KR20120116396A

KR20120116396A - 교정 시약 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120116396A
Application number: KR1020127012645A
Authority: KR
Inventors: 게어 마치아르 아사디; 에베르송 노고케케
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2009-11-16
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-10-22
Also published as: BR112012011055A2; US20120220489A1; WO2011058136A1; CA2778866A1; EP2502072A1; MX2012005428A; JP2013511032A; CN102648414A

Abstract

본 발명은 링커를 통해 단백질 담체에 접합되는 펩티드를 포함하는 교정 시약 (이때, 상기 펩티드는 관심 에피토프를 포함함) 및 이의 용도를 제공한다.

Description

교정 시약 및 이의 용도{CALIBRATION REAGENT AND USES THEREOF}

역상 단백질 어레이 (RPA) 는 극미량의 생물학적 샘플 (예를 들어 세포 용해물, 조직 용해물, 또는 체액) 에서 상이한 신호 변환 캐스케이드의 핵심 분석대상물을 나타내는 중점을 두는 단백질 세트를 분석하기 위한 편리한 방법으로서 최근 개발되고 수립되어 왔다. 특정 핵심 단백질의 풍부함 뿐만 아니라 그러한 핵심 단백질의 활성화된, 번역-후 변형된 (예를 들어, 인산화된) 형태를 나타내는 단백질 발현의 상대적인 차이점은, 예를 들어 세포 배양액에 대해 주어진 약학 화합물의 특정 치료 효과, 예를 들어 키나아제에 대한 약물 후보자의 저해성 효과를 기술하고 분류할 수 있거나, 상이한 질병 상태, 예를 들어 이들의 상이한 진행 상태에서 종양의 하위-유형을 기술하고 분류할 수 있다. RPA 는 많은 샘플의 평행적 비교 측정을 수행할 수 있고, 예를 들어 상이한 질병 개체군으로부터의 샘플 또는 상이하게 치료되는 세포 배양액으로부터의 샘플의 평행적 비교 측정을 수행할 수 있다. 별개의 샘플 코호트에서 발견될 단백질 발현 또는 단백질 활성화 패턴의 현저한 변화는 가장 효율적인 약물 후보자, 처리 유도되는 작용 모드 도식 설명 또는 신규 진단학적/예방학적 질병 마커의 확인을 촉진할 것이다.

역상 단백질 어레이 (RPA) 에 사용되는 것과 같은 면역친화도 검정은 관심 단백질 및 친화성 시약 사이에 특정 상호작용에 기초하고 있다. 검정은 샘플 스팟을 형성하는 어레이 상에서의 생물학적 샘플의 고정화를 포함한다. 샘플화된 어레이는 친화성 시약, 즉 항체로 인큐베이션되고, 후속적으로 형성된 친화성 시약 및 관심 단백질의 복합체는 생성되는 검출 신호, 예를 들어 발광 신호에 의해 측정된다. 각각의 어레이는 분석대상물-특이적 친화성 시약으로 염색되고, 이는 라벨링될 수 있거나 2차 검출 시약으로 인큐베이션된다. 형성된 복합체는 다양한 수단 (색도계, 형광, 화학발광 등) 으로 검출된다. 전형적으로 RPA 는 상이한 샘플 사이의 신호 활성화 또는 발현의 상대적 변화를 측정한다.

샘플의 정량적 분석은 교정 시약의 사용을 요구한다. 현재, 단백질 분석대상물을 위해, 교정 시약은 분석대상물과 동일한 아미노 서열을 갖는 재조합 단백질이다. 예를 들어, 특허 출원 WO2007/048436A1 는 역상 단백질 마이크로어레이에 대한 교정 곡선을 기술하고 있고, 이에 의해 상이한 농도의 관심 정제 단백질 (Akt) 은 BSA 또는 래트 혈청을 포함하는 스팟팅 완충제에 첨가된다. 그러나, 올바른 에피토프를 나타내는 재조합 단백질의 제조는 시간을 소모하며 종종 실패한다. 특히, 인산화된 에피토프를 위해, 지금까지 이용가능한 믿을만한 교정 시약이 없었다.

따라서, 상이한 관심 분석대상물 에피토프를 선택할만한 특이성을 갖는 보편적으로 적용가능하게 제공되도록 설계된 시약이 요구되고 있다. 이는, 상이한 프린트 런에서 구축되는 어레이 상에서 또는 상이한 장치 상에서, 상이한 실험 수행자에 의해 별도로 수행되는 실험으로부터 결과를 교정되게 한다. 또한, 각각의 친화성 시약에 의해 생성되는 단백질-특이적 RPA 신호의 선형 배열은 최적으로 미리-규정될 수 있다.

따라서, 본 발명은 링커를 통해 단백질 담체에 부착되는 펩티드를 포함하는 교정 시약을 제공하는 것이며, 이때 상기 펩티드는 관심 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 관심 에피토프는 인산화된다.

이러한 교정 시약으로, RPA 또는 또다른 친화도 검정으로 단백직을 정량화하기 위한 믿을만한 표준 곡선이 생성될 수 있다. RPA 는, 자주 로봇 마이크로어레이어를 사용하여 고도로 결합되는 기질 표면 상에서, 예를 들어 세포 또는 조직 용해물의 적은 샘플 부피의 침전물에 의해 구축된다. 기질 상의 각각의 용해물 스팟은 세포성 단백질 및 분석대상물의 전체 보충물을 함유한다. 수백개의 샘플은 동일한 검정에서 샘플의 높은 처리량의 교차-비교를 허용하는 하나의 마이크로어레이 상으로 평행적으로 스팟팅될 수 있다. 샘플의 동일한 세트를 함유하는 복제 어레이는 샘플 재료의 동일한 초기 부피로부터 용이하게 제조될 수 있는데, 이는 스팟 당 샘플 부피의 소비가 극도로 낮기 때문이다.

본 발명의 교정 시약은 인산화된 관심 에피토프를 포함하는 단백질을 정량화하는데 특히 유용하다.

도 1A 는 태깅된 교정 시약의 구조를 나타낸다. (A) 관심 에피토프를 포함하는 펩티드, (B) 친수성 링커, (C) 담체 단백질, (D) 교정 시약의 농도 측정을 위한 라벨 (예를 들어 Dabsyl). 펩티드는 링커에 공유적으로 결합되고 링커는 담체 단백질에 공유적으로 결합된다.
도 1B 는 도식적 어레이 레이아웃을 나타낸다. 어레이는 12 개의 어레이 필드 (정사각형에서 넘버 1-12) 및 대조군 필드 (1-16) 로 나누어진다. 각각의 어레이 필드는 완전한 표준 희석 시리즈 (위치 1-12) 의 12 샘플 위치 (3 열 x 4 위치, 각각 이중 스팟 => 24 스팟으로) 를 포함한다. 화살표는 농도가 감소하는 방향을 나타낸다. 2 개의 인접한 어레이 필드는 거울 위치에서 배열되어, 낮은 표준 농도의 스팟을 충족시키는 높은 표준 농도의 스팟을 피한다. 대조군 필드는 공(co)-어레이 용해물 대조를 위해 사용되었다 (이중 스팟에서 16 샘플 위치).
도 2A 및 2B 는, 인간 Erk1 (도 2A) 및 인간 Erk2 (도 2B) 단백질의 펩티드 서열을 나타낸다. 2 개의 단백질의 중심에서 인산화 자리 주변의 선택된 펩티드 서열을 밑줄로 나타낸다 (둘 모두의 단백질에 대해 동일함). 총 Erk1 (BioSource 항체) 에 대해 선택된 펩티드 서열 (에피토프를 포함하는 펩티드) 는 프레임으로 마킹된다. Erk2 단백질의 상응하는 서열에서 상이한 아미노산은 화살표로 표시한다.
도 2C 는 관심 에피토프를 포함하는 펩티드에서 인산화된 아미노산 (A...(p)) 의 바람직한 위치를 나타낸다.
도 2D 는 표준 곡선의 도식적 표시를 나타내고, 이에 의해 역학 범위 (dr) 가 나타난다. C = 교정 시약의 농도, S = 신호 세기.
도 3 은 상이한 펩티드-단백질 접합 비의 펩티드-BSA 시약의 인쇄되고 에피토프에 대항하는 항체로 탐침된 표준 곡선을 함유하는 어레이의 검정 이미지 구획을 나타낸다. 도 3A: 히스톤 H3-BSA, 비: 0.7x (I), 2.7x (II), 13.4 (III), 항체: 1:5000 Abcam ab1791. 도 3B: pRb-BSA, 비: 0.25x (I), 1x (II), 10x (III), 항체: 1:500 CST no 9308. 도 3C: pErk1/2-BSA, 비: 0.7x (I), 2.7x (II), 13.4x (III), 항체: 1:500 CST no 9101. 어레이 레이아웃 (AL): 표준 곡선은 희석 곡선 12 시리즈 (2-배 희석) 로서 인쇄되었다 (각각의 희석은 이중 스팟으로). 상이한 펩티드-BSA 시약의 출발 농도는 50nM 의 균일한 에피토프 농도 (스팟 1) 로 조정되었다.
도 4 는 인쇄된 히스톤H3-BSA 2.7x 시약 (히스톤 H3 검정, 1:5000) (도 4A-C) 및 인쇄된 pErk-BSA 2.7x 시약 (pErk1/2 검정, 1:500) 의 표준 곡선으로부터 분석된 정량적 검정 신호를 나타낸다 (도 4D-F). 속이 채워진 원은 이중 스팟의 평균으로서 측정된 표준 곡선 신호를 나타내고, 실선은 1-자리 결합 모델의 피트 곡선을 나타내며; 정사각형은 공-어레이된 용해물 대조군에 상응하는 신호를 나타내고, 용해물의 총 단백질 농도를 나타낸다: 0.25mg/ml (neg = 음성 및 pos = 양성 처리된 대조군, 수는 용해물의 확인을 나타냄 (표 1 참조)). 도 4A 및 4D: lin-log 곡선; 도 4C 및 도 4F: log-log 곡선. 도 4B 및 도 4E 는 특이적 에피토프 결합 반응으로 이미지 검정한 것을 나타낸다. 표준 곡선은 12 시리즈 희석 곡선 (2-배 희석) 으로서 인쇄되고, 각각의 희석은 이중 스팟으로서 인쇄되었다. 상이한 펩티드-BSA 시약의 출발 농도는 50nM 의 균일한 에피토프 농도로 조정되었다 (스팟 1). 둘 모두는 하나의 이미지 내에서 농도 및 신호 범위에서 10의 약 4 승배의 역학 범위를 나타낸다.
도 5A 는 표준 곡선 시약의 용액을 인쇄하기 위해 매트릭스 단백질 (acBSA) 의 첨가를 증가시킨 결과를 나타낸다 (pErk1/2 검정 (1:500)의 경우에 대해 나타냄). (좌측 a,b,c) 인쇄된 pErk-BSA 2.7x 시약; (우측 d,e,f,) 인쇄된 재조합 Erk1 단백질 (Invitrogen). (상부 a,d) 순수 스팟팅 완충제 중 인쇄된 희석 시리즈, (중간 b,d) 스팟팅 완충제 + 50 ㎍/ml acBSA 중에서, 및 (하부) 스팟팅 완충제 + 100 ㎍/ml acBSA 중에서. acBSA = 아세틸화된 BSA. acBSA 의 첨가는 보다 균질한 스팟 형태학을 야기했다.
도 5B 는 매트릭스 단백질 (acBSA 대 BSA) 의 유형이 용액을 인쇄하기 위해 첨가된 것의 결과를 나타내고, 히스톤 H3 검정의 경우에 대해 나타낸다. (좌측 a,b) 히스톤-BSA 2.7x 시약의 희석 시리즈; (우측) 재조합 히스톤 H3 단백질 (Roche) 의 희석 시리즈. 주요한 신호 차이점이 검출되지 않았으나, acBSA 첨가는 보다 균질한 스팟 형태학을 야기했다.
도 6 은 항체 용액 중에서 상응하는 자유 에피토프 펩티드의 증가 농도 (B: 100nM, C: 1000nM; D: 10'000nM) 의 부재 (정상 검정: A) 및 존재 (경쟁 검정: B 내지 D) 하에서 히스톤 H3 검정의 어레이 신호 이미지 (ab1791 항체의 1:10'000 희석) 를 나타낸다. 정상 검정에서 특이적 항체 표준 신호 / 용해물 대조군은 자유 펩티드의 최고 농도 (10000 nM) 에서 경쟁 반응에 의해 대략 완전하게 / 완전하게 억제되었다. 노출 시간: 0.5ch 및 이미지의 디스플레이 범위 (DR) 0...10000.
도 7 은 히스톤 H3 펩티드 표준 히스톤 H3-BSA 2.7x (속이 채워진 원) 의 12 지점 희석 포인트 및 가장 우세한 신호를 갖는 Upstate 로부터의 히스톤 H3 재조합 단백질에 대한 표준 곡선을 나타낸다 (속이 채워진 삼각형). 대조군 용해물의 신호 (250㎍/ml) 는 비교를 위한 펩티드 표준 곡선으로 첨가되었고 (속이 채워진 직사각형); 신호로부터 다시(back)-계산되었다. 그래프는 인쇄된 표준 희석 (속이 채워진 데이타 지점) 의 평균 신호를 나타내고, 한 자리 결합 모델 (실선, Hill 피트) 의 피트 곡선을 나타낸다. 데이타 지점은 이중 스팟의 평균 신호에 상응하고, 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. LOD 값은 평균 블랭크 신호 수준 + 3-배 표준편차에서 피트 곡선으로부터 다시-계산된 농도였다 (우측 그래프에서 도트 선 참조: 히스톤 H3 펩티드 표준에 대해

, 히스톤 H3 재조합 단백질 (Upstate) 에 대해

). 도 7A: 검정 1, Lin-Log 플롯, LOD (히스톤 H3 단백질) = 0.133nM, LOD (히스톤 H3-BSA 2.7x) = 0.104nM. 도 7B: 검정 1, Log-Log 플롯. 도 7C: 검정 2, Lin-Log 플롯, LOD (히스톤 H3 단백질) = 0.178nM, LOD (히스톤 H3-BSA 2.7x) = 0.141nM. 도 7D: 검정 2, Log-Log 플롯. (r2 > 0.99 의 상관계수).
도 8 은 pRb 펩티드 표준 (속이 채워진 원) 및 pRb 재조합 단백질 (Active Motif) (속이 채워진 삼각형) 의 12 지점 희석 곡선으로부터의 pRb 검정 (1:250 CST #9308) 에 대한 표준 곡선을 나타낸다. 대조군 용해물 (400㎍/ml) 의 신호는 비교를 위한 펩티드 표준 곡선에 첨가되고 (속이 채워진 정사각형, pos = 양성, neg = 음성, 수는 용해물의 확인을 나타냄, 표 1 참조); 농도는 신호부터 다시-계산되었다. 그래프는 인쇄된 표준 희석 (속이 채워진 데이타 지점) 의 평균 신호를 나타내고 한자리 결합 모델 (실선, Hill 피트) 의 피트 곡선을 나타낸다. 데이타 지점은 이중 스팟의 평균 신호에 상응하고; 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. LOD 값은 평균 블랭크 신호 수준 + 3-배 표준편차에서 피트 곡선으로부터 다시-계산된 농도였다 (우측 그래프에서 도트 선 참조: Rb 펩티드 표준에 대해

, Rb 재조합 단백질 (Active Motif) 에 대해

). 도 8A: 검정 1, Lin-Log 플롯, LOD (pRb 단백질) = 0.117nM, LOD (pRb-BSA 1x) = 0.024nM. 도 8B: 검정 1, Log-Log 플롯. 도 8C: 검정 2, Lin-Log 플롯, LOD (pRb 단백질) = 0.077nM, LOD (pRb-BSA 1x) = 0.026nM. 도 8D: 검정 2, Log-Log 플롯. r² > 0.99 의 상관계수.
도 9 는 가장 우세한 신호 (속이 채워진 삼각형) 로 pErk1/2 펩티드 표준 pErk1-BSA 2.7x (속이 채워진 원) 및 pErk1 재조합 단백질 (Invitrogen) 의 12 지점 희석 곡선으로부터 pErk1/2 검정 (1:500 CST #9101) 에 대한 표준 곡선을 나타낸다. 대조군 용해물 (400㎍/ml) 의 신호는 비교를 위해 펩티드 표준 곡선에 첨가되었다 (속이 채워진 정사각형, pos = 양성, neg = 음성, 수는 용해물의 확인을 나타냄, 표 1 참조); 농도는 신호로부터 다시-계산되었다. 그래프는 인쇄된 표준 희석 (속이 채워진 데이타 지점) 의 평균 신호 및 한자리 결합 모델 (실선, Hill 피트)의 피트 곡선을 나타낸다.
데이타 지점은 이중 스팟의 평균 신호에 상응하고; 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. LOD 값은 평균 블랭크 신호 수준 + 3-배 표준편차에서 피트 곡선으로부터 다시-계산된 농도였다 (우측 그래프에서 도트 선 참조: Erk1/2 펩티드 표준에 대해

, Erk1/2 재조합 단백질 (Invitrogen) 에 대해

). 도 9A: 검정 1 (Lin-Log 플롯), LOD (pErk1 단백질) = 0.058nM, LOD (pErk1-BSA2.7x) = 0.028nM. 도 9B: 검정 1 (Log-Log-플롯). 도 9C: 검정 2 (Lin-Log 플롯), LOD (pErk1 단백질) = 0.052nM, LOD (pErk1-BSA2.7x) = 0.032nM. 도 9D: 검정 2 (Log-Log-플롯). r² > 0.99 의 상관계수.
도 10 은 가장 우세한 신호 (속이 채워진 삼각형) 로 Erk1 재조합 단백질 (Invitrogen) 및 Erk1 펩티드 표준 Erk1-BSA 2.7x (속이 채워진 원) 의 12 지점 희석 곡선으로부터 Erk1/2 검정 (1:1000 Biosource 44-654G) 에 대한 표준 곡선을 나타낸다. pErk 대조군 용해물 (400㎍/ml) 의 총 Erk 신호는 비교를 위해 펩티드 표준 곡선에 첨가되었다 (속이 채워진 정사각형, pos= 양성, neg=음성, 수는 용해물의 확인을 나타냄, 표 1 참조); 농도는 신호로부터 다시-계산되었다. 그래프는 인쇄된 표준 희석 (속이 채워진 데이타 지점) 의 평균 신호 및 한자리 결합 모델 (실선, Hill 피트) 의 피트 곡선을 나타낸다. 데이타 지점은 이중 스팟의 평균 신호에 상응하고; 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. LOD 값은 평균 블랭크 신호 수준 + 3-배 표준편차에서 피트 곡선으로부터 다시-계산되었다 (우측 그래프에서 도트 선 참조). 도 10A: Lin-Log 플롯 (검정 1), LOD (Erk1 단백질) = 0.059nM, LOD (Erk1-BSA2.7x) = 0.045nM. 도 10B: Log-Log-플롯 (검정 1). 도 10C: Lin-Log 플롯 (검정 2) (하부): LOD (Erk1 단백질) = 0.084nM, LOD (Erk1-BSA2.7x) = 0.046nM. 도 10D: 검정 2, Log-Log-플롯. r² > 0.99 의 상관계수.
도 11 은 총 Erk1 단백질 (Invitrogen) (속이 채워진 다이아몬드) 에 필적할만한 우세한 신호로 pErk1 재조합 단백질 (Invitrogen) 및 Erk1 펩티드 표준 Erk-BSA 2.7x (속이 채워진 원) 의 12 지점 희석 곡선으로부터 Erk1/2 검정 (1:1000 Biosource 44-654G) 에 대한 표준 곡선을 나타낸다. pErk 대조군 용해물의 총 Erk 신호는 비교를 위해 펩티드 표준 곡선에 첨가되었다 (속이 채워진 정사각형); 농도는 신호로부터 다시-계산되었다. 그래프는 인쇄된 표준 희석 (속이 채워진 데이타 지점) 의 평균 신호를 나타내고 한자리 결합 모델 (실선, Hill 피트) 의 피트 곡선을 나타낸다. 데이타 지점은 이중 스팟의 평균 신호에 상응하고; 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. LOD 값은 평균 블랭크 신호 수준 + 3-배 표준편차 (우측 그래프에서 도트 선 참조) 에서 피트 곡선으로부터 다시-계산되었다. 도 11A: 검정 1 (Lin-Log 플롯), LOD (pErk1 단백질) = 0.040nM, LOD (Erk1-BSA2.7x) = 0.045nM. 도 11B: 검정 1(Log-Log-플롯). 도 11C: 검정 2 (Lin-Log 플롯), LOD (pErk1 단백질) = 0.047nM, LOD (Erk1-BSA2.7x) = 0.046nM. 도 11D: 검정 2 (Log-Log-플롯). r² > 0.99 의 상관계수.
도 12 는 실시예 5 의 스파이킹 실험에 대한 어레이 레이아웃을 나타낸다. 인쇄된 표준 희석 시리즈의 조건, 적용된 시약 및 스파이킹된 용해물을 표 7 에 나타냈다.
도 13 은 히스톤 H3 검정 (1:10'000 희석의 ab1791항체) 의 어레이 신호 이미지를 나타낸다. 이중 검정 1 (A1) 및 검정 2 (A2), 및 블랭크 검정 (B) 을 나타낸다. 노출 시간: 1s 및 이미지의 디스플레이 범위 (DR): 300...5000. 검정은 1:10'000 희석에서 히스톤 H3 항체 (Abcam, ab1791) 로 수행하였다.
도 14 는 히스톤 H3 검정 (1:10000 Abcam ab1791) : 대조군 히스톤H3(-) 용해물 6 (속이 채워진 삼각형) 로 스파이킹된 히스톤 H3 펩티드 표준의 7 지점 희석 시리즈 및 완충제 (속이 채워진 원) 중에서 히스톤 H3 펩티드 표준 (히스톤 H3-BSA 2.7x) 의 8 지점 희석 곡선에 대한 표준 곡선을 나타낸다. 스파이크-인 (spike-in) 곡선에서의 나타낸 신호는, 순수 용해물의 히스톤 H3 의 내인성 농도의 신호 기여에 대해 교정되었다, (오프셋 (블랭크) 신호의 값 및 다시-계산된 내인성 단백질 농도의 값은 그래프에 나타냄). 그래프는 측정된 데이타 지점 (속이 채워진 데이타 지점) 및 한자리 결합 모델 (실선, Hill 피트) 의 피트 곡선을 나타낸다. 데이타 지점은 농도 당 N=5 복제 스팟의 평균 신호에 상응하고 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. 검정 1 (상부) 및 검정 2 (하부). Lin-Log 플롯 (좌측) 및 Log-Log 플롯 (우측). r² > 0.99 의 상관계수.
도 15 는 pRb 검정 (1:500 희석의 CST #9308 항체) 의 어레이 신호 이미지를 나타낸다. 이중 검정 1 (A1) 및 검정 2 (A2), 및 블랭크 검정 (B) 을 나타낸다. 노출 시간: 16s 및 이미지의 디스플레이 범위 (DR) : 1500...30000. 검정은 1:250 희석에서 pRb 항체 (CST #9308) 로 수행되었다.
도 16 은 pRb 검정 (1:250 CST #9308)pRB(-) : 용해물 12 (속이 채워진 삼각형) 로 스파이킹된 pRb 펩티드 표준의 7 지점 희석 시리즈 및 완충제 (속이 채워진 원) 중에서 pRb 펩티드 표준 (pRb-BSA 1x) 의 8 지점 희석 곡선에 대한 표준 곡선을 나타낸다. 나타낸 스파이크-인 곡선의 신호는 순수 용해물의 내인성 pRb 농도의 신호 기여에 대해 교정되었다 (오프셋 (블랭크) 신호의 값 및 다시-계산된 내인성 pRb 농도는 그래프에서 나타남). 그래프는 측정된 데이타 지점 (속이 채워진 데이타 지점) 및 한자리 결합 모델 (실선, Hill 피트) 의 피트 곡선을 나타낸다. 데이타 지점은 농도 당 N=5 복제 스팟의 평균 신호에 상응하고, 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. 검정 1 (상부) 및 검정 2 (하부). Lin-Log 플롯 (좌측) 및 Log-Log 플롯 (우측). r² > 0.99 의 상관계수.
도 17 은 pErk1/2 검정 (1:500 희석의 CST #9101 항체) 의 어레이 신호 이미지를 나타낸다. 이중 검정 1 (A1) 및 검정 2 (A2), 및 블랭크 검정 (B) 을 나타낸다. 노출 시간: 2s 및 이미지의 디스플레이 범위 (DR) : 500...30000. 검정은 1:500 희석에서 pErk1/2 항체 (CST #9101) 로 수행되었다.
도 18 은 pErk1/2 검정 (1:500 CST #9101) 에 대한 표준 곡선 : 완충제 중에서 pErk1/2 펩티드 표준 (pErk1-BSA 2.7x) 의 8 지점 희석 곡선 (속이 채워진 원) 및 pErk(-) 용해물 13 으로 스파이킹된 pErk1/2 펩티드 표준의 7 지점 희석 시리즈(속이 채워진 삼각형) 을 나타낸다. 나타낸 스파이크-인 곡선의 신호는 순수 용해물의 내인성 pErk1/2 농도의 신호 기여에 대해 교정되었다 (오프셋 (블랭크) 신호의 값 및 다시-계산된 내인성 단백질 농도는 그래프에서 나타냄). 그래프는 측정된 데이타 지점 (속이 채워진 데이타 지점) 및 한자리 결합 모델 (실선, Hill 피트) 의 피트 곡선을 나타낸다. 데이타 지점은 농도 당 N=10 복제 스팟의 평균 신호에 상응하고, 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. 검정 1 (상부) 및 검정 2 (하부). Lin-Log 플롯 (좌측) 및 Log-Log 플롯 (우측).
도 19 는 Erk1/2 검정 (1:1000 희석의 BioSource 44-654G 항체) 의 어레이 이미지를 나타낸다. 이중 검정 1 (A1) 및 검정 2 (A2), 및 블랭크 검정 (B) 을 나타낸다. 노출 시간: 2s 및 이미지의 디스플레이 범위 (DR): 500...30000.
도 20 은 Erk1/2 검정 (1:1000 Biosource 44-654G) 에 대한 표준 곡선 : 완충제 중에서 pErk1/2 펩티드 표준 pErk1-BSA 2.7x 의 8 지점 희석 곡선(속이 채워진 원) 및 pErk(-) 용해물 13 로 스파이킹된 pErk1/2 펩티드 표준의 7 지점 희석 시리즈 (속이 채워진 삼각형) 를 나타낸다. 그래프는 측정된 데이타 지점 (고체 지점) 및 모든 데이타 지점 (실선) 의 평균 신호를 나타낸다. 예측된 바와 같이 Erk1/2 검정은, 완충제 중에서 pErk1/2 펩티드 표준 희석에 대한 대부분의 제로 신호를 생성했고, pErk1/2 의 상이한 농도로 스파이킹된 모든 용해물 스팟에 대한 균일한 우세한 신호를 생성했다. 평균 신호는 스파이크-인 농도 상에서 독립적인 용해물 13 의 내인성 Erk1/2 수준을 나타낸다. 신호 축은 pErk1/2 검정에 대해서와 같은 규모였다 (도 19 참조). 데이타 지점은 각각의 스파이크-인 농도에 대한 N=10 복제 스팟의 평균 신호에 상응하고, 에러 바는 이들의 표준편차를 나타낸다. 검정 1 (좌측): 평균 신호 (표준 곡선) = 0.010±0.002 RFI, 평균 신호 (스파이크 곡선) = 1.097±0.057 RFI 및 검정 2 (우측): 평균 신호 (표준 곡선) = 0.008±0.002 RFI, 평균 신호 (스파이크 곡선) = 0.969±0.016 RFI.

용어 "관심 에피토프" 는 관심 친화성 시약에 의해 인식되는 폴리펩티드의 일부를 지칭한다. 관심 친화성 시약은 바람직하게는 관심 에피토프에 대해 특이적이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "에피토프 펩티드" 는 관심 에피토프를 포함하는 펩티드를 지칭한다. 에피토프 펩티드는 바람직하게는 12 내지 25 아미노산 길이이다. 보다 바람직하게는, 펩티드의 길이는 12 내지 20, 가장 바람직하게는 14 내지 17 아미노산 길이이다.

관심 에피토프는 변형, 예를 들어 인산화될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "인산화된 에피토프" 는 포스페이트 기를 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프를 지칭한다. 바람직하게는, 관심 에피토프는 1 내지 5 개의 인산화된 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 아미노산의 위치는 에피토프 펩티드의 대략 중간지점이다. 예를 들어, 15 아미노산 길이의 펩티드에서, 변형된 아미노산은 바람직하게는 위치 7, 8 및/또는 9 이다 (도 2C 참조). 아미노산을 변형 (예를 들어, 인산화) 하기 위한 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다.

에피토프 펩티드는 링커를 통해 단백질 담체에 공유적으로 결합되고 (도 1A 참조), 이에 의해 에피토프 펩티드는 링커에 공유적으로 결합되고 링커는 단백질 담체에 공유적으로 결합된다. 바람직한 구현예에서, 링커는 BSA 의 자유 N-말단 시스테인 (Cys) 기에 공유적으로 결합되는데, 이때 자유 Cys 기는 디술피드 가교에 포함되지 않는 시스테인 잔기이다.

에피토프 펩티드는 필수적으로 2 개의 단계로 단백질 담체에 부착될 수 있다:

단계 1) 링커는 에피토프 펩티드에 접합되고, 이때 상기 링커는 바람직하게는 택으로 라벨링된다. 링커는 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 펩티드의 N-말단에 부착된다.

단계 2) 링커의 자유 말단은 단백질 담체에 접합된다.

링커 또는 스페이서는 2 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5, 보다 바람직하게는 3 내지 4 개의 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 천연 아미노산은 특히 알라닌, 시스테인, 라이신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르테이트, 글루타메이트, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글리신, 발린, 루신, 이소루신, 아스파라긴, 글루타민, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신과 같은 자연 발생 아미노산이다. 비천연 아미노산은 자연적으로 발생하지 않는 아미노산이다. 비천연 아미노산에 대한 예는 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (Doa) 및 아미노옥시아세트산이다.

링커는 친수성이고 천연 아미노산 단독 또는 비천연 아미노산 단독 또는 천연 및 비천연 아미노산 둘 다의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 하나 이상의 하기 천연 아미노산을 포함한다: 시스테인, 라이신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르테이트, 글루타메이트. 또한 바람직하게는, 링커는 하나 이상의 Doa 를 포함한다. 보다 바람직하게는, 링커는 시스테인-Doa-Doa 이다.

바람직하게는, 링커는 Dabsyl 로 라벨링된다.

특정 아미노산 서열로 펩티드를 제조하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 적합한 방법은 예를 들어 문헌 [Merrifield, Science 1986, 232:341-347 (방법)] 및 [Carpino et al., J. Am. Chem. 1990, 112: 9651-52 (시약)] 에 기술된 고체상 합성법이다.

단백질 담체는 표면에 비특이적으로 결합하는 단백질이다. 바람직하게는, 단백질 담체는 20kDa 이상의 단백질이고, 친화도 검정에서 사용되는 친화성 시약으로 낮은 교차 반응성을 나타내거나 전혀 나타내지 않는다. 단백질 담체는 바람직하게는 알부민이고, 보다 바람직하게는 혈청 알부민, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 인간 혈청 알부민이다. 바람직한 혈청 알부민은 BSA 이다.

"관심 친화성 시약" 은 관심 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 시약이다. 바람직하게는, 관심 친화성 시약은 관심 에피토프에 대해 특이적이고 선택적이다. 친화성 시약은 항체, 앱타머, 또는 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPin) 일 수 있다. 바람직하게는, 친화성 시약은 항체이다.

"관심 항체" 는 임의의 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 IgG 항체, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 관심 항체는 인간화 항체 및 설치류 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 설치류 항체는 마우스, 래빗 및 래트 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 항체는 래빗 모노클로날 항체이다.

"관심 앱타머" 는 관심 에피토프에 높은 친화도로 결합하는 단일-가닥 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드 (15 내지 60 염기 길이) 이다.

"설계된 안키린 반복 단백질" 또는 "ARPin" 은 하나 이상의 안키린 반복을 포함하는 결합 분자이다. 안키린 반복은 루프에 의해 분리되는 2 개의 알파 나선으로 이루어진 단백질에서의 모티프이고, 이는 폭넓게 다양한 표적 단백질을 특이적으로 인식하도록 선택될 수 있다. 안키린 반복의 전형적인 길이는 33 아미노산이다. 항체와는 달리, 이들은 임의의 디술피드 결합을 함유하지 않고 모든 세포성 구획에서 발견된다.

더욱이, 본 발명은 표준 곡선의 생성에 대해 상기 기술된 바와 같은 교정 시약의 용도를 제공한다. 본 발명은 하기 단계를 포함하는 표준 곡선을 생성시키는 방법을 제공한다:

a) 둘 이상의 농도로 상기 기술되는 교정 시약을 어레이 상에 고정하는 것,

b) 탈착 가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 것,

c) 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 것, 및

d) 관심 에피토프의 양과 신호 세기의 상관관계를 나타내는 것.

표준 또는 교정 곡선은 정량적 연구 툴이고, 기질의 농도를 결정하기 위해 사용되는 검정 데이터, 즉 관심 에피토프의 농도를 플롯팅하는 방법이다.

용어 "결합된 친화성 시약" 은 관심 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 갖는 복합체를 형성하는 친화성 시약을 지칭한다. 형성된 복합체는 색도계, 형광 또는 화학발광과 같은 다양한 수단에 의해 검출된다.

친화성 시약은 친화성 시약에 부착되는 탈착가능한 라벨에 의해 검출될 수 있다. 바람직하게는, 상기 라벨은 형광 세기로 결합된 항체의 양이 측정되게 하는 형광물질이다. 다른 적합한 라벨은 예를 들어 알칼리 포스페이트 (AP) 및 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 이다.

또한, 친화성 시약은 2차 검출 시약에 의해 검출될 수 있다. 2차 검출 시약은 친화성 시약에 선택적으로 결합하는 라벨링된 분자이다. 마이크로어레이 상에 결합된 친화성 시약은 예를 들어, 친화성 시약의 종-특이적 에피토프를 인식하고 라벨링된 2차 항체 또는 Fab 단편을 사용함으로써 검출될 수 있다. 적합한 라벨은 형광물질, 비오틴, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 및 이소토프를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 2차 검출 시약 (예를 들어 2차 항체) 는 형광물질로 라벨링된다.

교정 시약에 결합되는 친화성 시약의 양은 바람직하게는 형광 신호와 같은 광학 신호에 의해 검출된다.

결합된 관심 친화성 시약의 양은, 친화성 시약의 검출가능한 신호를 측정함으로써 관심 에피토프의 양과 상관관계를 나타내고 각각의 신호는 관심 에피토프의 농도로 인한 것이다. 이들 결과는 표준 곡선에서 나타난다. 표준 곡선은, 관심 에피토프의 각각의 농도 (Y 축) 대 관심 에피토프의 농도 (X 축) 에 대한 결합된 관심 친화성 시약의 측정량을 플롯팅함으로써 산출될 수 있다. 결합된 친화성 시약의 양은 통상 검출된 신호 강도 (신호 세기) 로서 나타낸다. 바람직하게는, 상기 신호는 광학 신호, 보다 바람직하게는 형광 세기이다. 전형적으로, 표준 곡선을 생성시키기 위한 목적으로, 어레이 상에서 스팟은 교정 시약의 상이한 농도를 바람직하게는 희석 시리즈 (예를 들어 2배 희석 시리즈) 로 포함한다.

교정 시약의 공지된 농도에서 관심 에피토프의 농도는, 펩티드:담체 비를 측정함으로써 수득되고, 이는 하나의 단백질 담체에 접합되는 펩티드의 수이다.

펩티드:담체 비를 측정하기 위한 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 적합한 방법은 예를 들어 하기 단계를 포함하는 방법이다:

단계 1: 예를 들어 광도측정의 흡광도 측정에 의해 접합된 펩티드 농도를 측정하는 것, 이에 의해 펩티드 또는 펩티드에 부착된 링커는 바람직하게는 택으로 라벨링됨 (예를 들어 Dabsyl);

단계 2: 브래드포드 (Bradford) 시험을 통해 접합된 생성물의 총 단백질 농도를 측정하는 것, 및

단계 3: 펩티드:단백질 비를 계산하는 것.

바람직하게는, 링커는 예를 들어 Dabsyl 과 같은 택으로 라벨링되고, 이는 펩티드:단백질 담체 비를 측정하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 방법에 사용되는데 적합한 비는 10 및 그 이상의 수까지일 수 있다. 바람직하게는, 비는 3 미만이고, 보다 바람직하게는 1 과 같거나 1 미만, 가장 바람직하게는 비는 0.3 내지 1 이다.

관심 친화성 시약은 30 분 이상, 바람직하게는 1 시간 초과, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12시간±30 분) 동안 어레이 상에서 인큐베이션된다. 과량의 친화성 시약이 제거되고, 신호 세기를 측정하기 전에 어레이가 세척되는 것이 바람직하다.

어레이는 소수성 표면을 갖는 고체 지지체이고, 이는 표면에 단백질의 결합을 허용한다. RPA 및 다른 친화도 검정에 대한 어레이는 시판되고 당업자에게 익히 공지되어 있다. 교정 시약은, 어레이의 표면을 갖는 담체 단백질의 상호작용에 의해 어레이 상에 고정된다. 소수성 표면에 비특이적으로 결합하는 것을 피하기 위해, 스팟팅된 어레이는 바람직하게는 예를 들어 BSA 와 같은 비특이적 단백질로 후속적으로 코팅된다.

교정 시약은 2 가지 이상의 농도로 어레이 상에서 적용된다. 바람직하게는, 적용된 농도는 희석 시리즈를 형성한다 (예를 들어 1:2, 1:5, 또는 1:10 의 희석 시리즈). 교정 시약은 바람직하게는 3 가지 이상의 상이한 농도로 적용된다. 보다 바람직하게는, 교정 시약은 3 내지 20 가지의 상이한 농도로 적용되고, 심지어 5 내지 15 가지의 상이한 농도가 보다 바람직하다.

교정 시약은 스팟과 같이 어레이 상에서 원하는 위치에서 적용될 수 있다. 교정 시약은 전형적으로 완충제 중에서 용해된다. 완충제 용액은 약산 및 이의 짝염기 또는 약염기 및 이의 짝산의 혼합물로 이루어진 수용액이다. 적합한 완충제는 예를 들어, CSBL 스팟팅 완충제 (제조 번호 9020, Zeptosens, Witterswil, 스위스) 이다. 바람직한 구현예에서, 상기 완충제는 매트릭스 단백질을 포함한다. 바람직한 매트릭스 단백질은 BSA 이고, 보다 바람직하게는 매트릭스 단백질은 아세틸화된 BSA 이다. 전형적으로, 적용된 교정 시약 용액은 관심 친화성 시약을 갖는 어레이를 인큐베이션 하기 전에 건조된다.

어레이 상의 교정 시약의 스팟은 전형적으로 필드에서 배열된다. 어레이 필드는 예를 들어 정사각형, 직사각형, 원 및 삼각형과 같은 기하학적 면적을 형성할 수 있다. 어레이 레이아웃의 예는 도 1B 및 12 에 나타낸다. 2 개의 필드에서 스팟은 예를 들어 상이한 희석 시리즈 (상이한 농도 범위) 를 가질 수 있다. 양성 및 음성 대조군은 전형적으로 교정 시약보다 상이한 필드에서 배열된다.

표준 곡선으로, 샘플 중의 관심 단백질의 농도는 교정 시약이 다시 계산될 수 있는 것과 동일한 방식으로 진행된다.

따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 생물학적 샘플에서 관심 에피토프를 포함하는 단백질을 정량화하는 방법을 제공한다:

a) 어레이 상에서 하기를 고정하는 것:

i) 2 가지 이상의 농도의 상기 기술되는 교정 시약, 및

ii) 하나 이상의 생물학적 샘플,

b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 것,

c) 하나 이상의 생물학적 샘플의 각각에 대해 및 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 것,

d) 신호 세기와 관심 에피토프의 양의 상관관계를 나타내는 것,

e) 하나 이상의 생물학적 샘플에서 관심 에피토프를 포함하는 단백질을 정량화하는 것.

생물학적 샘플은 생물학적 기원이고 분자의 복합체 혼합물이다. 샘플은 예를 들어 세포의 용해물, 세포 추출물, 체액 (예를 들어 전혈, 혈정, 혈장, 소변, 조직액, 활액, 눈물, 타액 및 림프) 에 의해 형성될 수 있다. 샘플은 분획화되거나 비-분획화될 수 있다.

교정 시약과 같은 생물학적 샘플은 스팟으로서 어레이 상에서 원하는 위치에서 적용된다. 생물학적 샘플은 완충제로 희석될 수 있거나 희석되지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 완충제는 매트릭스 단백질을 포함한다. 바람직한 매트릭스 단백질은 BSA 이고, 보다 바람직하게는 매트릭스 단백질은 아세틸화된 BSA 이다. 전형적으로 적용된 샘플은, 관심 친화성 시약으로 어레이를 인큐베이션 하기 전에 건조시킨다.

생물학적 샘플의 스팟 및 어레이 상의 교정 시약은 전형적으로 필드에서 배열된다. 어레이 필드는 정사각형, 직사각형, 원 및 삼각형과 같은 기하학적 면적을 형성할 수 있다. 어레이 레이아웃의 예는 도 1B 및 12 에 나타낸다. 바람직하게는, 생물학적 샘플의 스팟은 교정 시약의 스팟 보다 또다른 필드에서 배열된다.

바람직하게는, 교정 시약의 적용된 농도는 희석 시리즈를 형성한다 (예를 들어 1:2, 1:5, 또는 1:10 의 희석 시리즈). 또한 바람직한 것은, 교정 시약이 3 가지 이상의 상이한 농도로 적용되는 것이다. 보다 바람직하게는, 교정 시약이 3 내지 20 가지의 상이한 농도로 적용되고, 심지어 보다 바람직한 것은 5 내지 15 가지의 상이한 농도이다. 생물학적 샘플에서 관심 펩티드의 예측 농도 근처로 교정 시약의 농도 범위 및 검출 방법의 작업 범위를 어떻게 선택하는지는 당업자에게 익히 공지되어 있다.

관심 친화성 시약은 30 분 이상 동안 어레이 상에서 인큐베이션되고, 바람직하게는, 어레이 상에서 1 시간 초과 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12 시간 ± 30 분) 동안 인큐베이션된다. 과량의 친화성 시약이 제거되고 바람직하게는 어레이는 신호 세기를 측정하기 전에 세척된다.

더욱이, 본 발명은 관심 친화성 시약의 검출, 민감도 및 역학 범위의 하한을 측정함으로써 친화성 시약을 특징화하기 위한 상기 기술된 표준 곡성의 용도를 제공한다.

용어 "검출 하한 (LOD)" 은 친화성 시약으로 검출될 수 있는 관심 에피토프의 최소량을 지칭한다. 친화성 시약의 용어 "역학 범위" 는 교정 시약의 측정가능한 농도 범위를 지칭한다. 역학 범위는 전형적으로 표준 곡선으로 결정되고, 이에 의해 역학 범위는 측정된 신호와 선형 또는 실질적으로 선형 상관관계인 교정 시약 농도의 범위이다. 용어 "검출 하한" 및 "역학 범위" 는 당업자에게 익히 공지되어 있다.

따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 관심 친화성 시약의 검출 하한을 결정하는 방법을 제공한다:

a) 어레이 상에서 2 가지 이상의 농도로 상기 기술되는 교정 시약을 고정하는 것,

c) 교정 시약의 2 가지 이상의 농도 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 것,

d) 관심 에피토프의 양과 신호 세기와의 상관관계를 나타내는 것, 및

e) 친화성 시약으로 검출될 수 있는 관심 에피토프의 최소량을 결정하는 것.

바람직한 구현예에서, 검출가능한 관심 에피토프의 최소량은 블랭크 + 블랭크의 표준편차 3 배에서 측정된 신호에 상응한다. 블랭크 수준은 교정 시약을 포함하지 않는 샘플의 검출되는 신호이나, 그렇지 않은 경우 교정 시약을 포함하는 샘플과 동일하다.

교정 시약은 상기 기술되는 바와 같이 적용된다. 바람직하게는, 적용되는 2 가지 이상의 농도로 희석 시리즈 (예를 들어, 1:2, 1:5, 또는 1:10 의 희석 시리즈) 를 형성한다. 또한 바람직하게는, 교정 시약은 3 가지 이상의 상이한 농도로 적용된다. 보다 바람직하게는, 교정 시약은 3 내지 20 가지의 상이한 농도, 심지어 보다 바람직한 것은 5 내지 15 가지의 상이한 농도로 적용되는 것이다.

관심 친화성 시약은 30 분 이상 동안 어레이 상에서 인큐베이션되고, 바람직하게는, 이는 어레이 상에서 1 시간 초과 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12 시간 ± 30 분) 동안 인큐베이션된다. 과량의 친화성 시약이 제거되고 바람직하게는 어레이는 신호 세기를 측정하기 전에 세척된다.

본 발명은 하기를 포함하는 관심 친화성 시약의 민감도를 결정하는 방법을 제공한다:

b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 것, 이때 상기 관심 친화성 시약은,

c) 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 것,

d) 관심 에피토프의 양과 신호 세기의 상관관계를 나타내는 것, 및 이에 의해 표준 곡선을 생성시키는 것,

e) 표준 곡선의 선형 부분을 결정하는 것, 및

f) 표준 곡선의 선형 부분의 경사도를 결정하는 것.

교정 시약은 상기 기술된 바와 같이 적용된다. 바람직하게는, 적용되는 2 가지 이상의 농도는 희석 시리즈 (예를 들어, 1:2, 1:5, 또는 1:10 의 희석 시리즈) 를 형성한다. 또한 바람직하게는, 교정 시약은 3 가지 이상의 상이한 농도로 적용된다. 보다 바람직하게는, 교정 시약은 3 내지 20 가지의 상이한 농도로 적용되며, 심지어 보다 바람직한 것은 5 내지 15 가지의 상이한 농도이다.

관심 친화성 시약 30 분 이상 동안 어레이 상에서 인큐베이션되고, 바람직하게는, 어레이 상에서 1 시간 초과 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12 시간 ± 30 분) 동안 인큐베이션된다. 과량의 친화성 시약이 제거되고 바람직하게는 어레이는 신호 세기를 측정하기 전에 세척된다.

본 발명은 하기를 포함하는 관심 친화성 시약의 역학 범위를 결정하는 방법을 제공한다:

a) 2 가지 이상의 농도로 상기 기술되는 교정 시약을 어레이 상에 고정하는 것,

e) 표준 곡선의 선형 부분을 결정하는 것, 및

f) 표준 곡선의 선형 부분의 관심 교정 시약의 농도 범위를 결정하는 것.

관심 친화성 시약은 30 분 이상 동안 인큐베이션되고, 바람직하게는 이는 어레이 상에서 1 시간 초과 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12 시간 ± 30 분) 동안 인큐베이션된다. 과량의 친화성 시약이 제거되고 바람직하게는 어레이는 신호 세기를 측정하기 전에 세척된다.

또한, 교정 시약은 친화성 시약의 특이성을 결정하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "특이성" 은 관심 에피토프에 대한 친화성 시약의 선택성을 지칭한다. 특이성이 낮은 친화성 시약은 또한 관심 에피토프 이외의 에피토프에 결합한다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 친화성 시약의 특이성을 결정하는 방법을 제공한다:

a) 하기를 어레이 상에 고정하는 것:

i) 관심 에피토프를 포함하는 상기 기술되는 교정 시약 및

ii) 단백질 담체에 접합되는 대조군 펩티드를 포함하는 하나 이상의 샘플 (이때 대조군 펩티드는 관심 에피토프를 포함하지 않음),

b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 어레이를 인큐베이션하는 것,

c) 어레이 상에서 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 것, 및

d) 대조군 펩티드와 상관관계를 나타내는 신호 세기와, 교정 시약의 관심 에피토프와 상관관계를 나타내는 신호 세기를 비교하는 것.

현저한 신호의 검출은, 관심 항체가 관심 에피토프 이외의 에피토프들 또한 인식하기 때문에 낮은 특이성을 갖는다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "현저한 신호" 는 백그라운드 신호보다 현저히 높은 신호이고, 이때 백그라운드 신호는 샘플의 부재 하에서 검출되는 신호이다 (예를 들어 스팟 사이에서 검출되는 신호). 현저히 높다는 것은, 통계적으로 유의한 백그라운드 신호와 차이가 있다는 것을 의미한다 (p ≤ 0.05, 바람직하게는, p ≤ 0.01).

바람직하게는, 어레이 상에서 스팟 당 적용되는 대조군 펩티드의 농도는 에피토프 펩티드의 농도에 근접한다 (± 5%). 유사한 펩티드 농도를 갖는 대조군 펩티드를 포함하는 샘플의 스팟 및 교정 시약의 스팟은 바람직하게는 필드에서 어레이 상에서 군집화되고, 이에 의해 필드는 예를 들어 정사각형, 직사각형, 원 및 삼각형과 같은 기하학적 영역을 형성할 수 있다. 2 개의 필드에서 샘플의 총 단백질 농도는 상이할 수 있다 (예를 들어 필드 1 에서 에피토프 농도가 높고 필드 2 에서 에피토프 농도가 낮음).

대조군 에피토프는 관심 에피토프를 포함하지 않으며, 이는 관심 에피토프와 상이하다. 대조군 에피토프의 이러한 에피토프 (대조군 에피토프) 는 예를 들어 관심 에피토프의 변형된 등가물일 수 있다 (예를 들어 관심 에피토프의 인산화되지 않은 등가물). 바람직하게는, 단백질 담체에 접합되는 대조군 펩티드를 포함하는 하나 초과의 샘플은 어레이 상에서 적용된다. 이들 샘플에서 대조군 펩티드는 상이한 농도를 가질 수 있거나 이들은 상이한 에피토프를 포함할 수 있다. 하나의 샘플에서 대조군 에피토프는 예를 들어 관심 에피토프의 인산화되지 않은 등가물일 수 있고 또다른 샘플에서 대조군 에피토프는 관심 에피토프와 상이한 아미노산 서열을 갖는다.

관심 친화성 시약은 어레이 상에서 30 분 이상 동안, 바람직하게는 1시간 이상 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12 시간 ± 30 분) 동안 인큐베이션된다. 과량의 혼합물의 제거되고 바람직하게는 어레이는 신호 세기를 측정하기 전에 세척된다.

대안적으로는, 검출가능한 관심 친화성 시약은 단계 a) 전에 관심 자유 에피토프 펩티드로 인큐베이션되고 단계 b) 에서 어레이는 친화성 시약 및 자유 펩티드의 혼합물로 인큐베이션된다.

따라서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 친화성 시약의 특이성을 결정하는 방법을 제공한다:

a) 관심 자유 에피토프 펩티드로 검출가능한 관심 친화성 시약을 인큐베이션하는 것,

b) 하기를 어레이 상에 고정하는 것:

i) 관심 에피토프를 포함하는 상기 기술되는 교정 시약 및

ii) 단백질 담체에 접합되는 대조군 펩티드를 포함하는 샘플 (이때 대조군 펩티드는 관심 에피토프를 포함하지 않음),

c) 단계 a) 의 자유 에피토프 펩티드 및 관심 친화성 시약의 혼합물로 어레이를 인큐베이션하는 것,

d) 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 어레이 상에서 측정하는 것, 및

e) 대조군 펩티드와 상관관계를 나타내는 신호 세기와, 교정 시약의 관심 에피토프와 상관관계를 나타내는 신호 세기를 비교하는 것.

"관심 자유 에피토프 펩티드" 는 또다른 분자에 부착되지 않는 관심 에피토프 펩티드이다. 특히, 자유 펩티드는 단백질 담체에 부착되지 않는다.

자유 펩티드의 농도는, 관심 친화성 시약이 자유 펩티드로 포화되도록 선택된다. 이러한 농도는 예를 들어 하기 방법에 의해 결정될 수 있다:

a) 자유 에피토프 펩티드의 2 가지 이상의 상이한 농도로 검출가능한 관심 친화성 시약을 인큐베이션하는 것,

b) 상기 기술되는 교정 시약을 2 개 이상의 어레이 상에 고정하는 것,

c) 단계 a) 의 자유 에피토프 펩티드 및 관심 친화성 시약의 혼합물로 어레이를 인큐베이션하는 것, 이때 각각의 어레이는 자유 에피토프 펩티드의 상이한 농도를 포함하는 혼합물을 가짐,

d) 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 어레이 상에 측정하고, 친화성 시약이 어레이 결합하지 않도록 친화성 시약을 이것으로 포화시키고 자유 펩티드의 농도를 측정하는 것.

자유 펩티드는 바람직하게는 관심 친화성 시약으로, 30 분 이상 동안, 바람직하게는 1 시간 이상 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12 시간 ± 30 분) 동안 인큐베이션된다.

관심 친화성 시약 및 자유 펩티드의 혼합물은 어레이 상에서 30 분 이상 동안, 바람직하게는 1시간 이상 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 16 시간 동안, 가장 바람직하게는 약 12 시간 (12 시간 ± 30 분) 동안 인큐베이션된다. 과량의 혼합물의 제거되고 바람직하게는 어레이는 신호 세기를 측정하기 전에 세척된다.

본 발명을 일반적으로 기술하는 것은, 하기 도면과 연계하여 특정 실시예를 참조로 하여 보다 잘 이해될 것이며, 이는 단지 설명할 목적으로 포함된 것이며, 달리 지시되지 않는 한 본원을 한정하고자 함이 아니다.

실시예 :

실시예에서 지칭되는 시판되는 시약은 달리 명시되지 않는 한 제조자의 지사항에 따라 사용되었다.

실시예 1: 재료 및 방법

용해물 샘플

단백질 농도를 변형된 브래드포드 시험에서 측정하였다 (Coomassie + 단백질 검정 시약 no. 23238, Pierce). 용해물 샘플을 사용시까지 -70℃ 에서 냉동고에 저장하였다.

표 1. 대조군 용해물 샘플.

Rb = 망막아세포종 종양 서프레서 단백질, Erk= 세포외 신호 조절 키나아제, p = 인산화된 아미노산 잔기.

상이한 작업 패키지에서 어레이 인쇄를 위해, 용해물 샘플을 CLB1 (용균 완충제) (Zeptosens) 에서 주어진 단백질 농도로 조정하고 최종적으로 CSBL 스팟팅 완충제 (Zeptosens)) 에서 1:10 으로 희석하였다. 최종 인쇄된 단백질 농도를 항상 각각의 구획에서 나타냈다.

역상 단백질 마이크로어레이 어레이 인쇄

전형적인 어레이 레이아웃은 도 1B 에서 도시된다. 각각의 어레이는 19 x 20 (380) 스팟을 함유했다. 320 스팟은 160 샘플 위치에 대해 사용하였고, 각각은 이중 스팟에서 인쇄하였다. 스팟 직경은 약 150 ㎛ 였다. 스팟-스팟 거리는 수평축에서 280 ㎛ 였고 수직 축으로 300 ㎛ 였다.

어레이는 12 개의 어레이 필드로 나뉜다. 각각의 필드는 12 개의 샘플 위치로 구성되고, 각각의 위치는 이중 스팟으로 인쇄된다. 12 개의 샘플 위치는 각각 4 위치의 3 열로서 배열되었다. 12-지점 희석 시리즈 (2배 희석) 는 위치 1 (최고 농도 = 출발 농도) 에서 위치 12 (최저 농도) 의 순서로 인쇄되고, 도 1B 를 참조한다. 화살표는 농도가 감소되는 방향을 나타낸다. 인접 어레이 필드는 거울 위치에서 배열된다. 이는 최저 표준 농도의 스팟을 충족시키는 최고 표준 농도의 스팟을 피하기 위해 행해졌다. 용해물은 대조군 필드에서 (이중 스팟에서 16 위치) 대조군으로서 공-어레이되었다.

상이한 작업 패키지에 대한 어레이는 모든 실험을 수행하는데 충분한 수량으로 시리즈 복제로 인쇄되었다 (칩 당 6 어레이). 각각의 시리즈를 위한 인쇄 용액은 액체 취급 로봇 (Tecan Genesis RSP 100) 스팟에 의해 384 웰 플레이트에서 신선하게 제조하였다. 각각의 표준 곡선을 위해, 출발 농도 (예를 들어 50 nM) 에서 표준 시약의 저장액을 제조하였다. 상이한 샘플 (12 x 2-배 희석) 을 플레이트 웰에서 시리즈 희석으로 제조하였다. 웰 당 부피는 25 ㎕ 였다. 대조군 용해물의 인쇄를 위해, 샘플을 균일한 출발 농도 (예를 들어 1.5 mg/ml) 로 조정하고 스팟팅 완충제 CSBL (예를 들어 최종 농도 = 150 ㎍/㎖) 에서 1:10 으로 희석하였다.

각각의 스팟은 시판되는 피에조-전기 어레이어 (Nanoploter NP2, GeSim GmbH, D-Groberkmannsdorf) 를 사용하여 약 400 피코리터 부피의 단일 방울로서 어레이하였다. 희석 시리즈 및 용해물 샘플과 함께, 형광-라벨링된 단백질로 이루어진 참조 재료는 랜딩 마크의 3 개의 별도의 열로 공-어레이되었다 (도 1B 참조). 이들 참조 스팟 (Ref) 은 어레이 조명의 국부적 불균질, 어레이-투-어레이 및 칩-투-칩 변형을 보충하기 위해 사용되었다. 어레이를 클린룸 조건 하에서 제조하였다.

희석 시리즈 및 용해물 대조군을 위한 샘플을 냉동된 저장액으로부터 항상 신선하게 제조하였다.

스팟팅 후, 마이크로어레이를 BSA 로 블로킹하고, ddH₂0 로 철저하게 세척하고, 질소 스트림 하에서 건조시키고 사용시까지 +4℃ 에서 암실에서 저장하였다. 측정을 위해, 유체 구조를 각각의 검정 조건에서 분석대상물-특이적 항체 용액으로 개별적으로 칩의 6 개의 동일 어레이 각각으로 어드레싱하기 위해 칩에 부착하였다 (어레이 당 챔버 부피는 약 15 ㎕ 임)

항체 및 검정 시약

표 2 는 본 연구에 사용된 단백질 및 상응하는 항체의 목록이다.

표 2. 단백질 분석대상물 및 항체의 목록.

NMI-TT 는 모든 기타 시약, 예를 들어 역상 단백질 어레이 (RPA) 상에서 검정을 수행하는데 요구되는 시약, 완충제를 제공한다.

항-종 Fab 단편은 마이크로어레이 상에서 검정 신호 생성을 위한 검출 시약으로서 사용되었다.

Alexa Fluor 647 라벨링된 항-래빗 IgG Fab 분자 (Z-25308, Molecular Probes) (각각의 분석대상물에 결합되는 래빗 폴리클로날 항체를 검출하기 위함).

검정 완충제 (항체)

RPA 측정을 위한 검정 완충제 (검정 완충제) 는 50 mM 이미다졸/HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20, 0.005% 나트륨 아지드였고, 5% (w/v) BSA 의 첨가로 pH7.4 였다.

인쇄 완충제 (교정 시약)

인쇄 완충제는 CSBL (Zeptosens - a Division의 Bayer Schweiz AG) 였다.

하기 시약을 본 연구 동안 첨가물로서 사용하였다: BSA (#T844.2, Roth) 아세틸화된 BSA (#05491, Fluka).

역상 단백질 어레이 - 검정 절차 및 데이타 분석

어레이 상에서 단백질 분석대상물의 검출을 직접적인 2-단계의 순차적 면역검정으로 수행하였다. 제 1 단계는, 마이크로어레이 상에서 검정 완충제에서 분석대상물-특이적 항체의 첨가 및 25℃ 에서 밤새 인큐베이션하는 것으로 이루어졌다. 검정 완충제로 세척함으로써 과량의 항체를 제거한 후, 마이크로어레이를 암실에서 25 ℃ 에서 1 시간 동안 형광-라벨링된 항-종 Fab 단편으로 인큐베이션하였다. 이러한 연구에서 적용되는 래빗 항체의 검출을 위해, 검정 완충제에서 500-배 희석에서 Fab 단편을 사용하였다. 최종적으로, 어레이를 세척하고 용액 중에서 ZeptoREADER® 이미저 장치 (Zeptosens) 로 이미징하였다.

추가의 경쟁 실험을 수행하여 항원-항체 결합의 특이성을 용액 중에서 및 어레이 스팟 상에서 시험하였다. 이를 위해, 자유 합성된 펩티드 생성물 (각각 적용되는 항체를 위한 특이적 결합 에피토프 서열) 을 검정 완충제 용액 중에서 1차 항체로 함께 혼합하고 반응 혼합물을 어레이 상에서 인큐베이션 하기 전에 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 모든 다른 검정 단계를 상기 기술되는 정상 검정에 필적할만한 조건에서 수행하였다. 자유 펩티드의 농도를 적용되는 항체 농도의 몰과량으로 선택하였다 (표 2 참조). 경쟁을 위한 펩티드 농도는 달리 언급되지 않는 한 전형적으로 1000 nM, 100 nM 및 10 nM 에서 선택된다.

ZeptoREADER® 는 마이크로어레이의 자동 고 처리량 판독을 위한 벤치 탑 용액이다. 간단하게 말하면, 36 까지의 마이크로어레이 (6 칩) 을 하나의 담체 상으로 마운팅할 수 있다 (MTP 풋프린트 포맷). 통합된 스태커는 단일 런으로 360 까지의 마이크로어레이 (10 전체적으로 로딩된 담체) 를 의도치않게 판독하는 것을 허용하였다. 마이크로어레이는 532 nm (녹색) 및 635 nm (적색) 에서 여기될 수 있고; 형광 방출은 547-597 nm (녹색) 내지 650-700 nm (적색) 에서 통과하는 방출 필터로 검출된다. 본 연구를 위해, 각각의 어레이에 대해 전형적으로 9 형광 이미지의 시리즈를 0.5 내지 16 초의 노출 시간에서 적색 검출 채널 중에서 취하고 ZeptoVIEW^TM PRO 소프트웨어 (Zeptosens) 로 추가로 분석하기 위해 16 비트 티프 포맷으로 저장하였다.

마이크로어레이 분석

마이크로어레이 이미지를 소프트웨어 ZeptoVIEW^TM Pro 2.0 (Zeptosens) 를 사용하여 분석하였다. 어레이 분석 그리드의 스팟 직경 (이는 마이크로어레이로 정렬됨) 을 160 ㎛ 에서 일정하게 세팅하였다.

각각의 측정을 위한 데이타 분석을 하기와 같이 수행하였다:

적절한 노출 시간의 하나의 분석대상물 이미지의 선별 (모든 스팟 신호는 이미지의 포화 아래임).

백그라운드-교정된, 각각의 개별 스팟에 대해 참조로 된 평균 신호 세기의 계산 (RFI = 참조 형광 세기 단위). 참조 신호를 국소 샘플 및 참조 스팟 신호의 비로서 계산하였다.

하나의 인쇄 조건의 모든 복제 스팟을 위해 (대부분의 경우 이중 스팟), 백그라운드-교정된, 각각의 이중 스팟 쌍의 참조 평균 세기 (RFI) 를 평균냈다. 도면 및 표에서 신호는 각각의 평균 신호를 나타내고, 에러 바는 표준편차에 상응한다. 평균 적용되는 복제 스팟의 수 (N) 를 나타낸다.

또한, 분석대상물-특이적 1차 항체의 부재 하에서 블랭크 검정 실험은 2차 검출 시약의 비특이적 결합 기여를 가능하게 하기 위한 대조군으로 수행하였다. 모든 블랭크 이미지의 RFI 신호는 무시할만큼 낮았고 (표준 및 용해물 샘플에 대해) 따라서 데이타 분석 공정으로 고려되지 않았다.

희석 곡선의 데이타 지점 (이중 스팟의 평균 신호) 은 엑셀 내장 소프트웨어 패키지 XLfit v4.3.0 (IDBS, Guildford UK) 을 사용하여 피팅하였다. 피팅을 위해, 한자리 결합 자리 모델을 선택했다 (피팅 함수 #251:y = D+((Vmax*(x^n))/((x^n)+(Km^n))), D = 신호 오프셋, Vmax = 포화 신호, Km = 친화도 상수, n=1 결합 자리).

평균 블랭크 신호 (4 최저 데이타 지점) + 3-배 표준편차에서 피트로부터 표준 농도는 다시-계산된 바와 같았다.

실시예 2: 교정 시약의 제조 (펩티드-단백질 접합체)

펩티드 서열

4 개의 항원을 조사를 위해 선택하였다. 이들 항원은 히스톤 H3, Rb 인산화된, 인산화된 Erk1/2 및 Erk1 였다. 4 펩티드 서열은 선택된 항체 각각에 대해 선택된 항원 4 개의 선형 결합 에피토프를 나타낸다. 에피토프 서열 정보는 항체 판매회사로부터 입수하였다. 항원 에피토프 아미노산 서열, 길이, 항원의 에피토프 위치 및 각각의 항체 정보를 표 3 에 요약하였다.

표 3. 항원, 에피토프 펩티드 서열 및 상응하는 항체 정보 목록

인간 Erk1 (p44 MAPK) 및 Erk2 (p42 MAPK) 의 인산화 자리에 대항하는 항체 (단백질의 중심에 위치함) 는 아미노산 위치 Thr202 및 Tyr204 주변에 동일한 에피토프 아미노산 서열을 공유한다. Erk1 MAPK 의 총 형태에 대항하는 항체 (여기서는 BioSource 로부터 선택됨) 는 단백질의 C-말단에 위치하는 상이한 선형 서열 영역에 대항하여 레이징된다. 다른 판매회사의 항체에 대해서도 이러한 서열이 종종 사용될 수 있다. 2 개의 단백질 Erk1 (SEQ. ID NO: 5) 및 Erk2 (SEQ. ID NO: 6) 의 완전한 펩티드 서열이 도 2A 및 2B 에 나타난다. Erk1 단백질 (위치 317-339) 에 대해 본 연구에서 사용된 선택되는 에피토프 서열은 3 개의 위치에서 아미노산 차이를 제외하고는, 상응하는 C-말단 Erk2 서열에 대해 상동이다.

펩티드 합성

4 개의 선택되는 항원 각각에 대해, 2 개의 펩티드를 NMI-TT 로 합성하였다. 2 개의 펩티드는 (i) 면역검정에서 경쟁 시약으로서 사용되는 자유 펩티드 형태 및 (ii) RPA 칩 상에서 표준 시약 분자로서 BSA 단백질에 콘쥬게이션되는데 사용되는 기능화 형태로 구성된다. 기능화 펩티드는 캡핑 사이클을 사용하여 혈청 알부민 단백질에 공유적으로 커플링되기 위한 N-말단 Cys-스페이서 기능으로 합성하였다. Doa-Doa (Doa = 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산) 를 C18 길이 등가의 (PEG-유사) 친수성 스페이서로서 선택하였다. 캡핑 사이클을 합성에 사용하여 양호한 특이성을 달성하였고 단백질 콘쥬게이션을 위한 올바른 표적 서열의 최종 풍부함을 달성하였다. 합성 후, 펩티드를 양호한 순도를 위한 HPLC 및 올바른 분자 질량을 위한 질량 분광측정법 (MS) 으로 품질 대조하였다. 상응하는 질량 정보를 갖는 합성된 펩티드 생성물의 서열 정보 및 달성되는 순도를 표 4 에 나타냈다.

표 4. NMI-Technologietransfer GmbH (Reutlingen, 독일) 사제의 8 개의 펩티드 생성물 목록.

각각의 항원에 대해, 펩티드의 유리 형태를 경쟁 시약으로서 합성하고, BSA 단백질 (표준 시약) 에 공유 콘쥬게이션을 위해 기능화 형태로 합성하였다. 펩티드의 기능화 형태를 첨부된 N-말단 스페이서 Dabs-Cys(C)-Doa-Doa 로 합성하였다. Dabs = Dabsyl (흡광도 라벨). Doa = 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (친수성 스페이서). Cys (C) 를, 티올 화학을 통해 BSA 에 펩티드를 공유적으로 커플링하기 위해 기능기로서 사용하였다. 펩티드를 N-말단 자유 (H2N) 또는 아세틸화된 형태 (Ac), 및 C-말단 자유 (COOH) 또는 아미드화 형태 (CONH2) 로서 합성하였다. 인산화된 아미노산을 볼드체로 표시하였다 (funct. = 기능화, 포스포, p = 인산화된).

모든 펩티드는 상술된 바와 같이 95% 초과 (이들 중 대부분이 99% 초과)의 고 순도 및 올바른 분자 질량에 도달했다. 주요 차이점이 이들 펩티드의 합성 동안 나타났다.

펩티드-단백질 접합

최종 표준 시약을 펩티드-단백질 접합체 각각과 같이 제조하였다. 이를 위해, 펩티드의 각각의 기능화 형태는 3 개의 상이한 비에서 (비는 표 5 에 나타냄) 몰 과량으로, 이의 자유 N-말단 Cys 기에 공유적으로 커플링을 통해 미리-활성화된 (말레이미드-활성화된) 소 혈청 알부민 (BSA) 으로 접합하였고, 2 mg 의 단백질을 각각의 커플링 반응을 위해 사용하였다. 펩티드 커플링은 문헌 [Poetz el al., Proteomics 5, 2402-2411 (2005)] 에서 이미 기술되어 있다. 간단히 말하면, 고체 펩티드를 100% DMSO 중에서 농축된 저장액으로서 용해시키고 최대 20% 에서 DMSO 를 함유하는 pH 7.4 완충제에서 PBS 중에서 작업 농도로 후속적으로 희석시켰다. 펩티드 및 활성화된 BSA 용액을 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 접합되지 않은 펩티드는, 스핀 컬럼 (크기 배제) 에 의해 제거하고 접합 단백질의 분획을 pH 7.4 PBS 중에서 수집하였다. 후속적으로, 펩티드-단백질 분획의 (커플링된) 펩티드 농도는, 466 nm 에서 분광광도계의 흡광도 측정에 의해 결정되었다 (스펙트럼 Dabsyl 흡광도의 최대, 점멸 계수 33'000 M^-1cm^-1, 펩티드 당 하나의 라벨). 펩티드-단백질 분획의 흡광도 색은 눈으로 선명하게 보였다 (도 2 참조).

접합체 분획의 단백질 농도는 브래드포드에 따라 측정되었다. 총 단백질 농도는 대략 1.5 mg/ml 였다. 형성된 생성물의 측정된 펩티드 농도, 총 단백질 농도 및 최종 계산된 펩티드:단백질 (염료:단백질) 비를 표 5 에 요약하였다.

표 5. 펩티드-단백질 접합체로서 제조된 표준 시약 12.

각각의 항원에 대해, 펩티드-단백질 접합체의 2 변형체를, 상이한 펩티드:단백질 몰비를 구성하여 제조하였다. 접합된 펩티드 농도는 대조군으로서 활성화된 라벨링되지 않은 단백질 (BSA) 을 사용하여 펩티드-통합된 Dabsyl 라벨의 광도측정의 흡광도 측정을 통해 결정하였다. 접합된 생성물의 총 단백질 농도를, Bradford 시험을 통해 측정하였다. 펩티드:단백질 비를 접합된 펩티드의 질량 첨가에 대해 올바른, 염료:단백질 몰비로서 계산하였다.

펩티드 접합체의 품질 대조를, 참조로서 순수 예비-활성화된 BSA 를 사용하여 DS-PAGE (4-12% 겔) 을 통해 수행하였다. 겔을 60 분 동안 쿠마시 염색하였다. 겔 이미지는 예측된 바와 같은 순수 생성물 밴드를 나타냈고, 질량 시프트는 상이하게 계산된 펩티드:단백질 커플링 비에 상응했다. 전형적으로, 최종적으로 측정된 커플링 비는 초기 제조된 몰 과량의 펩티드:단백질의 비의 17-40% 에 달했고, 이는 다른 펩티드로 이미 실험한 것에 따르는 것이었다. 이러한 변이는 적용되는 고 출발 농도에서 상이한 용해도일 수 있고/있거나 예를 들어 수성 커플링 완충제 중에서 펩티드의 배좌 구조일 수 있다.

모든 4 개의 펩티드-단백질 접합체 표준 시약은 PAGE 에 따라 순수한 것이었다.

최종적으로, 모든 펩티드 시약을 동결건조시켰다: 최소 5 mg 의 각각의 자유 펩티드 (4 경쟁자 시약), 및 최소 1 mg 의 각각의 펩티드-단백질 접합체 (4 표준 시약, 선별된 펩티드:단백질 비에서).

재조합 단백질 및 SDS - PAGE 대조군 ( 히스톤 , Erk )

상이한 판매회사로부터 8 개의 재조합 단백질을 펩티드 표준 (표 6) 에 대한 전체적인 단백질 대안으로서 공통으로 선택하였다. 7 개의 단백질 (2x 히스톤 H3, 5x Erk) 을 참조 단백질로서 BSA 를 사용하여 SDS-PAGE 로 품질 대조하였다.

표 6. 재조합 단백질의 목록.

단백질의 순도는 겔 전기영동 후 단일 밴드로부터 명백한 바와 같이 양호했다. 그러나, 단일 밴드의 신호 세기는 참조로서 로딩되는 BSA 의 동일량과 비교시 단백질의 상이한 농도를 나타내는 큰 차이점을 나타냈다. 명백하게, 판매회사의 데이타 시트에서 주어진 농도의 값은 믿을만하지 못했다. 따라서, 단백질 밴드의 통합 신호 세기를, 공-로딩된 BSA 에 비해 최선의 올바른 농도로 추정하기 위해 분석하였다. 따라서, 교정 인자 결과는 하기에서 인쇄된 모든 표준 희석 시리즈의 샘플 제조에서 고려되었다 (표 6 참조).

검정 및 인쇄 조건의 최적화 - 제 1 표준 곡선

제 1 실험에서, 상이한 어레이 세트 상에서 검정을 수행하였고, 이는 상이한 조성 및 조건에서 상이한 펩티드-BSA 시약의 표준 곡선으로 인쇄되어, 후속적으로 시험된 면역검정 성능 상에서 이들의 결과를 시험하였다. 하기 조건을 시험하였다:

상이한 펩티드:단백질 접합 비를 갖는 펩티드-BSA 시약의 표준 곡선

(히스톤H3-BSA, pRb-BSA 및 pErk-BSA 에 대해 시험됨)

추가의 단백질 매트릭스 첨가 (BSA) 의 존재 및 부재 하에서 인쇄된 펩티드-BSA 시약의 표준 곡선

12 시리즈 희석 곡선 (2-배 희석) 으로서 표준 곡선을 인쇄하고, 이중 스팟으로서 각각을 희석시켰다 (실시예 1 : 재료 및 방법에 기술된 바와 같음). 인쇄를 위한 상이한 시약의 출발 농도를 50 nM 의 균일한 에피토프 농도로 조정하였다. 또한, 양성 및 음성 대조군 용해물을 동일한 어레이로 공동-인쇄하였다. 용해물 샘플을 0.25 mg/ml 의 총 단백질 농도에서 어레이하였다. 면역 검정을 지시된 항체 조건에서 수행하였다. 검성 성능 상에서 관찰된 차이점을 이들 결과를 기초로 하여 질적으로 평가하고, 시약의 이들 유형으로 기존 경험, 최적 인쇄 및 검정 조건을 선택하였다.

상이한 펩티드:단백질 접합 비를 포함하는 펩티드 시약의 표준 곡선

일반적으로, 상이한 펩티드:단백질 비에서 인쇄된 펩티드 표준 시약의 표준 곡선은 검정에서 비교할만한 신호 대부분을 제공했다. 검정 이미지를 도 3 에 도시하였다. 그러나, 가장 낮은 펩티드-단백질 접합 비의 펩티드 표준 시약 (1 훨씬 미만) 은, 도넛-유사 스팟 형태학을 나타내는 경향이 있는 반면, 가장 높은 접합 비의 시약은 보다 낮은 검정 신호 반응을 제공하는 경향이 있다 (참조, 특히 pErk1/2 검정에 대해). 후자는 BSA 분자 당 하나 초과의 에피토프 서열을 함유하는 고정된 펩티드-BSA 분자로 보다 낮은 검정 항체의 결합 접근성으로서 간섭될 수 있다 (여기서, 전형적으로 가장 높은 비에 대해 3-6). 추가 실험에 대해, 본 발명자들은 중간 콘쥬게이션: 히스톤H3-BSA 2.7x (0.41 펩티드:단백질), pRb-BSA 1x (0.41 펩티드:단백질) 및 pErk-BSA 2.7x (0.89 펩티드:단백질)의 시약을 선택하였다.

신호 및 농도의 역학 범위

인쇄된 표준 곡선 상에서 검정은, 매우 두드러지는 신호를 나타내고 신호의 높은 역학 범위를 나타내고, 이는 하나의 이미지에서 동일한 측정 및 하나로부터 추출될 수 있다. 도 4 는 히스톤H3-BSA 2.7x 및 pErk-BSA 2.7x 의 경우에 대해 각각 양적인 신호 분석을 나타냈다. 양호한 선형성을 갖는 1-자리 결합 모델 (r² > 0.99) 의 낮은 말단 곡선에 대해 신호를 완벽히 피팅하였다. 신호의 역학 범위는 하나의 이미지 내에서 농도의 10의 4승배를 커버했다 (1 노출 시간). 검정의 역학 범위는 1-2 순서로 추가로 확장될 수 있는데 (본 발명자들의 경험으로), 이는 판독기가 상이한 노출 시간에서 이미지 기록을 허용하고 상이한 그레이 필터 사용을 허용하기 때문이다.

이들 인쇄된 제 1 표준 곡선의 출발 농도는 50 nM 에서 선택되었다. 공동-인쇄된 대조군 용해물 샘플에 비교한 신호에서, 표준 곡선의 검정 신호인 것으로 드러났고, 따라서 표준의 최고 출발 농도는 각각의 대조군 용해물의 고유 값 (수준) 보다 훨씬 높았고, 특히 인산화된 단백질 분석대상물에 대해 그러하다. 따라서, 표준 곡선의 출발 농도는 각각 조정되어야만 했다. 또한, 음성 및 양성 대조군 용해물의 신호 차이, 각 발현 수준은 매우 낮았고, 특히 인산화된 분석대상물 pErk 및 pRb 에 대해 그러하다 (명백하게, 제조된 세포주의 양성 처리는 차선책이었다). 따라서, 신규 대조군 용해물을 제조하고 제공하였다 (표 1 참조).

매트릭스 단백질 첨가의 존재/부재 하에서 펩티드- BSA 시약의 표준 곡선

또다른 어레이 세트에서, 펩티드 표준 시약의 표준 곡선 및 제 1 재조합 단백질을 3 가지의 상이한 완충제 조건에서 인쇄하였다: (i) 임의의 추가 단백질 첨가의 부재 하에서, 및 (ii) 50 ㎕/ml (iii) 100 ㎕/ml 의 매트릭스 단백질 (아세틸화된 BSA = acBSA) 의 존재 하에서 (도 5A 에 도시함). 이는, 스팟 형태학 상에서 매트릭스 단백질 첨가의 결과를 시험하기 위해 행해졌다. 표준 곡선 신호 (후속적으로 검정을 수행하는 것을 생성함) 는, 매트릭스 단백질의 첨가가 없는 것에 비해 보다 양호하고 보다 균질한 신호 분포를 야기했다 (다른 적용으로부터 예측된 바와 같음). 이러한 결과는 재조합 단백질 뿐만 아니라 펩티드 시약의 표준 스팟에 대해서도 관찰되었다. 동시에, 평균 스팟 신호는 대부분 변하지 않고 남아 있었고, 이는 단백질 첨가가 스팟 내에서 표준 분자의 일정한 수의 재조직화를 주로 야기했다는 것을 나타낸다. 첨가된 매트릭스 단백질은 전형적으로 보다 큰 스팟 직경을 생성하였고, 이는 용해물 샘플의 스팟 직경에 대해 보다 양호하게 필적했다. 또한, 이는 보다 일정하게 용해물 샘플 스팟 및 차후의 표준 데이타 분석을 만들었다. acBSA 매트릭스 단백질 (100 ㎕/ml) 의 보다 높은 농도의 첨가는, 펩티드 시약에 대해 도넛-형상화된 신호 스팟 형태학을 야기했다. 매트릭스 단백질의 유형의 영향을 시험하기 위해 또다른 실험을 수행하였다: BSA 의 변형되지 않은 형태 및 아세틸화된 형태의 첨가를 표준 곡선에서 직접 비교하였다. 결과를 도 5B 에 도시하고 (히스톤 H3 에 대해 나타냄) acBSA 가 균질한 스팟 신호를 생성하기 위해 보다 높은 효력을 갖는 것을 나타냈다. 스팟의 평균 신호는 비교할만한 것이다. 지금까지 우리의 시험으로부터 결론내자면, 본 발명자들은 재조합 단백질 뿐만 아니라 펩티드 표준 새약의 표준 곡선의 인쇄에 대해 최선의 균일한 조건을 선택했다 (CSBL 완충제 + 50 ㎕/ml acBSA).

최선의 선택된 인쇄의 요약 및 본 연구에 대한 검정 조건:

모든 표준 곡선에 대해 선택된 균일한 인쇄 조건:

스팟팅 완충제 CSBL + 50 ㎕/ml 아세틸화된 BSA (acBSA) 의 첨가

희석 시리즈 (펩티드 표준) 에 대해 선택된 출발 농도:

10 nM 히스톤 H3

1 nM pRb

2.5 nM pERk1/2

5 nM ERk1/2

선택된 검정 조건 (항체 희석):

히스톤 H3 검정에 대해 1:10000

pRb 검정에 대해 1:250

pErk1/2 검정에 대해 1:500

Erk1/2 검정에 대해 1:1000 (3 항체)

인쇄된 참조 스팟의 신호는 4 s 이미지 노출 시간에서 전형적으로 15000 그레이로 조정하였다.

실시예 3: 용액 중에서 자유 펩티드로 경쟁 실험으로부터 유래되는 교정 시약의 특이성

어레이를 4 펩티드 표준 시약의 표준 곡선으로 인쇄하였다 (히스톤H3-BSA 2.7x, pRb-BSA 1x, pErk-BSA 2.7x 및 Erk1-BSA 2.7x) 및 모든 이용가능한 재조합 단백질을 비교하였다 (12 지점 희석을 갖는 12 표준 곡선). 대조군 용해물 샘플 대조군 (음성 및 양성 대조군, 새로운 전달 샘플) 을 400 ㎍/ml 및 250 ㎍/ml 의 총 단백질 농도에서 공동-인쇄하였다. 표준 및 대조군 용해물을 스팟팅 완충제 CSBL 중에서 제조하고, 50 ㎍/ml acBSA 의 첨가로 제조하였다. 표준 곡선 샘플의 출발 농도를 조정하여, 최종 양성 대조군 용해물의 검정 신호에 도달시켰다. 어레이 레이아웃 및 조건을 표 7 에 요약하였다.

표 7. 경쟁 실험을 위한 어레이 레이아웃: 인쇄된 표준 곡선, 적용된 시약 및 용해물 대조군의 조건. 제 1 컬럼에서의 수는 도 1B 에 나타낸 대조군 필드에서 위치 또는 어레이 필드를 지칭한다.

상응하는 자유 펩티드의 증가하는 농도의 존재 및 부재 (정상 검정) 하에서 4 개의 단백질 분석대상물 각각에 대해 어레이 상에서 검정을 수행하였고, 이를 어레이 상에서 인큐베이션 (경쟁 검정) 전에 각각의 항체 용액으로 예비-혼합하였다. 전형적으로, 자유 펩티드의 3 개의 상이한 농도 (달리 지시되지 않는 한 1000 nM, 100 nM 및 10 nM) 를 어레이 스팟 상에서 특이적 항체-단백질 분석대상물의 형성을 억제하기 위해 각각의 항체로 복합체에 대한 이들 효능에 대해 시험하였다. 또한, 경쟁 검정을 상응하는 재조합 단백질로 예비-인큐베이션하고 항체 용액으로 수행하여, 자유 펩티드 시약과 특이성 및 이들의 경쟁 효력을 비교하였다. 블랭크 검정 (1차 항체의 부재 하에서) 을 추가의 대조군으로서 수행하였으나, 이들의 신호는 무시할만큼 낮았고 따라서 정량적 데이타 분석에서 고려되지 않았다.

표 8 내지 11 은 최대 표준 곡선 신호 면에서 정량적 결과를 요약한다.

Erk1/2 검정의 결과는 Biosource 로부터 Erk1/2 항체 뿐만아니라, 2 개의 추가로 선택된 CST 항체 (#4695 rb 모노클로날 및 #9102 rb 폴리클로날) 가, pErk-BSA 표준 스팟이 아닌 오직 Erk1-BSA 표준 스팟 (및 비교 신호 세기에서) 만을 특이적으로 인식한다는 것을 나타낸다. 이는, 본 프로젝트에 사용된 상이한 3 개의 판매회사로부터의 3 개의 항체 모두가, 단백질의 C-말단 마지막에서 매우 유사한 펩티드 모티프에 대항하여 레이징되었음을 내포하는 것이다. 이는 추가의 이전 경쟁 실험에 의해 추가로 확증되었으며 (첨가 실험), 이는 Erk1/2 인산화 자리 (본 프로젝트에서 사용된 바와 같음) 의 아미노산 서열을 나타내나 인산화되지 않은 (탈-포스포 펩티드, NMI 에서 시판) 자유 에피토프 펩티드의 존재 하에서 CST (#9102) 로부터의 Erk1/2 항체로 수행하였다. 경쟁 검정에서, 전에 나타낸 바와 같은 달리 비교할만한 조건 하에서 수행하였고, 이러한 탈-포스포 펩티드는 표준 특정 신호을 억제할 수 있었고, 각각의 Erk1/2 정상 검정에서 관찰되었다 (데이타에서 나타나지 않음). 따라서, CST 로부터 구입한 Erk 항체가 총 및 Erk1/2 단백질의 인산화된 형태를 구분하기 위해 상이한 단백질 에피토프 서열을 사용하는 것으로 밝혀졌다.

표 8. 히스톤 H3 검정 (1:10'000) 에 대한 모든 어레이 필드의 표준 곡선 신호의 신호 값 (최대) 의 표. 특정 표준 곡선의 신호는 밑줄로 나타낸다.

표 9. pRb 검정 (1:250) 에 대한 모든 어레이 필드의 표준 곡선 신호의 신호 값 (최대) 의 표. 특이적 표준 곡선의 최대 신호를 볼드체로 나타냄.

표 10. pErk1/2 검정 (1:500) 에 대한 모든 어레이 필드의 표준 곡선 신호의 신호 값 (최대) 의 표. 특이적 표준 곡선의 최대 신호를 볼드체로 나타냄.

표 11. 1:1000 희석에서 3 개의 상이한 항체로 수행된 Erk1/2 검정에 대한 모든 어레이 필드의 표준 곡선 신호의 신호 값 (최대) 의 표: (상부) Biosource 44-654G, (중간) CST #4695 rb 모노클로날, 및 (하부) CST #9102 rb 폴리클로날 항체. 특이적 표준 곡선의 최대 신호를 볼드체로 나타냄.

실시예 4: 교정 시약 - 검출 한계의 민감도 ( LOD )

동일한 레이아웃의 어레이 상에서 수행한 모든 검정을 도 1B 및 표 7 에서 나타냈다. 어레이는 모든 4 펩티드 표준 시약 (히스톤H3-BSA 2.7x, pRb-BSA 1x, pErk-BSA 2.7x 및 Erk1-BSA 2.7x) 및 비교를 위한 (12 지점 희석 곡선을 갖는 12 표준 곡선) 모든 이용가능한 재조합 단백질의 표준 곡선으로 이루어졌다. 펩티드 표준 곡선의 최고 농도를 히스톤 H3 표준에 대해 10 nM, pRb 표준에 대해 1 nM, pErk 표준에 대해 2.5 nM 및 Erk 표준에 대해 5 nM 로 조정하였다. 이들 출발 농도를, 양성 대조군 용해물에 의해 생성되는 최고치의 내인성 신호에 따라 선택하였다. 이에 따라 단백질 표준의 농도를 제조하고 SDS-PAGE 교정 인자를 적용하여 조정하였다. 대조군 용해물 샘플 (음성 및 양성 대조군, 새로운 전달 포함) 을 400 ㎍/ml (≥ 4 mg/ml 단백질 농도로 입수가능한 저장액에 대해) 및 250 ㎍/ml의 총 단백질 농도에서 공동-인쇄하였다. 표준 및 대조군 용해물을 스팟팅 완충제 CSBL 중에서 제조하고, 50 ㎍/ml acBSA 를 첨가하였다.

경쟁을 완료하는데 (경쟁 검정) 효과적인 최고의 농도에서 자유 펩티드의 존재 및 부재 (정상 검정) 하에서 4 개의 단백질 분석대상물 각각에 대해 검정을 수행하였다. 각각의 조건 (정상 검정, 경쟁 검정) 을 이중 검정으로 (조건 당 2 개의 어레이) 측정하였다. 블랭크 검정 (1차 항체의 부재 하에서) 을 대조군으로서 추가로 측정하였다. 모든 어레이 이미지를 정량적으로 분석하였다. 각각의 어레이의 12 어레이 필드 각각에 대해 각 검정, 표준 신호를, 인쇄된 12-지점 희석 시리즈 각각으로부터 추출된 데이타 지점으로 한자리 결합 모델을 피팅함으로써 생성시켰다. 검출 한계 (LOD) 를, 블랭크 수준 (4 개의 최저 데이타 지점) + 각 3-배 표준편차에서 평균 신호에 상응하는 다시-계산된 농도로서 피트 곡선으로부터 측정하였다.

이중 검정에 대해 정상 및 경쟁 검정의 생성된 표준 곡선 (데이타 지점 및 피트 곡선, 및 다시-계산된 LOD 값) 을 도 7 내지 11 에서 나타냈다. LOD 는 각각의 표준 곡선에 대해 그래프에 주어졌다. 피트 곡선의 양호한 품질은 r² > 0.99 의 상관계수로 달성하였다.

히스톤 H3-BSA 펩티드 표준에 특이적으로 결합하는 Abcam 항체 및 또한 히스톤 H3 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 Abcam 항체는, Upstate 로부터 인간 단백질이 가장 유망하다. 펩티드 표준 및 재조합 단백질 (Upstate) 의 표준 곡선의 신호 세기를 잘 비교될 수 있다. 2 개의 검정의 생산성은 매우 양호했다. 신호 CV 는 펩티드 표준에 대해 약 12% 및 히스톤 H3 단백질 (Upsate) 에 대해 약 13% 가 전형적이다. 평균 LOD 는 펩티드 표준에 대해 0.123 = 0.019 nM, 및 재조합 단백질 (Upstate) 에 대해 0.156 = 0.023 nM 였다. LOD 값은 이중 검정으로 잘 재생되었고, 펩티드 표준 및 단백질에 필적할 만했다 (도 7).

CST 항체는 pRb-BSA 펩티드 표준에 특이적으로 결합했고 CST 항체는 Active Motif 로부터 pRb 재조합 단백질에 특이적으로 결합했다. 그러나, 단백질 표준 곡선의 신호 세기는 명백히 낮았고 펩티드 표준 곡선의 오직 약 10% 에 달했다. 단백질이 부분적으로 인산화되거나 인산화되지 않는 것으로 추정하였다 (주석: 공공 데이타 뱅크에서 pRb 및 Rb 주석은 동일한 단백질에 대해 평행으로 사용되고, 여기서 사용되는 pRb 가 인산화된 단백질을 나타냄). 2 개의 검정의 재생산은 매우 양호했다. 신호 CV 는 펩티드 표준에 대해 전형적으로 약 7% 였고 pRb 단백질에 대해 약 12% 로 약간 높았다. LOD 값은 이중 검정으로 잘 재생되었다. 평균 LOD 는 펩티드 표준에 대해 0.025 = 0.001 nM, 및 for 재조합 단백질에 대해 0.097 = 0.020 nM 였다 (도 8).

CST 항체는 오직 pErk1/2-BSA 펩티드 표준에 특이적으로 결합하고, Erk1-BSA 표준에는 결합하지 않았다. CST 항체는 또한 pErk1 재조합 단백질 (Invitrogen) 에 우세하게 결합되고 각각 pErk1/2-BSA 펩티드 표준 신호의 약 25% 의 신호 세기에 달했다. CST 항체는 중요치 않은 정도로 pErk (Active Motif) (약 12%) ≥ Erk1 (CST) (약 11%) > Erk1 단백질 (Invitrogen) (약 3%) 에 결합했다. 신호는 pErk1 단백질 (Invitrogen) 의 신호에 대해 주어졌다 (%). 2 개의 검정의 재생은 매우 양호했다. 신호 CV 는 전형적으로, 펩티드 표준에 대해 약 2% 이고, pErk1 단백질 (Invitrogen) 에 대해 약 6% 로 약간 높았다. LOD 값은 이중 검정으로 재생되었다. 평균 LOD 는 펩티드 표준에 대해 0.030 = 0.002 nM, 및 pErk1 단백질 (Invitrogen) 에 대해 0.055 = 0.003 nM 였다 (도 9). 피트 곡선의 양호한 품질이 r² > 0.99 의 상관계수로 달성되었다.

Biosource 항체는 오직 Erk1-BSA 펩티드 표준에 특이적으로 결합하였고, pErk1-BSA 표준에는 결합하지 않았다. Biosource 항체는 Erk1 및 pErk1 재조합 단백질에 특이적으로 결합했고 (상이한 단백질 중에서 가장 우세하게 입수가능함), 이들 단백질 및 Erk1-BSA 펩티드 표준에 필적할만한 신호 세기가 잘 생성되었다. Biosource 항체는 적은 정도로 Erk2 단백질 (Biosource) > pErk (Active Motif) > Erk1 (CST) 에 결합했다. 2 개의 검정의 재생은 매우 양호했다. 신호 CV 는 전형적으로 펩티드 표준에 대해 약 3% 였고, Erk1 단백질에 대해 약 8% 및 pErk1 단백질에 대해 약 5% 로 약간 높았다. LOD 값은 이중 검정으로 잘 재생되었다. 평균 LOD 는 펩티드 표준에 대해 0.046±0.001 nM, 및 재조합 Erk1 단백질 (Invitrogen) 에 대해 0.072±0.013 nM, 및 재조합 pErk1단백질 (Invitrogen) 에 대해 0.044±0.004 nM 였다 (도 10 및 11).

피트 곡선의 양호한 품질이 r² > 0.99 의 상관관계 계수로 달성됐다.

실시예 5: 용해물로 스파이킹된 표준 곡선 (5 및 10 복제 스팟 )

무수 단백질 분석대상물 농도의 측정

레이아웃의 어레이 상에서 수행한 검정을 하기 도 12 에 나타냈다. 어레이는 3 펩티드 표준 시약 히스톤H3-BSA 2.7x, pRb-BSA 1x 및 pErk-BSA 2.7x 으로 이루어졌다. 희석 시리즈는 2-배 희석으로 8 지점 시리즈로서 인쇄되었다. 2 가지 유형의 희석 시리즈를 각각의 펩티드 시약에 대해 인쇄하였다: 하나의 시리즈는 실시예 4 와 유사하게 스팟팅 완충제 (CSBL + 50 ㎍/ml acBSA) 로 인쇄하였고, 예를 들어 4 로 사용되는 바와 같은 동일한 출발 농도로 적용하였다. 각각의 단백질에 대해 음성인 용해물로 스파이킹된 7-지점 희석 시리즈로서 인쇄되었다. 스파이킹된 희석 시리즈에서 용해물의 적용되는 총 단백질 농도를 150 ㎍/ml 에서 일정하게 유지하였다. 용해물로 스파이킹된 최고의 출발 농도를 완충제에서 각각의 시리즈의 출발 농도의 반으로서 선택하였다. 적어도 스파이크-인 시리즈 각각의 샘플, 순수 음성 용해물 (스파이크 농도의 부재 하에서) 을 블랭크 대조군으로서 인쇄하였다.

표 11: 인쇄된 표준 희석 시리즈의 조건, 적용된 시약 및 스파이킹된 용해물을 표 1 에 나타냈다. 검정 레이아웃을 도 12 에 나타냈다.

이중 검정 (2 어레이 상에서) 이중 검정을 4 개의 단백질 분석대상물 각각에 대해 수행하였다. 블랭크 검정 (1차 항체의 존재 하에서) 을 대조군으로부터 추가로 측정하였다. 모든 어레이 이미지를 정량적으로 분석하였다. 각각의 어레이의 6 어레이 필드의 각각에 대해 각 검정, 표준 신호 곡선을, 인쇄된 8-지점 희석 시리즈 각각으로부터 추출된 데이타 지점으로 한자리 결합 모델을 피팅함으로써 생성시켰다. 각각의 시리즈에서 입수되는 복제 스팟의 최대 수에 대해 데이타 지점을 평균 냈다 (N=5 또는 N=10). 비교를 위해, 평균 신호를 또한 이중 스팟에 대해 계산하였다 (각각의 필드의 중심 열). 검출한계 (LOD) 를, 이전 기술된 바와 같이 피트 곡선으로부터 결정하였다. 또한, 스파이크-인 시리즈의 신호는 내인성 (블랭크) 신호에 대해 올바른 것이였고, 올바른 신호는 완충제 중에서 표준 곡선으로 프로젝팅되었다.

결과를 도 13 내지 20 에 나타냈다.

히스톤 H3 펩티드: 검정은 히스톤 H3 펩티드 표준의 희석 곡선에 대한 특이적 신호 반응을 나타냈다. 블랭크 검정은 제로 반응을 나타냈다. 히스톤 H3 으로 스파이킹된 용해물의 신호는 완충제 중에서 표준 곡선의 신호 (비교) 를 따랐으나, 오프셋 세기가 약간 낮았다 (순수 용해물의 내인성 히스톤 H3 신호 수준의 차감 후). 2 개의 검정의 재생은 매우 양호했다. 순수 용해물 중에서 히스톤 H3 단백질의 내인성 농도를 표준 곡선 피팅으로부터 용해물의 블랭크 신호의 다시-계산에 의해 측정하였다. 평균 농도는 0.063±0.005 nM 였다. 다른 용해물 스팟은 낮은 신호를 미미하게 나타냈다 (도 13 및 14). 피트 곡선의 양호한 품질은 r2 > 0.99 의 상관계수로 달성되었다.

pRB 검정: 검정은 pRb 펩티드 표준의 희석 곡선에 대해 특이적 신호 반응을 나타냈다. pRb 로 스파이킹된 용해물의 신호는 완충제 중에서 표준 곡선의 신호를 비교하며 따랐고, 오프셋 세기는 보다 낮았다 (순수 용해물의 내인성 pRb 신호 수준의 차감 후). 2 개의 검정의 재생은 매우 양호했다. 순수 용해물 중에서 pRb 단백질의 내인성 농도는 표준 곡선 피팅으로부터 용해물의 블랭크 신호의 다시-계산에 의해 측정되었다. 내인성 단백질의 평균 농도는 0.066±0.010 nM 였다. 용해물 6 을 함유하는 다른 스팟 (히스톤 H3 에 대해 음성) 및 용해물 13 (pErk1/2 에 대해 음성) 은 이들 용해물 중에서 pRb 단백질의 내인성 수준을 명백히 나타내는 상이한 세기에서 일정 신호를 나타냈다. 피트 곡선의 양호한 품질은 r² > 0.99 의 상관계수로 달성되었다 (도 15 및 16).

pERK1/2 검정 (CST #9101): 검정은 pErk1/2 펩티드 표준의 희석 곡선에 대해 특이적인 신호 반응을 나타냈다. 블랭크 검정은 제로 반응을 나타냈다. pErk1/2 로 스파이킹된 용해물의 신호는 완충제 중에서 표준 곡선의 신호를 따랐으나, 오프셋 세기가 약간 높았다 (순수 용해물의 내인성 pErk 신호 수준의 차감 후). 2 개의 검정의 재생은 매우 양호했다. 순수 용해물 중에서 pErk1/2 단백질의 내인성 농도를 표준 곡선 피팅으로부터 용해물의 블랭크 신호의 다시-계산에 의해 측정하였다. 내인성 단백질의 평균 농도는 0.149±0.005 nM 였다. 용해물 6 (히스톤 H3 에 대해 음성) 및 용해물 12 (pRb 에 대해 음성) 를 함유하는 다른 스팟은 이들 용해물 중에서 pErk1/2 단백질의 내일성 수준을 명백히 나타내는 상이한 세기에서 일정한 신호를 나타냈다. 양호한 품질의 피트 곡선은 r² > 0.99 의 상관계수로 달성되었다 (도 17 및 18).

pERK1/2 검정 (BioSource 44-654G): 검정으로, 예측되는 바와 같이, 모든 적용되는 펩티드 표준의 희석 곡선에 대해 신호 반응이 없는 것으로 밝혀졌다. 블랭크 검정은 제로 반응을 나타냈다. 용해물을 함유하는 모든 스팟은 이들 용해물 중에서 Erk1/2 단백질 의 내인성 수준을 명백히 나타냈다.

복제 스팟의 증가된 수의 결과에 대한 일반적인 주목:

모든 4 개의 검정에 대해, 변형의 공계수 상에서 복제 스팟의 수의 결과에 대해 분석 데이타를 비교하였다 (CV). 모든 분석대상물-특이적 신호의 평균 신호를 복제 스팟 신호 (조건 당 N=5 또는 N=10) 및 N=2 복제 스팟 신호로부터 형성시켰다 (어레이 필드 각각에서 중심 열로부터 선택됨). 거의 모든 경우에서, 이중 스팟 분석의 CV 는 N=5 또는 N=10 복제 스팟 분석에 대해 필적할만하거나 약간 적었다 (이를테면, 모든 실험을 통해 CV 의 지속적인 낮은 수준에서 이러한 점이 관찰됨).

실시예 6: 일반적 주목

펩티드 표준 시약의 이점:

분자의 조성 (펩티드 대 단백질 비) 을 재생 방식으로 잘 제조할 수 있었고 - 분자 당 에피토프 서열의 농도/수는 각각의 펩티드 서열에서 작은 흡광도 라벨 (Dabsyl) 의 도입으로 잘 측정될 수 있었다. RPA 검정에서 라벨의 역효과는 관찰되지 않았다. 합성 펩티드 표준의 인산화 정도는 잘 측정되었고 100% 였다.

대조적으로, 시판되는 재조합 단백질 제조의 인산화 정도는, 아마 크게 다양할 수 있고 측정이 용이하지 않았다 (상이한 판매회사의 수 개의 단백질 후보자로 본 결과를 참고, Erk/pErk 의 경우).

펩티드-단백질 접합체는 균일 담체 단백질로서 BSA 를 사용했다 (BSA 는 단백질 어레이 적용을 위해 분자를 잘 특징짓는다). 상이한 에피토프 펩티드 표준의 신호 반응이 (동일한) 담체 단백질 특성에 의해 크게 충격받지 않을 것으로 예상되었다.

대조적으로, 상이한 판매회사의 재조합 단백질로부터 검정 신호 반응에서 우세한 차이점이 측정되었고 (예를 들어 Erk 의 경우), 이는 상이한 단백질 제조로 인해 그러할 수 있고 특징적이다 (상이한 발현 시스템, ±GST-택, ±His-택).

조성

- 합성된 펩티드의 모든 4 개의 자유 형태는 펩티드 표준 신호의 완전한 경쟁을 달성했다. 포스포-에피토프에 대해 적용되는 항체의 보다 높은 친화도에 대해 나타낼 수 있는 보다 낮은 농도에서 전체 경쟁에서 도달했다. 검정 반응 상에서 경쟁자 펩티드의 주요 영향 또는 반대 결과 또는 어레이 품질이 관찰되지 않았다.

- 대조적으로, 경쟁자로서 사용되는 재조합 단백질은 백그라운드 어레이 상에서 추가 신호를 생성시키고 (특이적 스팟 신호보다 부분적으로 높은 인자 예를 들어 히스톤 H3 단백질의 경우), 이는 어레이 분석을 어렵게 만들거나 심지어 불가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 재조합 단백질은 또한 기원적 표준 곡선의 신호를 억제하는 것으로 보인다. 그러나, 재조합 단백질은 대조군 용해물의 신호를 억제할 수 없었고, 심지어는 용해물 중에서 다른 단백질에 비특이적으로 결합하는 것으로 인해 용해물 스팟 상에서 추가의 신호를 생성시켰다. 이는, 펩티드가 경쟁자 시약으로서 명백히 바람직함을 내포한다.

- 용해물 스팟 상에서, 펩티드로 경쟁하는 것은 용해물 신호의 완전한 억제를 야기했으나 (예를 들어 히스톤 H3 용해물에 대해), 심지어 적용되는 경쟁자의 최고 농도에서 기저 신호를 떠나 억제하였고 (예를 들어 pRb, pErk 용해물에 대해), 이는 적용되는 항체의 특정 비특이적 결합 기여로 인한 것이다. 따라서, 경쟁 및 정상 검정을 평행적으로 사용하는 것은 모든 미래의 관심 분석대상물을 측정하기 위해 통상적 개념으로서 제안된 것이다.

표준 곡선 및 검정의 품질

- 생성되는 표준 곡선은 RPA 상에서 인쇄된 희석 시리즈를 형성하는 것은, 복제 스팟 신호의 낮은 CV 에서 확대된 고 품질로 생성되었고 모든 경우에서 r² >0.99 의 상관계수로 데이타 지점으로 양호하게 피팅되었다. 펩티드 시약의 표준 곡선은 재조합 단백질의 표준 곡선 보다 상관관계 (보다 적은 r² 값) 를 양호하게 피팅하는 경향을 나타냈다.

- 이중 스팟 (N=2) 의 CV 신호 및 복제 스팟의 증가된 수의 신호 (N=5, N=10) 는, 인쇄된 이중 스팟으로부터 표준 곡선이 최적 결과를 제공함을 필적할만하게 나타냈다.

- 또한, 이중 검정의 재생은 평균 표준 신호 (어레이 대 어레이) 의 낮은 CV 에서 확대된 것으로 매우 양호했고, 이는 10 퍼센트의 범위였다. 펩티드 시약의 표준 곡선은 재조합 단백질에 대해서보다 (평균 CV = 9%) 낮은 CV (평균 CV = 6%) 경향을 나타냈다.

- 2 개의 총 단백질 분석대상물의 표준 곡선의 신호 세기 (히스톤 H3 및 Erk1) 은 매우 양호하게 매칭되었다. 2 개의 인산화된 단백질 분석대상물 (pRb 및 pErk) 의 표준 곡선은 재조합 단백질에 대해 낮은 신호를 나타냈고, 아마도 인산화의 규정된 정도가 낮고 덜하기 때문인 것으로 보인다.

도면은 이중 검정의 어레이 이미지를 도시하고 있고 완충제 중에서 펩티드 표준 곡선의 그래프, 각각의 용해물로 스파이킹된 펩티드 표준의 곡선 및 완충제 중에서 펩티드 표준의 조합 곡선 및 순수 용해물의 내인성 단백질 농도의 교정 후 용해물로의 스파이킹을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Calibration Reagent and Uses thereof <130> 8723 NDR <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Gln Leu Ala Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> PHOSPHORYLATION <400> 2 Gly Asn Ile Tyr Ile Ser Pro Leu Lys Ser Pro Tyr Lys Ile Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 3 Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Arg Ile Thr Val Glu Glu Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Pro Thr Asp Glu 20 <210> 5 <211> 379 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (202)..(202) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (206)..(206) <223> PHOSPHORYLATION <400> 5 Met Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg 1 5 10 15 Thr Glu Gly Val Gly Pro Gly Val Pro Gly Glu Val Glu Met Val Lys 20 25 30 Gly Gln Pro Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Gln Leu Gln Tyr Ile 35 40 45 Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg 50 55 60 Lys Thr Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Gln Ile Leu Leu Arg Phe Arg 85 90 95 His Glu Asn Val Ile Gly Ile Arg Asp Ile Leu Arg Ala Ser Thr Leu 100 105 110 Glu Ala Met Arg Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp 115 120 125 Leu Tyr Lys Leu Leu Lys Ser Gln Gln Leu Ser Asn Asp His Ile Cys 130 135 140 Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 145 150 155 160 Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asn Thr 165 170 175 Thr Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Ala Asp 180 185 190 Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg 195 200 205 Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys 210 215 220 Ser Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser 225 230 235 240 Asn Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His 245 250 255 Ile Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile 260 265 270 Ile Asn Met Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ser Lys Thr 275 280 285 Lys Val Ala Trp Ala Lys Leu Phe Pro Lys Ser Asp Ser Lys Ala Leu 290 295 300 Asp Leu Leu Asp Arg Met Leu Thr Phe Asn Pro Asn Lys Arg Ile Thr 305 310 315 320 Val Glu Glu Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro 325 330 335 Thr Asp Glu Pro Val Ala Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Met Glu Leu 340 345 350 Asp Asp Leu Pro Lys Glu Arg Leu Lys Glu Leu Ile Phe Gln Glu Thr 355 360 365 Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala Pro 370 375 <210> 6 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (184)..(184) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (186)..(186) <223> PHOSPHORYLATION <400> 6 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly Gln 1 5 10 15 Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly Glu 20 25 30 Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys Val 35 40 45 Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr Cys 50 55 60 Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His Glu 65 70 75 80 Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu Gln 85 90 95 Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu Tyr 100 105 110 Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr Phe 115 120 125 Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn Val 130 135 140 Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr Cys 145 150 155 160 Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro Asp 165 170 175 His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr 180 185 190 Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser Ile 195 200 205 Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn Arg 210 215 220 Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile Leu 225 230 235 240 Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile Asn 245 250 255 Leu Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Pro His Lys Asn Lys Val 260 265 270 Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro Asn Ala Asp Ser Lys Ala Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val Glu 290 295 300 Gln Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro Ser Asp 305 310 315 320 Glu Pro Ile Ala Glu Ala Pro Phe Lys Phe Asp Met Glu Leu Asp Asp 325 330 335 Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala Arg 340 345 350 Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser 355

Claims

링커를 통해 단백질 담체에 부착되는 펩티드를 포함하는 교정 시약으로서, 상기 펩티드가 관심 에피토프를 포함하는 시약.
제 1 항에 있어서, 관심 에피토프가 하나 이상의 인산화된 아미노산을 포함하는 교정 시약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 펩티드가 12 내지 25 의 아미노산 길이인 교정 시약.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 담체가 소 혈청 알부민 (BSA) 인 교정 시약.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 시스테인 및 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산을 포함하는 교정 시약.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드:단백질 담체 비가 0.3 내지 1 인 교정 시약.
하기 단계를 포함하는, 표준 곡선을 생성시키는 방법:
a) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 교정 시약을 2 가지 이상의 농도로 어레이 상에 고정하는 단계,
b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 단계,
c) 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 단계, 및
d) 신호 세기와 관심 에피토프의 양의 상관관계를 나타내는 단계.
하기 단계를 포함하는, 샘플에서 관심 에피토프를 포함하는 단백질 농도를 정량화하는 방법:
a) 하기를 어레이 상에 고정하는 단계:
i) 2 가지 이상의 농도의 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 교정 시약, 및
ii) 하나 이상의 생물학적 샘플,
b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 단계,
c) 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대해 및 하나 이상의 생물학적 샘플 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 단계,
d) 신호 세기와 관심 에피토프의 양의 상관관계를 나타내는 단계, 및
e) 하나 이상의 생물학적 샘플에서 관심 에피토프를 포함하는 단백질을 정량화하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 관심 친화성 시약의 검출 하한을 결정하는 방법:
a) 2 가지 이상의 농도로 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 교정 시약을 어레이 상에 고정하는 단계,
b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 단계,
c) 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 단계,
d) 신호 세기와 관심 에피토프의 양의 상관관계를 나타내는 단계, 및
e) 친화성 시약으로 검출될 수 있는 관심 에피토프의 최소량을 결정하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 관심 친화성 시약의 민감도를 결정하는 방법:
a) 2 가지 이상의 농도로 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 교정 시약을 어레이 상에 고정하는 단계,
b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 단계,
c) 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대한 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 단계,
d) 신호 세기와 관심 에피토프의 양의 상관관계를 나타내고, 이에 의해 표준 곡선을 생성시키는 단계,
e) 표준 곡선의 선형 부분을 결정하는 단계, 및
f) 표준 곡선의 선형 부분의 경사도를 결정하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 관심 친화성 시약의 역학 범위를 결정하는 방법:
a) 2 가지 이상의 농도로 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 교정 시약을 어레이 상에 고정하는 단계,
b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 상기 어레이를 인큐베이션하는 단계,
c) 2 가지 이상의 농도의 교정 시약 각각에 대해 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 측정하는 단계,
d) 신호 세기와 관심 에피토프의 양의 상관관계를 나타내고, 이에 의해 표준 곡선을 생성시키는 단계,
e) 표준 곡선의 선형 부분을 결정하는 단계, 및
f) 표준 곡선의 선형 부분의 관심 교정 시약의 농도 범위를 결정하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 관심 친화성 시약의 특이성을 결정하는 방법:
a) 하기를 어레이 상에 고정하는 단계:
i) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 교정 시약 및
ii) 단백질 담체에 접합되는, 관심 에피토프를 포함하지 않는 대조군 펩티드를 포함하는 하나 이상의 샘플,
b) 검출가능한 관심 친화성 시약으로 어레이를 인큐베이션하는 단계,
c) 결합된 친화성 시약의 신호 세기를 어레이 상에서 측정하는 단계, 및
d) 대조군 펩티드와 상관관계를 나타내는 신호 세기와, 교정 시약의 관심 에피토프와 상관관계를 나타내는 신호 세기를 비교하는 단계.
제 12 항에 있어서, 검출가능한 관심 친화성 시약이 단계 a) 전에 관심 자유 에피토프 펩티드로 인큐베이션되고, 단계 b) 에서 어레이는 친화성 시약 및 자유 펩티드 혼합물로 인큐베이션되는 방법.
제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 교정 시약이 매트릭스 단백질의 존재 하에 고정되는 방법.
표준 곡선을 생성시키기 위한 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 교정 시약의 용도.
특히 상기 실시예를 참조로 하여 이미 설명된 바와 실질적으로 같은 단백질, 펩티드, 방법 및 용도.