JPS62266464A - 核酸分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生化学分析に関し、更に詳しくは、検出可能な
光を放出し得る標識が、核酸の同定、並びに選択された
核酸及び断片の濃度及び相互関係の測定のために用いら
れる分析に関する。

米国特許第４，１３３，６３９号；第４．０５０．８９
５号；第４．３２１，０５７号；第４，３９９，０９９
号；第４，４４７，５４６号明細書その他に記載された
化学的及び生化学的分析のための公知技術には、縮型全
反射（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｔｏｔａｌ　ｒｅｆｌｅｃ
ｔｉｏｎ、ＡＴＲ）分光原理を利用した光学系がある。

ＡＴＲセルとして、かかる光学系では光学波ガイド、典
型的にはプレート、ロッド又は光学繊維を用いる。セル
の一端が励起光で照射された場合、その光はセル表面で
減衰波を発生するように内部で全反射される。励起光は
、減衰波がセル表面を囲んでいる狭い領域（典型的には
数百〜千人単位の厚さ）のみに存在する被験物質中で螢
光を励起するように選択される。発生した螢光は、螢光
物質が分析され得る情報を提供することができる。この
ような系は、例えば抗原物質、化学物質その他を分析す
るために今まで使用されてきた。

タンパク質アミノ酸配列の合成に関する遺伝情報はデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリポ核酸（ＲＮＡ）により
得られ、両方ともに通常二重らせん構造の非常に長い複
合分子であることも周知である。ＤＮＡ又はＲＮＡは各
種類に独特の形で全生物中に遍在するため、核酸又はそ
の独特な断片（以後、すべて一括してポリヌクレオチド
と称される）の性質は、特定種の存在を分析するために
利用することができる。例えば、すべてのウィルス遺伝
子はＲＮＡ又はＤＮＡを存する。このようなウィルス核
酸は、タンパク質の外被又は殻から節単に単離し、高度
に精製された形で直ちに利用することができる。ウィル
ス核酸の多くは直鎮状二重鎖（天然痘及びＳＶ４０のよ
うなウィルス類ではＤＮＡ、レオウィルスのようなウィ
ルス類ではＲＮＡ）である。−重鎮核酸は、相補的−重
鎮が用いられるならば、必ず二重鎖となる。核酸の二重
鎖は、核酸を変性条件（例えば、高もしくは低ｐＨ、高
温、水素結合を切断するＥＤＴＡ及びグアニジンのよう
な試薬、等）に付して分離することができる。変性は、
通常核酸を一重鎖に分離するだけではなく、同定可能な
形で互いに分離することが著しく困難で大きな予測し得
ない断片群に鎖を切断させることもできる。しばしば制
限酵素は特定部位で核酸を切断するために使用され、最
終的同定のために電気泳動その他の時間のかかる方法に
より苦労して分離される様々な断片を生じる。

本発明の主な目的は、ポリヌクレオチド又は核酸部分を
分析するための装置及び方法を提供することであって、
その装置及び方法は上記部分の遺伝子源の確実迅速な同
定を可能ならしめる。本発明のもう１つの重要な目的は
、最初に断片を均一群に分離しなくとも、核酸断片含有
試料に対し直接利用し得る装置及び方法を提供すること
である。

本発明の更に他の目的は、核酸の検出及び同定の課題、
光学繊維を用いる螢光分析の感度及び簡便性に適合する
ことである。

これら及び他の目的は、細長い組型全反射（ＡＴＲ）セ
ルの表面に固定又は結合されたポリヌクレオチド又は核
酸断片もしくは部分の螢光分析用として、本発明の装置
及び方法であれば適合する。

被験試料中の二重鎖核酸は、例えば約８０℃に加熱して
変性され、核酸の一重鎖を生成する。変性は、Ｍｇ”の
ような安定イオンを除去するため、キレート剤を加えて
補助し得る。−重鎮は公知の適切な制限酵素によって所
望の長さの配列に切断してもよい。例えば液体クロマト
グラフィー又は電気泳動により分離された、被験種に特
有の二重鎖核酸の選択された一重鎖部分は、異なる屈折
率媒体（例えば、プリズム、ロッド又は繊維光学要素の
形のＡＴＲセル、及び被験核酸含有液体試料）間で形成
される界面の光学的低密度側に固定される。試料は次い
で界面に接触して徐々に冷却されるが、試料中の一重鎖
核酸の一部が界面に最初から結合された一重鎖核酸部分
と相補的であって、結合核酸の一部が試料核酸とハイブ
リッド形成するまで冷却される。

いかなるポリヌクレオチドがセル表面上の結合部分で再
生したとしても、二重鎖ポリヌクレオチドに特異的な螢
光色素（例えば、特異性及び結合安定性を増加させるた
めには、二量体型が好ましい）で染色することができる
。又は、競合的結合用として、ポリヌクレオチドの予め
標識された相補的−重鎮を使用してもよく、この場合に
はその存在が試料中で分析されることになる。不完全対
は、試料中の一重鎖断片が結合部分と二重鎖を形成しな
いところではどこでも二重らせんを切断する酵素をこの
時点で加えることにより、抑制することができる。セル
の一端は、次いで、ＡＴＲセル表面で減衰波を発生する
ように、内部で全反射される励起光で照射される。励起
光は、減衰波がＡＴＲセル表面を囲む狭い領域のみで染
色ポリヌクレオチド上の螢光色素を励起するように選択
される。鎖長が減衰波で照射される帯域内に属する場合
には、得られる螢光はセル表面に結合した二重鎖ポリヌ
クレオチドの測定に結かり、ひいてはＡＴＲセル上に事
前に固定された核酸に相補的な試料中核酸の測定に結が
る。螢光寿命測定は、螢光色素の量的効率、ひいては界
面に最初から結合したポリヌクレオチド及びそれと複合
化する試料中のポリヌクレオチド間での対合の度合いを
測定可能ならしめ得る。これは、特異的結合色素、非典
型的もしくはより非特異的な結合色素及び非結合色素か
らの放射光を識別し、このためシグナル／パックグラン
ド比を改善することを可能にする。

本発明の他の目的は、以下において部分的に明らかにな
り、部分的に記載されるようになる。本発明はしたがっ
て、下記の詳細な説明及びすべてが特許請求の範囲に示
されている出願の範囲において例示された他の各々のも
のに関する、要素の構成、組合せ及び部品の配列を有す
る装置、並びにいくつかの工程、１以上のかかる工程の
関係及び順序を伴う方法からなる。

本発明の性質及び目的を更に十分に理解するためには、
添付図面に関連した下記の詳細な説明が参照されるべき
であるが、ここで図面における同一番号は同一要素に関
する。

本発明の装置の詳細な説明において、装置の“上部”及
び“下部”という部分の説明は、全体的に便宜上のもの
であって、図面における概略的表示に記載を関連づける
ためであることに留意すべきである。装置はいかなる場
所又は向きでも機能することができ、しかもそのように
することは本発明の範囲に属することが認識されるであ
ろう。

更に、図中の表示は概略的であって、実際の尺度又は比
率で表示しようとなされたものではないことも理解され
るであろう。

本発明は、ＡＴＲセルに沿い内部で全反射される励起光
（該励起光はセル内を逆行する螢光を励起する）、及び
その螢光の検出により機能するが、これらすべては１９
８２年８月９日に出願され本出願の譲受人に譲渡された
同時係属出願第４０６．３２４号明細書に総括して記載
されており、本発明の光学的操作方法の詳細について更
にこれを参照することができる。

第１図では、本発明の原理に基づき製造された分析キッ
ト２０を縦断面図で示している。好ましい態様では、キ
ット２０はＡ　Ｔ　Ｒ’セル２２、密閉容器２４及び取
付手段２６からなる。

セル２２は、近位端もしくは入射面２８から遠位もしく
は柊末端３０まで伸びるロッド又は光学繊維の形が典型
的である、細長で実質的に円柱状の光学的透明体が好ま
しい。セル２２は、セルの縦軸のまわりに実質上回転対
称な一定の固定角の範囲内で面２８に入る光学的放射光
を、多数の全内部反射を介してその長さ方向に伝達する
のに適合している。セルが繊維光学素子分野で周知のも
のと同し第１図に示された繊維（説明上、セル２２がこ
の関係から以後述べられる）である場合には、繊維に入
射してその中を伝達する光の繊維軸Ｂに対する最大許容
角は、繊維及び周囲の媒体の屈折率により決定される。

面２８において、繊維表面は典型的には平面で、繊維の
長軸方向に正しく向けられ、入射励起光を散乱しがちな
きす又は表面欠陥を最小化するために高度に研摩されて
いることが好ましい。

最初に屈折率ｎ０の媒体中を伝達し、屈折率ｎ２の物質
で囲まれた屈折率ｎ、の繊維に入射する光の場合、最大
許容角は下記式で示される：（１１ＮＡ＝ｎｏ　５ｉｎ
Ｂ　＝　（ｎ＋１−ｎｚ”）”２上記式において、ＮＡ
は所謂繊維の開口数である。例えば、限定的ではないが
、繊維２２は、ガラス、石英、ポリプロピレン、ポリオ
レフィン、ナイロンその他のような多数の透光性物質の
うちいずれであってもよく、被験液体試料よりも大きな
屈折率を有するように選択される。後者は典型的には屈
折率約１．３３の水溶液である。更に、繊維２２の物質
は試料液体に比較的不溶性でかつ非反応性であるように
も選択されることが好ましい。

繊維２２のサイズは所望に変更し得るものの、約１龍〜
数百μ径で長さが長くとも５龍の繊維又はロッドが大半
の分析に適切であることが判明したが、しかしながらこ
のような長さ及び直径は単に例示的であって、限定的で
はないと理解されるべきである。

繊維に放射された励起光により繊維表面で発生した螢光
威励起光が入射した繊維の同一近位端において集合し又
は観察されるような好ましい態様では、迷光が繊維の面
３０から面２８に逆行することを防止することが望まれ
る。そのため、面３０は内部からそこに入射する光を漏
出するように形成されるが、好ましくは面３０を囲む媒
体の屈折率に匹敵する物質、例えば励起光に対し非螢光
性でかつ吸光性の物質で被覆される。典型的には、カー
ボンブラックで担持されたエポキシ樹脂はこのような機
能を果たす。

典型的態様において、繊維表面の機能部分は、分析が実
施される活性領域により定まる。繊維２２の機能部分の
表面を活性化するために、繊維は典型的には、−重鎖核
酸又はポリヌクレオチドをジアゾカップリングするため
の薬剤として、まず繊維表面に芳香族アミンを結合する
ことにより処理され、コーティング３２を付与する。芳
香族アミンは、アミンがガラスによる立体障害をうけず
に反応し得るように、スペーサーを介して繊維表面にカ
ップリングさせた方がよい。利用可能ないくつかのかか
るスペーサーカップリング技術は、下記実施例で示され
るように周知である。

実施例１ ガラス表面（以後、“Ｇ”で示される）上のヒドロキシ
ル部分は、端部に芳香族アミノ基を有するメチレン基鎖
で置換されたトリメトキシシラン、典型的には でカップリングすることができる。この試薬はペトラー
チ・ケミカル社（Ｐｅｔｒａｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏｍｐａｎｙ）から市販されている。試薬は、好ま
しくはｐＨ８に緩衝された溶液の場合に、以下のように
、ガラス（Ｇ）上のヒドロキシル基と反応してメタノー
ルを離脱し、シロキチン結合を形成する：実施例２ 又は、ガラス表面を、メチレン鎖で連結された２個のエ
ポキシ基から形成される試薬とカップリングさせてもよ
い。例えば、過剰の試薬を高アルカリ溶液（典型的には
Ｎａ０Ｈ）中で使用して、各試薬分子の非常に多くの両
端をガラスとのカップリングから防止した場合には、下
記反応が生じてエーテル結合を形成する： 後者の中間体をスルフヒドリル又はチオールと反応させ
た場合には、下記のようにチオエーテルを生じる： ＋３）　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓ　）Ｉ
ＮＨ。

実施例３ 更に他のカップリングは、下記のように脂肪族アミン結
合を介して達成することができる：Ｇ　（Ｏｌｌ）　ｚ
　＋　（ＣＨ：ＩＱ）　：＋−３ｉ−（Ｃ１ｌ□）３〜
ＮＨ２→ＧＯＳｉ−（Ｃ）＋２）　ｚ−ＮＨｚ上記反応
生成物に、中間メチレン鎖をもつ過剰のジイソチオシア
ナートをｐＨ８で加え、チオ尿素結合を形成する： ＋５）　　　　ＧＯ３Ｓｉ−（ＣＩｌ□）ｚ−Ｎｉｌ□
＋ＮＣ３−（ＣＩＩＺ）　ｂ−ＮＣＳＧ（ｈＳｉ−（Ｃ
１ｈ）　：＋−Ｎ）ｌ−Ｃ−ＮＨ−（Ｃ１ｌｚ）　ｂ−
ＮＣ５Ｉ 過剰の芳香族ジアミンをｐＨ８で加えて、所望の芳香族
の形成させる、即ち （６１Ｇ（ｈＳｊ−（ＣＩ（２）　３−Ｎ１１−Ｃ−Ｎ
ｌ（−（Ｃ１ｌｚ）　６−ＮＣ５＋実施例４ 通常安定な生成物を生成する第４のガラスカップリング
法は、クロロベンジル基をもつトリメトキシシランでｐ
１１８にてガラスを処理することである： 反応生成物をｐＨ９でニトロ基をもつ芳香族アミンと反
応させる： 次いで、反応生成物をｐＨ６で亜ジチオン酸ナトリウム
のような強還元剤で処理し、下記のようにニトロ基を芳
香族アミンに還元する： 前記方法のいずれかで製造された芳香族アミンは、所望
の一重鎖核酸を結合させるために使用することができる
。予備段階として、ガラスに結合した芳香族アミン（以
後、ＧＡ◇ＮＨ２）を約０℃で亜硝酸（亜硝酸塩溶液）
で処理する。これにより中間体を生成し、次いでｐＨ８
でポリ−Ｔ（以後、＜ＴＴＴ）　、公知の合成りＮＡ、
その唯一の塩基はチミジンである）と反応させるが、す
べては以下のように記載される： セルは短鎖ポリアデニンと間隔があいた核酸鎖を生成し
易いことが知られている。そこで、後者の生成物は、繊
維表面に結合した核酸部分を形成する目的の一重鎖核酸
分子（以後、ＡＡＡ−ＮＵＣ）の開始部に典型的に存在
するアデニン部分と反応させる。アデニンはチミジンの
接合体であるため、後者はＭｇ”の存在下ｐＨ７室温で
二重鎖化し、結合を形成する。

二重鎖結合は、次いで、アデニン−チミジン複合体をソ
ラレン（６−ヒドロキシ−５−ベンゾフラノアクリル吹
δ−ラクトン）又は他の架橋剤で処理して強化すること
ができる。ソラレンは、比較的不溶性であって、紫外線
で容易に活性化されることから、好ましい。反応は周知
であるが、不可逆的にハイブリッド形成させるためのそ
の使用は新規であると考えられる。適切なハイブリッド
形成のためには、結合Ｄ　Ｎ　Ａ断片は少なくとも１０
塩基の長さであるべきであるが、妥当な特異性のために
は更に大きな数が必要である。この技術では、識別に利
用されないそのＤＮＡ部分、即ち開始部のポリアデニン
鎖を結合することが判明するであろう。そのようにする
目的は、ジアゾ結合が結合−重鎖核酸の認識配列部分に
結合し得るという問題を回避するためである。換言すれ
ば、ソラレンとの反応は、認識部位をふさがずに核酸配
列の一端に結合させるためである。ソラレン処理による
強化がなければ、変性が酸を切断してしまうであろう。

もちろん、上記タイプの問題が生じると考えられない場
合には、この余分の工程を除去してもよい。

コーティング３２を形成するために使用される化学物質
の濃度は、経験的に、形成されるコーティング結合の具
体的タイプ、及びコーティング中での結合が望まれる核
酸部分の性質に依存する。

しかしながら、反応部位（即ち、コーティングが、相補
的核酸断片とハイブリッド形成するための結合−重鎮核
酸部分を含有した繊維上のそれらの部位）は、平均して
、典型的ＤＮＡ二重鎖の平均直径１０人の数倍（例えば
、３倍以上）離れて位置することに留意すべきである。

部位濃度が低い場合には、コーティングとの最終的ハイ
ブリッド形成反応は空間的又は立体的に障害され、この
ため多くの目的物にとって非常に徐々に進行するであろ
う。

前記結合方法はい（つかの望ましい特徴を有する。ガラ
スとは強く結合する。この結合は変性条件下であっても
不可逆的であり、光安定的である。

ＡＴＲ表面及び分子鎖間のスペーサー供与は、（妥当な
拡散動態のために）容易な接近を許し、しかもハイブリ
ッド形成過程の一部たる鎖湾曲化のために十分の空間を
与える。ポリＡ−ポリＴ結合は、鎖が単一部位で結合し
、それによって妥当なハイブリッド形成動態に必要な鎖
伸縮柔軟性を維持することを保証する。この結合は、認
識部位が結合部位から除外されることも保証している。

密閉容器２４は中空で細長い管であり、好ましくは、必
ずではないが透光性であって、被験液体に対し比較的不
溶性でかつ化学的に非反応性の物質から製造される。典
型的には、密閉容器２４は、繊維２２の最大外径よりも
大きい、好ましくは繊維２２上の少な（とも活性化され
たコーティング３２を覆う既知容量範囲を画するような
大きさの内径を存するガラス管であることが前便である
。

好ましい態様において、繊維２２の被覆表面及び密閉容
器２４の内壁間の空間は、毛細管次元の大きさであって
もよい。

取付手段２６は繊維２２及び密閉容器２４を一定関係で
支持するために設けられており、一定関係にあって、特
に、既知容量の試料が繊維表面の活性領域を覆い、しか
も繊維の入射端が最適条件下で繊維に光入射するよう正
確に支持されるように、密閉容器は繊維から離されてい
る。その結果、繊維は面２８又は面３０に隣接する取付
手段によって支持することができる。しかしなから、繊
維及び面２８に隣接する取付手段間の接触は、取付手段
の屈折率が一般にｎ、よりも高いため、開口数を低下さ
せる傾向がある。この問題を解決するために、典型的に
は繊維は、光が伝達する繊維の少なくとも端部近くで、
取付手段及び繊維間に挿入される低屈折率媒体を提供す
るための、典型的には透明な高分子量ポリマーの被着材
で被覆することができる。繊維の近位端に隣接した取付
手段による問題を回避するため、第１図において取付手
段は、受台３６のように簡単に示されているが、受台は
、密閉容器２４に結合しかつ支持する一部位３８、及び
繊維２２の遠位端３０を強固に固定−するフェルール４
２に結合しかつ支持する他の部位４０を有する。フェル
ール４２が形成される物質は光学的観点からみて重要で
はないが、被験液体試料に対して化学的には比較的非反
応であることを要する。第１図の態様において、密閉容
器２４及び繊維２２は、密閉容器及び繊維双方の長軸が
実質上水平になるように取付られて示されているが、そ
の結果、繊維２０は密閉容器２４の内部で伸びて一端が
突出し、端２８がその外方に突出して、繊維２２は密閉
容器２４の内表面に空間を形成して維持されている。こ
の具体的態様において、密閉容器２４は両端で開口して
いるため、液体を流入又は一端から流出させることがで
きる。

第１図の態様の操作において、繊維２２のコーティング
３２は数種の一重鎖核酸部分のいずれかから形成される
。後者は前記のように結合せしめられて繊維に対しての
試料核酸部分の結合部位を提供し、結合した部分は次い
で染色により測定される。

試料は最初に（必要であれば）潜在的核酸を濃縮させる
ために公知技術で処理され、次いでウィルスカプシド又
は生体細胞構造物が浸透ショック、界面活性剤又は他の
分離剤により分離せしめられて、核酸を放出する。試料
は次いで、放出された二重鎖核酸を変性しかつ核酸鎖を
断片に切断する処理に付される。例えば、二重Ｒ（Ｄ　
Ｎ　Ａは、温和な加熱（７５°Ｃ）及びＥＤＴＡとの処
理によって簡単に変性させることができる。ＥＤＴＡの
使用は、試料又はポリアデニン／チミジン結合工程から
混入した場合において、）１ｇ−イオンを除去するため
でもあり、このような除去は、金属イオンが一重鎮核酸
を再生させることを防止する上で非常に望ましい。もち
ろん、公知の酵素的ＤＮＡ切断法を用いて核酸を切断し
てもよい。切断及び変性が生じる順序は本発明において
重要ではない。

試料は次いで皮下注射器で密閉容器２４及び繊維２２間
の空間４４に注入され、試料は密閉容器２４の対向端で
形成されるメニスカスにより空間４４に保持される。試
料は、液体試料中の被験物質がコーティング３２の核酸
部分にまで拡散しかつ再生又は相補うように、所望であ
れば空間４４中でインキュベートされる。核酸接合反応
の可逆性は、特に系が単に吸着されただけの未接合核酸
を除去するために洗浄される場合において、系の感度に
結合活性制御限界を与える。吸着及び接合間における結
合活性のこの差異は、洗浄前にソラレン族化合物が試料
に加えられる場合には増加させることができる。このよ
うな化合物は二重鎖核酸領域に結合して、光照射時にこ
れらの二重鎖領域を不可逆的に架橋結合させるように機
能する。

二重鎖再生核酸は、二重鎖核酸に対して大きな結合活性
及び特異的を有する螢光色素を直接試料溶液に加えて染
色することが好ましい。好ましい色素は、結合活性を高
め、それによって遊離色素濃度及びハックグランドを低
下させるように、２以上の独立した核酸結合部位を有す
る。本発明で使用される典型的色素としては、エチジウ
ムプロミドアクリジンオレンジ（カラーインデックス寛
４６００５）、キナクリン、ジェチジウムブロミド、ジ
アクリジンオレンジ、各種ヘテロダイマー類その他があ
る。エチジウムプロミドは、４８０〜５５０−の至適励
起波長範囲及び５８０〜６５０−の至適螢光波長範囲を
有する。エチジウムプロミドの構造は下記のように考え
られている：又は、試薬不安定性の可能性を減少させる
ために、色素は、繊維が水中でミリセコンド（ｍｓｅｃ
）で放出するように、最初に繊維にのみ非常に弱く予め
結合した形で提供することができる。選択される色素は
１種であることが好ましく、その螢光シグナルは、互い
に核酸鎖がハイブリッド形成する結合及びその程度によ
って強く影響されるが、このような色素は螢光色素とし
て周知である。エチジウムプロミド及びアクリジンオレ
ンジ又はそれらの二量体のような螢光色素の場合、空間
４４中の試料に要求される濃度は、低濃度、即ち約１０
−”〜１０””　Ｍにすることができる。

空間４４に注入された溶液の表面は、もとの溶液中に存
在するよりも約６ケタのオーダーで多い一重鎮核酸を含
有すると考えられることに留意すべきである。このため
、溶液及び繊維の界面では核酸再結合速度が高く、色素
は繊維上で形成される二重鎖に優先的に結合するが、そ
の鎖は照射される唯一のものである。色素は、繊維上の
被験核酸及び試薬間の反応前には浮動性であって、複合
体型のみの標識である。色素は螢光色素であるため、本
来は結合型よりも非結合型の方が低効率である。二量体
型色素の使用は、色素の二重鎖核酸との結合活性を２乗
したほどの強い結合をするように作用する。したがって
、二量体色素の場合、遊離色素がもとの溶液中でさほど
要求されないため、二重鎖ＤＮＡの選択性増加及び低い
バンクグランドが得られ、その結果非常に高いシグナル
／ノイズ比が得られる。

装置は、典型的には繊維中での光伝達に伴う減衰波によ
りコーティング３２中で螢光を励起又は誘導することが
できる光で入射面２８が照射されるように、螢光計４３
に連結している。螢光は、コーティング３２の標識複合
体中で誘導され、しかる後励起された物質から繊維中に
逆行し、・次いで面２８を通過し、螢光計４３で読取ら
れる。螢光強度は存在する二重鎖核酸の量に比例するた
め、原試料中の存在する核酸に相当した相対的量の関数
であるといえる。

上記データには、ハイブリッド形成対の完全性の程度を
反映する色素の量的効率の差異に基因した誤差が生じる
。このような誤差を補正する１つの方法は、量的効率に
比例した螢光寿命の補足測定を行なうことである。シグ
ナル強度／寿命の比は量的効率と関係がないため、誤差
を生じない。

実際の寿命値は、核酸鎖間の相互関係の程度の測定とし
ても機能する。

固有の螢光寿命は、螢光がその最大値■がら１　／　ｅ
値（ｅは自然対数の底である）まで励起停止に伴い減衰
するのに要する時間として定義される。公知の技術及び
装置を用いた場合に、螢光寿命は、最初に、使用された
螢光色素用の迅速に変調された励起光、例えばレーザー
又は副限界（ｓｕｂ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）発光ダイオ
ード（ＬＥＤ）からの変動振幅光で物質を照射し、次い
で、発生した螢光の変調振幅を測定して、調べることが
できる。

本発明の装置で分析するもう１つの方法は、競合結合型
の分析を行なうことである。後者の場合、同定又は測定
するための一重鎖ポリヌクレオチドの既知量が、公知の
方法で１．好ましくは多数の公知の機能性螢光色素のう
ちのいずれかで標識される。最初の測定は、検量目的で
、適切な螢光計により、このような標ｇｌｉｉｔからの
全螢光について行なわれる。既知量の標識ポリヌクレオ
チドが次いで試料溶液に加えられる。標識及び未標識双
方のポリヌクレオチドの混合物は次いでハイブリッド形
成部位で競合し得るＡＴＲセルと接触するように！！２
置され、セルは準備されかつ前記のように照射される。

測定が次いでセルからの螢光強度に関して行なわれる。

後者の螢光強度対検量時に測定された強度の比は、試料
中に存在する未標識ポリスクレオチドの量に比例する。

これら及び他の変更は本発明の範囲から逸脱することな
（上記方法及び装置において行ない得るため、上記記載
中に含まれ又は添付図面に示されるすべての事項は限定
的意味ではなく説明の意味に解釈されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の原理に従う分析キットの縦断面図であ
り、第２図は第１図の態様の先端図である。 ｉ１１人　、　　マイロン　ジエー、フロック手続補正
書 昭和６２年　５月　８日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、ｓ件の表示 昭和６２年　特　許　願　第６４４５６号２、発明の名
称 核酸分析 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 氏　名　マイロン　ジュー。ブロック ４、代理人 ５、補正の対象　　　（１）「明　細　書」Ｉ＋・＼ （１）別紙の通り、印書せる全文明細書１通を提出致し
ます。 手続補正書 昭和６２年　５月　８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、励起光による励起時に螢光を放出し得る螢光標識を
   有する二重鎖型ポリヌクレオチドを分析する装置であっ
   て、 上記装置が； 上記励起光及び上記螢光の双方に対して光学的に透過性
   の細型全内部反射セル； 上記セルの表面に結合したコーティング（該コーティン
   グは、装置が分析すべき一重鎖ポリヌクレオチドに対し
   少なくとも部分的に相補的な一重鎖ポリヌクレオチドを
   含有する）； の組合せからなることを特徴とする装置。 ２、螢光標識と相互反応し得る減衰波を表面近くで発生
   させ、もって上記標識から螢光を誘導させるために、セ
   ルを励起光で内部照射するための手段； 上記標識の励起により発生しかつ上記セルの端部から出
   る螢光を収集するための手段；及び収集された螢光を測
   定するための手段； を有する、特許請求の範囲第１項記載の装置。 ３、表面に結合したコーティングを有する細型全内部反
   射セルであって、 上記コーティングが一重鎖ポリヌクレオチドを含有する
   ことを特徴とするセル。 ４、コーティングが一重鎖ポリヌクレオチドにカップリ
   ングした芳香族部分を含有する、特許請求の範囲第３項
   記載の細型全内部反射セル。 ５、芳香族部分がジアゾ結合を介して一重鎖ポリヌクレ
   オチドにカップリングしている、特許請求の範囲第４項
   記載の細型全内部反射セル。 ６、溶解により表面から実質上迅速に溶離するほど表面
   に弱くカップリングした色素を有し、該色素がポリヌク
   レオチドの二重鎖型のみと特異的にカップリングする色
   素であって、該色素が第二帯の励起光をうけた時に第一
   帯の螢光を放出する発色団を含有している、特許請求の
   範囲第３項記載の細型全内部反射セル。 ７、セルが励起光及び螢光の双方に対して光学的に透過
   性である、特許請求の範囲第４項記載の細型全内部反射
   セル。 ８、芳香族部分がスペーサー分子を介して表面にカップ
   リングしている、特許請求の範囲第４項記載の細型全内
   部反射セル。 ９、スペーサーがメチレン基鎖で置換されたトリメトキ
   シシランである、特許請求の範囲第４項記載の細型全内
   部反射セル。 １０、スペーサーがメチレン鎖で連結された一対のエポ
   キシ基からなる、特許請求の範囲第８項記載の細型全内
   部反射セル。 １１、スペーサーが脂肪族アミンである、特許請求の範
   囲第８項記載の細型全内部反射セル。 １２、スペーサーがクロロベンジル基を有するトリメト
   キシシランである、特許請求の範囲第８項記載の細型全
   内部反射セル。 １３、ジアゾ結合が一重鎖ポリヌクレオチドの開始部に
   存在するポリアデニン部分とのポリチミジン接合による
   、特許請求の範囲第５項記載の細型全内部反射セル。 １４、接合したポリチミジン及びポリアデニンが架橋結
   合している、特許請求の範囲第１３項記載の細型全内部
   反射セル。 １５、一重鎖型の目的とするポリヌクレオチドのための
   液体試料分析方法であって、 上記方法が： 選択された一重鎖ポリヌクレオチドを光学的透過性細型
   全内部反射セルの表面に結合させ（上記選択された一重
   鎖ポリヌクレオチドは上記の目的のポリヌクレオチドに
   対し少なくとも部分的に相補的である）； 上記結合ポリヌクレオチドで再生させるために、目的の
   一重鎖ポリヌクレオチドにとって十分な条件下で、結合
   ポリヌクレオチドを有する上記表面を少なくとも上記試
   料と接触させ；上記セル表面上の再生ポリヌクレオチド
   に、既知波長帯の励起光をうけた時に螢光発生可能な発
   色団を含有する色素部分をカップリングさせ； 上記発色団と相互反応し得る減衰波を表面近くで発生さ
   せ、もってそこで螢光を誘導させるために、上記セルを
   上記励起光で内部照射し；上記発色団の励起により発生
   しかつ上記セルの端部から出る螢光を収集し；及び 収集された螢光を測定する； 工程からなることを特徴とする方法。 １６、表面を接触させる工程が、結合ポリヌクレオチド
   により再生する一重鎖ポリヌクレオチドが実質的に試料
   のみからのものであるように、試料のみとで行なわれ；
   及び 再生ポリヌクレオチドを染色するために使用される色素
   が、上記ポリヌクレオチドの二重鎖型のみと特異的にカ
   ップリングする色素である；特許請求の範囲第１５項記
   載の方法。 １７、カップリング工程が、表面を試料と接触させる前
   における、選択される一重鎖ポリヌクレオチドの既知量
   を螢光色素で染色し、かつ染色されたポリヌクレオチド
   の既知量を試料に加える工程からなり、もって上記の染
   色された一重鎖ポリヌクレオチドが再生過程において上
   記試料中に最初から存在する一重鎖ポリヌクレオチドと
   競合するようになる、特許請求の範囲第１５項記載の方
   法。 １８、結合工程が、表面に芳香族アミンを結合させ、次
   いで選択された一重鎖ポリヌクレオチドに上記芳香族ア
   ミンをジアゾカップリングさせることからなる、特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 １９、芳香族アミンがスペーサー分子を介して表面にカ
   ップリングしている、特許請求の範囲第１８項記載の方
   法。 ２０、スペーサーがメチレン基鎖で置換されたトリメト
   キシシランである、特許請求の範囲第１９項記載の方法
   。 ２１、スペーサーがメチレン鎖で連結された一対のエポ
   キシ基からなる、特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２２、スペーサーが脂肪族アミンである、特許請求の範
   囲第１９項記載の方法。 ２３、スペーサーがクロロベンジル基を有するトリメト
   キシシランである、特許請求の範囲第１９項記載の方法
   。 ２４、ジアゾカップリングが、最初にアミンをジアゾ基
   に変換し、該ジアゾ基をポリチミジンにカップリングし
   、該ポリチミジンを選択された一重鎖ポリヌクレオチド
   の開始部に存在するポリアデニン部分と接合することに
   より形成される、特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２５、アミンがハロゲン化ジアゾニウムとの処理により
   ジアゾ基に変換される、特許請求の範囲第２４項記載の
   方法。 ２６、ポリアデニンをポリチミジンと架橋結合する工程
   を有する、特許請求の範囲第２４項記載の方法。 ２７、測定工程が螢光強度の測定からなる、特許請求の
   範囲第２４項記載の方法。 ２８、測定工程が、螢光の螢光減少寿命の測定からなる
   、特許請求の範囲第２４項記載の方法。 ２９、色素が二量体色素である、特許請求の範囲第１５
   項記載の方法。 ３０、色素がジエチジウムブロミドである、特許請求の
   範囲第２９項記載の方法。 ３１、色素がジアクリジンオレンジである、特許請求の
   範囲第２９項記載の方法。 ３２、励起光による励起時に螢光を放出し得る螢光標識
   を有する二重鎖型ポリヌクレオチドを分析する装置であ
   って、 上記装置が： 上記励起光及び上記螢光の双方に対して光学的に透過性
   のガラス製細型全内部反射セル；ポリアデニン鎖を有す
   るポリヌクレオチド分子の端部に隣接して不可逆的に結
   合するポリＴ−ポリＡ配列にカップリングしたスペーサ
   ー分子を介して、上記セルの表面上の各々単一部位にそ
   れぞれ共有結合した上記二重鎖ポリヌクレオチド分子を
   含有するコーティング； の組合せからなることを特徴とする装置。