MX2012005428A - Reactivo de calibracion y sus usos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se proporciona un reactivo de calibración que comprende un péptido conjugado a un portador de proteína a través de un enlazador, en donde el péptido comprende un epítopo de interés y su uso.

Description

REACTIVO DE CALIBRACION Y SUS USOS Descripción de la Invención Los arreglos de proteína de fase inversa (RPA, por sus siglas en inglés) se han desarrollado y establecido en los años recientes como un método conveniente para analizar grupos de proteínas enfocados que representan analitos clave de diferentes cascadas de transducción de señal en cantidades por minuto de muestras biológicas (por ejemplo, lisados celulares, lisados tisulares, o fluidos corporales) . Las diferencias de la expresión de proteínas relativas, que representan no solamente la abundancia de proteínas clave específicas, sino también formas activadas, modificadas posttraducción (por ejemplo, fosforilada) de proteínas clave se pueden describir y clasificar, por ejemplo, los efectos de tratamientos específicos de compuestos farmacéuticos dados los cultivos celulares, por ejemplo, los efectos inhibidores de candidatos de fármacos en cinasas, o describir y clasificar diferentes estados de enfermedad, por ejemplo, sub-tipos de tumores en sus diferentes estados de avance. Los RPA pueden llevarse a cabo con mediciones comparativas de muchas muestras en paralelo, por ejemplo, muestras de cultivo celular diferencialmente tratadas o muestras de diferentes poblaciones de enfermedad. Los cambios significativos de la expresión de la proteína o los patrones de activación de la Ref. 229673 proteína a ser encontrados en diferentes cohortes de la muestra fomentarán, por ejemplo, la identificación de los candidatos de fármaco más eficientes, el esclarecimiento de esquemas de modo de acción inducidos por el tratamiento o el descubrimiento de nuevos marcadores de enfermedad de diagnóstico/pronóstico .

Los ensayos de inmunoafinidad tales como los Arreglos de Proteína de Fase Inversa (RPA, por sus siglas en inglés) se basan en interacciones específicas entre un reactivo de afinidad y una proteína de interés . El ensayo comprende la inmovilización de muestras biológicas del arreglo que forman los puntos de muestra. El arreglo muestreado se incuba con un reactivo de afinidad, es decir, un anticuerpo, y el complejo posteriormente formado del reactivo de afinidad de la proteína de interés se miden a través de la señal de detección generada por ejemplo, una señal luminiscente. Cada arreglo se tiñe con un reactivo de afinidad específico del analito, que puede marcarse o se incuba con un reactivo de detección secundario. Los complejos formados se detectan a través de varios medios (colorimétrico, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.). Típicamente el RPA mide los cambios relativos de expresión de señales de activación entre diferentes muestras.

El análisis cuantitativo de las muestras requiere el uso de reactivos de calibración. Actualmente, para analitos proteicos, los reactivos de calibración son proteínas recombinantes que tienen la misma secuencia de aminoácido que el analito. Por ejemplo, la Solicitud de Patente WO20O7/048436A1 describe las curvas de calibración para los microarreglos de proteína de fase inversa, por lo tanto se agregan diferentes concentraciones de la proteína purificada de interés (Akt) al regulador de pH de tinción que comprende BSA o suero de rata. Sin embargo, la producción de la proteína recombinante que presenta el epítopo correcto es consumidora de tiempo y por lo general no exitosa. En particular, para epítopos fosforilados , mientras no existan reactivos de calibración confiables disponibles .

Por consiguiente, existe la necesidad de un reactivo diseñado para proporcionar una aplicabilidad universal con especificidad seleccionable para diferentes epítopos de analito de interés. Esto permitiría calibrar los resultados de los experimentos realizados, por ejemplo, en tiempos separados, mediante diferente personal de laboratorio, en diferentes dispositivos o en arreglos construidos en diferentes corridas de impresión. También el intervalo lineal de las señales del RPA específicas de proteína a ser generadas a través del reactivo de afinidad respectivo pueden opcionalmente pre-definirse .

Por consiguiente, la presente invención proporciona un reactivo de calibración que comprende un péptido que se une a través de un enlazador a una proteína portadora, en donde el péptido comprende un epítopo de interés. Preferiblemente, tal epítopo de interés está fosforilado.

Con el reactivo de calibración confiable se pueden generar curvas estándar generadas para cuantificar la proteína con un RPA u otro ensayo de afinidad. Los RPA se construyen a través de la deposición de pequeños volúmenes de muestra, por ejemplo, de un lisado celular o tisular, sobre superficies de sustrato altamente enlazadas utilizando por lo general un micro- impresor robotizado. Cada punto del lisado en el sustrato contiene el complemento total de las proteínas celulares y analitos. Se pueden localizar cientos de muestras en paralelo en un microarreglo permitiendo una comparación cruzada de alto rendimiento de las muestras en el mismo ensayo. Los ensayos replicados que contienen el mismo grupo de muestras, pueden fácilmente producirse del mismo volumen inicial del material de muestra, ya que el consumo del material de muestra por punto es extremadamente bajo.

El reactivo de calibración de la presente invención es particularmente útil para cuantificar proteínas que comprenden un epítopo fosforilado de interés.

El término "epítopo de interés" se refiere a una parte de un polipéptido que es reconocido por el reactivo de afinidad de interés. El reactivo de afinidad de interés es preferiblemente específico para epítopo de interés.

El término "péptido epítopo" como se utiliza en la presente se refiere al péptido que comprende el epítopo de interés. El péptido epítopo tiene preferiblemente entre 12 y 25 aminoácidos en longitud. Más preferiblemente, la longitud del péptido es de 12 a 20, más preferiblemente de 14 a 17 aminoácidos en longitud.

El epítopo de interés puede modificarse, por ejemplo, fosforilarse . El término "epítopo fosforilado" como se utiliza en la presente se refiere a un epítopo que comprende por lo menos un aminoácido con un grupo fosfato. Preferiblemente, el epítopo de interés comprende de 1 a 5 aminoácidos fosforilados . Preferiblemente, la posición del aminoácido modificado está aproximadamente en la parte media del péptido epitopo. Por ejemplo, en un péptido de 15 aminoácidos en longitud, el aminoácido modificado está preferiblemente en la posición 7, 8 y/o 9 (ver Figura 2C) . Los métodos para modificar un aminoácido (por ejemplo, para fosforilarlo) son bien conocidos por el experto en la técnica.

El péptido epítopo está covalentemente enlazado a la proteína portadora a través de un enlazador (ver Figura 1A) , por lo tanto el péptido epítopo está covalentemente enlazado al enlazador y el enlazador está covalentemente enlazado al portador de la proteína. En una modalidad preferida, el enlazador está covalentemente enlazado al grupo cisteína N-terminal libre (Cys) del BSA, en donde el grupo Cys libre es un residuo de cisteína que no esté involucrado en un puente de disulf ro.

El péptido epítopo puede unirse al portador de la proteína esencialmente en dos pasos: Paso 1) el enlazador se conjuga al péptido epítopo, en donde el enlazador preferiblemente se marca con una etiqueta. El enlazador puede acoplarse a N-terminal o C-terminal de péptido. Preferiblemente, el enlazador se acopla a N-terminal del péptido.

Paso 2) el extremo libre del enlazador se conjuga con el portador de proteína.

El enlazador o separador es un péptido que comprende de 2 a 10, preferiblemente 2 a 5, más preferiblemente de 3 a 4 aminoácidos naturales o no naturales Los aminoácidos naturales son aminoácidos de existencia natural tales como en particular, alanina, cisteína, lisina histidina, arginina, aspartato, glutamato, serina, treonina, metionina, glicina, valina, leucina, isoleucina, asparagina, glutamina, prolina, triptófano, fenilalanina, tirosina. Los aminoácidos no naturales son aminoácidos que no son de existencia natural. Los ejemplos de aminoácidos no naturales son ácido 8-amino-3,6 dioxa-octanoico (Doa) y ácido aminooxi-acético.

El enlazador es hidrófilo y puede comprender solamente aminoácidos naturales o solamente aminoácidos no naturales o una mezcla de ambos, aminoácidos naturales y no naturales. Preferiblemente, el enlazador comprende uno o más de los siguientes aminoácidos naturales: cisteína, lisina, histidina, arginina, aspartato, glutamato. También, preferiblemente, el enlazador comprende uno o más Doa. Más preferiblemente, el enlazador es cisteína-Doa-Doa.

Preferiblemente, el enlazador se marca con Dabsilo. Los métodos para producir péptidos con una secuencia de aminoácido específica son bien conocidos por el experto en la técnica. Un método adecuado es, por e emplo, la síntesis de fase sólida descrita en Merrifield, Science 1986, 232:341-347 (método) y Carpino y otros, J. Am. Chem. 1990, 112: 9651-52 (reactivos).

El portador de la proteína es una proteína que no se une específicamente a las superficies. Preferiblemente, el portador de la proteína es una proteína de por lo menos 20 kDa y muestra nada o baja reactividad cruzada con el reactivo de afinidad utilizado en el ensayo de afinidad. El portador de la proteína es preferiblemente una albúmina, más preferiblemente albúmina de suero, tal como por ejemplo, albúmina de suero de bovino (BAS, por sus siglas en inglés) , o albúmina de suero humano. La albúmina de suero preferida es BSA.

Un "reactivo de afinidad de interés" es un reactivo que reconoce y se une el epítopo de interés. Preferiblemente, el reactivo de afinidad de interés es específico y selectivo para el epítopo de interés. El reactivo de afinidad puede ser un anticuerpo, un aptámero, una proteína de repetición de anquirina designada (DARPin) . Preferiblemente, el reactivo de afinidad es un anticuerpo.

Un "anticuerpo de interés" puede ser cualquier anticuerpo. Preferiblemente, tal anticuerpo es un anticuerpo IgG, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo de interés incluye pero no se limita a anticuerpo humanizado y anticuerpo de roedor. Un anticuerpo de roedor incluye pero no se limita a un anticuerpo de ratón, conejo y rata. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de conejo.

Un "aptámero de interés" es un oligonucleótido de ARN o ADN monocatenario de 15 a 60 bases en longitud que se une con alta afinidad al epítopo de interés.

Una "proteína de repetición de anquirina diseñada" o "DARPin" es una molécula de unión que comprende por lo menos una repetición de. anquirina. Una repetición de anquirina es un motivo en proteínas que consiste de dos hélices alfas separadas por bucles, que pueden seleccionarse para reconocer específicamente una amplia variedad de proteínas objetivo. La longitud típica de una repetición de anquirina, es de 33 aminoácidos. A diferencia de los anticuerpos no contienen ningún enlace de disulfuro y se encuentran en todos los compartimentos celulares.

Además, la presente invención proporciona el uso dé un reactivo de calibración como se describe anteriormente para la generación de una curva estándar. La presente invención proporciona un método para generar una curva estándar que comprende los pasos de: a) inmovilizar el reactivo de calibración antes descrito en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, y d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés.

Una curva estándar o de calibración es una herramienta de investigación cuantitativa, un método para la representación de los datos del ensayo que se utiliza para determinar la concentración de una sustancia, es decir, la sustancia del epítopo de interés .

El término "reactivo de afinidad enlazado" se refiere a un reactivo de afinidad que forma un complejo con una proteína o péptido que comprende el péptido de interés. Los complejos formados se detectan a través de varios medios tales como por ejemplo colorimétrico, fluorescencia, o quimioluminiscencia .

Un reactivo de afinidad puede detectarse, a través de una etiqueta detectable acoplada al reactivo de afinidad. Preferiblemente, la etiqueta es un fluoróforo, que permite por lo tanto la determinación de la cantidad de anticuerpo unido a través de la intensidad de la fluorescencia. Otras etiquetas adecuadas son, por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) y peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) .

Un reactivo de afinidad también puede detectarse a través de un reactivo de detección secundario. Un reactivo de detección secundario es una molécula marcada que selectivamente se une a los reactivos de afinidad. El reactivo de afinidad enlazado en el mismo microorganismo puede detectarse por ejemplo mediante el uso de un segundo anticuerpo o un fragmento Fab, que marca y reconoce epítopos específicos de especies del reactivo de afinidad. Las etiquetas adecuadas incluyen pero no se limitan fluoróforo, biotina, peroxidasa de rábano picante e isótopo. Preferiblemente, el reactivo de detección secundario (por ejemplo, un anticuerpo secundario) se marca con un fluoróforo.

La cantidad de reactivo de afinidad unida al reactivo de calibración preferiblemente se detecta a través de una señal óptica tal como una señal de fluorescencia.

La cantidad de reactivo de afinidad unida de interés se correlaciona con la cantidad de epítopo de interés midiendo la señal detectable del reactivo de afinidad y atribuyendo cada señal a una concentración del epítopo de interés. Los resultados se explican en una curva estándar. Una curva estándar puede trazarse representando la cantidad determinada del reactivo de afinidad enlazado de interés para cada concentración del epítopo de interés (en el eje Y) contra la concentración del epítopo de interés (en el eje X) . La cantidad de reactivo de afinidad unida usualmente se despliega como la Resistencia de la señal detectada (intensidad de señal) . Preferiblemente la señal es una señal óptica, más preferiblemente intensidad de fluorescencia. Típicamente, para los propósitos de generar una curva estándar, los puntos en el arreglo comprenden diferentes concentraciones del reactivo de calibración, preferiblemente con una dilución serial (por ejemplo, una serie de una dilución doble) .

La concentración del epítopo de interés en una concentración conocida del reactivo de calibración se obtiene determinando la proporción de péptido: portador, que es número de péptidos conjugados a un portador de proteína.

Los métodos para determinar la proporción de péptido: portador son bien conocidos por el experto en la técnica. Un método adecuado es, por ejemplo, un método que comprende los siguientes pasos : paso 1 : determinar la concentración de péptido conjugado a través de por ejemplo medición de absorbencia fotométrica, por lo tanto los péptidos o el enlazador unidos a los péptidos preferiblemente se marcan con una etiqueta (por ejemplo, Dabsilo) ; paso 2: determinar la concentración total de la proteína del producto conjugado a través de* la prueba Bradford y paso 3: calcular la proporción de péptido:proteína. Preferiblemente, el enlazador se marca con una etiqueta tal como por ejemplo Dabsilo, que permite determinar la proporción de péptido: ortador de proteína. Las proporciones adecuadas para utilizarse en los métodos de la invención pueden ser de hasta 10 y mayores. Preferiblemente, la proporción es menor de 3, preferiblemente, la proporción es igual a o menor de 1, más preferiblemente la proporción está entre 0.3 y 1.

El reactivo de afinidad de interés se incuba en el arreglo durante al menos 30 minutos, preferiblemente por más de 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas ±30 minutos) . El exceso de reactivo de afinidad se elimina y preferiblemente el arreglo se lava antes de medir la intensidad de señal.

Un arreglo es un soporte sólido con una superficie hidrófoba, que permite la unión de las proteínas a la superficie. Los arreglos para el RPA y otros ensayos de afinidad están comercialmente disponibles y bien conocidos por el experto en la técnica. El reactivo de calibración se inmoviliza en el arreglo a través de interacción de la ' proteína portadora con la superficie del arreglo. Para evitar la unión no específica a la superficie hidrófoba el arreglo detectado preferiblemente posteriormente se recubre con una protelna no específica, tal como, por ejemplo, BSA.

El reactivo de calibración se aplica al arreglo en dos o más concentraciones. Preferiblemente, las concentraciones aplicadas forman unas series de dilución (por ejemplo, una serie de dilución de 1:2, 1:5, o 1:10). El reactivo de calibración preferiblemente se aplica en por lo menos tres diferentes concentraciones. Más preferiblemente, el reactivo de calibración se aplica en de 3 a 20 diferentes concentraciones, aún más preferido de 5 a 15 diferentes concentraciones .

El reactivo de calibración puede aplicarse a la posición deseada en el arreglo como un punto. El reactivo de calibración típicamente se resuelve en un regulador de pH. Una solución reguladora del pH es una solución acuosa que consiste de una mezcla de un ácido débil y su base conjugada o una base débil y su ácido conjugado. Un regulador de pH es, por ejemplo, el regulador de detección CSBL (número de Producto 9020, Zeptosens, Witters il, Suiza) . En una modalidad preferida tal regulador de pH comprende proteínas de matriz. Una proteína de matriz preferida es BSA, más preferiblemente la proteína de matriz es BSA acetilada. Típicamente, la solución de reactivo de calibración aplicada se deja secar antes de incubar el arreglo con el reactivo de afinidad de interés.

Los puntos del reactivo de calibración en un arreglo típicamente se configuran en un campo. Los campos del arreglo pueden formar áreas geométricas tales como por ejemplo cuadros, rectángulos, círculos, y triángulos. Los ejemplos de un diseño de arreglo se muestran en las Figuras IB y 12. Los puntos en dos campos pueden tener por ejemplo, diferentes . series de dilución (diferentes intervalos de concentraciones) . Los controles positivo o negativo típicamente se configuran en un campo diferente al del reactivo de calibración.

Con la curva estándar la concentración de una proteína de interés en una muestra avanza en la misma forma que el reactivo de calibración puede calcularse de nuevo.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para cuantificar una proteína que comprende el epítopo de interés en una muestra biológica que comprende: a) inmovilizar en un arreglo i) el reactivo de calibración anteriormente descrito en dos o más concentraciones, y ii) una o más muestras biológicas, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración y para cada una o más muestras biológicas, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y e) cuantificar la proteína que comprende el epítopo de interés en una o más muestras biológicas .

La muestra biológica es de origen biológico y una mezcla de complejo de molécula. Una muestra puede formarse a través de, por ejemplo, lisados de células, extractos de células, fluidos corporales (por ejemplo, sangre completa, suero, plasma, orina, fluido tisular, fluido sinovial, lágrimas, orina, saliva y linfoide) . Las muestras pueden fraccionarse o no fraccionarse.

La muestra biológica, al igual que el reactivo de calibración, se aplica en la posición deseada en el arreglo como un punto. Las muestras biológicas pueden diluirse o no diluirse con un regulador de pH. En una modalidad preferida tal regulador de pH comprende proteínas de matriz . Una proteína de matriz preferida es BSA, más preferiblemente la proteína de matriz es BSA acetilada. Típicamente, las muestras aplicadas se dejan secar antes de incubar el arreglo con el reactivo de afinidad de interés.

Los puntos de las muestras biológicas y los reactivos de calibración en un arreglo típicamente se configuran en un campo. Los campos del arreglo pueden formar áreas geométricas tales como por ejemplo cuadros, rectángulos, círculos, y triángulos. Los ejemplos de un diseño de arreglo se muestran en Figuras IB y 12. Preferiblemente, los puntos de las muestras biológicas se configuran en otro campo diferente al de los puntos del reactivo de calibración.

Preferiblemente, las concentraciones se aplican al reactivo de calibración de las series de dilución (por ejemplo, una serie de dilución de 1:2, 1:5, o 1:10). También se prefiere que el reactivo de calibración se aplique en por lo menos tres diferentes concentraciones. Más preferiblemente, el reactivo de calibración se aplica en de 3 a 20 diferentes concentraciones, aún más preferido de 5 a 15 diferentes concentraciones. Será bien conocido por el experto en la técnica cómo seleccionar el intervalo de concentraciones del reactivo de calibración cerca de la concentración esperada del péptido de interés en las muestras biológicas y dentro del intervalo operativo del método de detección.

El reactivo de afinidad de interés se incuba a por lo menos 30 minutos en el arreglo, preferiblemente, se incuba en el arreglo por más de 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas +30 minutos) . El exceso de reactivo de afinidad se elimina y preferiblemente el arreglo se lava antes de medir la intensidad de señal.

Además, la presente invención proporciona el uso de la curva estándar descrita anteriormente para caracterizar el reactivo de afinidad determinando el límite inferior de detección, la sensibilidad y el intervalo dinámico del reactivo de afinidad de interés .

El término "límite inferior de detección (LOD, por sus siglas en inglés) " se refiere a la cantidad mínima del epítopo de interés que puede detectarse con un reactivo de afinidad. El término "intervalo dinámico" del reactivo de afinidad se refiere al intervalo miscible de concentración del reactivo de calibración. El intervalo dinámico típicamente se determina con una curva estándar, por lo tanto el intervalo dinámico es el intervalo de las concentraciones del reactivo de calibración para los cuales existe una correlación lineal o sustancialmente lineal a la señal medida. Los términos "límite inferior de detección" y "intervalo dinámico" son bien conocidos por el experto en la técnica.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para determinar un límite inferior de detección de un reactivo de afinidad de interés que comprende: a) inmovilizar el reactivo de calibración antes descrito en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y e) determinar la cantidad mínima del epítopo de interés que puede detectarse con el reactivo de afinidad.

En una modalidad preferida, la cantidad mínima del epítopo detectable de interés puede determinarse con el retro-cálculo de las concentraciones que corresponden a la señal medida en blanco más tres veces la desviación estándar del blanco. El nivel en blanco es la señal detectable de una muestra que no comprende el reactivo de calibración pero por el contrario es idéntica a las muestras que comprenden el reactivo de calibración.

El reactivo de calibración se aplica como se describe anteriormente. Preferiblemente, las dos o más concentraciones aplicadas forman unas series de dilución (por ejemplo, una serie de dilución de 1:2, 1:5, o 1:10). También se prefiere, que el reactivo de calibración se aplique en por lo menos tres diferentes concentraciones. Más preferiblemente, el reactivo de calibración se aplica en de 3 a 20 diferentes concentraciones, aún más preferido de 5 a 15 diferentes concentraciones.

El reactivo de afinidad de interés se incuba a por lo menos 30 minutos en el arreglo, preferiblemente, se incuba en el arreglo por más de 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas ±30 minutos) . El exceso de reactivo de afinidad se elimina y preferiblemente el arreglo se lava antes de medir la intensidad de señal.

La presente invención proporciona un método para determinar la sensibilidad del reactivo de afinidad de interés que comprende a) inmovilizar el reactivo de calibración anteriormente descrito en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, en donde el reactivo de afinidad de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y por lo tanto generar una curva estándar, e) determinar la parte lineal de la curva estándar y f) determinar el declive de la parte lineal de la curva estándar.

El reactivo de calibración se aplica como se describe anteriormente. Preferiblemente, las dos o más concentraciones aplicadas forman unas series de dilución (por ejemplo, una serie de dilución de 1:2, 1:5, o 1:10). También se prefiere, el reactivo de calibración se aplique en por lo menos tres diferentes concentraciones. Más preferiblemente, el reactivo de calibración se aplica en de 3 a 20 diferentes concentraciones, aún más preferido de 5 a 15 diferentes concentraciones.

El reactivo de afinidad de interés se incuba a por lo menos 30 minutos en el arreglo, preferiblemente, se incuba en el arreglo por más de 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas +30 minutos) . El exceso de reactivo de afinidad se elimina y preferiblemente el arreglo se lava antes de medir la intensidad de señal.

La presente invención proporciona un método para determinar el arreglo dinámico del reactivo de afinidad de interés que comprende a) inmovilizar el reactivo de calibración anteriormente descrito en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, en donde el reactivo de afinidad de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y por lo tanto generar una curva estándar, e) determinar la parte lineal de la curva estándar y f) determinar el intervalo de concentración del reactivo de calibración de interés de la parte lineal de la curva estándar.

El reactivo de calibración se aplica como se describe anteriormente. Preferiblemente, las dos o más concentraciones aplicadas forman unas series de dilución (por ejemplo, una serie de dilución de 1:2, 1:5, o 1:10). También se prefiere, el reactivo de calibración se aplica en por lo menos tres diferentes concentraciones. Más preferiblemente, el reactivo de calibración se aplica en de 3 a 20 diferentes concentraciones, aún más preferido de 5 a 15 diferentes concentraciones.

El reactivo de afinidad de interés se incuba a por lo menos 30 minutos, preferiblemente se incuba en el arreglo por más de 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas ±30 minutos) . El exceso de reactivo de afinidad se elimina y preferiblemente el arreglo se lava antes de medir la intensidad de señal .

Además, el reactivo de calibración puede utilizarse para determinar la especificidad de un reactivo de afinidad. El término "especificidad" como se utiliza en la presente se refiere a la selectividad del reactivo de afinidad para el epítopo de interés. Un reactivo con una baja afinidad específica se une también a epítopos diferentes del epítopo de interés .

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para determinar la especificidad de un reactivo de afinidad que comprende los siguientes pasos: a) inmovilizar en un arreglo i) el reactivo de calibración anteriormente descrito que comprende el epítopo de interés y ii) por lo menos una muestra que comprende un péptido de control conjugado al portador de la proteína, en donde el péptido de control no comprende el epítopo de interés, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado en el arreglo, y d) comparar la intensidad de señal correlacionada con el epítopo de interés del reactivo de calibración con la intensidad de señal correlacionada con el péptido de control.

La detección de una señal significativa significa que el anticuerpo de interés tiene una baja especificidad ya que también reconoce epítopos diferentes del epítopo de interés. El término "señal significativa" como se utiliza en la presente es una señal que es significativamente más alta que la señal de fondo, en donde la señal de fondo es la señal detectada en ausencia de una muestra (por ejemplo, la señal detectada entre dos puntos) . Significativamente superior significa que la diferencia con la señal de fondo es estadísticamente relevante (p = 0.05, preferiblemente, p = 0.01) .

Preferiblemente, la concentración del péptido de control aplicada por punto en el arreglo está cerca de (+/-5%) a la concentración del péptido epítopo. Los puntos del reactivo de calibración y los puntos de las muestras que comprenden el péptido de control tienen una concentración de péptido similar y preferiblemente se agrupan en los arreglos en campos, por lo tanto los campos pueden formar áreas geométricas como por ejemplo cuadrados, rectángulos, círculos, y triángulos . La concentración de la proteína total de las muestras en dos campos puede ser diferente (por ejemplo, una concentración de epítopo mayor en el campo 1 y una concentración de epítopo más baja en el campo 2) .

El epítopo de control no comprende el epítopo de interés, pero comprende un epítopo que es diferente del epítopo de interés. Este epítopo del epítopo de control (epítopo de control) puede por ejemplo modificarse equivalente el epítopo de interés (por ejemplo, equivalente no fosforilado del epítopo de interés) . Preferiblemente más de una muestra que comprende un péptido de control conjugado al portador de la proteína se aplica en el arreglo. El péptido de control en estos ejemplos puede tener diferentes concentraciones o pueden comprender diferentes epítopos . El epítopo de control en una muestra puede por ejemplo ser un equivalente no fosforilado del epítopo de interés y en otra muestra el epítopo de control tiene una secuencia de aminoácido diferente que la del epítopo de interés.

El reactivo de afinidad de interés se incuba a por lo menos 30 minutos en el arreglo, preferiblemente durante al menos 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas ±30 minutos) . El exceso de la mezcla se elimina y preferiblemente el arreglo se lava antes de medir la intensidad de señal.

Alternativamente, el reactivo de afinidad detectable de interés se incuba con un péptido epítopo libre de interés antes del paso a) y en el paso b) el arreglo se incuba con la mezcla del reactivo de afinidad y el péptido libre.

Por consiguiente, la presente invención invención también proporciona un método para determinar la especificidad del reactivo de afinidad que comprende los siguientes : a) incubar un reactivo de afinidad detectable de interés con el péptido epítopo libre de interés, b) inmovilizar en un arreglo i) el reactivo de calibración anteriormente descrito que comprende el epítopo de interés y ii) una muestra que comprende un péptido de control conjugado al portador de la proteína, en donde el péptido de control no comprende el epítopo de interés, c) incubar el arreglo con la mezcla del reactivo de afinidad de interés y el péptido epítopo libre del paso a) , d) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado en el arreglo y e) comparar la intensidad de señal correlacionada con el epítopo de interés del reactivo de calibración con la intensidad de señal correlacionada con el péptido de control.

Un "péptido epítopo libre de interés" es un péptido epítopo de interés que no se une a otra molécula. En particular, el péptido libre no se une al portador de la proteína.

La concentración del péptido libre se selecciona de tal forma que el reactivo de afinidad de interés se satura con el péptido libre. Esta concentración puede determinarse por ejemplo, a través del siguiente método: a) incubar los reactivos de afinidad detectable de interés con por lo menos dos diferentes concentraciones del péptido epítopo libre, b) inmovilizar el reactivo de calibración anteriormente descrito en por lo menos dos arreglos, c) incubar los arreglos con una mezcla del reactivo de afinidad de interés y el péptido epítopo libre del paso a) en donde cada arreglo con una mezcla comprende una concentración diferente del péptido epítopo libre, d) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado en los arreglos y determinar la concentración del péptido libre en el cual el reactivo de afinidad se satura con este de tal forma que el reactivo de afinidad se une al arreglo.

El péptido libre es preferiblemente incubado con el reactivo de afinidad de interés durante al menos 30 minutos, preferiblemente durante al menos 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas ±30 minutos) .

La mezcla del reactivo de afinidad de interés y el péptido libre es durante al menos 30 minutos, preferiblemente se incuba en el arreglo durante al menos 1 hora, más preferiblemente de 1 a 16 horas, más preferiblemente de aproximadamente 12 horas (12 horas ±30 minutos) . El exceso de la mezcla se elimina y preferiblemente el arreglo se lava antes de medir la intensidad de señal.

Habiéndose ahora ' generalmente descrito esta invención, la misma se entenderá mejor a través de la referencia a los ejemplos específicos, que se incluyen en la presente para propósitos de ilustración solamente y no pretenden limitarla a menos que se especifique lo contrario, junto con las figuras anexas.

La Figura 1A muestra la estructura de un reactivo de calibración marcado. (A) Péptido que comprende el epítopo de interés, (B) Enlazador hidrófilo, (C) Proteína portadora, (D) Etiqueta para la determinación de la concentración del reactivo de calibración (por ejemplo, Dabsilo) . El péptido está covalentemente enlazado al enlazador y el enlazador está covalentemente enlazado al portador de la proteína.

La Figura IB muestra un diseño del arreglo esquemático. El arreglo se divide en 12 campos de arreglo (número 1-12 en cuadro) y campo de control (1-16) . Cada campo del arreglo comprende las 12 posiciones de la muestra (3 filas x 4 posiciones, cada uno en puntos duplicados => 24 puntos) de una serie de dilución estándar (posición 1-2) . Las flechas indican la dirección de la concentración en disminución. Se configuran dos campos de arreglo adyacentes en posición en espejo, para evitar que los puntos de alta concentración estándar se junten los puntos de baja concentración estándar. El campo de control se utilizó para los controles de lisado de co-arreglo (16 posiciones de muestra en puntos por duplicado) Las Figuras 2A y 2B muestran la secuencia de péptido de la proteína Erkl humana (Figura 2A) y la proteína Erk2 (Figura 2B) . Las secuencias de péptido seleccionadas alrededor de los sitios de fosforilación en el centro de las proteínas están subrayadas (idénticas para las dos proteínas) . La secuencia de péptido seleccionada (péptido que comprende el epítopo) para el Erkl total (anticuerpo BioSource) se marca un marco. Los diferentes aminoácidos en la secuencia correspondiente de la proteína Erk2 se indican por flechas. La Figura 2C muestra las posiciones preferidas de los aminoácidos fosforilados (A... (p) ) en un péptido que comprende el epítopo de interés . La Figura 2D muestra una representación esquemática de una curva estándar mientras que se indica el intervalo dinámico (dr) . C = concentración del reactivo de calibración, S = intensidad de señal.

Las Figuras 3A-3C muestran secciones de imágenes del ensayo de los arreglos que contienen curvas estándar impresas de los reactivo péptido-BSA de diferentes proporciones del conjugado péptido-proteína y se sondean con anticuerpo contra el epítopo. Figura 3A: Histona H3-BSA, proporción: 0.7x (I), 2.7x (II), 13.4 (III), Anticuerpo: 1:5000 Abcam abl791. Figura 3B: pRb-BSA, proporción: 0.25x (I), lx (II), ??? (III), Anticuerpo: 1:500 CST no 9308. Figura 3C: pErkl/2-BSA, proporción: 0.7x (I), 2.7x (II), 13.4x (III), Anticuerpo: 1:500 CST no 9101. Diseño del arreglo (AL): Las curvas estándar se imprimieron como 12 curvas de dilución serial (diluciones dobles) , cada dilución como puntos por duplicado. Las concentraciones de partida de los diferentes reactivos péptido-BSA se ajustaron a una concentración de epítopo uniforme de 50 nM (punto 1) .

Las Figuras 4A-4F muestran señales de ensayo cuantitativas en el lisado de las curvas estándar del reactivo HistonaH3-BSA 2.7x impreso (ensayo H3 de Histona, 1:5000) (Figuras 4A-4C) y el reactivo pErk-BSA 2.7x impreso (ensayo pErkl/2, 1:500) (Figuras 4D-4F) . Los círculos sólidos representan las señales de las curvas estándar medidas como el promedio de puntos por duplicado, la línea sólida representa la curva adaptada del modelo de unión del sitio 1; los cuadros indican todas las señales de controles de lisados co-arreglados correspondientes, la concentración de la proteína total de los lisados: 0.25mg/ml (control tratado neg = negativo y pos = positivo, el número indica la identidad del lisado (ver Tabla 1)). Figura 4A y 4D: curvas lin-log; Figura 4C y Figura 4F: curvas log-log. Figura 4B y Figura 4E muestran imágenes del ensayo con respuestas de unión de epítopo específicas. Las curvas estándar se imprimieron como 12 curvas de dilución serial (diluciones dobles) , cada dilución como puntos por duplicado. Las concentraciones de partida de los diferentes reactivos de péptido-BSA se ajustaron a una concentración de epítopo uniforme de 50nM (1 punto) . Ambos casos muestran un intervalo dinámico de 4 órdenes de magnitud en concentración e intervalos de señal dentro de una imagen.

La Figura 5A muestra un efecto de las adiciones en aumento de la proteína de matriz (acBSA) para soluciones impresas del reactivo de curva estándar, mostrados para el caso del ensayo pErkl/2 (1:500). (a,b,c en el lado izquierdo) reactivo pErk-BSA 2.7x impreso; (d,e,f en el lado derecho) proteína Erkl recombinante impresa (Invitrogen) . (a,d superior) dilución en series impresas en regulador de pH de detección puro, (medio b,d) en regulador de pH de detección más 50 g/ml de acBSA, y (fondo) en regulador de pH de detección más 100 g/ml de acBSA. acBSA = BSA acetilado. La adición de un acBSA conduce a una morfología de punto más homogénea .

La Figura 5B muestra el efecto de que el tipo de proteína de matriz (acBSA vs BSA) que tiene adicionadas soluciones impresas, mostradas para el caso del ensayo de histona H3. (a,b en el izquierdo). Diluciones en serie del reactivo Histona-BSA 2.7x; (lado derecho) series de dilución de la proteína histona H3 recombinante (Roche) . No se detectaron diferencias de señal principales, pero la adición de acBSA condujo a una morfología de punto más homogénea.

Las Figuras 6A-6D muestran imágenes de la señal de arreglo del ensayo de histona H3 (1:10'000 de dilución del anticuerpo abl791) en ausencia (ensayo no mal: A)) y presencia (ensayo de competencia: B a D) de concentraciones en aumento (B: ?????, C: lOOOnM; D: 10'OOOnM) del péptido epítopo libre correspondiente en la solución del anticuerpo. Las señales del anticuerpo específicas de controles estándar/lisado en el ensayo normal se suprimieron a aproximadamente por completo/completamente mediante la reacción de competencia en la concentración mayor del péptido libre (10000 nM) . Tiempo de exposición: 0.5s e Intervalo de Despliegue (DR, por sus siglas en inglés) de imágenes 0...10000 Las Figuras 7A-7D muestran curvas estándar para el ensayo de Histona H3 (1:10000 Abcam abl791) de 12 curvas de diluciones de punto de Histona H3-BSA estándar del péptido de Histona H3 2.7x círculos sólidos) y la proteína recombinante de histona H3 de Upstate con señales más prominentes (triángulos sólidos) . Las señales de los lisados de control (250 µg/ml) se agregaron a las curvas estándar del péptido para comparación (cuadros sólidos) ; las concentraciones se volvieron a calcular de las señales. Las gráficas muestran las señales medias de las diluciones estándar impresas (puntos de datos sólidos) y la curva de ajuste de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, ajuste Hill) . Los puntos de los datos corresponden a las señales medias de puntos por duplicado, las barras de error indican sus desviaciones estándar. Los valores LOD fueron concentraciones calculadas de nuevo de la curva adecuada en el nivel de señal en blanco media más desviación estándar de 3 veces (ver líneas puteadas en las gráficas de la derecha: para el estándar de péptido de Histona H3 , para la proteína recombinante de Histona H3 Upstate) . Figura 7A: Ensayo 1, gráfica Lin-Log, LOD (proteína de Histona H3) = 0.133nM, LOD (Histona H3-BSA 2.7x) = 0.104nM. Figura 7B: Ensayo 1, gráfica Log-Log. Figura 7C: Ensayo 2, gráfica Lin-Log, LOD (proteína de Histona H3) = 0.178n , LOD (Histona H3-BSA 2.7x) = 0.141nM. Figura 7D: Ensayo 2, gráfica Log-Log. (coeficientes de correlación de r2 > 0.99).

Figuras 8A-8D muestran curvas estándar para el ensayo p b (1:250 CST #9308) de 12 curvas de diluciones de punto del estándar de péptido pRb (círculos sólidos) y la proteína recombinante pRb del Motivo Activo (triángulos sólidos) . Las señales de los lisados de control ( 00µg/ml) se agregaron a las curvas estándar del péptido para comparación (cuadros sólidos, pos= positivo, neg=negativo, el número indica la identidad del lisado, ver Tabla 1) ; las concentraciones se volvieron a calcular de las señales . Las gráficas muestran las señales medias de la dilución estándar impresa (puntos de dato sólido) y la curva de ajuste de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, ajuste Hill) . Los puntos de los datos corresponden a las señales medias de puntos por duplicado; las barras de error indican sus desviaciones estándar. Los valores LOD fueron concentraciones calculadas de nuevo de la curva adecuada en el nivel de señal en blanco media más desviación estándar de 3 veces (ver líneas puteadas en las gráficas de la derecha: para estándar del péptido Rb, para la proteína recombinantes Rb del Motivo Activo) . Figura 8A: gráfica Lin-Log del Ensayo 1, LOD (proteína pRb) = 0.117nM, LOD (pRb-BSA lx) = 0.024nM. Figura 8B: Ensayo 1, gráfica Log-Log. Figura 8C: Ensayo 2, gráfica Lin-Log, LOD (proteína pRb) = 0.077nM, LOD (pRb-BSA lx) = 0.026nM. Figura 8D: Ensayo 2, gráfica Log-Log. Coeficientes de correlación r2 > 0.99 Figuras 9A-9D muestran curvas estándar para el ensayo pErkl/2 (1:500 CST #9101) de 12 curvas de diluciones de punto del estándar del péptido pErkl/2 pErkl-BSA 2.7x (círculos sólidos) y la proteína recombinante pErkl de Invitrogen con señales más prominentes (triángulos sólidos) . Las señales de los lisados de control (400µg/ml) se agregaron a las curvas estándar del péptido para comparación (cuadros sólidos, pos = positivo, neg = negativo, el número indica la identidad del lisado, ver Tabla 1) ; las concentraciones se volvieron a calcular de las señales. Las gráficas muestran las señales medias de la dilución estándar impresa (puntos de dato sólido) y la curva de ajuste de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, ajuste Hill) . Los puntos de los datos corresponden a las señales medias de puntos por duplicado; las barras de error indican sus desviaciones estándar. Los valores LOD fueron concentraciones calculadas de nuevo de la curva adecuada en el nivel de señal en blanco media más desviación estándar de 3 veces (ver líneas puteadas en las gráficas de la derecha: para el estándar del péptido Erkl/2, — para la proteína recombinante Erkl/2 de Invitrogen) . Figura 9A: Ensayo 1 (gráfica Lin-Log) , LOD (proteína pErkl) = 0.058nM, LOD (pErkl-BSA2.7x) = 0.028nM. Figura 9B: Ensayo 1 (gráfica Log-Log) . Figura 9C: Ensayo 2 (gráfica Lin-Log), LOD (proteína pErkl) = 0.052nM, LOD (pErkl-BSA2.7x) = 0.032nM. Figura 9D: Ensayo 2 (gráfica Log-Log). Coeficientes de correlación r2 > 0.99.

Las Figuras 10A-10D muestran curvas estándar para el ensayo Erkl/2 (1:1000 Biosource 44-654G) de 12 curvas de diluciones de punto estándar del péptido Erkl Erkl-BSA 2.7x (círculos sólidos) y la proteína recombinante Erkl de Invitrogen con señales más prominentes (triángulos sólidos) . Las señales Erk totales de lisados de control pErk (400 µg/ml) se agregaron a las curvas estándar del péptido para comparación (cuadros sólidos, pos= positivo, neg=negativo, el número indica la identidad del lisado, ver Tabla 1) ; las concentraciones se retro-calcularon de las señales. Las gráficas muestran las señales medias de la dilución estándar impresa (puntos de dato sólido) y la curva de ajuste de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, ajuste Hill) . Los puntos de los datos corresponden a las señales medias de puntos por duplicado; las barras de error indican sus desviaciones estándar. Los valores LOD fueron concentraciones calculadas de nuevo de la curva adecuada en el nivel de señal en blanco media más desviación estándar de 3 veces (ver líneas puteadas en las gráficas de la derecha) . Figura 10A: gráfica Lin-Logs del Ensayo 1, LOD (proteína Erkl) = 0.059nM, LOD (Erkl-BSA2.7x) = 0.045nM. Figura 10B: gráfica Log-Logs del Ensayo 1. Figura 10C: gráfica Lin-Log del Ensayo 2 (parte inferior): LOD (proteína Erkl) = 0.084nM, LOD (Erkl-BSA2.7x) = 0.046nM. Figura 10D: Ensayo 2, gráfica Log-Log. Coeficientes de correlación r2 > 0.99 Las Figuras 11A-11D muestran curvas estándar para el ensayo Erkl/2 (1:1000 Biosource 44-654G) de 12 curvas de diluciones de punto de Erk-BSA 2.7x del estándar de péptido Erkl (círculos sólidos) y la proteína recombinante pErkl de Invitrogen con señales prominentes comparables con la proteína Erkl total de Invitrogen (diamantes sólidos) . Las señales Erk totales de los lisados de control pErk se agregaron a las curvas estándar del péptido para comparación (cuadros sólidos) ; las concentraciones se retro-calcularon de las señales. Las gráficas muestran las señales medias de la dilución estándar impresa (puntos de dato sólido) y la curva de ajuste de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, ajuste Hill) . Los puntos de los datos corresponden a las señales medias de puntos por duplicado; las barras de error indican sus desviaciones estándar. Los valores LOD fueron concentraciones calculadas de nuevo de la curva adecuada en el nivel de señal en blanco media más desviación estándar de 3 veces (ver líneas puteadas en las gráficas de la derecha) . Figura 11A: Ensayo 1 (gráfica Lin-Log) , LOD (proteína pErkl) = 0.040nM, LOD (Erkl-BSA2.7x) = 0.045nM. Figura 11B: Ensayo 1 (gráfica Log-Log) . Figura 11C: Ensayo 2 (gráfica Lin-Log), LOD (proteína pErkl) = 0.047nM, LOD (Erkl-BSA2.7x) = 0.046nM. Figura 11D: Ensayo 2 (gráfica Log-Log) . Coeficientes de correlación r2 > 0.99.

La Figura 12 muestra el diseño del arreglo para experimentos con aumentos del Ejemplo 5. Las condiciones de las series de dilución estándar impresas, los reactivos aplicados y lisados aumentados se dan en la Tabla 7.

Las Figuras 13A1, 13A2 y 13B muestran imágenes de señal de arreglo del ensayo de Histona H3 (1:10 '000 de dilución del anticuerpo abl791) . Ensayo por duplicado 1 (Fig. 13A1) y ensayo (Fig. 13A2) así como el ensayo en blanco (Fig. 13B) se muestran. Tiempo de exposición: ls e Intervalo de Despliegue (DR) de imágenes: 300...15000. Los ensayos se llevaron a cabo con el anticuerpo de Histona H3 (Abcam, abl791) a una dilución de 1:10'000.

La Figura 14 muestra curvas estándar para el ensayo Histona H3 (1:10000 Abcam abl791) : 8 curvas de diluciones de punto del estándar del péptido de Histona H3 (Histona H3-BSA 2.7x) en regulador de pH (círculos sólidos) y 7 series de diluciones de punto del estándar del péptido de Histona H3 aumentado en el lisado de Histona H3(-) de control 6 (triángulos sólidos) . Se muestran las señales de las curvas aumentadas que se corrigieron para la concentración de la señal de la concentración endógena de Histona H3 de lisado puro (valores de señales compensadas (blanco) y de concentraciones proteicas endógenas recalculadas se indican en gráficas) . Las gráficas muestran los puntos de datos medidos (puntos de datos sólidos) y las curvas adecuadas de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, adaptación Hill) . Los puntos de los datos corresponden a las señales medias de N=5 puntos por replicado por concentración, las barras de error indican sus desviaciones estándar. Ensayo 1 (parte superior) y Ensayo 2 (parte inferior) . Gráfica Lin-Logs (lado izquierdo) y gráfica Log-Log (lazo derecho) . Los coeficientes de correlación son r2 > 0.99.

Las Figuras 15Al, 15A2 y 15B muestran las imágenes de señal del arreglo del ensayo pRb (dilución 1:500 del anticuerpo CST #9308) . Ensayo 1 por duplicado (Fig. 15A1) y ensayo 2 (Fig. 15A2) así como ensayo en blanco (Fig. 15B) se muestran. Tiempo de exposición: 16s e Intervalo de Despliegue (DR) de imágenes: 1500...30000. Los ensayos se llevaron a cabo con el anticuerpo pRb (CST #9308) a una dilución de 1:250.

La Figura 16 muestra curvas estándar para el ensayo pR (1:250 CST #9308) : 8 curvas de diluciones de punto del estándar de péptido pRb (pRb-BSA lx) en regulador de pH (círculos sólidos) y 7 series de diluciones de punto del estándar del péptido pRb aumentado en lisado pRB(-) 12 (triángulos sólidos) . Las señales muestran las curvas aumentadas que se corrigieron para contribución de la señal de la concentración del pRb endógeno del lisado puro (valores de señales compensadas (en blanco) y de concentraciones pRb endógenas de nuevo calculadas que se indican en las gráficas) . Las gráficas muestran los puntos de datos medidos (puntos de dato sólido) y las curvas adecuadas de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, ajuste Hill) . Los puntos de datos corresponden a las señales medias de N=5 puntos por duplicado por concentración, las barras de error indican sus desviaciones estándar. Ensayo 1 (parte superior) y Ensayo 2 (parte inferior) . Gráficas Lin-Logs (lado izquierdo) y gráficas Log-Log (lado derecho). Los coeficientes de correlación son r2 > 0.99.

Las Figuras 17A1, 17A2 y 17B muestran las imágenes de señal del arreglo del ensayo pErkl/2 (dilución 1:500 del anticuerpo CST #9101) . Ensayo 1 por duplicado (Fig. 17A1) y ensayo 2 (Fig. 17A2) así como ensayo en blanco (Fig. 17B) se muestran. Tiempo de exposición: 2s e Intervalo de Despliegue (DR) de imágenes: 500...30000. Los ensayos se llevaron a cabo con el anticuerpo pErkl/2 (CST #9101) a una dilución de 1:500.

La Figura 18 muestra curvas estándar para el ensayo pErkl/2 (1:500 CST #9101) : 8 curvas de diluciones de punto del estándar de péptido pErkl/2 (pErkl-BSA 2.7x) en regulador de pH círculos sólidos) and 7 series de diluciones de punto del estándar de péptido pErkl/2 aumentado en el lisado 13 pErk(-) (triángulos sólidos) . Las señales muestran las curvas aumentadas que se corrigieron para contribución de la señal de la concentración de pErkl/s endógeno del lisado puro (valores de señales de compensación (en blanco) y las concentraciones proteicas endógenas retro-calculadas se indican en las gráficas) Las gráficas muestran los puntos de datos medidos (puntos de dato sólido) y las curvas adecuadas de un modelo de unión de un sitio (línea sólida, ajuste Hill) . Los puntos de datos corresponden a las señales medias de N=10 puntos por duplicado por concentración, las barras de error indican sus desviaciones estándar. Ensayo 1 (parte superior) y Ensayo 2 (parte inferior) . Gráfica Lin-Logs (lado izquierdo) y gráficas Log-Log (lado derecho) .

Las Figuras 19A1, 19A2 y 19B muestran las imágenes de señal del arreglo del ensayo Erkl/2 (dilución 1:1000 del anticuerpo BioSource 44-654G) . Ensayo 1 por duplicado (Fig. 19A1) y ensayo 2 (Fig. 19A2) así como ensayo en blanco (Fig. 19B) se muestran. Tiempo de exposición: 2s e Intervalo de Despliegue (DR) de imágenes: 500...30000.

La Figura 20 muestra curvas estándar para el ensayo Erkl/2 (1:1000 Biosource 44-654G) : 8 curvas de diluciones de punto pErkl-BSA 2.7x del estándar de péptido pErkl/2 en regulador de pH círculos sólidos) y 7 series de diluciones de punto del estándar de péptido pErkl/2 aumentado en el lisado 13 pErk (-) (triángulos sólidos). Las gráficas muestran los puntos de datos medidos (puntos sólidos) y las señales medias de todos los puntos de datos (líneas sólidas) . El ensayo Erkl/2 generado, como se esperaba, señales de casi cero para las diluciones del estándar de péptido pErkl/2 en regulador de pH, y señales prominentes uniformes para todos los puntos de lisado aumentados con diferentes concentraciones de pErkl/2. Las señales medias representan los niveles de Erkl/2 endógeno del lisado 13 independiente en concentración aumentada. Los ejes de señal se escalaron en cuanto al ensayo pErkl/2 (ver Figura 19) . Los puntos de datos corresponden a las señales medias de N=10 puntos por duplicado para cada concentración aumentada, las barras de error indican sus desviaciones estándar. Ensayo 1 (izquierda) : señal media (curva estándar) = 0.010 + 0.002 RFI, señal media (curva aumentada) = 1.097 ± 0.057 RFI y Ensayo 2 (derecha): señal media (curva estándar) = 0.008 ± 0.002 RFI, señal media (curva aumentada) = 0.969 ± 0.016 RFI.

Ejemplos : Los reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario .

Ejemplo 1: Materiales y Métodos Muestras de Lisados Las concentraciones de proteína se determinaron en un ensayo Bradford modificado (Coomassie Más Reactivo de Ensayo de Proteína, no. 23238, Pierce) . Las muestras de lisados se almacenaron en un congelador a -70 °C hasta uso.

Tabla 1. Muestras de lisado de control. Rb= Proteína supresora de tumor de retinoblastoma, Erk= cinasa regulada por la señal extracelular, p = residuo de aminoácido fosforilado .

Para la impresión del arreglo en diferentes paquetes operativos, las muestras de lisados se ajustaron a una concentración de proteína dada en CLB1 (regulador de pH de lisis) (Zeptosens) y finalmente se diluyó a 1:10 en regulador de detección CSBL (Zeptosens) ) . Las concentraciones de proteína impresas finales siempre se indican en las secciones respectivas.

Impresión del Arreglo de Micro-Arreglos de Proteína de Fase Inversa Diseño del arreglo típico en la Figura IB. Cada arreglo contuvo 19 x 20 (380) puntos. Se utilizaron 320 puntos para 160 posiciones de muestra, cada una a ser impresa en puntos por duplicado. Los diámetros de los puntos fueron de aproximadamente 150 µp?. La distancia de punto-a-punto fue de 280 µ?? en el eje horizontal y 300 µp? en el eje vertical.

El arreglo se dividió en 12 campos de arreglo. Cada campo comprendió 12 posiciones de muestra, cada posición se imprimió en puntos por duplicado. Las 12 posiciones de muestra se organizaron en 3 filas de 4 posiciones cada una. Las series de diluciones de 12 puntos (diluciones de 2 pliegues) se imprimieron en el orden de la posición 1 (concentración más alta = concentración de inicio) a la posición 12 (concentración más baja) , ver Figura IB. Las flechas indican la dirección de las concentraciones en disminución. Los campos del arreglo adyacentes se organizaron en posición en espejo. Esto se hizo para evitar que los puntos de las concentraciones estándar más altas se unieran a los puntos de las concentraciones estándar más bajas. Los lisados se co-arreglaron como controles en el campo de Control (16 posiciones en puntos por duplicado) .

Los arreglos de diferentes paquetes de trabajo se imprimieron en series de replicados (6 arreglos por chip) en un número suficiente para llevar a cabo todos los experimentos. Las soluciones de impresión para cada serie se prepararon en fresco en placas de 384 cavidades por medio de un robot de manejo de líquido (Tecan Génesis RSP100) . Para cada curva estándar, se preparó una solución madre del reactivo estándar a la concentración de inicio (por ejemplo, 50 nM) . Las diferentes muestras (12 x diluciones de 2 pliegues) se prepararon como diluciones seriales en las cavidades de la placa. El volumen por cavidad fue de 25 µ? . Para imprimir los lisados de control, las muestras se ajustaron a una concentración de inicio uniforme (por ejemplo, 1.5 mg/ml) y diluyeron 1:10 en el regulador de pH de detección CSBL (por ejemplo concentración final = 150 µg/ml) .

Cada punto se arregló como una gotícula individual de aproximadamente 400 picolitros en volumen, utilizando un impresor robotizado piezo-eléctrico comercial (NanoPlotter NP2, GeSim GmbH, D-GroSerkmannsdorf) . Junto con las series de dilución y las muestras de lisado, se co-arreglo un material de referencia que consiste de proteína marcada con fluorescencia en tres filas separadas de las marcas de descanso (ver Figura IB) . Estos puntos de referencia (Ref) se utilizaron para compensar las faltas de homogeneidad locales eventuales de la iluminación del arreglo, variaciones de arreglo-a-arreglo y de chip-a-chip. Los arreglos se produjeron bajo condiciones de sala blanca.

Las muestras para las series de dilución y los controles de lisados siempre se prepararon frescas de concentrados congelados .

Después de la detección, los microarreglos se bloquearon con BSA, lavaron vigorosamente con ddH20, secaron bajo una corriente de nitrógeno y almacenaron en la oscuridad a +4°C hasta uso. Para las mediciones, se acopló una estructura de fluido al chip para tratar cada uno de los 6 arreglos idénticos de un chip individualmente con solución de anticuerpo específico de analito en la condición del ensayo respectivo (el volumen de cámara por arreglo fue de aproximadamente 15 L) .

Anticuerpos y Reactivos del Ensayo La Tabla 2 enumera las proteínas y los anticuerpos correspondientes utilizados en este estudio.

Tabla 2 Lista de analitos de proteína y anticuerpos. NMI-TT proveyó todos los otros reactivos, por ejemplo reactivos de detección marcados, reguladores de pH, necesarios para realizar los ensayos en Arreglos de Proteína de Fase Inversa (RPA, por sus siglas en inglés) .

Los fragmentos Fab anti-especie se utilizaron como reactivos de detección para la generación de señal del arreglo en los microarreglos .

• Moléculas Fab IgG anti-conejo marcada con Alexa Fluor 647 (Z-25308, Molecular Probes) , para detectar los anticuerpos policlonales de conejo unidos al analito respectivo.

Regulador de pH de Ensayo (anticuerpo) El regulador de pH de ensayo para la medición RPA (regulador de pH de ensayo) fue de 50 mM de imidazol/HCl , 150 mM de NaCl, 0.1% de Tween20, 0.005% de azida de sodio, pH7.4 con la adición de 5% (p/v) de BSA Reguladores de pH de Impresión (reactivo de calibración) El regulador de pH de impresión fue CSBL (Zeptosens- una División de Bayer Schweiz AG) .

Se utilizaron los siguientes reactivos como adiciones durante el estudio: BSA (#T844.2, Roth) , BSA acetilado (#05491, Fluka) Arreglos de Proteína de Fase Inversa Procedimiento y Análisis de Datos del Ensayo La detección del analito de proteína en el arreglo se realizó en un inmunoensayo secuencial de dos pasos directo.

El primer paso comprendió la adición del anticuerpo específico del analito en regulador de pH de ensayo sobre el microarreglo e incubación durante la noche a at 25°C. Después de remover el exceso de anticuerpos lavando con regulador de pH de ensayo, los microarreglos se incubaron con el fragmento Fab anti-especie marcado con fluorescencia durante 1 hora a 25°C en la oscuridad. Para la detección de los anticuerpos de conejo aplicados en este estudio, se utilizaron fragmentos Fab a una dilución de 500 veces en regulador de pH de ensayo. Finalmente, los arreglos de lavaron y formaron en imágenes en solución (regulador de pH de ensayo) con el instrumento para formar imágenes ZeptoREADER."1 (Zeptosens) .

Los experimentos de competencia adicionales se realizaron para ensayar la especificidad de la unión del anticuerpo-antígeno en solución y en el punto del arreglo. Para esto, se mezcló el producto de péptido sintetizado libre (secuencias de epítopo de unión específicas para los anticuerpos respectivamente aplicados) junto con el anticuerpo primario en solución de regulador de pH de ensayo e incubó por 30 min a temperatura ambiente, antes de incubar la mezcla de reacción en el arreglo. Todos los otros pasos del ensayo se llevaron a cabo a condiciones comparables con el ensayo normal antes descrito. Las concentraciones del péptido libre se seleccionaron en exceso molar de la concentración de anticuerpo aplicada (ver también la Tabla 2) Las concentraciones del péptido para la competencia se seleccionaron típicamente a 1000 n , 100 nM y 10 nM, si no se indica lo contrario.

ZeptoREADER* es una solución de mesa de trabajo para la lectura de alto rendimiento automática de microarreglos. En breve, hasta 26 microarreglos (6 chips) pueden montarse en un portador (formato de huella MTP) . Un apilador integrado permite la lectura sin vigilancia de hasta 360 microarreglos (10 portadores completamente cargados) en una sola corrida. Los microarreglos pueden excitarse a 532 nm (verde) y 635 nm (rojo) ; la emisión de fluorescencia se detectó con filtros de emisión que pasan entre 547-597 nm (verde) y 650-700 nm (rojo) . Para este estudio, se tomaron típicamente 9 imágenes de fluorescencia para cada arreglo en el canal de detección rojo a tiempos de exposición en el intervalo de 0.5 -16 segundos y se almacenaron en un formato tif de 16 bits para análisis adicional con el software ZeptoVIEW™ PRO software (Zeptosens) .

Análisis de Microarreglo Las imágenes de microarreglo se analizaron utilizando el software ZeptoVIEW™ Pro 2.0 (Zeptosens). El diámetro de punto de la cuadrícula de análisis del arreglo, que se alineó con los microarreglos, se fijó constante a 160 µ?t?.

El análisis de los datos para cada medición se llevó a cabo como sigue: · Selección de una imagen del analito de tiempo de exposición adecuado (todas las señales de punto por debajo de la saturación de la imagen) .

• Cálculo de las intensidades de señal media de referencia, corregidas en fondo, de cada punto individual (en RFI = unidades de Intensidad de Fluorescencia de Referencia) . La señal de referencia se calcula como la proporción de la muestra local y la señal de punto.

• Para todos los puntos duplicados de una condición de impresión (en la mayor parte de los casos puntos por duplicado) , las intensidades de señal media de referencia, corregidas en fondo (RFI, por sus siglas en inglés) de cada par de puntos por duplicado se promediaron. Las señales en los diagramas y las tablas representan las señales medias respectivas, las barras de error corresponden a las desviaciones estándar. Se indican los números de puntos por duplicado aplicados (N) para el promedio.

Además , los experimentos de ensayo en blanco en la ausencia del anticuerpo primario específico del analito se llevaron a cabo para controlar posibles contribuciones de unión no específicas de los reactivos de detección secundarios . Las señales RFI de todas las imágenes en blanco fueron insignificantemente bajas (para estándares también como muestras de lisados) y por consiguiente no se consideraron en el proceso para el análisis de los datos.

Los puntos de datos de las curvas de dilución (señales medias de puntos por duplicado) se ajustaron utilizando el paquete de software XLfit v4.3.0 del Programa de Ayuda de Excel (IDBS, Guildford UK) . Se seleccionó un modelo de sitio de unión de un sitio para la adaptación (función de adaptación #251: y D+ ( (Vmax* (xAn) ) / ( (xAn) + (KmAn) ) ) con D = compensación de señal, Vmax = señal de saturación, Km = constante de afinidad, n=l sitio de unión) .

Los límites-de-Detección (LOD, por sus siglas en inglés) fueron como concentraciones estándar retro-calculadas del ajuste en la señal en blanco media (los 4 puntos de datos más bajos) más la desviación estándar de tres pliegues.

Ejemplo 2: Producción de reactivos de calibración (conjugados de péptido-proteína) Secuencias de Péptido Se seleccionaron cuatro antígenos para la investigación. Estos antígenos fueron Histona H3 , Rb fosforilado, Erkl/2 fosforilado y Erkl . Las secuencias de 4 péptidos representan los epítopos de unión lineales de los 4 antígenos seleccionados para los anticuerpos respectivamente seleccionados. La información de secuencia de epítopo se obtuvo de los vendedores del anticuerpo. Antígenos, secuencias de aminoácido, longitudes, posición del epítopo de los antígenos e información del anticuerpo respectivo se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Lista de antígenos, secuencias de péptido epítopo e información del anticuerpo correspondiente.

Los anticuerpos contra los sitios de fosforilación de Erkl humano (p44 MAPK) y Erk2 (p42 MAPK) , colocados en el centro de la proteína, comparten la misma secuencia de aminoácido de epítopo alrededor de la posición del aminoácido Thr202 y Tyr204. El anticuerpo contra la forma total de Erkl MAPK, en la presente se seleccionó de BioSource, se produjo contra una región de secuencia lineal diferente en el extremo C-terminal de la proteína. Esta región de secuencia por lo general se utiliza para anticuerpos de otros vendedores. Las secuencias de péptido completas de las dos proteínas Erkl (SEC. ID NO: 5) y Erk2 (SEC. ID NO : 6) se muestran en las Figuras 2A y 2B. La secuencia de epítopo seleccionada utilizada en este estudio para la proteína Erkl (posición 317-339) es homóloga a la secuencia Erk2 C-terminal correspondiente, excepto por la diferencia de los aminoácidos en tres posiciones.

Síntesis de Péptido Para cada uno de los cuatro antígenos seleccionados, dos péptidos han sido sintetizados en y por NMI-TT. Los dos péptidos comprendieron (i) una forma de péptido libre a ser utilizada como reactivos de competencia en los inmunoensayos y (ii) una forma funcionalizada a ser utilizada para la conjugación con proteínas BSA como moléculas reactivas estándar chips RPA. Los péptidos funcionalizados se sintetizaron con una función Cys-separador N-terminal para el acoplamiento covalente con proteína de albúmina de suero utilizando ciclos de tapado. Se seleccionó Doa-Doa (Doa = ácido 8-Amino-3 , 6-Dioxaoctanoico) como un separador hidrófilo equivalente de longitud C18 (de tipo PEG) . Los ciclos de tapado se utilizaron en la síntesis para obtener una buena especificidad y un enriquecimiento final de las secuencias objetivo correctas para la conjugación de la proteína.

Después de la síntesis, los péptidos fueron igualmente controlados por HPLC para buena pureza, y espectrometría de masas ( S) para la masa molecular correcta. La información de secuencia de los productos peptídicos sintetizados con la información de masa correspondiente y pureza obtenida se resume en la Tabla 4.

Tabla 4. Lista de 8 productos peptídicos sintetizados a y por NMI-Technologietransíer GmbH (Reutlingen, Alemania) . Para cada antígeno, se sintetizó una forma libre del péptido como reactivo de competencia, y una forma funcionalizada para la conjugación covalente a la proteína BSA (reactivo estándar) . La forma funcionalizada de los péptidos se sintetizó con un separador Dabs-Cys (C) -Doa-Doa N-terminal adjuntado. Dabs = Dabsilo (marca de absorbencia). Doa = ácido 8-Amino-3,6-Dioxaoctanoico (separador hidrófilo) . Cys (C) se utilizó como grupo funcional para el acoplamiento covalente del péptido a BSA a través de química de tiol . Los péptidos se sintetizaron como formas libres N-terminal (H2N) o acetiladas (Ac) , y formas libres C-terminal (COOH) o amidadas (C0NH2) . Los aminoácidos fosforilados se marcaron en negrillas. (func. = funcionalizado, fosfo, p = fosforilado) .

Todos los péptidos alcanzaron una alta pureza de > 95% como se específica (la mayor parte >99%) y masa molecular correcta. No se encontraron dificultades mayores durante la síntesis de estos péptidos.

Conjugación de Péptido-Proteína Los reactivos estándar finales se produjeron como conjugados de péptido-proteína respectivos. Para esto, cada forma funcionalizada del péptido se conjugó en exceso molar a 3 diferentes proporciones (activado por maleimida) de albúmina de suero de bovino (BSA) a través del acoplamiento covalente a su grupo Cys N-terminal libre, se utilizaron 2 mg de proteína para cada reacción de acoplamiento. El acoplamiento del péptido se describe anteriormente en Poetz y otros, Proteomics 5, 2402-2411 (2005) . Brevemente, los péptidos sólidos se disolvieron como existencias concentradas en 100% de DMSO y posteriormente se diluyeron a concentraciones operativas en PBS pH 7.4 regulador de pH conteniendo DMSO a un máximo de 20%. Las soluciones de péptido y BSA activadas se mezclaron e incubaron en la oscuridad por 2h a temperatura ambiente. El péptido sin conjugar se eliminó por medio de una columna giratoria (exclusión de tamaño) y las fracciones de las proteínas conjugadas se recolectaron en PBS pH7.4. Posteriormente, las concentraciones de péptido (acoplado) de las fracciones de péptido-proteína se determinaron por medición de absorbencia espectrofotométrica a 466 nm (máximo de la absorbencia Dabsilo de espectro, coeficiente de extinción 33 '000 M"1 cm"1, una etiqueta por péptido) . El color de la absorbencia de las fracciones de péptido-proteína fue claramente visible a simple vista (ver Figura2) .

Las concentraciones de proteína de las fracciones conjugadas se determinaron de acuerdo con Bradford. Las concentraciones proteicas totales fueron de aproximadamente 1.5 mg/ml . Las concentraciones peptídicas medidas, las concentraciones proteicas totales, y proporciones de péptido : roteína ( tinte : proteína) calculadas finales de los productos formados se resumen en la Tabla 5.

Proporción Preparación Concentración de péptido Concentración de PéptidoiProteína proteína Conjugado exceso molar reg. absorbencia absorbencia Dabs(D) péptido proteína pH 466 nm neta conc(p ) Tabla 5. Se produjeron 12 reactivos estándar como conjugados de péptido-proteína. Para cada antígeno, se prepararon 3 variantes de conjugados de péptido-proteína que comprenden diferentes proporciones molares de péptido:proteína. La concentración del péptido conjugado se determinó a través de la medición de la absorbencia fotométrica del la etiqueta Dabsilo integrada al péptido utilizando proteína no marcada activada (BSA) como un control La concentración proteica total del producto conjugado se determinó mediante la prueba Bradford. La proporción de péptido: roteína se calculó como proporción molar de tinte : rotelna, corregida para adición de masa de los péptidos conjugados.

El control de calidad de los conjugados de péptido se llevó a cabo a través de SDS-PAGE (4-12% de gel) utilizando el BSA pre-activado puro como una referencia. Los geles fueron Coomassie teñido por 60 min. Las imágenes del gel mostraron bandas de producto puro como se esperaba, con cambios de masa correspondientes a las diferentes proporciones de péptido : roteína calculadas. Típicamente, las proporciones de acoplamiento finalmente determinadas alcanzaron 17-40% de las proporciones molares inicialmente esperadas de péptido :proteína, que fueron de acuerdo con la experiencia previa con otros péptidos. Las variaciones puede deberse a diferentes solubilidades en las altas concentraciones de inicio aplicadas y/o por ejemplo diferentes estructuras conformacionales de péptido de los los péptidos en el regulador de pH de acoplamiento acuoso.

Los cuatro estándares de reactivo conjugados de péptido-proteína fueron puros de acuerdo con PAGE.

Finalmente, todos los reactivos de péptido se liofilizaron: min. 5 mg de cada péptido libre (4 reactivos competitivos) , y min. 1 mg de cada conjugado de péptido-proteína (4 estándares reactivos, a las proporciones de péptido: proteína seleccionadas) .

Proteínas Recombinantes y Control SDS-PAGE control (Histona, Erk) Se seleccionaron recíprocamente 8 diferentes proteínas de diferentes vendedores como alternativa de proteína completa para los estándares del péptido (Tabla 6) .

Se controló la calidad de 7 proteínas (2x Histona H3, 5x Erk) por SDS-PAGE utilizando BSA como proteínas de referencia.

Tabla 6. Lista de proteínas recombinantes La pureza de las proteínas bue buena como evidente de las bandas individuales después , de la electroforesis en gel. Sin embargo, las intensidades de señal de las bandas individuales mostraron grandes diferencias indicando diferentes concentraciones de la proteína cuando se comparan con las mismas cantidades de BSA cargado como una referencia. Obviamente los valores de las concentraciones dadas en estas hojas de datos de los vendedores no fueron confiables. Por consiguiente, las intensidades de señal integrales de las bandas de proteína se analizaron para estimar en el mejor de los casos las concentraciones correctas con relación al BSA co-cargado. Los factores de corrección resultantes (ver Tabla 6) por consiguiente se consideraron en la preparación de la muestra de todas las series de dilución estándar impresas en lo siguiente.

Optimización de las Condiciones de Ensayo e Impresión - Primeras Curvas Estándar En los primeros experimentos, los ensayos se realizaron en diferentes grupos de arreglos que se imprimieron con curvas estándar de diferentes reactivos de péptido-BSA a diferentes composiciones y condiciones, para examinar sus efectos en el rendimiento del inmunoensayo posteriormente ensayado. Se examinaron las siguientes condiciones: .

• Las curvas estándar de los reactivos de péptido-BSA con las diferentes proporciones de conjugados de péptido : proteína (ensayados para HistonaH3 -BSA, pRb-BSA y pErk-BSA) • Las curvas estándar de reactivos de péptido-BSA impresos en la ausencia y presencia de la adición de matriz de proteína adicional (BSA) Las curvas estándar se imprimieron como 12 curvas de diluciones seriales (diluciones de 2 pliegues) , cada dilución como puntos por duplicado (como se describe en el Ejemplo 1: Materiales y Métodos) . Las concentraciones de inicio de diferentes reactivos para la impresión se ajustaron a una concentración de epítopo uniforme de 50 nM Además, los lisados de control positivo y negativo se coimprimieron en los mismos arreglos. Las muestras de lisados se organizaron a una concentración proteica total de 0.25 mg/ml. Los inmunoensayos de llevaron a cabo en las condiciones de anticuerpo indicadas. Las diferencias observadas en el rendimiento del ensayo se evaluaron cuantitativamente y, con base en estos resultados y la experiencia previa con estos tipos de reactivos, se seleccionaron las mejores condiciones de impresión y ensayo .

Curvas estándar de reactivos de péptido que contienen diferentes proporciones de conjugados de péptido :proteína Generalmente, las curvas estándar de los estándares de reactivo de péptido impresas a diferentes proporciones de péptido : proteína proporcionaron señales casi comparables en los ensayos . Las imágenes del ensayo se describen en las Figuras 3A-3C. Sin embargo, los estándares del reactivos de péptido de las proporciones más bajas de conjugados de péptido-proteína (muy por debajo de 1) tendieron a mostrar más morfologías de punto de tipo dona, a pesar de que los reactivos de las proporciones de conjugados más altas tendieron a proveer respuesta de señal de ensayo más baja (ver especialmente para el ensayo pErkl/2) . La tendencia anterior puede interpretarse como una accesibilidad de unión menor (menor que la lineal) de anticuerpos del ensayo para moléculas de péptido-BSA inmovilizadas que contienen más de una secuencia de epítopo por molécula BSA (aquí típicamente 3-6 para las proporciones más altas) . Para los experimentos adicionales, por consiguiente se seleccionaron los reactivos de proporciones de conjugación intermedias: HistonaH3 -BSA 2.7x (0.41 péptido : proteína) , pRb-BSA lx (0.41 péptido : proteína) y pErk-BSA 2.7x (0.89 péptido ¡proteína) .

Intervalo dinámico de señales y concentraciones Los ensayos en las curvas estándar impresas demostraron señales muy prominentes y un alto intervalo dinámico de señales que pueden extraerse de una y la misma medición en una imagen. Las Figuras 4A-4F muestran las señales cuantitativas analizadas representativas para el caso de HistonaH3 -BSA 2.7x y pErk-BSA 2.7x. Las señales se adaptaron perfectamente a la curva del extremo más bajo de un modelo de unión de 1 sitio (r2 > 0.99) con buena linealidad. El intervalo dinámico de las señales cubrió 4 órdenes de magnitud sobre 4 órdenes de concentración dentro de una imagen (un tiempo de exposición) . El intervalo dinámico del ensayo aún se puede expandir en 1-2 órdenes (según nuestra experiencia) , ya que el lector permite registros de imágenes a diferentes tiempos de exposición y además el uso de diferentes filtros en gris.

La concentración de inicio de estas curvas estándar impresas se seleccionó a 50 n . En una comparación de señal con las muestras de lisado de control co- impresas, resultó que las señales del ensayo de las curvas estándar y por lo tanto la concentración de inicio más alta de los estándares fue mucho mayor que los valores intrínsecos (niveles) de los lisados de control respectivos, especialmente de los analitos de proteína fosforilados . Por consiguiente las concentraciones de inicio de las curvas estándar tienen que ajustarse respectivamente. También las diferencias de señal de lisados de control negativos y positivos, respectivamente los niveles de expresión, fueron muy bajos, especialmente para los analitos fosforilados pErk y pRb (obviamente el tratamiento positivo de las líneas de células preparadas había sido subóptimo) . Por lo tanto se prepararon y proveyeron los nuevos lisados de control (ver Tabla 1) .

Curvas estándar de reactivos de péptido-BSA en ausencia/presencia de adiciones de proteína de matriz En otro grupo de arreglos, las curvas estándar de estándares de reactivo de péptido y las primeras proteínas recombinantes se imprimieron a tres diferentes condiciones de regulador de pH: (i) en la ausencia de cualquier adición de proteína adicional, y en la presencia de (ii) 50 pg/ml y (iii) 100 pg/ml de proteína de matriz (BSA acetilado = acBSA) , como se describe en la Figura 5A. Esto se hizo para ensayar el efecto de las adiciones de proteína de matriz en morfología de punto. Las señales de la curva estándar, generadas en ensayos posteriormente realizados, mostraron que la adición de proteína de matriz generalmente conduce a una mejor y más homogénea distribución de señal según comparado con la no adición de proteína de matriz (como se espera de otras aplicaciones) . Este efecto se observó para los los puntos estándar de reactivos de péptido así como de proteínas recombinantes. Al mismo tiempo, señales de punto medias permanecieron casi sin cambio, indicando que las adiciones de proteína principalmente conducen a una reorganización de un número constante de moléculas estándar dentro del punto. La proteína de matriz adicionada típicamente generó mayores diámetros de punto que se compararon mejor con los diámetros de punto de las muestras de lisados. Esto también hace al posterior análisis de los datos de estándares y puntos de muestra de Usados más consistente. Las adiciones de concentraciones mayores de proteína de matriz acBSA (100 µ9/p?1) conduce a morfologías de punto de señal en forma de dona, para los reactivos de péptido. Se realizó otro experimento para examinar el efecto del tipo de proteína de matriz: las adiciones de formas no modificadas y acetiladas de BSA se compararon directamente en las curvas estándar. Los resultados se describen en la Figura 5B (mostrados para Histona H3) y revelaron que acBSA tuvo la potencia superior para generar señales de punto homogéneas, especialmente para los puntos estándar de proteínas recombinantes . Las señales medias de los puntos fueron comparables . En una conclusión de nuestra examinación hasta ahora, se seleccionó la mejor condición uniforme para la impresión de las curvas estándar del estándar del péptido reactivo así como proteínas recombinantes (regulador de pH CSBL Plus 50 g/ml acBSA) .

Resumen de las mejores condiciones de impresión y ensayo seleccionadas para este estudio: Condición de impresión uniforme seleccionada para todas las curvas estándar: Adición de regulador de pH de detección CSBL Plus de 50 g/ml BSA acetilado (acBSA) Concentraciones de inicio seleccionadas para series de dilución (estándares de péptido) : 10 nM Histona H3 1 nM pRb 2.5 nM pERkl/2 5 nM ERkl/2 Condiciones de ensayo (diluciones de anticuerpo) seleccionadas: 1:10000 para el ensayo de Histona H3 1:250 para el ensayo pRb 1:500 para el ensayo pErkl/2 1:1000 para los ensayos Erkl/2 (3 anticuerpos) Las señales de los puntos de referencia impresos se ajustaron típicamente a niveles en gris de 15000 a 4 s de tiempo de exposición de imagen.

Ejemplo 3: Especificidad de reactivos de calibración como se derivan de experimentos de competencia con péptido libre en solución Los arreglos se imprimieron con curvas estándar de los 4 estándares de reactivo de péptido (HistonaH3 -BSA 2.7x, pRb-BSA lx, pErk-BSA 2.7x y Erkl-BSA 2.7x) así como todas las proteínas recombinantes disponibles para la comparación (12 curvas estándar con 12 curvas de dilución de punto) . Los controles muestras de lisados de control (controles negativo y positivo, muestras recién suministradas) se co-imprimieron a una concentración proteica total de 400 µg/ml y 250 g/ml. Los estándares y lisados de control se prepararon en regulador de H de detección CSBL, los estándares con adiciones de 50 g/ml de acBSA. Las concentraciones de inicio se las muestras de curva estándar se ajustaron para obtener a lo mínimo las señales del ensayo de los lisados de control positivos. El diseño y condiciones del arreglo se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Diseño del arreglo para experimentos de competencia: Condiciones de curvas estándar impresas, reactivos aplicados y controles de lisados. Los números en la primera columna se refieren a los campos del arreglo o la posición en los campos de control mostrados en la Figura IB.

El ensayo se realizó en arreglos para cada uno de los cuatro analitos de proteína en la ausencia (ensayo normal) y presencia de concentraciones en aumento de péptido libre correspondiente, que se pre-mezcló con la solución del anticuerpo respectiva antes de la incubación en los arreglos (ensayos de competencia) . Típicamente se ensayaron tres diferentes concentraciones de péptido libre (1000 nM, 100 nM y 10 nM, si no se indica lo contrario) para su eficiencia en el completo con el anticuerpo . respectivo para suprimir la formación de complejos de analito de anticuerpo-proteína específicos en los puntos del arreglo. Además, el ensayo de competencia se llevó a cabo con soluciones de anticuerpo que se pre- incubaron con proteínas recombinantes correspondientes, para comparar su eficiencia en la competencia y especificidad con la de los reactivos de péptido libre. Los ensayos en blanco (en la ausencia del anticuerpo primario) se realizaron como controles adicionales pero sus señales fueron negligentemente bajas y por consiguiente no se consideraron en el análisis de datos cuantitativo.

Las Tablas 8 a 10 resumen los resultados cuantitativos en términos de señales de curva estándar máximas .

Los resultados de los ensayos Erkl/2 demuestran bastante bien que no solamente el anticuerpo Erkl/2 de Biosource, sino también los dos anticuerpos CST adicionalmente seleccionados (#4695 rb monoclonal y #9102 rb policlonal) reconocen específicamente solamente los puntos estándar de Erkl-BSA (y en intensidades de señal comparables) , pero no de puntos estándar de pErk-BSA. Esto implica que los tres anticuerpos de los tres diferentes vendedores utilizados en este proyecto obviamente se plantearon contra un motivo de péptido muy similar en el extremo C-terminal de la proteína. Esto además colaboró mediante un experimento de competencia anterior adicional (experimento adicionado) , que se realizó con el anticuerpo Erkl/2 de CST (#9102) en la presencia de péptido epítopo libre que representó la secuencia de aminoácido del sitio de fosforilación de Erkl/2 (como se utiliza en .este proyecto) pero no estuvo fosforilado (péptido des-fosfo, disponible de NMI) . En el ensayo de competencia, realizado por el contrario bajo condiciones comparables como se muestra anteriormente, esto péptido des-fosfo no fue capaz de suprimir las señales específicas de los puntos estándar y de lisado observados en el ensayo normal Erkl/2 respectivo (datos no mostrados) . Por consiguiente se muestra que los anticuerpos Erk comprados de CST utilizan diferentes secuencia de epítopo de proteína para diferenciar entre las formas total y fosforilada de la proteína Erkl/2.

Señales de curva estándar máximas (RFI) 15 20 Tabla 8. Tabla de valores de señal (máxima) de señales de curva estándar de 5 todos los campos del arreglo para el ensayo de Histona H3 (1:10'000) . Las señales de curvas estándar específicas están subrayadas Señales de curva estádar máximas (RFI) Ensayo normal Ensayo de competencia 10 Campo Tipo de reactivo +péptldo +péptido ?péptido arreglo estándar señal est. 1000 nM est 100 nM est 10 nM est 1 Histona H3-BSA2.7x 0.03 0.004 0.01 0.000 0.02 0.004 0.02 0.004 2 Historia H3 Roche <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.001 3 Histona H3 Upstate 0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 4 Erk1 Invitrogen <0.01 0.001 <0.01 0.001 <0.01 0.000 <0.01 0.000 5 pErk-BSA 2.7x <0.01 0.001 <0.01 0.001 <0.01 0.001 0.01 0.003 6 Erk1-BSA2.7x 0.01 0.001 <0.01 0.001 <0.01 0.000 <0.01 0.000 7 pErk Active Motrf <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 8 pErkl Invitrogen <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.001 9 pRb-BSA 1x 0.47 0.019 <0.01 0.001 <0.01 0.003 0.07 0.003 10 pRb Active Motif 0.04 0.002 <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.001 11 Erk2 Biosource <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.001 12 Erk1 CST <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 <0.01 0.000 20 Tabla 9 . Tabla de valores de señal (máxima) de señales de curva estándar de todos 5 los campos del arreglo para el ensayo de pRb (1:250). Las señales de curvas estándar específicas están en negrillas.

Señales de curva estándar máximas (RFI) Ensayo normal Ensayo de competencia Campo Tipo de reactivo +péptido +péptido ?-péptido 10 arreglo estándar señal est. 1000 nM est. 100 nM est. 10 nM est. 1 Historia H3-BSA 2.7x 0.11 0.012 0.10 0.004 0.10 0.003 0.10 0.001 2 Histona H3 Roche 0.01 0.000 0.01 0.003 0.01 0.000 0.01 0.002 3 Histona H3 Upstate 0.01 0.001 0.01 0.003 < 0.01 0.000 0.01 0.001 4 Erk1 Invitrogen 0.23 0.007 0.01 0.001 0.01 0.002 0.01 0.001 5 pErk-BSA 2.7x 3.47 0.092 0.10 0.018 0.45 0.024 1.05 0.062 6 Erk1-BSA 2.7x 0.02 0.001 0.02 0.004 0.02 0.007 0.01 0.002 7 pErk Active Motif 0.19 0.019 0.01 0.006 0.01 0.002 0.01 0.001 8 pErkl Invitrogen 1.66 0.050 0.01 0.001 0.01 0.004 0.05 0.007 9 pRb-BSA 1 x 0.01 0.001 0.01 0.003 0.01 0.000 0.01 0.005 10 pRb Active Motif 0.01 0.000 0.01 0.004 0.01 0.001 0.01 0.001 11 Erk2 Biosource 0.01 0.000 0.01 0.000 0.01 0.003 0.01 0.001 12 Erk1 CST 0.04 0.002 20 < 0.01 0.000 < 0.01 0.002 0.01 0.002 Tabla 10. Tabla de valores de señal (máxima) de señales de curva estándar de todos los campos del arreglo para el ensayo pErkl/2 (1:500). Las señales de curvas estándar específicas están en negrillas.

Biosource 44-65 G rb policio» Señales de curva estándar máximas {RFI) Ensayo normal Ensayo de competencia campo del Tipo de reactivo +péptido «protelna «protelna arreglo estándar señal est. 1000 nM est 100 nM est. 10 nM est 1 Historia H3-BSA 2.7x 0.04 0.000 0.02 0.001 0.22 0.019 0.13 0.013 2 Historia H3 Roche 0.02 0.003 0.01 0.001 0.15 0.015 0.07 0.004 3 Historia H3 Upstate < 0.01 0.006 0.01 0.003 0.16 0.014 0.09 0.003 4 Er*1 Invitrogen 10.91 0.409 0.02 0.001 0.38 0.014 5.17 0.056 5 pErk-BSA 2.7x < 0.01 0.037 0.01 0.000 0.14 0.022 0.08 0.031 6 Erf<1-BSA2.7x 8.24 0.356 0.14 0.018 5.69 0.327 7.88 0.210 7 pErk Active Motlf 1.17 0.129 0.01 0.000 0.15 0.003 0.31 0.007 8 pErfrt Invitrogen 10.43 0.372 0.02 0.003 0.32 0.026 3.88 0.010 9 pRb-BSA x 0.03 0.003 0.01 0.003 0.16 0.001 0.10 0.010 10 pRb Active Motrf 0.02 0.004 0.01 0.002 0.17 0.001 0.11 0.006 11 Erk2 Biosource 3.57 0.085 0.01 0.001 0.18 0005 0.90 0.095 12 Erk1 CST 0.28 0.017 < 0.01 0.001 0.16 0.004 0.15 0.002 CST #4695 rb monoc!onal ab Señales de curva estándar máximas (RFI) Ensayo normal Ensayo de competencia Array Typo +péptldo +protefna •+proteina field standard reaqent señal est ?????? est. 100 nM est, 10 nM est 1 HiStona H3-BSA 2.7X 0.01 0.001 0.01 0.001 0.12 0.006 no ensayo — 2 Hfstona H3 Roche 0.01 0.001 < 0.01 0.001 0.08 0.001 no ensa o — 3 Historia H3 Upstate 0.01 0.002 < 0.01 0.001 0.10 0.007 no ensayo — 4 Erk Invitrogen 7.12 0.152 0.04 0.001 0.59 0.006 no ensayo — 5 pErk-BSA 2.7x < 0.01 0.007 0.01 0.002 0.09 0.016 no ensayo — 6 ErM-BSA2.7x 2.77 0.159 0.01 0.002 0.29 0.015 no ensayo — 7 pErk Active Motlf 0.22 0.052 < 0.01 0.000 0.11 0.001 no ensayo — 8 pErkl Invitrogen 5.17 0.373 0.02 0.000 0.39 0.003 no ensayo — 9 pR -BSA 0.01 0.002 0.01 0.000 0.10 0.002 no ensayo — 10 pRb Active Motrf 0.01 0.001 < 0.01 0.002 0.09 0.004 no ensayo — 11 Erk2 Biosource 1.51 0.072 0.01 0.001 0.16 0.002 no ensayo — 12 ErM CST 0.04 0.003 < 0.01 0.002 0.10 0.001 no ensayo — CST #9102 rb oolfclonal ab Señales de curva estándar máximas (RFI) Ensayo normal Ensayo de competencia Array Type +péptldto ?protein «protelna field standard reagent serial est 1000 nM est. 100 nM Std 10 nM est 1 HiStona H3-BSA 2.7x 0.08 0.007 0.07 0.006 0.1O 0.008 no ensayo — 2 Histona M3 Roche < 0.01 0.000 < 0.01 0.001 0.03 0.005 no ensayo '— 3 Hlstona H3 Upstate < 0.01 0.008 < 0.01 0.002 0.03 0.001 no ensayo — 4 Erk1 Invitrogen 8.96 0.047 7.28 0.221 0.19 0.000 no ensayo — 5 pErk-BSA 2.7x < 0.01 0.008 0.01 0.002 0.04 0.004 no ensayo — 6 Erk1-BSA2.7x 2.44 0.002 0.08 0.000 0.12 0.004 no ensa o — 7 pErk Active Motlf 0.36 0.041 0.23 0.007 0.03 0.004 no ensayo — 8 pErkl Invitrogen 7.20 0.261 4.65 0.049 0.11 0.001 no ensayo — 9 pRb-BSA 1x 0.01 0.001 0.01 0.001 0.04 O.O07 no ensayo — 10 pRb Active Motrf < 0.01 0.002 < 0.01 0.000 0.04 0.004 no ensayo — 11 Ertó Biosource 1.51 0.222 0.91 0.034 0.07 0.003 no ensayo — 12 Erk1 CST 0.05 0.000 0.03 0.003 0.03 0.001 no ensayo — Tabla .11. Tabla de valores de señal (máximos) de señales de curva estándar de todos los campos del arreglo para el ensayo Erkl/2 conducido con tres diferentes anticuerpos a diluciones de 1:1000: anticuerpo (parte superior) Biosource 44-654G, (media)- CST #4695 rb. monoclonal, y (inferior) CST #9102 rb policlonal. Las señales máximas de las curvas estándar específicas son indican en negrillas.

Ejemplo 4: Sensibilidad del reactivo de calibración - Límites-de-Detección (LOD) Todos los ensayos se realizaron en arreglos del mismo diseño como se muestra en la Figura IB y Tabla 7. Los arreglos comprendieron las curvas estándar de los 4 estándares de reactivo de péptido (HistonaH3 -BSA 2.7x, pRb-BSA lx, pErk-BSA 2.7x y Erkl-BSA 2.7x) así como todas las proteínas recombinantes disponibles para comparación (12 curvas estándar con 12 curvas de dilución de punto) . Las concentraciones más altas de las curvas estándar del péptido se ajustaron a 10 nM para estándares de Histona H3, 1 nM para estándares de pRb, 2.5 nM para estándares de pErk y 5 nM para estándares de Erk. Estas concentraciones de inicio se seleccionaron de acuerdo con las señales endógenas más altas generadas por los lisados de control positivos. Las concentraciones estándares de proteína se prepararon por consiguiente y se ajustaron aplicando los factores de corrección SDS-PAGE. Las muestras de lisado de control (controles negativo y positivo, incluyendo el nuevo suministro) se co- imprimieron a una concentración proteica total de 400 pg/ml (para existencias disponibles con > 4 mg/ml de concentración de proteína) y 250 g/ml. Los lisados estándar y de control se prepararon en regulador de pH de detección CSBL, los estándares con adiciones de 50 pg/ml de acBSA.

Los ensayos se realizaron para cada uno de los cuatro analitos proteicos en la ausencia (ensayo normal) y presencia de péptido libre a la concentración más alta efectiva para completar la competencia (ensayos de competencia) . Cada condición (ensayo normal, ensayo de competencia) se midió en ensayos por duplicado (dos arreglos por condición) . Los ensayos en blanco (en ausencia de anticuerpo primario) se midieron adicionalmente como un control. Todas las imágenes del arreglo se analizaron cuantitativamente. Para cada ensayo, las curvas de señal estándar para cada uno de los 12 campos del arreglo de cada arreglo se generaron adaptando un modelo de unión de un sitio a los puntos de datos extraídos de cada una de las series de dilución de 12 puntos. Los límites-de-detección (LOD) se determinaron de la curva adaptada como concentraciones retro-calculadas que correspondieron a las señales medias de los niveles en blanco (cuatro puntos de datos más bajos) más desviaciones estándar respectivas de 3 pliegues .

Las curvas estándar generadas de ensayo normal y de competencia (puntos de datos y curvas adaptadas, así como valores LOD retro-calculados) para los ensayos por duplicado se muestran en las Figuras 7 a 11. Los LOD se dan en las gráficas para cada curva estándar. Se obtuvo una buena calidad en las curvas adaptadas con coeficientes de correlación de r2 > 0.99.

El anticuerpo Abcam específicamente se une al estándar del péptido HistonaH3-BSA y el anticuerpo Abcam específicamente se une también a las proteínas recombinantes de Histona H3 , más prominentemente a la proteína humana de Upstate. Las intensidades de señal de las curvas estándar del estándar de péptido y proteína recombinante (Upstate) fueron bien comparables. La reproducibilidad de los dos ensayos fue muy buena. Las CV de señal fueron típicamente de alrededor de 12% para los estándares del péptido y de alrededor de 13% para la proteína Histona H3 (Upsate) . Los LOD medios fueron de 0.123 ± 0.019 nM para el estándar de péptido, y 0.156 ± 0.023 nM para la proteína recombinante (Upstate). Los valores LOD se pudieron reproducir muy bien para los ensayos por duplicado y comparables con el estándar de péptido y de proteína (Figura 7) .

El anticuerpo CST se une específicamente al estándar de péptido pRb-BSA y el anticuerpo CST se une específicamente también a la proteína recombinante pRb de Active Motif.

Sin embargo las intensidades de señal de las curvas estándar proteicas fueron claramente más bajas y lograron solamente aproximadamente 10% de las curvas estándar proteicas. Se presume que la proteína no está o está solamente parcialmente fosforilada (nota: la anotación de pRb y Rb en bancos de datos públicos obviamente se utiliza en paralelo para la misma proteína y no fue claro para nosotros si pRb utilizado en la presente indicó la proteína fosforilada) . La reproducibilidad de los dos ensayos fue muy buena. Los CV de señal fueron típicamente de 7% para el estándar de péptidos y ligeramente superior a aproximadamente 12% para la proteína pRb. Los valores LOD se reprodujeron muy bien para los ensayos por duplicado. Los LOD medios fueron de 0.025 + 0.001 nM para el estándar de péptido, y 0.097 + 0.020 nM para la proteína recombinante (Figure 8.

El anticuerpo CST específicamente se une solamente al estándar de péptido pErkl/2-BSA, y no al estándar Erkl-BSA El anticuerpo CST también se une específicamente forma prominente a la proteína recombinante pErkl (Invitrogen) y alcanza intensidades de señal de aproximadamente 25% de las señales del estándar de péptido pErkl/2-BSA respectivo. El anticuerpo CST se une en un grado menor también a pErk de Active Motif (aproximadamente 12%) > Erkl de CST (aproximadamente 11%) > proteína Erkl de Invitrogen (aproximadamente 3%) . Las señales se dan con relación a la señal de la proteína pErkl (Invitrogen) en %. Las reproducibilidades de los dos ensayos fueron muy buenas. Las CV de las señales fueron típicamente de aproximadamente 2% para el estándar de péptido, y ligeramente mayores de aproximadamente 6% para la proteína pErkl (Invitrogen) . Los valores LOD fueron bien reproducibles reproducible para los ensayos por duplicado. Los LOD medios fueron de 0.030 ± 0.002 nM para el estándar de péptido, y 0.055 ± 0.003 nM para la proteína pErkl (Invitrogen) (Figura 9) .

Se logró una buena calidad de las curvas adaptadas con coeficientes de correlación de r2 > 0.99 El anticuerpo de Biosource específicamente se unió solamente al estándar de péptido Erkl-BSA, no al estándar pErkl-BSA. El anticuerpo de Biosource se unió específicamente a las proteínas recombinantes Erkl y pErkl (más prominentemente entre las diferentes proteínas disponibles) , y generó intensidades de señal bien comparables para estas proteínas y estándar de péptidos Erkl-BSA. El anticuerpo de Biosource se unió en un grado menor también a la proteína Erk2 (Biosource) > pErk (Active Motif) > Erkl (CST) . La reproducibilidad de los dos ensayos fue muy buena. Las CV de señal fueron típicamente de aproximadamente 3% para el de péptido, y ligeramente mayores de aproximadamente 8% para la proteína Erkl y de aproximadamente 5% para la proteína pErkl . Los valores LOD fueron bien reproducibles para los ensayos por duplicado. Los LOD medios fueron de 0.046 ± 0.001 nM para el estándar de péptido, y 0.072 + 0.013 nM para la proteína recombinante Erkl (Invitrogen) , y 0.044 ± 0.004 nM para la proteína recombinante pErkl (Invitrogen) (Figura 10A-10D y 11A-11D) .

Se logró buena calidad en las curvas adaptadas con coeficientes de correlación de r2 > 0.99 Ejemplo 5: Curvas estándar aumentadas en Usados (5 y 10 puntos por duplicado) Determinación de concentraciones de analito proteico absolutas.

Los ensayos se realizaron en arreglos del diseño mostrado en la siguiente Figura 12. Los arreglos comprendieron las series de dilución de los 3 estándares de reactivo de péptido HistonaH3 -BSA 2.7x, pRb-BSA lx y pErk-BSA 2.7x. Las diluciones en serie se imprimieron como series de 8 puntos con diluciones de 2 pliegues. Se imprimieron dos tipos de series de diluciones para cada reactivo de péptido: una serie se imprimió en regulador de pH de detección (CSBL plus 50 g/ml acBSA) similar al ejemplo 4, aplicando la misma concentración de inicio como se utilizó para el ejemplo 4. Las otras series se imprimieron como series de diluciones de 7 puntos aumentadas en lisados que fueron negativos para la proteína respectiva. La concentración proteica total aplicada de los lisados en las series de dilución aumentadas se mantuvo constante a 150 g/ml . La concentración de inicio más alta aumentada en el lisado se seleccionó como la mitad de la concentración de inicio de la serie respectiva en regulador de pH. Como la última muestra de cada serie aumentada, se imprimió el lisado negativo puro (en ausencia de cualquier concentración aumentada) como un control en blanco.

Tabla 11: Las condiciones de series de dilución estándar impresas, reactivos aplicados y lisados aumentados se dan en la Tabla 1. El diseño del ensayo se muestra en la Figura 12.

Los ensayos por duplicado (en 2 arreglos) se realizaron para cada uno de los cuatro analitos proteicos. Los ensayos en blanco (en ausencia del anticuerpo primario) se midieron adicionalmente como un control. Todas las imágenes del arreglo se analizaron cuantitativamente. Para cada ensayo, las curvas de señal estándar para cada uno de los 6 campos del arreglo de cada arreglo se generaron adaptando un modelo de unión de un sitio a los puntos de datos extraídos de cada una de las series de diluciones de 8 puntos . Los puntos de datos se promediaron para el número máximo de puntos por duplicado disponibles en cada serie (N=5 o N=10) . Para una comparación, las señales medias también se calcularon para puntos por duplicado (filas centrales de cada campo) . Los límites-de-detección (LOD) se determinaron de las curvas adaptadas como se describe anteriormente. Además, las señales de series aumentadas se corrigieron para las señales endógenas (en blanco) y la señal corregida se proyectó en curvas estándar en regulador de pH.

Los resultados se muestran en las Figuras 13A1 a 20.

Péptido de Histona H3 : Los ensayos revelaron la respuesta de señal específica para curvas de diluciones de estándar de péptido de Histona H3. El ensayo en blanco mostró cero respuestas. Las señales del lisado aumentado con Histona H3 seguido por las señales de la curva estándar en regulador de H a intensidades compensadas comparables, pero ligeramente inferiores (después de la sustracción del nivel de señal de Histona H3 endógena del lisado puro) . Las reproducibilidades de los dos ensayos fueron muy buenas. La concentración endógena de la proteína de Histona H3 en el lisado puro se determinó por retro-cálculo de las señales en blanco del lisado de las adaptaciones de curva. La concentración media fue de 0.063 ± 0.005 nM. Otros puntos de lisado mostraron señales marginalmente inferiores (Figura 13 y 14) . Se obtuvo una buena calidad de las curvas adaptadas con coeficientes de correlación de r2 > 0.99 Ensayo pRB: Los ensayos revelaron la respuesta de señal específica para curvas de dilución en el estándar de péptido pRb. El ensayo en blanco mostró cero respuestas. Las señales del lisado aumentado con pRb seguido por las señales de la curva estándar en regulador de pH a intensidades compensadas comparables pero ligeramente inferiores (después de la sustracción del nivel de señal pRb endógeno del lisado puro) . La concentración endógena de la proteína pRb en el lisado puro se determinó mediante el retro-cálculo de las señales en blanco del lisado de las adaptaciones de la curva estándar. La concentración media de la proteína endógena fue de 0.066 ± 0.010 nM. Otros puntos que contienen el lisado 6 (negativo para Histona H3) y el lisado 13 (negativo para pErkl/2) mostraron señales constantes a diferente intensidad que obviamente representan sus niveles endógenos de la proteína pRb en estos lisados. Se obtuvo una buena calidad de las curvas adaptadas con . coeficientes de correlación de r2 > 0.99 (Figuras 15 y 16) Ensayo pERKl/2 (CST #9101) : Los ensayos revelaron la respuesta de señal específica para curvas de dilución del estándar de péptido pErkl/2. El ensayo en blanco mostró cero respuestas. Las señales del lisado aumentado con pErkl/2 siguieron las señales de la curva estándar en regulador de pH a intensidades compensadas comparables pero ligeramente más altas (después de la sustracción del nivel de señal pErk endógeno del lisado puro) . Las reproducibilidades de los dos ensayos fueron muy buenas. La concentración endógena of pErkl/2 proteína en el lisado puro se determinó mediante el retro-cálculo de las señales en blanco del lisado de las adaptaciones de la curva estándar. La concentración media de la proteína endógena fue de 0.149 ± 0.005 nM. Otros puntos que contienen el lisado 6 (negativo para Histona H3) y lisado 12 (negativo para pRb) mostraron señales constantes a diferente intensidad que obviamente representan sus niveles endógenos of pErkl/2 proteína en estos lisados. Se obtuvo una buena calidad de las curvas adaptadas con coeficientes de correlación de r2 > 0.99 (Figuras 17A1-18 y 18) Ensayo pERKl/2 (BioSource 44-654G) : Los ensayos no revelaron respuesta de señal para las curvas de dilución de todos los estándar de péptidos aplicados, como se esperaba. El ensayo en blanco mostró cero respuestas. Todos los lisados conteniendo puntos mostraron señales constantes a diferente intensidad que obviamente representan sus niveles endógenos de proteína Erkl/2 en estos lisados.

Comentarios Generales Sobre el Efecto de Número Aumentado de Puntos por Duplicado: Para los 4 ensayos, los datos analizados se compararon para el efecto del número de puntos por duplicado en coeficientes de variaciones (CV) . Las señales medias de todas las señales específicas de analito se formaron para todos los números disponibles de señales de punto por duplicado (N=5 o N=10 por condición) y de N=2 señales de punto por duplicado (seleccionadas de las filas centrales de cada campo del arreglo) . En la mayor parte de los casos, los CV del análisis de puntos por duplicado fueron comparables o ligeramente menores que para el análisis de puntos por duplicado N=5 o N=10 (para mencionar que esto se observó a un nivel persistentemente bajo de los CV a todos los experimentos) .

Ejemplo 6: Comentarios Generales Ventajas de los estándares de reactivo de péptido: la composición de las moléculas (proporciones de péptido a ¦ proteína) pueden prepararse muy bien en una concentración en forma reproducible /número de secuencias de epítopo por molécula que podría determinarse bien mediante la introducción de una pequeña marca de absorbencia (Dabsilo) en cada secuencia de péptido. No se observaron efectos adversos en la etiqueta en los ensayos RPA el grado de fosforilación del estándar de péptidos sintéticos se determina bien y 100% Al contrario, el grado de fosforilación de las preparaciones comerciales de proteína recombinante es probablemente muy variable y no fácil de determinar (ver nuestros resultados con varias proteínas candidato de diferentes vendedores, para el caso de Erk/pErk) los conjugados de péptido-proteína que utilizan BSA como una proteína portadora uniforme (BSA es una molécula bien caracterizada para aplicaciones del arreglo de proteína) . Se espera que las respuestas de señal de diferentes estándares de péptido epítopo no se impacten en gran parte por las propiedades de la proteína portadora (la misma) .

Por el contrario, se midieron las diferencias prominentes en la respuesta de señal del ensayo de proteínas recombinantes de diferentes vendedores (por ejemplo, para el caso de Erk) , que podría ser también debido a las diferentes preparaciones y características proteicas (diferentes sistemas de expresión, etiqueta +GST, etiqueta ±His, etc.) Competencia - Las 4 formas libres de péptidos sintetizados obtuvieron la competencia completa de señales de estándar de péptido. Hubo una tendencia a que los fosfo-péptidos obtuvieran la competencia completa a concentraciones menores que pueden indicar afinidades superiores de los anticuerpos aplicados a fosfo-epítopos . No se observó un impacto mayor o efectos adversos del péptido competidor en la respuesta al ensayo o calidad del arreglo.

Por el contrario, las proteínas recombinantes utilizadas en los arreglos (parcialmente por factores mayores que las señales de punto específicas por ejemplo para el caso de proteínas de Histona H3) que hacen difícil el análisis del arreglo o aún imposible. Sin embargo, también las proteínas recombinantes parece que suprimen las señales de las curvas estándar originales. Sin embargo, las proteínas recombinantes podrían suprimir las señales de los lisados de control, pero aún generar señales adicionales en los puntos del lisado que podrían deberse a la unión no específica a otras proteínas en los lisados. Esto implica que los péptidos son claramente preferibles como reactivos competidores.

- En los puntos en el lisado, la competencia con los péptidos podría conducir a la supresión completa de las señales del lisado (por ejemplo para lisados de Histona H3) , pero también a la supresión parcial (no completa) dejando una señal basa aún a concentración más altas del competidor aplicado (por ejemplo para lisados pRb, pErk) que podría deberse a una cierta contribución de unión no específica de los anticuerpos aplicados. Por consiguiente el uso ensayos de competencia y normales en paralelo podría ser propuesto como un concepto universal para medir todos los futuros analitos de interés .

Calidad de las curvas estándar y ensayos Las curvas estándar generadas de series de dilución impresas en el RPA fueron generalmente de alta calidad que se manifiesta en bajos CV de señales de puntos por duplicado y buenas adaptaciones a los puntos de datos con coeficientes de correlación de r2 >0.99 en todos los casos. Las curvas estándar de reactivos de péptido mostraron la tendencia a correlaciones de adaptación mejor adaptadas (valores r2 inferiores) que las curvas estándar de proteínas recombinantes.

- Las señales CV de los puntos por duplicado (N=2) y de números de puntos por duplicado aumentados (N=5, N=10) fueron comparables indicando que las curvas estándar de puntos por duplicado impresos ya proveyeron buenos resultados.

- La reproducibilidad de ensayos por duplicado también fue muy buena como se manifiesta en bajos CV de señales estándar medias (arreglo-a-arreglo) , que estuvieron en el intervalo de unos cuantos a 10 por ciento. Las curvas estándar de reactivos de péptido mostraron la tendencia a CV inferiores (CV medio = 6%) que para proteínas recombinantes (CV medio = 9%) - Las intensidades de señal de las curvas estándar de 2 analitos de proteina total (Histona H3 y Erkl) coincidieron muy bien. Las curvas estándar de 2 analitos de proteina fosforilados (pRb y pErk) mostraron señales inferiores para las proteínas recombinantes , probablemente debido a un grado menor y menos definido de fosforilación.

Las figuras describen las imágenes del arreglo de los ensayos por duplicado y las gráficas de las curvas estándar proteicas en regulador de pH, las curves de los estándares de péptidos aumentados en el lisado respectivo y las curves combinadas de estándares de péptido en regulador de pH y aumentadas en el lisado después de la corrección de las concentraciones de proteína endógena de los lisados puros Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un reactivo de calibración caracterizado, porque comprende un péptido que se une a través de un enlazador a un portador de proteína caracterizado porque el péptido comprende un epítopo de interés.

2. El reactivo de calibración de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el epítopo de interés comprende por lo menos un aminoácido fosforilado.

3. El reactivo de calibración de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el péptido es de 12 a 25 aminoácidos de longitud.

4. El reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el portador de proteína es Albúmina de Suero de Bovino.

5. El reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el enlazador comprende Cisteína y ácido 8-amino-3,6-Dioxaoctanoico .

6. El reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la proporción del péptido :portador de proteína está entre 0.3 y 1.

7. Un método para generar una curva estándar, caracterizado porque comprende los pasos de: a) inmovilizar el reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, y d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés.

8. Un método para cuantificar la concentración de una proteína, caracterizado porque comprende el epítopo de interés en una muestra que comprende a) inmovilizar en un arreglo i) el reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en dos o más concentraciones, y ii) una o más muestras biológicas b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración y para cada una o más muestras biológicas, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y e) cuantificar la proteína que comprende el epítopo de interés en una o más muestras biológicas.

9. Un método para determinar el límite inferior de detección de un reactivo de afinidad de interés, caracterizado porque comprende: a) inmovilizar el reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y e) determinar la cantidad mínima del epítopo de interés que puede detectarse con el reactivo de afinidad.

10. Un método para determinar la sensibilidad del reactivo de afinidad de interés, caracterizado porque comprende : a) inmovilizar el reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y por lo tanto generar una curva estándar, e) determinar la parte lineal de la curva estándar y f) determinar el declive de la parte lineal de la curva estándar.

11. Un método para determinar el intervalo dinámico de un reactivo de afinidad de interés, caracterizado porque comprende : a) inmovilizar el reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en dos o más concentraciones en un arreglo, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, - .- c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado para cada una de las dos o más concentraciones del reactivo de calibración, d) correlacionar la intensidad de señal con la cantidad de epítopo de interés, y por lo tanto generar una curva estándar, e) determinar la parte lineal de la curva estándar y f) determinar el intervalo de concentración del reactivo de calibración de interés de la parte lineal de la curva estándar.

12. Un método para determinar la especificidad de un reactivo de afinidad de interés, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) inmovilizar en un arreglo i) el reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y ii) por lo menos una muestra que comprende un p ptido de control conjugado al portador de la proteína, en donde el péptido de control no comprende el epítopo de interés, b) incubar el arreglo con un reactivo de afinidad detectable de interés, c) medir la intensidad de señal del reactivo de afinidad enlazado en el arreglo, y d) comparar la intensidad de señal correlacionada con el epítopo de interés del reactivo de calibración con la intensidad de señal correlacionada con el péptido de control.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el reactivo de afinidad detectable de interés se incuba con un péptido epítopo libre de interés ante4s del paso a) y en donde en el paso b) el arreglo se incuba con la mezcla del reactivo de afinidad y el péptido libre .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el reactivo de calibración se inmoviliza en la presencia de proteínas de matriz.

15. El uso del reactivo de calibración de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para generar una curva estándar.