NO155516B - Fluorescerende diagnostisk reagens og anvendelse derav for bestemmellse av hapten-antigener. - Google Patents
Fluorescerende diagnostisk reagens og anvendelse derav for bestemmellse av hapten-antigener. Download PDFInfo
- Publication number
- NO155516B NO155516B NO813029A NO813029A NO155516B NO 155516 B NO155516 B NO 155516B NO 813029 A NO813029 A NO 813029A NO 813029 A NO813029 A NO 813029A NO 155516 B NO155516 B NO 155516B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hapten
- compound
- hydrophobic
- fluorescent
- hydrophilic
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 22
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 claims abstract description 11
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 11
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical group O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 10
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 claims description 4
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 5
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- GZAJOEGTZDUSKS-UHFFFAOYSA-N 5-aminofluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(N)=CC=C21 GZAJOEGTZDUSKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- -1 methylcarboxymethyl Chemical group 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 description 3
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- DQMZLTXERSFNPB-UHFFFAOYSA-N primidone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NCNC1=O DQMZLTXERSFNPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002393 primidone Drugs 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229960002143 fluorescein Drugs 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- URWAJWIAIPFPJE-UHFFFAOYSA-N Rickamicin Natural products O1CC(O)(C)C(NC)C(O)C1OC1C(O)C(OC2C(CC=C(CN)O2)N)C(N)CC1N URWAJWIAIPFPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 1
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical class O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N netilmycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@]([C@H](NC)[C@@H](O)CO1)(C)O)NCC)[C@H]1OC(CN)=CC[C@H]1N ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- URWAJWIAIPFPJE-YFMIWBNJSA-N sisomycin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC=C(CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N URWAJWIAIPFPJE-YFMIWBNJSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår et forbedret fluorescerende diagnostisk reagens og anvendelse derav for bestemmelse av hapten-antigener.
Ved kjente metoder for immunofluorescensbestemmelse på faste overflater blir det stoff som skal analyseres, f.eks. et hapten merket med en fluorescerende del og fiksert til en overflate ved adsorbsjon eller på annen måte i konkurranse med et umerket hapten (Tsay et al., "Quantitation of Serum Gentamicin Concentration by a Solid Phase Immunofluorescence Method",
Clin. Chem., Vol. 26 (1980)). Når det til en slik overflate er bundet en bestemt mengde av et antistoff, vil overflaten ved neddypping i en serumprøve immunologisk binde merket og umerket hapten i mengder som begrenses av antistoffets respektive bindingsevne. Hapten-antigen-konsentrasjonen i serum henholds-vis blod kan deretter måles ved hjelp av et presisjonsfluoro-meter etter at overflaten er tatt ut av serumet. Som presisjons-fluorometer er FIAX<®->system 100 egnet såvel for kvalitative som for kvantitative målinger.
Immunofluorescensbestemmelse på en fast overflate er en hurtig, enkel og relativt nøyaktig metode for kvantitativ bestemmelse. Metoden har imidlertid minst tre vesentlige ulemper, nemlig uspesifikke bindinger på overflaten, nedsatt antigenitet og uspesifikke bindinger til andre serumbestanddeler og den derav følgende fluorcscens-slukking.Hensikten med foreliggende oppfinnelse er å finne frem til et fluorescerende diagnostisk reagens som retter opp disse mangler.
Det kan antas at det høye antall uspesifikke overflate-bindinger av det merkede hapten i det vesentlige kan tilbake-føres til hydrofobe vckselvirkninqcr mellom den faste overflate og det fluorescens-merkede hapten-kompleks. Når f.eks. den fluorescerende forbindelse eller markeringen er fluoresceinisotiocyanat og haptenet er difenylhydantoin, er det fluorescens-merkede hapten-kompleks hydrofobt. Ved en rekke vanlige overflater på cellulosebasis blir det fluorescens-merkede kompleks ikke bare bundet spesifikt til ahtistoffet, men også uspesifikt til hele den faste overflate.
Problemet med lav eller nedsatt antigenitet av det fluorescens-merkede hapten-kompleks kan høyst sannsynlig føres til-bake til den steriske hindring mellom haptenet og fluorescens-molekyldelen. Ved fluorescens-merkede komplekser svekker nær-heten av den hydrofobe fluorescens-molekyldel antistoff-hapten-tilnærmingen. Dessuten bevirker dette den sterke binding av komplekset til albumin eller andre serumbestanddeler. Følgene av dette er et svekket fluorescens-signal, også kjent som"fluorescens-slukking". De nevnte problemer kan muligens skyldes fluorescens-forbindelsen og hapten-molekyIdelens romlige nærhet i kompleksmolekylet. Den hydrofobe karakter av de to molekyldeler forsterker problemene. Det har imidlertid nå vist seg at de nevnte ulemper kan overvinnes ved at det bygges inn et hydrofilt mellomledd ("spacer") mellom de to ovennevnte molekyldeler. Herved oppnås et forbedret fluorescerende .reagens og en forbedret immunofluorescens-analysemetode.
Hensikten med foreliggende oppfinnelse er derfor å
oppnå et reagens som medfører en sterk reduksjon av de uspesifikke bindinger mellom det fluorescens-merkede hapten-kompleks og den faste overflate ved innbygging av et hydrofilt mellomledd i det merkede kompleks, som øker det fluorescens-markerte haptens antigenitet, og nedsetter den fluorescens-slukking av det fluorescens-markerte hapten som albuminer eller andre serumbestanddeler forårsaker.
I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes et fluorescerende diagnostisk reagens bestående av et konjugat av
a) et hydrofobt hapten,
b) en hydrofil forbindelse og
c) en hydrofob fluorescerende forbindelse på basis av fluorescein, umbelliferon eller fluorescamin,
hvor såvel det hydrofobe hapten som den hydrofobe fluorescerende forbindelse er bundet, adskilt fra hverandre, til den hydrofile forbindelse.
Reagenset karakteriseres ved at den hydrofile forbindelse er et aminoglykosid med den generelle formel
R1 : =C eller -CH; R2 : -CII9OH, -CII2NH2,
R3: =C eller -CH;
R4,R5 og Rg: -H eller -OH;
R,: -0H eller -NH0;
R?: -NH2, -NHCH2CH3 eller -NH-COCH(OH)CH2CH2NH2;
Rg: -H eller -CH2OH;
R1Q: -OH eller -CH3 og
R1 1 : -NH2 eller -NHCH^
Med hensyn til haptenet er det praktisk talt ubegrensede muligheter. Den eneste forutsetning består i at haptenet er et hydrofobt molekyl og enten allerede har en funksjonell molekylgruppe for binding av det hydrofile mellomledd, eller kan modifiseres slik at det får en slik molekylgruppe. Det dreier seg i denne forbindelse om de samme funksjonelle grupper som vanligvis anvendes ved sammenkobling av haptenet med fluorescens-markeringcn, f.eks. alkohol, eter, ester, amid, halogen,nitril eller mcrkapto-grupper, spesielt amino- og karboksylgrupper.
Det foreligger mange muligheter for å velge ut en egnet funksjonell gruppe for det aktuelle hapten som skal analyseres, og innføre denne allerede ved syntesen av haptenet eller etterpå. Når det gjelder haptenene fenobarbital, difenylhydantoin og primidon, har f.eks. aminogruppen og karboksylgrupper som metylkarboksymetyl-, metylkarboksybutyl-, karboksymety1- og karboksybuty1-grupper, vist seg egnet.
Reagenset ifølge oppfinnelsen er særlig anvendelig
i forbindelse med bestemmelse av antikonvulsiva som f.eks. fenobarbital, difenylhydantoin og primidon. Disse medikamenter anvendes ved kroniske sykdommer i nervesystemet som f.eks. epilepsi. Da det i mange tilfeller er konsentrasjonen av det angjeldende farmakon i serum som avgjør om det har virkning som legemiddel eller som gift, er dets nøyaktige konsentrasjons-bestemmelse i serum meget viktig. Ved hjelp av reagenset og immunofluorescens-bestemmelsen i henhold til oppfinnelsen er det mulig å foreta slike serumanalyser.
Den hydrofile forbindelse har minst to reaktive steder i molekylet, nemlig aminogruppene, som har evne til å binde såvel haptenet som den fluorescerende forbindelse. Amino-glykosidene er spesielt gentamyciner, tobramycin, amikacin, sisomycin, netilmycin og kanamyciner.
Eksempler på egende aminoglykosider er stillet sammen i tabell I (side 5).
Den hydrofobe fluorescerende forbindelse er et derivat
av fluorescein, umbelliferon og fluorescamin. Spesielt foretrukket er 5-jodacetyl-aminofluorescein, 5-aminofluorescein, fluoresceinisotiocyanat, 5-diklortriazinyl-aminofluorescein og rhodaminisotiocyanat. Fluoresceinisotiocyanat (R= -NCS) og 5-aminofluorescein (R= ~NH2) har følgende struktur:
Den hydrofobe fluorescerende forbindelse bør fortrinnsvis
bare ha en reaktiv molekylposisjon, da flere reaktive posisjoner har en tendens til å gjøre den kvantitative måling av haptenet som skal måles, mindre nøyaktig.
Fremstillingen av det fluorescerende diagnostiske
reagens skjer vanligvis ved at man først omsetter det hydrofobe hapten, i form av et reaktivt derivat, med den hydrofile forbindelse og deretter bringer reaksjonsproduktet til reaksjon med den fluorescerende forbindelse som så bindes til det hydrofile mellomledd.
Reaksjonskomponentene omsettes i molforholdet 1:1:1. Reagensfremstillingen skjer analogt med vanlige fremgangs-måter for syntese av fluorescensmerkede haptener og fremgår også mer detaljert av eksemplene.
Foretrukne fluorescerende reagenser i henhold til opfinnelsen er konjugater av ovennevnte aminoglykosider med den angitte generelle formel og 5-aminofluorescein eller fluoresceinisotiocyanat og et antikonvulsivum, spesielt difenylhydantoin, fenobarbital eller primidon. Særlig foretrukket er konjugater mellom et antikonvulsivum, spesielt difenylhydantoin, fluoresceinisotiocyanat og gentamycin og konjugater mellom et antikonvulsivum, spesielt fenobarbital, tobramycin og fluorescein-isotiocyanat.
Foreliggende oppfinnelse angår dessuten en anvendelse
av reagenset ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av hapten-antigener.
Eksempel
Et fluorescerende diagnostisk reagens av difenylhydantoin (DPH) som hapten, gentamycin som hydrofil forbindelse og fluorescein-isotiocyanat som fluorescerende forbindelse ble fremstilt på følgende måte: Til en oppløsning av et karbonsyrederivat av 0,5 mmol difenylhydantoin og 0,5 mmol N-hydroksysuccinimid (NHS) i 1 ml vannfri dimetylformamid ble det tilsatt 0,75 mmol dicykloheksyl-karboimid (DCC). Blandingen ble deretter omrørt ved romtemperatur i en time og deretter avkjølt i kjøleskap under omrøring til neste dag. Etter frafiltrering av et hvitt bunnfall, ble filtratet langsomt tilsatt til en løsning av 600 mg gentamycin i 5 ml 0,01 molar karbcnatbuffer med pH 9,0. Med gentamycin skal det her forståes en blanding av forbindelsene nevnt under 2, 3 og 4 i tabell I. Reaksjonsblandingens pH ble overvåket og holdt konstant på verdien 9,0. Deretter ble reaksjonsblandingen avkjølt under omrøring i løpet av natten i kjøleskap og sentri-fugert ved 3000 omdreininger pr minutt i 10 minutter. Supernatanten ble renset på silikagelplater og eluert tre ganger med en metanol-kloroformblanding i forholdet 10:7 og en gang med en ammoniakalsk kloroform-blanding (metanol:kloroform: 5n NH4OH= 2:1:1). Den UV-positive sone som først vandret ved eluering med metanol-kloroform-5nNH4OH-blanding, ble fraskilt og ekstrahert med en blanding av metanol-kloroform-5nNH4OH. Etter at løsnings-midlet var fjernet under redusert trykk, ble difenylhydantoin-gentamycinet oppnådd som residuum.
Fremstilling av difenylhydantoin-gentamycin-fluorescein-tiocyanat-derivatet: Syntesen ble foretatt analogt fremstillingen av difenylhydantoin-gentamycin-derivåtet.
Difenylhydantoin-gentamycin-derivatet oppnådd som ovenfor beskrevet, ble løst i 2 ml av en 0,01 molar karbonatbuffer (pH 9,0) og porsjonsvis tilsatt en ekvimolar mengde fluorescein-isotiocyanat. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt natten over ved romtemperatur i mørke. Reaksjonen var dermed over, og bunnfallet ble fraskilt ved sentrifugering. Supernatanten ble renset på silikagelplater etter den ovenfor beskrevne eluerings-prosedyre.
Den fluorescerende sone ble fraskilt og ekstrahert med
en blanding av metanol:kloroform:5nNH4OH. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og det faste residuum tatt opp i destillert vann som var tilsatt en dråpe konsentrert ammoniakk.
I tabell III er vannløseligheten av haptenene fenobarbital og difenylhydantoin i uendret form, i modifisert form (karboksy-lert resp. aminert) og i såkalt konjugert form, nemlig som om-setningsprodukt med gentamycin, sammenlignet. Av sammen-ligningen fremgår det at haptenene i uendret og i modifisert form er hydrofobe (uløseligheten i vann er et mål for hydro-fobiteten av en forbindelse). Med økende uløselighet i vann til-tar hydrofobisiteten av forbindelsen og dermed også sannsynlig-heten for bindinger til overflaten, hvorved uspesifikke bindinger forårsaker store unøyaktigheter i immunofluorescens-analysemetoden. Som det videre fremgår av tabell III oppnås et løselig, dvs. hydrofilt produkt, når man forbinder et hydrofobt hapten som fenobarbital eller difenylhydantoin, med en hydrofil forbindelse som gentamycin. Slike produkter bindes ikke som sådanne til den faste overflate.
Da de vanlige fluorescensreagenser er hydrofobe kan albumin og andre serumproteiner leires til disse og forhindre eller nedsette deres evne til fluorescens når de exciteres ved immunofluorescens-bestemmelsen. Den fluorescens-slukkende effekt av albumin blir vist i tabell IV med to fluorescensreagenser, nemlig fluoresceinisotiocyanat og 5-aminofluorescein, som eksempler, på uendret fluorescens-reagens, på omsetningsproduktet med haptenet, samt på reagenset oppnådd i henhold til oppfinnelsen av hapten, fluorescerende forbindelse og en hydrofil forbindelse (hapten-gentamycin-konjugat).
Den etterfølgende tabell V dokumenterer haptenets for-bedrede antigenitet når dette inngår som bestanddel i det fluorescerende reagens i henhold til oppfinnelsen. Når f.eks. haptenet difenylhydantoin bare kombineres med den hydrofobe fluorescerende forbindelse, er antigeniteten av dette, dvs. evnen til å forbinde seg med det korresponderende antistoff, betraktelig nedsatt. Bygges imidlertid en hydrofil forbindelse som f.eks. gentamycinet, inn, er antigeniteten høy-ere enn for reaksjonsprodukt av hapten og den fluorescerende forbindelse, eller faktisk like høy som antigeniteten av det rene hapten.
Claims (6)
1. Fluorescerende diagnostisk reagens bestående av et
konjugat av a) et hydrofobt hapten, b) en hydrofil forbindelse og c) en hydrofob fluorescerende forbindelse på basis
av fiuorescein, umbelliferon eller fluorescamin,
hvor såvel det hydrofobe hapten som den hydrofobe fluorescerende forbindelse er bundet, adskilt fra hverandre, til den hydrofile forbindelse,
karakterisert ved at den hydrofile forbindelse
er et aminoglykosid med den generelle formel
hvor:
R1 : =C eller -CH,
R2: -CH2OH, -CH2NH2, -CH2NHCH3,
R3: =C eller -CH;
R4/R5 og Rg: -H eller -OH;
R,: -OH eller -NH„
6 2. R?: -NH2, -NHCH2CH3 eller -NH-COCfI(OH)CH2CH NH
2 Rg: -H eller -CH2OH
R1Q: -OH eller -CH3 og •R^: -NH2 eller -NHCH32. Fluorescerende diagnostisk reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at den hydrofobe fluorescerende forbindelse er fluorescein-isotiocyanat og aminoglykosidet er gentamycin.
3. Fluorescerende diagnostisk reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at den fluorescerende forbindelse er fluorescein-isotiocyanat og aminoglykosidet er tobramycin.
4. Anvendelse av et reagens bestående av et konjugat av a) et hydrofobt hapten, b) en hydrofil forbindelse og c) en hydrofob fluorescerende forbindelse på basis av
fluorescein, umbelliferon eller fluorescamin, hvor såvel det hydrofobe hapten som den hydrofobe fluorescerende forbindelse er bundet, adskilt fra hverandre, til den hydrofile forbindelse, hvor den hydrofile forbindelse er et aminoglykosid med den generelle formel
hvor
R1: =C eller -CH;
R2: -CH2OH, -CH2NH2, -CH2NHCH3,
R3: =C eller -CH;
R4,R5 og Rg: -H eller -OH;
Rg: -OH eller -NH2R?: -NH2, -NHCH2CH3 eller -NHCOCH(OH)CH2-CH2-NH2;
Rg: -H eller -CH2OH;
R1Q: -tOH eller -CH3 og
R1 : -NH2 eller -NHCH3
for bestemmelse av hapten-antigener.
5. Anvendelse som angitt i krav 4, av et reagens hvor den hydrofile fluorescerende forbindelse er fluorescein-isotiocyanat og aminoglykosidet er gentamycin.
6. Anvendelse.som angitt i krav 4, av et reagens hvor den hydrofile fluorescerende forbindelse er fluorescein-isotiocyanat og aminoglykosidet er tobramycin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18523580A | 1980-09-08 | 1980-09-08 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO813029L NO813029L (no) | 1982-03-09 |
| NO155516B true NO155516B (no) | 1986-12-29 |
| NO155516C NO155516C (no) | 1987-04-08 |
Family
ID=22680153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO813029A NO155516C (no) | 1980-09-08 | 1981-09-07 | Fluorescerende diagnostisk reagens og anvendelse derav for bestemmelse av hapten-antigener. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0047459B1 (no) |
| JP (1) | JPS5777963A (no) |
| AT (1) | ATE10399T1 (no) |
| CA (1) | CA1172560A (no) |
| DE (1) | DE3167327D1 (no) |
| DK (1) | DK394681A (no) |
| FI (1) | FI72394C (no) |
| IE (1) | IE53511B1 (no) |
| NO (1) | NO155516C (no) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1195995A (en) * | 1982-11-08 | 1985-10-29 | Curtis L. Kirkemo | Substituted carboxyfluoresceins |
| ATE42317T1 (de) * | 1983-07-29 | 1989-05-15 | Henning Berlin Gmbh | Voraktivierte kunststoffoberflaechen zur immobilisierung von organisch-chemischen und biologischen materialien, verfahren zur herstellung und verwendung derselben. |
| US5877310A (en) * | 1997-04-25 | 1999-03-02 | Carnegie Mellon University | Glycoconjugated fluorescent labeling reagents |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3966898A (en) * | 1973-06-28 | 1976-06-29 | Pharmacia Diagnostics Ab | Method and reagent for determining immunologic materials |
| US4169137A (en) * | 1974-12-20 | 1979-09-25 | Block Engineering, Inc. | Antigen detecting reagents |
| GB1573212A (en) * | 1976-04-15 | 1980-08-20 | Technicon Instr | Immunoassay for gentamicin |
| SE431591B (sv) * | 1977-06-16 | 1984-02-13 | Syva Co | Immunanalys med fluorescenssleckning jemte reagens herfor |
| IL56467A (en) * | 1978-02-10 | 1982-04-30 | Sin Hang Lee | Cytochemical agents and methods for the detection of steroid hormone receptors in human tissues |
| US4182856A (en) * | 1978-04-25 | 1980-01-08 | Miles Laboratories, Inc. | Reagents for use in binding assays to determine diphenylhydantoin |
-
1981
- 1981-08-29 AT AT81106776T patent/ATE10399T1/de active
- 1981-08-29 EP EP81106776A patent/EP0047459B1/de not_active Expired
- 1981-08-29 DE DE8181106776T patent/DE3167327D1/de not_active Expired
- 1981-09-04 CA CA000385220A patent/CA1172560A/en not_active Expired
- 1981-09-07 IE IE2060/81A patent/IE53511B1/en unknown
- 1981-09-07 JP JP56140808A patent/JPS5777963A/ja active Pending
- 1981-09-07 DK DK394681A patent/DK394681A/da not_active Application Discontinuation
- 1981-09-07 FI FI812771A patent/FI72394C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-09-07 NO NO813029A patent/NO155516C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3167327D1 (en) | 1985-01-03 |
| DK394681A (da) | 1982-03-09 |
| JPS5777963A (en) | 1982-05-15 |
| IE53511B1 (en) | 1988-12-07 |
| ATE10399T1 (de) | 1984-12-15 |
| CA1172560A (en) | 1984-08-14 |
| FI72394B (fi) | 1987-01-30 |
| EP0047459A3 (en) | 1982-03-24 |
| IE812060L (en) | 1982-03-08 |
| EP0047459A2 (de) | 1982-03-17 |
| NO813029L (no) | 1982-03-09 |
| FI72394C (fi) | 1987-05-11 |
| EP0047459B1 (de) | 1984-11-21 |
| FI812771L (fi) | 1982-03-09 |
| NO155516C (no) | 1987-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1042792A (en) | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays | |
| US4082738A (en) | Cyanocobalamin derivatives | |
| JP4435305B2 (ja) | トピラメートのイムノアッセイ、並びに類似体及び抗体 | |
| US5336621A (en) | Divalent hapten derivatives | |
| EP0399184A2 (en) | Reagents, methods and kits for an amphetamine-class fluorescence polarization immunoassay | |
| US20030045716A1 (en) | Acridinium ester labels having hydrophilic modifiers | |
| JPH082910B2 (ja) | ハプテン−ビオチン複合体及び免疫検定法 | |
| JPS6127710B2 (no) | ||
| US7781570B2 (en) | Site-specific aminoglycoside derivatives for use in immunodiagnostic assays | |
| NO155516B (no) | Fluorescerende diagnostisk reagens og anvendelse derav for bestemmellse av hapten-antigener. | |
| EP0380019B1 (en) | Methadone fluorescence polarization immunoassay | |
| KR19990014715A (ko) | 에스에이치기 표지용 시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 | |
| JPH0720985B2 (ja) | ハプテン―蛋白質―接合体及び免疫検定法 | |
| EP0819254A1 (en) | Reagents and methods for the detection and quantification of vancomycin in biological fluids | |
| US4360592A (en) | Process for the detection of antibodies | |
| US4489157A (en) | Chloramphenicol derivatives | |
| EP0108403A2 (en) | Substituted carboxyfluoresceins | |
| US4608200A (en) | Chloramphenicol derivatives, antigens and antibodies | |
| FI80801B (fi) | Konjugat av en monoklonal antikropp och anvaendning. eller ett fragment daerav och ett kelaterande aemne, dess framstaellning | |
| JP3130043B2 (ja) | プロポキシフェンのイムノアッセイ用ハプテン、トレーサー、免疫原および抗体 | |
| CN116930478A (zh) | 一种甲状腺素荧光偶联物及其制备方法和应用 | |
| JP5523695B2 (ja) | チオ尿素リンカーを含むコンジュゲートの安定化 | |
| JPH0783924A (ja) | Ｎ−部分置換アミノグリカンを用いた免疫測定用標識試薬 | |
| JPH02231564A (ja) | バルビツール酸塩の検出方法、それに用いるトレーサー化合物およびその製法 | |
| WO1995021196A1 (en) | Immunoassay for inositols |