JPH0783924A - Ｎ−部分置換アミノグリカンを用いた免疫測定用標識試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】アミノグリカンに置換度が２０〜８０％になる
ように免疫物質と標識物質とを、直接的にまたはビオチ
ンとアビジンのように相互に反応特異性を有する複数の
化合物を介して、結合せしめたＮ−部分置換アミノグリ
カンの複合体よりなる免疫測定用標識試薬。 【効果】本発明で用いるＮ−部分置換アミノグリカン
は、アミノグリカンのアミノ基の置換度を２０〜８０％
に変換したものであり、水に対する溶解度が高く、高分
子量化したアミノグリカンの適用が可能となり、アミノ
グリカンの反応活性基の増加が可能となる。また、水に
対する溶解度が高くなることから、アミノグリカンの導
入数を増加させることにより反応活性基を増加させるこ
とも可能となった。これらにより免疫測定の感度向上が
達成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、置換度２０〜８０％の
Ｎ−部分置換アミノグリカンを用いた免疫測定用標識試
薬、特に高感度測定を可能とした免疫測定用標識試薬に
関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】本発明者
らは、免疫測定法の高感度化の手段として、１分子当た
り多数の反応活性基を有する化合物として、例えばキト
サン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン酸等のアミ
ノグリカンを用いて、これらに存在する反応活性基の大
部分を多数の標識物質で標識した化合物と免疫物質を結
合させ、免疫物質１分子当たりの標識物質量を増加させ
る方法を先に開発した（ＷＯ９０／１３０２９号公
報）。特に、反応活性基としてアミノ基を有するキトサ
ンは入手の容易な物質であることから、好適に用いられ
ている。しかし、この方法では例えば、キトサンを用い
た場合、その測定感度は１ｎｇ／ｍｌ程度であり、極め
て微量に存在する生理活性物質等の免疫測定には、必ず
しも充分とはいえないのが実情である。従って、さらな
る高感度化を図ることが要請されている。この方法とし
て、例えばさらに高分子量のキトサンを用いて反応活性
基の数を増加させる方法や免疫測定用標識試薬中でのキ
トサンの導入数を増加させて反応活性基を増加させる方
法等が考えられる。

【０００３】しかしながら、キトサン等のアミノグリカ
ンは容易に分子間水素結合を形成してアグリゲートとな
るため、水に対する溶解度が低く、特に高分子量化によ
り溶解度が低下すること、またアミノグリカンの導入数
を増加させると最終的な標識試薬が水に対して高い溶解
度を有するとはいい難いことなどの問題点を有してい
る。そのため、キトサン等のアミノグリカンの高分子量
化アミノグリカンの導入数の増加により高感度化を図る
としても、適用できるアミノグリカンの分子量、アミノ
グリカンの導入数に制限がある。従って、アミノグリカ
ンを用いた免疫測定の感度の向上にも限界があるのが実
情である。

【０００４】従って、本発明の目的は、キトサン等の高
分子量アミノグリカンを用いたり、またアミノグリカン
の導入数を増加させて反応活性基の数を増加させた場合
でも、水に対して高い溶解度を保持させるために、アミ
ノ基の置換の程度が最終的に２０〜８０％になるように
調製したアミノグリカンを用いる、高感度測定の可能な
免疫測定用標識試薬を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は前記課題を
解決するために鋭意検討した。その結果、キトサン等の
アミノグリカンの置換度が２０〜８０％の場合に、特に
好ましくは４０〜６０％の場合に水溶性が高くなること
を利用し、置換度が２０〜８０％、好ましくは４０〜６
０％のＮ−部分置換アミノグリカンを免疫測定用標識試
薬として使用することにより前記の課題を解決できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明の要旨は、（１） アミノグ
リカンに置換度が２０〜８０％になるように免疫物質と
標識物質とを結合せしめたＮ−部分置換アミノグリカン
の複合体よりなる免疫測定用標識試薬、（２） アミノ
グリカンに置換度が２０〜８０％になるように免疫物
質、および反応特異性を有する複数の化合物を介して標
識物質とを結合せしめたＮ−部分置換アミノグリカンの
複合体よりなる免疫測定用標識試薬、（３） Ｎ−部分
置換アミノグリカンにおけるＮ−アセチル基含有量が置
換部分中の０〜５０％である前記（１）又は（２）記載
の免疫測定用標識試薬、（４） 反応特異性を有する化
合物がビオチンとアビジンであり、Ｎ−部分置換アミノ
グリカンの置換アミノ基にビオチンが結合しており、該
ビオチンには標識物質で標識されたアビジンが結合して
いる前記（２）記載の免疫測定用標識試薬、（５） ア
ミノグリカンに置換度が２０〜８０％になるように免疫
物質と反応特異性を有する一方の化合物とを結合せしめ
たＮ−部分置換アミノグリカンの複合体と、該化合物と
の反応特異性を有する他方の化合物が標識物質で標識さ
れた複合体よりなる免疫測定用標識試薬、（６） 反応
特異性を有する化合物がビオチンとアビジンであり、Ｎ
−部分置換アミノグリカンの置換アミノ基にビオチンが
結合した複合体と、標識物質で標識されたアビジンより
なる前記（５）記載の免疫測定用標識試薬に関する。

【０００７】本明細書において、置換またはＮ置換と
は、アミノグリカンのアミノ基に免疫物質、標識物質ま
たはアセチル基等が結合していること、もしくはそれら
を結合させることをいう。置換度とはアミノグリカンの
全アミノ基のうち、免疫物質、標識物質あるいはアセチ
ル基等が結合しているアミノ基の割合をいう。Ｎ−部分
置換アミノグリカンとはＮ置換が部分的（２０〜８０
％、好ましくは４０〜６０％）であるアミノグリカンを
いう。また、置換アミノ基とは、例えばビオチン等が結
合した部位のアミノ基をいう。本発明に用いられる置換
度２０〜８０％のＮ−部分置換アミノグリカンは、アミ
ノグリカンとしてキトサン、ポリガラクトサミンおよび
ポリノイラミン酸よりなる群から選ばれる一種が用いら
れ、それらが有するアミノ基を置換もしくは脱アセチル
化して誘導したものである。本発明のＮ−部分置換アミ
ノグリカンは、Ｎ置換の程度を２０〜８０％、特に好ま
しくは４０〜６０％とすることにより、水に対する溶解
性が高まり、高分子量化したアミノグリカンであっても
充分な溶解性を示す。置換度が２０％未満では測定感度
が十分でなく、８０％を越えると溶解性に劣るため好ま
しくない。このようなＮ置換部分は、免疫物質と標識物
質で置換されていることが望ましいが、一部のアミノ基
は０〜１０％アセチル基で置換されていてもよい。この
ときアセチル基で置換されている割合は、置換部分中の
０〜５０％である。本発明においてアミノグリカンは、
特に限定されるものではないが、なかでもキトサンが好
適に使用される。

【０００８】本発明に用いられるＮ−部分置換アミノグ
リカンを調製するには、置換度１０％以下のアミノグリ
カンを原料とするのが好ましく、かかるものとしては、
例えば市販のキトサン（置換度は通常、５〜２５％）等
を用いることができる。また、置換度１００％のアミノ
グリカンを種々の公知の方法により調製して置換度１０
％以下にしたものを用いることもできる。例えば、ほぼ
１００％アセチル化されているキチンを原料として用い
るときは、これを４０〜４５％の飽和水酸化ナトリウム
水溶液中に浸漬し、ある程度膨潤したのち１００〜１２
０℃において３〜４時間加熱処理する。８０％以上脱ア
セチル化されると、キトサンの白色沈澱が生ずるので、
これを遠心分離により回収し、水に懸濁・遠心分離し水
により洗浄したのち、さらに一晩流水に対し透析して、
原料キトサンを得る。また、置換度が１０％を越えるキ
トサンを用いる場合も、同様に処理することにより１０
％以下の置換度のものを調製することができる。ポリ−
Ｎ−アセチルガラクトサミンやシアル酸から置換度１０
％以下の原料アミノグリカンを得る場合にも同様の方法
で行うことができる。

【０００９】本発明の免疫測定用標識試薬は、免疫物質
の結合したＮ−部分置換アミノグリカンに直接または間
接的に標識物質が結合された複合体よりなるものであ
る。即ち、免疫物質の結合したＮ−部分置換アミノグリ
カンの大部分（２０〜８０％、好ましくは４０〜６０
％）の反応活性基（アミノ基）に、直接的に標識物質が
結合しているもの、あるいは標識物質で修飾された化合
物が結合して間接的に標識物質が結合しているものであ
る。

【００１０】まず、アミノグリカンと標識物質を直接的
に結合させてＮ−部分置換アミノグリカン−標識物質の
結合体を調製するには、例えば縮合剤として１−エチル
−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド、ジ−ｐ−トレオイルカルボジイミド、１−シクロヘ
キシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミ
ド（ＣＨＭＣ）のような水溶性カルボジイミド、または
ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイミ
ド類や、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ブロモス
クシンイミド等の存在下でアミノグリカンと標識物質を
反応させることによって、アミノグリカンと標識物質の
結合したＮ−部分置換アミノグリカン−標識物質が調製
される。ここで標識物質としては、フルオレセイン、ロ
ーダミン類、クマリン系色素、シアニン系色素等の蛍光
色素類、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラ
ーゼ等の酵素類等、免疫測定において標識物質として通
常使用されるものが例示され、いずれでもよい。

【００１１】次に、Ｎ−部分置換アミノグリカン−標識
物質のＮ−部分置換アミノグリカン部分と免疫物質を結
合させるには、縮合剤として前記と同様のカルボジイミ
ド類、Ｎ−ブロモスクシンイミド類の存在下でＮ−部分
置換アミノグリカン−標識物質と免疫物質を反応させる
ことによって、免疫物質がＮ−部分置換アミノグリカン
−標識物質のＮ−部分置換アミノグリカン部分に結合し
た複合体（免疫物質−Ｎ−部分置換アミノグリカン−標
識物質）を調製することができる。この縮合反応は免疫
物質分子中のカルボキシル基とＮ−部分置換アミノグリ
カン分子中のアミノ基が縮合するものと考えられる。

【００１２】また、アミノグリカンに免疫物質、および
反応特異性を有する複数の化合物を介して標識物質が結
合したＮ−部分置換アミノグリカンの複合体よりなる免
疫測定用標識試薬を調製するには、アミノグリカンと標
識物質の間に特異的に結合する通常２種類の化合物（化
合物Ａおよび化合物Ｂ）を介在させる。即ち、アミノグ
リカンの反応活性基（アミノ基）には化合物Ｂが結合
し、該化合物Ｂには標識物質で修飾された化合物Ａが結
合した複合体となる（免疫物質−Ｎ−部分置換アミノグ
リカン−化合物Ｂ−化合物Ａ−標識物質）。このような
化合物Ａと化合物Ｂの組み合わせは、蛋白質と該蛋白質
と特異的に結合する化合物であることが望ましく、具体
的には、アビジンとビオチン、プロテインＡと抗体など
が好ましく、特にアビジンとビオチンの組み合わせが最
適である。即ち、例えば免疫物質の結合したＮ−部分置
換アミノグリカンのアミノ基にビオチンが結合してお
り、該ビオチンには標識物質で標識されたアビジンが結
合した複合体が好適な例として挙げられる。

【００１３】また、本発明の免疫測定用標識試薬は、ア
ミノグリカンに置換度が２０〜８０％になるように免疫
物質と反応特異性を有する一方の化合物とを結合せしめ
たＮ−部分置換アミノグリカンの複合体と、該化合物と
の反応特異性を有する他方の化合物が標識物質で標識さ
れた複合体よりなるものであってもよく、例えばアミノ
グリカンのアミノ基に免疫物質とビオチンが結合した複
合体と、標識物質で標識されたアビジンを組み合わせた
ものが好適な例として挙げられる。

【００１４】本発明において、前記のような化合物Ａお
よび化合物Ｂを介在させた複合体を用いて免疫測定用標
識試薬を調製するには、まず、化合物Ｂをアミノグリカ
ンの大部分の反応活性基と反応させて、Ｎ−部分置換ア
ミノグリカン−化合物Ｂ複合体（Ｎ−部分置換アミノグ
リカン−化合物Ｂ）とした後、免疫物質と反応させて複
合体（免疫物質−Ｎ−部分置換アミノグリカン−化合
物Ｂ）とし、一方化合物Ａを標識物質で標識し、複合体
とする。次いで、複合体と複合体を反応させて複
合体（免疫物質−Ｎ−部分置換アミノグリカン−化合
物Ｂ−化合物Ａ−標識物質）とする。このような方法に
より、本発明の免疫測定用標識試薬である複合体およ
び複合体の組み合わせ、あるいは複合体を調製す
る。本発明においては、このような反応順序が好まし
く、この順序を変えた場合、副反応がおき、収率が低下
する。

【００１５】以下に、Ｎ−部分置換アミノグリカンとし
てＮ−部分置換キトサン（以下、ｓ−キトサンと略す）
を、化合物Ａとしてアビジンを、化合物Ｂとしてビオチ
ンを、また標識物質として蛍光色素をそれぞれ用いた免
疫測定用標識試薬の調製例について、具体的に説明す
る。ｓ−キトサンは分子中に多数のアミノ基を有してお
り、ｓ−キトサンとビオチンを塩基性溶液中、水溶性カ
ルボジイミド（ＣＨＭＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドのような縮合剤の存在下で反応させると、大部分の
ｓ−キトサンのアミノ基にビオチンがアミド結合してビ
オチン化ｓ−キトサンが得られる。このビオチン化ｓ−
キトサンに免疫物質である蛋白質を上記と同様の縮合剤
を用いて反応させると、ｓ−キトサンの残余の遊離アミ
ノ基に蛋白質（免疫物質）が結合したビオチン化ｓ−キ
トサンが得られる。

【００１６】一方、蛍光色素で修飾したアビジンを、蛍
光色素として、例えばシアニン色素のカルボキシル基と
蛋白質であるアビジンのアミノ基とを上記と同様の方法
で反応させて得ることができる。即ち、シアニン色素の
カルボキシル基は、アビジンのアミノ基と有機溶媒中
で、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのような縮
合剤を用いて、常法により容易に縮合させてアミド結合
させることができる。シアニン色素とアビジンとの反応
終了後、未反応物はなるべく除去することが好ましく、
例えば透析法、遠心分離法、ゲル濾過法又は限外濾過法
などによって除くことができる。

【００１７】次に、上記の蛋白質（免疫物質）が結合し
たビオチン化ｓ−キトサンに上記の蛍光色素で修飾した
アビジンを反応させると、アビジンはビオチンと選択的
に非常に高い親和力を持って結合することにより、本発
明の免疫測定用標識試薬を得ることができる。

【００１８】次に、前記の調製例についてキトサンを例
にしてさらに具体的に説明する。まず、置換度１０％以
下の原料アミノグリカンを用いて置換度２０〜８０％の
Ｎ−部分置換アミノグリカンを得るには、所定の置換度
のアミノグリカンが得られるように原料アミノグリカン
の部分置換反応を行う。

【００１９】（１）ビオチンによるＮ−置換反応 置換度ほぼ０％のキトサン約２ｍｇを２ｍｌの０．０
２Ｎ−ＨＣｌに溶解する。 ビオチン５〜２０ｍｇを０．０８５Ｎ−Ｎａ₂ ＣＯ₃
水溶液０．５ｍｌに溶かし、上記のキトサン溶液に添加
する。キトサンは再び沈澱する。 １−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチ
ル）カルボジイミド（ＣＨＭＣ）２０ｍｇを添加し、４
℃に放置する。 白色沈澱が消えた時点で、氷酢酸を数滴加えて反応を
停止する。これによりキトサンのアミノ基の２０〜８０
％がビオチン化されたビオチン化キトサンが得られる。 蒸留水に対して透析し、さらに２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に対して透析する。

【００２０】置換度１０％程度のキトサンを原料化合物
とするときは、ビオチンの使用量を減らし、総置換度が
２０〜８０％になるように調節する。また、ビオチンの
代わりに蛍光色素等の標識物質を用いて、標識物質によ
るＮ−部分置換も同様にして行うことができる。

【００２１】（２）免疫物質（抗体または抗原蛋白質）
とキトサンとの結合反応 上記のようにして得られたビオチン化キトサンとほぼ
等モルの抗体（抗原）を含んだ水溶液を混合し、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボ
ジイミド（ＣＨＭＣ）を１０ｍｇ添加し、４℃において
５時間反応させる。 ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより、未反応抗
体（抗原）、ビオチン化キトサンおよびＣＨＭＣを除
き、抗体（抗原）の結合したＮ−部分ビオチン化キトサ
ンが得られる。

【００２２】なお、置換度の測定方法は、次の通りであ
る。 ｉ）Ｎ−置換体がＮ−部分置換アミノグリカン−ビオチ
ンの場合 例えば、分子量１００万のキトサンを用いると、該キト
サンには１分子当たりのグルコサミン単位が約６０００
個、即ちアミノ基を約６０００個を含むことになる。 ビオチン化後、ｘｇ／ｖｍｌのビオチン化キトサンが
得られたとする。その一部を元素分析にかけ、含まれる
硫黄がａ％、窒素がｂ％だったとすれば、キトサンのア
ミノ基がビオチン化された割合（ビオチン置換度）は、
式（１）により求められる。

【００２３】

【数１】

【００２４】（ただし、式中、０≦ｂ．ｓ．≦１００で
ある。）そこで、ビオチン化キトサンの分子量は、式
（２）から算出する。 Ｍ．Ｗ. _(b-c) ＝１，０００，０００＋２２６．３×６０００×ｂ．ｓ． （２）

【００２５】次に再び、サンプルの一部をとり、１％
ニンヒドリン溶液と１：１で混合し、２５分間煮沸反応
を行い、冷却後、５７０ｎｍの吸光度を測定する。検量
線からサンプル中の遊離のアミノ基量が計算できる。ニ
ンヒドリン法から、ｘｇ中の遊離のアミノ基量はｙｍｏ
ｌであったとすればキトサン１分子当たりの置換度
（Ｎ．ｓ．）は、式（３）により求められる。

【００２６】

【数２】

【００２７】また、キトサンのアセチル化度（Ａｃ．
ｓ．）は、式（４）で表される。 Ａｃ．ｓ．＝Ｎ．ｓ．−ｂ．ｓ． （４）

【００２８】なお、抗体の結合数はビオチンに比べてず
っと小さいので置換度にはほとんど寄与しない。従っ
て、本発明においては無視する。

【００２９】ii）Ｎ−置換体がＮ−部分置換アミノグリ
カン−標識物質（色素）の場合 色素結合キトサンがｘｇ／ｖｍｌ得られたとする。こ
のサンプルの一部をとって色素の吸光度を測定すると、
検量線からサンプル中の色素量ｗｇが算出できる。よっ
て、キトサン量は（ｘ−ｗ）ｇである。色素の分子量を
Ｌ，キトサンの分子量を１００万とするとキトサン１分
子当たりの色素結合数Ｎは、式（５）で表される。

【００３０】

【数３】

【００３１】次にサンプルを一部とり、１％ニンヒド
リン溶液と１：１で混合し、２５分間煮沸反応を行い、
冷却後５７０ｎｍの吸光度を測定する。検量線からサン
プル中の遊離のアミノ基が計算できる。ニンヒドリン法
からｘｇ中の遊離アミノ基がｙｍｏｌであったとすれ
ば、キトサン１分子に残っているアミノ基は、ｙ×１，
０００，０００／（ｘ−ｗ）で表されるから、このとき
のキトサン１分子当たりの置換度Ｎ．ｓ．は、式（６）
により、またこのときのキトサンのアセチル化度Ａｃ．
ｓ．は、式（７）により、それぞれ表される。

【００３２】

【数４】

【００３３】

【数５】

【００３４】通常のキトサンは反応活性基としてアミノ
基を複数個有する分子量１０⁴ 〜７×１０⁵ 程度の化合
物であり、１分子当たりのアミノ基の数は５０〜３５０
０個であるため、仮に置換度が５０％の場合、アミノ基
の置換数は２５〜１７００個程度である。しかし、本発
明におけるように、例えば、１０⁶ 〜２×１０⁶ 程度の
高分子量のキトサンを使用すれば、１分子当たりのアミ
ノ基の数は５０００〜１００００個となるため、アミノ
基の置換数は、２５００〜５０００個とすることができ
る。従って、Ｎ−部分置換した高分子量のキトサンを用
いることにより、免疫測定の感度は１．５〜３倍上昇す
る。

【００３５】また、高感度化を図る方法として、キトサ
ンの導入部位を増加させる方法が挙げられる。例えば、
免疫物質と結合したｓ−キトサンに間接的に標識物質を
結合させる場合、アビジンと標識物質の間にさらにｓ−
キトサンを介してもよい。即ち、免疫物質−ｓ−キトサ
ン−ビオチン−アビジン−ｓ−キトサン−標識物質であ
ってもよい。アビジンとｓ−キトサンとの結合は、前記
と同様の縮合剤の存在下で反応させることにより容易に
行うことができる。このようにすることにより免疫測定
の感度を約１００倍程度高めた免疫測定用標識試薬を調
製することができる。このような本発明の免疫測定用標
識試薬は、蛍光免疫測定、酵素免疫測定等の公知の免疫
測定方法において使用できる。

【００３６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。

【００３７】実施例１ （１）６５ｍｌの水に３５ｇの水酸化ナトリウムを溶か
し、この水溶液に分子量約２×１０⁶ のキチン（一丸フ
ァルコス社製）０．５ｇを加え、一晩撹拌した。 （２）キチンは、膨潤した状態になっているので、その
まま１００℃，４時間加熱処理により脱アセチル化を行
った。 （３）生じた沈澱を遠心回収し、水に懸濁後、流水にて
一晩透析した。またこのとき一部を希酢酸に溶解し、粘
度法にて分子量を測定したところ、約１０⁶ であった。 （４）透析後、白色沈澱（キトサン）を遠心回収し、そ
こから２０ｍｇをとり、２０ｍｌの０．０２Ｎ−ＨＣｌ
に溶解した。

【００３８】（５）０．０８５Ｎ−Ｎａ₂ ＣＯ₃ 水溶液
５ｍｌにビオチン０．１ｇを溶かし、上記キトサン溶液
に加えた。しばらく撹拌していると、キトサンの白色沈
澱が再び生じるので、ここへ１−シクロヘキシル−３−
（２−モルフォリノエチル）カルボジイミド（ＣＨＭ
Ｃ）０．２ｇを加えて、４℃で撹拌しながら放置した。

【００３９】（６）白色沈澱が消えた時点で、氷酢酸を
約２００μｌ加え、反応を停止し、蒸留水に対して透析
し、さらに２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に対して透
析することによって、ビオチン化キトサン（ｂ−ｃ）溶
液を得た。

【００４０】（７）前記（６）で得られたｂ−ｃ溶液か
ら一部をとり、元素分析を行ったところ、Ｓ＝５．３
％，Ｎ＝１０．１％であった。従って、式（１）より
ｂ．ｓ．は、４２％であった。また、ｂ−ｃの分子量は
式（２）より１．５７×１０⁶ であった。また、前記
（６）で得られたｂ−ｃ溶液から一部をとり、ニンヒド
リン法によって遊離のアミノ基量を測定したところ、ｂ
−ｃ２ｍｇ中には４．１μｍｏｌのアミノ基が存在して
いた。従って、式（３）より（６）で得られたｂ−ｃの
置換度は４６％であった。また、このときのアセチル化
度は４％であった。

【００４１】（８）ｂ−ｃとほぼ等モルのヤギ由来抗ヒ
トＩｇ抗体を含んだ水溶液と混合し、１−シクロヘキシ
ル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイミド
（ＣＨＭＣ）１０ｍｇを加え、４℃で５時間反応させ
た。 （９）ゲル濾過によって未反応抗体，ｂ−ｃ，及びＣＨ
ＭＣを除去し、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体の結合したｂ−
ｃ（Ａｂ−ｂ−ｃ）を得た。

【００４２】（１０）アビジン１ｍｇ及びトリエチルア
ミン０．２ｍｌを１ｍｌのエタノールに溶解させた。次
いで、蛍光色素として２ｍｇのシアニン系色素ＮＫ１１
６０（日本感光色素研究所製）を加えて充分に溶解さ
せ、溶液を作成した。さらに前記溶液にジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）１４ｍｇを加えて、室温で
４時間反応させた。反応終了後、エバポレータでエタノ
ールとトリエチルアミンを減圧除去した。残留物を、
０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝６．５）２ｍｌに懸濁し
た後、遠心分離機を用いて５０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離を行って、上澄みを採取し、再度遠心分離にかけ
てＮＫ１１６０で修飾されたアビジンの溶液を得た。 （１１）前記（９）で得られたＡｂ−ｂ−ｃと前記（１
０）で得られたＮＫ１１６０で修飾されたアビジンを混
合し、Ａｂ−ｂ−ｃ−ａ−ＮＫ１１６０を得た。

【００４３】（１２）ポリメタクリル酸メチル製の樹脂
製光ファイバー（三菱レイヨン（株）製）を３ｃｍに切
り、両端面をエタノールを潤滑剤としてポリシングフィ
ルムで研磨した。 （１３）０．５ｍｌの水に１０ｍｇの硫酸ニッケルを溶
かし、次いで２．５ｍｌのエタノールを加えた。この際
に生じる沈澱を遠心分離にて除去し、採取した上澄みを
ニッケル−エタノール溶液とした。次にエタノール溶媒
の２０ｍＭ水酸化カリウム溶液０．４ｍｌにニッケル−
エタノール溶液０．１ｍｌと５０％グルタルアルデヒド
５０μｌを添加し混合して、処理溶液とした。

【００４４】（１４）前記（１２）の光ファイバーの片
面を前記（１３）の処理溶液中に、５０℃で１０分間浸
漬した後、２０ｍＭ塩酸、次にＰＢＳで洗浄した。次に
この光ファイバーを２ｍｇ／ｍｌのヒト膵アミラーゼ溶
液に浸漬し、４℃で一晩放置した。 （１５）光ファイバーを溶液から取り出し、１％水素化
ホウ素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳ
で洗浄して、ヒト膵アミラーゼ固定化センサーとし、こ
れを検出部とした。

【００４５】（１６）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体
溶液の中に、前記（１５）の検出部を２０分間浸漬し、
前記（１１）で調製したＡｂ−ｂ−ｃ−ａ−ＮＫ１１６
０の溶液中に２０分間浸漬した。次いで、０．０５％ト
ゥイーン２０含有ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ）で洗浄
後、１個のレーザを使用する蛍光測定系である図１に示
す装置を用いて、ヘリウム−ネオンレーザ系で測定した
ところ、０．３ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００４６】実施例２ （１）実施例１の（１）〜（４）と同様の方法でキトサ
ン溶液を調製し、ここへメタノール０．８ｍｌとトリエ
チルアミン０．２ｍｌに５ｍｇのＮＫ１１６０を溶解し
た液を添加し、キトサンの沈澱が再び生じたら、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボ
ジイミド（ＣＨＭＣ）０．２ｇを加え、４℃に放置し
た。

【００４７】（２）白色沈澱が消えた時点で、ただちに
蒸留水に対して透析することによってＮＫ１１６０−キ
トサン（ｆ−ｃ）溶液（３３ｍｇ／２６ｍｌ）を得た。 （３）前記（２）で得たｆ−ｃ溶液を３０ｍｌにフィル
アップし、ＮＫ１１６０量を吸光度から測定したとこ
ろ、ｆ−ｃ溶液中には１３．１ｍｇ／３０ｍｌのＮＫ１
１６０が存在していた。従って、式（５）より、キトサ
ン１分子当たりの色素結合数Ｎは、約１３７０であっ
た。

【００４８】（４）次に、前記（２）で得られたｆ−ｃ
から一部をとり、ニンヒドリン法でアミノ基を測定した
ところ、２ｍｇ中のｆ−ｃには５．５２μｍｏｌのアミ
ノ基が存在していた。従って、式（６）よりｆ−ｃの置
換度は２４％であった。またこのときのアセチル化度は
１．３％であった。

【００４９】（５）実施例１の（８）〜（９）と同様の
方法でヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体の結合したＮＫ１１６０
−キトサン（Ａｂ−ｃ−ＮＫ１１６０）を得た。 （６）実施例１の（１２）から（１５）と同様の方法
で、ヒト膵アミラーゼ固定化センサーとし、これを検出
部とした。 （７）Ａｂ−ｂ−ｃ−ａ−ＮＫ１１６０の代わりにＡｂ
−ｃ−ＮＫ１１６０を用いた以外は、実施例１の（１
６）と同様の方法でヒト膵アミラーゼ抗体を測定したと
ころ、０．３ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００５０】実施例３ （１）実施例１の（１）〜（９）と同様の方法でヤギ由
来抗ヒトＩｇ抗体の結合したｂ−ｃ（Ａｂ−ｂ−ｃ）を
得た。 （２）大過剰の２．５ｍｇのシアニン系色素ＮＫ３６８
２（日本感光色素研究所製）を０．０１Ｍトリエチルア
ミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに懸濁した（実
際に溶けている量は３６０μｇ／１０ｍｌである）。 （３）アビジン１ｍｇを５００μｌの水に溶かして、前
記（１）の懸濁液に加え、撹拌し、さらにＮ−シクロヘ
キシル−Ｎ’−（２−モルフォリノエチル）カルボジイ
ミド メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＨＭＣ）
０．１ｇを加えて一晩放置した。 （４）前記（２）の溶液を限外濾過を用いて、エタノー
ルで３〜４回洗浄して未反応色素を除去した。 （５）得た沈澱をｐＨ８．０に調整したＫＯＨ溶液に懸
濁し、「ＮＫ３６８２修飾アビジン液」（以下、Ｆ₁ ア
ビジンと略す）とした。

【００５１】（６）前記（５）で得られたＦ₁ アビジン
を、前記（１）で得られたＡｂ−ｂ−ｃと混合し、Ａｂ
−ｂ−ｃ−ａ−Ｆ₁ を得た。 （７）ヘリウム−ネオンレーザの代わりに７８０ｎｍ半
導体レーザ（３０ｍＷ）を用いた以外は、実施例１の
（１４）〜（１６）と同様の方法で測定したところ、
０．３ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００５２】実施例４ 実施例２においてＮＫ１１６０の代わりに、ＮＫ３６８
２を用いる以外はすべて同様の方法で行ったところ、ヒ
ト膵アミラーゼ抗体を０．３ｎｇ／ｍｌまで測定でき
た。

【００５３】比較例１ （１）実施例１（６）において、白色沈澱が消え始めた
時点で反応を停止した以外は、同様の方法で行ったとこ
ろ、置換度１３％のｂ−ｃを得た。 （２）以後、実施例１の（８）〜（１６）と同様の方法
でヒト膵アミラーゼ抗体を測定したところ、Ａｂ−ｂ−
ｃ−ａ−ＮＫ１１６０は一部不溶化してしまい、８０μ
ｇ／ｍｌまでしか測定できなかった。

【００５４】比較例２ （１）実施例１の（６）において白色沈澱が消えてから
さらに１０時間反応を続けた以外は同様の方法で行った
ところ、再びｂ−ｃの白色沈澱が生じてきた。そのとき
の置換度は８９％であった。このｂ−ｃは再び水に溶け
なかったので使用不能となった。

【００５５】

【発明の効果】本発明で用いるＮ−部分置換アミノグリ
カンは、アミノグリカンのアミノ基の置換度を２０〜８
０％に変換したものであり、水に対する溶解度が高く、
高分子量化したアミノグリカンの適用が可能となり、ア
ミノグリカンの反応活性基の増加が可能となる。また、
水に対する溶解度が高くなることから、アミノグリカン
の導入数を増加させることにより反応活性基を増加させ
ることも可能となった。これらにより免疫測定の感度向
上が達成される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は１個のレーザを使用する蛍光測定系の概
略図である。

【符号の説明】 １ 光ファイバー ２ レーザ ３ 光軸合わせのためのガイドレール ４ 検出部 ５ フィルター ６ 蛍光検出器 ７ ハーフミラー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢野 秀樹 岐阜県揖斐郡揖斐川町北方１−１ イビデ ン株式会社内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノグリカンに置換度が２０〜８０％
   になるように免疫物質と標識物質とを結合せしめたＮ−
   部分置換アミノグリカンの複合体よりなる免疫測定用標
   識試薬。
2. 【請求項２】 アミノグリカンに置換度が２０〜８０％
   になるように免疫物質、および反応特異性を有する複数
   の化合物を介して標識物質とを結合せしめたＮ−部分置
   換アミノグリカンの複合体よりなる免疫測定用標識試
   薬。
3. 【請求項３】 Ｎ−部分置換アミノグリカンにおけるＮ
   −アセチル基含有量が置換部分中の０〜５０％である請
   求項１又は２記載の免疫測定用標識試薬。
4. 【請求項４】 反応特異性を有する化合物がビオチンと
   アビジンであり、Ｎ−部分置換アミノグリカンの置換ア
   ミノ基にビオチンが結合しており、該ビオチンには標識
   物質で標識されたアビジンが結合している請求項２記載
   の免疫測定用標識試薬。
5. 【請求項５】 アミノグリカンに置換度が２０〜８０％
   になるように免疫物質と反応特異性を有する一方の化合
   物とを結合せしめたＮ−部分置換アミノグリカンの複合
   体と、該化合物との反応特異性を有する他方の化合物が
   標識物質で標識された複合体よりなる免疫測定用標識試
   薬。
6. 【請求項６】 反応特異性を有する化合物がビオチンと
   アビジンであり、Ｎ−部分置換アミノグリカンの置換ア
   ミノ基にビオチンが結合した複合体と、標識物質で標識
   されたアビジンよりなる請求項５記載の免疫測定用標識
   試薬。