JP2015215323A - 尿酸の検出電極及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】尿酸の検出電極及びその製造方法を提供する。【解決手段】本発明の実施形態に係る第２世代の尿酸の検出電極は、少なくともウリカーゼと媒体とを同時に電極上で結合させることを特徴とする。製造される検出電極は長期間使用でき、ウリカーゼの活性も低下しない。実務上、製造される電極は尿液中の尿酸濃度の計測に成功し、計測結果は良好な精度及び確度を誇り、干渉も少ない。本発明に係る尿酸の検出電極は臨床にも使用できる。【選択図】図１
Description
本発明は、尿酸の検出電極、その製造方法及びその応用に関する。
尿酸（ｕｒｉｃ ａｃｉｄ）は尿液及び血液中に存在する窒素を含有する物質であり、人体のプリン体（ｐｕｒｉｎｅ）の新陳代謝で発生する主な老廃物である。健康的な人では、血液中の正常な尿酸値は２４０―５２０μＭであり、尿液中の正常な尿酸値は０．２１４ｍＭ―４．４ｍＭである。
血液中或いは尿液中の尿酸濃度が高過ぎると痛風、高尿酸血症、レッシュ・ナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、及び腎臓病等に繋がる。故に、これら高い尿酸濃度が引き起こす疾病を予防、診断、或いは治療するために、尿酸濃度の計測が非常に重要である。
血液中或いは尿液中の尿酸濃度が高過ぎると痛風、高尿酸血症、レッシュ・ナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、及び腎臓病等に繋がる。故に、これら高い尿酸濃度が引き起こす疾病を予防、診断、或いは治療するために、尿酸濃度の計測が非常に重要である。
尿酸を分析する方法は、分光測光法（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）、酵素法（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、 ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフ質量分析、キャピラリー電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、化学発光分析（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、蛍光分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、燐光分析（ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、及び電気化学法を含む。
＜参考文献＞
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しかしながら、従来のこれらの方法は時間がかかり、コストも高く、複雑で、特定性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を欠くといった欠点があった。このため、特定性を有し、低コストで、操作が容易で、簡単且つ高速な方法を開発する必要があった。先ずウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ或いはｕｒａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ、ＵＯｘ）を使用し尿酸を検出する方法を１９４１年にＢｕｌｇｅｒ等 ［１］が開発し、彼らはウリカーゼを使用し尿酸の減少を計測した。
長期的且つ安定的に重複して使用可能なウリカーゼ電極を発展する場合、ウリカーゼを電極に固定させることが最重要な要素になる。多くの酵素固定方式が存在し、例えば、物理吸着法［２―７］、包括固定法（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）［８―９］、自己組織化単分子膜法［１０―１１］、架橋結合法［１２―１３］、化学結合法［１４―１５］等がある。
物理吸着法は簡単ではあるが、但し酵素が電極から容易に剥離し、電極の寿命が短かった。自己組織化単分子膜法及び包括固定法も類似の問題がある。このため、架橋結合法或いは化学結合法が酵素を固定するための理想的な方式であり、電極の効果を増強させ、耐用年数を延ばす（ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ）。
物理吸着法は簡単ではあるが、但し酵素が電極から容易に剥離し、電極の寿命が短かった。自己組織化単分子膜法及び包括固定法も類似の問題がある。このため、架橋結合法或いは化学結合法が酵素を固定するための理想的な方式であり、電極の効果を増強させ、耐用年数を延ばす（ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ）。
酵素電極の電極材料も重要であり、酵素の固定強度、電流の出力、及び製造コストに影響を与える。電極材料は金属及び非金属カーボンの２種類を含む。修飾される金属電極、例えば、酸化亜鉛が塗布される金電極［６］、多層カーボンナノチューブ（ｍｕｌｔｉ−ｗａｌｌｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅ、ＭＷＣＮＴ）が修飾される金電極［１５］、カルボキシル化多層カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ＭＷＣＮＴ）及びポリアニリン（ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ）導電高分子が修飾される金電極［５］、酸化銅薄膜が修飾される銀電極［３］、及び金ナノ粒子が修飾される３―アミノプロピルトリエトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ 、ＡＰＴＥＳ）自己組織化単分子膜が塗布される酸化インジウムすず電極［１４］等がウリカーゼ電極の固定化の為に使用されている。
金属材料は高価なため、カーボンベースの非金属材料も徐々にウリカーゼ電極に使用され始めている。例えば、グラッシーカーボン電極に自己組織化ウリカーゼがチオニン−酸化グラフェンに混合されるハイブリッドナノシート（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ＵＯｘ ｍｉｘｅｄ ｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｇｒａｐｈｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｓｈｅｅｔｓ）［１１］、グラファイトディスク紺青―ニッケルイオン薄膜（Ｐｒｕｓｓｉａｎ ｂｌｕｅ−Ｎｉ２＋ ｆｉｌｍ）修飾電極［１６］、サンドイッチ構造の電流式シルクスクリーンカーボン電極［４］、フェロセン修飾酸化グラフェンシルクスクリーン電極［７］、及びシルクスクリーンイリジウムが修飾されるカーボン電極［１３］等である。
金属材料は高価なため、カーボンベースの非金属材料も徐々にウリカーゼ電極に使用され始めている。例えば、グラッシーカーボン電極に自己組織化ウリカーゼがチオニン−酸化グラフェンに混合されるハイブリッドナノシート（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ＵＯｘ ｍｉｘｅｄ ｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｇｒａｐｈｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｓｈｅｅｔｓ）［１１］、グラファイトディスク紺青―ニッケルイオン薄膜（Ｐｒｕｓｓｉａｎ ｂｌｕｅ−Ｎｉ２＋ ｆｉｌｍ）修飾電極［１６］、サンドイッチ構造の電流式シルクスクリーンカーボン電極［４］、フェロセン修飾酸化グラフェンシルクスクリーン電極［７］、及びシルクスクリーンイリジウムが修飾されるカーボン電極［１３］等である。
尿酸は電気活性化合物であり、電極の水溶液中でウリカーゼ（ＵＯｘ）により容易に酸化されてアラントイン（ａｌｌａｎｔｏｉｎ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、及び二酸化炭素［１７］を発生させる。
尿酸＋２Ｈ２Ｏ＋Ｏ２ＵＯｘＡｌｌａｎｔｏｉｎ＋Ｈ２Ｏ２＋ＣＯ２
発生する過酸化水素は作用電極表面で酸化作用により、放出された電流を検出し尿酸の濃度を割り出す。
Ｈ２Ｏ２→Ｏ２＋２Ｈ＋＋ｅ―
Ｈ２Ｏ２→Ｏ２＋２Ｈ＋＋ｅ―
しかしながら、過酸化水素需に必要な酸化電位は通常非常に高く（＞０．４０Ｖ）、他の電気活性物質、例えばアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）も溶液中で酸化してしまい、尿酸の分析に干渉を与えた。この問題の解決方法として、酸化還元媒体（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を利用し酸素を代替し尿酸の酸化電位を低減させ、不必要な干渉を減少させる方法がある。同時に、分析過程で、空気圧の波動が分析の確度に影響を与えないようにする。近年、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ、 Ｆｃ）も酸化還元媒体として汎く用いられている。例えば、フェロセンを含有する酸化還元媒体を、プラチナ電極の表面にピロール（ｐｙｒｒｏｌｅ）電気重合（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を施工し、ポリマー薄膜を形成させ、ウリカーゼ［１７］を固定させる。フェロセンカルボキシアルデヒドが酸化グラフェンに化学結合され、シルクスクリーン電極（ｓｃｒｅｅｎ ｐｒｉｎｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）に塗布され、ウリカーゼを固定させ、血清中の尿酸［７］を計測させる。
本発明者は以前鉛筆の芯によりブドウ糖検出電極を製造しており（特許文献１参考）、良好な効果を有する。
本発明者は以前鉛筆の芯によりブドウ糖検出電極を製造しており（特許文献１参考）、良好な効果を有する。
そこで、本発明者は上記の欠点が改善可能と考え、鋭意検討を重ねた結果、合理的設計で上記の課題を効果的に改善する本発明の提案に到った。
本発明は、このような従来の問題に鑑みてなされたものである。上記課題解決のため、本発明は、良好な安定性及び重複使用可能な尿酸の検出電極及びその製造方法を提供することを主目的とする。
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る尿酸の検出電極の製造方法は、金属基材を提供する工程と、前記金属基材の表面に金の表面を形成させることで、電極を形成させる工程と、Ｌ―メチオニン（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）により前記金の表面を修飾させ、金粒子とＬ―メチオニン内のメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）との共有結合を形成させ、第一修飾表面を有する第一修飾電極を形成させる工程と、アルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）を含有する酸化還元媒体とＬ―メチオニンのアミノによりシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ Ｂａｓｅ）共有結合を形成させ、且つ第二修飾表面を有する第二修飾電極を形成させる工程と、Ｎ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）により前記第二修飾表面を修飾させ、前記Ｎ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドとＬ―メチオニン的カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）との共有結合を形成させ、第三修飾表面を有する第三修飾電極を形成させる工程と、前記第三修飾表面とウリカーゼとを接触させることで、ウリカーゼとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とのアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）共有結合を形成させ、第四修飾表面を有する第四修飾電極を形成させる工程を順に含むことを特徴とする。
請求項４に記載の尿酸の検出電極は、金属表面を有する基材構造と、前記金属表面の少なくとも一部分に形成される金の表面と、Ｌ―メチオニンがメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）により前記金の表面に結合されることと、アルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）を含有する酸化還元媒体であり、前記酸化還元媒体と前記Ｌ―メチオニンのアミノとのシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ Ｂａｓｅ）を形成させることと、ウリカーゼはジイミド（ｄｉｉｍｉｄｅ）を有するペプチド結合剤（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）により前記アミド酸と結合され、前記ウリカーゼと前記ペプチド結合剤とがアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成させる尿酸酵素ことを特徴とする。
本発明における好適な実施の形態について、添付図面を参照して説明する。尚、以下に説明する実施の形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を限定するものではない。また、以下に説明される構成の全てが、本発明の必須要件であるとは限らない。
（第１実施形態）
以下、第１実施形態を図１〜４に基づいて説明する。図１は本発明に係る尿酸の検出電極及びその製造方法を示す。以下の６つの工程を含む。工程（Ｉ）では、線材が軸上に巻かれ長さ約３センチメートルのエナメル銅線１０（ｅｎａｍｅｌｅｄ ｃｏｐｐｅｒ ｗｉｒｅ）が裁断され、カッターで両端約０．８ｃｍのポリイミド層が除去され、粗めのサンドペーパーで研磨され、銅１２が露出される。
以下、第１実施形態を図１〜４に基づいて説明する。図１は本発明に係る尿酸の検出電極及びその製造方法を示す。以下の６つの工程を含む。工程（Ｉ）では、線材が軸上に巻かれ長さ約３センチメートルのエナメル銅線１０（ｅｎａｍｅｌｅｄ ｃｏｐｐｅｒ ｗｉｒｅ）が裁断され、カッターで両端約０．８ｃｍのポリイミド層が除去され、粗めのサンドペーパーで研磨され、銅１２が露出される。
工程（ＩＩ）では、上述の銅線をテトラクロロ金酸塩（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｕｒａｔｅ）水溶液に入れ、電圧を加え、テトラクロロ金酸塩を金粒子に還原させて銅１２の表面に沈着させ、金の表面１４を有する電極１６を形成させる。本工程の製造条件は温度約２８℃、電圧約２．０Ｖで約２時間かかる。続いて、水で電極１６を洗浄し、電極１６の表面の未還原の金化合物を洗い落とす。
工程（ＩＩＩ）では、電極１６を例えばＬ―メチオニン（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）溶液等の２５℃の濃度２０．０ｍＭのアミノ酸溶液に１時間浸し、金粒子とＬ―メチオニン中のメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合される第一修飾表面１４Ａを形成させ、且つ第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを形成させる。次に、２５℃の脱イオン水で第一修飾電極１６Ａを洗浄し、金の表面１４上の物理的に付着したＬ―メチオニンを除去する。
工程（ＩＶ）では、第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを７５℃の濃度２０．０ｍＭのフェロセンカルボキシアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ、 ＦｃＡｌｄ、体積比９９．５／０．５のエタノール／塩化水素に溶解される）溶液中に１時間浸し、媒体（ＦｃＡｌｄ）とＬ―メチオニンのアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）によりシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）共有結合される第二修飾表面１４Ｂを形成させ、第二修飾表面１４Ｂを有する第二修飾電極１６Ｂを形成させる。その後、７５℃で脱イオン水により第二修飾電極１６Ｂを洗浄する。
工程（Ｖ）では、第二修飾電極１６Ｂを４０℃でメチルアルコールに溶解される濃度２０．０ｍＭのＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）溶液中に１時間浸し、Ｎ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合を形成させ、第三修飾表面１４Ｃを形成させ、且つ第三修飾表面を有する第三修飾電極１６Ｃを形成させる。そして、メチルアルコール及び脱イオン水を順に用い、４０℃で第三修飾電極１６Ｃを洗浄し、未反応のＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドを除去する。
工程（ＶＩ）では、第三修飾電極１６Ｃを２５℃で０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、 ＮａＰＢ）に浸し、用意された５０μＭの濃度のウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）溶液中に２４時間浸し、置換反応が発生するとウリカーゼとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とが結合され、アミド結合またはペプチド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）共有結合が形成され、ウリカーゼが第三修飾表面１６Ｃに固定され、第四修飾表面１４Ｄ及び第四修飾表面を有する第四修飾電極１６Ｄとなる。これによって、第四修飾電極１６Ｄは尿酸の検出電極となり、０．１Ｍ、ｐＨ７．０、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液中に保存される。
工程（ＩＩＩ）では、電極１６を例えばＬ―メチオニン（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）溶液等の２５℃の濃度２０．０ｍＭのアミノ酸溶液に１時間浸し、金粒子とＬ―メチオニン中のメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合される第一修飾表面１４Ａを形成させ、且つ第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを形成させる。次に、２５℃の脱イオン水で第一修飾電極１６Ａを洗浄し、金の表面１４上の物理的に付着したＬ―メチオニンを除去する。
工程（ＩＶ）では、第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを７５℃の濃度２０．０ｍＭのフェロセンカルボキシアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ、 ＦｃＡｌｄ、体積比９９．５／０．５のエタノール／塩化水素に溶解される）溶液中に１時間浸し、媒体（ＦｃＡｌｄ）とＬ―メチオニンのアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）によりシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）共有結合される第二修飾表面１４Ｂを形成させ、第二修飾表面１４Ｂを有する第二修飾電極１６Ｂを形成させる。その後、７５℃で脱イオン水により第二修飾電極１６Ｂを洗浄する。
工程（Ｖ）では、第二修飾電極１６Ｂを４０℃でメチルアルコールに溶解される濃度２０．０ｍＭのＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）溶液中に１時間浸し、Ｎ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合を形成させ、第三修飾表面１４Ｃを形成させ、且つ第三修飾表面を有する第三修飾電極１６Ｃを形成させる。そして、メチルアルコール及び脱イオン水を順に用い、４０℃で第三修飾電極１６Ｃを洗浄し、未反応のＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドを除去する。
工程（ＶＩ）では、第三修飾電極１６Ｃを２５℃で０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、 ＮａＰＢ）に浸し、用意された５０μＭの濃度のウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）溶液中に２４時間浸し、置換反応が発生するとウリカーゼとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とが結合され、アミド結合またはペプチド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）共有結合が形成され、ウリカーゼが第三修飾表面１６Ｃに固定され、第四修飾表面１４Ｄ及び第四修飾表面を有する第四修飾電極１６Ｄとなる。これによって、第四修飾電極１６Ｄは尿酸の検出電極となり、０．１Ｍ、ｐＨ７．０、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液中に保存される。
上述の好ましい実施形態には適当な変更を加えられる。例えば、他の金属材料、或いは銅を代替材料とする、工程（ＩＶ）は工程（Ｖ）或いは工程（ＶＩ）の後に実行する、底の形状を棒状、板状、或いは他の任意の形状とするなどである。
他の実施形態では、金の表面１２の形成方法は沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、インク噴射（ｉｎｋ−ｉｎｊｅｃｔ）、電着（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、シルクスクリーン（ｓｃｒｅｅｎ−ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、或いは他の方法を含む。他のアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）、カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、チオール基（ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐ）を有するアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、或いはＬ―メチオニンを代替させ、但し特性は検証を待つ。他のジイミド構造を有するペプチド結合剤（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によりＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドを代替させる。他のアルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）を有する酸化還元媒体或いはフェロセンカルボキシアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）を代替させる。このほか、製造温度及び各溶液の濃度は適度に変更可能である。
ＦＴＩＲにより尿酸の検出電極の特性を分析する
図２Ａ乃至図２Ｇは図１の各工程を経た後、製造された電極の構造をフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）により分析する。
図２Ａの波数（ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒ）は２３３０ｃｍ―１の箇所に１つの極弱い反射波頂を有し、これはポリイミドエナメル銅導線からポリイミド外膜を除去した後、銅導線に残留するポリイミドによるものである。前記反射波頂はポリイミドのイソシアン酸塩（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、ｎｅａｒ ２２７０ｃｍ−１）の振動モードである。
図２Ｂでは、金粒子が銅導線の表面に電着された後、赤外スペクトラムの信号はない。
図２Ｃは、Ｌ―メチオニンが金粒子に結合された後のスペクトラムである。前記スペクトラムの波数３０００―２８４０ｃｍ―１の反射波頂はＬ―メチオニンのアルカン（ａｌｋａｎｅ）の強Ｃ―Ｈ伸展振動を表し、波数１４６５ｃｍ―１の反射波頂はＬ―メチオニンのメチレン基（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｒｏｕｐ、−ＣＨ２−）の湾曲振動を表し、波数１３７５ｃｍ―１の反射波頂はメチル基の湾曲振動を表し、波数１６００ｃｍ―１（非対称）及び１４００ｃｍ―１（対称）の反射波頂はＬ―メチオニンのカルボン酸塩（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）の強伸展振動を表し、波数３３００―２６００ｃｍ―１の反射波頂はＬ―メチオニンのアミン塩のＮ―Ｈワイド伸展振動を表し、波数１６１０ｃｍ―１（非対称）及び１５００ｃｍ―１（対称）の反射波頂はＬ―メチオニンの１級アミン塩（ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｉｎｅ ｓａｌｔｓ）の強Ｎ―Ｈ湾曲振動を表す。
図２Ｄはフェロセンカルボキシアルデヒド（ＦｃＡｌｄ）のアセトアルデヒド基がＬ―メチオニンのアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）を修飾させた後のＦＴＩＲスペクトラムを表し、波数１６９０―１６４０ｃｍ―１の反射波頂はフェロセン環のイミン（ｉｍｉｎｅ、Ｒ２Ｃ＝Ｎ−Ｒ）の伸展振動を表し、波数１６５０―１６１１ｃｍ―１の反射波頂はフェロセン（Ｆｃ）環の内Ｃ＝Ｃ二重結合の伸展振動を表す。このほか、波数１０００―６５０ｃｍ―１はフェロセン（Ｆｃ）環の＝Ｃ―Ｈの平面外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｌａｎｅ）の湾曲を表す。
図２ＥはＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）とがエステル結合を形成させた後のＦＴＩＲスペクトラムを表す。波数１３５０―１０００ｃｍ―１の反射波頂はＣ−Ｎの伸展振動を表す。波数１３００―１０００ｃｍ―１の反射波頂はＣ―Ｏの伸展振動を表す。波数１６９０―１６４０ｃｍ―１の反射波頂はイミン（ｉｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）の伸展振動を表す。波数３０００―２８４０ｃｍ―１の反射波頂はＣ―Ｈの伸展振動を表す。このほか、波数１６００ｃｍ―１（非対称）及び１４００ｃｍ―１（対称）の反射波頂は反応がカルボン酸塩の伸展振動を弱めたことを示す。
図２ＦはＬ―メチオニンとウリカーゼとが置換反応後にアミド結合（-ＣＯ-ＮＨ-、ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成させた後のＦＴＩＲスペクトラムを表し、波数１６８０―１６３０ｃｍ―１のそれぞれの反射波頂はＣ＝Ｏの伸展振動を表し、波数３４７５―３１５０ｃｍ―１の反射波頂はＮ―Ｈの伸展振動を表す。ウリカーゼはＤＣＣ及びウリカーゼのペプチド結合（アミド酸）フレームを代替させて形成される。また、波数１６４０―１５５０ｃｍ―１の反射波頂はアミド結合のＮ―Ｈ湾曲振動を表す。
図２Ｇは純ウリカーゼのＦＴＩＲスペクトラムを表し、図２Ｇと図２Ｆとを比較し、ウリカーゼの電極への結合が成功したかを検証する。
図２Ａ乃至図２Ｇは図１の各工程を経た後、製造された電極の構造をフーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）により分析する。
図２Ａの波数（ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒ）は２３３０ｃｍ―１の箇所に１つの極弱い反射波頂を有し、これはポリイミドエナメル銅導線からポリイミド外膜を除去した後、銅導線に残留するポリイミドによるものである。前記反射波頂はポリイミドのイソシアン酸塩（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、ｎｅａｒ ２２７０ｃｍ−１）の振動モードである。
図２Ｂでは、金粒子が銅導線の表面に電着された後、赤外スペクトラムの信号はない。
図２Ｃは、Ｌ―メチオニンが金粒子に結合された後のスペクトラムである。前記スペクトラムの波数３０００―２８４０ｃｍ―１の反射波頂はＬ―メチオニンのアルカン（ａｌｋａｎｅ）の強Ｃ―Ｈ伸展振動を表し、波数１４６５ｃｍ―１の反射波頂はＬ―メチオニンのメチレン基（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｒｏｕｐ、−ＣＨ２−）の湾曲振動を表し、波数１３７５ｃｍ―１の反射波頂はメチル基の湾曲振動を表し、波数１６００ｃｍ―１（非対称）及び１４００ｃｍ―１（対称）の反射波頂はＬ―メチオニンのカルボン酸塩（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）の強伸展振動を表し、波数３３００―２６００ｃｍ―１の反射波頂はＬ―メチオニンのアミン塩のＮ―Ｈワイド伸展振動を表し、波数１６１０ｃｍ―１（非対称）及び１５００ｃｍ―１（対称）の反射波頂はＬ―メチオニンの１級アミン塩（ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｉｎｅ ｓａｌｔｓ）の強Ｎ―Ｈ湾曲振動を表す。
図２Ｄはフェロセンカルボキシアルデヒド（ＦｃＡｌｄ）のアセトアルデヒド基がＬ―メチオニンのアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）を修飾させた後のＦＴＩＲスペクトラムを表し、波数１６９０―１６４０ｃｍ―１の反射波頂はフェロセン環のイミン（ｉｍｉｎｅ、Ｒ２Ｃ＝Ｎ−Ｒ）の伸展振動を表し、波数１６５０―１６１１ｃｍ―１の反射波頂はフェロセン（Ｆｃ）環の内Ｃ＝Ｃ二重結合の伸展振動を表す。このほか、波数１０００―６５０ｃｍ―１はフェロセン（Ｆｃ）環の＝Ｃ―Ｈの平面外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｌａｎｅ）の湾曲を表す。
図２ＥはＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）とがエステル結合を形成させた後のＦＴＩＲスペクトラムを表す。波数１３５０―１０００ｃｍ―１の反射波頂はＣ−Ｎの伸展振動を表す。波数１３００―１０００ｃｍ―１の反射波頂はＣ―Ｏの伸展振動を表す。波数１６９０―１６４０ｃｍ―１の反射波頂はイミン（ｉｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）の伸展振動を表す。波数３０００―２８４０ｃｍ―１の反射波頂はＣ―Ｈの伸展振動を表す。このほか、波数１６００ｃｍ―１（非対称）及び１４００ｃｍ―１（対称）の反射波頂は反応がカルボン酸塩の伸展振動を弱めたことを示す。
図２ＦはＬ―メチオニンとウリカーゼとが置換反応後にアミド結合（-ＣＯ-ＮＨ-、ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成させた後のＦＴＩＲスペクトラムを表し、波数１６８０―１６３０ｃｍ―１のそれぞれの反射波頂はＣ＝Ｏの伸展振動を表し、波数３４７５―３１５０ｃｍ―１の反射波頂はＮ―Ｈの伸展振動を表す。ウリカーゼはＤＣＣ及びウリカーゼのペプチド結合（アミド酸）フレームを代替させて形成される。また、波数１６４０―１５５０ｃｍ―１の反射波頂はアミド結合のＮ―Ｈ湾曲振動を表す。
図２Ｇは純ウリカーゼのＦＴＩＲスペクトラムを表し、図２Ｇと図２Ｆとを比較し、ウリカーゼの電極への結合が成功したかを検証する。
サイクリックボルタンメトリー分析
サイクリックボルタンメトリー分析（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ、 ＣＶ）により本発明の実施形態で準備される尿酸の検出電極の酸化電位を獲得する。分析の電位のスキャン範囲は―０．８から０．８Ｖであり、スキャン速度は５０ｍＶ ｓ―１である。分析サンプルは９種の尿酸標準溶液であり、濃度はそれぞれ０．０ｍＭ、０．５９５ｍＭ、１．１９ｍＭ、１．７９ｍＭ、２．３８ｍＭ、２．９８ｍＭ、３．５７ｍＭ、４．１７ｍＭ、４．７６ｍＭであり、０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を利用する。サイクリックボルタンメトリー分析の温度は３５℃である。
サイクリックボルタンメトリー分析（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ、 ＣＶ）により本発明の実施形態で準備される尿酸の検出電極の酸化電位を獲得する。分析の電位のスキャン範囲は―０．８から０．８Ｖであり、スキャン速度は５０ｍＶ ｓ―１である。分析サンプルは９種の尿酸標準溶液であり、濃度はそれぞれ０．０ｍＭ、０．５９５ｍＭ、１．１９ｍＭ、１．７９ｍＭ、２．３８ｍＭ、２．９８ｍＭ、３．５７ｍＭ、４．１７ｍＭ、４．７６ｍＭであり、０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を利用する。サイクリックボルタンメトリー分析の温度は３５℃である。
図３Ａは上述の３種の標準溶液のサイクリックボルタンメトリー分析図であり、曲線ａ乃至曲線ｉはそれぞれ９種の尿酸標準溶液（０．０ｍＭ、０．５９５ｍＭ、１．１９ｍＭ、１．７９ｍＭ、２．３８ｍＭ、３．５７ｍＭ、４．１７ｍＭ、及び７．７６ｍＭ）のサイクリックボルタンメトリーの曲線であり、矢印はスキャンの方向を示す。
図から観察できる酸化還元媒体（ｍｅｄｉａｔｏｒ）の酸化及び還原電位はそれぞれ０．２３９Ｖ及び―０．２３２Ｖである。尿酸濃度が増加すると、媒体の陽極の電流の波頂は広大になり、酸化電位も増加する。尿酸濃度が増加すると、酸化電位は０．２３９Ｖから０．４４９Ｖに増える。ＮａＰＢ緩衝背景溶液の酸化及び還原電流の波頂は、それぞれ０．０４４Ｖ及び―０．０４２Ｖであり、これは尿酸濃度が増加（曲線ａから曲線ｉ）したためであり、対応する水素イオンの酸化及び還原が減少する原因でもある。
ＮａＰＢ背景溶液の陽極の電流の波頂は―０．６１Ｖであり、これは尿酸濃度が増加したためであり、Ｈ２Ｏの還原も減少する。Ｈ２Ｏの還原によりＨ２及びＯＨ―が発生し、Ｈ＋が還原されてＨ２になるのを抑制させる。然しながら、尿酸濃度が増加し、ＯＨ―及びＨ＋が中和しＨ＋の還原電流の波頂も減少する。実験中サイクリックボルタンメトリー分析に於いて、プラチナ対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）から泡が出る現象が観察された。ここから推察すると、作用電極に以下の反応が発生している。
尿酸＋２Ｈ２Ｏ＋ウリカーゼ（ＯＸ）→Ａｌｌａｎｔｏｉｎ＋ＣＯ２＋２Ｈ＋＋ウリカーゼ（ｒｅｄ）
ウリカーゼ（ｒｅｄ）＋２ＦｃＡｌｄ＋Ｄウリカーゼ（ＯＸ）＋２ＦｃＡｌｄ
２ＦｃＡｌｄＤ２ＦｃＡｌｄ＋＋２ｅ―
ＮａＰＢ背景溶液の陽極の電流の波頂は―０．６１Ｖであり、これは尿酸濃度が増加したためであり、Ｈ２Ｏの還原も減少する。Ｈ２Ｏの還原によりＨ２及びＯＨ―が発生し、Ｈ＋が還原されてＨ２になるのを抑制させる。然しながら、尿酸濃度が増加し、ＯＨ―及びＨ＋が中和しＨ＋の還原電流の波頂も減少する。実験中サイクリックボルタンメトリー分析に於いて、プラチナ対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）から泡が出る現象が観察された。ここから推察すると、作用電極に以下の反応が発生している。
尿酸＋２Ｈ２Ｏ＋ウリカーゼ（ＯＸ）→Ａｌｌａｎｔｏｉｎ＋ＣＯ２＋２Ｈ＋＋ウリカーゼ（ｒｅｄ）
ウリカーゼ（ｒｅｄ）＋２ＦｃＡｌｄ＋Ｄウリカーゼ（ＯＸ）＋２ＦｃＡｌｄ
２ＦｃＡｌｄＤ２ＦｃＡｌｄ＋＋２ｅ―
標準添加校正検量線
標準添加校正検量線により尿酸の検出電極の感度を獲得し、限界値（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＬＯＤ）及び線形濃度の検出範囲を検出する。標準添加校正検量線は標準添加法［１９］により３５℃で製造される。
標準添加校正検量線により尿酸の検出電極の感度を獲得し、限界値（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＬＯＤ）及び線形濃度の検出範囲を検出する。標準添加校正検量線は標準添加法［１９］により３５℃で製造される。
毎回計測前に、窒素ガスを１０分間通気しリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）から酸素を抜く。計測時には、窒素ガスを持続的に溶液表面に吹き付ける。先ず、０．１Ｍ、ｐＨ９．５のＮａＰＢを準備し濃度４．７６ｍＭの尿酸を溶液に溶かす。４ミリリットルの０．１Ｍ、ｐＨ９．５のＮａＰＢを電気化学電池に入れ、背景溶液とし、磁石で回転速度１００ｒｐｍで攪拌させる。
次に、４０ｓ毎に約５．０μＬから８８５．０μＬの体積の尿酸標準溶液を溶液の濃度が２．３８ｍＭになるまで添加する。毎回標準添加後の最後の３秒間に電流値を読み取る。尿酸濃度が、例えば２．９８ｍＭ、３．５７ｍＭ、及び４．７６ｍＭ等更に高くなる場合、外部標準法を利用して電流信号を計測する。
次に、４０ｓ毎に約５．０μＬから８８５．０μＬの体積の尿酸標準溶液を溶液の濃度が２．３８ｍＭになるまで添加する。毎回標準添加後の最後の３秒間に電流値を読み取る。尿酸濃度が、例えば２．９８ｍＭ、３．５７ｍＭ、及び４．７６ｍＭ等更に高くなる場合、外部標準法を利用して電流信号を計測する。
図３Ｂは本発明の実施形態で用意される尿酸の検出電極を、上述の方法で標準添加校正検量線を行った際の電流―時間曲線である。図示するように、最初１６００ｓの時は電流の変化が小さい。このため、前記一部分の電流―時間曲線を拡大したものが図３Ｂの図である。電極及び容器のサイズのため、実験では標準添加の最高尿酸濃度は２．３８ｍＭに制限される。前記の値を超過した濃度値、例えば、２．９８ｍＭ、３．５７ｍＭ、及び４．７６ｍＭの場合は、それぞれ外部標準法により電流信号を計測する。毎回尿酸標準添加を行った後、約５ｓ以上の時間で電流が安定する。
図３Ｃは尿酸の標準添加校正検量線である。前記検量線は電流信号及び対応する尿酸の標準濃度の線形回帰により獲得する。線形濃度の範囲が０ｍＭから４．７６ｍＭの場合、良好な線形を有し、線形相関係数（ｒ２）は０．９９１２となる。濃度０．００ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０６ｍＭで得られる尿酸の検出電極の検出限界値（ＬＯＤ）は６μＭである。
干渉効果
４ｍＬの濃度０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を、回転速度１００ｒｐｍの磁石で攪拌させた後、背景溶液とする。
次に、濃度０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を用意された２７０ μＬの濃度４．７６ｍＭの尿酸標準溶液に背景溶液を加え、人間の模擬血清の尿酸の正常値である０．３ｍＭの尿酸標準濃度まで希釈する。前記溶液の電流信号値を記録する。
続いて、濃度０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）が調合される１Ｍの干渉物標準溶液から必要な量抽出し、０．３ｍＭの標準溶液にそれぞれ加え、濃度０．１ｍＭから５．０ｍＭの干渉溶液を準備する。各干渉溶液の電流値を記録し、尿酸標準溶液の電流値を比較し、信号比値及び選択性係数（ｋ尿酸、干渉物）を獲得し、干渉の程度を指示し、計算式は以下のようになる。
信号比値＝（信号合計値）尿酸＋干渉物／（信号値）尿酸
ｋ尿酸、干渉物＝（信号値）干渉物／（信号値）尿酸
４ｍＬの濃度０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を、回転速度１００ｒｐｍの磁石で攪拌させた後、背景溶液とする。
次に、濃度０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を用意された２７０ μＬの濃度４．７６ｍＭの尿酸標準溶液に背景溶液を加え、人間の模擬血清の尿酸の正常値である０．３ｍＭの尿酸標準濃度まで希釈する。前記溶液の電流信号値を記録する。
続いて、濃度０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）が調合される１Ｍの干渉物標準溶液から必要な量抽出し、０．３ｍＭの標準溶液にそれぞれ加え、濃度０．１ｍＭから５．０ｍＭの干渉溶液を準備する。各干渉溶液の電流値を記録し、尿酸標準溶液の電流値を比較し、信号比値及び選択性係数（ｋ尿酸、干渉物）を獲得し、干渉の程度を指示し、計算式は以下のようになる。
信号比値＝（信号合計値）尿酸＋干渉物／（信号値）尿酸
ｋ尿酸、干渉物＝（信号値）干渉物／（信号値）尿酸
尿液サンプルの事前処理
尿液サンプルは実験室の研究員から入手する。尿液を取得後、ミクロ細孔膜濾過器により濾過する。濾過後に２ｍＬの尿液サンプルを取得し、０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を十倍希釈する。４つの４ｍＬの上述の希釈尿液サンプルを準備し、定量分析を行う。
尿液サンプルは実験室の研究員から入手する。尿液を取得後、ミクロ細孔膜濾過器により濾過する。濾過後に２ｍＬの尿液サンプルを取得し、０．１Ｍ、ｐＨ９．５のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）を十倍希釈する。４つの４ｍＬの上述の希釈尿液サンプルを準備し、定量分析を行う。
尿液中の尿酸定量分析
各尿液サンプルに対し、４０ｓ毎に４０μＬの濃度４．７６ｍＭの尿酸溶液を４ｍＬの尿液サンプルに添加し、電流信号は尿酸が未添加の尿液サンプル（ｕｎｓｐｉｋｅｄ ｓａｍｐｌｅ）の１．５倍から３倍になる。毎回尿酸を尿液サンプル（ｓｐｉｋｅｄ ｓａｍｐｌｅ）溶液に添加した後の濃度はそれぞれ０．０４７ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１４ｍＭ、及び０．１８ｍＭとなる。
続いて、線形標準添加校正検量線のｘ軸切片値により、希釈の倍数を掛け、原尿液サンプルの尿酸濃度を獲得する。同時に、計測された尿酸濃度の標準偏差値（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）も計算し、分析の精確性を得る。
各尿液サンプルに対し、４０ｓ毎に４０μＬの濃度４．７６ｍＭの尿酸溶液を４ｍＬの尿液サンプルに添加し、電流信号は尿酸が未添加の尿液サンプル（ｕｎｓｐｉｋｅｄ ｓａｍｐｌｅ）の１．５倍から３倍になる。毎回尿酸を尿液サンプル（ｓｐｉｋｅｄ ｓａｍｐｌｅ）溶液に添加した後の濃度はそれぞれ０．０４７ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１４ｍＭ、及び０．１８ｍＭとなる。
続いて、線形標準添加校正検量線のｘ軸切片値により、希釈の倍数を掛け、原尿液サンプルの尿酸濃度を獲得する。同時に、計測された尿酸濃度の標準偏差値（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）も計算し、分析の精確性を得る。
本実施形態に係る尿酸の検出電極の確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）は尿液サンプルに添加された尿酸標準の回収率に基づき計算される。希釈された尿液サンプルは、濃度が相等する尿酸標準溶液が添加された後、それぞれ標準添加法により尿酸標準が尿液サンプル（ｓｐｉｋｅｄ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅ）に添加された理論総尿酸濃度値（［ＵＡ］理論合計値）、及び実際の計測で得られた総尿酸濃度値（［ＵＡ］計測合計値）を獲得する。その後、以下の公式により確度を計算する。
確度＝１―｜（［ＵＡ］計測合計値／［ＵＡ］理論合計値―１）｜×１００％
確度＝１―｜（［ＵＡ］計測合計値／［ＵＡ］理論合計値―１）｜×１００％
最も好ましい反応条件
本実施形態に係る尿酸の検出電極の計測時の最も好ましいリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）のｐＨ値は、固定電圧０．３６１Ｖの条件で標準添加を実行したのちに獲得する。リン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）の濃度は０．１Ｍに固定され、ｐＨ値を７．０から、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５まで変化させ、０．３ｍＭ（５０ｐｐｍ）の尿酸標準溶液の電流値をそれぞれ計測させる。計測温度は均しく３５℃に制御される。
分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計方法及び最小有意差検定（ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｅｓｔ）を用い、獲得された６つの電流計測値の有意差を比較する。ｐＨ７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、及び９．５の計測値はそれぞれ６．７１±０．８３μＡ、 １０．５±１．７７μＡ、 １０．３±３．７５μＡ、 １１．１±２．２７μＡ、 １２．１±１．８２μＡ、 １２．１±０．６５μＡとなる。最大電流と最小相対標準偏差値に基づくと、ｐＨ９．５の計測結果が最も好ましい。
本実施形態に係る尿酸の検出電極の計測時の最も好ましいリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）のｐＨ値は、固定電圧０．３６１Ｖの条件で標準添加を実行したのちに獲得する。リン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）の濃度は０．１Ｍに固定され、ｐＨ値を７．０から、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５まで変化させ、０．３ｍＭ（５０ｐｐｍ）の尿酸標準溶液の電流値をそれぞれ計測させる。計測温度は均しく３５℃に制御される。
分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計方法及び最小有意差検定（ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｅｓｔ）を用い、獲得された６つの電流計測値の有意差を比較する。ｐＨ７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、及び９．５の計測値はそれぞれ６．７１±０．８３μＡ、 １０．５±１．７７μＡ、 １０．３±３．７５μＡ、 １１．１±２．２７μＡ、 １２．１±１．８２μＡ、 １２．１±０．６５μＡとなる。最大電流と最小相対標準偏差値に基づくと、ｐＨ９．５の計測結果が最も好ましい。
本実施形態に係る尿酸の検出電極の計測時の最も好ましい温度は、ｐＨ９．５に固定される条件で標準添加の実行後に得られる。温度の変化の範囲は１５℃から、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃までであり、尿酸標準溶液（０−１．１９ ｍＭ）の電流値をそれぞれ計測させる。獲得された各標準添加線形検量線の、最高感度（４３．０ μＡ ｍＭ−１）及び最低検出限界値（０．００３ ｍＭ）の動作温度は３５℃であり、前記温度値は尿酸の計測のための動作温度である。
表一には本実施形態に係る尿酸の検出電極に干渉を及ぼす幾つかの物質を列挙し、異なる濃度での計測結果を示す。結果は１．７ｍＭの尿素（ｕｒｅａ）、０．５ｍＭの乳酸（ｌａｔｉｃ ａｃｉｄ）、５．０ｍＭのブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、０．１ｍＭのクレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）、１．０ｍＭのピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）に対する干渉が全て１５％より小さく、３．４ｍＭのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、１．０ｍＭのシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、１．０ｍＭのグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、１．０ｍＭのヒスタジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、０．１０ｍＭのチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、 ０．１ｍＭのドーパ（ＤＯＰＡ）、及び ０．１ｍＭのドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）の干渉が大きいことを示す。然しながら、計測の誤差（計測データの標準偏差値）を考慮し、統計技術のｔ検定（ｔ ｔｅｓｔ）方法で評価すると、尿酸単独の総信号値及び尿酸には以下の干渉物質の内の何れか一つの総信号値をそれぞれ加える。
尿素、乳酸、ブドウ糖、システイン、チロシン、クレアチニン、及びピルビン酸の内の何れか一つの計測された信号値を加え、明確な差異はない。ｔ検定の結果はこれら物質が明確に干渉効果を与えていないことを示す。アスコルビン酸、グルタミン酸、ヒスタジン、ドーパ、ドーパミンの干渉は大きいが、然しこれらの物質の人体の血液中での濃度は通常非常に低い。このため、本実施形態に係る尿酸の検出電極が人体の尿液の尿酸の計測に用いられても、受ける干渉の程度は極めて小さい。
尿素、乳酸、ブドウ糖、システイン、チロシン、クレアチニン、及びピルビン酸の内の何れか一つの計測された信号値を加え、明確な差異はない。ｔ検定の結果はこれら物質が明確に干渉効果を与えていないことを示す。アスコルビン酸、グルタミン酸、ヒスタジン、ドーパ、ドーパミンの干渉は大きいが、然しこれらの物質の人体の血液中での濃度は通常非常に低い。このため、本実施形態に係る尿酸の検出電極が人体の尿液の尿酸の計測に用いられても、受ける干渉の程度は極めて小さい。
電極の長期安定性
本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極は、以下の５つの特性或いはパラメータを示す。酸化電位、感度、検出限界、反応時間、及び標準添品加検量線の最大の線形濃度範囲を含み、その結果を図４に示す。
１．１９ｍＭの尿酸及び標準添加検量線を製造する尿酸濃度に用いられ、サイクリックボルタンメトリー分析を行い、酸化電位を獲得し、濃度０―２．３８ｍＭで獲得する線形検量線は他の４つのパラメータに用いられる。実験期間は２０９日であり、毎週一回計測する。毎回計測後に、電極は０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）に保存され、冷蔵庫に温度４℃で保管される。
図４Ａは尿酸の検出電極の酸化電位の変化を示す。初期には０．３６１Ｖ及び０．３６６Ｖの高い酸化電位を有するが、１００日後には０．３２０Ｖまで徐々に低下する。総括すると、尿酸の検出電極の尿酸検出電位は長期間相当安定した計測電位を有すると言える。
本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極は、以下の５つの特性或いはパラメータを示す。酸化電位、感度、検出限界、反応時間、及び標準添品加検量線の最大の線形濃度範囲を含み、その結果を図４に示す。
１．１９ｍＭの尿酸及び標準添加検量線を製造する尿酸濃度に用いられ、サイクリックボルタンメトリー分析を行い、酸化電位を獲得し、濃度０―２．３８ｍＭで獲得する線形検量線は他の４つのパラメータに用いられる。実験期間は２０９日であり、毎週一回計測する。毎回計測後に、電極は０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ）に保存され、冷蔵庫に温度４℃で保管される。
図４Ａは尿酸の検出電極の酸化電位の変化を示す。初期には０．３６１Ｖ及び０．３６６Ｖの高い酸化電位を有するが、１００日後には０．３２０Ｖまで徐々に低下する。総括すると、尿酸の検出電極の尿酸検出電位は長期間相当安定した計測電位を有すると言える。
図４Ｂは本実施形態に係る尿酸の検出電極の、長期の使用期間内での信号の感応時間の変化を示す。図に示すように、約０．６０ｍＭの低濃度（１００ ｐｐｍ）で計測すると、感応時間は５秒と速い。高濃度（＞１００ ｐｐｍ）で尿酸を計測すると、感応時間は最初は１０ｓであるが、次には１５ｓから２０ｓまで増える。総合すると、長期の使用期間に於いて、感応時間は非常に安定しており、またどの時間に於いても高濃度が検出される感応時間は１５ｓを維持させる。
図４Ｃは本実施形態に係る尿酸の検出電極の、長期の使用期間に於ける標準検量線の最大線形濃度の変化を示し、最大線形濃度はｒ２＞０．９９５が標準となる。結果は２０９日の期間内で、最大線形濃度の多くは２．３８ｍＭを維持させる。線形標準添加検量線の斜率は電極の感度を示し、よって図４Ｄは本実施形態に係る尿酸の検出電極の、長期の使用期間に於ける感度の変化を示す。
計測期間の初期には、感度は７２．８μＡ Ｍ―１にも達し、全ての計測期間で感度は共に３５ μＡ Ｍ―１より大きい。全体としては、感度は５０μＡ Ｍ―１前後の変化を示す。
計測期間の初期には、感度は７２．８μＡ Ｍ―１にも達し、全ての計測期間で感度は共に３５ μＡ Ｍ―１より大きい。全体としては、感度は５０μＡ Ｍ―１前後の変化を示す。
図４Ｅは本実施形態に係る尿酸の検出電極の、長期の使用期間での検出限界値の変化を示す。１６６日より前の計測では、検出限界値は１．２μＭから６．０μＭの間で変化するが、但し大部分の検出限界値は約２．４μＭ以上を維持させる。１７７日より後の検出限界値は２０．２μＭまで上昇し、その後１０μＭまで戻る。
注意すべきは、感度と検出限界値との間には大きな関連性は無い点である。ある実験のパラメータでは、例えば、攪拌速度及び温度は検出限界値に最も影響を与える要因となっている。実験は本発明に係る尿酸の検出電極が長期の使用後にも、十分良好な検出限界値を有していることを示す。ここでは、実験の３０９日（データは図示せず）後にも本実施形態に係る尿酸の検出電極が使用可能であり、酸化電位は０．３３８Ｖ、反応時間は５ｓ―１５ｓ、検出線形の尿酸濃度の範囲は０ｍＭ―１．７８ｍＭ（ｒ２ ＝ ０．９９４６）、感度は７７．６μＡ Ｍ―１、及び検出限界値は１３．８μＭである。
これらデータは本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極は長期的に良好な安定性を保ち、また長期間使用後もウリカーゼの活性が低下しないことを証明している。
注意すべきは、感度と検出限界値との間には大きな関連性は無い点である。ある実験のパラメータでは、例えば、攪拌速度及び温度は検出限界値に最も影響を与える要因となっている。実験は本発明に係る尿酸の検出電極が長期の使用後にも、十分良好な検出限界値を有していることを示す。ここでは、実験の３０９日（データは図示せず）後にも本実施形態に係る尿酸の検出電極が使用可能であり、酸化電位は０．３３８Ｖ、反応時間は５ｓ―１５ｓ、検出線形の尿酸濃度の範囲は０ｍＭ―１．７８ｍＭ（ｒ２ ＝ ０．９９４６）、感度は７７．６μＡ Ｍ―１、及び検出限界値は１３．８μＭである。
これらデータは本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極は長期的に良好な安定性を保ち、また長期間使用後もウリカーゼの活性が低下しないことを証明している。
表二には本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極を用い、標準添加法により４人の尿液サンプルを計測した計測結果を示す。尿酸濃度は０．３８０ｍＭから２．８６０ｍＭである。相対標準偏差（ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）は２．４％より小さく、本発明の尿酸の検出電極が高精度を有していることを証明する。
表三は本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極を用い、四人の尿液サンプルを分析した確度及び標準添加の回収率を示す。計測結果は、確度は共に８５．６％より大きく、本実施形態に係る尿酸の検出電極は実際に人の尿液の尿酸の検出に使用可能であることを証明する。
尿酸の検出電極の効果の比較
表三は本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極と、他の７つの文献の尿酸の検出電極の効果の比較である。これら８種類の尿酸の検出電極に使用される電極材料は主に３種類あり、高分子薄膜（Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．、 ２００７）、金属（Ｈｕａｎｇ、 ｅｔ ａｌ．、 ２０１３； Ｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．、 ２０１２； Ｃｈａｕｈａｎ ａｎｄ Ｐｕｎｄｉｒ、 ２０１１； 本発明）、及びカーボン（Ｄｅｙ ａｎｄ Ｒａｊ、 ２０１３； Ｐｉｅｒｍａｒｉｎｉ、 ｅｔ ａｌ．、 ２０１３； Ｋａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、 ２０１２）を含む。しかしながら、近年の目覚しい発展に伴い、複合材料を使用した多くの尿酸の検出電極が製造され、電極効果を増加させている。これら文献のウリカーゼの固定方法は、物理付着或いは化学結合を含み、但し絶対多数は酸化還元媒体を使用しておらず、Ｏ２を酸化尿酸の代替とし、このため更に高い酸化電位により続いてＨ２Ｏ２を酸化させる必要があるのみならず、空気中に含まれるＯ２の波動が大きな計測の誤差を引き起こす。
表四から分かるように、フェロセンを酸化還元媒体の２つの電極（Ｄｅｙ ａｎｄ Ｒａｊ、２０１３；本発明）として使用し、酸化尿酸は直接相当に低い酸化電位を有する。本発明の実施形態では、酸化還元媒体及びウリカーゼが同時に電極に結合され、低い尿酸濃度の場合、感応時間は僅か５ｓであり、高い尿酸濃度の場合、感応時間は１５ｓである。他の電極に比べ、更に高速である。表四の結果からは、本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極は更に広い標準添加検量線の線形濃度の範囲（０．０−２．３８ ｍＭ、 ｒ２ ≧ ０．９９５２）を有していると分かり、理想的な検出限界値（約２．４ μＭ）であり、２０９日の計測期間中も感度を保持させている。本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極の再使用性は、他の文献の電極よりも優れており、臨床でも長期間重複して使用可能な潜在力を有する。
表三は本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極と、他の７つの文献の尿酸の検出電極の効果の比較である。これら８種類の尿酸の検出電極に使用される電極材料は主に３種類あり、高分子薄膜（Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．、 ２００７）、金属（Ｈｕａｎｇ、 ｅｔ ａｌ．、 ２０１３； Ｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．、 ２０１２； Ｃｈａｕｈａｎ ａｎｄ Ｐｕｎｄｉｒ、 ２０１１； 本発明）、及びカーボン（Ｄｅｙ ａｎｄ Ｒａｊ、 ２０１３； Ｐｉｅｒｍａｒｉｎｉ、 ｅｔ ａｌ．、 ２０１３； Ｋａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、 ２０１２）を含む。しかしながら、近年の目覚しい発展に伴い、複合材料を使用した多くの尿酸の検出電極が製造され、電極効果を増加させている。これら文献のウリカーゼの固定方法は、物理付着或いは化学結合を含み、但し絶対多数は酸化還元媒体を使用しておらず、Ｏ２を酸化尿酸の代替とし、このため更に高い酸化電位により続いてＨ２Ｏ２を酸化させる必要があるのみならず、空気中に含まれるＯ２の波動が大きな計測の誤差を引き起こす。
表四から分かるように、フェロセンを酸化還元媒体の２つの電極（Ｄｅｙ ａｎｄ Ｒａｊ、２０１３；本発明）として使用し、酸化尿酸は直接相当に低い酸化電位を有する。本発明の実施形態では、酸化還元媒体及びウリカーゼが同時に電極に結合され、低い尿酸濃度の場合、感応時間は僅か５ｓであり、高い尿酸濃度の場合、感応時間は１５ｓである。他の電極に比べ、更に高速である。表四の結果からは、本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極は更に広い標準添加検量線の線形濃度の範囲（０．０−２．３８ ｍＭ、 ｒ２ ≧ ０．９９５２）を有していると分かり、理想的な検出限界値（約２．４ μＭ）であり、２０９日の計測期間中も感度を保持させている。本発明の実施形態に係る尿酸の検出電極の再使用性は、他の文献の電極よりも優れており、臨床でも長期間重複して使用可能な潜在力を有する。
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
１０ エナメル銅線
１２ 銅線
１４ 金の表面
１４Ａ 第一修飾表面
１４Ｂ 第二修飾表面
１４Ｃ 第三修飾表面
１４Ｄ 第四修飾表面
１６ 電極
１６Ａ 第一修飾電極
１６Ｂ 第二修飾電極
１６Ｃ 第三修飾電極
１６Ｄ 第四修飾電極
１２ 銅線
１４ 金の表面
１４Ａ 第一修飾表面
１４Ｂ 第二修飾表面
１４Ｃ 第三修飾表面
１４Ｄ 第四修飾表面
１６ 電極
１６Ａ 第一修飾電極
１６Ｂ 第二修飾電極
１６Ｃ 第三修飾電極
１６Ｄ 第四修飾電極
工程（ＩＩ）では、上述の銅線をテトラクロロ金酸塩（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｕｒａｔｅ）水溶液に入れ、電圧を加え、テトラクロロ金酸塩を金粒子に還元させて銅１２の表面に沈着させ、金の表面１４を有する電極１６を形成させる。本工程の製造条件は温度約２８℃、電圧約２．０Ｖで約２時間かかる。続いて、水で電極１６を洗浄し、電極１６の表面の未還元の金化合物を洗い落とす。
工程（ＩＩＩ）では、電極１６を例えばＬ―メチオニン（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）溶液等の２５℃の濃度２０．０ｍＭのアミノ酸溶液に１時間浸し、金粒子とＬ―メチオニン中のメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合される第一修飾表面１４Ａを形成させ、且つ第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを形成させる。次に、２５℃の脱イオン水で第一修飾電極１６Ａを洗浄し、金の表面１４上の物理的に付着したＬ―メチオニンを除去する。
工程（ＩＶ）では、第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを７５℃の濃度２０．０ｍＭのフェロセンカルボキシアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ、 ＦｃＡｌｄ、体積比９９．５／０．５のエタノール／塩化水素に溶解される）溶液中に１時間浸し、媒体（ＦｃＡｌｄ）とＬ―メチオニンのアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）によりシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）共有結合される第二修飾表面１４Ｂを形成させ、第二修飾表面１４Ｂを有する第二修飾電極１６Ｂを形成させる。その後、７５℃で脱イオン水により第二修飾電極１６Ｂを洗浄する。
工程（Ｖ）では、第二修飾電極１６Ｂを４０℃でメチルアルコールに溶解される濃度２０．０ｍＭのＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）溶液中に１時間浸し、Ｎ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合を形成させ、第三修飾表面１４Ｃを形成させ、且つ第三修飾表面を有する第三修飾電極１６Ｃを形成させる。そして、メチルアルコール及び脱イオン水を順に用い、４０℃で第三修飾電極１６Ｃを洗浄し、未反応のＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドを除去する。
工程（ＶＩ）では、第三修飾電極１６Ｃを２５℃で０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、 ＮａＰＢ）に浸し、用意された５０μＭの濃度のウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）溶液中に２４時間浸し、置換反応が発生するとウリカーゼとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とが結合され、アミド結合またはペプチド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）共有結合が形成され、ウリカーゼが第三修飾表面１６Ｃに固定され、第四修飾表面１４Ｄ及び第四修飾表面を有する第四修飾電極１６Ｄとなる。これによって、第四修飾電極１６Ｄは尿酸の検出電極となり、０．１Ｍ、ｐＨ７．０、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液中に保存される。
工程（ＩＩＩ）では、電極１６を例えばＬ―メチオニン（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）溶液等の２５℃の濃度２０．０ｍＭのアミノ酸溶液に１時間浸し、金粒子とＬ―メチオニン中のメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合される第一修飾表面１４Ａを形成させ、且つ第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを形成させる。次に、２５℃の脱イオン水で第一修飾電極１６Ａを洗浄し、金の表面１４上の物理的に付着したＬ―メチオニンを除去する。
工程（ＩＶ）では、第一修飾表面１４Ａを有する第一修飾電極１６Ａを７５℃の濃度２０．０ｍＭのフェロセンカルボキシアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ、 ＦｃＡｌｄ、体積比９９．５／０．５のエタノール／塩化水素に溶解される）溶液中に１時間浸し、媒体（ＦｃＡｌｄ）とＬ―メチオニンのアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）によりシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）共有結合される第二修飾表面１４Ｂを形成させ、第二修飾表面１４Ｂを有する第二修飾電極１６Ｂを形成させる。その後、７５℃で脱イオン水により第二修飾電極１６Ｂを洗浄する。
工程（Ｖ）では、第二修飾電極１６Ｂを４０℃でメチルアルコールに溶解される濃度２０．０ｍＭのＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）溶液中に１時間浸し、Ｎ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とにより共有結合を形成させ、第三修飾表面１４Ｃを形成させ、且つ第三修飾表面を有する第三修飾電極１６Ｃを形成させる。そして、メチルアルコール及び脱イオン水を順に用い、４０℃で第三修飾電極１６Ｃを洗浄し、未反応のＮ、Ｎ´―ジシクロヘキシルカルボジイミドを除去する。
工程（ＶＩ）では、第三修飾電極１６Ｃを２５℃で０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、 ＮａＰＢ）に浸し、用意された５０μＭの濃度のウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）溶液中に２４時間浸し、置換反応が発生するとウリカーゼとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とが結合され、アミド結合またはペプチド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）共有結合が形成され、ウリカーゼが第三修飾表面１６Ｃに固定され、第四修飾表面１４Ｄ及び第四修飾表面を有する第四修飾電極１６Ｄとなる。これによって、第四修飾電極１６Ｄは尿酸の検出電極となり、０．１Ｍ、ｐＨ７．０、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液中に保存される。
図から観察できる酸化還元媒体（ｍｅｄｉａｔｏｒ）の酸化及び還元電位はそれぞれ０．２３９Ｖ及び―０．２３２Ｖである。尿酸濃度が増加すると、媒体の陽極の電流の波頂は広大になり、酸化電位も増加する。尿酸濃度が増加すると、酸化電位は０．２３９Ｖから０．４４９Ｖに増える。ＮａＰＢ緩衝背景溶液の酸化及び還元電流の波頂は、それぞれ０．０４４Ｖ及び―０．０４２Ｖであり、これは尿酸濃度が増加（曲線ａから曲線ｉ）したためであり、対応する水素イオンの酸化及び還元が減少する原因でもある。
ＮａＰＢ背景溶液の陽極の電流の波頂は―０．６１Ｖであり、これは尿酸濃度が増加したためであり、Ｈ２Ｏの還元も減少する。Ｈ２Ｏの還元によりＨ２及びＯＨ―が発生し、Ｈ＋が還元されてＨ２になるのを抑制させる。然しながら、尿酸濃度が増加し、ＯＨ―及びＨ＋が中和しＨ＋の還元電流の波頂も減少する。実験中サイクリックボルタンメトリー分析に於いて、プラチナ対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）から泡が出る現象が観察された。ここから推察すると、作用電極に以下の反応が発生している。
ＮａＰＢ背景溶液の陽極の電流の波頂は―０．６１Ｖであり、これは尿酸濃度が増加したためであり、Ｈ２Ｏの還元も減少する。Ｈ２Ｏの還元によりＨ２及びＯＨ―が発生し、Ｈ＋が還元されてＨ２になるのを抑制させる。然しながら、尿酸濃度が増加し、ＯＨ―及びＨ＋が中和しＨ＋の還元電流の波頂も減少する。実験中サイクリックボルタンメトリー分析に於いて、プラチナ対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）から泡が出る現象が観察された。ここから推察すると、作用電極に以下の反応が発生している。
Claims (8)
- 金属基材を提供する工程と、
前記金属基材の表面に金の表面を形成させることで、電極を形成させる工程と、
Ｌ―メチオニン（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）により前記金の表面を修飾させ、金粒子とＬ―メチオニン内のメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）との共有結合を形成させ、第一修飾表面を有する第一修飾電極を形成させる工程と、
アルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）を含有する酸化還元媒体とＬ―メチオニンのアミノによりシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ Ｂａｓｅ）共有結合を形成させ、且つ第二修飾表面を有する第二修飾電極を形成させる工程と、
Ｎ、Ｎ’―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）により前記第二修飾表面を修飾させ、前記Ｎ、Ｎ’―ジシクロヘキシルカルボジイミドとＬ―メチオニン的カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）との共有結合を形成させ、第三修飾表面を有する第三修飾電極を形成させる工程と、
前記第三修飾表面とウリカーゼとを接触させることで、ウリカーゼとＬ―メチオニンのカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）とのアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）共有結合を形成させ、第四修飾表面を有する第四修飾電極を形成させる工程と、を順に含むことを特徴とする、
尿酸の検出電極及びその製造方法。 - 前記金属基材は銅であることを特徴とする請求項１に記載の尿酸の検出電極及びその製造方法。
- 前記酸化還元媒体はフェロセンカルボキシアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）を含有することを特徴とする請求項１に記載の尿酸の検出電極及びその製造方法。
- 金属表面を有する基材構造と、
前記金属表面の少なくとも一部分に形成される金の表面と、
Ｌ―メチオニンがメチルスルファニル基（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ ｇｒｏｕｐ）により前記金の表面に結合されることと、
アルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）を含有する酸化還元媒体であり、前記酸化還元媒体と前記Ｌ―メチオニンのアミノとのシッフ塩基（ポリアゾメチン）（Ｓｃｈｉｆｆ Ｂａｓｅ）を形成させることと、
ウリカーゼはジイミド（ｄｉｉｍｉｄｅ）を有するペプチド結合剤（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）により前記アミド酸と結合され、前記ウリカーゼと前記ペプチド結合剤とがアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成させることと、を備えることを特徴とする、
尿酸の検出電極。 - 前記ペプチド結合剤はＮ、Ｎ’―ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）であることを特徴とする、請求項４に記載の尿酸の検出電極。
- 前記酸化還元媒体はフェロセンカルボキシアルデヒド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）を含有することを特徴とする、請求項４に記載の尿酸の検出電極。
- 前記金属表面は銅の表面であることを特徴とする、請求項４に記載の尿酸の検出電極。
- ２０９日重複使用すると、酸化還元電位は約０．３３Ｖを維持させ、感度は約５０μＡ Ｍ―１を維持させ、検出限界値は２０．２μＭ以下を維持させることを特徴とする、請求項４に記載の尿酸の検出電極。
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