CN107847581A - 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了稳定的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽、包含所述多肽的免疫原性组合物以及其用于预防和/或治疗RSV感染的用途。

Description

稳定化的可溶性融合前RSV F多肽
本发明涉及医学领域。本发明特别地涉及重组融合前RSV F多肽及其例如在免疫原性组合物中的用途。
背景技术
在20世纪50年代发现呼吸道合胞病毒(RSV)后，该病毒很快成为人类中与下呼吸道感染和上呼吸道感染相关的公认的病原体。据估计，全世界每年有6400万RSV感染，导致16万人死亡(世卫组织急性呼吸道感染更新2009年9月)。最严重的疾病尤其发生在早产儿，老年人和免疫受损的个体中。在2岁以下的儿童中，RSV是最常见的呼吸道病原体，占因呼吸道感染而住院的约50％，并且住院高峰发生在2-4月龄。据报道，几乎所有儿童到2岁时都被RSV感染过。终身重复感染归因于无效的自然免疫力。在老年人中，RSV疾病负担与由非大流行性A型流感感染引起的那些相似。
RSV是一种属于肺病毒(pneumoviridae)亚科的副粘病毒。它的基因组编码各种蛋白质，包括称为RSV糖蛋白(G)和RSV融合蛋白(F)的膜蛋白，它们是用于中和抗体的主要抗原靶标。针对F1蛋白质的融合介导部分的抗体可以防止细胞中的病毒吸收，并且因此具有中和作用。
当前不存在针对RSV感染的疫苗，但是由于疾病负担高其是被希望的。RSV融合糖蛋白(RSV F)是一种有吸引力的疫苗抗原，因为如上所述，它是人类血清中中和抗体的主要靶标。实际上，针对RSV F(帕利珠单抗)的中和单克隆抗体可以防止严重的疾病并且已经被批准用于在婴儿中的预防。
RSV F通过从不稳定的融合前构象融合到稳定的融合后构象的不可逆的蛋白质重折叠，将病毒和宿主细胞膜融合。已经确定了RSV F(McLellan JS等人，Science[科学]342,592-598(2013)；McLellan JS等人，Nat Struct Mol Biol[自然结构与分子生物学]17,248-250(2010)；McLellan JS等人，Science[科学]340,1113-1117(2013)；Swanson KA等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica[美国国家科学院院刊]108,9619-9624(2011))和来自相关的副粘病毒的融合蛋白的两种构象的结构，提供了对这种复杂的融合机器的机制的深刻理解。与其他I类型融合蛋白一蛋白质一样，无活性前体(RSV F0)需要在细胞内成熟过程中通过弗林蛋白酶样蛋白酶进行切割。RSV F含有两个弗林蛋白酶位点，这导致三个多肽：F2、p27和F1，其中后者在其N-末端含有疏水性融合肽(FP)。为了从融合前构象重折叠成融合后构象，在残基137和216之间的包括FP和七肽重复区A(HRA)的重折叠区域1(RR1)必须从螺旋、环和链的组合转化成长的连续螺旋。然后，位于RR1的N-末端片段的FP能够远离病毒膜延伸并插入到靶细胞的近侧膜中。接下来，在融合前F刺突中形成C-末端茎并包括七肽重复区B(HRB)的重叠区域2(RR2)重新定位到RSV F的头部的另一侧并且将HRA卷曲螺旋三聚体与HRB结构域结合以形成六螺旋束。RR1卷曲螺旋的形成和RR2的重新定位以完成六螺旋束是在重折叠过程中发生的最显著的结构变化。
人类血清中的大多数中和抗体是针对融合前构象，但是由于它的不稳定性，融合前构象具有在溶液中和病毒体表面上过早重折叠成融合后构象的倾向。具有高表达水平并保持稳定的融合前构象的RSV F蛋白质将成为用于针对RSV的基于亚基或载体的疫苗的有希望的候选者。
发明内容
本发明提供了稳定的、重组的、融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)多肽，即稳定化在融合前构象的重组RSV F多肽。本发明的RSV F多肽包含至少一个表位，该表位对融合前构象F蛋白质是特异性的。在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽是可溶性多肽。本发明还提供了编码根据本发明的融合前RSV F多肽的核酸分子和包含此类核酸分子的载体。
本发明还涉及组合物，优选地免疫原性组合物，这些组合物包含RSV F多肽、核酸分子和/或载体，并且涉及其在诱导针对RSV F蛋白质的免疫应答中的用途，特别是其作为疫苗的用途。本发明还涉及用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)免疫应答的方法，这些方法包括给予受试者有效量的融合前RSV F多肽、编码所述RSV F多肽的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。优选地，该诱导免疫应答特征在于对RSV的中和抗体和/或针对RSV的保护性免疫。在具体的方面中，本发明涉及一种用于在受试者中诱导中和抗呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白质抗体的方法，该方法包括给予受试者有效量的包含融合前RSV F多肽、编码所述RSV F多肽的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体的免疫原性组合物。
附图说明
图1.蛋白质F(A2)KN66EI I76V L203I S215P的纯化。A)来自阳离子交换柱的洗脱的色谱图。蓝色踪迹是在280nm处的吸光度，棕色踪迹是电导率。箭头指示在15％洗脱步骤洗脱的收集峰。B)来自离子交换柱的洗脱液的Superdex 200凝胶过滤色谱图。蓝色踪迹是在280nm处的吸光度，棕色踪迹是电导率。箭头指示收集峰。
图2.A)在还原和非还原条件下，含有来自SEC色谱的峰的F(A2)KN66EI I76VL203I S215P(A)和F(A2)K66E I76V L203I S215P(B)蛋白质样品的SDS-PAGE分析。指示出了还原样品中的F1，F2片段和非还原样品中的F1+F2。C)具有和不具有L203I的F(A2)KN66EII76V S215P和F(A2)KN66EI I76V S215P的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)。天然标记指示出蛋白质的相对电泳迁移率，但不能用于确定蛋白质分子量。在242至480kDa之间的带的位置对应于三聚体RSV F蛋白质的位置(由箭头指示)。将凝胶用考马斯亮蓝染色。
图3.将Leu 203另外取代为Ile增加了融合前F在具有S215P取代的亚稳态融合前F蛋白质中的稳定性。在收获当天(转染后72小时＝第1天)和在4℃下储存5和15天后测试细胞培养上清液中的融合前RSV F的浓度。
图4.具有L203I的蛋白质的温度稳定性。通过DSF确定纯化的蛋白质样品的解链温度(Tm)。
图5：在还原(R)和非还原(NR)条件下，包含L203I突变的纯化的F蛋白质的SDS-PAGE分析。指示出了还原样品中的F1，F2片段和非还原样品中的F1+F2。将凝胶用考马斯亮蓝染色。
图6：包含L203I突变的纯化的F蛋白质的SEC-MALS分析：A：F(A2)-KN66EI-I76V-I203L-S215P-D486N；B：F(A2)-K66E-I76V-I203L-S215P-D486N。
具体实施方式
呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(F)参与了病毒膜与病毒感染所需的宿主细胞膜的融合。将RSV F mRNA翻译成被称为F0的574个氨基酸前体蛋白质，其在N-末端含有信号肽序列(例如，SEQ ID NO:13的氨基酸残基1-26)，该信号肽序列在内质网中被信号肽酶去除。F0在两个位点(在氨基酸残基109/110和136/137之间)处被细胞蛋白酶(尤其弗林蛋白酶，或弗林蛋白酶样)切割，去除短的糖基化间插序列(也称为p27区域)，包含氨基酸残基110至136，并产生称为F1和F2的两个结构域或亚基。F1结构域(氨基酸残基137-574)在其N-末端含有疏水性融合肽，并且C-末端含有跨膜(TM)(氨基酸残基530-550)和胞质区(氨基酸残基551-574)。F2结构域(氨基酸残基27-109)通过两个二硫键共价连接至F1。F1-F2异二聚体在病毒粒子中组装为同源三聚体。
当前不存在抗RSV感染的疫苗，但是其是被希望的。一种产生疫苗的潜在方法是基于纯化的RSV F蛋白质的亚基疫苗。然而，对于这种方法，理想的是，纯化的RSV F蛋白质处于与RSV F蛋白质的融合前状态的构象相似的构象，该构象随时间的推移是稳定，并且可以足够的量产生。此外，对于可溶性的基于亚基的疫苗，RSV F蛋白质需要通过缺失跨膜(TM)和胞质区域来截短以产生可溶性的分泌的F蛋白质(sF)。因为该TM区域负责膜的锚定和三聚化，所以无锚定的可溶性F蛋白质比全长蛋白质明显地更不稳定，并且将容易地重折叠成融合后的末端状态。为了获得呈稳定的融合前构象的显示高表达水平和高稳定性的可溶性F蛋白质，因此需要将该融合前构象进行稳定化。还因为全长(膜结合的)RSV F蛋白质是亚稳态的，因此对于任何减活或基于载体的疫苗方法来说，融合前构象的稳定也是需要的。
为了稳定可溶性RSV F，将该可溶性RSV F切割成呈在融合前构象的F1和F2亚基，将基于fibritin的三聚结构域融合到可溶性RSV-F C端末端的C端(McLellan等人，NatureStruct.Biol[自然结构生物学]17:2-248-250(2010)；McLellan等人，Science[科学]340(6136):1113-7(2013))。这种fibritin结构域或‘Foldon’衍生自T4fibritin并且早期被描述为人工天然三聚结构域(Letarov等人，Biochemistry Moscow[莫斯科生物化学]64:817-823(1993)；S-Guthe等人，J.Mol.Biol[分子生物学]337:905-915，(2004))。然而，三聚结构域并没有导致稳定的融合前RSV-F蛋白质。此外，这些努力尚未产生适合在人类中进行测试的候选者。
最近，我们描述了能够稳定RSV融合前F构象的若干突变的组合(WO2014/174018和WO 2014/202570)。因此，已经描述了稳定的融合前RSVF多肽，这些融合前RSV F多肽包含在位置67上的氨基酸残基的突变和/或在位置215上的氨基酸残基的突变，优选地在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变和/或在位置215上的氨基酸残基S到P的突变。此外，已经描述了可溶性的融合前RSV F多肽，这些融合前RSV F多肽包含截短的F1结构域，并且如与野生型RSV F蛋白质中的RSV F1和/或F2结构域相比，包含至少一个稳定突变，其中该多肽包含连接至所述截短的F1结构域的异源三聚结构域。还描述了另外的融合前RSV F多肽，其中这些多肽包含至少一个另外的突变，其中所述突变选自下组，该组由以下各项组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基突变；
(b)在位置77上的氨基酸残基突变；
(c)在位置80上的氨基酸残基突变；
(d)在位置92上的氨基酸残基突变；
(e)在位置175上的氨基酸残基突变；
(f)在位置184上的氨基酸残基突变；
(g)在位置185上的氨基酸残基突变；
(h)在位置201上的氨基酸残基突变；
(i)在位置209上的氨基酸残基突变；
(j)在位置421上的氨基酸残基突变；
(k)在位置426上的氨基酸残基突变；
(l)在位置465上的氨基酸残基突变；
(m)在位置486上的氨基酸残基突变；
(n)在位置487上的氨基酸残基突变；以及
(o)在位置508上的氨基酸残基突变。
优选地，该至少一个另外的突变选自下组，该组由以下各项组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基S到G的突变；
(b)在位置77上的氨基酸残基K到E的突变；
(c)在位置80上的氨基酸残基K到E的突变；
(d)在位置92上的氨基酸残基E到D的突变；
(e)在位置175上的氨基酸残基N到P的突变；
(f)在位置184上的氨基酸残基G到N的突变；
(g)在位置185上的氨基酸残基V到N的突变；
(h)在位置201上的氨基酸残基K到Q的突变；
(i)在位置209上的氨基酸残基K到Q的突变；
(j)在位置421上的氨基酸残基K到N的突变；
(k)在位置426上的氨基酸残基N到S的突变；
(l)在位置465上的氨基酸残基K到E或Q的突变；
(m)在位置486上的氨基酸残基D到N的突变；
(n)在位置487上的氨基酸残基E到Q、N或I的突变；以及
(o)在位置508上的氨基酸残基K到E的突变。
如果仅应用这些突变中的一种(特别是突变S215P)，则获得可用于评估可替代的取代的稳定效果的亚稳态蛋白质。
根据本发明，已经发现在位置203上的氨基酸残基L到I的突变进一步稳定了呈融合前构象的蛋白质。
本发明进一步提供了包含在位置203上的氨基酸残基L到I的突变的重组融合前F多肽。
本发明具体提供了重组融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)多肽，其中如与在野生型RSV F蛋白质中的RSV F1和/或F2结构域相比，该多肽在F1和/或F2结构域中包含至少一个，优选地至少两个稳定突变，其中这些稳定突变中的至少一个是在位置203上的氨基酸残基L到I的突变。
本发明进一步提供了包含在位置215上的氨基酸残基S到P的突变(S215P)和在位置203上的氨基酸残基L到I的突变的重组融合前F多肽。
因此，本发明提供了新的稳定突变，以提供重组稳定的融合前RSV F多肽，即稳定化在融合前构象的RSV F多肽。本发明的稳定的融合前RSV F多肽处于融合前构象，即它们包含(展示)至少一个对融合前构象F蛋白质具有特异性的表位。对融合前构象F蛋白质具有特异性的表位是在融合后构象中不存在的表位。不希望被任何具体的理论所束缚，相信RSVF蛋白质的融合前构象可以含有与在天然RSV病毒粒子上表达的RSV F蛋白质上的那些相同的表位，并且因此可以提供用于引发保护性的中和抗体的优点。
在某些实施例中，本发明的多肽包含至少一个表位，该至少一个表位被以下各项识别：一种融合前特异性单克隆抗体(此后称为CR9501)，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:1的重链CDR1区、SEQ ID NO:2的重链CDR2区、SEQ ID NO:3的重链CDR3区和SEQID NO:4的轻链CDR1区、SEQ ID NO:5的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3区；和/或一种融合前特异性单克隆抗体(称为CR9502)，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:7的重链CDR1区、SEQ ID NO:8的重链CDR2区、SEQ ID NO:9的重链CDR3区和SEQ ID NO:10的轻链CDR1区、SEQ ID NO:11的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:12的轻链CDR3区。CR9501和CR9502包含重链和轻链可变区域，并且因此分别包含抗体58C5和30D8的结合特异性，抗体58C5和30D8先前已经显示出以其融合前构象而不是融合后构象与RSV F蛋白质特异性结合(参见WO 2012/006596)。
在某些实施例中，这些重组融合前RSV F多肽包含至少一个表位，该至少一个表位由至少一个如上所述的融合前特异性单克隆抗体识别并且是三聚体的。在某些实施例中，根据本发明的稳定的融合前RSV F多肽是可溶性并且包含截短的F1结构域。
已知RSV作为具有两个抗原性亚型A和B的单个血清型存在。两类型的成熟加工的F蛋白质的氨基酸序列大约93％是相同的。如贯穿本申请所使用的，氨基酸位置是参照来自A2病毒株的RSV F蛋白质序列(SEQ ID NO:13)给出的。如在本发明中所使用的，因此用语“在RSV F蛋白质的位置“x”处的氨基酸”意指与SEQ ID NO:13的RSV A2病毒株的RSV F蛋白质中的位置“x”处的氨基酸对应的氨基酸。注意，在本申请中所使用的编号系统中，1是指一个未成熟F0蛋白质的N-末端氨基酸(SEQ ID NO:13)。当使用一种RSV病毒株而不是A2病毒株时，F蛋白质的氨基酸位置将通过在必要时插入空位使其他RSV病毒株的序列与SEQ IDNO:13的F蛋白质比对，参考SEQ ID NO:1的A2病毒株的F蛋白质的编号来编号。使用本领域熟知的方法进行序列比对，例如，通过CLUSTALW、Bioedit或CLC Workbench。
根据本发明的氨基酸可以是二十个天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一个，例如像D-氨基酸(具有手性中心的氨基酸的D-对映异构体)或在蛋白质中不天然存在的任何变体，例如像正亮氨酸。标准氨基酸基于它们的性质可以被分成若干组。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些性质对蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用是重要的。一些氨基酸具有特殊的性质，例如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥键)；脯氨酸，其诱导多肽骨架转动；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔韧性。表1显示了标准氨基酸的缩写和性质。
本领域技术人员将理解可以通过常规的分子生物学程序对蛋白质进行突变。如与不包含该(这些)突变的RSV F多肽相比，根据本发明的突变优选地导致融合前RSV F多肽的表达水平增加和/或稳定化增加。
在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽是可溶的。
因此，在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽包含截短的F1结构域，其中如与在野生型RSV F蛋白质中的RSV F1和/或F2结构域相比，多肽在F1和/或F2结构域中包含至少一个稳定突变。在某些实施例中，这些可溶性融合前RSV F多肽进一步包含连接至所述截短的F1结构域的异源三聚结构域。根据本发明，显示了通过将一种异源三聚结构域连接到一种截短的F1结构域的C-末端氨基酸残基，与该(这些)稳定突变组合，提供了显示出高表达并且结合至融合前特异性抗体的RSV F多肽，指示这些多肽处于融合前构象。此外，将这些RSV F多肽稳定化在融合前构象，即，即使加工多肽后，它们仍旧结合至融合前特异性抗体CR9501和/或CR9502，表明保留了该融合前特异性表位。
在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽包含至少三个突变(如与野生型RV F蛋白质相比)。
在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽包含选自下组的至少一个另外的突变，该组由以下各项组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基突变；
(b)在位置67上的氨基酸残基突变；
(c)在位置83上的氨基酸残基突变；
(d)在位置92上的氨基酸残基突变；
(e)在位置184上的氨基酸残基突变；
(f)在位置207上的氨基酸残基突变；
(g)在位置486上的氨基酸残基突变；以及
(h)在位置487上的氨基酸残基突变。
在某些实施例中，该至少一个另外的突变选自下组，该组由以下各项组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基S到G的突变；
(b)在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变；
(c)在位置83上的氨基酸残基L到M的突变；
(d)在位置92上的氨基酸残基E到D的突变；
(e)在位置184上的氨基酸残基G到N的突变；
(f)在位置207上的氨基酸残基V到I的突变；
(g)在位置486上的氨基酸残基D到N的突变；以及
(h)在位置487上的氨基酸残基E到Q、N或I的突变。
在某些实施例中，这些多肽包含至少两个突变。
在某些实施例中，这些多肽包含至少三个突变。
在某些实施例中，这些多肽包含至少四个、五个或六个突变。
在某些实施例中，该异源三聚结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:14)。
如上所述，在某些实施例中，本发明的多肽包含截短的F1结构域。如在此所使用的“截短的”F1结构域是指不是全长F1结构域的F1结构域，即其中N-末端地或C-末端地一个或多个氨基酸残基已经缺失。根据本发明，至少跨膜结构域和胞质尾区已经缺失以允许表达为可溶性胞外结构域。
在某些其他的实施例中，将该三聚结构域连接至RSV F1结构域的氨基酸残基513。在某些实施例中，该三聚结构域包含SEQ ID NO:14并且连接至RSV F1结构域的氨基酸残基513。
在某些实施例中，该F1结构域和/或该F结构域来自RSV A病毒株。在某些实施例中，该F1和/或F2结构域来自SEQ ID NO:13的RSV A2病毒株。
在某些实施例中，该F1结构域和/或该F结构域来自RSV B病毒株。在某些实施例中，该F1和/或F2结构域来自SEQ ID NO:15的RSV B病毒株。
在某些实施例中，该F1结构域和/或该F结构域来自RSV CL57-v244病毒株。在某些实施例中，该F1和/或F2结构域来自SEQ ID NO:22的RSV CL57-v244病毒株。
在某些实施例中，该F1和F2结构域来自相同的RSV病毒株。在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽是嵌合多肽，即包含来自不同的RSV病毒株的F1和F2结构域。
在某些实施例中，这些融合前RSV F多肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
在某些实施例中，如与野生型RSV F多肽相比，本发明的融合前RSV F多肽的表达水平是增加的。在某些实施例中，表达水平增加至少5倍，优选地多达10倍。在某些实施例中，表达水平增加超过10倍。
根据本发明的融合前RSV F多肽是稳定的，即加工多肽(例如像纯化、冻融循环、和/或储存等)时不易变成融合后构象。
在某些实施例中，如与没有该(这些)突变的RSV F多肽相比，根据本发明的融合前RSV F多肽在4℃下储存时具有增加的稳定性。在某些实施例中，这些多肽在4℃下储存时稳定持续至少30天，优选地至少60天，优选地至少6个月，甚至更优选地至少1年。“存储时稳定”意指例如如使用如实例7或9中所述的方法所测定的，在多肽呈溶液(例如，培养基)存储在4℃下至少30天后，这些多肽仍然显示对一种融合前特异性抗体(例如，CR9501)具有特异性的至少一个表位。在某些实施例中，在融合前RSV F多肽在4℃下存储时这些多肽显示该至少一个融合前特异性表位持续至少6个月，优选地持续至少1年。
在某些实施例中，如与不具有所述一种或多种突变的RSV F多肽相比，根据本发明的融合前RSV F多肽在受热时具有增加的稳定性。在某些实施例中，融合前RSV F多肽在55℃，优选地在58℃，更优选地在60℃的温度下加热稳定持续至少30分钟。“热稳定性”，它意指在经受增加的温度(即，55℃或更高的温度)至少30分钟之后，多肽仍显示至少一个融合前的特异性表位，例如，如使用如实例6中所述的方法所确定的。
在某些实施例中，在适合的配制缓冲液中经受1至6次冻融循环后，多肽显示该至少一个融合前特异性表位。
如贯穿本申请所使用的，核苷酸序列是从5'到3'方向提供，并且氨基酸序列是从N-末端到C-末端提供，如本领域中所习惯的。
在某些实施例中，根据本发明的编码的多肽进一步包含前导序列，也称为信号序列或信号肽，对应于SEQ ID NO:13的氨基酸1-26。它是存在于大部分注定去往分泌通路的新合成的蛋白质的N-末端的短(典型地5-30个氨基酸长)肽。在某些实施例中，根据本发明的多肽不包含前导序列。
在某些实施例中，这些多肽包含HIS-标签。His-标签或多组氨酸-标签是蛋白质中的氨基酸基序，该氨基酸基序由至少五个组氨酸(H)残基组成，经常在蛋白质的N-或C-末端，通常用于纯化的目的。
本发明进一步提供了编码根据本发明的RSV F多肽的核酸分子。
在优选实施例中，对编码根据本发明的多肽的核酸分子进行密码子优化，以在哺乳动物细胞，优选地人类细胞中表达。密码子优化的方法已知并且已经在先前描述(例如WO96/09378)。如与野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被更优选的密码子置换，那么认为序列是密码子优化的。在此，非优选密码子是在一种生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的密码子，并且更优选的密码子是在一种生物体中比一个非优选密码子更经常地使用的密码子。对于特定生物体的密码子使用的频率可见于密码子频率表中，例如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选地多于一个非优选密码子，优选地最多的或所有非优选密码子，被更优选的密码子置换。优选地，在一种生物体中最经常使用的密码子用于一种密码子优化的序列。被优选的密码子置换一般导致更高表达。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响由核酸分子编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映有待表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括或可以不包括内含子。
核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(GeneArt)、基斯奎思公司(GenScripts)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。
本发明还提供了包含如上所述的核酸分子的载体。在某些实施例中，因此根据本发明的核酸分子是载体的一部分。这些载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且可以例如被设计为能在原核和/或真核细胞中复制。此外，许多载体可以用于真核细胞的转化并将整个或部分整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所需核酸的稳定的宿主细胞。所使用的载体可以是适合克隆DNA并且可以用于转录感兴趣的核酸的任何载体。根据本发明的适合的载体是例如：腺病毒载体、甲病毒、副粘病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、反转录病毒载体等。本领域技术人员能选择适合的表达载体，并以功能性方式插入本发明的核酸序列。
包含编码融合前RSV F多肽的核酸分子的宿主细胞也形成本发明的一部分。融合前RSV F多肽可以通过重组DNA技术产生，该重组DNA技术涉及在宿主细胞、或转基因动物或植物中表达这些分子，宿主细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、BHK细胞、人类细胞系(例如HEK293细胞、PER.C6细胞)或酵母、真菌、昆虫细胞等。在某些实施例中，细胞是来自多细胞的生物，在某些实施例中，它们是脊椎动物或无脊椎动物来源的。在某些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，细胞是人类细胞。通常，宿主细胞中一种重组蛋白质例如本发明的融合前RSV F多肽的产生包括将以可表达形式的编码多肽的异源核酸分子引入该宿主细胞中，在有助于该核酸分子表达的条件下培养这些细胞，以及允许多肽在所述细胞中表达。以可表达形式编码蛋白质的核酸分子可以是表达盒的形式，并且通常需要能够引起核酸表达的序列，例如增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等。本领域的普通技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中一种基因的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同的来源获得，包括病毒、原核生物或真核生物来源，或人工设计的。
细胞培养基可从不同的供应商获得，并且可以常规地选择合适的培养基用于宿主细胞以表达感兴趣的蛋白质，在此是融合前RSV F多肽。合适的介质可以含有或可以不含有血清。
“异源核酸分子”(在本文中也被称为“转基因”)是非天然存在于宿主细胞中的核酸分子。例如，通过标准分子生物学技术将其引入载体中。一般地，转基因可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码一种或多种转基因的核酸置于启动子的控制下来完成。可以添加另外调节序列。许多启动子可用于表达一种或多种转基因，并为技术人员所知，例如这些可以包含病毒、哺乳动物、合成启动子等。用于获得在真核细胞中的表达的适合的启动子的非限制性实例是CMV-启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95。一种聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素polyA信号(US 5,122,458)可以存在于该(这些)转基因后面。可替代地，若干广泛使用的表达载体在本领域中可获得并且可获自商业来源，例如英杰公司的pcDNA和pEF载体系列、碧迪科学公司(BD Sciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于重组表达所关注的蛋白质，或获得适合的启动子和/或转录终止子序列、polyA序列等。
细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括贴壁细胞培养物，例如，附着于培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。大部分的大规模悬浮培养物是作为分批工艺或分批补料工艺操作，因为它们操作和规模扩大最直接了当。如今，基于灌注原理的连续工艺正变得更常见的并且也是适合的。合适的培养基也是技术人员熟知的，并且通常可以从商业来源大量获得，或者根据标准方案定制。可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。培养细胞的合适条件是已知的(参见例如TissueCulture[组织培养]，学术出版社(Academic Press)，Kruse和Paterson编辑(1973)，以及R.I.Freshney，Culture of animal cells:A manual of basic technique[动物细胞培养：基本技术手册]，第四版(威利利斯公司，2000，ISBN 0-471-34889-9))。
本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F多肽和/或核酸分子，和/或载体的组合物。本发明因此提供了包含融合前RSV F多肽的组合物，该融合前RSV F多肽显示在RSV F蛋白质的融合前构象中存在但在融合后构象中不存在的一种表位。本发明还提供了包含编码这样的融合前RSV F多肽的核酸分子和/或载体的组合物。本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F多肽、和/或核酸分子、和/或载体的免疫原性组合物。本发明还提供了根据本发明的稳定化的融合前RSV F多肽、核酸分子、和/或载体用于在受试者中诱导针对RSV F蛋白质的免疫应答的用途。进一步提供了用于在受试者中诱导针对RSV F蛋白质的免疫应答的方法，这些方法包括给予受试者根据本发明的融合前RSV F多肽、和/或核酸分子、和/或载体。还提供了根据本发明的融合前RSV F多肽、核酸分子和/或载体，用于在受试者中诱导针对RSV F蛋白质的免疫应答。进一步提供了根据本发明的融合前RSV F多肽、和/或核酸分子、和/或载体用于制造用于在受试者中诱导针对RSV F蛋白质的免疫应答的药剂的用途。
本发明的融合前RSV F多肽、核酸分子或载体可以用于预防(防治)和/或治疗RSV感染。在某些实施例中，预防和/或治疗可以靶向易受RSV感染的患者群组。这样的患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的患者。
根据本发明的融合前RSV F多肽、核酸分子和/或载体可以用于例如由RSV所引起的疾病或病状的独立治疗和/或防治，或与其他防治和/或治疗性治疗，例如(现有或将来)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体组合。
本发明进一步提供了利用根据本发明的融合前RSV F多肽、核酸分子和/或载体用于在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法。在特定实施例中，用于在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法包括给予对其有需要的受试者有效量的如上所述的融合前RSV F多肽、核酸分子和/或载体。治疗有效量是指多肽、核酸分子或载体有效用于预防、缓解和/或治疗由被RSV感染所引起的疾病或病状的量。预防涵盖抑制或减少RSV的传播或抑制或减少与被RSV感染有关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如在此使用的，改善可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。
为给予受试者，例如人类，本发明可以采用医药组合物，这些医药组合物包含如在此所述的融合前RSV F多肽、核酸分子和/或载体以及医药学上可接受的载剂或赋形剂。在本上下文中，术语“医药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。这些药学上可接受的载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第18版，A.R.Gennaro编辑，马克出版公司(Mack Publishing Company)[1990]；PharmaceuticalFormulation Development of Peptides and Proteins[肽和蛋白质的制药配方开发]，S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑，Taylor和Francis[2000]；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients[药用辅料手册]，第3版，A.Kibbe编辑，英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。尽管还可以运用冻干制剂，但RSV F多肽、或核酸分子优选地是作为无菌溶液配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0到9.5，例如pH 5.0到7.5范围内。RSV F多肽典型地在具有适合的药学上可接受的缓冲液的溶液中，并且该组合物还可以含有盐。任选地，可以存在稳定剂，例如白蛋白。在某些实施例中，添加清洁剂。在某些实施例中，可以将RSV F多肽配制成可注射制剂。
在某些实施例中，根据本发明的组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知来进一步提高对一种所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在此可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的RSV F多肽的免疫应答。合适的助剂的实例包括铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，例如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540、WO 90/03184、WO 96/11711、WO2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(例如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等)；真核蛋白质(例如，其抗体或片段(例如针对抗原本身或CD1a，CD3，CD7，CD80)和受体的配体(例如，CD40L，GMCSF，GCSF等)，其在与受体细胞相互作用时刺激免疫应答。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05mg-5mg，例如每剂量铝含量为0.075mg-1.0mg。
这些融合前RSV F多肽还可以与例如像聚合物、脂质体、病毒体、病毒样粒子组合或结合来给予。这些融合前F多肽可以在有或者没有佐剂下与纳米粒子组合、用纳米粒子壳体包裹或与纳米粒子结合。封装在脂质体内描述于例如US 4,235,877中。与大分子结合披露在例如US 4,372,945或US4,474,757中。
在其他实施例中，这些组合物不包含佐剂。
在某些实施例中，本发明提供了用于产生针对呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的方法，这些方法包括提供根据本发明的组合物并且将其配制成一种医药学上可接受的组合物。术语“疫苗”是指含有在受试者中有效诱导一定程度的针对某一病原体或疾病的免疫性的活性组分的药剂或组合物，它将引起与被该病原体或该疾病感染有关的症状的严重程度、持续时间或其他表现的至少降低(多达完全缺乏)。在本发明中，该疫苗包含有效量的融合前RSV F多肽和/或编码融合前RSV F多肽的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体，它导致针对RSV F蛋白质的免疫应答。这提供了在受试者中预防引起住院治疗的严重下呼吸道疾病并且降低由RSV感染和复制引起的并发症例如肺炎和细支气管炎的频率的方法。根据本发明的术语“疫苗”表示它是一种医药组合物，并且因此典型地包括医药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。它可以包含或可以不包含另外的活性成分。在某些实施例中，它可以是一种组合疫苗，该组合疫苗进一步包含了诱发例如针对RSV的其他蛋白质和/或针对其他传染物的免疫应答的其他组分。另外的活性组分的给予可以例如通过分开给予或通过给予本发明的疫苗与其他活性组分的组合产物来进行。
可以将组合物给予受试者，例如人类受试者。用于单独给予的组合物中的RSV F多肽的总剂量可以是例如约0.01μg至约10mg，例如1μg-1mg，例如10μg-100μg。确定所推荐的剂量将通过实验进行并且对本领域技术人员来说是常规的。
根据本发明的组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实施例包括不经肠给予，例如皮内、肌内、皮下、经皮、或粘膜给予，例如鼻内、经口等。在一个实施例中，通过肌内注射来给予组合物。技术人员已知给予组合物(例如疫苗)以便诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同的可能性。
如在此所使用的受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、棉鼠、或非人类灵长类动物或人类。优选地，该受试者为人类受试者。
多肽、核酸分子、载体、和/或组合物还可以在同源或异源初免-加强方案中作为初免来给予或作为加强来给予。如果执行加强疫苗接种，那么典型地，此类加强疫苗接种将在该组合物第一次给予受试者(在这些情况下这被称为‘初次疫苗接种’)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时间处给予至同一受试者。在某些实施例中，给予包括初次给予和至少一次加强给予。
此外，本发明的多肽可以用作诊断工具，例如通过确定这样的个体的血清中是否存在能够结合本发明的多肽的抗体来测试个体的免疫状态。因此,本发明还涉及用于检测患者中RSV感染的存在的体外诊断方法，所述方法包括步骤：a)使获得自所述患者的生物样品与根据本发明的多肽接触；以及b)检测抗体-多肽复合物的存在。
本发明进一步提供了用于稳定RSV F多肽的融合前构象的方法，该方法包括如与野生型RSV F1和/或F2结构域相比，在RSV F1和/或F2结构域中引入至少一个突变，其中该至少一个突变锁定α螺旋4免于被RSV顶点(α螺旋1、4和5)中三螺旋中的突变铰链或移动。在某些实施例中，α4中的该至少一个突变是在位置203处的氨基酸残基Leu到Ile的突变。
通过这些方法可获得和/或获得的稳定化的融合前RSV F多肽，以及它们如上所述的其用途也成为本发明的一部分。
实例
实例1
为了使RSV F的融合前构象的不稳定顶点稳定化，将α4中的Leu203Ile取代引入具有稳定S215P突变和C-末端fibritin基序的亚稳态RSV F变体中。
RSV F蛋白质的表达和纯化
重组蛋白质在293Freestyle细胞(生命技术公司(Life Technologies))中表达。使用293Fectin(生命技术公司)，根据厂商说明书对细胞进行瞬时转染，并且在37℃和10％CO2的振荡培养箱中进行培养。在转染后第5天收货含有F蛋白质的培养物上清液。将无菌过滤的上清液储存在4℃下直到使用。将这些重组多肽通过2步方案(应用阳离子交换色谱，随后进行尺寸排阻色谱(图1))进行纯化。对于离子交换步骤，将培养物上清液用2倍体积的50mM NaOAc pH 5.0稀释，并以5ml/分钟通过5ml HiTrap Capto S(GE医疗集团(GEHealthcare))柱。随后用10倍柱体积(CV)的20mM NaOAc、50mM NaCl、0.01％(v/v)tween20，pH 5洗涤柱，并用50mM NaOAc、1M NaCl、0.01％(v/v)tween20，pH 5的15％步骤洗脱进行洗脱。将洗脱物浓缩并且使用40mM Tris、150mM NaCl、0.01％(v/v)tween20，以及pH 7.4作为运行缓冲液，将蛋白质在Superdex200柱(GE医疗集团)上进一步纯化。在SDS-PAGE和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析纯化的蛋白质(图2)。用考马斯亮蓝染色后凝胶上可见蛋白质。SDS-PAGE上的主带对应于还原样品中的RSV F蛋白质的F1和F2结构域；在非还原样品中，主带对应于与二硫键链接在一起的F1+F2结构域的大小。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上，蛋白质的电泳迁移率对应于RSV F三聚体之一。通过与CR9501抗体结合确定该纯化的蛋白质的融合前构象(数据未显示)。将该纯化的融合前三聚体RSV F蛋白质储存在4℃下直到进一步分析。
稳定性研究
在储存稳定性测定中评估融合前蛋白质自发转化为融合后构象的能力。将粗细胞培养物上清液样品储存在4℃下并且如上所述通过定量测定在Octet仪器上测量样品中F蛋白质的浓度。测量是在上清液收货当天(第1天)和储存指定时间段后进行。CR9501是仅识别融合前F构象的单克隆抗体(WO2012/006596)并用于测量融合前RSV F蛋白质浓度。
通过差示扫描荧光测定法(DSF)确定纯化的蛋白质的温度稳定性。将纯化的融合前F蛋白质与SYPRO橙色荧光染料(生命技术公司S6650)在96孔光学qPCR板中混合。最佳的染料和蛋白质浓度通过实验确定(数据未显示)。所有的蛋白质稀释液均在PBS中进行，并且仅含有染料的阴性对照样品用作参考扣除。使用以下参数在qPCR仪器(AppliedBiosystems[应用生物系统公司]ViiA 7)中进行测量：从25℃-95℃以0.015℃/秒的温度斜坡。不断地收集数据。使用GraphPad PRISM软件(版本5.04)绘制解链曲线的一阶导数。在导数曲线的最小点处计算解链温度。
如图3所示，仅在S215P取代下稳定的亚稳态F变体在4℃下储存5天后丧失了几乎所有与融合前特异性Mab CR9501的结合。相比之下，另外的L203I取代显著地增加了这种亚稳态RSV F变体的稳定性。收获当天CR9501结合的总的结合较高，并且在4℃下储存15天后仅观察到CR9501结合的小幅下降。与仅含有单个S215P取代的亚稳态融合前F蛋白质相比，Leu203到Ile的另外的取代增加了融合前F稳定性储存稳定性。根据DSF实验(图4)，与含有N67I和S215P取代(57.0℃)的变体相比，另外的L203I取代也提高了热稳定性(59.5℃)。
测试构建体的表达水平，储存稳定性和与对RSV-F的融合前构象具有特异性的抗体CR9501的抗体结合。以下给出了这个抗体的重链和轻链的可变区域以及重链和轻链的CDR的氨基酸序列。CR9501包含WO 2012/006596中称为58C5的抗体的结合区。
实例2
根据本发明，已经显示Leu203Ile取代与其他稳定突变的组合导致非常稳定的RSVF蛋白质。
RSV F蛋白质的表达、纯化和表征
如上所述，表达重组蛋白质并进行纯化。将纯化的蛋白质在SDS-PAGE上进行分析(图5)。蛋白质是纯的，其中在凝胶上观察到的唯一带对应于还原样品中的RSV F蛋白质的F1和F2结构域和对应于非还原样品中连接在一起的F1+F2结构域。纯化的样品的SEC-MALS分析(图6)表明存在于样品中的唯一蛋白质种类具有约170kDa的分子量，其对应于糖基化的RSV F三聚体的预期分子量。使用TSK G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience[东曹生物科学公司])在Agilent HPLC系统上进行SEC-MALS。使用MiniDAWN Treos在线检测器(怀亚特技术公司(Wyatt Technology))进行MALS测量。在280nm下使用UV监测器并且在660nm下使用折射率检测器(Optilab TrEX，怀亚特技术公司)监测蛋白质浓度。检测器以如下顺序探测：UV、MALS、RI。SEC-MALS实验采用MALS缓冲液(17,3gr Na2HPO4*2H2O/L、7.3gr NaH2PO4*H2O/L、2.9gr NaCl/L，pH 7)以及1ml/min的流速。使用折射率检测器和0.141ml/g的折射率增量(dn/dc)值，使用Astra软件6.1(怀亚特技术公司)分析数据。通过使用折射率结果的最高峰值确定分子量，使用对消光系数校正的UV信号的总峰面积％来确定总峰面积。
稳定性研究
如实例1中所述，通过差示扫描荧光测定法(DSF)确定纯化的蛋白质的温度稳定性。如图4所示，当L203I取代与S215P、D486N组合，与或不与N67I组合时，蛋白质的热稳定性分别增加至约67℃和约70℃。
表1.标准氨基酸，缩写和性质
氨基酸 3字母 1字母 侧链极性 侧链电荷(pH 7.4)
丙氨酸 Ala A 非极性 中性
精氨酸 Arg R 极性 正
天冬酰胺 Asn N 极性 中性
天冬氨酸 Asp D 极性 负
半胱氨酸 Cys C 非极性 中性
谷氨酸 Glu E 极性 负
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性
甘氨酸 Gly G 非极性 中性
组氨酸 His H 极性 正(10％)中性(90％)
异亮氨酸 Ile I 非极性 中性
亮氨酸 Leu L 非极性 中性
赖氨酸 Lys K 极性 正
甲硫氨酸 Met M 非极性 中性
苯丙氨酸 Phe F 非极性 中性
脯氨酸 Pro P 非极性 中性
丝氨酸 Ser S 极性 中性
苏氨酸 Thr T 极性 中性
色氨酸 Trp W 非极性 中性
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性
缬氨酸 Val V 非极性 中性
表2.抗体CR9501和CR9502的氨基酸序列
以下给出了若干融合前RSV F构建体的氨基酸序列。注意的是在此所述的不同的构建体中的氨基酸编号是基于野生型序列(具有两个修饰(K66E和I76V)的SEQ ID NO:13)。
序列
RSV F蛋白质A2全长序列(SEQ ID NO:13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
RSV F蛋白质B1全长序列(SEQ ID NO:15)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
SEQ ID NO:14(fibritin)
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
FA2、K66E、I76V、S215P(SEQ ID NO:20)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
FA2、K66E、I76V、L203I、S215P(SEQ ID NO:21)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQILPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
FA2、K66E、I76V、L203I、S215P、D486N(SEQ ID NO:23)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQILPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
FA2、K66E、N67I、I76V、L203I、S215P、D486N(SEQ ID NO:24)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQILPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
RSV F蛋白质CL57-v224全长序列(SEQ ID NO:22)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCW KLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
CR9501重链(SEQ ID NO:16)：
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501轻链(SEQ ID NO:17)：
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CR9502重链(SEQ ID NO:18)：
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502轻链(SEQ ID NO:19)：
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGG GTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS

Claims (19)

1.一种重组融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)多肽，其中如与在野生型RSV F蛋白质中的RSV F1和/或F2结构域相比，该多肽在F1和/或F2结构域中包含至少两个稳定突变，其中这些稳定突变中的至少一个是在位置203上的氨基酸残基L到I的突变。
2.根据权利要求1所述的融合前RSV F多肽，其中该多肽进一步包含在位置215上的氨基酸残基S的突变，优选地在位置215上的氨基酸残基S到P的突变。
3.根据权利要求1或2所述的融合前RSV F多肽，其中该多肽包含至少一个对该融合前构象F蛋白质具有特异性的表位，其中该至少一个表位被以下各项识别：一种融合前特异性单克隆抗体，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:1的重链CDR1区、SEQ ID NO:2的重链CDR2区、SEQ ID NO:3的重链CDR3区和SEQ ID NO:4的轻链CDR1区、SEQ ID NO:5的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:6的轻链CDR3区；和/或一种融合前特异性单克隆抗体，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:7的重链CDR1区、SEQ ID NO:8的重链CDR2区、SEQ ID NO:9的重链CDR3区和SEQ ID NO:10的轻链CDR1区、SEQ ID NO:67的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:11的轻链CDR3区。
4.根据权利要求1、2或3所述的融合前RSV F多肽，其中该多肽是三聚体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的融合前RSV F多肽，包含截短的F1结构域，其中该多肽包含连接至所述截短的F1结构域的异源三聚结构域。
6.根据权利要求5所述的融合前RSV F多肽，其中该异源三聚结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:14)。
7.根据权利要求5或6所述的融合前RSV F多肽，其中该三聚结构域连接至RSV F蛋白质的氨基酸残基513。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的融合前RSV F多肽，其中该多肽包含至少一个另外的突变，其中所述突变选自下组，该组由以下各项组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基突变；
(b)在位置67上的氨基酸残基突变；
(c)在位置83上的氨基酸残基突变；
(d)在位置92上的氨基酸残基突变；
(e)在位置184上的氨基酸残基突变；
(f)在位置207上的氨基酸残基突变；
(g)在位置486上的氨基酸残基突变；以及
(h)在位置487上的氨基酸残基突变。
9.根据权利要求8所述的融合前RSV F多肽，其中该至少一个另外的突变选自下组，该组由以下各项组成：
(a)在位置46上的氨基酸残基S到G的突变；
(b)在位置67上的氨基酸残基N/T到I的突变；
(c)在位置83上的氨基酸残基L到M的突变；
(d)在位置92上的氨基酸残基E到D的突变；
(e)在位置184上的氨基酸残基G到N的突变；
(f)在位置207上的氨基酸残基V到I的突变；
(g)在位置486上的氨基酸残基D到N的突变；以及
(h)在位置487上的氨基酸残基E到Q、N或I的突变。
10.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F多肽，其中该F1结构域和/或该F2结构域来自RSV A病毒株。
11.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F多肽，其中该F1结构域和/或该F2结构域来自RSV B病毒株。
12.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSV F多肽，其中该多肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:24。
13.编码根据前述权利要求1-12中任一项所述的融合前RSV F多肽的核酸分子。
14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中已经将该核酸分子密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
15.一种载体，该载体包含根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子。
16.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-12中任一项所述的融合前RSV F多肽、根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子和/或根据权利要求15所述的载体。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的融合前RSV F多肽、根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子、和/或根据权利要求15所述的载体，用于诱导针对RSV F蛋白质的免疫应答。
18.根据权利要求1-12中任一项所述的融合前RSV F多肽、根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子、和/或根据权利要求15所述的载体，用作疫苗。
19.根据权利要求1-12中任一项所述的融合前RSV F多肽、根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子、和/或根据权利要求15所述的载体，用于预防和/或治疗RSV感染。
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