TWI504891B - 尿酸偵測電極與其製法 - Google Patents

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Description

尿酸偵測電極與其製法
本發明係關於一種尿酸偵測電極與其製造方法及應用。
尿酸(uric acid)是一種尿液和血液中常被發現的含氮物質，是人體中嘌呤(purine)新陳代謝的主要最終產物。健康的人們，其血液中的正常尿酸值為240-520 μM，尿液中的正常尿酸值為0.214-4.4 mM。若血液或尿液中尿酸濃度過高，會造成痛風、高尿酸血症、尼氏乃罕症候群(Lesch-Nyhan syndrome)，以及腎臟病。因此，為了預防、診斷，或治療這些由高尿酸造成的疾病，量測尿酸的濃度就非常重要。
分析尿酸的方法包含光譜法(spectrophotometry)、酵素法(enzymatic method)、高效液相層析儀分析(high-performance liquid chromatography， HPLC)、液相層析-質譜儀分析、毛細管電泳分析(capillary electrophoresis)、化學發光分析(chemiluminescence)、螢光分析(fluorescence)、磷光分析(phosphorescence)，以及電化學方法。但通常這些方法具有耗時、昂貴、複雜，缺乏特定性(specificity)等缺點。因此，需要開發一種具特定性、低成本、操作簡易、簡單、快速的方法。首先使用尿酸酵素(uricase或urate oxidase, UOx )偵測尿酸的為1941年的Bulger等 [1]，他們使用尿酸酶量測尿酸的減少。
若要發展長期穩定可重複使用的尿酸酵素電極，將尿酸酵素固定於電極上是最重要的因素。有許多酵素固定化的方式，例如物理吸附法[2-7]、包覆法(entrapment method)[8-9]、自組裝單分子層法[10-11]、交聯法[12-13]、化學鍵結法[14-15]。其中物理吸附法雖然簡單，但酵素容易從電極上剝離，使得電極的壽命不長。自組裝單分子層法以及包覆法也有類似的問題。因此，交聯法或化學鍵結法可能是固定化酵素的理想方式，可用以加強電極的效能、增加使用壽命(shelf life)。
在酵素電極中，電極材料也扮演一個重要角色，可影響酵素固定化強度、電流導出，以及製造成本。電極材料包含金屬和非金屬碳兩大類。修飾的金屬電極，例如以氧化鋅塗佈金電極[6]，多壁奈米碳管(multi-walled carbon nanotube，MWCNT)修飾金電極[15]，羧酸酯化多壁奈米碳管(carboxylated MWCNT)和聚苯胺(polyaniline)導電高分子修飾之金電極[5]，氧化銅薄膜修飾銀電極[3]，以及金奈米粒子修飾3-氨基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane ，APTES)自組裝單分子層塗佈氧化銦錫電極[14]等均已經被使用在尿酸酶電極的固定化。因為金屬材料較貴，根基於碳的非金屬材料也逐漸被使用在尿酸酶電極。例如，在玻璃碳電極上自組裝尿素酶混合於硫堇-石墨烯氧化物之混合奈米片(self-assembled UOx mixed thionine-graphene oxide hybrid nanosheets)[11]，石墨碟以普魯士藍-鎳離子薄膜(Prussian blue-Ni2+ film)修飾電極[16]。三明治結構電流式網印碳電極[4]，二茂鐵修飾石墨烯氧化物網印電極[7]，以及網印銥修飾的碳電極[13]。
尿酸是一種電活性化合物，可在電極的水溶液中被尿素酶(UOx )輕易氧化而產生尿囊素(allantoin)、過氧化氫(H2 O2 )，和二氧化碳[17]：
尿酸 + 2H2 O + O2 Allantoin + H2 O2 + CO2
所產生的過氧化氫可於工作電極表面上經由氧化作用，偵測釋放出的電流而獲知尿酸的濃度。
H2 O2 ® O2 + 2H+ + e–
然而，因為過氧化氫需要的氧化電位通常很高(＞0.40 V)，導致其他電活性物質，例如抗壞血酸(ascorbic acid)也在溶液中被氧化，而干擾尿酸的分析。解決此問題的一個方法，是利用氧化還原媒介物(mediator)取代氧以降低尿酸的氧化電位，減少不必要的干擾。同時，也可以避免分析過程中，因空氣壓力的波動對分析準確度產生影響。近來，二茂鐵(ferrocene, Fc)已被廣泛地作為氧化還原媒介物。例如，以含有二茂鐵作為氧化還原媒介物，在鉑電極表面進行吡咯(pyrrole)電聚合(electropolymerization)，形成一聚合物薄膜，用於固定化尿素酶[17]。二茂鐵甲醛被化學鍵結到石墨烯氧化物，並塗佈於網印電極(screen printed electrode)，以固定尿素酶，並量測在血清中的尿酸[7]。
發明人先前以鉛筆芯製造葡萄糖偵測電極(台灣專利申請號TW098106428)，具有良好的效能。
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本發明的目的在於提供一種尿酸偵測電極與其製造方法，具有良好的穩定性，可被重複使用。
根據上述目的，本發明實施例提供一種尿酸偵測電極的製造方法，包含下列順序步驟：提供一金屬基材；形成一金表面於該金屬基材表面上，以形成一電極；以甲硫胺酸(L-methionine)修飾該金表面，使金粒子與甲硫胺酸中的甲基硫基(methylsulfanyl group)形成共價鍵結，並且形成一具有第一修飾表面的第一修飾電極；以一包含醛基(aldehyde group)的氧化還原媒介物(redox mediator)與甲硫胺酸的胺基形成一席夫鹼(聚甲亞胺)(Schiff Base)共價鍵結，並形成一具有一第二修飾表面之第二修飾電極；以N ,N ’-二環己基碳化二亞胺 (N ,N '-dicyclohexylcarbodiimide, DCC)修飾該第二修飾表面，該N ,N ’-二環己基碳化二亞胺與甲硫胺酸的羧基(carboxyl group)形成共價鍵結，並形成一具有一第三修飾表面之第三修飾電極；以及以該第三修飾表面與尿酸酵素接觸，使得尿酸酵素與甲硫胺酸的羧基(carboxyl group)形成醯胺鍵(amide bond)共價鍵結，以形成一具有一第四修飾表面之第四修飾電極。。
根據上述目的，本發明實施例提供一種尿酸偵測電極，包含：一基材結構，具有一金屬表面；一金表面形成在該金屬表面的至少一部份上；一甲硫胺酸透過一甲基硫基(methylsulfanyl group)與該金表面鍵結；一氧化還原媒介物包含一醛基(aldehyde group)，該媒介物與該甲硫胺酸的胺基形成一席夫鹼(聚甲亞胺)(Schiff Base)；以及一尿酸酵素透過一具有二亞胺(diimide)的肽鍵連接劑(peptide coupling agent)與該胺基酸鍵結，其中該尿酸酵素經由取代該肽鍵連接劑，並與甲硫胺酸之羧酸基形成一醯胺鍵(amide bond)共價鍵結。
以下將詳述本案的各實施例，並配合圖式作為例示。除了這些詳細描述之外，本發明還可以廣泛地實行在其他的實施例中，任何所述實施例的輕易替代、修改、等效變化都包含在本案的範圍內，並以之後的專利範圍為準。在說明書的描述中，為了使讀者對本發明有較完整的了解，提供了許多特定細節；然而，本發明可能在省略部份或全部這些特定細節的前提下，仍可實施。此外，眾所周知的程序步驟或元件並未描述於細節中，以避免造成本發明不必要之限制。
圖1顯示根據本發明較佳實施例的尿酸感應電極的製造方法，其包含下列六個步驟。步驟(I)，從線材捲軸上裁減長度約3公分的漆包銅線10(enameled copper wire)，以刀去除兩端約0.8 cm的聚酰亞氨層，再以粗的砂紙磨，以露出銅12。
步驟(II)，將上述銅線置於四氯金酸(tetrachloroaurate)水溶液，施加電壓，使四氯金酸還原成金粒子沈積在銅12表面上，形成具有一金表面14的電極16。此步驟的製程條件約為溫度28°C、電壓2.0 V，時間2小時。接著，以水清洗電極16，清除電極16表面上未還原的金化合物。步驟(III)，將電極16浸沒於25°C、濃度20.0 mM的胺基酸，例如甲硫胺酸(左旋蛋胺酸，L-methionine)溶液中1小時，使金粒子與甲硫胺酸中的甲基硫基(methylsulfanyl group)形成共價鍵結之第一修飾表面14A，並且形成具有第一修飾表面14A的第一修飾電極16A。接著，在25°C下，以去離子水清洗第一修飾電極16A，清除金表面14上以物理吸附的甲硫胺酸。步驟(IV)，將具有第一修飾表面14A的第一修飾電極16A沉浸在75°C、濃度20.0 mM的二茂鐵甲醛(ferrocene carboxaldehyde, FcAld，溶於體積比99.5/0.5的乙醇/氯化氫)溶液中1小時，使媒介物(FcAld)與甲硫胺酸的胺基(amino group)形成一席夫鹼(聚甲亞胺)(Schiff base)共價鍵結的第二修飾表面14B，並且形成具有第二修飾表面14B的第二修飾電極16B。接著，在75°C下，以去離子水清洗第二修飾電極16B。步驟(V)，將第二修飾電極16B於40°C下，沉浸在溶於甲醇，濃度為20.0 mM的N ,N ’-二環己基碳化二亞胺(N ,N '-dicyclohexylcarbodiimide)溶液中1小時，使N ,N ’-二環己基碳化二亞胺與甲硫胺酸的羧基(carboxyl group)形成共價鍵結，形成第三修飾表面14C，並形成具有第三修飾表面的第三修飾電極16C。接著可依序以甲醇與去離子水，在40°C下清洗第三修飾電極16C，以移除未反應的N ,N ’-二環己基碳化二亞胺。步驟(VI)，將第三修飾電極16C於25°C，沉浸在以0.1 M、pH 7.0的磷酸鈉緩衝溶液(sodium phosphate buffer solution, NaPB)，所製備的50 μM濃度的尿酸酵素(uricase)溶液中24小時，透過取代反應，以鍵結尿酸酵素與甲硫胺酸的羧基(carboxyl group)，形成醯胺鍵(amide bond or peptide bond)共價鍵結，而固定尿酸酵素在第三修飾表面16C上，成為第四修飾表面14D與具有第四修飾表面的第四修飾電極16D。至此，第四修飾電極16D即為所需的尿酸偵測電極，可保存於0.1 M、pH 7.0、4°C的磷酸鈉緩衝溶液中備用。
上述較佳實施例可做適當變更。例如，其他金屬材料，或可取代銅。步驟(IV)可在步驟(V)或(VI)之後執行。基底的形狀可為棒狀、片狀、或其他任意形狀。
在其他實施例，形成金表面12的方法可包含沈積(deposition)、噴墨(ink-inject)、電鍍(electrodeposition)、網印(screen-printing)，或其他方法。其他具有胺基(amino group)、羧基(carboxyl group)、硫醇基(thiol group)的胺基酸(amino acid)或許可取代甲硫胺酸，但特性待驗證。其他具有二亞胺結構的肽鍵連接劑(peptide coupling agent)可取代N ,N ’-二環己基碳化二亞胺。其他具有一醛基(aldehyde group)的氧化還原媒介物或許可取代二茂鐵甲醛(ferrocene carboxaldehyde)。此外，製程溫度與各溶液濃度亦可做適度變更。
以FTIR分析尿酸偵測電極的特性
圖2A至圖2G顯示在圖1的每個步驟後，以傅立葉轉換紅外光譜(FTIR)分析所製作電極的結構。圖2A在波數(wavenumber)為2330 cm-1 處具有一個很弱的反射波峰，這是聚酰亞氨包覆的銅導線，去除聚酰亞氨外膜後，殘留在銅導線上的聚酰亞氨所致。此反射波峰應該是聚酰亞氨的異氰酸酯(R-N=C=O, near 2270 cm–1 )的振動模式。圖2B顯示，在金粒子電鍍在銅導線的表面後，沒有紅外光譜線的訊號。圖2C顯示甲硫胺酸被鍵結至金粒子後的光譜。此光譜於波數3000-2840 cm-1 的反射波峰顯示甲硫胺酸的烷烴(alkane)的強C-H拉伸振動；於波數1465 cm-1 的反射波峰顯示甲硫胺酸的亞甲基(methylene group, -CH2 -)的彎曲振動；於波數1375 cm-1 的反射波峰顯示甲基的彎曲振動；於波數1600 cm-1 (非對稱)和1400 cm-1 (對稱)的反射波峰顯示甲硫胺酸的羧酸鹽(carboxylate)的強拉伸振動；於波數3300-2600cm-1 的反射波峰顯示甲硫胺酸的胺鹽的N-H寬廣拉伸振動；於波數1610cm-1 (非對稱)和1500 cm-1 (對稱)的反射波峰顯示甲硫胺酸的一級胺鹽(primary amine salts)的強N-H彎曲振動。圖2D顯示以二茂鐵甲醛(FcAld)的乙醛基修飾甲硫胺酸的胺基(amino group)後的FITR頻譜：於波數1690-1640cm-1 的反射波峰顯示二茂鐵環的亞胺基(imine，R2 C=N-R)的拉伸振動；於波數1650-1611cm-1 的反射波峰顯示二茂鐵(Fc)環的內C=C雙鍵的拉伸振動。此外，於波數1000-650cm-1 顯示二茂鐵(Fc)環的=C-H於平面外(out-of-plane)的彎曲。圖2E顯示甲硫胺酸的羧基(carboxyl group)與N ,N ’-二環己基碳化二亞胺(N ,N '-dicyclohexylcarbodiimide)形成酯鍵後的FITR頻譜。於波數1350-1000cm-1 的反射波峰顯示C-N的拉伸振動。於波數1300-1000cm-1 的反射波峰顯示C-O的拉伸振動。於波數1690-1640cm-1 的反射波峰顯示亞胺基(imine group)的拉伸振動。於波數3000-2840cm-1 的反射波峰顯示C-H的拉伸振動。另一方面，於波數於波數1600 cm-1 (非對稱)和1400 cm-1 (對稱)的反射波峰顯示反應會使羧酸鹽的拉伸振動變弱。圖2F顯示甲硫胺酸與尿酸酵素透過取代反應形成一醯胺鍵(–CO–NH–,  amide bond) 後的FITR頻譜，分別於波數1680-1630cm-1 的反射波峰顯示C=O的拉伸振動，波數3475-3150cm-1 的反射波峰為N–H的拉伸振動。顯示尿酸酵素取代DCC及尿酸酵素的縮氨鍵(醯胺)骨架被形成。同時，於波數1640-1550cm-1 的反射波峰顯示醯胺鍵的N-H彎曲振動。圖2G顯示純尿酸酵素的FITR頻譜，其與圖2F比較，可驗證尿酸酵素已經被成功地鍵結在電極上。
循環伏安分析
由循環伏安分析(cyclic voltammetric, CV)可獲得本發明實施例所製備尿酸偵測電極的氧化電位。分析時，電位掃描範圍從-0.8至0.8 V，掃描速度為 50 mV s–1 。分析樣品為九種尿酸標準溶液，濃度分別為0.0 mM、0.595 mM、1.19 mM、 1.79 mM、2.38 mM、2.98 mM、3.57 mM、4.17 mM、4.76 mM，利用0.1 M、pH 9.5的磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)配製。循環伏安分析溫度為35℃。
圖3A顯示上述三種標準溶液的循環伏安分析圖，其中曲線a至i分別為九種尿酸標準溶液(0.0，0.595，1.19，1.79，2.38，3.57，4.17，和4.76  mM)的循環伏安曲線，而箭號表示掃描的方向。
由圖可觀察到氧化還原媒介物(mediator)的氧化與還原電位分別為0.239 V與-0.232 V。當尿酸濃度增加，媒介物的陽極電流波峰變寬變大，氧化電位增加。當尿酸濃度增加，氧化電位由0.239 V增加至 0.449 V。NaPB緩衝背景溶液的氧化與還原電流波峰，分別是0.044 V與 -0.042 V，這是因為當尿酸濃度增加(由a至i)，所對應的氫離子的氧化與還原減少的緣故。NaPB背景溶液的陽極電流波峰在-0.61 V，可能是因為當尿酸濃度增加，H2 O的還原減少。H2 O還原會產生H2 和OH– ，會受到H+ 還原成H2 的抑制。然而，當尿酸濃度增加，OH– 和H+ 的中和使得H+ 的還原電流波峰減小。實驗中可觀察到在循環伏安分析時，鉑輔助電極(counter electrode)有冒泡的現象。據推測，在工作電極發生的反應如下：
尿酸 + 2H2 O + 尿酸酵素(ox) " Allantoin + CO2 + 2H+ +尿酸酵素(red)
尿酸酵素(red) + 2FcAld+ D尿酸酵素(ox) + 2FcAld
2FcAld D 2FcAld+ + 2e–
標準品添加校正檢量線
由標準品添加校正檢量線可獲得尿酸偵測電極的靈敏度、偵測極限值(limit of detection, LOD)，以及線性濃度偵測範圍。標準品添加校正檢量線是以標準品添加方法[19]在35°C下製作。
每次量測前，利用通氮氣10分鐘使磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)脫氧；測量時，持續把氮氣吹在溶液表面。首先，以0.1 M、pH 9.5的NaPB製備濃度4.76 mM的尿酸儲存溶液。四毫升的0.1 M、pH 9.5的NaPB被放入電化學電池中，當作背景溶液，並且以磁石攪拌，轉速100 rpm。接著，每隔40 s添加約5.0至885.0 μL體積的尿酸標準溶液，直至溶液的濃度為2.38 mM。取每次標準品添加後最後3秒的時間讀取電流值。當尿酸濃度更高，例如2.98、3.57，以及4.76  mM時，則利用外部標準品法量測電流訊號。
圖3B顯示根據本發明實施例製備的尿酸偵測電極，以上述方法製備標準品添加校正檢量線時的電流-時間曲線。如圖顯示，在起初1600 s時，電流的改變不大。因此，此一部分的電流-時間曲線，被放大顯示在圖3B的插圖中。由於電極和容器的尺寸緣故，實驗時標準品添加的最高尿酸濃度被限制為2.38 mM。而超過此值的濃度值，例如2.98、3.57，以及4.76  mM時，分別利用外部標準品法量測電流訊號。每次進行尿酸標準品添加後，需要大約5 s的時間，使電流達到穩定。
圖3C顯示尿酸標準品添加校正檢量線。此檢量線是由電流訊號與所對應尿酸標準品濃度的線性回歸獲得。在線性濃度範圍0至4.76 mM時，具有良好的線性，線性相關係數(r2 )為0.9912。而由濃度0.00、0.01、0.02、0.03、0.06 mM得到尿酸偵測電極的偵測極限值(LOD)為6 μM。
干擾效應
將4 mL、濃度0.1M、pH 9.5的磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)，以轉速100 rpm磁石攪拌後，當作背景溶液。接著，將以濃度0.1M、pH 9.5磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)所製備的270 μL、濃度4.76 mM的尿酸標準品溶液，加入背景溶液，稀釋成0.3 mM尿酸標準品濃度，以模擬人類血清中尿酸的正常值。紀錄此溶液的電流訊號值。接著，將濃度0.1 M、pH 9.5的磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)配製的1 M干擾物標準溶液，取需要的量，分別加入0.3 mM的標準溶液中，以製備濃度從0.1至5.0 mM的干擾溶液。紀錄每個干擾溶液的電流值，並與尿酸標準溶液的電流值比較，以獲得訊號比值以及選擇性係數(k 尿酸，干擾物 )，以指示干擾的程度，其計算公式如下：
訊號比值 = (訊號總值)尿酸 + 干擾物 /(訊號值)尿酸
k 尿酸 , 干擾物 = (訊號值)干擾物 /(訊號值)尿酸
尿液樣本前置處理
尿液樣本取自實驗室的工作人員。尿液取得後，以一微孔隙薄膜過濾器過濾。過濾後取2 mL的尿液樣本，以0.1 M、pH 9.5的磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)稀釋十倍。共製備4個4 mL的上述稀釋尿液樣本，進行定量分析。
尿液中的尿酸定量分析
對於每個尿液樣品，每隔40 s，添加40 μL濃度4.76 mM的尿酸溶液至4 mL的尿液樣本中，直到電流訊號為未添加尿酸尿液樣本(unspiked sample)的1.5至3倍。每次進行添加尿酸尿液樣本(spiked sample)溶液後的濃度分別為0.047 mM、0.09 mM、0.14 mM，以及0.18 mM。接著，由線性標準品添加校正檢量線的x 軸截距值，乘以稀釋的倍數，即可得到原尿液樣本中的尿酸濃度。同時，也計算所測得尿酸濃度的標準偏差值(standard deviation)，以了解分析的精確性。
本實施例尿酸偵測電極的準確度(accuracy)是根據添加尿酸標準品至尿液樣本的尿酸標準品回收率計算。即稀釋的尿液樣本，經添加與其濃度相當的尿酸標準品溶液之後，分別由標準品添加法獲得添加尿酸標準品至尿液樣本(spiked urine sample)的理論總尿酸濃度值([UA]理論總值 )以及實際量測得到的總尿酸濃度值([UA]量測總值 )。然後，以下列公式計算準確度：
準確度 = 1 – |([UA]量測總值 /[UA]理論總值 – 1)| × 100%
最佳反應條件
本實施例尿酸偵測電極量測時的最佳磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)的pH值，是以固定電壓0.361 V條件下，進行標準品添加而得。磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)的濃度固定為0.1 M，而改變其pH值，從7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，至9.5，分別測量0.3 mM (50 ppm)尿酸標準品溶液的電流值。量測溫度均控制在35℃。並運用變異數分析(ANOVA)統計方法以及最小顯著差異性測驗(least significant test)，以比較所獲得六個電流量測值的差異。pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，以及9.5的量測值分別為 6.71 ± 0.83， 10.5 ± 1.77， 10.3 ± 3.75， 11.1 ± 2.27， 12.1 ± 1.82， 12.1 ± 0.65 μA。根據最大電流與最小相對標準偏差值，pH 9.5的測試結果最佳。
本實施例尿酸偵測電極量測時的最佳溫度，是以固定pH 9.5條件下，進行標準品添加而得。溫度改變範圍從15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，至40℃，分別量測尿酸標準品溶液(0-1.19 mM)的電流值。由所獲得各標準品添加線性檢量線中，具有最高靈敏度 (43.0 μA mM-1 )與最低偵測極限值(0.003 mM)的工作溫度為35℃。以該溫度值作為量測尿酸的工作溫度。
表一列出某些可能對本實施例尿酸偵測電極產生干擾之物質，在不同濃度的測試結果。結果顯示對於1.7 mM尿素(urea)、0.5 mM乳酸(latic acid)、5.0 mM葡萄糖(glucose)、0.1 mM肌酸酐(Creatinine)、1.0 mM丙酮酸(pyruvate)的干擾度皆小於15%，而其他物質包含3.4 mM抗壞血酸(ascorbic acid)、1.0 mM半胱胺酸(cysteine)、1.0 mM谷氨酸(glutamic acid)、1.0 mM組氨酸(histidine)、0.10 mM酪胺酸(tyrosine)、 0.1 mM多巴(DOPA)，以及 0.1 mM多巴胺(dopamine)的干擾度大。然而，考慮到量測誤差(由測量數據的標準偏差值)，並以統計技術的t 測試(t test)方法評估，單獨尿酸的總訊號值，與尿酸分別加上下列干擾物質的其中之一的總訊號值，包含尿素、乳酸、葡萄糖、半胱胺酸、酪胺酸、肌酸酐，以及丙酮酸其中之一的量測訊號值，並無明顯差異。亦即t 測試結果顯示這些物質並沒有造成明顯的干擾效應。雖然抗壞血酸、谷氨酸、組氨酸、多巴、多巴胺的干擾度大，然而這些物質在人體血液中的濃度通常非常低。因此，本實施例尿酸偵測電極用於人體尿液中尿酸測試，受干擾的程度很小。
電極的長期穩定度
本發明實施例的尿酸偵測電極，是以下列五種特性或參數展現：氧化電位、靈敏度、偵測極限、反應時間，以及標準添品加檢量線的最大線性濃度範圍，其結果顯示在圖4中。以1.19 mM的尿酸以及用於製作標準品添加檢量線的尿酸濃度，進行循環伏安分析，獲得氧化電位，而濃度0-2.38 mM所獲得的線性檢量線可用於其他四個參數。實驗期間為209天，每個星期測試一次。每次測試後，電極儲存在0.1 M、pH 7.0的磷酸鈉緩衝溶液(NaPB)中，並置於冰箱，溫度4℃。圖4A顯示尿酸偵測電極的氧化電位變化。初始時具有較高的氧化電位0.361 V和0.366 V，100天之後逐漸降低至0.320 V。總體而言，尿酸偵測電極的尿酸偵測電位在一長期的期間內，具有相當穩定的量測電位。
圖4B顯示本實施例尿酸偵測電極，在長期使用期間內的訊號感應時間變化。如圖顯示，在大約0.60 mM低濃度(100 ppm)測試時，感應時間快至5秒。在高濃度(＞100 ppm)尿酸測試時，感應時間，一開始為10 s，接著增加至15 s至20 s。總體而言，在長期使用期間，感應時間很穩定，且多數時候偵測高濃度的感應時間維持在15 s。
圖4C顯示本實施例尿酸偵測電極，在長期使用期間標準檢量線的最大線性濃度的變化，其中最大線性濃度以r2 ＞0.995為準則。結果顯示，在209天的期間內，最大線性濃度多數可維持在2.38 mM。因線性標準品添加檢量線的斜率即為電極的靈敏度，故圖4D顯示本實施例尿酸偵測電極，在長期使用期間靈敏度的變化。在測試期間初期，靈敏度可高達 72.8 μA M-1 ；在全部測試期間，靈敏度皆大於 35 μA M-1 。總體而言，靈敏度大約在50 μA M-1 左右變化。
圖4E顯示本實施例尿酸偵測電極，在長期使用期間偵測極限值的變化。在166天之前的測試，偵測極限值在 1.2 μM至6.0 μM之間變化，但大部份的偵測極限值維持在大約2.4 μM。在177天之後，偵測極限值上升到20.2 μM，之後又掉回10 μM。注意到靈敏度與偵測極限值之間似乎沒有太大關聯。某些實驗參數，例如攪拌速率、溫度可能是最影響偵測極限值的因素。實驗顯示本發明尿酸偵測電極在長期使用後，仍具有十分良好的偵測極限值。其中，在試驗309天(數據未顯示於圖中)後，本實施例尿酸偵測電極仍可使用，其氧化電位為0.338 V，反應時間為5-15 s，可偵測線性尿酸濃度範圍為0-1.78 mM (r 2 = 0.9946)，靈敏度為77.6 μA M-1 ，以及偵測極限值為13.8 μM。這些數據證明了本發明實施例尿酸偵測電極的長期穩定性良好，且長期使用尿酸酵素的活性不會降低。
表二列出利用本發明實施例尿酸偵測電極，以標準品添加法測試四個人體尿液樣本的測試結果。尿酸濃度從0.380 mM至2.860 mM。由於相對標準偏差(related standard deviations)小於2.4%，證明本發明的尿酸偵測電極具有高精確度。
表三列出利用本發明實施例尿酸偵測電極，分析四個人體尿液樣本的準確度以及標準品添加的回收率。測試結果，準確度皆大於85.6%，證明本實施例尿酸偵測電極可實際用於人體尿液尿酸偵測。
尿酸偵測電極的效能比較
表三列出本發明實施例尿酸偵測電極，與其他7個文獻尿酸偵測電極的效能比較。這八種尿酸偵測電極，所使用的電極材料主要有三種，包含高分子薄膜(Arora et al., 2007)，金屬(Huang, et al., 2013; Rawal et al., 2012; Chauhan and Pundir, 2011; 本發明)，以及碳(Dey and Raj, 2013; Piermarini, et al., 2013; Kanyong et al., 2012)。然而，近年來的進階發展，多數尿酸偵測電極的製作均使用複合材料，以增加電極的效能。這些文獻的尿酸酵素固定化方法，包含物理吸附或化學鍵結，但絕大多數沒有使用氧化還原媒介物，以替代O2 去氧化尿酸，因此不僅需要更高的氧化電位使接續的H2 O2 氧化，也容易因為空氣中O2 含量波動導致量測誤差變大。由表四可清楚看出，有使用二茂鐵為氧化還原媒介物的兩個電極(Dey and Raj, 2013；本發明)，直接氧化尿酸，具有相當低的氧化電位。在本發明實施例中，氧化還原媒介物和尿酸酵素(尿素酶)被同時鍵結在電極上，在低尿酸濃度時，感應時間僅5 s，而高尿酸濃度時，感應時間為15 s。相較於其他電極，顯得更快速。表四的結果亦可看出，本發明實施例的尿酸偵測電極，具有更寬廣的標準品添加檢量線的線性濃度範圍(0.0-2.38 mM,r 2 ≥ 0.9952)，理想的偵測極限值(約2.4 μM)，並在209天測試期間中保持靈敏度。本發明實施例的尿酸偵測電極的再使用性，優於文獻的其他電極，在臨床上具有長期重複使用的潛力。
以上所述僅為本發明之較佳實施例而已，並非用以限定本發明之申請專利範圍；凡其他未脫離本發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請專利範圍內。
【主要元件符號說明】
10‧‧‧漆包銅線
12‧‧‧銅線
14‧‧‧金表面
14A‧‧‧第一修飾表面
14B‧‧‧第二修飾表面
14C‧‧‧第三修飾表面
14D‧‧‧第四修飾表面
16‧‧‧電極
16A‧‧‧第一修飾電極
16B‧‧‧第二修飾電極
16C‧‧‧第三修飾電極
16D‧‧‧第四修飾電極
圖1顯示根據本發明較佳實施例的尿酸偵測電極與其製造方法。
圖2顯示在圖1中，於每個製作步驟的FTIR頻譜，分別是(A)漆包銅線(B)金粒子修飾電極表面(C)以甲硫胺酸修飾後的電極表面(D)以二茂鐵甲醛修飾後的電極表面(E)以N ,N ’-二環己基碳化二亞胺修飾後的電極表面(F)鍵結尿酸酵素後的電極表面(G)純尿酸酵素粉末。
圖3A顯示根據本發明較佳實施例的尿酸偵測電極的循環伏安圖譜。
圖3B顯示根據本發明較佳實施例的尿酸偵測電極的標準品添加測得的電流-時間圖。
圖3C顯示根據本發明較佳實施例的尿酸偵測電極的標準品添加檢量線。
圖4顯示根據本發明較佳實施例的尿酸偵測電極的長期穩定度。分別為(A)氧化電位(B)感應時間(C)最大線性濃度範圍(D)靈敏度(E)偵測極限值。
10‧‧‧漆包銅線
12‧‧‧銅線
14‧‧‧金表面
14A‧‧‧第一修飾表面
14B‧‧‧第二修飾表面
14C‧‧‧第三修飾表面
14D‧‧‧第四修飾表面
16‧‧‧電極
16A‧‧‧第一修飾電極
16B‧‧‧第二修飾電極
16C‧‧‧第三修飾電極
16D‧‧‧第四修飾電極

Claims (10)

  1. 一種尿酸偵測電極的製造方法，包含下列順序步驟：提供一金屬基材；形成一金表面於該金屬基材表面上，以形成一電極；以L-甲硫胺酸(L-methionine)修飾該金表面，使金粒子與L-甲硫胺酸中的甲基硫基(methylsulfanyl group)形成共價鍵結，並且形成一具有第一修飾表面的第一修飾電極；以一包含醛基(aldehyde group)的氧化還原媒介物與L-甲硫胺酸的胺基形成一席夫鹼(聚甲亞胺)(Schiff Base)共價鍵結，並形成一具有一第二修飾表面的第二修飾電極；以N ,N ’-二環己基碳化二亞胺(N ,N '-dicyclohexylcarbodiimide)修飾該第二修飾表面，該N ,N ’-二環己基碳化二亞胺與L-甲硫胺酸的羧基(carboxyl group)形成共價鍵結，並形成一具有一第三修飾表面的第三修飾電極；以及以該第三修飾表面與尿酸酵素接觸，使得尿酸酵素與L-甲硫胺酸的羧基(carboxyl group)形成醯胺鍵(amide bond)共價鍵結，以形成一具有一第四修飾表面的第四修飾電極。
  2. 如申請專利範圍第1項的製造方法，其中該金屬基材為銅。
  3. 如申請專利範圍第1項的製造方法，其中該氧化還原媒介物包含二茂鐵甲醛(ferrocene carboxaldehyde)。
  4. 一種尿酸偵測電極，包含：一基材結構，具有一金屬表面； 一金表面形成在該金屬表面的至少一部份上；一L-甲硫胺酸透過一甲基硫基(methylsulfanyl group)與該金表面鍵結；一氧化還原媒介物包含一醛基(aldehyde group)，該媒介物與該L-甲硫胺酸的胺基形成一席夫鹼(聚甲亞胺)(Schiff Base)；以及一尿酸酵素透過一具有二亞胺(diimide)的肽鍵連接劑(peptide coupling agent)與該胺基酸鍵結，其中該尿酸酵素與該肽鍵連接劑形成一醯胺鍵(amide bond)。
  5. 如申請專利範圍第4項的尿酸偵測電極，其中該肽鍵連接劑係N ,N ’-二環己基碳化二亞胺(N ,N '-dicyclohexylcarbodiimide)。
  6. 如申請專利範圍第4項的尿酸偵測電極，其中該氧化還原媒介物包含二茂鐵甲醛(ferrocene carboxaldehyde)。
  7. 如申請專利範圍第4項的尿酸偵測電極，其中該金屬表面為銅表面。
  8. 如申請專利範圍第4項的尿酸偵測電極，可重複使用209天，其氧化還原電位維持在大約0.33V。
  9. 如申請專利範圍第4項的尿酸偵測電極，可重複使用209天，其靈敏度維持在大約50μA M-1 。
  10. 如申請專利範圍第4項的尿酸偵測電極，可重複使用209天，其偵測極限值維持在20.2μM以下。
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