DE3708513C2

DE3708513C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Nukleinsäure-Analyse

Info

Publication number: DE3708513C2
Application number: DE3708513A
Authority: DE
Inventors: Tomas B Hirschfeld
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1986-03-21
Filing date: 1987-03-16
Publication date: 1998-11-05
Anticipated expiration: 2007-03-17
Also published as: GB8705957D0; CA1299074C; GB2190189A; FR2596159A1; FR2596159B1; JP2735189B2; DE3708513A1; JPS62266464A; GB2190189B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf biochemische Analysen und insbesondere auf Analysen, bei denen eine Markierung benutzt wird, welche in der Lage ist, aufnehmbare Strahlung zu emittieren, um Nukleinsäure zu identifizieren und um die Konzentration und Kreuzkorrelation ausgewählter Nuklein säuren und Fragmente zu messen.

Eine bekannte Technik für chemische und biochemische Ana lysen ist in den folgenden US-PSen beschrieben:
4 133 639, 4 050 895, 4 321 057, 4 399 099, 4 447 546 und weiteren. Hierin ist ein optisches System beschrieben, das die Prinzipien einer abgeschwächten Totalreflexions spektroskopie (ATR) benutzt. Als ATR-Zelle benutzt ein optisches System einen optischen Wellenleiter, im typi schen Falle eine Platte, einen Stab oder eine optische Faser. Wenn ein Ende der Zelle mit einer Erregerstrahlung beleuchtet wird, dann wird diese Strahlung innen total derart reflektiert, daß eine abklingende Welle an der Zellenoberfläche erzeugt wird. Die Erregerstrahlung wird so gewählt, daß die abklingende Welle eine Fluoreszenz in den zu analysierenden Substanzen erregt, die nur in einer dünnen Zone (im typischen Fall mit einer Dicke von weni gen Hundert bis Eintausend Angstrom-Einheiten) angeordnet sind und die Zellenoberfläche umgeben. Die resultierende Fluoreszenz kann eine Information liefern, gemäß welcher das fluoreszierende Material analysiert werden kann.

Derartige Systeme wurden bisher benutzt, um beispielswei se antigene Substanzen, Chemikalien und dergleichen zu analysieren.

Es ist weiter bekannt, daß die genetische Information, betreffend die Synthese der Aminosäuresequenz in Protein, durch Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) durchgeführt wird, und dies sind beides sehr lange komplexe Moleküle gewöhnlich in Form einer Doppelschrau be. Weil DNA oder RNA in allen lebenden Stoffen allgegen wärtig sind, und zwar in Formen, die einzigartig für jede Species ist, kann die Natur der Nukleinsäure oder von einzigartigen Fragmenten hiervon (diese werden im folgen den kollektiv als Polynukleotide bezeichnet) dazu dienen, das Vorhandensein einer gegebenen Species durch Analyse festzustellen. Beispielsweise enthalten alle Virengene entweder RNA oder DNA. Derartige Virusnukleinsäuren kön nen leicht von dem Proteinüberzug isoliert werden und sie sind gegenwärtig in hochreiner Form verfügbar. Viele der Virusnukleinsäuren sind linear und doppelsträngig (DNA in derartigen Viren wie Smallpox und SV40 beispielsweise, und RNA in Viren wie beispielsweise Reoviren). Einsträngi ge Nukleinsäuren können immer doppelsträngig werden, wenn komplementäre Einzelstränge verfügbar sind. Die Doppel stränge der Nukleinsäure können getrennt werden, indem die Nukleinsäure Denaturalisierungsbedingungen unterwor fen wird (beispielsweise einem hohen oder einem niedrigen pH, hohen Temperaturen, Reagenzmitteln wie beispielsweise EDTA und Guanidin, welches die Wasserstoffbindungen auf bricht, usw.). Die Denaturalisierung trennt gewöhnlich nicht nur die Nukleinsäure in Einzelstränge, sondern kann auch die Stränge in ein großes unvorhersagbares Sortiment von Fragmenten aufbrechen, die extrem schwierig voneinander in identifizierbarer Form trennbar sind. Oft müssen Beschrän kungsenzyme benutzt werden, um die Nukleinsäuren an bestimm ten Sitzen aufzubrechen, um eine Vielzahl von Fragmenten zu erzeugen, die laboratoriumsmäßig durch Elektrophorese und andere zeitraubende Techniken getrennt werden, um sie schließlich identifizieren zu können.

Die EP 70 687 A2 beschreibt ein hybridisierendes diagnosti sches Verfahren, welches einsträngige Polynukleotide benutzt, um eine Hybridisierung mit immobilisierten einsträngigen Polynukleotid-Proben durchzuführen. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

- es wird ein einsträngiges Polynukleotid auf einem Träger unter Hybridisationsbedingungen mit ein strängigen Polynukleotid-Segmenten in Berührung gebracht, die komplementär zu einem repräsenta tiven Teil der einsträngigen Proben-Nukleotiden sind;
- es werden die nicht-hybridisierten einsträngigen Polynukleotid-Segmente aus der immobilisierten Probe getrennt;
- es wird die immobilisierte Probe durch Licht er regt und
- es wird das Lichtansprechen der Probe detektiert.

Die EP 131 830 A1 beschreibt eine Nukleinsäure-Probe mit den folgenden Bestandteilen:

- eine Nukleinsäure-Komponente;
- einen die Nukleinsäure bindenden Liganden, der photochemisch mit der Nukleinsäure-Kompontente ver bunden ist und
- eine Markierung, die chemisch mit dem Liganden verbun den ist.

Mit dieser Probe soll ein vereinfachtes System geschaffen wer den, um Nukleinsäuren durch hybridisierende Analyse festzu stellen.

Die GB 21 39 349 A beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure, die man in Zellen vermutet, welche Nukleo proteine und Nuklease enthalten. Die Zellen zerfallen hierbei in einem Lyse-Puffer, der ein Mittel aufweist, um die Nukleoproteine aufzubrechen und welches die Nuklease verhindert, wenn DNA bestimmt wird, wobei das Produkt in ein strängige Form gebracht wird und das Verfallsprodukt unter Hybridisationsbedingungen mit einem Polynukleotid kontaktiert wird, welches eine Nukleotiden-Sequenz aufweist, die komple mentär zu einer Sequenz ist, die in der zu bestimmenden Nuklein säure vorhanden ist, wobei schließlich das Ausmaß der Hybridi sierung bestimmt wird.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu schaffen, um Polynukleotide oder Nukleinsäure-Hälften einfach und schnell zu analysieren und die genetische Quelle zu identifizieren.

Gelöst wird die gestellte Aufgabe durch die Gesamtheit der im Vorrichtungsanspruch 1 angegebenen Merkmale bzw. durch die Gesamtheit der im Verfahrensanspruch 12 angegebenen Merkmale.

Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteran sprüchen.

Durch die Erfindung kann auf einfache Weise eine Fluoreszenz analyse von Polynukleotiden oder Nukleinsäure-Fragmenten oder Teilen hiervon durchgeführt werden, die an der Oberfläche des Lichtleiters, d. h. der Glasfaser, festgelegt und mit dieser verbunden sind. Jede doppelsträngige Nukleinsäure in der zu analysierenden Sonde wird denaturiert, beispielsweise durch Erhitzung auf ca. 80°C, um Einzelstränge der Nukleinsäure zu erzeugen. Die Denaturierung kann durch Chelate unterstützt werden, um Stabilisie rungsionen, wie beispielsweise Mg⁺⁺, zu entfernen. Die einzelnen Stränge können in Sequenzen gewünschter Länge durch geeignete Restriktionsenzyme aufgebrochen werden. Gewählte Teile von Einzelsträngen von doppelsträngigen Nukleinsäurecharakteristiken der zu identifizierenden Species, die beispielsweise durch Flüssigkeitschromato graphie oder Elektrophorese getrennt sind, werden auf der optisch weniger dichten Seite einer Trennfläche festge legt, die zwischen Medien mit unterschiedlichem Brechungs index ausgebildet sind (beispielsweise eine ATR-Zelle in Form eines Prismas, eines Stabes oder eines optischen Faserelementes, und eine Flüssigkeitsprobe, die vermut lich die zu analysierende Nukleinsäure enthält). Die Probe wird nunmehr graduell in Berührung mit der Zwi schenfläche in einem solchen Ausmaß abgekühlt, daß ein Teil der Einzelstränge der Nukleinsäure in der Probe komplementär zu den Einzelsträngen-Nukleinsäureteilen stehen, die anfänglich an der Zwischenfläche festgelegt waren. Ein Teil der gebundenen Nukleinsäure wird mit der Proben-Nukleinsäure hybridisiert.

Was auch immer für Polynukleotide mit den gebundenen Tei len auf der Oberfläche der Zelle renaturiert wurden, so können diese nunmehr mit einer Fluorchromfarbe eingefärbt werden, die spezifisch für doppelsträngige Polynukleotide ist (beispielsweise vorzugsweise in zweiteiliger Form, um die Spezifizierung und die Bindungsstabilität zu verbes sern). Statt dessen können für kompetitive Verbindungen voretikettierte komplementäre Einzelstränge von Poly nukleotiden benutzt werden, deren Vorhandensein in der Probe analysiert werden soll. Es können partielle Gegenstücke diskriminiert werden, indem an dieser Stelle ein Enzym beigefügt wird, das die Doppelhelix immer dann abspaltet, wenn Einzelstrangfragmente in der Probe mit den gebundenen Teilen keine Doppelstränge bilden. Dann wird ein Ende der Zelle mit Erregerstrahlung beleuchtet und diese Strahlung wird innerhalb der Zelle innen total reflektiert, so daß eine abklingende Welle an der Ober fläche der ATR-Zelle auftritt. Die Erregerstrahlung ist so gewählt, daß die abklingende Welle das Fluorchrom der eingefärbten Polynukleotide nur in der dünnen Zone er regt, die die Oberfläche der ATR-Zelle umgibt. Wenn die Kettenlänge auf die Zone angepaßt ist, die durch die ab klingende Welle beleuchtet wird, dann stellt die resul tierende Fluoreszenz ein Maß der Doppelstrang-Nukleotide dar, die an der Zellenoberfläche gebunden sind, und dem gemäß ein Naß der Nukleinsäure in der Probe komplementär zu der Nukleinsäure, die vorher auf die ATR-Zelle ge bracht wurde. Fluoreszenzlebensdauermessungen können auch die Quantenwirksamkeit des Fluorchrom ermöglichen und demgemäß kann die Anpassung zwischen den Polynukleotiden, die anfänglich auf der Zwischenfläche vorhanden waren, und jenen gemessen werden, die durch Komplexbildung mit der Probe entstanden sind. Dies schafft die Möglichkeit, zwischen Emissionen von spezifisch gebundenen Farben und atypisch oder wenig spezifisch gebundenen Farben und un gebundenen Farben zu unterscheiden, so daß das Signal- Rausch-Verhältnis verbessert wird.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird im folgenden auf die beigefügte Zeichnung Bezug genommen, in der gleiche Bezugszeichen gleiche Elemente kennzeich nen. Die Zeichnung zeigt in

Fig. 1 einen Längsschnitt eines Analysenaufbaus mit den erfindungsgemäßen Prinzi pien, und

Fig. 2 ist eine Stirnansicht des Ausführungs beispiels nach Fig. 1.

In der folgenden Beschreibung der erfindungsgemäßen Vor richtung wird auf "obere" und "untere" Teile Bezug genom men. Dies ist rein willkürlich und bezieht sich lediglich auf die schematische Darstellung der Zeichnung. Es ist klar, daß die Vorrichtung in jeder Lage und Orientierung im Raum funktionsfähig ist und die Erfindung nicht auf eine bestimmte Lage beschränkt ist. Es ist weiter klar, daß die zeichnerische Darstellung rein schematisch ist und kein Versuch unternommen wurde, um tatsächliche Ab messungen oder Verhältnisse darzustellen.

Die vorliegende Erfindung arbeitet mit totaler innerer Reflexion der Erregerstrahlung längs einer ATR-Zelle und die Erregung bewirkt eine Fluoreszenz, die in die Zelle zurückgeführt wird, und die Erfindung befaßt sich mit der Untersuchung jener Fluoreszenz, wie dies allgemein in der US-PS 45 82 809 beschrieben ist.

In Fig. 1 ist ein Längsschnitt eines Analyseaufbaus 20 dargestellt, der gemäß den Lehren der Erfindung ausgebil det ist. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel um faßt der Analyseaufbau 20 eine ATR-Zelle 22, eine Umhül lung 24 und einen Trägeraufbau 26.

Die Zelle 22 besteht vorzugsweise aus einem langgestreck ten, im wesentlichen zylindrischen optisch transparenten Körper, im typischen Fall in Gestalt eines Stabes oder einer optischen Faser, die sich von der Eintrittsfläche 28 nach dem gegenüberliegenden Ende 30 erstreckt. Die Zelle 22 läßt über ihre Länge über mehrfache innere Totalreflexion optische Strahlungen fort schreiten, die in die Fläche 28 unter einem bestimmten festen Winkel ein treten, der im wesentlichen rotationssymmetrisch um die Längsachse der Zelle verläuft. Wenn die Zelle eine Faser ist, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist (zur Erläuterung wird die Zelle 22 in diesem Zusammenhang als Faser be zeichnet), ist der maximale Akzeptionswinkel gegenüber der Achse der optischen Faser, wie in der Faseroptik be kannt, B für die Strahlung, die in die Faser eintritt und so in der Faser weitergeleitet wird, und dieser Winkel wird durch die Brechungsindices von Faser und umgebendem Medium bestimmt. An der Eintrittsfläche 28 ist die Faser oberfläche im typischen Fall eben ausgebildet und sie liegt normal zur Längsachse der Faser, und die Fläche ist vorzugsweise fein poliert, um Flecken oder Oberflächen fehler auf ein Mindestmaß zu bringen, die sonst die ein fallende Erregerstrahlung streuen würden.

Für eine Strahlung, die anfänglich durch ein Medium mit dem Brechungsindex n₀ fortschreitet und auf eine Faser mit dem Brechungsindex n₁ auftrifft, die durch ein Material mit dem Brechungsindex n₂ umgeben ist, ergibt sich der maximale Akzeptanzwinkel aus der folgenden Glei chung:

Dabei ist NA die sogenannte numerische Apertur der Faser. Beispielsweise, aber nicht beschränkend, kann die Faser 22 aus einer großen Zahl optisch transparent er Materia lien bestehen, beispielsweise aus Glas, aus Quarz, aus Polypropylen, aus Polyolefinen, aus Nylon oder derglei chen, die so gewählt sind, daß die Faser einen Brechungs index erhält, der größer ist als der Brechungsindex der flüssigen Probe, die analysiert werden soll. Diese Probe ist im typischen Fall eine wäßrige Lösung mit einem Bre chungsindex in der Nähe von 1,33. Das Material der Faser 22 wird außerdem so gewählt, daß es relativ unlöslich in der Probenflüssigkeit ist und mit dieser nicht reagiert. Die Größe der Faser 22 kann erforderlichenfalls geändert werden. Es hat sich gezeigt, daß eine Faser oder ein Stab von etwa 1 mm Durchmesser bis zu wenigen hundert Mikro metern Durchmesser und mit einer Länge von 5 mm für die meisten Versuche ausreichend ist. Es ist jedoch klar, daß Länge und Durchmesser nur Beispiele darstellen und nicht beschränkend sind.

Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel, bei welchem die Fluoreszenz an der Faseroberfläche durch Erreger strahlung, die in die Faser hinabgeschickt wird, indu ziert wird, am gleichen proximalen Ende der Faser gesammelt und beobachtet wird, an dem die Strahlung inji ziert wird, ist es erwünscht, die Streustrahlung daran zu hindern, von der Endoberfläche 30 nach der Eintrittsober fläche 28 zurückzukehren. Infolgedessen kann die Fläche 30 so gestaltet sein, daß einfallendes Licht nach außen geleitet wird, aber vorzugsweise ist die Fläche mit einem Material überzogen, das dem Brechungsindex des Mediums angepaßt ist, das die Fläche 30 umgibt, und dieses Mate rial kann sowohl nicht-fluoreszierend als auch absorbie rend für die Erregerstrahlung sein. Im typischen Fall führt ein mit Kohlenstoffschwarz angereichertes Epoxyd kunstharz diese Funktion durch.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel ist beabsichtigt, daß der wirksame Abschnitt der Faseroberfläche durch den akti vierten Bereich definiert wird, bei dem die Analyse durchgeführt wird. Um die Oberfläche des wirksamen Ab schnitts der Faser 22 zu aktivieren, wird letztere im ty pischen Falle so behandelt, daß ein Überzug 32 erzeugt wird, indem zunächst ein aromatisches Amin auf die Fa seroberfläche als Mittel aufgetragen wird, um eine Diazo kopplung mit der Einstrang-Nukleinsäure oder dem Poly nukleotid herzustellen. Das aromatische Amin sollte auf die Oberfläche der Faser über einen Abstandshalter so aufgebracht werden, daß das Amin frei reagieren kann, ohne durch das Glas räumlich daran gehindert zu werden. Eine Anzahl derartiger Abstandskopplungstechniken, die hierbei angewendet werden können, ist bekannt, wie in den folgenden Beispielen erläutert:

Beispiel I

Die Hydroxylanteile auf der Glasoberfläche (diese werden als "G" bezeichnet) können mit Trimethoxysilan gekoppelt werden, das mit einer Kette aus Methylengruppen substitu iert ist, die eine aromatische Amingruppe am Ende besitzen, und zwar im typischen Falle

Dieses Reagenz ist kommerziell verfügbar und wird von der Petrarch Chemical Company geliefert. Das Reagenz wird in Lösung vorzugsweise auf pH 8 gepuffert und reagiert mit den Hydroxylgruppen auf dem Glas (G), um Methanol zu eli minieren und Siloxanbindungen wie folgt zu bilden:

Beispiel II

Statt dessen kann man die Glasoberfläche mit einem Reagenz koppeln, welches aus zwei Epoxydgruppen gebildet ist, die durch eine Methylenkette verbunden sind. Wenn beispiels weise das Reagenzmittel im Überschuß in einer hochalkali schen Lösung (im typischen Falle NaOH) benutzt wird, um zu verhindern, daß zu viele der beiden Enden jedes Re agenzmoleküls mit dem Glas gekoppelt werden, tritt die folgende Reaktion ein, um eine Ätherverknüpfung zu bil den:

Wenn nunmehr die letztere Zwischenstufe mit einem Sulfhydryl oder mit Thiol reagiert, dann wird eine Thioäther kette wie folgt gebildet:

Beispiel III

Eine noch andere Kopplung kann über eine aliphatische Aminkette wie folgt erreicht werden:

G(OH)₃ + (CH₃O)₃-Si-(CH₂)₃-NH₂→GOSi-(CH₂)₃-NH₂ (4)

Zu dem vorstehenden Reaktionsprodukt kann man im Über schuß Doppelisothiocyanat bei pH 8 zusetzen mit einer Zwischenproduktmethylenkette, um eine Thioharnstoffver knüpfung zu bilden:

Indem man im Überschuß doppeltaromatische Amine mit pH 8 zusetzt, wird die Erzeugung der gewünschten aromatischen Substanz vollendet, d. h.

Beispiel IV

Eine vierte Glaskopplungstechnik führt zu einem ungewöhn lich stabilen Produkt, und diese Technik besteht darin, das Glas mit Trimethoxysilan mit einer Chlorbenzylgruppe bei pH 8 zu behandeln:

Das Reaktionsprodukt reagiert bei pH 9 mit einem aromati schen Amin, das eine Nitrogruppe enthält:

Dann wird das Reaktionsprodukt mit einem stark reduzie renden Mittel, beispielsweise mit Natriumdithionit, bei pH 6 behandelt, um die Nitrogruppe zu einem aromatischen Amin wie folgt zu reduzieren:

Die aromatischen Amine, die durch irgendeines der erwähn ten Verfahren erzeugt werden, können benutzt werden, um die gewünschte einsträngige Nukleinsäure zu binden. Als Vorstufe sollte man das an das Glas gebundene aromatische Amin (im folgenden

genannt) mit salpetriger Säure (Salpetersäurelösung) bei 0°C behandeln. Hierdurch wird ein Zwischenprodukt erzeugt, das dann bei pH 8 mit Poly-T reagiert (im folgenden mit (TTT) bezeichnet, eine bekannte synthetische DNA, deren einzige Basis Thymidin ist). All dies kann wie folgt beschrieben werden:

Es ist bekannt, daß Zellen Stränge von Nukleinsäuren zu erzeugen suchen, die in gegenseitigem Abstand über kurze Stränge von Polyadenin angeordnet sind. Wenn das letztere Produkt nunmehr mit den Adeninteilen reagiert, die im ty pischen Fall am Anfang eines interessierenden einsträngi gen Nukleinsäuremoleküls (im folgenden AAA-NUC) vorhanden ist, so wird das Nukleinsäureteil erzeugt, das an der Fa seroberfläche gebunden ist. Insoweit als Adenin ein Kon jugat von Thymidin ist, wird letzteres doppelsträngig in Gegenwart von Mg⁺ bei pH 7 und Raumtemperatur, um eine Bindung zu erzeugen.

Die doppelsträngige Bindung kann nun durch Behandlung des Adenin-Thymidin-Konjugats mit Psoralen (6-Hydroxy-5-ben zofuranacrylsäure δ-lacton) oder einem anderen Kreuzverbindungsmittel dauerhaft gemacht werden. Psoralen ist zu bevorzugen, da es relativ schwer flüchtig und leicht durch Ultraviolettstrahlung zu aktivieren ist. Ob gleich die Reaktion bekannt ist, wird angenommen, daß die Benutzung neu ist, dadurch die Hybridisation irreversi bel zu machen. Für eine ordnungsgemäße Hybridisation sollte das gebundene DNA-Segment wenigstens 10 Basen lang sein, obgleich eine größere Zahl für eine vernünftige Spezifizierung notwendig sein kann. Es zeigt sich, daß durch diese Technik jener Teil der DNA gebunden wird, der zur Erkennung nicht benutzt wird, d. h. die Polyadenin kette am Anfang. Der Zweck dieser Behandlung besteht darin, Probleme zu vermeiden, die sich aus einer mögli chen Bindung der Diazokette mit einem Teil der Erkennungssequenz der gebundenen einsträngigen Nuklein säure ergeben. Mit anderen Worten ausgedrückt, erlaubt die Reaktion mit Psoralen eine Befestigung an einem Ende der Nukleinsäuresequenz, ohne den Erkennungssitz zu ver stopfen. Wegen der Verstärkung, die durch die Psoralen-Be handlung bewirkt wird, würde eine Denaturierung die Säure aufbrechen. Wenn die erwähnte Problemtype voraus sichtlich jedoch nicht auftritt, kann man diese Extra stufe weglassen.

Die Konzentrationen der zur Erzeugung des Überzugs 32 be nutzten Chemikalien hängen empirisch von der jeweiligen Art der Überzugsverkettung ab, die erzeugt werden soll, und von der Natur der Nukleinsäureteilchen, die man haben möchte, um den Überzug zu binden. Es ist jedoch zu beach ten, daß die reaktiven Stellen (d. h. jene Stellen auf der Faser, an denen der Überzug die gebundene einsträngi ge Nukleinsäure enthält, die man zu komplementären Nukleinsäurefragmenten zu hybridisieren beabsichtigt) durchschnittlich im Abstand um ein Mehrfaches (beispiels weise ein Dreifaches oder ein Mehrfaches) des durch schnittlichen 10-Å-Durchmessers eines typischen DNA-Doppel stranges beabstandet sein sollte. Wenn die Konzen tration der Stellen weniger dicht ist, wird die abschlie ßende Hybridisierungsreaktion mit dem Überzug räumlich oder sterisch behindert, und demgemäß kann die Reaktion zu langsam für manche Zwecke fortschreiten.

Das beschriebene Bindeverfahren besitzt eine Reihe von erwünschten Charakteristiken. Es wird eine feste Verbin dung mit Glas erreicht. Diese Bindung ist irreversibel, selbst unter Denaturierungsbedingungen, und sie ist lichtstabil. Die Anordnung eines Abstandshalters zwischen der ATR-Oberfläche und der Molekularkette schafft eine leichte Zugänglichkeit (für vernünftige Diffusionskine tik) und genügend Raum für die Kettenbiegsamkeit, was ein Teil des Hybridisierungsprozesses ist. Die Poly-A-Poly-T-Ver bindung gewährleistet, daß die Kette an einer einzigen Stelle gebunden wird, wodurch die Kettenflexibilität er halten bleibt, die für eine vernünftige Hybridisierungs kinetik benötigt wird. Diese Verbindung gewährleistet auch, daß die Erkennungsstelle von dem Ort der Verbindung ausgeschlossen ist.

Die Umhüllung 24 ist ein hohles langgestrecktes Rohr, welches vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, optisch transparent ist und aus einem Material besteht, welches relativ unlöslich ist und chemisch nicht mit der zu ana lysierenden Flüssigkeit reagiert. Im typischen Falle wird die Umhüllung 24 einfach von einem Glasrohr gebildet, dessen Innendurchmesser größer ist als der maximale Außendurchmesser der Faser 22, wobei die Dimensionierung vorzugsweise so getroffen ist, daß ein vorbestimmtes Vo lumen gebildet wird, das wenigstens den aktivierten Über zug 32 auf der Faser 22 umschließt. Gemäß einem bevorzug ten Ausführungsbeispiel kann der Zwischenraum zwischen der überzogenen Oberfläche der Faser 22 und der Innenwand des Rohres 24 Kapillarabmessungen aufweisen.

Es sind Haltemittel 26 vorgesehen, um die Faser 22 und die Umhüllung 24 in einer festen Beziehung zu haltern, wobei insbesondere die Umhüllung von der Faser derart im Abstand liegt, daß das vorbestimmte begrenzte Volumen der Probe den aktivierten Bereich der Faseroberfläche umschließen kann und das Eingangsende der Faser präzise so ausgerichtet ist, daß ein optimaler Lichteinfall in die Faser gewährleistet ist. Infolgedessen kann die Faser durch die Lager benachbart zu jeder Stirnfläche 28 bzw. 30 abgestützt werden. Eine Berührung zwischen der Faser und dem Lager in der Wähe der Fläche 28 führt jedoch zu einer Verminderung der numerischen Apertur, weil der Brechungsindex des Lagermaterials gewöhnlich größer als n₁ ist. Um dieses Problem zu lösen, kann im typischen Fall die Faser wenigstens in der Nähe des Faserendes, in das die Strahlung eingeführt wird, mit einem Überzug vor zugsweise aus einem transparenten Polymerisationsprodukt mit hohem Molekulargewicht überzogen werden, um ein Zwi schenmedium zwischen Lager und Faser mit niedrigem Bre chungsindex anzuordnen. Um Probleme zu vermeiden, die sich als Folge der Lagerung am proximalen Ende der Faser ergeben, ist das Lager in Fig. 1 einfach als Wiege 36 ausgebildet, von dem ein Teil 38 mit der Umhüllung 24 verbunden ist und ein anderer Teil 40 ein Endstück 42 trägt, in dem das distale Ende 30 der Faser 22 fest ein gespannt ist. Das Material, aus dem das Endstück 42 ge formt ist, ist vom optischen Standpunkt nicht wichtig, jedoch sollte es chemisch mit der zu analysierenden flüs sigen Probe nicht reagieren. Bei dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 1 sind Umhüllung 24 und Faser 22 so darge stellt, daß die Längsachsen der Umhüllung und der Faser im wesentlichen horizontal verlaufen, wobei die Faser 22 auslegerartig innerhalb der Umhüllung 24 verläuft und das Ende 28 nach außen vorsteht. Die Faser 22 wird im Abstand zur Innenoberfläche der Umhüllung 24 gehalten. Bei diesem speziellen Ausführungsbeispiel ist die Umhüllung 24 an beiden Enden offen, so daß Flüssigkeit von beiden Enden eingeführt und abgezogen werden kann.

Wenn eine Analyse mit dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 1 vorgenommen wird, dann wird der Überzug 32 der Faser 22 von irgendwelchen einsträngigen Nukleinsäureteilchen ge bildet. Letztere werden wie oben beschrieben gebunden, um Befestigungsstellen für die Probennukleinsäureteilchen mit der Faser zu bilden, und die Teilchen werden dann durch Einfärbung gemessen.

Die Probe wird zunächst durch bekannte Techniken behan delt, um die potentielle Nukleinsäure (falls erforder lich) zu konzentrieren, und dann werden die viralen Capside oder die biologischen zellaren Strukturen bei spielsweise durch einen osmotischen Stoß, durch Waschmit tel oder andere Zerfallsmittel aufgebrochen, um die Nukleinsäuren freizugeben. Die Probe wird dann einer Be handlung unterworfen, die alle doppelsträngigen Nuklein säuren denaturiert, die freigegeben werden, und es werden die Nukleinsäureketten in Fragmente aufgebrochen. Bei spielsweise kann doppelsträngige DNA einfach durch Be handlung mit mäßiger Hitze (75°C) und EDTA denaturiert werden. Durch die Verwendung von EDTA werden außerdem die Mg⁺⁺-Ionen entfernt, wenn letztere entweder in der Probe oder während der Polyadenin/Thymidin-Verbindungsstufe vorhanden sind. Die Entfernung dieser Ionen ist sehr er wünscht, um zu verhindern, daß die Metallionen die ein strängige Nukleinsäure renaturieren. Natürlich kann man bekannte Enzymaufspalttechniken für DNA benutzen, um die Nukleinsäure zu fragmentieren. Die Reihenfolge, mit der die Fragmentierung und die Denaturierung erfolgen, ist für die Erfindung nicht wichtig.

Dann wird die Probe in den Zwischenraum 44 zwischen der Umhüllung 24 und der Faser 22 eingespritzt, und dies ge schieht beispielsweise mit einer Injektionsnadel, wobei die Probe in dem Zwischenraum 44 durch den Meniskus ge halten wird, der sich an den beiden gegenüberliegenden Enden der Umhüllung 24 bildet. Die Probe wird im Zwi schenraum 44 während einer Inkubationszeit belassen, da mit das zu analysierende Material in der flüssigen Probe diffundieren kann und damit die Nukleinsäureteilchen im Überzug 32 renaturiert oder komplementiert werden kön nen. Die Reversibilität der Nukleinsäure-Konjugations reaktionen schafft eine durch Avidität gesteuerte Grenze für die Empfindlichkeit des Systems, insbesondere wenn das System ausgewaschen ist, um nur absorbierte, aber un konjugierte Nukleinsäure zu entfernen. Diese Differenz in der Avidität zwischen Absorption und Konjugation kann er höht werden, wenn vor dem Auswaschen Verbindungen der Psoralenfamilie der Probe zugesetzt werden. Solche Ver bindungen binden die doppelsträngigen Nukleinsäureberei che und nach Belichtung durch Licht dienen sie dazu, die Kreuzverbindungsirreversibilität dieser doppelsträngigen Bereiche aufrechtzuerhalten.

Die doppelsträngige renaturierte Nukleinsäure wird ge färbt, indem vorzugsweise die Probelösung direkt mit einem Fluorchromfarbstoff versehen wird, der eine sehr starke Avidität zu der doppelsträngigen Nukleinsäure be sitzt. Die bevorzugten Farbstoffe haben mehr als eine un abhängige Nukleinsäurebindungsstelle, um die Avidität zu erhöhen und so die freie Farbkonzentration und den Hin tergrund zu vermindern. Typische Farbstoffe, die in Ver bindung mit der Erfindung anwendbar sind, sind Äthidiumbromidacridinorange (C. I. Nr. 46005), Quinacrin, Diäthidiumbromid, Diacridinorange, die verschiedenen Heterodimere und dergleichen. Äthidiumbromid hat einen optimalen Erregerwellenlängenbereich von 480 bis 550 µm und einen optimalen Fluoreszenzwellenlängenbereich von 580 bis 650 µm. Die Strukturformel von Äthidiumbromid wird wie folgt angenommen:

Statt dessen kann, um die Gefahr einer Instabilität des Reagenz zu reduzieren, der Farbstoff anfänglich in einer Form vorgesehen werden, die nur sehr schwach an der Faser anhaftet, so daß er in Wasser in Millisekunden aufgelöst ist. Der gewählte Farbstoff ist vorzugsweise ein solcher, dessen Fluoreszenzsignal in hohem Maße durch die Bindung und demgemäß durch das Ausmaß beeinflußt wird, mit dem beide Nukleinsäureketten hybridisiert sind. Derartige Farbstoffe sind gewöhnlich als Fluorchromfarbstoffe be kannt. Für Fluorchromfarbstoffe, beispielsweise Äthidium bromid und Acridinorange oder ihre Dimere, kann die Kon zentration, die für die Probe im Zwischenraum 44 erfor derlich ist, niedrig sein, d. h. zwischen etwa 10^-10 und 10^-14 M.

Die Oberfläche der in den Zwischenraum 44 eingespritzten Lösung enthält vermutlich etwa sechs Größenordnungen mehr von einsträngiger Nukleinsäure als im Rest der Lösung vorhanden ist. Daher ist hier eine höhere Nukleinsäure rekombinationsrate an der Berührungsfläche der Lösung mit der Faser, und der Farbstoff bindet sich vorzugsweise an den Doppelsträngen, die an der Faser ausgebildet sind, und diese Stränge sind die einzigen, die beleuchtet wer den. Vor der Reaktion zwischen der zu prüfenden Nuklein säure und dem Reagenz auf der Faser kann der Farbstoff frei schwimmen und der Farbstoff stellt daher ein Etikett bzw. Nachweismittel nur für die konjugierte Form dar. Weil der Farbstoff Fluorchrom ist, ist er weniger wirksam ungebunden als gebunden. Die Benutzung der dimeren Form des Farbstoffs führt zu einer stärkeren Bindung, die die Avidität des Farbstoffs für die doppelsträngige Nuklein säure potenziert. So kann man mit dimeren Farbstoffen eine Erhöhung der Selektivität für doppelsträngige DNA erhalten und geringere Störeffekte, weil weniger freier Farbstoff in der Losung erforderlich ist, wodurch sich ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis ergibt.

Die Vorrichtung ist mit einem Fluorimeter 43 derart ge koppelt, daß die Eintrittsfläche 28 mit Strahlung be leuchtet wird, die im typischen Fall in der Lage ist, eine Fluoreszenz im Überzug 32 durch eine abklingende Welle zu erzeugen, die die Aussendung der Strahlung längs der Faser begleitet. Die induzierte Fluoreszenz in dem etikettierten Komplex im Überzug 32 wird dann in die Fa ser von dem erregten Material zurückgeleitet und tritt dann über die Fläche 28 aus, um vom Fluorimeter 43 abge lesen zu werden. Die Intensität der Fluoreszenz ist pro portional zu der Menge der vorhandenen doppelsträngigen Nukleinsäure und demgemäß eine Funktion der relativen Menge von Anpaß-Nukleinsäure in der ursprunglichen Probe.

In den erwähnten Daten kann sich ein Fehler ergeben, der durch die Veränderung der Quantenwirksamkeit im Farbstoff verursacht wird, und hierdurch kann das Ausmaß der Per fektion der Hybridisierungsanpassung beeinträchtigt wer den. Eine Möglichkeit, einen solchen Fehler zu korrigie ren, besteht darin, eine zusätzliche Messung der Fluor eszenzlebensdauer vorzunehmen, die proportional zu der Quantenwirksamkeit ist. Das Verhältnis von Signalintensi tät zu Lebensdauer ist unabhängig von der Quantenwirksam keit und demgemäß frei von diesem Fehler. Die tatsächli chen Lebensdauerwerte können daher als Maß für die Korre lation der Nukleinsäurestränge miteinander dienen.

Die natürliche Fluoreszenzlebensdauer kann als jene Zeit definiert werden, die die Fluoreszenz benötigt, um nach Aufhören der Erregung von einem Wert I auf einen Wert I/e abzufallen, wobei "e" die Naperbasis ist. Unter Benutzung bekannter Techniken und Vorrichtungen kann die Fluoreszenz lebensdauer dadurch bestimmt werden, daß zunächst das Material mit einer schnell modulierten Erregerstrah lung für die benutzte Fluorchromfarbe beleuchtet wird, beispielsweise eine Strahlung mit einer Fluktuierungs amplitude, die von einem Laser oder einer Unter-Pegel-LED ausgeht, wobei dann die Modulationsamplitude der erzeug ten Fluoreszenz gemessen wird.

Ein anderes Analyseverfahren, welches mit der erfindungs gemäßen Vorrichtung durchgeführt werden kann, besteht darin, eine Kompetitionsbindungsanalyse durchzuführen.

Bei letzterer wird eine bekannte Menge von einsträngigen zu identifizierenden Polynukleotiden in bekannter Weise markiert, vorzugsweise mit irgendeinem Farbstoff aus einer großen Zahl bekannter fluoreszierender Farbstoffe. Dann wird eine erste Messung der Gesamtfluoreszenzstrah lung von einer solchen markierten Menge von einem ge eigneten Fluorimeter zum Zwecke der Eichung gemessen. Dann wird eine bekannte Menge von markierten Poly nukleotiden der Probenlösung zugesetzt. Die Mischung von markierten und nicht-markierten Polynukleotiden wird dann in Berührung mit einer ATR-Zelle gebracht, so daß die Hybridisierungsstellen sich bilden können. Die Zelle wird präpariert und wie oben beschrieben beleuch tet. Dann wird eine Messung der Fluoreszenzintensität von der Zelle vorgenommen. Das Verhältnis der letzteren Fluoreszenzintensität zur Intensität, die während der Eichung gemessen wurde, ist dann proportional zur Menge des in der Probe vorhandenen nicht-markierten Poly nukleotids.

Claims

1. Vorrichtung zur Analyse eines Polynukleotids in einsträngiger Form in einer flüssigen Probe, welche in Kombi nation folgende Merkmale aufweist:

- die die Probe enthaltende Meßzelle (20) umfaßt eine Umhüllung (24) und eine optische Faser (22);
- die optische Faser (22) weist ein einsträngiges Poly nukleotid an der Oberfläche auf, das teilweise komple mentär mit dem zu analysierenden einsträngigen Poly nukleotid ist;
- die in der Meßzelle (20) befindliche flüssige Probe ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt, der stärker an ein doppelsträngiges Polynukleotid bindet als an ein einsträngiges Polynukleotid;
- Mittel sind vorgesehen, um in die optische Faser eine Erregerstrahlung einzustrahlen und die resultierende Fluoreszenzstrahlung zu messen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Faser mit einem Über zug versehen ist, der eine aromatische Verbindung aufweist, die mit dem einsträngigen Polynukleotid gekoppelt ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Verbindung an das einsträngige Polynukleotid über eine Diazo-Verbindung gekoppelt ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff so schwach an die Oberfläche der optischen Faser angekoppelt ist, daß er sofort in Wasser aufgelöst wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Verbindung mit der Oberfläche über ein Abstandshaltermolekül gekoppelt ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül aus Trimethoxysilan besteht, substituiert mit einer Kette aus Methylengruppen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül aus zwei Epoxydgruppen besteht, die durch eine Methylenkette verbunden sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül ein aliphatisches Amin ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül aus Trimethoxysilan mit Chlorbenzylgruppen besteht.

10. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Diazo-Verbindung aus Poly thymidin, konjugiert mit den Polyadenin-Teilchen besteht, die zu Beginn im einsträngigen Polynukleotid vorhanden sind.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die konjugierten Polythymidine und Polyadenine überkreuz verbunden sind.

12. Verfahren zur Analyse eines Polynukleotids in ein strängiger Form in einer flüssigen Probe, bei dem

- ein einsträngiges Polynukleotid an die Oberfläche einer optischen Faser aufgebracht wird, das teilweise komplemen tär mit dem zu analysierenden einsträngigen Polynukleotid ist,
- die flüssige Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt wird, der stärker an ein doppelsträngiges Polynukleotid bindet, als an ein einsträngiges Polynukleotid,
- die Oberfläche der optischen Faser mit der flüssigen Probe in Kontakt gebracht wird, so daß das zu analysieren de einsträngige Polynukleotid mit dem an der Oberfläche der optischen Faser anhaftenden einsträngigen Polynukleotid hybridisiert,
- in die optische Faser eine Erregerstrahlung eingestrahlt wird, und die resultierende Fluoreszenzstrahlung gemessen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche ein aromati sches Amin angehaftet wird, und daß dann die Diazo-Kopplung des aromatischen Amins an dem gewählten einsträngigen Poly nukleotid bewirkt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das aromatische Amin an der Ober fläche über ein Abstandshaltermolekül angeheftet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül von einem Trimethoxysilan gebildet ist, substituiert mit einer Kette aus Methylengruppen.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül aus einem Paar von Epoxydgruppen gebildet ist, die durch eine Methylenkette verbunden sind.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül ein aliphatisches Amin ist.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandshaltermolekül aus Trimethoxysilan mit einer Chlorbenzylgruppe besteht.

19. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Diazokopplung dadurch herge stellt wird, daß erst das Amin in eine Diazogruppe umgewandelt wird, daß dann die Diazogruppe mit dem Polythymidin gekoppelt und das Polythymidin mit Polyadeninteilchen konjugiert wird, die zu Beginn des gewählten einsträngigen Polynukleotids vor handen sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Amin durch Behandlung mit einem Diazonhalogen in eine Diazogruppe umgewandelt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyadenin mit dem Polythymidin überkreuz verbunden wird.

22. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Messung die Intensität der fluoreszierenden Strahlung festgestellt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz-Zerfallzeit der fluoreszierenden Strahlung gemessen wird.

24. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff ein Dimericfarbstoff ist.

25. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff Di ethidiumbromid ist.

26. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff Di acridinorange ist.