KR100941679B1 - 인산기-선택적인 형광 프로브를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법 - Google Patents

인산기-선택적인 형광 프로브를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산기-선택적인 형광 프로브의 제조 방법에 관한 것으로서, 특히 특정 구조의 인산기 결합성 물질에 형광 물질을 공유 결합시킨 후, 생성 화합물을 금속 이온과 배위 결합시키는 것을 포함하는, 인산기-선택적인 형광 프로브의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 인산기-선택적인 형광 프로브는 포스파타제 활성 측정 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
포스파타제 (phosphatase), 탈인산화 반응 (dephosphorylation), CIP (calf intestinal alkaline phosphatase), 형광 편광도 (fluorescence polarization), 인산기-선택적인 프로브 (phosphate-specific probe).

Description

인산기-선택적인 형광 프로브를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법{METHOD FOR PHOSPHATASE ACTIVITY ASSAYS USING PHOSPHATE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBE}
본 발명은 인산기-선택적인 형광 프로브, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 생리 분자들의 인산화 (phosphorylation) 또는 탈인산화 (dephosphorylation)는 생체 분자의 생물리적 변이(modification) 중 가장 중요한 위치를 차지한다. 탈인산화 반응의 촉매로 작용하는 효소인 포스파타제는 단백질, 핵산, 지질 등 광범위한 생체 분자를 기질로 사용하며, 특히 생체 내 인산화/탈인산화를 통한 신호 전달 체계에서 필수적인 효소로 이용된다. 또한, 특정 단백질의 인산기를 제거하거나, 핵산의 말단에 있는 인산기를 제거하여 재조합 플라스미드를 제조하는 경우에도 포스파타제가 유용하게 이용된다.
이에 따라, 포스파타제의 활성을 효과적이면서 용이하게 측정할 수 있는 방 법을 개발하려는 연구가 진행되고 있다.
포스파타제의 활성을 측정하는 방법으로는, 포스파타제에 의해 기질인 p-나이트로페닐 포스페이트 (pNPP)의 인산기를 제거한 후, 생성물인 p-나이트로페놀 (pNP)의 400 nm에서의 UV 흡광도를 측정하는 방법이 공지되어 있다. 하지만, 상기 방법에서 사용되는 기질인 pNPP는 실제 생리적 환경 내에서 발생하는 포스파타제의 기질과는 무관한 물질이기 때문에, 실제적인 생리 기질에 대한 포스파타제의 활성을 측정하는 것과는 차이가 있다. 또한, pNP의 UV 소멸 계수 (extinction coefficient)는 약 18,000 cm-1M-1 정도이기 때문에, 10-5 M 이하의 농도 변화를 UV 흡광도를 사용하여 측정하기에는 부적합하였다.
이러한 문제점을 극복하기 위해, 포스파타제와 반응하여 형광 신호를 증가시킬 수 있는 물질을 포스파타제의 기질로 사용하려는 시도가 있었다 (문헌[O. Wolfbeis and E. Koller, Microchimica Acta, 1985, 85, 389 - 395] 참조). 또한, 형광 공명 에너지 전이 (FRET, fluorescence resonance energy transfer)를 기초로 한 방법도 개발되었는데, 이 방법은 형광 물질의 형광의 양이 근접한 다른 형광 물질에 전달된 후, 방출되는 형광의 변화량을 실시간으로 측정하는 방법이다 (문헌[S. Rodems et al., ASSAY and Drug Development Technologies, 2002, 1, 9 - 19] 참조). 하지만, 형광 세기 (fluorescence intensity)는 pH 변화에 민감하고, 형광 물질의 성질에 따라 광표백 (photo-bleaching)이 되기 쉽기 때문에, 결과적으로 시간에 따라 신호의 세기가 감소되어 측정한 시간과 이용한 광원, 사용하는 완 충 용액 종류 및 형광 물질의 보관 상태에 따라 얻어지는 신호의 재현성에 오차가 생기는 문제점이 있다.
한편, 형광 편광도를 이용하여 단백질 키나아제 (kinase)와 같은 인산기와 관련된 효소의 활성을 측정하는 방법이 공지되어 있다. 이 방법에서는, 먼저 키나아제의 기질이 될 수 있는 짧은 펩타이드의 끝에 형광물질을 공유결합으로 표지한 후, 키나아제 및 ATP와 함께 반응시켜 인산화된 생성물을 수득한다. 이어서, 상기 인산화된 생성물을 포함하는 반응 용액에 인산기에 선택적으로 결합하는 금속이 부착된 나노 입자인 IMAPTM (Molecular Devices, USA) 혹은 인산기에 선택적인 항체를 가한 후, 형광 편광도를 측정한다. 이와 같이, 인산화된 생성물이 IMAPTM 혹은 항체에 결합하게 되면, 형광 편광도가 그렇지 않은 기질에 비해 증가하게 되어 효소 활성을 측정할 수 있다. 이 방법은 단백질 포스파타제의 활성 측정에도 사용할 수 있으나, 사용되는 기질에 공유 결합으로 형광 물질을 표지 해줘야 하고, 기질 자체가 실제 단백질 기질이 아닌 단백질의 반응 부분의 아미노산 서열로 이루어진 짧은 펩타이드와 같은 작은 분자인 경우에만 사용할 수 있는 단점이 있다. 즉, 생체 내에서 포스파타제의 실제 기질이 되는 단백질은 상대적으로 큰 분자여서 이것을 기질로 사용하는 방법에서는 포스파타제의 활성을 측정할 수는 없다는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 형광 편광도를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 포스파타제 활성 측정에 사용되는 형광 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광 프로브의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인산기-선택적인 형광 프로브, 이의 제조 방법, 및 상기 인산기-선택적인 형광 프로브를 이용하여 포스파타제의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 인산기 결합성 물질에 형광 물질을 공유 결합시킨 후, 생성 화합물을 금속 이온과 배위 결합시키는 것을 포함하는, 인산기-선택적인 형광 프로브의 제조 방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112008000861917-pat00001
[화학식 2]
Figure 112008000861917-pat00002
[화학식 3]
Figure 112008000861917-pat00003
[화학식 4]
Figure 112008000861917-pat00004
상기 식들에서,
R1은 아미노, 하이드록실, 싸이올, 카르복실, 카르보닐, 비닐 및 알릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고,
R2 및 R3은 에틸렌 글라이콜릴 에테르 (-(CH2O)n-) (이때, n은 3 이하의 정수이다), 지방족 탄화수소 (-(CH2)m-) (이때, m은 3 이하의 정수이다) 및 아미드 (-CONH-)기 로 이루어진 군으로부터 선택된 기이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 인산기-선택적인 형광 프로브를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 인산기-선택적인 형광 프로브를 사용하여 기질의 탈인산화 반응을 분석하는 방법을 제공한다:
(1) 완충 용액 중에서, 인산기-선택적인 형광 프로브를 기질과 혼합하여 상기 형광 프로브를 기질의 인산기에 결합시킨 후, 상기 형광 프로브가 결합된 기질을 포함하는 반응 용액의 형광 편광도 값을 측정하는 단계;
(2) 상기 반응 용액에 포스파타제를 첨가하여 탈인산화 반응을 수행하면서, 탈인산화 반응 도중 또는 반응이 완료된 후 상기 반응 용액의 형광 편광도 값을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 탈인산화 반응 전/후의 상기 반응 용액의 형광 편광도 값을 비교하는 단계.
본 발명에 따른 인산기-선택적인 형광 프로브 및 이를 이용한 포스파타제 활성 측정 방법을 이용하면,
첫째, UV 흡광도를 사용하는 방법에 비해 더 낮은 농도의 변화를 민감하게 측정할 수 있고,
둘째, 형광 편광도를 이용하여 측정하기 때문에 형광 세기를 이용하여 측정 할 경우 발생할 수 있는 농도 및 pH 의존성이 거의 없으며, 형광 염료의 종류에도 영향을 덜 받고,
셋째, 포스파타제가 생체 내에서 실제 기질로 사용하는 생고분자들을 이용하기 때문에 보다 실제에 가까운 상황에서 활성도를 측정할 수 있고,
넷째, 실시간으로 포스파타제의 활성을 모니터링 할 수 있고, 중간에 효소 반응을 멈추지 않고 반응 시작부터 반응 완료 시까지 용액상의 효소 반응을 분석할 수 있으며,
다섯 째, 기존의 형광 편광도를 측정하는 방법과 달리, 기질에 별도의 공유 결합으로 형광분자를 표지할 필요가 없기 때문에 비용 및 소요 시간이 감소하며,
여섯 째, 반응 용액에 형광 프로브만 첨가하면 반응 진행에 관한 신호를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 고속 처리 검색(high-throughput screening)에 적합하고,
일곱째, 96- 혹은 384 웰 플레이트 (well-plate)를 이용하여 다양한 종류의 포스파타제의 활성을 한 번에 분석하거나, 특정 포스파타제에 대한 다수의 저해제를 분석할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 기존의 포스파타제 활성 측정 방법에 비해 훨씬 간편하고 효과적이며 결과의 재현성 (reproducibility)이 뛰어난 측정 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 인산기-선택적인 형광 프로브를 제조하기 위해서는, 다이피 콜릴 (dipicolyl)기를 갖는 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 인산기 결합성 물질에 형광 물질을 공유 결합시킨 후, 생성 화합물을 금속 이온과 배위 결합시킨다.
Figure 112008000861917-pat00005
Figure 112008000861917-pat00006
Figure 112008000861917-pat00007
Figure 112008000861917-pat00008
상기 식들에서,
R1은 아미노, 하이드록실, 싸이올, 카르복실, 카르보닐, 비닐 및 알릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, 특히 아미노기가 바람직하며,
R2 및 R3은 에틸렌 글라이콜릴 에테르 (-(CH2O)n-) (이때, n은 3 이하의 정수이다), 지방족 탄화수소 (-(CH2)m-) (이때, m은 3 이하의 정수이다) 및 아미드 (-CONH-)기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이다.
상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 상업적으로 입수 가능하거나, 용이하게 제조할 수 있다.
본 반응에 사용되는 형광 물질로는 플루오레세인 (fluorescein), 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine), BODIPY (인비트로젠(Invitrogen), 미국), 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor, 인비트로젠, 미국), Cy5(인비트로젠, 미국), Cy3(인비트로젠, 미국), 텍사스 레드(Texas Red, 인비트로젠, 미국) 등을 예시할 수 있으며, 이외에도 당업자에게 공지된 형광 물질이라면 본 발명에서 모두 이용 가능하다.
상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 R1기를 통해 형광 물질과 결합되며, 경우에 따라 R1기에 링커 (linker)가 결합된 이후에 형광 물질이 결합될 수도 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1 내지 4의 인산기 결합성 물질과 상기 형광 물질간의 공유 결합은 용매 중에서 각 반응 물질을 서로 반응시킴으로써 수행되는데, 이때 사용되는 용매의 예로는 디메틸 술폭사이드 (DMSO), 디메틸 포름아미드 (DMF) 아세토 니트릴 (CH3CN), 테트라하이드로 퓨란 (THF), 혹은 이들에 수용성 완충용액 (PBS (phosphate buffer saline), HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) 또는 MES (4-morpholineethanesulfonic acid))을 10 내지 90 중량%의 비율로 혼합한 용액 등이 있다. 이 경우, 형광 물질은 인산기 결합성 물질에 대해 통상적인 양으로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1 : 1 내지 1 : 5 몰 비로 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응은 10 내지 60℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다.
선택적으로, 링커 (linker)를 사용하여 상기 인산기 결합성 물질에 상기 형광 물질을 공유 결합시킬 수 있다. 상기 링커의 예로는 2-아미노에탄싸이올 하이드로클로라이드, 에틸렌 디아민 등과 같은 아민 링커, 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 펜타에틸렌 글리콜 등과 같은 알콜 링커, 및 6-아미노 헥사노익 엑시드 등이 있다. 이 경우, 상기 링커들은 상기 인산기 결합성 물질에 대해 통상적인 양으로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1 : 1 내지 1 : 5 몰 비로 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응은 10 내지 60℃의 온도 범위에서, 디메틸 술폭사이드 (DMSO), 디메틸 포름아미드 (DMF), 아세토 니트릴 (CH3CN), 테트라하이드로 퓨란 (THF) 등의 용매 중에서 수행될 수 있다.
이어서, 상기 형광 물질이 공유 결합된 인산기 결합성 물질을 통상적인 방법으로 Zn2 +, Mn2 +, Ni2 +, Ga3 +, Cu2 +, Fe2 +, Co3 + 등과 같은 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+과 배위 결합시킨다 (문헌[Kinoshita et al. Molecular & Celullar Proteomics, 2006, pp. 749 - 757] 참고).
결과적으로, 상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 다이피콜릴 (dipicolyl)이 금속 이온과 배위 결합된 구조를 갖는다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 형광 프로브는 그의 금속 이온-다이피콜릴 구조가 인산기에 선택적으로 결합하므로, 인산기를 가진 기질과 반응시킴으로써 기질의 인산기 함량을 측정하는 데 이용할 수 있다. 이때, 상기 기질은 DNA, RNA, 및 인산기를 갖는 단백질 등과 같은 생고분자를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 인산기-선택적인 형광 프로브를 사용하면, 기질에 별도의 공유 결합으로 형광 표지를 하지 않고도 인산기 함량을 정량적으로 측정할 수 있으며, 형광 편광도 측정을 통해 포스파타제의 탈인산화 반응을 분석할 수도 있다. 특히, 상기 형광 프로브가 핵산을 기질로 하는 경우, 형광 프로브는 핵산 내부에 존재하는 포스포다이에스터 (phosphodiester)기에 비해서 핵산의 말단에 있는 인산기에 훨씬 더 선택적으로 결합하기 때문에, 핵산에 대한 포스파타제의 활성을 측정하기에 매우 적합하다.
즉, 본 발명에 따른 형광 프로브를 사용하여 기질의 형광 편광도의 변화를 측정하면, 기질의 인산기 함량을 측정할 수 있으며, 기질의 탈인산화 반응을 분석하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 형광 프로브를 사용하여 형광 편광도를 측정하는 경우, 실제 생체 내에서 탈인산화 반응의 기질로 사용되는 DNA, RNA 및 단백질과 같은 생고분자 (biopolymer)에 대한 포스파타제의 활성을 측정할 수 있다.
일반적으로, 포스파타제는 DNA를 기질로 이용할 경우에는 DNA 5'-말단의 인산기를 제거하는 반응을 촉매하고, 단백질을 기질로 사용할 시에는 단백질 내의 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 혹은 타이로신 (tyrosine)에 붙어있는 인산기를 제거하는 반응을 촉매하는 효소이다. 따라서, 기질인 DNA나 단백질에 본 발명에 따른 형광 프로브를 가하고, 여기에 포스파타제를 가하여 지정된 완충 용액 내에서 탈인산화 반응을 시키면, 반응 전후의 형광 편광도가 변화하게 된다. 즉, 탈인산화 반응이 진행되기 전에는 형광 프로브가 기질의 인산기에 결합하여 있기 때문에 형광 편광도가 프로브 자체의 형광 편광도 값보다 증가해 있다가, 탈인산화 반응이 진행됨에 따라 점차 기질로부터 분리된 자유-인산 (free-phosphate)의 양이 증가하게 됨으로써, 인산에 결합된 형광 프로브의 양도 증가하게 되고, 결과적으로 전체적인 반응 용액의 형광 편광도가 감소하게 된다. 본 발명에 따른 방법을 이용하면, 포스파타제의 기질로 이용하는 생고분자들이 본 발명에 따른 형광 프로브와 분자의 크기 차이가 많이 나기 때문에, 기질에 별도의 공유 결합에 의한 형광 표지를 사용하지 않고도, 손쉽게 형광 편광도의 변화 신호를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 형광 프로브를 사용하여, 탈인산화 반응에 대한 포스파타제의 활성은 예를 들어 다음과 같이 분석할 수 있다.
먼저, pH 7 내지 10의 범위에서, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM 다이싸이오트레이톨 등과 같은 완충 용액 중에서, 인산기-선택적인 형광 프로브를 기질과 혼합하여, 20 내지 37℃의 온도에서 상기 형광 프로브를 기질의 인산기에 결합시킨다. 상기 기질은 DNA, RNA 또는 인산기를 포함하는 단백질 등을 포함한다. 이 경우, 상기 기질과 상기 형광 프로브의 혼합 비율은 통상적이며, 바람직하게는 1 : 1 내지 2 : 1 몰 비이다.
이어서, 상기 형광 프로브가 결합된 기질을 포함하는 반응 용액의 형광 편광도 값을 측정한다. 이때, 형광 편광도 값은 형광 분광 광도계 등의 장치를 이용하여 측정할 수 있다.
이어서, 상기 반응 용액에 포스파타제를 첨가하여 탈인산화 반응을 20 내지 37℃의 온도에서 수행하면서, 상기 반응 용액의 형광 편광도 값을 측정한다. 이 경우, 상기 형광 프로브가 결합된 기질과 포스파타제의 혼합 비율은 통상적이며, 바람직하게는 기질 500 nM 당 포스파타제 0.01 내지 1 unit 이다.
상기 반응 용액의 형광 편광도 값은 탈인산화 반응 도중에 측정할 수 있으며, 또는 반응이 완료된 후에 측정할 수도 있다. 또한, 중간에 효소 반응을 멈추지 않고 처음부터 반응의 끝까지 용액의 탈인산화 반응을 실시간으로 측정할 수도 있다.
이와 같이 상기 탈인산화 반응 전/후의 상기 반응 용액을 측정한 후, 측정된 형광 편광도 값을 비교하면 포스파타제의 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있다.
또한, 상기와 같이 하나의 포스파타제의 활성을 분석하는 것이 아니라, 96 혹은 384 웰 플레이트 (well-plate)를 이용하여 다양한 종류의 포스파타제의 활성을 한 번에 분석할 수 있으며, 이외에도 특정 포스파타제에 대한 다수의 저해제를 분석할 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인산기 -선택적인 형광 프로브 ( phos - tag - Zn - TMR )의 합성
Figure 112008000861917-pat00009
문헌(Kinoshita et al. Mol. Cell. Proteomics, 2006, 5, 749; Kinoshita et al. Dalton Trans . 2004, 1189)에 기재된 방법에 따라 제조한 phos-tag 유도체 (50 mg)를 DMSO에 녹여 50 mM의 용액을 제조하였다. 생성 용액 (40 mL)에 보락스 (borax, Na2B2O7, 16 mg), 물 (1 mL) 및 2-아미노에탄싸이올 하이드로클로라이드 (5 mg)을 가한 다음, 반응 용액을 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 역상 (C18) HPLC (컬럼- 애질런트 테크놀로지 (Agilent Technology), 이클립스 (Eclipse) XDB-C18, 완충용액 A - 0.1% 트라이플루오로아세트산 수용액 (0.1% trifluoroacetic acid in H2O), 완충용액 B - 아세토니트릴 중의 0.1% 트라이플루오로아세트산을 사용하여 말단 아미노기를 갖는 화학식 A의 화합물을 분리하였다.
MALDI-TOF MS : [M+H] = 672.
이어서, 화학식 A의 화합물을 다시 DMSO에 녹여 혼합 용액 (20 mM, 50 mL)을 제조하고, 여기에 테트라메틸로다민 석신이미딜 에스터 (tetramethylrhodamine succinimidyl ester, TMR-SE) (DMF 중의 10 mM, 50 mL) 및 20 mM Na2CO3 용액 (200 mL)을 가한 후, 상온에서 약 16시간 동안 반응시켰다. 이어서, 역상 (C18) HPLC (컬럼- 애질런트 테크놀로지, 이클립스 XDB-C18, 완충용액 A - 0.1% 트라이플루오로아세트산 수용액, 완충용액 B - 아세토니트릴 중의 0.1% 트라이플루오로아세트산)로 분리하여 화학식 2 의 화합물 (약 100 nmol)을 수득하였다. 이 화합물에 대해 MALDI-TOF MS 질량 분석기로 분석하여 분자량 1084 Da을 확인하였다. 화학식 2의 화합물을 2당량의 Zn(OAc)2 수용액에 가하여 인산기-선택적인 형광 프로브 phos-tag-Zn-TMR을 수득하였다.
1H NMR (화합물 B, 300 MHz, DMSO-d6) d 9.12 - 9.04 (1H), 8.97 (1H), 8.78 - 8.70 (2H), 8.62 - 8.54 (3H), 8.30 - 8.33 (1H), 8.23 - 8.14 (2H), 7.94 - 7.84 (3H), 7.64 - 7.39 (9H), 7.06 - 7.02 (4H), 7.00 (2H), 4.42 -4.10 (8H), 3.39 - 3.16 (7H), 3.29 (12H), 2.91 - 2.73 (4H), 2.59 -2.44 (4H), 2.32 - 2.28 (2H).
실시예 2: 인산기-선택적인 형광 프로브(Benz-dipy-Zn-TMR)의 합성
Figure 112008000861917-pat00010
문헌(국제 특허 제 WO/2004099233 호)에 기재된 바와 같이 제조한 화학식 C의 화합물(10 mg)에 에틸렌 디아민(2 당량)과 에탄올(5 mL)을 첨가하고, 78℃로 3시간 동안 가열한 다음 냉각하였다. 이어서, 회전 증발기로 용매를 증발시킨 후, 역상 (C18) HPLC (컬럼- 애질런트 테크놀로지, 이클립스 XDB-C18, 완충용액 A - 0.1% 트라이플루오로아세트산 수용액, 완충용액 B - 아세토니트릴 중의 0.1% 트라이플루오로아세트산)로 분리하여 화학식 D의 화합물을 수득하였다.
1H NMR (화합물 D, 300 MHz, CDCl3) d 8.51 (4H), 7.86 (2H), 7.63 - 7.46 (9H), 7.12 (4H), 3.85 - 3.69 (12H), 3.57 (2H), 3.00 (2H).
이어서, 화학식 D의 화합물을 다시 DMSO에 녹인 후, 생성 용액(20 mM, 50 mL)에 테트라메틸로다민 석신이미딜 에스터(TMR-SE, DMF 중의 10 mM, 50 mL)와 20 mM Na2CO3 용액 (200 mL)을 가하고, 상온에서 약 16시간 동안 반응시킨 후, 역상 (C18) HPLC (컬럼- 애질런트 테크놀로지, 이클립스 XDB-C18, 완충용액 A - 0.1% 트라이플루오로아세트산 수용액, 완충용액 B - 아세토니트릴 중의 0.1% 트라이플루오로아세트산)로 분리하여 화학식 E의 화합물(약 80 nmol)을 수득하였다. 수득된 화합물을 MALDI-TOF MS 질량 분석기로 분석하여 분자량이 999 Da임을 확인하였다. 상기 화학식 E의 화합물을 2 당량의 Zn(OAc)2 수용액에 가하고 교반하여 인산기-선택적인 형광 프로브 Benz-dipy-Zn-TMR을 수득하였다.
실시예 3: 포스파타제와 인산화된 DNA 간의 탈인산화 반응 분석
5'-말단에 인산화된 DNA 올리고머 용액 (5'-p-(dT)20, 최종 농도 400 nM)과 상기 실시예 1에서 제조한 인산기-선택적인 형광 프로브 용액(phos-tag-Zn-TMR, 최종 농도 400 nM)을 반응 완충 용액 (NEBuffer 2, pH=7.9, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 미국)과 혼합하여, 혼합 용액 (500 mL)을 제조하였다. 상기 혼합 용액에 CIP (calf intestinal alkaline phosphatase, 0.1 U, New England Biolabs, USA)를 가한 후, 상온 (25℃)에서 5분 동안 유지시켰다. 포스파타제인 CIP를 가한 직후부터 퍼킨-엘머 LB50B 형광 분광 광도계 (Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer)를 이용하여 형광 편광도를 연속적으로 실시간으로 측정하고 도 1에 나타내었다.
실시예 4: 포스파타제와 인산화된 단백질간의 탈인산화 반응 분석
α-카제인 (α-casein, 최종 농도 300 nM)과 실시예 1에서 제조한 인산기-선택적인 형광 프로브 용액 (phos - tag - Zn - TMR,최종 농도 300 nM)을 반응 완충 용액 (NEBuffer 2, pH=7.9, New England Biolabs, USA)과 혼합하여, 혼합 용액 (500 mL)을 제조하였다. 상기 혼합 용액에 CIP (1 U, New England Biolabs, USA)을 가한 후, 상온 (25℃)에서 15분 동안 유지시켰다. 포스파타제인 CIP를 가한 직후부터 퍼킨-엘머 LB50B 형광 분광 광도계를 이용하여 형광 편광도를 연속적으로 실시간으로 측정하고 도 2에 나타내었다.
실시예 5: 포스파타제와 인산화된 단백질간의 탈인산화 반응 분석
α-카제인(α-casein, 최종 농도 300 nM)과 실시예 2에서 제조한 인산기에 선택적으로 결합하는 형광 프로브 용액 (benz - dipy - Zn - TMR, 최종 농도 300 nM)을 반응 완충 용액(NEBuffer 2, pH=7.9, 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국)과 혼합하여, 혼합 용액 (500 mL)을 제조하였다. 상기 혼합 용액에 CIP(1 U, New England Biolabs, USA)을 가한 후, 상온 (25℃)에서 15분 동안 유지시켰다. 포스파타제인 CIP를 가한 직후부터 퍼킨-엘머 LB50B 형광 분광 광도계를 이용하여 형광 편광도를 연속적으로 실시간으로 측정하고 도 3에 나타내었다.
도 1 내지 3을 참고하면, 본 발명에 따른 인산기-선택적인 형광 프로브를 사용하여, DNA 및 단백질과 같은 기질에 대한 포스파타제의 활성을 실시간으로 측정 할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 Phos-tag-Zn-TMR 형광 프로브를 이용하여, 포스파타제와 인산화된 DNA (5'-p-(dT)20) 간의 탈인산화 반응에 대한 형광 편광도의 변화를 실시간으로 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 Phos-tag-Zn-TMR 형광 프로브를 이용하여, 포스파타제와 인산화된 단백질(α-casein) 간의 탈인산화 반응에 대한 형광 편광도의 변화를 실시간으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 Benz-dipy-Zn-TMR 형광 프로브를 이용하여, 포스파타제와 인산화된 단백질(α-casein) 간의 탈인산화 반응에 대한 형광 편광도의 변화를 실시간으로 나타낸 그래프이다.

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  9. 하기 화학식 1 또는 4의 인산기 결합성 물질, 형광 물질 및 금속 이온을 포함하는 인산기-선택적인 형광 프로브와 기질을 반응시킨 후 형광 편광도의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는, 포스파타제 활성 측정 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112009078891534-pat00018
    [화학식 4]
    Figure 112009078891534-pat00019
    상기 식들에서,
    R1은 아미노, 하이드록실, 싸이올, 카르복실, 카르보닐, 비닐 및 알릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고,
    R2 및 R3은 에틸렌 글라이콜릴 에테르 (-(CH2O)n-) (이때, n은 3 이하의 정수이다), 지방족 탄화수소 (-(CH2)m-) (이때, m은 3 이하의 정수이다) 및 아미드 (-CONH-)기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이다.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 기질이 DNA, RNA 및 인산기를 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 생고분자인 것을 특징으로 하는, 포스파타제 활성 측정 방법.
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서,
    (1) 완충 용액 중에서, 상기 인산기-선택적인 형광 프로브를 기질과 혼합하여 상기 형광 프로브를 기질의 인산기에 결합시킨 후, 상기 형광 프로브가 결합된 기질을 포함하는 반응 용액의 형광 편광도 값을 측정하는 단계;
    (2) 상기 반응 용액에 포스파타제를 첨가하여 탈인산화 반응을 수행하면서, 탈인산화 반응 도중 또는 반응이 완료된 후 상기 반응 용액의 형광 편광도 값을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 탈인산화 반응 전/후의 상기 반응 용액의 형광 편광도 값을 비교하는 단계
    를 포함하는, 포스파타제 활성 측정 방법.
  13. 삭제
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