CN115739042A - 一种表面修饰磁性纳米颗粒及分离水中多价噬菌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面修饰磁性纳米颗粒及分离水中多价噬菌体的方法。本发明通过将4‑(2‑氨基苯基)苯胺和纳米磁性颗粒混合，制备得到表面氨基化的纳米磁性颗粒(NPs‑NH2)，然后分别用EDC与NHS活化上述NPs‑NH2后交联万古霉素，随后采用mPEG‑SC10000溶液重悬进行PEG涂层，获得表面修饰磁性纳米颗粒。本发明还提供一种利用上述表面修饰磁性纳米颗粒分离水中多价噬菌体的方法，利用表面修饰的纳米磁性颗粒的属性，将其作为载体在细菌悬浮培养液中吸附目标细菌，然后在噬菌体原液中特异性吸附对应宿主细胞的噬菌体，利用外加磁场实现分离，然后对噬菌体进行扩培得到噬菌体扩培液，将新得到的噬菌体扩培液加入到下一种宿主细胞混合物中重复吸附、分离和扩培程序，可获得多价噬菌体。
Description
技术领域
本发明属于污水生物处理领域，具体涉及一种表面修饰磁性纳米颗粒及分离水中多价噬菌体的方法。
背景技术
噬菌体是一种专性感染原核生物的病毒，自身没有内在代谢，需要借助宿主细胞的代谢机制来支持其繁殖。在自然水生生态系统中，噬菌体已被证明为形成微生物群落、碳循环和基因转移等的重要驱动力。有研究表明，污水处理系统中噬菌体浓度约为108～1010个/mL，高于任何其他生态系统，因此相关研究的应用收到越来越广泛的关注。目前功能性噬菌体均从环境中取样筛选，通常将提取液经过超声振荡和离心处理取得上清液，经灭菌滤膜过滤除菌后，使用切向流过滤/超滤技术缩小滤液体积，进行噬菌体富集，最后采用双层平板法来筛选分离噬菌体。然而，传统分离噬菌体的方法耗时长、效率低，且对噬菌体活力损耗大，一次性只能分离得到单价噬菌体。
磁性纳米颗粒是一种具有多种优异性能的新型磁性材料，具有超顺磁性等特点，通过表面改性或化学修饰可以在其表面修饰上多种功能基团以得到功能化的磁性纳米颗粒，偶联生物学大分子，实现多价噬菌体的高效保活分离。目前，亟需一种从污水中分离得到多价噬菌体的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，并提供一种表面修饰磁性纳米颗粒及分离水中多价噬菌体的方法。
本发明所采用的具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，具体如下：
S1：向4-(2-氨基苯基)苯胺的水溶液中加入盐酸溶液，形成4-氨基苯胺混合液；将纳米碳化铁磁性颗粒超声分散到水中得到第一悬浮液，再将所述4-氨基苯胺混合液加入第一悬浮液中，超声分散后得到第二悬浮液；将亚硝酸钠的水冷却溶液滴加到所述第二悬浮液中，得到第三悬浮液；对所述第三悬浮液中的磁性颗粒进行磁分离和清洗，得到表面氨基化纳米磁性颗粒；
S2：将所述表面氨基化纳米磁性颗粒分散于MES缓冲液中，室温下超声激活；再将激活后的表面氨基化纳米磁性颗粒加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混匀后静置，再加入万古霉素溶液进行孵育培养，从而活化表面氨基化纳米磁性颗粒；分离活化后的表面氨基化纳米磁性颗粒，洗涤后得到活化纳米磁性颗粒；
S3：将所述的活化纳米磁性颗粒加入mPEG-SC10000溶液中，通过重悬处理进行PEG涂层修饰，得到表面修饰磁性纳米颗粒。
作为上述第一方面的优选，所述4-氨基苯胺混合液的配制方法为：将1mL 97％的4-(2-氨基苯基)苯胺与20mL水混合，然后加入2mL质量分数为10％的盐酸溶液，形成4-氨基苯胺混合液；优选的，所述第一悬浮液的配制方法为：将2g纳米碳化铁磁性颗粒分散到100ml蒸馏水中，超声浴15min；优选的，所述亚硝酸钠的水冷却溶液为12mmol/L亚硝酸钠的蒸馏水冷却溶液，其温度为0℃，加到所述第二悬浮液中的水冷却溶液质量为820mg。
作为上述第一方面的优选，所述磁分离和清洗的方法为：通过钕基永磁体对第三悬浮液中的纳米磁性颗粒进行沉降处理，磁滗析后，依次用水、乙醇、乙酸乙酯和丙酮超声洗涤沉淀的纳米磁性颗粒，且每一次超声洗涤后均用磁性材料吸引回收纳米磁性颗粒。
作为上述第一方面的优选，S2中，进行所述超声激活的方法为：将1mg所述表面氨基化纳米磁性颗粒加入2mL MES缓冲液中，室温超声激活3～5分钟。
作为上述第一方面的优选，S2中，活化所述表面氨基化纳米磁性颗粒的方法为：将激活后的表面氨基化纳米磁性颗粒加入0.3mL浓度为20mg/mL的胺反应性N-羟基丁二酰亚胺和0.4mL浓度为20mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混匀后静置5min，再加入0.2ml浓度为2mg/ml的万古霉素溶液，混匀后4℃下孵育培养6小时。
作为上述第一方面的优选，S3中，孵育培养完毕后，通过静置分离的方式从溶液中分离出表面氨基化纳米磁性颗粒，再分别使用MES缓冲液和超纯水各洗涤一次；优选的，在静置分离过程中通过外加磁力进行加速沉降。
作为上述第一方面的优选，S3中，所述重悬处理方法为：将孵育培养完毕后分离的活化纳米磁性颗粒进行去离子水洗涤，再加入1ml浓度为0.4mg/ml的mPEG-SC10000溶液，于4℃下以10rpm的转速旋转1小时后，再用去离子水洗涤回收。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的制备方法制得的一种表面修饰磁性纳米颗粒。
第三方面，本发明提供一种利用第二方面的表面修饰磁性纳米颗粒分离水中多价噬菌体的方法，具体如下：
步骤1、将所述的表面修饰磁性纳米颗粒作为磁珠载体，加入至少两组细菌悬浮培养液中分别对细菌进行吸附，得到宿主细胞混合物；其中，每一组细菌悬浮培养液中含有单一的细菌种类，不同组细菌悬浮培养液中包含的细菌种类不同；
步骤2、将待分离的噬菌体原液加入一种宿主细胞混合物中混合孵育，使部分噬菌体以磁珠载体上附着的细菌为宿主细胞进行特异性吸附，然后通过外加磁场将磁珠载体及其附着物从宿主细胞混合物中分离，再将分离得到的磁珠载体及其附着物重新在当前的宿主细胞混合物所对应的单一细菌培养液中进行培养富集，得到噬菌体富集液；
步骤3、再依次针对剩余的每一种宿主细胞混合物，取在前一种单一细菌中培养富集得到的噬菌体富集液，按照步骤2中的做法进行混合孵育、分离以及培养富集；以在最后一种宿主细胞混合物中富集得到的噬菌体作为最终分离的多价噬菌体。
作为上述第三方面的优选，所述待分离的噬菌体原液为从污水处理厂收集的污泥样本中提取的噬菌体原液。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
本发明提供了一种表面修饰磁性纳米颗粒以及利用该表面修饰磁性纳米颗粒分离水中多价噬菌体的方法，该磁性纳米颗粒经表面修饰后的固有属性吸附特定细菌，可以从污水处理厂的污泥样本提取所得的噬菌体原液中捕集对应宿主细菌的特异性噬菌体。本发明可高效保活地从水中分离得到多价噬菌体。
附图说明
图1为分离多价噬菌体流程示意图；
图2为实施例1中制备的表面修饰纳米磁性颗粒的XPS表征图：(a)为修饰后磁性纳米颗粒的N1s高分辨谱，(b)为修饰后磁性纳米颗粒的C1s高分辨谱；
图3为实施例2中激光共聚焦显微镜扫描图：(a)明亮场下表面修饰磁性纳米颗粒的扫描图；(b)噬菌体和表面修饰磁性纳米颗粒结合的扫描图；
图4为多价噬菌体PEBX(a)、PEBY(b)和PEBZ(c)在混合平板上的透明圆形噬菌斑。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
在本发明的一个较佳实施例中，提供了一种表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其具体步骤如S1～S3所示：
S1：向4-(2-氨基苯基)苯胺的水溶液中加入盐酸溶液，形成4-氨基苯胺混合液；将纳米碳化铁磁性颗粒超声分散到水中得到第一悬浮液，再将上述4-氨基苯胺混合液加入第一悬浮液中，超声分散后得到第二悬浮液；将亚硝酸钠的水冷却溶液滴加到上述第二悬浮液中，得到第三悬浮液；对上述第三悬浮液中的磁性颗粒进行磁分离和清洗，得到表面氨基化纳米磁性颗粒。
作为本发明实施例的一种优选实现方式，上述S1中，4-氨基苯胺混合液的配制方法为：将1mL 97％的4-(2-氨基苯基)苯胺与20mL水混合，然后加入2mL质量分数为10％的盐酸溶液，形成4-氨基苯胺混合液。另外上述第一悬浮液的配制方法为：将2g纳米碳化铁磁性颗粒分散到100ml蒸馏水中，超声浴15min。另外上述亚硝酸钠的水冷却溶液为12mmol/L亚硝酸钠的蒸馏水冷却溶液，其温度为0℃，加到上述第二悬浮液中的水冷却溶液质量为820mg。
作为本发明实施例的一种优选实现方式，上述磁分离和清洗的方法为：通过钕基永磁体对第三悬浮液中的纳米磁性颗粒进行沉降处理，磁滗析后，依次用水、乙醇、乙酸乙酯和丙酮超声洗涤沉淀的纳米磁性颗粒，且每一次超声洗涤后均用磁性材料吸引回收纳米磁性颗粒。
S2：将上述表面氨基化纳米磁性颗粒分散于MES缓冲液中，室温下超声激活；再将激活后的表面氨基化纳米磁性颗粒加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混匀后静置，再加入万古霉素溶液进行孵育培养，从而活化表面氨基化纳米磁性颗粒；分离活化后的表面氨基化纳米磁性颗粒，洗涤后得到活化纳米磁性颗粒。
作为本发明实施例的一种优选实现方式，上述S2中，进行上述超声激活的方法为：将1mg上述表面氨基化纳米磁性颗粒加入2mL MES缓冲液中，室温超声激活3～5分钟。另外活化上述表面氨基化纳米磁性颗粒的方法为：将激活后的表面氨基化纳米磁性颗粒加入0.3mL浓度为20mg/mL的胺反应性N-羟基丁二酰亚胺和0.4mL浓度为20mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混匀后静置5min，再加入0.2ml浓度为2mg/ml的万古霉素溶液，混匀后4℃下孵育培养6小时。
S3：将上述的活化纳米磁性颗粒加入mPEG-SC10000溶液中，通过重悬处理进行PEG涂层修饰，得到表面修饰磁性纳米颗粒。
作为本发明实施例的一种优选实现方式，上述S3中，孵育培养完毕后，通过静置分离的方式从溶液中分离出表面氨基化纳米磁性颗粒，再分别使用MES缓冲液和超纯水各洗涤一次。优选的，在静置分离过程中，可以进一步通过外加磁力进行加速沉降。
作为本发明实施例的一种优选实现方式，上述S3中，重悬处理方法具体为：将孵育培养完毕后分离的活化纳米磁性颗粒进行去离子水洗涤，再加入1ml浓度为0.4mg/ml的mPEG-SC10000溶液，于4℃下以10rpm的转速旋转1小时后，再用去离子水洗涤回收。
基于上述S1～S3所示方法制备得到的表面修饰磁性纳米颗粒，可用于分离水中多价噬菌体，具体的分离方法如下：
步骤1、将上述表面修饰磁性纳米颗粒作为磁珠载体，加入至少两组细菌悬浮培养液中分别对细菌进行吸附，得到宿主细胞混合物。其中，每一组细菌悬浮培养液中含有单一的细菌种类，不同组细菌悬浮培养液中包含的细菌种类不同。
需要说明的是，由于多价噬菌体是能裂解多种细菌即宿主细胞的噬菌体，因此本发明中具体需要配置的细菌悬浮培养液种类N也与希望分离的多价噬菌体的价数相关，N≥2。分离的目标多价噬菌体所希望裂解的每一种宿主细胞都需要对应配置一种宿主细胞混合物。
步骤2、将待分离的噬菌体原液加入一种宿主细胞混合物中混合孵育，使部分噬菌体以磁珠载体上附着的细菌为宿主细胞进行特异性吸附，然后通过外加磁场将磁珠载体及其附着物从宿主细胞混合物中分离，再将分离得到的磁珠载体及其附着物重新在当前的宿主细胞混合物所对应的单一细菌培养液中进行培养富集，得到噬菌体富集液。
需要说明的是，在该步骤中，待分离的噬菌体原液是一种含有大量不同类型噬菌体的复杂溶液体系，其中所含的噬菌体种类越多越有可能提取到目标多价噬菌体。为了保证噬菌体原液中噬菌体的多样性，待分离的噬菌体原液可以是从环境样品中提取的噬菌体原液，优选为从市政污水处理厂收集的污泥样本中提取的噬菌体原液。
需要说明的是，在该步骤中，混合孵育的时间无需过长，一般控制在8～12分钟，能够保证噬菌体与宿主细胞特异性吸附即可。在这个过程中，由于细菌附着在磁珠载体上，而能够与当前的宿主细胞特异性吸附的噬菌体进一步特异性吸附在细菌上，但无法与当前宿主细胞特异性吸附的噬菌体则分散在溶液中，因此在外加磁场分离过程中能够与当前的宿主细胞特异性吸附的噬菌体随着磁珠载体被分离提取。由此培养富集得到的噬菌体富集液中，基本上都是能够与当前的宿主细胞特异性吸附的噬菌体。
步骤3、再依次针对剩余的每一种宿主细胞混合物，取在前一种单一细菌中培养富集得到的噬菌体富集液，按照步骤2中的做法进行混合孵育、分离以及培养富集；以在最后一种宿主细胞混合物中富集得到的噬菌体作为最终分离的多价噬菌体。
需要说明的是，每一种宿主细胞混合物都需要按照步骤2中的做法进行混合孵育、分离以及培养富集的过程，而且这种培养过程是递归进行的，即在第一种宿主细胞混合物中通过混合孵育、分离以及培养富集得到第一种噬菌体富集液(其中的噬菌体能够裂解第一种宿主细胞)后，再将这种噬菌体富集液在第二种宿主细胞混合物中通过混合孵育、分离以及培养富集，得到第二种噬菌体富集液(其中的噬菌体能够同时裂解第一种和第二种宿主细胞)，如果还有第三种噬菌体富集液，则继续用第二种噬菌体富集液在第三种宿主细胞混合物中通过混合孵育育、分离以及培养富集，得到第三种噬菌体富集液(其中的噬菌体能够同时裂解第一种、第二种和第三种宿主细胞)，依次类推。如图1所示，展示了通过两种宿主细胞混合物分离两价噬菌体的流程。
下面通过两个实施例来具体展示前述表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法以及利用制备的表面修饰磁性纳米颗粒分离水中多价噬菌体的效果。
实施例1
本实施提供一种分离水中多价噬菌体的表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，具体如下：
步骤(1)、将1mL 4-(2-氨基苯基)苯胺(SigmaAldrich,97％,浓度为7.59mmol/mL)与20mL蒸馏水混合，然后加入2mL盐酸溶液，形成深黄色的4-氨基苯胺混合液。
将2g纳米磁性颗粒分散到100ml水中，超声浴15min后得到第一悬浮液。
将上述4-氨基苯胺混合液加入上述第一悬浮液中，超声分散获得第二悬浮液。
将820mg浓度为12mmol/L的亚硝酸钠(NaNO2,Sigma-Aldrich)的蒸馏水冷却溶液(0℃)，滴加到上述第二悬浮液中以生成重氮离子，该过程中可立即观察到气体的形成，最终滴加完毕后得到第三悬浮液。
采用1.2T钕基永磁体(K&J Magnetics,N52级，600高斯)对得到的第三悬浮液施加磁力进行磁分离，进而使第三悬浮液中的纳米碳化铁磁性颗粒(铁碳化物碳纳米管Fe3C，Nanostructured&非晶材料公司)沉降处理，再通过磁滗析分离沉淀的纳米磁性颗粒后，依次用水、乙醇、乙酸乙酯和丙酮(各3×40ml)超声洗涤纳米磁性颗粒三次，每一次超声洗涤(溶剂中超声3分钟)后均用磁铁吸引回收纳米磁性颗粒，最终得到表面氨基化纳米磁性颗粒(NPs-NH2)。
步骤(2)、取1mg的NPs-NH2，将其分散在2ml MES缓冲剂中，室温下超声激活3～5分钟。然后分离激活后的NPs-NH2，加入0.3mL浓度为20mg/mL的胺反应性N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和0.4mL浓度为20mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，混匀后静置5min，再加入0.2ml浓度为10mg/ml的万古霉素(vancomycin)，混匀后于4℃下孵育6小时，进而活化上述NPs-NH2，提高反应效率并稳定中间体。待活化结束，NPs-NH2在溶液中沉降后，去除上层清液保留底部沉淀的NPs-NH2，即得到活化纳米磁性颗粒。
步骤(3)、将活化纳米磁性颗粒用去离子水洗涤两次后，加入1ml浓度为0.4mg/ml的mPEG-SC 10000(Biopharma,USA)进行重悬处理，在4℃下以10rpm的转速旋转1小时后，再对沉淀物用去离子水洗涤三次，得到用于噬菌体捕获的表面修饰磁性纳米颗粒。
用XPS表征所得纳米磁性颗粒表面元素组成，其结果如图2所示。如图2中(a)所示，在399.754eV和401.45eV结合能处的两个峰分别属于NH2-C键和N-C键，表明CNC(Fe3C)胺化和万古霉素被胺化的CNCs包覆成功。如图2中农(b)所示，284.55eV的结合能归属于C-C键，287.35eV的结合能归属于万古霉素的C＝O键，进一步确认万古霉素涂层的成功；此外，286.05eV的结合能归属于PEG的C-O-C键，证明了PEG涂层的成功。
实施例2
本实施例提供一种利用上述实施例1制备的表面修饰纳米磁性颗粒分离水中多价噬菌体的方法，具体如下：
(1)从污水处理厂收集污泥样本，采用焦磷酸钠法从污泥絮凝体中分离噬菌体颗粒，然后离心、过滤，去除大于0.2μm的颗粒。滤液中的噬菌体颗粒经PEG沉淀进一步浓缩纯化后，再悬浮于SM缓冲液中作为噬菌体原液。
(2)取1mg实施例1制备的表面修饰纳米磁性颗粒，与1mL新鲜的绿脓杆菌培养液(OD600＝0.1)在室温下混合10分钟，作为第一宿主细胞混合物。同时，取1mg实施例1制备的表面修饰纳米磁性颗粒，与1mL新鲜的大肠杆菌培养液(OD600＝0.1)在室温下混合10分钟，作为第二宿主细胞混合物。
(3)将噬菌体原液加入到第一宿主细胞混合物中，在管中孵育培养10分钟，让噬菌体吸附在第一宿主细胞上，然后使用钕基永磁体(K&J Magnetics,N52,600gauss)将吸附噬菌体第一宿主细胞混合物吸引到管的底部。
(4)分离去除上层液体，留下底部的1ml固液混合物(含有噬菌体、宿主细胞和表面修饰纳米磁性颗粒)，加入新鲜的绿脓杆菌9ml培养4小时，对噬菌体进行扩培富集，富集得到第一噬菌体富集液；
(5)将上述的第一噬菌体富集液加入到第二宿主细胞混合物中，然后按照与第一宿主细胞混合物相同的做法，重复之前的吸附、分离和扩培富集程序，得到第二噬菌体富集液。
(6)将第二噬菌体富集液梯度稀释(10-4～10-9)后进行双层平板实验，纯化获得三株噬菌体，依次命名为PEBX、PEBY、PEBZ。
(7)将筛选纯化得到的三株噬菌体PEBX、PEBY、PEBZ进行双层平板实验，已验证其侵染能力。
本实施例中，为了证明表面修饰磁性纳米颗粒与噬菌体出现了结合，以噬菌体PEBX为例进行了结合前后的激光共聚焦显微镜扫描。图3为激光共聚焦显微镜扫描结果，从图3(a)中可见，明亮场下表面修饰磁性纳米颗粒的扫描图，从图3(b)中可见，由于sybr-金染色PEBX,PEBX-cnc复合物发出绿色荧光，表明噬菌体和表面修饰磁性纳米颗粒出现了结合。
另外，PEBX、PEBY、PEBZ的双层平板实验中，平板培养至绿脓杆菌和大肠杆菌混合形成清晰的斑块，如图4所示，结果表明，三株筛选得到的噬菌体PEBX、PEBY、PEBZ均具备侵染绿脓杆菌、大肠杆菌两种目标细菌的能力。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，具体如下：
S1：向4-(2-氨基苯基)苯胺的水溶液中加入盐酸溶液，形成4-氨基苯胺混合液；将纳米碳化铁磁性颗粒超声分散到水中得到第一悬浮液，再将所述4-氨基苯胺混合液加入第一悬浮液中，超声分散后得到第二悬浮液；将亚硝酸钠的水冷却溶液滴加到所述第二悬浮液中，得到第三悬浮液；对所述第三悬浮液中的磁性颗粒进行磁分离和清洗，得到表面氨基化纳米磁性颗粒；
S2：将所述表面氨基化纳米磁性颗粒分散于MES缓冲液中，室温下超声激活；再将激活后的表面氨基化纳米磁性颗粒加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混匀后静置，再加入万古霉素溶液进行孵育培养，从而活化表面氨基化纳米磁性颗粒；分离活化后的表面氨基化纳米磁性颗粒，洗涤后得到活化纳米磁性颗粒；
S3：将所述的活化纳米磁性颗粒加入mPEG-SC10000溶液中，通过重悬处理进行PEG涂层修饰，得到表面修饰磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种分离水中多价噬菌体的表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述4-氨基苯胺混合液的配制方法为：将1mL 97％的4-(2-氨基苯基)苯胺与20mL水混合，然后加入2mL质量分数为10％的盐酸溶液，形成4-氨基苯胺混合液；优选的，所述第一悬浮液的配制方法为：将2g纳米碳化铁磁性颗粒分散到100ml蒸馏水中，超声浴15min；优选的，所述亚硝酸钠的水冷却溶液为12mmol/L亚硝酸钠的蒸馏水冷却溶液，其温度为0℃，加到所述第二悬浮液中的水冷却溶液质量为820mg。
3.根据权利要求1所述的一种分离水中多价噬菌体的表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述磁分离和清洗的方法为：通过钕基永磁体对第三悬浮液中的纳米磁性颗粒进行沉降处理，磁滗析后，依次用水、乙醇、乙酸乙酯和丙酮超声洗涤沉淀的纳米磁性颗粒，且每一次超声洗涤后均用磁性材料吸引回收纳米磁性颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种分离水中多价噬菌体的表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S2中，进行所述超声激活的方法为：将1mg所述表面氨基化纳米磁性颗粒加入2mL MES缓冲液中，室温超声激活3～5分钟。
5.根据权利要求1所述的一种分离水中多价噬菌体的表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S2中，活化所述表面氨基化纳米磁性颗粒的方法为：将激活后的表面氨基化纳米磁性颗粒加入0.3mL浓度为20mg/mL的胺反应性N-羟基丁二酰亚胺和0.4mL浓度为20mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，混匀后静置5min，再加入0.2ml浓度为2mg/ml的万古霉素溶液，混匀后4℃下孵育培养6小时。
6.根据权利要求1所述的一种分离水中多价噬菌体的表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S3中，孵育培养完毕后，通过静置分离的方式从溶液中分离出表面氨基化纳米磁性颗粒，再分别使用MES缓冲液和超纯水各洗涤一次；优选的，在静置分离过程中通过外加磁力进行加速沉降。
7.根据权利要求1所述的一种分离水中多价噬菌体的表面修饰磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S3中，所述重悬处理方法为：将孵育培养完毕后分离的活化纳米磁性颗粒进行去离子水洗涤，再加入1ml浓度为0.4mg/ml的mPEG-SC10000溶液，于4℃下以10rpm的转速旋转1小时后，再用去离子水洗涤回收。
8.一种根据权利要求1～7任一所述的制备方法制得的表面修饰磁性纳米颗粒。
9.一种利用权利要求8所述的表面修饰磁性纳米颗粒分离水中多价噬菌体的方法，其特征在于，包括：
步骤1、将所述的表面修饰磁性纳米颗粒作为磁珠载体，加入至少两组细菌悬浮培养液中分别对细菌进行吸附，得到宿主细胞混合物；其中，每一组细菌悬浮培养液中含有单一的细菌种类，不同组细菌悬浮培养液中包含的细菌种类不同；
步骤2、将待分离的噬菌体原液加入一种宿主细胞混合物中混合孵育，使部分噬菌体以磁珠载体上附着的细菌为宿主细胞进行特异性吸附，然后通过外加磁场将磁珠载体及其附着物从宿主细胞混合物中分离，再将分离得到的磁珠载体及其附着物重新在当前的宿主细胞混合物所对应的单一细菌培养液中进行培养富集，得到噬菌体富集液；
步骤3、再依次针对剩余的每一种宿主细胞混合物，取在前一种单一细菌中培养富集得到的噬菌体富集液，按照步骤2中的做法进行混合孵育、分离以及培养富集；以在最后一种宿主细胞混合物中富集得到的噬菌体作为最终分离的多价噬菌体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待分离的噬菌体原液为从污水处理厂收集的污泥样本中提取的噬菌体原液。
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