CN111896741A - 制备和肽素抗体及建立检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备和肽素抗体及建立检测方法，属于肽化学和免疫学领域。本发明的目的是提供了人CPP抗原表位肽抗原，用于产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体，用此抗体建立检测CPP方法及CPP体外诊断试剂盒。本发明CPP抗原表位肽、合成CPP‑N抗原表位肽、合成CPP‑M肽。本发明制备出特异性CPP抗原，产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体，用于建立检测CPP方法和CPP体外诊断试剂盒，其中一种为快速定量检测CPP浓度免疫层析试纸条，检测血液或体液中CPP水平,用于判定AMI,中风等多种疾病的发生。
Description
技术领域
本发明属于肽化学和免疫学领域。
背景技术
精氨酸加压素 (Arginine Vasopressin, AVP)基因位于20号染色体上，编码一个164氨基酸肽，称为精氨酸加压素原, 它是由下丘脑-神经垂体系统的神经元产生。精氨酸加压素原结构包括信号肽、AVP、神经物理素IINeuropathysinⅡ）及和肽素（Copeptin，CPP）。
AVP含有9个氨基酸的短肽，又称为抗利尿激素或血管加压素，AVP能与V1a, V2,V1b受体作用，发挥其生物效应：V1a受体有很强的收缩小动脉的作用；兴奋V2受体可产生抗利尿效应，促进肾脏的保水作用，维持体内渗透压和心血管稳态平衡；V1b受体存在于腺垂体及胰岛细胞，具有内分泌调解活性。AVP是能调节渗透压、血液动力学、血液凝集、并影响内分泌、神经效应的肽类激素。AVP分泌受到高渗透压、血容量不足、下丘脑渗透压感受器、神经调节等因素影响。由此可见，AVP参与调节神经系统，心血管系统，内分泌系统，泌尿系统功能。
研究发现，脑血管栓塞、急性心肌梗死、高血压、慢性阻塞性肺病，糖尿病患者血液中AVP水平明显升高，血液中AVP水平升高代表多种疾病的发生。然而，检测血循环中AVP水平具有挑战性, 因为AVP是一个不稳定的短肽,半衰期小于20分种，并且大部分AVP与血小板结合，需要寻找AVP的替代指标。
精氨酸加压素原从下丘脑到脑垂体的转移过程中被裂解, 释放出等摩尔量AVP和CPP到循环中。CPP是位于精氨酸加压素原-C末端并发生糖基化的39个氨基酸肽，CPP生理功能可能参与AVP肽折叠过程。与AVP不同，CPP在循环中半衰期很长，有几天时间,无酶切位点和受体，体内几乎不降解，主要由肾脏排泄。可用免疫学方法测定血液中CPP水平，因此, 将CPP作为 AVP 释放的替代标记物。
研究发现, 多种急性疾病中,下呼吸道感染、败血症、中风和急性胰腺炎等患者血液中CPP水平持续升高，并且持续升高CPP水平与疾病严重程度之间存在正相关系。特别是急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI)发生时，循环中CPP水平立即升高,AMI患者急性期循环中CPP水平可持续升高，ST段抬高AMI患者的 CPP水平高于非ST段抬高急性冠脉综合征 (Acute coronary syndromes，ACS)患者，因而，检测血循环中CPP水平是诊断多种疾病，特别是AMI发生及进展的重要指标，需要开发检测循环中CPP水平的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供了人CPP抗原表位肽抗原，用于产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体，用此抗体建立检测CPP方法及CPP体外诊断试剂盒。
本发明CPP抗原表位肽氨基酸序列
SEQ ID NO.1: CASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY;
合成CPP-N抗原表位肽，氨基酸序列
SEQ ID NO.2：CKIEISNATQLDGPA
合成CPP-M肽，氨基酸序列
SEQ ID NO.3：FHYKSNATQLDGPAGALL 。
本发明CPP抗原表位肽(SEQ ID NO.1)偶联载体蛋白,形成 CPP抗原表位肽抗原；CPP-N抗原表位肽(SEQ ID NO.2)偶联载体蛋白，CPP-N抗原表位肽抗原；载体蛋白包括牛血清白蛋白（BSA)、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白(OVA)、蓝载体蛋白(BCP)。
本发明CPP抗原表位肽抗原，免疫动物(鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴,马等），产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明CPP抗原表位肽抗原，免疫动物(鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴,马等），用CPP-M肽（SEQ ID NO.3）筛选出CPP-N单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明CPP单克隆抗体或多克隆抗体，建立检测CPP方法，包括免疫层析法，酶联免疫吸附法，化学发光法，电化学发光法，微流体检测技术，免疫芯片技术，免疫生物传感器技术等。
本发明CPP单克隆抗体或多克隆抗体，建立检测CPP体外诊断试剂盒，其中一种为快速定量检测CPP免疫层析试纸条；所述试纸条包括PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述的结合垫吸附CPP抗体标记荧光微球；所述硝酸纤维素膜上固定CPP抗体形成的检测线（T线）和抗IgG抗体形成的质控线（C线）。
本发明制备出特异性CPP抗原，产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体，用于建立检测CPP方法和CPP体外诊断试剂盒，其中一种为快速定量检测CPP浓度免疫层析试纸条，检测血液或体液中CPP水平,用于判定AMI,中风等多种疾病的发生。
附图说明
图1是精氨酸加压素原（Pre-provasopressin)多肽结构；
图2是免疫层析试纸条侧面图；
图3是免疫层析试纸条正面图；
图4是CPP校准品浓度与荧光强度单位相关曲线图。
具体实施方式
本发明为了建立检测CPP方法，本发明提供了人CPP抗原表位肽抗原，用于产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体，用此抗体建立检测CPP方法及CPP体外诊断试剂盒。
具体而言，本发明公开了一种CPP 抗原表位肽抗原制备过程，步骤如下：
合成CPP抗原表位肽（SEQ ID NO.1），氨基酸序列为126-164位：
CASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY
合成CPP-N抗原表位肽（SEQ ID NO.2），氨基酸序列为131-140位：
CKIEISNATQLDGPA
合成CPP-M肽（SEQ ID NO.3），氨基酸序列为131-140：
FHYKSNATQLDGPAGALL
本发明CPP-N抗原表位肽的N-端另加5个氨基酸，最外端为Cys氨基酸，CPP抗原表位肽的N-端外加Cys 氨基酸，易于偶联载体蛋白，制备出CPP抗原表位肽抗原。
在本发明中，可用载体蛋白包括牛血清白蛋白（BSA)、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白（OVA）、蓝载体蛋白(BCP)等。选择活化BCP，有效与CPP抗原表位肽末端-SH基结合，形成CPP抗原表位肽抗原。
用CPP-M肽筛选出CPP-N单克隆抗体或多克隆抗体，结合CPP氨基酸序列为SNATQLDGPA。
本发明制备的CPP抗原表位肽抗原，用于免疫动物，包括鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴, 马等，产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明公开了一种制备CPP抗体过程，步骤如下：
（1）CPP 抗原表位肽偶联BCP载体蛋白；（2）CPP-BCP免疫动物产生CPP抗血清；（3）测定CPP抗血清滴度和特异性；（4）CPP抗原表位肽偶联树脂；（5）CPP肽-树脂分离和纯化出CPP抗体；（6）测定CPP抗体效价和特异性。
本发明公开了一种制备CPP-N单克隆抗体过程，步骤如下：
1.免疫接种
本发明用CPP-N抗原表位肽偶联BCP载体蛋白，获得CPP-N-BCP，免疫接种鼠，用CPP-M肽包被酶联反应板检测出高CPP-N抗体滴度鼠，用于细胞融合。
2. 细胞融合
用聚乙二醇(PEG)为融合剂，融合鼠脾细胞与Sp2/0细胞，用HAT培养液，筛选出杂交瘤细胞，用ELISA检测出分泌CPP-N单克隆抗体杂交瘤细胞孔。
3. 筛选出分泌CPP-N单克隆抗体杂交瘤细胞
用有限稀释法对阳性检出孔的细胞进行亚克隆筛选,获得分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量扩增，长期传代培养后，获得了稳定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株。
4. 用ELISA鉴定CPP-N单克隆抗体特征
用ELISA鉴定出IgG 类CPP-N单克隆抗体,测定CPP-N单克隆抗体结合力。
5. 制备大量CPP-N单克隆抗体
扩大培养分泌CPP-N单克隆抗体杂交瘤细胞株，收集细胞上清液，用(NH4)2SO4沉淀上清液中单克隆抗体，获得单克隆抗体浓缩液；ProteinA-胶粒分离和纯化出CPP-N单克隆抗体，测定单克隆抗体浓度，分装后，-20℃ 保存；用ELISA测定纯化CPP-N单克隆抗体与CPP结合力及特异性。
本发明公开了一种合成CPP校准品：
本发明用 CPP单克隆抗体或多克隆抗体进一步建立检测 CPP方法，包括免疫层析法（Immunochromatography），电化学发光法(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)，化学发光法（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA），酶联免疫吸附法（ELISA），微流体免疫学方法（Microfluidic immunoassay），免疫芯片技术（Immune chipTechnology），免疫生物传感技术（Immuno-biosensor technology）等。
本发明公开了一种用CPP单克隆抗体或多克隆抗体建立检测CPP体外诊断试剂盒的过程，具体为快速定量检测CPP免疫层析试纸条，步骤如下：
CPP抗体-荧光微球制备过程：
（1）碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基修饰荧光微球；（2）加入CPP抗体进行偶联反应；（3）终止偶联反应；（4）用Tris缓冲液悬浮CPP抗体-荧光微球，4℃，保存备用。
本发明公开了一种结合垫吸附CPP抗体-荧光微球的制备过程：
用Tris缓冲液稀释CPP抗体-荧光微球浓度到需要浓度，将上述荧光微球喷涂到结合垫上，干燥后，密封，备用。
本发明公开了一种硝酸纤维素膜上T线和C线的制备过程：
用Tris缓冲液稀释CPP抗体（T线液）和抗IgG抗体（C线液）到需要浓度，将T线液和C线液分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T线和C线，干燥后，密封，备用。
本发明公开了一种试纸条组装过程：
在PVC底板中间粘贴硝酸纤维素膜，一端粘贴吸水纸，位于硝酸纤维素膜上方；另一端粘贴结合垫，位于硝酸纤维素膜上方；在结合垫另一端粘贴样品垫，位于结合垫上方，形成试纸板，切割成宽3-5mm试纸条。
本发明公开了一种试纸卡组装过程：
本发明含有外壳，由壳面和壳底座两部分构成。将上述试纸条置于壳底座上，合上壳面，形成试纸卡。所述壳面上对应于硝酸纤维膜位置设有检测窗口，壳面上对应于样品垫位置设加样孔。
本发明用双抗体夹心免疫层析原理：样品中CPP通过层析作用向前移动，与结合垫吸附CPP抗体-荧光微球结合，形成CPP-CPP抗体-荧光微球复合物，在毛细动力作用下，进入硝酸纤维素膜，CPP-CPP抗体-荧光微球与硝酸纤维素膜T线固定CPP抗体结合，而形成荧光微球-CPP抗体-CPP-CPP抗体复合物，聚集在T线，游离CPP抗体-荧光微球在T线处不结合，继续向前移动，并与C线固定抗IgG抗体结合，未结合成分继续移动到吸水纸位置。T线捕获的荧光微球量与样品中CPP浓度呈正相关，而C线捕获的荧光微球,表明完成免疫层析过程。通过免疫荧光分析仪对T线、C线信号进行扫描，根据T线信号强度与样品中CPP浓度呈正相关，获得样品中CPP浓度。
本发明提供一种CPP免疫层析试纸卡检测过程
将CPP校准品加到CPP免疫层析试纸卡加样孔中，反应10-15分钟，用荧光免疫层析分析仪，测定试纸卡上T线和C线荧光强度，制备CPP浓度与荧光强度单位相关曲线，进一步设置荧光免疫层析分析仪CPP浓度与荧光强度单位相关参数后，设立荧光免疫层析分析仪自动检测CPP浓度系统，进一步检测样品中CPP浓度。
结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步骤实验过程。
一．制备CPP抗体
（一）制备CPP抗原表位肽
合成CPP抗原表位肽（SEQ ID NO.1)CASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY，是人CPP肽第126至164位一段，含40个氨基酸肽，N末端外加Cys氨基酸。
（二）CPP肽偶联蓝载体蛋白
1. 载体蛋白液： Maleimide活化蓝载体蛋白(Blue carrier protein, BCP), 购于Thermo Scientific公司，3mgBCP溶解在0.5mlddH2O(6mg/ml)
2. CPP肽液: 2mg合成CPP肽（>95%），溶解在0.5ml PBS，pH7.2 (4mg/ml)
3. 0.5mlBCP载体蛋白液与0.5ml CPP肽液混合，室温条件下，反应2 小时
4. 加上述反应液到Microcon-30KDa Centrifugal Filter
5. 离心，14000g，2-8分钟, 减少反应液到50-100ul
3. 去除收集管中液体, 加400ul PBS（pH7.5）到蛋白浓缩和净化离心柱中
4. 离心，14000g，2-8分钟, 减少离心柱中液体积到50-100ul
5. 重复3-4步骤，5次以上
6. 吸出蛋白浓缩和净化离心柱中约50-100ul CPP-BCP液
7.测定CPP-BCP浓度，-80℃冻存
（三）产生CPP抗血清
1. (Day 0) 采集2mlNew Zealand兔血液
2. (Day 1)0.2mlCPP-BCP(1.8mg/ml)与0.2ml福氏完全佐剂(CFA)混合,10点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
3. (Day 14) 0.1ml CPP-BCP(1.8mg/ml)与0.1ml福氏不完全佐剂(IFA)混合, 5点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
4. (Day 28) 0.2ml CPP-BCP(1.5mg/ml)与0.2mlIFA混合, 5点皮下注射到NewZealand兔（40ul/每点）
5. (Day 35) 采集25ml New Zealand兔血液
6. (Day 42) 0.1ml CPP-BCP(1.5mg/ml)与0.1mlIFA混合, 5点皮下注射到NewZealand兔（40ul/每点）
7. (Day 56) 采集25ml New Zealand兔血液
8. (Day 60) 采集50ml New Zealand兔血液, 终止实验。
测定CPP抗血清滴度和特异性
1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备CPP肽(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包被液到酶联反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.加入100ul不同稀释度CPP抗血清（1:10,1:50,1:200，1:1000）到孔中, 在室温下，缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4. 用PBST（0.02%Tween20）洗涤酶联反应板5次，每次5分钟
5. 加1:5000稀释100ul抗兔IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶联反应板5次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9．放酶联反应板板到MULTISKANFC分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值。
（四）CPP肽偶联树脂
1.5mg CPP肽溶解在2ml结合液（50mM Tris，pH8.5, 5mM EDTA）中
2．活化树脂（SulfoLink CouplingResin）购于 ThermoFisherScientific， 加2ml活化树脂到层析柱中，排出液体
3.用20ml结合液（50mMTris，pH8.5, 5mM EDTA）洗涤层析柱中活化树脂
4.加2mlCPP肽液到活化树脂层析柱中，封闭上下孔，上下摇动15分钟，放置30分钟
5.10ml结合液洗涤树脂层析柱
6.用结合液制备50mML-Cysteine，加 1.5mlL-Cysteine液到树脂层析柱中，封闭上下孔，上下摇动15分钟，放置30分钟
7.10ml1.0MNaCl液洗涤树脂层析柱
8.用5ml保存液（ PBS，pH7.5，0.05% NaN3）洗涤树脂层析柱
9.加保存液到树脂层析柱中，封闭上下孔，4℃,保存。
（五）CPP-树脂层析柱分离CPP抗体
1.5mlCPP抗血清与5ml稀释液（20 mM Tris，pH7.5）混合，并通过0.22um 滤膜
2. 加10mlCPP抗血清稀释液通过树脂层析柱，反复这一步10次
3. 加20ml 洗涤液A(20mM Tris, pH7.5)洗涤树脂层析柱
4. 加20ml 洗涤液B(20mM Tris, pH7.5，0.5M NaCl)洗涤树脂层析柱
5. 加1ml 洗脱液(100mM Glycine, pH2.5)通过树脂层析柱，收集洗脱液，放到有40ul2.0M Tris, pH9.0 微量离心管中，混均，反复这一步8次。
6. 将混合洗脱液转入透析袋中，用透析液（20mM NaPO4(pH7.5),150mM NaCl,1.0mM EDTA, 1.0mM DTT,1.0mM PMSF, 10% Glycerol）, 4℃，过夜。
7. 加上述抗体透析液到蛋白微浓缩离心柱中（Microcon-10kDa CentrifugalFilter）
8. 浓缩和净化CPP抗体
9.测定CPP抗体浓度，-20℃储存。
（六）测定CPP抗体效价和特异性
1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备CPP肽(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包被液到酶联反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次。
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次。
3. 加入100ul不同浓度CPP抗体（0, 1,5, 20, 100ng/ml）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟, 吸除反应液，
4. 用PBST（0.02%Tween20）洗涤酶联反应板5次，每次5分钟
5. 加1:2000稀释100ul抗兔IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶联反应板5次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9．放酶联反应板板到MULTISKANFC分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值。
二．制备CPP-N单克隆抗体
（一）制备CPP-N抗原表位肽
CPP-N抗原表位肽（SEQ ID NO.2）CKIEISNATQLDGPA，是人CPP第131至140位一段肽，含15个氨基酸短肽，N-端外加5个氨基酸，最末端为Cys氨基酸。
（二）CPP-N肽偶联蓝载体蛋白
1. 载体蛋白液： Maleimide活化蓝载体蛋白(Blue carrier protein, BCP), 购于Thermo Scientific公司，4mgBCP溶解在0.5mlddH2O(8mg/ml)
2. CPP-N肽液: 3mg合成CPP-N肽（>95%），溶解在0.5ml PBS，pH7.2 (6mg/ml)
3. 0.5mlBCP载体蛋白液与0.5ml CPP-N肽液混合，室温条件下，反应2 小时
4. 加上述反应液到Microcon-30KDa Centrifugal Filter
5. 浓缩和净化CPP-N-BCP
6.测定CPP-N-BCP浓度，-80℃冻存。
（三）制备CPP-N单克隆抗体
免疫接种
1.CPP-N-BCP肽与福氏完全佐剂乳化(0.1mg/ml), 对8周左右BALB/c鼠进行四肢皮下多点注射及腹膜内（Intraperitoneal,IP)初次免疫接种;2-3周后，CPP-N-BCP/福氏不完全佐剂乳化(0.1mg/ml)，对BALB/c鼠进行四肢皮下多点注射及IP第二次增强免疫接种。
2.6-8周后，使用眼眶后放血，获得BALB/c鼠血液（0.1-0.4ml），用CPP-M肽包被反应板进行ELISA检测，选出具有足够抗CPP-M抗体滴度BALB/c鼠用于细胞融合。
3.8-9周后，CPP-N-BCP/PBS混合(0.1mg/ml)，体积为 0.5ml，对选出BALB/c鼠进行四肢皮下多点注射及IP 第三次增强免疫接种。
4.在进行细胞融合前2-3天，用0.1mgCPP-N-BCP/PBS混合，体积为 0.1ml，注入选出BALB/c鼠尾静脉内，进行加强免疫。
细胞融合
1.融合细胞2周前，用8-azaguanine DMEM液培养鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)，达到最好生长状态。
2.快速摘除BALB/c鼠脾脏，分离出脾细胞，用5：1比例与Sp2/0细胞混合，聚乙二醇(PEG4000)为融合剂，融合脾细胞与Sp2/0细胞。
3.融合细胞悬于含FBS的HAT培养液中，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板（200ul/孔），置于5%C02中在37°C培养，5天后，半保留换液, 10天后，用ELISA检测96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞培养上清液。
4.ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
（1）用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备CPP-M肽(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包被液到酶反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次
（2）每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
（3）每孔加入100ul杂交瘤细胞培养上清液, 在室温下, 缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
（4）用PBST（0.02%Tween20）洗涤反应板5次，每次5分钟
(5) 加1:5000稀释100ul抗鼠IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,吸除抗体液
(6) 用PBST洗涤酶反应板5次，每次5分钟
(7) 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
(8) 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
(9) 放酶反应板板到MULTISKANFC分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值。
筛选出分泌CPP-N单克隆抗体杂交瘤细胞
1.用有限稀释法进行亚克隆筛选,对IgG 类CPP-N单克隆抗体阳性检出孔的细胞，用HTDMEM培养基稀释至每孔1个细胞，在 96孔细胞培养板培养，5小时内，显微镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆，用ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量扩增并冻存。
2.长期传代培养单克隆抗体杂交瘤细胞株后，用有限稀释法再进行亚克隆鉴定，从而获得了稳定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株。
3.对稳定单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，产生一定量抗体，鉴定单克隆抗体特征。
生产和纯化CPP-N单克隆抗体
1.用转瓶扩大培养分泌CPP-N单克隆抗体杂交瘤细胞株，收集细胞上清液，上清液通过0.45um滤膜过滤。
2.用(NH4)2SO4沉淀上清液中单克隆抗体，透析后除(NH4)2SO4，获得单克隆抗体浓缩液。
3.ProteinA-胶粒与单克隆抗体浓缩液反应，缓冲液洗涤后，用0.1Mcitricacid(pH3.0)洗脱结合CPP-N单克隆抗体，透析单克隆抗体，浓缩和净化单克隆抗体，测定单克隆抗体浓度，分装后，-20℃ 保存。
4.用ELISA测定纯化单克隆抗体与CPP结合力及特异性
（1）用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备CPP肽(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包被液到酶反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤2次。
（2）每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次。
（3）每孔加入100ulCPP-N单克隆抗体稀释液（0，1，5， 20，100ng/ml）, 在室温下,缓慢摇动60分钟, 吸除反应液，
（4）用PBST（0.02%Tween20）洗涤反应板5次，每次5分钟
(5) 加1:2500稀释100ul抗鼠IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,吸除抗体液
(6) 用PBST洗涤酶反应板5次，每次5分钟
(7) 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
(8) 加50ul 2N H2SO4, 终止反应，
(9) 放酶反应板板到MULTISKANFC分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值。
三.制备检测CPP免疫层析试纸条
（一）CPP抗体偶联到铕螯合物荧光微球上
本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒（Europium Chelate PS-COOH），购于Bangs Laboratories Inc.选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100-300nm。
本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS把CPP-N单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球（直径200nm）上, 步骤如下：
1. 取0.4ml Europium Chelate PS-COOH (10mg/ml), 直径200nm，加入1.5ml离心管中，离心，13000rpm，6分钟，去除上清液
2. 再加入1.0ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)到离心管中，悬浮微球
3. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液
4. 重复2-3步骤2次
5. 再加0.5ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)含5mM EDC和10mM Sulfo-NHS到离心管中,混均，25℃， 反应30分钟
6. 离心，13000rpm，6分钟，去除反应液
7. 加入1.0ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中
8. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液，重复7-8步骤1次
9. 加入0.4ml CPP-N单克隆抗体（0.5mg/ml）到上述离心管中，25℃， 反应2小时
10. 加入50ul of 0.2M Tris(pH7.5) 到离心管中，25℃， 反应30分钟
11. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液，
12. 加入1.0ml 0.2% BSA，0.01% Tween-20 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中
13. 离心，13000rpm，6分钟，去除上清液，重复12-13步骤2次
14. 用缓冲液（10mM Tris，pH8.0，0.2% BSA，10% Sucrose, 0.1% PVP，0.2% Tween20,0.01% NaN3）悬浮CPP-N单克隆抗体-荧光微球，4℃储存，备用。
（二）处理样品垫和结合垫
本发明选用玻璃纤维MF1样品垫（GE Healthcare），浸泡在样品垫处理液（20 mM Tris,pH7.5, 2% Sucrose,0.5%BSA，0.5% Tween-20，0.01% NaN3)，室温下，1 小时，再30℃，干燥8小时，密封，备用。
本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫（EMD Millipore），浸泡在结合垫处理液（10 mMTris, pH8.0，0.2% PVP, 15% Sucrose,0.5%BSA，0.5% Tween-20，0.01% NaN3)，室温下，1小时，再30℃，干燥8小时，密封，备用。
（三）喷涂结合垫和硝酸纤维素膜
1. 用缓冲液1（10mM Tris，pH8.0，5.0%Sucrose,0.2%PVP，0.2% Tween20, 0.01%NaN3）将CPP-N单克隆抗体-铕螯合物荧光微球液稀释到0.25mg/ml，用Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，6ul/cm 速度，将CPP-N抗体-荧光微球喷到结合垫（GFDX）上，30℃，烘干6小时，加入干燥剂封存，备用。
2. 用缓冲液2（5mM Tris，pH8.0，0.5%Trehalose,0.1% PVP，0.01% Tween20, 0.01%NaN3）稀释CPP抗体到2.5mg/ml，稀释抗鼠IgG 抗体浓度到2.0mg/ml，将硝酸纤维素膜放在Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，0.6ul/cm速度，将上述CPP抗体液和抗鼠IgG抗体液喷到硝酸纤维素膜上，两线间距5mm, 30℃，干燥4小时，加入干燥剂，封存备用。
（四）组装免疫层析试纸卡
试纸条组装在湿度小于30%，30-37℃房间进行。免疫层析试纸条, 看图1，包括PVC底板及粘附于PVC底板上的样品垫（22mm）、结合垫（8mm）、硝酸纤维素膜（25mm）、吸水纸（30mm）;其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔CPP抗体涂层形成T线和由抗鼠IgG抗体涂层形成C线; 结合垫喷涂有CPP-N单克隆抗体-铕螯合物荧光微球。
本发明实施例中，T线与C线平行设置，T线与C线之间的距离为5mm。
吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近C线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。结合垫位于硝酸纤维素膜靠近T线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，重叠长度为3mm; 样品垫重叠在结合垫上方。将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm 试纸条。
将上述试纸条装入壳底座中，合上壳面，构成试纸卡（图2），壳面上设置有加样孔（8）检测窗口（9）；加样孔开口于样品垫（2）上部，露出部分样品垫区域；检测窗口开位于硝酸纤维素膜（4）上部，以露出全部T线（5）和C线（6）。
四．免疫荧光分析仪检测CPP浓度过程
（一）免疫层析试纸卡操作过程
用CPP免疫层析试纸卡进行定量检测样品中CPP时，在样品孔上加入CPP校准液或血清/浆（60ul）和全血（100ul）, 再加50层析液(PBS，pH7.5,0.2% BSA，0.5% Tween-20)到样品孔中，反应10-15分钟，T线和C线产生相应的荧光信号，用荧光免疫层析分析仪进行检测。
（二）建立免疫荧光分析仪检测CPP浓度程序
1.建立CPP浓度相关曲线
用CPP肽作为校准品，PBS（pH7.5）含0.5%BSA制备CPP校准品，浓度为 0, 2, 5, 10，20，50，100pmol。 加60ulCPP校准品到CPP免疫层析试纸卡样品孔中，再加50ul层析液到样品孔中, 进行膜层析反应，10-15分钟后，用荧光免疫层析分析仪, 选定激发波长365nm,检测波长610nm，测定试纸条卡T线及C线荧光强度。以CPP校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位为横坐标，制备CPP校准品浓度与荧光强度单位相关曲线，得到方程式，y=7.1297x–6.4447，R2=0.992，看图4，通过此相关曲线得到CPP浓度标准卡，作为对样品中所含CPP浓度进行定量分析依据。
输入上述标准卡到荧光免疫层析分析仪，建立自动运行系统，荧光免疫层析分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中CPP浓度。
2.用CPP免疫层析试纸卡检测样品中CPP浓度
60ul血清加到CPP层析试纸卡加样孔部位，再加50层析液到样品孔中，进行膜层析反应，10-15分钟后，用荧光免疫层析分析仪自动检测系统，测定CPP浓度，结果如下：
<110> 长春恒晓生物科技有限责任公司
<120> 制备和肽素抗体及建立检测方法
<160> 3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<400> 1
CASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<400> 1
CKIEISNATQLDGPA
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<400> 1
FHYKSNATQLDGPAGALL
Claims (6)
1.一种合成CPP抗原表位肽，其特征在于：CPP抗原表位肽氨基酸序列
SEQ ID NO.1: CASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY;
合成CPP-N抗原表位肽，氨基酸序列
SEQ ID NO.2：CKIEISNATQLDGPA
合成CPP-M肽，氨基酸序列
SEQ ID NO.3：FHYKSNATQLDGPAGALL 。
2.根据权利要求1所述的合成CPP抗原表位肽，其特征在于：CPP抗原表位肽(SEQ IDNO.1)偶联载体蛋白,形成 CPP抗原表位肽抗原；CPP-N抗原表位肽(SEQ ID NO.2)偶联载体蛋白，CPP-N抗原表位肽抗原；载体蛋白包括牛血清白蛋白（BSA)、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白(OVA)、蓝载体蛋白(BCP)。
3.根据权利要求2所述的CPP抗原表位肽，其特征在于：CPP抗原表位肽抗原，免疫动物(鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴,马等），产生CPP单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的CPP-N抗原表位肽，其特征在于：CPP抗原表位肽抗原，免疫动物(鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴,马等），用CPP-M肽（SEQ ID NO.3）筛选出CPP-N单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求3或4所述的CPP抗原表位肽，其特征在于：CPP单克隆抗体或多克隆抗体，建立检测CPP方法，包括免疫层析法，酶联免疫吸附法，化学发光法，电化学发光法，微流体检测技术，免疫芯片技术，免疫生物传感器技术等。
6.根据权利要求3或4所述的CPP抗原表位肽，其特征在于：CPP单克隆抗体或多克隆抗体，建立检测CPP体外诊断试剂盒，其中一种为快速定量检测CPP免疫层析试纸条；所述试纸条包括PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述的结合垫吸附CPP抗体标记荧光微球；所述硝酸纤维素膜上固定CPP抗体形成的检测线（T线）和抗IgG抗体形成的质控线（C线）。
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