CN102056942B - 修饰的胱抑蛋白a支架蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于展示肽如肽适体的新型支架蛋白。该新型支架蛋白是胱抑蛋白A或STM(胱抑蛋白A的一种变体)的修饰形式，可用作支架蛋白和展示系统。
Description
本发明涉及用于展示肽，如肽适体的新型支架蛋白。具体说，本发明涉及修饰的胱抑蛋白A多肽和修饰的基于胱抑蛋白A(Stefin A)的人工蛋白用作支架蛋白和展示系统的应用。
背景技术
研究蛋白质相互作用对于理解许多生物学过程，如基因产物在健康和患病个体体内的作用而言至关重要。具体说，肽适体已经成为分子医学的基本理论和应用研究中使用的重要的分子工具。由于它们能够在胞内水平特异性结合给定的靶蛋白并使其失活，它们提供了一种在体外和体内进行功能性蛋白质分析的实验方案。它们也可用于胞外蛋白质。关于在研究蛋白质功能的应用，这些工具可用于分子检测、诊断和/或用作治疗剂。肽和肽适体可以溶液游离形式使用。然而，不受限制的小肽容易形成呈现受限的相互作用表面的结构。而且，它们与靶分子结合后，常常发生构象熵降低，结合自由能降低，最终游离肽常常不形成紧密的非共价复合物，这是个难题。此外，在细胞内肽快速降解，这限制了它们在研究蛋白质体内相互作用中的有效性，这也是个难题。
除了以游离溶液使用之外，感兴趣的肽还可结合于物理支持物，或展示于较大的多肽中。前者不容易应用于体内研究。而在后一种情况中，通过遗传方法将肽插入简单稳定的支架蛋白的一级序列中。支架的折叠在构象上限制了肽，因此肽适体以高特异性和高亲和力结合其结合伙伴。在多肽中展示在本发明中非常重要。这种展示常常是用支架蛋白进行的。
现有技术支架包含灭活的葡萄球菌核酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)和硫氧还蛋白A(TrxA)，以及分离的蛋白质折叠，如葡萄球菌蛋白A的Z结构域、“亲和蛋白(affibody)”、抗脂质运载蛋白(anticalin)和锚蛋白重复。现有技术中的支架蛋白还包括III型纤连蛋白结构域(′Fn3′)、产生抗脂质运载蛋白的脂质运载蛋白家族蛋白质、后胆色素结合蛋白(BBP)等。
近期，WO 2006/131749记载了在胱抑蛋白A中产生若干合理突变，以改进其作为支架的性能。修饰的胱抑蛋白A支架在以下三个位点包含突变：Lys71-Leu73、V48D和G4W，其称为STM(胱抑蛋白A三突变体)。已证明，这三个突变的组合产生的蛋白质与人细胞蛋白质的相互作用最少，具体说，已经无法检测到这种蛋白质与其已知天然结合伙伴的相互作用。然而，我们发现将肽插入该蛋白的71-73位会产生在插入肽末端对该蛋白的截短强烈的选择压力。虽然这种截短的蛋白质可展示生物学功效，但观察结果导致以下担忧：简单地插入71-73位而不引起截短的一小组肽可能不能与靶蛋白自由地相互作用，这是个难题。而且，在单一位置上插入肽不可避免地限制了用于蛋白质相互作用的总表面积，进而限制结合亲和力，也可能限制特异性。
如本发明所述，对胱抑蛋白A和修饰的基于胱抑蛋白A的人工蛋白如STM(胱抑蛋白A三突变体)进行的新型突变提供了可替代的改进且更稳定的支架蛋白，也提供比现有技术更佳多样化的展示系统。而且，也不大可能预计到这些新型蛋白质支架/展示系统作为高效的展示实体。已经在胱抑蛋白A/STM蛋白中特定的不同区域上产生下文所述的新突变，令人惊讶地发现它们不影响胱抑蛋白A/STM蛋白的构型或它们作为支架蛋白的潜在功能。而且，通过进一步工程改造，可以用本发明的改进支架提供修饰，其中该支架具有多个至今现有技术中不可能实现的插入。
发明内容
本发明第一方面提供修饰的胱抑蛋白A多肽或修饰的STM蛋白，其中该修饰包含在选自下组的位点插入的单个突变或异源寡核苷酸编码的肽：
(i)密码子4上的突变，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或异源寡核苷酸编码的肽替代，所述另一氨基酸对于胱抑蛋白A不是色氨酸或对于STM不是甘氨酸；或者
(ii)在编码包含或限定环1的氨基酸的密码子46-54中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入；或者
(iii)在编码包含或限定环2的氨基酸的密码子67-84中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入。
在本申请的说明书和权利要求书中，术语“包含”、“含有”和这些术语的变化形式，例如“包含着”和“包含了”的含义是“包括但不限于”，它们不旨在(且不会)排除其它部分、添加剂、组分、整数或步骤。
在本申请的说明书和权利要求书中，除非另有说明，单数形式也包括复数含义。具体说，使用不定冠词时，应理解为考虑到复数和单数含义，除非另有说明。
应理解，除出现不相容的情况以外，在本发明的特定方面、实施方式或实施例中描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团也可应用于本文所述的任何其它方面、实施方式或实施例。
本文提到支架蛋白时，指融合成一个蛋白质的序列，该术语也与融合蛋白同义。“融合蛋白”指包含与一种或多种不同(即“异源”)肽或蛋白质结合的本发明支架蛋白的蛋白质。插入异源肽或蛋白质使该融合蛋白能够结合所需的靶点。
本发明基于新的修饰，包括插入野生型胱抑蛋白A蛋白质本身(胱抑蛋白A优选是人胱抑蛋白A)或者插入其三突变体STM，使它们成为适合用作稳定的支架蛋白的形式；而伴随的有利情况是，通过突变与组织蛋白酶或其它未知蛋白发生天然相互作用所需的残基消除生物学显著的相互作用和活性，从而使它们呈生物中性。而且，应考虑到所选的突变或插入位点能够接受和限制插入的肽产生(例如)肽适体。尽管人体研究可能需要人支架，但使用(例如)小鼠胱抑蛋白A在小鼠生物和/或疾病模型中进行研究可能有利，类似地，衍生自其它物种或植物的胱抑蛋白A也可用于该特定物种中。因此，本发明的支架和展示系统可用于任何所选的物种，胱抑蛋白A的产生依赖于使用者的要求。
应理解，编码胱抑蛋白A或其STM形式的密码子4的氨基酸的DNA序列中的改变，或者编码包含或限定胱抑蛋白A或其STM形式的环1的氨基酸的密码子46-54中的改变，或者编码包含或限定胱抑蛋白A或其STM形式的环2的氨基酸的密码子67-84中的改变可以相互独立。也就是说，对胱抑蛋白A蛋白质的修饰可以在三个不同的独立区域之一中进行，即在4位中或者在限定环1或环2中。相似地，对三突变体形式STM的修饰也可在三个特定的独立位点之一中进行，即在4位中或者在限定环1或环2中。胱抑蛋白A或STM的其余序列不变，它们包括下述序列。
野生型人胱抑蛋白A的序列见下(SEQ ID NO：1)：
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
三突变体STM的序列见下(SEQ ID NO：2)，用粗体和下划线标出STM与野生型胱抑蛋白A不同的突变位点：
MIPGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
本文所用术语“突变”指遗传物质中的永久性改变，突变可能是氨基酸残基的加入、缺失、插入或取代。
优选地，在单个突变是胱抑蛋白A密码子4的甘氨酸的实施方式中，其取代选自下组：G4V、G4I、G4L、G4M、G4F、G4P、G4N、G4V、G4Q、G4S、G4T、G4W、G4Y、G4R、G4H、G4K、G4D和G4E。更优选地，该改变是G4R，也就是说，密码子4中的甘氨酸被精氨酸取代。
优选地，在单个突变是STM密码子4的色氨酸的实施方式中，其取代选自下组：W4V、W4I、W4L、W4M、W4F、W4P、W4N、W4V、W4Q、W4S、W4T、W4G、W4Y、W4R、W4H、W4K、W4D和W4E。更优选地，该改变是W4R，也就是说4位的色氨酸被精氨酸取代。
已发现，编码胱抑蛋白A或STM氨基端8个氨基酸的胱抑蛋白A开放阅读框5’区域中的改变能够引入限制性内切酶切割位点或靶向重组位点。例如，在本文中已证明，改变DNA序列以便在4位编码(例如)精氨酸(取代野生型的甘氨酸，或STM中的色氨酸)后，令人惊讶地产生稳定的蛋白质，该蛋白与STM的生物物理学特性相同，但此时开放阅读框具有独特的限制性酶切位点，例如但不限于AvrII酶切位点，因此该蛋白用作可替代的高效支架蛋白。
优选地，在突变是编码包含或限定胱抑蛋白A(SEQ ID NO：3QVVAGTNYY)或STM(SEQID NO 4：QVDAGTNYY)环1的氨基酸的密码子46-54中的任何改变的实施方式中，该改变包括例如QVLASTNYY(SEQ ID NO：5)。令人惊讶地证明，引入氨基酸序列，例如但不限于在48、49和50位引入亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸产生生物物理学特性与STM相同的蛋白质，因此它可能是高效的支架。
优选地，胱抑蛋白A中的突变在48-VAG-50中，STM中的突变在48-LAS-50中，以便得到48-LXS-50，其中X是任何氨基酸。
优选地，在突变是编码包含或限定胱抑蛋白A(SEQ ID NO：6LKVFKSLPGQNEDLVLTG)或STM(SEQ ID NO 7：LKVFNGPPGQNED LVLTG)环2的氨基酸的密码子67-84中的任何改变的实施方式中，该改变包括例如SEQ ID NO：8，即LKVFNGPPGQNEDLVRSG。令人惊讶地证明，氨基酸序列如精氨酸后接丝氨酸(以取代胱抑蛋白A或STM的亮氨酸82和苏氨酸83)导致产生类似于STM的稳定蛋白质，其适合用作展示肽适体的支架。
优选地，胱抑蛋白A中的突变在71-KSL-73和82-LT-83中，STM中的突变在71-NPG-73和82-LT-83中，以便得到71-NxP-73和82-RS-83，其中X是任何氨基酸。
优选地，在本发明的另一实施方式中，在胱抑蛋白A和STM中还有一个位于82-LT-83的突变，突变后得到82-XX-83，其中X是任何氨基酸。在特别优选的实施方式中，突变后得到82-RS-83。突变可以在82或83位上，或同时出现在这两个位置上。
优选地，该突变可以是本文所述突变与(例如但不限于)82-XX-83的任何组合，特别优选的变体是至少在71-73位和/或82-83位上有突变。
在另一方面，本发明涉及一种修饰的胱抑蛋白A多肽或修饰的STM蛋白，其包含在选自下组的位点上的两个突变或异源寡核苷酸编码的肽插入：
(i)密码子4上的突变，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或异源寡核苷酸编码的肽替代，所述另一氨基酸对于胱抑蛋白A不是色氨酸或对于STM不是甘氨酸；和/或
(ii)在编码包含或限定环1的氨基酸的密码子46-54中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入；和/或
(iii)在编码包含或限定环2的氨基酸的密码子67-84中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入。
应理解，在本发明的这个方面，当修饰的胱抑蛋白A可包含两个突变时，它可包括例如，4位的突变和具有环1功能的密码子46-54中的改变，或者它可包括4位的突变和具有环2功能的密码子67-84中的改变，或者它可包括具有环1功能的密码子46-54中的改变和具有环2功能的密码子67-84中的改变。
相似地，STM可包括4位的突变和具有环1功能的密码子46-54中的改变，或者可包括4位的突变和具有环2功能的密码子67-84中的改变，或者可包括具有环1功能的密码子46-54中的改变和具有环2功能的密码子67-84中的改变，或者可包括具有环2功能的密码子67-84中的改变。
另一方面，本发明涉及一种修饰的胱抑蛋白A多肽或修饰的STM蛋白，其中所述修饰是在三个位点上插入的突变或异源寡核苷酸编码的肽：
(i)密码子4上的突变，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或异源寡核苷酸编码的肽替代，所述另一氨基酸对于胱抑蛋白A不是色氨酸或对于STM不是甘氨酸；和
(ii)在编码包含或限定环1的氨基酸的密码子46-54中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入；和
(iii)在编码包含或限定环2的氨基酸的密码子67-84中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入。
因此，在本发明的这个具体实施方式中，修饰的胱抑蛋白A和STM包括上述所有三个突变。因此，修饰的胱抑蛋白A或STM支架蛋白在4位以及环1和环2中包括三个特定突变。
另一方面，本发明涉及一种修饰的胱抑蛋白A多肽或修饰的STM蛋白，其包含上述序列中的任何单个序列或其组合，但终止于胱抑蛋白A或STM的残基73或者胱抑蛋白A或STM的残基84，其中在三个位置上插入或未插入新的氨基酸序列。我们已经发现，在STM的NGP后插入氨基酸序列后，对终止密码子存在强大的选择压力，但令人惊讶的是，这种截短的蛋白质既稳定又能干扰靶蛋白的生物学功能。
因此，本发明也包括截短或缩短的修饰的胱抑蛋白A和STM支架蛋白，理想情况下，其在C末端缩短15或25个残基，因而终止于胱抑蛋白A或STM的残基73或84。本发明也包括截短或缩短的修饰的胱抑蛋白A或STM，它们缩短15至25之间的任何整数个残基，因而终止于胱抑蛋白A或STM的残基73至84。
本发明优选包括所述的所有变体，因为通过将寡核苷酸插入经工程改造建立的开放阅读框中的限制性位点，每种变体都能在胱抑蛋白A或STM变体的一个或多个位点上引入异源肽。因此，本发明提供基于以下内容的多种新支架：
在4位上插入该蛋白的独特的异源肽，该蛋白的其余部分类似胱抑蛋白A或STM，或者本文所述的其它变体之一。
在46-54位上，特别是48/49/50位上插入该蛋白的独特的异源肽，该蛋白的其余部分类似胱抑蛋白A或STM，或者本文所述的其它变体之一。
在67-84位上，特别是71/72/73位上插入该蛋白的独特的异源肽，该蛋白的其余部分类似胱抑蛋白A或STM，或者本文所述的其它变体之一。
在67-84位上，特别是82/83位上插入该蛋白的独特的异源肽，该蛋白的其余部分类似胱抑蛋白A或STM，或者本文所述的其它变体之一。
插入4位和/或48/49/50位和/或71/72/73位和/或82/83位的多个肽的任何组合。
插入4位和/或48/49/50位和/或71/72/73位和/或82/83位的单个或多个肽的任何组合，后接去除或取代胱抑蛋白A或STM的最后25个或最后15个氨基酸残基的终止密码子。
本发明支架蛋白和所述新突变的具体优点是它们能够使用全部环1或环2，或者环1和环2，以及氨基末端。并且，这些突变使得能够递呈至少和抗体所用相近大小的表面。此外，它们各自可单独使用，或者可成对使用，或者可与其它突变组合使用。相互作用表面的不同位置，以及在不同位点插入的肽之间不同的相互作用可能提供该支架的新应用，例如不能在一个位点上被递呈从而产生有用相互作用的肽现在可用另一个肽递呈，或者不同位点上的肽组合使给定肽从非相互作用构象转变为相互作用构象。此外，任何这些新突变均可用于全长胱抑蛋白A、全长STM、本文所述的全长蛋白质、或任何这些蛋白质的突变形式，其中衍生自胱抑蛋白A或STM的最后一个残基是SteA或其新变体的Leu73，或者是STM或其新变体的Pro73，或者是胱抑蛋白A或STM的最后15或25个氨基酸被截短插入的异源肽的最后一个残基。
另一方面，本发明涉及分离核酸，其包含编码上文所述的支架蛋白或多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。
另一方面，本发明涉及一种鉴定能够结合感兴趣结构的靶肽的方法，该方法包括提供上文所述的包含靶肽的修饰的胱抑蛋白A或STM蛋白作为支架蛋白；使所述支架蛋白与所述感兴趣结构相接触；和监测所述支架和感兴趣结构之间的结合，其中支架蛋白与感兴趣结构的结合能将所述靶肽鉴定为能够结合所述结构的候选靶肽。
在本发明的另一方面，所述支架蛋白选自下组：
SEQ ID NO：9(SDM)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRSGYQVDKN KDDELTGF*
SEQ ID NO：10(SQM)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRSGYQVDKN KDDELTGF*
SEQ ID NO：11(SUC)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRSGYQVDKN KDDELTGF*
SEQ ID NO：12(SUM)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLTGYQVDKN KDDELTGF*
SEQ ID NO：13(SUN)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLTGYQVDKN KDDELTGF*
SEQ ID NO：14(SDM-)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRS*
SEQ ID NO：15(SDM--)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGP*
SEQ ID NO：16(SQM-)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRS*
SEQ ID NO：17(SQM--)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGP*
SEQ ID NO：18(SUC-)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNEDL VRS*
SEQ ID NO：19(SUC--)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGP*
SEQ ID NO：20(SUM-)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLT*
SEQ ID NO：21(SUM--)：MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSL*
SEQ ID NO：22(SUN-)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFKSLPGQNEDL VLT*
SEQ ID NO：23(SUN--)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAG TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF KSL*
SEQ ID NO：24(SQT)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNADR VLTGYQVDKN KDDELTGF*
SEQ ID NO：25(SQL)：MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLALAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVFNGPPGQNADR VLTGYQVDKN KDDELTGF*
在本发明的另一方面，提供了本发明支架蛋白用作选自下组的试剂的应用：诊断剂、治疗剂、生物标记物、结合和特异性检测生物标记物的试剂、合理化药物设计模板、药物发现靶点或试剂、抗体替代品和研究工具。
在本发明的另一方面，提供了本发明支架蛋白用作融合蛋白的应用。
上文所述的优选特征加以必要的修改也可应用于本发明的所有和各个方面。
总之，上文和下文中记载的结果证明，本发明支架可以在多个位置上进行工程改造，令人惊讶的是，单独或组合的各个改变能良好耐受，但氨基端和环2中的插入会显著增加突变的失稳作用。因此，这些位点不能常规使用，令人惊讶的是，一些插入物可以耐受，这使得我们可以使用它们提高(例如)SQM-环1中肽适体的结合亲和力和特异性。此外，环1似乎能够递呈一系列肽，很少出问题。这非常令人惊讶，因为这是最短的环。
发明详述
“缺失”指氨基酸或核苷酸序列由于失去一个或多个氨基酸残基或核苷酸而发生的改变。术语“插入”或“添加”指与参比序列，例如天然产生分子的序列相比，导致分子或其代表中加入一个或多个氨基酸残基或核苷酸的氨基酸或核苷酸序列的改变。“取代”指用不同的氨基酸或核苷酸替代一个或多个氨基酸或核苷酸。
为了改良作为支架的胱抑蛋白A或STM，需要能够在替代位点和/或多个位点插入异源肽。为此，需要改变编码胱抑蛋白A或STM的开放阅读框，以便引入可插入编码异源肽的寡核苷酸的限制性核酸内切酶识别位点。改变开放阅读框几乎不可避免地导致包含所表达蛋白质的氨基酸序列改变。假定蛋白质已经被设计成功能和稳定性的最优组合，蛋白质的氨基酸序列改变最可能引起(且最常观察到)的后果是失去二级结构，因而稳定性降低。在本发明中，该新型支架蛋白保持了稳定性(参见实施例和附图)。
为了确定也能改变新的胱抑蛋白A/STM的氨基酸序列的DNA(开放阅读框)水平的改变是否导致该蛋白稳定性降低，在大肠杆菌(E.coli)中表达本文所述的所有变体，用圆二色性法将其二级结构组成与胱抑蛋白A作比较。发现所有蛋白质均在大肠杆菌中良好地表达，通常表达至约28mg变体蛋白/毫升细菌培养物(图1)。用Ni-琼脂糖和亲和层析技术将蛋白质纯化至接近均一，将纯化制剂稀释至0.3毫克蛋白质/毫升。通过圆二色性法分析所得的各个样品。这种方法包括在一系列近UV波长上扫描蛋白质，以使蛋白质的二级结构元件(α-螺旋或β-折叠)影响光的椭圆率。二级结构的比例越大，对椭圆率的影响越大。因为该影响受蛋白质浓度的影响，所以在临分析前将蛋白质稀释至0.3mg/ml。由于该影响与所分析蛋白质中的肽键数量成正比，所以显示的是考虑了这一因素的摩尔椭圆率。数据如图3所示。该数据说明，STM和新变体之间二级结构的比例相当，STM中存在插入物不会对其结构产生不良影响。注意到相对于其他变体而言两种变体(SUN和SQM)的结构增加。这可归因于存在于所有这些蛋白质中的氨基末端尾中获得二级结构，可由精氨酸取代4位的甘氨酸(胱抑蛋白A)或色氨酸(STM)驱动，因为这是SUN和SQM之间共有的唯一的改变，它们是具有这一改变的仅有的变体。
支架
正如本领域所熟知的那样，术语“支架”指可将靶肽递呈给溶剂、其自身结构不会因靶肽而变形的蛋白质。可利用免疫沉淀实验检测肽到溶剂的递呈。例如，可将能识别肽的抗体的可获得性作为肽递呈给溶剂的指标。因此，为了检测支架蛋白将肽递呈给溶剂的能力，表达包含该肽的支架，并用识别该肽的抗体尝试免疫沉淀该支架-肽融合物。如果可用该抗体免疫沉淀或捕获该蛋白，就表明该肽被递呈给溶剂，正如支架蛋白需要做到的那样。另外或或者，可通过磷酸化研究获得肽被递呈给溶剂的指示。通过将磷酸受体位点掺入靶肽，然后在允许磷酸化的条件下使支架-肽融合物与关联激酶相接触，可验证肽到溶剂的递呈。肽的磷酸化表明正确递呈给溶剂。支架蛋白对因携带靶肽而引起变形的抗性可通过诸如圆二色性或热稳定性等技术来检测。具体说，对未插入靶肽的支架蛋白的圆二色性与携带靶肽的同一支架蛋白的圆二色性基本相同。这证明，支架蛋白中存在靶肽不会使携带它的支架蛋白的结构受损或变形。检测对靶肽引起变形的抗性的另一种方式是研究插入和未插入靶肽的支架蛋白的热稳定性。
支架蛋白必须能够接受肽插入物。优选地，该肽插入物具有36个或更少氨基酸，优选20个或更少氨基酸。靶肽插入物优选具有12个或更少氨基酸。
支架蛋白必须为已知结构。“已知结构”指晶体结构或溶液结构(NMR结构)必须已知。
本发明支架蛋白的优选特征
优选地，支架蛋白限定靶肽。通过比较靶肽在支架蛋白中时对结合靶肽的实体的亲和力与该肽不在支架蛋白中时的亲和力来证明支架蛋白中存在约束作用。这两种亲和力有差异表明支架蛋白限定该肽，呈现特定的三维构象。支架蛋白优选能限定肽，以至于其存在于支架蛋白中时结合亲和力升高。换言之，支架蛋白优选降低结合的熵耗(entropiccost)，从而与结合游离肽相比提高测定的亲和力。
在一些实施方式中，可通过N-末端或C-末端单独融合于靶肽提供该约束。
支架蛋白优选提供体内稳定性提高的靶肽。可通过比较支架蛋白中的靶肽的表达与靶肽自身的表达来证明这种作用。优选地，在支架蛋白中，靶肽稳定性提高。
支架蛋白优选为生物学中性。“生物学中性”指已消除与其它已知蛋白的相互作用。而且，优选消除该蛋白所具有的任何信号转导能力。因此，本发明的支架蛋白优选为STM支架蛋白。
生物学中性是本发明的一个优点，因为现有技术中的大部分支架蛋白不具备这项性质。例如，硫氧还蛋白A用作细胞中天然氧化还原通路的显性负(调节物)。而且，已知它能抑制P53和BCL6信号转导通路。有利的是，本发明的支架蛋白不干扰天然产生的信号转导通路。
支架蛋白应该较小。“小”指小于25kDa，优选小于13kDa。最优选地，支架蛋白应小于110aa(除靶肽插入物外)。
优选地，本发明支架蛋白的构象稳定。“构象稳定”指不应发生构象改变。支架蛋白优选不含绞链区。支架蛋白优选不含PH结构域。支架蛋白优选不含SH3结构域。支架蛋白优选不含SH2结构域。支架蛋白优选不含′WW′结构域。支架蛋白优选不含′WD′结构域。支架蛋白优选不含HEAT重复。支架蛋白优选不含富脯氨酸的结构域。在细胞中，支架蛋白优选不具有翻译后修饰。支架蛋白优选不具有已知能促进构象改变的其它结构域。
本发明支架蛋白优选不具有蛋白质-蛋白质相互作用结构域。如果蛋白质-蛋白质相互作用结构域被突变致使其无功能，则认为该蛋白质不具有这些蛋白质-蛋白质相互作用结构域。
优选地，本发明支架蛋白没有翻译后修饰。因此，本发明支架蛋白优选不具有糖基化位点。这是相对于现有技术的支架蛋白如抗肌萎缩蛋白的一个优点，因为翻译后修饰本身可干扰相互作用或产生假的相互作用。
如上所述，肽插入物应不使支架蛋白变形。在这个标准上，绿色荧光蛋白不会被认为是支架蛋白，因为至少三分之一的插入靶肽消除了绿色荧光蛋白的荧光。这证明，靶肽插入物使蛋白质结构变形。因此，这不是本发明支架蛋白，因为本发明支架蛋白应该不会因靶肽插入而变形。
硫氧还蛋白A(TrxA)是现有技术中的一种支架蛋白。TrxA小而稳定。然而，在两个半胱氨酸残基之间将靶肽插入TrxA。有利的是，本发明支架蛋白避免了此种安排，因为TrxA中的半胱氨酸残基可发生可逆的二硫键结合，这可能改变支架蛋白的构象并可能影响递呈的靶肽的构象。因此，靶肽的插入位点优选不在支架蛋白上的两个半胱氨酸残基之间。
设计考虑
支架蛋白优选具有以下一个或多个特征：
1)结构已知，以便在获悉情况下选择用于肽插入或取代的位点；
2)足够稳定，以限制一系列肽的折叠；
3)生物学中性，即缺少与可能产生某表型的细胞蛋白质的相互作用；和
4)在原核和真核环境中能够类似地，优选相同地折叠，因此在一个系统中获得的数据可预测在另一系统中进行的实验。
本发明提供适合肽适体技术要求的支架。本发明支架蛋白优选具有上面定义的所有标准。亲代胱抑蛋白A的结构已知；工程改造的支架稳定并能耐受至少一个肽的插入而不失去其生物物理学稳定性；它能够递呈用于产生功能性相互作用的各种肽；且不仅将所有已知的生物学相互作用工程改造掉。
进一步的应用
本领域技术人员应理解，本发明支架蛋白中递呈肽适体时，在微阵列中使用肽适体特别有利。现有技术中的微阵列技术主要依赖抗体。然而，抗体结合阵列时，可能失去特异性。而且，微阵列中所用的重组蛋白质可提供递呈蛋白质的信息，但无法提供什么物质与其结合的信息。相反，在检测阵列时使用本发明支架蛋白中展示的肽适体可提供更多信息。例如，观察结合伙伴时，使用支架蛋白展示适体时产生有利的内容信息。这一优点被鉴定为天然和知悉(informed)文库的区别。因此，在另一方面，本发明涉及这些新型支架蛋白在阵列上展示肽的应用。
优选地，本发明支架蛋白是基于胱抑蛋白A的序列。“基于胱抑蛋白A的序列”指支架蛋白应该具有胱抑蛋白A的98个氨基酸残基中的至少30个，优选具有胱抑蛋白A的氨基酸序列的25％，优选具有胱抑蛋白A的氨基酸序列的30％、40％、50％、60％或70％，优选80％、优选85％、优选90％、优选95％或更多胱抑蛋白A序列。最优选地，该支架蛋白具有胱抑蛋白A或STM的序列，或本文所述的新变体之一，并包括上述一个或多个突变。
肽适体在体内破坏蛋白质-蛋白质相互作用的能力可能用于快速鉴定新的先导药物。而且，本发明能够有利地促进候选小分子药物在破坏蛋白质-蛋白质相互作用的应用。
有利的是，可实现包含翻译后修饰位点如磷酸化位点的肽插入物的应用。这有利于分析因靶肽磷酸化状态而改变的相互作用。而且，它可用于鉴定以磷酸化依赖方式结合的候选肽适体。
在一些实施方式中，可能需要通过(例如)在靶肽插入物的任一侧工程改造半胱氨酸残基，以便在靶肽插入物的任一侧引入二硫键。如果仅以一种方式使用支架，这可能有用。在这方面，需要注意家族II半胱氨酸蛋白酶抑制剂利用二硫键形成对应于一个优选插入区域的二级结构元件。在本发明中，这可通过(例如)以下方式实现：在支架多肽的C末端，或者在靶肽内如靶肽的C末端加入一个半胱氨酸，并在第二个位置如该支架的N末端或靶肽的N末端插入第二个半胱氨酸残基，从而使它们交联。然而，优选避免以此方式对肽进行共价约束。因此，在本发明的优选支架中，靶肽优选不侧接半胱氨酸残基。
总之应理解，不同支架可能在它们所递呈的肽上强加一个位移(bias)，以使靶肽的研究宜包括在一个以上支架上递呈的肽和/或文库，以便最大程度提高成功的可能性。
本发明支架使得研究人员能够将体外观察延伸至胞内环境，反之亦然，并使得能够在体外鉴定或产生可用于细胞内部而无需担忧折叠方式或二硫键的氧化状态的工具。
基于本发明支架的肽适体是可用于验证药物靶点的工具，该药物靶点可用作诊断或预后检测的组件，或甚至构成治疗人类疾病的先导化合物的基础。优选基于全长人蛋白的本发明支架可用作生物治疗剂和/或用于基因治疗。
靶肽
本文所用术语“靶肽”指感兴趣的肽。靶肽优选为异源肽。异源指从其通常环境中分离的肽，优选是具有在携带、包含或展示它的支架蛋白的序列中通常不存在的序列的肽。如果该肽具有在支架蛋白序列之外的地方出现的序列，为了使其成为“异源”，该序列将位于支架蛋白以外(out of context)，即不占据支架蛋白多肽内的天然存在的位置(地址)。在这一方面，“位置”指线性氨基酸链内的位置，而不是三维空间中相对于其它氨基酸残基的位置。靶肽可以是人造肽，例如通过构建用于掺入该支架蛋白的肽文库产生的肽。在这些实施方式中，出于本发明目的考虑人造肽应是“异源”肽。
肽适体是用于研究细胞中的蛋白质功能的由支架蛋白约束和递呈的肽。其中一些能够破坏蛋白质-蛋白质相互作用，一些能够建立识别模块，以便产生用于对蛋白质功能进行胞内分析的分子工具包。
设计或鉴定可以特异性和高亲和力地结合给定蛋白质的小分子的能力是许多实验，包括蛋白质微阵列的开发、在活细胞环境中进行蛋白质分析和验证候选药物靶点中的限速步骤。实际上，蛋白质-蛋白质相互作用可由折叠蛋白质的小表面介导。这导致将在稳定蛋白质(成为支架)内递呈的小肽表面用作蛋白质识别模块。这种试剂在本文中称为肽适体，它已被用于破坏多种系统中的蛋白质生物活性。
与游离肽相比，肽适体更容易被递送，在细胞中更稳定，它们的受限折叠导致较低的结合熵耗，因此对靶蛋白的亲和力提高。在分子工具包的设计中，肽适体的蛋白质工程改造允许它们提供识别官能团，但这种可能尚未完全实现。肽适体与其靶点的亲和力为10″6至5x10″9M，相比而言抗体/靶点相互作用的IQ为10′7至10″11M。利用多重插入提高相互作用的表面积时，预计肽适体能够匹配或可能超过抗体的结合亲和力。然而，肽适体明显能够在体内破坏蛋白质-蛋白质相互作用。在酵母或哺乳动物细胞中进行肽适体筛选，这不同于对有可能错误折叠的原核表达的蛋白质进行的肽或抗体文库噬菌体展示筛选。
虽然大多数广泛使用的支架是大肠杆菌(Escherichia coli)蛋白质硫氧还蛋白(TrxA)，但已经使用许多其他蛋白质。这种技术的成功取决于该支架的坚固性，但三分之一的肽可能使GFP失稳，而许多基于TrxA的肽适体在培养的人类细胞中不能稳定表达，这提示，此种支架的刚性也可能不足以在不使其自身部分展开的情况下递呈肽。从一个支架中取出并放入另一个支架中的肽常常会失去与其靶蛋白相互作用的能力，增加了筛选与给定靶点相互作用的受限物质失败的可能性，除非使用合适的支架。最后，现有技术中没有严格鉴定递呈肽所用支架的生物学活性，导致人们关心肽适体表达时观察到的任何表型都可能(至少部分可能)是因支架作用产生且不是插入的肽。因此，我们产生了用于递呈受限肽的各种各样的坚固的生物学中性支架。我们寻求一种可以在一系列实验系统中稳定表达、同时递呈能够与多种靶点发生功能性相互作用的肽的蛋白质。这种支架通过提高其坚固性显著改进了肽适体技术。此外，使用多个支架中的文库对各个靶点进行同时筛选时，通过扩展可用支架库，本发明有利地提高了在对更多靶蛋白筛选中获得命中的可能性。
胱抑蛋白A
胱抑蛋白A是半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)家族的半胱氨酸组织蛋白酶(木瓜蛋白酶家族的溶酶体肽酶)的蛋白质抑制剂的初始成员。半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的胱抑蛋白亚组是相对较小(约100个氨基酸)的单结构域蛋白质。它们没有已知的翻译后修饰，并缺少二硫键，这提示它们能够在各种胞外和胞内环境中相同地折叠。SteA本身是98个氨基酸的单体、单链、单结构域蛋白质。已经分析过SteA的结构，这有利于通过合理突变使SteA变为STM支架。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的唯一已知的生物学活性是抑制组织蛋白酶活性，这使得我们能够不断地检测我们工程改造的蛋白质的残留生物学活性。因此，我们公开了对天然SteA的蛋白质工程改造可产生可用作肽适体支架的变体。现有技术中的肽适体遇到了在细胞实验中鉴定生物学活性的困难，这至少部分由各种现有支架的性能欠佳所致。本发明提供一种对于想要在体外和体内研究蛋白质-蛋白质相互作用的人大有裨益的有用支架。
胱抑蛋白A序列
“基于”胱抑蛋白A的支架具有衍生自胱抑蛋白A的序列。衍生自胱抑蛋白A的序列优选包含胱抑蛋白A野生型序列，优选包含一个或多个本文所述的修饰(突变)。本领域技术人员可以明显看出，可以在不背离本发明的情况下对支架序列作出小修饰。具体说，本发明涉及与本文所示序列至少25％，35％，45％，55％或60％相同，优选至少70％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少92％、优选至少94％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％或者甚至更多相同的氨基酸序列和/或核苷酸序列，然而在各个情况下，如果序列变异不会对支架将靶肽递呈给溶剂的能力造成不良影响，并且不会恢复或产生生物学功能，例如野生型胱抑蛋白A具备、但被本发明突变消除的生物学功能，则这种序列变异被认为是“小”修饰。
而且，小修饰也可包括本文所述的胱抑蛋白A或胱抑蛋白A衍生序列的小的缺失或加入，例如在胱抑蛋白A衍生多肽中加入或缺失10个氨基酸或更少氨基酸。因此，本发明涉及相对于本文所述的胱抑蛋白A或STM序列总共加入或缺失40个氨基酸或更少、优选30个氨基酸或更少、优选20个氨基酸或更少、优选15个氨基酸或更少、更优选10个氨基酸或更少、优选9个氨基酸或更少、优选8个氨基酸或更少、优选7个氨基酸或更少、优选6个氨基酸或更少、优选5个氨基酸或更少、优选4个氨基酸或更少、优选3个氨基酸或更少、优选2个氨基酸或更少、优选1个氨基酸的氨基酸序列。加入或缺失总数是重要因素，以使9个或更少的氨基酸差异可能意味着缺失9个氨基酸，或缺失三处每处三个氨基酸，或加入两处每处三个氨基酸和缺失一处三个氨基酸，等等。本发明也涉及相应的核酸变体。在每种情况下，如果序列变异不会对支架将靶肽递呈给溶剂的能力产生不良影响，且不会恢复或产生生物学功能，例如野生型胱抑蛋白A所具备的生物学功能，则该序列变异被认为是“小”修饰。
胱抑蛋白A和STM突变
在讨论突变位点时，“接近”意味着在7个氨基酸以内、优选5个氨基酸以内、优选3个氨基酸以内、优选2个氨基酸以内、优选在标称氨基酸处或两个相邻氨基酸之一处。
在插入中，优选在核酸水平引入限制性酶切位点，优选独特的限制性酶切位点以利于后期插入。重组核酸技术领域的这些知识和常识使得本领域技术人员能够引入相关的限制性酶切位点，同时保持该支架的关键特征。“独特”指在支架蛋白的编码序列中独特。可使用非独特位点，但优选独特位点以便于插入和操作该构建物。使用(例如)两个或多个位点来促进去除和取代SteA环1的密码子67-84中任何密码子的序列时，这两个或多个位点优选是各自独特的。然而，如果这两个或多个位点相同，可能有利地简化去除和取代操作，例如可能只包括一个限制性酶处理步骤。本发明所属领域的技术人员能够进行这些选择。在优选实施方式中，引入两个相同位点以去除和取代该环。优选地，用于突变编码序列的限制性位点是不同的，以便利用不同的限制性酶在编码序列的这四个位置上进行插入或修饰，从而利于操作。
4位突变
术语“4位突变”在本文中用于描述在胱抑蛋白A的G4位点或STM的W4位点周围，优选接近上述位点或优选在上述位点中的突变，突变指加入或插入或取代SteA或STM的氨基末端氨基酸残基。这类突变优选接近Pro3，优选接近G4(胱抑蛋白A)或W4(STM)。这类突变优选靠近人胱抑蛋白A或STM的Pro3，或优选在人胱抑蛋白A或STM的Pro3中。最优选是用R取代残基4。
在优选实施方式中，除上文所述的环1和/或2的其它突变外，4位位点用作一级、二级或三级插入位点。R而非G的存在能提高识别(靶点结合)表面的可及性，因为R是带正电的氨基酸，能防止α螺旋环覆盖识别位点。而且，所述改变单独出现时使适体失稳，但适体结合靶点后会稳定化。
密码子46-54中的突变
术语“密码子46-54中的突变”在本文中用于描述在SteA的VAG位点或STM的DAG位点周围，优选接近上述位点或优选在上述位点中的突变。VAG位点是位于人SteA残基46-50的QVVAG位点的残基48-50。DAG位点是位于STM残基46-50的QVDAG位点的残基48-50。
它优选指VAG/DAG位点周围、优选接近该位点或优选在该位点中的加入或插入或取代。它优选指VAG/DAG位点中的加入或插入。
在优选实施方式中，46-54位点用作一级、二级或三级插入位点，与本文上述突变联合使用。
在一个优选实施方式中，VAG/DAG位点的突变是LAS。
实验证明，修饰D48L和G50S导致细菌系统中的表达水平提高。
密码子67-84中的突变
术语“密码子67-84中的突变”在本文中用于描述人胱抑蛋白A的L73-L80环或STM的P73-L80环周围，优选接近所述环或优选在所述环上的突变。
该术语可以指该位点上的加入、插入或取代。
在一个实施方式中，突变可包括用任何肽序列优选用一系列不同的靶肽序列(优选每个胱抑蛋白支架分子只有一个靶肽序列)，即文库取代L73和L80之间或P73和L80之间的整个环。
在核酸水平，优选的突变是产生用于插入该环的限制性酶切位点，更优选用于取代该环编码序列的两个限制性位点的突变。特别优选的限制性酶切位点是RsrII限制性位点。
在优选实施方式中，环2位点用作一级、二级或三级插入位点，与本文上述突变联合使用。
在NGP处工程改造有突变的两种新的本发明支架(SQM具有L82R和T83S、SQT具有E78A和L80R)各自在大肠杆菌中高表达，这最出于意料，因为它们与亲代蛋白明显不同。如圆二色性法所显示，SQM和SQT均具有稳定的结构，这是出乎意料的，因为它们与亲代蛋白明显不同。
插入这些适体的肽是可接触溶剂的，如抗体结合实验所示，这些蛋白质连接于固体表面时优选保持其结合和功能。而且，由于三个插入物的位置它们的表面积增加，因此产生较高的亲和力结合，实验证明具有某特定组肽的SQM能正确折叠，且不会形成可能遮蔽结合位点的二聚体，这与STM的情况相反，因而提供优于现有技术的显著优势。而且，可通过本发明支架，利用(例如)SQM制备肽适体文库，从而鉴定因存在多个结合表面可能与人体组织中的靶点相互作用的适体。
插入
优选地，插入物接近人胱抑蛋白A的L73-L80环或STM的P73-L80环、或优选位于上述环中，更优选具有退火序列编码的两个残基LeuAla，因此该支架蛋白比原始的胱抑蛋白A长2个残基。
突变组合
本发明支架蛋白优选基于胱抑蛋白A或STM，其包含至少一个上述突变。优选地，支架蛋白包含至少两个或所有三个上述突变。本发明支架蛋白优选具有所有三个上述突变，该蛋白的其余部分类似于胱抑蛋白A或STM或其它变体之一。此外或或者，当末端突变位于72/73位或82/83位时，其后接去除或取代胱抑蛋白A或STM的最后25个或最后15个氨基酸的终止密码子。有利的是，靶肽可插入三个优选突变位点中的任何一个突变位点中。在高度优选的实施方式中，基于胱抑蛋白A/STM的支架蛋白允许使用总共三个表面。它们是4位、环1和环2限定的表面(图2)。
固相和微阵列
如上所述，本发明可应用于微阵列。在固相实施方式，如微阵列实施方式中，优选工程改造本发明支架蛋白，以利于其结合或连接于该测定的固相基质上。这优选通过粘合于金涂层，或通过与生物素结合进行。为了工程改造支架以便粘合于金涂层，优选将一个或多个Cys残基引入支架蛋白的C或N末端。为了工程改造支架以便通过附连生物素进行固定，优选将一个或多个拷贝的八氨基酸生物素结合域(′streptag′)引入所述支架。可通过这些或任何其它合适方式中的一种或多种方式进行固定。优选固定本发明的支架蛋白。优选工程改造本发明的支架蛋白以进行固定。优选用固定的支架蛋白进行本发明的相互作用检测。
本发明的其它优势
基于胱抑蛋白A的支架蛋白优于使用肽，因为它们可以在体内使用。而且，使用重组系统的成本低于使用合成肽。而且，基于相同的原因构建文库的成本低于使用合成文库，也因为它们可利用核酸操作合理设计。这能降低对复杂的肽合成化学过程的依赖。
基于胱抑蛋白A的支架蛋白优于现有技术例如噬菌体展示，因为它们在细胞内部，而噬菌体展示依赖于胞外相互作用。而且，本发明支架蛋白可作用于天然靶点，而非重组靶点。这能产生一个额外优点，即允许检测正确地磷酸化或糖基化的翻译后修饰的蛋白质，或在体内翻译后修饰、但如果在体外产生可能不能正确形成的蛋白质。
本发明支架蛋白的另一项优点是它们能够检测天然产生的一系列剪接变体和翻译后修饰变体，这些变体在体内产生，不需要单独制造和测定或区分它们进行分析。
本发明的另一项应用是在将微悬臂作为与基于胱抑蛋白A的支架蛋白发生相互作用的读出机中的应用。而且，本发明支架蛋白特别适合与电化学和/或薄膜晶体管型读出机一起使用。
本发明支架的另一项优点是本发明肽适体可代替抗体，结果证明，它们的性能可能更好，例如用肽适体检测CDK2比抗体更快。因此，肽适体而非抗体的应用意味着在生产分子探针的过程中需要使用的动物更少，这为科学研究提供了显著优势。
下面通过实施例的方式描述本发明，其中参照了以下附图。
附图简要说明
图1显示STM和变体在大肠杆菌中的表达和溶解度；图1A显示SUN、SUM和STM变体，图1B显示SUC和SDM变体，图1C显示SQM变体。
图2显示采用Cn3D软件和PDB协同IDVD产生的STM变体的NMR解析结构，其中标出了密码子4位、环1中的密码子48-50位、环2中的密码子67-84位以及91-92位密码子(Martin等，1995“人胱抑蛋白A的三维解析结构”(The three-dimensional solution structureof human stefin A)，JMol Biol，第246卷，第331-43页)。标明了突变产生修饰的胱抑蛋白A蛋白的区域。
图3显示了SDM、SUC、AUM、SUN、SQM、STM W4R和STM参比曲线的圆二色(CD)谱分析，其测定因结构不对称造成的左手极化光与右手极化光的吸光度差异，以便说明STM和新变体之间保留的二级结构的比例。
图4显示长时间储藏后，STM、SDM、SQM、SUM、SUN、SUC、pep6M、pep9M和pep10M的圆二色(CD)谱分析。
图5显示STM、SDM、SQM、SUM、SUN、SUC、pep6M、pep9M和pep10M的独立制剂的圆二色(CD)谱分析。
图6显示SQT和其表位标记变体：-SQT-AUI(1)、SQT-AUI(2)、SQT-HA(2)、SQT-myc(1)、SQT-myc(2)、SQT-AUI(1)、AUI(2)、SQTAUI(1)、HA(2)和SQT-AUI(1)、myc(2)的圆二色(CD)谱分析。
图7显示表位标记的SQM变体：-SQM-myc(1)、SQM-AUI(2)、SQM-myc(n)AUI(1)、SQM-AUI(1)、HA(2)、SQM-myc(n)、AUI(1)、HA(2)、SQM-HA(N-末端)、SQM-myc(2)、SQM(21随机-环1)、SQM-AUI(1)、SQM(AUIx2、环1)、SQM-HA(n)、AUI(1)、SQM-HA(n)、myc(2)、SQM-AUI(1)、myc(2)、SQM-HAx2(n)、AUI(1)、myc(2)、SQM-HA(n)、AUI(1)、myc(2)和称为pep22(Trx)的肽适体的圆二色(CD)谱分析。
图8A显示用抗-AUI抗体对AUI肽进行的免疫沉淀，图8B显示SQM-myc(环1)免疫沉淀，图8C显示SQT-HA(环2)免疫沉淀。
图9显示用在不同位置具有不同表位的肽适体进行的微阵列实验结果。
图10显示在SQM支架中抗体/表位相互作用的表面等离振子共振(SPR)测定结果。图10A比较了固定在化学吸附的SQM(Nt Ha，L1 Au1，L2 Myc)单层(黑色)上的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.3)配制的33nM抗-Myc(红色)、抗-Ha(蓝色)和抗-Au1(绿色)溶液。图10B显示拟合至饱和动力学函数M＝(CxBmax)/(C+K)的不同浓度的抗-Myc下的SPR反应，产生的平衡常数为50x10-9M。
图11显示包含插入环1(上)或环2(中)或氨基酸末端(下)的864个随机肽适体的微阵列的结果。
图12显示将肽适体用于SQM(SQM-pep6)和SQT(SQT-pep10m)以检测两份人(HeLa)细胞裂解物中内源性cdk2表达。
实施例1
参照图2，显示了胱抑蛋白A的三维结构和胱抑蛋白A中被突变以生成新的本发明支架蛋白的三个位点。这些位点是：胱抑蛋白A的G4位或STM的W4位；限定环1密码子46-54中任何一个，特别是密码子48-50位；任何密码子；限定环2的密码子67-84中任何一个，特别是70-73的突变。通过突变如上所述胱抑蛋白A序列产生用作支架蛋白的修饰的胱抑蛋白A或STM多肽。在上文所述的序列中给出得到的基于胱抑蛋白A但具有特定突变的蛋白质。
实施例2
图1显示STM和示范性变体在大肠杆菌中的表达。将STM和本文所述变体的开放阅读框克隆到一种大肠杆菌表达载体pET30a+中，该表达载体经工程改造在氨基末端尾上包含额外官能团，如半胱氨酸残基(在所有变体中均出现)或StrepII标签(仅在STM中)。与其它变体相比，插入的StrepII标签的额外8个氨基酸造成在STM蛋白迁移中的微小差异。在不存在(-)或存在(+)异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的条件下培养携带这些表达构建物的大肠杆菌细胞，IPTG能诱导STM和变体蛋白的表达(用*标出)。在37℃诱导3小时后，超声裂解细胞，将16,000xg离心10分钟后回收的全细胞裂解物(T)或可溶(S)部分加载到15％聚丙烯酰胺凝胶上。用考马斯蓝染色观察蛋白质。通过此种方法的测定，可溶组分中所示各蛋白(SUN、SUM、STM、SUC、SDM和SQM)100％可回收，这表明变体蛋白在大肠杆菌中仍然能够折叠。
实施例3
在基于胱抑蛋白A的新支架蛋白和/或STM的生产中，已采用一种合理方法来设计新肽。新的本发明支架蛋白需要具有理想支架所需具备的可广泛用于体外和体内研究的品质，还需要将这些标准应用于新支架设计。
从稳定的小胞内蛋白酶抑制剂胱抑蛋白A或STM开始，我们工程改造了许多保持母体蛋白的稳定构象的生物学中性支架。我们预计，修饰的新支架蛋白能够在已知相互作用物质和文库筛选中递呈结合于感兴趣靶点的肽。基于支架的分子工具可应用于各种生物学途径研究，并可用于验证药物靶点。SteA是98个氨基酸的单体、单结构域蛋白质，其未接受已知的翻译后修饰并缺少二硫键。SteA显示出显著的热稳定性、在90.8℃观察到可逆转变(transition)、折叠焓为490kJ/mol，这些是SteA-基支架的所有重要特征。
实施例4
将STM变体表达质粒(均使用pET30a+)转化到大肠杆菌中。将单个菌落接种到培养物中，37℃振荡培养过夜(在轨道振荡器上250rpm振荡培养)。第二天早晨，将过夜培养物各0.5mL接种到500mL补充有卡那霉素的新鲜培养基中，以维持对pET30质粒的选择。培养物达到对数中期(OD600～0.6-0.8)时，诱导变体蛋白表达。将该培养物再于37℃振荡培养3小时。离心收获大肠杆菌细胞，并用FP(French Press)裂解。离心澄清该裂解物，用Ni-螯合物亲和层析由所得上清液纯化STM变体蛋白。为此，每20mL裂解物使用0.5mL Ni-NTA琼脂糖(凯杰公司(QIAgen))。用50mL Falcon试管于700g离心该树脂2分钟，弃去上清液。用2.5mL1x平衡/洗涤缓冲液洗涤该树脂三次，每次洗涤的具体步骤是将该树脂重悬于缓冲液、然后700g 4℃离心2分钟、去除上清液。将裂解物与洗涤的金属亲和树脂混合，在辊上4℃孵育2小时。保留一份裂解物进行后续分析。通过700g 4℃离心5分钟和去除上清液从裂解物中分离树脂。保留另一份裂解物，以便对结合效率进行后续分析。通过以下方法洗涤该树脂六次：将珠重悬于10mL洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)，然后700g4℃离心2分钟，再去除上清液。在室温下用1mL洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，150mM咪唑，pH7.4)培育树脂10分钟。700g离心该悬液5分钟，保留上清液。再重复该步骤两次，以便再产生两份洗脱组分。保留蛋白质浓度最高的组分，4℃储存。在圆二色谱分析中，用50mM磷酸缓冲液pH 7.4缓冲交换该样品。在分析当天将样品稀释至约0.3mg/ml，用纳米滴(NanoDrop)分光光度计进行精确的蛋白质测定。如图所示，临分析前加入1mM DTT。用JascoJ715分光偏振计在200-260nm处测定CD谱。用摩尔蛋白质浓度标准化该谱图，对残留摩尔椭圆率作图，以便最大程度降低样品之间的伪像(artefact)。
实施例5
为了确定基于胱抑蛋白A和STM的本发明新支架蛋白的构象是否稳定以及在DNA(开放阅读框)水平作出的导致新的胱抑蛋白A/STM变体氨基酸序列改变的改变是否导致该蛋白稳定性降低，表达本文所述的所有变体，并进行圆二色性分析，以将其二级结构组成与胱抑蛋白A作比较。由图1可以看出，所有蛋白质在大肠杆菌中等同地表达，一般表达至约28mg变体蛋白/毫升细菌培养物。接着，用Ni-琼脂糖通过亲和层析将蛋白质纯化至接近均一，在进行圆二色谱分析之前将纯化制剂稀释至0.3mg/ml。如上所述，圆二色性分析包括在一系列近UV波长上扫描蛋白质，以使蛋白质的二级结构元件(α-螺旋或β-折叠)影响光的椭圆率。
从图3可以看出，在STM和通常称为SDM、SQM、SUM、SUN和SUC的本发明新变体(参见上文中的SEQ ID NO：9-13)之间二级结构的比例保持不变，并且STM中存在插入物不会对其结构造成不良影响。特别需要注意的是，与其他测试的支架蛋白相比，有两种变体(SUN和SQM)似乎显示出结构增加。这可归因于存在于所有这些蛋白质中的氨基末端尾中获得二级结构，可由精氨酸取代4位的甘氨酸(胱抑蛋白A)或色氨酸(STM)驱动，因为这是SUN和SQM之间共有的唯一的改变，它们是具有这一改变的仅有的变体。考虑到SUN、SUM、SUC和SDM中的小改变时，结果表明218nm处大拐点的位置基本不受各改变的影响(图3)，这表明，与通常预计氨基酸改变会使蛋白质失稳不同，胱抑蛋白A衍生物中二级结构的比例不受氨基酸改变的影响。相反，各变体之间的内弯深度明显不同(图3).
实施例6
研究了贮存的影响。图4显示，用pH7.4的磷酸缓冲液4℃储存所检测的所有支架蛋白变体的浓缩母液两周后，分析新鲜稀释的相同样品时二级结构的比例保持不变(与图5相比)。这是无法预测的，因为至此大多数蛋白质已被完全变性或因吸附于储存容器而丢失，除非加入大量载体蛋白。此步骤，即加入载体蛋白的步骤不合需要，因为目的是使用高度纯化的肽适体制剂以最大程度降低诊断和分析实验中因无关蛋白质如载体蛋白质的存在而产生的非特异性信号。总之，新支架蛋白胱抑蛋白A变体可储存于简单的磷酸缓冲液中，没有明显不良影响。此观察结果意味着，这种性能可能有助于所述新支架蛋白胱抑蛋白A变体的工业应用。
实施例7
也对变体STM、SDM、SQM、SUM、SUN、SUC和三种肽适体pep6M、pep9M和pep10M进行圆二色谱分析(图6)。加入DTT，以防止所表达的变体蛋白的氨基末端尾中存在的半胱氨酸残基形成可能影响实验的分子间二硫键。存在或不存在DTT不会改变观察到的二级结构，但在不存在情况下获得的谱图更易于解释，因为DTT本身能在近UV区产生信号。这些结果表明，DTT不会影响本发明支架蛋白的二级结构。
实施例8
评估了除环1和环2中的改变外在4位也包含突变，即在单个支架中包含多个插入位点的SQM变体(SEQ ID NO：10)作为支架蛋白展示系统的能力。分别在4位、48位和72/82位插入肽(HA、AU1或MYC)，产生圆二色谱数据(图7)。圆二色谱分析数据表明，新插入位点不仅能够递呈肽进行相互作用，还能在不显著丢失结构的情况下实现这一目的。
实施例9
使用两种方法测定氨基酸改变对支架结构的影响。简言之，第一种方法是测定工程改造的蛋白质在大肠杆菌中的相对表达水平，其基本原理是大部分氨基酸改变可能使该蛋白失稳。下表1给出了由细菌培养物表达各种支架变体的表达产率，产率记作每升培养物中纯化蛋白的毫克数。
表1
所用的第二种方法是用圆二色谱(CD)直接评估每种蛋白质中二级结构元件的比例。比较大肠杆菌的蛋白质产率时，发现相对于STM，SUN、SUM和SUC相对于胱抑蛋白A的每个单独改变几乎没有影响，或导致产率提高(表I)。在一种蛋白中合并两个突变(SDM)或所有三个突变(SQM)时，也是这样。事实上，来自4个SQM制剂的蛋白质平均产率为58+/-29毫克纯化支架/升细菌培养物，而来自三个STM培养物的产率为59+/-41毫克支架/升培养物。
在200nm和260nm之间获得不同STM变体的CD谱图。CD谱图形状的改变被认为能够反映折叠蛋白的α-螺旋和β-片层含量的改变。所有STM变体均显示相似的CD谱图，其拐点在约218nm处，这表明它们结构相似且引入的修饰没有破坏作用(图3)。然而，也观察到CD谱图的差异，与STM相比，SDM、SUC和SUM显示较平直的曲线，而SQM和SUN显示更深的曲线(图3)。可能的解释是折叠的稳定性提高，即与STM相比，在SQM和SUN溶液中正确折叠的蛋白质的平均超时含量较高，这导致较高的椭圆率读出值。根据CD谱图和测定的蛋白质产率(表1)，可推知SQM变体可能是合适的支架蛋白。
实施例10
通过检测递呈于SQM中产生的新位点时简单的表位标签是否能够被其关联抗体识别，以研究评估SQM是否能够递呈肽以便进行相互作用。选择三个长度和物理化学特性不同的肽表位(AU1、HA和MYC标签)。将这些肽单独插入，或者以各种组合的方式插入支架中的可用位置(N末端、环1或环2)。最初，将HA标签插入氨基末端位点、将AU1标签(最短的肽)插入环1，并将Myc标签插入环2。令人惊讶的是，对于HA标签插入氨基末端的耐受性较差，与空支架相比蛋白质产率下降约2.5倍。相似地，Myc插入环2导致大肠杆菌中的蛋白质产率下降超过5倍。相反，AU1标签插入环1未使SQM失稳，实际上可能提高产率(表1)。
总之，蛋白质表达数据表明，SQM能够在三个位点，即氨基末端、环1和环2上递呈肽。其中，新的环1位点的应用前景似乎最广泛。
实施例11
进行实验，以评估衍生自现有肽适体的短肽错插入前述STM支架的环2的影响。这些肽长度不同，是10个残基(A48、A52和A58)、17个残基(A7)和22个残基(A52串联)长。其中，只有A7影响STM蛋白的二级结构(数据未显示)。令人惊讶的是，将相同肽插入SQM的环2时，所得各肽适体中二级结构的比例未改变(数据未显示)。这表明与STM相比SQM更能够耐受肽插入。还进行实验，以评估表位标签插入上述三个位点(表I)对所得肽适体的二级结构的比例的影响。结果出乎意料地表明，即使是降低蛋白质产率的那些插入也没有显著破坏所得肽适体的二级结构(图7)。然而，注意到N末端位点存在肽改变了曲线的形状，将拐点从218nm推向209nm(图7，SQM-Ha)。为了确定这可否反映在此位点插入对支架结构的总体影响，分析了环1和/或环2中有插入物的一系列SQM-衍生的肽适体的谱图，它们的氨基末端均有插入物。一致地发现，与氨基末端位点上没有插入物的相应蛋白质相比，这些蛋白具有较少的二级结构(图7)。
实施例12
确定可能在限度内将模式肽插入本发明三个位置中的每个位置后，发现插入的肽适体可被免疫沉淀。参照图8A，显示了插入环1的AU1肽的免疫沉淀，表明插入环1的AU1肽可被抗-AU1抗体足够紧密地结合，以致于可以免疫沉淀肽适体。图8B和8C也表明，关联抗体可识别SQM环1中的表位(AU1和MYC)和SQT环2中的表位(HA)，因而关联抗体可免疫沉淀表位标记的支架变体。利用也可用微阵列形式良好识别的其他表位标签确认了这一点(图9)。用胺化学方法将肽适体(Pep2、pep6、pep9或pep10m)固定在显微镜载玻片上的SQM或SQT的环2中，并用购得的可溶性未标记的活性CDK2(新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs))进行探测。彻底洗涤后，用抗-CDK2抗体和标记的第二抗体检测结合于固定的肽适体的CDK2，然后用标准的DNA微阵列扫描仪拍照观察。数据表明，在临床相关范围，SQM递呈pep6时优于任何其他支架，而SQT递呈pep10m时优于任何支架变体。我们将空SQT支架产生的低信号设定为背景。将由大肠杆菌纯化的不同位置上具有不同表位的肽适体印刷到涂有镍螯合物(应捕获各肽适体的六组氨酸标签，以便进行受控的定向(controlledorientation))或者涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上。所有印刷均从印刷缓冲液点和总是不产生信号并用作阴性对照的游离SQM点开始和结束。在所有情况下，抗体吸收都是特异性的。用SPR验证了这些结果(图10)。按照对SQM靶点的最高亲和力对以下抗体排序，即：抗-Myc、抗-Ha和抗-Au1，注射33nM溶液后观察到的表面浓度变化为0.4、0.13和0.02pM cm-2(见下表2)。这些数值表明平衡常数K的相对定性结果。根据抗-Myc抗体计算的K值在大约50nM的数量级，这与利用抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行的相似研究相一致。由于在SPR实验中的情况不理想，未精确测定抗-Ha和抗-Au1的K值。抗-Ha显示出立即出现的强烈结合峰，然后是第二个较缓慢的结合组分，在解离中观察到相似的情况。这种情况表明发生了多个过程，可能由结合于支架氨基末端的多种可替代构象，或者甚至是市售样品中的杂质所致。或者，它可能是非常快的动力学结合和解离常数造成的。AU1的情况类似于Myc，具有良好解析的结合曲线，但观察到固定抗体的绝对值显著降低约2个数量级。在Ha和Au1的情况中，K值明显小于50x10-9M。
表2显示抗体对共价结合的含有所有三个表位标签的SQM适体的相对反应。
两种表面的结果在性质上相同，没有观察到显著差异，但胺表面上的信噪比和再现率较好。表面之间的相似性表明在随机取向和受控取向的情况下，所有三个环均对周围环境开放，并且是可寻址的。没有具有可变结合亲和力的位于N末端、环1或环2中的相同表位的证据。也通过以混合物的形式同时加入上述浓度的抗体来重复实验。在所有情况下观察到结果相当，表明这些环互相分离并且独立作用。抗体结合于相邻环后，没有观察到环被封闭的证据。这表明，我们提议用于肽递呈的表面可各自独立地使用，也可联合使用，工程改造的支架能够出乎意料地递呈用于相互作用的大表面积，适合三个抗体分子同时结合，它可用于识别最高达450kDa的蛋白质或多蛋白复合物。
实施例13
分析了分别插入三个位点的864个随机肽的表达概况。在该实验中，在96孔板中培养随机肽适体的少量培养物，高通量纯化该肽适体(即不对各孔优化表达和纯化方案)，将等体积的各个肽适体点到显微镜载玻片上，产生小微阵列。然后，用识别该支架蛋白的两种抗体中的任一种探测该微阵列。用抗体获得的信号强度与该阵列上各处的肽适体含量成正比。结果表明，在环1和环2上插入通常能良好表达，而几乎50％的氨基末端插入物不能被良好表达(图11)。结果表明，我们用SQM环1中长度为6个氨基酸的随机插入物检测的384种肽适体中68％良好表达，16％可低水平表达，而15％无法检测到表达。我们用SQM环2中长度为12个氨基酸的随机插入物检测的384种肽适体中76％良好表达，而14％可低水平表达，而10％根本无法检测到表达。最后，在192种氨基末端具有随机插入物的肽适体中，只有35％良好表达，而32％低水平表达，32％无法检测到表达。
总之，虽然许多不同肽可由氨基末端位点上的插入递呈，但它们也常常可能对支架稳定性不利。因此认为，本发明支架和新位点可用于产生用较大的表面积与靶蛋白相互作用，因而具有较高的亲和力和特异性的肽适体。
实施例14
尝试进一步工程改造环2，以拯救相对于STM 82-83位新突变的失稳作用。因此，工程改造在氨基末端和环1上与SQM具有相同改变，也具有71-NGP-73，但现在用78-ADR-80或77-SDRL-80或78-NTD-80取代野生型(胱抑蛋白A)序列78-EDL-80的新支架。这些改变允许我们使用两个RsrII位点将编码肽的寡核苷酸引入环2。其中，具有78-ADR-80的支架被证明是最具灵活性的。这种新支架被称为SQT(SEQ ID NO：24)。发现与SQM相比，大肠杆菌中SQT的蛋白质表达产率降低(表3)。然而，与相同序列插入SQM环2的情况相比，在环2上具有插入物的SQT的产率却提高(表3)。环2中有AU1时这种差异最显著，使用SQM时1升细菌培养物的表达水平低于1毫克肽适体，但使用SQT时产率为45毫克/升培养物。表3显示肽适体的肽的产率，表示为在标准条件下从1升细菌培养物中获得的纯化蛋白的毫克数。
表3
插入物 SQM SQT
无 19 15
Pep2 9 16
Pep6 2 3
Pep9 21 105
Pep10m 2 11
myc 11 65
AUI(环1) 103 25
AUI(环2) 1 36
AUI，AUI nd 49
HA(环2) nd 32
AUI，HA 205 36
myc(环1) 7 34
Myc(环2) 11 49
AUI，myc 14 52
一个令人惊讶的观察结果是，就环1中单独插入物的表达产率而言，SQM高于SQT。例如，对SQT-AU1-环1而言每升培养物获得25毫克肽适体，但对SQM-AU1-环1而言每升培养物获得103毫克肽适体，但这种情况并不普遍存在，因为对于环1中具有Myc表位的肽适体而言这种作用相反(表3)。SQT环1和环2中具有双插入的肽适体通常被良好表达，并且与SQM中的相同组合相比这种肽适体的产率较高，但迄今为止我们在将AU1标签插入环1并将HA标签插入SQM的环2时获得最高的肽适体产率(表3)。
考虑可替代肽插入的影响时，发现SQT能够递呈模式CDK结合肽(pep2、6、9和10m)或Myc表位。通常，SQT比SQM更能够接受这些肽。然而令人惊讶的是，与STM相比SQT似乎优势很小(pep2，pep9)或没有优势(pep6，pep10m)。这些数据提示，与更复杂的改变相比很可能更适宜对支架进行小工程改造和将肽插入环，即使这些复杂改变的设计能最大程度减少对二级结构的破坏。
实施例15
为了提高使用SQT环1时的文库构建效率，我们将5’-AGGCCTTGATCACCATGGACTAGCA-3’(SEQ ID NO：26)插入在5’端使用NheI位点并且在3’端使用SpeI位点的寡核苷酸序列的NheI位点中，SpeI位点在退火至NheI位点时丢失，这也导致STM开放阅读框中丢失3’NheI位点。插入的寡核苷酸携带3个新的限制性位点(StuI、BclI和NcoI)，它们可用于插入编码肽的寡核苷酸。该区域内修饰支架的最终序列(包括新接头)是：DNA：5’-AAGTGCTAGCAGGCCTTGATCACCATGGACTAGCAAGCACAAATTA-3’(SEQ ID NO 27)。蛋白质：(N-末端)44-KTQVLAgldhhgla STNYYIKVRAG-(C末端)，小写字母表示插入的寡核苷酸编码的氨基酸。需要注意，使用该接头的NheI和NcoI位点插入寡核苷酸将导致插入物终止于SpeI/NheI退火序列编码的两个残基(LeuAla)，因此SQT支架蛋白比原始胱抑蛋白A长两个残基。我们将此种延长的支架称为SQL。为了了解这种方案可否改进文库构建，我们将侧接5’-NheI和3’-NcoI位点的随机寡核苷酸插入SQL的相应位点中。我们测序的所有20个转化子均显示出正确插入了单个寡核苷酸。相反，单独使用NheI位点并克隆和测序其中24个转化子时，只有8个转化子符合要求(单插入物、正确取向)。另外9个克隆是空质粒(表明消化和去磷酸化步骤的低效)，3个是多联体(在连入支架ORF之前寡核苷酸互相连接)，4个是错误取向。这些数字显示了使用定向插入相对于两端侧接NheI位点的随机寡核苷酸插入SQT的NheI位点时获得的支架的巨大进步。因此，我们对环2进行了相似的方案，即改变开放阅读框的核苷酸序列以产生SQT的XmaI位点，而不是RsrII位点。这不改变SQT的氨基酸序列。
实施例16
将微阵列实验中显示对CDK2的表观亲和力最高的两种肽适体用于“免疫印迹”方案(也称为Westerm印迹，参见图12)，只是使用肽适体(SQM-pep6和SQT-pep10M)代替抗体。类似地，省去“免疫印迹”发色步骤中的抗体，因为肽适体具有S-标签，可用融合于辣根过氧化物酶(HRP)的S-蛋白进行检测。作为阴性对照，用空支架探测平行印迹(显示SQT)，并用所述S-蛋白方案发色。作为阳性对照，用抗-cdk2抗体检测平行印迹，抗-cdk2抗体能够检测相对分子量相同的蛋白质，但使用与肽适体浓度相同的抗体时需要较长的曝光时间。图12显示对人组织培养细胞的两个裂解物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到硝酸纤维素或PVDF膜，并用如上所述的支架、肽适体或支架进行检测的结果。数据表明，在该方案中肽适体不仅能够替代抗体，实际上其性能更优，因为与抗体相比，用肽适体能更快速地检测CDK2。因此，使用肽适体而非抗体带来的优势在于生产分子探针时需要较少的动物。
Claims (13)
1.一种胱抑蛋白A多肽，该多肽由SEQ ID NO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25和异源肽组成，其中，所述SEQ ID NO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25在位置4具有突变，其中，所述突变是用精氨酸取代残基4，且：
a)所述异源肽在SEQ ID NO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25的位置4插入；或
b)所述异源肽在位置48-50插入；或
c)所述异源肽在位置71-73插入；或
d)所述异源肽在位置82/83插入。
2.如权利要求1所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(a)、(b)、(c)和(d)的至少两个位置插入。
3.如权利要求2所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(a)、(b)、(c)和(d)的至少三个位置插入。
4.如权利要求3所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(a)、(b)、(c)和(d)的全部四个位置插入。
5.如权利要求1－4中任一项所述的多肽，其特征在于，(a)所述的异源肽在接近胱抑蛋白A的G4位点的位置插入。
6.一种胱抑蛋白A多肽，该多肽由SEQ ID NO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25和异源肽组成，其中，所述SEQ ID NO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25在位置4具有突变，其中，所述突变是用精氨酸取代残基4，其中：
i)所述异源肽在位置48-50插入；或
ii)所述异源肽在位置71-73插入；或
iii)所述异源肽在位置82/83插入。
7.如权利要求6所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(i)、(ii)、和(iii)的至少两个位置插入。
8.如权利要求7所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(i)、(ii)、和(ii i)的所有三个位置插入。
9.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10、13、16、17、22、23、24和25中任一项所示。
10.如权利要求1-8所述的胱抑蛋白A多肽或权利要求9所述的多肽用于制备支架蛋白的应用。
11.一种鉴定能够结合感兴趣结构的靶肽的方法，其包括：
(i)提供权利要求1-8所述的胱抑蛋白A多肽或权利要求9所述的多肽；
(ii)将所述多肽与所述感兴趣结构相接触；和
(iii)监测所述多肽与所述感兴趣结构间的结合，其中所述多肽与所述感兴趣结构发生结合则将该靶肽鉴定为能够结合所述结构的候选靶肽。
12.权利要求1-8所述的胱抑蛋白A多肽或权利要求9所述的多肽用于制备作为结合和特异性检测生物标记物的试剂的应用。
13.一种检测感兴趣结构的方法，该方法包括：
提供权利要求1-8所述的胱抑蛋白A多肽或权利要求9所述的多肽，所述多肽含有能结合所述感兴趣结构的靶肽；
使所述多肽与所述感兴趣结构接触；和
监测所述多肽与所述感兴趣结构之间的结合，其中，所述多肽与所述感兴趣结构之间发生结合，表明检测到所述结构。
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Citations (1)
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| Design and Validation of a Neutral Protein Scaffold for the Presentation of Peptide Aptamers;Robbie Woodman et al.;《J. Mol. Biol.》;20051007;第352卷(第5期);第1118-1133页 * |
| Significance of the Highly Conserved Gly-4 Residue in Human Cystatin A;Kazunori Shibuya,et al.;《J. Biochem.》;19950101;第118卷(第3期);摘要，表1 * |
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Effective date of registration: 20140625 Address after: British Liz Applicant after: Apte J Can Ltd. Address before: Yorkshire Applicant before: University OF LEEDS Effective date of registration: 20140625 Address after: Yorkshire Applicant after: University OF LEEDS Address before: Yorkshire Applicant before: University OF LEEDS Applicant before: MEDICAL RESEARCH COUNCIL |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |