JPS62269070A - 抗原または抗体の濃度を測定する方法 - Google Patents

抗原または抗体の濃度を測定する方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、生体液中を循環する抗原まｋは抗体の濃度を
測定する方法およびハプテンの濃度を測定する方法に関
する。
「従来の技術及び問題点」 液相および固相免疫測定方法並びにこれらの変形および
変法は、循環する抗原および抗体のホストの測定につい
ての文献において記載されてき１こ。
１つまたはそれ以上の免疫測定方法技術に関し、米国ま
たはその他の国において数々の特許が出されている。抗
原およびハプテンの測定においては、拮抗的な二抗体放
射性免疫測定法が実質的に８Ｒ要な役割を果している。
この方法は感度ら再現性６良いが、抗原と結合した抗体
から結合しなかった抗原またはハプテンを分離するため
に遠心操作が必要である。この方法は、−次の液相動力
学を用いるが、ポリエチレングリコールを触媒とする第
二抗体に依拠する。そこで、この方法においてはいくつ
かの欠点が必然的となる。即ち（ａ）同位体標識のため
に高度に精製された抗原またはハプテンがどうしても必
要であり、また（ｂ）トレーサの不純物と不安定性およ
び／またはポリエチレングリコール−第二抗体の分離に
一部依拠して極めて非特異性のある結合が起る。
拮抗的な二抗体酵素免疫測定方法は、前記方法に比べは
るかに小規模で使用されている。抗原またはハプテンの
酵素標識は、それらの同位体標識に比べてはるかに安定
であるけれども、かかる測定方法においては、非特異的
な結合が生じて何度も洗浄する必要があり、そのために
、感度および再現性を落す結果となっている。
前記の二重抗体拮抗型の測定方法においては、蛍光物質
または化学発光物質標識を用いた場合でも、非特異的な
結合や感度の低さ、再現性といった固有の問題を十分に
解決することができない。
米国特許第３，８１７，８３７号に記載されている均−
系の酵素免疫測定方法は、拮抗的な二抗体放射免疫測定
に対する上述した非特異的な結合問題を部分的には解決
した。しかしながら、前記米国特許第３．８１７．８３
７号の方法は、体液中にかなり高濃度で存在する低分子
量のハプテン（不完全抗原）に限られている。
米国特許第４，４２０，５６８号に記載された蛍光偏光
拮抗免疫測定方法は、米国特許第３，８１７，８３７号
に記載された感度問題の大部分を解決することに成功し
た。しかしながら、その応用は低分子量の分子に限られ
ている。以来、他の拮抗的な蛍光免疫測定方法が高分子
量の抗原に対し報告されているが、蛍光偏光法と同様、
実施のために特殊な装置が必要である。
拮抗的な固体相免疫測定方法は、この過去１０年で使用
されるようになり、低分子量のハプテンと分子量３０，
０００（ドルトン）以下のいくつかの高分子量の抗原に
対して拮抗的な二抗体法に次第にとってかわっている。
このような同位体を用いた拮抗的な固体相免疫測定方法
は、液相免疫測定方法にともなう非特異結合の問題を実
質上なくしたが、固体支持体上の立体障害に一部依拠す
る高分子量の抗原に対しては応用することができない。
固体相非同位体拮抗免疫測定方法は、同様な固体支持体
上の立体障害の問題があり、酵素標識の場合には、標識
それ自体の大きさが立体的な問題に加わる。本発明は、
拮抗的な固体相免疫測定方法に固有な固相支持体の立体
障害問題を解決しようとするものである。高分子量で多
価の抗原および抗体を測定するために、固体相免疫学的
放射能および非放射能測定方法が十分に開発されてきた
。
いくつかの方法が報告されており、最近、米国およびそ
の他の国の特許のいくつかにおいてかかる分析技術の種
々の態様が記載されている。
米国特許第３，６５４，０９０号は、多価の抗原を検出
するための逐次的二段階免疫測定方法の最も初期の技術
のひとつである。以来、上記特許の基本的技術の変法が
放射能または非放射能信号を発生するプローブを用いて
高分子量の抗原を測定するために応用されている。この
ような方法はイムノメトリック法と呼ばれている。
イムノメトリック法において、同一の抗原に対して異な
る種において生起する２種類のポリクローナル抗体（ひ
とつは固体支持体に固定化され、第２のものは信号発生
プローブで標識されている。
）を用いると、測定感度が上がり、パックグラウンド信
号がある程度減少することが分計的見地から確認され、
その方法が確立されている。米国特許第４，３７６．１
１０号は、イムノメトリック法において多価の抗体上の
２種の異なるエピトープに対し２種のモノクローナル抗
体を使用することを教示している。これとは異なり、米
国特許第３，６５４，０９０号、米国特許第４，３７６
．１１０号は、同時インキュベーション（非段階測定シ
ステム）を採用している。
同様に、米国特許第４，４７４，８９２号も、同一の抗
原に対して異なるクラスまたはサブクラスのモノクロー
ナル抗体を用いる２部位イムノメトリック法を記載して
いる。これらの上記方法は、十分な感度、特異性および
バックグラウンド信号のある程度の低減を達成するが、
抗体を固体支持体に固定し、固体相型の反応とするため
に、全て反応速度が遅くなるという問題を生ずる。固体
相反応が液相反応より遅いということははっきりと確認
されており、また、固定化に先立って、固定化される抗
体が高い親和性定数を持つものであったとしても、非常
に低いバックグラウンド比を持つということも十分知ら
れている。このことは大部分、固体支持体上の立体障害
効果が大きいためである。
このような方法にあっては、固定化される抗体の量並び
に第二の抗体に結合され信号を発生するプローブの濃度
および特異的な活性を最適に合わせないと、いわゆる　
“高濃度域のフック現象”が起ってしまい、かかる方法
の信頼性および有効性を損う結果となってしまう。
イムノメトリック法の更なる欠点は抗体を固定化する工
程のバッチ間のバラツキである。米国特許第４，４９６
，６５４号は、抗体の固定化におけるバラツキについて
論じ、最初にアヒジンを固体支持体上に固定化し、次い
で、この支持体とビオチニル化した抗体とを反応させ固
体相抗体支持体を形成すると、均一な固定化が達成され
ることを教示している。しかしながら、かかる開示され
た変法においても、反応速度の遅さと、　“高濃度域の
フック現象“の危険性は避けられない。本発明は、これ
らイムノメトツク法に特有のこれら欠点を解消せんとす
るものである。
従来の抗原を検出するためのイムノメトリック法の変法
は、イムノツルバントのような固定化された抗原を用い
ることにより、特異的な抗体を測定するためにも拡張さ
れている。このような技術の注目に値する応用は、アレ
ルゲン特異性免疫グロブリンＩｇＥ　　（レアギン性免
疫グロブリン）の検出のために広く用いられている。歴
史的には、特異的なアレルゲン試験は、米国特許第３，
７２０，７６０号およびその他の国における対応特許の
教示に従い、かかる特許においては、特異的なアレルゲ
ンは固体支持体（主として濾紙ディスク）に固定し、ア
レルゲン特異性免疫グロブリンＩｇＥを含有する可能性
のある被検試料と反応させる。最初のインキュベーショ
ン（通常２４時間）の後、血清成分に由来する特異的結
合を除くため固体支持体を洗浄し、次いで、固体支持体
を標識した抗−ＩｇＥ抗体と反応させる。固体支持体の
第２の洗浄工程の後、標識された物質の存在をチェック
する。この方法は広く普及しているが、いくつかの欠点
を持っている。即ち、固体相反芯であるために反応速度
が遅く、ＩｇＨに対し本来のアレルゲンと同一の結合特
性を存する固定化されたアレルゲンを生成することが困
難なこと、さらに、固体相アレルゲンの製造におけるバ
ッチ間のバラツキがあることである。　最近、Ａａｌｂ
ｅｒｓｅらは、ラジオアレルゴソルベント試験型測定方
法における固体相に結合された抗原に代えてハプテンで
修飾した抗体を使用することを記載している　（」、ｔ
ｍｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　８７：５１５７　（１９８６）
　）。かかる方法においては、特異的なアレルゲンＩｇ
Ｅを含有する可能性のある被検試料をトリニトロベンゼ
ンスルホン酸（ＴＮＰ）で修飾した特異的なアレルゲン
と２時間反応さけ、次いで、固体相に結合された抗ＴＮ
Ｐと一晩反応させて、ＩｇＥ−アレルゲン−抗Ｔ　Ｎ　
Ｐ　複合体を形成する。この固体相を洗浄した後、再度
ｌ＋５　　（−抗ＩｇＥ抗体と反応させ再洗浄し、被検
試料中のアレルゲン特異性１ｇＥの濃度に正比例する１
２５【同位体の存在をカウントする。このアブローヂに
おいて、著者は、最初の反応で液相の反応動力学の利点
を活用したと主張しているが、アレルゲンのＴＮＰ標識
の程度を立証できていない。アレルゲンをハプテン例え
ばＴＮＰで直接標識することは、標識の過程で標識され
ていない必須アレルゲン成分を見落す可能性があり、し
たがって、上記方法においては、定量することができな
い。さらに、この方法では反応時間が２日であり、この
点でも米国特許第３，７２０．７６０号に記載された方
法と比べて反応時間が長く改善されていない。
本発明は、従来のアレルゲンテストおよびその改良法に
とらなう問題点を解消せんとする乙のである。
「問題点を解決するための手段」 本発明は、新しい方法を用いる生物体液中で循環する抗
原または抗体の測定に関するものである。
本明細書中において記載する方法は、まず所定のリガン
ドで実質的に標識されている可溶性マトリックスまたは
バックボーンに化学的に結合された特異的な抗原または
抗体を使用する。そして被検試料との最初の液相反応の
後、被検抗原または抗体と信号発生プローブで標識され
た抗−抗原または抗−抗体との間で形成される免疫複合
体を、液体マトリックスに結合したリガンドに対する抗
リガンドを含有する固体支持体上でそのまま固定するこ
とを特徴とするものである。
「作用」 所定のリガンドで実質的に標識された液体可溶性マトリ
ックスに対し抗原または抗体を結合させる本方法は、少
なくとも２つの明確な目的に役立つ。
（ａ）液体マトリックスに結合されるリガンドがごく少
数でも免疫複合体全てが効果的に完全に固定化されるの
で、抗リガンドを介して固体支持体上に固定化されるこ
とのできる免疫複合体の数が大きく増大する。本明細書
中で記載するように液体マトリックスを使用することな
く抗原または抗体を所定のリガンドで直接標識すると抗
リガンドにより固体支持体に固定化される免疫複合体の
数が制限される。
何故ならば、少数の抗原または抗体のみが所定のリガン
ドで標識されまた標識されてぃなＣ）抗原または抗体か
らリガンドで標識された抗原または抗体を分離するため
の高度なアフィニティークロマトグラフィ技術を使用す
る必要が生じるからである。
（ｂ）最初の反応で液相の反応動力学を用いる有用性が
明らかである。何故ならば、これにより液体マトリック
スに結合した抗原または抗体と信号を発生する標識され
た抗−抗原または抗−抗体との間の免疫腹合体の形成が
促進されるからである。
液相の反応動力学が必要ない場合には、本発明の教示は
、抗原または抗体を液体マトリックスに結合し、前記マ
トリックスを所定のリガンドで標識し、次いで、前記マ
トリックスを抗リガンドを含有する固体支持体上予め反
応させることにより、有効な固体相マトリックスを製造
するために用いることができる。
次に上記概要の本願発明をそのいくつかの分析スキーム
を以下に示すことによりさらに詳しく説明する。
スキーム■：非段階的測定方法 所定の抗原または抗体を含有する可能性のある被検□試
料を、液相中で標識されたリガンド−抗体または標識さ
れたリガンド−抗原と、それらとは異なるように標識さ
れた特異的な抗−抗体または標識された特異的な抗−抗
原の存在下で反応させる。液相中の免疫腹合体を、液体
マトリックスを介して特異的な抗原または抗体に結合し
たリガンドに対する固体支持体上の固定化された抗リガ
ンドと反応させる。次いでこの固体相を洗浄し、抗−抗
原または抗−抗体に結合した標識発生信号をチェックす
る。抗原または抗体の検出に対し適用した本方法を下記
に図式的に示す。
（ａ）抗体検出の非段階的測定方法 洗浄およびＺのチェック 図中に於いて Ａｂ、＝測定される循環する抗体 Ａｇ　＝液体マトリックスに共有結合されたＡｂ、に対
する特異的な抗原 Ｘ＝液体マトリックスに共有結合されたリガンド Ｙ＝固体支持体に共有結合または受動的に結合れた抗リ
ガンド Ｚ＝信号発生標識（酵素、放射性活性標識。
蛍光性化合物、化学発光性化合物、生物発光性化合物ま
たは酵素の基質） ・・・・・−液体マトリックス 抗体Ａｂ、の濃度はＺにより発生する信号に正比例する
。
（ｂ）抗原検出の非段階的測定方法 固体相を再洗浄し、循環するＡｇの濃度がＺによって発
生される信号Ｚに正比例するＺをチェックする。
スキームロ：段階的測定方法 段階的測定方法においては、被検試料をリガンドで標識
した抗原または抗体と反応させ、次いで固体相流リガン
ドと接触させ特定の時間反応させる。続いて、固体相を
洗浄し、信号発生プローブで標識した抗−抗原または抗
−抗体と再度反応さ仕る。固体相を再び洗浄し、信号発
生プローブに対しチェックする。以下にかかる概念を概
略的に示す。
（ａ）抗体検出の段階的測定方法 Ｚをチェックする。
（ｂ）抗原検出の段階的測定方法 ハｏ　　　　　　　Ａ［）　　　　　ＡＩ）［］−ｙ　
−ｘ・拳・・・・・拳・・・・・・・・・・・・・・・
・固体相を洗浄し、Ｚをチェックする。
スキーム■：ハプテンの検出：拮抗的測定方法ハプテン
検出の場合、所定のハプテンに対する抗体を液体マトリ
ックスまたはバックボーンに化学的に結合さけ、次いで
リガンドで標識する。上記のハプテンを含有する可能性
のある被検試料を、液相でリガンドで標識された抗体を
含む液体マトリックスと、以下に示すように、ハプテン
で標識されたプローブ（１−１−Ｚ）の存在下で反応さ
せる。
所定の時間内にリガンドで標識された抗体上の結合部位
に対する被検ハプテンと標識されたハプテンプローブと
の間の拮抗が起こる。次いで、固体相を含有する液体マ
トリックスに結合したリガンドに対する固体支持体」二
に固定化された抗リガンド壱添加する。固体相を洗浄し
、被検試料中のハプテンの濃度に反比例するハプテンで
標識されたプローブの存在をチェックする。
固体相を洗浄しＺをチェックする。
ある種のハプテンに対しては、ハプテンで標識した信号
発生プローブが高分子蛾の特にある種の標識である場合
には、生じ得る立体障害を回避するために液体マトリッ
クスを用いることなくリガンドを直接ハプテン抗体に結
合するのが有１１であることらある。
特異的な抗原または抗体を結合さ什る几めに液体マトリ
ックスまたはパックホーンを用い、次いで前記バックボ
ーンを所定のリガンドて標識するのが本発明の好ましい
実施態様である。当業者であれば、前記マトリックスに
対する結合の様式または順序を変えることは容易に想到
することができるであろう。
可溶性の抗原または抗体の液体マトリックスの調型。
以下の一連の反応は、所定の抗原または抗体と特異的な
リガンドを含有する液体マトリックスまたはバックボー
ンのための種々の反応スキームである。これら一連の反
応において、可溶性ポリマは種々の化合物で活性化され
、種々の機構により反応せしめられる。活性化されたポ
リマ・マトリックスは、抗原または抗体に直接結合され
る場合もあるし、ポリペプチドポリマまたはコポリマを
介して間接的に抗原または抗体に結合され、次いでこれ
に抗原または抗体が共有結合される場合もある。マトリ
ックス−抗原もしくは抗体複合体またはマトリックス−
ポリペプチド／コポリマー抗原もしくは抗体複合体は、
然る後、リガンドで直接または予め標識されたリガンド
鎖で間接的に標識される。これらの例で使用されるリガ
ンドはビオチンであり、かつ抗リガンドはアビジンであ
る。
池の使用し得るリガンド−抗リガンドの組合せについて
は、可能な他のリガンドについての記載部分において言
及する。
叉裟ジ安ヒ二脇」− かかる反応手順においては、２つの可溶性炭水化物を用
いた。即ち、（ｉ）分子量６，０００〜８０，０００（
ドルトン）の可溶性デキストランおよび（ｉｉ）分子量
７０．０００〜４００，０００（ドルトン）の可溶性フ
ィコール。
これら２つの炭水化物は以下の実施例中でも用い、マト
リックス−ＯＨで表わす。以下の実施例で使用したアミ
ノ酸コポリマは（ａ）ポリリジン、フェニルアラニン、
（ｂ）ポリリジン、アラニン、（Ｃ）ポリグルタミン酸
、グルタミン酸エステル、（ｄ）ポリグルタミン酸、ア
ラニン、リジン、チロシンなど多数のコポリマの例から
選択することができる。当業者であれば、他のアミノ酸
コポリマも容易に想到することができるであろう。
反応手順！ａ ！、１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化
及びカップリング ＰＨ１０，０ｈ−蛋白質−Ｎ　Ｈｔ　＋　（抗原又は抗
体）■ ピル）カルボジイミドであり、・・・−はマトリックス
である。
反応手順ｔｂ アミノ酸コずリマーとＣＤＩ反応の使用・・・−０−Ｃ
−Ｎ−ＡＡＣ ・・・−〇−Ｃ−勺−ＡＡＣ”１白質−ボリリジンー交
−ビオチン「実施例」 以下に実施例を挙げるが本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
実施例１ 反応手順１ｂを用いた特異的なアレルゲンを含有するマ
トリックスの調製　； ＢｅＬｈｅｌｌ、Ｇらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　２５４　：　２５７２　、１９７９年）を改変した
上記ＣＤＩ活性化反応を、反応手順１ｂに従いアレルゲ
ンの調製に応用した。
以下にその手順を記載する。
（１）上記反応手順１に記載した１２４ｎＭのマトリッ
クス−ＯＨを、１，１′　−カルボニルジイミダゾール
（ＣＤ　Ｉ　）　１０．０１１！９を含むジメチルスル
ホキシド２．０峠に溶解し、室温で振盪しながら３０分
間反応させた。
（１１）　　アミノ酸コポリマ　（例えばグルタミン酸
、グルタミン酸エチルエステル）　７７０ｎＭをジメチ
ルスルホキシド２．０１に溶解し、上記（１）の反応混
合物に加え、振盪しながら、室温で２４時間反応させた
。
（山）上記（ｉ）の反応混合物を体積２倍の水で希釈し
、セファクリル−３００カラムでクロマト分離し、マト
リックス−コポリマ複合体を単離した。
（ｉｖ’）　　マトリックス−コポリマを含有する両分
を蒸留水に対して透析し、更に、ｐＨ５，０の酢酸緩衝
液に対して透析した。
（ｖ）　　透析したマトリックス−コポリマ複合体に、
凍結乾燥したアレルゲン抽出物２０．Ｏｘｙを加え、続
いてＮ−エチル−Ｎ’　　−（ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド（Ｅ　Ｄ　Ｃ）　０．１５Ｍを加え、
振盪しながら４℃で２４時間反応させた。反応のｐ　Ｉ
（は、かかる反応中ｐＨ５，０に保持した。次いで、反
応混合物をｐＨ８，１の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液に対して４℃で１２時間透析した。
（ｖｌ）マトリックス−コポリマ複合体をジメチルホル
ムアミドｌ　、　ＯｘＱに溶解したＮ−ハイドロキシス
クシンイミドビオチン７．３μＭと４℃で一晩反応させ
た。最終反応混合物をセファクリル−３００カラムでク
ロマト分離し、マトリックス−コポリマーアレルゲン−
ビオチン複合体に対応する画分を集め、以下に詳述する
ようにアレルゲン活性をチェックした。
これとは別に、上記反応を改変した。かかる変法におい
ては、ビオチニル化したポリリジンを以下のように上記
工程（ｖｉ）においてマトリックス−コポリマーアレル
ゲン複合体と反応させた。ポリリジン　［分子量３，８
００（ドルトン）］１．８μＭとＮ−ハイドロキンスク
シンイミドビオチン１８０μＭをジメチルホルムアミド
１ｏｌＱに溶解した。ビオチニル化したポリリジンをＣ
Ｍ−セファロースカラムに吸着し、ＮａＣＱ　２．ＯＭ
を含有するｐＨ９，０の５０ｎＭ−ホウ酸ナトリウム緩
衝液で溶出した。ビオチニル化したポリリジン）夏合体
をｐＨ５，０に調製し、（ｖｉ）で記載したようにＥＤ
Ｃを用いてマトリックス−コポリマーアレルゲン複合体
と反応させ、クロマト分離し、マトリックス−コポリマ
ーアレルゲン−ポリリジン−ビオチン複合体を得た。
反応手順２ａ ノアノゲンブロマイド活性化及びカップリング・・・−
ＯＨ＋０Ｎ−Ｂｒ １Ｆ−ＰＨ１１，０ ・・・−〇−Ｃ三Ｎ ヒ蛋白質−ＮＨｚ ＨＨ 曙 ・・・−０−Ｃ−Ｎ−蛋白質−ポリリジン−Ｎ−ピオチ
ン反応手順２ｂ シアノゲンブロマイド反応とアミノ酸コポリマー（ＡＡ
Ｃ）の使用・・・−ＯＨ＋ＣＮ−Ｂｒ ヒーＰＨ１１，０ ・・・−０−Ｃ４Ｎ ↓アミノ酸コポリマー（ＡＡＣ） ・・・−０−ＣＮ−ＡＡＣ ＰＨ５，ＯＢＤＣ−ナー蛋白質−Ｎｌ−１ｔ・・・−０
−Ｃ−Ｎ−ＡＡＣ−蛋白質 実施例２ 反応手順２ｂを用いたアレルゲンを含有するマトリック
スの調製； Ｍａｒｃｈ、Ｓらの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　６０１４９．１９７４年）を改変した上記シアノゲン
プロマイド活性化反応を反応手順２ｂに従い特異的なア
レルゲンの調製に応用した。以下に記載する。
（ｉ）　　上記スキームｌで記載したように１２４ｍＭ
のマトリックス−ＯＨを２．０Ｍ炭酸ナトリウム２．０
１に溶解し、シアノゲンブロマイド溶液（２９のＣＮＢ
ｒ結品をアセトリトリルＬ、ＯｙＱに溶解したもの）１
００μｅと２分間ｐＨ１１，０で反応させ、さらに同様
のシアノゲンブロマイド溶液１００μｇと２分間反応さ
せた。
（ｉｉ）　　その後、直ちに、アミノ酸コポリマ３８５
μＭを上記（ｉ）に加え、室温で撹拌しながら、−晩反
応させた。
（ｉｉｉ）　　反応混合物をセファクリル３００カラム
でクロマト分離してマトリックス−コポリマ複合体を単
離し、蒸留水に対して透析後、ｐＨ５，０の酢酸緩衝液
に対して透析した。
（ｉｖ）透析したマトリックス−コポリマ腹合体に凍結
乾燥したアレルゲン抽出物２０ｘｇとＥＤＣＯ，１５Ｍ
とを加え、反応混合物をｐ）（ｓ、ｏに保持しながら、
４℃で２４時間反応させた。続いて、この反応混合物を
ｐＨ８，１の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液に対し
て、４℃で１２時間透析した。この後の反応手順は、実
施例１で記載した工程（ｖｉ）に従う。ビオチニル化さ
れたポリリジンを用いる変法も又、上記実施例１と同様
である。
（以　　下　　余　　白　） 反応手順３ａ ↓ ■（ １。
・・・−０−・・・・・・・・・−蛋白質一ボリリジン
ーＮ−ヒオチン反応手順３ｂ ＢＤＤＧＥ反応とアミノ酸コポリマー（ＡＡＣ）の使用
↓ ＨＨ ・・・−０−・・・・・・・・・・・−ＣＩ　２−）１
−Ａ　Ａ　Ｃ−蛋白質−ポリリジン−Ｎ−ビオチン実施
例３ 反応手順３ｂを用いた特異的なアレルゲンを含有するマ
トリックスの調製　； Ｓｕｎｂｅｒｇ、Ｌ、らの方法（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ、　９０８７１９７４年）を改変した上記ＢＤ
ＤＧＥ活性化反応を反応手順２ｂに従いアレルゲンの調
製に応用した。
以下に記載する。
（ｉ）　　反応スキーム１に記載したように、１５０ｎ
Ｍのマトリックス−ＯＨを０．２６ｍ　ＭのＮ　ａ　Ｂ
　ｌｌ　、を含有する０、３Ｍ水酸化ナトリウム溶液４
．ＯｍＱに溶解し、１．４−ブタンノオールージグリシ
ジルエーテル２．７ｍＭと室温で４時間反応させた。
（ｉｉ）　　上記（１）で活性化したマトリックスにア
ミノ酸コポリマ６００ｎＭを加え、４℃でさらに４時間
反応させた。次いで、反応混合物を蒸留水に対して透析
し、さらにｐＨ５，０の酢酸緩衝液に対して透析した。
（山）生成したマトリックス−コポリマー複合体に、凍
結乾燥したアレルゲン抽出物２（１；Ｏｉ９とＥＤ　Ｃ
Ｏ，１５Ｍとを実施例１の反応工程（■）におけるよう
に添加した。続いて反応手順は、実施例１の反応工程（
ｖｌ）に従う。これとは別のビオチニル化ボリノジンの
反応手順もまた実施例Ｉと同様である。
（以　　下　　余　　白　） 反応手順４ カルボキシメチル化反応 ・・・−ＯＨ＋クロル酢酸ナトリウム ■ ＯＨ ・・・−ＯＣＨ２ＣＮ　　　　ＡＡＣ ＰＨ５，ＯＥＤＣ−士一蛋白質−Ｎ　Ｈ２実施例４ 反応手順４を用いるアレルゲンを含有するマトリックス
の調製　； Ｉｎｍａｎ、Ｊの方法（Ｊ、Ｉｍ’ｍｕｎｏ１．１１４
　：　７０４（１９７５）を改変したカルボキシメチル
化による活性化反応を反応手順４に従い特異的なアレル
ゲンの調製に応用した。以下に記載する。
（１）反応スキームｌで記載したマトリックス−ＯＨ０
，３３μＭを０．３２ｍ１２の１．３５Ｍモノクロル酢
酸ナトリウム（蒸留水３００峠＋　５　Ｍ水酸化ナトリ
ウＡ　１３５Ｍ１２＋　−！−／クロ／ｌ／酢酸６４．
４９をｐＨ６，８４＝調製し、最終体積を蒸留水で５０
０１としたもの）に溶解した。この混合物を数分間激し
く混合した。
（ｉｉ）１０Ｍ水酸化ナトリウム８６μＱを加え、蒸留
水で体積を０．４３ｉρに調製し、４０℃で３時間反応
させた。
（ｉｉｉ）　　この反応混合物に２．０Ｍリン酸ナトリ
ウム１７．２μＱを加え、０．１Ｍの塩酸を用いて滴定
しｐＨ７，０に調製した。活性化されたマトリックスを
蒸留水に対して透析し、続いて、ｐＨ５，０の酢酸緩衝
液に対してさらに透析した。
（ｉｖ）　　次いで、カルボキシメチル−マトリックス
をアミノ酸コポリマ７７０　ｎ　Ｍと０．１５ＭのＥＤ
Ｃ存在下β°Ｈ５，０，４℃で２４時間反応させた。次
いで、反応混合物を蒸留水に対して透析し、続いて、ｐ
Ｈ５，０の酢酸緩衝液に対してさらに透析した。
（ｖ）凍結乾燥した特異的なアレルゲン２０ｍ９を０．
１５Ｍ　　ＥＤＣとともに工程（ｉｖ）におけるマトリ
ックス−コポリマ複合体に加え、実施例１の工程（ｖ）
におけるように反応させた。これ以後の反応手順は、実
施例１の反応工程（ｖｌ）に従い、これとは別のビオチ
ニル化されたポリリジンを用いる反応もまた実施例Ｉに
おけると同様である。
（以、下　余　白） 反応手順５ａ 過ヨウ素酸化反応 Ｎ　ａ　９　Ｈ４−才−蛋白質−Ｎ　Ｉ−１を反応手順
５ｂ アミノ酸コポリマーと過ヨウ素酸反応との使用ＮａＢＨ
４−に一アミノ酸コポリマー（ＡＡＣ）ＥＤＣ士蛋白質 実施例５ 反応手順５を用いた特異的なアレルゲンを含有するマト
リックスの調製： Ｎａｋａｎｅ、Ｐ、らの方法（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ
　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ。
２２　：　１Ｇ８４　（１９７４）を改変した過ヨウ素
酸化活性化反応を反応手順５ｂに従い特異アレルゲンの
調製に応用した。以下に記載する。
（ｉ）　　反応手順１に記載した１２４ｎＭのマトリッ
クス−ＯＨを０．３Ｍの炭酸水素ナトリウムにＰＨ８゜
１で溶解し、ＬＯｘ（ｌの０．２Ｍ過ヨウ素酸ナトリウ
ムと１時間室温で反応させた。
（ｉｉ）　　アミノ酸コポリ７５００ｎＭを加え、１５
０分間室温で反応させた。ナトリウムボロハイドライド
０．２６ｏ＋Ｍを加えて、シッフ塩基を安定化した。
（ｉｉｉ）　　マトリックス−コポリマ複合体を蒸留水
に対して透析し、更にＰＨ５，０の酢酸緩衝液に対して
透析した。次いで、実施例Ｉにおける反応工程（Ｖ）、
（ｖｉ）と同様の工程を行う。これとは別にビオチニル
化したポリリジンを用いた反応もまた実施例１に従う。
反応スキーム■ この反応スキームでは、可溶性のポリマを用いる。即ち
、（ｉ）分子量５．０００〜１２Ｇ、ＱＯＯ（ドルトン
）のボｉ）アクリル酸（ｉｉ）分子量１２０，０００〜
２４０，０００（ドルトン）のカルボキシル化されたポ
リアクリルアミド（カルボシル化度５０〜１００％）（
ｉｉｉ）分子量５゜０００〜２００．０００の反応性カ
ルボキシル基を有するポリペプチド又はコポリマ。これ
らの形態のポリマ及びコポリマの反応手順は同じである
。
ポリアクリル酸　　　　　カルボキシル化ポリ７クリル
７ミドＲ−Ｃ−々−蛋白質 〇 −Ｎ　−ヒドロキシスクシンイミドビオチン実施例６ 反応スキーム■を用いた特異的なアレルゲンを含有する
マトリックスの調製； （ｉ）　　ポリアクリル酸又はカルボキシル化したポリ
アクリルアミド０．Ｑ３３ｎＭを２．ＯｘＱの０．０１
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０に溶解した。０．１ＭのＥＤ
ＣとＯ，１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドをポリマ
溶液に加え、さらに凍結乾燥した特異的なアレルゲン抽
出物ＬＱ、Ｑａ＋ｇを加え、ｐＨを８．０に保持しなが
ら、室温で２４時間インキュベートした。
（ｉｉ）　　ポリマーアレルゲン複合体をセファデック
スｃ　−１００カラムでクロマト分離し、ｐＨ７，５の
０．０１Ｍリン酸緩衝液で溶出し、排除体積画分を集め
た。
（ｉｉｉ）　　集めた両分を遠心濃縮機で２，０＊Ｑま
で濃縮し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン０．
７３ｍＭと２時間室温で反応させた。
（ｉｖ）　　ポリマーアレルゲン−ビオチン複合体を　
ｐＨ７，５のＯ，０１Ｍリン酸緩衝液に対して４℃で１
８時間透析した。
リガンドと抗リガンドの選択 本発明に用いることのできる特異的なリガンドとそれら
に対する抗リガンドは、種々の化合物の中から選択され
る。ここに示す例は単に説明するために示したものであ
って、当業者であれば、それ以外のいかなるリガンド−
抗リガンドの組合せも容易に想到することができろであ
ろう。
リガンド　　　　　抗リガンド ハプテン　　　　　　　抗ハプテン ビオチン　　　　　　　アビジン フロオロセイン　　　　抗フロオロセインジニトロフェ
ノール　抗ジニトロフェノールアビジン　　　　　　　
抗アビジン ビオチン　　　　　　　抗ビオチン 牛血清アルブミン　　　抗牛血清アルブミンリガンドお
よび抗リガンドの上記例において、ここに記載した反応
手順は、反応容器例えば試験管中で行なわれ、次いで、
抗リガンドを含有する固体相支持体をその反応容器に入
れる。この場合の固体相支持体は、被覆されたビーズ、
浸漬スティック等である。
被覆したチューブ固体相法を用いるのも場合によっては
望ましい。何故ならば、操作および洗浄が容易であるか
らである。この場合、上記のリガンド−抗リガンドの組
合せは不適当となる可能性もある。その理由は、第１反
応を液相で行い、続いて固体相の分離を行うからである
。上記のリガンド抗リガンドの組合せを液相の第１反応
中で使用する必要がない場合には上記リガンド−抗リガ
ンドの組合せを効果的な固体相系の調製に使用すること
ができる。一方、液相の第１反応を、被覆されたチュー
ブのような同一の反応容器中で実施したい場合には、以
下に記載したような手法が可能である。
（１）　　可溶性マトリックスに結合したリガンドが、
アビジンであり、かつ固体相被覆チューブがアビジンで
被覆されている。アビジンを含有する免疫複合体−マト
リックスをアビジン被覆チューブに効果的に固定化する
ために、最初の液相反応が完結した後にビオチンを加え
る。これにより上記スキームＩ及びＨに示したようにマ
トリックス・・・・・・アビジン−ビオチン−アビジン
−目のような固定化された複合体が形成される。
（２）先に記載したように、液体マトリックスをビオチ
ニル化し、被覆された固体上の抗アビジン抗体を用いる
ことで、曲者の後者への固定化は最初の液相反応の後、
抗アビジン抗体とビオチニル化された液体免疫曳合体マ
トリックスの両方に結合する反応混合物にアビジンを添
加することにより達成される。これは下記の固定化され
た複合体を形成する。
マトリックス・・・・・・ビオチン−アビジン−抗アビ
ジン抗体−口 （３）先に記載したように液体マトリックスをビオチニ
ル化し、ビオチニル化された蛋白質例えば牛血清アルブ
ミンを用いることで、前者の後者への固定化は最初の液
相反応が生じた後、反応容器にアビジンを添加すること
により達成される。この場合、固体相には下記のような
免疫曳合体が形成される。
マトリックス・・・・・・ビオチン−アビジン−ビオチ
ン−血清アルブミン−２ この他、当業者であれば、他の可能な組合わせは容易に
想到することができるであろう。
実施例７ 本発明による循環する全１ｇＥ　　（レアギン免疫グロ
ブリン）の測定； 二種類のモノクローナル抗体を、精製１ｇＨに対して作
製し、Ｇａ１ｆｅ、ＧとＭｉｓｔｅｉｎ、Ｃの方法（Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓａｎｄ　Ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｉ
ｉｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｖ
ｏｌ、７３　Ｌａｎｇｏｎｅ、　Ｊ、ａｎｄ　Ｖａｎ　
Ｖｕｎａｋｉｓ。
Ｈ，、ｅｄｓ、　Ａ　ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（
１９８１）　ＰＰ　３−４６）を用いて、ＩｇＥ分子上
の相異るエピトープを識別することを確認した。各々の
抗体から１８０画分を、硫安沈澱の後、ＤＥＡＥ−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂにより精製する。一方の抗体は、Ｎ
ａｋａｎｅ、Ｐ、らの過ヨウ素酸方法（Ｊ、Ｉｌｉｓｔ
ｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ　２２１０８４（１９７
４）　）を用いてホースラディシュバーオキシダーゼに
結合させ、適当な濃度になるように、０．１５Ｍの塩化
ナトリウム０．０１％のチメロサール及び０．１％のヒ
ト血清アルブミンを含有するＰＨ７，０の０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液で試験溶液に稀釈した。ＩｇＨに対する第２
のモノクロナール抗体は反応スキーム■、実施例６で記
載したように、ポリアクリル酸に結合させ、実施例６に
記載した特異的なアレルゲンの代わりに精製したＩｇＧ
　２．９４ｎＭを用いてさらにビオチニル化した。　ポ
リアクリル酸−抗ＩｇＥ−ビオチン複合体は、上記の酵
素標識抗体と同じ緩衝液にて適当に稀釈する。
アビジンはＣａＬｔ、に、ａｎｄ　Ｔｒｅｇｇｅａｒ、
Ｇ、Ｗの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１５８　：　１５７０
　（１９６７）　）を用いて１／８インチのポリスチレ
ンビーズに固定化し、さらに凍結乾燥することによって
余分の水分を除く。
１０〜６００１０　／　ｘＱのＩｇＥ値を有する標準溶
液は、馬血清中に調製し、ＷＨＯ（世界保健機構）の５
ｅｃｏｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｆｅｒ
ｎｃｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎのヒト血清［ｇＥ　７
５１５０２に対して正規化した。
循環血中の全１ｇＥ試料をランダムに３０選び、以下の
様に測定した。　゛ Ｏ濃度標準液も含めてＩｇＥ標準溶液各１０μｌと各血
清試料１０μｅとを１２Ｘ７５ｆＪＩの試験管にピペッ
トで入れた。各々のチューブにポリアクリル酸−抗１ｇ
Ｅ−ビオチン複合体溶液１００μＱと酵素で標識したモ
ノクローナル抗１ｇＥ抗体溶液１００μｇとを加え、て
ばやく混ぜ、室温で３０分間インキュベートした。この
最初のインキュベーションの後、各チューブにアビジン
被覆ビーズをひとつずつ加え、室温で振盪しながらさら
に３０分間インキュベートした。ビーズを前述の抗体を
稀釈した緩衝液に０．５％のＴｗｅｅｎ　２０を含む洗
浄液で２回洗浄し、０．５ｘＱの酵素基質溶液（過酸化
水素３．５ｉ９．　Ｏ−フェニレンジアミン５．０１９
を０．１Ｍのクエン酸リン酸緩衝液Ｐ　Ｉ−１５，０に
溶解したもの）を加え、１０分間反応させた。０．５Ｍ
の硫酸０．５ｊｔＣを加えて呈色反応を停止きせ、分光
光度計で波長４９２ｎｍの吸収を測定した。標準曲線の
各点の吸収は、以下の表のようになった。
３０の血清試料の個々におけるＩｇＥ　濃度を上記標準
曲線から計算し、ファルマシア社にュージャージー州、
ビス力タウェイ）製の全１ｇＥ酵素測定法を用いて同じ
試料について測定したＩｇＥ　濃度と比較した。結果は
以下の通りであった。
ファルマシア法による平均値：　１１１Ｑ　ｌｕｎｇ本
方法による平均値　　　　：　８８１Ｕ／ｄ（本性によ
る測定値）　＝１．０４　Ｘ　　（ファルマシア法によ
る測定値）　−２，７１０／１１１２相関係数＝　０．
９６９０ 寡ｍ阿」一 本発明を用いたＩｇＥ特異性アレルゲンの測定；本発明
の実施態様を用いてＩｇＥ特異性アレルゲンの測定を行
なった。以下に詳細を記載する。
上記実施例７で記載したようにＰＨ７，０の０．０５Ｍ
リン酸緩衝生理食塩水に溶解させたマトリックス−アレ
ルゲン−ビオチン、マトリックス−アレルゲン−ＡＡＣ
−ビオチンまたはマトリックス−アレルゲン−ＡＡＣ−
ポリリジン−ビオチン２００μｇを被検血清またはアト
ピー血清標準液１００μＱに添加し、室温で２時間反応
させた。各チューブに、アビジン被覆ビーズをひとつ加
え、室温で６０分メカニカルシェーカー上２００ストロ
ーク／分で振盪反応させた。実施例７と同様にビーズを
２回洗浄し、上記と同様に緩衝液で稀釈したヤギ由来−
抗ＩｇＥ−ホースラディシュバーオキシダーゼ酵素標識
３００μρと更に６０分反応した。ビーズを２回再洗浄
し、実施例７で記載したのと同様の酵素基質溶液３００
μσと２０分間反応させ、０．５．ｗｄの０．５Ｍ硫酸
を加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した
。
以下の結果は、反応スキームＩ及び■で記載したような
種々のマトリックスに結合したアレルゲン群について得
られたものである。
（ａ）オオアワガエリ　（Ｇ６） 精製したオオアワガエリアレルゲン（Ｇ６）を（ｉ）反
応手順１ｂの実施例１に記載したようにポリグルタミン
酸、グルタミン酸エステルを介してフィコール７０に、
（１１）実施例６に記載したようにポリアクリル酸（Ｆ
ＡＡ）に、（ｉｉｉ）実施例６に記載したようにカルボ
キシル化したポリアクリルイミドに結合した。
ファルマシア社にュージャージー州ピスカタウェイ）製
のファデバスーラスト　（Ｐｈａ’ｄｅｂａｓ−Ｒａｓ
ｔ　）キットによって分類されているＧ６に対するクラ
ス■のアトピー血清を非アトピー血清で稀釈し、クラス
ＩＩＩ、　ＩＩＩ及びＩのアトピー血清をシュミレート
し、４つの他のアドビー試料及び１つの非アトピー血清
とともに上記プロトコールを用いて測定した。これらの
測定結果を以下に示す。
（ｂ）欅の木 精製した樺の木アレルゲン抽出物（Ｔ３）を、 （１）反応手順１ｂを用い実施例１に記載したようにア
ミノ酸コポリマーポリリジンフェニルアラニンを介して
フィコール７ｏに、（ｉｉ）　　反応手順２ｂを用い実
施例１に記載したようにポリグルタミン酸、アラニン、
リジン、チロシンコポリマを介してデキストラン８０に
、 （ｉｉｉ）　　反応スキーム■の実施例６に記載したよ
うにカルボキシル化したポリアクリルアミド（ＣＰＡ）
に 結合した。
ファルマシア社製のファデバスーラストキ。
トによって分類されたＴ３に対するクラス■のアトピー
血清を非アトピー血清で稀釈し、クラス■、■および■
のアトピークラスをシュミレートし、Ｔ３に対する２つ
のアトピー血清と１つの非アトピー血清とともに上記プ
ロトコールを用い測定した。以下に、これらの測定結果
を示す。
所定のアレルゲンに対して用いるマトリックス、コポリ
マー並びに反応スキームおよび手順の選択は個々のアレ
ルゲンの蛋白質量に依存し、当業者であればこれらの選
択は容易に想到し得るであろう。
本発明について詳細に説明したが、本発明はこれら具体
例のみに限定されるものではなく特許請求の範囲に記載
した発明こそが本発明の技術的思想であり、かかる発明
について法律的な保護権利を求めるものである。
「発明の効果」 本発明によれば、液体マトリックスに結合されるリガン
ドがごく少数であっても、免疫複合体全てが効果的に完
全に固定化されるので、抗リガンドを介して固体支持体
上に固定化される免疫複合率の数を大きく増大させるこ
とができる。また、本発明にあっては、第１反応を液相
の動力学に従って行うので、液体マトリックスに結合し
た抗原又よ抗体と信号を発生する標識された抗−抗原又
は抗−抗体との間の免疫複合体の形成を促進することが
できる。
出願人　ダイアグノスティック　プロダクッコーポレー
ション

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、被検試料と、液体マトリックスに担持されリガンド
    で標識された特異的な抗原または抗体とを前記抗原また
    は抗体と異なるように標識された特異的な抗−抗原また
    は標識された特異的な抗−抗体の存在下で反応させ、か
    くして形成された免疫複合体を、前記液体マトリックス
    を介して前記特異的な抗原または抗体に結合したリガン
    ドに対する固体支持体上に固定化された抗−リガンドと
    反応させ、然る後、固体相を洗浄し、前記特異的な抗原
    または抗体の濃度に正比例する前記抗−抗原または抗−
    抗体上の標識をチェックすることからなる抗原または抗
    体の濃度を測定する方法。 ２、前記標識が、酵素、放射性標識、蛍光性化合物、化
    学発光性化合物、生物発光性化合物または酵素基質であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗原ま
    たは抗体の濃度を測定する方法。 ３、前記液体マトリックスが、一連の可溶性の炭水化物
    、例えば分子量が６，０００〜８０，０００（ドルトン
    ）のデキストランまたは分子量が７０，０００〜４００
    ，０００（ドルトン）のフィコールから選ばれることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗原または抗体
    の濃度を測定する方法。 ４、前記液体マトリックスが、分子量が５，０００〜２
    ０，０００（ドルトン）の可溶性ポリマまたはコポリマ
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗
    原または抗体の濃度を測定する方法。 ５、前記リガンドで標識された抗原または抗体が、アミ
    ノ酸コポリマを介して前記液体マトリックスに共有結合
    で結合されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の抗原または抗体の濃度を測定する方法。 ６、前記液体マトリックスに結合したリガンドがアビジ
    ンであり、かつ前記固体相がアビジンで被覆された被覆
    チューブであり、ビオチンの添加により、免疫複合体マ
    トリックスが前記アビジン被覆チューブに効果的に固定
    化されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
    抗原または抗体の濃度を測定する方法。 ７、前記リガンドがビオチンであり、かつ前記固体相が
    抗−アビジン抗体で被覆された被覆チューブであり、ア
    ビジンの添加により、免疫複合体マトリックスが前記抗
    アビジン抗体被覆チューブに効果的に固定化されること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗原または抗
    体の濃度を測定する方法。 ８、前記リガンドがビオチンであり、かつ前記固体相が
    ビオチニル化された蛋白質で被覆された被覆チューブで
    あり、アビジンの添加により、免疫複合体が前記ビオチ
    ニルされた蛋白質被覆チューブに効果的に固定化される
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗原また
    は抗体の濃度を測定する方法。 ９、前記リガンドが、ハプテン、ビオチン、フルオロセ
    イン、ジニトロフェノール、アビジンおよび牛血清アル
    ブミンからなる群から選ばれ、かつ前記抗リガンドが、
    夫々、抗ハプテン、アビジン、抗ビオチン、抗フルオロ
    セイン、抗ジニトロフェノール、抗アビジンおよび抗牛
    血清アルブミンからなる群から選ばれることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の抗原または抗体の濃度を
    測定する方法。 １０、前記リガンドが、特異的な抗原または抗体に化学
    的に結合された可溶性マトリックスを介して特異的な抗
    原または抗体に共有結合されることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の抗原または抗体の濃度を測定する
    方法。 １１、前記可溶性マトリックスに担持されリガンドで標
    識されている抗原または抗体が、抗リガンドによって固
    体支持体に固定化されて、抗原または抗体固体相を形成
    することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗原
    または抗体の濃度を測定する方法。 １２、被検試料と、マトリックスに担持されリガンドで
    標識された特異的な抗原または抗体とを反応させ、次い
    で、前記マトリックスを固体支持体上に固定化された抗
    リガンドと接触させ、この固体支持体を洗浄し、それを
    前記抗原または抗体の標識と異なるように標識された抗
    −抗原または抗−抗体と反応させ、然る後、この固体支
    持体を洗浄し、前記特異的な抗原または抗体の濃度に正
    比例する前記抗−抗原または抗−抗体に結合した標識の
    存在をチェックすることからなる抗原または抗体の濃度
    を測定する方法。 １３、前記標識が、酵素、放射性標識、蛍光性化合物、
    化学発光性化合物、生物発光性化合物または酵素基質で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の抗
    原または抗体の濃度を測定する方法。 １４、前記液体マトリックスが、一連の可溶性の炭水化
    物、例えば分子量が６，０００〜８０，０００（ドルト
    ン）のデキストランまたは分子量が７００，０００〜４
    ００，０００（ドルトン）のフィコールから選ばれるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の抗原また
    は抗体の濃度を測定する方法。 １５、前記液体マトリックスが、分子量５，０００〜２
    ０，０００（ドルトン）の可溶性ポリマまたはコポリマ
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の
    抗原または抗体の濃度を測定する方法。 １６、前記リガンドで標識された抗原または抗体が、ア
    ミノ酸コポリマを介して前記液体マトリックスに共有結
    合で結合されることを特徴とする特許請求の範囲第１２
    項記載の抗原または抗体の濃度を測定する方法。 １７、前記リガンドが、前記特異的な抗原または抗体に
    化学的に結合された可溶性マトリックスまたはバックボ
    ーンを介して前記特異的な抗原または抗体に共有結合さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の抗
    原または抗体の濃度を測定する方法。 １８、前記可溶性マトリックスによって担持されリガン
    ドで標識された抗原または抗体が、抗リガンドにより固
    体支持体に固定化されて、抗原または抗体固体相を形成
    することを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の抗
    原または抗体の濃度を測定する方法。 １９、前記液体マトリックスに結合したリガンドがアビ
    ジンであり、かつ前記固体相がアビジンで被覆された被
    覆チューブであり、ビオチンの添加により、免疫複合体
    マトリックスが前記アビジン被覆チューブに効果的に固
    定化されることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記
    載の抗原または抗体の濃度を測定する方法。 ２０、前記リガンドがビオチンであり、かつ前記固体相
    が抗−アビジン抗体で被覆された被覆チューブであり、
    アビジンの添加により、免疫複合体マトリックスが前記
    抗アビジン抗体に効果的に固定化されることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１２項記載の抗原または抗体の濃度
    を測定する方法。 ２１、前記リガンドがビオチンであり、かつ前記固体相
    がビオチニル化された蛋白質で被覆された被覆チューブ
    であり、アビジンの添加により、免疫複合体が前記ビオ
    チニルされた蛋白質被覆チューブに効果的に固定化され
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の抗原
    または抗体の濃度を測定する方法。 ２２、前記リガンドが、ハプテン、ビオチン、フルオロ
    セイン、ジニトロフェノール、アビジンおよび牛血清ア
    ルブミンからなる群から選ばれ、かつ前記抗リガンドが
    、夫々、抗ハプテン、アビジン、抗ビオチン、抗フルオ
    ロセイン、抗ジニトロフェノール、抗アビジンおよび抗
    牛血清アルブミンからなる群から選ばれることを特徴と
    する特許請求の範囲第１２項記載の抗原または抗体の濃
    度を測定する方法。 ２３、被検試料と、リガンドで標識された特異的な抗体
    を含有するマトリックスとをハプテンで標識されたプロ
    ーブの存在下で反応させ、リガンドで標識された抗体の
    結合部位に対して被検ハプテンと標識されたハプテンと
    の間で所定の時間拮抗的な結合を生じさせ、次いで、前
    記リガンドに対する固体支持体上に固定化された抗リガ
    ンドを添加し、この固体相を洗浄し、被検試料中のハプ
    テンの濃度に逆比例する前記プローブの存在をチェック
    することからなるハプテンの濃度を測定する方法。 ２４、前記リガンドが、いかなる状態にあっても、前記
    特異的な抗体を化学的に結合させた可溶性液体マトリッ
    クスまたはバックボーンを介して所定のハプテンに対す
    る前記特異的な抗体に結合されることを特徴とする特許
    請求の範囲第２３項記載のハプテンの濃度を測定する方
    法。 ２５、可溶性マトリックスによって担持され前記リガン
    ドで標識された特異的な抗体が、抗リガンドにより固体
    支持体に固定されて、抗体固体相を形成することを特徴
    とする特許請求の範囲第２３項記載のハプテンの濃度を
    測定する方法。 ２６、前記標識が、酵素、放射性標識、蛍光性化合物、
    化学発光性化合物、生物発光性化合物または酵素基質で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載のハ
    プテンの濃度を測定する方法。 ２７、前記液体マトリックスが、一連の可溶性の炭水化
    物、例えば分子量が６，０００〜８０，０００（ドルト
    ン）のデキストランまたは分子量７０，０００〜４００
    ，０００（ドルトン）のフィコールから選択されること
    を特徴とする特許請求の範囲第２３項記載のハプテンの
    濃度を測定する方法。 ２８、前記液体マトリックスが、分子量が５，０００〜
    ２０，０００（ドルトン）の可溶性ポリマまたはコポリ
    マであることを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載
    のハプテンの濃度を測定する方法。 ２９、前記液体マトリックスに結合したリガンドがアビ
    ジンであり、かつ前記固体相がアビジンで被覆された被
    覆チューブであり、ビオチンの添加により、免疫複合体
    マトリックスが前記アビジンで被覆されたチューブに効
    果的に固定化されることを特徴とする特許請求の範囲第
    ２３項記載のハプテンの濃度を測定する方法。 ３０、前記リガンドが・ビオチンであり、かつ前記固体
    相が抗アビジン抗体で被覆された被覆チューブであり、
    アビジンの添加により、免疫複合体マトリックスが前記
    抗アビジン抗体被覆チューブに効果的に固定化されるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載のハプテン
    の濃度を測定する方法。 ３１、前記リガンドがビオチンであり、かつ前記固体相
    がビオチニル化された蛋白質で被覆された被覆チューブ
    であり、アビジンの添加により、免疫複合体が前記ビオ
    チニル化された蛋白質被覆チューブに効果的に固定化さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載のハ
    プテンの濃度を測定する方法。 ３２、前記リガンドが、ハプテン、ビオチン、フルオロ
    セイン、ジニトロフェノール、アビジンおよび牛血清ア
    ルブミンからなる群から選ばれ、かつ前記抗リガンドが
    、夫々、抗ハプテン、アビジン、抗ビオチン、抗フルオ
    ロセイン、抗ジニトロフェノール、抗アビジンおよび抗
    牛血清アルブミンからなる群から選ばれることを特徴と
    する特許請求の範囲第２３項記載のハプテンの濃度を測
    定する方法。 ３３、被検試料と、リガンドで標識された特異的な抗原
    とをハプテンで標識されたプローブの存在下で反応させ
    、リガンドで標識された抗体の結合部位に対して被検ハ
    プテンと標識された抗体プローブとの間で所定の時間拮
    抗的な結合を生じさせ、次いで、前記リガンドに対する
    固体支持体上に固定化された抗リガンドを添加し、この
    固体相を洗浄し、被検試料中のハプテンの濃度に逆比例
    する前記プローブの存在をチェックすることからなるハ
    プテンの濃度を測定する方法。 ３４、前記標識が、酵素、放射性標識、蛍光性化合物、
    化学発光性化合物、生物発光性化合物または酵素基質で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第３３項記載のハ
    プテンの濃度を測定する方法。 ３５、前記特異的な抗体に結合したリガンドがアビジン
    であり、かつ前記固体相がアビジンで被覆した被覆チュ
    ーブであり、ビオチンの添加により、免疫複合体が前記
    アビジンで被覆されたチューブに効果的に固定化される
    ことを特許とする特許請求の範囲第３３項記載のハプテ
    ンの濃度を測定する方法。 ３６、前記リガンドがビオチンであり、かつ前記固体相
    が抗アビジン抗体で被覆された被覆チューブであり、ア
    ビジンの添加により、免疫複合体が前記抗アビジン抗体
    で被覆されたチューブに効果的に固定化されることを特
    徴とする特許請求の範囲第３３項記載のハプテンの濃度
    を測定する方法。 ３７、前記リガンドがビオチンであり、かつ前記固体相
    がビオチニル化された蛋白質で被覆された被覆チューブ
    であり、アビジンの添加により、免疫複合体が前記ビオ
    チニル化された蛋白質被覆チューブに効果的に固定化さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第３３項記載のハ
    プテンの濃度を測定する方法。 ３８、前記リガンドが、ハプテン、ビオチン、フルオロ
    セイン、ジニトロフェノール、アビジンおよび牛血清ア
    ルブミンからなる群から選ばれ、かつ前記抗リガンドが
    、夫々、抗ハプテン、アビジン、抗ビオチン、抗フルオ
    ロセイン、抗ジニトロフェノール、抗アビジンおよび抗
    牛血清アルブミンからなる群から選ばれることを特徴と
    する特許請求の範囲第３３項記載のハプテンの濃度を測
    定する方法。
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