WO2015165434A1 - Verfahren zur isolierung von spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen probe - Google Patents

Verfahren zur isolierung von spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen probe Download PDF

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WO2015165434A1
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mobile solid
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Sven Goethel
Viorel Rusu
Erik RUIJTERS
Tim Welten
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Magnamedics Gmbh
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    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G01N2030/143—Preparation by elimination of some components selective absorption

Definitions

  • the invention relates to a method and a kit for sample preparation for the isolation of trace components in the analysis and diagnostics of a liquid biological sample by depletion of high molecular weight
  • Liquid biological materials such as whole blood, serum, saliva, urine or plasma and other clinically relevant fluids are typically assayed for the quantitative content of low molecular weight organic compounds by immunoassays, particularly ELISA assays, to record disease progression, a disease altogether first to diagnose or to determine the drug level.
  • Trace components to be analyzed may be naturally occurring compounds (for example, vitamins or metabolic metabolites), but also exogenously administered substances such as drugs or drugs.
  • Bio samples as used for example in forensics and in the
  • Contain compounds as ingredients Some of these compounds are regarded as constituents of samples as a "quasi" matrix, i.e. they have similar properties as the trace components.
  • the trace components are present in pending analyzes most of the time in a low concentration in the samples. Therefore, it should be possible, depending on the origin of the samples and the analytical objectives, the biological samples but also drug analyzes in different
  • the object of the invention is to provide a method for sample preparation with positive selection of trace components in negative selection of abundant compound of a sample using magnetic particles or magnetic particles for sample preparations.
  • the object is achieved by a method and a kit for
  • Sample preparation including the following features:
  • the present invention relates to a method of isolating trace components in biological samples, wherein depletion of various types of compounds (1) and (2) can occur.
  • Compounds (1) may include, for example, abundant proteins.
  • applications that are carried out in the area of sample preparation in the kit-based format are also possible.
  • the kit-based format are also possible.
  • present invention selectively isolating trace components in the presence of a high protein matrix (e.g., hormones,
  • Vitamins especially vitamin D, immunosuppressants, mycotoxins etc.
  • silica particles especially silica particles with magnetic nuclei.
  • the invention is directed to the field of sample preparation for UHPLC, HPLC, LC / MS, LC / MS /, MS, capillary LC, capillary electrophoresis, immunoassays including ELISA and other assays directed to Sample preparation procedures for the detection of trace components and / or low molecular weight compounds are designed for analyzes in complex clinical and non-clinical samples.
  • Clinical samples according to the invention are directed to homogenized tissue, whole blood, cell culture, plasma, serum, urine, saliva, tears, spinal fluid, tissue fluid, amniotic fluid, follicular fluid and hemolyzed blood.
  • Non-clinical samples are directed at food, drinks,
  • compounds (1) and compounds (2) can be easily and quickly depleted or separated from the biological fluids by the process according to the invention without the
  • Compositions or the amounts of trace components from the sample to be changed This is true at least in the event that the trace components are not concentrated in a final clean-up step.
  • Compounds (1) and (2) which can be depleted and / or separated in the context of the present invention can be, for example, serum albumins, immunoglobulins, fibrinogen, regulator proteins.
  • the inventive method allows for analysis of the corresponding target compounds such as
  • tissue samples biopsy
  • body fluid blood, plasma
  • a high significance for existing amounts or their increase / decrease is achieved.
  • Depletion of a compound means in the context of the method according to the invention a reduction of high molecular weight compounds (1) from a biological sample.
  • a mobile solid phase support for example of magnetic silica, preferably of mesoporous silica but also polystyrene, melamine, polymethacrylate, polyamide, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyacrylamide, agarose, chitin, Dextran, rubber and polyvinyl alcohol may be made.
  • a mobile solid phase support for example of magnetic silica, preferably of mesoporous silica but also polystyrene, melamine, polymethacrylate, polyamide, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyacrylamide, agarose, chitin, Dextran, rubber and polyvinyl alcohol may be made.
  • separation according to the invention is meant the binding of compounds (2) to mobile solid phase carriers.
  • the mobile solid phase carriers can have different configurations as those used for
  • the further purification of biological samples in addition to the compounds (1) and (2) involves the isolation of trace components which can be carried out by selective and reversible binding to mobile solid phase support, for example in the form of silica gel particles, which may have a surface-modified structure ,
  • silica particles can be used as mobile
  • the silica particles can be single or multiple types of Surface structures include, wherein the binding of the trace components to the mobile solid phase support by ionic, hydrophobic, ⁇ - ⁇
  • the mobile solid phase carrier magnetic particles for example, in the core and include at the
  • the silica gel particles in this case have pores whose size is in the range of 2 to 50 nm, preferably 5 to 30 nm and whose inner surface is a range of 0.1 to 400 m 2 / g, preferably 10 to 200 m 2 / g includes.
  • the particles have a diameter in the range from 20 nm to 500 ⁇ m, preferably from 50 nm to 100 ⁇ m, in particular preferably from 100 nm to 10 ⁇ m.
  • protic and aprotic polar organic solvents are used for binding and / or elution. These generally have a dipole moment in the range of 1.6 to 4.0 Debye, preferably from 1.69 to 3.96 Debye.
  • polar organic solvents are, for example, but not finally mentioned: acetonitrile, ethanol, methanol, propanol, isopropanol, n-propanol, isobutanol and n-butanol, as well as acetone, dimethyl sulfoxide and polyethylene glycol (PEG).
  • the polar organic solvents may be used singly or in admixture.
  • the mixtures are for example adjusted so that alcohols such as ethanol and iso-propanol in different proportions by weight or acetonitrile are combined with an alcohol such as iso-propanol or ethanol or combinations of alcohols such as ethanol and iso-propanol with different proportions by weight with eg acetonitrile.
  • Solvents such as hexane are taken up by liquid-liquid extraction and after subsequent evaporation of the solvent, the residue can be taken up in a suitable polar solvent such as methanol or acetonitrile.
  • Cardiovascular such as amiodarone, digoxin, digitoxin, flecainide, lidocaine, N-acetylprocainamide, procainamide, propranolol,
  • Immunosuppressants such as acebutolol, ajmaline, desethylamiodarone, approdine, atenolol, bisopropol, quinidine, diltiazem, disopyramide, dronedarone, flecainide, flunarizine, gallopamil, sotalol, tocainide, verapamil, norverapamil, for the central nervous system, such as carbamazepine, carbamazepine-10, 11-exopid, carbamazepine-diol, 10-OH carbamazepine, ethosuximide, felbamate, phenobarbital, free carbamazepine, free phenytoin, free primodone, free valproic acid, gabapetine, lacosamide, lamotrigine, levetiracetam,
  • Antibiotics such as vancomycin, amikacin, chloramphenicol, gentamicin,
  • Kanamycin metilmicin, streptomycin
  • Antifungals such as itraconazole, fluconazole, posaconazole, voriconazole, 5-flucytosine, hydroxy-itraconazole,
  • Antidepressants such as O-desmethyl venlafaxine, mirtazapine, venlafaxine,
  • Citalopram Paroxetine, Desmethyl Fluoxetine, Fluoxetine, Fluvoxamine, Duloxetine, Sertraline, N-Desmethyl Setralin, Methylphenidate / Ritalin, Reboxetine, Trazodone, Mianserin, Atomoxetine,
  • Neuroleptics such as N-desmethyl olanzapine, olanzapine, 9-OH risperidone, risperidone, haloperidol, quetiapine, clozapi, N_Desemethyl clozapine, aripiprazole, amisulpride, pipamerone, promethazine, levomepromazine, perazine, chlorprothixin ziprasidone, tricyclic antidepressants such as amitriptyline, chlorpromazine, cyclobenzaprine, Clozapine, norclozapine, doxepin, perphenazine, imipramine, clomipramine,
  • Benzodiazepines such as aminoclonazepam, aminoflunitrazepam,
  • Hydroxyalprazolam Hydroxytriazolam, Brotizolam, Clobazam, Clonazepam, Chlordiazepoxide, Clorazepate, Clotiazepam, Cloxazolam, Diazepam, Ketazolam, Midazolam, Nordiazepam, Oxazepam, Prazepam, Temazepam, Tetrazepam, Zolpidem, Alprazolam, Bromazepam, Flunitrazepam, Flurazepam, Lorazepam, Lormetazepam, Nitrazepam, triazolam,
  • Drugs such as amphetamine, barbiturate, cannabinoids, cocaine,
  • Lysergic acid diethylamide, morphine, opiates, propoxyphene, fentanyl, sufentanyl, ephedrine, ethyl glucuronide,
  • Hormones Female Estrogen, Male Estrogen, Male Testosterone
  • Female Testosterone Female Testosterone
  • Female Progesterone Male Progesterone
  • Steroids Such As Cortisol, ACTH, Aldosterone, Dehydroepiandrostenedione (DHEA), Dehydroepiandrostenedione sulfate (DHEAS), androstenedione, 17-OH
  • vitamin B vitamins such as vitamin B1, vitamin B6,
  • Metabolites such as methylmalonic acid, folic acid, arachidonic acid, prostaglandin E2, homocysteine,
  • Catecholamines such as noradrenalin (norepinephrine), adrenaline (epinephrine), dopamine, serotonin, tumor markers, psychotropic drugs, cardiovascular drugs, insecticides, pesticides, fungicides, antibodies, vasopressin, oxytocin,
  • Thyroglobulin calcitonin, catecholamine, parathyroid hormone, aldesterone, renin, angiotensin, cortisone, desoxycorticosterone, androsterone, pregnenolone, estrone, estradiol, estriol, FSH, gonadotropin, tacrolimus, everolimus, MPA, insulin, anti-insulin antibodies, glucagon, gastrin, Secretin, AMP, GMP, MMP 20, ZAP 1, ZAP 2, ZAP 3, prostaglandins, thromboxane, erythropoietin, histamine, primidone, acetazolamide, sultiam, glutethimide, pentobarbital, secobarbital, bupivacaine, mepivacaine, quinidine, amikacin, gentamicin, tobramycin,
  • the mobile solid phase support can silica particles or silica particles, which can be configured with at least one magnetic core.
  • the particles that can be loaded with silica gel include functional groups such as -OH, -COOH, -NH 2 , R-SO 2 -OH, -NH 2 ; -RNH, -R 2 N, alkyl such as .CHa, -C 2 H 5 , -C 4 H 9 , -C 8 H 17) -C 9 H 19 , -C 10 H 21) -
  • interactions are achieved, which can ensure an optionally reversible binding of the compounds (1) and (2) and / or trace components on the surface of the mobile solid phase support.
  • These include ionic interactions, hydrogen bonds, hydrophobic interactions, ⁇ - ⁇ interactions, and metal-ion interactions.
  • the abovementioned interactions in particular when using polar solvents, permit induced adhesion of the compounds (1) and (2) and / or the trace components on the surface of the mobile solid phase supports.
  • the coating of iron oxide-containing particles with silica gel for the process according to the invention can be carried out, for example, as follows:
  • a suspension of iron oxide-containing particles in an alcohol e.g., isopropanol
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • Coating can be controlled by the amount of tetraethyl orthosilicate added.
  • the coated iron oxide-containing particles are washed with an alcohol (eg methanol) and stored in water.
  • an alcohol eg methanol
  • silica gel particles as mobile solid phase carriers, which consist of a mesoporous layer which is applied to the magnetic core and has a layer thickness in the range from 10 to 100 nm.
  • Magnetic Cores for the Mobile Solid Phase Carriers of the Invention Silica gel particles can be known per se from iron oxide (Fe 2 O 3 or Fe30 4 ) and include a surrounding layer, for example
  • Silica but also polystyrene, melamine, polymethacrylate, polyamide, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyester, polycarbonate,
  • Polyacrylamide Polyacrylamide, agarose, chitin, dextran, rubber and polyvinyl alcohol.
  • Iron oxide particles having a mesoporous silica gel coating are preferably used for the process according to the invention.
  • silica gel particles are preferred which consist of a
  • mesoporous layer coated on the magnetic core having a layer thickness in the range of 10 to 100 nm, wherein the magnetic cores maghemite and / or magnetite in the range of 30 to 95 wt% and have a mean diameter in the range of 20 nm to 500 pm, preferably from 200 nm to 10 pm, particularly preferably from 300 nm to 5 pm.
  • the method according to the invention can be carried out in such a way that a selective and / or reversible binding of the compounds (1) and (2) to the mobile solid phase carriers takes place, i. a binding of compounds (1) and (2) to a mobile solid phase carrier to deplete the compounds (1) and separation of the compounds (2) is carried out with simultaneous isolation of the trace components, wherein the trace components remain in solution.
  • This has the advantage that, depending on the task, it is possible to carry out a rapid and selective isolation of trace components by parallel binding of compounds (1) and (2) to the mobile solid phase carriers without obtaining multistage fractions. The obtained trace components can then be subjected to a subsequent analysis.
  • the mobile solid phase carriers may differ in size and type of functional groups, so only specific ones
  • Compounds (1) and (2) or trace components are different bind designed mobile solid phase carrier.
  • the method steps for binding the individual Proben beaueile can be carried out simultaneously, ie parallel in time, or in succession.
  • the trace components thus obtained may then be subjected to subsequent analysis after an optional elution step.
  • Trace components may then be subjected to subsequent analysis after an optional elution step.
  • the trace components may then be subjected to analysis after an elution step.
  • the depletion of compounds (1) and separation of compounds (2) can in this respect be carried out with the isolation of the trace components in the sample offset in time or simultaneously, wherein the process steps are variable ausgestaltbar depending on the nature of the task.
  • a buffer solution with low ionic strength is used, wherein the volume fraction of the biological sample to the buffer solution 1: 2 to 1: 10 and the buffer solution has a molar salt content of 0 to 0.5 mol.
  • a further process step b) to a volume of the biological sample 0.5 to 2.5 parts by volume of a buffer solution with low ionic strength is added, which contains a divalent salt having a molar concentration of up to one mol / l, wherein the divalent salt is zinc sulfate in particular.
  • the separation of the silica particles with at least one magnetic core is carried out with the aid of a magnetic separator.
  • the present invention also sample analyzes with a low content of trace elements, wherein the compounds of a Sample can be adsorbed by changing the dielectric constant by means of polar organic solvents with a dipole moment in the range of 1.6 to 4.0 Debye on silica gel particles with a magnetic core and the magnetic silica particles are separated with the adsorbed compounds in the magnetic field.
  • the binding or attachment on the surface of the solid phase support can be done by various mechanisms. So it is possible that the
  • the abovementioned interactions allow an induced adhesion of the compounds on the surface of the adsorbent.
  • the induced adhesion is created through targeted irreversible change of the pH 's, the salt concentration, the polarity of the solvent, and the trace component is eluted from the solid phase support.
  • a concentration of the trace component (s) can be achieved.
  • the method according to the invention also includes the combination of the selective isolation of the trace components and the depletion and / or separation of compounds (1) and (2).
  • the combination is usually, but not exclusively, achieved in a two-step process.
  • compounds (1) and (2) are bound by selective and non-selective bonds to the solid phase support and thus removed from the reaction mixture.
  • the trace components are selectively and reversibly bound to a further solid phase support and, if necessary, by varying the solvent (pH, Sakzkonzentration, polarity of the solvent) eluted again from the solid phase support.
  • the steps can take place at the same time in a reaction chamber, but also separated in time and in two or more cavities.
  • the present invention advantageously provides a simple implementation of
  • the method according to the invention can be carried out as part of an in-vitro diagnosis by means of parallel or simultaneous determinations of the
  • Marker according to the invention are carried out, wherein the determinations are carried out on at least one patient sample.
  • the determinations are carried out on at least one patient sample.
  • the inventive method can be carried out by means of a 2D electrophoresis, wherein in the first dimension
  • a gel electrophoresis is performed.
  • the method according to the invention and its determinations can be carried out by means of a rapid test (eg lateral-flow test), whether in single or multiparameter determination.
  • the present invention includes a sample preparation kit for clinical samples, wherein the components used in the kit include lysis buffer, organic solvents, and magnetic solid phase carriers.
  • the constituents present in the kit should be used analogously to the constituents described in the method according to the invention in a concentration range between 1 and 15 percent by volume.
  • concentration range between 1 and 15 percent by volume.
  • Cortisone solution 250 pg / ml in sterile water
  • Magenitsche silica gel particles (magnetic bead mix (50 mg / ml)) in aqueous zinc sulfate solution (0.4 M)
  • Zinc sulfate-containing bead mix is added to the reaction mixture, mixed and incubated for one minute.
  • the proteins are precipitated on the magnetic bead mix.
  • the added or generated solids are separated in their entirety by a suitable magnetic separator and the supernatant solution is removed for further analysis.
  • the supernatant is in the microtiter plate reader at 240 nm
  • the recovery rate of cortisol added in Example 1 is 92%.
  • Cortisone solution 250 pg / ml in sterile water
  • Microplate reader 1 Protocol with magnetic mobile solid phase carriers Protocol with magnetic mobile solid phase carriers
  • microtiter plate format 35 ⁇ whole blood (or 100 ⁇ serum) of 0, 25, 50 or 75 ⁇ cortisol solution and 1-fold, 1.5-fold, 2-fold and 4-fold concentrated silica gel particles (magnetic bead mix solution), according to the following pipetting scheme, mixed thoroughly and incubated for 1 minute.
  • the reaction mixture is transferred from the microtiter plate format into Eppendorf tube format.
  • the precipitated proteins are collected by centrifugation at 10,000 G for 10 minutes and the supernatant transferred back to the microtiter plate format.
  • the microtiter plate reader reads the sample at 240 nm.
  • Phosphatidylinositol are dissolved in 0.4 M aqueous potassium bicarbonate, pH 9 solution at a final concentration of 0.5 g / L.
  • Standard in appropriate concentration to the reaction mixture, typically in volumes between 10 - 50 ⁇ . Subsequently, the reaction mixture is mixed.
  • a particle suspension of mobile solid phase supports which may optionally have a specific surface modification, for example, but not limited to, a
  • Anion exchange functionality in the range of 1 mg - 10 mg
  • Chromatography material populated pipette tips e.g., ZipTips
  • Composition, concentration and possibly particle dimensions of the particle suspension under (3) differs, given in the range of 1 - 10 mg dry weight in a suitable buffer solution.
  • an organic solvent is preferred, but not limited to, acetone trilil in the range of% to 3
  • the trace components that remain in the supernatant after (7) can be further purified.
  • the trace components that remain in the supernatant after (7) can be further purified.
  • Trace components selectively, for example but not exclusively, via an antigen / antibody recognition, or else non-selectively, for example but not exclusively, via a reversed phase or
  • Particle suspension in the range of 1 - 10 mg dry weight in suitable buffer solution, which is in composition and
  • Concentration of the particle suspension under (5) differs, bound. After magnetic separation, the supernatant is discarded and the particles are resuspended in appropriate washing solution.
  • Filter plates equipped with chromatographic material pipette tips (such as ZipTips) or pillars of different formats.
  • Solid phase carriers which differ in composition and concentration of the particle suspension under (5), which are added in the range of 1 - 10 mg of dry matter in a suitable buffer solution, are selectively extracted from the trace components.
  • trace components can be concentrated.
  • the supernatant from (7) is diluted with water or a polar organic solvent in the range from 2 to 10 parts by volume of the supernatant and to the diluted reaction mixture is added a particle suspension, which is different in composition and concentration of the particle solution under (5) and the trace components are bound.
  • the binding can be carried out analogously to (8) selectively or nonselectively. After magnetic separation, the supernatant is discarded and the particles are washed in suitable washing solution
  • particle suspension may also be suitable filter plates, pipette tips (e.g., ZipTips) equipped with chromatography material, or columns of various formats.
  • pipette tips e.g., ZipTips
  • Sample material human serum or plasma
  • the protocol for sample preparation of serum / plasma samples is identical to the protocol in Example 4 - whole blood samples - with the difference that step (1) of example 4 is omitted.
  • Figure 1 shows possible process steps covered by the present invention.
  • the depletion or separation of compounds (1) and (2) can simultaneously (case A and B) or separately (case C and D).
  • Isolation of a trace component (as required) is usually, but not exclusively, the last step in the process.
  • red blood cell lysis is a necessary process step - other clinical samples such as serum / plasma or saliva may not require this process step.
  • Protocol 1 Protein precipitation on silica gel particles (magnetic beads) with subsequent magnetic separation
  • Protocol 1 is particularly suitable for analytes that are present in serum at comparatively high concentrations. These include: antibiotics,
  • Benzodiazepines, Antidepressants, Neuroleptics Protocol 2 Typical "protein-crash" protocol for fast sample preparation
  • the reaction mixture is 10 min. centrifuged at 5,000 g.
  • Protocol 2 is particularly suitable for trace elements present in comparatively low concentrations in the serum. These include: catecholamines, steroid hormones, prostaglandins. Furthermore, protocol 2 is suitable if the reaction mixture after sample preparation has to be adapted to the conditions of the LC (rebuffering).
  • Protocol 3 Liquid-liquid extraction without gravel gel particles (or without
  • Protocol 4 Protein Precipitation on Kiesgel Particles (magnetic beads) followed by liquid / liquid extraction
  • Area or IS area refers to the area below the signal peak
  • Protocol 1 Protein Precipitation on Magnetic Silica Gel Particles with Subsequent Magnetic Separation
  • Pure water acts as a correction solution for the mobile phase.
  • Protocol 1 is particularly suitable for analytes that are present in serum at comparatively high concentrations.
  • protein precipitation conditions organic phase fraction
  • LC conditions mobile phase composition
  • the optional addition of the correction solution is as described above.
  • Typical trace components are: steroid hormones, such as cortisol, cortisone, deoxycortisol,
  • the reaction mixture is 10 min. centrifuged at 5,000 g.
  • Protocol 2 is particularly useful when the precipitation conditions and the LC conditions (composition of the mobile phase) are close to each other. Then the optional step of adding ddH20 can be dispensed with.
  • Typical trace components are here: apolar vitamins A, E and K.
  • Protocol 1 To 50 ⁇ urine will be 20 ⁇ internal standard, 20 ⁇ urine
  • Stabilization buffer and 40 ⁇ MagSi-TOX PRep particle mix are added and mixed.
  • reaction batch is separated for 1 minute on the magnetic separator and transferred 80 .mu.l of the clear supernatant into an HPLC vessel.
  • Protocol 1 is particularly suitable for analytes typically in Multiparameter approaches (screenings) performed. These include in particular: drug abuse analysis, benzodiazepine analysis, neonatal screening, pain management.
  • benzodiazepines such as clonazepam, nitrazepam, diazepam
  • the hemolysis rate of red blood cells can be performed directly in the transmitted light microscope at a magnification.
  • reaction mixture 2 ⁇ is transferred to a slide and analyzed for existing intact red blood cells in the transmitted light microscope.
  • the parameters determined from lysed whole blood include:
  • the internal standard mix should consist of deuterated cyclosporin A, deuterated tacrolimus, deuterated sirolimus and deuterated everolimus.
  • the silica gel particles (bead mix / protein precipitate mixture) are magnetically separated within one minute.
  • 50 ⁇ supernatant is removed and transferred to a suitable vessel, e.g. HPLC glass vial, transferred.
  • a suitable vessel e.g. HPLC glass vial
  • the thus prepared sample is measured in the LC-MS / MS and the data are evaluated with suitable analysis software.
  • Kieselgel based surfaces such as solid phase support for the purpose of isolation or (concentration) concentration and / or additional purification following the Protocol 1 to Example 12
  • Vitamin D as a powder
  • Reaction batch mixed twice by pipetting.
  • the diluted particle mix also serves as a binding buffer.
  • microtiter plate is transferred to a suitable magnet and the magnetic particles are exposed to the magnetic separator for 1 minute.
  • the magnetic particles are washed 1x with 100 ⁇ pure water
  • the magnetic particles are dissolved in 30 ⁇ desorption solution (80%
  • Magnetic Separator Protocol 1 a 20 ⁇ of internal standard and 40 ⁇ magnetic silica gel particle solution are added to human serum containing 50 ⁇ of ethyl glucuronide and mixed
  • reaction mixture is separated for 1 minute on the magnetic separator and 80 .mu. ⁇ of the clear supernatant transferred to an HPLC vessel and analyzed.
  • Silica gel particles (bead mix MagSi-TDM PREP type I and type 2)
  • Silica gel particles (bead mix MagSi-TDM PR £ p type I and type 2)
  • the reaction mixture is 130 ⁇ acetonitrile as
  • QC quality control with 3 different values QC1, QC 2 and QC 3 ..
  • Protocol 1 is particularly suitable for the analysis of cardiovascular and antiarrhythmic trace elements from human serum samples.
  • Example 16 is particularly suitable for the analysis of cardiovascular and antiarrhythmic trace elements from human serum samples.
  • QC quality control with 3 different values QC1, QC 2 and QC 3
  • the above protocol is therefore particularly suitable for the analysis of dexamethasone, mineral corticosteroids, steroid hormones.
  • Silica gel particles (bead mix MagSi-TDM PREP Type I and Type 2)
  • Figure 3 shows an example of the calibration curve for the antidepressant drugs to be studied using citalopram as an example.

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Abstract

Verfahren zur Probenvorbereitung für die Isolierung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen Probe durch Abreicherung von Verbindungen (1) und Abtrennung von Verbindungen (2), umfassend folgende Schritte: a) Lyse der Zellen und/oder b) Abreicherung von Verbindungen (1) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger und/oder c) Abtrennung von Verbindungen (2) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger, wobei die Bindung auf dem mobilen Festphasenträger unter b) und c) selektiv und/oder reversible erfolgen kann.

Description

Verfahren zur Isolierung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen
biologischen Probe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zur Probenvorbereitung für die Isolierung von Spurenkomponenten in der Analytik und Diagnostik aus einer flüssigen biologischen Probe durch Abreicherung hochmolekularer
Verbindungen (1 ) und Abtrennung niedermolekularer Verbindungen (2). Flüssige biologischen Materialien wie Vollblut, Serum, Speichel, Urin oder Plasma und anderen klinisch relevante Flüssigkeiten werden typischerweise mittels Immuno-Assays, insbesondere ELISA-Assays, auf den quantitativen Inhalt von niedermolekularen, organischen Verbindungen hin untersucht, um einen Krankheitsverlauf aufzuzeichnen, eine Krankheit überhaupt erst zu diagnostizieren oder den Medikamentenspiegel zu bestimmen. Bei den
Spurenkomponenten die es zu analysieren gilt kann es sich um natürlich vorkommende Verbindungen handeln (z.B. Vitamine oder Stoffwechsel- metaboliten), aber auch um exogen verabreichte Substanzen wie Medikamente oder Drogen.
In den letzten Jahren beginnt sich die LC-MS (bzw. LC-MS/MS) als Alternative zu Immuno-Assays zu etablieren. Typischerweise wird hierzu die klinische Probe mittels Präzipitation und anschließender Zentrifugation von
Plasmaproteinen abgetrennt und anschließend die niedermolekularen
Verbindungen in einer reversed Phase LC aufgetrennt, quantifiziert (Fläche des LC Diagramms) und die Molmasse per Massenspektrometrie (MS) analysiert.
Obwohl mit der Massenspektrometrie sehr sensitive und genaue Messergebnisse erzielt werden können, gibt es zahlreiche Substanzen, die sich negativ auf das Messergebnis auswirken. Da diese Substanzen aus einer Matrix wie z.B. Vollblut, Serum aber auch Pflanzenextrakten oder Nahrungsmitteln stammen können, spricht man auch von sogenannten negativen Matrixeffekten. Bei den zu nennenden Substanzen ist zwischen hochmolekularen-Verbindungen wie z.B. Proteinen und niedermolekularen-Verbindungen wie z.B. Phospholipiden zu unterscheiden, da eine Abreicherung bzw. Abtrennung beider
Substanzklassen mit einer einzigen physikalisch/chemischen Methode nicht
|Bestätigungskopie| möglich ist.
Es ist bekannt, dass abhängig von der Art der Probe und dem
Untersuchungsziel, der qualitative und quantitative Anteil einer Zielverbindung bzw. einer Spurenkomponente wie beispielsweise eines Biomarker Targets aus einer biologischen Probe auf unterschiedlichen instrumenteilen Plattformen und für unterschiedliche Endanwendungen wie klinische Kontrollen,
Dopinguntersuchungen, forensisch-toxikologische Gutachten oder
Nahrungsmittelkontrollen durchgeführt werden. Dabei sind unabhängig von der durchzuführenden Untersuchungsmethode, wie beispielsweise für Immuno- Assays (ELISA) oder Massenspektroskopie, Vorbehandlungen der Probe notwendig, um Störkomponenten wie beispielsweise Matrixeffekte zu
minimieren. Der analytische Prozess von der Probenentnahme bis zum Endergebnis ist im Wesentlichen in fünf Schritte unterteilt:
1.Probenentnahme
2. Probenvorbereitung
3.Probenfraktionierung
4. Analytdetektion
5. Datenauswertung
Biologische Proben, wie sie zum Beispiel in der Forensik und in der
pharmazeutischen Industrie als Rohstoffe und Endprodukte vorliegen, sind aber Mehrkomponentensysteme mit sehr komplexer Zusammensetzung, die oft Fettsäuren, Proteine, Salze, Lipide, Säuren, Basen und organische
Verbindungen als Bestandteile enthalten. Einige dieser Verbindungen sind als Bestandteile von Proben als„quasi" Matrix anzusehen, d. h. sie weisen ähnliche Eigenschaften wie die Spurenkomponenten auf.
Zudem liegen die Spurenkomponenten bei anstehenden Analysen in der meisten Zeit in einer niedrigen Konzentration in den Proben vor. Daher soll es ermöglicht werden, je nach der Herkunft der Proben und der analytischen Ziele, die biologischen Proben aber auch Drogenanalysen in verschiedene
Bestandteile zu trennen und spezifische Komponenten wie beispielsweise Spurenkomponenten zu isolieren bzw. anzureichern.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren für eine Probenvorbereitung mit positiver Selektion von Spurenkomponenten bei negativer Selektion von abundanten Verbindung einer Probe unter Verwendung von magnetischen Teilchen bzw. magnetischen Partikeln zur Probenvorbereitungen bereit zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren und ein Kit zur
Probenvorbereitung gelöst, wobei folgende Merkmale beinhaltet sind:
1. Lyse der Zellen und/oder
2. Abreicherung von Verbindungen (1 ) aus einer flüssigen biologischen Probe durch Bindung auf einem Festphasenträger und/oder
c) Abtrennung von Verbindungen (2) durch Bindung auf einem mobilem Festphasenträger, wobei die Bindung auf den mobilen Festphasenträgern unter b) bis c) selektiv und/oder reversible erfolgen kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von Spurenkomponenten in biologischen Proben, wobei eine Abreicherung bzw. Abtrennung von verschiedenen Arten von Verbindungen (1 ) und (2) erfolgen kann. Verbindungen (1 ) können beispielsweise abundante Proteine umfassen. Weiterhin sind auch Anwendungen, die im Bereich der Proben Vorbereitung im Kit- basierten Format erfolgen, möglich. Insbesondere ermöglicht die
vorliegende Erfindung eine selektive Isolierung von Spurenkomponenten in Gegenwart einer proteinreichen Matrix (beispielsweise von Hormonen,
Vitaminen, insbesondere Vitamin D, Immunsupressiva, Mykotoxinen etc.) unter der Verwendung von kontrollierter Depletion von Proteinen in Gegenwart von Kieselgel Partikeln, insbesondere von Kieselgel Partikeln mit magnetischen Kernen zu steuern.
Die Erfindung ist gerichtet an das Gebiet der Probenvorbereitung für die UHPLC, HPLC, LC/MS, LC/ MS/, MS, Kapillar LC, Kapillar Elektrophorese, Immuno-Assays inkl. ELISA und andere Tests, die auf die Probenvorbereitungsverfahren für den Nachweis von Spurenkomponenten und/oder niedermolekularen Verbindungen für Analysen in komplexen klinischen und nicht-klinischen Proben ausgerichtet sind. Klinische Proben im Sinne der Erfindung sind gerichtet auf homogenisiertes Gewebe, Vollblut, Zellkultur, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Tränen, Rückenmarksflüssigkeit, Gewebeflüssigkeit, Fruchtwasser, Follikelflüssigkeit und hämolysiertes Blut. Nicht klinische Proben sind gerichtet auf Nahrungsmittel, Getränke,
Wasserproben, flüssige Umweltproben und Fermentationsmedien. Zur geeigneten Diagnose von Krankheiten bedarf es einer geeigneten Therapie, wobei eine schnelle Diagnose erfolgen soll, um aussichtreiche klinische
Entscheidungen treffen zu können. So ist erfindungsgemäß vorgesehen neben der Möglichkeit der Aufarbeitung einer biologischen Probe hinsichtlich der darin enthaltenen Spurenkomponenten auch ein Verfahren bereit zustellen mit dem die Spurenkomponenten isoliert und nachfolgend zu analysiert werden können.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich überraschenderweise Verbindungen (1 ) und Verbindungen (2) aus den biologischen Flüssigkeiten leicht und schnell abreichern bzw. abtrennen, ohne dass die
Zusammensetzungen oder die Mengen der Spurenkomponenten aus der Probe verändert werden. Dies trifft zumindest für den Fall zu, dass die Spurenkomponenten nicht in einem Abschließenden clean-up Schritt aufkonzentriert werden. Verbindungen (1 ) und (2), die im Rahmen der vorliegenden Erfindung abgereichert und/oder abgetrennt werden können, können beispielsweise Serumalbumine, Immunglobuline, Fibrinogen, Regulator Proteine sein.
Weiterhin können als Verbindungen (2) auch Zucker, Lipide, Phospholipide und anorganische Salze mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert bzw.
abgetrennt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht nach Analyse der entsprechenden Zielverbindungen wie beispielsweise von
Spurenkomponenten in Form von Medikamenten oder Biomarker Targets klinische Entscheidungen zu treffen, die in eine Therapieerfolg umgesetzt werden können. Solche klinischen Entscheidungen umfassen dann
gegebenenfalls weiterführende Behandlungen mittels Arzneimitteln zur Therapie von Krankheiten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können dem zu untersuchenden Patienten Gewebeproben (Biopsie) oder Körperflüssigkeit (Blut, Plasma) entnommen werden, wobei die Diagnose in vitro/ex vivo, d. h. außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers erfolgen kann. Aufgrund der Bestimmung der erfindungsgemäßen Spurenkomponenten wird eine hohe Signifikanz für vorhandene Mengen oder deren Erhöhung/Erniedrigung erreicht. Abreicherung einer Verbindung bedeutet im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Verringerung von hochmolekularen Verbindungen (1 ) aus einer biologischen Probe. Dies kann durch Bindung, wie beispielsweise Adsorption, an einen mobilen Festphasenträger, der beispielsweise aus magnetischem Kieselgel, bevorzugt aus mesopörsem Kieselgel aber auch Polystyrol, Melamin, Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polythethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat, Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Kautschuk und Polyvinylalkohol bestehen kann, erfolgen.
Unter Abtrennung ist erfindungsgemäß die Bindung von Verbindungen (2) an mobile Festphasenträger zu verstehen. Die mobilen Festphasenträger können dabei verschiedene Ausgestaltungen aufweisen wie diejenigen, die zur
Abreicherung von Verbindungen(l ) eingesetzt werden, d.h. sie können alle die gleichen Abmessungen, Oberflächen und Kernbestandteile enthalten oder auch unterschiedlichen Ausgestaltungen untereinander aufweisen. Die Ausgestaltung der mobilen Festphasenträger richtet sich nach der Art, Größe und Menge der in der Probe vorhandenen Verbindungen (1 ) und (2).
Die weitere Reinigung von biologischen Proben neben den Verbindungen (1 ) und (2) beinhaltet die Isolierung von Spurenkomponenten, die durch selektive und reversible Bindung an mobile Festphasenträger, beispielsweise in Form von Kieselgel Partikel, die eine oberflächen-modifizierte Struktur aufweisen können, erfolgen kann. Dafür können Kieselgel Partikel als mobile
Festphasenträger verwendet werden, müssen jedoch nicht. Die Isolierung der Spurenkomponenten, beispielsweise im Rückstand kann auch nach
Durchführung der Abtrennung bzw. Abreicherung der Verbindungen (1 ) und (2) erfolgen. Die Kieselgel Partikel können einzelne oder mehrere Arten von Oberflächenstrukturen beinhalten, wobei die Bindung der Spurenkomponenten an die mobilen Festphasenträger durch ionische-, hydrophobe-, ττ-π
Wechselwirkungen, sowie Metall-Ion-Wechselwirkungen erfolgen und eine reversible Bindung begründen kann.
In einer besonderen Ausgestaltung weisen die mobilen Festphasenträger magnetische Teilchen, beispielsweise im Kern auf und umfassen an der
Oberfläche eine Mischung verschiedener Molekülketten, die zwei
Hauptfunktionen haben: Einerseits als mobiler Festphasenträger für die abgereicherten bzw. abgetrennten Verbindungen (1 ) und (2) zu fungieren und andererseits als mobiler Festphasenträger für die Isolierung von
Spurenkomponenten zur Verfügung zu stehen, wobei die jeweilige Bindung der mobilen Festphasenträger in Bezug auf die Verbindungen (1 ) und (2) und den Spurenkomponenten von unterschiedlichen und spezifischen
Wechselwirkungen abhängen kann.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die
Verbindungen (1 ) und/oder (2) an einem mobilen Festphasenträger wie beispielsweise einem Adsorbens aus Kieselgel-Partikeln mit einem
magnetischen Kern und Oberflächenstrukturen, die funktionelle Gruppen wie NH2 und COOH aufweisen können gebunden. Die Kieselgel-Partikel weisen dabei Poren auf, deren Größe im Bereich von 2 bis 50 nm, bevorzugt 5 bis 30 nm liegen und deren innere Oberfläche einen Bereich von 0,1 bis 400 m2/g, bevorzugt 10 bis 200 m2/g umfasst.
Im Allgemeinen haben die Partikel einen Durchmesser im Bereich von 20 nm bis 500 μητι, bevorzugt von 50 nm bis 100 μητι, insbesondere bevorzugt von 100 nm bis 10 pm. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden zur Bindung und/oder Eluierung protische und aprotische polare organische Lösungsmittel verwendet. Diese haben im Allgemeinen ein Dipolmoment im Bereich von 1.6 bis 4.0 Debye, bevorzugt von 1.69 bis 3.96 Debye.
Als geeignete polare, organische Lösungsmittel seien beispielsweise, aber nicht abschließend genannt: Acetonitril, Ethanol, Methanol, Propanol, iso-Propanol, n-Propanol, Isobutanol und n-Butanol, sowie Aceton, Dimethylsulfoxid und Polyethylenglykol (PEG). Die polaren, organischen Lösungsmittel können einzeln oder im Gemisch verwendet werden. Die Mischungen werden beispielsweise so eingestellt, dass Alkohole wie Ethanol und Iso-Propanol in verschiedenen Gewichtsanteilen oder Acetonitril zusammen mit einem Alkohol wie z.B. Iso-Propanol oder Ethanol oder Kombinationen aus Alkoholen wie Ethanol und Iso-Propanol mit verschieden Gewichtsanteilen mit z.B. Acetonitril kombiniert werden.
Zur weiteren Reinigung bzw. weiteren Konzentrierung der Spurenkomponenten können diese in einem weiteren Schritt in nicht-polaren, aprotischen
Lösungsmitteln, wie beispielsweise Hexan durch flüssig-flüssig Extraktion aufgenommen werden und nach anschließender Verdampfung des Lösungsmittels, kann der Rückstand in einem geeigneten polaren Lösungsmittel wie beispielweise Methanol oder Actonitril wieder aufgenommen werden.
Als Spurenkomponenten bzw. Biomarker Targets im Sinne der Erfindung sind beispielhaft aber nicht abschließend folgende Substanzen oder
Substanzklassen zu zählen:
Kardiovaskuläre, wie Amiodaron, Digoxin, Digitoxin, Flecainid, Lidocain, N- Acetylprocainamid, Procainamid, Propranolol,
Immunsuppressiva, Cyclosporin A, Tacrolismus, Sirolismus, Everolismus, Antiarrhythmika, wie Acebutolol, Ajmalin, Desethylamiodaron, Aprodine, Atenolol, Bisopropol, Quinidin, Diltiazem, Disopyramid, Dronedaron, Flecainid, Flunarizin, Gallopamil, Sotalol, Tocainid, Verapamil, Norverapamil, für das zentrale Nervensystem, wie Carbamazepin, Carbamazepin-10, 11- Exopid, Carbamazepin-diol, 10-OH Carbamazepin, Ethosuximid, Felbamat, Phenobarbital, freies Carbamazepin, freies Phenytoin, freies Primodon, freie Valproinsäure, Gabapetin, Lacosamid, Lamotrigin, Levetiracetam,
Oxcarbazepin, Phenylethylmalonamid (PEMA), Phenobarbital, Pregabalin, Rufinamide, Stiripentol, Sulthiam, Tiagabin, Topiramat, Theophyllin, Vigabatrin, Zonisamid, Phenytoin, Primidon, Valproinsäure,
Antibiotika, wie Vancomycin, Amikacin, Chloramphenicol, Gentamicin,
Kanamycin, Metilmicin, Streptomycin,
Antimykotika, wie Itraconazol, Fluconazole, Posaconazol, Voriconazol, 5- Flucytosin, Hydroxy-Itraconazol,
Antidepressiva, wie O-Desmethyl Venlafaxin, Mirtazapin, Venlafaxin,
Citalopram, Paroxetin, Desmethyl Fluoxetin, Fluoxetin, Fluvoxamin, Duloxetin, Sertralin, N-Desmethyl Setralin, Methylphenidat/Ritalin, Reboxetin, Trazodon, Mianserin, Atomoxetin,
Neuroleptika, wie N-Desmethyl Olanzapin, Olanzapin, 9-OH Risperidon, Risperidon, Haloperidol, Quetiapin, Clozapi, N_Desmethyl Clozapin, Aripiprazol Amisulprid, Pipameron, Promethazin, Levomepromazin, Perazin, Chlorprothixin Ziprasidon, trizyklische Antidepressiva, wie Amitriptylin, Chlorpromazin, Cyclobenzaprin, Clozapin, Norclozapin, Doxepin, Perphenazin, Imipramin, Clomipramin,
Trimipramin,
Benzodiazepine, wie Aminoclonazepam, Aminoflunitrazepam,
Hydroxyalprazolam, Hydroxytriazolam, Brotizolam, Clobazam, Clonazepam, Chlordiazepoxid, Clorazepat, Clotiazepam, Cloxazolam, Diazepam, Ketazolam, Midazolam, Nordiazepam, Oxazepam, Prazepam, Temazepam, Tetrazepam, Zolpidem, Alprazolam, Bromazepam, Flunitrazepam, Flurazepam, Lorazepam, Lormetazepam, Nitrazepam, Triazolam,
Drogen, wie Amphetamin, Barbiturat, Cannabinoide, Kokain,
Lysergsäurediethylamid, Morphin, Opiate, Propoxyphen, Fentanyl, Sufentanyl, Ephedrin, Ethylglucuronid,
Hormone, weibliches Östrogen, männliches Östrogen, männliches Testosteron weibliches Testosteron, weibliches Progesteron, männliches Progesteron, Steroide, wie Cortisol, ACTH, Aldosteron, Dehydroepiandrostenedion (DHEA), Dehydroepiandrostenedion Sulfat (DHEAS), Androstenedion, 17-OH
Progesterone, 11-Desoxycortisol, Corticosteron, fettlösliche Vitamine, wie Vitamin A, Vitamin E, Vitamin K, 25-OH-Vitamin D3, 25-OH-Vitamin D2,
B-Vitamine, wie Vitamin B1 , Vitamin B6,
Stoffwechselprodukte, wie Methylmalonsäure, Folsäure, Arachidonsäure, Prostagladin E2, Homocystein,
Katecholamine, wie Noradrernalin (Norepinephrin), Adrenalin (Epinephrin), Dopamin, Serotonin Ferner Tumormarker, Phsychopharmaka, Cardiovaskuläre Medikamente, Insektizide, Pesticide, Fungizide, Antikörper, Vasopressin, Oxytocin,
Somatostatin, Enzephalin, beta-Endorphin, Thyroxin, Trijodthyronin,
Thyroglobulin, Calcitonin, Catecholamin, Parathormon, Aldesteron, Renin, Angiotensin, Cortison, Desoxycorticosteron, Androsteron, Pregnenolon, Östron, Östradiol, Östriol, FSH, Gonadotropin, Tacrolimus, Everolimus, MPA, Insulin, Anti-Insulin-Antikörper, Glucagon, Gastrin, Sekretin, AMP, GMP, MMP 20, ZAP 1 , ZAP 2, ZAP 3, Prostaglandine, Thromboxan, Erythropoetin, Histamin, Primidon, Acetazolamid, Sultiam, Glutethimid, Pentobarbital, Secobarbital, Bupivacain, Mepivacain, Chinidin, Amikacin, Gentamicin, Tobramycin,
Cefalexin, Sulfamethoxazol, Methotrexat, Cyclosporin, Methylprednisolon, Salicylsäure, Acetaminophen, Indomethacin, Allopurinol, Carotin, Vitamin C, Vitamin D, 25-OH Vitamin D, Angiotensin I und II, Hämopexin, Transferrin, Kortisol, Insulin, Fibrinogen, Antithrombin, Plasminogen, Antiplasmin, etc. Die mobilen Festphasenträger können Kieselgel Partikel bzw. Kieselgel Teilchen, die mit mindestens einem magnetischen Kern ausgestaltet sein können, aufweisen. Durch Beschichten des mit Eisenoxid dotierten Kerns umfassen die Partikel bzw. Teilchen, die beispielsweise mit Kieselgel beaufschlagt werden können, funktionelle Gruppen wie beispielsweise -OH, -COOH, -NH2, R-SO2- OH, -NH2; -RNH, -R2N, Alkyl wie.CHa, -C2H5, -C4H9, -C8H17) -C9H19, -C10H21 ) -
CnH23, "Ci2H25, -Ci3H27, -Ci4H29, -C-15H31 , -C16H33, -C-|7H35, -CieH3 , -C6H5, - Z1O2, ΤΊΟ2, C6H9NO6, Phenylhexyl, Biphenyl, Hydroxyapatit, Boronsäure.
Durch die voranstehend genannten funktionellen Gruppen werden Wechselwirkungen erzielt, die eine gegebenenfalls reversible Bindung der Verbindungen (1 ) und (2) und/oder Spurenkomponenten auf der Oberfläche der mobilen Festphasenträger gewährleisten können. Dazu zählen ionische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, ττ-π Wechselwirkungen sowie Metall-Ion-Wechselwirkungen. Die voran genannten Wechselwirkungen ermöglichen insbesondere bei der Verwendung polarer Lösungsmittel eine induzierte Anhaftung der Verbindungen (1 ) und (2) und/oder der Spurenkomponenten auf der Oberfläche der mobilen Festphasenträger.
Die Beschichtung von Eisenoxid enthaltenden Partikeln mit Kieselgel ist an sich bekannt (J.Colloid Interface Sei. 1968, 26, 62 bis 69; Langmuir 2005, 21 , 10763 bis 10769; J. Colloid Interface Sei 2005, 283, 392 bis 396).
Die Beschichtung von Eisenoxid enthaltenden Partikeln mit Kieselgel für das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Eine Suspension von Eisenoxid enthaltenden Partikeln in einem Alkohol (z.B. Isopropanol) wird unter starkem Rühren in Gegenwart von Ammoniak zur Beschichtung mit Tetraethylorthosilicat (TEOS) versetzt. Die Dicke der
Beschichtung kann durch die Menge des zugegeben Tetraethylorthosilicat gesteuert werden.
Die beschichteten Eisenoxid enthaltenden Partikel werden mit einem Alkohol (z.B Methanol) gewaschen und in Wasser gelagert. Für das erfindungsgemäße Verfahren werden insbesondere Kieselgel Partikel als mobile Festphasenträger bevorzugt, die aus einer mesoporösen Schicht bestehen, die auf den magnetischen Kern aufgetragen ist und eine Schichtdicke im Bereich von 10 bis 100 nm aufweist. Magnetische Kerne für die erfindungsgemäßen mobilen Festphasenträger Kieselgel Partikel können an sich bekannte Partikel aus Eisenoxid (Fe2O3 oder Fe304) umfassen und eine umgebende Schicht beispielsweise aus
Siliciumdioxid, aber auch Polystyrol, Melamin, Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polythethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat,
Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Kautschuk und Polyvinylalkohol aufweisen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden bevorzugt Eisenoxidpartikel mit einer mesoporösen Kieselgel Beschichtung eingesetzt, wie sie beispielsweise in Gegenwart von Polyethylenglykol als porogenes Mittel entsteht.
Im Besonderen bevorzugt werden Kieselgel Partikel, die aus einer
mesoporösen Schicht bestehen, die auf den magnetischen Kern aufgetragen ist und eine Schichtdicke im Bereich von 10 bis 100 nm aufweist, wobei die magnetischen Kerne Maghemit und/oder Magnetit im Bereich von 30 bis 95 Gew% enthalten und einen mittleren Durchmesser im Bereich von 20 nm bis 500 pm, bevorzugt von 200 nm bis 10 pm, insbesondere bevorzugt von 300 nm bis 5 pm aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Form durchgeführt werden, dass eine selektive und/oder reversible Bindung der Verbindungen (1 ) und (2) an die mobilen Festphasenträger erfolgt, d.h. eine Bindung von Verbindungen (1 ) und (2) an ein mobile Festphasenträger zur Abreicherung der Verbindungen (1 ) und Abtrennung der Verbindungen (2) bei simultaner Isolierung der Spurenkomponenten erfolgt, wobei die Spurenkomponenten in Lösung verbleiben. Dies hat den Vorteil, dass man je nach Aufgabenstellung eine schnelle und selektive Isolierung von Spurenkomponenten durch parallele Bindung von Verbindungen (1 ) und (2) an die mobilen Festphasenträger vornehmen kann ohne mehrstufige Fraktionen zu erhalten. Die erhaltenen Spurenkomponenten können dann einer nachfolgenden Analyse unterzogen werden.
Es ist jedoch auch möglich, dass zunächst die Verbindungen (1 ) und (2) an mobile Festphasenträger gebunden werden und anschließend die in der Lösung verbliebenen Spurenkomponenten an mobile Festphasenträger gebunden werden. Die mobilen Festphasenträger können sich nach Größe und Art der funktionellen Gruppen unterscheiden, so dass nur bestimmte
Verbindungen (1 ) und (2) oder Spurenkomponenten sich an die unterschiedlich ausgestalteten mobilen Festphasenträger binden. Die Verfahrensschritte zur Bindung der einzelnen Probenbestandeile können simultan, d.h. zeitlich parallel, oder nacheinander erfolgen. Die so erhaltenen Spurenkomponenten können dann nach einem optionalen Elutionsschritt einer nachfolgenden Analyse unterzogen werden.
Ferner ist in einer weiteren Ausgestaltung des Erfindungsgegenstandes vorgesehen, dass zunächst nur Verbindungen (2) abgetrennt werden, in einer nachfolgenden Abreicherung die Verbindungen (1 ) aus der Probe entfernt werden und nachfolgend die Spurenkomponenten, die in der Lösung verblieben sind, einer Analyse unterzogen werden. Alternativ können die
Spurenkomponenten auch an mobile Festphasenträger mit bestimmter
Ausgestaltung der Oberfläche, beispielsweise durch die geeignete Wahl der funktionellen Gruppen, gebunden werden. Die gebundenen
Spurenkomponenten können dann nach einem optionalen Elutionsschritt einer nachfolgenden Analyse unterzogen werden.
Auch ist es vorgesehen, zunächst eine Bindung der Spurenkomponenten an geeignete mobile Festphasenträger zu generieren und nachfolgend eine Abreicherung von Verbindungen (2) und Abtrennung von Verbindungen (1 ) aus der Probe vorzunehmen. Die Spurenkomponenten können dann nach einem Elutionsschritt einer Analyse unterzogen werden.
Die Abreicherung von Verbindungen (1 ) und Abtrennung von Verbindungen (2) können insofern mit der Isolierung der Spurenkomponenten in der Probe zeitlich versetzt oder simultan erfolgen, wobei die Verfahrensschritte je nach Art der Aufgabenstellung variabel ausgestaltbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei der Lyse der Zellen in einem ersten Verfahrensschritt a) eine Pufferlösung mit niedriger lonenstärke verwendet, wobei der Volumenanteil der biologischen Probe zur Pufferlösung 1 :2 bis 1 :10 beträgt und die Pufferlösung einen molaren Salzanteil von 0 bis 0,5 mol aufweist. In einem weiteren Verfahrensschritt b) wird zu einem Volumenteil der biologischen Probe 0,5 bis 2,5 Volumenteile einer Pufferlösung mit niedriger lonenstärke zugesetzt, die ein zweiwertiges Salz mit einer molaren Konzentration von bis zu einem mol/l enthält, wobei das zweiwertige Salz insbesondere Zinksulfat ist.
Die Abtrennung der Kieselgel Partikeln mit mindestens einem magnetischen Kern erfolgt mit Hilfe eines magnetischen Separators.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie in den folgenden Schritten durchgeführt werden:
(i) Bereitstellen einer flüssigen biologischen Probe, die eine oder mehrere Spurenkomponenten, sowie Verbindungen (1 ) und/oder Verbindungen
(2) enthält,
(ii) Kontaktieren der flüssigen biologischen Probe mit Kieselgel Partikeln mit einem magnetischen Kern,
(iii) Einmischen von organischen Lösungsmitteln in vordefiniertem Verhältnis (iv) Verwirbeln und Intubieren des Gemisches, wobei die Verbindungen (1 ) und/oder Verbindungen (2) auf der Oberfläche der Partikel adsorbiert werden,
(v) Abtrennen der magnetischen Partikel durch Anlegen eines magnetischen Feldes, und
(vi) Abnahme des Überstands mit einer oder mehreren Spurenkomponenten in Lösung bzw. Suspension. Alternativ Extraktion einer oder mehrere Verbindungen (1 ) und (2) und/oder von Spurenkomponenten aus der Probe mit anschließender Eluierung und Analyse.
(vii) Optional Austrocknen des Überstands oder der Elutionslösung bzw.- flüssigkeit durch Verdampfen des organischen Lösungsmittels, Mischung bei erhöhter Temperatur (50-85 °C) oder im Gasstrom und
(viii) Analysieren der einen oder mehrerer Verbindungen (1 ) und (2) und/oder Spurenkomponenten unter Verwendung von Gelelektrophorese, UHPLC, HPLC, UPLC, LC/MS, LC-MS/MS, Kapillar LC, Kapillar Elektrophorese UV/Vis, Immunoassay Detektion und/oder Durchflusszytometrie.
Optional können auch einige andere chromatographische Techniken innerhalb der analytischen Kette vor der Massenspektroskopie erfolgen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Probenanalysen mit einem geringem Gehalt von Spurenelementen, wobei die Verbindungen aus einer Probe durch Änderung der Dielektrizitätskonstante mit Hilfe von polaren, organischen Lösungsmitteln mit einem Dipolmoment im Bereich von 1.6 bis 4.0 Debye an Kieselgel Partikeln mit einem magnetischen Kern adsorbiert werden und die magnetischen Kieselgelpartikel mit den adsorbierten Verbindungen im Magnetfeld abgetrennt werden.
Die Bindung oder Anlagerung auf der Oberfläche des Festphasenträgers kann durch verschiedene Mechanismen erfolgen. So ist es möglich, dass die
Verbindungen durch verschiedene Wechselwirkungen auf der Oberfläche gebunden werden, so dass im Zuge einer nachfolgenden Probenaufbereitung die durch Adsorption gebundenen Spurenkomponenten ggf. leicht von der Oberfläche wieder gelöst werden können. Zu den Wechselwirkungen, die ggf. eine reversible Bindung der Verbindungen auf der Oberfläche gewährleisten, zählen ionische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen,
hydrophobe Wechselwirkungen, ττ-π Wechselwirkungen und Metall-Ion
Wechselwirkungen. Die voran genannten Wechselwirkungen ermöglichen insbesondere bei der Verwendung polarer Lösungsmittel eine induzierte Anhaftung der Verbindungen auf der Oberfläche des Adsorbens. Durch gezielte Änderung des pH's, der Salzkonzentration, der Polarität des Lösungsmittels wird die induzierte Anhaftung irreversibel gestaltet und die Spurenkomponente wird vom Festphasenträger eluiert. Neben einer Reinigung der Probe, kann so auch eine (Auf-)Konzentrierung der Spurenkomponente(n) erzielt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet auch die Kombination der selektiven Isolierung der Spurenponenten und der Abreicherung und/oder Abtrennung von Verbindungen (1 ) und (2). Die Kombination wird üblicherweise, aber nicht ausschließlich, in einem Zweischrittverfahren erzielt. Hierbei werden Verbindungen (1 ) und (2) durch selektive und nicht-selektive Bindungen an den Festphasenträger gebunden und damit aus dem Reaktionsgemisch entfernt. In einem weiteren Schritt werden die Spurenkomponenten selektiv und reversibel an einen weiteren Festphasenträger gebunden und ggf. durch Variation des Solvens (pH, Sakzkonzentration, Polarität des Lösungsmittels) wieder vom Festphasenträger eluiert. Dabei können die Schritte zeitgleich in einer Reaktionskammer, aber auch zeitlich getrennt und in zwei oder mehreren Kavitäten stattfinden. Insbesondere in der Analytik von Spurenkomponenten neben Proteinen und störenden niedermolekularen Verbindungen als Hauptkomponente eröffnet die vorliegende Erfindung in vorteilhafterweise eine einfache Durchführung der
Analytik mit geringen Fehlern, die besonders durch die Komplexität des
Systems und die Matrixeffekte bedingt sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen einer in-vitro Diagnose mittels parallelen oder simultanen Bestimmungen der
erfindungsgemäßen Marker durchgeführt werden, wobei die Bestimmungen an mindestens einer Patientenprobe durchgeführt werden. In einer weiteren
Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer 2D-Elektrophorese erfolgen, wobei in der ersten Dimension eine
isoelektrische Fokussierung, in der zweiten Dimension eine Gelelektrophorese durchgeführt wird. In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren und dessen Bestimmungen mittels eines Schnelltests durchgeführt werden (z. B. lateral-flow Test), sei es in Einzel- oder Multiparameterbestimmung.
Schließlich beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Anwendungspaket bzw. Kit zur Probenvorbereitung für klinische Proben, wobei die in dem Kit verwendeten Bestandteile Lysepuffer, organische Lösungsmittel und magnetische Festphasenträger umfassen. Die im Kit vorhandenen Bestandteile sollen dabei analog zu dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen Bestandteilen in einem Konzentrationsbereich zwischen 1 bis 15 Volumenprozent verwendet werden. Dadurch sind unterschiedliche klinische Anwendungen für das Kit möglich, wobei insbesondere durch die Verwendung variabler Konzentrationsbereiche der vorhandenen Kit Bestandteile verschiedene Probenarten analysiert werden können. Nachfolgend sind beispielhaft einige typische Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und Kits zur Probenvorbereitung aufgeführt
Beispiel 1 :
Probenvorbereitung für die Isolierung und Analyse
Kortisol in humanem Vollblut: Materialien:
Lysiertes Vollblut mit Kortisol
Kortisollösung: 250 pg/ml in sterilem Wasser
Magenitsche Kieselgel Partikel (Magnetischer Bead mix (50 mg/ml)) in wässriger Zinksulfatlösung (0.4 M)
Organischer Lösungsmittelmix, 100% Acetonitril
Mikrotiterplatten, UVA is kompatibel
Mikrotiterplatten Lesegerät
Im Mikrotiterplattenformat wird wässrige Kortisollösung, in
unterschiedlichen Konzentrationen zum Vollblut addiert, gemischt und 1 Min. zwecks Zelllyse inkubiert.
Zinksulfathaltiger Beadmix wird zum Reaktionsansatz gegeben, gemischt und eine Minute inkubiert.
Durch Addition von Acetonitril zum Reaktionsansatz werden die Proteine an den magnetischen Beadmix präzipitiert.
Die zugegebenen bzw. generierten Feststoffe werden in der Gesamtheit durch einen geeigneten magnetischen Seperator abgetrennt und die überstehende Lösung wird zur weiteren Analyse abgenommen.
Der Überstand wird im Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 240 nm
vermessen und die optische Dichte (OD24o) aufgezeichnet.
Als Ergebnis ist festzustellen, dass lysiertes Vollblut bei 240 nm eine vom zugesetzten Kortisol unabhängige Hintergrundabsorption aufweist. Daher müssen die Absorptionswerte von Kortisolhaltigen Proben vom Blindwert subtrahiert (korrigiert) werden.
in Pipettierschema ist nachfolgend aufgelistet:
PipettierVollWasser [μΙ] Kortisollsg. Bead- Acetonitril Summe schema: blut [μΙ] Lösung [μΙ] Lösung [μΙ]
[μΙ]
1 50 250 0 50 700 1050
2 50 250 0 50 700 1050
3 50 210 40 50 700 1050
4 50 210 40 50 700 1050
5 50 170 80 50 700 1050
6 50 170 80 50 700 1050
7 50 130 120 50 700 1050
8 50 130 120 50 700 1050
9 50 90 160 50 700 1050
10 50 90 160 50 700 1050
11 50 50 200 50 700 1050
12 50 50 200 50 700 1050
Auslesung:
Figure imgf000020_0001
Die Wiederfindungsrate von in Beispiel 1 additiv zugeführtem Kortisol beträgt 92%.
Beispiel 2:
Vergleich von Protokollen zur Abreicherung bzw. Abtrennung von Verbindungen (1 ) und (2) zur Bestimmung von Kortisol in humanem Vollblut mit magnetischen und unmagnetischen mobilen Festphasenträgern:
Materialien:
Lysiertes Vollblut mit Kortisol
Kortisollösung: 250 pg/ml in sterilem Wasser
Kieselgel Partikel (Magnetischer Bead mix (20 mg/ml))
Organischer Lösungsmittel mix, 100% Acetonitrile
Mikrotiterplatten, UV/Vis kompatibel
Mikrotiterplatten Lesegerät 1 ) Protokoll mit magnetischen mobilen Festphasenträgern:
• Im Mikrotiterplattenformat werden zu 35 μΙ Vollblut (bzw. 100 μΙ Serum) 0, 25, 50 oder 75 μΙ Kortisollösung und 1-fach, 1.5-fach, 2-fach und 4- fach konzentrierte Kieselgel Partikel (magnetische Bead Mix Lösung), gemäß dem nachfolgenden Pipettierschema, gegeben, gründlich gemischt und für 1 Minute inkubiert.
• Durch Addition von Acetonitril (270 μΙ bei Vollblutproben und 360 μΙ bei Serumproben) werden die Proteine an die magneticchen Beads präzipitiert.
• Nach 1 minütiger magnetischer Separation wird der Überstand
abgenommen, in ein freies Mikrotiterplattenwell transferiert und im Mikrotiterplattenlesegerät bei 240 nm ausgelesen.
2) Protokoll ohne magnetische mobile Festphasenträger:
1. Im Mikrotiterplattenformat werden zu 35 μΙ Vollblut (bzw. 100 μΙ Serum) 0, 25, 50 oder 75 μΙ Kortisollösung und 75, 50, 25 oder 0 μΙ Wasser gemäß dem untigen Pipetierschema, gegeben, gründlich gemischt und für 1 Minute inkubiert.
2. Durch Addition von Acetonitril (270 μΙ bei Vollblutproben und 360 μΙ bei Serumproben) werden die Proteine präzipitiert.
3. Der Reaktionsansatz wird vom Mikrotiterplatten-format in Eppendorf- Tube format überführt.
4. Die präzipitierten Proteine werden durch 10 minütige Zentrifugation bei 10.000 G kollektiert und der Überstand zurück ins Mikrotiterplattenformat überführt.
5. Im Mikrotiterplattenlesegerät wird die Probe bei 240 nm ausgelesen. Pipettierschema:
Figure imgf000022_0001
*Eine Minute Inkubation zur Lyse der Vollblutzellen ist nur bei Vollblut-Proben notwendig - entfällt für Serum und Wasserproben. Beispiel 3:
Abtrennung von Verbindungen (2) durch mobile magnetische Festphasenträger MagSi-TDMPREPam Beispiel des Phosphatidylinositols: Materialien:
Phosphatidyllösung (wässrig): 0.5 g/L
Kieselgel Partikel (Magnetischer Bead mix (50 mg/ml))
Wasser p.a.
Organischer Lösungsmittelmix, 100% Acetonitril
Mikrotiterplatten, UV/Vis kompatibel
Mikrotiterplatten Lesegerät
Protokoll:
• Phosphatidylinositol werden in 0.4 M wässriger Kaliumbicarbonat, pH 9 Lösung bei einer Endkonzentration von 0.5 g/L gelöst.
• 25 μΙ Phosphatidylinositollösung werden in Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben.
• Zur Lösung werden 40 μΙ magnetische Partikelmischung gegeben und gemischt. Anschließend wird die Lösung 30 Sek. inkubiert.
• Zur Lösung werden 70 μΙ Wasser und 90 μΙ Acetonitrile gegeben.
• Die Kieselgel Partikel werden für 1 min. im Magnetfeld separiert.
• Der Überstand wird im Mikrotiterplattenlesegerät bei OD405 auf
Turbidimetrie untersucht.
Figure imgf000023_0001
Bespiel 4:
Protokoll zur Probenvorbereitung von Vollblutproben zwecks LC-MS/MS, aber auch Immunoassay; LC oder Elektrophorese zur Isolierung und Analyse von Spurenkomponenten: Probenmaterial: EDTA-Blut, Heparin Blut, Citrat-Blut
1. Zu 50 μΙ Vollblut wird Lyselösung (ddWasser) im Bereich von 100 bis 250 μΙ geben, der Reaktionsansatz wird gemischt und 30 sec. - 2 min. bei Raumtemperatur inkubiert.
2. Ggf. wird ein Interner Standard, bevorzugt ein deuterierter interner
Standard, in geeigneter Konzentration zum Reaktionsansatz gegeben, typischerweise in Volumina zwischen 10 - 50 μΙ. Anschließend wird der Reaktionsansatz gemischt.
3. Optional kann eine Partikelsuspension aus mobilen Festphasenträgern, die ggf. eine spezifische Oberflächenmodifikation aufweisen kann, zum Beispiel, aber nicht ausschließlich, eine
Anionenaustauscherfunktionalität, im Bereich von 1 mg - 10 mg
Trockengewicht in geeigneter Pufferlösung zum Reaktionsansatz gegeben werden. Im Anschluss wird der Reaktionsansatz für 10 sec. bis 2 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Hierdurch werden Verbindungen (2), die einen Matrixeffekt auslösen, abgereichert. Alternativformate zu Partikelsuspension können auch geeignete Filterplatten, mit
Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen (z.B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.
4. Im Anschluss wird die Partikelsuspension im Magnetfeld pelettiert und der Überstand wird von den mobilen Festphasenträgern separiert.
5. Zum Überstand aus (4) wird eine weitere Partikelsuspension in Form von erfindungsgemäßen mobilen Festphasenträgern, die sich in
Zusammensetzung, Konzentration und ggf. Partikeldimensionen von der Partikelsuspension unter (3) unterscheidet, im Bereich von 1 - 10 mg Trockengewicht in geeigneter Pufferlösung gegeben.
6. Zum Reaktionsansatz aus (5) wird ein organisches Solvens bevorzugt, aber nicht ausschließlich, Acetontrilil im Bereich von % bis 3
Volumenanteilen des Reaktionsansatzes gegeben und der
Reaktionsansatz gründlich durchmischt. Hierbei werden Proteine und weitere Hochmolekulare Substanzen an die vorhandenen partikulären, mobilen Festphasenträger präzipitiert.
7. Die magnetischen Partikel zusammen mit dem Präzipitat werden im
Magnetfeld kollektiert und der Überstand wird abgenommen. Optional können die Spurenkomponenten, die nach (7) im Überstand verblieben sind, weiter aufgereinigt werden. Hierzu werden die
Spurenkomponenten selektiv, zum Beispiel aber nicht ausschließlich, über eine Antigen/Antikörper Erkennung, oder aber auch nicht-selektiv, zum Beispiel aber nicht ausschließlich, über eine reversed-Phase oder
Ionenaustauscher Funktionalität, an eine magnetische
Partikelsuspension, im Bereich von 1 - 10 mg Trockengewicht in geeigneter Pufferlösung, die sich in Zusammensetzung und
Konzentration von der Partikelsuspension unter (5) unterscheidet, gebunden. Nach magnetischer Separation wird der Überstand verworfen und die Partikel werden in geeigneter Waschlösung resuspendiert.
Dieser Vorgang wird ggf. wiederholt und abschießend werden die kollektierten Partikel in geeignete Elutionspuffer aufgenommen. Dabei gehen die gebundenen Spurenkomponenten in Lösung.
Alternativformate zu Partikelsuspension können auch geeignete
Filterplatten, mit Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen (z.B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.
Optional können im Überstand verbliebene Verbindungen (2), durch Bindung an eine Partikelsuspension in Form von mobilen
Festphasenträgern, die sich in Zusammensetzung und Konzentration von der Partikelsuspension unter (5) unterscheiden, die im Bereich von 1 - 10 mg Trockensubstanz in geeigneter Pufferlösung zugegeben werden, selektiv von den Spurenkomponenten extrahiert werden.
Alternativformate zu Partikelsuspension können auch geeignete
Filterplatten, mit Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen
(z.B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.
Optional können Spurenkomponenten ankonzentriert werden. Hierzu wird der Überstand aus (7) mit Wasser oder einem polaren organischen Solvenz in Bereich von 2 - 10 Volumenanteilen vom Überstand verdünnt und zu dem verdünnten Reaktionsansatz wird eine Partikelsuspension, die sich in Zusammensetzung und Konzentration von der Partikellösung unter (5) abgrenzt, zugegeben und die Spurenkomponenten werden gebunden. Dabei kann die Binding analog zu (8) selektiv oder nichtselektiv erfolgen. Nach magnetischer Separation wird der Überstand verworfen und die Partikel werden in geeigneter Waschlösung
resuspendiert. Dieser Vorgang wird ggf. wiederholt und abschießend werden die kollektierten Partikel in geeignetem Elutionspuffer
aufgenommen. Dabei gehen die gebundenen Spurenkomponenten in Lösung. Alternativformate zu Partikelsuspension können auch geeignete Filterplatten, mit Chromatographiematerial bestückte Pipettenspitzen (z.B. ZipTips) oder Säulen unterschiedlichen Formats darstellen.
Beispiel 5:
Protokoll zur Probenvorbereitung von Serum/Plasma zwecks LC-MS/MS, aber auch Immunoassay; LC oder Elektrophorese zur Isolierung bzw. Anreicherung und Analyse von Spurenkomponenten
Probenmaterial: humanes Serum oder Plasma
Das Protokoll zur Probenvorbereitung von Serum/Plasma Proben ist identisch mit dem Protokoll unter Beispiel 4 - Vollblutproben - mit dem Unterschied, dass auf Schritt (1 ) aus Beispiel 4 verzichtet wird.
Beispiel 6:
Protokoll zur Proben Vorbereitung von Vollblutproben zwecks LC-MS/MS, aber auch Immunoassay; LC oder Elektrophorese zur Isolierung und Analyse von Spurenkomponenten (Kochsalzlyse):
1. Zu 50 μΙ Vollblut wird 15 μΙ Lyselösung - wässrige ZnS04 (p.a.) im
Bereich von 0.2 M - 1 M zugegeben und 0.5 - 2 min. bei
Raumtemperatur inkubiert.
Alle weiteren Schritte folgen dem Beispiel 4, Schritte 1 bis 10.
Das erfindungsgemäße Verfahren und Kit wird anhand der nachfolgenden Abbildung 1 nochmals erläutert:
In dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Verfahren zur Isolierung von Spurenkomponenten anhand des Kits können einzelne Prozessschritte simultan oder separat, in ein oder mehreren Kavitäten
durchgeführt werden. Abbildung 1 zeigt mögliche Prozessschritte, die durch die vorliegende Erfindung abgedeckt werden. Die Abreicherung bzw. Abtrennung von Verbindungen (1 ) und (2) kann simultan (Fall A und B) oder separat (Fall C und D) erfolgen. Eine Isolierung einer Spurenkomponente (so erforderlich) erfolgt üblicherweise, aber nicht ausschließlich, als letzter Prozessschritt. Bei Vollblutproben ist die Lyse von roten Blutzellen ein notwendiger Prozessschritt - bei anderen klinischen Proben wie Serum/Plasma oder Saliva kann dieser Prozessschritt entfallen.
Beispiel 7:
Vergleichsmessungen der Serumkonzentration von Spurenkomponenten mit vier verschiedenen Protokollen
Materialien
LC-MS/MS System
Protokoll 1 : Proteinpräzipitation an Kieselgel Partikel (Magnetische Beads) mit nachfolgender magnetischer Separation
1. Zu 50 μΙ Metabolitanalyt enthaltendem humanem Serum werden 20 μΙ interner Standard und 40 μΙ Kieselgel Partikel Lösung gegeben und gemischt
2. Zum Reaktionsansatz werden 130 μΙ Acetonitrile als Präzipitationsagens gegeben und kräftig durchmischt.
3. The Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator
separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt.
Probenvorbereitungszeit pro Probe: ca. 2 Minuten
Protokoll 1 eignet sich besonders für Analyte, die in vergleichsweise hohen Konzentrationen im Serum vorliegen. Hierzu zählen: Antibiotika,
Benzodiazepine, Antidepressiva, Neuroleptika Protokoll 2: Typisches„Protein-crash" Protokoll für schnelle Probenvorbereitung
1. Zu 200 μΙ humanem Serum werden 200 μΙ Methanol, das bereits den internen Standard enthält, gegeben und kräftig durchmischt.
2. Der Reaktionsansatz wird 10 min. bei 5.000 g zentrifugiert.
3. 80 μΙ des klaren Überstandes wird in ein HPLC Gefäss überführt.
Probenvorbereitungszeit pro Probe: ca 12 min. Protokoll 2 eignet sich insbesondere für Spurenelemente, die in vergleichsweise niedrigen Konzentrationen im Serum vorliegen. Hierzu zählen: Katecholamine, Steroidhormone, Prostaglandine. Des Weiteren eignet sich Protokoll 2, wenn der Reaktionsansatz nach Proben Vorbereitung auf die Konditionen der LC angepasst werden müssen (Umpufferung).
Protokoll 3: Flüssig-flüssig Extraktion ohne Kiesgelpartikel (bzw. ohne
magnetische Beads) 1. Zu 200 μΙ Metabolitanalyt enthaltendem humanem Serum wird eine
Mischung aus Ethylacetat, Dichlormethan und Isopropanol (Verhältnis 3:1 :1 ) gegeben und kräftig durchmischt.
2. Inkubation für 2 Minuten zwecks Separation der wässrigen und
organischen Phase.
3. 300 μΙ der organischen Phase werden in ein HPLC Gefäß überführt. 4. Die organische Phase wird bis zur trockene im Stickstoffstrom
eingedampft und in 100 μΙ Methanol rekonstituiert.
Probenvorbereitungszeit pro Probe: ca 12 - 17 min. Protokoll 4: Proteinpräzipitation an Kiesgel Partikel (magnetische Beads) gefolgt von Flüssig/Flüssig-extraktion
1 ) Zu 200 μΙ humanem Serum werden 20 μΙ interner Standard und 160 μΙ Kieselgelpartikel gegeben und gemischt
2) Zum Reaktionsansatz werden 520 μΙ Acetonitrile als Präzipitationsagens gegeben und kräftig durchmischt.
3) The Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator M12 + 12 (MagnaMedics) separiert und 300 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäss überführt.
4) Zum Überstand wird eine Mischung aus Ethylacetat, Dichlormethan und Isopropanol (Verhältnis 3:1 :1 ) gegeben und kräftig durchmischt.
5) 300 μΙ der organischen Phase werden in ein HPLC Gefäß überführt.
6) Die organische Phase wird bis zur Trockenheit im Stickstoffstrom
eingedampft und in 100 μΙ Methanol rekonstituiert. Analyt Protokoll Fläche IS Fläche
Arachidonsäure Magnetische 3736009 130817
Partikel direkt
Zentrifugation 264096 8310
Flüssig/Flüssig 2137996 60391
Extraktion
Magnetische 3458125 100706
Partikel/Flüssig- Flüssig Extraktion
5-HETE Magnetische 660739 2578
Partikel direkt
Prostagladin Zentrifugation 165336 704
Flüssig/Flüssig 304197 1141
Extraktion
Magnetische 398497 1432
Partikel/Flüssig- Flüssig Extraktion
Fläche bzw. IS Fläche bezeichnet den Bereich unterhalb des Signalpeaks
Beispiel 8:
Vergleichsmessungen zwischen magnetischer Kieselgel Partikel- Probenvorbereitungsmethode und einer einfachen„Protein-crash" Methode - Anpassung des Reaktionsansatzes an die mobile Phase
Materialien:
LC-MS/MS System
LC
2 ml Eppendorf-Behälter
Magnetischer Separator
Protokoll 1 : Proteinpräzipitation an magnetischer Kieselgel Partikel mit nachfolgender magnetischer Separation
1. Zu 50 μΙ eines Steroid-Hormon-Analyts enthaltendem humanem Serum werden 20 μΙ interner Standard und eine Mischung aus 40 μΙ magnetischer Kieselgel Partikel Lösung und 10 μΙ wässrigem Zinksulfat magnetischer Kieselgel Partikel Lösung und 10 μΙ wässrigem Zinksulfat
(2M) gegeben und gemischt
2. Zum Reaktionsansatz werden 250 μΙ Methanol als Präzipitationsagens gegeben und kräftig durchmischt.
3. der Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator
separiert und 50 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt. 4. Zum Überstand wird 25 μΙ ddH20 gegeben und gut durchmischt
(optionaler Schritt). Das reine Wasser fungiert hier als Korrekturlösung zur mobilen Phase.
5. Das hierdurch optimierte WassenMethanol Verhältnis von nahe 1 :1
optimiert das LC-MS/MS Chromatogram signifikant.
Probenvorbereitungszeit pro Probe: ca. 2 Minuten Protokoll 1 eignet sich insbesondere für Analyte die in vergleichsweise hohen Konzentrationen im Serum vorliegen. Wenn die Proteinpräzipitationsbedingen (Anteil organischer Phase) und LC Konditionen (Zusammensetzung der mobilen Phase) weit auseinanderliegen, erfolgt die optionale Zugabe der Korrekturlösung wie oben beschrieben. Typische Spurenkomponenten sind hier: Steroidhormone, wie Cortisol, Cortison, Desoxycortisol,
Desoxycorticosteron, Corticosteron, Androsteron, Progesteron, Pregnenolon, Östrogen, Östron, Östradiol, Östriol, Testosteron, 17-Hydroxyprogesterone, Antibiotika, polare Vitamine wie Vitamin B1 und B6. Protokoll 2:
1. Zu 200 μΙ eines humanem Serum wird 200 μΙ Methanol, das den internen Standard enthält, gegeben und kräftig durchmischt.
2. Der Reaktionsansatz wird 10 min. bei 5.000 g zentrifugiert.
3. 75 μΙ des klaren Überstandes wird in ein HPLC Gefäß überführt.
Protokoll 2 eignet sich besonders, wenn die Präzipitationsbedingungen und die LC Konditionen (Zusammensetzung der mobilen Phase) nah beieinander liegen. Dann kann auf den optionalen Schritt der Zugabe von ddH20 verzichtet werden. Typische Spurenkomponenten sind hier: apolare Vitamine A, E und K.
Die Wirkung einer Probenvorbereitung nach Beispiel 8 für Protokoll 1 und 2 sind in Abbildung 2a und 2b für 17- Hydroxyprogesterone dargestellt, wonach in Abbildung 2b die Probenvorbereitung nach Protokoll 1 und in Abbildung 2a die Probenvorbereitung nach Protokoll 2 dargestellt ist. Das Hintergrundrauschen kann in Protokoll 1 deutlich im Vergleich zu Protokoll 2 reduziert werden.
Beispiel 9:
Multiplex-Ansätze aus Urin
Materialien:
2 ml Eppendorf-Gefäße
Magnetischer Separator
Protokoll 1 1. Zu 50 μΙ Urin werden 20 μΙ Interner Standard, 20 μΙ Urine
Stabilisierungspuffer und 40 μΙ MagSi-TOXPRep Partikel mix gegeben und gemischt.
2. Hierzu wird 130 μΙ Acetonitrile gegeben und kräftig durchmischt
3. Der Reakktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt.
Parameter Parameterklasse Matrix-Effekt in %
Amphetamin Drogenmissbrauch 103
Metaphetamin Drogenmissbrauch 93
MDMA Drogenmissbrauch 80
MDA Drogenmissbrauch 78
7-Amino-Flunitrazepam Benzodiazepin 84
Lorazepam Benzodiazepin 91
Oxazepam Benzodiazepin 101
Temazepam Benzodiazepin 100
Nordiazepam Benzodiazepin 96
Diazepam Benzodiazepin 106
Methadon Drogenmissbrauch 123
Bromazepam Benzodiazepin 93
Protokoll 1 eignet sich ins besondere für Analyte die typischerweise in Multiparameteransätzen (Screenings) durchgeführt. Dazu zählen insbesondere: Drogenmissbrauchsanalytik, Benzodiazepin-Analytik, Neugeborenen- Screening, Schmerzmanagement.
Bsp. Benzodiazepine wie Clonazepam, Nitrazepam, Diazepam
Beispiel 10: Vollblut Zell-Lyse
Materialien
Lichtmikroskop
Objektträger und Deckgläser
ddH20
Vollblut
Protokoll 1
Die Hämolyse-Rate von roten Blutzellen kann direkt im Durchlichtmikroskop bei einer Vergrößerung durchgeführt werden.
1. Zu 25 μΙ Vollblut wird 40 μΙ, 50 μΙ, 60 μΙ, 70 μΙ, 80 μΙ, 90 μΙ und 100 μΙ ddH2O gegeben, gemischt und 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert.
2. 2 μΙ des Reaktionsgemisches wird auf einen Objektträger überführt und auf vorhandene intakte rote Blutzellen im Durchlichtmikroskop analysiert werden.
Wasser40 μΙ 50 μΙ 60 μΙ 70 μΙ 80 μΙ 90 μΙ 100 μΙ volumen
Intakte ja nein nein nein nein nein nein
Zellen
vorhanden
Als Mindestrate reinen Wassers als Hämolyse-Reagenzes wurde 2 Volumina Wasser auf 1 Volumen Vollblut bestimmt. Durch dieses Verhältnis wird zusätzlich die Viskosität auf ein Maß herabgesetzt, die eine optimale
magnetische Separation von Kieselgel-Partikeln mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewährleistet.
Zu den Parametern, die aus lysiertem Vollblut bestimmt werden, zählen:
Immunsuppressiva, kombiniert mit Vitamin B1/B6.
Beispiel 11 :
Bestimmung von Immunsuppressiv-Konzentrationen aus humanem Vollblut. Analyse von kritischen Faktoren während der Probenvorbereitung. Materialien:
2 ml Eppendorf-Gefäße
Magnetischer Separator
LC-MS/MS System mit geeigneter Analysesoftware
Vollblutproben
Protokoll 1 :
1. Zu 25 μΙ Vollblut wird 60 μΙ ddH20 zur Vollblutzell-Lyse gegeben,
gemischt und 1 Minute inkubiert.
2. Zum Reaktionsansatz werden 10 μΙ Interner Standard-Mix-Lösung in Methanol gegeben. Der Interne Standard-Mix sollte hierbei aus deuteriertem Cyclosporin A, deuteriertem Tacrolimus, deuteriertem Sirolimus und deuteriertem Everolimus bestehen.
3. Zum Reaktionsansatz werden 40 μΙ Silikapartikel-Mix (50 mg/mL) oder ein Gemisch aus 40 μΙ Kieselgel Partikel ((Bead-Mix (50 mg/mL)) und 10 μΙ wässriger Zinksulfat-Heptahydratlösung (2M) gegeben. Zum Reaktionsanstz werden x μΙ Acetonitrile (ACN) gegeben und kräftig durchmischt. Durchmischung wird entweder 10x auf- und abpipettiert oder der Reaktionsansatz wird gevortextet.
In einem geeignetem Magneten werden die Kieselgel Partikel (Bead- Mix/Proteinpräzipitatgemisch) innerhalb von einer Minute magnetisch separiert.
50 μΙ Überstand wird abgenommen und in ein geeignetes Gefäß, z.B. HPLC Glasfläschchen, überführt.
Die so aufbereitete Probe wird im LC-MS/MS gemessen und die Daten mit geeigneter Analysesoftware ausgewertet.
Probe Präzipita- Fläche Fläche Fläche/ Adaptionen tionsvolumen unterhalb IS Fläche
(Acetonitril) des IS
Substanz- peaks
PBS ACN, 190 μΙ 2696 6142 0,4390 Mischung durch Puffer Pipettieren
PBS ACN, 190 μΙ 2701 5711 0,4729 Mischung durch Puffer Pipettieren
Vollblut ACN, 190 μΙ 913 1319 0,6925 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 190 μΙ 807 1239 0,6515 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 190 μΙ 1233 2559 0,4819 Zusätzliche
Präzipitation mit ZnS04
Vollblut ACN, 190 μΙ 1082 1964 0,5509 Zusätzliche
Präzipitation mit ZnS04
Vollblut ACN, 190 μΙ 607 990 0,6124 Mischung durch
Vortexieren
Vollblut ACN, 190 μΙ 584 951 0,6136 Mischung durch
Vortexieren
Vollblut ACN, 190 μΙ 928 2405 0,3859 Mischung durch
Vortexieren Vollblut ACN, 190 μΙ 1010 2768 0,3650 Mischung durch
Vortexieren
Vollblut ACN, 220 μΙ 1055 2357 0,4478 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 220 μΙ 1077 2326 0,4631 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 250 μΙ 1189 2756 0,4312 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 250 μΙ 1277 3207 0,3982 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 280 μΙ 1135 2803 0,4050 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 280 μΙ 1157 2703 0,4281 Mischung durch
Pipettieren
Vollblut ACN, 220 μΙ 861 2372 0,3631 Zusätzliche
Präzipitation mit ZnS04
Vollblut ACN, 220 μΙ 602 1690 0,3563 Zusätzliche
Präzipitation mit ZnS04
Vollblut ACN, 250 μΙ 523 1267 0,4126 Zusätzliche
Präzipitation mit ZnS04
Vollblut ACN, 250 μΙ 506 1356 0,3732 Zusätzliche
Präzipitation mit ZnS04
Vollblut ACN, 280 μΙ 454 1373 0,3307 Zusätzliche
Präzipitation mit ZnS04
Beispiel 12:
Positive Selektion von Vitamin D - Bindung von Spurenkomponenten an
Kieselgel basierte Oberflächen wie Festphasenträger zwecks Isolierung bzw. (Auf-)Konzentration und/oder zusätzlich Aufreinigung im Anschluss an das Protokoll 1 zu Beispiel 12
Materialien:
Vitamin D als Pulver
Miktotiterplatte
Kieselgel-Partikel (Beadmix (x mg/ml))
Aceton itril
ddH20
UV/Vis Lesegerät
Protokoll 1
1. 80 μΙ Probe (Vitamin D, 16 nmol, in 60% wässrigem Acetonitrile, analog wie die Lösungszusammensetzung nach der Probenvorbereitung aus Protokoll 1 ) wird in einer 96 Proben Deep-well Mikrotiterplatte vorgelegt 2. Zur Probe werden 250 μΙ verdünnter Partikelmix gegeben und 8 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation wird der
Reaktionsansatz zweimal durch Pipettieren durchmischt. Der verdünnte Partikelmix dient gleichzeitig als Bindungspuffer.
3. Die Mikrotiterplatte wird auf einen geeigneten Magneten transferiert und die Magnetpartikel für 1 Minute mit dem magnetischen Separator beaufschlagt.
4. Die Magnetpartikel werden 1x mit 100 μΙ reinem Wasser gewaschen
5. Die magnetischen Partikel werden in 30 μΙ Desorptionslösung (80%
wässrigem Acetonitril) re-suspendiert und für 30 Sekunden inkubiert. 6. Abtrennung der magnetischen Kieselgel Partikeln (Beadmix für 1 Minute)
7. 25 μΙ des Überstandes werden abgenommen und in eine neue
Mikrotiterplatte überführt.
8. Die gereinigte Probe wird mit 75 μΙ reinem Wasser verdünnt und im
UV/Vis Lesegerät analysiert.
9. Hierzu wird ein Absorbtionsspektrum zwischen A230 - A320 nm
aufgenommen und aus der Fläche unter dem Peak die Konzentration bestimmt. Partikel Menge Vitamin D im Menge Vitamin D in
Bindungspuffer [nmol] Desorptionslösung [nmol]
MagSi-proteomics C18 2,5 16,2
MagSi-C18 ferrofluid 1 18,6
Dynal RPC 3,9 12,5
MagSi-proteomics C8 2,3 17,8
MagSi-Phenyl-A 1 ,4 16,8
MagSi-Phenyl-E 1 ,8 15,4
MagSi-C18_endcapped 0 15,1
Beispiel 13:
Drogenmissbrauchsanalytik am Beispiel von Ethylglucuronid Materialien
LC-MS/MS System mit geeigneter Analysesoftware
Humanes Serum
Magnetischer Separator Protokoll 1 a) Zu 50 μΙ Ethylglucuronid enthaltendem humanem Serum werden 20 μΙ interner Standard und 40 μΙ magnetische Kieselgel Partikel Lösung gegeben und gemischt
b) Zum Reaktionsansatz werden 130 μΙ Acetonitril als Prazipitationsreagens gegeben und kräftig durchmischt,
c) Der Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt und analysiert.
Beispiel 14:
Anticoagulants Apixaban
Materialien: Kieselgelpartikel (Beadmix MagSi-TDMPREP Typ I und Typ 2)
LC-MS/MS System mit geeigneter Analysesoftware
Humanes Serum
Magnetischer Separator
Protokoll 1
a) Zu 50 μΙ Ethylglucuronid enthaltendem humanem Serum werden 20 μΙ interner Standard und 40 μΙ Magnetpartikellösung Typ 1 oder Typ 2 gegeben und gemischt
b) Zum Reaktionsansatz werden 130 μΙ Acetonitril als Präzipitationsreagens gegeben und kräftig durchmischt,
c) The Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator
separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt.
Figure imgf000038_0001
Wobei eine definierte Präzision=(Standardabweichung/Durchschnitt)x100 angenommen wird, d.h. je geringer der Wert, desto besser das Ergebnis. Im vorliegenden Beispiel scheint daher das Verfahren unter Verwendung von Kieselgelpartikel Lösung MagSi-TDMpp,epTYP 2 von MagnaMedics für die Isolierung der vorliegenden Spurenkomponenten am besten geeignet. Beispiel 15:
Austaustabilität von Amiodaron im Serum
Materialien:
Kieselgelpartikel (Beadmix MagSi-TDMPR£pTyp I und Typ 2)
LC-MS/MS System mit geeigneter Analysesoftware
Humanes Serum
Magnetischer Separator
Protokoll 1
1. Zu 50 μΙ Amiodaron enthaltendem humanem Serum werden 20 μΙ
interner Standard und 40 μΙ magnetische Kieselgelpartikel Lösung Typ 1 oder Typ 2 gegeben und gemischt
2. Zum Reaktionsansatz werden 130 μΙ Acetonitrile als
Präzipitationsreagens gegeben und kräftig durchmischt.
3. The Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator
separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt. 4. Nach jeder Messung wurde die prozessierte Serumprobe bei 18°C
tiefgefroren und wieder aufgetaut.
Figure imgf000039_0001
QC=Qualitätskontrolle mit 3 unterschiedlichen Werten QC1 , QC 2 und QC 3..
Das Protokoll 1 eignet sich insbesondere zur Analyse von Cardiovaskulären und Antiarrhythmischen Spurenelementen aus humanen Serum-Proben. Beispiel 16:
Analyse von Steroiden
Materialien: Kieselgel Partikel (Beadmix MagSi-TDMPRepTyp I und Typ 2), LC- MS/MS System mit geeigneter Analysesoftware, Humanes Serum,
Magnetischer Separator
Protokoll 1
1. Zu 50 μΙ humanem Serum werden 20 μΙ interner Standard und 40 μΙ einer magnetische Kieselgel Partikel Typ 1 oder Typ 2 gegeben und gemischt
2. Zum Reaktionsansatz werden 130 μΙ Acetonitril als Präzipitationsreagens gegeben und kräftig durchmischt.
3. The Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator
separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt.
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
QC=Qualitätskontrolle mit 3 unterschiedlichen Werten QC1 , QC 2 und QC 3 Das obige Protokoll ist damit besonders für die Analyse von Dexamethasone, Mineral-Corticoide, Steroidhormone geeignet.
Beispiel 17:
Antidepressivum Analyse aus Serum Materialien:
Kieselgel Partikel (Beadmix MagSi-TDMPREPTyp I und Typ 2)
LC-MS/MS System mit geeigneter Analysesoftware
Humanes Serum
Magnetischer Separator
Protokoll 1
1. Zu 50 μΙ humanem Serum werden 20 μΙ interner Standard und 40 μΙ Beadmix MagSi-TDMPR£P Typ 1 oder Typ 2 gegeben und gemischt
2. Zum Reaktionsansatz werden 130 μΙ Acetonitril als Präzipitationsreagens gegeben und kräftig durchmischt.
3. Der Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator
separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt.
In Abbildung 3 ist beispielhaft die Kalibrationskurve für die zu untersuchenden Antidepressiva am Beispiel von Citalopram dargestellt. Man erkennt den linearen Verlauf der Regressionsgeraden für Immuno-Assays und LC-MS/MS. Der nahezu lineare Verlauf über den gesamten Analysebereich ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und eine hohe Wiederfindungswahrscheinlichkeit der zu untersuchenden Spurenkomponenten oder
Verbindungen 1 und/oder 2 Beispiel 18:
Urinanalytik
Materialien: Kieselgel Partikel (Beadmix MagSi-TOXPR£PTyp I und Typ 2) LC-MS/MS System mit geeigneter Analysesoftware, Humanes Serum
Magnetischer Separator
LProtokol
• Zu 50 μΙ Urin werden 20 μΙ Interner Standard Mix, 20 μΙ Urin
Stabilisierungspuffer und 40 μΙ Beadmix MagSi-TOXPP£PTyp I oder Typ II gegeben und gemischt.
• Hierzu wird 130 μΙ Acetonitril gegeben und kräftig durchmischt
• Der Reaktionsansatz wird für 1 Minute am Magnetischen Separator
separiert und 80 μΙ des klaren Überstandes in ein HPLC Gefäß überführt. Zur Illustration der in der nachfolgenden Tabelle für die Urinanalytik beispielhaft genannten Substanzen, ist in Abbildung 4 beispielhaft das Chromatogramm der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Substanzen aus einer harnstoffhaltigen Lösung wie beispielsweise Human-Urin dargestellt.
Parameter Parameter Kasse Intensität in Units
Caffeine Anti-Asthma 16
Theophilin Anti-Asthma 13
Midazolam Benzodiazepine 7,4
Clozapine Neuroleptische Medikamente 7,3
6-O-Acetylmorphine Drogenmissbrauch 6,8
Atenolol Antiarryth mic 6,2
Nortriptylin Tri-cyclische Antidepressiva 6,1
Theobromin Alcaloid 4,8
Oxicodon Schmerzmittel 4
Adenosin Antagonist von Katecholaminen 1 ,6
5-Aminosalicylisäure Entzündungshemmer 2,2
MDMA Drogenmissbrauch 1 ,4

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Isolierung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen Probe zur Probenvorbereitung in der Analytik und
Diagnostik durch Abreicherung von Verbindungen (1 ) und Abtrennung von Verbindungen (2), umfassend folgende Schritte:
a) Lyse der Zellen und/oder
b) Abreicherung von Verbindungen (1 ) durch Bindung auf einem mobilen
Festphasenträger und/oder
c) Abtrennung von Verbindungen (2) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger, wobei die Bindung auf dem mobilen Festphasenträger unter b) und c) selektiv und/oder reversible erfolgen kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der Spurenkomponenten simultan und/oder zeitlich verzögert zu den Schritten a), b) und/oder c) erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die
Verbindungen (1 ) Proteine und Verbindungen (2) Peptide, Aminosäuren, Zucker, Lipide, Phospholipide und anorganische Salze umfassen. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe protischer und aprotischer Lösungsmittel eine Bindung der
Verbindungen (1 ) und (2) an die mobilen Festphasenträger erfolgt und die Verbindungen (1 ) und (2) eluierbar sind. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Elutionsmittel Hexan, Acetonitril, Methanol, Ethanol, H20, Isopropanol, n-Propanol, Isobutanol, n-Butanol und DMSO enthalten.
5. Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mobilen Festphasenträger für die Abreicherung von Verbindungen (1 ), Abtrennung von
Verbindungen (2) und/oder Isolierung von Spurenkomponenten beschichtete magnetische Partikel umfassen, wobei die Beschichtung aus der Gruppe von Verbindungen, umfassend Siliciumdioxid, Polystyrol, Melamin, Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polythethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat, Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Kautschuk, Polyvinylalkohol ausgewählt ist und die Partikel einen Partikeldurchmesser zwischen 100 nm und 100 μιη aufweisen.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächen der Partikel funktionelle Gruppen beinhaltet, die ausgewählt sind aus der Gruppe - OH, -COOH, Diethylaminoethanol, NH2, R-SO2-OH, -NH2; -RNH, -R2N,- R3N+, .CH3, -C2H5, -C4H9, -CeH-17, -C9H19, -CioH2-i, -CnH23, -Ci2H25, - Ci3H27, -Ci4H2g, -C-15H31 , -C16H33, -C17H35, -C-I8H37, -C6H5, -ZrO2, TiO2, ΟβΗθΝΟβ Phenyl-Hexyl, Bi-Phenyl, Hydroxyapatit und Boronsäure.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) simultan und/oder zeitlich versetzt mit Schritt a) und/oder Schritt b) durch selektive und/oder reversible Bindung auf einem mobilen Festphasenträger erfolgt.
Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse folgende Schritte beinhaltet:
a) zu einem Volumen eines biologischen flüssigen Materials werden 1 ,5 bis 10 Volumen einer Pufferlösung mit geringer ionischer Stärke mit Salzkonzentrate von 0 - 0,5 M hinzugefügt oder
b) zu einem Volumenteil einer biologischen Flüssigkeit werden 0,05 bis 2,5 Teile des Volumens des Puffers mit hoher lonenstärke
hinzugefügt, welches ein zweiwertiges Salz mit einer Konzentration im Bereich von 0,1 M bis 3 M beinhaltet, wobei das zweiwertige Salz vorzugsweise ZnSO4 ist.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Spurenkomponenten, insbesondere Vitamin D, durch Variation der Polarität des Lösungsmittels und/oder des pH-Wertes und/oder der Salzkonzentration auf einem Festphasenträger gebunden und wieder eluiert wird.
10. Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Isolierung von
Verbindungen (1 ) und/oder Abtrennung von Verbindungen (2) durch einen Wechsel in der dielektrischen Konstante durch Hinzufügen mindestens einer organischen Lösung erfolgt, welche einen
Dipolmoment zwischen 1 ,6 und 4,0 Debye bei einem Volumenanteil in einem Bereich zwischen 1 ,5 und 4 aufweist. 1 1 . Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine selektive und/oder reversible Bindung der Spurenkomponenten an einen Festphasenträger durch spezifische Wechselwirkung erfolgt, umfassend:
a) ionische Wechselwirkungen zur Bindung der geladenen
Verbindungen,
b) Wasserstoffbrückenbindungen zur Bindung der polaren Verbindungen, c) hydrophobe Wechselwirkungen zur Bindung der hydrophoben
Verbindungen,
d) TT-TT-Elektronen-Wechselwirkungen zur Bindung von Verbindungen, welche delokalisierte π-Elektronensysteme wie Aromate enthalten, e) Metall-Affinität-Bindungen zur Bindung von ausgewählten
Verbindungen wie Phosphatgruppen.
12. Verfahren zur Probenvorbereitung nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verbleibenden
Spurenkomponenten, insbesondere Biomarker Targets durch
magnetische Felder und/oder Zentrifugation getrennt und durch
Elektrophorese, CE, HPLC, UPLC, LC/MS, LC-MS/MS, UV/Vis,
Immunoassay-Detektion oder Durchflusszytometrie analysiert werden. Kit für die Isolierung von Spurenkomponenten aus einer flüssigen biologischen Probe zur Probenvorbereitung in der Analytik und
Diagnostik durch Abreicherung von Verbindungen (1 ) und Abtrennung von Verbindungen (2) umfassend folgende Schritte: a) Lyse der Zellen und/oder
b) Abreicherung von Verbindungen (1 ) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger und/oder
c) Abtrennung von Verbindungen (2) durch Bindung auf einem mobilen Festphasenträger, wobei die Bindung auf dem mobilen Festphasenträger unter b) und c) selektiv und/oder reversible erfolgen kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der Spurenkomponenten simultan und/oder zeitlich verzögert zu den Schritten a), b) und/oder c) durch selektive und/oder reversible Bindung auf einem mobilen Festphasenträger erfolgt.
Kit zur Isolierung von Spurenkomponenten nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit für die klinische Anwendung Lysepuffer, organische Lösungsmittel und magnetischen Festphasenträger in einem Konzentrationsbereich von 0,1 - 15 % (w/v) beinhaltet.
Kit zur Isolierung von Spurenkomponenten nach Anspruch 13 oder 14, umfassend Suspensionen magnetischer mobiler Festphasenträger in einem Bereich von 10mg/ml bis 100mg/ml, wobei die mobilen
Festphasenträger beschichtete magnetischen Partikel umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung aus der Gruppe von Verbindungen, umfassend Siliciumdioxid, Polystyrol, Melamin,
Polymethakrylat, Polyamid, Polyvinylclorid, Polyethylen, Polypropylen, Polyester, Polycarbonat, Polyacryamid, Agarose, Chitin, Dextran, Kautschuk, Polyvinylalkohol, ausgewählt ist.
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