JPH06109731A - スルホン酸エステル化アミノグリカンを用いた免疫測定用標識試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】免疫物質の結合したスルホン酸エステル化アミ
ノグリカンに標識物質が結合した複合体よりなる免疫測
定用標識試薬、免疫物質の結合したスルホン酸エステル
化アミノグリカンに反応特異性を有する複数の化合物を
介して標識物質が結合した複合体よりなる免疫測定用標
識試薬、及び免疫物質と結合したスルホン酸エステル化
アミノグリカンに反応特異性を有する一方の化合物が結
合した複合体と、該化合物との反応特異性を有する他方
の化合物が標識物質で標識された複合体よりなる免疫測
定用標識試薬。 【効果】本発明のスルホン酸エステル化アミノグリカン
は、水に対する溶解度が高く、高分子アミノグリカンの
適用が可能となり、アミノグリカンの反応活性基の増加
が可能となる。また、アミノグリカンの導入数の増加に
より反応活性基を増加させることも可能となった。これ
らにより免疫測定の感度向上が達成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、スルホン酸エステル化
アミノグリカンを用いた免疫測定用標識試薬、特に標識
物質の増感を可能とした免疫測定用標識試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】本発明者
らは、免疫測定法の高感度化の手段として、１分子当た
り多数の反応活性基を有する化合物として、例えばキト
サン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン酸等のアミ
ノグリカンを用いて、これらに存在する反応活性基の大
部分を多数の標識物質で標識した化合物と免疫物質を結
合させ、免疫物質１分子当たりの標識物質量を増加させ
る方法を先に開発した（ＷＯ９０／１３０２９号公
報）。特に、反応活性基としてアミノ基を有するキトサ
ンは入手の容易な物質であることから、好適に用いられ
ている。しかし、この方法では例えば、キトサンを用い
た場合、その測定感度は１ｎｇ／ｍｌ程度であり、極め
て微量に存在する生理活性物質等の免疫測定には、必ず
しも充分とはいえないのが実情である。従って、さらな
る高感度化を図ることが要請されている。この方法とし
て、例えばさらに高分子のキトサンを用いて反応活性基
の数を増加させる方法や免疫測定用標識試薬中でのキト
サンの導入数を増加させて反応活性基を増加させる方法
等が考えられる。

【０００３】しかしながら、キトサン等のアミノグリカ
ンは水に対する溶解度が低く、特に高分子量化により溶
解度が低下すること、またアミノグリカンの導入数を増
加させると最終的な標識試薬が水に対して高い溶解度を
有するとはいいがたいことなどの問題点を有している。
そのため、キトサン等のアミノグリカンの高分子化やア
ミノグリカンの導入数の増加により高感度化を図るとし
ても、適用できるアミノグリカンの分子量、アミノグリ
カンの導入数に制限がある。従って、アミノグリカンを
用いた免疫測定の感度の向上にも限界があるのが実情で
ある。

【０００４】従って、本発明の目的は、キトサン等の高
分子量のアミノグリカンを用いたり、またアミノグリカ
ンの導入数を増加させて反応活性基の数を増加させた場
合でも、親水性官能基を導入したアミノグリカンを用い
ることにより、水に対して高い溶解度を保持するため高
感度の免疫測定が可能な免疫測定用標識試薬を提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は前記課題を
解決するために鋭意検討した。その結果、キトサン等の
アミノグリカンのヒドロキシル基をきわめて親水性の高
いスルホン酸エステルに誘導することにより、水に対す
る溶解度を高くすることが可能となり、得られたスルホ
ン酸エステル化アミノグリカンを免疫測定用標識試薬に
適用することにより前記の課題を解決できることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明の要旨は、免疫物質の結合し
たスルホン酸エステル化アミノグリカンに直接または間
接的に標識物質が結合した複合体よりなる免疫測定用標
識試薬に関する。

【０００７】本発明に用いられるスルホン酸エステル化
アミノグリカンは、アミノグリカンとしてキトサン、ポ
リガラクトサミンおよびポリノイラミン酸よりなる群か
ら選ばれる一種が用いられ、それらが有するヒドロキシ
ル基をスルホン酸エステルに誘導したものである。本発
明のスルホン酸エステル化アミノグリカンは、スルホン
基の導入により水に対する溶解性が高まり、高分子量化
したアミノグリカンであっても充分な溶解性を示す。本
発明においてアミノグリカンは、特に限定されるもので
はないが、なかでもキトサンが好適に使用される。用い
られるキトサンの分子量は、通常１０⁴ 〜１０⁵ 程度で
あるが、本発明においては、高分子キトサンを用いて反
応活性基の数を増加させることを目的とする点から、通
常１０⁴〜１０⁷ 、好ましくは１０⁵ 〜１０⁶ 程度のも
のが使用される。アミノグリカンとしてキトサンを用い
たスルホン酸エステル化キトサンの構造は、一級ヒドロ
キシル基のみにスルホン基が導入されたもの（式
（１））あるいは一級ヒドロキシル基および二級ヒドロ
キシル基の両方に導入されたもの（式（２））が推定さ
れる。スルホン基の導入量は、グルコサミン単位当たり
のスルホン酸の平均導入数として定義される。スルホン
基の導入量は０．１〜３個であり、好ましくは０．１〜
２個である。

【０００８】

【化１】

【０００９】

【化２】

【００１０】本発明で用いるスルホン酸エステル化アミ
ノグリカンは、種々の公知の方法により調製することが
できる。例えば、下記の方法ａ〜方法ｃが挙げられる。 方法ａ：希硫酸水溶液中においてアミノグリカンを処理
する方法、 方法ｂ：塩化リチウム含有ジアルキルアセトアミド溶液
中においてアミノグリカンをピリジン−三酸化硫黄錯体
で処理してスルホン基を導入した後、希鉱酸で処理する
方法、 方法ｃ：ジメチルフオルムアミド（ＤＭＦ）中において
アミノグリカンをＤＭＦ−三酸化硫黄錯体で処理してス
ルホン基を導入した後、希鉱酸で処理する方法。

【００１１】具体的には、方法ａでは、アミノグリカン
と０．０１〜１規定、好ましくは０．０５〜０．１規定
の硫酸とを２０〜１００℃、好ましくは６０〜８０℃の
温度条件下で反応させることによりヒドロキシメチル基
にスルホン基を導入することができる。１規定より濃い
硫酸を用いるとアミノグリカンの分解が起こり、０．０
１規定より薄い硫酸を用いた場合はスルホン基の導入量
が少なくなり効果が得られない。また、１００℃を越え
て加熱処理を行うとアミノグリカンの分解が起こり、２
０℃未満ではスルホン酸エステル化反応が進みにくい。
方法ａでは、キトサン等のアミノグリカンは酢酸水溶液
等の有機酸水溶液に溶解して、通常０．０５〜１０ｍｇ
／ｍｌ、好ましくは１〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いる。
アミノグリカンに対する硫酸の割合は、アミノグリカン
の分子量や濃度にもよるが、アミノグリカン１００ｇに
対しておよそ０．２５〜１００モル程度である。１００
モルを越えて用いるとアミノグリカンの分解が起こり、
０．２５モル未満ではスルホン基の導入量が少なくなり
効果が得られない。反応時間は、反応温度や反応濃度に
もよるが通常２〜４時間である。

【００１２】また、方法ｂでは、アミノグリカンを５％
塩化リチウムを含むＤＭＡ溶液に溶解し、この溶液にピ
リジン−三酸化硫黄錯体を溶解した溶液を加え、反応温
度を４０〜９０℃に維持しながら反応させることによ
り、一級ヒドロキシル基のみでなく二級ヒドロキシル基
にもスルホン基を導入することができる。このスルホン
酸エステル化反応は、酸化反応も起こり得るので、慎重
に反応温度を制御することを要する。９０℃を越えると
アミノグリカンの酸化および分解が起こり、４０℃未満
ではスルホン酸エステル化反応が進みにくい。方法ｂに
おいて、キトサン等のアミノグリカンを５％塩化リチウ
ムを含むＤＭＡ溶液に溶解する場合は、通常０．５〜１
０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３〜９ｍｇ／ｍｌの濃度で用
いる。また、アミノグリカンに対するＤＭＡ−三酸化硫
黄錯体の割合は、使用するアミノグリカンの分子量や濃
度にもよるが、アミノグリカン１００ｇに対しておよそ
０．５〜５モル程度である。５モルを越えて用いるとア
ミノグリカンの酸化および分解が起こり、０．５モル未
満ではスルホン基の導入量が少なくなり効果が得られな
い。反応時間は、反応温度や反応濃度にもよるが通常１
〜２４時間である。

【００１３】また、方法ｃでは、アミノグリカンをＤＭ
Ｆに溶解し、この溶液にＤＭＦ−三酸化硫黄錯体を添加
し、０〜４０℃に、好ましくは１０〜１５℃に温度を制
御しつつ反応させることにより、一級ヒドロキシル基の
みでなく二級ヒドロキシル基にもスルホン基を導入する
ことができる。このスルホン酸エステル化反応も発熱反
応であるので、慎重に反応温度を制御することを要す
る。４０℃を越えるとアミノグリカンの分解が起こり、
０℃未満ではスルホン酸エステル化反応が進みにくい。
方法ｃにおいて、キトサン等のアミノグリカンをＤＭＦ
に溶解する場合は、通常０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ま
しくは３〜９ｍｇ／ｍｌの濃度で用いる。また、アミノ
グリカンに対するＤＭＦ−三酸化硫黄錯体の割合は、使
用するアミノグリカンの分子量や濃度にもよるが、アミ
ノグリカン１００ｇに対しておよそ０．５〜５モル程度
である。５モルを越えて用いるとアミノグリカンの酸化
および分解が起こり、０．５モル未満ではスルホン基の
導入量が少なくなり効果が得られない。反応時間は、反
応温度や反応濃度にもよるが通常１〜２４時間である。

【００１４】このようにして得られるスルホン酸エステ
ル化アミノグリカンの反応液からの単離は、アルカリで
中和後、反応液をｐＨ１０に調整した水溶液に対して透
析し、生じた沈澱を遠心除去した後、エタノール等のア
ルコールの添加または直接反応液をエバポレーション等
で濃縮することにより、析出する沈澱物を濾取すること
によって行うことができる。

【００１５】なお、こうして得られた生成物の中には、
アミノ基も硫酸化されているものがある。このような場
合には、後の反応に遊離のアミノ基を必要とすることか
ら、この生成物を希塩酸等の希鉱酸に溶解し、加熱処理
することにより、Ｎ−スルホン基のみを脱離せしめ、遊
離のアミノ基を再生させることができる。

【００１６】本発明の免疫測定用標識試薬は、免疫物質
の結合したスルホン酸エステル化アミノグリカンに直接
または間接的に標識物質が結合された複合体よりなるも
のである。即ち、免疫物質の結合したスルホン酸エステ
ル化アミノグリカンの大部分の反応活性基（アミノ基）
に、直接的に標識物質が結合し、あるいは標識物質で修
飾された化合物が結合して、間接的に標識物質が結合し
ているものである。

【００１７】まず、スルホン酸エステル化アミノグリカ
ンと標識物質を直接的に結合させた本発明の免疫測定用
標識試薬を調製するには、例えば縮合剤として１−エチ
ル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド、ジ−ｐ−トレオイルカルボジイミド、１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボジイ
ミド（ＣＨＭＣ）のような水溶性カルボジイミド、また
はジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイ
ミド類や、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ブロモ
スクシンイミド等の存在下でスルホン酸エステル化アミ
ノグリカンと標識物質を反応させることによって、スル
ホン酸エステル化アミノグリカンと標識物質の結合体
（スルホン酸エステル化アミノグリカン−標識物質）が
製造される。ここで標識物質としては、フルオレセイ
ン、ローダミン類、クマリン系色素、シアニン系色素等
の蛍光色素類、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、エ
ステラーゼ等の酵素類等、免疫測定において標識物質と
して通常使用されるものが例示され、いずれでもよい。

【００１８】次に、スルホン酸エステル化アミノグリカ
ン−標識物質のスルホン酸エステル化アミノグリカン部
分と免疫物質を結合させるには、縮合剤として前記と同
様のカルボジイミド類、Ｎ−ブロモスクシンイミド類の
存在下でスルホン酸エステル化アミノグリカン−標識物
質と免疫物質を反応させることによって、免疫物質がス
ルホン酸エステル化アミノグリカン−標識物質のスルホ
ン酸エステル化アミノグリカン部分に結合した複合体
（免疫物質−スルホン酸エステル化アミノグリカン−標
識物質）を製造することができる。この縮合反応は免疫
物質分子中のカルボキシル基とスルホン酸エステル化ア
ミノグリカン分子中のアミノ基が縮合するものと考えら
れる。

【００１９】また、免疫物質の結合したスルホン酸エス
テル化アミノグリカンに反応特異性を有する複数の化合
物を介して標識物質が結合した複合体よりなる免疫測定
用標識試薬を調製するには、スルホン酸エステル化アミ
ノグリカンと標識物質の間に特異的に結合する通常２種
類の化合物（化合物Ａおよび化合物Ｂ）を介在させる。
即ち、免疫物質が結合した複数の反応活性基（アミノ
基）を有するスルホン酸エステル化アミノグリカンには
化合物Ｂが結合し、該化合物Ｂには標識物質で修飾され
た化合物Ａが結合した複合体となる（免疫物質−スルホ
ン酸エステル化アミノグリカン−化合物Ｂ−化合物Ａ−
標識物質）。このような化合物Ａと化合物Ｂの組み合わ
せは、蛋白質と該蛋白質と特異的に結合する化合物であ
ることが望ましく、具体的には、アビジンとビオチン、
プロテインＡと抗体、抗体とプロテインＡなどが好まし
く、特にアビジンとビオチンの組み合わせが最適であ
る。即ち、例えば免疫物質の結合したスルホン酸エステ
ル化アミノグリカンのアミノ基にビオチンが結合してお
り、該ビオチンには標識物質で標識されたアビジンが結
合した複合体が好適な例として挙げられる。

【００２０】また、本発明の免疫測定用標識試薬は、免
疫物質と結合したスルホン酸エステル化アミノグリカン
に反応特異性を有する一方の化合物が結合した複合体
と、標識物質で標識された該化合物と反応特異性を有す
る他方の化合物の複合体よりなるものであってもよく、
例えば免疫物質の結合したスルホン酸エステル化アミノ
グリカンのアミノ基にビオチンが結合した複合体と、標
識物質で標識されたアビジンを組み合わせたものが好適
な例として挙げられる。

【００２１】本発明において、前記のような化合物Ａお
よび化合物Ｂを介在させた複合体を用いて免疫測定用標
識試薬を調製するには、まず、化合物Ｂをスルホン酸エ
ステル化アミノグリカンの大部分の反応活性基と反応さ
せて、スルホン酸エステル化アミノグリカン−化合物Ｂ
複合体（スルホン酸エステル化アミノグリカン−化合物
Ｂ）とした後、免疫物質と反応させて複合体（免疫物
質−スルホン酸エステル化アミノグリカン−化合物Ｂ）
とし、一方化合物Ａを標識物質で標識し、複合体とす
る。次いで、複合体と複合体を反応させて複合体
（免疫物質−スルホン酸エステル化アミノグリカン−化
合物Ｂ−化合物Ａ−標識物質）とする。このような方法
により、本発明の免疫測定用標識試薬である複合体お
よび複合体の組み合わせ、あるいは複合体を製造す
る。本発明においては、このような反応順序が好まし
く、この順序を変えた場合、副反応が起こり、収率が低
下する。

【００２２】以下に、スルホン酸エステル化アミノグリ
カンとしてスルホン酸エステル化キトサン（以下、ｓ−
キトサンと略す）を、化合物Ａとしてアビジンを、化合
物Ｂとしてビオチンを、また標識物質として蛍光色素を
それぞれ用いた免疫測定用標識試薬の調製例について、
さらに具体的に説明する。ｓ−キトサンは分子中に多数
のアミノ基を有しており、ｓ−キトサンとビオチンを塩
基性溶液中、水溶性カルボジイミド（ＣＨＭＣ）、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドのような縮合剤の存在下で反
応させると、大部分のｓ−キトサンのアミノ基にビオチ
ンがアミド結合してビオチン化ｓ−キトサンが得られ
る。このビオチン化ｓ−キトサンに免疫物質である蛋白
質を上記と同様の縮合剤を用いて反応させると、ｓ−キ
トサンの残余の遊離アミノ基に蛋白質（免疫物質）が結
合したビオチン化ｓ−キトサンが得られる。

【００２３】一方、蛍光色素で修飾したアビジンを、蛍
光色素として、例えばシアニン色素のカルボキシル基と
蛋白質であるアビジンのアミノ基とを上記と同様の方法
で反応させて得ることができる。即ち、シアニン色素の
カルボキシル基は、アビジンのアミノ基と有機溶媒中
で、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのような縮
合剤を用いて、常法により容易に縮合させてアミド結合
させることができる。シアニン色素とアビジンとの反応
終了後、未反応物はなるべく除去することが好ましく、
例えば透析法、遠心分離法、ゲル濾過法又は限外濾過法
などによって除くことができる。次に、上記の蛋白質
（免疫物質）が結合したビオチン化ｓ−キトサンに上記
の蛍光色素で修飾したアビジンを反応させると、アビジ
ンはビオチンと選択的に非常に高い親和力を持って結合
することにより、本発明の免疫測定用標識試薬を得るこ
とができる。

【００２４】通常のキトサンは反応活性基としてアミノ
基を複数個有する分子量１０⁴ 〜７×１０⁵ 程度の化合
物であり、１分子当たりのアミノ基の数は５０〜３５０
０個であるが、本発明におけるように、例えば１０⁶ 〜
２×１０⁶ 程度の高分子量キトサンを使用することによ
り、１分子当たりのアミノ基の数を５０００〜１０００
０個にすることができる。従って、スルホン酸エステル
化した高分子量キトサンを用いることより、免疫測定の
感度が２〜３倍上昇する。また、高感度化を図る方法と
して、キトサンの導入部位を増加させる方法が挙げられ
る。例えば、免疫物質と結合したｓ−キトサンに間接的
に標識物質を結合させる場合、アビジンと標識物質の間
にさらにｓ−キトサンを介してもよい。即ち、免疫物質
−ｓ−キトサン−ビオチン−アビジン−ｓ−キトサン−
標識物質であってもよい。アビジンとｓ−キトサンとの
結合は、前記と同様の縮合剤の存在下で反応させること
により容易に行うことができる。このようにすることに
より免疫測定の感度を約１００倍程度高めた免疫測定用
標識試薬を調製することができる。このような本発明の
免疫測定用標識試薬は、蛍光免疫測定、酵素免疫測定等
の公知の免疫測定方法において使用できる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。 実施例１ ヒト膵アミラーゼ抗体の測定 （１）３ｍｇ／ｍｌの分子量約１０⁶ のキトサン５ｍｌ
と０．０７規定硫酸５ｍｌを混合し、７０℃、２時間熱
処理した。次いで、分画分子量１０⁵ の透析膜を用い
て、蒸留水に対して透析し、さらにｐＨ１０に調整した
炭酸ナトリウム水溶液で透析後、透析物中の沈殿を１５
００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で除去した。 （２）前記（１）で得られた上清を再び蒸留水で透析
し、得られた透析物をスルホン基を導入して硫酸エステ
ル化されたキトサン（ｓ−キトサン）の水溶液とした。
こうして得られたグルコサミン単位当たりのｓ−キトサ
ンのスルホン基導入数（ｄ．ｓ．）は元素分析値の結果
（Ｓ／Ｎ比：含有している窒素のモル数に対する硫黄の
モル数）から０．１と推定された。

【００２６】（３）トリエチルアミン０．２ｍｌとエタ
ノール１ｍｌを混合し、ここへシアニン色素の一種ＮＫ
１１６０（日本感光色素研究所製）を２ｍｇ溶解した。 （４）前記（２）で得られたｓ−キトサン水溶液１ｍｌ
に前記（３）のＮＫ１１６０の溶液を加え、さらに１−
エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド（ＷＳＣ）０．３ｍｌを添加し、暗所下、室温
で一晩反応させた。 （５）前記（４）の反応物をエタノールで２回洗浄し、
未反応ＮＫ１１６０、ＷＳＣを除去した後、沈殿中に残
ったエタノールをアスピレータで減圧除去した。 （６）前記（５）で得られた乾固物をリン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）２ｍｌに溶解し、さらにヤギ由来抗ヒト
Ｉｇ抗体１００μｇを加え、さらに水溶性カルボジイミ
ド（ＣＨＭＣ）１０ｍｇを添加して４℃、６時間反応さ
せた。反応終了後、陰イオン交換カラムを用いて未反応
物を除去し、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−ｓ−キトサン−
ＮＫ１１６０（ＡＳＣＤ）を得た。

【００２７】（７）ポリメタクリル酸メチル製の樹脂製
光ファイバー（三菱レイヨン（株）製）を３ｃｍに切
り、両端面をエタノールを潤滑剤としてポリシングフィ
ルムで研磨した。 （８）０．５ｍｌの水に１０ｍｇの硫酸ニッケルを溶か
し、次いで２．５ｍｌのエタノールを加えた。この際に
生じる沈殿を遠心分離にて除去し、採取した上清をニッ
ケル−エタノール溶液とした。次にエタノール溶媒の２
０ｍＭ水酸化カリウム溶液０．４ｍｌにニッケル−エタ
ノール溶液０．１ｍｌと５０％グルタルアルデヒド５０
μｌを添加し混合して、処理溶液とした。

【００２８】（９）前記（７）の光ファイバーの片面を
前記（８）の処理溶液中に、５０℃で１０分間浸漬した
後、２０ｍＭ塩酸、次にＰＢＳで洗浄した。次にこの光
ファイバーを２ｍｇ／ｍｌのヒト膵アミラーゼ溶液に浸
漬し、４℃で一晩放置した。 （１０）光ファイバーを溶液から取り出し、１％水素化
ホウ素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳ
で洗浄して、ヒト膵アミラーゼ固定化センサーとし、こ
れを検出部とした。 （１１）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体溶液の中に、
前記（１０）の検出部を２０分間浸漬し、前記（６）で
調製したヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−ｓ−キトサン−ＮＫ
１１６０の溶液中に２０分間浸漬した。次いで、０．０
５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ（Tween PBS)で洗浄後、
１個のレーザを使用する蛍光測定系である図１に示す装
置を用いて、ヘリウム−ネオンレーザ系で測定したとこ
ろ、３ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００２９】比較例１ （１）実施例１の（４）において、ｓ−キトサンの代わ
りに硫酸処理をしていないキトサンを用いた場合、ＮＫ
１１６０で修飾されたキトサンはＰＢＳに不溶性となり
使用不能となった。

【００３０】実施例２ ヒト膵アミラーゼ抗体の測定 （１）キトサンの代わりに分子量約１０⁶ のポリノイラ
ミン酸３ｍｇ／ｍｌを使用する以外は、実施例１の
（１）〜（２）と同様の方法で、スルホン基を導入して
硫酸エステル化されたポリノイラミン酸（ｓ−ポリノイ
ラミン酸）の水溶液を得た。こうして得られたｓ−ポリ
ノイラミン酸のｄ．ｓ．値は元素分析の結果から０．３
と推定された。 （２）前記（１）のｓ−ポリノイラミン酸にペルオキシ
ダーゼ２ｍｇを溶解し、さらに６０ｍｇのＣＨＭＣを加
えて４℃、５時間反応させた。反応終了後、陰イオン交
換カラムを用いて未反応物を除去し、さらにヤギ由来抗
ヒトＩｇ抗体１００μｇを加えＣＨＭＣ１０ｍｇを加え
て４℃、５時間反応させた。反応終了後、再び陰イオン
交換カラムを用いて精製し、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−
ｓ−ポリノイラミン酸−ペルオキシダーゼ（ＡＳＰＰ）
を得た。

【００３１】（３）ＥＩＡ用マイクロプレートウェルに
ヒト膵アミラーゼ溶液を注入し、ヒト膵アミラーゼを吸
着させた。 （４）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体溶液を前記
（３）のウェルに注入し、３０分間抗原抗体反応をさせ
た。 （５）前記（４）のウェルを Tween PBSで３回洗浄後、
前記（２）で得られたＡＳＰＰを加えて３０分間抗原抗
体反応をさせ、さらに Tween PBSで３回洗浄した。 （６）次に１ｍｇ／ｍｌのルミノール水溶液をウェルに
注入し、１５分間酵素反応をさせた。 （７）４２５ｎｍの発光量をフォトンカウンターで測定
したところ、０．３ｎｇ／ｍｌまでヒト膵アミラーゼ抗
体を検出できた。

【００３２】実施例３ ヒトカルシトニンの測定 （１）実施例１の（１）〜（２）と同様の方法でｓ−キ
トサン溶液を得た。 （２）１００μｌの水に４ｍｇの炭酸ナトリウムと１０
ｍｇのビオチンを溶かした。次いで、前記（１）で得ら
れたｓ−キトサン溶液２ｍｌと混合し、さらにＣＨＭＣ
を６０ｍｇ添加して、室温で２時間反応させた。反応
後、蒸留水に対して一晩透析した。透析後、回収された
透析物をビオチン化−ｓ−キトサン（ｂ−ｓ−ｃ）とし
た。

【００３３】（３）前記（２）のビオチン化−ｓ−キト
サン懸濁液にウサギ由来ヒトカルシトニン抗体１００μ
ｇを加え、さらに水溶性カルボジイミド１０ｍｇを添加
して、４℃、６時間反応させた。反応終了後、陰イオン
交換カラムを用いて未反応物を除去し、ウサギ由来ヒト
カルシトニン抗体が結合したビオチン化−ｓ−キトサン
を得た。 （４）アビジン１ｍｇおよびトリエチルアミン０．２ｍ
ｌを１ｍｌのエタノールに溶解させた。次いでＮＫ１１
６０を加えて充分に溶解させ、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド０．３ｍｌを加えて室温で一晩反応させた。 （５）遠心分離でアビジンを沈殿回収後、この沈殿をエ
タノールで２回洗浄し、遠心回収後、アスピレータで沈
殿中に残っているエタノールを減圧除去した。この残留
物を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、ＮＫ
１１６０で修飾されたアビジンを得た。 （６）ポリメタクリル酸メチル製の樹脂製光ファイバー
（三菱レイヨン（株）製）を３ｃｍに切り、両端面をエ
タノールを潤滑剤としてポリシングフィルムで研磨し
た。 （７）０．５ｍｌの水に１０ｍｇの硫酸ニッケルを溶か
し、次いで２．５ｍｌのエタノールを加えた。この際に
生じる沈殿を遠心分離にて除去し、採取した上清をニッ
ケル−エタノール溶液とした。次にエタノール溶媒の２
０ｍＭ水酸化カリウム溶液０．４ｍｌにニッケル−エタ
ノール溶液０．１ｍｌと５０％グルタルアルデヒド５０
μｌを添加し混合して、処理溶液とした。

【００３４】（８）前記（６）の光ファイバー片面を前
記（７）の処理溶液中に、５０℃で１０分間浸漬した
後、２０ｍＭ塩酸、次いでＰＢＳで洗浄した。次にこの
光ファイバーを２ｍｇ／ｍｌのヤギ由来ヒトカルシトニ
ン抗体溶液に浸漬し、４℃で一晩放置した。 （９）光ファイバーを溶液から取り出し、１％水素化ホ
ウ素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳで
洗浄して、ヤギ由来ヒトカルシトニン抗体固定化センサ
ーを作製し、これを検出部とした。 （１０）前記（３）のウサギ由来ヒトカルシトニン抗体
が結合したビオチン化−ｓ−キトサンと前記（５）のＮ
Ｋ１１６０で修飾されたアビジンを混合し、凍結乾燥し
て２週間、−２０℃に保存した。 （１１）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌに前記
（９）の検出部を浸漬し、室温で３０分間放置後、前記
（１０）の凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁した溶液に３０
分間浸漬した。 （１２）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸
カリウム水溶液で洗浄後、実施例１と同様にして図１に
示す装置を用いて測定したところ、０．３ｎｇ／ｍｌま
で測定できた。

【００３５】比較例２ （１）実施例３の（３）において、ｓ−キトサンの代わ
りに、未処理のキトサンを用いてウサギ由来ヒトカルシ
トニン抗体が結合したビオチン化キトサンを製造したと
き、キトサンは分子量が３×１０⁵ のものまでしか用い
ることができなかった。この場合、分子量が３×１０⁵
以上になると水に対して不溶性となるため使用不能とな
った。 （２）分子量３×１０⁵ の未処理キトサンを用いてウサ
ギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化キト
サンを製造し、それ以外は実施例３と同様の方法でヒト
カルシトニンを測定したことろ、１ｎｇ／ｍｌまでしか
測定できなかった。

【００３６】実施例４ （１）実施例１の（１）〜（５）と同様の方法でＮＫ１
１６０の結合したｓ−キトサン（Ｆ−ｓ−キトサン）を
得た。 （２）前記（１）で得られたＦ−ｓ−キトサンの乾固物
をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍｌに溶解し、さ
らにアビジン１００μｇを加え、さらに水溶性カルボジ
イミド（ＣＨＭＣ）１０ｍｇを添加して４℃、６時間反
応させた。反応終了後、陰イオン交換カラムを用いて未
反応物を除去し、アビジン−Ｆ−ｓ−キトサン（Ａ−Ｆ
−ｓ−キトサン）を得た。 （３）実施例３の（２）〜（３）と同様の方法でウサギ
由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化−ｓ−
キトサンを得た。 （４）実施例３の（６）〜（９）と同様の方法でヤギ由
来ヒトカルシトニン抗体固定化センサーを作成し、これ
を検出部とした。

【００３７】（５）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌ
に前記（４）の検出部を浸漬し、室温で３０分放置後、
前記（３）のビオチン化−ｓ−キトサン溶液に２０分浸
漬した。 （６）ＰＢＳで洗浄後、前記（２）のＡＦ−ｓ−キトサ
ン溶液に１０分浸漬した。 （７）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸カ
リウム水溶液で洗浄後、実施例１と同様にして図１に示
す装置で測定したところ、５ｐｇ／ｍｌまで測定でき
た。

【００３８】実施例５ （１）キトサンの代わりに分子量１０⁵ のポリガラクト
サミンを用いて実施例４と同様の方法でカルシトニンを
測定した。得られたｓ−ポリガラクトサミンのｄ．ｓ．
値は０．１と推定された。 （２）図１に示す装置で測定したところ３０ｐｇ／ｍｌ
まで測定できた。

【００３９】実施例６ （１）実施例１の（１）〜（２）と同様の方法でｓ−キ
トサン溶液を得た。 （２）実施例３の（２）〜（３）と同様の方法により、
ウサギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化
−ｓ−キトサンを、および実施例３の（４）〜（５）と
同様の方法により、ＮＫ１１６０で修飾されたアビジン
を得た。また、実施例３の（６）〜（９）と同様の方法
によりヤギ由来ヒトカルシトニン抗体固定化センサーを
作製し、これを検出部とした。 （３）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌに前記（２）
の検出部を浸漬し、室温で３０分間放置後、前記（２）
のウサギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン
化−ｓ−キトサン溶液にさらに３０分浸漬した。 （４）ＰＢＳで洗浄した後、前記（２）のＮＫ１１６０
で修飾されたアビジンに１０分間浸漬した。 （５）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸カ
リウム水溶液で洗浄後、実施例１と同様にして図１に示
す装置を用いて測定したところ、０．３ｎｇ／ｍｌまで
測定できた。

【００４０】実施例７ ヒト膵アミラーゼ抗体の測定 （１）分子量約２×１０⁶ のキトサン（フルカ社製）
１．０ｇを５％塩化リチウム含有ＤＭＡ１０００ｍｌに
添加し、一夜撹拌して溶解させた。得られた溶液に３倍
当量のピリジン−三酸化硫黄錯体を溶解した１００ｍｌ
のＤＭＡ溶液を加え、湯浴上で５０〜６０℃に加熱し、
撹拌しながら反応させた。反応の終点は、反応液を６Ｎ
−ＮａＯＨ水に滴下し、未反応キトサンによる白濁化
（不溶化）がみられなくなったときを指標とした。反応
液を中和したのち、ｐＨ１０とし、未反応キトサンを不
溶化し、遠心除去した。ついで、エバポレーションによ
り適量に濃縮し、水に対する透析により脱塩および脱Ｄ
ＭＡを行った。得られた透析物から再びエバポレーショ
ンにより水を除去することによって、スルホン基導入数
が３のスルホン酸エステルを取得した。 （２）得られたスルホン酸エステル化キトサンを適量の
０．０２Ｎ−塩酸に溶解し、５０℃において２時間加熱
処理した。反応液を中和した後ｐＨ１０とし、アミノ基
のみがスルホン化されていたキトサンを不溶化し、遠心
除去した。上清を透析脱塩し、エバポレーションによっ
て水を除去することにより、３位および６位がスルホン
化され、アミノ基が遊離の、スルホン酸エステル化キト
サン（ｓ−キトサン）を取得した。こうして得られたｓ
−キトサンのｄ．ｓ．値は、元素分析値（Ｓ／Ｎ比）の
結果から１．９と推定された。

【００４１】（３）トリエチルアミン０．２ｍｌとエタ
ノール１ｍｌを混合し、ここへシアニン色素の一種ＮＫ
１１６０（日本感光色素研究所製）を２ｍｇ溶解した。 （４）前記（２）で得られたｓ−キトサン水溶液１ｍｌ
に前記（３）のＮＫ１１６０の溶液を加え、さらに１−
エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド（ＷＳＣ）０．３ｍｌを添加し、暗所下、室温
で一晩反応させた。 （５）前記（４）の反応物をエタノールで２回洗浄し、
未反応ＮＫ１１６０、ＷＳＣを除去した後、沈殿中に残
ったエタノールをアスピレータで減圧除去した。 （６）前記（５）で得られた乾固物をリン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）２ｍｌに溶解し、さらにヤギ由来抗ヒト
Ｉｇ抗体１００μｇを加え、さらに水溶性カルボジイミ
ド（ＣＨＭＣ）１０ｍｇを添加して４℃、６時間反応さ
せた。反応終了後、陰イオン交換カラムを用いて未反応
物を除去し、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−ｓ−キトサン−
ＮＫ１１６０（ＡＳＣＤ）を得た。

【００４２】（７）ポリメタクリル酸メチル製の樹脂製
光ファイバー（三菱レイヨン（株）製）を３ｃｍに切
り、両端面をエタノールを潤滑剤としてポリシングフィ
ルムで研磨した。 （８）０．５ｍｌの水に１０ｍｇの硫酸ニッケルを溶か
し、次いで２．５ｍｌのエタノールを加えた。この際に
生じる沈殿を遠心分離にて除去し、採取した上清をニッ
ケル−エタノール溶液とした。次にエタノール溶媒の２
０ｍＭ水酸化カリウム溶液０．４ｍｌにニッケル−エタ
ノール溶液０．１ｍｌと５０％グルタルアルデヒド５０
μｌを添加し混合して、処理溶液とした。

【００４３】（９）前記（７）の光ファイバーの片面を
前記（８）の処理溶液中に、５０℃で１０分間浸漬した
後、２０ｍＭ塩酸、次にＰＢＳで洗浄した。次にこの光
ファイバーを２ｍｇ／ｍｌのヒト膵アミラーゼ溶液に浸
漬し、４℃で一晩放置した。 （１０）光ファイバーを溶液から取り出し、１％水素化
ホウ素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳ
で洗浄して、ヒト膵アミラーゼ固定化センサーとし、こ
れを検出部とした。 （１１）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体溶液の中に、
前記（１０）の検出部を２０分間浸漬し、前記（６）で
調製したヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−ｓ−キトサン−ＮＫ
１１６０の溶液中に２０分間浸漬した。次いで、０．０
５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ（Tween PBS)で洗浄後、
１個のレーザを使用する蛍光測定系である図１に示す装
置を用いて、ヘリウム−ネオンレーザ系で測定したとこ
ろ、３ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００４４】実施例８ ヒト膵アミラーゼ抗体の測定 （１）キトサンの代わりに分子量約１０⁶ のポリノイラ
ミン酸３ｍｇ／ｍｌを使用する以外は、実施例７の
（１）〜（２）と同様の方法で、スルホン基を導入して
硫酸エステル化されたポリノイラミン酸（ｓ−ポリノイ
ラミン酸）の水溶液を得た。得られたｓ−ポリノイラミ
ン酸のｄ．ｓ．値は１．８と推定された。 （２）前記（１）のｓ−ポリノイラミン酸にペルオキシ
ダーゼ２ｍｇを溶解し、さらに６０ｍｇのＣＨＭＣを加
えて４℃、５時間反応させた。反応終了後、陰イオン交
換カラムを用いて未反応物を除去し、さらにヤギ由来抗
ヒトＩｇ抗体１００μｇを加えＣＨＭＣ１０ｍｇを加え
て４℃、５時間反応させた。反応終了後、再び陰イオン
交換カラムを用いて精製し、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−
ｓ−ポリノイラミン酸−ペルオキシダーゼ（ＡＳＰＰ）
を得た。

【００４５】（３）ＥＩＡ用マイクロプレートウェルに
ヒト膵アミラーゼ溶液を注入し、ヒト膵アミラーゼを吸
着させた。 （４）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体溶液を前記
（３）のウェルに注入し、３０分間抗原抗体反応をさせ
た。 （５）前記（４）のウェルを Tween PBSで３回洗浄後、
前記（２）で得られたＡＳＰＰを加えて３０分間抗原抗
体反応をさせ、さらに Tween PBSで３回洗浄した。 （６）次に１ｍｇ／ｍｌのルミノール水溶液をウェルに
注入し、１５分間酵素反応をさせた。 （７）４２５ｎｍの発光量をフォトンカウンターで測定
したところ、０．３ｎｇ／ｍｌまでヒト膵アミラーゼ抗
体を検出できた。

【００４６】実施例９ ヒトカルシトニンの測定 （１）実施例７の（１）〜（２）と同様の方法でｓ−キ
トサン溶液を得た。 （２）１００μｌの水に４ｍｇの炭酸ナトリウムと１０
ｍｇのビオチンを溶かした。次いで、前記（１）で得ら
れたｓ−キトサン溶液２ｍｌと混合し、さらにＣＨＭＣ
を６０ｍｇ添加して、室温で２時間反応させた。反応
後、蒸留水に対して一晩透析した。透析後、回収された
透析物をビオチン化−ｓ−キトサン（ｂ−ｓ−ｃ）とし
た。

【００４７】（３）前記（２）のビオチン化−ｓ−キト
サン懸濁液にウサギ由来ヒトカルシトニン抗体１００μ
ｇを加え、さらに水溶性カルボジイミド１０ｍｇを添加
して、４℃、６時間反応させた。反応終了後、陰イオン
交換カラムを用いて未反応物を除去し、ウサギ由来ヒト
カルシトニン抗体が結合したビオチン化−ｓ−キトサン
を得た。 （４）アビジン１ｍｇおよびトリエチルアミン０．２ｍ
ｌを１ｍｌのエタノールに溶解させた。次いでＮＫ１１
６０を加えて充分に溶解させ、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド０．３ｍｌを加えて室温で一晩反応させた。 （５）遠心分離でアビジンを沈殿回収後、この沈殿をエ
タノールで２回洗浄し、遠心回収後、アスピレータで沈
殿中に残っているエタノールを減圧除去した。この残留
物を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、ＮＫ
１１６０で修飾されたアビジンを得た。 （６）ポリメタクリル酸メチル製の樹脂製光ファイバー
（三菱レイヨン（株）製）を３ｃｍに切り、両端面をエ
タノールを潤滑剤としてポリシングフィルムで研磨し
た。 （７）０．５ｍｌの水に１０ｍｇの硫酸ニッケルを溶か
し、次いで２．５ｍｌのエタノールを加えた。この際に
生じる沈殿を遠心分離にて除去し、採取した上清をニッ
ケル−エタノール溶液とした。次にエタノール溶媒の２
０ｍＭ水酸化カリウム溶液０．４ｍｌにニッケル−エタ
ノール溶液０．１ｍｌと５０％グルタルアルデヒド５０
μｌを添加し混合して、処理溶液とした。

【００４８】（８）前記（６）の光ファイバー片面を前
記（７）の処理溶液中に、５０℃で１０分間浸漬した
後、２０ｍＭ塩酸、次いでＰＢＳで洗浄した。次にこの
光ファイバーを２ｍｇ／ｍｌのヤギ由来ヒトカルシトニ
ン抗体溶液に浸漬し、４℃で一晩放置した。 （９）光ファイバーを溶液から取り出し、１％水素化ホ
ウ素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳで
洗浄して、ヤギ由来ヒトカルシトニン抗体固定化センサ
ーを作製し、これを検出部とした。 （１０）前記（３）のウサギ由来ヒトカルシトニン抗体
が結合したビオチン化−ｓ−キトサンと前記（５）のＮ
Ｋ１１６０で修飾されたアビジンを混合し、凍結乾燥し
て２週間、−２０℃に保存した。 （１１）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌに前記
（９）の検出部を浸漬し、室温で３０分間放置後、前記
（１０）の凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁した溶液に３０
分間浸漬した。 （１２）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸
カリウム水溶液で洗浄後、実施例１と同様にして図１に
示す装置を用いて測定したところ、０．３ｎｇ／ｍｌま
で測定できた。

【００４９】実施例１０ （１）実施例７の（１）〜（５）と同様の方法でＮＫ１
１６０の結合したｓ−キトサン（Ｆ−ｓ−キトサン）を
得た。 （２）前記（１）で得られたＦ−ｓ−キトサンの乾固物
をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍｌに溶解し、さ
らにアビジン１００μｇを加え、さらに水溶性カルボジ
イミド（ＣＨＭＣ）１０ｍｇを添加して４℃、６時間反
応させた。反応終了後、陰イオン交換カラムを用いて未
反応物を除去し、アビジン−Ｆ−ｓ−キトサン（Ａ−Ｆ
−ｓ−キトサン）を得た。 （３）実施例９の（２）〜（３）と同様の方法でウサギ
由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化−ｓ−
キトサンを得た。 （４）実施例９の（６）〜（９）と同様の方法でヤギ由
来ヒトカルシトニン抗体固定化センサーを作成し、これ
を検出部とした。

【００５０】（５）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌ
に前記（４）の検出部を浸漬し、室温で３０分放置後、
前記（３）のビオチン化−ｓ−キトサン溶液に２０分浸
漬した。 （６）ＰＢＳで洗浄後、前記（２）のＡＦ−ｓ−キトサ
ン溶液に１０分浸漬した。 （７）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸カ
リウム水溶液で洗浄後、実施例１と同様にして図１に示
す装置で測定したところ、５ｐｇ／ｍｌまで測定でき
た。

【００５１】実施例１１ （１）キトサンの代わりに分子量１０⁵ のポリガラクト
サミンを用いて実施例１０と同様の方法でカルシトニン
を測定した。得られたｓ−ポリガラクトサミンのｄ．
ｓ．値は、元素分析値（Ｓ／Ｎ比）の結果から１．９と
推定された。 （２）図１に示す装置で測定したところ３０ｐｇ／ｍｌ
まで測定できた。

【００５２】実施例１２ （１）実施例７の（１）〜（２）と同様の方法でｓ−キ
トサン溶液を得た。 （２）実施例９の（２）〜（３）と同様の方法により、
ウサギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化
−ｓ−キトサンを、および実施例９の（４）〜（５）と
同様の方法により、ＮＫ１１６０で修飾されたアビジン
を得た。また、実施例９の（６）〜（９）と同様の方法
によりヤギ由来ヒトカルシトニン抗体固定化センサーを
作製し、これを検出部とした。 （３）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌに前記（２）
の検出部を浸漬し、室温で３０分間放置後、前記（２）
のウサギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン
化−ｓ−キトサン溶液にさらに３０分浸漬した。 （４）ＰＢＳで洗浄した後、前記（２）のＮＫ１１６０
で修飾されたアビジンに１０分間浸漬した。 （５）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸カ
リウム水溶液で洗浄後、実施例７と同様にして図１に示
す装置を用いて測定したところ、０．３ｎｇ／ｍｌまで
測定できた。

【００５３】実施例１３ （１）ＤＭＦ１５００ｍｌを３０００ｍｌの三口丸底フ
ラスコ中で、氷浴下、撹拌して冷却した。ついで、三酸
化硫黄９００ｇを時間かけて滴下して添加した。反応は
高度に発熱的であり、温度を約４０度以下に維持するよ
うに注意した。ＤＭＦ−三酸化硫黄錯体は、過剰のＤＭ
Ｆを含む黄色結晶状として得られた。錯体とＤＭＦのこ
の混合物は、冷蔵保存し、濾過や精製等をせずにそのま
ま以下の反応に使用した。

【００５４】（２）１１０℃で３時間乾燥した分子量約
２×１０⁶ のキトサン（フルカ社製）７ｇを７００ｍｌ
のＤＭＦと混合し、２５℃に数時間放置した。この混合
物を５℃に冷却したのち、同温度に冷却したＤＭＦ−三
酸化硫黄錯体４０ｇを三回に分けて撹拌しつつ添加し
た。反応の全期間を通じて温度が１５℃以下に維持され
るように冷却しつつ撹拌した。全反応時間は約３時間で
あった。反応混合物を氷水中に溶解し、希水酸化ナトリ
ウム水で中和し、濾過して不溶物を除いた。濾液を等量
のメタノール中にゆっくりと注ぎ、析出する生成物を濾
取し乾燥した。この生成物は、実施例７の（２）と同様
に処理して、３位および６位がスルホン化され、アミノ
基が遊離の、スルホン酸エステル化キトサン（ｓ−キト
サン）を取得した。こうして得られたｓ−キトサンの
ｄ．ｓ．値は、元素分析値（Ｓ／Ｎ比）の結果から、
１．２と推定された。 （３）得られたｓ−キトサンを実施例７の（３）〜
（６）と同様に処理して、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−ｓ
−キトサン−ＮＫ１１６０（ＡＳＣＤ）を得た。 （４）次いで、実施例７の（７）〜（１０）と同様に処
理して、ヒト膵アミラーゼ固定化センサーを調製し、こ
れを検出部とした。 （５）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体溶液の中に、前
記（４）の検出部を２０分間浸漬し、前記（３）で調製
したヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−ｓ−キトサン−ＮＫ１１
６０の溶液中に２０分間浸漬した。次いで、０．０５％
トゥイーン２０含有ＰＢＳ（Tween PBS)で洗浄後、１個
のレーザを使用する蛍光測定系である図１に示す装置を
用いて、ヘリウム−ネオンレーザ系で測定したところ、
３ｎｇ／ｍｌまで測定できた。

【００５５】実施例１４ ヒト膵アミラーゼ抗体の測定 （１）キトサンの代わりに分子量約１０⁶ のポリノイラ
ミン酸３ｍｇ／ｍｌを使用する以外は、実施例１３の
（１）〜（２）と同様の方法で、スルホン基を導入して
硫酸エステル化されたポリノイラミン酸（ｓ−ポリノイ
ラミン酸）の水溶液を得た。得られたｓ−ポリノイラミ
ン酸のｄ．ｓ．値は、元素分析値（Ｓ／Ｎ比）の結果か
ら １．３と推定された。 （２）前記（１）のｓ−ポリノイラミン酸にペルオキシ
ダーゼ２ｍｇを溶解し、さらに６０ｍｇのＣＨＭＣを加
えて４℃、５時間反応させた。反応終了後、陰イオン交
換カラムを用いて未反応物を除去し、さらにヤギ由来抗
ヒトＩｇ抗体１００μｇを加えＣＨＭＣ１０ｍｇを加え
て４℃、５時間反応させた。反応終了後、再び陰イオン
交換カラムを用いて精製し、ヤギ由来抗ヒトＩｇ抗体−
ｓ−ポリノイラミン酸−ペルオキシダーゼ（ＡＳＰＰ）
を得た。

【００５６】（３）ＥＩＡ用マイクロプレートウェルに
ヒト膵アミラーゼ溶液を注入し、ヒト膵アミラーゼを吸
着させた。 （４）濃度既知のヒト膵アミラーゼ抗体溶液を前記
（３）のウェルに注入し、３０分間抗原抗体反応をさせ
た。 （５）前記（４）のウェルを Tween PBSで３回洗浄後、
前記（２）で得られたＡＳＰＰを加えて３０分間抗原抗
体反応をさせ、さらに Tween PBSで３回洗浄した。 （６）次に１ｍｇ／ｍｌのルミノール水溶液をウェルに
注入し、１５分間酵素反応をさせた。 （７）４２５ｎｍの発光量をフォトンカウンターで測定
したところ、０．３ｎｇ／ｍｌまでヒト膵アミラーゼ抗
体を検出できた。

【００５７】実施例１５ ヒトカルシトニンの測定 （１）実施例１３の（１）〜（２）と同様の方法でｓ−
キトサン溶液を得た。 （２）１００μｌの水に４ｍｇの炭酸ナトリウムと１０
ｍｇのビオチンを溶かした。次いで、前記（１）で得ら
れたｓ−キトサン溶液２ｍｌと混合し、さらにＣＨＭＣ
を６０ｍｇ添加して、室温で２時間反応させた。反応
後、蒸留水に対して一晩透析した。透析後、回収された
透析物をビオチン化−ｓ−キトサン（ｂ−ｓ−ｃ）とし
た。

【００５８】（３）前記（２）のビオチン化−ｓ−キト
サン懸濁液にウサギ由来ヒトカルシトニン抗体１００μ
ｇを加え、さらに水溶性カルボジイミド１０ｍｇを添加
して、４℃、６時間反応させた。反応終了後、陰イオン
交換カラムを用いて未反応物を除去し、ウサギ由来ヒト
カルシトニン抗体が結合したビオチン化−ｓ−キトサン
を得た。 （４）アビジン１ｍｇおよびトリエチルアミン０．２ｍ
ｌを１ｍｌのエタノールに溶解させた。次いでＮＫ１１
６０を加えて充分に溶解させ、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド０．３ｍｌを加えて室温で一晩反応させた。 （５）遠心分離でアビジンを沈殿回収後、この沈殿をエ
タノールで２回洗浄し、遠心回収後、アスピレータで沈
殿中に残っているエタノールを減圧除去した。この残留
物を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、ＮＫ
１１６０で修飾されたアビジンを得た。 （６）ポリメタクリル酸メチル製の樹脂製光ファイバー
（三菱レイヨン（株）製）を３ｃｍに切り、両端面をエ
タノールを潤滑剤としてポリシングフィルムで研磨し
た。 （７）０．５ｍｌの水に１０ｍｇの硫酸ニッケルを溶か
し、次いで２．５ｍｌのエタノールを加えた。この際に
生じる沈殿を遠心分離にて除去し、採取した上清をニッ
ケル−エタノール溶液とした。次にエタノール溶媒の２
０ｍＭ水酸化カリウム溶液０．４ｍｌにニッケル−エタ
ノール溶液０．１ｍｌと５０％グルタルアルデヒド５０
μｌを添加し混合して、処理溶液とした。

【００５９】（８）前記（６）の光ファイバー片面を前
記（７）の処理溶液中に、５０℃で１０分間浸漬した
後、２０ｍＭ塩酸、次いでＰＢＳで洗浄した。次にこの
光ファイバーを２ｍｇ／ｍｌのヤギ由来ヒトカルシトニ
ン抗体溶液に浸漬し、４℃で一晩放置した。 （９）光ファイバーを溶液から取り出し、１％水素化ホ
ウ素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、ＰＢＳで
洗浄して、ヤギ由来ヒトカルシトニン抗体固定化センサ
ーを作製し、これを検出部とした。 （１０）前記（３）のウサギ由来ヒトカルシトニン抗体
が結合したビオチン化−ｓ−キトサンと前記（５）のＮ
Ｋ１１６０で修飾されたアビジンを混合し、凍結乾燥し
て２週間、−２０℃に保存した。 （１１）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌに前記
（９）の検出部を浸漬し、室温で３０分間放置後、前記
（１０）の凍結乾燥粉末を蒸留水に懸濁した溶液に３０
分間浸漬した。 （１２）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸
カリウム水溶液で洗浄後、実施例１と同様にして図１に
示す装置を用いて測定したところ、０．３ｎｇ／ｍｌま
で測定できた。

【００６０】実施例１６ （１）実施例１３の（１）〜（５）と同様の方法でＮＫ
１１６０の結合したｓ−キトサン（Ｆ−ｓ−キトサン）
を得た。 （２）前記（１）で得られたＦ−ｓ−キトサンの乾固物
をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍｌに溶解し、さ
らにアビジン１００μｇを加え、さらに水溶性カルボジ
イミド（ＣＨＭＣ）１０ｍｇを添加して４℃、６時間反
応させた。反応終了後、陰イオン交換カラムを用いて未
反応物を除去し、アビジン−Ｆ−ｓ−キトサン（Ａ−Ｆ
−ｓ−キトサン）を得た。 （３）実施例１５の（２）〜（３）と同様の方法でウサ
ギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン化−ｓ
−キトサンを得た。 （４）実施例１５の（６）〜（９）と同様の方法でヤギ
由来ヒトカルシトニン抗体固定化センサーを作成し、こ
れを検出部とした。

【００６１】（５）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌ
に前記（４）の検出部を浸漬し、室温で３０分放置後、
前記（３）のビオチン化−ｓ−キトサン溶液に２０分浸
漬した。 （６）ＰＢＳで洗浄後、前記（２）のＡＦ−ｓ−キトサ
ン溶液に１０分浸漬した。 （７）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸カ
リウム水溶液で洗浄後、実施例１と同様にして図１に示
す装置で測定したところ、５ｐｇ／ｍｌまで測定でき
た。

【００６２】実施例１７ （１）キトサンの代わりに分子量１０⁵ のポリガラクト
サミンを用いて実施例１０と同様の方法でカルシトニン
を測定した。得られたｓ−ポリガラクトサミンのｄ．
ｓ．値は、元素分析値（Ｓ／Ｎ比）の結果から１．２と
推定された。 （２）図１に示す装置で測定したところ３０ｐｇ／ｍｌ
まで測定できた。

【００６３】実施例１８ （１）実施例１３の（１）〜（２）と同様の方法でｓ−
キトサン溶液を得た。 （２）実施例１５の（２）〜（３）と同様の方法によ
り、ウサギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチ
ン化−ｓ−キトサンを、および実施例１５の（４）〜
（５）と同様の方法により、ＮＫ１１６０で修飾された
アビジンを得た。また、実施例１５の（６）〜（９）と
同様の方法によりヤギ由来ヒトカルシトニン抗体固定化
センサーを作製し、これを検出部とした。 （３）各濃度のカルシトニン溶液１０μｌに前記（２）
の検出部を浸漬し、室温で３０分間放置後、前記（２）
のウサギ由来ヒトカルシトニン抗体が結合したビオチン
化−ｓ−キトサン溶液にさらに３０分浸漬した。 （４）ＰＢＳで洗浄した後、前記（２）のＮＫ１１６０
で修飾されたアビジンに１０分間浸漬した。 （５）０．２％トゥイーン２０含有１Ｍチオシアン酸カ
リウム水溶液で洗浄後、実施例１３と同様にして図１に
示す装置を用いて測定したところ、０．３ｎｇ／ｍｌま
で測定できた。

【００６４】

【発明の効果】本発明のスルホン酸エステル化アミノグ
リカンは、アミノグリカンのヒドロキシル基をスルホン
酸エステル基に変換したものであり、水に対する溶解度
が高く、高分子アミノグリカンの適用が可能となり、ア
ミノグリカンの反応活性基の増加が可能となる。また、
水に対する溶解度が高くなることから、アミノグリカン
の導入数を増加させることにより反応活性基を増加させ
ることも可能となった。これらにより免疫測定の感度向
上が達成される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は１個のレーザを使用する蛍光測定系の概
略図である。

【符号の説明】

１ 光ファイバー ２ レーザ ３ 光軸合わせのためのガイドレール ４ 検出部 ５ フィルター ６ 蛍光検出器 ７ ハーフミラー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢野 秀樹 岐阜県揖斐郡揖斐川町北方１−１ イビデ ン株式会社内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫物質の結合したスルホン酸エステル
   化アミノグリカンに標識物質が結合した複合体よりなる
   免疫測定用標識試薬。
2. 【請求項２】 免疫物質の結合したスルホン酸エステル
   化アミノグリカンに反応特異性を有する複数の化合物を
   介して標識物質が結合した複合体よりなる免疫測定用標
   識試薬。
3. 【請求項３】 反応特異性を有する化合物がビオチンと
   アビジンであり、免疫物質の結合したスルホン酸エステ
   ル化アミノグリカンのアミノ基にビオチンが結合してお
   り、該ビオチンには標識物質で標識されたアビジンが結
   合した複合体よりなる請求項２記載の免疫測定用標識試
   薬。
4. 【請求項４】 免疫物質と結合したスルホン酸エステル
   化アミノグリカンに反応特異性を有する一方の化合物が
   結合した複合体と、該化合物との反応特異性を有する他
   方の化合物が標識物質で標識された複合体よりなる免疫
   測定用標識試薬。
5. 【請求項５】 反応特異性を有する化合物がビオチンと
   アビジンであり、免疫物質の結合したスルホン酸エステ
   ル化アミノグリカンのアミノ基にビオチンが結合した複
   合体と、標識物質で標識されたアビジンよりなる請求項
   ４記載の免疫測定用標識試薬。