DE112020002216T5

DE112020002216T5 - Verfahren zur Verbesserung des Glykosylamin-Nachweises

Info

Publication number: DE112020002216T5
Application number: DE112020002216.1T
Authority: DE
Inventors: Andres GUERRERO NAVARRO
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2019-05-03
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2022-03-17
Also published as: GB2599034B; WO2020227027A1; CN113767286A; GB2599034A; US20220214334A1; GB2599034A8; GB202117324D0

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verbesserung der Sensitivität des Nachweises von Glykosylaminen, die von Glykokonjugaten wie Glykoproteinen oder Glykopeptiden durch enzymatische Spaltung freigesetzt werden, wenn sie mit Amin-reaktiven Farbstoffen markiert werden.

Description

BEZUGNAHME AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen U.S. Patentanmeldung Nr. 62/842,809 , eingereicht am 3. Mai 2019, deren Inhalt für jeden Zweck durch Bezugnahme einbezogen ist.
FÖRDERUNG DURCH BUNDESMITTEL
Nicht anwendbar.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der verbesserten Fähigkeit ein mit einem Amin-reaktiven Farbstoff markiertes Glykosylamin nachzuweisen, insbesondere wenn das Glykosylamin in einer Lösung ist, die andere Amine enthält, die bei der Markierung mit dem Amin-reaktiven Farbstoff konkurrieren.
Eine Reihe kommerzieller und regulatorischer Erfordernisse machen eine Bestimmung der Art und Menge der Glykane, die auf einem Glykoprotein oder Glykopeptid vorhanden sind erforderlich, insbesondere für Glykoprteine die für Therapeutika verwendet werden. Da die Glykane, die an dem Glykoprotein anhaften, die Eigenschaften, die für die Funktion des Glykoproteins kritisch sind beinträchtigen können, einschließlich dessen pharmakokinetischen Eigenschaften, Stabilität, Bioaktivität und Immunogenität, ist es wichtig zu bestimmen welche davon vorhanden sind. Die Charakterisierung der Glykane, die an biologischen Präparaten (wie therapeutischen Glykoproteinen und Vakzinen) gebunden sind, ist ein Erfordernis der Zulassungsbehörde für Lebensmittel und Arzneimittel (FDA) um die Stoffzuammensetzung und Konstanz bei der Herstellung zu zeigen, wodurch ein Bedarf an umfangreicher Charakterisierung des Produkts entsteht. Die Analyse der Kohlenhydratprofile ist auch wichtig für die Qualitätskontrolle bei der Produktion von sowohl therapeutischen als auch nicht therapeutischen rekombinanten Proteinen, bei denen eine Änderung des Kohlenhydratprofils ein Anzeichen für die Belastung des Systems sein kann, was bei Fermentern im kommerziellen Maßstab ein Signal für einen Zustand sein kann, bei dem es erforderlich ist, dessen Inhalt zu entsorgen. Es besteht daher bei Biochemikern, klinischen Chemikern, Herstellern von Pharmazeutika und Herstellern von Proteinen ein erhebliches Interesse die Verteilungsprofile der Glykane in biologischen Proben, wie therapeutischen Glykoproteinen, zu bestimmen.
Traditionell wurden Kohlenhydrate durch reduktive Aminierung mit dafür geeigneten Farbstoffen markiert. Zum Beispiel wird die reduktive Aminierung von N-Glykanen, die von einem Glykoprotein durch das Deglykosylierungsenzym PNGase F freigesetzt werden, typischerweise durch Konjugieren der freien reduzierenden Enden des Glykans an die freien Aminogruppen eines Markers erreicht, wie einem fluoreszierenden Farbstoff oder einem Rest mit elektrischer Ladung, wie 2-Aminobenzamid oder „2-AB,“ wie in dem in U.S. Patent Nr. 5,747,347 gelehrt. Abhängig von dem verwendeten Marker, können die markierten Glykane dann durch eine Reihe von Analyseverfahren, wie Hochleistungsflüssigchromatographie („HPLC“), Kapillarelektrophorese („CE,“ einschließlich Kapillarzonenelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, isoelektrische Kapillarfokussierung, Kapillarisotachophorese und elektrokinetische Mizellen-Chromatographie), oder mikrofluidische Trennung analysiert werden.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Farbstoffe oder Marker (die Begriffe werden im Allgemeinen hierein austauschbar verwendet) entwickelt, die Kohlenhydrate, wie die N-Glykane markieren, die von einem Glykoprotein durch PNGase F schneller als bei traditionellen Verfahren freigesetzt werden. Die Wirkung der PNGase F setzt N-Glykane in Form von Glykosylaminen frei. Farbstoffe wie INSTANTPC® (ProZyme, Inc.) und RAPIFLUOR-MS® (Waters Corp.) sind in der Lage schnell mit den von den Glykoproteinen freigesetzten Glykosylaminen zu reagieren. Unglücklicherweise reagieren die Glykosylamine auch mit allen anderen freien Aminen (Amine, die zur Verfügung stehen um mit den Glykosylaminen von Interesse bei der Markierung durch den Amin-reaktiven Farbstoff zu konkurrieren) in der Reaktionslösung und vielen Pufferlösungen, die freie Amine enthalten, wie Tris-Puffer. Dies ist eine Sorge bei der Analyse von Glykanen, die auf einigen Glykoproteinen vorliegen, was bei der Stabilität, dem pH-Wert, der Löslichkeit, und den Kosten zu berücksichtigen ist, welche die Verwendung von Tris-Puffern oder anderen, freie Amine enthaltenden, Quellen zum Transport oder der Lagerung der Glykoproteine vorgeben können.
Therapeutische Glykoproteine sind teuer und einige sind nur in kleinen Mengen erhältlich. Die Menge der Glykane, die für die Analyse zur Verfügung steht, ist daher oft sehr klein und kann im Bereich von Pikogramm liegen, während die Menge an freiem Amin in der Lösung um eine Größenordnung höher sein kann. Das Menge der Amine im Puffer oder aus anderen Quellen, verglichen mit den Glykanen von Interesse, kann daher die Sensitivität des Assays stark reduzieren. Dies wurde bisher nur unvollständig adressiert durch Vermeidung der Verwendung von Puffern, wie Tris-enthaltenden Puffern, die freie Amine enthalten, oder durch Austausch der Puffer, was mühsam, nicht für die Automatisierung geeignet, und nicht immer erfolgreich ist.
In Fachgebiet besteht daher ein Bedarf an Verfahren, die die Sensitivität der Markierung von Glykosylaminen mit Amin-reaktiven Farbstoffen verbessert, wenn sie in Lösungen bereitgestellt werden, die freie Amine aufweisen. Die vorliegende Erfindung deckt überaschenderweise diesen Bedarf und andere Erfordernisse.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen, Verfahren, Systeme und Kits für eine verbesserte Abtrennung von markierten Analyten bei der Elektrophorese bereit. In einer ersten Gruppe von Ausführungsformen stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Markieren von Glykosylaminen, und gegebenenfalls zum Analysieren der markierten Glykosylamine bereit. Die Verfahren umfassen die folgenden Schritte in der folgenden Reihenfolge: (a) Erhalten der Glykosylamine in einer wässrigen Lösung, (b) Mischen der wässrigen Lösung, in der die Glykosylamine vorhanden sind, mit einer Menge eines organischen Lösungsmittels, wodurch eine organische Lösungsmittelmischung gebildet wird, die aus etwa 80% oder mehr des organischen Lösungsmittels zusammengesetzt ist, (c) Durchführen der organischen Lösungsmittelmischung, welche die Glykosylamine enthält durch einen porösen festen Träger, wodurch die Glykosylamine auf dem porösen festen Träger immobilisiert werden, und (d) Markieren der Glykosylamine mit einem Amin-reaktiven Farbstoff, entweder (1) während die Glykosylamine auf dem porösen festen Träger immobilisiert sind, und anschließendem Eluieren der markierten Glykosylamine von dem porösen festen Träger mit einer wässriger Lösung in einen Behälter, oder (2) Eluieren der immobilisierten Glykosylamine von dem porösen festen Träger mit einer wässriger Lösung in einen Behälter und anschließendem Markieren der eluierten Glykosylamine mit dem Amin-reaktiven Farbstoff, wodurch die Glykosylamine markiert werden. In einigen Ausführungsformen wird der poröse feste Träger aus einem hydrophilen Material hergestellt und die organische Lösungsmittemischung ist etwa 80% bis 95% organisches Lösungsmittel zu etwa 20% bis 5% wässriger Lösung. In einigen Ausführungsformen ist das hydrophile Material (a) Zellulose, (b) Glasfaser, (c) Aluminiumoxid, (d) Siliziumdioxid, (e) eine funktionalisierte Oberfläche, die Diol, Aminopropyl, Carbamoyl, Cyanopropyl, Ethylendiamin-N-propyl enthält, (f) Siliziumdioxid, derivatisiert mit Diol, Aminopropyl oder Carbamoyl, (g) Zellulose, (h) Cyclodextrin, (i) Aspartamamid, (j) Triazol, (k) Diethylaminoelthyl, (I) ein Harz, das bei der Festphasenextraktion von Kohlenhydraten verwendet wird, oder (m) eine Kombination von zwei oder mehreren davon. In einigen Ausführungsformen wird der feste Träger aus Siliziumdioxid hergestellt, und das Siliziumdioxid ist kovalent an eine oder mehrere Carbamoylgruppe(n) gebunden. In einigen Ausführungsformen liegt das Siliziumdioxid in Form von Kügelchen oder Partikeln vor. In einigen Ausführungsformen haben die Kügelchen oder Partikel eine Größe von 3-60 Mikron. In einigen Ausführungsformen haben die Kügelchen oder Partikel eine Größe von etwa 30 Mikron. In einigen Ausführungsformen sind die Kügelchen oder Partikel, die kovalent an die Carbamoylgruppen gebunden sind Amide-80. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse feste Träger in Form einer Membran vor. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse feste Träger in Form eines Monolithen vor. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse feste Träger in Form von Kügelchen vor. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse feste Träger in Form von Fasern vor. In einigen Ausführungsformen ist der poröse feste Träger ein Harz. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt (c'), Waschen des porösen festen Trägers mit einer Lösung, die aus 80 bis 90% organisches Lösungsmittel und 20 bis 10% wässriger Lösung besteht, zwischen den Schritten (c) und (d). In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt (e), Abtrennen des markierten Glykosylamins über eine Trennmethode. In einigen Ausführungsformen ist die Trennmethode für das markierte Glykosylamin eine Hochleistungsflüssigchromatographie, Ultrahochleistungsflüssigchromatographie, hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie, Kapillarelektrophorese, mikrofluidische Trennung oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, wodurch das markierte Glykosylamin abgetrennt wird. In einigen Ausführungsformen werden die abgetrennten, markierten Glykosylamine über Fluoreszenznachweis der Markierung analysiert. In einigen Ausführungsformen werden die abgetrennten, markierten Glykosylamine über Massenspektrometrie analysiert. In einigen Ausführungsformen ist das organische Lösungsmittel Acetonitril, absoluter Ethanol, absoluter Methanol, Isopropanol, Butanol, Toluol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydrofuran, Diethylether, Dichlormethan, Chloroform, tert-Buthylmethylether, Benzol, Kohlenstofftetrachlorid, Isooctan, Hexan oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon. In einigen Ausführungsformen ist das organische Lösungsmittel Acetonitril. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse feste Träger in einer Vertiefung einer Multiwellplatte oder Mikrowellplatte vor. In einigen Ausführungsformen liegt der feste Träger in einem Lumen einer Mikrofluidikvorrichtung vor. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse feste Träger in einer Zentrifugensäule oder einer Festphasenextraktionskartusche vor. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse feste Träger in einer Zentrifugensäule vor. In einigen Ausführungsformen hat der poröse feste Träger eine Oberfläche aus einem nicht hydrophilen Material und die organische Lösungsmittelmischung weist 95% oder mehr des organischen Lösungsmittels auf. In einigen Ausführungsformen ist das nicht hydrophile Material Polyethylen, Nylon, Polyvinylidenfluorid oder Polypropylen. In einigen Ausführungsformen hat der poröse feste Träger Poren oder Öffnungen von 10 Mikron oder kleiner.
In einer zweiten Gruppe von Ausführungsformen stellt die Erfindung Kits zur Markierung eines Glykosylamins mit einem Amin-reaktiven Farbstoff bereit, wobei das Glykosylamins von einem Glykoprotein oder Glykopeptid mit einem Enzym freigesetzt wird. Das Kit umfasst ein Deglykosylierungsenzym, eine wässrige Lösung, die geeignet ist für die Inkubation des Deglykosylierungsenzyms mit dem Glykoprotein oder Glykopeptid, einen Amin-reaktiven Farbstoff, ein organischen Lösungsmittel, und einen Behälter mit darin angeordnetem porösen festen Träger. In einigen Ausführungsformen ist die wässrige Lösung und das organische Lösungsmittel, das mit dem Kit bereitgestellt wird, in vorab gemessener Form, sodass wenn sie kombiniert werden, eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 80-95% organisches Lösungsmittel zu 20-5% wässriger Lösung aufweist. In einigen Ausführungsformen ist die wässrige Lösung und das organische Lösungsmittel, das mit dem Kit bereitgestellt wird, in vorab gemessener Form, sodass wenn sie kombiniert werden, eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 80-90% organisches Lösungsmittel zu 20-10% wässriger Lösung aufweist. In einigen Ausführungsformen ist die wässrige Lösung und das organische Lösungsmittel, das mit dem Kit bereitgestellt wird, in vorab gemessener Form, sodass wenn sie kombiniert werden, eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 85% ±2% organisches Lösungsmittel zu 15% ±2% wässriger Lösung aufweist. In einigen Ausführungsformen ist das organische Lösungsmittel Acetonitril, absoluter Ethanol, absoluter Methanol, Isopropanol, Butanol, Toluol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydrofuran, Diethylether, Dichlormethan, Chloroform, tert-Buthylmethylether, Benzol, Kohlenstofftetrachlorid, Isooctan, Hexan oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon. In einigen Ausführungsformen ist das organische Lösungsmittel Acetonitril. In einigen Ausführungsformen ist das Deglykosylierungsenzym PNGase F. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit weiterhin ein Denaturierungsmittel. In einigen Ausführungsformen ist der poröse feste Träger ein hydrophiles Material. In einigen Ausführungsformen liegt der poröse fester Träger in Form einer Membran vor. In einigen Ausführungsformen ist das hydrophile Material (a) Zellulose, (b) Glasfaser, (c) Aluminiumoxid, (d) Siliziumdioxid, (e) eine funktionalisierte Oberfläche, die Diol, Aminopropyl, Carbamoyl, Cyanopropyl, Ethylendiamin-N-propyl enthält, (f) Siliziumdioxid, derivatisiert mit Diol, Aminopropyl oder Carbamoyl, (g) Zellulose, (h) Cyclodextrin, (i) Aspartamamid, (j) Triazol, (k) Diethylaminoelthyl, (I) ein Harz, das bei der Festphasenextraktion von Kohlenhydraten verwendet wird, oder (m) eine Kombination von zwei oder mehreren davon. In einigen Ausführungsformen wird der feste Träger aus Siliziumdioxid hergestellt, und das Siliziumdioxid ist kovalent an eine oder mehrere Carbamoylgruppen gebunden. In einigen Ausführungsformen wird der feste Träger aus Siliziumdioxid hergestellt, und das Siliziumdioxid liegt in Form von Kügelchen oder Partikeln vor. In einigen Ausführungsformen haben die Kügelchen oder Partikel eine Größe von 3-60 Mikron. In einigen Ausführungsformen haben die Kügelchen oder Partikel eine Größe von etwa 30 Mikron In einigen Ausführungsformen sind die Kügelchen oder Partikel, die kovalent an Carbamoylgruppen gebunden sind Amide-80.
Figurenliste

. ist ein Diagramm, das exemplarische Ausführungsformen von einigen der erfinderischen Verfahren zeigt. Nummer 1 zeigt einen Kolben, der Glykoprotein in einer wässriger Lösung beinhaltet. Der Proteinrest ist als durchgezogene Linie gezeigt, während die Glykane als standardisierte geometrische Figuren gezeigt sind, die verschiedene Zuckerreste darstellen. Die Bindung jedes Glykans an den Proteinrest ist durch eine dünnere Linie dargestellt als diejenige, die den Proteinrest darstellt. Gefolgt auf den enzymatischen Verdau durch PNGase F, bezeichnet durch die Nummer 2 in der Abbildung, zeigt die Nummer 3 den Kolben der das nun deglykosylierte Protein beinhaltet, dargestellt durch die gleiche durchgezogene Linie wie zuvor, und Glykosylamine die von dem Protein durch das Enzym freigesetzt wurden sind durch geometrische Formen dargestellt. Nummer 4 bezeichnet die Zugabe des organischen Lösungsmittels zur wässrigen Ausgangslösung in einer Menge, die ausreichend ist um eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung zu bilden, die aus 80% bis 95% organischem Lösungsmittel und 20% bis 5% wässriger Lösung besteht (Beachte: obwohl die Beschriftung angibt, dass das organische Lösungsmittel hinzugefügt wird um eine 80% bis 95% - ige Lösung zu bilden, wird die Mischung des organischen Lösungsmittels zu wässriger Lösung, die die Glykosylamine beinhaltet, in der Beschreibung als die „organischen Lösungsmittelmischung“ bezeichnet). In der gezeigten exemplarischen Ausführungsform fließt die organische Lösungsmittelmischung dann durch einen porösen festen Träger, der aus einem hydrophilen Material besteht und sich in einem zweiten Behälter befindet. Wie in Nummer 5 gezeigt, werden die Glykosylamine im zweiten Behälter auf dem porösen festen Träger zurückgehalten und immobilisiert, während die organische Lösungsmittelmischung durchfließt, und sobald sie den Behälter verlassen hat nicht mehr in Kontakt mit den immobilisierten Glykosylaminen ist. Nummer 6 zeigt einen optionalen Waschschritt, bei dem die immobilisierten Glykosylamine mit einer Lösung aus 80 bis 95% organischen Lösungsmittel/20 bis 5% wässriger Lösung gewaschen werden, um die Anzahl der vorhandenen Amine, die nicht immobilisierte Glykosylamine sind, oder die auf andere Weise auf dem festen Träger zurückbleiben, zu reduzieren. Nummer 7 zeigt eine Ausführungsform bei der die immobilisierten Glykosylamine mit einem Amin-reaktiven Farbstoff markiert sind, während sie auf dem porösen festen Träger immobilisiert sind. Nummer 8 zeigt einen optionalen Waschschritt, bei dem die markierten, immobilisierten Glykosylamine mit einer Lösung aus 80 bis 95% organischen Lösungsmittel/20 bis 5% wässriger Lösung gewaschen werden, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Nummer 9 zeigt die markierten, immobilisierten Glykosylamine, die von dem porösen festen Träger mit einer wässriger Lösung eluiert werden.
. stellt ein Balkendiagramm dar, das die Ergebnisse der Studien zeigt, bei denen eine Probe von Etanercept denaturiert, deglykosyliert und in vier Parallelproben aufgeteilt wurde. Die Glykosylamine in den Proben wurden mit dem Amin-reaktiven Farbstoff InstantPC™ markiert, während die Glykosylamine entweder in Lösung (die ersten zwei Balken von links) oder auf einem porösen festen Träger immobilisiert waren (der dritte und vierte Balken von links), wobei entweder 750 mM Tris-Puffer anwesend war (der zweite und vierte Balken von links, markiert „750 mM“) oder Tris-Puffer war abwesend (der erste und dritte Balken von links, markiert die „Kontrolle“).

DETAILIERTE BESCHREIBUNG
EINFÜHRUNG
Wie im Abschnitt Hintergrund dargelegt, ist die Analyse der Art und Menge für verschiedene regulatorische Zwecke und zum Zweck der Qualitätskontrolle wichtig. Insbesondere ist die Analyse der Art der Glykane, die an therapeutischen Glykoproteinen gebunden sind, wie monoklonalen Antikörpern, und die Menge jeder Glykan-Art eine wichtige Messung bei der Qualitätskontrolle bei der Herstellung solcher Glykoproteine und bei der Bestätigung der gewünschten pharmakologischen Aktivität der Glykoproteine geworden.
Die Bestimmung der Art, der in der Probe vorhandenen Kohlenhydrate, wird typischerweise durch Markieren der Kohlenhydrate und anschließendem Bestimmen der Kohlenhydrate unter Verwendung geeigneter Messinstrumente durchgeführt. Die N-Glykane können analysiert werden durch ihre Freisetzung von Glykoproteinen mit Enzymen wie PNGase F, wodurch sie markiert werden, und anschließendem Nachweis des Vorhandenseins der markierten Verbindung, zum Beispiel über Fluoreszenznachweis. Die Glykane werden von dem Enzym in Form von Glykosylaminen freigesetzt, die dann mit den Amin-reaktiven Farbstoffen, wie INSTANTPC® (ProZyme, Inc.) und RAPIFLUOR-MS® (Waters Corp.) markiert, die schnell mit den Aminresten auf den Glykosylaminen reagieren. Diese Farbstoffe reagieren jedoch nicht nur mit Glykosylaminen sondern auch mit anderen Amingruppen in der Lösung. Zum Beispiel enthalten Puffer wie „TBE“ (Tris/Borat/EDTA) und „TAE“ (Tris/Essigsäure/EDTA) Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethan), der ein primäres Amin trägt. Wenn die Glykosylamine von Interesse in einer Lösung vorliegen, die mit einem Amin-reaktiven Farbstoff markierte Amingruppen enthalten, können die anderen Amine in der Lösung mit den Ziel-Glykosylaminen für die Markierung mit dem Amin-reaktiven Farbstoff konkurrieren, wodurch die Menge an dem für die Markierung der Glykosylamine von Interesse zur Verfügung stehenden Farbstoff reduziert wird.
Wie im Abschnitt Hintergrund dargelegt, sind therapeutische Glykoproteine teuer und einige von Ihnen sind nur in sehr kleinen Mengen erhältlich. Die Menge an Glykosylamin, die von einer Probe, wie einem Glykoprotein freigesetzt wird ist entsprechend gering und kann im Bereich von Pikogramm liegen, während die Menge an freiem Amin in einem Tris-Puffer oder einer anderen Lösung, die die Glykosylamine enthält, um Größenordnungen höher sein kann. Der Überschuss an Amin aus dem Puffer oder anderen Quellen, verglichen mit den Glykanen von Interesse, kann daher die Sensitivität des Assays durch Konkurrieren der Glykosylamine für den Amin-reaktiven Farbstoff stark reduzieren. Der Nachweis von kleinen Mengen der Glykane, die auf Glykoproteinen vorhanden sind, in Puffern, die Tris oder freie Amine aus anderen Quellen enthalten, kann daher inmitten von Signalen von markierten Aminen im Puffer oder anderen Aminenthaltenden Verbindungen schwierig sein. Leider können Überlegungen wie Stabilität, Löslichkeit, pH-Wert oder Kosten vorgeben, dass Amin-enthaltende Formulierungshilfsstoffe verwendet werden um den Versand und die Lagerung der Glykoproteine von Interesse zu ermöglichen.
Überraschenderweise löst die vorliegende Erfindung dieses Problem, und ermöglicht den sensitiven Nachweis von Glykanen (oder, da sie von Glykoproteinen durch enzymatische Spaltung freigesetzt werden, von Glykosylaminen), die in der Probe vorhanden sind, auch wenn die Probe in einer Lösung vorliegt, die Amin-enthaltende Formulierungshilfsstoffe enthält, wie einen Tris-enthaltenden Puffer oder andere Quellen für freie Amine.
Bei den derzeitigen Protokollen werden die N-Glykane, die auf einem Glykoprotein vorhanden sind, durch Denaturieren des Glykoproteins in einer wässrigen Lösung analysiert, die typischerweise Reduktionsmittel oder andere Denaturierungsmittel und Puffersalze enthält. Die Denaturierung schließt normalerweise das Erhitzen der wässrigen Lösung, die das Glykoprotein umfasst, auf eine erhöhte Temperatur, oftmals etwa 95°C, und anschließendes Abkühlen der Lösung ein. Das Glykoprotein wird dann typischerweise durch Inkubieren in einer wässrigen Lösung mit einem Deglykosylierungsenzym der Wahl, wie PNGase F deglykosyliert. Die resultierende wässrige Lösung umfasst nicht nur die wässriger Lösung selbst, in der die enzymatische Spaltung durchgeführt wurde, sondern auch (i) das vollständig oder teilweise deglykosylierte Protein, das nach der Freisetzung der N-Glykane als Glykosylamine durch die Wirkung des Enzyms zurückbleibt, (ii) jegliche Glykosylamine, die durch die enzymatische Spaltung zurückbleiben, (iii) das Deglykosylierungsenzym, (iv) Puffersalze, (v) Reduktionsmittel und (vi) jedes andere Denaturierungsmittel, das in dem Denaturierungsschritt verwendet wird. In einigen Ausführungsformen kann das Glykoprotein ursprünglich in einer biologischen Probe vorliegen. In diesem Fall kann die Lösung weiterhin Lipide, zusätzliche Proteine, Salze und andere Metaboliten enthalten. Diese Teile des vorliegenden Arbeitsablaufs sind schematisch in als Punkte 1 - 3 gezeigt.
Zur Vereinfachung der Bezugnahme wird hierin auf die Herstellung der wässrigen Lösung, die die Glykosylamine enthält, gefolgt auf Denaturierung und teilweiser oder vollständiger Deglykosylierung des Glykoproteins manchmal auf „Erhalten einer wässrigen Lösung, die Glykosylamine enthält“ Bezug genommen, und auf die Lösung selbst wird hierin manchmal auf die „Glykosylamin-Ausgangslösung“ Bezug genommen. Bei den derzeitigen Protokollen wird der Amin-reaktive Farbstoff typischerweise zu der Glykosylamin-Ausgangslösung gegeben, um die Glykosylamine, die in der Glykosylamin-Ausgangslösung enthalten sind, zu markieren, und die markierten Glykosylamine werden dann einer Reinigungsprozedur unterworfen, um sie von den anderen Molekülspezies in der Lösung zu trennen, sodass das markierte Glykosylamin analysiert werden kann. Der Amin-reaktive Farbstoff ist in einem organischen Lösungsmittel, das mit der Glykosylamin-Ausgangslösung kompatibel ist und die Glykosylamin-Ausgangslösung muss vor der Zugabe des Farbstoffs nicht getrocknet werden.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren verläuft der Denaturierungs- und Deglykosylierungsschritt wie gewohnt. Jedoch sobald die N-Glykane von dem Glykoprotein als Glykosylamine in der Glykosylamin-Ausgangslösung freigesetzt worden sind ändert sich der Arbeitsablauf. Wie in , Punkt 4 dargestellt, wird zu der Glykosylamin-Ausgangslösung ein organisches Lösungsmittel in einer Menge zugefügt, die ausreichend ist um die wässrige Startlösung so zu ändern, dass eine Lösung von etwa 80% bis zu 95% organisches Lösungsmittel entsteht (und dementsprechend etwa 20% bis runter auf 6% wässrige Lösung, wobei „etwa“ in diesem Kontext ±1 % bedeutet). Zur Vereinfachung der Bezugnahme kann auf die resultierende Lösung, die nun eine etwa 80% bis 95%ige organische Lösungsmittellösung ist, als die „organische Lösungsmittelmischung“ Bezug genommen werden. Der Fachmann kann dann die Glykosylamine in der organischen Lösungsmittelmischung auf einem porösen festen Träger immobilisieren, wie schematisch in , Punkt 5 gezeigt. Ohne den Wunsch an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass Glykosylamine in organischen Lösungsmittellösungen in den angegebenen Konzentrationen auf einem hydrophilen porösen festen Träger oder einer hydrophilen Oberfläche eines porösen festen Trägers über polare Wechselwirkungen zwischen den Glykosylaminen und dem Träger zurückgehalten werden. Die anderen Bestandteile in der organischen Lösungsmittelmischung bleiben gewöhnlich in Lösung, treten durch den porösen festen Träger und können aus dem Gefäß, das den porösen festen Träger beinhaltet, entfernt werden. Dies führt zum Entfernen der meisten, wenn nicht allen Aminen in der Glykosylamin-Ausgangslösung, die für die Reaktion mit dem Amin-reaktiven Farbstoff zur Verfügung stehen (andere als die immobilisierten Glykosylamine), und resultiert in einer starken Reduktion der Menge der anderen vorhandenen freien Amine.
Sobald die Glykosylamine auf dem festen Träger immobilisiert worden sind, können sie gegebenenfalls mit einer organischen Lösung von etwa 80-95% organischem Lösungsmittel, vorzugsweise etwa 80% bis etwa 90% organischem Lösungsmittel gewaschen werden, um jegliche Amine zu entfernen, die nicht auf dem porösen festen Träger immobilisiert sind, wie in , Punkt 6 gezeigt, und können dann entweder (a) mit dem Amin-reaktiven Farbstoff markiert werden während sie sich auf dem festen Träger befinden, wie in , Punkt 7 dargestellt, gegebenenfalls mit einem 80-95%igen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise etwa 80% bis etwa 90% organischem Lösungsmittel gewaschen werden, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen ( , Punkt 8), und anschließend mithilfe einer wässrigen Lösung eluiert werden, sodass sie einer analytischen Maßnahme zugeführt werden können, wie in , Punkt 9 dargestellt, oder (b) von dem festen Träger mit einer wässriger Lösung in einen frischen Behälter eluiert werden, mit dem Amin-reaktiven Farbstoff in dem frischen Behälter markiert, und anschließend einer analytischen Maßnahme zugeführt werden (Ausführungsform (b) ist in nicht gezeigt). Bezogen auf die Markierung auf dem festen Träger (Ausführungsform (a), oben), ist der Amin-reaktiven Farbstoff teuer und der Fachmann verwendet typischerweise nur so viel, dass der poröse feste Träger mit dem Farbstoff gesättigt ist. Da der Farbstoff typischerweise in einer organischen Lösung vorliegt, werden die Glykosylamine nicht vom Träger eluiert. Wie vorstehend berichtet, können die markierten Glykosylamine nach der Markierung vom Träger mit einer wässrigen Lösung eluiert und einer Analyse zugeführt werden.
Wie bereits erwähnt können die markierten Glykosylamine Standard-Analyseverfahren zugeführt werden, um die Art und Menge der N-Glykane zu bestimmen, die auf dem Glykoprotein oder Glykopeptid vorhanden waren, von denen die Glykosylamine freigesetzt wurden. Typischerweise werden die markierten Glykosylamine über Flüssigchromatographie abgetrennt (wie Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Ultrahochleistungsflüssigchromatographie oder hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie („HILIC“)), Kapillarelektrophorese oder mikrofluidische Trennung), und anschließend durch Zuführen der abgetrennten, markierten Glykosylamine zu Analysevorrichtungen, wie einem Fluoreszenzdetektor oder einem Massenspektrometer analysiert werden. In einigen Ausführungsformen werden die abgetrennten, markierten Glykosylamine zuerst einem Fluoreszenzdetektor und anschließend einem Massenspektrometer zugeführt. Andere in den Fachkreisen bekannte Analyseverfahren und Vorrichtungen können natürlich auch verwendet werden.
Bei den erfindungsgemäßen Arbeitsabläufen werden, verglichen mit herkömmlichen Protokollen, einer oder mehrere Schritte zu dem Arbeitsablauf hinzugefügt, und das organische Lösungsmittel, das verwendet wird um die organische Lösungsmittelmischung in dem gewünschten prozentualen Verhältnis von organischem Lösungsmittel zu der Glykosylamin-Ausgangslösung zu bilden, als zusätzliches Reagenz verwendet. Das Ziel der Modifizierung der Verfahren ist gewöhnlich die Anzahl der Schritte und die Anzahl und Menge der verwendeten Reagenzien zu reduzieren, um den Arbeitsablauf zu vereinfachen und die Kosten zu reduzieren. Kontraintuitiv lohnt es sich jedoch in diesem Fall zusätzliche Schritte und Reagenzien hinzuzufügen. Das Problem beim Reduzieren des Einflusses der freien Amine beim Konkurrieren mit den Glykosylamine um den Amin-reaktiven Farbstoff ist bei den derzeitigen Verfahren nicht ausreichend adressiert worden, was entweder daran liegt, dass die Verwendung von Lösungen, die freie Amine enthalten, vermieden wird, oder durch Pufferaustausch, einer langwierigen und nicht immer effektiven Methode, die nicht automatisiert werden kann.
Wie in den Beispielen dargelegt, wurde eine Studie durchgeführt, die der vorliegenden Erfindung unterliegt, bei der ein exemplarisches Glykoprotein denaturiert, deglykosyliert, und anschließend in vier Proben aufgeteilt wurde. Der Tris-Puffer wurde zu zwei der Proben hinzugefügt um eine Konzentration von 750 mM Tris zu erreichen, während die gleiche Menge an Wasser zu den anderen beiden Proben gegeben wurde, sodass das Probenvolumen der vier Proben gleich war. Eine Probe, zu der Tris gegebene wurde und eine Probe zu der Wasser gegebene wurde wurden in Lösung mit dem Amin-reaktiven Farbstoff InstantPC™ markiert, gefolgt von dem gewöhnlichen Arbeitsablauf, und über Fluoreszenz analysiert. Ein organisches Lösungsmittel, Acetonitril, wurde zu den zwei anderen Proben hinzugefügt (eine, bei der Tris hinzugefügt wurde und eine, bei der Wasser hinzugefügt wurde) um eine organische Lösungsmittelmischung aus 85% organischem Lösungsmittel/15% wässriger Lösung zu bilden, und jede Probe wurde auf einem festen Träger immobilisiert, der für eine HILIC-Trennung der Kohlenhydrate oder für die Festphasenextraktion verwendet wird. Der feste Träger wurde zweimal mit einer 85%igen organischen Lösungsmittel/15% wässriger -Lösung gewaschen um freies Amin zu entfernen, während die Glykane immobilisiert waren. Die immobilisierten Glykosylamine werden dann mit InstantPC™ markiert, von dem festen Träger eluiert und über Fluoreszenz analysiert.
ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Fluoreszenzanalyse der in Anwesenheit oder Abwesenheit von Tris-Puffer markierten Glykosylamine zeigt, bei der Amine enthalten sind, die mit den Glykosylaminen um den Amin-reaktiven Farbstoff konkurrieren. Die zwei Säulen auf der linken Seite zeigen die Ergebnisse für die Proben, die in Lösung markiert wurden. Die erste Säule zeigt das Ergebnis der Probe, zu der Wasser hinzugefügt und die anschließend in Lösung markiert wurde: sie hatte einen Signalbereich von etwa 36. Die zweite Säule zeigt das Ergebnis der Probe, zu der Tris hinzugefügt und die anschließend in Lösung markiert wurde: sie hatte einen Signalbereich von etwa 2, oder ein Signal, das annähernd 18fach niedriger war als die Probe, die ohne Anwesenheit von Tris markiert wurde. Anders ausgedrückt war der Signalbereich der Probe, die in Anwesenheit von Tris markiert wurde 5.55% des Signalbereichs der Probe, die in dessen Abwesenheit markiert wurde. Die Ergebnisse veranschaulichen die Schwierigkeit bei der Markierung von Glykosylaminen in Anwesenheit von Aminen in der Lösung, die bei der Markierung konkurrieren.
Bezugnehmend aus , zeigen die zwei rechten Säulen die Ergebnisse für die Proben, die markiert wurden während sie auf dem porösen festen Träger immobilisiert waren. Die zweite Säule auf der rechten Seite zeigt das Ergebnis für die Probe, zu der Wasser hinzugefügt wurde, und die auf dem porösen festen Träger immobilisiert war, und anschließend markiert wurde während sie auf dem Träger immobilisiert war: sie hatte einen Signalbereich von etwa 33, und das Signal lag daher etwas niedriger als das der entsprechenden Probe, die in Lösung markiert wurde. Die Säule auf der rechten Seite der graphischen Darstellung zeigt das Ergebnis für die Probe, zu der Tris hinzugefügt wurde, die auf dem porösen festen Träger immobilisiert wurde, gewaschen wurde um freie Amine zu entfernen, und anschließend markiert wurde: es wurde ein Signalbereich von etwa 27 gefunden, beziehungsweise ein Signal von annähernd 81% der Probe, die in Abwesenheit von Tris markiert wurde, eine dramatische Verbesserung gegenüber der entsprechenden Probe, die in Lösung markiert wurde. Weiterhin war der Signalbereich der Tris-enthaltenden Probe, die immobilisiert, gewaschen und anschließend markiert wurde 27, was mehr als eine Größenordnung über dem Wert der Probe lag, die mit dem gleichen Amin-reaktiven Farbstoff in Lösung bei Anwesenheit von Tris markiert wurde.
Wie in gezeigt, verbessern die erfindungsgemäßen Verfahren somit dramatisch die Sensitivität der Markierung und die Fähigkeit anschließend die markierten Glykosylamine nachzuweisen, die in einer wässrigen Lösung vorliegen, die Amine enthält, die mit einem Amin-reaktiven Farbstoff konkurrieren können. Während dies der Fall ist bei Proben, die in einem Puffer auf Tris-Basis, oder einem anderen Puffer oder Lösung vorliegen, von denen bekannt ist dass sie Amine enthalten, die für die Reaktion mit dem Amin-reaktiven Farbstoff zur Verfügung stehen, können in einigen Proben unbekannte Mengen solcher Amine vorhanden sein. Des Weiteren könnte der Praktiker den Wunsch haben einen einzigen Arbeitsablauf für alle Glykosylamin-Analysen anzuwenden, der immer noch sensitiv genug ist um gute Ergebnisse zu erzielen, unabhängig davon ob die Proben in einem Puffer oder einer anderen Lösung vorliegen, die Amine aufweisen. Dementsprechend wird erwartet, dass Ausführungsformen der erfinderischen Verfahren allgemein gebräuchliche Arbeitsabläufe werden, insbesondere wenn die zu analysierenden Proben nicht charakterisiert wurden (z.B., biologische Proben), die Tris- oder andere Amin-enthaltende Puffer enthalten können, oder andere Quellen für freie Amine aufweisen können, die die Markierung beeinträchtigen könnten.
Bestimmte Aspekte verschiedener Ausführungsformen der erfinderischen Verfahren werden nun diskutiert, um weitere Erklärungen und Anleitungen zur Verfügung zu stellen.
ORGANISCHE LÖSUNGSMITTEL
Die organischen Lösungsmittel werden bei Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, um die Konzentration der wässrigen Glykosylamin-Ausgangslösung auf einen Punkt zu reduzieren, bei dem die Glykosylamine in der Probe auf dem porösen festen Träger zurückbleiben, wodurch die Abtrennung der Glykosylamin-Ausgangslösung, zum Beispiel durch Waschen des porösen festen Trägers mit der resultierenden organischen Lösungsmittelmischung ermöglicht wird. In einigen Ausführungsformen ist die Verwendung von Acetonitril als organisches Lösungsmittel besonders bevorzugt. Acetonitril ist sowohl hydrophob als auch aprotisch. Es ist zu erwarten, dass andere organische Lösungsmittel bei den Ausführungsformen der Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, wobei organische Lösungsmittel, die sowohl hydrophob als auch aprotisch sind, bevorzugt sind. Von eine Vielzahl von anderen organischen Lösungsmitteln wird angenommen, dass sie bei den Ausführungsformen gemäß der Erfindung verwendet werden können, einschließlich absolutem Ethanol, absolutem Methanol, Isopropanol, Butanol, Toluol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydrofuran, Diethylether, Dichlormethan, Chloroform, tert-Buthylmethylether, Benzol, Kohlenstofftetrachlorid, Isooctan und Hexan. Mischungen aus zwei oder mehreren organischen Lösungsmitteln, wie diejenigen die aufgeführt sind, können auch verwendet werden.
Dimethylsulfoxid („DMSO“) und Dimethylformamid („DMF“) sind als primäres organisches Lösungsmittel oder als ein Hauptbestandteil einer Mischung von organischen Lösungsmitteln zur Verwendung bei den Ausführungsformen gemäß den Verfahren der Erfindung weniger bevorzugt. Es wird angenommen, dass DMSO oder DMF mit einem der organischen Lösungsmittel, die im vorhergehenden Absatz aufgeführt sind, oder mit einer Mischung der organischen Lösungsmittel die oben aufgeführt sind in relativ geringen Mengen (wie 0,1 % bis 2%) gemischt werden können, ohne die Fähigkeit Glykosylamine auf dem festen Träger zurückzuhalten zu verlieren, wenn das organische Lösungsmittel oder die Mischung der organischen Lösungsmittel vorliegt.
Da Glykane und andere Kohlenhydrate hydrophil sind, tendieren sie dazu auf hydrophilen Oberflächen zurückgehalten zu werden wenn sie in Lösungen vorliegen, die aus etwa 80%-95% organischem Lösungsmittel bestehen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Konzentration des organischen Lösungsmittels etwa 85%, wobei „etwa“ in diesem Kontext ±2% bedeutet.
Für den Fachmann ist ersichtlich, dass keines der organischen Lösungsmittel in allen Situationen, auf allen festen Trägern verwendet werden kann, die für die Verwendung bei den Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein können. Des Weiteren ist dem Fachmann im Gebiet der Markierung von Glykanen, die von Glykoproteinen freigesetzt werden, bewusst, dass gewöhnlich Kombinationen von Reagenzien getestet werden müssen, um zu bestimmen ob die Kombination für das Freisetzen, Markieren und Analysieren der Glykane, die auf vielen Glykoproteinen vorhanden sind geeignet ist, und dass das Testen im Fachgebiet als Routine angesehen wird. In der Praxis kann der Fachmann leicht jedes bestimmte organische Lösungsmittel auf seine Eignung im Hinblick auf bestimmte Glykan enthaltende Proben testen, die der Fachmann mit einem bestimmten Amin-reaktiven Farbstoff markieren möchte, und auf jeglichen festen Träger auf dem der Fachmann die Glykosylamine für Markierung fixieren möchte, durch Zugabe von einem Überschuss an organischem Lösungsmittel, das getestet werden soll, zu einer Probe der Glykosylamin-Ausgangslösung, die eine bekannte Menge eines ausgewählten Glykosylamins (des „Test-Glykosylamins“) enthält, in Kontakt bringen der Mischung aus Lösungsmittel/Lösung mit dem festen Träger der Wahl (von dem entweder bereits bekannt ist, dass er für das Protokoll für die Markierung der Glykosylamine geeignet ist, oder ein poröser fester Träger, der für seine Eignung zu diesem Zweck getestet wird), Markieren der Glykosylamine mit dem Amin-reaktiven Farbstoff der Wahl, Eluieren der Glykosylamine vom festen Träger mit einem wässrigen Puffer, und Zuführen der eluierten Lösung einer Analyse um zu bestimmen ob das Test-Glykosylamin markiert worden ist und, wenn ja, ob es in der erwarteten Menge vorhanden ist. Wenn das Test-Glykosylamin im analysierten Eluat nicht in der erwarteten Menge identifiziert wird, ist dies ein Hinweis dafür, dass die spezielle Kombination des organischen Lösungsmittels, des Markers und des festen Trägers für die Markierung des Test-Glykosylamins mit dem Marker nicht geeignet war.
ZUGABE DES ORGANISCHEN LÖSUNGSMITTELS ZUR GLYKOSYLAMIN-AUSGANGSLÖSUNG
In den erfindungsgemäßen Verfahren befindet sich die Glykosylamin-Ausgangslösung, die die Glykosylamine von Interesse enthält (und die auch Proteine, Denaturierungsmittel, Salze, Enzyme oder andere Verbindungen enthalten kann) in einem Ausgangsbehälter. Die Probe der Glykosylamin-Ausgangslösung wird dann mit dem organischen Lösungsmittel gemischt, um eine organische Lösungsmittelmischung der gewählten Konzentration des organischen Lösungsmittels (d.h. etwa 80% bis 95%, etwa 80 bis 90%, 85%±3%, vorzugsweise 85%±2%, wobei „etwa“ ±1% bedeutet) zu bilden, wenn die organische Lösungsmittelmischung mit dem porösen festen Träger in Kontakt gebracht wird. Wie es für den Fachmann ersichtlich ist, gibt es eine Reihe von Wegen um dies zu bewerkstelligen. Zum Beispiel kann das organische Lösungsmittel zu dem Behälter, der zu Beginn die Probe der wässrigen Startlösung enthält, in der Menge hinzugefügt werden, die die gewünschte Konzentration an organischem Lösungsmittel in der organischen Lösungsmittelmischung erzeugt. Alternativ kann die Probe der Glykosylamin-Ausgangslösung in einen größeren Behälter überführt und mit dem organischen Lösungsmittel gemischt werden, um eine Mischung zu erzeugen, die die gewünschte Konzentration an organischem Lösungsmittel aufweist, bevor sie einem Behälter mit dem porösen festen Träger hinzugefügt wird. Alternativ kann eine Menge an organischem Lösungsmittel in einem Behälter vorhanden sein, der den poröse festen Träger beinhaltet, sodass, wenn die Glykosylamin-Ausgangslösung dem Behälter hinzugefügt wird, die Mischung des organischen Lösungsmittels und der Glykosylamin-Ausgangslösung eine Mischung mit der gewünschten Konzentration an organischem Lösungsmittel bildet (in diesen Ausführungsformen ist jeder Ausgang vorzugsweise mit einem Deckel versehen oder verschlossen, sodass die Glykosylamin-Ausgangslösung mit dem organischen Lösungsmittel vermischt wird und eine Mischung der erwünschten Konzentration bildet, ohne dass sie ausfließen kann). Letztlich kann damit gestartet werden, dass die gewünschte Menge an organischem Lösungsmittel in den Behälter gegeben wird, der den porösen festen Träger beinhaltet, und die Glykosylamin-Ausgangslösung langsam genug in den Behälter gegeben wird, sodass die Mischung des organischen Lösungsmittels und der Glykosylamin-Ausgangslösung im Behälter am porösen festen Träger die gewünschte Konzentration von organischem Lösungsmittel zu Glykosylamin-Ausgangslösung aufweist.
Wie in den Beispielen beschrieben, wurde bei den Studien, die der vorliegenden Offenbarung unterliegen, ein organisches Lösungsmittel zu einer Glykosylamin-Ausgangslösung in einer Menge hinzugefügt, bei der eine organische Lösungsmittelmischung von 85% organischem Lösungsmittel und 15% wässriger Lösung erzeugt wurde.
Zur Vereinfachung der Bezugnahme wird hierin auf den Behälter, der den porösen festen Träger beinhaltet, gelegentlich als „Reaktionsgefäß“ Bezug genommen. Bei Mikrofluidikvorrichtung wird die Probe der Glykosylamin-Ausgangslösung nicht in einen getrennten, den porösen festen Träger tragenden Behälter überführt, sondern von einer ersten Sektion eines Kanals, einer Röhre oder Ähnlichem zu einer Sektion eines Kanals, einer Röhre oder Ähnlichem, wobei die zweite Sektion den porösen festen Träger enthält. Der Begriff „Reaktionskammer“ wird hierin gelegentlich verwendet um die Sektion einer Mikrofluidikvorrichtung zu bezeichnen, die für die Verwendung in Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren konfiguriert wurde. Zur Vereinfachung der Bezugnahme, wird die folgende Diskussion im Allgemeinen in Bezug auf die Ausführungsformen diskutiert, bei denen Glykosylamin-Ausgangslösung in ein Reaktionsgefäß überführt wird, kann jedoch auch so verstanden werden, dass sie sich auf Mikrofluidik-Anwendungen bezieht, bei denen die Glykosylamin-Ausgangslösung in eine Sektion überführt wird, die einen Raum umfasst, der groß genug ist um die Probe der Mischung des organischen Lösungsmittels und der Glykosylamin-Ausgangslösung und den porösen festen Träger aufzunehmen, sofern nichts anderes angegeben oder durch den Kontext erforderlich ist. Das Reaktionsgefäß hat eine erste Öffnung, gewöhnlich am oberen Ende, durch die Lösungen und Reagenzien eingeführt werden können, einen Körper, der typischerweise zylindrisch ist und den porösen festen Träger enthält, und eine zweite Öffnung, gewöhnlich am Boden des Behälters angebracht, die typischerweise gegenüber der ersten Öffnung liegt. Die zweite Öffnung kann verschließbar sein, um zu verhindern, dass die Lösungen aus dem Reaktionsgefäß austreten bis es gewünscht ist. Der Körper des Behälters hat ein Lumen, das einen Querschnitt aufweist (kreisförmig im Falle eines zylindrischen Körpers), dessen Bereich durch die inneren Dimensionen des Körpers definiert ist. Der poröse feste Träger ist typischerweise so im Reaktionsgefäß angeordnet, dass er die Querschnittsfläche der Reaktionskammer ausfüllt, sodass die organischen Lösungsmittelmischung, die die zu markierenden Glykosylamine enthält, durch die Poren und Öffnungen in dem porösen festen Träger laufen muss um die zweite Öffnung zu erreichen.
In einigen typischen Ausführungsformen kann der Behälter an dem Ende offen sein, an dem die Flüssigkeit aus dem Behälter austreten (typischerweise der Boden, wenn der Behälter so gestaltet ist, dass sich die Flüssigkeiten vertikal von oben nach unten zum Boden bewegen, oder horizontal, wie das bei einigen Mikrofluidikanwendungen der Fall sein kann, bei denen ein Mikrofluid-Röhrchen so gestaltet sein kann, dass die Flüssigkeiten von der einen Seite eingeführt werden und an der anderen Seite aus einer anderen Öffnung als der in die eingeführt wurden, austreten. Falls gewünscht kann der Behälter ein manuelles oder automatisiertes Hilfsmittel zum Verschließen der Ausgangsöffnung aufweisen, sodass die Reagenzien während den Schritten, die deren Anwesenheit erfordern, im Behälter zurückgehalten werden, während die Ausgangsöffnung geöffnet werden kann, um sie, wenn gewünscht, aus dem Behälter zu spülen oder zu eluieren. Zum Beispiel kann der Boden eine Klappe, einen Deckel oder eine andere Abdeckung haben, die wenn sie die Öffnung verschließen, die Flüssigkeiten im Behälter zurückhalten, und die wenn sie geöffnet sind die Flüssigkeiten aus dem Behälter aufließen lassen. Bei Mikrofluidikanwendungen, bei denen die Markierung in einer Reaktionskammer, die vertikal oder horizontal angeordnet sein kann, durchgeführt wird, kann es zum Beispiel eine oder mehrere Ventile zwischen der Reaktionskammer und dem Kanal oder den Passagen geben, durch die sich die Reaktanten vorwärtsbewegen, mit einem Ventil, das die Reaktionskammer von einem bestimmten Kanal trennt, der geöffnet wird, um die Lösungen und Lösungsmittel aus der Reaktionskammer über den gewünschten Weg zu eluieren.
MATERIALIEN FÜR DEN FESTEN TRÄGER
Das für den porösen festen Träger ausgewählte Material ist entweder in eine Konfiguration, wie ein Gewebe, die ermöglicht, dass die organische Lösungsmittelmischung mit einem großen Oberflächenbereich des Materials in Kontakt tritt, oder die eine Vielzahl von Poren oder Öffnungen aufweist, die der organischen Lösungsmittelmischung erlaubt mit einem großen Oberflächenbereich des Materials in Kontakt zu treten. In einigen Ausführungsformen ist der poröse feste Träger aus einem hydrophilen Material hergestellt, das bevorzugt Glykosylamine gegenüber Protein, Puffersalze, Reduktionsmittel oder anderen Reagenzien zurückhält, von denen bekannt ist, dass sie in einer bestimmten Mischung vorhanden sind, aus der die Kohlenhydrate abgetrennt werden sollen.
Für den Fachmann ist ersichtlich, dass die Glykosylamine auf dem porösen festen Träger in Sekundenschnelle festgehalten werden. Für die Glykosylamine ist es jedoch weder wünschenswert, dass sie zu schnell (zum Beispiel weniger als 1 Sekunde), wobei für das Auftreten der Retention keine Zeit bleibt, noch zu langsam durch den festen Träger zu fließen (zum Beispiel mehr als 15 Minuten) sodass unnötige zusätzliche Zeit für das Protokoll benötigt wird. Die Durchflussgeschwindigkeit durch den porösen festen Träger sollte daher langsam genug für die Glykosylamine sein, damit sie die Möglichkeit haben auf dem porösen festen Träger zurückgehalten zu werden, jedoch schnell genug um unnötige Verzögerungen des Arbeitsablauf zu vermeiden. Dem Fachmann sind die auszuwählenden Materialien geläufig, wie Kartuschen, die bei den Protokollen für die Festphasenextraktion verwendet werden, mit Porengrößen und anderen Eigenschaften, die zu der gewünschten Durchflussgeschwindigkeit führen, sowie andere Prozeduren, wie positiver Druck, Zentrifugation oder die Verwendung einer Vakuumsammelleitung zur Erhöhung der Durchflussrate der Flüssigkeiten über oder durch einen festen Träger. Es ist davon auszugehen, dass dem Praktiker die Extraktion der Glykosylamine aus einer Probe unter Verwendung von Festphasenextraktionsverfahren und die Wahl des verwendeten Materials, der Porengrößen und Durchflussraten für Festphasenextraktionsverfahren geläufig ist, und dass diese Kenntnis eine ausreichende Anleitung in Bezug auf die Wahl des Materials für den porösen festen Träger, für die Porengröße und für die Durchflussraten für das Fließen der Lösungsmittel/Lösungs-Mischung durch den porösen festen Träger in verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren liefert.
In einigen Ausführungsformen ist der poröse feste Träger aus einem Material hergestellt, das für die Auftrennung über Festphasenextraktion („SPE“) von Kohlenhydraten oder für die hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie („HILIC“) von Kohlenhydraten verwendet wird. Es ist vorgesehen, dass Materialien bei der HILIC-Auftrennung von Kohlenhydraten und bei der SPE-Extraktion von Kohlenhydraten verwendet werden, die für die Verwendung mit dem porösen festen Träger geeignet sind. SPE findet breite Anwendung in dem Fachgebiet und es gibt zahlreiche Anleitungen über Materialien, die für die für die Verwendung bei der SPE geeignet sind, und wie sie auszuführen ist, wie zum Beispiel von Thurman und Mills, SOLID-PHASE EXTRACTION: PRINCIPLES AND PRACTICE, John Wiley & Sons Inc. (New York, NY, 1998), N. Simpson, SOLID-PHASE EXTRACTION: PRINCIPLES, TECHNIQUES, AND APPLICATIONS, Marcel Dekker Inc. (New York, NY, 2000), und Waters Corp., BEGINNER'S GUIDE TO SPE: SOLID-PHASE EXTRACTION, John Wiley & Sons Inc. (New York, NY, 2014). Dementsprechend ist davon auszugehen, dass der Fachmann leicht Materialien auswählen kann, die für die Verwendung als poröser fester Träger geeignet sind.
Beispiele für hydrophile Materialien, die leicht so konfiguriert werden können, dass sie als poröser fester Träger dienen können, schließen ein: (a) Zellulose, (b) Glasfaser, (c) Aluminiumoxid, (d) Aminopropyl, (e) Aspartamide, (f) Cyclodextrin, (g) Triazole, (h) Diethylaminoethyl, (i) Harze, die typischerweise bei der HILIC-Trennung von Kohlenhydraten verwendet werden, (j) Siliziumdioxid, das modifiziert worden ist mit Diol, Cyanopropyl, Ethylendiamin-N-propyl oder Amid (Carbamoyl) Gruppen, oder (k) Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Materialien. In einigen Ausführungsformen kann der poröse feste Träger graphitierter Kohlensoff sein, der Glykosylamine bindet, jedoch dessen Verwendung ist weniger bevorzugt da er, unter anderem, mit oberflächenaktiven Mitteln gesättigt sein kann, die normalerweise zum Denaturieren des Glykoproteins oder Glykopeptids verwendet werden.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der poröse feste Träger zusammengesetzt aus Siliziumdioxid-Kügelchen oder -Partikeln, die kovalent an Carbamoylgruppen gebunden sind. In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Siliziumdioxid-Kügelchen oder -Partikel, die kovalent an Carbamoylgruppen gebunden sind Amide-80. In einigen bevorzugten Ausführungsformen haben die Amide-80-Kügelchen oder -Partikel eine Größe von 3-60 Mikron, stärker bevorzugt eine Größe von 5-50 Mikrons, noch stärker bevorzugt eine Größe von etwa 30 Mikron, wobei „etwa“ hier ± 2 Mikron bedeutet. Wie hierin verwendet sind die Begriffe „funktionalisiert“, „derivatisiert“ und „modifiziert“ (im Kontext mit einem Material, das als ein poröser fester Träger fungiert) äquivalent und bedeuten, dass die Oberfläche des Materials, das den Körper des festen Trägers bildet, kovalent an Moleküle von einer der aufgelisteten funktionellen Gruppen (z.B. Aminopropyl, Diol, Carbamoyl) gebunden ist, oder in einigen Ausführungsformen, an Moleküle von zwei oder mehr der aufgelisteten funktionellen Gruppen (z.B. sowohl Diol-Moleküle als auch Carbamoyl-Moleküle sind kovalent auf der Oberfläche des Materials des porösen festen Trägers gebunden).
Wie berichtet, kann in einigen Ausführungsformen der poröse feste Träger aus Glas hergestellt worden sein. Vorzugsweise ist das Glas so geformt, dass es einen großen Oberflächenbereich aufweist, um das Zurückhalten der Glykosylamine in der Lösungsmittel/Lösungs-Mischung zu erleichtern und ist vorzugsweise so geformt, dass die Mischung durchfließen kann um ein solches Festhalten zu erleichtern. Zum Beispiel kann das Glas eine Vielzahl von kleinen Vertiefungen haben, wodurch das Filtern der Flüssigkeiten ermöglicht wird, oder es kann in Form von Kügelchen oder Partikeln vorliegen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen liegt das Glas in Form von Glasfasern vor. In einigen Ausführungsformen können die Glasfasern verwoben sein. In Ausführungsformen, bei denen die Glasfasern lose sind, werden die Fasern typischerweise in Verbindung mit einem darunterliegenden strukturellen Träger verwendet, der die Fasern in dem Behälter festhält, während die Lösungsmittel, die Lösungen und die unerwünschten Reagenzien durchfließen. In diesen Ausführungsformen ist der strukturellen Träger zwischen den Glasfasern und den Öffnungen angeordnet, durch die die Lösungsmittel, Lösungen und unerwünschten Bestandteile zum Ausgang des Behälters fließen. Alternativ kann der Behälter auch so konfiguriert sein, dass er einen Ausgang aufweist, der klein genug ist um die Fasern an ihrer Position festzuhalten während die Lösungen ausfließen können.
In einigen Ausführungsformen kann der poröse feste Träger aus einer Form von Aminopropyl hergestellt worden sein. Die verschiedenen Aminopropyl-Formen, die zum Abtrennen der Kohlenhydrate geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und einige davon sind im Handel verfügbar. Zum Beispiel Aminopropyl AP (NH2) HPLC -Säulen zum Abtrennen von Kohlenhydraten sind von Separation Methods Technologies, Inc. (Newark, DE) erhältlich. APHERA™ NH2 HPLC -Säulen werden von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO) verkauft. Aminopropylsilane werden in dem Fachgebiet für die HILIC-Trennung von Zuckern verwendet. Es ist davon auszugehen, dass dem Fachmann verschiedene Wege geläufig sind, bei denen Aminopropyl verwendet wird, um Kohlenhydrate mittels Verfahren, wie HPLC und HILIC zu trennen, und geeignete Formen von Aminopropyl für die Bindung von Glykosylamine auswählen kann, die für die Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen Aminopropyl eingesetzt werden soll, geeignet sind.
In einigen Ausführungsformen kann der poröse feste Träger aus Zellulose hergestellt worden sein. Die Zellulose kann als Blätter verwendet werden, sie wird jedoch normalerweise bei der Festphasenextraktion als ein mikrokristallines Pulver verwendet, und diese Form ist bevorzugt, da sie einen größeren Oberflächenbereich für die Bindung der Glykosylamine bereitstellt. Diejenigen, die in der Praxis tätig sind werden verstehen, dass Festphasenträger die in Form von Pulvern, Nanopartikeln oder anderen kleinen Partikeln typischerweise in Verbindung mit einem Filter oder anderen Strukturen verwendet werden, die den Lösungsmitteln, Lösungen und unerwünschten Reagenzien ermöglichen nach dem Eluieren durch sie durchzufließen, während die Pulver, Nanopartikel oder anderen kleinen Partikel im Behälter zurückgehalten werden. In diesen Ausführungsformen ist der Filter oder die anderen Strukturen zwischen den Pulvern, Nanopartikeln oder anderen kleinen Partikeln und der Öffnung angeordnet, durch die die Lösungsmitteln, Lösungen und unerwünschten Reagenzien aus dem Behälter austreten.
In einigen Ausführungsformen kann der poröse feste Träger aus magnetischen Kügelchen bestehen, die mit Diol, Cyanopropyl, Ethylendiamin-N-propyl oder Amid (Carbamoyl)-Gruppen funktionalisiert sind.
Weiterhin ist vorgesehen, dass das für den porösen festen Träger verwendete Material die zurückgehaltenen Glykosylamine freisetzen wird, nachdem sie mit einer wässriger Lösung, wie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung eluiert werden (zur Klarheit ist anzumerken, dass sich die wässrige Lösung, die in diesem Schritt die Glykosylamine von dem porösen festen Träger eluiert, von der Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung unterscheidet, die verwendet wird um überschüssigen Marker von dem porösen festen Träger zu waschen, wie schematisch in dem optionalen Waschschritt dargestellt, der in , Punkte 6 und 9 gezeigt ist, da die wässrige Lösung keine Konzentration von etwa 80%-95% des organischen Lösungsmittels dieses Waschschrittes enthält. Typischerweise sind 20% oder weniger der Lösung, die verwendet wird, um die zurückgehaltenen Glykosylamine von dem porösen festen Träger zu eluieren, ein organisches Lösungsmittel mit mindestens 80%, und vorzugsweise mehr wässriger Lösung.)
Weniger häufig kann der poröse feste Träger in einigen Ausführungsformen aus einem nicht hydrophilen Material hergestellt sein, jedoch auf seiner Oberfläche mit einem hydrophilen Material beschichtet sein. Da Glykosylamine auf den festen Trägern über Wechselwirkungen mit der Oberfläche festgehalten werden, nicht durch Wechselwirkung mit einem beliebigen nicht hydrophilen Material unterhalb des hydrophilen Materials auf der Oberfläche, ist zu erwarten, dass die Glykosylamine mit dem festen Träger interagieren als wären er aus einem hydrophilen Material hergestellt. Demgemäß werden Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen der poröse feste Träger aus einem nicht hydrophilen Material hergestellt ist, jedoch dessen Oberfläche mit einem hydrophilen Material beschichtet ist, so behandelt als wäre der poröse feste Träger aus einem hydrophilen Material hergestellt.
Ohne einer Theorie unterworfen sein zu wollen, wird angenommen, dass in einer organischen Lösungsmittelmischung mit Konzentrationen an organischem Lösungsmittel von etwa 80% bis 95% (wobei etwa hier ±1% bedeutet) und die Verwendung eines porösen festen Trägers aus einem hydrophilen Material, die Glykosylamine in der Probe auf dem porösen festen Träger über hydrophile Wechselwirkungen festgehalten werden. Ohne einer Theorie unterworfen sein zu wollen, wird angenommen, dass bei Konzentrationen an organischem Lösungsmittel über 95% und die Verwendung eines porösen festen Trägers, die Glykosylamin-Probe ausfallen oder aggregiert, und eingefangen und auf dem porösen festen Träger zurückgehalten werden können durch Filtrieren durch die Poren und Öffnungen des porösen festen Trägers, unabhängig davon ob das Material des porösen festen Trägers hydrophil oder nicht hydrophil ist. Zum Beispiel, wenn derjenige der in der Praxis tätig ist eine Konzentration an organischem Lösungsmittel von über 95% wählt, zum Beispiel bis 99% oder höher, können beim Verdünnen der wässrigen Komponente bis zu einem Punkt, dass die Glykosylamine in einem beinahe reinen organischen Lösungsmittel sind, nicht hydrophile Materialien als poröse feste Träger verwendet werden. Dies ermöglicht in der Praxis Materialien zu verwenden, wie Polyethylen, Nylon, Polyvinylidenfluorid oder Polypropylen, die weniger teuer sind und leichter Poren oder Öffnungen der gewünschten Größe (z.B. 10 Mikron oder weniger) für den porösen festen Träger erzeugen. Wie bei den oben diskutierten hydrophilen Materialien, sollte das für den porösen festen Träger gewählte nicht hydrophile Material keines sein, das chemische Gruppen enthält oder damit derivatisiert ist, von denen zu erwarten ist, dass sie mit den Proteinen oder anderen Verbindungen reagieren, die erwartungsgemäß in der organischen Lösungsmittelmischung vorhanden sind. Ohne einer Theorie unterworfen sein zu wollen, wird angenommen, dass bei Konzentrationen an organischem Lösungsmittel über 95%, die Glykosylamine aggregieren oder aus der Probe der Glykosylamin-Ausgangslösung ausfallen und durch Filtrieren durch die Poren und Öffnungen einer Größe von 10 Mikron oder weniger in dem porösen festen Träger eingefangen und auf dem porösen festen Träger zurückgehalten werden können. Während die Verwendung von Lösungsmitteln mit einer Konzentration an organischem Lösungsmittel über 95% die Verwendung eine größere Bandbreite an Materialien für den porösen festen Träger zulässt, wie Polyethylen, wird auch die Menge an wässriger Lösung reduziert, die vorhanden ist, um die nicht erwünschten Reagenzien vom porösen festen Träger zu waschen, die freie Amine enthalten können und somit mit den Glykosylaminen für die Markierung mit dem Amin-reaktiven Farbstoff konkurrieren. Es wird daher angenommen, dass in Ausführungsformen, bei denen die organische Lösungsmittelmischung eine Konzentration an organischem Lösungsmittel von etwa 80% bis 95% (wobei etwa hier ±1 % bedeutet) hat und bei denen der poröse feste Träger aus einem hydrophilen Material hergestellt ist oder eine Oberfläche aufweist, die daraus besteht, im Allgemeinen bei den Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt sind
DIE BILDUNG DES PORÖSEN FESTEN TRÄGERS
Der Begriff „fester Träger“ bedeutet, dass der Träger eine feste Oberfläche hat, jedoch nicht notwendigerweise, dass der feste Träger aus einem Stück des Materials hergestellt worden ist aus dem er besteht. Der „feste Träger“ kann zum Beispiel aus einer Vielzahl von derivatisierten Siliziumdioxid-Kügelchen oder -Partikel zusammengesetzt sein, die wenn sie zusammengruppiert und über das Innere des Behälters angeordnet sind eine hydrophile Oberfläche bereitstellen, auf der die Glykosylamine zurückgehalten werden können. Wenn der feste Träger aus Kügelchen oder Partikeln hergestellt ist, können die Kügelchen oder Partikel zum Beispiel in einer Plastikhalterung verdichtet oder festgehalten werden, um die Kügelchen oder Partikel an der gewünschten Position im Behälter zu fixieren. In solchen Ausführungsformen kann die Plastikhalterung zusammengesetzt sein aus einem Plastikring mit einer Größe, die genau über das Lumen des Behälters passt, mit kreuzvernetzten Plastiksträngen ausgehend vom einem Ring über dem Inneren des Behälters, wie die Saiten eines Tennisschlägers, mit Löchern zwischen den kreuzvernetzten Strängen, wodurch kleinere Hohlräume entstehen, mit einem Durchmesser kleiner als die Kügelchen oder Partikel, wodurch Kügelchen oder Partikel an Ort und Stelle festgehalten werden, während die Flüssigkeiten durchlaufen können. Auf ähnliche Weise kann der feste Träger aus Glasfaser hergestellt sein, die kreuzweise übereinander angeordnet sind, um Oberflächen zu liefern, auf denen die Glykosylamine zurückgehalten werden können. Falls nötig können die Glasfasern am Platz mit einer Plasikhalterung, wie derjenigen, die vorstehend beschrieben ist, fixiert werden. In einigen Ausführungsformen können die Kügelchen, Partikel, Glasfasern oder Ähnliches in einem Bett am Boden des Behälters eingebettet sein. Die Kügelchen oder anderen Partikel können zum Beispiel festgehalten werden durch Verengen der Wände des Behälters bis auf einen Durchmesser, der kleiner ist als die Kügelchen oder Partikel, oder durch Anbringen einer geeigneten Halterung mit kreuzvernetzten Anteilen, wodurch Vertiefungen oder Öffnungen entstehen, die zu klein sind für die Kügelchen oder Partikel um durchzutreten, jedoch ermöglichen, dass die Flüssigkeiten eluiert werden.
In einigen Ausführungsformen liegt das hydrophile Material in Form einer Membran oder eines Monolithen vor, die rigid oder porös sein können. Die Membran oder der Monolith können so geformt sein, dass sie präzise in das Lumen des Behälters passen und den Querschnitt des Lumens an der gewünschten Position ausfüllen. Alternativ kann die Membran oder der Monolith so geformt sein, dass sie geringfügig kleiner als das Lumen des Behälters sind, und zum Beispiel durch eine Lippe oder einen Vorsprung um das Innere des Behälters, oder durch zwei oder mehrere Vorsprünge im Inneren des Behälters festgehalten werden, um die Position der Membran oder des Monolithen an der gewünschten Position zu fixieren.
Unabhängig davon ob der poröse feste Träger aus Kügelchen, Partikeln, einer Membran oder einem Monolith besteht, ist er an der gewünschten Position im Behälter über den gesamten Querschnitt des Lumens des Behälters positioniert, sodass die Lösungen oder Lösungsmittel im Behälter den porösen festen Träger passieren müssen bevor sie ihn verlassen. Verengt sich der Behälter von einem zylindrischen Teil zu einem konischen Teil, wie zum Beispiel bei einem Eppendorf-Röhrchen, können die Kügelchen, die Partikel, die Membran oder der Monolith zum Beispiel solche Ausmaße haben, dass sie den Bereich des Bodens des zylindrischen Teils vollständig abdecken und dort fixiert werden durch Verengen der Wände des Behälters, die den konischen Teil zu bilden (wenn auch anders als bei einem normalen Eppendorf-Röhrchen, haben die in den Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Behälter vorzugsweise ein Loch im Boden, damit die Flüssigkeiten aus dem Behälter eluiert werden können). Auf ähnliche Weise können, wenn der Behälter der zylindrische Teil einer Vertiefung einer Multiwellplatte ist, und die Vertiefung eine Düse am Boden mit einer Öffnung aufweist, die Lösungen falls gewünscht austreten, oder die Membran oder der Monolith, solche Ausmaße haben, dass sie den Bereich des Bodens des zylindrischen Teils der Vertiefung vollständig abdecken dort fixiert werden durch Verengen der Wände der Vertiefung, die den Teil der Düse unterhalb der Membran oder des Monoliths bilden, während die Kügelchen oder Partikel durch die Verengung der Seitenwände der Vertiefung auf einen engeren Durchmesser als die Kügelchen oder Partikel, während die Flüssigkeiten immer noch austreten können. In den Ausführungsformen, bei denen die hydrophilen Materialen für den porösen festen Träger verwendet werden, und die Glykosylamine nicht aus Monosacchariden bestehen oder sehr klein sind, kann die Größe der Poren oder Öffnungen größer sein als bei den nachfolgend diskutierten Ausführungsformen, solange die Glykosylamine durch die Poren und Öffnungen zwingend in Kontakt mit dem hydrophilen Material gebracht werden, sowie die organischen Lösungsmittelmischung durch den porösen festen Träger fließt. Die Glykosylamine tendieren dazu mit dem hydrophilen Material des festen Trägers zu interagieren oder darauf zurückgehalten zu werden, wenn in einem organischen Lösungsmittel eine Konzentration von 80% oder mehr organisches Lösungsmittel zu 20% oder weniger wässrige Lösung vorliegt.
So wie die Begriffe „porös“ und „permeabel“ verwendet werden um einen festen Träger zu beschreiben, soll vermittelt werden, dass der feste Träger den Lösungsmitteln und Lösungen ermöglicht graduell durch ihn gefiltert zu werden. Alle festen Träger, die in dieser Offenbarung beschrieben sind, sind poröse feste Träger, sofern nichts anderes angegeben ist oder durch den Kontext erforderlich ist. Es ist zu beachten, dass der poröse feste Träger in einigen Ausführungsformen zum Beispiel durch Befestigungsmaterialien, Verengungen der Gefäßwände oder interne Strukturen des Behälters in dem er sich befindet, festgehalten oder an der Position fixiert wird. Solche Befestigungsmaterialien, Verengungen der Gefäßwände oder interne Strukturen sind fest und können den porösen festen Träger zurückhalten oder stützen, sie müssen jedoch nicht aus dem gleichen Material hergestellt sein, wie das des Reaktionsgefäßes. Es ist nicht beabsichtigt, dass sie als ein poröser fester Träger angesehen werden, so wie der Begriff in dieser Offenbarung verwendet wird.
Die Form des porösen festen Trägers kann nach Wahl des Fachmanns variieren, solange er so gestaltet ist, dass die organischen Lösungsmittelmischung, die die zu markierenden Glykosylamine enthält durch sie hindurchströmen lässt. Zum Beispiel kann der poröse feste Träger ein Monolith, ein Filter oder eine Membran über dem Lumen eines Röhrchens sein, wie das einer Mikrofluidikvorrichtung, oder es kann Glasfaser oder ein Harz sein, welches das Innere einer Kartusche für die Festphasenextraktion („SPE“) teilweise oder vollständig ausfüllt. In einigen Ausführungsformen kann das Material für den festen Träger in Form von Kügelchen oder Partikel vorliegen, die im Reaktionsbehälter fixiert sind, zum Beispiel ein Rahmen oder Plastik mit Kreuzschraffierung, die kleiner ist als der Durchmesser der Kügelchen oder Partikel, an einer Position unterhalb der Kügelchen oder Partikel im Lumen des Behälters. Ist der poröser feste Träger ein Harz, kann er sich zum Beispiel in einem Behälter mit einem konischen Ende befinden, das sich bis zu einem Durchmesser zuspitzt, der die Flüssigkeit jedoch nicht das Harz durchlässt.
Die organische Lösungsmittelmischung strömt typischerweise durch den porösen festen Träger. In einigen Ausführungsformen kann die organische Lösungsmittelmischung, die die Glykosylamine enthält, durch den porösen festen Träger mit einem stromabwärts angelegten Vakuum durch den porösen festen Träger gesaugt werden, oder kann insbesondere in Mikrofluidikvorrichtungen durch Anlegen von Druck stromaufwärts durch den porösen festen Träger gepresst werden. Es sollte festgestellt werden, dass dem Fachmann seit Jahren verschiedene Festphasenmaterialien, wie Festphasenextraktions-Kartuschen um Glykane für die Reinigungsschritte vieler Protokolle zur Verfügung stehen. Es ist somit davon auszugehen, dass dem Fachmann die verschiedenen Formen, Konfigurationen und Materialtypen vertraut sind, die für die Verwendung beim Einfangen von Glykosylaminen aus organischen Lösungsmittelmischungen geeignet sind, bei gleichzeitigem Auswaschen unerwünschter Komponenten.
ELUIEREN DER GLYKOSYLAMINE VON DEM PORÖSEN FESTEN TRÄGER
Glykosylamine, die auf dem porösen festen Träger unter Anwesenheit der organischen Lösungsmittelmischung mit etwa 80-95% organischem Lösungsmittel zurückgehalten werden, können von dem porösen festen Träger mit einer wässrigen Lösung eluiert werden. Bis zu 20% der Lösung, die zum Eluieren der Glykosylamine von dem festen Träger verwendet wird, kann ein organisches Lösungsmittel sein, es ist jedoch mindestens zu 80% eine wässrige Lösung, wobei höhere Konzentrationen an wässriger Lösung bevorzugt sind. Es ist anzumerken, dass die „wässrige Lösung“ Wasser sein kann, jedoch eine Pufferlösung, wie HEPES-Puffer (2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure), Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder Ammoniumformiat-Puffer bevorzugt ist. Die Anwesenheit von Salzen in den Pufferlösungen erhöht die Polarität der wässrigen Lösung, verbessert die Freisetzung der Glykosylamine vom festen Träger während dem Eluieren. Die Puffer helfen dabei die Glykosylamine den pH-Wert der Lösung zu kontrollieren und deren Stabilität zu erhöhen.
Die eluierten und markierten Glykosylamine werden dann gesammelt und stehen zur Verfügung, um sie Analysevorrichtungen für die Analyse zuzuführen. Zum Beispiel können die markierten Glykosylamine über Hochleistungsflüssigchromatographie, Kapillarelektrophorese, mikrofluidische Trennung oder hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie („HILIC“) aufgetrennt werden. Die markierten Glykosylamine können dann über Fluoreszenznachweis und Messung der Fluoreszenzintensität, über Massenspektrometrie oder eine Kombination von einem Nachweis der Fluoreszenzintensität und Massenspektrometrie analysiert werden.
BEHÄLTER DIE FESTE TRÄGER BEINHALTEN
Wie vorstehend berichtet sind bei typischen Ausführungsformen die zu markierenden Glykosylamine zu Beginn in einer wässrigen Lösung, die dann durch Zugabe einer größeren Menge eines organischen Lösungsmittels zu der Lösung verdünnt wird. Die resultierende organische Lösungsmittelmischung, die die Glykosylamine enthält, wird dann zur Vereinfachung in einen für diesen Zweck gestalteten zweiten Behälter überführt. In typischen Ausführungsformen hat der Behälter einen länglichen Körper mit zwei Enden. In einigen Ausführungsformen liegen die zwei Enden auf den gegenüberliegenden Seiten entlang der Länge des Körpers des Behälters. Die Enden lassen sich unabhängig voneinander öffnen oder sind unabhängig voneinander öffnenbar, um das Einfüllen der Lösungen und Reagenzien am ersten Ende und das Austreten der Lösungen und Reagenzien am zweiten Ende zu ermöglichen. In einigen Ausführungsformen ist der Behälter zylindrisch. In einigen Ausführungsformen ist der Behälter zylindrisch, verengt sich jedoch zu einer Düse am zweiten Ende, um das Einfangen der markierten Glykosylamine wenn sie eluiert sind für die Analyse zu erleichtern. In einigen Ausführungsformen kann der Behälter ähnlich einem Standard-Eppendorf-Röhrchen, ein Mikrofugenröhrchen oder Zentrifugen-Röhrchen sein, jedoch mit einer Öffnung am Boden. Typischerweise haben solche Röhrchen einen ersten Abschnitt, der einen offenen oder öffnenbaren Ausgang des ersten Endes aufweist, einen zylindrischen Körper, der den zweiten gegenüberliegenden Abschnitt verbindet, wobei der zweite Abschnitt eine konische Form hat, die sich von dem zylindrischen ersten Anschnitt weg verengt bis das zweite Ende erreicht ist. Das zweite Ende kann geöffnet werden, kann jedoch in einigen Ausführungsformen verschließbar sein, wobei den Lösungen im Behälter inkubieren können, wenn das Ende am Boden geschlossen ist, und aus dem Behälter ausfließen können, wenn das zweite Ende geöffnet ist. Zum Beispiel kann das Ende am Boden mit einer Kappe oder einem entfernbaren Verschluss ausgestattet sein, um dem Benutzer oder der automatischen Vorrichtung zu ermöglichen, das Ende am Boden zu öffnen und der Lösung zu ermöglichen aus dem Behälter auszufließen. In anderen Ausführungsformen kann der Behälter allgemein eine zylindrische, konische, tetrahedrale oder quaderförmige Gestalt haben. Die Behälter können so gestaltet sein, dass sie von einem Apparat aufgenommen werden, der für deren Aufnahme gestaltet worden ist. In diesem Fall wird darauf als „Kartusche“ Bezug genommen.
In einigen Ausführungsformen ist der zweite Behälter eine Vertiefung („Well“) in einer Multiwellplatte, und in bevorzugten Ausführungsformen ist jede Vertiefung der Multiwellplatte ein Behälter, der an die Glykosylamine angepasst ist, um sie einzufangen und zurückzuhalten. Solche Vertiefungen haben typischerweise einen zylindrischen Aufbau, der sich Richtung Bodenbereich verengt, und eine Öffnung umfasst, die der Lösung ermöglicht aus der Vertiefung auszutreten. Der Ausgang am Boden der Vertiefung ist vorzugsweise enger als der Durchmesser der Vertiefung und kann eine Düse sein, die vom Boden der Vertiefung hervorspringt, insbesondere dort wo es erwünscht ist, um die Platte in einem System für die automatische Probennahme zu verwenden.
Der zweite Behälter beinhaltet einen porösen festen Träger, der zwischen dem oberen Ende und dem Ausgang angeordnet ist, egal ob es sich um ein Röhrchen, eine Kartusche oder eine Vertiefung („Well“) handelt. In einer Vertiefung mit einer Düse ist der erste poröse feste Träger vorzugsweise unmittelbar über der Düse angeordnet. Der poröse feste Träger besteht vorzugsweise aus einem hydrophilen Material, wie in den vorstehenden Abschnitten diskutiert. In Ausführungsformen, bei denen der poröse feste Träger zum Beispiel in Kügelchen eingeschlossen ist, wie derivatisierten Siliziumdioxid-Kügelchen, kann der Ausgang einen kleineren Durchmesser haben als der Durchmesser der Kügelchen, oder die Kügelchen können mittels konventionellen Maßnahmen fixiert werden, wie mithilfe einer oder mehreren porösen Kompressionsfritte(n), oder mithilfe eines Plastik-Retainers unter den Kügelchen, der Querstreben aufweist.
Kartuschen für die Festphasenextraktion (SPE) und andere Vorrichtungen, die hydrophile Polymere zum Zurückhalten von Kohlenhydraten enthalten, weisen typischerweise Hilfsmittel zum Zurückhalten der Polymere innerhalb der Vorrichtungen auf. Diese Hilfsmittel sind typischerweise ausgewählt aus Reagenzien, die nicht mit den Kohlenhydraten, und anderen Reagenzien reagieren, von denen auszugehen ist, dass sie damit in Berührung kommen, und um Flüssigkeiten wie Waschlösungen zu ermöglichen, aus der Vorrichtung über den beabsichtigten Ausgang, wie einer Düse auszutreten. Jede dieser konventionellen Hilfsmittel können verwendet oder angepasst werden, um den porösen festen Träger in der Vorrichtung zurückzuhalten.
Die Reaktionsgefäße selbst sind aus Materialien hergestellt, die nicht reaktiv gegenüber den Reagenzien und Lösungen sind, die darin verwendet werden. Typischerweise sind die Reaktionsgefäße aus Plastik. Kartuschen und Behälter für die SPE der Kohlenhydrate sind in dem Fachgebiet gut bekannt und können von einer Reihe von Anbietern bezogen werden. Die Kunststoffe oder anderen Materialien, die für die SPE-Kartuschen verwendet werden um die Kohlenhydrate anderer Arten von Verbindungen, wie Proteine abzutrennen sind im Allgemeinen geeignet um sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden.
ELUIEREN DER GLYKOSYLAMINE, DIE AUF DEM PORÖSEN FESTEN TRÄGER ZURÜCKGEBLIEBEN SIND
Sobald der überschüssige Marker von den markierten Glykosylaminen, die auf dem porösen festen Träger zurückgehalten worden sind, entfernt worden ist, werden die zurückbleibenden Glykosylamine von dem porösen festen Träger durch Waschen des Trägers mit einer wässrigen Lösung eluiert. Wässrige Lösungen, zu denen Salz hinzugefügt wird, sind bevorzugt. Es können auch Kombinationen von Lösungen verwendet werden. Die wässrige Lösung kann bis zu 20% organisches Lösungsmittel umfassen oder nur Wasser oder eine Pufferlösung sein. Jede spezielle Lösung oder Kombination kann für ihre Eignung zum Eluieren der Glykosylamine auf einem festen Träger, der aus einem beliebigen Material hergestellt ist, leicht durch das Durchführen von parallelen Assays getestet werden.
KITS
In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung Kits für die Markierung von Glykosylaminen bereit, die von einem Glykoprotein oder Glykopeptid durch enzymatische Spaltung gemäß den vorstehend diskutierten erfinderischen Verfahren freigesetzt werden. Die Kits enthalten Reagenzien und Materialien für die Deglykosylierung des Glykoproteins oder Glykopeptids durch enzymatischen Verdau, für die Bildung einer organischen Lösungsmittelmischung, die die resultierenden Glykosylamine enthält, für die Immobilisierung der Glykosylamine auf einem porösen festen Träger, und für die anschließende Markierung mit einem Amin-reaktiven Farbstoff.
Das Kit schließt ein Deglykosylierungsenzym ein. In einigen Ausführungsformen ist das Enzym PNGase F. Das Kit umfasst eine wässrige Lösung wie einen Puffer, der für das Inkubieren des Glykoproteins oder Glykopeptids mit dem Deglykosylierungsenzym geeignet ist. In den Ausführungsformen der Denaturierung können die Kits weiterhin ein Detergenz oder Denaturierungsmittel enthalten.
Das Kit schließt weiterhin ein organisches Lösungsmittel, wie Acetonitril, absoluten Ethanol, absoluten Methanol, Isopropanol, Butanol, Toluol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydrofuran, Diethylether, Dichlormethan, Chloroform, tert-Buthylmethylether, Benzol, Kohlenstofftetrachlorid, Isooctan, Hexan oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ein. In einigen Ausführungsformen des Kits ist das organische Lösungsmittel Acetonitril. Das Enzym, die Lösung oder das Lösungsmittel, Detergenzien oder Denaturierungsmittel werden, sofern enthalten, bequem in getrennten Behältern bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen wird die wässrige Lösung und das organische Lösungsmittel in abgemessenen Mengen bereitgestellt werden, sodass wenn sie kombiniert werden, eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 80-95% organisches Lösungsmittel zu 20-5% wässriger Lösung aufweist. In einigen Ausführungsformen sind die abgemessenen Mengen so, dass, wenn sie kombiniert werden, eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 80-90% organisches Lösungsmittel zu 20-10% wässriger Lösung aufweist. In einigen Ausführungsformen sind die abgemessenen Mengen so, dass, wenn sie kombiniert werden, eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 85% ±2% organisches Lösungsmittel zu 15% ±2% wässriger Lösung aufweist.
Das Kit umfasst weiterhin einen Behälter mit darin angeordnetem porösen festen Träger. Der poröse feste Träger ist in dem Behälter so angeordnet, dass die Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung, die die freigesetzten Glykosylamine enthält, durch den porösen festen Träger durchläuft, wenn die Mischung in den porösen festen Träger, zum Beispiel über Eintauchen oder Pipettieren der Mischung eingeführt wird. In einigen Ausführungsformen, liegt der poröse feste Träger in Form einer Membran vor. In einigen Ausführungsformen ist der poröse feste Träger ein hydrophiles Material. In einigen Ausführungsformen ist das hydrophile Material (a) Zellulose, (b) Glasfaser, (c) Aluminiumoxid, (d) Siliziumdioxid, (e) eine funktionalisierte Oberfläche, die Diol, Aminopropyl, Carbamoyl, Cyanopropyl, Ethylendiamin-N-propyl enthält, (f) Siliziumdioxid, derivatisiert mit Diol, Aminopropyl oder Carbamoyl, (g) Zellulose, (h) Cyclodextrin, (i) Aspartamamid, (j) Triazol, (k) Diethylaminoelthyl, (I) ein Harz, das bei der Festphasenextraktion von Kohlenhydraten verwendet wird, oder (m) eine Kombination von zwei oder mehreren davon. In einigen Ausführungsformen ist der poröse feste Träger aus Siliziumdioxidhergestellt und das Siliziumdioxid ist an eine oder mehrere Carbamoylgruppen kovalent gebunden. In einigen Ausführungsformen liegt das Siliziumdioxid in Form von Kügelchen oder Partikeln vor. In einigen Ausführungsformen haben die Kügelchen oder Partikel eine Größe von 3-60 Mikron. In einigen Ausführungsformen haben die Kügelchen oder Partikel eine Größe von etwa 30 Mikron. In einigen Ausführungsformen sind die Kügelchen oder Partikel , die kovalent an Carbamoylgruppen gebunden sind Amide-80.
Das Kit umfasst weiterhin einen Amin-reaktiven Farbstoff. In einigen Ausführungsformen ist der Farbstoff InstantPC™.
BEISPIELE
Beispiel 1.
Dieses Beispiel legt Abkürzungen für einige der Reagenzien dar, die in den exemplarischen Arbeitsabläufen der Markierungsverfahren unter Verwendung exemplarischer Kohlenhydrate in einigen der unten aufgeführten Beispielen verwendet werden.
„SDS“: Natriumdodecylsulfat
„Tris“: Tris(hydroxymethyl)aminomethan
„PNGase F Mix”: eine 1:1 Mischung von PNGase F (~1 mg/ml) und 750 mM HEPES ((4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure) pH 8.0 Puffer.
Beispiel 2.
Dieses Beispiel legt einen exemplarischen Arbeitsablauf für die N-Glykan InstantPC™ - Markierung dar, unter Verwendung eines exemplarischen Amid-Trägers.
N-Glykan-Freisetzung und Herstellung
Vier 10 µl-Proben von 4 mg/ml eines exemplarischen Glykoproteins, Etanercept, wurden in die Vertiefungen einer PCR-Platte gegeben. Jeweils zwei µl SDS wurden jeder Vertiefung hinzugefügt und die PCR-Platte wurde für 3 Minuten bei 90° C inkubiert, um das Glykoprotein zu denaturieren. Nach dem Abkühlen der Proben auf unter 50°C, wurden 2 µl der PNGase F-Mischung in jede Vertiefung gegeben, um den Enzymverdau der Glykoproteine zu bewirken und die Glykane des Glykoproteins als Glykosylamine freizusetzen. Die PCR-Platte wurde dann für 5 Minuten bei 50° C inkubiert. Zehn µl von 1,5M Tris pH 8 Puffer wurde dann zu zwei Proben hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 750mM Tris zu erreichen, während 10 µl H₂O zu jeder der beiden anderen Proben hinzugefügt wurde, um das Volumen der vier Proben gleich zu halten. Das Volumen jeder Probe war etwa 26 µl.
Markierung und anschließende Analyse von zwei in Lösung gehaltenen Proben
Eine der Proben zu der Tris-Puffer hinzugefügt wurde und eine Probe zu der nur Wasser hinzugefügt wurde, wurden durch Zugabe von 15 µl einer Markierungsreaktionsmischung (InstantPC™ Farbstoff, gemischt mit Farbstofflösungsmittel) zu der wässrigen Lösung markiert, welche auch das nun deglykosylierte Glykoprotein, SDS, PNGase F und andere Reagenzien enthielt, die in dem Puffer und der PNGase F-Mischung vorhanden sind. Beide Proben wurden bei 50°C für 3 Minuten inkubiert. Zu jeder Probe wurde Wasser hinzugefügt, um das Volumen bis zu 100 µl zu erhöhen und um das Probenvolumen an das Probenvolumen der Proben anzupassen, die in dem nächsten Absatz diskutiert sind. Ein µl von jeder Probe wurde dann für eine Abtrennung durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) injiziert und anschließend über die Fluoreszenz der markierten Glykosylamine analysiert.
Immobilisierung von zwei Proben und deren anschließende Markierung
Die anderen beiden Proben, eine Probe zu der Tris-Puffer hinzugefügt wurde und eine Probe zu der nur Wasser hinzugefügt wurde, jeweils mit einem Volumen von etwa 26 µl, wurden mit 174 µl eines organischen Lösungsmittels, Acetonitril, vermischt um eine Lösung von etwa 85% organischem Lösungsmittel und 15% wässriger Lösung zu ergeben. Die resultierende Mischung wurde dann auf eine „MonoSpin“ Amid-Festphasenextraktions („SPE“) -Zentrifugensäule (GL Sciences, Inc., USA, Torrance, CA) geladen, wodurch die Glykosylamine in der Mischung auf dem festen Träger der Säule immobilisiert wurden, während andere Bestandteile in der Acetonitril/Wasser-Lösung durchfließen konnten. Der feste Träger wurde dann einmal mit einer Lösung von 85% Acetonitril/15% Wasser gewaschen.
Jede Probe wurde dann durch Zugabe von 15 µl einer Markierungsreaktionsmischung (InstantPC™ Farbstoff gemischt mit Farbstofflösungsmittel) zum festen Träger markiert, um alle Glykosylamine, die auf dem festen Träger immobilisiert sind zu markieren. Beide Proben wurden bei 50°C für 3 Minuten inkubiert. Die nun markierten Glykosylamine wurden dann durch Waschen des festen Trägers mit 100 µl einer wässrigen Lösung eluiert. Nach dem Eluieren wurde 1 µl von jeder Probe für eine Abtrennung durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) injiziert und anschließend über die Fluoreszenz der markierten Glykosylamine analysiert.
Beispiel 3
Dieses Beispiel berichtet über die Ergebnisse der in Beispiel 2 dargelegten Studie.
Die Ergebnisse sind in in graphischer Form dargestellt. Die beiden Säulen auf der linken Seite des Graphen zeigen die Fluoreszenz der Proben, die in Lösung markiert wurden. Die Kontrolle (die Probe, bei der nur Wasser zur Deglykosylierungsmischung hinzugefügt wurde) zeigt einen Signalbereich von über 35 Millionen Einheiten, während die Probe, die Tris-Puffer enthält einen Signalbereich von etwa 2 Millionen zeigt, was die Schwierigkeit zeigt Glykosylamine nachzuweisen, wenn Tris-Puffer oder andere Aminquellen anwesend sind, die mit dem Amin-reaktiven Farbstoff in der Probe reagieren können. Die beiden Säulen auf der rechten Seite des Graphen zeigen die Fluoreszenz der Proben, die in 85% organisches Lösungsmittel/15% wässrige Lösung gegeben, auf einem hydrophilen festen Träger immobilisiert, auf dem Träger markiert, eluiert und analysiert wurden. Die zweite Säule von rechts zeigt das Ergebnis der Kontrolle (nur Wasser zugefügt zur Deglykosylierungsmischung), und zeigt einen Signalbereich nahe bei 33 Millionen Einheiten, nahe beim unteren Limit des Fehlerbalkens der Kontrollprobe, markiert in Lösung. Die Probe, die Tris-Puffer enthält zeigt einen Signalbereich von annähernd 26 Millionen, ein Signal das mindestens 10 mal höher ist als das der Tris-enthaltenden Probe, markiert in Lösung.
Die hierin beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen sind so zu verstehen, dass sie lediglich zu illustrativen Zwecken dienen und dass dem Fachmann angesichts dessen verschiedene Modifikationen oder Änderungen nahegelegt werden, die im Geist und Geltungsbereich dieser Anmeldung und im Rahmen der anhängigen Ansprüche eingeschlossen sind. Alle hierin zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke eingeschlossen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 62/842809 [0001]
US 5747347 [0005]

Claims

Ein in vitro-Verfahren zum Markieren von Glykosylamin, und gegebenenfalls zum Analysieren der markierten Glykosylamine, wobei das Verfahren die folgenden Schritte in der folgenden Reihenfolge umfasst: (a) Erhalten der Glykosylamine in einer wässrigen Lösung, (b) Mischen der wässrigen Lösung, in der die Glykosylamine vorhanden sind mit einer Menge eines organischen Lösungsmittels, wodurch eine organische Lösungsmittelmischung gebildet wird, die aus etwa 80% oder mehr des organischen Lösungsmittels zusammengesetzt ist, (c) Durchführen der organischen Lösungsmittelmischung, welche die Glykosylamine enthält durch einen porösen festen Träger, wodurch die Glykosylamine auf dem porösen festen Träger immobilisiert werden, und (d) Markieren der Glykosylamine mit einem Amin-reaktiven Farbstoff, entweder (1) während die Glykosylamine auf dem porösen festen Träger immobilisiert sind, und anschließendem Eluieren der markierten Glykosylamine von dem porösen festen Träger mit einer wässriger Lösung in einen Behälter, oder (2) Eluieren der immobilisierten Glykosylamine von dem porösen festen Träger mit einer wässriger Lösung in einen Behälter und anschließendem Markieren der eluierten Glykosylamine mit dem Amin-reaktiven Farbstoff, wodurch die Glykosylamine markiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der poröse feste Träger aus einem hydrophilen Material hergestellt ist und die organische Lösungsmittemischung etwa 80% bis 95% organisches Lösungsmittel zu etwa 20% bis 5% wässriger Lösung ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das hydrophile Material (a) Zellulose, (b) Glasfaser, (c) Aluminiumoxid, (d) Siliziumdioxid, (e) eine funktionalisierte Oberfläche, die Diol, Aminopropyl, Carbamoyl, Cyanopropyl, Ethylendiamin-N-propyl enthält, (f) Siliziumdioxid, derivatisiert mit Diol, Aminopropyl oder Carbamoyl, (g) Zellulose, (h) Cyclodextrin, (i) Aspartamamid, (j) Triazol, (k) Diethylaminoelthyl, (I) ein Harz, das bei der Festphasenextraktion von Kohlenhydraten verwendet wird, oder (m) eine Kombination von zwei oder mehreren davon ist.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der feste Träger aus Siliziumdioxid hergestellt wird und das Siliziumdioxid an eine oder mehrere Carbamoylgruppen kovalent gebunden ist.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Siliziumdioxid in Form von Kügelchen oder Partikeln vorliegt.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Kügelchen oder Partikel eine Größe von 3-60 Mikron aufweisen.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Kügelchen oder Partikel eine Größe von 30 Mikron aufweisen.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kügelchen oder Partikel, die kovalent an Carbamoylgruppen gebunden sind, Amide-80 sind.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der poröse feste Träger in Form einer Membran vorliegt.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der poröse feste Träger in Form eines Monoliths vorliegt.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der poröse feste Träger in Form von Kügelchen vorliegt.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der poröse feste Träger in Form von Fasern vorliegt.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der poröse feste Träger ein Harz ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt (c'), Waschen des porösen festen Trägers mit einer Lösung, die 80 bis 90% organisches Lösungsmittel und 20 bis 10% wässriger Lösung ist, zwischen den Schritten (c) und (d) umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt (e), Abtrennen des markierten Glykosylamins über eine Trennmethode umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei bei der Trennmethode das Glykosylamin einer Hochleistungsflüssigchromatographie, Ultrahochleistungsflüssigchromatographie, hydrophilen Interaktionsflüssigkeitschromatographie, Kapillarelektrophorese, mikrofluidische Trennung oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon unterworfen wird, wodurch das markierte Glykosylamin abgetrennt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei das abgetrennte, markierte Glykosylamin weiterhin über Fluoreszenznachweis der Markierungen analysiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 15 wobei das abgetrennte, markierte Glykosylamin weiterhin über Massenspektrometrie der Markierungen analysiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das organische Lösungsmittel Acetonitril, absoluter Ethanol, absoluter Methanol, Isopropanol, Butanol, Toluol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydrofuran, Diethylether, Dichlormethan, Chloroform, tert-Buthylmethylether, Benzol, Kohlenstofftetrachlorid, Isooctan, Hexan oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das organische Lösungsmittel Acetonitril, absoluter Ethanol, absoluter Methanol, Isopropanol, Butanol, Toluol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydrofuran, Diethylether, Dichlormethan, Chloroform, tert-Buthylmethylether, Benzol, Kohlenstofftetrachlorid, Isooctan, Hexan oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das organische Lösungsmittel Acetonitril ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das organische Lösungsmittel Acetonitril ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der poröse feste Träger in einer Vertiefung einer Multiwellplatte oder Mikrowellplatte vorliegt.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der poröse feste Träger in einem Lumen einer Mikrofluidikvorrichtung angeordnet ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der poröse feste Träger in einer Zentrifugen-Säule oder Festphasen-Extraktionskartusche angeordnet ist.
Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei der poröse feste Träger in einer Zentrifugen-Säule angeordnet ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der poröse feste Träger eine Oberfläche aus einem nicht hydrophilen Material aufweist, und die organische Lösungsmittelmischung 95% oder mehr des organischen Lösungsmittels aufweist.
Das Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das nicht hydrophile Material Polyethylen, Nylon, Polyvinylidenfluorid oder Polypropylen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der poröse feste Träger Poren und Öffnungen von 10 Mikron oder kleiner hat.
Ein Kit zur Markierung eines Glykosylamins, das von einem Glykoprotein oder Glykopeptid mit einem Enzym freigesetzt wird, mit einem Amin-reaktiven Farbstoff, wobei das Kit umfasst: ein Deglykosylierungsenzym, eine wässrige Lösung, die geeignet ist für die Inkubation des Deglykosylierungsenzyms mit dem Glykoprotein oder Glykopeptid, einen Amin-reaktiven Farbstoff, ein organischen Lösungsmittel, und einen Behälter mit darin angeordnetem porösen festen Träger.
Das Kit nach Anspruch 30, wobei die wässrige Lösung und das organische Lösungsmittel in abgemessener Form bereitgestellt werden, sodass wenn sie kombiniert werden eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 80-95% organisches Lösungsmittel zu 20-5% wässriger Lösung aufweist.
Das Kit nach Anspruch 31, wobei die wässrige Lösung und das organische Lösungsmittel in abgemessener Form bereitgestellt werden, sodass wenn sie kombiniert werden eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 80-90% organisches Lösungsmittel zu 20-10% wässriger Lösung aufweist.
Das Kit nach Anspruch 31, wobei die wässrige Lösung und das organische Lösungsmittel in abgemessener Form bereitgestellt werden, sodass wenn sie kombiniert werden eine Mischung aus organischem Lösungsmittel und wässriger Lösung gebildet wird, die 85% ±2% organisches Lösungsmittel zu 15% ±2% wässriger Lösung aufweist.
Das Kit nach Anspruch 30, wobei das organische Lösungsmittel Acetonitril, absoluter Ethanol, absoluter Methanol, Isopropanol, Butanol, Toluol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydrofuran, Diethylether, Dichlormethan, Chloroform, tert-Buthylmethylether, Benzol, Kohlenstofftetrachlorid, Isooctan, Hexan oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon ist.
Das Kit nach Anspruch 34, wobei das organische Lösungsmittel Acetonitril ist.
Das Kit nach Anspruch 30, wobei das Deglykosylierungsenzym PNGase F ist.
Das Kit nach Anspruch 30, weiterhin umfassend ein Denaturierungsmittel.
Das Kit nach Anspruch 30, wobei weiterhin der poröse feste Träger ein hydrophiles Material ist.
Das Kit nach Anspruch 38, wobei weiterhin der poröse feste Träger in Form einer Membran vorliegt.
Das Kit nach Anspruch 38, wobei weiterhin das hydrophile Material (a) Zellulose, (b) Glasfaser, (c) Aluminiumoxid, (d) Siliziumdioxid, (e) eine funktionalisierte Oberfläche, die Diol, Aminopropyl, Carbamoyl, Cyanopropyl, Ethylendiamin-N-propyl enthält, (f) Siliziumdioxid, derivatisiert mit Diol, Aminopropyl oder Carbamoyl, (g) Zellulose, (h) Cyclodextrin, (i) Aspartamamid, (j) Triazol, (k) Diethylaminoelthyl, (I) ein Harz, das bei der Festphasenextraktion von Kohlenhydraten verwendet wird, oder (m) eine Kombination von zwei oder mehreren davon ist.
Das Kit nach Anspruch 40, wobei der feste Träger aus Siliziumdioxid hergestellt wird und das Siliziumdioxid an eine oder mehrere Carbamoylgruppen kovalent gebunden ist.
Das Kit nach Anspruch 41, wobei das Siliziumdioxid in Form von Kügelchen oder Partikeln vorliegt.
Das Kit nach Anspruch 42, wobei die Kügelchen oder Partikel eine Größe von 3-60 Mikron aufweisen.
Das Kit nach Anspruch 42, wobei die Kügelchen oder Partikel eine Größe von 30 Mikron aufweisen.
Das Kit nach Anspruch 41, wobei die Kügelchen oder Partikel, die kovalent an die Carbamoylgruppen gebunden sind, Amide-80 sind.