JP6256932B2 - 濃度の大きく異なる複数成分を含有する試料の分析前処理方法 - Google Patents

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Description

本発明は、例えばガスクロマトグラフなどによる測定を行う際に、分析対象試料を測定に適するように前処理するための分析前処理方法に関し、特に、濃度が大きく異なる複数成分を含有する分析対象試料の分析を行うための分析前処理方法に関するものである。
近年、生体に含まれる代謝物を網羅的にその相対的な変動などを分析することで、外観には現れない生命現象を探索する解析手法が注目されている。この解析手法はメタボローム解析などと称され、病気の診断や病因の解析等の医療分野、医薬品等の毒性あるいは副作用検査等の医薬分野で適用が試みられている。また、このような医薬に関する分野以外にも、食品の品質管理、品質鑑定、品質予測、食品の安全性評価、食品製造の最適化、工業用微生物や植物等の育種などの分野でも応用が期待されている。
上述のようにメタボローム解析では、例えば、分析対象となる物質の相対的な変動などを分析するため、分析対象試料の前処理を行い、前処理して得られた分析試料を用いて分析対象となる物質の測定を行って、その測定結果に基づいて解析を行う必要がある。この場合に、分析対象となる物質の測定を行う装置としては、一般にガスクロマトグラフ質量分析装置や液体クロマトグラフ質量分析装置などが用いられる。一方、ヒトなどの生体由来のサンプルや食品由来のサンプルなどには多数の成分が様々な濃度範囲で含有されている。しかし、ガスクロマトグラフなどの分析装置において１回の処理で測定可能な濃度範囲は限られており、例えば低濃度成分は測定可能な範囲であるが、高濃度の成分は測定可能な範囲を超えてしまい、１つの試料に対して１回の測定では必要な成分の測定結果を得ることができず、２回以上測定を行う必要がある。また、クロマトグラフのリテンションタイムが近接する高濃度の成分が多数存在するとそれとリテンションタイムが近接する低濃度の成分のピークの検出或いは定量が困難になり、低濃度の成分の分析が困難になる。さらに、例えば、ガスクロマトグラフなどの分離カラムに、高濃度成分が大量に導入されると、分離カラムの液相の保持可能な容量を超えるため、目的成分も含めてリテンションタイムが大きくずれることがある。リテンションタイムがずれると、解析が困難になり、特にメタボローム解析のように多成分を測定する場合には、分析に支障をきたす。
このような状況に対して、高濃度成分から低濃度成分まで広範囲な成分の測定を行うことを可能とするクロマトグラフが提案されている。例えば特許文献１には、サンプルバルブ、計量管、カラム、検出器を備えたガスクロマトグラフにおいて、サンプルガスの流入路に前記サンプルバルブ側から止め弁、減圧弁およびサンプルガスと標準ガスを交互に導入する三方弁を配設すると共に、サンプルガスの排出路に止め弁を配設し、かつこれら４つの弁を制御する演算部を設けたことを特徴とするガスクロマトグラフが提案されている。このガスクロマトグラフでは、サンプル量を計量管のサイズによらずに増減するように構成することで、広範な成分の測定が可能であるとされている。
また、クロマトグラフにおいてリテンションタイムを調整してピークを検出する方法として、例えば液体クロマトグラフィーによる分析対象物の分離、溶出において、溶出溶媒の濃度を変更することが提案されている。例えば、特許文献２には、生体内に含まれる多種類のアミノ酸及びその誘導体、並びにアミノ酸類似物質を含むアミノ官能性化合物液体を分析する方法として、アミノ官能性化合物を含む試料中のアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させて所定のアミノ官能性化合物誘導体を生成せしめる工程、前記アミノ官能性化合物誘導体を段階的な濃度勾配溶出手段を用いる液体クロマトグラフィーにより溶出する工程、及び、前記液体クロマトグラフィーにより溶出されたアミノ官能性化合物誘導体を質量分析法により検出する工程を含むことを特徴とするアミノ官能性化合物の分析方法が開示されている。
特許第２９６１６８０号公報 国際公開第２００５／１１６６２９号
しかしながら、特許文献１に記載のガスクロマトグラフでは、サンプル自体はそのまま使用するため、高濃度の成分のリテンションタイムと近接する低濃度の成分の測定が困難になるという点は解消されない。また、特許文献２に記載の方法では、段階的な濃度勾配溶出手段を用いることにより、質量分析法において質量が同一であるために分離して検出することが困難な複数のアミノ官能性化合物を液体クロマトグラフィーによって予め分離、溶出することが可能ではあるが、例えばアミノ官能性化合物の濃度の違いやアミノ官能性化合物と誘導体化試薬とを反応させるなどの前処理については全く考慮されていない。そこで、本発明の目的とするところは、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度が所定範囲に調整されており、分析前処理後の測定において１回の処理で複数の成分を一斉に測定が可能な分析試料を容易に得ることが可能な分析前処理方法を提供することにある。
前述の従来技術の問題点に鑑みて、本発明の発明者が鋭意検討を行ったところ、相対的に低濃度の成分と高濃度の成分を、それぞれ供給量を変えて固相に供給するとともに、低濃度の成分及び高濃度の成分、固相、溶媒の組み合わせにより、（ｉ）各成分の固相への保持、溶出を調整することが可能である、（ii）各成分の固相への保持、溶出を調整することが可能であるとともに、固相の見かけ容積に対して所定容量の試料を供給する場合は、前述の組み合わせによらず試料を固相に捕捉させることができ、その後気体を供給することで溶媒などの揮発成分を除去可能である、との知見を得た。これらの知見に基けば、前述の課題を解決可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度が所定範囲に調整された分析試料を得るための分析前処理方法であって、
濃度の大きく異なる複数の成分を含む試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給し、相対的に低濃度の成分を固相に保持させる第一保持工程、
固相に第一溶媒をさらに供給し、相対的に高濃度の成分を固相から除去する第一洗浄工程、
第一保持工程において供給した所定量よりも少量の前記試料と、第二溶媒とを第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を固相に保持させる第二保持工程、
固相に保持された成分を押出溶媒により一斉に押し出して分析試料を得る溶出工程、
を含み、
第一溶媒は、相対的に低濃度の成分と相対的に高濃度の成分とを溶解可能であり、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を保持させない特性を有し、
第二溶媒は、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる特性を有する、分析前処理方法。
（２）第二溶媒は、第一溶媒と、これとは異なる溶媒との混合溶媒である前記（１）記載の分析前処理方法。
（３）第一溶媒が、水溶性有機溶媒と水とを含む混合溶媒であり、第二溶媒が、第一溶媒と、当該第一溶媒に含まれる水溶性有機溶媒との混合溶媒である前記（１）又は（２）に記載の分析前処理方法。
（４）第一溶媒の水溶性有機溶媒（Ａ）と水（Ｂ）との重量比（Ａ／Ｂ）が９／１〜０／１であり、第二溶媒の比（Ａ／Ｂ）が５００／１〜２０／１である前記（３）記載の分析前処理方法。
（５）第一洗浄工程においてさらに非水溶媒を供給し、第二保持工程終了後に、非水溶媒を供給する第二洗浄工程を含む、前記（１）〜（４）の何れか１項に記載の分析前処理方法。
（６）低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが小さく、固相が無極性の官能基を有する担体により構成されており、
第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、
第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が大きくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、
押出溶媒は、第一溶媒より極性が小さい、前記（１）又は（２）に記載の分析前処理方法。
（７）低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが大きく、固相が極性の官能基を有する担体により構成されており、
第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、
第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が小さくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、
押出溶媒は、第一溶媒より極性が大きい、前記（１）又は（２）に記載の分析前処理方法。
（８）第一溶媒が水溶性有機溶媒を含む前記（６）又は（７）に記載の分析前処理方法。
（９）第二保持工程が、
第一保持工程において供給した所定量よりも少量で、固相の見かけ容積の０％より大きく２５％以下の容積の前記試料を第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を含む試料を固相に捕捉させる捕捉工程、
捕捉工程後の固相に気体を供給し、揮発成分を除去して固相を乾燥させる乾燥工程、
乾燥工程後の固相に第二溶媒を供給し、夾雑物を除去する第二洗浄工程、
を含む、前記（１）記載の分析前処理方法。
（１０）第一洗浄工程において、第一溶媒の後に気体を供給する、前記（９）記載の分析前処理方法。
（１１）溶出工程の前に、前記固相に誘導体化試薬を供給し、固相に保持された成分を誘導体化するとともに固相から遊離させる誘導体化工程を含み、
溶出工程が、誘導体化工程終了後に、前記固相に押出溶媒を供給し、誘導体化された成分を固相から一斉に押出して分析試料を得る工程である前記（１）〜（５）、（９）、（１０）何れか１項に記載の分析前処理方法。
（１２）第一溶媒が、水溶性有機溶媒と水とを含む混合溶媒である前記（９）〜（１１）の何れか１項に記載の分析前処理方法。
（１３）第一溶媒の水溶性有機溶媒（Ａ）と水（Ｂ）との重量比（Ａ／Ｂ）が９／１〜０／１である前記（１２）記載の分析前処理方法。
（１４）前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、アセトン及びメタノールから選択される少なくとも１種である前記（３）〜（５）、（８）、（１２）、（１３）の何れか１項に記載の分析前処理方法。
（１５）前記試料が、相対的に高濃度の成分として、アルコール性水酸基を有する成分を含み、相対的に低濃度の成分として、カルボキシル基又はアミノ基を有する成分を含み、
前記固相が、極性の官能基及びイオン交換性の官能基から選択される少なくとも１種の官能基を有する担体により構成されている、前記（１）〜（１４）の何れか１項に記載の分析前処理方法。
（１６）試料に含まれるアルコール性水酸基を有する成分が、糖質であり、試料に含まれる相対的に低濃度の成分が、アミン化合物、アミノ酸及び有機酸から選択される少なくとも１種である（１５）に記載の分析前処理方法。
（１７）前記固相が、イオン交換性の官能基として、電荷の異なる複数のイオン交換性の官能基を有する（１５）又は（１６）に記載の分析前処理方法。
（１８）前記イオン交換性の官能基が強イオン交換性の官能基である前記（１７）に記載の分析前処理方法。
（１９）試料に含まれる高濃度の成分と低濃度の成分の濃度の比（高濃度／低濃度）が２０以上である前記（１）〜（１８）の何れか１項に記載の分析前処理方法。
（２０）前記（１）〜（１９）の何れか１項に記載の分析前処理方法により得られた分析試料を用いて、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に測定する工程を含む分析方法。
本発明において、試料に含まれる高濃度成分と低濃度成分の電荷の偏りの差は、ｎ−オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）や酸解離定数（ｐＫａ）により判断することができる。また、本発明において、溶媒における極性の差は、ｎ−オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰｏｗ）、双極子モーメント、誘電率により判断することができる。
また、本発明において「保持」とは、固相と高濃度及び低濃度成分が溶媒との関係で相互作用を有する場合を意味し、「捕捉」とは、固相と高濃度及び低濃度成分が溶媒との関係で相互作用を有しないものを含む場合を意味する。
本発明によれば、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度が所定範囲に調整された分析試料を容易に得ることができる。また、この分析試料を用いることで、例えばガスクロマトグラフ質量分析装置などの分析装置により、１回の処理で複数の成分を一斉に測定が可能になる。
実施例１で得られたトリメチルシリル化された成分を含む分析用試料のガスクロマトグラフ質量分析装置によるクロマトグラムを示したものである。 実施例２、比較例１、２で得られたトリメチルシリル化された成分を含む分析用試料のガスクロマトグラフ質量分析装置によるクロマトグラムを示したものであり、図中の（ｉ）が比較例１、（ii）が比較例２、（iii）が実施例２のクロマトグラムである。 図２の縦軸方向を拡大したクロマトグラムを示したものである。 実施例３、比較例３、４で得られたトリメチルシリル化された成分を含む分析用試料のガスクロマトグラフ質量分析装置によるクロマトグラムを示したものであり、図中の（ｉ）が比較例３、（ii）が比較例４、（iii）が実施例３のクロマトグラムである。 図４の縦軸方向を拡大したクロマトグラムを示したものである。
〔分析前処理方法〕
本発明に係る分析前処理方法は、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度が所定範囲に調整された分析試料を得るためのものである。そして、この分析前処理方法は、濃度の大きく異なる複数の成分を含む試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給し、相対的に低濃度の成分を固相に保持させる第一保持工程、固相に第一溶媒をさらに供給し、相対的に高濃度の成分を固相から除去する第一洗浄工程、第一保持工程において供給した所定量よりも少量の前記試料と、第二溶媒とを第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を固相に保持させる第二保持工程、固相に保持された成分を押出溶媒により一斉に押し出して分析試料を得る溶出工程、を含む。ここで、この際に使用する第一溶媒は、相対的に低濃度の成分と相対的に高濃度の成分とを溶解可能であり、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を保持させない特性を有する。また、第二溶媒は、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる特性を有する。
前記の分析前処理方法では、先ず、低濃度の成分（以下、「低濃度成分」とも称する。）と高濃度の成分（以下、「高濃度成分」とも称する。）とを含む分析対象試料と第一溶媒を固相に供給して、高濃度成分は固相に保持させず、低濃度成分のみを固相に保持させる。その後、再度同じ分析対象試料を先の供給時よりも少量になるように固相に供給し、低濃度成分と高濃度成分を固相に保持させる。このように、高濃度成分を固相に保持させる時の試料の供給量を低濃度成分のみを固相に保持させる時よりも少なくすることで、高濃度成分の固相への保持量を少なくすることが可能になる。そのため、固相に対する低濃度成分の保持量と高濃度成分の保持量を所定範囲に調整することが可能になる。また、この際の供給量に基づいて試料に含まれる各成分の濃度を算出することが可能である。そのため、前処理後に行う測定において、前処理試料を用いて分析対象試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に測定することができる。また、高濃度成分の保持量を小さくすることから、前処理後に行う測定において、例えばガスクロマトグラムのリテンションタイムが近接するような場合でも、低濃度成分が高濃度成分の影響を受けることを低減することができ、より多くの成分の測定が可能になる。また、高濃度成分がクロマトグラフの分離カラムに大量に導入されるという事態を回避することができ、メタボローム解析のような多成分の測定を安定して行うことができる。
このような分析前処理に適用可能な分析対象試料としては、例えばメタボローム解析の解析手法を用いて、分析対象試料に含まれ得る各種の化学物質である成分を網羅的に測定する必要があるものであればよい。また、このような分析対象試料では、一般に、様々な種類の化学物質が、様々な濃度範囲で含まれていると考えられる。このような分析対象試料としては、例えば、生物由来の体液、飲食品（生肉、野菜、加工品等を含む）、細胞や微生物等の培養液（飲食品を除く）、植物（飲食品を除く）等が挙げられる。生物由来の体液としては、血液、リンパ液、髄液、唾液、尿等が挙げられる。また、分析対象試料は、必要に応じて、固相に負荷可能な液状に調製するのが好ましい。例えば、破砕や遠心分離処理等を行って各種の成分を含み得る液を取得する。このようにして取得された液にも、複数の成分が、様々な濃度で含まれ得る。尚、例えばメタボローム解析の対象となる試料では、多くの場合、分析対象となる試料にどのような成分がどの程度含まれているかは概ね知られており、当業者は容易に高濃度成分と低濃度成分を想定することができる。もっとも、全く未知の試料の場合は、予備実験を行って、高濃度成分及び低濃度成分を確認することになる。
また、適用可能な成分は、例えばメタボローム解析の分析対象となり得るものであり、例えば、糖質、アミノ酸、有機酸、アミン化合物、グリセリド、アルカロイド、ステロイド、フラボノイド、タンパク質、糖リン酸、核酸、カロテノイド類、ヌクレオシド、テルペン類などが挙げられる。このうち、アルコール性水酸基を有する成分及びカルボキシル基又はアミノ基を有する成分が、好適である。これらの成分が、高濃度成分又は低濃度成分として試料に含まれる場合に、各成分の濃度を所定範囲に調整し、分析前処理後の測定において一斉に測定をすることができる。
適用可能なアミノ酸としては、アミノ基とカルボキシル基を有するものであればよく、例えば、カルボキシル基が結合している炭素にアミノ基も結合しているα−アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アミノ酪酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
適用可能な有機酸としては、カルボキシル基を有する有機化合物（アミノ酸を除く）であればよく、例えば、炭素数が１以上のカルボン酸が挙げられる。このうち、炭素数が２〜４０である場合が好適である。例えば、ギ酸、短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸、芳香族カルボン酸、ヒドロキシ酸（クエン酸、クエン酸塩等）等である。これらの脂肪酸は飽和脂肪酸でもよいし、不飽和脂肪酸（１価の不飽和脂肪酸でもよいし、２価以上のものでもよい。）であってもよい。また、１価のカルボン酸でも良いし、２価以上のものであってもよい。尚、後述するように、栄養表示基準に基づく糖質にはある種の有機酸が含まれるが、本発明では、有機酸として分類する。
適用可能な糖質としては、日本国の栄養表示基準に基づく糖質（但し、有機酸は除く。）であればよく、糖類（単糖類及び二糖類）、三糖以上のオリゴ糖や多糖類、糖アルコール等である。このうち、糖類がより好適である。糖質の立体構造は鎖状でも、環状でもよい。
適用可能なアミン化合物としては、アンモニアの水素原子が炭化水素残基等で置換された化合物であればよく、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンの何れでもよい。構造は、鎖状でも、環状でもよい。また、アミン化合物はアミノ基を有する化合物（但し、アミノ酸を除く。）でもあり、アミノ基の数は特に限定はなく、モノアミン、ポリアミン何れでもよい。炭化水素残基としては、置換基を有してもよいアルキル基、アリール基等が挙げられる。このようなアミン化合物としては、脂肪族アミン、芳香族アミン、複素環式アミン、等が挙げられ、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、スペルミジン、スペルミン、アマンタジン、アニリン、フェネチルアミン、トルイジン、カテコールアミン、１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、キヌクリジン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサゾール、チアゾール、４−ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
適用可能なグリセリドとしては、グリセリン又はポリグリセリンと脂肪酸とのエステルであればよく、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステルの何れでもよい。グリセリドを構成する脂肪酸の炭素数は、１０〜４０が好ましい。トリグリセリドは、体内脂肪組織などに蓄えられる脂肪、食品中の油脂などが該当する。モノグリセリド、ジグリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステルは、食品に含まれる乳化剤などが該当する。
適用可能なアルカロイドとしては、アミノ酸や核酸など別のカテゴリーに入る生体分子を除いて、天然物由来の含窒素有機化合物である。アルカロイドとしては、例えば、クスコヒグリン、ヒグリン、ヒグロリンなどのピロリジン誘導体、アトロピン、コカイン、エルゴニンなどのトロパン誘導体、レトロネシン、インジシン、プラチフィリン、ロリンなどのピロリジジン誘導体、セダミン、コニインなどのピペリジン誘導体、ルピニン、シチシン、スパルテイン、マトリン、オルモサニンなどのキノリジジン誘導体、スワインソニンなどのインドリジジン誘導体、トリゴネリン、ニコチン、アクチニジン、エボニンなどのピリジン誘導体、サルソリン、Ｎ−メチルコリダルジン、クリプトスチリン、パパベリン、ベルベリン、ヒドラスチン、グラウシン、モルヒネ、コデイン、テバイン、リコリンなどのシノメニンイソキノリン誘導体および類縁アルカロイド、アンヌロリンなどのオキサゾール誘導体、イボテン酸などのイソオキサゾール誘導体、ノストシクラミドなどのチアゾール誘導体、フェブリフギン、グリコリン、バジシン（ペガニン）などのキナゾリン誘導体、ルタクリドンなどのアクリジン誘導体、クスパリン、キニーネ、キニジン、シンコニンなどのキノリン誘導体、セロトニン、ハルミン、フィゾスチグミン（エセリン）、エルゴタミン、ストリキニーネ、イボガミン、ビンカアルカロイドなどのインドール誘導体、ヒスタミンなどのイミダゾール誘導体、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、サキシトキシンなどのプリン誘導体などの窒素複素環を含むアルカロイド、チラミン、エフェドリン、プソイドエフェドリン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンなどのβ−フェネチルアミン誘導体、コルヒヒチンなどのコルヒチンアルカロイドなどの側鎖に窒素を有するアルカロイド、プトレシン誘導体、スペルミジン誘導体、スペルミン誘導体などのポリアミンアルカロイドなどが挙げられる。
適用可能なステロイドとしては、炭素の六員環が三つと五員環が一つ結合した基本構造（Ｃ１８Ｈ２８、ステロイド骨格）を有するものであれば、特に限定はなく、例
えば、コレスタン、コラン、プレグナン、アンドロスタン、エストランの何れのものでもよい。また、その誘導体でもよい。このような誘導体としては、例えば、コレスタンのＡ環の３位に水酸基を有するステロールなどが挙げられる。また、ステロールとしては、動物由来のコレステロール、植物由来のフィトステロールなどが挙げられる。
適用可能なフラボノイドとしては、フラバンを基本骨格として有するものであれば特に限定はなく、例えば、フラバン、イソフラボン、フラバノン、カルコン、アントシアニン、カテキン、フラボン、フラボノールなど及びそれらの誘導体が挙げられる。
分析対象試料には、濃度の大きく異なる複数の成分が含まれる。この濃度の違いが大きいほど、本発明の効果が発揮される。このような濃度の違いとしては、高濃度の成分と低濃度の成分の濃度の比（高濃度／低濃度）が２０以上である場合に適用するのが好ましい。
前述の分析前処理方法の実施形態としては、大別すると２つの方法がある。以下では、それぞれの方法の実施形態について説明する。
＜第一の分析前処理方法＞
第一の分析前処理方法（以下、「第一の方法」と称する場合がある。）では、第一保持工程において、濃度の大きく異なる複数の成分を含む試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給し、相対的に低濃度の成分を固相に保持させる。
この時、固相に供給する試料の実施形態としては、試料の特性に応じて適宜選択することができる。例えば、液状の試料の場合はそのまま用いてもよいし、液状の試料を希釈溶媒で希釈した希釈液を用いてもよいし、試料を希釈溶媒により希釈した後遠心処理を行って得られた上澄液を試料として用いてもよい。試料を希釈する希釈溶媒としては、第一保持工程における固相との相互作用の観点から、第一溶媒を用いるのが好ましい。
第一溶媒は、相対的に低濃度の成分と相対的に高濃度の成分とを溶解可能なものを用いる。これにより、低濃度成分及び高濃度成分と固相との相互作用を利用して、選択的に固相に低濃度成分を保持させることが可能になる。また、第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を保持させない特性を有する。このような第一溶媒は、固相と低濃度成分及び高濃度成分との相互作用の関係を考慮して決定することができる。より具体的な実施形態は後述する。
固相への試料及び第一溶媒の供給の仕方は特に限定はなく、試料を供給した後に第一溶媒を供給してもよいし、試料と第一溶媒とを同時に供給してもよいし、それぞれを分割して任意の順に供給してもよいし、その他の態様でもよい。また、試料と第一溶媒とを同時に供給する態様には、試料と第一溶媒との混合液を供給する場合が含まれる。さらに、混合液には、実質的に前述の第一溶媒中に所定の成分が含まれるように調整されたものを含む。
以上のように、「試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給し」には、試料と第一溶媒を別々の供給源から別々に順番に所定量供給する態様、試料と第一溶媒を別々の供給源から同時に所定量供給する態様、第一溶媒で試料を希釈した希釈液として試料と第一溶媒を同時に供給する態様、その他の態様を含む。
第一保持工程の後に、第一洗浄工程を行う。第一洗浄工程では、固相に第一溶媒をさらに供給し、相対的に高濃度の成分を固相から除去する。このように、第一保持工程時に固相に保持されず残存している高濃度成分を固相から除去することで、低濃度成分のみを固相に存在させる。これにより、第二保持工程において固相に保持される高濃度成分のみを、得られる分析試料に存在させることができる。
第一洗浄工程の後に、第二保持工程を行う。第二保持工程では、第一保持工程において供給した所定量よりも少量の前記試料と、第二溶媒とを第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を固相に保持させる。
この時、固相に供給する試料の実施形態としては、第一保持工程において供給した所定量よりも少量になるようにすれば特に限定はない。例えば、液状の試料の場合はそのまま用いて供給量自体を少量にして、第一保持工程の時のよりも高濃度成分の供給量が少なくなるようにしてもよいし、液状の試料を希釈した希釈液の場合は、第一保持工程の時よりも希釈倍率を大きくして、第一保持工程の時のよりも高濃度成分の供給量が少なくなるようにしてもよい。また、第一保持工程において希釈液を用いた場合は、第二保持工程においては、第一保持工程において使用した希釈液をさらに希釈溶媒で希釈するのが、効率的である。この際の希釈溶媒としては、第二保持工程における固相との相互作用の観点から、第二溶媒を用いるのが好ましい。
第二溶媒は、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる特性を有するものを用いる。このような第一の方法における第二溶媒としては、固相との相互作用を考慮した第二溶媒の調製の容易性の観点等から、第一溶媒と、これとは異なる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる特性を有するものが好ましい。このような第二溶媒は、固相と低濃度成分及び高濃度成分との相互作用の関係を考慮して決定することができる。より具体的な実施形態は後述する。
固相への試料及び第二溶媒の供給の仕方は特に限定はなく、試料を供給した後に第二溶媒を供給してもよいし、試料と第二溶媒とを同時に供給してもよいし、それぞれを分割して任意の順に供給してもよいし、その他の態様でもよい。また、試料と第二溶媒とを同時に供給する態様には、試料と第二溶媒との混合液を供給する場合が含まれる。さらに、混合液には、実質的に前述の第二溶媒中に所定の成分が含まれるように調整されたものを含む。
第一の方法では、第二保持工程の後に、固相に保持されずに残存している成分などを除去するため、固相に洗浄溶媒を供給する第二洗浄工程を行うのが好ましい。この際の洗浄溶媒は、固相と固相に保持されている高濃度成分と低濃度成分との相互作用に影響ない溶媒であれば、特に限定はなく、例えば、第二溶媒が挙げられる。尚、後述するように、固相に保持された成分の誘導体化を行う場合は、第二溶媒以外の非水溶媒を用いてもよい。
第二保持工程の後、或いは、必要に応じて行う第二洗浄工程の後、溶出工程を行う。溶出工程では、固相に保持された成分を押出溶媒により一斉に押し出して分析試料を得る。
押出溶媒は、固相と低濃度成分及び高濃度成分との相互作用の関係を考慮して決定することができる。即ち、固相よりも高濃度成分及び低濃度成分と親和性のよいものを用いるとよい。より具体的な実施形態は後述する。
溶出工程が終了すると、必要に応じて定容化工程を行ってもよい。定容化工程では、分析試料を所望の容量に調整するために押出溶媒により分析試料を希釈する。
以下では、分析対象試料に含まれる高濃度成分と低濃度成分に応じて、第一の方法の実施形態についてより詳細に説明するが、第一の方法がこれらの実施形態に限定されることはなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の形態で実施し得ることは勿論である。
（第一実施形態）
第一実施形態は、試料が、相対的に高濃度の成分として、アルコール性水酸基を有する成分を含み、相対的に低濃度の成分として、カルボキシル基又はアミノ基を有する成分を含み、固相は、極性の官能基及びイオン交換性の官能基から選択される少なくとも１種の官能基を有する担体により構成されている場合である。即ち、試料中の低濃度成分としてイオン性の官能基を含み、高濃度成分として極性の官能基を含むことで、低濃度成分が高濃度成分よりも電荷の偏りが大きい場合の実施形態である。この場合も前述の工程により分析前処理を行うため、本実施形態に特有の事項について以下で説明する。
アルコール性水酸基を有する成分としては、固相との相互作用の観点から、水に対する溶解度が１ｇ／１００ｇ−Ｈ２Ｏ以上の成分が好ましい。このような成分としては、糖質などが挙げられる。糖質のうち、糖類が好適である。また、カルボキシル基又はアミノ基を有する成分としては、固相との相互作用の観点から、アミン化合物、アミノ酸及び有機酸から選択される少なくとも１種が好ましい。また、有機酸としては、前述したもののうち、水に対する溶解度が０．００１ｇ／１００ｇ−Ｈ２Ｏ以上の成分が好ましく、１ｇ／１００ｇ−Ｈ２Ｏ以上がより好ましい。例えば、水溶性の良好な有機酸としては、短鎖脂肪酸、ヒドロキシ酸、２価以上のカルボン酸などが挙げられる。
このような組み合わせの場合、カルボキシル基は水素イオンを放出して負電荷を有し、アミノ基は窒素原子の非共有電子対により塩基性が強く陽イオンを配位して正電荷を有するのに対して、アルコール性水酸基は極性を有するがカルボキシル基よりも水素イオンを放出する傾向が小さいため、固相の極性の官能基及びイオン交換性の官能基との親和性が、カルボキシル基又はアミノ基を有する成分の方がアルコール性水酸基を有する成分よりも高くなる。このような、主として電荷による、固相と低濃度成分及び高濃度成分との相互作用の強さの違いに基づいて、第一溶媒と低濃度成分及び高濃度成分との相互作用の強さを調整することで、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を保持させない特性を有する第一溶媒を調製することができる。また、同様に、第二溶媒と低濃度成分及び高濃度成分との相互作用の強さを調整することで、高濃度の成分を保持させる特性を有する第二溶媒を調製することができる。
このような第一溶媒としては、水溶性有機溶媒と水とを含む混合溶媒であるのが好ましい。このような水溶性有機溶媒としては、各種の成分の溶解性及び水に対する溶解性の観点から、アセトニトリル、アセトン及びメタノールから選択される少なくとも１種が好ましい。また、効率的に、固相に低濃度成分を保持させるが高濃度成分を保持させないようにする観点から、水溶性有機溶媒（Ａ）と水（Ｂ）との重量比（Ａ／Ｂ）は９／１〜０／１であるのが好ましい。
また、第二溶媒としては、第一溶媒と、当該第一溶媒に含まれる水溶性有機溶媒との混合溶媒であるのが好ましい。このように、第一溶媒に含まれる水溶性有機溶媒を用いることで、第二溶媒、低濃度成分及び高濃度成分、固相の相互作用の関係を容易に調整することができる。また、第一溶媒が前述のように水溶性有機溶媒と水とを含む混合溶媒である場合、第一溶媒に水溶性有機溶媒を添加することで第二溶媒の極性を低下させることができる。その結果、高濃度成分は、固相より第一溶媒と相互作用が強かったが、第二溶媒より固相との相互作用が強くなり、高濃度成分を固相に保持することができる。また、低濃度成分はより固相との相互作用が強くなり、第一保持工程で保持された低濃度成分はそのまま固相に保持され、第二保持工程において供給されたものも固相に保持される。第一溶媒への所定の水溶性有機溶媒の添加量は、固相に高濃度成分を保持させることが可能になるようにすればよく、より効率的に高濃度成分を保持させる観点から、第二溶媒における、水溶性有機溶媒（Ａ）と水（Ｂ）との重量比（Ａ／Ｂ）が５００／１〜２０／１となるように決定されるのが好ましい。
本実施形態で使用可能な固相としては、極性の官能基及びイオン交換性の官能基から選択される少なくとも１種の官能基を有する担体により構成されていればよい。このような固相の構成としては、各官能基を有する担体を１つの筐体内にランダムに混ぜ合わせて配置したもの、１つの筐体内に積層して配置したもの、別々の筐体内に各担体を配置し、それらを連続させたものなどが挙げられる。また、担体としては、シリカ系のもやスチレンとジビニルベンゼンの共重合体などの樹脂系のものなどが挙げられる。このうち、アミノ酸、有機酸及び糖質（より好適には糖類）をより効率的に固相に保持させる観点から、イオン交換性の官能基を有する担体が好ましく、樹脂系の担体を用いるのが好ましく、イオン交換性の官能基を有する樹脂系の担体がより好ましい。尚、本実施形態において、極性を有する官能基とは、官能基内に電気的な偏りがある官能基を意味する。また、極性の大きさは、担体のＬｏｇＰｏｗを指標とすることができる。また、イオン性はｐＫａを指標とすることができる。
固相がイオン交換性の官能基を有する場合、低濃度成分の構成に応じて、イオン交換性の官能基として、電荷の異なる複数のイオン交換性の官能基を有してもよい。例えば、低濃度成分として、有機酸とアミノ酸及び／又はアミン化合物とを含む場合、有機酸はカルボキシル基の水素イオンが遊離して負電荷を有し、アミノ酸及びアミン化合物はアミノ基に水素イオン等が配位して正電荷の部分を有するため、両者を確実に保持する観点から、陰イオン交換性の官能基を有する担体及び陽イオン交換性の官能基を有する担体により構成される固相が好ましい。また、イオン交換性の官能基は、アルコール性水酸基を有する成分及びカルボキシル基及び／又はアミノ基を有する成分、例えば、アミン化合物、アミノ酸、有機酸及び糖質（より好適には糖類）をより効率的に固相に保持させる観点から、強イオン交換性の官能基であるのが好ましい。また、後述するように、固相に保持した各成分の誘導体化を行う場合は、水分を除去する必要があるところ、強イオン交換性の官能基を有する担体の場合は、非水溶媒を通液するだけで、残存する水分を容易に除去可能に構成することができるという利点もある。尚、強イオン交換性とは、強陽イオン交換性又は強陰イオン交換性を意味し、強陽イオン交換性とは強酸性陽イオン交換性を意味し、強陰イオン交換性とは強塩基性陰イオン交換性を意味する。
本実施形態の固相としては、市販のものを使用することができる。イオン交換性の官能基を有する担体により構成されたものとしては、例えば、株式会社アイスティサイエンス製のＳｍａｒｔ−ＳＰＥ−ＰＳＡ、ＮＨ２、ＳＡＸ、ＳＣＸ、ＡＸ、ＷＡＸ、ＣＸ、ＷＣ
Ｘなどの固相カートリッジが挙げられる。極性の官能基を有する担体により構成されたものとしては、例えば、株式会社アイスティサイエンス製のＳｍａｒｔ−ＳＰＥ−ＳＩ、ＦＬ、ＰＬＳ３、ＨＬＢなどの固相カートリッジが挙げられる。
高濃度成分が糖類で、低濃度成分がアミン化合物、アミノ酸及び有機酸から選択される少なくとも１種である場合の、固相の構成についてより具体的に例示する。即ち、低濃度成分としては、アミン化合物のみ、アミノ酸のみ、有機酸のみ、アミノ酸及び有機酸、アミン化合物及び有機酸、アミノ酸及びアミン化合物、アミン化合物、アミノ酸及び有機酸の７つの実施形態が考えられる。低濃度成分が、有機酸のみの場合は、固相は、陰イオン交換性の官能基を有する担体により構成されるのが好ましい。一方、アミノ酸及びアミン化合物を含む場合は、陰イオン交換性の官能基を有する担体及び陽イオン交換性の官能基を有する担体により構成されるのが好ましい。糖類及び有機酸は陰イオン交換性の官能基と相互作用をする傾向が強く、アミノ酸及びアミン化合物は陽イオン交換性の官能基と相互作用をする傾向が強いためである。
本実施形態では、第一洗浄工程において、第一溶媒を固相に供給した後、非水溶媒をさらに供給してもよい。これにより、固相に残存する水を除去し、残存する水分による溶媒の極性の大きさが変動することを防止することができる。このような非水溶媒としては、固相に残存する水分を効率よく除去する観点から、水溶性有機溶媒が挙げられ、より具体的には、アセトニトリル、アセトン、メタノールなどが挙げられる。このような水溶性有機溶媒のうち、後述するように誘導体化を行う場合は水酸基を有さないものが好ましく、例えば、アセトニトリル、アセトンがより好ましい。
本実施形態では、第二保持工程終了後に、非水溶媒を供給する第二洗浄工程を行うのが好ましい。この第二洗浄工程は、後述するように、固相に保持された高濃度成分と低濃度成分を誘導体化する場合に特に好適である。誘導体化を行う場合に水が存在すると誘導体化が妨げられるためである。このような非水溶媒としては、固相に残存する水分を効率よく除去する観点から、水溶性有機溶媒が挙げられ、より具体的には、アセトニトリル、アセトン、メタノールなどが挙げられる。このような水溶性有機溶媒のうち、後述するように誘導体化を行う場合は水酸基を有さないものが好ましく、例えば、アセトニトリル、アセトンがより好ましい。
試料に含まれる成分が、例えば、アミン化合物、アミノ酸、有機酸、糖質（特に糖類）などである場合、これらはガスクロマトグラフにより測定する場合には、測定を可能にするため誘導体化試薬により誘導体化を行うのが好ましい。この際、本発明では、固相に保持させた状態の各成分を誘導体化するように構成するのが好ましい。例えば、溶出工程の前に、固相に誘導体化試薬を供給し、固相に保持された成分を誘導体化するとともに固相から遊離させる誘導体化工程を行うのが好ましい。このようにして誘導体化を行うことにより、誘導体化された各成分を固相から遊離させることが可能になる。そのため、固相と誘導体化前の各成分との相互作用の種類に関わらず、溶出工程において、固相に保持された成分を誘導体化物として押出溶媒により一斉に押し出すことが可能になる。このような押出溶媒としては、誘導体化物の安定性の観点から、ヘキサン、又は、アセトンとヘキサンの混合溶液が好ましい。また、アセトンとヘキサンの混合溶液としては、同様の理由から、アセトン（Ａ）とヘキサン（Ｈ）の容積基準の混合比（Ａ／Ｈ）が、１／１〜１／９が好ましい。
本実施形態における誘導体化としては、公知の方法を採用でき、例えば、シリル化、アシル化、エステル化、環状誘導体化などが挙げられ、これらの誘導体化を行うための試薬も一般的な試薬を用いることができる。このうち、低濃度成分と高濃度成分が、アミン化合物、アミノ酸、有機酸、糖類である場合は、シリル化が好ましく、トリメチルシリル化がより好ましい。トリメチルシリル化を行うための誘導体化試薬としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＭＴＭＳＡ）、Ｎ−トリメチルシリルジメチルアミン（ＴＭＳＤＭＡ）、Ｎ−トリメチルシリルジエチルアミン（ＴＭＳＤＥＡ）、Ｎ−トリメチルシリルイミダソール（ＴＭＳＩ）などが挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上組み合わせて用いてもよい。このうち、アミノ酸、有機酸及び糖類を効率的にトリメチルシリル化する観点からは、ＭＳＴＦＡ、ＢＳＴＦＡ及びＴＭＣＳから選択される少なくとも１種を含むのが好ましく、ＭＳＴＦＡ又はＭＳＴＦＡとＴＭＣＳを含むものがより好ましい。また、ＭＳＴＦＡとＴＭＣＳを含む場合は、ＭＳＴＦＡとＴＭＣＳの比（モル比）は、効率的にトリメチルシリル化を行う観点から、ＭＳＴＦＡに対してＴＭＣＳが０．５〜２０％が好ましい。
また、誘導体化試薬は、アミン化合物、アミノ酸、有機酸及び糖類をより効率的にトリメチルシリル化する観点からは、ピリジンを含んでいてもよい。ピリジンはトリメチルシリル化の触媒としての機能を有するものと推測される。
本実施形態では、誘導体化を行う前に、固相に保持された成分に所定の処理を行ってもよい。例えばトリメチルシリル化を行う場合を例にすると、トリメチルシリル化された時に複数の異性体などが生成する成分のうち特定の異性体を優先的に生成させるための処理である。これにより、このような成分の測定精度を向上させ得る。このような処理としては、例えば、誘導体化試薬と各成分を反応させる前に、所定の試薬と反応させて固相に保持された成分と反応させる方法などが挙げられる。この際、誘導体化試薬と所定の試薬の固相への供給の仕方は、両者を同時に行ってもよいし、誘導体化試薬を後に供給してもよい。このような所定の試薬の有効成分としては、例えば、窒素を含有する化合物を含有するのが好ましく、アミン化合物を含有するのがより好ましい。このようなアミン化合物としては、アルコキシアミンおよびその塩（塩酸塩を含む）などが好ましい。アルコキシアミンおよびその塩（塩酸塩を含む）としては、例えば、メトキシアミンおよびその塩（塩酸塩を含む）（以下、「メトキシアミン等」と称する。）などが挙げられる。メトキシアミン等は例えば、ピリジン、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタンなどの窒素を含有する化合物を溶解することが可能な溶媒に溶解した溶液を用いるのが好ましい。尚、このようなメトキシアミン等を含有する試薬を用いて行う処理をメトキシム化と称する。
本実施形態における、試料、固相及び溶媒の使用量などは、分析前処理後に行う測定に使用する分析試料の必要量などに応じて適宜決定することができる。
（第二実施形態）
第二実施形態は、低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが小さく、固相が無極性の官能基を有する担体により構成されており、第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が大きくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、押出溶媒は、第一溶媒より極性が小さい場合である。この場合も前述の工程により分析前処理を行うため、本実施形態に特有の事項について以下で説明する。
このように、本実施形態では、低濃度成分及び高濃度成分の電荷の偏り、並びに、固相、第一溶媒、第二溶媒及び押出溶媒の極性の関係に着目することで、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度を所定範囲に調整することを可能にしている。本実施形態では、低濃度成分と高濃度成分の電荷の偏りの関係は、低濃度成分が高濃度成分よりも電荷の偏りが小さい場合である。また、固相が無極性の官能基を有する担体により構成されているため、低濃度成分も電荷の偏りを有することで、極性が調整された押出溶媒で固相から押出し可能になる。本実施形態において、低濃度成分及び高濃度成分の電荷の偏りとは、分子内の極性又は分子内に含まれるイオンの電荷を意味する。
本実施形態では、前述のように、第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有する。また、固相が無極性の官能基を有する担体により構成されており、低濃度成分の電荷の偏りが高濃度成分より小さいため、低濃度成分の方が高濃度成分よりも固相との相互作用は大きくなっている。この電荷の偏りに基づく相互作用の相違を利用して、第一溶媒の極性を調整すればよい。即ち、低濃度成分の電荷の偏りと高濃度成分の電荷の偏りの間の極性を有するように第一溶媒の極性を調整すればよい。また第一溶媒の極性の調整は、極性の異なる溶媒を混合することで調整することができる。混合する溶媒の選択は、低濃度成分及び高濃度成分の電荷の偏りに基づき選択することができる。
第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が大きくなる溶媒との混合溶媒である。このような混合溶媒を用いることで、第二溶媒の極性は第一溶媒よりも大きくなる。そして、固相の無極性の官能基を有する担体との関係で、固相と高濃度成分との相互作用の方が、第二溶媒と高濃度成分との相互作用より大きくなるように、第二溶媒の極性を大きくすることで、固相に高濃度成分が保持される。この場合、低濃度成分は、高濃度成分よりも電荷の偏りが小さいため、第二溶媒よりも固相との相互作用が大きくなる。そのため、低濃度成分も固相に保持される。
押出溶媒は、第一溶媒より極性が小さい溶媒を用いる。もっとも、固相から低濃度成分と高濃度成分を溶出するため、固相の無極性の官能基を有する担体との関係で、固相より低濃度成分及び高濃度成分と相互作用の大きい溶媒を選択する。
本実施形態における低濃度成分及び高濃度成分、固相、第一溶媒、第二溶媒並びに押出溶媒の組み合わせは、低濃度成分と高濃度成分の種類に応じ、前述のようにして組み合わせることができるが、第一溶媒は、水溶性有機溶媒を含むのが好ましい。水溶性有機溶媒は一般に極性を有し、第一溶媒の極性を調整するのに好適なためである。また、第二溶媒及び溶出溶媒についても同様である。このような水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、アセトン及びメタノールから選択される少なくとも１種が好ましい。また、溶出溶媒は、第一及び第二溶媒と異なる水溶性有機溶媒を用いてもよい。以下では、高濃度成分としてモノグリセリドを含み、低濃度成分としてコレステロールを含む試料の場合について簡単に説明する。
モノグリセリドは、グリセリンの１つの水酸基と脂肪酸とのエステルであり、水酸基を２つ有し、コレステロールはコレスタンのＡ環の３位に水酸基を有し、低濃度成分であるコレステロールの方が電荷の偏り、即ち、極性が小さくなっている。この場合、第一溶媒は、水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いるのが好ましく、この際の水溶性有機溶媒（Ａ）と水（Ｂ）との重量比（Ａ／Ｂ）は、９０／１０〜７５／２５が好ましい。好ましい水溶性有機溶媒は前述のとおりである。第二溶媒は、重量比（Ａ／Ｂ）は、６０／４０〜４０／６０が好ましい。溶出溶媒は、第一溶媒より極性の小さい溶媒であれば特に限定はなく、例えば、ヘキサン、アセトン、ヘキサンとアセトンの混合溶液などが挙げられる。固相としては、無極性の官能基を有する担体により構成されていればよく、市販の固相カートリッジ等を使用することができる。例えば、株式会社アイスティサイエンス製のＳｍａｒｔ−ＳＰＥ Ｃ１８などが挙げられる。
（第三実施形態）
第三実施形態は、低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが大きく、固相が極性の官能基を有する担体により構成されており、第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が小さくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、押出溶媒は、第一溶媒より極性が大きい場合である。この場合も前述の工程により分析前処理を行うため、本実施形態に特有の事項について以下で説明する。
このように、本実施形態でも、低濃度成分及び高濃度成分の電荷の偏り、並びに、固相、第一溶媒、第二溶媒及び押出溶媒の極性の関係に着目することで、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度を所定範囲に調整することを可能にしている。本実施形態では、低濃度成分と高濃度成分の電荷の偏りの関係は、低濃度成分が高濃度成分よりも電荷の偏りが大きい場合である。本実施形態においても、低濃度成分及び高濃度成分の電荷の偏りとは、分子内の極性又は分子内に含まれるイオンの電荷を意味する。
本実施形態では、第二実施形態と同様に、第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有するが、第二実施形態とは異なり、固相が極性の官能基を有する担体により構成されている。このように、固相が極性の官能基を有する担体により構成されており、低濃度成分の電荷の偏りが高濃度成分より大きいため、低濃度成分の方が高濃度成分よりも固相との相互作用は大きくなっている。この電荷の偏りに基づく相互作用の相違を利用して、第一溶媒の極性を調整すればよい。即ち、低濃度成分の電荷の偏りと高濃度成分の電荷の偏りの間の極性を有するように第一溶媒の極性を調整すればよい。本実施形態でも、第一溶媒の極性の調整は、極性の異なる溶媒を混合することで調整することができる。混合する溶媒の選択は、低濃度成分及び高濃度成分の電荷の偏りに基づき選択することができる。
第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が小さくなる溶媒との混合溶媒である。このような混合溶媒を用いることで、第二溶媒の極性は第一溶媒よりも小さくなる。そして、固相の極性の官能基を有する担体との関係で、固相と高濃度成分との相互作用の方が、第二溶媒と高濃度成分との相互作用より大きくなるように、第二溶媒の極性を小さくすることで、固相に高濃度成分が保持される。この場合、低濃度成分は、高濃度成分よりも電荷の偏りが大きいため、第二溶媒よりも固相との相互作用が大きくなる。そのため、低濃度成分も固相に保持される。
押出溶媒は、第一溶媒より極性が大きい溶媒を用いる。もっとも、固相から低濃度成分と高濃度成分を溶出するため、固相の極性の官能基を有する担体との関係で、固相より低濃度成分及び高濃度成分と相互作用の大きい溶媒を選択する。
本実施形態における低濃度成分及び高濃度成分、固相、第一溶媒、第二溶媒並びに押出溶媒の組み合わせは、低濃度成分と高濃度成分の種類に応じ、前述のようにして組み合わせることができる。この場合、第一溶媒の極性を調整する観点から、第一溶媒は、水溶性有機溶媒を含むのが好ましい。このような水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、アセトン及びメタノールから選択される少なくとも１種が好ましい。以下では、高濃度成分としてモノグリセリドを含み、低濃度成分としてカテキンを含む試料の場合について簡単に説明する。
モノグリセリドは、グリセリンの１つの水酸基と脂肪酸とのエステルであり、水酸基を２つ有し、カテキンは、フラバンを基本骨格の水素を４つの水酸基で置換した構造を有するため、低濃度成分の方が電荷の偏りが大きくなっている。この場合、第一溶媒は、水溶性有機溶媒と非水溶性有機溶媒との混合溶媒を用いるのが好ましい。このような非水溶性有機溶媒としては、ヘキサンなどが挙げられる。この際の水溶性有機溶媒（Ａ）と非水溶性有機溶媒（Ｃ）との重量比（Ａ／Ｃ）は、２５／７５〜２０／８０が好ましい。好ましい水溶性有機溶媒は前述のとおりである。第二溶媒は、重量比（Ａ／Ｃ）は、１０／９０〜１／９９が好ましい。溶出溶媒は、第一溶媒より極性の大きい溶媒であれば特に限定はなく、例えば、アセトン、ヘキサンとアセトンの混合溶液などが挙げられる。また、アセトンとヘキサンの混合溶液としては、アセトン（Ａ）とヘキサン（Ｈ）の容積基準の混合比（Ａ／Ｈ）が、１００／０〜５０／５０が好ましい。固相としては、極性の官能基を有する担体により構成されていればよく、市販の固相カートリッジ等を使用することができる。例えば、株式会社アイスティサイエンス製のＳｍａｒｔ−ＳＰＥ ＮＨ２、ＰＳＡなどが挙げられる。
＜第二の分析前処理方法＞
第二の分析前処理方法（以下、「第二の方法」と称する場合がある。）では、第二保持工程が、第一保持工程において供給した所定量よりも少量で、固相の見かけ容積の０％より大きく２５％以下の容積の前記試料を第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を含む試料を固相に捕捉させる捕捉工程、捕捉工程後の固相に気体を供給し、揮発成分を除去して固相を乾燥させる乾燥工程、乾燥工程後の固相に第二溶媒を供給し、夾雑物を除去する第二洗浄工程、を含む、という点で、第一の方法と異なる。
即ち、第二の方法は、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度が所定範囲に調整された分析試料を得るためのものである。そして、この分析前処理方法は、濃度の大きく異なる複数の成分を含む試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給し、相対的に低濃度の成分を固相に保持させる第一保持工程、固相に第一溶媒をさらに供給し、相対的に高濃度の成分を固相から除去する第一洗浄工程、第一保持工程において供給した所定量よりも少量で、固相の見かけ容積の０％より大きく２５％以下の容積の前記試料を第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を含む試料を固相に捕捉させる捕捉工程、捕捉工程後の固相に気体を供給し、揮発成分を除去して固相を乾燥させる乾燥工程、乾燥工程後の固相に第二溶媒を供給し、夾雑物を除去する第二洗浄工程、固相に保持された成分を押出溶媒により一斉に押し出して分析試料を得る溶出工程、を含む。ここで、この際に使用する第一溶媒は、相対的に低濃度の成分と相対的に高濃度の成分とを溶解可能であり、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を保持させない特性を有する。また、第二溶媒は、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる特性を有する。
第二の方法でも、先ず、低濃度の成分（以下、「低濃度成分」とも称する。）と高濃度の成分（以下、「高濃度成分」とも称する。）とを含む分析対象試料と第一溶媒を固相に供給して、高濃度成分は固相に保持させず、低濃度成分のみを固相に保持させる。その後、再度同じ分析対象試料を先の供給時よりも少量で、固相の見かけ容積の０％より大きく２５％以下の容積になるように固相に供給し、低濃度成分と高濃度成分を含む試料を固相に捕捉させ、乾燥工程及び第二洗浄工程を経て低濃度成分と高濃度成分を固相に保持させる。このように、高濃度成分を固相に保持させる時の試料の供給量を低濃度成分のみを固相に保持させる時よりも少なくすることで、高濃度成分の固相への保持量を少なくすることが可能になる。そのため、固相に対する低濃度成分の保持量と高濃度成分の保持量を所定範囲に調整することが可能になる。また、この際の供給量に基づいて試料に含まれる各成分の濃度を算出することが可能である。そのため、前処理後に行う測定において、前処理試料を用いて分析対象試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に測定することができる。また、高濃度成分の保持量を小さくすることから、前処理後に行う測定において、例えばガスクロマトグラムのリテンションタイムが近接するような場合でも、低濃度成分が高濃度成分の影響を受けることを低減することができ、より多くの成分の測定が可能になる。また、高濃度成分がクロマトグラフの分離カラムに大量に導入されるという事態を回避することができ、メタボローム解析のような多成分の測定を安定して行うことができる。
以下では、第二の方法に特有の事項について主として説明する。第一保持工程は、第一の方法と同じである。
第一保持工程の後に、第一洗浄工程を行う。第一洗浄工程では、固相に第一溶媒をさらに供給し、相対的に高濃度の成分を固相から除去する。このように、第一保持工程時に固相に保持されず残存している高濃度成分を固相から除去することで、低濃度成分のみを固相に存在させる。これにより、捕捉工程において固相に捕捉され、乾燥工程を経て第二洗浄工程において固相に保持される高濃度成分のみを、得られる分析試料に存在させることができる。
第一洗浄工程では、固相に第一溶媒を供給した後に気体を供給することが好ましい。これにより、固相から第一溶媒を確実に排出することができるため、捕捉工程において試料を固相により確実に捕捉することができる。また、乾燥工程において不揮発成分を固相に捕捉させつつ、揮発成分を固相からより確実に除去することができる。第一洗浄工程で使用可能な気体としては、例えば、空気、酸素、不活性ガスなどが挙げられる。不活性ガスとしては、例えば二酸化炭素、窒素や希ガスなどが挙げられる。気体の固相への供給条件は、第一溶媒を除去可能であれば特に限定はなく、例えば、２０〜４０℃の雰囲気下で、固相の見かけ容積に対して１０３〜１０４倍容積／ｍｉｎの供給速度で、２〜３０秒である。
第一洗浄工程の後に、捕捉工程を行う。捕捉工程では、第一保持工程において供給した所定量よりも少量で、固相の見かけ容積の０％より大きく２５％以下の容積の前記試料を第一洗浄工程後の固相にさらに供給し、相対的に高濃度の成分を含む試料を固相に捕捉させる。このように、固相の見かけ容積に対して所定範囲の容積となるような少量の試料を供給する場合、固相に供給した試料がそのまま留まるため、第一保持工程の場合と異なり、高濃度成分、低濃度成分、固相、溶媒の相互作用を考慮する必要はない。また、本発明では、捕捉工程で固相に供給する容量が極少量であり、その後乾燥工程を行うため、溶媒等の揮発成分は気体を供給することで揮発して除去され、高濃度成分、低濃度成分、夾雑物などの不揮発成分は固相に残存させることができる。
この時、固相に供給する試料の実施形態としては、第一保持工程において供給した所定量よりも少量で、固相の見かけ容積の０％より大きく２５％以下の容積になるようにすれば特に限定はない。例えば、液状の試料又はその希釈液の場合はそのまま用いて供給量自体を少量にして、第一保持工程の時のよりも高濃度成分の供給量が少なくなるようにしてもよいし、液状の試料を希釈した希釈液の場合は、第一保持工程の時よりも希釈倍率を大きくして、第一保持工程の時のよりも高濃度成分の供給量が少なくなるようにしてもよい。
このように、捕捉工程では、所定量の試料を固相に供給するが、所定量の試料の他に所定量の溶媒を供給してもよい。溶媒の供給の実施形態は、第一保持工程で述べたのと同様の実施形態を例示できるが、前述のように、試料を溶媒で希釈した希釈液として、試料と同時に供給するのが好ましい。捕捉工程で使用可能な溶媒としては、低濃度成分と高濃度成分を溶解可能なものであれば特に限定はない。試料を希釈液として供給する場合は、作業の簡便性の観点から、第一保持工程と同様のものを用いるのが好ましく、第一溶媒を用いることができる。
捕捉工程後に乾燥工程を行う。乾燥工程では、固相に気体を供給し、捕捉工程時に固相に供給され、滞留している少量の試料に含まれる揮発成分を揮発させて除去する。乾燥工程で使用可能な気体としては、例えば、空気、酸素、不活性ガスなどが挙げられる。このうち、二酸化炭素、窒素や希ガスなどの不活性ガスが好ましい。また、溶媒に水が含まれる場合は、水分除去の効率の観点から、乾燥処理を行った気体を用いてもよい。気体の固相への供給条件は、揮発成分を除去可能であれば特に限定はなく、例えば、２０〜４０℃の雰囲気下で、固相の見かけ容積に対して１０４〜１０５倍容積／ｍｉｎの供給速度で、１０〜６０秒である。
乾燥工程の後に、乾燥工程で除去されなかった夾雑物を除去するため、固相に第二溶媒を供給する第二洗浄工程を行う。この際の第二溶媒は、低濃度成分及び高濃度成分を固相に保持させる特性を有するものを用いる。これにより、捕捉工程において固相に捕捉された低濃度及び高濃度成分を固相との相互作用により固相に保持させるとともに、第一保持工程において保持させた低濃度成分も固相へ保持させつつ、夾雑物を固相から除去することができる。このような洗浄溶媒は、固相と低濃度成分及び高濃度成分との相互作用の関係を考慮して決定することができる。より具体的な実施形態は後述する。尚、後述するように、固相に保持された成分の誘導体化を行う場合は、非水溶媒を用いるのが好ましい。
第二洗浄工程の後、第一の方法と同様にして、溶出工程、必要に応じて定容化工程を行う。
以下では、分析対象試料に含まれる高濃度成分と低濃度成分に応じて、第二の方法の実施形態についてより詳細に説明するが、第二の方法がこれらの実施形態に限定されることはなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の形態で実施し得ることは勿論である。
（第四実施形態）
第四実施形態は、第一実施形態と同様に、試料が、相対的に高濃度の成分として、アルコール性水酸基を有する成分を含み、相対的に低濃度の成分として、カルボキシル基又はアミノ基を有する成分を含み、固相は、極性の官能基及びイオン交換性の官能基から選択される少なくとも１種の官能基を有する担体により構成されている場合である。即ち、試料中の低濃度成分としてイオン性の官能基を含み、高濃度成分として極性の官能基を含むことで電荷が低濃度成分場合の実施形態である。この場合も前述の工程により、分析前処理を行うため、本実施形態に特有の事項について以下で説明する。
本実施形態でも、アルコール性水酸基を有する成分、カルボキシル基又はアミノ基を有する成分、第一溶媒及び第二溶媒の調製、固相は、第一実施形態と同じである。
本実施形態では、第一洗浄工程において、第一溶媒を供給した後気体を供給するのが好ましい。前述のように、このように気体を供給することで、固相から第一溶媒を確実に排出することができるため、捕捉工程において試料を固相により確実に捕捉することができる。また、乾燥工程において不揮発成分を固相に捕捉させつつ、揮発成分を固相からより確実に除去することができる。第一洗浄工程で使用可能な気体、供給条件は前述のとおりである。
本実施形態では、第一洗浄工程の後、捕捉工程を行う。第一洗浄工程では、前述のように水を含む第一溶媒を用いるのが好ましい。しかし、水が固相に残存している場合、高濃度成分を固相に保持させるために試料を供給すると、水分による極性の影響により、高濃度成分と固相の相互作用に影響するため、固相に対する高濃度成分の保持が不安定になる傾向にある。ところが、本発明では、捕捉工程と乾燥工程を行うため、捕捉工程において固相と高濃度成分の相互作用を考慮する必要がなく、乾燥工程において水分を除去し、第二洗浄工程において固相と高濃度成分との相互作用により高濃度成分を固相に保持させればよい。また、後述するように、固相に保持された高濃度成分と低濃度成分を誘導体化する場合は、水分も除去可能な点で、乾燥工程は有効である。水分が誘導体化を妨げるためである。尚、本実施形態における乾燥工程で使用可能な気体及び気体の供給条件は前述のとおりである。
本実施形態では、乾燥工程終了後に、乾燥工程後に固相に残存する夾雑物を除去するため、固相に第二溶媒を供給する第二洗浄工程を行う。第二溶媒としては、低濃度成分と高濃度成分を固相に保持させることができる溶媒を用いる。このような第二溶媒としては、固相よりも低濃度成分と高濃度成分に対する相互作用が小さいものを用いればよい。例えば、第一溶媒と当該第一溶媒に含まれる水溶性有機溶媒との混合溶媒、非水溶媒等が挙げられる。非水溶媒は、後述するように誘導体化を行う場合に好適である。非水溶媒としては、例えば、水溶性有機溶媒が挙げられ、より具体的には、アセトニトリル、アセトン、メタノールなどが挙げられる。このような水溶性有機溶媒のうち、後述するように誘導体化を行う場合は水酸基を有さないものが好ましく、例えば、アセトニトリル、アセトンがより好ましい。水溶性有機溶媒を用いることで、乾燥工程で水分が若干残存した場合でも、補助的に水分を除去することができる。
試料に含まれる成分が、例えば、アミノ化合物、アミノ酸、有機酸、糖類などである場合、第一実施形態の場合と同様に、誘導体化、必要に応じてその前処理（例えば、トリメチルシリル化等）を行うのが好ましい。
本実施形態における、試料、固相及び溶媒の使用量などは、分析前処理後に行う測定に使用する分析試料の必要量などに応じて適宜決定することができる。
（第五実施形態）
第五実施形態は、第二実施形態と同様に、低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが小さく、固相が無極性の官能基を有する担体により構成されており、第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が大きくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、押出溶媒は、第一溶媒より極性が小さい場合である。
本実施形態でも、第二実施形態の場合と同じ考え方で、第一溶媒、第二溶媒、押出溶媒、固相を選択することができ、好適条件も同じである。具体例として、第二実施形態と同様に、高濃度成分としてモノグリセリドを含み、低濃度成分としてコレステロールを含む試料を前処理する場合を挙げることができる。この場合も、第二実施形態と同様に第一溶媒、第二溶媒、押出溶媒、固相を選択することができる。また、それらの好適条件も同じである。
本実施形態でも、前述のように、第一洗浄工程において、第一溶媒を供給した後気体を供給するのが好ましい。第一洗浄工程で使用可能な気体及び気体の供給条件は前述のとおりである。また、本実施形態における乾燥工程で使用可能な気体及び気体の供給条件も前述のとおりである。
（第六実施形態）
第六実施形態は、第三実施形態と同様に、低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが大きく、固相が極性の官能基を有する担体により構成されており、第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が小さくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、押出溶媒は、第一溶媒より極性が大きい場合である。
本実施形態でも、第三実施形態の場合と同じ考え方で、第一溶媒、第二溶媒、押出溶媒、固相を選択することができ、好適条件も同じである。具体例として、第三実施形態と同様に、高濃度成分としてモノグリセリドを含み、低濃度成分としてカテキンを含む試料を前処理する場合を挙げることができる。この場合も、第三実施形態と同様に第一溶媒、第二溶媒、押出溶媒、固相を選択することができる。また、それらの好適条件も同じである。
本実施形態でも、前述のように、第一洗浄工程において、第一溶媒を供給した後気体を供給するのが好ましい。第一洗浄工程で使用可能な気体及び気体の供給条件は前述のとおりである。また、本実施形態における乾燥工程で使用可能な気体及び気体の供給条件も前述のとおりである。
〔分析方法〕
本発明に係る分析方法の実施形態としては、例えば、前述のような各種の分析前処理方法により得られた分析試料を用いて、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に測定する工程を含めばよい。実施形態としては、分析前処理方法により分析試料を得る工程１、得られた分析試料を用いて試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に測定する工程２を含み、工程１と工程２を連続して直ちに行う分析方法、工程１を行った後、分析試料一旦保管し、その後、工程２を行う分析方法等が挙げられる。
成分を測定する方法としては、特に限定はなく、ガスクロマトグラフ質量分析や液クロマトグラフ質量分析などが挙げられる。また、本発明の分析方法では、その測定結果に基づいて解析を行う解析工程を含むことが好ましい。このような解析は、例えば、クロマトグラブ質量分析装置に備えられた電子計算機などにより行うことができる。
前述したような分析前処理方法を行うことで、濃度の大きく異なる複数の成分を含む試料から、各濃度が所定範囲に調整された分析試料を容易に得ることができる。そのため、この分析試料をそのまま用いることで、ガスクロマトグラフ質量分析装置などを用いて、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に測定することができる。また、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に解析することが可能なため、所望の各成分の相対的な変動などを一斉に解析することを容易に行うことができる。
（実施例１）
＜分析前処理＞
分析対象試料として、野菜ジュースを用いた。
トリメチルシリル化する誘導体化試薬として、ＭＳＴＦＡを用いた。メトキシム化する試薬として、メトキシアミンを用いた。
固相としては、強陽イオン交換性の官能基を有する担体と強陰イオン交換性の官能基を有する担体により構成された固相カートリッジ（株式会社アイスティサイエンス製、ＡｉＳＴＩ−ＳＰＥ ＡＣＸ）を用いた。
分析対象試料である野菜ジュース１０μＬと蒸留水１９０μＬ及びアセトニトリル８００μＬを混合し、３７℃で３０分間加温した後、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。得られた上澄液を試料抽出液として用いた。この試料抽出液（上澄液）は、概ね水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。試料抽出液中の分析対象とする成分は、アミノ酸、有機酸、糖類であり、高濃度成分が糖類で、低濃度成分がアミノ酸及び有機酸であることが知られている。水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液が、アミノ酸及び有機酸と糖類とを溶解可能であり、アミノ酸及び有機酸を固相に保持させ、糖類を保持させない特性を有していることは、予め確認済みである。したがって、水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液は第一溶媒として機能する。
得られた試料抽出液１００μＬ（分析対象試料としては概ね１μＬ分に相当する。）を固相カートリッジに供給した、即ち、分析対象試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸が、イオン交換の相互作用により保持される（第一保持工程）。
固相カートリッジに水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液（第一溶媒）を更に５０μＬ供給し、固相に保持されなかった成分、特に、糖類を除去した。さらに非水溶媒としてアセトニトリル１００μＬを供給し、固相に残存する水分を除去した（第一洗浄工程）。
上述の予め得られた試料抽出液（上澄液）５μＬをアセトニトリル１００μＬと混合して混合溶液を得た。この混合溶液は、概ね水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。また、使用する試料抽出液の量が第一保持工程の場合の５／１００である。水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液が、アミノ酸、有機酸及び糖類を保持させる特性を有していることは、予め確認済みである。したがって、水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液は第二溶媒として機能する。この混合液１０５μＬ（分析対象試料としては概ねμ０．０５μＬ分に相当する。）を第一洗浄工程終了後の固相に供給した、即ち、第一保持工程において供給した所定量よりも少量の分析対象試料と、第二溶媒とを第一洗浄工程後の固相にさらに供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が保持され、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸及び糖類が保持される（第二保持工程）。
第二保持工程終了後に、非水溶媒であるアセトニトリル１００μＬを供給し、固相に保持されなかった成分及び水分を除去した（第二洗浄工程）。
第二洗浄工程終了後に、メトキシアミン５μＬ及びＭＳＴＦＡ２５μＬを固相に供給し、固相に保持されている成分と反応させ、メトキシム化及びトリメチルシリル化を行った。これにより、固相に保持された成分の誘導体化物が固相から遊離する（誘導体化工程）。
誘導体化工程終了後、固相に押出溶媒としてヘキサン１００μＬを供給し、誘導体化された糖類、アミノ酸及び有機酸を固相から一斉に押出して分析試料を得た（押出工程）。
押出工程終了後、分析試料に押出溶媒であるヘキサン４００μＬ添加し、定容化した（定容化工程）。定容化した分析試料を後述の測定用試料として用いた。
＜成分の測定＞
分析前処理で得られた測定用試料を１０μＬ用い、ガスクロマトグラフ質量分析装置を用いて測定した。この時の測定条件は、下記のとおりとした。この際のクロマトグラムを図１に示す。このクロマトグラムは、糖類は前述の試料抽出液（上澄液）５μＬ（分析対象試料（野菜ジュース）としては、概ねμ０．０５μＬ分に相当する。）、有機酸及びアミノ酸は同試料抽出液１０５μＬ（分析対象試料（野菜ジュース）としては、概ね１．０５μＬ分に相当する。）に含まれる量を反映したものである。
［ＧＣ−ＭＳ分析条件］
PTV Injector ： LVI-S250（AiSTI Science co.ltd.）；Stomach Insert
Injector Temp. ： 70℃（0.4min）−120℃／min−240℃−50℃／min−300℃（15min）
Auto Samplor ： Agilent 7683 （Agilent co.ltd.）；50μL Syringe
Injection Volume ： 10μL
GC/MSMS ： Agilent 7890B
Column ： DB-5ms，0.25 mm i.d. × 30m，df；0.25μm
Column Oven Temp. ： 60℃（4min）−20℃／min−310℃（4min）
Inlet Mode ： Solvent Vent Mode
Vent ： 70kPa，150mL/min，0.1min
Parge Flow ： 50mL／min，4min
Constant Flow ： 1.2mL/min
MS ： Agilent 5975C
Detector Temp. ： 280℃
Ion Souce Temp. ： 250℃
MS Method ： SCAN m/z50−450
図１中の番号１〜１３が、それぞれ、（１）リンゴ酸（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、（２）アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、（３）アミノ酪酸（ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、（４）グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、（５）フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、（６）アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、（７）クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）、（８）フルクトース（ｆｌｕｃｔｏｓｅ）、（９）フルクトース（ｆｌｕｃｔｏｓｅ）、（１０）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、（１１）グルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、（１２）スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）のトリメチルシリル（ＴＭＳ）化化合物に対応する。図１に示すように、本発明の分析前処理方法を採用することで、高濃度成分である糖類と、低濃度成分であるアミノ酸及び有機酸を同時に一斉に測定できていることが分かる。尚、（９）と（１０）のフルクトースはそれぞれ異性体である。
（実施例２）
＜分析前処理＞
分析対象試料として、フルーツジュースを用いた。トリメチルシリル化及びメトキシム化する試薬並びに固相は、実施例１と同じものを用いた。
分析対象試料であるフルーツジュース２０μＬと蒸留水１８０μＬ及びアセトニトリル８００μＬを混合し、３７℃で３０分間加温した後、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。得られた上澄液を試料抽出液として用いた。この試料抽出液（上澄液）は、概ね水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。試料抽出液中の分析対象とする成分は、アミノ酸、有機酸、糖類であり、高濃度成分が糖類で、低濃度成分がアミノ酸及び有機酸であることが知られている。実施例２でも、水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液が第一溶媒として機能する。
得られた試料抽出液（上澄液）１００μＬ（分析対象試料としては概ね２μＬ分に相当する。）を固相カートリッジに供給した、即ち、分析対象試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸が、イオン交換の相互作用により保持される（第一保持工程）。
固相カートリッジに水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液（第一溶媒）を更に５０μＬ供給し、固相に保持されなかった成分、特に、糖類を除去した。さらに非水溶媒としてアセトニトリル１００μＬを供給し、固相に残存する水分を除去した（第一洗浄工程）。
上述の予め得られた試料抽出液（上澄液）１μＬをアセトニトリル１００μＬと混合して混合液を得た。この混合液は、概ね水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。また、使用する試料抽出液の量が第一保持工程の場合の１／１００である。尚、水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液は第二溶媒として機能する。この混合液１０１μＬ（分析対象試料としては概ねμ０．０２μＬ分に相当する。）を第一洗浄工程終了後の固相に供給した、即ち、第一保持工程において供給した所定量よりも少量の分析対象試料と、第二溶媒とを第一洗浄工程後の固相にさらに供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が保持され、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸及び糖類が保持される（第二保持工程）。
第二保持工程終了後に、非水溶媒であるアセトニトリル１００μＬを供給し、固相に保持されなかった成分及び水分を除去した（第二洗浄工程）。
第二洗浄工程終了後に、メトキシアミン５μＬ及びＭＳＴＦＡ２５μＬを固相に供給し、固相に保持されている成分と反応させ、メトキシム化及びトリメチルシリル化を行った。これにより、固相に保持された成分の誘導体化物が固相から遊離する（誘導体化工程）。
誘導体化工程終了後、固相に押出溶媒としてヘキサン１００μＬを供給し、誘導体化された糖類、アミノ酸及び有機酸を固相から一斉に押出して分析試料を得た（押出工程）。
押出工程終了後、分析試料に押出溶媒であるヘキサン４００μＬ添加し、定容化した（定容化工程）。定容化した分析試料を測定用試料として用いた。
＜成分の測定＞
分析前処理で得られた測定用試料を１０μＬ用い、実施例１と同様にして、ガスクロマトグラフ質量分析装置を用いて測定した。この際のクロマトグラムを図２、３に示す。このクロマトグラムは、糖類は前述の試料抽出液（上澄液）１μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ねμ０．０２μＬ分に相当する。）、有機酸及びアミノ酸は同試料１０１μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ねμ２．０２μＬ分に相当する。）に含まれる量を反映したものである。尚、図２、３中の（iii）で示すクロマト
グラムが実施例２の結果である。
図２、３中の番号１〜１４が、それぞれ、（１）プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、（２）セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、（３）スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、（４）リンゴ酸（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、（５）アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、（６）アミノ酪酸（ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、（７）グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、（８）酒石酸（Ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）（９）アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、（１０）クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）、（１１）フルクトース（ｆｌｕｃｔｏｓｅ）、（１２）フルクトース（ｆｌｕｃｔｏｓｅ）、（１３）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、（１４）グルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）のトリメチルシリル（ＴＭＳ）化化合物に対応する。尚、（１２）と（１３）のフルクトースはそれぞれ異性体である。
（比較例１）
＜分析前処理＞
分析対象試料として、実施例２と同じフルーツジュースを用いた。トリメチルシリル化及びメトキシム化する試薬並びに固相は、実施例２と同じものを用いた。
分析対象試料であるフルーツジュース１００μＬと蒸留水１００μＬ及びアセトニトリル８００μＬを混合し、３７℃で３０分間加温した後、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。得られた上澄液を試料抽出液として用いた。試料抽出液（上澄液）２０μＬとアセトニトリル４００μＬと混合し、希釈溶液を得た。尚、試料抽出液（上澄液）は、概ね水２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。また、試料抽出液（上澄液）２０μＬとアセトニトリル４００μＬと混合した希釈溶液は、水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。この希釈溶液４２０μＬ（分析対象試料としては概ね２μＬ分に相当する。）を固相に供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が保持され、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸及び糖類が保持される。
この後、実施例２の「第二洗浄工程」、「誘導体化工程」、「押出工程」、「定容化工程」と同様の工程を行って、測定用試料を得た。
＜成分の測定＞
分析前処理で得られた測定用試料を１０μＬ用い、実施例２と同様にして、ガスクロマトグラフ質量分析装置を用いて測定した。この際のクロマトグラムを図２、３に示す。このクロマトグラムは、糖類、有機酸及びアミノ酸は試料４２０μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ね２μＬ分に相当する。）に含まれる量を反映したものである。尚、図２、３中の（ｉ）で示すクロマトグラムが比較例１の結果である。
（比較例２）
＜分析前処理＞
分析対象試料として、実施例２と同じフルーツジュースを用いた。トリメチルシリル化及びメトキシム化する試薬並びに固相は、実施例２と同じものを用いた。
分析対象試料であるフルーツジュース２０μＬと蒸留水１８０μＬ及びアセトニトリル８００μＬを混合し、３７℃で３０分間加温した後、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。得られた上澄液を試料抽出液として用いた。試料抽出液（上澄液）１μＬとアセトニトリル４００μＬと混合し、希釈溶液を得た。尚、試料抽出液（上澄液）は、水２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。また、試料抽出液（上澄液）２０μＬとアセトニトリル４００μＬと混合した溶液は、水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。この希釈溶液４０１μＬ（分析対象試料としては概ね０．０２μＬ分に相当する。）を固相に供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が保持され、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸及び糖類が保持される。
この後、実施例２の「第二洗浄工程」、「誘導体化工程」、「押出工程」、「定容化工程」と同様の工程を行って、測定用試料を得た。
＜成分の測定＞
分析前処理で得られた測定用試料を１０μＬ用い、実施例２と同様にして、ガスクロマトグラフ質量分析装置を用いて測定した。この際のクロマトグラムを図２、３に示す。このクロマトグラムは、糖類、有機酸及びアミノ酸は試料４０１μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ね０．０２μＬ分に相当する。）に含まれる量を反映したものである。尚、図２、３中の（ii）で示すクロマトグラムが比較例２の結果である。
図２、３の（iii）に示すように、本発明の分析前処理方法を採用することで、高濃度
成分である糖類と低濃度成分であるアミノ酸及び有機酸を同時に一斉に測定することができることが分かる。一方、図２、３の（ｉ）に示すように、比較例１では、低濃度成分であるアミノ酸と有機酸は測定可能であるが、大量の糖類が存在するため、糖類に相当する部分は、ピーク形状が崩れて分析できないことが分かる。また、図２、３の（ii）に示すように、比較例２では、高濃度成分である糖類は測定可能であるが、アミノ酸及び有機酸に相当する部分は、濃度が低すぎるため、ピークの検出が不安定で分析できないことが分かる。
（実施例３）
＜分析前処理＞
分析対象試料として、フルーツジュースを用いた。
トリメチルシリル化する誘導体化試薬として、ＭＳＴＦＡを用いた。メトキシム化する試薬として、メトキシアミン／ピリジンを用いた。
固相としては、強陽イオン交換性の官能基を有する担体と強陰イオン交換性の官能基を有する担体により構成された固相カートリッジ（株式会社アイスティサイエンス製、ＡｉＳＴＩ−ＳＰＥ ＡＣＸ）を用いた。固相カートリッジの担体部分の見かけ容積は１０μＬである。
分析対象試料であるフルーツジュース２０μＬと蒸留水１８０μＬ及びアセトニトリル８００μＬを混合し、３７℃で３０分間加温した後、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。得られた上澄液を試料抽出液として用いた。この試料抽出液（上澄液）は、概ね水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。試料抽出液中の分析対象とする成分は、アミノ酸、有機酸、糖類であり、高濃度成分が糖類で、低濃度成分がアミノ酸及び有機酸であることが知られている。水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液が、アミノ酸及び有機酸と糖類とを溶解可能であり、アミノ酸及び有機酸を固相に保持させ、糖類を保持させない特性を有していることは、予め確認済みである。したがって、水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液が第一溶媒として機能する。
得られた試料抽出液（上澄液）１００μＬ（分析対象試料としては概ね２μＬ分に相当する。）を固相カートリッジに供給した、即ち、分析対象試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸が、イオン交換の相互作用により保持される（第一保持工程）。
固相カートリッジに水を２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液（第一溶媒）を更に５０μＬ供給し、固相に保持されなかった成分、特に、糖類を除去した。更に空気を２５℃雰囲気下、５０ｍＬ／ｍｉｎで５秒間、固相カートリッジに供給し、第一溶媒を除去した（第一洗浄工程）。
試料抽出液（上澄液）１μＬ（分析対象試料としては概ね０．０２μＬ分に相当する。固相の見かけ容積の１０％に相当する。）を固相に供給した、即ち、第一保持工程において供給した所定量よりも少量の分析対象試料と第一溶媒を固相に供給した。これにより、試料抽出液が固相に捕捉される（捕捉工程）。本例では、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸が、イオン交換の相互作用により保持されるが、糖類は試料抽出液中の第一溶媒との関係で固相との相互作用を生じないが、固相に存在し得る。
捕捉工程終了後に、窒素を２５℃雰囲気下、５００ｍＬ／ｍｉｎで３０秒間、固相カートリッジに供給し、固相を乾燥させる（乾燥工程）。これにより、第一溶媒などの揮発成分が除去され、第一溶媒等に含まれる水分も固相から除去可能なため、後に行う誘導体化における水分の影響を抑制することができる。
乾燥工程終了後に、第二溶媒として非水溶媒であるアセトニトリル１００μＬを供給した（第二洗浄工程）。これにより、アミノ酸、有機酸、糖類を固相に保持させつつ夾雑物を除去した。尚、アセトニトリルは水溶性有機溶媒であるため、乾燥工程において水分が若干残存していたとしても、第二溶媒によっても除去が可能である。
第二洗浄工程終了後に、メトキシアミン／ピリジン混合液５μＬを固相に供給して固相に保持されている成分と反応させメトキシム化を行った後、ＭＳＴＦＡ２５μＬを固相に供給し、メトキシム化した各成分のトリメチルシリル化を行った。これにより、固相に保持された成分の誘導体化物が固相から遊離する（誘導体化工程）。
誘導体化工程終了後、固相に押出溶媒としてヘキサン１００μＬを供給し、誘導体化された糖類、アミノ酸及び有機酸を固相から一斉に押出して分析試料を得た（押出工程）。
押出工程終了後、分析試料に押出溶媒であるヘキサン４００μＬ添加し、定容化した（定容化工程）。定容化した分析試料を測定用試料として用いた。
＜成分の測定＞
分析前処理で得られた測定用試料を１０μＬ用い、ガスクロマトグラフ質量分析装置を用いて測定した。この時の測定条件は、下記のとおりとした。この際のクロマトグラムを図４、５に示す。このクロマトグラムは、糖類は前述の試料抽出液（上澄液）１μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ねμ０．０２μＬ分に相当する。）、有機酸及びアミノ酸は同試料１０１μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ねμ２．０２μＬ分に相当する。）に含まれる量を反映したものである。尚、図４、５中の（iii）で示すクロマトグラムが実施例３の結果である。
［ＧＣ−ＭＳ分析条件］
実施例１と同じである。
図４、５中の番号１〜１４が、それぞれ、（１）プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、（２）セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、（３）スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、（４）リンゴ酸（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、（５）アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、（６）アミノ酪酸（ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、（７）グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、（８）酒石酸（Ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）（９）アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、（１０）クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）、（１１）フルクトース（ｆｌｕｃｔｏｓｅ）、（１２）フルクトース（ｆｌｕｃｔｏｓｅ）、（１３）グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、（１４）グルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）のトリメチルシリル（ＴＭＳ）化化合物に対応する。尚、（１１）と（１２）のフルクトースはそれぞれ異性体である。
（比較例３）
＜分析前処理＞
分析対象試料として、実施例３と同じフルーツジュースを用いた。トリメチルシリル化及びメトキシム化する試薬並びに固相は、実施例３と同じものを用いた。
分析対象試料であるフルーツジュース１００μＬと蒸留水１００μＬ及びアセトニトリル８００μＬを混合し、３７℃で３０分間加温した後、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。得られた上澄液を試料抽出液として用いた。試料抽出液（上澄液）２０μＬとアセトニトリル４００μＬと混合し、希釈溶液を得た。尚、試料抽出液（上澄液）は、概ね水２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。また、試料抽出液（上澄液）２０μＬとアセトニトリル４００μＬと混合した希釈溶液は、水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。この希釈溶液４２０μＬ（分析対象試料としては概ね２μＬ分に相当する。）を固相に供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が保持され、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸及び糖類が保持される。
次に、アセトニトリル１００μＬを供給し、固相に保持されなかった成分及び水分等を除去した。この後、実施例３の、「誘導体化工程」、「押出工程」、「定容化工程」と同様の工程を行って、測定用試料を得た。
＜成分の測定＞
分析前処理で得られた測定用試料を１０μＬ用い、実施例３と同様にして、ガスクロマトグラフ質量分析装置を用いて測定した。この際のクロマトグラムを図４、５に示す。このクロマトグラムは、糖類、有機酸及びアミノ酸は試料４２０μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ね２μＬ分に相当する。）に含まれる量を反映したものである。尚、図４、５中の（ｉ）で示すクロマトグラムが比較例３の結果である。
（比較例４）
＜分析前処理＞
分析対象試料として、実施例３と同じフルーツジュースを用いた。トリメチルシリル化及びメトキシム化する試薬並びに固相は、実施例３と同じものを用いた。
分析対象試料であるフルーツジュース２０μＬと蒸留水１８０μＬ及びアセトニトリル８００μＬを混合し、３７℃で３０分間加温した後、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。得られた上澄液を試料抽出液として用いた。試料抽出液（上澄液）１μＬとアセトニトリル２０μＬと混合し、希釈溶液を得た。尚、試料抽出液（上澄液）は、水２０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。また、試料抽出液（上澄液）１μＬとアセトニトリル２０μＬと混合した溶液は、水を１．０ｖｏｌ％含む水−アセトニトリル溶液中に分析対象となる成分が溶解した溶液である。この希釈溶液２１μＬ（分析対象試料としては概ね０．０２μＬ分に相当する。）を固相に供給した。これにより、強陽イオン交換性の官能基を有する担体にアミノ酸が保持され、強陰イオン交換性の官能基を有する担体に有機酸及び糖類が保持される。
この後、比較例３と同様にして、測定用試料を得た。
＜成分の測定＞
分析前処理で得られた測定用試料を１０μＬ用い、実施例３と同様にして、ガスクロマトグラフ質量分析装置を用いて測定した。この際のクロマトグラムを図４、５に示す。このクロマトグラムは、糖類、有機酸及びアミノ酸は試料２１μＬ（分析対象試料（フルーツジュース）としては概ね０．０２μＬ分に相当する。）に含まれる量を反映したものである。尚、図４、５中の（ii）で示すクロマトグラムが比較例４の結果である。
図４、５の（iii）に示すように、本発明の分析前処理方法を採用することで、高濃度成分である糖類と低濃度成分であるアミノ酸及び有機酸を同時に一斉に測定することができることが分かる。一方、図４、５の（ｉ）に示すように、比較例３では、低濃度成分であるアミノ酸と有機酸は測定可能であるが、大量の糖類が存在するため、糖類に相当する部分は、ピーク形状が崩れて分析できないことが分かる。また、図４、５の（ii）に示すように、比較例４では、高濃度成分である糖類は測定可能であるが、アミノ酸及び有機酸に相当する部分は、濃度が低すぎるため、ピークの検出が不安定で分析できないことが分かる。

Claims (20)

  1. 試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分の各濃度が所定範囲に調整された分析試料を得るための分析前処理方法であって、
    濃度の大きく異なる複数の成分を含む試料と第一溶媒とをそれぞれ所定量固相に供給し、相対的に低濃度の成分を固相に保持させる第一保持工程、
    固相に第一溶媒をさらに供給し、相対的に高濃度の成分を固相から除去する第一洗浄工程、
    第一保持工程において供給した所定量よりも少量の前記試料と、第二溶媒とを第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を固相に保持させる第二保持工程、
    固相に保持された成分を押出溶媒により一斉に押し出して分析試料を得る溶出工程、
    を含み、
    試料に含まれる相対的に低濃度の成分と相対的に高濃度の成分とで電荷の偏りがあり、
    固相は、極性の官能基及びイオン交換性の官能基から選択される少なくとも１種の官能基の担体、又は、無極性の担体により構成されており、
    第一溶媒は、相対的に低濃度の成分と相対的に高濃度の成分とを溶解可能であり、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を保持させない極性を有し、
    第二溶媒は、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有する、分析前処理方法。
  2. 第二溶媒は、第一溶媒と、これとは異なる溶媒との混合溶媒である請求項１記載の分析前処理方法。
  3. 第一溶媒が、水溶性有機溶媒と水とを含む混合溶媒であり、第二溶媒が、第一溶媒と、当該第一溶媒に含まれる水溶性有機溶媒との混合溶媒である請求項１又は２に記載の分析前処理方法。
  4. 第一溶媒の水溶性有機溶媒（Ａ）と水（Ｂ）との重量比（Ａ／Ｂ）が９／１〜０／１であり、第二溶媒の比（Ａ／Ｂ）が５００／１〜２０／１である請求項３記載の分析前処理方法。
  5. 第一洗浄工程においてさらに非水溶媒を供給し、
    第二保持工程終了後に、非水溶媒を供給する第二洗浄工程を含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の分析前処理方法。
  6. 低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが小さく、固相が無極性の官能基を有する担体により構成されており、
    第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、
    第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が大きくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、
    押出溶媒は、第一溶媒より極性が小さい、請求項１又は２に記載の分析前処理方法。
  7. 低濃度の成分が高濃度の成分よりも電荷の偏りが大きく、固相が極性の官能基を有する担体により構成されており、
    第一溶媒は、低濃度の成分を固相に保持させ、高濃度の成分を固相に保持させない極性を有し、
    第二溶媒は、第一溶媒と該第一溶媒よりも極性が小さくなる溶媒との混合溶媒であって、低濃度の成分と高濃度の成分とを固相に保持させる極性を有し、
    押出溶媒は、第一溶媒より極性が大きい、請求項１又は２に記載の分析前処理方法。
  8. 第一溶媒が水溶性有機溶媒を含む請求項６又は７に記載の分析前処理方法。
  9. 第二保持工程が、
    第一保持工程において供給した所定量よりも少量で、固相の見かけ容積の０％より大きく２５％以下の容積の前記試料を第一洗浄工程後の固相に供給し、相対的に高濃度の成分を含む試料を固相に捕捉させる捕捉工程、
    捕捉工程後の固相に気体を供給し、揮発成分を除去して固相を乾燥させる乾燥工程、
    乾燥工程後の固相に第二溶媒を供給し、夾雑物を除去する第二洗浄工程、
    を含む、請求項１記載の分析前処理方法。
  10. 第一洗浄工程において、第一溶媒の後に気体を供給する、請求項９記載の分析前処理方法。
  11. 溶出工程の前に、前記固相に誘導体化試薬を供給し、固相に保持された成分を誘導体化するとともに固相から遊離させる誘導体化工程を含み、
    溶出工程が、誘導体化工程終了後に、前記固相に押出溶媒を供給し、誘導体化された成分を固相から一斉に押出して分析試料を得る工程である請求項１〜５、９、１０の何れか１項に記載の分析前処理方法。
  12. 第一溶媒が、水溶性有機溶媒と水とを含む混合溶媒である請求項９〜１１の何れか１項に記載の分析前処理方法。
  13. 第一溶媒の水溶性有機溶媒（Ａ）と水（Ｂ）との重量比（Ａ／Ｂ）が９／１〜０／１である請求項１２記載の分析前処理方法。
  14. 前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、アセトン及びメタノールから選択される少なくとも１種である請求項３〜５、８、１２、１３の何れか１項に記載の分析前処理方法。
  15. 前記試料が、相対的に高濃度の成分として、アルコール性水酸基を有する成分を含み、相対的に低濃度の成分として、カルボキシル基又はアミノ基を有する成分を含み、
    前記固相が、極性の官能基及びイオン交換性の官能基から選択される少なくとも１種の官能基を有する担体により構成されている、請求項１〜１４の何れか１項に記載の分析前処理方法。
  16. 試料に含まれるアルコール性水酸基を有する成分が、糖質であり、試料に含まれる相対的に低濃度の成分が、アミン化合物、アミノ酸及び有機酸から選択される少なくとも１種である請求項１５に記載の分析前処理方法。
  17. 前記固相が、イオン交換性の官能基として、電荷の異なる複数のイオン交換性の官能基を有する請求項１５又は１６に記載の分析前処理方法。
  18. 前記イオン交換性の官能基が強イオン交換性の官能基である請求項１７に記載の分析前処理方法。
  19. 試料に含まれる高濃度の成分と低濃度の成分の濃度の比（高濃度／低濃度）が２０以上である請求項１〜１８の何れか１項に記載の分析前処理方法。
  20. 請求項１〜１９の何れか１項に記載の分析前処理方法により得られた分析試料を用いて、試料に含まれる濃度の大きく異なる複数の成分を一斉に測定する工程を含む分析方法。


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