DE602004009318T2

DE602004009318T2 - Bestimmung freier fraktionen

Info

Publication number: DE602004009318T2
Application number: DE602004009318T
Authority: DE
Inventors: Joachim Schuhmacher; Christian Kohlsdorfer
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2003-08-16
Filing date: 2004-08-04
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2024-08-05
Also published as: DE602004009318D1; US20070111208A1; EP1658499A1; US20110143363A1; US7754496B2; EP1658499B1; WO2005017528A1; ATE374947T1; ES2294524T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der pharmakologischen Eigenschaften von Substanzen, wie z. B. von chemischen Substanzen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren und Sets zur Verwendung in der Bestimmung des freien Anteils f_u von pharmakologisch aktiven Verbindungen in wässrigen Lösungen und Seren. Die Erfindung betrifft auch die oben genannten Verfahren, wobei feste Teilchen verwendet werden, die mit einem lipophilen Medium beschichtet sind.
Hintergrund
Die Quantifizierung der Proteinbindung von neuen chemischen Einheiten stellt einen wichtigen frühen Screening-Schritt bei der Entwicklung von Arzneimitteln dar und ist für die Bestimmung der Sicherheitsgrenzen während der Arzneimittelentwicklung von grundlegendem Interesse.
Herkömmlicherweise eingesetzte Verfahren zur Bestimmung der Proteinbindung, z. B. Ultrafiltration oder Gleichgewichtsdialyse, können leicht an einen hohen Durchsatz angepasst werden³, doch bei lipophilen Arzneimitteln, die stark an Plasmaproteine gebunden sind, ist deren Einsatz aufgrund der unspezifischen Adsorption eingeschränkt. Aufgrund der Tatsache, dass in den letzten Jahren ein Trend in Richtung mehr lipophiler Arzneimittel zu beobachten war⁴, steigt der Bedarf an neuen Verfahren zur Überwindung dieser Probleme, die auch an einen hohen Durchsatz angepasst werden können.
Ein Verfahren, das speziell für die Bestimmung der Proteinbindung von lipophilen Arzneimitteln entwickelt wurde, basiert auf der Verteilung der Arzneimittel zwischen Plasma und Erythrozyten bzw. einem Puffer und Erythrozyten⁵. Nachstehend wird dieses Verfahren als Verteilungsverfahren bezeichnet. Bei stark proteingebundenen Arzneimitteln (z. B. bei Arzneimitteln, die eine hohe Affinität in Bezug auf Proteine aufweisen) ist die Genauigkeit dieses grundlegenden Verfahrens jedoch leider mangelhaft.
Eine Modifikation des Verteilungsverfahrens ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt⁶, wobei dieser Nachteil überwunden wird, indem f_u in verschiedenen Plasmaverdünnungen durch lineare Regression bestimmt wird. Eine weitere Modifikation des Verteilungsverfahrens umgeht den kritischsten Schritt der Bestimmung von f_u durch Verteilung, nämlich die Handhabung des Arzneimittels in proteinfreiem Medium.
Es ist bekannt, das Transil^® eine verbreitet eingesetzte Substanz für die Hochdurchsatzbestimmung von Membranaffinitäten bei der Entwicklung von Arzneimitteln darstellt^9,10. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist bekannt, dass Transil^® feste Silica-Teilchen umfasst, die mit Eigelb-Phosphatidylcholin beschichtet sind.
Kürzlich wurde über einen neuen Ansatz zur Bestimmung relativer freier Anteile mittels Gleichgewichtsdialyse unter Einsatz von Plasma von verschiedenen Spezies in jeder Dialysekammer berichtet¹⁶. Jedoch ist die Validierung dieses Ansatzes noch ausständig. Experimente der Erfinder der vorliegenden Erfindung unter Einsatz dieses Verfahrens für stark an Plasmaproteine gebundene Arzneimittel (f_u < 0,5%) lieferten keine richtigen Ergebnisse (Daten nicht angeführt).
Der nächstliegende Stand der Technik offenbart eine Modifikation des Verteilungsverfahrens, bei der verdünntes Plasma verschiedener Spezies, aber nur Erythrozyten einer einzigen Spezies eingesetzt werden⁸, wodurch die Notwendigkeit umgangen wird, frische Erythrozyten für jeden einzelnen Testorganismus, der im Rahmen von interspezifischen Studien untersucht wird, isolieren zu müssen.
Das neue Verfahren stellt einen Fortschritt in Bezug auf das zuvor beschriebene Erythrozyten-Verteilungsverfahren dar⁸. Der zeitaufwendigste Schritt in diesem Verfah ren besteht im Präparieren der Erythrozyten: Diese werden durch Zentrifugieren von frischem, heparinisiertem Blut gewonnen und müssen drei Mal in isotonischem Phosphatpuffer gewaschen werden. Weiters muss das Waschen der Erythrozyten sehr vorsichtig durchgeführt werden, um eine Hämolyse zu vermeiden. In manchen Fällen kann eine Hämolyse aber nicht vollständig verhindert werden, und fehlerhafte Ergebnisse aufgrund der Bindung von Arzneimitteln an Hämoglobin können nicht ausgeschlossen werden. Alle diese Schwierigkeiten werden durch den Einsatz von festkörpergestützten Lipidmembranen vermieden. Das Material ist im Handel erhältlich und wurde speziell entwickelt, um die Membranaffinitäten im HTS-Format (als Alternative zu Liposomen) zu bestimmen^9,10.
Beschreibung der Erfindung
Ausgehend vom oben beschriebenen Zustand ist das durch die vorliegende Erfindung zu lösende technische Problem die Bereitstellung eines neuen und verbesserten Verfahrens zur Bestimmung des freien Anteils f_u von Substanzen, wobei dieses Verfahren auf einen experimentellen Hochdurchsatzansatz anwendbar ist.
Dieses Problem wird durch die Bereitstellung eines neuen Verfahrens gelöst, das eine deutliche Verbesserung des zuvor beschriebenen Erythrozyten-Verteilungsverfahrens darstellt⁸. Das Verfahren basiert auf der Verteilung von Arzneimitteln zwischen Plasmawasser, Plasmaproteinen und festkörpergestützten Lipidmembranen (z. B. Transil^®). Das Ersetzen der Erythrozyten durch festkörpergestützte Lipidmembranen (z. B. Transil^®) stellt eine wesentliche Vereinfachung der Durchführung von Proteinbindungsuntersuchungen durch Verteilung dar und macht das Verfahren besonders für Hochdurchsatzexperimente geeignet. Aufgrund des gesteigerten spezifischen Gewichts des Trägermaterials kann mit Transil^® leicht eine Phasentrennung erzielt werden. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber der Verwendung von Liposomen oder RP-18-Material dar, die/das beispielsweise in HPLC-Säulen-Packungen eingesetzt werden/wird.
Wie oben erwähnt ist bekannt, dass Transil^® eine verbreitet eingesetzte Substanz zur Bestimmung von Membranaffinitäten bei der Arzneimittelentwicklung ist^9,10. Die Bestimmung der Membranaffinitäten unterscheidet sich jedoch deutlich von der Bestimmung von freien Anteilen.
Die Erkenntnis, dass Erythrozyten durch festkörpergestützte Lipidmembranen ersetzt werden können, ist in der Hinsicht überraschend, dass Erythrozyten eher komplexe Strukturen sind, da sie eigentlich lebende Zellen mit einer zweischichtigen Lipidmembran sind, die eine Reihe funktioneller Enzyme, Ionenkanäle, Rezeptoren und dergleichen beherbergen.
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist weiters bekannt, dass die Ionisierung der Silica-Kügelchenoberfläche tendenziell eine Wirkung auf die Bindungseigenschaften dieser Teilchen hat¹⁰. Die Tatsache, dass die unvermeidliche Ionisierung des Feststoffträgers die Bestimmung der freien Anteile nicht beeinträchtigt, ist eine unvorhergesehene und unerwartete Erkenntnis.
Weiters ist auch die Tatsache, dass die Verbindung zwischen Transil^® und dem Puffer durch die Gegenwart der Plasmabestandteile nicht beeinträchtigt wird, ebenfalls unvorhergesehen. Dies stellt jedoch eine Voraussetzung für die Anwendung von Transil^® in den Verfahren der vorliegenden Erfindung dar.
Aus den oben angeführten Gründen kann es nicht als offensichtlich erachtet werden, dass Messungen, die mit festkörpergestützten Membranen, wie z. B. Transil^®-Kügelchen, durchgeführt werden, als Ersatzmessungen für die deutlich kostspieligeren Experimente unter Einsatz von frisch isolierten Erythrozyten eingesetzt werden können.
Um dies zu validieren, wurden Verbindungen ausgewählt, die einen weiten Bereich an Lipophilie (logP = 1,9 bis 5,6) abdecken und große Unterschiede in Bezug auf die freien Anteile (0,02% bis ~35%) aufweisen. Die Validierungsergebnisse weisen eine herausragende Übereinstimmung in Bezug auf f_u wie durch das Verfahren der vorlie genden Erfindung, das Verteilungsverfahren (unter Einsatz von Erythrozyten als "stationäre Phase") und durch Ultrafiltration bestimmt auf. Freie Anteile konnten genau bestimmt werden, wobei die Unterschiede zwischen den verschiedenen Verfahren weniger als 20% betrugen, selbst wenn die f_u-Werte unter 0,1% lagen. Die Spezies-Unterschiede in Bezug auf f_u bei Verwendung von Arzneimittel I, Arzneimittel II und Arzneimittel IV in Tabelle 2 waren unabhängig davon, ob sie durch das Transil^®-Verfahren oder ein klassisches Verteilungsverfahren unter Einsatz von Erythrozyten bestimmt wurden, fast ident. Die Ergebnisse zeigen demnach, dass die Erythrozyten durch festkörpergestützte Lipidmembranen ersetzt werden können. Weiters kann das neue Verfahren zur Bestimmung von sehr geringen (f_u< 0,1%) und sehr hohen freien Anteilen (f_u> 5%) eingesetzt werden, wodurch der Anwendungsbereich viel größer ist als für derzeit verfügbare Verfahren. Da die Genauigkeit und Fehlerfreiheit unabhängig davon, ob es sich um geringe oder hohe Anteile handelt, vergleichbar sind, erweist sich das Verfahren als besonders für lipophile Arzneimittel mit starker Bindung an Plasmaproteine geeignet. Bei lipophilen Arzneimitteln ist die Untersuchung der freien Anteile durch herkömmliche Verfahren, wie z. B. Ultrafiltration oder Gleichgewichtsdialyse, beschränkt, da lipophile Arzneimittel oft eine nicht-spezifische Adsorption an die Ultrafiltrationsvorrichtung oder die Dialysemembran aufweisen.
Es ist anzumerken, dass der kritischste Schritt bei lipophilen Arzneimitteln (die zur Adsorption an Oberflächen neigen) in der Bestimmung des Verteilungskoeffizienten in Puffer besteht. Wie untenstehend beschrieben kann die Adsorption an Glasmaterial jedoch vermieden werden, indem das Akkumulieren von wesentlichen Arzneimitteln in der Lipidphase akzeptiert wird. Wenngleich die Genauigkeit dieses Verfahrens zurückgehen kann, wenn die Verteilung weit von einer gleichmäßigen Verteilung entfernt ist, steigt die Fehlerfreiheit, da systematische Fehler vermieden werden. In solchen Fällen steigen die Anforderungen an die Validierung des analytischen Tests für niedrige Konzentrationen. Andererseits sind durch dieses Verfahren erhaltene Ergebnisse deutlich zuverlässiger als jene, die z. B. durch Ultrafiltration oder Gleichgewichtsdialyse erhalten werden, da bei diesen Verfahren die Ergebnisse aufgrund der Adsorption an die Ultrafiltrationsvorrichtung oder die Dialysemembran beeinflusst sein können. Die vergleichbaren freien Anteile, die im Fall von Arzneimittel 11 in Ta belle 2 unter Einsatz dieses Verfahrens oder herkömmlicher Verfahren erhalten werden, beweisen, dass dieser Ansatz zuverlässige Ergebnisse liefert.
Daraus folgt, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung mit Radioaktivitätsmessungen und Verfahren, die im Bereich der Arzneimittelentwicklung gängiger sind, wie z. B. LC-MS/MS, gültige Ergebnisse liefern. Das Verfahren kann eingesetzt werden, um ein weites Feld an Membranaffinitäten und freien Anteilen zu bestimmen, eignet sich aber besonders zur Untersuchung von freien Anteilen von Arzneimitteln, die stark an Plasmaproteine gebunden sind. Das Verfahren kann leicht für Hochdurchsatzexperimente angepasst werden und ist deshalb zur Bestimmung der Proteinbindung während der Arzneimittelentwicklung sowie für die Durchführung von Langzeitproteinbindungsstudien während der Arzneimittelentwicklung geeignet. Schließlich können unter Einsatz von Transil^® zur Bestimmung der Membranaffinität und der Proteinbindung eines Arzneimittels die wichtigsten Eingangsparameter für das Modellieren auf physiologischer Basis gleichzeitig untersucht werden.
Eine "Suspension" ist in der vorliegenden Erfindung ein beliebiges Gemisch, das feste Teilchen und eine Flüssigkeit umfasst.
Transil^®-Teilchen sind als ein Beispiel für Teilchen mit geeigneten Eigenschaften zu verstehen. Weitere Teilchen mit diesen geeigneten Eigenschaften können in Verfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingesetzt werden.
Die vorliegende Anmeldung betrifft Verfahren und Sets, wie in den Ansprüchen beschrieben.
Beschreibung der Zeichnungen
1
Arzneimittel I aus Tabelle 2: Bestimmung der Bindungsparameter in menschlichem saurem α₁-Glykoprotein (AGP) bei Inkubation mit steigenden Arzneimittelkonzentra tionen in einer 3,15 μM AGP-Lösung. Die Daten wurden folgender Gleichung unter Einsatz von Sigma Plot 2.01 angepasst: C_gebunden = n·C_AGP·C_u/(K_d+ C_u)(C_gebunden = Konzentration des gebundenen Arzneimittels, n = Anzahl der Bindungsstellen, C_AGP = AGP-Konzentration in dem Test, C_u = Konzentration des ungebundenen Arzneimittels, K_d = Dissoziationskonstante).
Beispiele
Arzneimittel und Reagenzien
Nicht-markierte (Arzneimittel I bis V) und ¹⁴C-markierte Arzneimittel (VI und VII) sowie Referenzverbindungen zur Analyse wurden in der Chemieabteilung der Bayer AG synthetisiert. Die verwendeten Lösungsmittel waren HPLC-rein. Alle anderen Chemikalien wiesen Analyse-Qualität auf.
Transil^® (mit Eigelb-Phosphatidylcholin beschichtete Silica-Kügelchen) wurden von NIMBUS Biotechnologie GmbH, Leipzig, Deutschland, bezogen. Dieses Material umfasst poröse Silica-Kügelchen, die mit einer einschichtigen Lipsomenmembran, die nicht-kovalent an das Kügelchen gebunden ist, bedeckt sind. Die festkörpergestützten Lipidmembranen werden in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert. Der Lipidgehalt sowie das Trockengewicht der jeweiligen Charge werden durch den Hersteller bereitgestellt. Der Lipidgehalt der in den Experimenten der vorliegenden Erfindung eingesetzten Chargen lagen zwischen etwa 10 und 65 μl/ml Suspension. Zur Bestimmung im HTS-Format wurden 96-Well-Platten mit auswechselbaren Glaseinlagen (0,5 oder 1,5 ml) eingesetzt.
Biologisches Material
Mausplasma von männlichen CD1-Mäusen (Hsd/Win:CD1), Rattenplasma von männlichen Wistar-Ratten (Hsd/Win:WU), Hundeplasma von weiblichen Beagles und Affenplasma von weiblichen Rhesusaffen wurde eingesetzt. Menschliches Plasma wurde von gesunden weinen Freiwilligen erhalten. Gepooltes Plasma von zumindest 3 Individuen wurde nach dem Zentrifugieren von frisch heparinisierten Blutproben erhalten und bis zur Verwendung bei ≤ –20°C gelagert.
Stabilität
Die Stabilität der Testsubstanzen im Plasma der verschiedenen Spezies wurde vor den Proteinbindungsstudien untersucht.
Bestimmung der nicht-markierten Arzneimittel
Die Bestimmung der Arzneimittel I bis V in Plasma erfolgte nach der Ausfällung der Proteine mit Acetonitril. Die Messung von Arzneimittel IV in Plasma erfolgte mittels HPLC-Analyse unter Einsatz derselben Ausstattung und unter ähnlichen Chromatographiebedingungen wie zuvor beschrieben⁸. Alle anderen nicht-markierten Arzneimittel wurden mittels LC/MS-MS auf einem Triple-Quadrupol-Tandemmassenspektrometer API 3000 (MDS Sciex, Ontario, Kanada) untersucht, das im Positiv-Ionen-Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus (MRM) unter Einsatz von ähnlichen Verfahren wie an anderer Stelle" beschrieben betrieben wurde. Ein 2300-HTLC-System (Cohesive Technologies, Franklin, Mass.) wurde als HPLC-System eingesetzt und im Laminarströmungsmodus betrieben. Die Chromatographie erfolgte unter Einsatz von Gradientenelution. Ein automatischer CTC-HTC-PAL-Probenehmer (CTC Analytics AG, Zingen, Schweiz) wurde eingesetzt.
Messung der Radioaktivität
Die Radioaktivitätskonzentrationen wurden durch herkömmliche Verfahren wie zuvor beschrieben¹² ermittelt.
Proteinbindung durch klassische Verfahren
Ultrafiltration, Gleichgewichtsdialyse und die Bestimmung der freien Anteile eines Arzneimittels über die Verteilung zwischen Erythrozyten und Plasma wurden wie zuvor beschrieben^8,12 durchgeführt.
Beispiel 1
Bestimmung der Proteinbildung über die Verteilung zwischen verdünntem Plasma und Transil^®
Die Proteinbindung aller Arzneimittel wurde über die Verteilung zwischen verdünntem Plasma und Transil^® in vitro bestimmt. Alle Inkubationen erfolgten in Glasröhrchen. Ein isotonischer Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 (Dulbeccos PBS, Sigma D8534), wurde zur Verdünnung des Plasmas verwendet.
Das gesamte Inkubationsvolumen betrug im Allgemeinen 0,3 und 1 ml. Das verdünnte Plasma (150 bis 980 μl) der Testspezies wurde in Glasröhrchen pipettiert, und Transil^® (10 bis 300 μl) wurde zugesetzt. Die in einem kleinen Volumen eines geeigneten Lösungsmittels gelöste Testsubstanz wurde zu den Transil^®-Plasma-Suspensionen zugesetzt.
Der Verdünnungsgrad und das Transil^®-Volumen sollten unter Berücksichtigung des erwarteten f_u-Werts ausgewählt werden. Für starker gebundene Verbindungen müssen eine stärkere Verdünnung und/oder ein höheres Transil^®-Volumen in Betracht gezogen werden (siehe unten).
Die Transil^®-Plasma-Suspensionen wurden bei Raumtemperatur auf einem Laborschüttler 30 min lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Transil^® durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 1800 g von der wässrigen Phase getrennt, nachdem Ali quoten mit 50 bis 100 μl zur Bestimmung der tatsächlichen Konzentrationen in den Transil^®-Plasma-Suspensionen entnommen worden waren.
Die Radioaktivitätskonzentration in der Suspension wurde unmittelbar nach der Inkubation bestimmt. Die Radioaktivitätskonzentration (oder die Arzneimittelkonzentration im Fall von HPLC- oder LC/MS-MS-Analysen) im Plasma wurde nach dem Zentrifugieren ermittelt.
Die Bestimmung der Transil^®/Puffer-Verteilung (die das Maß für die Membranaffinität, MA, ist) erfolgte auf dieselbe Weise. Im Fall von hohen Lipid/Puffer-Konzentrationsverhältnissen (MA_Puffer-Werte > 20.000) wurden die Transil^®-Suspensionen mit isotonischem Phosphatpuffer, pH 7,4, (bis zu 20fach) verdünnt, um das Pipettieren von Volumina unter 10 μl zu vermeiden.
Beispiel 2
Einschätzung von MA_Puffer und f_u in menschlichem Plasma
Eine Einschätzung der Membranaffinität wurde durch einen QSAR-Ansatz wie in Stahlhofen et al.¹⁰ beschrieben berechnet. Die freien Anteile im Plasma wurden unter Einsatz einer von der Bayer AG entwickelten eigenen Software eingeschätzt. (Alternativ dazu können andere Ansätze für eine erste Einschätzung in Bezug auf MA und f_u eingesetzt werden, z. B. log D_7,4 zur Einschätzung der Membranaffinitäten von neutralen Verbindungen und Einschätzungen von f_u basierend auf experimentellen Daten von Arzneimitteln derselben Verbindungsklasse.)
Berechnung von f_u
Der freie Anteil in verdünntem Plasma wurde als Verhältnis der Verteilungskoeffizienten für die Transil^®/Plasma'-(MA_Plasma') und die Transil^®/Puffer-Verteilung (MA_Puffer) berechnet.
Die Berechnung von MA_Puffer wurde wie folgt durchgeführt: Die Gesamtmenge des Arzneimittels in dem Test (n_gesamt) wurde unter Einsatz der Gesamtkonzentration in der Transil^®-Puffer-Suspension, des entsprechenden Inkubationsvolumens (V_gesamt), der Konzentration in dem Puffer (C_Puffer), des Volumens der Silica-Kügelchen (V_Silica) sowie des Lipidvolumens (V_Lipid) wie folgt erhalten:
worin das Volumen der Silica-Kügelchen anhand des Trockengewichts der entsprechenden Transil^®-Charge (dw_Transil®), des Volumens der zugesetzten Transil^®-Suspension (V_Transil®), des Verdünnungsfaktors von Transil^® (dil_Transil®), des Lipidvolumens (V_Lipid), der Silicagel-Dichte (ρ_Silica = 2,1 g/ml) und der Lipiddichte (ρ_Lipid = 1 g/ml) gemäß Gleichung 2) erhalten wurde. Das Trockengewicht sowie der Lipidgehalt (k) der entsprechenden Transil^®-Chargen wurden durch den Hersteller im Analysezertifikat angegeben.
Das Lipidvolumen in dem Test wurde anhand des Lipidgehalts der entsprechenden Transil^®-Charge, des Volumens und des Verdünnungsfaktors der zugesetzten Transil^®-Suspension berechnet: VLipid = k·VTransil®·dilTransil® 3)
In einem zweiten Experiment wurden die Gesamtmenge in der Transil^®-Plasma-Suspension und die Konzentration in dem verdünnten Plasma, C_Plasma', bestimmt. Die Verteilung zwischen Transil^® und dem verdünnten Plasma (scheinbare Membranaffinität in verdünntem Plasma), MA_Plasma', wurde wie folgt berechnet:
Der freie Anteil in dem verdünnten Plasma (f_u') wurde als Verhältnis der beiden Verteilungskoeffizienten berechnet:
Der freie Anteil im unverdünnten Plasma wurde anhand der f_u-Werte in verdünntem Plasma und des Verdünnungsfaktors a wie zuvor beschrieben berechnet (beispielsweise is bei 10fach verdünntem Plasma ist a = 0,1). Es ist anzumerken, dass f_u' weniger als etwa 50% betragen sollte, um eine höhere Variabilität der rückgerechneten freien Anteile in nativem Plasma zu vermeiden⁸.
Beispiel 3
Berechnung der optimalen Transil^®-Volumina für neue Verbindungen
Die Gleichungen 1–3 können umgeformt werden, um das optimale Transil^®-Volumen zur Bestimmung der MA für eine neue Verbindung zu berechnen. Die berechneten MA_Puffer-Werte und freien Anteile werden als Ausgangseinschätzungen für die Berechnung verwendet. Die optimalen Testbedingungen werden erfüllt, wenn die Mengen des Arzneimittels in Gleichgewicht in der Lipidphase und in dem Puffer (oder Plasma) gleich sind (n_Puffer oder n_Plasma oder n_Plasma' = n_Lipid = 0,5·n_gesamt) (Stahlhofen et al.¹⁰). Der Ausdruck (n_gesamt/n_Lipid – 1) in der folgenden Gleichung entspricht dann 1, und das optimale V_Transil® für die Transil^®/Puffer-Verteilung kann wie folgt berechnet werden:
Die Berechnung der Transil^®/Plasma Verteilung ist der der Transil^®/Puffer-Verteilung ähnlich, nur der Wert für MA_Puffer muss durch MA_Plasma' ersetzt werden, wobei gilt:
wobei a der Verdünnungsfaktor des Plasmas ist, beispielsweise ist a = 0,1 bei 10fach verdünntem Plasmas.
Beispiel 4
Konzentrationsabhängigkeit von MA
Die Verteilung ist nur dann von der Arzneimittelkonzentration unabhängig, wenn der Lipidgehalt in der Lipidphase viel größer ist als der Arzneimittelgehalt: Lipidgehalt/n_Lipid ≥ 100 [Mol/Mol].
Das Verhältnis Lipidgehalt/n_Lipid wird wie folgt berechnet:
Durch die Umformung der obenstehenden Gleichung kann die maximale Arzneimittelkonzentration berechnet werden, die in einer Inkubation eingesetzt werden kann (C_gesamt,max) (in der Annahme, dass Lipidgehalt/n_Lipid = 100):
Die Puffer- oder Plasmakonzentration im Gleichgewicht wird anhand der tatsächlich zugesetzten Konzentration (C_gesamt) wie folgt berechnet:
Die Plasmakonzentration in Bezug auf natives Plasma wird dann anhand der Plasmakonzentration in verdünntem Plasma und des Verdünnungsfaktors a (bei 10fach verdünntem Plasma ist a z. B. 0,1) berechnet:
Beispiel 5
Vergleich von durch das Transil^®-Verfahren erhaltenen freien Anteilen mit durch andere Verfahren bestimmten freien Anteilen
Zu Validierungszwecken wurden Arzneimittel mit einer Reihe an physiochemischen Eigenschaften und freien Anteilen ausgewählt. LogP-Werte (pH 7,5) wurden berechnet und betrugen für die Arzneimittel I bis VII jeweils 3,6, 5,6, 1,9, 2,5, 2,6, 2,6 bzw. 2,1. Die freien Anteile der Validierungsverbindungen wurden durch die Verteilung der Arzneimittel zwischen verdünntem Plasma und Transil^® oder durch das zuvor beschriebene Verteilungsverfahren bestimmt. Im Fall von Arzneimittel V wurde die Proteinbindung durch Ultrafiltration als Referenzverfahren bestimmt. Die Verteilung zwischen Puffer und Transil^® wurde bei einer einzigen Arzneimittelkonzentration bestimmt, typischerweise bei 200 μg/l. Gewöhnlicherweise wurden die Vergleiche unter Einsatz derselben Plasmacharge durchgeführt, um Unterschiede in Bezug auf die Proteinbindung aufgrund der Variation zwischen den Chargen zu vermeiden.
Ein vollständiger Datensatz mit typischen Werten für Transil^®-Volumina, der Verdünnungsfaktor des Plasmas, die Arzneimittelkonzentrationen in den Suspensionen und im Plasma im Gleichgewicht sind in Tabelle 1 angeführt.
Tabelle 2 fasst die mit nicht-radiomarkierten Arzneimitteln in Plasma von verschiedenen Spezies bei einer Gesamtkonzentration von etwa 200 μl/g erhaltenen Ergebnisse zusammen. Die freien Anteile von Arzneimittel I betrugen, durch das Transil^®-Verfahren bestimmt, 0,81% und 0,20% in Rattenplasma bzw. menschlichem Plasma. Diese Werte entsprechen annähernd jenen, die durch das Erythrozyten-Verteilungsverfahren bestimmt wurden (f_u = 0,91 bzw. 0,24%). Für das stark lipophile Arzneimittel II wurden sehr geringe, aber ähnliche freie Anteile in Mausplasma, Affenplasma und menschlichem Plasma bestimmt (~0,050%). Die freien Anteile im Rattenplasma waren etwas höher (~0,80%). Die durch das Erythrozyten-Verteilungsverfahren bestimmten f_u-Werte waren fast ident. Im Fall von Arzneimittel III wurden nur die freien Anteile in Rattenplasma verglichen: f_u entsprach bei Bestimmung durch Verteilung zwischen Plasma und Transil^® 1,62% bzw. 1,09% bei Bestimmung durch Verteilung zwischen Plasma und Erythrozyten. Ein etwa 5facher Unterschied in Bezug auf die freien Anteile (Mensch/Ratte) wurde bei Arzneimittel IV beobachtet. Die freien Anteile betrugen bei Bestimmung durch Verteilung zwischen Plasma und Transil^® 4,41% in Rattenplasma bzw. 1,09% in menschlichem Plasma. Die entsprechenden Werte bestimmt durch die Verteilung zwischen Plasma und Erythrozyten betrugen 4,97% bzw. 0,96%. Als letztes Beispiel wurde Arzneimittel V, eine Verbindung mit einem sehr hohen freien Anteil in menschlichem Plasma, ausgewählt. In diesem Fall wurde der Referenzwert für f_u durch Ultrafiltration erhalten: Der freie Anteil in menschlichem Plasma betrug bei Bestimmung durch die Verteilung zwischen Plasma und Transil^® 39,5% bzw. 33,3% bei Bestimmung durch Ultrafiltration.
In Tabelle 3 ist eine Zusammenfassung der für zwei ¹⁴C-markierte Arzneimittel erhaltenen Ergebnisse angeführt. Freie Anteile wurden bei 3 verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen (n = 3/Konzentration) an 2 oder 3 verschiedenen Tagen bestimmt.
Die Experimente unter Einsatz von Transil^® oder des Erythrozyten-Verteilungsverfahrens wurden parallel durchgeführt. In dem getesteten Konzentrationsbereich gab es keine Unterschiede in Bezug auf die freien Anteile, und die an den verschiedenen Tagen erhaltenen Ergebnisse waren fast ident. Aus diesem Grund werden Mittelwerte und Standardabweichungen aufgelistet. Im Fall von Arzneimittel VI wurden in Rattenplasma und menschlichem Plasma sehr ähnliche freie Anteile bestimmt: f_u betrug durch die Verteilung zwischen verdünntem Plasma und Transil^® bestimmt etwa 0,02%. Die entsprechenden Werte, die durch das Erythrozyten-Verteilungsverfahren erhalten wurden, betrugen etwa 0,025% in Rattenplasma bzw. etwa 0,020% in menschlichem Plasma. In Mausplasma betrug der freie Anteil bei Bestimmung durch beide Verfahren etwa 0,087%. Der freie Anteil in Hundeplasma betrug bei Bestimmung durch das neue Verfahren etwa 0,041% und bei Bestimmung durch das Erythrozyten-Verteilungsverfahren etwa 0,034%.
Der in Maus-, Ratten-, Hundeplasma und menschlichem Plasma unter Einsatz des Transil^®-Verfahrens bestimmte freie Anteil von Arzneimittel VII betrug 2,07, 3,59, 2,07 bzw. 1,11%. Die entsprechenden Werte, die unter Einsatz des Erythrozyten-Verteilungsverfahrens ermittelt wurden, waren vergleichbar (mit leicht höheren Werten für menschliches Plasma): f_u betrug in Maus-, Ratten-, Hundeplasma und menschlichem Plasma 2,60, 3,77, 2,12 bzw. 1,71%. Im Fall von Hundeplasma war die Schwankung der Ergebnisse etwas höher als gewöhnlich (Variationskoeffizient von 14–31%), da das Plasma von verschiedenen Hunden eingesetzt wurde, um die Schwankung an verschiedenen Tagen zu untersuchen.
Beispiel 6
Inkubation in 96-Well-Platten
Der Test kann zur Bestimmung von MA_Puffer-Werten leicht an ein Hochdurchsatzformat angepasst werden, wie von Loidl-Stahlhofen et al.^9,10 gezeigt. Um die Adsorption von lipophilen Arzneimitteln zur vermeiden, sollten für alle Inkubationen 96-Well-Platten mit Glaseinlagen eingesetzt werden. Weiters werden die tatsächlichen Kon zentrationen der Transil^®-Puffer-Suspensionen zur Überwachung der Adsorption bestimmt. Ergebnisse können nur dann akzeptiert werden, wenn die Konzentrationsabweichung weniger als 20% der theoretischen Konzentration beträgt.
In-silico-Werte für MA_Puffer und f_u können eingesetzt werden, um die experimentellen Bedingungen (V_Transil® und Plasmaverdünnungsfaktor) zur optimalen Genauigkeit einzustellen. Da diese In-silico-Werte ein hohes Maß an Unsicherheit aufweisen können, wird vorgeschlagen, Inkubationen mit 2 verschiedenen Transil^®-Volumina durchzuführen, damit zumindest eine Inkubation unter annehmbaren n_Puffer/n_Lipid-Bedingungen (siehe unten) durchgeführt wird, auch wenn die MA-Schätzung deutlich von dem wahren Wert abweicht. Weiters wird empfohlen, die MA_Puffer-Werte zuerst zu bestimmen, da die Experimente mit Plasma dann genauer gestaltet werden können. Eine Vernachlässigung von V_Silica und V_Lipid im Vergleich mit V_gesamt führt zu einer vereinfachten Version von Gleichung 7):
wobei
Das theoretische Optimum für V_Transil® wird anhand der Gleichung 12 mit n_Puffer/n_Lipid = 1 berechnet. Wenn der echte MA_Puffer 5-mal höher ist als der für die Berechung von V_Transil® eingesetzte geschätzte Wert, beträgt n_Puffer/n_Lipid etwa 0,2. Wie aus Gleichung 13 hervorgeht, würde ein solcher Fall keine relevante Wirkung auf die Genauigkeit der Bestimmung von MA haben, da n_Puffer direkt über C_Puffer bestimmt wird und n_gesamt deutlich höher ist als n_Puffer. Wenn MA_Puffer 5-mal niedriger ist als der geschätzte Wert, beträgt n_Puffer/n_Lipid etwa 5, was zu einer geringen Differenz zwischen n_gesamt und n_Puffer im Nenner von Gleichung 13 führt. Dadurch sinkt die Genauigkeit in der Folge deutlich. Aus diesem Grund wird empfohlen, die Bestimmung von MA_Puffer mit einem zusätzlichen V_Transil® durchzuführen, das etwa 5-mal größer ist als der be rechnete Wert für die gleichmäßige Verteilung zwischen Puffer und Lipidphase. Es wird vorgeschlagen, dass nicht mehr als 70% der Gesamtmenge in der Pufferphase vorliegen, was zu einer Obergrenze von etwa 2,3 für n_Puffer/n_Lipid führt.
Auf ähnliche Weise wird das Optimum für V_Transil® zur Bestimmung von MA_Plasma' basierend auf dem erwarteten f_u, dem gemessenen MA_Puffer und dem Plasmaverdünnungsfaktor für Plasma berechnet. MA_Puffer in Gleichung 12 wird durch MA_Plasma', wie in Gleichung 8 beschrieben, ersetzt. Wie aus Gleichung 8 hervorgeht, führt eine Unter- bzw. Überschätzung zu einer fast proportionalen Unter- oder Überschätzung von MA_Plasma', wenn der freie Anteil unter 10% liegt. Aus diesem Grund gelten in Bezug auf Genauigkeit wie oben für MA_Puffer dargelegt dieselben Überlegungen auch für f_u. In der Folge wird der Einsatz eines zusätzlichen, etwa 5-mal größeren V_Transil® auch zur Bestimmung von MA_Plasma' empfohlen. Alternativ dazu kann der Verdünnungsfaktor für das Plasma um das 5fache gesteigert werden, oder eine angemessene Kombination von Plasmaverdünnung und Transil^®-Volumen wird ausgewählt.
Ein Beispiel ist in Tabelle 4 für ein hypothetisches Arzneimittel mit einem freien Anteil von 0,50% und einem MA_Puffer von 10.000 angeführt. Wird ein n_Puffer/n_Lipid-Verhältnis von 2,3 angenommen, wird ein MA_Puffer-Bereich mit 2 Transil^®-Volumina, die von 865 bis über 100.000 berechnet werden, abgedeckt. Zur Bestimmung von MA_Plasma' wird das Transil^®-Volumen konstant gehalten, aber der Verdünnungsfaktor wird um das 5fache gesteigert, was dazu führt, dass ein f_u-Bereich von 0,041 bis 5,0% abgedeckt wird. Es muss berücksichtigt werden, dass der freie Anteil in dem verdünnten Plasma weniger als 50% betragen sollte, damit eine höhere Variabilität der rückgerechneten Werte vermieden wird⁸. Diese Bedingung schränkt die Obergrenze für f_u, die bestimmt werden kann, ein (siehe Tabelle 4). Aus diesem Grund wird empfohlen, den maximalen Verdünnungsfaktor für Plasma zunächst durch Umformen der Gleichung 6 wie folgt zu berechnen:
Zur Berechnung des Verdünnungsfaktors wird der obere Wert von f_u (z. B. 10-mal höher als der berechnete freie Anteil) eingesetzt, wie in dem in Tabelle 4 angeführten Beispiel durchgeführt wurde. Das führt zu einem Verdünnungsfaktor von etwa 0,02. Dieser Wert wird nun zur Berechnung des optimalen Transil^®-Volumens für einen freien Anteil von 0,5% eingesetzt.
Diese Beispiele zeigen, dass durch das oben beschriebene Verfahren MA_Puffer-Werte und freie Anteile im Hochdurchsatzformat bestimmt werden können, auch wenn sich die echten und geschätzten Werte um einen Faktor von 10 in beide Richtungen unterscheiden.
Beispiel 7
Bestimmung der Konzentrationsabhängigkeit des freien Anteils
Typischerweise erfolgen Inkubationen in Puffer oder in (verdünntem) Plasma mit einer Konzentration von 200 μg/l, um sicherzustellen, dass das Verhältnis Lipidgehalt/n_Lipid (siehe Gleichung 9) mehr als 100 beträgt und dass die Konzentration im Gleichgewicht in Bezug auf natives Plasma zumindest 10-mal geringer ist als die molare Konzentration des Hauptbindungsproteins in dem Plasma. Dieses Verfahren reicht gewöhnlicherweise während der Arzneimittelentwicklung aus. Während der Arzneimittelentwicklung muss jedoch zusätzlich dazu der freie Anteil in deutlich höheren Konzentrationen bestimmt werden als sie z. B. bei toxikokinetischen Experimenten zu beobachten sind. Die Maximalkonzentration, die bei der Inkubation unter der Voraussetzung eingesetzt werden kann, dass das Verhältnis Lipidgehalt/n_Lipid zumindest 100 beträgt, wird unter Einsatz von Gleichung 10 berechnet. Die Plasmakonzentration bei Gleichgewicht wird im Vergleich zu nativem Plasma anhand Gleichung 11 und 11a unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors des Plasmas berechnet. Tabelle 5 führt ein Beispiel für 2 hypothetische Arzneimittel mit freien Anteilen von 0,10% bzw. 0,50% an. Es wird angenommen, dass MA_Puffer-Werte 50.000 bzw. 10.000 betragen. Es ist ersichtlich, dass die Konzentration in Zusammenhang mit nativem Plasma durch eine Steigerung der Plasmaverdünnung gesteigert werden kann: Unter Einsatz von unverdünntem Plasma bei der Inkubation kann eine Maximalkonzentration von 263 μM bei Gleichgewicht erzielt werden, während unter Einsatz von 100fach verdünntem Plasma eine deutlich höhere Konzentration (393 μM) erhalten wird. Der Einfluss der Verdünnung ist im Fall von Arzneimittel B nicht so deutlich: Die Gleichgewichtskonzentration in Zusammenhang mit nativem Plasma wird von 263 auf 289 μm gesteigert. Diese Beispiele zeigen, dass freie Anteile bei sehr hohen Plasmakonzentrationen durch eine angemessene Anpassung des Verdünnungsfaktors des Plasmas bestimmt werden können. Der Einfluss des Verdünnungsfaktors kann jedoch für manche Kombinationen von MA_Puffer und freien Anteilen gering sein (siehe Beispiel B).
Für Arzneimittel I wurde die Konzentrationsabhängigkeit von f_u in Bezug auf menschliches saures α₁-Glykoprotein (AGP) untersucht, und Bindungsparameter (Anzahl der Bindungsstellen, n, Dissoziationskonstante, K_d) wurden berechnet (siehe 1). Die K_d wurde auf 0,069 μM geschätzt, und n betrug annähernd 1, was darauf hindeutet, dass AGP ein wichtiges Bindungsprotein im menschlichen Plasma ist (unter der Annahme, dass die AGP-Konzentration im menschlichen Plasma 16 μM beträgt, beträgt der anhand n und K_d berechnete freie Anteil etwa 0,43%, wobei der gemessene f_u 0,20 bis 0,24% beträgt, siehe Tabelle 2). Dieses Beispiel zeigt, dass das hierin beschriebene Verfahren die Dosisabhängigkeit von f_u angemessen bewertet und zur Bestimmung der Bindungsparameter geeignet ist.
Beispiel 8
Bestimmung von MA_Puffer im Fall von stark lipophilen Arzneimitteln
Wenngleich alle Inkubationen in Glasteströhrchen erfolgten, kann Adsorption in manchen Fällen nicht verhindert werden, und zwar bei Inkubationen, in denen die Arzneimittel in Protein-freien Lösungen verwendet werden. Dies wird durch eine starke Abweichung in Bezug auf zugesetzte und gemessene Konzentration in der Referenz nachgewiesen. Bei einigen wenigen Arzneimitteln, z. B. Arzneimittel II, führte auch die Verwendung von silanisierten oder siliconisierten Röhrchen nicht zu einer wesentlichen Verbesserung, und nur 20 bis 50% der zugesetzten Konzentrationen waren in der Referenz zu finden. Um die Adsorption zu minimieren, hat sich folgendes Verfahren als äußerst nützlich erwiesen: Gewöhnlicherweise werden Transil^®-Volumina so angepasst, dass eine 1:1-Verteilung des Arzneimittels zwischen der Lipidphase und dem Puffer wie unter Materialien und Verfahren beschrieben erhalten wird. Wenn man n_Puffer/n_Lipid-Verhältnisse akzeptiert, die deutlich geringer sind als 1 (z. B. 0,1 oder 0,05), führt das zu größeren Transil^®-Volumina, wie durch Gleichung 12 berechnet. Wie obenstehend dargelegt ermöglicht ein niedriges n_Puffer/n_Lipid-Verhältnis immer noch eine genaue Bestimmung von MA, wobei jedoch die Anforderungen in Bezug auf die Testgenauigkeit bei geringen Konzentrationen ansteigen. Die Verwendung von größeren Transil^®-Volumina hat einen großen Einfluss auf die maximale Arzneimittelkonzentration (C_total,max), die zu Inkubation verwendet werden kann, gemäß Gleichung 10, jedoch ohne die Pufferkonzentration bei Gleichgewicht zu beeinflussen (Gleichung 11). Ein Beispiel ist in Tabelle 6 für 2 Arzneimittel mit Membranaffinitäten von 10.000 bzw. 100.000 angeführt: Unter herkömmlichen Inkubationsbedingungen (n_Puffer/n_Lipid = 1) beträgt C_gesamt,max nur etwa 1,2 und 0,12 μg/ml. Wenn ein n_Puffer/n_Lipid-Verhältnis von 0,1 akzeptiert wird, können 5,5-mal höhere Konzentrationen eingesetzt werden, die bei einem n_Puffer/n_Lipid-Verhältnis von 0,05 noch etwa um das 2fache gesteigert werden können. Die Verwendung von so hohen Arzneimittelkonzentrationen hat den Vorteil, dass reaktive Stellen an den Glasröhrchen gesättigt werden und die Adsorption aufgrund der starken Akkumulation in der Lipidphase vermieden wird. Durch dieses Verfahren waren die Erfinder der vorliegenden Erfindung in der Lage, sogar die Adsorption von kritischen Arzneimitteln vollständig zu verhindern und zuverlässige Ergebnisse zu ermitteln. Der Vergleich der durch das Transil^® Verfahren bestimmten freien Anteile von Arzneimittel II und der durch das Erythrozyten-Verteilungsverfahren bestimmten freien Anteile zeigt eine hervorragende Übereinstimmung (siehe Tabelle 2).
Beispiel 9
Bestimmung der relativen f_u zwischen verschiedenen Spezies
In vielen Fällen ist es relevanter, die relativen freien Anteile zwischen verschiedenen Spezies zu kennen, als die absoluten Werte zu kennen (z. B. Zufuhr bei Menschen und Zufuhr bei Tieren in Sicherheitsstudien). Der relative f_u kann ohne die Bestimmung von MA_Puffer wie folgt berechnet werden:
wobei f_u,1 und f_u,2 die freien Anteile in Spezies 1 und 2 darstellen und MA_Plasma,1 und MA_Plasma,2 die entsprechenden Lipid/Plasma-Verteilungskoeffizienten. Wenn es erforderlich ist, die Plasma/Lipid-Verteilung in verdünntem Plasma zu bestimmen (bei stark gebundenen Arzneimitteln), kann eine gute Näherung für den echten f_u,rel-Wert wie folgt erhalten werden:
worin a₁ und a₂ die Verdünnungsfaktoren für das Plasma von Spezies 1 bzw. Spezies 2 sind.
Erwägungen in Bezug auf die Fehlerfreiheit und Genauigkeit dieses Verfahrens wurden für das Erythrozyten-Verteilungsverfahren wie zuvor beschrieben angestellt⁸.
Beispiel 10
Bestimmung der freien Anteile im HTS-Format
Das folgende Verfahren dient in den Laboratorien der Erfinder dazu, freie Anteile im HTS-Format zu bestimmen: Membranaffinitäten in Puffer werden zunächst in zwei verschiedenen Transil^® Volumina unter Einsatz von berechneten MA_Puffer-Werten bestimmt, um die oben beschriebenen Experimente zu planen. Dieser Ansatz stellt sicher, dass die Membranaffinitäten mit Sicherheit in einem Experiment mit guter Genauigkeit bestimmt werden können, auch wenn die berechneten und gemessenen Affinitäten stark voneinander abweichen. Gemessene Membranaffinitäten in Puffer werden dann eingesetzt, um die Experimente in verdünntem Plasma der Spezies von Interesse zu gestalten. Es werden erneut Inkubationen mit Plasma mit zwei verschiedenen Transil^®-Volumina und/oder verschiedenen Plasmaverdünnungen durchgeführt, um einen weiten Bereich an möglichen freien Anteilen in einem Experiment abzudecken.
Beispiel 11
Bestimmung der freien Anteile mit nicht-linearer Proteinbindung
Das Transil^®-Verfahren zeigt auch eine Nicht-Linearität in der Proteinbindung korrekt an, wie sie für die konzentrationsabhängige Bindung von Arzneimittel I in α₁-Glykoprotein-Lösungen dargestellt wird. Bindungsparameter konnten mit guter Genauigkeit bestimmt werden. Die Konzentrationsabhängigkeit von f_u in Plasma bei relevanten Konzentrationen wie z. B. bei toxikokinetischen Experimenten beobachtet kann bis zu sehr hohen Arzneimittelkonzentrationen erfolgen, da die Verteilung von Arzneimitteln in den Lipidmembranen nicht von der Arzneimittelkonzentration abhängig ist, vorausgesetzt dass der Lipidgehalt in der Lipidphase deutlich größer ist als der Arzneimittelgehalt. Die Maximalkonzentration in nativem Plasma (unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors des Plasmas), die ohne Störung der Verteilung in den Lipiden erreicht werden kann, hängt von der Membranaffinität und dem freien Anteil des entsprechenden Arzneimittels ab. Wie oben dargestellt kann diese durch die Anpassung des Verdünnungsfaktors des Plasmas gesteigert werden. Es ist anzumerken, dass zur Bewertung der Konzentrationsabhängigkeit von f_u die Transil^®-Volumina gemäß dem f_u angepasst werden können, der erwartungsgemäß unter optimalen Testbedingungen (n_Puffer/n_Lipid ~ 1) funktionieren müsste. Als allgemeine Leitlinie wird angenommen, dass die Proteinbindung von der Konzentration unabhängig ist, wenn nicht ein 10facher Überschuss an freien Bindungsproteinen vorhanden ist. In der Annahme einer 1:1-Bindung von stark an Plasmaproteine gebundene Arzneimittel an das Protein (f_u < 2%) wird bei einer Arzneimittelkonzentration, die 50% der Konzentration des Hauptbindungsproteins erreicht, ein 2facher Anstieg von f_u erwartet. Bei einer Arzneimittelkonzentration, die 75% der Proteinkonzentration erreicht, wird ein etwa 4facher Anstieg von f_u erwartet (siehe Anhang 1). Bei einer signifikanten Bindung eines Arzneimittels an verschiedene Plasmaproteine kommt es in Abhängigkeit von den Konzentrationen der entsprechenden Bindungsproteine und der Affinitätskonstanten des Arzneimittels in Bezug auf die Proteine bei höheren Arzneimittelkonzentrationen zu einem vergleichbaren Anstieg der freien Anteile.
Beispiel 12
Bestimmung der pH-Abhängigkeit der freien Anteile
Wie von Loidl-Stahlhofen et al.¹⁰ berichtet, sind die festkörpergestützten Lipidmembranen bis zu hohen pH-Werten stabil. Aus diesem Grund kann die pH-Abhängigkeit der freien Anteile, wie es während der Arzneimittelentwicklung erforderlich ist, überwacht werden.
Beispiel 13
Bestimmung des Anstiegs von f_u in Abhängigkeit von der Arzneimittelkonzentration im Plasma unter der Annahme der Bindung an ein einziges Protein
Die Bindung eines Arzneimittels an ein Protein kann wie folgt beschrieben werden:
worin C die Arzneimittelgesamtkonzentration ist, C_u die Konzentration des ungebundenen Arzneimittels ist, C_Prot die Proteingesamtkonzentration ist, n die Anzahl der Bindungsstellen an dem Protein ist und K_d die Dissoziationskonstante des Protein-Substanz-Komplexes ist. Das Einsetzen von C_u = C·f_u und eine Umformung ergibt:
Bei einem geringen freien Anteil nähert sich der Ausdruck (f_u – f_u ²) f_u an, und der Ausdruck K_d·(f_u – 1) nähert sich –K_d an, wodurch die Gleichung A2) wie folgt vereinfacht werden kann:
Die Arzneimittelkonzentration (C_x), bei der ein x-facher Anstieg beobachtet wird, entspricht demnach:
Wird ein zumindest 10facher Überschuss an freien Bindungsstellen in dem Protein angenommen, entspricht K_d/f_u = n·C_Prot/(1 – f_u) ~ n·C_Prot bei geringen freien Anteilen, wobei der Prozentsatz der Arzneimittelkonzentration in Bezug auf die Proteinkonzentration wie folgt dargestellt werden kann:
Es wird z. B. ein 2facher Anstieg der freien Anteile beobachtet, wenn die Arzneimittelkonzentration 50% der Proteinkonzentration beträgt. Ein x-facher Anstieg der freien Anteile wird beobachtet, wenn:
Der Fehler in den Gleichungen A5 und A6 beträgt nur weniger als etwa 10%, wenn f_u in der Lösung mit höherer Arzneimittelkonzentration weniger als 8% beträgt.
Obenstehend wurden folgende Abkürzungen verwendet:

C: Arzneimittelgesamtkonzentration in einer Proteinlösung
C_u: Konzentration des ungebundenen Arzneimittels in einer Proteinlösung
C_Prot: Gesamtproteinkonzentration im Plasma
f_u: Anteil an freiem (ungebundenem) Arzneimittel in einer Proteinlösung
K_d: Dissoziationskonstante des Protein-Arzneimittel-Komplexes
n: Anzahl der Bindungsstellen des Proteins
C_x: Arzneimittelgesamtkonzentration in einer Proteinlösung, bei der ein x-facher Anstieg des freien Anteils zu beobachten ist.

Tabelle 1
Ein vollständiger Datensatz mit typischen Werten für die Transil^®-Volumina, den Verdünnungsfaktor des Plasmas, die Arzneimittelkonzentration in der Suspension und im Plasma bei Gleichgewicht ist angeführt. Ungebundene Anteile (f_u) von Arzneimittel I in Rattenplasma und menschlichem Plasma wurden durch die Verteilung zwischen dem verdünnten Plasma der jeweiligen Spezies und Transil^® bestimmt. Die Plasma- und Pufferkonzentrationen wurden mittels IC/MS-MS gemessen. Es werden arithmetische Mittelwerte von 4–5 Bestimmungen und Standardabweichungen (in Klammer) angegeben (der Lipidgehalt der verwendeten Transil^®-Chargen betrug 9,1 bzw. 12,5 μl/ml für Ratten bzw. Menschen, und das Trockengewicht betrug 223 bzw. 207 mg/ml).
Tabelle 5

Gleichgewichtsarzneimittelkonzentration in nativem Plasma in Abhängigkeit von f_u, MA_Puffer und dem Verdünnungsfaktor des Plasmas (Lipidgehalt: 72,0 μl/ml, Trockengewicht Transil^®: 223 mg/ml, MG Arzneimittel: 459).

	Arzneimittel A		Arzneimittel B
f_u [%]	0,500		0,100
^MAPuffer	10.000		50.000
Verdünnungsfaktor des Plasmas	1,00	0,010	1,00	0,010
C_gesamt, maximal [μg/ml]	232	3,61	232	2,65
C_Plasma, nativ [μM]	263	393	263	289
Lipidgehalt/n_Lipid [Mol/Mol]	100	100	100	100

Tabelle 6

Maximale Inkubationskonzentration eines Arzneimittels in Abhängigkeit von MA_Puffer und n_Puffer/n_Lipid (Lipidgehalt: 72,0 μl/ml, Trockengewicht Transil^®: 223 mg/ml, MG Arzneimittel: 459, Inkubationsvolumen: 0,5 ml).

	n_Puffer/n_Lipid akzeptiert
	1,0		0,10		0,05
^MAPuffer	10.000	100.000	10.000	100.000	10.000	100.000
V_Transil® [μl]	0,694	0,0694	6,93	0,694	13,8	1,39
C_gesamt, maximal [μg/ml]	1,21	0,121	6,63	0,664	12,6	1,27
C_Puffer [μg/ml]	0,604	0,0604	0,604	0,0604	0,604	0,0604
Lipidgehalt/n_Lipid [Mol/Mol]	100	100	100	100	100	100

Abkürzungen

C

Arzneimittelgesamtkonzentration in einer Proteinlösung

C_u

Konzentration von ungebundenem Arzneimittel in einer Proteinlösung

C_Prot

Proteingesamtkonzentration im Plasma

f_u

Anteil von freiem (ungebundenem) Arzneimittel in einer Proteinlösung

K_d

Dissoziationskonstante des Protein-Arzneimittel-Komplexes

n

Anzahl der Bindungsstellen an dem Protein

C_x

Arzneimittelgesamtkonzentration in einer Proteinlösung, bei der ein x-facher Anstieg des freien Anteils zu beobachten ist.

Claims

Verfahren zur Bestimmung des freien Anteils einer Substanz, umfassend: (a) Inkubation der Substanz mit einer Suspension von Teilchen, die keine Erythrozyten sind, sondern bei denen es sich um festkörpergestützte Lipidmembranen handelt, in einer Pufferlösung zur Bestimmung der Verteilung der Substanz zwischen den Teilchen und der Pufferlösung; (b) Inkubation der Substanz mit einer Suspension von Teilchen, die keine Erythrozyten sind, sondern bei denen es sich um festkörpergestützte Lipidmembranen handelt, in Plasma zur Bestimmung der Verteilung der Substanz zwischen den Teilchen und dem Plasma; und (c) Bestimmung des freien Anteils der Substanz aus den unter (a) und (b) bestimmten Verteilungen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Suspension von Teilchen aus einer Gruppe von Suspensionen ausgewählt ist, umfassend: (a) eine Suspension von Teilchen mit einem festen Kern; (b) eine Suspension von Teilchen mit einem festen Kern, der ein Silica-Kügelchen umfasst; und (c) eine Suspension von Teilchen, die feste Silica-Teilchen umfassen, welche mit Eigelb-Phosphatidylcholin beschichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Inkubationen der Substanz mit den Suspensionen von Teilchen auf einer Platte mit mehreren Vertiefungen oder auf einer 96-Well-Platte erfolgen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der feste Kern ein ferromagnetischer fester Kern ist.
Verfahren zur Bestimmung des relativen freien Anteils einer Substanz in einer ersten Spezies in Bezug zum freien Anteil der gleichen Substanz in einer zweiten Spezies, gekennzeichnet durch den Einsatz von feststoffgestützten Lipidmembranen, umfassend: (a) Bestimmung der Membranaffinität in Plasma (MAplasma) der Substanz zur ersten Spezies, (b) Bestimmung der Membranaffinität in Plasma (MAplasma) der Substanz zur zweiten Spezies, (c) Bestimmung des relativen freien Anteils aus den unter den Schritten (a) und (b) erhaltenen Ergebnisse.
Set zum Einsatz in einem der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend eine Platte mit mehreren Vertiefungen, eine Pufferlösung, Plasma und Teilchen, ausgewählt aus einer Gruppe von Teilchen, umfassend: (a) Teilchen mit einem festen Kern; (b) Teilchen mit einem festen Kern, der ein Silica-Kügelchen ist; und (c) feste Silica-Teilchen, welche mit Eigelb-Phosphatidylcholin beschichtet sind, worin das Set Plasma von zwei unterschiedlichen Spezies umfasst.
Set nach Anspruch 6, worin spezifische Mengen von Teilchen in den Vertiefungen der Platte platziert sind.