DE69312186T2

DE69312186T2 - Chromatographischer Sandwichtest für spezifischen Antikörper und Vorrichtung dafür

Info

Publication number: DE69312186T2
Application number: DE69312186T
Authority: DE
Inventors: Stephen J Lovell
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1992-09-04
Filing date: 1993-09-02
Publication date: 1997-12-04
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: CA2105439A1; EP0585914A3; AU659754B2; EP0585914B1; AU4476593A; DE69312186D1; JPH06174712A; EP0585914A2

Description

Hintergrund der Erfindung

Immunoassays sind heute wohlbekannte Hilfsmittel der diagnostischen Industrie. Solche Assays machen sich die Spezifität der Antigen-Antikörper-Reaktion zunutze, um die Anwesenheit des Analyten in der Testprobe nachzuweisen. Dies ergibt ein einfaches Verfahren zum Messen des Analyten (siehe zum Beispiel EP-A- 0 291 194).
Wenn der Zielanalyt ein Antikörper ist, verwendet der Assay gewöhnlich einen Anti-Spezies-Antikörper, mit dem der Detektor beschichtet ist, wie Anti-IgG oder Anti-IgM. Dieser Detektortyp ist schwierig in einen einstufigen Assay einzubauen, da er dazu neigt, sowohl spezifischen als auch nichtspezifischen Antikörper zu binden, wenn der nichtspezifische Antikörper im Überschuß in der Probe vorhanden ist. Dies ist bei Serum im allgemeinen der Fall.
Es besteht also ein Bedürfnis nach alternativen Technologien, um einen solchen einstufigen Assay zu verwenden.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Diese Erfindung stellt einen einfachen und schnellen einstufigen Assay zum Nachweis spezifischer Antikörper in einer Probe bereit.
Insbesondere verwendet der Test eine chromatographische Vorrichtung mit zwei Zonen, wobei es sich bei den zwei Zonen um eine Detektorzone und eine Abfangzone handelt.
Die Detektorzone umfaßt mit einem Antigen oder Antigen-Analogon beschichtete Detektorteilchen, und die Abfangzone enthält ein an die chromatographische Matrix gebundenes Antigen oder Antigen- Analogon. Bei dem Assay wird die Probe, die den spezifischen Antikörper enthält, stromaufwärts von der Detektorzone, die sich wiederum stromaufwärts von der Abfangzone befindet, auf die Vorrichtung aufgetragen. Die spezifischen Antikörper binden zuerst an die Teilchen in der Nachweiszone, und diese Komplexe werden an die Abfangzone gebunden, wo das Detektorsignal abgelesen werden kann.

Kurzbeschreibung der Figuren

In Figur 1 ist eine chromatographische Vorrichtung dieser Erfindung dargestellt, die die chromatographische Matrix (1), die Detektorzone (2) und die Abfangzone zeigt.
In Figur 2 ist der in der Abfangzone gebildete Komplex dargestellt, der den Detektor (1), das Antigen an der Detektoroberfläche (2), das an die chromatographische Matrix gebundene Antigen (3) und den spezifischen Antikörper (4) zeigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Detektorzone umfaßt Detektorteilchen, die mit Antigen beschichtet sind. Für einen echten einstufigen Assay sollte der Detektor eine sichtbare Ablesung ergeben, obwohl auch andere Detektoren (z.B. Fluoreszenz, UV) verwendet werden können, wobei das einzige Kriterium darin besteht, daß Antigene an seine Oberfläche gebunden werden können.
Der Detektor ist ein teilchenförmiges Material. Ein geeignetes teilchenförmiges Material ist ein Beutel, der einen Farbstoff oder eine andere farbige Substanz als Ablesung enthält. Bei dem verwendeten Beutel kann es sich um einen von einer großen Vielfalt von Beuteln handeln, einschließlich intakter Erythrocyten, Erythrocyten-Geister, Liposomen (einwandige, zuweilen Vesikel genannte oder multilamellare), Polymermikrokapseln (zum Beispiel die durch Koaszervierung oder Grenzflächenpolymerisation hergestellten) usw., ohne auf diese beschränkt zu sein. Geeignet sind auch farbige Teilchen (z.B. Latex- oder andere polymere Teilchen) sowie gefällte oder unlösliche Metalle, Nichtmetalle und Legierungen.
Die primären Kriterien für die Auswahl der Detektorteilchen sind die Fähigkeit, das Antigen zu binden, und die Sichtbarkeit der Ablesung unter Testbedingungen.
Bei der signalerzeugenden Substanz kann es sich um jede Substanz handeln, die unter Testbedingungen ein nachweisbares Signal zeigt; vorzugsweise jedoch handelt es sich um einen sichtbaren farbigen Farbstoff oder ein Pigment. Andere Farbstoffe, wie UV- oder Fluoreszenzfarbstoffe, können ebenfalls verwendet werden, komplizieren aber den Nachweis, indem sie die Verwendung spezieller Geräte erforderlich machen. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Detektor um ein farbiges Latexteilchen.
Das Antigen ist mit in der Technik wohlbekannten Mitteln in einer solchen geometrischen Orientierung an die Oberfläche des Detektors gebunden, daß er einer Reaktion mit spezifischem Antikörper in der Probe unter Bildung eines Komplexes zugänglich ist. Dieser Komplex wandert dann durch die chromatographische Matrix zur Abfangzone, die Antigen enthält, das mit in der Technik wohlbekannten Mitteln an der Matrix immobilisiert ist. (Im Falle eines niedermolekularen Antigens kann es notwendig sein, das Antigen an ein Trägermakromolekül zu koppeln, bevor es an der chromatographischen Matrix immobilisiert wird.) Der mehrwertige spezifische Antikörper bindet ebenfalls an das gebundene Antigen in dieser Zone, wobei ein markiertes "Sandwich" aus Antigen/Antikörpen gebundenem Antigen entsteht, das dann nachgewiesen werden kann.
Der Assay ist in hohem Maße selektiv für den spezifischen Antikörper, da er auf der Bildung eines Antigen/Antikörper-Komplexes beruht, der ebenfalls in hohem Maße spezifisch ist.
Bei der chromatographischen Matrix kann es sich um jede der verschiedenen Matrices handeln, die in der Technik bekannt sind, einschließlich Siliciumoxid, Polyacrylamid, Aluminiumoxid und vorzugsweise Nitrocellulose. Weiterhin wird der Assay zwar vorzugsweise im Format einer Dünnschichtchromatographie-Vorrichtung (DC) durchgeführt, kann aber auch in jedem anderen geeigneten Chromatographie-Format, etwa Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
In der bevorzugten Ausführungsform ist die DC-Vorrichtung so angeordnet, wie es in Figur 1 gezeigt ist. Kurz gesagt, die Pröbe wird stromaufwärts von der Detektorzone (2) auf das chromatographische Medium (1) aufgetragen. Nachdem sie durch die Detektorzone gewandert ist, gelangt die Probe weiter zur Abfangzone (3), wo Antikörper/Antigen-Komplexe, die vorhanden sind, gebunden und nachgewiesen werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele veranschaulichen bestimmte bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung, sollen jedoch nicht alle Ausführungsformen veranschaulichen.

Beispiel 1 - Anti-Biotin-System

In diesem Beispiel wurde eine DC-Vorrichtung, die 8 µm Nitrocellulose als chromatographische Matrix enthielt, wie in Figur 1 angeordnet. Die Detektorzone enthielt 3 µl biotinylierten roten Latex, und die Abfangzone enthielt biotinyliertes BSA, das mit einem CAMAG-DC-Applikator in einer geraden Linie auf die Vorrichtung gesprüht wurde. Die Dichte des biotinylierten BSA auf der Membran betrug 1 µg/cm.
Die Probe wurde stromaufwärts von der Detektorzone auf die Oberfläche der Vorrichtung aufgebracht, und das System wurde visuell auf die Entwicklung einer roten Farbe in der Abfangzone überprüft. Zwei Proben wurden getestet, normales Kaninchen-Serum und Kaninchen-Serum, das Anti-Biotin-Antikörper enthielt.
Nur das Serum, das den spezifischen Anti-Biotin-Antikörper enthielt, lieferte ein positives Ergebnis.
Eine dritte Probe, die normales Kaninchen-Serum enthielt, das mit 20 µg/ml affinitätsgereinigtem Anti-Biotin-Antikörper beimpft wurde, wurde in ähnlicher Weise getestet und lieferte ein positives Ergebnis, was darauf hinwies, daß die Empfindlichkeit wenigstens 20 µg/ml beträgt. Triton X-100 (Endkonzentration 1% (w/v)) wurde zu allen Proben in diesem Beispiel gegeben, um eine schnelle Wanderung des Detektorlatex zu gewährleisten.

Beispiel 2 - Anti-Kaninchen-IgG-System

In diesem Beispiel wurde eine ähnliche Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet, außer daß es sich bei dem Detektor um blau gefärbte, 0,48 µm große Latexteilchen (0,48 µm) handelte, die mit Kaninchen-IgG beschichtet waren, und es sich bei der Abfangzone um Kaninchen-IgG handelte, das mit einem Mikropipettierer als Fleck auf die Nitrocellulose aufgetragen wurde (0,4 mg/ml IgG, 3 µl/Fleck); der Detektor in Form des blauen Latex wurde vor dem Auftragen auf die Nitrocellulose im Verhältnis 1:1 (v/v) mit einer Lösung gemischt, die aus PBS, 10% BSA, 5% Sucrose, 0,2% Triton X-100, pH 7,7, bestand.
Drei Seren wurden getestet, normales Ziegen-Serum (1/20 verdünnt), Ziegen-Serum, das Anti-Kaninchen-IgG enthielt (1/20 verdünnt), und Ziegen-Serum, das Anti-Kaninchen-IgG enthielt (1/20 verdünnt) und dem normales Kaninchen-Serum in einer Menge von 10% (v/v) zugesetzt war.
Nur die zweite Probe lieferte ein positives Ergebnis, was auf die Spezifität des Anti-Kaninchen-Antikörpers hinweist, da normales Kaninchen-Serum, das in die dritte Probe (die Kaninchen-IgG enthält) eingemischt wurde, an das Anti-Kaninchen-IgG bindet und die Reaktion blockiert.

Claims

1. Vorrichtung zur Durchführung von einstufigen Immunoassays für spezifische Antikörper gegen ein Antigen, umfassend eine chromatographische Matrix, die eine Detektorzone und eine Abfangzone stromabwärts von der Detektorzone enthält, wobei die Detektorzone Detektorteilchen umfaßt, die mit einem Antigen oder Antigenanalogon beschichtet sind, und die Abfangzone das Antigen oder Antigenanalogon enthält, das an die chromatographische Matrix gebunden ist.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die chromatographische Matrix aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Siliciumoxid, Nylon, Glasfaser, Polyacrylamid, Aluminiumoxid und Nitrocellulose besteht.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Detektorteilchen eine sichtbare Ablesung ergeben.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei der Detektor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus gefällten oder unlöslichen Metallen, gefällten oder unlöslichen Nichtmetallen, einen Farbstoff oder eine farbige Substanz enthaltenden Beuteln und gef"llten oder unlöslichen Legierungen besteht.

5. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines spezifischen Antikörpers gegen ein Antigen in einer Probe, umfassend: (i) Auftragen der Probe auf eine chromatographische Matrix einer Vorrichtung, die eine Detektorzone und eine Abfangzone enthält, wobei die Probe stromaufwärts von der Detektorzone aufgetragen wird;

(ii) Wandemlassen der Probe zuerst durch die Detektorzone, die Detektorteilchen enthält, die mit dem Antigen oder einem Antigenanalogon beschichtet sind, so daß sich Antigen-Antikörper-Komplexe bilden, und zweitens durch die Abfangzone, die an die chromatographische Matrix gebunden das Antigen oder ein Antigenanalogon enthält, so daß die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe an das Antigen oder Antigenanalogon binden; und (iii) Beobachten der Abfangzone im Hinblick auf die Gegenwart von Teilchen, wobei die Gegenwart von Teilchen die Gegenwart des spezifischen Antikörpers anzeigt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die chromatographische Matrix aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Siliciumoxid, Nylon, Glasfaser, Polyacrylamid, Aluminiumoxid und Nitrocellulose besteht.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Detektorteilchen eine sichtbare Ablesung ergeben.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Detektorteilchen ein Beutel ist, der einen Farbstoff oder eine farbige Substanz enthält.

9. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Detektor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus gefällten oder unlöslichen Metallen, gefällten oder unlöslichen Nichtmetallen und gefällten oder unlöslichen Legierungen besteht.

10. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Vorrichtung in einem dünnschichtchromatographischen Format vorliegt.