CN1446923A

CN1446923A - 用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法

Info

Publication number: CN1446923A
Application number: CN 02114476
Authority: CN
Inventors: 阎小君; 郭晏海
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2003-10-08

Abstract

本发明涉及将高通量肽芯片应用于大量蛋白功能和结构的研究中，具体说是一种用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法。在进行蛋白质功能和结构的研究中，常要进行某一蛋白的单克隆抗体的制备，传统的制备筛选杂交瘤细胞方法，一次实验只能获得一种单克隆抗体的杂交瘤细胞。如果面对成千上万种蛋白质，这种方法效率太低，不能满足实际研究的要求。本发明将高通量肽芯片应用于杂交瘤细胞筛选的过程中，该方法先用多种抗原，甚至是成千上万种的蛋白质分子或合成肽，同时免疫小动物，建立杂交瘤细胞库，再用肽芯片从杂交瘤细胞库中筛选相应的杂交瘤细胞株。因此，一次能筛选出多种杂交瘤细胞，大大地提高了工作效率。

Description

用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法

技术领域

本发明涉及将高通量肽芯片应用于大量蛋白功能和结构的研究中，具体说是一种用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法。

背景技术

在进行蛋白质功能和结构的研究中，常要进行某一蛋白的单克隆抗体的制备。按传统单克隆抗体的制备方法，首先需要进行免疫小鼠，即用待研究的蛋白或肽段免疫小鼠，使小鼠产生特异抗体细胞。取该小鼠的脾细胞，脾细胞中含有产生特异抗体细胞，将脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞进行体外融合，成为杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞兼具有两种亲本细胞的特点，既能分泌抗体，又能大量培养增殖。不过要得单克隆抗体，还需要反复克隆化，才能得到抗体分泌旺盛的杂交瘤细胞。由于早期杂交瘤细胞不稳定，容易丢失染色体变为非分泌型；强阳性株多次传代后也可变为弱阳性株，即使长期培养的杂交瘤也可出现这种情况。因此需要不断的克隆化，以保持杂交瘤细胞的稳定性。从背景技术可以看出传统的制备筛选杂交瘤细胞效率低，一次实验只能获得一种单克隆抗体的杂交瘤细胞。如果面对成千上万种蛋白质的话，显然这种方法效率低，不能满足实际研究的要求。

发明内容

本发明针对传统的筛选杂交瘤细胞的方法效率低的问题。将高通量肽芯片应用于杂交瘤细胞筛选的过程中，该方法先用多种抗原，甚至是成千上万种的蛋白质分子或合成肽，同时免疫一只小鼠，提取脾细胞后，体外和骨髓瘤细胞进行体外融合，产生多样性的杂交瘤细胞库，再用肽芯片从杂交瘤细胞库中筛选相应的杂交瘤细胞株。筛选出来的杂交瘤细胞株，可以进行单克隆抗体的生产。由于筛选的肽芯片上联接有待研究的并免疫小鼠的蛋白质分子或合成肽分子。因此，可以选到与待研究蛋白质分子或合成肽分子相对应的单克隆杂交瘤细胞。该技术的基本原理：B细胞在产生分泌型抗体的同时，在其细胞膜表面也表达大量的IgM抗体，两类抗体具有相同的抗原结合性。当骨髓瘤细胞与B细胞融合后，融合的杂交瘤细胞继承了B细胞表面的IgM抗体，这样，肽芯片上的特异抗原和杂交瘤细胞上的IgM抗体结合，将杂交瘤细胞滞留在肽芯片上的相应位置上。

本发明所采用的技术方案为：1、用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法，其特殊之处在于：所述的筛选方法包括以下工艺步骤：

1)、制备含有蛋白分子或肽分子固定点的肽芯片；

2)、用混合抗原免疫动物，使动物产生对多种抗原的抗体B细胞，建立杂交瘤细胞库；免疫动物可采用小鼠或兔子等小动物。

3)、用肽芯片在杂交瘤细胞库进行抗原的筛选。2、上述的制备含有肽芯片包括以下工艺步骤：

1)、肽芯片的结构设计；

2)、芯片材料的预处理；

3)、蛋白分子或肽段的修饰；

4)、蛋白分子或肽分子的定点固定。3、上述的建立杂交瘤细胞库包括以下工艺步骤：

1)、混合抗原免疫小鼠；

2)、免疫脾细胞的制备；

3)、脾细胞与骨髓细胞融合；

4)、融合细胞的早期培养。4、上述的用肽芯片在杂交瘤细胞库进行抗原的筛选包括以下工艺步骤：

1)、将培养的杂交瘤细胞悬液转入10ml离心管中，1500r/min离心5分钟，轻轻吸取上清液。

2)、加入5ml HT培养液，并轻轻将杂交瘤细胞重新悬浮，再将悬液1500r/min离心5分钟，轻轻吸去上清液。

3)、重复第2)步两次。

4)、将杂交瘤细胞悬浮于5ml HT培养液中。

5)、5ml杂交瘤细胞加入肽芯片中，并于37℃，30r/min的速度运转30min，使杂交瘤细胞与肽芯片上的特异分子结合，从而被固定在特异的位置上。

本发明对照现有技术，其有益效果为：

本发明将高通量肽芯片应用于杂交瘤细胞筛选的过程中，该方法用多种抗原同时免疫一只小动物，建立杂交瘤细胞库；再用高通量肽芯片进行筛选，因而一次实验就能筛选出多种杂交瘤细胞株，大大简化了传统的单克隆细胞技术，提高了研究开发的效率。

附图说明：

图1为本发明的工艺流程示意图；

图2为本发明的用于杂交瘤细胞筛选的肽芯片的结构示意图；

具体实施方式

参见图1，图2，若现有A，B，C，D…等10种抗原或肽分子，将这10种抗原或肽分子分别固定在芯片上，制备成肽芯片备筛选之用；另外将这10种分子混合后，免疫小鼠，通过细胞融合技术，最终得到杂交瘤细胞。之后将杂交瘤细胞悬液与肽芯片进行接触，瘤细胞悬液中含有对上述10种抗原特异的杂交瘤细胞，那么那些能在细胞膜上表达抗A分子的单克隆细胞就和芯片上的A点结合，从而被固定在A点处，同样，细胞膜上表达抗B、抗C或抗D等抗体分子的杂交瘤细胞将分别被固定在芯片的B点、C点或D点上。最后小心用PBS洗芯片3次，将杂质和未被固定的细胞洗掉，用细胞吸取针吸取各点上的细胞，进一步进行培养鉴定。其具体操作步骤如下：(一)、制备含有蛋白分子或肽分子固定点的肽芯片；

肽芯片制备包括：肽芯片的结构设计，芯片材料的预处理，蛋白分子或肽段的修饰，蛋白分子或肽分子的定点固定。

1、肽芯片的结构设计：参见图2，在玻璃方盒1的底部上开设芯片的点样区3，底部是检测分子固定区，四周是玻璃壁，主要功能是为了储留样品液，它呈方形槽，长度、宽度、高度为10mm、10mm、5mm，最多可容纳450μL样品。盒子配有盖子2。具体尺寸也可由具体要求而定。

2、芯片材料的处理

在超净工作罩中，用无水乙醇荡洗芯片载体-芯片玻璃方盒(方盒底部作为芯片载体，方盒大小为10mm×10mm×5mm)荡洗3次，倒去无水乙醇，在超纯净工作罩中干燥10min，将芯片载体用常规的APS和PDC处理。APS：3-胺丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane；APS)，PDS：1.4-苯二异硫氰酸盐(1.4-phenylenediisothiocyanate；PDS)，芯片玻璃盒用APS-PDS处理的方法：

1)将400μL0.5％APS丙酮溶液加入芯片玻璃盒中，盖上芯片盒盖，将盒上下颠倒荡洗10次，室温下放置5min。

2)将芯片盒中的有机溶剂倒入废液缸中，芯片玻璃盒敞开盖放于1000C烘烤30min。

3)将400μL0.01％PDS加入芯片盒中，盖上盖子，上下颠倒10次，室温下浸泡40分钟。

4)倒去盒中液体，用丙醇浸泡5min。

5)50℃烘箱内放置备用。

3、抗原(肽段)的修饰与固定：

将抗原肽用吡咯基团修饰(标记方法按常规)。将处理好的芯片放置超净工作台中，用手动芯片点样仪沾取修饰并纯化好的抗原肽2μl，点于芯片玻璃盒的底部，0.2mm直径的点，间距为1mm共点8×8＝64点。点样时在底部标记的点样位置点样，以便在后续取细胞时能准确定位。点好的芯片玻璃盒用PBS PH7.0荡洗3次，抛净盒内液体，于370C干燥箱内干燥1h，封装备用。

本发明的肽芯片是以筛选为目的，而且筛选的不是简单的分子，而是细胞，因此为了满足此目的，芯片上的每一个点上必须有足够的、可以和目的细胞结合的肽分子，才能固定特异细胞，为此，在制备该芯片时，芯片上的点样量要比一般的肽芯片的点样量大。另外，由于目的的要求，该芯片的外形结构也与一般的芯片有很大的差异，外形结构可为方行盒子并配有盒盖，适应样品与芯片长时间的接触。

(二)、用混合抗原免疫小动物，使动物产生对多种抗原的抗体B细胞，建立杂交瘤细胞库；免疫动物可采用小鼠或兔子等小动物。

混合抗原制备杂交瘤细胞库的基本方法与传统方法相同，不同的是本发明是使用混合抗原免疫小鼠，使小鼠产生对多种抗原的抗体B细胞。具体的操作：

1、混合抗原免疫小鼠

1)取0.1ml抗原溶液(抗原浓度100μg/0.1ml盐水)与0.1完全福氏佐剂搅拌成乳浆。

2)注射小鼠腹腔。

3)12天后免疫小鼠剪尾端放血，测定血清抗体活性。

4)从尾静脉注入100μg抗原加强免疫

5)四天后杀死免疫小鼠取出脾脏，制备脾细胞悬液。即可与胃髓瘤细胞融合。

2、免疫脾细胞的制备

1)以颈椎脱臼法杀死小鼠并浸入70％酒精中，浸泡后取出置解剖台上，擦干腹部残余的酒精，以无菌剪刀剪开腹部取出脾脏，置于无菌的含少量培养液的平皿中。

2)拨离脾脏包膜，使脾细胞全部洗入培养液中。

3)吸出脾细胞悬液倾于一支试管中，静置片刻，吸取细胞悬液于1500r/min离心7分钟。

4)去除上清液，加无小牛血清培养液面再次洗涤细胞，1500r/min离心7min，去除上清，加少量培养液，计数脾细胞(控制在1×10⁸细胞/ml左右)。

3、脾细胞与骨髓细胞融合1)融合前一天将PEG放于CO₂培养箱中调整PH值2)将PEG和培养液置37℃水溶箱中温热3)将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1∶3的比例用小玻棒轻轻地混合于无血清培养液中。1500r/min离心10分钟。4)去除所有的上清液，保持细胞团完整。5)将试管放在恒温干浴中保持37℃，用1ml吸管慢慢地将37℃预温的50％PEG(分子量1500)溶液0.8ml加至密集的细胞团中。用吸管尖端慢慢搅动使PEG与细胞混合，但不要吹吸。6)试管保持在干浴中，用吸管尖端缓缓搅动1min7)在1min内加完1ml预温的培养液，试管仍放在干浴中以保持温度8)在1min内再加完1ml37℃的培养液9)于2min内加完10ml37℃预温的培养液10)1500r/min离心10min11)去除上清液，重新将细胞悬浮于培养液中，使最后浓度1×10⁶细胞/0.12ml(相当于5ml吸管的2滴)。12)用无菌的5ml吸管，将细胞悬液加于已在前一天接种了饲养细胞(含1×10⁴饲养细胞/0.1ml)的培养瓶中。

4、融合细胞的早期培养1)从融合那天起为零天，将融合后的细胞培养于含有饲养细胞的RPMH-1640培养液中。2)次日即第一天，培养瓶中加5ml HAT培养液。3)第4天吸出上清1/2，加入1/2HAT培养液。4)第7天吸出上清1/2HAT培养液。5)第8天以后有规律地每隔3~5天，同上清吸去1/2HAT培养液换入HT培养液。6)第10-20天后，在显微镜下观察、应出现细胞克隆。(三)、用肽芯片在杂交瘤细胞库进行特异杂交瘤细胞筛选。

1)将培养的杂交瘤细胞悬液转入10ml离心管中，1500r/min离心5分钟，轻轻吸取上清液。

2)加入5ml HT培养液，并轻轻将杂交瘤细胞重新悬浮。再将悬液1500r/min离心5分钟，轻轻吸去上清液。

3)重复2)步两次。

4)将杂交瘤细胞悬浮于5ml HT培养液中。

5)5ml杂交瘤细胞加入肽芯片中。于37℃，30r/min的速度运转30min。使杂交瘤细胞与肽芯片上的特异分子结合，从而被固定在特异的位置上，用台盼蓝染色，用例置显微镜观察，并用吸取针吸取被固定的杂交瘤细胞，供扩大培养和小鼠腹腔接种。

6)同时将第1)步吸出的杂交瘤细胞培养上清加入于另一肽芯片上，于37℃ 30r/min，培养30min，使上清中的分泌型抗体与肽芯片上的特异肽分子结合，然后去除液体并用PBS洗涤芯片3次，然后加入胶体金标记的A蛋白3ml(浓度适量)，37℃反应30min，用PBS洗涤芯片3次，每次5ml，每次30s。用芯片阅读仪判读芯片，将结果与固定的杂交瘤细胞的位置进行比较。以便进一步确定单克隆杂交瘤的存在。

该方法应注意由于芯片制备过程中的污染，会造成单克隆细胞的中毒而培养不出来；另外由于在筛选过程中有些刚融合的细胞，其膜上表达的抗体分子量少，因此会由于在芯片特定的抗原点上固定不牢固，容易被冲洗掉，因而应注意。

Claims

1、一种用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法，其特征在于：所述的筛选方法包括以下工艺步骤：

(1)、制备含有蛋白分子或肽分子固定点的肽芯片；

(2)、用混合抗原免疫小动物，使小动物产生对多种抗原的抗体B细胞，建立杂交瘤细胞库，免疫动物可采用小鼠或兔子等；

(3)、用肽芯片在杂交瘤细胞库进行抗原的筛选。

2、根据权利要求1所述的用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法，其特征在于：制备含有肽芯片包括以下工艺步骤：

(1)、肽芯片的结构设计；

(2)、芯片材料的预处理；

(3)、蛋白分子或肽段的修饰；

(4)、蛋白分子或肽分子的定点固定。

3、根据权利要求1所述的用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法，其特征在于：建立杂交瘤细胞库包括以下工艺步骤：

(1)、混合抗原免疫小鼠；

(2)、免疫脾细胞的制备；

(3)、脾细胞与骨髓细胞融合；

(4)、融合细胞的早期培养。

4、根据权利要求1所述的用高通量肽芯片进行杂交瘤细胞筛选的方法，其特征在于：用肽芯片在杂交瘤细胞库进行抗原的筛选包括以下工艺步骤：

(1)、将培养的杂交瘤细胞悬液转入10ml离心管中，1500r/min离心5分钟，轻轻吸取上清液。

(2)、加入5ml HT培养液，并轻轻将杂交瘤细胞重新悬浮，再将悬液1500r/min离心5分钟，轻轻吸去上清液。

(3)、重复第(2)步两次。

(4)、将杂交瘤细胞悬浮于5ml HT培养液中。

(5)、5ml杂交瘤细胞加入肽芯片中，并于37℃，30r/min的速度运转30min，使杂交瘤细胞与肽芯片上的特异分子结合，从而被固定在特异的位置上。