KR20200142031A - Pd-l1 결합 아피머 및 이와 관련된 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질, 이들 단백질을 코딩하는 유전자 발현 구축물, 이들 단백질을 발현하는 세포, 및 이들 단백질, 유전자 발현 구축물 및 세포의 제약 제제, 및 암을 포함한 다양한 인간 상태의 치료에서의 용도에 관한 것이다.

Description

PD-L1 결합 아피머 및 이와 관련된 용도
관련 출원
본 출원은 2018년 4월 11일에 출원된 영국 출원 번호 1805963.4를 35 U.S.C. § 119(a) 하에 우선권 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간 암은 다수의 유전적 및 후성적 변경을 보유하여, 면역계에 의해 잠재적으로 인식가능한 신생항원을 생성한다 (Sjoblom et al., Science 314:268-74 (2006)). 암에 대한 내인성 면역 반응이 전임상 모델 및 환자에서 관찰되긴 하지만, 이러한 반응은 효과적이지 않고, 정착된 암은 "자기"로서 간주되어 면역계에 의해 관용된다. 이러한 관용 상태에 기여하면서, 종양은 숙주 면역 반응을 능동적으로 억제하기 위해 여러 별개의 메카니즘을 이용할 수 있다 (Topalian et al., J Clin Oncol 29:4828-36 (2011); Mellman et al., Nature 480:480-489 (2011)). 이들 메카니즘 중에서, 통상적으로 측부 조직 손상을 완화시키기 위해 면역 반응을 종결시키는 내인성 "면역 체크포인트"는 면역 파괴를 피하기 위해 종양에 의해 공동-선택될 수 있다. 특이적 면역 체크포인트 경로 억제제를 개발하기 위한 노력은, 진행성 흑색종을 갖는 환자의 치료를 위한 항-CTLA-4 항체인 이필리무맙의 개발을 비롯하여, 암을 치료하기 위한 새로운 면역요법 접근법을 제공하기 시작하였다 (Nodi et al., New Engl J Med 363:711-23 (2010)).
프로그램화된 사멸-1 (PD-1)은 활성화된 T 및 B 세포에 의해 발현된 주요 면역 체크포인트 수용체이고, 면역억제를 매개한다. PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 및 BTLA를 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 구성원이다. PD-1에 대한 2종의 세포 표면 당단백질 리간드인 프로그램화된 사멸 리간드-1 (PD-L1) 및 프로그램화된 사멸 리간드-2 (PD-L2)가 확인되었으며, 이는 항원-제시 세포뿐만 아니라 많은 인간 암에서 발현되고, PD-1에 결합시 T 세포 활성화 및 시토카인 분비를 하향조절하는 것으로 밝혀졌다 (Freeman et al., J. Exp. Med. 192(7): 1027-34 (2000); Latchm an et al., Nat Immunol 2:261-8 (2001)).
PD-1은 활성화된 T-세포가 종양 및/또는 기질 세포에 의해 발현된 면역억제 PD-L1 (B7-H1 또는 CD274로도 불림) 및 PD-L2 (B7-DC) 리간드와 마주칠 수 있는 말초 조직에서 주로 기능한다 (Flies et al., Yale J Biol Med 84:409-21 (2011); Topalian et al., Curr Opin Immuno 24:1-6 (2012)).
PD-1/PD-L1 상호작용의 억제는 전임상 모델에서 강력한 항종양 활성을 매개한다 (미국 특허 번호 8,008,449 및 7,943,743). PD-L1의 상향조절은 암이 숙주 면역계를 피하게 할 수 있는 것으로 보인다. 신세포 암종을 갖는 환자로부터의 196개 종양 시편의 분석은 PD-L1의 높은 종양 발현이 증가된 종양 공격성 및 4.5배 증가된 사멸 위험과 연관되어 있다는 것을 밝혀내었다 (Thompson et al., Proc Natl Acad Sci USA 101 (49): 17174-9 (2004)). PD-L1의 보다 높은 발현을 갖는 난소암 환자는 보다 낮은 발현을 갖는 환자보다 유의하게 더 불량한 예후를 가졌다. PD-L1 발현은 상피내 CD8+ T-림프구 수와 역의 상관관계가 있었으며, 이는 종양 세포 상의 PD-L1이 항종양 CD8+ T 세포를 억제할 수 있다는 것을 시사한다 (Hamanishi et al., Proc Natl Acad Sci USA 104 (9): 3360-3365 (2007)).
PD-L1은 또한 감염성 질환, 특히 만성 감염성 질환에 연루되어 왔다. 세포독성 CD8 T 림프구 (CTL)는 감염의 제어에서 중추적 역할을 한다. 그러나, 활성화된 CTL은 종종 만성 감염 동안 이펙터 기능을 상실한다. B7/CD28 패밀리의 PD-1 수용체 및 그의 리간드 PD-L1은 T 세포 공동-억제 경로로서 기능하고, 인간 면역결핍 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 포진 바이러스, 및 만성 감염을 확립할 수 있는 다른 박테리아, 원충 및 바이러스 병원체로의 만성 감염 동안 이펙터 CTL을 소진된 CTL로 전환시키는 주요 조절제로서 대두되고 있다. 이러한 박테리아 및 원충성 병원체는 이. 콜라이(E. coli), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 지아르디아(Giardia), 말라리아(Malaria), 리슈마니아(Leishmania) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함할 수 있다. 중요하게는, PD-1/PD-L1 경로의 차단은 소진된 CTL에 대한 기능적 능력을 회복시킬 수 있다. 따라서 PD1/PD-L1은 만성 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 효과적인 예방적 및 치료적 백신접종을 개발하기 위한 표적이다 (예를 들어, 문헌 [Hofmeyer et al., Journal of Biomedicine and Biotechnology, vol. 2011, Article ID 451694, 9 pages, doi:10.1155/2011/451694] 참조).
최근 연구는 또한 전신 면역 억제가 신경변성 질환에서 뇌 복구에 필요한 보호성 세포-매개 면역 반응을 탑재하는 능력을 축소시킬 수 있다는 것을 제시하였다. 알츠하이머병의 마우스 모델을 사용함으로써, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1) 경로에 대해 지시된 면역 체크포인트 차단은 인터페론 γ-의존성 전신 면역 반응을 유발하는 것으로 나타났고, 이어서 단핵구-유래 대식세포가 뇌로 동원되었다. 이러한 면역학적 반응은 확립된 병리상태를 갖는 마우스에서 유도되는 경우에, 뇌 아밀로이드-β (Aβ) 플라크의 클리어런스 및 개선된 인지 성능을 유도하였다. 이들 발견은 면역 체크포인트가 PD-L1에 대한 항체를 사용하여 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병에서 치료적으로 표적화될 수 있다는 것을 시사한다 (예를 들어, 문헌 [Baruch et al., Nature Medicine, January 2016, doi:10.1038/nm.4022] 참조).
PD-L1에 대한 특이적 항체는 항암제로서 개발되었다 (미국 특허 번호 9,212,224 및 8,008,449 참조). 암을 치료하기 위한 PD-1/PD-L1 상호작용의 Ab 억제제의 사용은 임상 시험에 들어갔다 (Brahmer et al., J Clin Oncol 28:3167-75 (2010); Flies et al., Yale J Biol Med 84:409-21 (2011); Topalian et al., N Engl J Med 366:2443-54 (2012); Brahmer et al., N Engl J Med 366:2455-65 (2012)). 그러나, 암, 감염성 질환 및 신경변성 질환, 예를 들어 알츠하이머병의 치료에 유용한 추가의 PD-L1 억제 활성 - 예컨대, 예를 들어 치료 활성 또는 PK/ADME 조절 활성을 제공하는 다른 폴리펩티드 서열과의 융합 단백질의 일부로서 용이하게 포맷화될 수 있는 PD-L1 억제제에 대한 필요가 존재한다. 본 출원은 상기 및 다른 필요를 충족시킨다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-L1에 결합하고 인간 PD-1과의 상호작용을 차단한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-L1에 결합하고 인간 CD80과의 상호작용을 차단한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 1x10-7M 이하의 Kd, 1x10-8M 이하의 Kd, 1x10-9M 이하의 Kd 또는 심지어 1x10-10M 이하의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 10-3s-1 또는 더 느린, 10-4s-1 또는 더 느린 또는 심지어 10-5s-1 또는 더 느린 Koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 103M-1s-1 또는 더 빠른, 104M-1s-1 또는 더 빠른, 105M-1s-1 또는 더 빠른 또는 심지어 106M-1s-1 또는 더 빠른 Kon으로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 검정에서 PD-L1에 1 μM 이하, 100 nM 이하, 40 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 심지어 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합한다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 CD80 (B7-1)과의 경쟁적 결합 검정에서 PD-L1에 1 μM 이하, 100 nM 이하, 40 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합한다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 화학식 (I)에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는다:
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
여기서
FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열식별번호: 1)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열식별번호: 2)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열식별번호: 3)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고;
n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이다.
일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 하기 화학식에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는다:
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 4)
여기서
Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고;
n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이고;
Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp 또는 Glu이고;
Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr이고;
Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이고;
Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고;
Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이다.
일부 실시양태에서, Xaa1은 Gly, Ala, Arg 또는 Lys, 보다 더 바람직하게는 Gly 또는 Arg이다. 일부 실시양태의 경우, Xaa2는 Gly 또는 Ser이다. 일부 실시양태의 경우, Xaa3은 Arg Arg, Lys, Asn 또는 Gln, 보다 바람직하게는 Lys 또는 Asn이다. 일부 실시양태의 경우, Xaa4는 Gly 또는 Ser이다. 일부 실시양태의 경우, Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro, 보다 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Pro, 보다 더 바람직하게는 Leu 또는 Pro이다. 일부 실시양태의 경우, Xaa6은 Ala, Val, Asp 또는 Glu, 보다 더 바람직하게는 Ala 또는 Glu이다. 일부 실시양태의 경우, Xaa7은 Ile, Leu 또는 Arg, 보다 바람직하게는 Leu 또는 Arg이다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 하기 화학식에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는다:
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 5)
여기서 Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고; n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이다.
상기 서열의 일부 실시양태에서, (Xaa)n ("루프 2")은 화학식 (II)에 나타내어진 아미노산 서열이다:
-aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6- (II)
여기서
aa1은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 보다 바람직하게는 소형 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 소형 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa6은 방향족 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다.
일부 실시양태의 경우, aa1은 Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Lys 또는 Arg를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa2는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa3은 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, 보다 바람직하게는 His 또는 Tyr, Trp 또는 His를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa4는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa5는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa6은 Phe, Tyr, Trp, Asp 또는 Glu; 바람직하게는 Trp 또는 Asp; 보다 바람직하게는 Trp를 나타낸다.
상기 서열의 특정의 다른 실시양태에서, (Xaa)n ("루프 2")은 화학식 (III)에 나타내어진 아미노산 서열이다:
-aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp- (III)
여기서
aa1은 염기성 측쇄 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 보다 바람직하게는 소형 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Tyr, Trp 또는 His를 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu를 나타내고;
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 소형 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg를 나타낸다.
일부 실시양태의 경우, aa1은 Lys, Arg, His, Ser, Thr, Asn 또는 Gln, 보다 바람직하게는 Lys, Arg, His, Asn 또는 Gln, 보다 더 바람직하게는 Lys 또는 Asn을 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa2는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa3은 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Tyr, Trp 또는 His를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa4는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa5는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg를 나타낸다.
상기 서열의 일부 실시양태에서, (Xaa)n ("루프 2")은 서열식별번호: 6 내지 41로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 그에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 서열의 일부 실시양태에서, (Xaa)n ("루프 2")은 서열식별번호: 6 내지 41로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 그에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 서열의 일부 실시양태에서, (Xaa)m ("루프 4")은 화학식 (IV)에 나타내어진 아미노산 서열이다:
-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15- (IV)
여기서
aa7은 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa8은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa9는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa10은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa11은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa12는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa13은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa14는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa15는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 중성 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다.
일부 실시양태의 경우, aa7은 Gly, Ala, Val, Pro, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu, 보다 더 바람직하게는 Gly, Ala, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa8은 Asp, Glu, Lys, Arg, His, Gln, Ser, Thr, Asn, Ala, Val, Pro, Gly, Tyr 또는 Phe, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, Lys, Arg, His 또는 Gln을 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa9는 Gln, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Arg, Lys, Gly, Leu, Pro 또는 Tyr, 보다 더 바람직하게는 Gln, Thr 또는 Asp를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa10은 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Gln, Asn, Ala, Leu, Tyr, Trp, Pro 또는 Gly, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, His, Gln, Asn, Leu, Trp 또는 Gly를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa11은 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Arg, Lys, His, Val, Ile, Tyr 또는 Gly, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Lys 또는 His를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa12는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Asn, Lys, Arg, Val, Leu, Ile, Trp, Tyr, Phe 또는 Gly, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Tyr, Trp, Arg 또는 Lys를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa13은 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Pro, Asp, Glu, His, Arg, Trp, Tyr 또는 Phe, 보다 더 바람직하게는 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Asp 또는 Glu를 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa14는 Ala, Ile, Trp, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, His, Ser, Thr, Gln 또는 Asn, 보다 더 바람직하게는 Ala, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, Ser, Gln 또는 Asn을 나타낸다. 일부 실시양태의 경우, aa15는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln, Asn, Ala, Val, Leu, Gly 또는 Phe, 보다 더 바람직하게는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다.
상기 서열의 일부 실시양태에서, (Xaa)n ("루프 4")은 서열식별번호: 42 내지 77로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 그에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 서열의 일부 실시양태에서, (Xaa)n ("루프 4")은 서열식별번호: 42 내지 77로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 그에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 서열식별번호: 78 내지 86으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성, 보다 더 바람직하게는 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 서열식별번호: 78 내지 86으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 동일성, 보다 더 바람직하게는 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 서열식별번호: 87 내지 94 중 하나의 뉴클레오티드 1-336에 상응하는 코딩 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 동일한, 보다 더 바람직하게는 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일한 코딩 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에 이어 65℃에서 0.2X SSC 중 세척의 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 87 내지 94 중 어느 하나에 혼성화되는 코딩 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제 단백질은 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙, 아벨루맙 및/또는 두르발루맙에 의한 PD-L1 결합과의 경쟁적 방식으로 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 통해 PD-L1에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제 단백질은 Ile-54, Tyr-56, Glu-58, Glu-60, Asp-61, Lys-62, Asn-63, Gln-66, Val-68, Val-76, Val-111, Arg-113, Met-115, Ile-116, Ser-117, Gly-120, Ala-121, Asp-122, Tyr-123 및 Arg-125로부터 선택된 PD-L1의 적어도 10개의 잔기를 수반하는 계면을 포함하는 PD-L1과의 결정 구조를 형성하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제 단백질은 PD-L1에 결합하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드에 의존성인 방식으로, (a) 스타필로코쿠스 장독소 B (SEB)로 처리된 경우 인간 PBMC에서 특정 Vfi 쇄, 예를 들어 VB3, VB12, VB14 및 VB17을 보유하는 T 세포의 하위세트에서 T-세포 수용체 신호전달을 증가시키고/거나; (b) SEB 검정에서 인터페론-γ 생산을 증가시키고/거나; (c) SEB 검정에서 인터류킨-2 (IL-2) 생산을 용량 의존성 방식으로 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제 단백질은 PD-L1에 결합하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드에 의존성인 방식으로, (a) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 T-세포 증식을 증가시키고/거나; (b) MLR 검정에서 인터페론-γ 생산을 증가시키고/거나; (c) MLR 검정에서 인터류킨-2 (IL-2) 분비를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드에 추가로, 예시하자면, 분비 신호 서열, 펩티드 링커 서열, 친화성 태그, 막횡단 도메인, 세포 표면 보유 서열, 번역후 변형을 위한 기질 인식 서열, 단백질-단백질 상호작용을 통해 응집하는 단백질의 다량체 구조를 생성하는 다량체화 도메인, 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티, 항체의 조직 국재화 및 항원 결합 부위를 변경시키기 위한 폴리펩티드 서열, 및 PD-L1 또는 상이한 표적에 결합하는 1개 이상의 추가의 아피머 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 예컨대 Fc 도메인 또는 그의 부분, 알부민 단백질 또는 그의 부분, 알부민-결합 폴리펩티드 모이어티, 트랜스페린 또는 그의 부분, 트랜스페린-결합 폴리펩티드 모이어티, 피브로넥틴 또는 그의 부분, 또는 피브로넥틴-결합 폴리펩티드 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티를 포함한다.
융합 단백질이 Fc 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 경우에, 일부 실시양태에서 이는 FcRn 결합을 보유하는 Fc 도메인이다.
융합 단백질이 Fc 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 경우에, 일부 실시양태에서 Fc 도메인 또는 그의 부분은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 또는 그의 하위부류 (이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 111 또는 서열식별번호: 112의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성, 보다 더 바람직하게는 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
융합 단백질이 Fc 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 경우에, 일부 실시양태에서 Fc 도메인 또는 그의 부분은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; B 세포 수용체의 하향 조절 또는 그의 조합으로부터 선택된 이펙터 기능을 보유한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질이 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티를 포함하는 경우에, 그 모이어티는 단백질에서 그것이 부재하는 경우에 비해 단백질의 혈청 반감기를 적어도 5배, 예를 들어 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 500배 또는 심지어 1000배만큼 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염 등을 추가로 포함하는, 인간 환자에서의 치료 용도에 적합한 제약 제제로서 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 표적 항원에 결합하는 1개 이상의 항원 결합 부위를 형성하는 1개 이상의 VH 및/또는 VL 쇄를 포함하는 재조합 항체이며, 여기서 VH 및/또는 VL 쇄 중 적어도 1개는 PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 억제하는 적어도 1개의 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열을 또한 포함하는 융합 단백질인 재조합 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-L1에 결합하고 인간 PD-1과의 상호작용을 차단한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 1x10-7M 이하의 Kd, 1x10-8M 이하의 Kd, 1x10-9M 이하의 Kd 또는 심지어 1x10-10M 이하의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 10-3s-1 또는 더 느린, 10-4s-1 또는 더 느린 또는 심지어 10-5s-1 또는 더 느린 Koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 103M-1s-1 또는 더 빠른, 104M-1s-1 또는 더 빠른, 105M-1s-1 또는 더 빠른 또는 심지어 106M-1s-1 또는 더 빠른 Kon으로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 검정에서 PD-L1에 1 μM 이하, 100 nM 이하, 40 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 심지어 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합한다.
일부 실시양태에서, VH 쇄는 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 면역 체크포인트이다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 면역 공동자극 수용체이고, 키메라 항체는 결합시 공동자극 수용체에 효능작용한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 혈관신생 인자 또는 그에 대한 수용체이고, 키메라 항체는 혈관신생 인자 또는 그에 대한 수용체에 길항작용한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 종양 항원이다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 가용성 면역억제 인자 또는 그에 대한 수용체이고, 키메라 항체는 면역억제 인자의 면역억제 활성을 억제하여 면역자극 신호로서 작용한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 PD-1, PD-L2, CTLA-4, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA, TIGIT, CD28, ICOS, CD137, OX40, GITR, CD27, CD30, HVEM, DNAM-1 또는 CD28H, CEACAM-1, CEACAM-5, BTLA, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR, B7-H3, B7-H4, CD40, CD4OL, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, 갈렉틴-9, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, LIGHT, MHC 부류 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX4OL, PVR, SIRPα, TCR, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, VEGF, VEGF 수용체, EGFR, Her2/neu, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E 또는 TSLP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서,
서열식별번호: 113의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성 (예를 들어, 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성)을 갖는 서열을 갖는 아피머-중쇄 융합 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨), 및
서열식별번호: 114의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성 (예를 들어, 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성)을 갖는 서열을 갖는 경쇄 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨)
을 포함하는 재조합 아피머-이필리무맙 항체 융합 단백질이 제공된다.
일부 실시양태에서,
서열식별번호: 115 또는 117의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성 (예를 들어, 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성)을 갖는 아피머-중쇄 융합 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨), 및
서열식별번호: 116의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성 (예를 들어, 그에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성)을 갖는 서열을 갖는 경쇄 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨)
을 포함하는 재조합 아피머-베바시주맙 항체 융합 단백질이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 항체는 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염 등을 추가로 포함하는, 인간 환자에서의 치료 용도에 적합한 제약 제제로서 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, (i) 수용체의 리간드 결합 도메인, 및 (ii) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 재조합 수용체 트랩 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 1x10-7M 이하의 Kd, 1x10-8M 이하의 Kd, 1x10-9M 이하의 Kd 또는 심지어 1x10-10M 이하의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 10-3s-1 또는 더 느린, 10-4s-1 또는 더 느린 또는 심지어 10-5s-1 또는 더 느린 Koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 103M-1s-1 또는 더 빠른, 104M-1s-1 또는 더 빠른, 105M-1s-1 또는 더 빠른 또는 심지어 106M-1s-1 또는 더 빠른 Kon으로 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 검정에서 PD-L1에 1 μM 이하, 100 nM 이하, 40 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 심지어 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 결합 도메인은 PGE2, TGF-β, VEGF, CCL2, IDO, CSF1, IL-10, IL-13, IL-23 또는 아데노신에 결합한다.
일부 실시양태에서, 재조합 수용체 트랩 융합 단백질은 재조합 수용체 트랩 융합 단백질의 다량체화, 즉 다량체 복합체 내에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 심지어 10개의 재조합 수용체 트랩 융합 단백질을 포함하는 복합체를 유도하는 1개 이상의 다량체화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 수용체 트랩 융합 단백질은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염 등을 추가로 포함하는, 인간 환자에서의 치료 용도에 적합한 제약 제제로서 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, (i) 동족 수용체에 결합하여 효능작용 또는 길항작용하는 폴리펩티드 리간드 서열, 및 (ii) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 재조합 수용체 리간드 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 1x10-7M 이하의 Kd, 1x10-8M 이하의 Kd, 1x10-9M 이하의 Kd 또는 심지어 1x10-10M 이하의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 10-3s-1 또는 더 느린, 10-4s-1 또는 더 느린 또는 심지어 10-5s-1 또는 더 느린 Koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 103M-1s-1 또는 더 빠른, 104M-1s-1 또는 더 빠른, 105M-1s-1 또는 더 빠른 또는 심지어 106M-1s-1 또는 더 빠른 Kon으로 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 검정에서 PD-L1에 1 μM 이하, 100 nM 이하, 40 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 심지어 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합한다.
재조합 수용체 리간드 융합 단백질의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 리간드는 공동-자극 수용체에 대한 리간드이고, 결합시 공동-자극 수용체에 효능작용한다.
예를 들어, 폴리펩티드 리간드는 B7.1, 4-1BBL, OX40L, GITRL 또는 LIGHT로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 폴리펩티드 리간드는 항종양 면역을 촉진하는 면역자극 시토카인, 예컨대 IFN-α2, IL-2, IL-15, IL-21 및 IL-12일 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 수용체 리간드 융합 단백질은 재조합 수용체 리간드 융합 단백질의 다량체화, 즉 다량체 복합체 내에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 심지어 10개의 재조합 수용체 리간드 융합 단백질을 포함하는 복합체를 유도하는 1개 이상의 다량체화 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 수용체 리간드 융합 단백질은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염 등을 추가로 포함하는, 인간 환자에서의 치료 용도에 적합한 제약 제제로서 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, (i) T-세포의 표면 상의 CD3에 결합하는 CD3 결합 폴리펩티드, 및 (ii) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 다중특이적 T-세포 결속화 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 1x10-7M 이하의 Kd, 1x10-8M 이하의 Kd, 1x10-9M 이하의 Kd 또는 심지어 1x10-10M 이하의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 10-3s-1 또는 더 느린, 10-4s-1 또는 더 느린 또는 심지어 10-5s-1 또는 더 느린 Koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 103M-1s-1 또는 더 빠른, 104M-1s-1 또는 더 빠른, 105M-1s-1 또는 더 빠른 또는 심지어 106M-1s-1 또는 더 빠른 Kon으로 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 검정에서 PD-L1에 1 μM 이하, 100 nM 이하, 40 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 심지어 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 T-세포 결속화 융합 단백질은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염 등을 추가로 포함하는, 인간 환자에서의 치료 용도에 적합한 제약 제제로서 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, (i) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 세포외 부분; (ii) 막횡단 도메인; 및 (c) 4-1BB 신호전달 도메인 및 CD3ε 신호전달 도메인 및 임의적인 공동자극 신호전달 영역을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 1x10-7M 이하의 Kd, 1x10-8M 이하의 Kd, 1x10-9M 이하의 Kd 또는 심지어 1x10-10M 이하의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 10-3s-1 또는 더 느린, 10-4s-1 또는 더 느린 또는 심지어 10-5s-1 또는 더 느린 Koff로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 PD-L1에 103M-1s-1 또는 더 빠른, 104M-1s-1 또는 더 빠른, 105M-1s-1 또는 더 빠른 또는 심지어 106M-1s-1 또는 더 빠른 Kon으로 결합한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 검정에서 PD-L1에 1 μM 이하, 100 nM 이하, 40 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 심지어 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 키메라 수용체 융합 단백질을 코딩하는 유전자로 조작된 세포, 바람직하게는 림프구, 보다 더 바람직하게는 T-림프구를 제공하며, 이러한 유전자는 발현되는 경우에 세포 표면 상에 키메라 수용체 융합 단백질을 제시한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 아피머 작용제, 예컨대 상기 (및 본원에) 기재된 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
일부 실시양태에서, 코딩 서열은 1개 이상의 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 1개 이상의 복제 기점, 미니염색체 유지 요소 (MME) 및/또는 핵 국재화 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 코딩 서열과 작동가능하게 연결되고 코딩 서열과 함께 전사되는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 코딩 서열은 1개 이상의 인트론 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 코딩 서열과 함께 전사되는 1개 이상의 리보솜 결합 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 RNA, 예컨대 mRNA이다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 아피머 작용제, 예컨대 상기 (및 본원에) 기재된 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 아피머 작용제, 예컨대 상기 (및 본원에) 기재된 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 DNA, 플라스미드 벡터 또는 미니서클이 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 가용성 수용체 또는 그의 리간드 결합 도메인을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 성장 인자, 시토카인 또는 케모카인 또는 그의 생물학적 활성 폴리펩티드 단편을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 공동자극 효능제 폴리펩티드를 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 체크포인트 억제 폴리펩티드를 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 및 그에 접합된 검출가능한 표지, 독소 또는 1종 이상의 치료제를 포함하는 아피머 작용제를 제공한다.
또한, 본 개시내용의 핵산, 바이러스 벡터, 플라스미드 DNA, 플라스미드 벡터 또는 미니서클, 및 (ii) 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염, 형질감염 증진제, 전기천공 증진제 등을 포함하는, 인간 환자에서의 치료 유전자 전달에 적합한 제약 제제가 본원에 제공된다.
추가로, 대상체에게 본원에 기재된 단백질, 재조합 항체 또는 핵산 (PD-L1에 결합하는 아피머를 포함함)을 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 PD-L1을 발현하는 암 세포를 포함하며, 임의로 여기서 암 세포는 흑색종 세포이다.
일부 실시양태에서, 단백질, 재조합 항체 또는 핵산은 혼합 림프구 반응에서 T 세포에 의한 IFNγ 생산의 증가를 도출하는 유효량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 단백질, 재조합 항체 또는 핵산은 비히클-단독 대조군에 비해 대상체에서 T 세포에 의한 IFNγ 생산을 적어도 2배만큼 증가시키는 유효량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 PD-L1을 발현하는 암 세포를 포함하는 종양을 갖고, 종양 내 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 축적의 수준은 투여 96시간 후에 혈장 내 수준의 적어도 5배이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 PD-L1을 발현하는 암 세포를 포함하는 종양을 갖고, 단백질, 재조합 항체 또는 핵산은 대상체에서 종양의 성장을 적어도 10%만큼 억제하는 유효량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 흑색종을 갖는다.
도 1. 아피머 라이브러리의 생성: 가변화된 결합 루프는 독특한 결합 표면 및 선택가능한 아피머 결합제를 생성한다.
도 2. 단량체 아피머 결합. 인간 폐 선암종 암 세포주에서의 유동 세포측정법에 의한 아피머 결합.
도 3. 아피머 다량체는 다중 포맷의 높은 수율 및 순도로 이. 콜라이에서 용이하게 발현된다 (심지어 진탕기 플라스크 생산에서도).
도 4a 및 4b. 아피머 다량체는 단량체 결합 도메인을 넘어선 결합력을 나타내는 동역학으로 PD-L1에 결합한다.
도 5a 및 5b 및 5c. 아피머 Fc 융합체는 이펙터 기능, 반감기 연장 및 증진된 친화도를 제공한다.
도 6a-6c. PD-1 및 CD80 및 PD-L1 항체 기준물에 대한 경쟁 ELISA.
도 7. 아피머-Fc 융합체는 증가된 혈청 반감기를 나타낸다.
도 8. 인간 PBMC 자극 검정에 의한 면역원성 시험은 코어 아피머 서열이 인간에서 면역원성일 위험이 낮다는 것을 나타낸다.
도 9. 데이터는 아피머가 인간 Fc 상의 다양한 부위에서 포맷화될 수 있고 따라서 IgG-아피머 융합체로 해석될 것임을 나타낸다. 전형적인 발현 수율은 400-800 mg/l 범위이다. 분석용 SEC-HPLC를 사용하여 순도를 평가하였다.
도 10. 비아코어를 사용하여 결정된 여러 PD-L1 아피머 Fc 포맷의 KD를 예시하며, 치료 표적에 적합한 결합 동역학의 미세 조정을 위한 고도로 가요성인 포맷화를 보여준다. 2가 Fc 포맷에 의한 결합력 효과가 명백하게 관찰되었다.
도 11a-11b. 이필리무맙 (바이오시밀러) / AVA04-141은 Expi293F 세포에서 일시적으로 발현되었고, 단백질 A 정제 후 정제된 수율은 ~160 mg/L이었다.
도 12a-12c. 비최적화 비아코어는 이중특이적 항체-아피머 융합체가 두 표적을 결속시킬 수 있다는 것을 입증한다.
도 13a-13d. Expi293F 세포에서 일시적으로 발현된 베바시주맙 (바이오시밀러) / AVA04-251은 97% 초과의 수율로 정제될 수 있었고, 비아코어는 구축물이 가요성 링커 [(G4S)3]를 포함하였는지 또는 강성 링커 [A(EAAAK)3]를 포함하였는지 간에 이중특이적 항체-아피머 융합체가 두 표적을 결속시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이어서 강성 링커를 갖는 구축물을 마우스에서의 약동학적 연구에서 시험하였다 (도 13d).
도 14. 단백질 복합체의 결정화로부터 유래된 항-PD-L1 아피머 AVA04-261 및 인간 PD-L1의 계산된 3차원 구조를 보여준다.
도 15. 인간 PD-L1에 결합된 항-PD-L1 아피머 AVA04-261의 결정-유래 구조로부터, 도 15는 2개의 단백질 사이의 접촉 계면에서 아미노산 잔기 사이의 수소 결합 상호작용을 제공한다.
도 16. 인간 유래 PD-L1에 결합된 항-PD-L1 아피머 AVA04-261의 결정-유래 구조로부터, 도 16은 2개의 단백질 사이의 접촉 계면에 수반되는 아미노산 잔기의 목록을 제공한다.
도 17a-17b. Fc 융합체 (2가 PD-L1 결합제 포맷 및 이중특이적 2가 PD-L1 결합제 및 표적 X 결합제 포맷을 나타냄), 다양한 포맷의 인라인 항체 융합체, BiTE 포맷, 및 항-PD-L1 아피머와 수용체 트랩 도메인의 인라인 융합체를 포함한, 항-PD-L1 아피머 포맷화의 예시적인 예. 가요성 링커 (G4S)6은 서열식별번호: 106에 상응한다. 강성 링커 A(EAAAK)6은 서열식별번호: 196에 상응한다.
도 18a-18b. 도 18a는 AVA04 아피머, 강성 또는 가요성 링커 및 아피머 XT (AVA03-42)를 조합한 다양한 클론 조성물을 보여준다. 분석용 SEC-HPLC를 사용하여 각각의 클론의 순도를 평가하였다. 도 18b는 rhPD-1-Fc 또는 huSA 상의 다양한 아피머 XT에 대한 동역학적 분석의 결과를 보여준다.
도 19. 1μl의 정제된 변이체 단백질의 SDS-PAGE 전개. 표는 이. 콜라이 생산 수율, 루프 4 내의 아미노산 위치에 걸친 AVA04-251 알라닌 스캐닝, 및 각각의 아피머에 대한 비아코어 결합 결과를 요약한 것이다. 루프 2 서열은 서열식별번호: 39에 상응한다. 루프 4 서열은 위에서 아래로 서열식별번호: 187-195에 상응한다.
도 20. +4℃ 조건에서 PBS 1x 완충제 중에 저장한 경우 9개월 기간에 걸친 AVA04-251 V.2의 안정성. PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 야라-3000 (페노메넥스(Phenomenex)) 칼럼 상에서의 SEC-HPLC 분석.
도 21. AVA04-251 CG에 대한 구조 및 SEC-HPLC/SDS-PAGE 결과. 최종 AVA04-251 CG는 얼티메이트 3000 HPLC (써모(Thermo)) 상에서 PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 SEC-HPLC 야라-3000 칼럼 상에서 >98% 순도였다. SDS-PAGE 영상은 환원 및 비-환원 AVA04-251 CG 사이의 kDa 차이를 보여준다.
도 22. AVA04-251 CF에 대한 SEC-HPLC 및 SDS-PAGE 결과. 최종 AVA04-251 CF는 얼티메이트 3000 HPLC (써모) 상에서 PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 SEC-HPLC 야라-3000 칼럼 상에서 >99% 순도였다. SDS-PAGE 영상은 환원 및 비-환원 AVA04-251 CF 사이의 kDa 차이를 보여준다.
도 23. AVA04-261 BN 포맷에 대한 정제 및 동역학적 분석의 결과. SDS-PAGE 영상은 비-환원 조건 하에 힌지 내의 시스테인을 통해 이량체화되고 환원 완충제 중에서 단량체로 환원된 이량체 종을 보여주며, AVA04-261 BN 포맷은 PD-1 PD-L1 차단 생물검정 (프로메가(Promega))에서 단량체 AVA04-261과 비교하여 결합력을 갖고, 비아코어에서 59.9pM KD를 갖는다.
도 24. AVA04-251 AZ 인간 (링커 없이 hFc1 상에 포맷화된 AVA04-251)에 대한 정제 및 동역학적 분석의 결과. 최종 단백질은 얼티메이트 3000 HPLC (써모) 상에서 PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 SEC-HPLC 야라-3000 칼럼 상에서 >99% 순도였다. 데이터 블랭크 차감되고 1:1 결합 모델에 피팅된 비아코어 단일 사이클 동역학은 31.5pM의 KD를 나타낸다. PD-1 PD-L1 차단 생물검정 (프로메가)은 Fc 힌지와 아피머 사이의 (G4S)4 (서열식별번호: 197) 링커의 V.2 포맷과 동일한 활성을 입증한다.
도 25. AVA04-251 AG.3 및 AVA04-251 BS 포맷에 대한 정제 및 동역학적 분석의 결과. 분석용 SEC-HPLC를 사용하여 각각의 단백질의 순도를 평가하였다. 데이터 블랭크 차감되고 1:1 결합 모델에 피팅된 비아코어 단일 사이클 동역학은 AVA04-251 AG.3 및 AVA04-251 BS에 대해 각각 36.2pM 및 25.7pM의 KD를 나타낸다.
도 26. 비-공유 결합 복합체의 화학량론을 분석하기 위한 PD-L1 결합 도메인 (14kDa)과 Fc 융합체 AVA04-251 V.2 또는 AVA04-236 V (82kDa)의 가교 질량 분광측정법.
도 27 및 28. 포맷화된 AVA04-251 Fc의 시노몰구스 PD-L1에 대한 결합의 교차 반응성.
도 29a-29b. 혼합 림프구 반응에서 AVA04-251_V.2 처리 후 증가하는 IFNγ의 수준.
도 30. 스타필로코쿠스 장독소 B 자극 검정에서 AVA04-251_V.2로의 처리 후 IL2의 증가.
도 31. C57/Bl6 마우스에서 AVA04-251 XT 포맷을 주사한 마우스로부터의 혈청 중 ELISA에 의해 투여된 시간의 함수로서의 농도 (반감기가 계산되도록 함).
도 32a-32b. 동소 MDA-MB-231 종양 세포를 보유하는 인간화 NOG 마우스에서의 조직 분포 실험에서 AVA04-251_V.2의 생체내 특징화.
도 33a-33d. 인간화 MC38 동계 모델에서 종양 성장을 저속화시키는 AVA04-251_V.2의 생체내 효능.
도 34a-34d. A375 이종이식 모델에서 AVA04-251_V.2의 생체내 효능.
도 35a-35b. 마우스 동종이형 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 마우스 대용물 AVA04-182 V.2의 활성. 개별 반응으로서 제시된 데이터, 및 평균 +/- SEM *P<0.05,**p<0.01, 참조 물질을 이소형 대조군과 비교하는 대응표본 t-검정 사용.
도 36a-36b. MB49 마우스 동계 모델에서 종양 성장 억제 (도 36a); MB49 모델에서 처리 후 제21일에 종양 크기 (도 36b).
I. 개관
본 개시내용은 PD-L1에 결합하고 이 분자와 PD-1의 상호작용을 억제하며, 이에 따라 암, 화생, 신생물 및 특정 바이러스 및 기생충 감염의 치료에서 유용성을 갖는 체크포인트 억제제를 나타내는 아피머의 생성을 기초로 한다.
자연 발생 단백질 (시스타틴)을 기반으로 하고 결합 표면을 생성하는 2개의 루프를 안정하게 디스플레이하도록 조작된, 본 개시내용의 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드는 항체, 항체 단편 및 다른 비-항체 결합 단백질에 비해 다수의 이점을 제공한다.
하나는 아피머 폴리펩티드 그 자체의 작은 크기이다. 그의 단량체 형태에서, 약 14 kDa 또는 항체의 크기의 1/10이다. 이러한 작은 크기는 특히 불량하게 혈관화된 표적 조직 및/또는 섬유화 표적 조직 (종양과 같이)에서 증가된 조직 침투에 대한 보다 큰 잠재력을 제공한다.
아피머는 단순 단백질 구조를 가지며 (다중-도메인 항체에 비해), 아피머가 기능을 위해 디술피드 결합 또는 다른 번역후 변형을 요구하지 않기 때문에, 이들 폴리펩티드를 포함한 많은 포맷 실시양태는 원핵생물 및 진핵생물 시스템에서 제조될 수 있다.
아피머의 라이브러리를 이용하는 능력 (예컨대 첨부된 실시예에 기재된 파지 디스플레이 기술) 뿐만 아니라 부위 지정 돌연변이유발을 이용하는 능력은 치료 용도를 위한 이상적인 범위로 조정가능한 결합 동역학을 갖는 아피머를 생성할 수 있다. 예를 들어, 아피머는 PD-L1에 대해 높은 친화도, 예컨대 단량체 아피머의 경우 한 자릿수 나노몰 또는 그 미만의 KD 및 다가 포맷에서는 피코몰 KD 및 결합력을 가질 수 있다. PD-L1에 대한 긴밀한 결합 동역학, 예컨대 표적 조직 국재화에 이로운 10-4 내지 10-5 (s-1) 범위의 느린 Koff 레이트를 갖는 아피머가 생성될 수 있다.
본 개시내용의 PD-L1 결합 아피머는 정교한 선택성을 갖는 아피머를 포함한다.
또한, PD-L1 결합 아피머는 용이하게 포맷화되어, Fc 융합체, 전체 항체 융합체 및 인-라인 다량체와 같은 포맷이 용이하게 생성되고 제조될 수 있게 한다.
또한, 디술피드 결합 및 번역후 변형에 대한 필요성이 없기 때문에, PD-L1 결합 아피머 (또는 단량체 아피머)를 포함한 단백질의 많은 실시양태를, 단백질이 전신으로 전달되는 포맷 (예컨대 근육 조직으로부터의 발현)을 비롯하여 환자의 조직 내로 도입되는 유전자 전달 구축물의 발현에 의해 치료적으로 전달할 수 있거나, 또는 국부로 전달 (예컨대 종양내 유전자 전달을 통해)할 수 있다.
II. 정의
본 개시내용의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어 및 어구를 하기에 정의한다.
a. 아피머
용어 "스테핀 폴리펩티드"는 다수의 시스타틴-유사 서열을 함유하는 단백질을 포괄하는 패밀리인 시스타틴 슈퍼패밀리 내의 단백질의 하위군을 지칭한다.
시스타틴 패밀리의 스테핀 하위군은 비교적 작은 (약 100개 아미노산) 단일 도메인 단백질이다. 이들은 공지된 번역후 변형을 받지 않고, 디술피드 결합이 결여되어 있으며, 이는 이들이 광범위한 세포외 및 세포내 환경에서 동일하게 폴딩될 수 있을 것임을 시사한다. 스테핀 A 그 자체는 98개 아미노산의 단량체 단일 쇄 단일 도메인 단백질이다. 스테핀 A의 구조는 해석되어 있어, 아피머 스캐폴드 내로 스테핀 A의 합리적 돌연변이를 용이하게 한다. 시스타틴의 유일한 공지된 생물학적 활성은 카텝신 활성의 억제이며, 이로써 본 발명자들의 조작된 단백질의 잔류 생물학적 활성을 철저하게 시험할 수 있었다.
용어 "아피머" (또는 "아피머 스캐폴드" 또는 "아피머 폴리펩티드")는 스테핀 폴리펩티드의 재조합적으로 조작된 작은, 매우 안정한 단백질을 지칭한다. 아피머 단백질은 모노클로날 항체와 유사한 방식으로 높은 친화도 및 특이성으로 목적하는 표적 단백질에 결합하도록 모두 무작위화될 수 있는 2개의 펩티드 루프 및 N-말단 서열을 디스플레이한다. 스테핀 단백질 스캐폴드에 의한 2개의 펩티드의 안정화는 펩티드가 취할 수 있는 가능한 입체형태를 구속하며, 이는 유리 펩티드의 라이브러리와 비교하여 결합 친화도 및 특이성을 증가시킨다. 이들 조작된 비-항체 결합 단백질은 상이한 적용에서 모노클로날 항체의 분자 인식 특징을 모방하도록 설계된다. 스테핀 폴리펩티드 서열의 다른 부분에 대한 변이가 수행될 수 있으며, 이러한 변이는 이들 친화성 시약의 특성을 개선시키고, 예컨대 안정성을 증가시키고, 이들을 다양한 온도 및 pH 등에 걸쳐 강력하게 만든다. 바람직하게는 아피머는 스테핀 A 야생형 서열, 예컨대 인간 스테핀 A와 상당한 동일성을 공유하는, 스테핀 A로부터 유래된 서열을 포함한다. 본 개시내용으로부터 벗어나지 않으면서 스캐폴드 서열에 대해 변형이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 특히, 아피머 스캐폴드는 인간 스테핀 A에 상응하는 서열에 대해 적어도 25%, 35%, 45%, 55% 또는 60% 동일한, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 예를 들어 여기서 서열 변이는 목적하는 표적 (예컨대 PD-L1)에 결합하는 스캐폴드의 능력에 불리하게 영향을 미치지 않으며, 예를 들어 생물학적 기능, 예컨대 야생형 스테핀 A가 보유하지만 본원에 기재된 돌연변이 변화로 제거된 생물학적 기능을 회복시키거나 생성하지 않는다.
"아피머 작용제"는 아피머 폴리펩티드 서열을 포함하고, 환자에게 전달하기 위해 의도된 치료 활성 단백질을 나타내도록 임의의 다른 변형 (예를 들어, 접합, 번역후 변형 등)을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
"PD-L1", "분화 클러스터 274", "CD274", "B7 상동체 1" 또는 "B7-H1"로도 공지된 "프로그램화된 사멸-리간드 1"은 인간의 경우에 CD274 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 인간 PD-L1은 상이한 상황 하에 면역계를 억제하는데 있어서 주요 역할을 하는 40kDa 유형 1 막횡단 단백질이다. 대표적인 인간 PD-L1 서열은 유니프롯KB 1차 수탁 번호 Q9NZQ7에 의해 제공되고, 그의 다른 인간 이소형을 포함할 것이다. PD-L1 리간드는 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포 상에서 발견되는 그의 수용체 PD-1에 결합하여 활성화 또는 억제를 조정한다. PD-L1은 또한 공동자극 분자 CD80 (B7-1)에 대한 상당한 친화도를 갖는다. PD-L1과 T 세포 상의 그의 수용체 PD-1 ("프로그램화된 세포 사멸 단백질 1" 또는 "CD279")의 결속은 IL-2 생산 및 T 세포 증식의 TCR-매개 활성화를 억제하는 신호를 전달한다. 이와 관련하여, PD-L1은 체크포인트로 간주되고, 종양에서의 그의 상향조절된 발현은 T-세포 매개 항종양 반응의 억제에 기여한다. PD-L1은 일반적으로 다양한 포유동물 종으로부터의 PD-L1과 관련하여 사용될 것이지만, 본 출원 전반에 걸쳐 PD-L1에 대한 임의의 언급은 인간 PD-L1을 포함하고, 바람직하게는 인간 PD-L1 그 자체를 지칭하는 것으로 이해될 것이다.
"PD-L1 아피머 작용제"는 PD-L1, 특히 인간 PD-L1에 적어도 10-6M의 해리 상수 (Kd)로 결합하는 적어도 1개의 아피머 폴리펩티드를 갖는 아피머 작용제를 지칭한다.
"코딩된 아피머"는 유전자 전달 과정을 통해 환자의 신체 내 세포에 의해 발현되는 경우에 의도된 아피머 작용제를 생체내에서 생산하는 핵산 구축물을 지칭한다.
"아피머-연결된 접합체"는 아피머 폴리펩티드 서열을 함유하는 아피머 작용제의 폴리펩티드 부분의 C-말단 또는 N-말단을 통한 연속 펩티드 결합의 형성을 통한 것 이외의 다른 화학적 접합을 통해 그에 접합된 1개 이상의 모이어티를 갖는 아피머 작용제를 지칭한다. 아피머-연결된 접합체는 "아피머-약물 접합체"일 수 있으며, 이는 접합된 1개 이상의 약리학적 활성 모이어티를 포함하는 아피머 작용제를 지칭한다. 아피머-연결된 접합체는 또한 "아피머-태그 접합체"일 수 있으며, 이는 접합된 1개 이상의 검출가능한 모이어티 (즉, 검출가능한 표지)를 포함하는 아피머 작용제를 지칭한다.
b. 폴리펩티드
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 예를 들어 1개 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 이러한 정의에 포함된다.
용어 "아미노산 잔기" 및 "아미노산"은 상호교환가능하게 사용되며, 폴리펩티드의 맥락에서, 폴리펩티드의 1개 더의 펩티드 결합에 참여하고 있는 아미노산을 의미한다. 일반적으로, 아미노산을 지정하기 위해 본원에 사용된 약어는 생화학적 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회의 권고사항에 기초한다 (문헌 [Biochemistry (1972) 11:1726-1732] 참조). 예를 들어, Met, Ile, Leu, Ala 및 Gly는 각각 메티오닌, 이소류신, 류신, 알라닌 및 글리신의 "잔기"를 나타낸다. 잔기란 카르복실 기의 OH 부분 및 α-아미노 기의 H 부분을 제거함으로써 상응하는 α-아미노산으로부터 유래된 라디칼을 의미한다. 용어 "아미노산 측쇄"는 문헌 [K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, pages 2 and 33]에 의해 정의된 바와 같이, --CH(NH2)COOH 부분을 제외한 아미노산의 그 부분이다.
대부분의 경우에, 본 개시내용의 용도에 사용된 아미노산은 단백질에서 발견되는 자연 발생 아미노산, 또는 아미노 및 카르복실 기를 함유하는 이러한 아미노산의 자연 발생 동화 또는 이화 생성물이다. 특히 적합한 아미노산 측쇄는 하기 아미노산의 측쇄로부터 선택된 측쇄를 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, 및 펩티딜글리칸 박테리아 세포벽의 구성성분으로 확인된 아미노산 및 아미노산 유사체.
"염기성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Arg, Lys 및 His를 포함한다. "산성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Glu 및 Asp를 포함한다. "중성 극성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Ser, Thr, Asn, Gln, Cys 및 Tyr을 포함한다. "중성 비-극성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro, Trp 및 Phe를 포함한다. "비-극성 지방족 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Gly, Ala, Val, Ile 및 Leu를 포함한다. "소수성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp를 포함한다. "작은 소수성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Ala 및 Val을 포함한다. "방향족 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Tyr, Trp 및 Phe를 포함한다.
용어 아미노산 잔기는, 예를 들어 대상 아피머 (특히 화학적 합성에 의해 생성되는 경우)는 아미노산 유사체, 예컨대, 예를 들어 시아노알라닌, 카나바닌, 젠콜산, 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 디히드록시-페닐알라닌, 5-히드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 디아미노피멜산, 오르니틴 또는 디아미노부티르산을 포함할 수 있기 때문에, 본원에서 언급된 임의의 구체적 아미노산의 유사체, 유도체 및 동종체를 추가로 포함한다. 본원에서 적합한 측쇄를 갖는 다른 자연 발생 아미노산 대사물 또는 전구체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이며, 본 개시내용의 범주에 포함된다.
또한 아미노산의 구조가 입체이성질체 형태를 허용하는 경우 이러한 아미노산의 (D) 및 (L) 입체이성질체가 포함된다. 본원에서의 아미노산 및 아미노산 잔기의 배위는 적절한 기호 (D), (L) 또는 (DL)에 의해 지정되고, 배열이 지정되지 않은 경우에는 아미노산 또는 잔기는 배위 (D), (L) 또는 (DL)을 가질 수 있다. 본 개시내용의 화합물 중 일부의 구조는 비대칭 탄소 원자를 포함함을 주목해야 할 것이다. 따라서, 이러한 비대칭에서 발생하는 이성질체가 본 개시내용의 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 이성질체는 전형적인 분리 기술 및 입체적으로 제어되는 합성에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있다. 본 출원의 목적상, 달리 상반되게 명백히 언급되지 않는 한, 지명된 아미노산은 (D) 및 (L) 입체이성질체 둘 다를 포함하는 것으로 해석될 것이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬되었을 때 (필요하다면 갭이 도입됨) 동일하거나, 또는 명시된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭하고, 이때 임의의 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의해 퍼센트 동일성을 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들은 BLAST, ALIGN, 메그얼라인(Megalign), 베스트핏(BestFit), GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package) 및 이들의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 2개의 핵산 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의해 측정시에 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬되었을 때 이들이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 실시양태에서는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개 잔기, 적어도 약 20개 잔기, 적어도 약 40-60개 잔기, 적어도 약 60-80개 잔기 또는 그 사이의 임의의 적분 값인 아미노산 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개 잔기, 예컨대 적어도 약 80-100개 잔기보다 더 긴 영역에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 서열, 예컨대 표적 단백질 또는 항체의 코딩 영역의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개 염기, 적어도 약 20개 염기, 적어도 약 40-60개 염기, 적어도 약 60-80개 염기 또는 그 사이의 임의의 적분 값인 뉴클레오티드 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개 염기, 예컨대 적어도 약 80-1000개 염기 또는 그 초과보다 더 긴 영역에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 서열, 예컨대 관심 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 1개의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 족은 일반적으로 관련 기술분야에서 정의되었으며, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌으로 티로신을 치환하는 것은 보존적 치환이다. 일반적으로, 본 개시내용의 폴리펩티드, 가용성 단백질 및/또는 항체의 서열에서의 보존적 치환은 표적 결합 부위에 대한, 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드, 가용성 단백질 또는 항체의 결합을 제거하지 않는다. 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 더이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수하거나 (즉, 오염물질이 없음), 적어도 90% 순수하거나, 적어도 95% 순수하거나, 적어도 98% 순수하거나, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"는 적어도 2개의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현된 하이브리드 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "링커" 또는 "링커 영역"은 제1 폴리펩티드 (예를 들어, 아피머의 카피)와 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 또 다른 아피머, Fc 도메인, 리간드 결합 도메인 등) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 폴리펩티드의 발현, 분비 또는 생물활성에 불리하게 영향을 미치지 않아야 한다. 바람직하게는, 링커는 항원성이 아니며, 면역 반응을 도출하지 않는다.
"아피머-항체 융합체"는 아피머 폴리펩티드 부분 및 항체의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 아피머-항체 융합체는, 예를 들어 항체의 VH 및/또는 VL 쇄 중 1개 이상의 C-말단 또는 N-말단에 부가된 1개 이상의 아피머 폴리펩티드 서열을 갖는 전장 항체를 포함하며, 즉 조립된 항체의 적어도 1개의 쇄는 아피머 폴리펩티드와의 융합 단백질이다. 아피머-항체 융합체는 또한 1개 이상의 아피머 폴리펩티드 서열이 항체 단편의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 갖는 융합 단백질의 일부로서 제공되는 실시양태를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 통상적으로 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 있는 적어도 1개의 항원-결합 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 상기 중 임의의 것의 조합을 인식하고 그에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 상기 용어는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 항체 (이들 단편이 Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 포맷화된 경우), 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질 (Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 포맷화됨), 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포괄한다.
항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 지칭되는 그의 중쇄 불변 도메인의 정체에 기초하여 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 그의 하위부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다.
용어 항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역 단독 또는 조합을 지칭한다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 프레임워크 영역 (FR) 및 "초가변 영역"으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어진다. 각각의 쇄 내의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지 기술이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.]) 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). 추가로, 이들 2가지 접근법의 조합이 CDR을 결정하기 위해 관련 기술분야에서 때때로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 최소의 비-인간 서열을 함유하는 특이적 이뮤노글로불린 쇄, 키메라 이뮤노글로불린 또는 그의 단편인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 CDR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 비-인간 종으로부터의 항체에서의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 정밀화하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 내 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 인간화 항체는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR을 함유하는 가변 도메인을 포함할 수 있지만, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 이뮤노글로불린 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 통상적으로 키메라 항체와는 다른 것으로 간주된다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 특정한 항체, 특정한 아피머 또는 다른 특정한 결합 도메인이 인식하고 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우에, 에피토프는 인접 아미노산 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬배치되는 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산들로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성시에도 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체형태적 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3개, 보다 통상적으로는 적어도 5, 6, 7 또는 8-10개의 아미노산을 고유한 공간 입체형태로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적인"은 생물학적 분자를 포함한 이종 분자 집단의 존재 하에서 표적의 존재를 결정해주는, 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대 표적과 아피머, 항체 또는 다른 결합 파트너 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 표적에 특이적으로 결합하는 아피머는 다른 표적에 결합하는 경우보다 더 큰 친화도, 결합력으로 (다량체 포맷화된 경우), 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속기간으로 상기 표적에 결합하는 아피머이다.
본원에 사용된 "접합체", "접합" 또는 그의 문법적 변형은 관련 기술분야에 공지된 임의의 결합 또는 연결 방법에 의해 2개 이상의 화합물을 함께 결합 또는 연결하여 또 다른 화합물을 형성하는 것을 지칭한다. 이는 또한 2개 이상의 화합물을 함께 결합 또는 연결함으로써 생성되는 화합물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티 또는 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 항-PD-L1 아피머가 예시적인 접합체이다. 이러한 접합체는 융합 단백질, 화학적 접합체에 의해 생산된 것 및 임의의 다른 방법에 의해 생산된 것을 포함한다.
c. 핵산
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자 코딩", "DNA 서열 코딩" 및 "DNA 코딩"은 데옥시리보핵산 데옥시리보뉴클레오티드의 가닥을 따르는 뉴클레오티드의 순서 또는 순차를 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 쇄를 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
뉴클레오티드 서열에 관하여 사용되는 경우, 문법적 및 다른 형태의 용어인 본원에 사용된 "서열"은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 서열은 돌연변이될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 000,000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 그 위의 또는 그 사이의 임의의 적분 값) 핵산, 예를 들어 약 100개 내지 약 10,000개, 또는 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 500개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 1개 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 숙주 세포 내에 전달할 수 있고, 통상적으로는 이를 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "형질감염"은 진핵 세포 내로의 외인성 핵산을 지칭한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 바이오리스틱 기술 (바이오리스틱)을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "담체"는 조성물을 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 단리된 핵산을 포함하는 단리된 핵산이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 담체가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등의 세포 내로의 핵산의 전달을 용이하게 하는 것을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 제어 서열 및 작동가능하게 연결된 발현될 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 사용되는 충분한 시스-작용 요소 (시스-작용 요소)를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지된 모든 것, 예컨대 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 함유된) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결이 후자의 발현을 유발하는 연결로 연결된 것을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 기능적 관계인 경우, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이는 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 전형적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열분석은 인접하며, 필요에 따라 동일한 리딩 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 세포 특이적 전사의 합성 기구에 요구되는 합성 기구에 의해 인식되거나 도입되는 프로모터 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "구성적 발현"은 모두 생리학적 조건 하에 발현되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유도성 발현"은 특정 조건 하에서의 발현, 예컨대 세포내 신호전달 경로의 활성화 (또는 불활성화) 또는 발현 구축물을 보유하는 세포와 소분자의 농도에 민감한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현 (또는 발현의 정도)을 조절하는 소분자와의 접촉을 지칭한다.
용어 "전기천공"은 생체막에서의 현미경적 경로 (기공)를 유도하는 막횡단 전기장 펄스의 사용을 지칭하며; 그의 존재는 생체분자, 예컨대 플라스미드 또는 다른 올리고뉴클레오티드가 세포 막의 한 측에서 다른 측으로 통과하는 것을 허용한다.
d. 체크포인트 억제제, 공-자극 효능제 및 화학요법제
"체크포인트 분자"는 조직 및/또는 면역 세포에 의해 발현되고 체크포인트 분자의 발현 수준에 의존성인 방식으로 면역 반응의 효능을 감소시키는 단백질을 지칭한다. 이들 단백질이 차단되는 경우에, 면역계 상의 "브레이크"가 방출되고, 예를 들어 T 세포가 암 세포를 보다 효과적으로 사멸시킬 수 있다. T 세포 또는 암 세포 상에서 발견되는 체크포인트 단백질의 예는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT를 포함한다.
"체크포인트 억제제"는 체크포인트 분자로부터의 면역억제 신호전달을 역전시키는 약물 개체를 지칭한다.
"공동자극 분자"는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여 공동자극, 예컨대 비제한적으로 증식을 매개하는 면역 세포, 예컨대 T 세포 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효과적인 면역 반응을 용이하게 하는 항원 수용체 또는 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동-자극 분자는 MHCI 분자, BTLA 수용체 및 Toll 리간드, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 공동자극 분자의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ , IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1 , CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244,2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS , SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, 및 CD83 리간드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"공동자극 효능제"는 공동자극 분자, 예컨대 공동자극 리간드를 활성화시키고 (그에 효능작용하고) 면역자극 신호를 생성하거나 또는 달리 면역 반응의 효력 또는 효능을 증가시키는 약물 개체를 지칭한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판, 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 페메트렉세드; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; TLK-286; CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네미신, 예컨대 디네미신 A; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르), 테가푸르 (유프토랄), 카페시타빈 (젤로다), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 및 이마티닙 (2-페닐아미노피리미딘 유도체), 뿐만 아니라 다른 c-Kit 억제제; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK 폴리사카라이드 복합체 (제이에이치에스 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신, 필데신); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아브락산), 및 도세탁셀 (탁소테레); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2개 이상의 조합, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴)으로의 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
또한, 이러한 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 온몸 치료의 형태인 항호르몬제도 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 예는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 예컨대, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스 타목시펜 포함), 랄록시펜 (에비스타), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤); 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스); 난소를 저해하거나 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 류프롤리드 아세테이트 (루프론 및 엘리가드), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (메게이스), 엑세메스탄 (아로마신), 포르메스타니, 파드로졸, 보로졸 (리비소르), 레트로졸 (페마라), 및 아나스트로졸 (아리미덱스)을 포함한다. 추가로, 화학요법제의 이러한 정의에는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스 또는 오스탁), 에티드로네이트 (디드로칼), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타), 알렌드로네이트 (포사맥스), 파미드로네이트 (아레디아), 틸루드로네이트 (스켈리드), 또는 리세드로네이트 (악토넬); 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴 백신, 류벡틴 백신, 및 박시드 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸); 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트; Kit 억제제, 예컨대 이마티닙 또는 EXEL-0862 (티로신 키나제 억제제); EGFR 억제제, 예컨대 에를로티닙 또는 세툭시맙; 항-VEGF 억제제, 예컨대 베바시주맙; 아리노테칸; rmRH (예를 들어, 아바렐릭스); 라파티닙 및 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제, GW572016으로도 공지됨); 17AAG (열 쇼크 단백질 (Hsp) 90 독인 겔다나마이신 유도체) 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "시토카인"은 일반적으로 또 다른 세포에 대해 세포간 매개체로서 작용하거나 또는 단백질을 생산하는 세포에 대해 자가분비 효과를 갖는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 지칭한다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인; 인터류킨 ("IL"), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, IL-18 내지 IL-29 (예컨대 IL-23), IL-31, 예컨대 프로류킨 rIL-2; 종양-괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β, TGF-β1-3; 및 다른 폴리펩티드 인자, 예컨대 백혈병 억제 인자 ("LIF"), 섬모 신경영양 인자 ("CNTF"), CNTF-유사 시토카인 ("CLC"), 카디오트로핀 ("CT") 및 kit 리간드 ("KL")를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "케모카인"은 백혈구의 화학주성 및 활성화를 선택적으로 유도하는 능력을 갖는 가용성 인자 (예를 들어, 시토카인)를 지칭한다. 이들은 또한 혈관신생, 염증, 상처 치유 및 종양발생의 과정을 촉발한다. 케모카인의 예는 뮤린 각질세포 화학유인물질 (KC)의 인간 상동체인 IL-8을 포함한다.
e. 치료
본원에 사용된 용어 "기능이상적"은 또한 항원 인식에 대한 불응성 또는 비반응성, 구체적으로 항원 인식을 하류 T-세포 이펙터 기능, 예컨대 증식, 시토카인 생산 (예를 들어, IL-2) 및/또는 표적 세포 사멸로 번역하는 능력의 손상을 포함한다.
용어 "무반응"은 T-세포 수용체를 통해 전달된 불완전한 또는 불충분한 신호로부터 발생한 항원 자극에 대한 비반응성의 상태 (예를 들어, ras-활성화의 부재 하에 세포내 Ca+2를 증가시킴)를 지칭한다. T 세포 무반응은 또한 공동-자극의 부재 하에 항원으로의 자극시에 발생할 수 있으며, 이는 세포가 심지어 공동자극과 관련하여 항원에 의한 후속 활성화에 불응성이 되도록 한다. 미반응성 상태는 종종 인터류킨-2의 존재에 의해 무효화될 수 있다. 무반응 T-세포는 클론 확장을 겪지 않고/거나 이펙터 기능을 획득하지 않는다.
용어 "소진"은 다수의 만성 감염 및 암 동안 일어나는 지속된 TCR 신호전달로부터 발생한 T 세포 기능이상의 상태로서 T 세포 소진을 지칭한다. 이는 불완전하거나 결함이 있는 신호전달을 통해서가 아니라 지속된 신호전달로부터 발생한다는 점에서 무반응과 구별된다. 이는 불량한 이펙터 기능, 억제 수용체의 지속된 발현 및 기능적 이펙터 또는 기억 T 세포의 것과 구별되는 전사 상태에 의해 정의된다. 소진은 감염 및 종양의 최적 제어를 방해한다.
"T-세포 기능을 증진시키는 것"은 T-세포가 지속된 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도, 유발 또는 자극하는 것, 또는 소진된 또는 불활성 T-세포를 재생 또는 재활성화시키는 것을 의미한다. T-세포 기능을 증진시키는 것의 예는 다음을 포함한다: 개입 전 수준에 비해 CD8+ T-세포로부터의 γ-인터페론의 증가된 분비, 증가된 증식, 증가된 항원 반응성 (예를 들어, 바이러스, 병원체 또는 종양 클리어런스). 일부 실시양태에서, 증진의 수준은 적어도 50%, 대안적으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%이다. 이러한 증진을 측정하는 방식은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
"T 세포 기능이상적 장애"는 항원 자극에 대한 감소된 반응성을 특징으로 하는 T-세포의 장애 또는 상태이다. 특정한 실시양태에서, T-세포 기능이상적 장애는 PD-1의 부적절한 증가된 수준과 특이적으로 연관된 장애이다. T-세포 기능이상적 장애는 또한 T-세포 항종양 기능(들)의 억제를 일으키는 종양 내의 PD-L1의 부적절한 증가된 수준과 연관될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, T-세포 기능이상적 장애는 T-세포가 무반응이거나 또는 시토카인 분비, 증식 또는 세포용해 활성 수행의 능력이 감소된 것이다. 구체적 측면에서, 감소된 반응성은 면역원을 발현하는 병원체 또는 종양의 비효과적 제어를 유발한다. T-세포 기능이상을 특징으로 하는 T 세포 기능이상적 장애의 예는 미해결 급성 감염, 만성 감염 및 종양 면역을 포함한다.
"종양 면역"은 종양이 면역 인식 및 클리어런스를 회피하는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료 개념으로서, 종양 면역은 이러한 회피가 감쇠되는 경우에 "치료"되고, 종양은 면역계에 의해 인식되어 공격받는다. 종양 인식의 예는 종양 결합, 종양 수축 및 종양 클리어런스를 포함한다.
"지속된 반응"은 치료 중단 후에 종양 성장의 감소에 대한 지속된 효과를 지칭한다. 예를 들어, 종양 크기는 투여 단계의 시작시의 크기와 비교하여 동일하거나 더 작게 남아있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속된 반응은 적어도 치료 지속기간과 동일한 지속기간, 치료 지속기간의 적어도 1.5x, 2.0x, 2.5x 또는 3.0x 길이의 지속기간을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 모세포종, 육종 및 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "종양" 및 "신생물"은 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 초래되는, 전암성 병변을 포함한 악성 (암성) 또는 양성 (비-암성)의 임의의 조직 덩어리를 지칭한다. 종양 성장은 일반적으로 비제어되고 진행성이며, 정상 세포의 증식을 유도하지 않거나 억제한다. 종양은, 예컨대 비제한적으로, 방광, 골, 뇌, 유방, 연골, 신경교 세포, 식도, 난관, 담낭, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 요도, 요관, 요도, 자궁, 질 기관 또는 조직 또는 상응하는 세포로부터 선택된 다양한 세포 유형, 조직 또는 기관에 영향을 줄 수 있다. 종양은 암, 예컨대 육종, 암종, 형질세포종 또는 (악성 형질 세포)를 포함한다. 본 개시내용의 종양은 백혈병 (예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수성 - 단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 다혈구혈증), 림프종 (호지킨병, 비-호지킨병), 원발성 마크로글로불린혈증 질환, 중쇄 질환, 및 고형 종양, 예컨대 육종 암 (예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 내피 육종, 림프관육종, 혈관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, (삼중 음성 유방암 포함), 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 암종, 기관지원성 암종, 수질성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 정조세포 종양, 배아성 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종 (소세포 폐 암종 및 비-소세포 폐 암종 또는 NSCLC 포함), 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 슈반세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종), 식도암, 담낭, 신장암, 다발성 골수종을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, "종양"은 췌장암, 간암, 폐암 (NSCLC 포함), 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 림프종, 담낭암, 신암, 백혈병, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 및 신경교종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 새로운 위치에서의 유사한 암성 병변의 발생과 함께 암이 원래 부위로부터 신체의 다른 영역으로 확산 또는 이전되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이하는" 세포는 이웃 세포와의 부착성 접촉을 상실하고 혈류 또는 림프를 통해 원발성 질환 부위로부터 이동하여 이웃 신체 구조를 침습하는 것이다.
용어 "암 세포" 및 "종양 세포"는 대부분의 암 세포 집단을 포함하는 비-종양발생 세포, 및 종양발생 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 다를 비롯하여, 암 또는 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 총 세포 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"는, 재생 및 분화 능력이 없는 세포만 지칭하여 이들 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별할 때 용어 "비-종양발생"에 의해 수식될 것이다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 지칭한다.
본원에 사용된 "완전 반응" 또는 "CR"은 모든 표적 병변의 소멸을 지칭하고; "부분 반응" 또는 "PR"은 기준선의 가장 긴 직경의 합계 (SLD)를 참조로 하여 표적 병변의 SLD의 적어도 30% 감소를 지칭하고; "안정 질환" 또는 "SD"는 치료가 시작된 이후의 최소 SLD를 참조로 하여 PR을 만족시키는 표적 병변의 충분한 수축도 아니고 PD를 만족시키는 충분한 증가도 아닌 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 "무진행 생존" (PFS)은 치료 동안 및 후에 치료될 질환 (예를 들어, 암)이 악화되지 않는 기간을 지칭한다. 무진행 생존은 환자가 완전 반응 또는 부분 반응을 경험한 시간의 양, 뿐만 아니라 환자가 안정 질환을 경험한 시간의 양을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "전체 반응률" (ORR)은 완전 반응 (CR)률 및 부분 반응 (PR)률의 합계를 지칭한다.
본원에 사용된 "전체 생존"은 특정한 지속 기간 후에 살아있을 가능성이 있는 군 내의 개체의 백분율을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 개체가 임상 병리상태의 예방적 개입 과정일 수 있는, 세포의 개입에 의해 유발된 임상 질환의 과정 또는 치료를 변화시키려 시도하는 것을 지칭한다. 질환의 발생 또는 재발을 예방하기 위한 치료, 증상의 완화, 임의의 질환의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행의 속도의 저속화, 질환 완화의 호전 또는 완화, 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "대상체"는 특정한 치료의 수용자가 될, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "효능제" 및 "효능작용"은 표적 또는 표적 경로의 생물학적 활성을 직접적으로 또는 간접적으로, 실질적으로 유도하거나, 활성화시키거나, 촉진하거나, 증가시키거나 또는 증진시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 용어 "효능제"는 단백질 또는 다른 관심 표적의 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 유도하거나, 활성화시키거나, 촉진하거나, 증가시키거나 또는 증진시키는 임의의 작용제를 포함하는 것으로 본원에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "길항제" 및 "길항작용"은 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접적으로 또는 간접적으로, 부분적으로 또는 전체적으로 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화시킬 수 있는 작용제를 지칭하거나 기재한다. 용어 "길항제"는 단백질 또는 다른 관심 표적의 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화시키는 임의의 작용제를 포함하는 것으로 본원에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "조정" 및 "조정하다"는 생물학적 활성의 변화 또는 변경을 지칭한다. 조정은 활성을 자극하거나 또는 활성을 억제하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 조정은 활성의 증가 또는 활성의 감소, 결합 특징의 변화, 또는 단백질의 활성, 경로, 시스템 또는 다른 관심 생물학적 표적과 연관된 생물학적, 기능적 또는 면역학적 특성의 임의의 다른 변화일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 선천성 면역계 및 적응 면역계 둘 다로부터의 반응을 포함한다. 이는 세포-매개 및/또는 체액성 면역 반응을 둘 다 포함한다. 이는 T-세포 및 B-세포 반응, 뿐만 아니라 면역계의 다른 세포, 예컨대 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 대식세포 등으로부터의 반응을 모두 포함한다.
용어 "제약상 허용되는"은 인간을 비롯한 동물에서의 사용에 대해 미국 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 또는 승인가능하거나, 또는 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거된 물질을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 아주반트" 또는 "허용되는 제약 담체"는, 본 개시내용의 적어도 1종의 작용제와 함께 대상체에 투여될 수 있고, 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며, 치료 효과를 전달하기에 충분한 용량으로 투여되는 경우에 비독성인 부형제, 담체 또는 아주반트를 지칭한다. 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자 및 미국 FDA는 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 아주반트가 임의의 제제의 불활성 성분인 것으로 간주한다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량" 또는 "치료 효과"는 대상체, 예컨대 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 유효한 본원에 기재된 아피머 작용제의 양을 지칭한다. 암 또는 종양의 경우에, 치료 유효량의 PD-L1 결합 아피머 작용제는 치료 효과를 가지며, 이에 따라 면역 반응을 부스팅하고, 항종양 반응을 부스팅하고, 면역 세포의 세포용해 활성을 증가시키고, 면역 세포에 의해 종양 세포의 사멸을 증가시키고, 종양 세포의 수를 감소시킬 수 있거나; 종양발생성, 종양발생 빈도 또는 종양발생 능력을 감소시킬 수 있거나; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킬 수 있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있거나; 암 세포 집단을 감소시킬 수 있거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤 (예를 들어, 연부 조직 및 골 내로의 암 확산 포함)을 억제하거나 또는 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 전이를 억제하고 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 성장을 억제하고 정지시킬 수 있거나; 암과 연관된 증상 중 1종 이상을 어느 정도까지 완화시킬 수 있거나; 이환율 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선시킬 수 있거나; 또는 이러한 효과들의 조합이 가능하다.
용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하다" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키다"는 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/하거나, 둔화시키고/거나, 그의 증상을 줄이고/거나 그의 진행을 중단시키는 치료적 조치, 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 방지하거나 또는 둔화시키는 예방적 또는 방지적 수단 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 자는 이미 장애에 걸린 자; 장애에 걸리기 쉬운 자; 및 장애를 예방해야 하는 자를 포함한다. 암 또는 종양의 경우에, 환자가 하기 중 1개 이상을 나타내면 대상체가 본 개시내용의 방법에 따라 성공적으로 "치료"된다: 증가된 면역 반응, 증가된 항종양 반응, 면역 세포의 증가된 세포용해 활성, 면역 세포에 의한 종양 세포의 증가된 사멸, 암 세포의 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 연부 조직 및 골 내로의 암 세포의 확산을 포함한, 말초 기관 내로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 또는 암 세포 전이의 억제 또는 부재; 암 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 1종 이상의 증상의 완화; 감소된 이환율 및 사망률; 삶의 질의 개선; 종양발생성의 감소; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소; 또는 이들 효과의 일부 조합.
f. 기타
실시양태가 본원에서 "포함하는"이라는 표현과 함께 기재되는 어떠한 경우에든, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어로 다른 면에서는 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해한다. 또한, 실시양태가 본원에서 "로 본질적으로 이루어진"이라는 표현과 함께 기재되는 어떠한 경우에든, "로 이루어진"의 용어로 기재되지만 다른 면에서는 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "약" 또는 "대략" 값 또는 파라미터의 언급은 값 또는 파라미터에 대한 실시양태를 포함한다 (및 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원의 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다; A 또는 B; A (단독); 및 B (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 각각의 하기 실시양태를 포괄하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
III. PD-L1 결합 아피머
아피머는 스테핀 A를 기반으로 하는 스캐폴드이며, 이는 스테핀 A, 예를 들어 포유동물 스테핀 A, 예를 들어 인간 스테핀 A로부터 유래된 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 본 출원의 일부 측면은, 야생형 스테핀 A 단백질로부터의 용매 접근가능한 루프 중 1개 이상이 PD-L1에, 바람직하게는 선택적으로 및 바람직하게는 10-6M 이하의 Kd로 결합하는 능력을 갖는 아피머를 제공하는 아미노산 서열을 갖는 것인 아피머를 포함하는, PD-L1에 결합하는 아피머 ("항-PD-L1 아피머"로도 지칭됨)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머는 백본 서열을 갖는 야생형 인간 스테핀 A 단백질로부터 유래되며, 여기서 루프 2 [(Xaa)n으로 지정됨] 및 루프 4 [(Xaa)m으로 지정됨] 중 하나 또는 둘 다는 화학식 (I)을 갖는 대안적 루프 서열 (Xaa)n 및 (Xaa)m으로 대체된다:
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
여기서
FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열식별번호: 1)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열식별번호: 2)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열식별번호: 3)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고, n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이다.
일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR1은 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열이고; 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR2는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열이고; 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, FR3은 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머는 하기 화학식에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는다:
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 4)
여기서
Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고; n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이고; Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp 또는 Glu, 보다 바람직하게는 Gly, Ala, Arg 또는 Lys, 보다 더 바람직하게는 Gly 또는 Arg이고; Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 보다 바람직하게는 Gly 또는 Ser이고; Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr, 보다 바람직하게는 Arg, Lys, Asn 또는 Gln, 보다 더 바람직하게는 Lys 또는 Asn이고; Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 보다 바람직하게는 Gly 또는 Ser이고; Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro, 보다 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Pro, 보다 더 바람직하게는 Leu 또는 Pro이고; Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu, 보다 바람직하게는 Ala, Val, Asp 또는 Glu, 보다 더 바람직하게는 Ala 또는 Glu이고; Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys, 보다 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Arg, 보다 더 바람직하게는 Leu 또는 Arg이다.
예를 들어, 항-PD-L1 아피머는 하기 화학식에 나타내어진 아미노산 서열을 가질 수 있다:
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 5), 여기서 Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고; n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이다.
일부 실시양태에서, n은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9이다.
일부 실시양태에서, m은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9이다.
일부 실시양태에서, Xaa는 각 경우에 독립적으로 원핵 또는 진핵 세포에서의 재조합 발현에 의해 폴리펩티드에 부가될 수 있는 아미노산, 보다 더 바람직하게는 20개의 자연 발생 아미노산 중 1개이다.
상기 서열 및 화학식의 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 화학식 (II)에 나타내어진 아미노산 서열이다:
-aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6- (II)
여기서
aa1은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Lys 또는 Arg를 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 보다 바람직하게는 소형 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu를 나타내고;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, 보다 더 바람직하게는 His 또는 Tyr, Trp 또는 His를 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu를 나타내고;
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 소형 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg를 나타내고;
aa6은 방향족 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Asp 또는 Glu; 보다 바람직하게는 Trp 또는 Asp; 및 보다 더 바람직하게는 Trp를 나타낸다.
상기 서열 및 화학식의 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 화학식 (III)에 나타내어진 아미노산 서열이다:
-aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp- (III)
여기서
aa1은 염기성 측쇄 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Lys, Arg, His, Ser, Thr, Asn 또는 Gln, 보다 바람직하게는 Lys, Arg, His, Asn 또는 Gln, 보다 더 바람직하게는 Lys 또는 Asn을 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 보다 바람직하게는 소형 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu를 나타내고;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Tyr, Trp 또는 His를 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu를 나타내고;
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 소형 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg를 나타낸다.
상기 서열 및 화학식의 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 6 내지 40으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 6 내지 41로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)n은 서열식별번호: 6 내지 41로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
상기 서열 및 화학식의 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 화학식 (IV)에 나타내어진 아미노산 서열이다:
-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15- (IV)
여기서
aa7은 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 바람직하게는 Gly, Ala, Val, Pro, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu, 보다 더 바람직하게는 Gly, Ala, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu를 나타내고;
aa8은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Asp, Glu, Lys, Arg, His, Gln, Ser, Thr, Asn, Ala, Val, Pro, Gly, Tyr 또는 Phe, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, Lys, Arg, His 또는 Gln을 나타내고;
aa9는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Gln, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Arg, Lys, Gly, Leu, Pro 또는 Tyr, 보다 더 바람직하게는 Gln, Thr 또는 Asp를 나타내고;
aa10은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Gln, Asn, Ala, Leu, Tyr, Trp, Pro 또는 Gly, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, His, Gln, Asn, Leu, Trp 또는 Gly를 나타내고;
aa11은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Arg, Lys, His, Val, Ile, Tyr 또는 Gly, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Lys 또는 His를 나타내고;
aa12는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Asn, Lys, Arg, Val, Leu, Ile, Trp, Tyr, Phe 또는 Gly, 보다 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Tyr, Trp, Arg 또는 Lys를 나타내고;
aa13은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Pro, Asp, Glu, His, Arg, Trp, Tyr 또는 Phe, 보다 더 바람직하게는 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Asp 또는 Glu를 나타내고;
aa14는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 Ala, Ile, Trp, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, His, Ser, Thr, Gln 또는 Asn, 보다 더 바람직하게는 Ala, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, Ser, Gln 또는 Asn을 나타내고;
aa15는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 중성 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln, Asn, Ala, Val, Leu, Gly 또는 Phe, 보다 더 바람직하게는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다.
상기 서열 및 화학식의 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 42 내지 77로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 42 내지 77로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, (Xaa)m은 서열식별번호: 42 내지 77로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머는 서열식별번호: 78 내지 86으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 78 내지 86으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머는 서열식별번호: 78 내지 86으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00005
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머는 엄격한 조건 (예컨대 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)의 존재 하에 이어 65℃에서 0.2X SSC 중 세척) 하에, 서열식별번호: 87 내지 94 중 하나의 뉴클레오티드 1-336에 상응하는 코딩 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 87 내지 94 중 하나의 뉴클레오티드 1-336과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일한 코딩 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 87 내지 94 중 하나의 뉴클레오티드 1-336에 혼성화되는 코딩 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00006
Figure pct00007
추가로, 부차적 변형은 또한 본원에 개시된 스테핀 A 또는 스테핀 A 유래된 서열에 대해 - 상기 기재된 루프 2 및 루프 4 삽입물 외에 - 작은 결실 또는 부가, 예컨대 스테핀 A 또는 스테핀 A 유래된 아피머 폴리펩티드에 비해 10개 이하의 아미노산의 부가 또는 결실을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 단량체로서 인간 PD-L1에 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하 또는 약 0.1 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합하는 아피머 폴리펩티드 부분을 갖는 PD-L1 결합 아피머 작용제이다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 단량체로서 인간 PD-L1에, 예컨대 비아코어에 의해 측정시 약 10-3s-1 (즉, 1/초의 단위) 또는 더 느린; 약 10-4s-1 또는 더 느린 또는 심지어 약 10-5s-1 또는 더 느린 오프 레이트 상수 (Koff)로 결합하는 아피머 폴리펩티드 부분을 갖는 PD-L1 결합 아피머 작용제이다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 단량체로서 인간 PD-L1에, 예컨대 비아코어에 의해 측정시 적어도 약 103M-1s-1 또는 더 빠른; 적어도 약 104M-1s-1 또는 더 빠른; 적어도 약 105M-1s-1 또는 더 빠른; 또는 심지어 적어도 약 106M-1s-1 또는 더 빠른 회합 상수 (Kon)로 결합하는 아피머 폴리펩티드 부분을 갖는 PD-L1 결합 아피머 작용제이다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 검정에서 단량체로서 인간 PD-L1에 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하 또는 약 0.1 nM 이하의 IC50으로 결합하는 아피머 폴리펩티드 부분을 갖는 PD-L1 결합 아피머 작용제이다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 65℃ 이상, 바람직하게는 적어도 70℃, 75℃, 80℃ 또는 심지어 85℃ 또는 그 초과의 용융 온도 (Tm, 즉 폴딩된 상태와 언폴딩된 상태 둘 다가 동등하게 존재하는 온도)를 갖는다. 용융 온도는 단백질 안정성의 특히 유용한 지표이다. 폴딩된 단백질 및 언폴딩된 단백질의 상대 비율은 시차 주사 열량측정법, UV 시차 분광분석법, 형광, 원형 이색성 (CD) 및 NMR을 비롯한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 많은 기술에 의해 결정될 수 있다 (Pace et al. (1997) "Measuring the conformational stability of a protein" in Protein structure: A practical approach 2: 299-321).
a. 융합 단백질 - 일반
일부 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 아피머 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조정하는 추가의 삽입, 치환 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 변형된 아피머의 1개 이상의 특성 또는 활성을 조정할 수 있다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은, 예를 들어 PD-1에 결합하고 이를 억제하기 위해 아피머 폴리펩티드에 대한 친화도를 조정하거나, 순환 반감기를 조정하거나, 치료 반감기를 조정하거나, 아피머 폴리펩티드의 안정성을 조정하거나, 프로테아제에 의한 절단을 조정하거나, 용량을 조정하거나, 방출 또는 생체이용률을 조정하거나, 정제를 용이하게 하거나, 탈아미드화를 감소시키거나, 보관-수명을 개선시키거나 또는 특정한 투여 경로를 개선 또는 변경시킬 수 있다. 유사하게, 아피머 폴리펩티드는 폴리펩티드의 검출, 정제 또는 다른 속성을 개선시키는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 다른 친화도 기반 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 연결된 분자 (비오틴을 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이들 추가의 서열은 융합 단백질의 형태로 아피머 폴리펩티드의 한쪽 말단 및/또는 다른쪽 말단에 부가된다. 따라서, 본 개시내용의 특정 측면에서 아피머 작용제는 적어도 1개의 아피머 폴리펩티드 서열 및 1개 이상의 이종 폴리펩티드 서열을 갖는 융합 단백질 (본원에서 "융합 도메인")이다. 융합 도메인은 목적하는 특성, 예컨대 단지 예로서, 세포로부터의 분비 또는 세포 표면 상의 보유를 부여하거나 (즉, 코딩된 아피머에 대해), 번역후 변형을 위한 기질 또는 다른 인식 서열로서 기능하거나, 단백질-단백질 상호작용을 통해 응집하는 다량체 구조를 생성하거나, 혈청 반감기를 변경시키거나 (종종 연장시키거나), 조직 국재화 또는 조직 배제 및 다른 ADME 특성을 변경시키도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 융합 도메인은, 예컨대 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리 및/또는 정제에 특히 유용하다. 발현 또는 정제를 용이하게 하는 이러한 융합 도메인의 널리 공지된 예는 단지 예시하자면, 친화성 태그, 예컨대 폴리히스티딘 (즉, His6 태그), 스트렙 II 태그, 스트렙타비딘-결합 펩티드 (SBP) 태그, 칼모듈린-결합 펩티드 (CBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스-결합 단백질 (MBP), S-태그, HA 태그, c-Myc 태그, 티오레독신, 단백질 A 및 단백질 G를 포함한다.
아피머 작용제가 분비되기 위해, 이는 일반적으로 내형질 세망의 루멘으로의 단백질의 수송을 지시하고 궁극적으로 분비되는 (또는 막횡단 도메인 또는 다른 세포 표면 보유 신호의 경우 세포 표면 상에 보유되는) 신호 서열을 함유할 것이다. 신호 서열 (신호 펩티드 또는 리더 서열로서도 지칭됨)은 신생 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 이들은 폴리펩티드를 내형질 세망으로 표적화하고, 단백질은 그의 목적지, 예를 들어 소기관의 내부 공간, 내막, 세포 외막 또는 분비를 통해 세포 외부로 분류된다. 대부분의 신호 서열은 단백질이 내형질 세망으로 수송된 후에 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 폴리펩티드로부터의 신호 서열의 절단은 통상적으로 아미노산 서열 내의 특이적 부위에서 발생하고, 신호 서열 내의 아미노산 잔기에 의존성이다.
일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 약 5 내지 약 40개 아미노산 길이 (예컨대 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25 또는 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35 또는 약 35 내지 약 40개 아미노산 길이)이다.
일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 단백질로부터의 천연 신호 펩티드이다. 다른 실시양태에서, 신호 펩티드는 비-천연 신호 펩티드이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비-천연 신호 펩티드는 상응하는 천연 분비된 인간 단백질로부터의 돌연변이체 천연 신호 펩티드이며, 1개 이상의 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의) 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 비-IgSF 단백질 패밀리, 예컨대 이뮤노글로불린 (예컨대 IgG 중쇄 또는 IgG-카파 경쇄), 시토카인 (예컨대 인터류킨-2 (IL-2), 또는 CD33), 혈청 알부민 단백질 (예를 들어 HSA 또는 알부민), 인간 아주로시딘 프리프로테인 신호 서열, 루시페라제, 트립시노겐 (예를 들어 키모트립시노겐 또는 트립시노겐)으로부터의 신호 펩티드 또는 그의 돌연변이체 또는 세포로부터 단백질을 효율적으로 분비할 수 있는 다른 신호 펩티드이다. 예시적인 신호 펩티드로는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00008
분비된 아피머 작용제의 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 발현되는 경우 신호 펩티드를 포함하며, 신호 펩티드 (또는 그의 부분)는 분비시 아피머 작용제로부터 절단된다.
대상 융합 단백질은 또한 이종 단백질 서열 또는 도메인을 분리시키는 1개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "링커"는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, 아피머)와 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 제2 아피머, Fc 영역, 수용체 트랩, 알부민 등) 사이에 삽입된 링커 아미노산 서열을 지칭한다. 연구자들에 의해 설계된 실험적 링커는 일반적으로 그의 구조에 따라 다음 3개의 카테고리로 분류된다: 가요성 링커, 강성 링커 및 생체내 절단가능한 링커. 기능적 도메인을 함께 연결하는데 있어서 (가요성 및 강성 링커에서와 같이) 또는 유리 기능적 도메인을 생체내에서 방출시키는데 있어서 (생체내 절단가능한 링커에서와 같이)의 기초적 역할 이외에도, 링커는 융합 단백질의 생산을 위한 많은 다른 이점, 예컨대 생물학적 활성의 개선, 발현 수율의 증가 및 바람직한 약동학적 프로파일의 달성을 제공할 수 있다. 링커는 융합 단백질의 발현, 분비 또는 생물활성에 불리하게 영향을 미치지 않아야 한다. 링커는 항원성이어서는 안되고, 면역 반응을 도출하지 않아야 한다.
적합한 링커는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 종종 글리신과 세린 잔기의 혼합물을 포함하며, 종종 입체 비장애 아미노산을 포함한다. 유용한 링커 내로 혼입될 수 있는 다른 아미노산은 트레오닌 및 알라닌 잔기를 포함한다. 링커의 길이는, 예를 들어 1-50개 아미노산 길이, 1-22개 아미노산 길이, 1-10개 아미노산 길이, 1-5개 아미노산 길이, 또는 1-3개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 제2 폴리펩티드가 제1 폴리펩티드로부터 분비될 수 있도록 효소 절단 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 가요성인 것으로 특징화될 수 있다. 가요성 링커는 통상적으로 연결된 도메인이 특정 정도의 이동 또는 상호작용을 요구하는 경우에 적용된다. 이들은 일반적으로 작은, 비-극성 (예를 들어 Gly) 또는 극성 (예를 들어 Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성된다. 예를 들어, 문헌 [Argos P. (1990) "An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion" J Mol Biol. 211:943-958]을 참조한다. 이들 아미노산의 작은 크기는 가요성을 제공하고, 연결되어 있는 기능적 도메인의 이동성을 허용한다. Ser 또는 Thr의 혼입은 물 분자와 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있으며, 따라서 링커와 단백질 모이어티 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 감소시킨다. 가장 통상적으로 사용되는 가요성 링커는 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치로 주로 이루어진 서열을 갖는다 ("GS" 링커). 가장 폭넓게 사용되는 가요성 링커의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n의 서열을 갖는다. 카피수 "n"을 조정함으로써, 이러한 GS 링커의 길이는 기능적 도메인의 적절한 분리를 달성하거나 또는 필요한 도메인간 상호작용을 유지하도록 최적화될 수 있다. GS 링커 이외에도, 많은 다른 가요성 링커가 재조합 융합 단백질을 위해 설계되었다. 이들 가요성 링커는 또한 작은 또는 극성 아미노산, 예컨대 Gly 및 Ser이 풍부하지만, 가요성을 유지하기 위해 추가의 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala, 뿐만 아니라 용해도를 개선시키기 위해 극성 아미노산, 예컨대 Lys 및 Glu를 함유할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 링커는 강성인 것으로 특징화될 수 있다. 가요성 링커는 기능적 도메인을 수동으로 연결하는 이점을 갖고 특정 정도의 이동을 허용하지만, 이들 링커의 강성의 결여는 특정 융합 단백질 실시양태에서, 예컨대 발현 수율 또는 생물학적 활성에서 제한일 수 있다. 이들 예에서 가요성 링커의 비유효성은 단백질 도메인의 비유효한 분리 또는 서로와의 그들의 간섭의 불충분한 감소에 기인하였다. 이들 상황 하에서, 강성 링커는 도메인 사이의 고정된 거리를 유지하고, 그들의 독립적인 기능을 유지하도록 성공적으로 적용되었다.
많은 천연 링커는 α-나선 구조를 나타냈다. α-나선 구조는 강성이고 안정하였으며, 절편내 수소 결합 및 밀접하게 패킹된 백본을 갖는다. 따라서, 강직 α-나선 링커는 단백질 도메인 사이에 강성 스페이서로서 작용할 수 있다. 문헌 [George et al. (2002) "An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding" Protein Eng. 15(11):871-9]. 일반적으로, 강성 링커는 α-나선 구조를 채택함으로써 또는 다수의 Pro 잔기를 함유함으로써 비교적 강직성인 구조를 나타낸다. 많은 상황 하에서, 이들은 가요성 링커보다 더 유효하게 기능적 도메인을 분리시킨다. 링커의 길이는 도메인 사이의 최적 거리를 달성하도록 카피수를 변화시킴으로써 용이하게 조정될 수 있다. 그 결과, 강성 링커는 도메인의 공간적 분리가 융합 단백질의 안정성 또는 생물활성을 보존하는데 중요한 경우 선택된다. 이와 관련하여, (EAAAK)n의 서열 (서열식별번호: 201)을 갖는 알파 나선-형성 링커가 많은 재조합 융합 단백질의 구축에 적용되었다. 또 다른 유형의 강성 링커는 프로-풍부 서열 (XP)n을 갖고, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 Ala, Lys 또는 Glu를 나타낸다.
단지 예시하자면, 예시적인 링커는 하기를 포함한다:
Figure pct00009
대상 융합 단백질에 사용될 수 있는 다른 링커는 SerGly, GGSG (서열식별번호: 203), GSGS (서열식별번호: 204), GGGS (서열식별번호: 205), S(GGS)n (서열식별번호: 206) (여기서 n은 1 내지 7임), GRA, 폴리(Gly), 폴리(Ala), GGGSGGG (서열식별번호: 166), ESGGGGVT (서열식별번호: 167), LESGGGGVT (서열식별번호: 168), GRAQVT (서열식별번호: 169), WRAQVT (서열식별번호: 170), 및 ARGRAQVT (서열식별번호: 171)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하기 기재된 Fc 융합체의 힌지 영역은 또한 링커로 간주될 수 있다.
세포의 형질 막 상에 단백질을 앵커링하기 위해 다양한 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 유형-I (세포 외부에 N-말단이 배향됨) 및 유형-II (시토졸에 N-말단이 배향됨) 내재성 막 단백질의 막횡단 도메인 (TM)은 키메라 단백질을 형질 막으로 표적화하는데 사용될 수 있다. 단백질은 또한 유전자의 3' 말단에의 GPI (글리코포스파티딜이노시톨 지질) 신호의 융합에 의해 세포 표면에 부착될 수 있다. 짧은 카르복시-말단 펩티드의 절단은 아미드 연결을 통해 새롭게 노출된 C-말단에의 당지질의 부착을 허용한다. 문헌 [Udenfriend et al. (1995) "How Glycosylphoshpatidylinositol Anchored Membrane Proteins are Made" Annu Rev Biochem 64:563-591]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 막횡단 폴리펩티드 서열 (막횡단 도메인)을 포함한다. 적절한 막횡단 폴리펩티드의 구별되는 특색은 아피머 작용제가 디스플레이될 세포의 표면에서 발현되는 능력을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이는 면역 세포, 특히 림프구 세포 또는 자연 킬러 (NK) 세포일 수 있고, 그곳에서 PD-L1과 상호작용하여 PD-L1이 상향조절되는 미리 한정된 표적 종양 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 지시한다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 막횡단 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 비제한적 예로서, 막횡단 폴리펩티드는 T 세포 수용체의 서브유닛, 예컨대 α, β, γ 또는 δ, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL2 수용체 p55 (a 쇄), p75 (β 쇄) 또는 γ 쇄, Fc 수용체의 서브유닛 쇄, 특히 Fey 수용체 III 또는 CD 단백질일 수 있다. 대안적으로 막횡단 도메인은 합성일 수 있고, 우세하게 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 수 있다.
특정의 다른 실시양태에서, 아피머 작용제는 아피머 폴리펩티드에 추가로, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커의 번역후 첨가를 신호전달하는 서열을 포함하는 융합 단백질이다. GPI 앵커는 많은 진핵생물 단백질의 C-말단에 번역후 첨가되는 당지질 구조이다. 아피머 작용제에 대한 이러한 변형은 이를 아피머 작용제가 재조합 단백질 (즉, 하기 기재된 바와 같은 코딩된 아피머)로서 재-발현되는 세포의 세포 막의 세포외 표면 상에 앵커링되게 (부착되게) 할 것이다. 이들 실시양태에서, GPI 앵커 도메인은 아피머 폴리펩티드 서열에 대해 C-말단이며, 바람직하게는 융합 단백질의 C-말단에서 발생한다.
일부 실시양태에서, GPI 앵커 도메인은 그것이 일부인 융합 단백질이 진핵생물 시스템에서 발현되는 경우 GPI 앵커의 번역후 첨가를 신호전달하는 폴리펩티드이다. GPI 앵커 신호 서열은 앵커 첨가의 부위 (ω 부위)에 이어서 친수성 스페이서 다음 소수성 스트레치에서 종료되는 작은 아미노산의 세트로 이루어진다 (Low, (1989) FASEB J. 3:1600-1608). 이 신호 서열의 절단은 보존된 중심 성분을 갖지만 가변적 주위 모이어티를 갖는 앵커의 첨가 전에 ER에서 일어난다 (Homans et al., Nature, 333:269-272 (1988)). GPI-앵커링된 단백질의 C-말단은 포스포에탄올아민 가교를 통해 고도로 보존된 코어 글리칸, 만노스(α1-2)만노스(α1-6)만노스(α1-4)글루코사민(α1-6)미오-이노시톨에 연결된다. 인지질 꼬리는 GPI 앵커를 세포 막에 부착시킨다.
대상 아피머-함유 융합 단백질에 사용될 수 있는 예시적인 GPI 앵커 도메인은 하기를 포함한다:
SGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT (서열식별번호: 172)
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI (서열식별번호: 173)
SAPVLSAVATVGITIGVLARVALI (서열식별번호: 174)
SSPDLSAGTAVSIMIGVLAGMALI (서열식별번호: 175)
TLGGNSASYTFVSLLFSAVTLLLLC (서열식별번호: 176)
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI (서열식별번호: 177)
GPI 앵커 부착은 GPI 번역후 변형을 수행할 수 있는 진핵생물 시스템에서 GPI 앵커 도메인을 함유하는 아피머 융합 단백질의 발현에 의해 달성될 수 있다. 막횡단 도메인 융합 단백질과 마찬가지로, 항종양을 개시하거나 촉진하는데 관여하는 림프구 및 다른 세포를 비롯한 인간 세포는 그렇게 할 수 있으며, 조작된 세포의 표면 상에 발현된 아피머 함유 융합체를 보유하기 위해 GPI 앵커 도메인을 포함하는 코딩된 아피머를 발현하도록 조작될 수 있다.
아피머 폴리펩티드 서열 그 자체에 또는 융합 단백질의 일부로서 제공되는 플랭킹 폴리펩티드 모이어티에 이루어질 수 있는 추가의 다른 변형은 효소에 의한 번역후 변형을 위한 부위인 1개 이상의 서열이다. 이들은 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질-연결 변형 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
b. PK 및 ADME 특성의 조작
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 투여의 경로, 예컨대 비경구 치료 투여에 최적인 반감기 및/또는 PK 프로파일을 갖지 않을 수 있다. 용어 "반감기"는 물질, 예컨대 본 개시내용의 아피머 작용제가 그의 약리학적 또는 생리학적 활성 또는 농도의 절반을 상실하는데 걸리는 시간의 양을 지칭한다. 생물학적 반감기는 물질의 제거, 배출, 분해 (예를 들어, 효소적), 또는 신체의 특정 기관 또는 조직에서의 흡수 및 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 반감기는 물질의 혈장 농도가 그의 정상 상태 수준의 절반에 도달하는데 걸리는 시간 ("혈장 반감기")을 측정함으로써 평가될 수 있다. 이러한 단점을 해결하기 위해, 아피머 작용제의 일부로서 반감기 연장 모이어티를 혼입시키는 것을 비롯하여, 다른 단백질 치료제의 경우에서 사용된 반감기 연장을 위한 다양한 일반적 전략이 존재한다.
용어 "반감기 연장 모이어티"는 아피머 폴리펩티드의 생체내 단백질분해적 분해 또는 다른 활성-감소 변형을 방지하거나 경감시키고/거나, 반감기를 증가시키고/거나, 비교자, 예컨대 변형된 아피머 폴리펩티드의 비접합된 형태와 비교하여, 흡수의 속도의 증가, 독성의 감소, 용해도의 개선, 단백질 응집의 감소, 변형된 아피머 폴리펩티드의 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성의 증가, 제조성의 증가 및/또는 변형된 아피머 폴리펩티드의 면역원성의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 약동학적 또는 생물물리학적 특성을 개선시키거나 변경시키는, 임의로 비-천연 코딩된 아미노산을 통해, 직접적으로 또는 링커를 통해, 본원에 기재된 아피머 작용제를 형성하기 위해 아피머 폴리펩티드에 공유적으로 연결된 ("접합된" 또는 "융합된") 제약상 허용되는 모이어티, 도메인 또는 분자를 지칭한다. 용어 "반감기 연장 모이어티"는 비-단백질성, 반감기 연장 모이어티, 예컨대 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 이산 PEG, 히드록시에틸 전분 (HES), 지질, 분지형 또는 비분지형 아실 기, 분지형 또는 비분지형 C8-C30 아실 기, 분지형 또는 비분지형 알킬 기, 및 분지형 또는 비분지형 C8-C30 알킬 기; 및 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 혈청 알부민, 트랜스페린, 애드넥틴 (예를 들어, 알부민-결합 또는 약동학 연장 (PKE) 애드넥틴), Fc 도메인, 및 비구조화된 폴리펩티드, 예컨대 XTEN 및 PAS 폴리펩티드 (예를 들어 아미노산 Pro, Ala 및/또는 Ser로 구성된 입체형태적으로 무질서한 폴리펩티드 서열), 및 상기 중 임의의 것의 단편을 포함한다. 아피머의 결정 구조 및 그의 표적과의 상호작용, 예컨대 도면에 제시된 PD-1과의 항-PD-L1 아피머 복합체의 검사는 특정 아미노산 잔기가 용매에 완전히 또는 부분적으로 접근가능한 측쇄를 갖는지를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 이러한 모이어티에 접합되지 않은 단백질의 반감기와 비교하여 (예컨대 아피머 폴리펩티드 단독에 비해) 포유동물 혈청에서 순환하는 생성된 아피머 작용제의 반감기를 연장시킨다. 일부 실시양태에서, 반감기는 약 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배 또는 6.0배 초과만큼 연장된다. 일부 실시양태에서, 반감기는 반감기 연장 모이어티가 없는 단백질과 비교하여 생체내 투여 후에 6시간 초과, 12시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 72시간 초과, 96시간 초과 또는 1주 초과만큼 연장된다.
추가 예시를 위한 수단으로서, 본 개시내용의 아피머 작용제의 생성에 사용될 수 있는 반감기 연장 모이어티는 하기를 포함한다:
● 자연적으로 긴-반감기 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 약리학상 아피머 서열의 유전자 융합체 (예를 들어, Fc 융합체, 트랜스페린 [Tf] 융합체 또는 알부민 융합체). 예를 들어, 문헌 [Beck et al. (2011) "Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1-2; Czajkowsky et al. (2012) "Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015-28; Huang et al. (2009) "Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology" Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692-9; Keefe et al. (2013) "Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; p. 345-56; Weimer et al. (2013) "Recombinant albumin fusion proteins. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 297-323; Walker et al. (2013) "Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325-43]을 참조한다.
● 불활성 폴리펩티드, 예를 들어 XTEN (재조합 PEG 또는 "rPEG"로도 공지됨), 단독아미노산 중합체 (HAP; HAP화), 프롤린-알라닌-세린 중합체 (PAS; PAS화), 또는 엘라스틴-유사 펩티드 (ELP; ELP화)에 대한 약리학적 활성 아피머 서열의 유전자 융합체. 예를 들어, 문헌 [Schellenberger et al. (2009) "A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186-90; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273-84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489-501. Floss et al. (2012) "Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37-45. Floss et al. "ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372-98]을 참조한다.
● 반복 화학적 모이어티, 예를 들어 PEG (PEG화) 또는 히알루론산에 대한 약리학적 활성 펩티드 또는 단백질의 화학적 접합에 의해 유체역학적 반경을 증가시키는 것. 예를 들어, 문헌 [Caliceti et al. (2003) "Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates" Adv Drug Delivery Rev. 55:1261-77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113-28; Kontermann (2009) "Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies" BioDrugs. 23:93-109; Kang et al. (2009) "Emerging PEGylated drugs" Expert Opin Emerg Drugs. 14:363-80; 및 Mero et al. (2013) "Conjugation of hyaluronan to proteins" Carb Polymers. 92:2163-70]을 참조한다.
● 폴리시알릴화에 의해 약리학적 활성 펩티드 또는 단백질 융합의 음전하를 유의하게 증가시키는 것; 또는 대안적으로, (b) 생물학적 약물 후보에, 천연 단백질, 예컨대 인간 CG b-서브유닛의 반감기를 연장시키는 것으로 공지된 음으로 하전된 고도로 시알릴화된 펩티드 (예를 들어, 카르복시-말단 펩티드 [CTP; 융모성 고나도트로핀 (CG) b-쇄의 것])를 융합시키는 것. 예를 들어, 문헌 [Gregoriadis et al. (2005) "Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids" Int J Pharm. 2005; 300:125-30; Duijkers et al. "Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females" (2002) Hum Reprod. 17:1987-93; and Fares et al. "Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit" (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304-8. 35; and Fares "Half-life extension through O-glycosylation]을 참조한다.
● 생물활성 단백질에, 통상적으로 긴-반감기 단백질, 예컨대 HSA, 인간 IgG, 트랜스페린 또는 피브로넥틴에 대한 펩티드 또는 단백질-결합 도메인의 부착을 통해 비-공유적으로 결합시키는 것. 예를 들어, 문헌 [Andersen et al. (2011) "Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain" J Biol Chem. 286:5234-41; O'Connor-Semmes et al. (2014) "GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans―PK/PD and safety" Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704-12. Sockolosky et al. (2014) "Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice" PLoS One. 2014;9:e102566]을 참조한다.
오래 살아남은 혈청 단백질에 대한 전형적인 유전적 융합은 PEG 또는 지질에의 화학적 접합으로부터 구별되는 반감기 연장의 대안적 방법을 제공한다. 2가지 주요한 단백질은 전통적으로 융합 파트너로서 사용되었다: 항체 Fc 도메인 및 인간 혈청 알부민 (HSA). Fc 융합체는 항체의 Fc 부분에 대한 펩티드, 단백질 또는 수용체 엑소도메인의 융합체를 포함한다. Fc 및 알부민 융합체 둘 다는 펩티드 약물의 크기를 증가시킴으로써 뿐만 아니라, 둘 다 신체의 자연 재생 메카니즘: 신생아 Fc 수용체, FcRn을 이용함으로써 연장된 반감기를 달성한다. FcRn에 대한 이들 단백질의 pH-의존성 결합은 엔도솜에서 융합 단백질의 분해를 방지한다. 이들 단백질에 기초한 융합체는 전형적인 PEG화된 또는 지질화된 펩티드보다 훨씬 더 긴, 3-16일 범위의 반감기를 가질 수 있다. 항체 Fc 도메인에 대한 융합체는 펩티드 또는 단백질 약물의 용해도 및 안정성을 개선시킬 수 있다. 펩티드 Fc 융합체의 예는 현재 후기-단계 임상 시험 중인 GLP-1 수용체 효능제인 둘라글루티드이다. 지방 아실화 펩티드에 의해 이용되는 동일한 단백질인 인간 혈청 알부민은 다른 대중적인 융합 파트너이다. 알비글루티드는 이 플랫폼에 기초한 GLP-1 수용체 효능제이다. Fc와 알부민 사이의 주요 차이는 융합 파트너의 선택에 따라 이량체 또는 단량체로서 융합된 펩티드의 제시를 유도하는 Fc의 이량체 성질 대 HSA의 단량체 구조이다. 아피머-Fc 융합체의 이량체 성질은 아피머 표적, 예컨대 종양 세포 상의 PD-L1이 함께 충분히 밀접하게 이격되어 있거나 또는 그 자체가 이량체인 경우에 결합력 효과를 생성할 수 있다. 이는 표적에 따라 바람직하거나 그렇지 않을 수 있다.
(i) Fc 융합체
일부 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 Fc 도메인 ("Fc 도메인"), 또는 그의 단편 또는 변이체, 예컨대 기능적 Fc 영역을 갖는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 이 맥락에서, Fc 융합체 ("Fc-융합체"), 예컨대 아피머-Fc 융합 단백질로서 생성된 아피머 작용제는 펩티드 백본을 통해 (직접적으로 또는 간접적으로) 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 공유적으로 연결된 1개 이상의 아피머 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. Fc-융합체는, 예를 들어 항체의 Fc 영역 (이는 이펙터 기능 및 약동학을 용이하게 함) 및 동일한 폴리펩티드의 일부로서 아피머 서열을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 Fc 영역은 또한 1개 이상의 아피머에 간접적으로 연결될 수 있다. 다양한 링커는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, Fc-융합체를 생성하기 위해 아피머 서열을 포함하는 폴리펩티드에 Fc를 연결하는데 임의로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc-융합체는 이량체화되어 Fc-융합체 동종이량체를 형성하거나, 비-동일한 Fc 도메인을 사용하여 Fc-융합체 이종이량체를 형성할 수 있다.
아피머 융합 단백질로서 대상 아피머 작용제를 생성하는데 사용하기 위해 인간 항체의 Fc 영역을 선택하는 데에는 여러 이유가 있다. 원리 근거는 항체의 경우와 비교하여 유사한 약동학적 프로파일을 입증하는데 충분히 큰 안정한 단백질을 생성하는 것 및 Fc 영역에 의해 부여되는 특성을 이용하는 것이며; 이는 세포내이입 후 세포 표면에 대한 융합 단백질의 FcRn-매개된 재생을 포함하는 샐비지 신생아 FcRn 수용체 경로를 포함하며, 이는 리소솜 분해를 회피하고, 혈류 내로의 방출을 다시 초래하며, 따라서 연장된 혈청 반감기에 기여한다. 또 다른 자명한 이점은 단백질 A에의 Fc 도메인의 결합이며, 이는 아피머 작용제의 제조 동안 하류 프로세싱을 단순화하고, 아피머 작용제의 고도로 순수한 제제의 생성을 허용할 수 있다.
일반적으로, Fc 도메인은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함할 것이다. 따라서, Fc 도메인은 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인 및 이들 도메인에 대한 가요성 힌지 N-말단을 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. Fc 도메인의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 그의 카르복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트에 제시된 바와 같은 EU 인덱스를 따른다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991)). Fc는 단리된 이 영역, 또는 전체 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질의 맥락에서의 이 영역을 지칭할 수 있다. 다형성은 다수의 상이한 Fc 위치에서 관찰되었으며, 또한 본원에 사용된 바와 같은 Fc 도메인으로서 포함된다.
특정 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 Fc, "기능적 Fc 영역"은 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 Fc 도메인 또는 그의 단편을 지칭한다. 기능적 Fc 영역은 FcRn에 결합하지만, 이펙터 기능을 갖지 않는다. FcRn에 결합하기 위한 Fc 영역 또는 그의 단편의 능력은 관련 기술분야에 공지된 표준 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 하위부류로부터 유래되지만, 다른 하위부류 (예를 들어, IgG2, IgG3 및 IgG4)도 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 예시적인 서열은 하기이다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열식별번호: 95)
일부 실시양태에서, 융합 단백질에 사용된 Fc 영역은 Fc 분자의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 1-16에 걸치는 코어 힌지 잔기 (즉, DKTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 178)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 아피머-함유 융합 단백질은 부분적으로 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 힌지 영역 내의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기로 인해 다량체 구조 (예를 들어, 이량체)를 채택할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 코어 힌지 서열에 플랭킹된 CH1 및 CH2 영역으로부터 유래된 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 힌지 서열은 GSTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 179) 또는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 180)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 힌지 서열은 바람직한 약동학적, 생물물리학적 및/또는 생물학적 특성을 부여하는 1개 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 힌지 서열은 하기를 포함한다:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열식별번호: 181);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열식별번호: 182);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 183);
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 184);
DKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열식별번호: 185); 및
DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 151).
일부 실시양태에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 18에서의 잔기 P는 Fc 이펙터 기능을 제거하기 위해 S로 대체될 수 있으며; 이 대체는 서열 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 183), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 184), 및 DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 186)를 갖는 힌지에서 예시된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 1-2에서의 잔기 DK는 잠재적 클립 부위를 제거하기 위해 GS로 대체될 수 있으며; 이 대체는 서열 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 184)에서 예시된다. 또 다른 실시양태에서, 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역 (즉, 도메인 CH1-CH3)의 위치 103에서의 C는 경쇄의 부재 하에 부적절한 시스테인 결합 형성을 방지하기 위해 S로 대체될 수 있으며; 이 대체는 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열식별번호: 182), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 183), 및 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 184)에 의해 예시된다.
일부 실시양태에서, Fc는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된 Fc 도메인을 비롯한 포유동물 Fc, 예컨대 인간 Fc이다. Fc 영역은 천연 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 천연 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 90% 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 95로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 96-108에 의해 제공된 예로부터의 Fc 서열을 포함한다. Fc 도메인의 C-말단 리신은 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 임의적인 성분임이 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 그의 C-말단 리신이 생략된 것을 제외하고는, 서열식별번호: 95 - 108로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 그의 C-말단 리신이 생략된 것을 제외하고는, 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
PD-L1 결합 아피머와 Fc와의 예시적인 Fc 융합체가 실시예 및 도면에 제공되며, 이는 아피머 서열이 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단 단부에 위치할 수 있고, 직접 부착될 수 있거나 또는 융합 단백질이 Fc 도메인과 아피머 폴리펩티드 서열 사이에 개재되는 다른 폴리펩티드 서열을 가질 수 있음을 입증한다. 예시된 예에서, 비구조화된 (가요성) 링커 (Gly4Ser)n은 PD-L1 결합 아피머 "251" (서열식별번호: 86) 및 힌지 영역이 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG인 인간 IgG1의 Fc 도메인 (서열식별번호: 95)과 함께 사용된다. 구축물은 둘 다 단백질의 성숙 버전으로부터 절단되는 CD33 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)를 포함하였다.
Figure pct00012
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 제시된 Fc 수용체 (FcR) 상으로 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시키는 것을 가능하게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 생성된 아피머 작용제가 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 이펙터 기능을 갖지 않는 (또는 이들이 감소된) Fc 도메인 서열을 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 IgG2 또는 IgG4 이소형의 자연 불능화 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 EP0307434에 기재되어 있다. 한 예는 위치 235 및 237 (EU 인덱스 넘버링)에서의 알라닌 잔기의 치환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은, 예를 들어 융합 단백질이 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터의 Fc 도메인을 포함하는 경우와 같이, 생성된 아피머 작용제가 일부 또는 모든 Fc 기능성을 보유할, 예를 들어 ADCC 및 CDC 활성 중 하나 또는 둘 다가 가능할 Fc 도메인 서열을 포함한다. 이펙터 기능의 수준은 공지된 기술에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 항체가 증진된 이펙터 기능을 갖도록, 예를 들어 IgG1 CH2 도메인이 239 및 332 및 330으로부터 선택된 위치에 1개 이상의 돌연변이를 갖는, 예를 들어 돌연변이가 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택되는 CH2 도메인 내의 돌연변이에 의해 달라질 수 있고/거나, 예를 들어 Fc 영역의 푸코실화의 감소가 있도록 본 개시내용의 항원-결합 단백질의 글리코실화 프로파일을 변경시킴으로써 달라질 수 있다.
(ii) 알부민 융합체
다른 실시양태에서, 아피머 작용제는 적어도 1개의 아피머 서열에 추가로, 알부민 서열 또는 알부민 단편을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, 아피머 작용제는 아피머를 포함하는 폴리펩티드 서열 내로의 혼입 이외의 화학적 연결을 통해 알부민 서열 또는 알부민 단편에 접합된다. 일부 실시양태에서, 알부민, 알부민 변이체 또는 알부민 단편은 인간 혈청 알부민 (HSA), 인간 혈청 알부민 변이체 또는 인간 혈청 알부민 단편이다. HSA에 대등한 알부민 혈청 단백질은, 예를 들어 시노몰구스 원숭이, 소, 개, 토끼 및 래트에서 발견된다. 비-인간 종 중에서, 소 혈청 알부민 (BSA)이 HSA와 가장 구조적으로 유사하다. 예를 들어, 문헌 [Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24]을 참조한다. 본 개시내용은 시노 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민으로부터 유래된 알부민 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 비-인간 종으로부터의 알부민의 사용을 고려한다.
약 20일의 혈청 반감기를 갖는 585개 아미노산 폴리펩티드 (대략 67 kDa)인 성숙 HSA는 콜로이드성 삼투 혈압, 혈액 pH의 유지 및 수많은 내인성 및 외인성 리간드의 수송 및 분포를 주로 담당한다. 단백질은 3가지 구조적으로 상동성인 도메인 (도메인 I, II 및 III)을 갖고, 거의 전체적으로 알파-나선 입체형태이며, 17개의 디술피드 가교에 의해 고도로 안정화된다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 1개 이상의 아피머 폴리펩티드 서열 및 성숙 인간 혈청 알부민에 대한 서열 (서열식별번호: 113) 또는 융합 단백질에서 목적하는 정도로 성숙 알부민의 PK 및/또는 생체분포 특성을 유지하는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 알부민 융합 단백질일 수 있다.
Figure pct00013
알부민 서열은 상기 기재된 바와 같은 링커 서열의 사용에 의해 아피머 폴리펩티드 서열 또는 아피머 작용제 내 다른 플랭킹 서열로부터 분리될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에서 "알부민" 또는 "성숙 알부민"에 대한 언급은 HSA를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나, 전장 HSA가 18개 아미노산의 신호 펩티드 (MKWVTFISLLFLFSSAYS (서열식별번호: 137)), 이어서 6개 아미노산의 프로-도메인 (RGVFRR) (서열식별번호: 207)을 갖는다는 것을 주목하며; 이러한 24개 아미노산 잔기 펩티드는 프리-프로 도메인으로 지칭될 수 있다. 아피머-HSA 융합 단백질은 재조합 단백질 코딩 서열에서 HSA 프리-프로-도메인을 사용하여 발현되고 분비될 수 있다. 대안적으로, 아피머-HSA 융합체는 상기 기재된 바와 같이 다른 분비 신호 서열을 포함시킴으로써 발현되고 분비될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질의 일부로서 제공되기 보다는, 혈청 알부민 폴리펩티드는 백본 아미드 결합 이외의 결합을 통해 아피머-함유 폴리펩티드에 공유적으로 커플링될 수 있으며, 예컨대 알부민 폴리펩티드 및 아피머-함유 폴리펩티드 각각 상의 아미노산 측쇄 사이의 화학적 접합을 통해 가교될 수 있다.
(iii) 알부민 결합 도메인
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 혈청-결합 모이어티를 아피머 폴리펩티드 서열을 갖는 융합 단백질 (또한 폴리펩티드의 경우)의 일부로서 포함할 수 있거나 또는 인접 폴리펩티드 쇄의 일부가 아닌 다른 부위를 통해 화학적으로 접합되도록 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 혈청-결합 폴리펩티드는 알부민 결합 모이어티이다. 알부민은 다수의 소수성 결합 포켓을 함유하며, 자연적으로 다양한 상이한 리간드, 예컨대 지방산 및 스테로이드 뿐만 아니라 상이한 약물의 수송체로서의 역할을 한다. 추가로, 알부민의 표면은 음으로 하전되어, 이를 고도로 수용성으로 만든다.
본원에 사용된 용어 "알부민 결합 모이어티"는 알부민에 결합할 수 있는, 즉 알부민 결합 친화도를 갖는 임의의 화학적 기를 지칭한다. 알부민은 내인성 리간드, 예컨대 지방산에 결합하지만; 이는 또한 외인성 리간드, 예컨대 와파린, 페니실린 및 디아제팜과 상호작용한다. 알부민에의 이들 약물의 결합은 가역적이기 때문에, 알부민-약물 복합체는 약물 생체분포 및 생체이용률을 증진시킬 수 있는 약물 저장소로서의 역할을 한다. 내인성 알부민-결합 리간드를 모방하는 성분, 예컨대 지방산의 혼입은 알부민 회합을 강화시키고 약물 효능을 증가시키는데 사용되었다.
일부 실시양태에서, 단백질 반감기를 증가시키는 대상 아피머 작용제의 생성에 적용될 수 있는 화학적 변형 방법은 지질화이며, 이는 펩티드 측쇄에의 지방산의 공유 결합을 포함한다. 원래 인슐린의 반감기를 연장시키기 위한 방법으로서 구상되고 개발되었지만, 지질화는 PEG화와 동일한 반감기 연장의 기초 메카니즘, 즉 신장 여과를 감소시키는 유체역학 반경의 증가를 공유한다. 그러나, 지질 모이어티는 그 자체가 비교적 작으며, 효과는 순환 알부민에의 지질 모이어티의 비-공유 결합을 통해 간접적으로 매개된다. 지질화의 하나의 결과는 그것이 펩티드의 수용해도를 감소시킨다는 것이지만, 펩티드와 지방산 사이의 링커의 조작은, 예를 들어 링커 내의 글루타메이트 또는 미니 PEG의 사용에 의해 이를 조정할 수 있다. 링커 조작 및 지질 모이어티의 변이는 알부민과 독립적으로 생체분포를 감속시킴으로써 증가된 반감기에 기여할 수 있는 자기-응집에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14]을 참조한다.
특정 아피머 작용제의 생성에 사용하기 위한 알부민 결합 모이어티의 다른 예는 알부민-결합 (PKE2) 애드넥틴 (WO2011140086 "혈청 알부민 결합 분자", WO2015143199 "혈청 알부민-결합 피브로넥틴 유형 III 도메인" 및 WO2017053617 "빠른-오프 레이트 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인" 참조), 스트렙토코쿠스 균주 G148의 단백질 G의 알부민 결합 도메인 3 (ABD3), 및 알부민 결합 도메인 항체 GSK2374697 ("AlbudAb") 또는 ATN-103 (오조랄리주맙)의 알부민 결합 나노바디 부분을 포함한다.
(iv) PEG화, XTEN, PAS 및 다른 중합체
매우 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자는 생성된 아피머 작용제의 생물학적 특성을 조정하고/거나 아피머 작용제에 새로운 생물학적 특성을 제공하기 위해 본 개시내용의 아피머 함유 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 이들 거대분자 중합체는 천연 코딩된 아미노산을 통해, 비-천연 코딩된 아미노산, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 관능성 치환기, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산에 첨가된 임의의 치환기 또는 관능기를 통해 아피머 함유 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 초과를 포함하나 이에 제한되지는 않는 넓은 범위의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 예를 들어 비제한적으로 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.
이러한 목적을 위해, 가요성 및 친수성 아미노산 쇄 (500 내지 600개 아미노산)에 융합된 PEG화, 폴리시알릴화, HES화, 글리코실화 또는 재조합 PEG 유사체를 포함한 다양한 방법이 개발되었다 (문헌 [Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283; Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246] 참조).
중합체의 예는 폴리알킬 에테르 및 그의 알콕시-캡핑된 유사체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 그의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜, 후자는 또한 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로 공지됨); 이산 PEG (dPEG); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드, 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드 (예를 들어, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 그의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 그의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 술페이트, 아미노덱스트란을 포함한 폴리사카라이드 및 그의 유도체; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 그의 유도체, 예를 들어 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 그의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 술페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 그의 유도체, 예를 들어 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대: 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 그의 공중합체; 그의 삼원공중합체; 그의 혼합물; 및 상기의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
선택된 중합체는 그것이 부착되는 아피머 작용제가 수성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 침전되지 않도록 수용성일 수 있다. 수용성 중합체는 선형, 갈래형 또는 분지형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리 (알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용될 수 있다. 예로서, PEG는 본 개시내용의 일부 실시양태를 기재하는데 사용된다. 아피머 작용제의 치료 용도를 위해, 중합체는 제약상 허용될 수 있다.
용어 "PEG"는 PEG의 말단에서의 크기 또는 변형에 상관 없이, 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하도록 폭넓게 사용되며, 하기 화학식에 의해 아피머 함유 폴리펩티드에 연결된 것으로서 나타내어질 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
또는
XO-(CH2CH2O)n-
여기서 n은 2 내지 10,000이고, X는 H이거나 또는 C1-4 알킬, 보호기 또는 말단 관능기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 말단 변형이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 폴리펩티드에 사용되는 PEG는 한쪽 말단에서 히드록시 또는 메톡시로 종결되며, 즉 X는 H 또는 CH3 ("메톡시 PEG")이다.
상기 화학식에서 말단 "-"에 의해 나타내어진 PEG의 다른 말단은 자연-발생 또는 비-자연 코딩된 아미노산을 통해 아피머 함유 폴리펩티드에 부착될 수 있음이 주목된다. 예를 들어, 부착은 폴리펩티드의 아민 기 (리신의 엡실론 아민 또는 N-말단을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 연결을 통해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 중합체는 티올 기 (시스테인의 티올 기를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 대한 말레이미드 연결에 의해 연결된다 - 이는 아피머 폴리펩티드 서열에 대한 부착의 경우 그 자체로 아피머 서열에서의 잔기를 시스테인으로 변경시키는 것을 요구한다.
아피머-함유 폴리펩티드에 연결되는 수용성 중합체의 수 (즉, PEG화 또는 글리코실화의 정도)는 생성된 아피머 작용제에서의 변경된 (증가된 또는 감소된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약역학적 특징, 예컨대 생체내 반감기를 제공하도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 아피머 작용제의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 퍼센트, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배 또는 적어도 약 100배 증가된다.
생성된 아피머 작용제의 PK 또는 다른 생물학적 특성을 변형시키는데 유용한 중합체 시스템의 또 다른 변형은 특히 아피머 폴리펩티드 서열을 갖는 융합 단백질의 일부로서, PEG의 기능적 유사체인 비구조화된 친수성 아미노산 중합체의 사용이다. 폴리펩티드 플랫폼의 고유한 생분해성은 이를 PEG에 대한 잠재적으로 보다 양성인 대안으로서 매력적이게 만든다. 또 다른 이점은 PEG의 다분산도와 반대로 재조합 분자의 정확한 분자 구조이다. 융합 파트너의 3차원 폴딩이 유지될 필요가 있는 HSA 및 Fc 펩티드 융합체와는 달리, 비구조화된 파트너에 대한 재조합 융합은 많은 경우 보다 높은 온도 또는 가혹한 조건, 예컨대 HPLC 정제에 처해질 수 있다.
이 부류의 폴리펩티드의 보다 진보된 것 중 하나는 XTEN (아무닉스(Amunix))으로 칭해지고, 864개 아미노산 길이이며, 6개 아미노산 (A, E, G, P, S 및 T)으로 구성된다. 문헌 [Schellenberger et al. "A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner" 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90]을 참조한다. 중합체의 생분해성 성질에 의해 가능하게 되어, 이는 전형적으로 사용되는 40 KDa PEG보다 훨씬 더 크고, 동시에 더 큰 반감기 연장을 부여한다. 아피머 함유 폴리펩티드에 대한 XTEN의 융합은 비변형된 폴리펩티드에 비해 60 내지 130배만큼 최종 아피머 작용제의 반감기 연장을 가져올 것이다.
유사한 개념적 고려사항에 기초한 제2 중합체는 PAS이다 (엑스엘-프로테인 게엠베하(XL-Protein GmbH)). 문헌 [Schlapschy et al. "PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins" 2013 Protein Eng Des Sel. 26(8):489-501]. 무작위 코일 중합체는 단지 3개의 작은 비하전된 아미노산인 프롤린, 알라닌 및 세린의 훨씬 더 제한된 세트로 구성되었다. Fc, HAS 및 XTEN과 마찬가지로, PAS 변형은 아피머 폴리펩티드 서열로 유전자 코딩되어, 발현되는 경우 인라인 융합 단백질을 생성할 수 있다.
c. 다중특이적 융합 단백질
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는, 예를 들어 제1 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드 및 적어도 1개의 추가의 결합 도메인을 포함하는 다중-특이적 폴리펩티드이다. 추가의 결합 도메인은, 예시하자면, 제2 아피머 폴리펩티드 서열 (이는 제1 아피머 폴리펩티드 서열과 동일하거나 상이할 수 있음), 항체 또는 그의 단편 또는 다른 항원 결합 폴리펩티드, 수용체의 리간드 결합 부분 (예컨대 수용체 트랩 폴리펩티드), 수용체-결합 리간드 (예컨대 시토카인, 성장 인자 등), 조작된 T-세포 수용체, 효소 또는 그의 촉매 단편, 또는 일부를 부여하는 다른 폴리펩티드 서열 중으로부터 선택된 폴리펩티드 서열일 수 있다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 PD-L1에 또한 지시되는 1개 이상의 추가의 아피머 폴리펩티드 서열을 포함한다. 추가의 항-PD-L1 아피머는 다중-특이적 아피머 융합 단백질을 생성하기 위해 제1 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드와 동일하거나 상이할 수 있다 (또는 그의 혼합물). 아피머 작용제는 PD-L1 상의 동일한 또는 중첩 부위에 결합할 수 있거나 또는 아피머 작용제가 동일한 PD-L1 단백질 상의 2개의 부위 (이중파라토프) 또는 2개 초과의 부위 (다중파라토프)에 동시에 결합할 수 있도록 2개의 상이한 부위에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 항체로부터의 1개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 생성된 아피머 작용제는 항-PD-L1 아피머 및 항원 결합 부위 둘 다를 포함하는 단일 쇄일 수 있거나 (예컨대 scFV의 경우), 또는 예컨대 항-PD-L1 항체의 서열이 또한 융합된 중쇄 및/또는 경쇄로 조립된 항체에서와 같은 다량체 단백질 복합체일 수 있다. 이러한 포맷의 예시적인 아피머/항체 융합체는 도 11a에 제시된 이필리무맙-AVA04-141 이중특이적 항체이며, 이는 CTLA-4 및 PD-L1 각각에 대해 2가이다. 또 다른 것은 도 13a에 제시된 베바시주맙-AVA04-251 이중특이적 항체이며, 이는 VEGF-A 및 PD-L1 각각에 대해 2가이다.
예시된 이필리무맙-AVA04-141 이중특이적 항체의 경우에, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 항-CTLA-4 항체의 중쇄의 C-말단 단부에서 인-라인 융합체로서 제공되며, 여기서 중쇄 (제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136) 및 Gly4-Ser 반복 링커 포함)는 하기 아피머 융합 서열을 갖는다:
Figure pct00014
그리고 경쇄 (제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136) 포함)는 하기 천연 이필리무맙 항체의 서열을 갖는다:
Figure pct00015
마찬가지로, 예시된 베바시주맙-AVA04-251 이중특이적 항체의 경우에, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 항-VEGF-A 항체의 중쇄의 C-말단 단부에서 인-라인 융합체로서 제공되며, 여기서 중쇄 (제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136) 및 가요성 Gly4-Ser 반복 링커 포함)는 하기 아피머 융합 서열을 갖는다:
Figure pct00016
그리고 경쇄 (제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136) 포함)는 하기 천연 베바시주맙 항체의 서열을 갖는다:
Figure pct00017
본 개시내용의 아피머를 포맷화하는데 있어서의 가요성을 추가로 예시하기 위해, 베바시주맙-AVA04-251 이중특이적 항체의 버전을 또한 생성하였으며, 여기서 경쇄는 상기와 동일하였지만 중쇄는 항체 중쇄와 항-PD-L1 아피머 사이에 강성 링커를 포함하였고, 여기서 중쇄 (제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136) 및 강성 A(EAAAK)3 링커 포함)는 하기 아피머 융합 서열을 갖는다:
Figure pct00018
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하고 도 17에 예시된 바와 같이, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드 서열은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단 단부 또는 그의 조합/순열에 부가될 수 있다. 더욱이, 다량체 아피머와 관련하여 도 9에 제시된 바와 같이, 1개 초과의 아피머 서열이 임의의 주어진 항체 쇄에 포함될 수 있다.
전장 이뮤노글로불린을 포함하는 다중-특이적 아피머 작용제에 관한 일부 실시양태에서, 항체에 대한 아피머 폴리펩티드 서열의 융합은 이뮤노글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능을 보존할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 그의 Fc 부분을 통해, Fc 수용체-양성 세포의 Fc 수용체에 결합할 수 있을 것이다. 일부 추가 실시양태에서, 아피머 작용제는 Fc 수용체-양성 세포에 결합하고 이에 의해 시토카인 및/또는 공동-자극 항원의 발현을 개시하거나 증가시킴으로서 Fc 수용체-양성 세포를 활성화시킬 수 있다. 추가로, 아피머 작용제는 공동-자극 항원 및/또는 시토카인을 통해 T 세포의 생리학적 활성화에 요구되는 적어도 제2 활성화 신호를 T 세포로 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는, 면역계로부터 이펙터 세포의 표면 상에 제시된 Fc 수용체를 발현하는 다른 세포, 예컨대 면역 세포, 간세포 및 내피 세포에 대한 그의 Fc 부분의 결합으로부터 유발되는, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 기능, 즉 면역계의 이펙터 세포가 항체에 의해 막-표면 항원이 결합된 표적 세포를 능동적으로 용해시키고 이에 따라 ADCC를 통한 종양 세포 사멸을 촉발시키는 세포-매개 면역 방어의 메카니즘을 가질 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, 아피머 작용제는 ADCC 기능을 입증할 수 있다 (도 5c).
상기 기재된 바와 같이, Fc-매개 세포독성과 달리, Fc 부분은 그의 안정성 및 신체에서의 지속성에 중요한 아피머 작용제의 혈청 수준을 유지하는 것에 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피 세포 상 및 포식세포 상의 Fc 수용체에 결합하는 경우에, 아피머 작용제는 내재화되고 혈류로 다시 재생되어, 신체내에서의 그의 반감기를 증진시킬 수 있다.
추가의 아피머 폴리펩티드의 예시적인 표적은 단지 예시하자면, 또 다른 면역 체크포인트 단백질 및 면역 공동-자극 수용체 (특히 추가의 아피머(들)가 공동-자극 수용체에 효능작용할 수 있는 경우), 수용체, 시토카인, 성장 인자 또는 종양-연관 항원을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아피머 작용제가 아피머/항체 융합 단백질인 경우, 이뮤노글로불린 부분은, 예를 들어 CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, VEGF, VEGF 수용체, EGFR 또는 Her2/neu에 대한 모노클로날 항체인 이뮤노글로불린일 수 있다. 이러한 이뮤노글로불린의 몇몇 예시적인 예는 트라스투주맙, 파니투무맙, 세툭시맙, 오비누투주맙, 리툭시맙, 페르투주맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, 토시투모맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 브렌툭시맙 및 겜투주맙 중 임의의 것 내에 포함된 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 PD-1, PD-L2, CTLA-4, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 또는 TIGIT를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예컨대 T-세포 상에서 발현된 면역 체크포인트 분자를 억제하는 1개 이상의 결합 도메인을 포함하는 아피머 작용제의 일부이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 CD28, ICOS, CD137, OX40, GITR, CD27, CD30, HVEM, DNAM-1 또는 CD28H를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 예컨대 T-세포 상에서 발현된 면역 공동-자극 분자에 효능작용하는 1개 이상의 결합 도메인을 포함하는 아피머 작용제의 일부이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 면역 공동-자극 분자의 1개 이상의 리간드 효능제, 예컨대 CD28, ICOS, CD137, OX40, GITR, CD27, CD30, HVEM, DNAM-1 또는 CD28H에 대한 효능제 리간드를 포함하는 아피머 작용제의 일부이다.
항-PD-L1 아피머의 PD-L1 억제 활성을, 억제 면역 체크포인트 중 1개 또는 여러개를 차단하고/거나 면역 공동자극 경로 중 1개 이상을 활성화시키는 결합 도메인과 조합함으로써, 다중-특이적 아피머 작용제는 그렇지 않으면 소진되었을 항종양 T 세포를 구제하여, 항종양 면역을 증진시킴으로써, 암 환자에서 양성 반응을 얻어낼 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, 협응적으로 발현된 면역-체크포인트 단백질의 아피머 작용제에 의한 이중 차단은 상가적 또는 상승작용적 항종양 활성을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 가용성 면역 억제 분자를 억제하는 1개 이상의 결합 도메인, 예컨대 가용성 면역 억제 분자에 결합하는 결합 도메인 (예컨대 수용체 트랩) 또는 상응하는 동족 수용체에 결합하고 수용체의 리간드 활성화를 방지하는 결합 도메인 (PGE2, TGF-β, VEGF, CCL2, IDO, CSF1, IL-10, IL-13, IL-23, 아데노신 또는 STAT3 활성화제의 길항제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하는 아피머 작용제의 일부이다. 특정 경우에, 아피머 작용제는 VEGF 수용체 트랩 도메인, 예컨대 아플리베르셉트의 VEGF 결합 수용체 도메인을 포함한다. 또 다른 예에서, 아피머 작용제는 TGF-β 수용체 트랩 도메인, 예컨대 MSB0011359C의 TGF-β 결합 수용체 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 종양 미세환경에서 상향조절되는 단백질, 즉 종양 연관 항원, 예컨대 종양 내 종양 세포 상에서 상향조절되는 것, 또는 대식세포, 섬유모세포, T-세포 또는 종양에 침윤하는 다른 면역 세포에 결합하는 1개 이상의 결합 도메인을 포함하는 아피머 작용제의 일부이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드는 CEACAM-1, CEACAM-5, BTLA, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR, B7-H3, B7-H4, CD40, CD4OL, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, 갈렉틴-9, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, LIGHT, MHC 부류 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX4OL, PVR, SIRPα, TCR, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, VEGF, VEGF 수용체, EGFR, Her2/neu, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E 또는 TSLP로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 결합하는 1개 이상의 결합 도메인을 포함하는 아피머 작용제의 일부이다.
d. 접합체
대상 아피머 작용제는 또한 아피머 작용제에 검출가능성 또는 추가의 약리학적 활성을 부여하도록 의도되는 1개 이상의 관능성 모이어티를 포함할 수 있다. 검출을 위한 관능성 모이어티는 생체내에서 세포 또는 조직 (예컨대 종양 세포)과의 아피머 작용제의 회합을 검출하는데 사용될 수 있는 것들이다. 약리학적 활성을 갖는 관능성 모이어티티는 아피머 작용제의 표적 (본 개시내용의 PD-L1 아피머 작용제의 경우에 PD-L1)을 발현하는 조직에 전달되고, 그렇게 함으로써 표적화된 조직 또는 세포에 약리학적 결과를 갖도록 의도되는 작용제이다.
본 개시내용은 매우 다양한 관능기, 치환기 또는 모이어티를 갖는 물질의 접합체를 포함한 아피머 작용제를 제공하며, 여기서 관능성 모이어티티는 표지; 염료; 면역부착 분자; 방사성핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트화제; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 억제 리보핵산; 생체적합물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규 관능기; 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 모이어티; 화학 방사선 여기가능한 모이어티; 광이성질체화가능한 모이어티; 비오틴; 비오틴의 유도체; 비오틴 유사체; 중원자를 포함하는 모이어티; 화학적으로 절단가능한 기; 광절단가능한 기; 연장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 산화환원-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소 표지된 모이어티; 생물물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 삽입성 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노전달물질; 방사성뉴클레오티드; 방사성전달물질; 중성자-포획제; 또는 상기의 임의의 조합, 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
(i) 표지 및 검출가능한 모이어티
모이어티가 검출가능한 표지인 경우, 이는 형광 표지, 방사성 표지, 효소적 표지 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 표지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관능성 모이어티티는 의학적 영상화에 적합한 특정 아피머 작용제를 형성하는 접합체의 일부로서 포함될 수 있는 검출가능한 표지이다. "의학적 영상화"란 진단, 연구 또는 치유적 치료의 목적으로 인간 또는 동물 신체의 내부 영역을 시각화하는데 사용되는 임의의 기술을 의미한다. 예를 들어, 아피머 작용제는 방사성섬광조영, 자기 공명 영상화 (MRI), 컴퓨터 단층촬영 (CT 스캔), 핵 영상화, 금속 단층촬영 (PET) 조영제를 포함하는 양전자 방출, 광학 영상화 (예컨대 근적외선 형광 (NIRF) 영상화를 비롯한 형광 영상화), 생체발광 영상화 또는 그의 조합에 의해 검출될 (및 정량화될) 수 있다. 관능성 모이어티티는 임의로 X선 영상화를 위한 조영제이다. 이러한 기술을 증진시키는데 유용한 작용제는 신체 내의 특정한 좌위, 기관 또는 질환 부위의 시각화를 가능하게 하고/거나 영상화 기술에 의해 생성된 영상의 품질을 일부 개선시켜 영상의 개선되거나 보다 용이한 해석을 제공하는 물질이다. 이러한 작용제는 본원에서 조영제로 지칭되며, 이의 사용은 영상의 상이한 영역 사이의 "콘트라스트"를 증가시킴으로써 영상의 상이한 부분의 구분을 용이하게 한다. 따라서, 용어 "조영제"는 그럼에도 불구하고 이러한 작용제의 부재 하에서 생성될 수 있는 영상의 품질을 증진시키는데 사용되는 작용제 (예를 들어, MRI의 경우와 같이), 뿐만 아니라 영상의 생성을 위한 전제조건인 작용제 (예를 들어, 핵 영상화에서와 같이)를 포괄한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 금속을 킬레이트화하는 킬레이트 모이어티, 예를 들어 방사성금속 또는 상자성 이온에 대한 킬레이트화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 방사선요법 또는 영상화 절차에 유용한 방사성핵종에 대한 킬레이트화제이다. 본 개시내용 내에서 유용한 방사성핵종은 감마-방출제, 양전자-방출제, 오거 전자-방출제, X선 방출제 및 형광-방출제와, 치료 용도를 위한 베타- 또는 알파-방출제를 포함한다. 방사선 요법에서 독소로서 유용한 방사성핵종의 예는 다음을 포함한다: 43K, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 81Rb, 90Y, 97Ru, 99mTc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi 및 213Bi. 킬레이트화제가 금속을 배위할 조건은, 예를 들어 미국 특허 번호 4,831,175, 4,454,106 및 4,472,509 (Gansow et al.)에 기재되어 있다. 킬레이트화제의 예는 단지 예시하자면, 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산 (NOTA), 1,4,7,10-테트라아지시클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산 (TETA)을 포함한다.
아피머 폴리펩티드의 아미노산 잔기 내로 직접 혼입될 수 있거나 또는 달리 킬레이트화제를 요구하지 않는 다른 검출가능한 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S 및 36Cl을 포함한다.
진단 절차에 유용한 상자성 이온이 또한 투여될 수 있다. 상자성 이온의 예는 크로뮴 (III), 망가니즈 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III), 에르븀 (III), 또는 이들 상자성 이온의 조합을 포함한다.
형광 표지의 예는 유기 염료 (예를 들어 시아닌, 플루오레세인, 로다민, 알렉사 플루오르, 다이라이트 플루오르, ATTO 염료, BODIPY 염료 등), 생물학적 형광단 (예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP), R-피코에리트린 등), 및 양자점을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용에 사용될 수 있는 비제한적 형광 화합물은 Cy5, Cy5.5 (또한 Cy5++로 공지됨), Cy2, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 피코에리트린, Cy7, 플루오레세인 (FAM), Cy3, Cy3.5 (또한 Cy3++로 공지됨), 텍사스 레드, 라이트사이클러-레드 640, 라이트사이클러 레드 705, 테트라메틸로다민 (TMR), 로다민, 로다민 유도체 (ROX), 헥사클로로플루오레세인 (HEX), 로다민 6G (R6G), 로다민 유도체 JA133, 알렉사 형광 염료 (예컨대 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 555 및 알렉사 플루오르 647), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 아이오딘화프로피듐, AMCA, 스펙트럼 그린, 스펙트럼 오렌지, 스펙트럼 아쿠아, 리사민, 및 형광 전이 금속 착물, 예컨대 유로퓸을 포함한다. 사용될 수 있는 형광 화합물은 또한 형광 단백질, 예컨대 GFP (녹색 형광 단백질), 증진된 GFP (EGFP), 청색 형광 단백질 및 유도체 (BFP, EBFP, EBFP2, 아주라이트, mKalama1), 시안 형광 단백질 및 유도체 (CFP, ECFP, 세룰리안, CyPet) 및 황색 형광 단백질 및 유도체 (YFP, 시트린, 비너스, YPet)를 포함한다. WO2008142571, WO2009056282, WO9922026.
효소적 표지의 예는 양고추냉이 페록시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 글루코스 옥시다제 및 β-갈락토시다제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 널리 공지된 표지는 비오틴이다. 비오틴 표지는 전형적으로 비오티닐 기, 스페이서 아암 및 단백질 상의 표적 관능기에의 부착을 담당하는 반응성 기로 구성된다. 비오틴은 표지된 단백질을 아비딘 모이어티를 포함하는 다른 모이어티에 부착시키는데 유용할 수 있다.
(ii) 아피머-약물 접합체
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는, 예를 들어 아피머-약물 접합체를 형성하는 1종 이상의 치료제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료제"는 인간 또는 또 다른 동물에서 질환의 치유, 경감, 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 물질을 지칭한다. 이러한 치료제는 미국 약전, 미국의 공식 동종요법 약전, 공식 국립 처방집, 또는 이들의 임의의 보충판에서 인정된 물질을 포함하고, 소분자, 뉴클레오티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아피머-함유 폴리펩티드에 부착될 수 있는 치료제는 예시와 같이, 세포독성제, 항대사물, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 시토카인, 항혈관신생제, 항유사분열제, 독소, 아폽토시스 작용제 등, 예컨대 DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 내형질 세망 스트레스 유도제, 백금 화합물, 항대사물, 빈카알칼로이드, 탁산, 에포틸론, 효소 억제제, 수용체 길항제, 치료 항체, 티로신 키나제 억제제, 방사선증감제 및 화학요법 조합 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
DNA 알킬화제의 비제한적 예는 질소 머스타드, 예컨대 메클로레타민, 시클로포스파미드 (이포스파미드, 트로포스파미드), 클로람부실 (멜팔란, 프레드니무스틴), 벤다무스틴, 우라무스틴 및 에스트라무스틴; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (세무스틴), 포테무스틴, 니무스틴, 라니무스틴 및 스트렙토조신; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판 (만노술판, 트레오술판); 아지리딘, 예컨대 카르보쿠온, 티오테파, 트리아지쿠온, 트리에틸렌멜라민; 히드라진 (프로카르바진); 트리아젠, 예컨대 다카르바진 및 테모졸로미드; 알트레타민 및 미토브로니톨이다.
토포이소머라제 I 억제제의 비제한적 예는 문헌 [Pommier Y. (2006) Nat. Rev. Cancer 6(10):789-802 and U.S. Patent Publication No. 200510250854; Protoberberine alkaloids and derivatives thereof including berberrubine and coralyne as described in Li et al. (2000) Biochemistry 39(24):7107-7116 and Gatto et al. (1996) Cancer Res. 15(12):2795-2800; Phenanthroline derivatives including Benzo[i]phenanthridine, Nitidine, and fagaronine as described in Makhey et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11 (8): 1809-1820; Terbenzimidazole and derivatives thereof as described in Xu (1998) Biochemistry 37(10):3558-3566; and Anthracycline derivatives including Doxorubicin, Daunorubicin, and Mitoxantrone as described in Foglesong et al. (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 30(2):123-]25, Crow et al. (1994) J. Med. Chem. 37(19):31913194, 및 Crespi et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 136(2):521-8]에 기재된 바와 같은, 캄프토테신 유도체, 예컨대 CPT-11 (이리노테칸), SN-38, APC, NPC, 캄프토테신, 토포테칸, 엑사테칸 메실레이트, 9-니트로캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 루르토테칸, 루비테칸, 실라테칸, 기마테칸, 디플로모테칸, 엑사테칸, BN-80927, DX-8951f 및 MAG-CPT를 포함한다. 토포이소머라제 II 억제제는 에토포시드 및 테니포시드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이중 토포이소머라제 I 및 II 억제제는 문헌 [Denny and Baguley (2003) Curr. Top. Med. Chem. 3(3):339-353]에 기재된 바와 같은, 사인토핀 및 다른 나프테센디온, DACA 및 다른 아크리딘-4-카르복스아미드, 인토플리신 및 다른 벤조피리도인돌, TAS-103 및 다른 7H-인데노[2,1-c]퀴놀린-7-온, 피라졸로아크리딘, XR 11576 및 다른 벤조페나진, XR 5944 및 다른 이량체 화합물, 7-옥소-7H-디벤즈[f,ij]이소퀴놀린 및 7-옥소-7H-벤조[e]퍼이미딘, 및 안트라세닐-아미노산 접합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 작용제는 토포이소머라제 II를 억제하고, 비제한적으로 안트라시클린 (아클라루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 암루비신, 피라루비신, 발루비신, 조루비신) 및 안트라센디온 (미톡산트론 및 픽산트론)과 같은 DNA 삽입 활성을 갖는다.
내형질 세망 스트레스 유도제의 예는 디메틸-셀레콕시브 (DMC), 넬피나비르, 셀레콕시브 및 붕소 방사선증감제 (즉, 벨케이드 (보르테조밉))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
백금-기반 화합물의 비제한적 예는 카르보플라틴, 시스플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 사트라플라틴, 아로플라틴, 로바플라틴 및 JM-216을 포함한다. (문헌 [McKeage et al. (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237 and in general, CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, in the Series Basic and Clinical Oncology, Angioli et al. Eds., 2004] 참조).
항대사물 작용제의 비제한적 예는 폴산 기재, 즉 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 페메트렉세드; 티미딜레이트 신타제 억제제, 예컨대 랄티트렉세드, 페메트렉세드; 퓨린 기재, 즉 아데노신 데아미나제 억제제, 예컨대 펜토스타틴, 티오퓨린, 예컨대 티오구아닌 및 메르캅토퓨린, 할로겐화/리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 클라드리빈, 클로파라빈, 플루다라빈 또는 구아닌/구아노신: 티오퓨린, 예컨대 티오구아닌; 또는 피리미딘 기재, 즉 시토신/시티딘: 저메틸화제, 예컨대 아자시티딘 및 데시타빈, DNA 폴리머라제 억제제, 예컨대 시타라빈, 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 겜시타빈 또는 티민/티미딘: 티미딜레이트 신타제 억제제, 예컨대 플루오로우라실 (5-FU)을 포함한다. 5-FU에 대한 등가물은, 예를 들어 문헌 [Papamicheal (1999) The Oncologist 4:478-487]에 기재된 바와 같은, 그의 전구약물, 유사체 및 유도체, 예컨대 5'-데옥시-5-플루오로우리딘 (독시플루오로이딘), 1-테트라히드로푸라닐-5-플루오로우라실 (프토라푸르), 카페시타빈 (젤로다), S-I (MBMS-247616, 테가푸르 및 2종의 조정제인 5-클로로-2,4-디히드록시피리딘 및 포타슘 옥소네이트로 이루어짐), 랄티트렉세드 (토무덱스), 놀라트렉세드 (티미탁, AG337), LY231514 및 ZD9331을 포함한다.
빈카알칼로이드의 예는 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈플루닌, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
탁산의 예는 도세탁셀, 라로탁셀, 오르타탁셀, 파클리탁셀 및 테세탁셀을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에포틸론의 예는 익사베필론이다.
효소 억제제의 예는 파르네실트랜스퍼라제 억제제 (티피파밉); CDK 억제제 (알보시딥, 셀리시클립); 프로테아솜 억제제 (보르테조밉); 포스포디에스테라제 억제제 (아나그렐리드; 롤리프람); IMP 데히드로게나제 억제제 (티아조푸린); 및 리폭시게나제 억제제 (마소프로콜)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용체 길항제의 예는 ERA (아트라센탄); 레티노이드 X 수용체 (벡사로텐); 및 성 스테로이드 (테스토락톤)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치료 항체의 예는 항-HER1/EGFR (세툭시맙, 파니투무맙); 항-HER2/neu (erbB2) 수용체 (트라스투주맙); 항-EpCAM (카투막소맙, 에드레콜로맙), 항-VEGF-A (베바시주맙); 항-CD20 (리툭시맙, 토시투모맙, 이브리투모맙); 항-CD52 (알렘투주맙); 및 항-CD33 (겜투주맙)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 미국 특허 번호 5,776,427 및 7,601,355.
티로신 키나제 억제제의 예는 다음 ErbB: HER1/EGFR (에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 반데타닙, 수니티닙, 네라티닙); HER2/neu (라파티닙, 네라티닙); RTK 부류 III: C-kit (악시티닙, 수니티닙, 소라페닙), FLT3 (레스타우르티닙), PDGFR (악시티닙, 수니티닙, 소라페닙); 및 VEGFR (반데타닙, 세막사닙, 세디라닙, 악시티닙, 소라페닙); bcr-abl (이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙); Src (보수티닙) 및 야누스 키나제 2 (레스타우르티닙)에 대한 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 아피머-함유 폴리펩티드에 부착될 수 있는 화학요법제는 또한 암사크린, 트라벡테딘, 레티노이드 (알리트레티노인, 트레티노인), 삼산화비소, 아스파라긴 고갈제 아스파라기나제/페가스파르가제), 셀레콕시브, 데메콜신, 엘레스클로몰, 엘사미트루신, 에토글루시드, 로니다민, 루칸톤, 미토구아존, 미토탄, 오블리메르센, 템시롤리무스 및 보리노스타트를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 아피머-함유 폴리펩티드와 연결, 라이게이션 또는 회합될 수 있는 특정 치료제의 예는 플로목세프; 포르티미신(들); 겐타미신(들); 글루코술폰 솔라술폰; 그라미시딘 S; 그라미시딘(들); 그레파플록사신; 구아메시클린; 헤타실린; 이세파미신; 조사마이신; 카나마이신(들); 플로목세프; 포르티미신(들); 겐타미신(들); 글루코술폰 솔라술폰; 그라미시딘 S; 그라미시딘(s); 그레파플록사신; 구아메시클린; 헤타실린; 이세파미신; 조사마이신; 카나마이신(들); 바시트라신; 밤베르마이신(들); 비아페넴; 브로디모프림; 부티로신; 카프레오마이신; 카르베니실린; 카르보마이신; 카루모남; 세파드록실; 세파만돌; 세파트리진; 세프부페라존; 세프클리딘; 세프디니르; 세프디토렌; 세페핌; 세페타메트; 세픽심; 세피네녹심; 세피니녹스; 클라드리빈; 아팔실린; 아피시클린; 아프라마이신; 아르베카신; 아스폭시실린; 아지드암페니콜; 아즈트레오남; 세포디짐; 세포니시드; 세포페라존; 세포라미드; 세포탁심; 세포테탄; 세포티암; 세포조프란; 세프피미졸; 세프피라미드; 세프피롬; 세프프로질; 세프록사딘; 세프테람; 세프티부텐; 세푸조남; 세팔렉신; 세팔로글리신; 세팔로스포린 C; 세프라딘; 클로람페니콜; 클로르테트라시클린; 클리나플록사신; 클린다마이신; 클로모시클린; 콜리스틴; 시클라실린; 답손; 데메클로시클린; 디아티모술폰; 디베카신; 디히드로스트렙토마이신; 6-메르캅토퓨린; 티오구아닌; 카페시타빈; 도세탁셀; 에토포시드; 겜시타빈; 토포테칸; 비노렐빈; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 테니포시드; 멜팔란; 메토트렉세이트; 2-p-술파닐아닐리노에탄올; 4,4'-술피닐디아닐린; 4-술파닐아미도살리실산; 부토르파놀; 날부핀; 스트렙토조신; 독소루비신; 다우노루비신; 플리카마이신; 이다루비신; 미토마이신 C; 펜토스타틴; 미톡산트론; 시타라빈; 플루다라빈 포스페이트; 부토르파놀; 날부핀; 스트렙토조신; 독소루비신; 다우노루비신; 플리카마이신; 이다루비신; 미토마이신 C; 펜토스타틴; 미톡산트론; 시타라빈; 플루다라빈 포스페이트; 아세디아술폰; 아세토술폰; 아미카신; 암포테리신 B; 암피실린; 아토르바스타틴; 에날라프릴; 라니티딘; 시프로플록사신; 프라바스타틴; 클라리트로마이신; 시클로스포린; 파모티딘; 류프롤리드; 아시클로비르; 파클리탁셀; 아지트로마이신; 라미부딘; 부데소니드; 알부테롤; 인디나비르; 메트포르민; 알렌드로네이트; 니자티딘; 지도부딘; 카르보플라틴; 메토프롤롤; 아목시실린; 디클로페낙; 리시노프릴; 세프트리악손; 캅토프릴; 살메테롤; 크시나포에이트; 이미페넴; 실라스타틴; 베나제프릴; 세파클로르; 세프타지딤; 모르핀; 도파민; 비알라미콜; 플루바스타틴; 펜아미딘; 포도필린산 2-에틸히드라진; 아크리플라빈; 클로로아조딘; 아르스페나민; 아미카르빌리드; 아미노퀴누리드; 퀴나프릴; 옥시모르폰; 부프레노르핀; 플록수리딘; 디리트로마이신; 독시시클린; 에녹사신; 엔비오마이신; 에피실린; 에리트로마이신; 류코마이신(들); 린코마이신; 로메플록사신; 루센소마이신; 리메시클린; 메클로시클린; 메로페넴; 메타시클린; 미크로노미신; 미데카마이신(들); 미노시클린; 목사락탐; 뮤피로신; 나디플록사신; 나타마이신; 네오마이신; 네틸미신; 노르플록사신; 올레안도마이신; 옥시테트라시클린; p-술파닐릴벤질아민; 파니페넴; 파로모마이신; 파주플록사신; 페니실린 N; 피파시클린; 피페미드산; 폴리믹신; 프리마이신; 퀴나실린; 리보스타마이신; 리파미드; 리팜핀; 리파마이신 SV; 리파펜틴; 리팍시민; 리스토세틴; 리티페넴; 로키타마이신; 롤리테트라시클린; 로사라마이신; 록시트로마이신; 살라조술파디미딘; 산시클린; 시소미신; 스파르플록사신; 스펙티노마이신; 스피라마이신; 스트렙토마이신; 숙시술폰; 술파크리소이딘; 술팔록스산; 술파미도크리소이딘; 술파닐산; 술폭손; 테이코플라닌; 테마플록사신; 테모실린; 테트록소프림; 티암페니콜; 티아조술폰; 티오스트렙톤; 티카르실린; 티게모남; 토브라마이신; 토수플록사신; 트리메토프림; 트로스펙토마이신; 트로바플록사신; 투베락티노마이신; 반코마이신; 아자세린; 칸디시딘(들); 클로르페네신; 더모스타틴(들); 필리핀; 푼기크로민; 메파르트리신; 니스타틴; 올리고마이신(들); 페리마이신 A; 투베르시딘; 6-아자우리딘; 6-디아조-5-옥소-L-노르류신; 아클라시노마이신(들); 안시타빈; 안트라마이신; 아자시타딘; 아자세린; 블레오마이신(들); 에틸 비스쿠마세테이트; 에틸리덴 디쿠마롤; 일로프로스트; 라미피반; 타프로스텐; 티오클로마롤; 티로피반; 아미프릴로스; 부실라민; 구스페리무스; 겐티스산; 글루카메타신; 글리콜 살리실레이트; 메클로페남산; 메페남산; 메살라민; 니플룸산; 올살라진; 옥사세프롤; S-에노실메티오닌; 살리실산; 살살레이트; 술파살라진; 톨페남산; 카루비신; 카르지노필린 A; 클로로조토신; 크로모마이신(들); 데노프테린; 독시플루리딘; 에다트렉세이트; 에플로르니틴; 엘립티늄; 에노시타빈; 에피루비신; 만노무스틴; 메노가릴; 미토브로니톨; 미토락톨; 모피다몰; 미코페놀산; 노갈라마이신; 올리보마이신(들); 페플로마이신; 피라루비신; 피리트렉심; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프테로프테린; 퓨로마이신; 라니무스틴; 스트렙토니그린; 티아미프린; 미코페놀산; 프로코다졸; 로무르티드; 시롤리무스 (라파마이신); 타크롤리무스; 부테타민; 페날코민; 히드록시테트라카인; 나에파인; 오르토카인; 피리도카인; 살리실 알콜; 3-아미노-4-히드록시부티르산; 아세클로페낙; 알미노프로펜; 암페낙; 브롬페낙; 브로모살리게닌; 부마디존; 카프로펜; 디클로페낙; 디플루니살; 디타졸; 엔페남산; 에토돌락; 에토페나메이트; 펜도살; 페프라디놀; 플루페남산; 토무덱스 (N-[[5-[[(1,4-디히드로-2-메틸-4-옥소-6-퀴나졸리닐)메틸]메틸아미노]-2-티에닐]카르보닐]-L-글루탐산), 트리메트렉세이트, 투베르시딘, 우베니멕스, 빈데신, 조루비신; 아르가트로반; 쿠메타롤 또는 디쿠마롤이다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 접합된 세포독성 인자, 예컨대 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질 및 화합물 (예를 들어, 지방산), 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 PAPI, PAPII 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신을 포함한다.
본 개시내용의 접합체를 생성하는데 문헌 [Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407]에 기재된 방법을 비롯하여, 항체 및 다른 단백질에 접합시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드 및 유기 및 무기 모이어티를 항체 및 다른 단백질에 접합시키는 방법은 통상적이고, 관련 기술분야에 매우 널리 공지되어 있으며, 대상 아피머 작용제의 그러한 버전을 생성하기 위해 용이하게 적합화된다.
접합된 모이어티가 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에, 그 모이어티는 아피머-함유 폴리펩티드에 화학적으로 가교될 수 있거나 또는 아피머-함유 폴리펩티드와의 융합 단백질의 일부로서 포함될 수 있다. 그리고 예시적인 예는 디프테리아 독소-아피머 융합 단백질일 것이다. 비-펩티드 개체의 경우에, 아피머-함유 폴리펩티드에 대한 첨가는 일반적으로 아피머-함유 폴리펩티드에 대한 화학적 접합에 의해 - 예컨대 폴리펩티드의 C-말단에서의 아미노산 측쇄 또는 카르복실 기 또는 N-말단에서의 아미노 기 상의 관능기를 통해 이루어질 것이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질로서든 화학적으로 가교된 모이어티로서든, 접합된 모이어티는 효소에 의해 절단될 수 있는 1개 이상의 부위를 포함할 것이거나 또는 다르게는 접합된 모이어티가 아피머-함유 폴리펩티드로부터 방출되는 것을 허용하는 환경적 조건 (예컨대 pH)에, 예컨대 종양 또는 다른 이환 조직 (또는 접합된 모이어티가 건강한 조직을 보호하도록 기능하는 경우 보호될 조직)에서 민감성이다.
IV. 발현 방법 및 시스템
본원에 기재된 재조합 아피머 작용제 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법에서부터 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열의 구축 및 이들 서열을 적합한 숙주에서 발현시키는 것까지의 범위에 이른다. 추가의 변형, 예컨대 화학적 변형 또는 접합을 포함하는 재조합 아피머 작용제 단백질에 대해, 재조합 아피머 작용제 단백질은 숙주 세포로부터의 단리 또는 화학적 합성 후에 화학적으로 또는 효소적으로 추가로 조작될 수 있다.
본 개시내용은 (i) 아피머 작용제의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하고 (예를 들어, 여기서 폴리뉴클레오티드는 벡터에 있고/거나 프로모터에 작동가능하게 연결됨); (ii) 숙주 세포 (예를 들어, 진핵생물 또는 원핵생물)를 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에서 배양하고; (iii) 임의로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장된 배지로부터 아피머 작용제를 단리하는 것을 포함하는, 본 개시내용의 재조합 아피머 작용제 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위한 재조합 방법 및 핵산을 포함한다. 예를 들어, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627을 참조한다.
일부 실시양태에서, 관심 재조합 아피머 작용제 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 및 관심 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택하여 설계될 수 있다. 표준 방법은 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열이 역-번역 유전자를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 특정한 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 부분을 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드가 합성된 다음 라이게이션될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
본 개시내용의 재조합 아피머 작용제 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 수득되면, 재조합 아피머 작용제 단백질의 생산을 위한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 재조합 아피머 작용제 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [the techniques described in Sambrook et al., 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY)]에 기재된 기술 참조).
재조합 아피머 작용제 단백질의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 통상적인 기술 (예를 들어, 전기천공, 리포솜 형질감염 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있고, 이어서 형질감염된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 개시내용의 재조합 아피머 작용제 단백질을 생산한다. 구체적 실시양태에서, 재조합 아피머 작용제 단백질의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
발현 벡터는 복제 기점을 포함할 수 있고, 예컨대 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 기초하여 선택될 수 있다. 예로서, 플라스미드 pBR322 (제품 번호 303-3s, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 비벌리)로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 유용하고, 한편 SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 또는 유두종바이러스 (예컨대 HPV 또는 BPV)로부터의 다양한 기점은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (예를 들어, SV40 기점은 그것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 종종 사용됨).
벡터는 1종 이상의 선택 마커 유전자, 예를 들어 선택 배양 배지에서 성장된 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 유전 요소를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 원핵 숙주 세포에 대해 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 테트라시클린 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하거나, (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 코딩한다. 바람직한 선택 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라시클린 내성 유전자이다. 네오마이신 내성 유전자는 또한 원핵 및 진핵 숙주 세포에서의 선택에 사용될 수 있다. 다른 선택 유전자를 사용하여 발현될 유전자를 증폭시킬 수 있다. 증폭은 성장에 중요한 단백질의 생산에 대한 보다 큰 요구가 있는 유전자가 재조합 세포의 연속 생성을 위해 염색체 내에서 탠덤으로 반복되는 과정이다. 포유동물 세포에 대한 선택 마커의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 단지 형질전환체만이 벡터에 존재하는 마커에 의해 생존하도록 고유하게 적합화된 선택 압력 하에 놓인다. 선택 압력은 배지 중의 선택제의 농도가 연속적으로 변화하고, 그에 의해 선택 유전자 및 재조합 아피머 작용제 단백질을 코딩하는 DNA 둘 다의 증폭을 유도하는 조건 하에서 형질전환된 세포를 배양함으로써 부과된다. 그 결과, 증가된 양의 재조합 아피머 작용제 단백질이 증폭된 DNA로부터 합성된다.
벡터는 또한 1개 이상의 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있으며, 이는 재조합 아피머 작용제 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 mRNA로 전사될 것이다. 예를 들어, 이러한 부위는 샤인-달가노 서열 (원핵생물) 또는 코작 서열 (진핵생물)을 특징으로 한다. 상기 요소들은 전형적으로 프로모터에 대해 3' 및 발현될 폴리펩티드의 코딩 서열에 대해 5'에 위치한다. 샤인-달가노 서열은 다양하지만, 전형적으로 폴리퓨린 (높은 A-G 함량을 가짐)이다. 많은 샤인-달가노 서열이 확인되었으며, 이들 각각은 상기 제시된 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있고 원핵 벡터에서 사용될 수 있다.
발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 재조합 아피머 작용제 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유할 것이다. 천연 또는 이종 프로모터는 발현에 사용되는 숙주 세포 및 목적하는 수율에 따라 사용될 수 있다.
원핵 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템; 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템; 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 박테리아 프로모터가 또한 적합하다. 그의 서열은 공개되어 있고, 이들은 제한 부위를 공급하기 위해 목적하는 바에 따라 링커 또는 어댑터를 사용하여 목적하는 핵산 서열(들)에 라이게이션될 수 있다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터는 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 효모 인핸서는 유리하게는 효모 프로모터와 함께 사용된다. 포유동물 숙주 세포와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 널리 공지되어 있고, 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득된 것을 포함한다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 열-쇼크 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
본 개시내용의 선택적 결합제를 발현시키는데 사용될 수 있는 추가의 프로모터는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: SV40 초기 프로모터 영역 (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); CMV 프로모터; 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터 (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5); 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., Nature, 296; 39-42, 1982); 원핵 발현 벡터, 예컨대 베타-락타마제 프로모터 (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); 또는 tac 프로모터 (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5). 또한, 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에서 이용된 하기 동물 전사 제어 영역이 관심 대상이다: 췌장 선방 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); 림프 세포에서 활성인 이뮤노글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44); 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95); 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76); 간에서 활성인 알파태아단백질 유전자 제어 영역 (Krumlauf et al. (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71); 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94); 뇌 내 핍지교세포 세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8).
인핸서 서열은 진핵 숙주 세포에서 전사를 증가시키기 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 포유동물 유전자로부터 이용가능한 여러 인핸서 서열이 공지되어 있다 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 인핸싱 요소이다.
인핸서는 벡터 내 폴리펩티드 코딩 영역의 5' 또는 3' 위치로 스플라이싱 도입될 수 있지만, 전형적으로는 프로모터의 5' 부위에 위치한다.
핵산을 발현시키기 위한 벡터는 박테리아, 곤충 및 포유동물 숙주 세포와 상용성인 것을 포함한다. 이러한 벡터는 특히 pCRII, pCR3 및 pcDNA3.1 (인비트로젠 캄파니(Invitrogen Company), 캘리포니아주 샌디에고), pBSII (스트라타진 캄파니(Stratagene Company), 캘리포니아주 라호야), pET15 (노바젠(Novagen), 위스콘신주 매디슨), pGEX (파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech), 뉴저지주 피스카타웨이), pEGFP-N2 (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 팔로 알토), pETL (BlueBacII; 인비트로젠), pDSR-알파 (PCT 공개 번호 WO90/14363) 및 pFastBacDual (깁코(Gibco)/BRL, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 포함한다.
추가의 가능한 벡터는 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않지만, 벡터 시스템은 선택된 숙주 세포와 상용성이어야 한다. 이러한 벡터는 플라스미드, 예컨대 블루스크립트(Bluescript)® 플라스미드 유도체 (고 카피수 ColEl-기반 파지미드, 스트라타진 클로닝 시스템 인크.(Stratagene Cloning Systems Inc.), 캘리포니아주 라호야), Taq-증폭된 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 설계된 PCR 클로닝 플라스미드 (예를 들어, TOPO™. TA 클로닝® 키트, PCR2.1 플라스미드 유도체, 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 및 포유동물, 효모 또는 바이러스 벡터, 예컨대 바큘로바이러스 발현 시스템 (pBacPAK 플라스미드 유도체, 클론테크, 캘리포니아주 팔로 알토)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 또는 다른 공지된 기술을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 개시된 재조합 아피머 작용제 단백질의 발현을 위한 숙주로서 포유동물 세포를 포함한 진핵 및 원핵 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 입수가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지 결정하는 것을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 세포, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는 효모 및 사상 진균 세포, 예컨대, 예를 들어 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카, 피키아 트레할로필라, 피키아 코클라마에, 피키아 멤브라나에파시엔스, 피키아 미누타 (오가타에아 미누타, 피키아 린드네리), 피키아 오푼티아에, 피키아 써모톨레란스, 피키아 살릭타리아, 피키아 구에르쿠움, 피키아 피즈페리, 피키아 스팁티스, 피키아 메타놀리카, 피키아 종, 사카로미세스 세레비지아에, 사카로미세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 클루이베로미세스 종, 클루이베로미세스 락티스, 칸디다 알비칸스, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 트리코더마 레에세이, 크리소스포리움 룩크노웬세, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미네움, 푸사리움 베네나툼, 피스코미트렐라 파텐스 및 뉴로스포라 크라사, 피키아 종, 임의의 사카로미세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로미세스 종, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스페르길루스 종, 트리코더마 레에세이, 크리소스포리움 룩크노웬세, 임의의 푸사리움 종, 야로위아 리폴리티카, 및 뉴로스포라 크라사를 포함한다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 개시내용의 재조합 아피머 작용제 단백질을 발현시키는데 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 재조합 아피머 작용제 단백질의 코딩 서열이 생산되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 본 개시내용의 재조합 아피머 작용제 단백질을 계내에서 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 아피머 작용제 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스); 아피머 작용제 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로미세스 피키아); 아피머 작용제 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CμMV) 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV))로 감염되거나 또는 아피머 작용제 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 세포, 림프 세포 (미국 특허 번호 5,807,715 참조), Per C.6 세포 (크루셀(Crucell)에 의해 개발된 래트 망막 세포))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 재조합 아피머 작용제 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 재조합 아피머 작용제 단백질의 제약 조성물의 생성을 위해 다량의 이러한 단백질이 생산될 때, 용이하게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는, 아피머 작용제 단백질 코딩 서열이 벡터 내 lac Z 코딩 영역과 인 프레임으로 개별적으로 라이게이션되어 융합 단백질이 생산되도록 할 수 있는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794); pIN 벡터 (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, pGEX 벡터를 사용하여 외래 폴리펩티드를 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에의 흡착 및 결합, 이어서 유리 글루타티온의 존재 하에서의 용리에 의해, 용해 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서, 아우토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 세포에서 성장한다. 아피머 작용제 단백질 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝되고, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우에, 관심 아피머 작용제 단백질 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3부분 리더 서열에 라이게이션될 수 있다. 이어서, 이러한 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에의 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하여 이뮤노글로불린 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다. (예를 들어, 문헌 [Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659] 참조). 삽입된 아피머 작용제 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적 개시 신호가 또한 요구될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 추가로, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 서로 맞게 작동해야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등의 포함에 의해 증진될 수 있다 (문헌 [Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조).
추가로, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 또는 목적하는 특이적 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현될 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 이를 위해, 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 글리코실화 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 고려된다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체를 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포가 적절한 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 풍부화된 배지에서 1-2일 동안 성장하도록 허용될 수 있고, 이어서 선택 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드 내의 선택 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그의 염색체 내로 안정하게 통합하고 성장하여 증식소(foci)를 형성한 다음 클로닝되어 세포주로 확장될 수 있도록 한다. 이러한 방법은 본 개시내용의 재조합 아피머 작용제 단백질을 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 재조합 아피머 작용제 단백질과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
다수의 선택 시스템이 사용될 수 있으며, 예컨대 비제한적으로 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells," Cell 11:223-232), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska et al. (1962) "Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene," Cell 22:817-823) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 사용될 수 있다. 또한, 항대사물 내성은 하기 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Tachibana et al. (1991) "Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV.2-Neo Gene," Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932; 및 Morgan et al. (1993) "Human gene therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217) (사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법은 문헌 [Ausubel et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.; Colbere-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. Mol. Biol. 150:1-14]에 기재됨); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156).
재조합 아피머 작용제 단백질의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (검토를 위해, 문헌 [Bebbington and Hentschel, "The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells," in DNA CLONING, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 재조합 아피머 작용제 단백질을 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우에, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 재조합 아피머 작용제 단백질의 뉴클레오티드 서열과 연관되기 때문에, 재조합 아피머 작용제 단백질의 생산이 또한 증가될 것이다 (Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
아피머 작용제가 아피머 항체 융합체 또는 다른 다중단백질 복합체인 경우에, 숙주 세포는 2개의 발현 벡터, 예를 들어 중쇄를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 공동-형질감염될 수 있고, 이들 중 하나 또는 둘 다는 아피머 폴리펩티드 코딩 서열을 포함한다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 과량의 독성 유리 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 배치되어야 한다 (Proudfoot (1986) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Nature 322:562-565; Kohler (1980) "Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질은 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질에 대해 특징적인 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 따라서, 재조합 아피머 작용제 단백질의 특정한 글리코실화 패턴은 단백질을 생산하는데 사용되는 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 좌우될 것이다. 아피머/항체 융합체의 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 N-글리칸만을 포함하는 글리코실화 패턴이 유리할 수 있으며, 이것이 항체의 경우 전형적으로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 푸코실화 대응물보다 더 강력한 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문이다 (예를 들어, 문헌 [Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]; 미국 특허 번호 6,946,292 및 7,214,775 참조).
추가로, 생산 세포주로부터의 아피머 작용제의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 증진될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건 하에 발현을 증진시키기 위한 통상적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 번호 0216846, 0256055 및 0323997 및 유럽 특허 출원 번호 89303964.4와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다. 따라서, 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO)는 글루타민 신테타제 유전자가 결여되어 있고 배지에서 글루타민의 부재 하에 성장되지만, 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에서의 유전자의 결여를 보완하는 글루타민 신테타제 유전자를 포함한다. 본원에 논의된 바와 같은 결합제 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 함유하는 이러한 숙주 세포 뿐만 아니라 이러한 숙주 세포를 사용하여 결합제를 제조하기 위한 본원에 논의된 바와 같은 발현 방법은 본 개시내용의 일부이다.
곤충 세포 배양 시스템 (예를 들어, 바큘로바이러스)에서의 재조합 단백질의 발현은 정확하게 폴딩되고 생물학적으로 기능성인 단백질을 생산하기 위한 강력한 방법을 또한 제공한다. 곤충 세포에서의 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 재조합 아피머 작용제 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 크기결정 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 것을 포함한다. 친화성 태그, 예컨대 헥사-히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 단백질에 부착되어 적절한 친화성 칼럼 상에서의 통과에 의한 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 질량 분광측정법 (MS), 핵 자기 공명 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 X선 결정학과 같은 이러한 기술을 사용하여 물리적으로 특징화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 박테리아 배양에서 생산된 재조합 아피머 작용제 단백질은, 예를 들어 세포 펠릿으로부터의 초기 추출, 이어서 1회 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. HPLC는 최종 정제 단계에 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
V. 생체내 전달을 위한 코딩된 아피머
치료 아피머 작용제 단백질, 예컨대 PD-L1 아피머 작용제의 전달에 대한 대안적 접근법은 치료 폴리펩티드의 생산을 신체 그 자체에 남겨두는 것일 것이다. 다수의 임상 연구는 다양한 상이한 전달 시스템을 사용하는 세포 내로의 생체내 유전자 전달의 유용성을 예시하였다. 생체내 유전자 전달은 아피머 작용제보다는 코딩된 아피머 뉴클레오티드 서열을 환자에게 투여하는 것을 추구한다. 이는 환자의 신체가 관심 치료 아피머 작용제를 장기간 동안 생산하고, 이를 생산 부위에 따라 전신으로 또는 국부로 분비하도록 한다. 유전자-기반의 코딩된 아피머는 폴리펩티드 버전의 아피머 작용제의 통상적인 생산, 정제 및 투여에 대한 노동- 및 비용-효과적인 대안을 제공할 수 있다. 코딩된 아피머의 전달이 적합화될 수 있는 다수의 항체 발현 플랫폼이 생체내에서 추구되었으며: 이들은 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 및 RNA를 포함한다. 코딩된 아피머 유전자 전달은 제품 및 생산 비용을 감소시킴으로써 비용-절감을 가능하게 할 수 있을 뿐만 아니라 약물 투여의 빈도를 감소시킬 수 있다. 종합하면, 코딩된 아피머의 발현에 의한 치료 아피머 작용제의 연장된 생체내 생산은 (i) 비용-민감 조건에서 아피머 작용제의 보다 넓은 치료적 또는 예방적 적용, (ii) 선진국 및 개발도상국 둘 다에서 요법에 대한 개선된 접근성, 및 (iii) 보다 효과적이고 알맞은 치료 양식에 기여할 수 있다. 생체내 유전자 전달에 추가로, 세포를 숙주 (또는 공여자)로부터 수거하고, 코딩된 아피머 서열로 조작하여 아피머 작용제를 생산하고, 환자에게 재투여할 수 있다.
근육내 항체 유전자 투여가 가장 폭넓게 평가되었고 (문헌 [Deal et al. (2015) "Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy" Curr Opin Immunol. 35:113-22]에서 검토됨), 또한 코딩된 아피머에 적용되는 경우에 가장 높은 임상 번역가능성 및 적용을 보유한다. 실제로, 골격근의 고유한 해부학적, 세포 및 생리학적 특성은 이를 장기간의 코딩된 아피머 발현 및 전신 순환을 위한 안정한 환경으로 만든다. 골격근은 용이하게 접근가능하여, 다중 또는 반복 투여를 가능하게 한다. 풍부한 혈관 공급은 순환계 내로의 분비된 치료 아피머 작용제에 대한 효율적인 수송 시스템을 제공한다. 근섬유의 세포융합 성질은 제한된 침투 부위로부터 섬유 내의 다수의 이웃하는 핵으로의 뉴클레오티드의 분산을 가능하게 한다. 골격근 섬유는 또한 말단 분화된 세포이고, 섬유 내의 핵은 유사분열후이다. 결과적으로, 숙주 게놈에서의 통합은 연장된 mAb 발현을 달성하기 위한 전제조건이 아니다. 간은 전임상 항체 유전자 전달에 종종 사용되는 또 다른 부위이고, 전형적으로 i.v. 주사를 통해 형질감염되며, 또한 아피머 작용제의 국부 전달을 위한 (예컨대 간암 및/또는 대사의 치료에서와 같이) 또는 전신 순환을 위해 혈관 내로 분비되는 아피머 작용제의 생성을 위한 코딩된 아피머에 대한 유전자 전달의 부위일 수 있다. 이 기관은 혈장 단백질의 합성을 비롯한 다양한 생리학적 기능을 갖는다. 이 기관은 생체내 코딩된 아피머 발현에 특히 매우 적합할 수 있다.
종양은 i.v. 또는 직접 주사/전기천공을 통해 표적화되는, 코딩된 아피머 전달을 위한 또 다른 부위를 제시한다. 실제로, 종양내 코딩된 아피머 발현은 치료 아피머 작용제의 국부 생산을 가능하게 할 수 있으며, 이는 그렇지 않다면 고형 종양에 침투하여 영향을 미치는데 요구될 수 있는 높은 전신 아피머 작용제 수준에 대한 필요를 면제한다. 혈액-뇌 장벽 트래피킹의 어려움을 피하기 위해 항체 유전자 전달의 맥락에서 빈번하게 표적화되어 마찬가지로 코딩된 아피머의 전달을 위한 표적이 될 뇌에도 유사한 근거가 적용된다. 예를 들어, 문헌 [Beckman et al. (2015) "Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors" Cancer 109(2):170-9; Dronca et al. (2015) "Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer, the better" Clin Cancer Res. 21(5):944-6; 및 Neves et al. (2016) "Antibody approaches to treat brain diseases" Trends Biotechnol. 34(1):36-48]을 참조한다.
유전자 요법의 성공은 비바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터에서의 개선에 의해 크게 촉진되었다. 다수의 물리적 및 화학적 비바이러스 방법이 DNA 및 mRNA를 포유동물 세포에 전달하는데 사용되었고, 이들 중 상당수는 생체외 및 생체내 둘 다의 유전자 요법을 위한 임상 단계 기술로서 개발되었으며, 본 개시내용의 코딩된 아피머의 전달을 위해 용이하게 적합화된다. 예시하자면, 양으로 하전된 머리기 및 소수성 지질 꼬리를 보유하는 친양쪽성 지질이 음으로 하전된 DNA 또는 RNA에 결합하고 일반적으로 세포내이입에 의해 세포에 진입하는 입자를 형성하는 능력에 기초한 양이온성 리포솜 기술이 사용될 수 있다. 일부 양이온성 리포솜은 또한 포유동물 세포에 의한 리포솜 흡수를 증진시키는 것으로 생각되는 중성 공동-지질을 함유한다. 예를 들어, 문헌 [Felgner et al. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. MNAS 84:7413-7417; San et al. (1983) "Safety and short term toxicity of a novel cationic lipid formulation for human gene therapy" Hum. Gene Ther. 4:781-788; Xu et al. (1996) "Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection" Biochemistry 35,:5616-5623; 및 Legendre et al. (1992) "Delivery of plasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes: comparison with cationic liposomes" Pharm. Res. 9, 1235-1242]을 참조한다.
유사하게, 다른 다가양이온, 예컨대 폴리-l-리신 및 폴리에틸렌-이민을 사용하여 코딩된 아피머를 전달할 수 있다. 이들 다가양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체화되고, DNA 또는 RNA의 나노입자로의 축합을 보조하며, 이러한 나노입자는 이어서 엔도솜-매개 흡수를 위한 기질이 된다. 플라스미드 DNA, 올리고데옥시뉴클레오티드 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 포함한 이들 양이온성 핵산 복합체 기술 중 몇몇은 잠재적인 임상 제품으로서 개발되었다. 변형된 (및 비변형된 또는 "네이키드") DNA 및 RNA는 또한 다수의 상황에서 성공적인 유전자 전달을 매개하는 것으로 제시되었고, 또한 코딩된 아피머의 전달을 위한 시스템으로서 사용될 수 있다. 이들은 직접적인 근육내 주사에 의한 플라스미드 DNA의 사용, 플라스미드 DNA의 종양내 주사의 사용을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Rodrigo et al. (2012) "De novo automated design of small RNA circuits for engineering synthetic riboregulation in living cells" PNAS 109:15271-15276; Oishi et al. (2005) "Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages" Chembiochem. 6:718-725; Bhatt et al. (2015) "Microbeads mediated oral plasmid DNA delivery using polymethacrylate vectors: an effectual groundwork for colorectal cancer" Drug Deliv. 22:849-861; Ulmer et al. (1994) Protective immunity by intramuscular injection of low doses of influenza virus DNA vaccines" Vaccine 12: 1541-1544; 및 Heinzerling et al. (2005) "Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin 12 into patients with metastatic melanoma: clinical efficacy" Hum. Gene Ther. 16:35-48]을 참조한다.
바이러스 벡터는 현재 대다수의 전임상 및 임상 유전자 요법 시험에서 전달 비히클로서 사용되고 있으며, 처음 승인된 유도 유전자 요법이다. 문헌 [Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017 (abedia.com/wiley/)]을 참조한다. 그에 대한 주요 유도인자는 자연 진화 개발을 반영하는 그의 이례적인 유전자 전달 효율이며; 바이러스 벡터 시스템은 바이러스가 감염에 의해 세포 막을 통해 횡단하는 능력을 진화시킴으로써 코딩된 아피머와 같은 핵산을 표적 세포에 전달하였기 때문에 유전자 전달에 대해 매력적이다. 아데노바이러스 시스템에 의해 개척되어, 바이러스 벡터-매개 항체 유전자 전달 분야는 지난 수십년 동안 상당한 진보를 이루었다. 무수한 성공적으로 평가된 투여 경로, 전임상 모델 및 질환 적응증은 항체 유전자 전달의 능력을 전면 제시하여, 이를 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자가 항체 유전자 전달 시스템 및 코딩된 아피머 구축물의 생체내 전달을 위한 기술을 용이하게 확인하고 적합화할 수 있을 것이다. 근육은 연장된 mAb 발현을 위해 선택된 투여 부위로서 나타났고, 유사하게 연장된 아피머 작용제 발현을 위한 적합한 표적 조직일 것이다. 벡터화된 종양내 코딩된 아피머 유전자 전달의 맥락에서, 종양용해 바이러스는 이들이 종양 세포를 특이적으로 표적화하고, 아피머 작용제 발현을 부스팅하며, 치료 반응을 - 예컨대 PD-L1 아피머 작용제에 대해 증폭시킬 수 있기 때문에 뚜렷한 이점을 갖는다.
코딩된 아피머의 생체내 유전자 전달은 또한 비바이러스 벡터, 예컨대 발현 플라스미드의 사용에 의해 달성될 수 있다. 비바이러스 벡터는 용이하게 생산되고 특이적 면역 반응을 유도하는 것으로 보이지 않는다. 근육 조직은 가장 흔하게는 형질감염을 위한 표적 조직으로서 사용되며, 이는 근육 조직이 잘 혈관화되고 용이하게 접근가능하며 근세포가 긴 수명의 세포이기 때문이다. 네이키드 플라스미드 DNA의 근육내 주사는 특정 백분율의 근세포의 형질감염을 일으킨다. 이러한 접근법을 사용하여, 시토카인 및 시토카인/IgG1 키메라 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA가 생체내 도입되었고, (자가면역) 질환 결과에 긍정적으로 영향을 미쳤다.
일부 경우에, 형질감염 효율을 증가시키기 위해 소위 혈관내 전달을 사용하며, 정맥에서 단기간의 일시적인 높은 압력을 유도함으로써 증가된 유전자 전달 및 발현 수준이 달성된다. 특수 혈압 커프는 혈관 압력을 일시적으로 증가시킴으로써 국재화된 흡수를 용이하게 할 수 있고, 이러한 유형의 유전자 전달을 위해 인간 환자에서 사용되도록 적합화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zhang et al. (2001) "Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates" Hum. Gene Ther., 12:427-438]을 참조한다.
증가된 효율은 또한 다른 기술을 통해 얻어질 수 있으며, 예컨대 화학적 담체인 양이온성 중합체 또는 지질의 사용에 의해 또는 물리적 접근법인 유전자 총 전달 또는 전기천공을 통해 핵산의 전달이 개선된다. 문헌 [Tranchant et al. (2004) "Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids" J. Gene Med., 6 (Suppl. 1):S24-S35; 및 Niidome et al. (2002) "Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors" Gene Ther., 9:1647-1652]을 참조한다. 전기천공은 특히 비바이러스 유전자 전달을 위한 흥미로운 기술로서 간주된다. 문헌 [Somiari, et al. (2000) "Theory and in vivo application of electroporative gene delivery" Mol. Ther. 2:178-187; 및 Jaroszeski et al. (1999) "In vivo gene delivery by electroporation" Adv. Drug Delivery Rev., 35:131-137]. 전기천공에 의해, 펄스 전류를 국부 조직 영역에 인가하여 세포 투과성을 증진시킴으로써, 막을 가로지르는 유전자 전달을 수행한다. 연구는 전기천공을 사용하지 않는 것보다 사용하였을 때 생체내 유전자 전달이 적어도 10-100배 더 효율적일 수 있다는 것을 제시하였다. 예를 들어, 문헌 [Aihara et al. (1998) "Gene transfer into muscle by electroporation in vivo" Nat. Biotechnol. 16:867-870; Mir, et al. (1999) "High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses" PNAS 96:4262-4267; Rizzuto, et al. (1999) "Efficient and regulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscle electroporation" PNAS 96: 6417-6422; 및 Mathiesen (1999) "Electropermeabilization of skeletal muscle enhances gene transfer in vivo" Gene Ther., 6:508-514]을 참조한다.
코딩된 PD-L1 결합 아피머는 바이러스, 비-바이러스 또는 물리적 시스템을 포함한, 유전자 요법에 통상적으로 사용되는 광범위한 유전자 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578, 1988, 및 Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)]을 참조한다. 유전자 요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물에 대한 논의는 문헌 [Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl. 1):31-32, 1997; Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck, ed., 12(3):483-501, 1998; Romano et al., Stem Cells, 18:19-39, 2000] 및 그에 인용된 참고문헌을 포함한다. 미국 특허 번호 6,080,728은 또한 매우 다양한 유전자 전달 방법 및 조성물에 대한 논의를 제공한다. 전달 경로는, 예를 들어 전신 투여 및 계내 투여를 포함한다.
효과적인 코딩된 아피머 유전자 전달 접근법은 그것이 필요한 특이적 조직/세포에 대해 지시되어야 하고, 생성된 트랜스진 발현은 특이적 적용에 적절한 수준이어야 한다. 프로모터는 전체 발현 강도 뿐만 아니라 세포-특이성을 좌우할 수 있는 벡터 게놈 설계 내의 주요 시스-작용 요소이다.
표 1. 예시적인 편재성 및 세포-특이적 프로모터.
Figure pct00019
Figure pct00020
일부 경우에, 모든 세포 유형에서 코딩된 아피머 구축물의 편재성 발현이 바람직하다. 구성적 프로모터, 예컨대 인간 신장 인자 1α-서브유닛 (EF1α), 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV), 닭 β-액틴 (CBA) 및 그의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제 (GUSB), 또는 유비퀴틴 C (UBC)를 사용하여 대부분의 조직에서 코딩된 아피머 구축물의 발현을 촉진할 수 있다. 일반적으로, 구성적 프로모터 중 CBA 및 CAG는 보다 큰 발현을 촉진하지만; CMV (~0.8 kb) 또는 EF1α (~1.2 kb)와 비교하여 ~1.7 kb의 그의 크기는, 특히 코딩된 아피머 구축물의 발현에 의해 생산된 아피머 작용제가 큰 경우 AAV와 같은 패키징 제약을 갖는 벡터에서 사용하기에 제한이 있을 수 있다. GUSB 또는 UBC 프로모터는 각각 378 bp 및 403 bp의 보다 작은 크기를 갖는 편재성 유전자 발현을 제공할 수 있지만, 이들은 CMV 또는 CBA 프로모터보다 상당히 더 약하다. 따라서, 발현에 영향을 미치지 않으면서 크기를 감소시키기 위한 구성적 프로모터에 대한 변형이 추구되었으며, CBh (~800 bp) 및 미니CBA (~800 bp)와 같은 예는 선택된 조직에서 대등한 발현 및 훨씬 더 높은 발현을 촉진할 수 있다 (Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 22:1143-1153).
코딩된 아피머 구축물의 발현이 기관 내의 특정 세포 유형으로 제한되어야 하는 경우에, 프로모터는 이러한 특이성을 매개하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신경계 내에서 프로모터는 발현을 뉴런, 성상세포 또는 핍지교세포로 제한하는데 사용되어 왔다. 뉴런에서, 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터는 편재성 프로모터보다 더 강한 발현을 구동한다. 추가적으로, 혈소판-유래 성장 인자 B-쇄 (PDGF-β), 시냅신 (Syn), 및 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2) 프로모터는 NSE보다 더 낮은 수준으로 뉴런-특이적 발현을 유도할 수 있다. 성상세포에서, 신경교세포 원섬유성 산성 단백질 (GFAP, 2.2 kb) 프로모터의 680 bp-길이의 단축된 버전 [gfaABC(1)D]은 GFAP 프로모터와 동일한 성상세포-특이성을 갖는 보다 높은 수준의 발현을 부여할 수 있다. 핍지교세포를 표적화하는 것은 또한, 발현이 이러한 신경교 세포에 제한되는 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 프로모터의 선택에 의해 달성될 수 있지만; 그의 1.9 kb 크기 및 낮은 발현 수준이 그의 사용을 제한한다.
코딩된 아피머 구축물을 골격근 세포에서 발현시키는 경우에, 근육 크레아틴 키나제 (MCK) 및 데스민 (1.7 kb)에 기초한 예시적인 프로모터는 높은 비율의 특이성을 나타냈다 (목적하는 경우에 간에서 최소의 발현을 가짐). α-미오신 중쇄 (α-MHC; 1.2 kb)의 프로모터는 다른 근육 프로모터와 비교하여 유의한 심장 특이성을 나타냈다 (Lee et al., 2011 J Cardiol. 57(1):115-22). 조혈 줄기 세포에서, 합성 MND 프로모터 (Li et al., 2010 J Neurosci Methods. 189(1):56-64) 및 2AUCOE (편재성 염색질 개방 요소)에 함유된 프로모터는 각각 EF1α 및 CMV 프로모터와 비교하였을 때 모든 세포 계통에서 더 높은 트랜스진 발현을 유도하는 것으로 나타났다 (Zhang et al., 2007 Blood. 110(5):1448-57; Koldej 2013 Hum Gene Ther Clin Dev. 24(2):77-85; Dighe et al., 2014 PLoS One. 9(8):e104805.). 반대로, 벡터-매개 유전자 전달 후에 발현을 단지 간의 간세포로만 제한하는 프로모터를 사용하는 것은 위험이 있는 시스템에서 트랜스진-특이적 면역 반응을 감소시키고, 심지어 발현된 단백질에 대한 면역 관용을 유도하는 것으로 밝혀졌으며 (Zhang et al., 2012 Hum Gene Ther. 23(5):460-72), 이는 특정 아피머 작용제에 대해 유익할 수 있다. α1-항트립신 (hAAT; 347 bp) 및 티록신 결합 글로불린 (TBG; ~400 bp) 프로모터는 다른 조직으로의 최소 침습으로 간에 제한된 유전자 발현을 유도한다 (Yan et al., 2012 Gene. 506(2):289-94; Cunningham et al., 2008 Mol Ther. 16(6):1081-8).
일부 실시양태에서, 생체내 코딩된 아피머 발현의 지속기간 및 양을 제어하는 메카니즘이 전형적으로 바람직할 것이다. 바이러스 벡터화- 및 플라스미드 DNA-기반 코딩된 아피머 유전자 전달과 함께 사용하기 위해 적합화될 수 있는 다양한 유도성 프로모터가 있다. 문헌 [Fang et al. (2007) "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo" Mol Ther. 5(6):1153-9; 및 Perez et al. (2004) "Regulatable systemic production of monoclonal antibodies by in vivo muscle electroporation" Genet Vaccines Ther. 2(1):2]을 참조한다. 현재 임상 평가 하에 있는 예시적인 조절가능한 메카니즘은 소분자 리간드에 의해 활성화된 엑디손-기반 유전자 스위치이다. 문헌 [Cai et al. (2016) "Plasma pharmacokinetics of veledimex, a small-molecule activator ligand for a proprietary gene therapy promoter system, in healthy subjects" Clin Pharmacol Drug Dev. 2016].
코딩된 아피머 구축물의 일부 실시양태에서, 바이러스 전사후 조절 요소 (PRE)가 사용될 수 있고; 이들 시스-작용 요소는 인트론 없는 바이러스 RNA의 핵 유출에 요구된다 (Huang and Yen, 1994 J Virol. 68(5):3193-9; 및 1995 Mol Cell Biol. 15(7):3864-9). 예는 HPRE (B형 간염 바이러스 PRE, 533 bp) 및 WPRE (우드척 간염 바이러스 PRE, 600 bp)를 포함하며, 이는 특정 경우에 트랜스진 발현의 수준을 거의 10배 증가시킬 수 있다 (Donello et al., 1998 J Virol. 72(6):5085-92). 추가로 예시하자면, 렌티바이러스 및 AAV 벡터를 사용하여, WPRE는 CMV 프로모터 구동 트랜스진 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 PPE, PDGF 및 NSE 프로모터-구동 트랜스진 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. WPRE의 또 다른 효과는 코딩된 아피머 구축물 트랜스진을 침묵으로부터 보호하는 것일 수 있다 (Paterna et al., 2000 Gene Ther. 7(15):1304-11; Xia et al., 2007 Stem Cells Dev. 2007 Feb; 16(1):167-76).
전사된 코딩된 아피머 전사체의 폴리아데닐화는 또한 핵 유출, 번역 및 mRNA 안정성에 중요할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 코딩된 아피머 구축물은 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 것이다. 유전자 발현 및 mRNA 안정성에 대한 상이한 폴리A 신호의 효과를 결정한 다양한 연구가 이용가능하다. 예시적인 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 후기 또는 소 성장 호르몬 폴리A (bGHpA) 신호 서열, 뿐만 아니라 최소 합성 폴리A (SPA) 신호를 포함한다 (Levitt et al., 1989 Genes Dev. 3(7):1019-25; Yew et al., 1997 Hum Gene Ther. 1997 8(5):575-84). 폴리아데닐화의 효율은 다른 폴리A 신호의 상류에 배치된 SV40 후기 폴리A 신호 상류 인핸서 (USE)에 의해 증가된다 (Schek et al., 1992 Mol Cell Biol. 12(12):5386-93). 일부 실시양태에서, 단지 예시하자면, 코딩된 아피머 구축물은 SV40 후기 + 2xUSE 폴리A 신호를 포함할 것이다.
표 2: 예시적인 폴리아데닐화 신호
Figure pct00021
일부 실시양태에서, 코딩된 아피머 구축물이 조절 인핸서를 1개 이상, 즉 임의의 프로모터 서열에 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있다. CMV 인핸서는 -598 내지 -68에서 CMV 프로모터의 상류에 있고 (Boshart et al., 1985 Cell. 41(2):521-30) (~600 bp), 전사 결합 부위를 함유한다. 일부 실시양태에서, CMV 인핸서는 조직-특이적 프로모터-구동 트랜스진 발현을 증가시키기 위해, 예컨대 ANF (심방 나트륨이뇨 인자) 프로모터, CC10 (곤봉 세포 10) 프로모터, SP-C (계면활성제 단백질 C) 프로모터 또는 PDGF-β (혈소판-유래 성장 인자-β) 프로모터 (단지 예로서)를 사용하여 구축물에 포함될 수 있다. 종합하면, CMV 인핸서는 상이한 세포-특이적 프로모터 및 상이한 세포 유형 하에서 트랜스진 발현을 증가시켜 이를 트랜스진 발현 수준을 증가시키는 광범위하게 적용가능한 도구로 만든다. 근육에서, 예를 들어 AAV 발현 시스템에서, 근육-특이적 프로모터와 함께 CMV 인핸서를 사용하는 트랜스진 발현은 트랜스진에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있고, 따라서 환자의 근육 세포 내로 도입된 코딩된 아피머 구축물로부터 아피머 작용제를 발현시키기 위한 본 개시내용에 특히 유용할 것이다.
대상 코딩된 아피머 구축물은 또한 1개 이상의 인트론 서열을 포함할 수 있다. mRNA에서의 인트론 또는 개재 서열의 존재는 시험관내에서 mRNA 프로세싱 및 증가된 트랜스진 발현에 중요한 것으로 처음 기재되었다 (Huang and Gorman, 1990 Mol Cell Biol. 10(4):1805-10; Niwa et al., 1990 Genes Dev. 4(9):1552-9). 인트론(들)은 아피머 작용제에 대한 코딩 서열 내에 위치할 수 있고/거나 프로모터와 트랜스진 사이에 위치할 수 있다. 프로모터와 트랜스진 사이에 위치한 다양한 인트론 (표 3)을 간 트랜스진 발현에 대해 AAV2를 사용하여 마우스에서 비교하였다 (Wu et al., 2008). MVM (마우스 미세 바이러스) 인트론은 시험된 임의의 다른 인트론보다 더 많이 및 인트론이 없는 것에 비해 80배 초과로 트랜스진 발현을 증가시켰다 (Wu et al., 2008). 그러나, AAV 발현 카세트를 사용하여 배양된 뉴런에서, 트랜스진 발현은 WPRE와 비교하여 트랜스진과 폴리A 신호 사이에 키메라 인트론 (인간 β-글로빈 공여자 및 이뮤노글로불린 중쇄 수용자)을 갖는 CaMPKII 프로모터 하에 더 적었다 (Choi et al., 2014). 종합하면, 인트론은 트랜스진 발현을 증가시키기 위해 발현 카세트 내에 포함되는 가치있는 요소일 수 있다.
표 3: 예시적인 인트론
Figure pct00022
에피솜 벡터의 경우, 대상 코딩된 아피머 구축물은 또한 1개 이상의 복제 기점, 미니염색체 유지 요소 (MME) 및/또는 핵 국재화 요소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 에피솜 벡터는 복제 기점 (ori)을 코딩하는 바이러스 게놈 DNA의 한 부분을 포함하며, 이는 이러한 벡터가 자기-복제되고 이에 따라 여러 세대에 걸쳐 숙주 세포에서 지속되기 위해 요구된다. 추가로, 본 개시내용의 에피솜 벡터는 또한 복제에 요구되는 바이러스 단백질, 즉 복제자 단백질(들)을 코딩하는 1개 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 임의로, 복제를 개시하는 것을 돕는 복제자 단백질(들)은 본 개시내용의 자기-복제 에피솜 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 내, 또 다른 DNA 분자 상에서, 예컨대 또 다른 벡터 상에서 또는 숙주 게놈 DNA 상에서 트랜스로 발현될 수 있다. 본 개시내용의 바람직한 자기-복제 에피솜 LCR-함유 발현 벡터는 진핵 숙주 세포에서의 장기간 안정한 유지에 요구되지 않는 바이러스 서열, 예컨대 전장 바이러스 게놈 DNA 분자에 존재할 수 있는 바이러스 종양원성 서열 또는 감염성 바이러스 입자를 생산할 코어 또는 캡시드 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈 DNA의 영역을 함유하지 않는다. 본원의 용어 "안정한 유지"는 2, 3, 4 또는 5 또는 그 초과의 세대 동안 벡터의 카피수의 유의한 손실 (예를 들어, >50%) 없이 연속 선택의 부재 하에 비-분열 세포 또는 분열 세포의 자손 세포에서 지속되거나 유지되는 본 개시내용의 자기-복제 에피솜 발현 벡터의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 10-15 또는 그 초과의 세포 세대에 걸쳐 유지될 것이다. 대조적으로, 숙주 세포에서의 플라스미드의 "일시적" 또는 "단기간" 지속성은 안정한 방식으로 숙주 세포에서 복제 및 분리되는 벡터의 능력을 지칭하고; 즉, 벡터는 1 또는 2 세대 후에 상실될 것이거나 또는 연속 세대 사이에 그의 카피수의 >51%의 상실을 겪을 것이다.
본 개시내용의 맥락에서 유용한 여러 대표적인 자기-복제, LCR-함유, 에피솜 벡터를 하기에 추가로 기재한다. 자기-복제 기능은 대안적으로, 예컨대 문헌 [Wohlge uth et al., 1996, Gene Therapy 3:503; Vos et al., 1995, Jour. Cell. Biol., Supp. 21A, 433; 및 Sun et al., 1994, Nature Genetics 8:33]에 기재된 1개 이상의 포유동물 서열을, 임의로 핵 보유에 요구될 수 있는 1개 이상의 서열과 조합하여 제공될 수 있다. 자기-복제 기능을 제공하기 위해 포유동물, 특히 인간 서열을 사용하는 것의 이점은 독성 또는 종양원성 특성을 가질 수 있는 외래 활성화 인자가 요구되지 않는다는 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 임의의 하나의 복제 기점 또는 임의의 하나의 에피솜 벡터에 제한되는 것이 아니라, 에피솜 벡터 내 LCR의 조직-제한 제어의 조합을 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 또한, WO1998007876 ("Self-replicating episomal expression vectors conferring tissue-specific gene expression") 및 미국 특허 7790446 ("Vectors, cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products")을 참조한다.
엡스타인-바르 바이러스-기반 자기-복제 에피솜 발현 벡터. 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)로부터의 잠재성 기점 oriP는 문헌 [Yates et. al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3806-3810 (1984); Yates et al., Nature 313:812-815 (1985); Krysan et al., Mol . Cell . Biol . 9:1026-1033 (1989); James et al.. Gene 86: 233-239 (1990), Peterson and Legerski, Gene 107:279-284 (1991); 및 Pan et al., Som . Cell Molec. Genet . 18:163-177 (1992)]에 기재되어 있다. 본 개시내용에 따라 유용한 EBV-기반 에피솜 벡터는 EBV의 2.61 kb 단편 상에 운반되는 EBV의 oriP 영역 및 EBV의 2.18 kb 단편 상에 운반되는 EBNA-1 유전자를 함유할 수 있다. oriP를 함유하는 벡터의 트랜스 에피솜 복제를 지지하는데 필요한 유일한 바이러스 유전자 생성물인 EBNA-1 단백질은 oriP를 함유하는 동일한 에피솜 발현 벡터 상에 제공될 수 있다. 또한, 바이러스 플라스미드의 트랜스 복제를 지지하는데 요구되는 것으로 공지된 임의의 단백질, 예컨대 EBNA-1에서와 같이, 유전자는 또한 또 다른 DNA 분자, 예컨대 상이한 DNA 벡터 상에서 발현될 수 있는 것으로 이해된다.
유두종 바이러스-기반, 자기-복제, 에피솜 발현 벡터. 본 개시내용의 에피솜 발현 벡터는 또한 소 유두종 바이러스 (BPV) 및 인간 유두종 바이러스 (HPV)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 유두종 패밀리 바이러스의 복제 기능에 기초할 수 있다. BPV 및 HPV는 포유동물 세포에서 안정하게 유지된 플라스미드로서 지속된다. BPV 및 HPV에 의해 코딩되는 -S 트랜스-작용 인자, 즉 E1 및 E2는 또한 최소의 복제 기점을 통해 많은 세포 유형에서 복제를 매개하는데 필요하고 충분한 것으로 확인되었다 (Ustav et al., EMBO J. 10: 449-457 (1991); Ustavet al., EMBO J . 10:4231-4329, (1991); Ustav et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 898-902 (1993)).
본 개시내용에 따라 유용한 에피솜 벡터는 문헌 [Piirsoo et al., EMBO J. , 15:1 (1996)] 및 WO 94/12629에 기재된 BPV-I 벡터 시스템이다. 문헌 [Piirsoo et al.]에 기재된 BPV-1 벡터 시스템은 BPV-1 복제 기점 (최소 기점 플러스 염색체외 유지 요소) 및 임의로 E1 및 E2 유전자를 보유하는 플라스미드를 포함한다. BPV-1 E1 및 E2 유전자는 BPV 에피솜 벡터의 안정한 유지를 위해 요구된다. 이들 인자는 플라스미드가 세포 주기 상태와 무관하게 세포당 30 카피 이하의 안정한 카피수로 복제되도록 보장한다. 따라서, 유전자 구축물은 분열 및 비-분열 세포 둘 다에서 안정하게 지속된다. 이는 조혈 줄기 세포 및 보다 많은 수임 전구체 세포와 같은 세포에서의 유전자 구축물의 유지를 가능하게 한다.
BPV 복제 기점은 E1 및 E2 복제 인자에 대한 결합 부위를 포함하는 60개 염기 쌍 (bp) DNA 단편 (뉴클레오티드 (nt) 7914-7927) 내의 상류 조절 영역의 31개 단부에 위치하였다. HPV의 최소 복제 기점은 또한 특징화되어 HPV의 URR 단편 (nt 7022-7927)에 위치하였다 (예를 들어, 문헌 [Chiang et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:5799-5803 (1992)] 참조). 본원에 사용된 바와 같은 "E1"은 BPV 하위유형 1의 뉴클레오티드 (nt) 849-2663에 의해 또는 하위유형 11의 HPV의 nt 832-2779에 의해 다른 유두종 바이러스의 등가 E1 단백질로 또는 유두종 바이러스 E1 단백질의 기능적 단편 또는 돌연변이체, 즉 E1의 복제 특성을 보유하는 E1의 단편 또는 돌연변이체로 코딩되는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 "E2H는 BPV 하위유형 1의 nt 2594-3837에 의해 또는 HPV 하위유형 11의 nt 2723-3823에 의해 다른 유두종 바이러스의 등가 E2 단백질 또는 유두종 바이러스 E2 단백질의 기능적 단편 또는 돌연변이체, 즉 E2의 복제 특성을 보유하는 E2의 단편 또는 돌연변이체로 코딩되는 단백질을 지칭한다. "미니염색체 유지 요소" (MME)는 유두종 바이러스 복제에 필수적인 바이러스 또는 인간 단백질이 결합하는 유두종 바이러스 게놈의 염색체외 유지 요소를 지칭하며, 이 영역은 문헌 [Piirsoo et al. (상기 문헌)]에 기재된 바와 같이 숙주 세포에서 유두종 바이러스 MO의 안정한 에피솜 유지에 필수적이다. 바람직하게는, MME는 전사 활성화제 E2에 대한 다중 결합 부위를 함유하는 서열이다. BPV에서의 MME는 본원에서 최소 약 6개의 순차적인 E2 결합 부위를 포함하고, 약 10개의 순차적인 E2 결합 부위를 갖는 최적의 안정한 유지를 제공하는, 상류 조절 영역 내에 위치하는 BPV의 영역으로서 정의된다. E2 결합 부위 9는 본원 하기에 기재되는 바와 같은 이러한 부위에 대한 예시적인 서열이며, 여기서 순차적 부위는 약 4-10개 뉴클레오티드, 최적으로는 6개 뉴클레오티드의 스페이서에 의해 분리된다. E1 및 E2는 또한 WO 94/12629 및 문헌 [Piirsoo et al. (상기 문헌)]에 기재된 바와 같이, 시스로 또는 트랜스로 플라스미드에 제공될 수 있다.
"E2 결합 부위"는 E2 단백질이 결합하는 유두종바이러스 이중-가닥 DNA의 최소 서열을 지칭한다. E2 결합 부위는 BPV-1 URR의 고친화도 E2 결합 부위 9인 서열 5* ACCGTTGCCGGT 3' (서열식별번호: 208)을 포함할 수 있고; 대안적으로, E2 결합 부위는, URR 내에서 발견되고 일반적 E2 결합 서열 5' ACCN6GGT 3' (서열식별번호: 209) 내에 속하는 결합 부위 9의 순열을 포함할 수 있다. 1개 이상의 전사 활성화제 E2 결합 부위는 대부분의 유두종바이러스에서 BPV 및 HPV에서와 같이 상류 조절 영역에 위치한다. 또한 본 개시내용에 따라 유용한 벡터는 BPV 유전자 지도 상의 6959 - 7945/1 - 470 사이의 BPV 영역 (WO 94/12629에 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있고, 이러한 영역은 복제 기점, 관심 유전자와 작동가능하게 회합된 제1 프로모터, E1 유전자의 전사를 유도하기 위한 제2 프로모터와 작동가능하게 회합된 BPV E1 유전자; 및 E2 유전자의 전사를 유도하기 위한 제3 프로모터와 작동가능하게 회합된 BPV E2 유전자를 포함한다.
BPV로부터의 E1 및 E2는 BPV 기점 또는 많은 HPV 하위유형의 기점을 함유하는 벡터를 복제할 것이다 (Chiang et al., 상기 문헌). HPV로부터의 E1 및 E2는 BPV 기점을 통해 및 많은 HPV 하위유형의 기점을 통해 벡터를 복제할 것이다 (Chiang et al., 상기 문헌). 본 개시내용의 모든 벡터에서와 같이, 본 개시내용의 BPV-기반 에피솜 발현 벡터는 숙주 세포의 2-5회 이상의 분열을 통해 지속되어야 한다.
또한, 미국 특허 7790446 및 문헌 [Abroi et al. (2004) "Analysis of chromatin attachment and partitioning functions of bovine papillomavirus type 1 E2 protein. Journal of Virology 78:2100-13]을 참조하며, 이는 BPV1 E2 단백질 의존성 MME 및 EBV EBNA1 의존성 FR 분리/분할 활성이 플라스미드의 복제와 독립적으로 기능한다는 것을 제시하였다. EBNA1/FR 및 E2/MME의 안정한-유지 기능은 세포 복제 기점에 대한 장기간 에피솜 유지를 보장하는데 사용될 수 있다.
파포바바이러스-기반, 자기-복제, 에피솜 발현 벡터. 본 개시내용의 벡터는 또한 인간 파포바바이러스 BK 게놈 DNA 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, BK 바이러스 게놈은 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 소화되어 벡터에 안정한 유지를 부여할 수 있는 BK 바이러스 복제 기점 서열을 함유하는 5 킬로베이스 (kb) 단편을 생성할 수 있으며 (예를 들어, 문헌 [De Benedetti and Rhoads, Nucleic Acids Res. 19:1925 (1991) 참조]), BK 바이러스의 3.2 kb 단편이 생성될 수도 있다 (Cooper and Miron, Human Gene Therapy 4:557 (1993)).
본 개시내용의 코딩된 아피머 구축물은 원형 또는 선형 핵산으로서 제공될 수 있다. 원형 및 선형 핵산은 적절한 대상 세포에서 아피머 작용제 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있다. 아피머 작용제를 발현하기 위한 1개 이상의 핵산 시스템은 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 성분 중 적어도 하나에 대해 이종임을 의미한다.
a. 바이러스 벡터
본 개시내용에 사용하기 위해 용이하게 적합화되는 예시적인 바이러스 유전자 요법 시스템으로는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 등을 포함한다. 바람직한 바이러스 벡터는 비-필수 유전자가 에피토프 및 관심 표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 보유하는 핵산 구축물로 대체된 비-세포병변 진핵 바이러스에 기초한다.
추가로 예시하자면, 코딩된 아피머는 이미 유전자 요법에서 인간 사용을 위해 승인된 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스 및 아데노-연관된 (AAV) 바이러스를 사용하여 생체내에서 전달될 수 있다.
아데노바이러스 벡터
1개 이상의 핵산 서열의 생체내 전달을 위한 한 예시적인 방법은 아데노바이러스 ("AdV") 발현 벡터의 사용을 포함한다. AdV는 숙주 게놈에서 통합되지도 않고 세포 분열 동안 복제되지도 않는 비-외피보유 이중-가닥 DNA 바이러스이다. AdV-매개 항체 유전자 전달은 다양한 상이한 질환 모델에서 치료 효능을 나타냈으며, 임상을 향해 진행하고 있다. 전신 mAb 발현은 대부분 피하 및 특히 정맥내 및 근육내 AdV 주사를 통해 추구되었다. 문헌 [Wold et al. (2013) "Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy" Curr Gene Ther. 13(6):421-33; 및 Deal et al. "Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy" 2015 Curr Opin Immunol. 35:113-22]을 참조한다. 다른 전달의 경로는, 예컨대 코딩 AdV의 비강내, 기관내 또는 흉막내 투여를 통한 보다 많은 국소 mAb 생산에 초점을 맞추었다. 종양용해 벡터로서의 AdV의 사용은 특히 종양 부위에서의 코딩된 항체의 생성을 위한 대중적인 접근법이다. 현재 아데노바이러스 유전자 전달 시스템에 의해 전달되는 외래 유전자는 에피솜이며, 따라서 숙주 세포에 대한 낮은 유전자독성을 갖는다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 사용하는 유전자 요법은 상당히 안전할 수 있다. 본 개시내용은 구체적으로 아데노바이러스 벡터 및 전달 시스템의 형태로 전달되는 코딩된 아피머 구축물의 발현에 의한 아피머 작용제의 전달을 고려한다.
아데노바이러스는 그의 중간-크기 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 폭넓은 표적-세포 범위 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 통상적으로 사용되었다. 바이러스 게놈의 둘 다 말단은 100-200 bp ITR (역전된 말단 반복부)을 함유하며, 이는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소이다. 게놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 소수의 세포 유전자의 전사의 조절을 담당하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제를 담당하는 단백질을 코딩한다. 지금까지 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, 결실된 E1 영역을 갖는 복제 부적격 아데노바이러스는 통상적으로 사용되고, 본 개시내용의 코딩된 아피머 구축물을 생성하기 위한 AdV의 하나의 예시적인 선택을 나타낸다. 아데노바이러스 벡터에서 결실된 E3 영역은 트랜스진에 대한 삽입 부위를 제공할 수 있다 (문헌 [Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989))]).
"아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 구축물의 패키징을 지지하고 (b) 아피머 작용제, 예컨대 PD-L1 결합 아피머 (코딩된 아피머 서열)를 포함한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구축물을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 코딩된 아피머에 대한 서열은 DA 프로모터 영역 내로 삽입될 수 있다. 예시적인 실시양태에 따르면, 재조합 아데노바이러스는 결실된 E1B 및 E3 영역을 포함하고, 코딩된 아피머에 대한 뉴클레오티드 서열은 결실된 E1B 및 E3 영역 내로 삽입된다.
아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV)
AAV (또는 재조합 AAV에 대해 "rAAV")는 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 감염시킬 수 있는 비-외피보유 소형 단일-가닥 DNA 바이러스이다. AdV와 유사하게, AAV-기반 벡터는 핵에서 에피솜 상태로 남아 있으며, 제한된 통합 위험을 나타낸다. AdV-매개 유전자 전달의 일반적으로 제한된 내구성과 대조적으로, 트랜스진 발현은 근육내 재조합 AAV (rAAV) 벡터 전달 후 수년 동안 지속될 수 있다.
인간 지단백질 리파제 유전자를 코딩하는 rAAV인 알리포겐 티파르보벡 (글리베라(Glybera)™)은 유럽에서 제1 유전자 요법 제품으로서 2012년에 승인되었다. 그 이후로, 다양한 rAAV-기반 유전자 요법 제품이 현재 임상 평가 중이다. 항체 유전자 전달의 맥락에서, 다양한 보고가 mAb-코딩 rAAV의 근육내 주사 후 마우스에서 항-인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) mAb의 생체내 생산을 입증하였다. 조합 요법에 대한 rAAV 벡터의 잠재력은 또한, 즉 2개의 mAb를 발현시킴으로써 입증되었다. AdV와 유사하게, 근육내 및 i.v. rAAV 투여가 가장 자주 추구되었다. 문헌 [Deal et al. "Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy" 2015 Curr Opin Immunol. 35:113-22]에서 검토되었다. 두개내, 비강내, 유리체내, 척수강내, 흉막내 및 복강내 경로를 포함한 다양한 추가의 전달 부위가 또한 보다 국부의 치료 효과를 달성하는 것으로 입증되었다. rAAV의 유용성이 항체 유전자 전달에 대해 입증되어, 본 개시내용은 또한 구체적으로 생체내에서 코딩된 아피머 서열의 전달 및 rAAV 구축물의 발현에 대한 결과로서 환자의 신체에서 아피머 작용제의 생산을 위한 rAAV 시스템의 사용을 고려한다.
AAV에 대한 한 가지 중요한 특색은 이들 유전자 전달 바이러스가 비-분열 세포 및 다양한 유형의 세포를 감염시킬 수 있다는 것이며, 이는 이들을 본 개시내용의 코딩된 아피머 전달 시스템을 구축하는데 유용하게 만든다. 예시적인 AAV 벡터의 사용 및 제조에 대한 상세한 설명은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,139,941 및 4,797,368, 뿐만 아니라 문헌 [LaFace et al., Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)]에서 발견된다. AAV는 그의 안전성으로 인해 전달 비히클의 좋은 선택이며, 즉 유전자 조작된 것 (재조합)은 숙주 게놈 내로 통합되지 않는다. 마찬가지로, AAV는 병원성이 아니고, 임의의 질환과 연관되지 않는다. 바이러스 코딩 서열의 제거는 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화하며, 따라서, 재조합 AAV는 염증 반응을 유발하지 않는다.
전형적으로, 재조합 AAV 바이러스는 2개의 AAV 말단 반복부에 의해 플랭킹된 관심 유전자 (즉, 아피머 작용제에 대한 코딩 서열)를 함유하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 반복부를 갖지 않는 야생형 AAV 코딩 서열을 함유하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945(1991))를 공동-형질감염시킴으로써 제조된다. 전형적으로, 코딩된 아피머 구축물을 함유하는 바이러스 벡터는 아피머 함유 폴리펩티드, 적합한 조절 요소 및 세포 형질도입을 매개하는 코딩된 아피머의 발현에 필요한 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 어셈블리된다. 일부 실시양태에서, 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터가 사용된다. 보다 구체적인 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV6, 또는 AAV8이다.
AAV ITR에 의해 경계화된 코딩된 아피머 서열을 갖는 AAV 발현 벡터는 선택된 서열(들)을 그로부터 절제된 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 ("ORF")을 갖는 AAV 게놈 내로 직접적으로 삽입함으로써 구축될 수 있다.
진핵 세포에 대해, 발현 제어 서열은 전형적으로 프로모터, 인핸서, 예컨대 이뮤노글로불린 유전자, SV40, 시토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 것 (상기 참조), 및 스플라이스 공여자 및 수용자 부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 뒤에 및 3' ITR 서열 앞에 삽입된다.
이들 및 다른 통상적인 벡터 및 조절 요소의 선택은 통상적이며, 많은 이러한 서열이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.], 및 예를 들어 페이지 3.18-3.26 및 16.17-16.27에서 그에 인용된 참고문헌, 및 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989)]을 참조한다. 물론, 모든 벡터 및 발현 제어 서열이 본 개시내용의 모든 트랜스진을 발현시키는데 동등하게 잘 기능하지는 않을 것이다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 범주로부터 벗어나지 않고 이들 발현 제어 서열 중에서 선택할 수 있다. 적합한 프로모터/인핸서 서열은 본 출원에 의해 제공된 지침을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 선택은 통상적인 문제이며, 분자 또는 구축물의 제한이 아니다.
레트로바이러스 벡터
코딩된 아피머 구축물의 전달의 맥락에서 유용한 비-세포병변 바이러스는 레트로바이러스를 포함하며, 이의 생활 주기는 숙주 세포 DNA 내로의 후속의 프로바이러스 통합을 갖는 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사를 포함한다. 레트로바이러스는 인간 유전자 요법 시험에 대해 승인되었다. 복제-결핍인 (즉, 목적하는 단백질의 합성을 지시할 수 있으나 감염성 입자를 제조할 수 없는) 상기 레트로바이러스가 가장 유용하다. 이러한 유전자 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내 유전자의 고효율 형질도입에 대한 일반적 유용성을 갖는다. 복제-결핍 레트로바이러스를 제조하기 위한 표준 프로토콜 (플라스미드 내로의 외인성 유전 물질의 혼입, 플라스미드로 라이닝된 패키징 세포의 형질감염, 패키징 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스의 제조, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자의 수집, 및 바이러스 입자로의 표적 세포의 감염의 단계를 포함함)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 아피머 작용제 코딩 서열을 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제-결핍성 바이러스를 제조한다. 비리온을 제조하기위해, gag, pol 및 env 유전자를 함유하지만 LTR (긴 말단 반복부) 및 psi (ψ) 성분을 함유하지 않는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 시토카인 유전자, LTR 및 psi를 함유하는 재조합 플라스미드가 이 세포주 내로 도입된 경우에, psi 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자 내로 패키징되도록 하고, 이는 이어서 배양 배지 내로 분비된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전달 시스템에 사용한다.
이러한 제2-세대 레트로바이러스 벡터를 사용한 성공적인 유전자 전달이 보고되었다. 카사하라(Kasahara) 등 (Science, 266:1373-1376(1994))은 EPO (에리트로포이에틴) 서열이 외피 영역 대신에 삽입되어, 결과적으로 신규 결합 특성을 갖는 키메라 단백질을 생산하는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스의 변이체를 제조하였다. 마찬가지로, 본 유전자 전달 시스템은 제2-세대 레트로바이러스 벡터에 대한 구축 전략에 따라 구축될 수 있다.
일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 "감마레트로바이러스"이며, 이는 레트로비리다에 과의 속을 지칭한다. 예시적인 감마레트로바이러스로는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이며, 이는 분열 및 비-분열 세포를 감염시킬 수 있으며, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇몇 예는 HIV (인간 면역결핍 바이러스: HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2를 포함함); 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함한다.
코딩된 아피머의 전달 및 발현에 사용될 수 있는 폭넓게 사용되는 레트로바이러스 벡터의 또 다른 부류는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV) 및 그의 조합을 기반으로 하는 것들을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739, 1992; Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640, 1992; Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59, 1990; Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378, 1989; Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224, 1991]; 및 PCT/US94/05700 참조).
본 개시내용에 또한 사용될 수 있는 추가의 다른 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 인간 포말 바이러스 (HFV) 또는 스푸마바이러스 속의 다른 바이러스에 기초한 벡터를 포함한다. 포말 바이러스 (FV)는 오늘날 공지된 가장 큰 레트로바이러스이며, 모든 비-인간 영장류 종을 비롯한 상이한 포유동물 중에서 널리 퍼져 있지만, 인간에는 부재한다. 이 완전한 비병원성은 FV 벡터를 인간에서의 유전자 요법을 위한 이상적인 유전자 전달 비히클로 자격부여하며, 유전자 전달 시스템으로서의 FV 벡터를 HIV-유래된 및 또한 감마레트로바이러스-유래된 벡터와 명백하게 구별한다.
본원에 사용하기에 적합한 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,399,346 및 5,252,479; 및 WIPO 공개 WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 및 WO 92/14829에 기재되어 있으며, 이는 핵산을 이러한 레트로바이러스 벡터를 사용하여 인간 세포 내로 효율적으로 도입하는 방법의 설명을 제공한다. 다른 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 마우스 유방 종양 바이러스 벡터 (예를 들어, 문헌 [Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659, 1998]), 렌티바이러스 등을 포함한다.
PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는 트랜스진의 전달을 위해 용이하게 적합화될 수 있는 추가의 레트로바이러스 바이러스 전달 시스템은, 단지 예시하자면, 공개된 PCT 출원 WO/2010/045002, WO/2010/148203, WO/2011/126864, WO/2012/058673, WO/2014/066700, WO/2015/021077, WO/2015/148683, WO/2017/040815를 포함한다 - 이들 각각의 명세서 및 도면은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 통합에 필요한 모든 시스-작용 서열, 즉, (a) 벡터 각각의 말단에 긴 말단 반복부 (LTR) 또는 그의 부분; (b) 음성 및 양성 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위; 및 (c) 비리온 내로의 게놈 RNA의 혼입에 필요한 패키징 신호를 함유한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 보다 상세한 내용은 문헌 [Boesen, et al., 1994, Biotherapy 6:291-302; Clowes, et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651 ; Kiem, et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141 ; Miller, et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581- 599; 및 Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-1 14]에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 레트로바이러스 GAG 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 레트로바이러스 POL 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 레트로바이러스 외피를 코딩하는 핵산 서열; 온코레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 긴-말단 반복부 (LTR) 서열을 포함하는 온코레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열; 아피머 작용제, 예컨대 PD-L1 아피머 작용제에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함하는 카세트 (여기서 카세트는 3' LTR의 U3 영역에 대해 5' 및 레트로바이러스 외피를 코딩하는 서열에 대해 3'에 위치함); 및 표적 세포에서의 역전사, 패키징 및 통합을 위한 시스-작용 서열을 포함하는 재조합 복제 적격 레트로바이러스이다.
일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 레트로바이러스 GAG 단백질; 레트로바이러스 POL 단백질; 레트로바이러스 외피; 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 긴-말단 반복부 (LTR) 서열, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 프로모터 서열 (프로모터는 포유동물 세포에서의 발현에 적합함), gag 핵산 도메인, pol 핵산 도메인 및 env 핵산 도메인을 포함하는 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드; 코딩된 아피머 서열을 포함하는 카세트 (여기서 카세트는 3' LTR의 5'에 위치하고, 작동가능하게 연결되며, 레트로바이러스 외피를 코딩하는 env 핵산 도메인에 대해 3'임); 및 표적 세포에서의 역전사, 패키징 및 통합에 필요한 시스-작용 서열을 포함하는 재조합 복제 적격 레트로바이러스이다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 일부 실시양태에서, 외피는 암포트로픽, 폴리트로픽, 제노트로픽, 10A1, GALV, 개코원숭이 내인성 바이러스, RD114, 랍도바이러스, 알파바이러스, 홍역 또는 인플루엔자 바이러스 외피 중 1종으로부터 선택된다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열은 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV), 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 개코원숭이 내인성 레트로바이러스 (BEV), 돼지 내인성 바이러스 (PERV), 고양이 유래된 레트로바이러스 RD114, 다람쥐 원숭이 레트로바이러스, 제노트로픽 뮤린 백혈병 바이러스-관련된 바이러스 (XMRV), 조류 세망내피증 바이러스 (REV), 또는 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GALV)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 조작된다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 일부 실시양태에서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스이다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 일부 실시양태에서, 예를 들어, 카세트의 하류에, 제2 치료 단백질, 예컨대 또 다른 체크포인트 억제제 폴리펩티드, 공동-자극 폴리펩티드 및/또는 면역자극 시토카인 (단지 예로서)에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 카세트가 있다. 특정 예에서, 제2 카세트는 제2 치료 단백질에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 미니프로모터 또는 polIII 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 일부 실시양태에서, 이는 바람직하게는 종양 미세환경의 세포에서 선택적으로 감염되고 복제되는 비용해성 암포트로픽 레트로바이러스 복제 벡터이다.
발현 구축물로서의 다른 바이러스 벡터
벡터화된 종양내 코딩된 아피머 유전자 전달의 맥락에서, 종양용해 바이러스는 이들이 종양 세포를 특이적으로 표적화하고, 치료 아피머 작용제 발현을 신장시키며, 항종양 치료 반응을 증폭시킬 수 있기 때문에 뚜렷한 이점을 갖는다. 상기 기재된 특정 바이러스 시스템과 중첩되는 종양용해 바이러스는 선택적 종양 세포 사멸 및 전신 항종양 면역의 유도를 통해 항종양 반응을 촉진시킨다. 작용 메카니즘은 완전히 해명되어 있지 않지만, 형질전환된 세포 내의 바이러스 복제, 1차 세포 사멸의 유도, 종양 세포 항-바이러스 요소와의 상호작용 및 선천성 및 적응성 항종양 면역의 개시에 의존할 가능성이 있다. 문헌 [Kaufman et al. 2015 "Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs" Nat Rev Drug Discov. 14(9):642-62]에 검토되어 있다. 현재 임상에 있는 종양용해 바이러스 중 많은 것은 암 세포에 의해 비정상적으로 발현되는 세포 표면 단백질에 대한 자연 향성을 갖는다. 지금까지, AdV, 폭스바이러스, 콕사키바이러스, 폴리오바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 레오바이러스 및 다른 것들은 초기-상 임상 시험으로 들어갔다. 2015년에, FDA 및 EMA는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)에 대한 유전자로 무장된 종양용해 포진 바이러스인 탈리모겐 라허파렙벡 (T-VEC, 임리직(Imlygic)™)을 승인하였다. 종양용해 바이러스의 자기-영구화 성질은 이들을 본 개시내용의 코딩된 아피머 유전자 전달을 위한 매력적인 플랫폼으로 만드는데, 이는 트랜스진 생성물이 바이러스 복제와 함께 증폭될 수 있고, 그에 의해 치료 효과를 최대화하기 때문이다. 문헌 [Liu et al. 2008 "Oncolytic adenoviruses for cancer gene therapy" Methods Mol Biol. 433:243-58].
거대 융합 단백질인, 즉 단일 아피머 도메인 너머에 다른 단백질 도메인을 포함하는 아피머 작용제의 경우, 국부 종양내 발현은 문제일 수 있는 경우 고형 종양에서 저조한 침투를 극복하기 위한 매력적인 전략을 제시할 수 있다. 문헌 [Beckman et al. (2007) "Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors" Cancer 109(2):170-9; 및 Dronca et al. 2015 "Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer, the better" Clin Cancer Res. 21(5):944-6]. 마찬가지로, 코딩된 아피머 구축물의 종양내 전달 및 동반되는 아피머 작용제의 국부 발현은, 그렇지 않다면 아피머 작용제가 전신으로 전달되는 (또는 발현되는) 경우 용량-제한 독성이 효능을 위한 유효한 종양내 농도에 도달하는 것을 방지할 수 있는 보다 양호한 치료 지수를 생성할 수 있다.
본 개시내용의 PD-L1 아피머 작용제의 경우에, 이들 아피머의 면역조정 성질은 종양용해 바이러스의 사용에 매우 적절하다. 사실, 종양용해 바이러스 요법을 위해, 면역 체크포인트 억제제 네트워크를 무효화하고, 그에 의해 암 내의 전-염증성 환경을 생성하는 것이 바람직하다. 종양용해 바이러스 및 통상적인 면역조정 mAb 투여의 조합을 평가하기 위한 다수의 임상 시험이 현재 진행중이다. 문헌 [Kaufman et al. 2015 "Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs" Nat Rev Drug Discov. 14(9):642-62; 및 Lichty et al. 2014 "Going viral with cancer immunotherapy" Nat Rev Cancer. 14(8):559-67]. 그러나, 체크포인트-차단 mAb를 사용한 전신 치료는 또한 대상 PD-L1 아피머 작용제의 일부 실시양태에 대한 문제일 수 있는 심각한 면역-관련 유해 효과를 유도할 수 있으며, 이는 예를 들어 코딩된 아피머-무장된 종양용해 바이러스를 통한 국부 요법에 대한 기회를 강조한다. 상이한 연구는 이 접근법을 추구하였으며, 대상 코딩된 아피머와 함께 사용하기 위해 용이하게 적합화될 수 있다. 디아스(Dias) 등은 복제-결핍 및 -적격 종양용해 AdV를 항-인간 CTLA-4 mAb로 무장하였다. 문헌 [Dias et al. 2012 "Targeted cancer immunotherapy with oncolytic adenovirus coding for a fully human monoclonal antibody specific for CTLA-4" Gene Ther. 19(10):988-98]. 최근 기재된 (및 본 개시내용의 코딩된 아피머와 함께 사용하기 위해 적합화될 수 있는) 또 다른 시스템은 항-뮤린 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) Fab, scFv 또는 전장 mAb를 갖는 무장된 종양용해 백시니아 바이러스를 포함하였다. 바이러스 복제를 반영하여, 종양에서의 mAb 수준은 종양 모델에 따라 9 또는 30 μg/ml로의 종양내 주사 후 3-5일에 피크가 되었다. 혈청 mAb 수준은 비록 3배 이상 더 낮지만 동일한 경향을 따랐으며, mAb 검출은 5일 후에 소실되었다. 종양내로 발현된 mAb는 항-PD-1 mAb 단백질의 종양내 주사에 비해 더 길게 지속되었으며, 추적은 주사 후 11일에 제한되었다. Fab 및 scFv 발현은 보고되지 않았다. 항-PD-1 scFv 또는 mAb 중 어느 하나로 무장된 바이러스의 항종양 반응은 비무장된 바이러스보다 우수하며, 비무장된 바이러스 및 전신 항-PD-1 mAb 단백질 주사의 조합만큼 유효하였다. 문헌 [Kleinpeter et al. 2016 "Vectorization in an oncolytic vaccinia virus of an antibody, a Fab and a scFv against programmed cell death-1 (PD-1) allows their intratumoral delivery and an improved tumor-growth inhibition" Oncoimmunology. 5(10):e1220467] (온라인). 또한 최근, 항-PD-L1 미니-항체 (scFv CH2-CH3 융합 단백질)로 무장된, 종양용해 AdV 및 헬퍼-의존성 AdV의 조합의 종양내 투여는 마우스에서 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법의 항종양 효과를 개선시켰다. 국부적으로 생산된 항-PD-L1 미니-항체의 이익은 항-PD-L1 IgG 주입 플러스 CAR T-세포 및 비무장된 AdV의 공-투여에 의해 달성될 수 없었다. 문헌 [Tanoue et al. 2017 "Armed oncolytic adenovirus expressing PD-L1 mini-body enhances anti-tumor effects of chimeric antigen receptor T-cells in solid tumors" Cancer Res. 77(8):2040-51]. 특히 CAR-T 세포 요법과의 조합에서 그 시스템의 사용은 또한 코딩된 아피머를 표적 종양에 전달하는데 사용하기 위해 고려된다.
다른 바이러스 벡터가 본 개시내용에서 유전자 전달 시스템으로 사용될 수 있다. 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy, 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest., 104(11):R55-62(1999)), 단순 포진 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:1411-1415(1995)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 레오바이러스, 홍역 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 폴리오바이러스로부터 유래된 벡터는 세포 내로 관심 유전자를 전달하기 위한 본 전달 시스템에 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 대해 여러 매력적인 특색을 제공한다. 또한, B형 간염 바이러스가 포함된다.
b. 비-바이러스 벡터
1990년에, 울프(Wolff) 등은 마우스의 골격근 내로의 네이키드 플라스미드 DNA (pDNA)의 주사가 어떻게 DNA-기재 치료제의 분야에 시동을 거는 코딩된 단백질의 국소 발현을 초래하였는 지를 보였다. 문헌 [Wolff et al. 1990 "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo" Science. 247(4949 Pt 1):1465-8]을 참조한다. 본 개시내용의 코딩된 아피머를 전달하기 위한 "pDNA"의 사용은 생물학적 벡터로서 바이러스에 대한 필요를 면제하며, 코딩된 아피머 유전자 전달을 위한 매력적인 플랫폼을 제시한다. 바이러스 벡터와 비교하여, pDNA는 저-면역원성 (예를 들어 반복된 투여를 허용함)인 것으로 간주되고, 제조, 수송 및 저장하기에 보다 저렴하며, 훨씬 더 긴 저장-수명을 갖는다. 핵에 진입 후, pDNA는 비-복제 비-통합 에피솜 상태로 남아 있으며, 유사분열에서 핵 외피의 파괴 동안 소실된다. pDNA는 바이러스 벡터에 비해 트랜스진의 크기에 관한 한정된 제한을 갖지 않고, 그의 모듈 성질은 간단한 분자 클로닝을 허용하며, 이는 이들을 치료 용도를 위해 조작하고 설계하기에 용이하게 만든다. 문헌 [Hardee et al. 2017 "Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy" Genes. 8(2):65]. 플라스미드는 진행중인 또는 완료된 유전자 요법 임상 시험의 약 17%에 사용되며, 내약성이 우수하고 안전한 것으로 나타났다.
DNA 투여의 방법은 트랜스진 발현에 크게 영향을 미칠 수 있다. 생체내 DNA-매개 코딩된 아피머 유전자 전달은 항체 유전자 전달에 사용되는 형질감염의 이러한 물리적 방법, 예컨대 전기천공 또는 유체역학 주사를 이용할 수 있다. 전기천공은 조직 내의 전기장의 전파를 제공하며, 이는 세포 막 투과성의 일시적 증가를 유도한다. DNA의 전기전달은 (i) 형질 막을 향한 DNA의 전기영동적 이동, (ii) DNA 축적 및 형질 막과의 상호작용, 및 (iii) 유전자 발현이 시작된 후에, 핵으로의 DNA의 세포내 트래픽킹을 포함하는 다단계 과정이다. 문헌 [Heller LC. 2015 "Gene electrotransfer clinical trials" Adv Genet. 89:235-62]. 근육내, 종양내 및 피내 투여는 임상 시험에서 평가되었으며, 또한 코딩된 아피머 구축물의 전기천공을 위한 적합한 표적 조직이다.
유체역학-기반 형질감염은 DNA 분자를 혈액 순환으로부터 및 조직 내로 유도하는, 고 부피의 pDNA의 정맥내 주사를 이용한다. 다른 잠재적으로 덜 침습성인 물리적 전달 방법은 초음파천공 및 마그네토펙션을 포함한다. DNA 흡수는 또한 분자를 화학적 전달 비히클 (예를 들어 양이온성 지질 또는 중합체 및 지질 나노입자)과 복합체화함으로써 개선될 수 있다. 이러한 기술은 또한 생체내 DNA-매개 코딩된 아피머 유전자 전달에 적용될 수 있다.
전달 방법의 선택 외에도, 코딩된 아피머 트랜스진 발현은 pDNA 구축물의 구성을 변형시킴으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hardee et al. 2017 "Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy" Genes 8(2):65; 및 Simcikova et al. 2015 "Towards effective non-viral gene delivery vector" Biotechnol Genet Eng Rev. 31(1-2):82-107]을 참조한다. 통상적인 pDNA는 전사 단위 및 박테리아 백본으로 이루어진다. 전사 단위는 코딩된 아피머 서열을 조절 요소와 함께 운반한다. 박테리아 백본은 항생제 내성 유전자, 복제 기점, 비메틸화 CpG 모티프, 및 잠재적으로 잠재 발현 신호와 같은 요소를 포함한다. 이들 서열의 일부는 플라스미드 DNA의 제조에 요구된다. 그러나, 일반적으로, 치료 코딩된 아피머 유전자 요법을 위해, 박테리아 백본의 존재는 반생산적일 가능성이 있을 것이다. 그러나, 항체 유전자 전달에 이미 사용되었고, 코딩된 아피머 유전자 전달을 위해 용이하게 조정될 수 있는 미니서클 DNA (mcDNA)를 비롯한 선택될 수 있는 다양한 상이한 유형의 이용가능한 최소 벡터가 있다. 미니서클은 재조합, 제한 및/또는 정제의 과정을 통해 생성된, 박테리아 서열이 없는 플라스미드 분자이다. [Simcikova et al. 2015, 상기 문헌]. 박테리아 백본의 제거는 보다 높은 형질감염 효율성 및 다양한 조직에서의 연장된 트랜스진 발현을 나타내었다.
또한, 전기천공을 통해 대상체에게 효율적으로 전달될 수 있고, 그 안에 포함된 코딩된 아피머 서열을 발현할 수 있는 선형 핵산 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 본원에 제공된다. LEC는 임의의 포스페이트 백본이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 코딩된 아피머 코딩 서열의 발현은 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
플라스미드 벡터
일부 실시양태에서, 대상 코딩된 아피머 구축물은 플라스미드 벡터로서 전달된다. 플라스미드 벡터는 관련 기술분야에 광범위하게 기재되었고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 상기 인용된 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다. 지난 몇 년간, 플라스미드 벡터는 항원-코딩 유전자를 생체내 세포로 전달하기 위한 DNA 백신으로서 사용되었다. 이들은 이들이 다른 벡터에 비해 안전성 문제를 감소시켰기 때문에 이에 특히 유리하다. 그러나, 숙주 세포와 상용성인 프로모터를 갖는 이들 플라스미드는 플라스미드 내의 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 에피토프를 발현할 수 있다. 다른 플라스미드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 추가적으로, 플라스미드는 DNA의 특정 단편을 제거 및 부가하기 위해 제한 효소 및 라이게이션 반응을 사용하여 맞춤 설계될 수 있다. 플라스미드는 다양한 비경구, 점막 및 국소 경로에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, DNA 플라스미드는 근육내, 피내, 피하 또는 다른 경로에 의해 주사될 수 있다. 그것은 또한 비강내 스프레이 또는 점적제, 직장 좌제에 의해 및 경구로 투여될 수 있다. 그것은 또한 유전자-총을 사용하여 표피 또는 점막 표면 내로 투여될 수 있다. 플라스미드는 수용액 중에서, 금 입자 상에 건조된 채로, 또는 리포솜, 덴드리머, 코클리에이트 및 마이크로캡슐화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 또 다른 DNA 전달 시스템과 회합되어 제공될 수 있다.
생체내에서 코딩된 아피머 구축물을 조직에 전달하기 위해 플라스미드 DNA를 사용하는 것의 적용 및 효율성을 확장시키기 위해, 상이한 접근법이 선행 기술 보고에서 보다 높은 mAb 발현 또는 전체적 효능을 생성하는 원리에 기초하여 추구되었다. 첫번째 전략은 간단히 다중 또는 반복된 pDNA 용량을 제공하는 것에 의존한다. 문헌 [Kitaguchi et al. 2005 "Immune deficiency enhances expression of recombinant human antibody in mice after nonviral in vivo gene transfer" Int J Mol Med 16(4):683-8; 및 Yamazaki et al. 2011 "Passive immune-prophylaxis against influenza virus infection by the expression of neutralizing anti-hemagglutinin monoclonal antibodies from plasmids" Jpn J Infect Dis. 64(1):40-9]. 또 다른 접근법은 전달 아주반트의 용도에 관한 것이다. pDNA 전기전달은 근육을 히알루론산을 일시적으로 파괴하여, 세포외 매트릭스의 점도를 감소시키고, DNA 확산을 용이하게 하는 효소인 히알루로니다제로 사전-처리함으로써 향상될 수 있다. 문헌 [Yamazaki et al. 2011, 상기 문헌; 및 McMahon et al. 2001 "Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: increased expression with reduced muscle damage" Gene Ther. 8(16):1264-70]. 항체 유전자 전달을 위해, 이는 30 μg pDNA로 3.5 μg/ml의 혈장 피크 역가를 달성하는 대략 3.5배의 mAb 발현의 증가를 유도하였으며, 코딩된 아피머 유전자 전달을 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적합화될 수 있을 것이다. 추가의 또 다른 전략은 항체 또는 카세트 조작에 초점을 맞춘다. 코돈-, RNA- 및 리더 서열-최적화 후, 피크 혈청 mAb 또는 Fab 역가는 '최적화된' pDNA의 근육내 전기전달로 달성되었다. 예를 들어, 문헌 [Flingai et al. 2015 "Protection against dengue disease by synthetic nucleic acid antibody prophylaxis/immunotherapy" Sci Rep. 5:12616]을 참조한다.
플라스미드의 목적은 세포 또는 조직에서 치료 아피머 작용제로 핵산 서열의 효율적인 전달 및 그의 발현이다. 특히, 플라스미드의 목적은 높은 카피수를 달성하고, 플라스미드 불안정성의 잠재적 원인을 회피하고, 플라스미드 선택을 위한 수단을 제공하는 것일 수 있다. 발현에 대해, 핵산 카세트는 카세트 내의 코딩된 아피머의 발현을 위한 필요한 요소를 함유한다. 발현은 플라스미드로의 삽입된 유전자, 핵산 서열 또는 핵산 카세트의 효율적인 전사를 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 플라스미드는 아피머 작용제에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 코딩된 아피머 구축물의 발현을 위해 제공되며; 또한 전사 단위로 지칭된다. 플라스미드가 에피토프 발현에 적합한 환경에 정치되는 경우, 전사 단위는 아피머 작용제 및 구축물에서 코딩되는 다른 어떤 것을 발현할 것이다. 전사 단위는 세포 면역 반응 요소 코딩 서열과 전사적으로 연결된 전사 제어 서열을 포함한다. 전사 제어 서열은 프로모터/인핸서 서열, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터/인핸서 서열을 포함한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인간 환자 세포를 비롯한 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 다양한 다른 프로모터 서열이 공지되어 있음과, 본원에 개시된 구축물에 유사하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 아피머 작용제의 발현의 수준은 연관된 프로모터 및 연관된 인핸서 요소의 존재 및 활성화에 좌우될 것이다.
일부 실시양태에서, 코딩된 아피머 서열 (목적하는 아피머 작용제를 코딩함)은 전사, 번역, RNA 안정성 및 복제를 위한 조절 요소 (즉, 전사 제어 서열을 포함함)를 함유하는 발현 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 발현 플라스미드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 통상의 기술자는 생체내에서 재조합 아피머 작용제를 제조하기 위한 적절한 발현 구축물을 설계할 수 있을 것이다.
미니서클
미니서클 (mcDNA)-기반 항체 유전자 전달은 또한 생체내에서 코딩된 아피머를 조직에 전달하기 위해 조정될 수 있다. 특정 상황 하에서, 비-바이러스 유전자 전달에 사용되는 플라스미드 DNA는 비허용가능한 염증 반응을 유발할 수 있다. 이것이 일어나는 경우, 면역독성 반응은 플라스미드 DNA의 박테리아 번식 후 플라스미드 상의 비메틸화된 CpG 모티프 및 그의 연관된 조절 서열의 존재에 크게 기인한다. 시험관내에서 DNA의 간단한 메틸화는 염증 반응을 감소시키기에 충분할 수 있지만, 감소된 유전자 발현을 초래할 수 있다. 클로닝 제거에 의한 CpG 섬의 제거, 또는 비-필수 서열의 제거는 염증 반응을 감소시키기 위한 성공적인 기술이었다. 문헌 [Yew et al. 2000 "Reduced inflammatory response to plasmid DNA vectors by elimination and inhibition of immunostimulatory CpG motifs" Mol Ther 1(3), 255-62].
박테리아 DNA는 포유동물 DNA보다 평균 4배 더 많은 CpG 섬을 함유하기 때문에, 우수한 해결책은 박테리아 제어 영역, 예컨대 복제 기점 및 항생제 내성 유전자를 플라스미드 제조 동안 유전자 전달 벡터로부터 제거하는 것이다. 따라서, "모" 플라스미드는 일반적으로 전달되는 유전자 (이 경우, 코딩된 아피머 코딩 서열) 및 그의 발현에 적합한 제어 영역을 포함하는 "미니서클", 및 일반적으로 모 플라스미드의 나머지를 포함하는 미니플라스미드로 재조합된다.
박테리아 서열의 제거는 단지 유전자 발현 요소로 이루어진 슈퍼코일화된 DNA 미니서클을 적절한 --바람직하게는 포유동물-- 제어 영역 하에서 생성하면서, 최소의 가능한 절제 부위를 사용하여 효율적일 필요가 있다. 미니서클 제조를 위한 일부 기술은 박테리아 파지 람다 (λ) 인테그라제 매개 재조합을 사용하여 미니서클 DNA를 제조한다. 예를 들어, 문헌 [Darquet, et al. 1997 Gene Ther 4(12): 1341-9; Darquet et al. 1999 Gene Ther 6(2): 209-18; 및 Kreiss, et al. 1998 Appl Micbiol Biotechnol 49(5):560-7)]을 참조한다.
따라서, 본원에 기재된 핵산 구축물의 실시양태는 미니서클 DNA의 형태로 프로세싱될 수 있다. 미니서클 DNA는 모든 원핵생물 벡터 부분으로부터 유리된 작은 (2 내지 4 kb) 원형 플라스미드 유도체에 관한 것이다. 미니서클 DNA 벡터는 박테리아 DNA 서열을 함유하지 않기 때문에, 이들은 외래물로서 인지되고 파괴될 가능성이 적다. 그 결과, 이들 벡터는 특정 통상적인 플라스미드에 비해 보다 긴 기간 동안 발현될 수 있다. 미니서클의 보다 작은 크기는 또한 그의 클로닝 용량을 확장시키고, 세포 내로의 그의 전달을 용이하게 한다. 미니서클 DNA를 제조하기 위한 키트는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수가능하다 (시스템 바이오사이언시스, 인크.(System Biosciences, Inc.), 미국 캘리포니아주 팔로 알토). 미니서클 DNA에 대한 정보는 문헌 [Dietz et al., Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy (2013); 21 8, 1526-1535 및 Hou et al., Molecular Therapy―Methods & Clinical Development, Article number: 14062 (2015) doi:10.1038/mtm.2014.62]에서 제공된다. 미니서클에 대한 보다 많은 정보는 문헌 [Chen Z Y, He C Y, Ehrhardt A, Kay M A. Mol Ther. 2003 September; 8(3):495-500]에서 제공되고, 미니서클 DNA 벡터는 활성 염색질 및 전사 수준에 의해 반영되는 지속된 발현을 달성한다. 문헌 [Gracey Maniar L E, Maniar J M, Chen Z Y, Lu J, Fire A Z, Kay M A. Mol Ther. 2013 January; 21(1):131-8].
비제한적 예로서, 미니서클 DNA 벡터는 하기와 같이 제조될 수 있다. 코딩된 아피머 코딩 서열을 그의 발현을 위한 조절 요소와 함께 포함하는 발현 카세트를 레콤비나제에 대한 부착 부위에 의해 플랭킹한다. 레콤비나제를 코딩하는 서열은 발현 카세트의 외부에 위치하며, 유도성 발현을 위한 요소 (예컨대, 예를 들어, 유도성 프로모터)를 포함한다. 레콤비나제 발현의 유도 시, 벡터 DNA는 재조합되어, 2개의 별개의 원형 DNA 분자를 생성한다. 원형 DNA 분자 중 하나는 상대적으로 작고, 코딩된 아피머에 대한 발현 카세트를 포함하는 미니서클을 형성하며; 이 미니서클 DNA 벡터는 임의의 박테리아 DNA 서열이 없다. 제2 원형 DNA 서열은 박테리아 서열 및 레콤비나제를 코딩하는 서열을 비롯한 나머지 벡터 서열을 함유한다. 그 후, 코딩된 아피머 서열을 함유하는 미니서클 DNA는 개별적으로 단리되고 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미니서클 DNA 벡터는 pBAD.Φ.C31.hFIX 및 pBAD.Φ.C31.RHB와 유사한 플라스미드를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Chen et al. (2003) Mol. Ther. 8:495-500]을 참조한다.
미니서클 DNA 벡터를 생성하는데 사용될 수 있는 예시적인 레콤비나제는 스트렙토미세스 박테리오파지 Φ31 인테그라제, Cre 레콤비나제, 및 λ 인테그라제/DNA 토포이소머라제 IV 복합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 레콤비나제 각각은 별개의 부위 사이의 재조합을 촉매한다. 예를 들어, Φ31 인테그라제는 상응하는 attP 및 attB 부위 사이의 재조합을 촉매하고, Cre 레콤비나제는 loxP 부위 사이의 재조합을 촉매하고, λ 인테그라제/DNA 토포이소머라제 IV 복합체는 박테리오파지 λ attP 및 attB 부위 사이의 재조합을 촉매한다. 예를 들어, 단백질이 Φ31 인테그라제를 갖는 또는 λ의 부재 하에서 λ 인테그라제를 갖는 것과 같은 일부 실시양태에서, 레콤비나제는 원형 생성물의 고유한 집단 및 따라서 높은 수율을 생성하는 비가역적 반응을 매개한다. 예를 들어, 단백질이 Cre 레콤비나제를 갖는 또는 λ의 존재 하에서 λ 인테그라제를 갖는 것과 같은 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 원형 생성물의 혼합물 및 따라서 보다 낮은 수율을 생성하는 가역적 반응을 매개한다. Cre 레콤비나제에 의한 가역적 반응은 돌연변이체 loxP71 및 loxP66 부위를 사용함으로써 조작될 수 있으며, 이는 미니서클 분자 상의 기능적으로 손상된 P71/66 부위 및 미니서클 분자 상의 야생형 loxP 부위를 생성하고, 그에 의해 미니서클 DNA 생성물의 제조를 향한 평형을 이동시키는 높은 효율성과 조합한다.
공개된 US 출원 20170342424는 또한 재조합 부위에서 재조합을 유발하고, 그에 의해 (i) 코딩된 아피머 서열을 포함하는 미니서클 및 (ii) 모 플라스미드의 나머지를 포함하는 미니플라스미드를 형성하는 효소에 노출된 모 플라스미드를 사용하는 시스템을 기재하고 있다. 한 재조합 부위는 효소와의 그의 반응이 야생형 부위보다 덜 효율적이도록 5' 말단에서 변형되고, 다른 재조합 부위는 효소와의 그의 반응의 야생형 부위보다 덜 효율적이도록 3' 말단에서 변형되고, 다른 재조합 부위는 효소와의 그의 반응이 야생형 부위보다 덜 효율적이도록 3' 말단에서 변형되며, 둘 다의 변형된 부위는 재조합 후 미니서클에 위치한다. 이는 미니서클의 형성을 선호한다.
c. RNA-매개 코딩된 아피머 유전자 전달
본 개시내용의 코딩된 PD-L1 아피머 작용제에 대한 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA, β-D-리보 배위를 갖는 LNA, a-L-리보 배위를 갖는 a-LNA (LNA의 부분입체이성질체), 2'-아미노 관능화를 갖는 2'-아미노-LNA, 및 2'-아미노 관능화를 갖는 2'-아미노-a-LNA를 포함함), 에틸렌 핵산 (ENA), 시클로헥세닐 핵산 (CeNA) 또는 이들의 하이브리드 또는 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
mRNA는 본 개시내용의 코딩된 아피머 구축물의 전달을 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 조정될 수 있는 항체 유전자 전달을 위한 신생 플랫폼을 제시한다. 현재의 결과는 상당히 상이하지만, 특정 예에서, mRNA 구축물은 생성된 혈청 mAb 역가의 관점에서 바이러스 벡터를 경쟁할 수 있는 것으로 보인다. 수준은 DNA에 비해 속도에서 현저한 이동인 mRNA 투여 후 수 시간 내의 치료상 적절한 범위에 있었다. DNA에 전형적으로 요구되는 물리적 방법이라기 보다는, mRNA 형질감염을 위한 지질 나노입자 (LNP)의 사용은 일부 실시양태에서 적용 범위에 대한 상당한 이점을 제공할 수 있다.
그의 1990년 연구에서, 울프(Wolff) 등 (1990, 상기 문헌)은 pDNA 외에도, 시험관내에서 전사된 (IVT) mRNA의 근육내 주사가 또한 코딩된 단백질의 국부 발현을 유도하였음을 밝혀내었다. mRNA는 그의 낮은 안정성 때문에 그 때 DNA만큼 활발하게 추구되지 않았다. 지난 수 년에 걸친 진보는 mRNA가 유전자 전달을 위한 도구로서 DNA 및 바이러스 벡터를 따라잡는 것을 허용하였다. 문헌 [Sahin et al. (2014) "mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs" Nat Rev Drug Discov. 13(10):759-80]에서 검토된다. 개념적으로, 이들 발현 플랫폼과는 몇몇 차이점이 있다. mRNA는 기능성이 되기 위해 핵 내로 진입할 필요가 없다. 이것이 세포질에 도달하면, mRNA는 즉시 번역된다. mRNA-기재 치료제는 DNA- 또는 바이러스 벡터-매개 유전자 전달에 비해 보다 일시적으로 발현되며, 숙주 게놈에서 삽입 돌연변이유발의 위험성을 제기하지 않는다. mRNA 제조는 상대적으로 간단하며 저렴하다. 투여의 관점에서, mRNA 흡수는 전기천공을 사용하여 증진될 수 있다. 문헌 [Broderick et al. 2017 "Enhanced delivery of DNA or RNA vaccines by electroporation" Methods Mol Biol. 2017;1499:193-200]. 그러나, 대부분의 초점은 비-물리적 형질감염 방법으로 나아갔다. 실제로, 지질 나노입자 (LNP)를 포함한 다양한 mRNA 복합체화 제제가 개발되었으며, 이는 다양한 조직에서의 i.v. 투여를 위한 안전하고 매우 효율적인 mRNA 담체인 것으로 입증되었다 (문헌 [Pardi et al. 2015 "Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes" J Control Release 217:345-51]). 이 진보에 따라, IVT mRNA는 임상 평가의 단계에 도달하였다.
바이서트(Beissert) 등의 WO2017162266 "다목적 및 효율적 유전자 발현을 위한 RNA 레플리콘"은 본 개시내용의 아피머의 효율적인 발현에 적합한, 예컨대 종양의 예방 및 요법을 위한 면역요법 치료에 적합한 작용제 및 방법을 기재하고 있다. 예를 들어, 아피머 작용제 코딩 서열은, 예컨대 알파바이러스 5' 복제 인식 서열로부터의 5' 복제 인식 서열을 포함하는 RNA 레플리콘으로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 레플리콘은, 예컨대 5' 복제 인식 서열 및 오픈 리딩 프레임이 중첩되지 않는, 예를 들어 5' 복제 인식 서열이 기능적 개시 코돈을 함유하지 않고, 일부 실시양태에서는 임의의 개시 코돈을 함유하지 않는, (변형된) 5' 복제 인식 서열, 및 특히 5' 복제 인식 서열로부터 하류에 위치한, 아피머 작용제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 가장 바람직하게는, 아피머 작용제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의의 개시 코돈은 RNA 레플리콘의 5'→ 3' 방향에 있다.
일부 실시양태에서, 면역 활성화를 방지하기 위해, 변형된 뉴클레오시드는 시험관내에서-전사된 mRNA 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, IVT RNA는 5' 캡핑될 수 있고, 예컨대 m7G5'ppp5'G2'-O-Met-캡핑된 IVT이다. 변형된 mRNA의 효율적인 번역은 이중-가닥 RNA를 제거함으로써 보장될 수 있다. 또한, 5' 및 3' UTR 및 폴리 (A) 테일은 개선된 세포내 안정성 및 번역 효율을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817 및 Kariko et al. WO/2017/036889 "Method for Reducing Immunogenicity of RNA"]을 참조한다.
일부 실시양태에서, PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는 mRNA는 본원에 기재된 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 화학적 변형은 1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신 또는 1-메틸슈도우리딘 및 5-메틸시토신일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단지 시험관내 전사 (IVT) 효소적 합성 방법을 사용하여 제조되는 본 개시내용의 1종 이상의 PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는 선형 폴리뉴클레오티드는 "IVT 폴리뉴클레오티드"로 지칭된다. IVT 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, PCT 출원 WO2013/151666에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 크기 및/또는 화학적 변형 패턴, 화학적 변형 위치, 화학적 변형 퍼센트 또는 화학적 변형 집단이 상이한 부분 또는 영역을 가지며, 상기의 조합은 "키메라 폴리뉴클레오티드"로 공지되어 있다. 본 개시내용에 따른 "키메라"는 2개 이상의 부조화되거나 이종의 부분 또는 영역을 갖는 개체이다. 본원에 사용된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 "부분" 또는 "영역"은 폴리뉴클레오티드의 전체 길이 미만인 폴리뉴클레오티드의 임의의 부분으로 정의된다. 이러한 구축물은 예를 들어 PCT 출원 WO2015/034928에 교시되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 원형인 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 "원형 폴리뉴클레오티드" 또는 "circP"로 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "원형 폴리뉴클레오티드" 또는 "circP"는 RNA와 실질적으로 같고, 그의 특성을 갖는 단일 가닥 원형 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "원형"은 또한 circP의 임의의 2차 또는 3차 배위를 포괄하는 것으로 의미된다. 이러한 구축물은 예를 들어 PCT 출원 WO2015/034925 및 WO2015/034928에 교시되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는데 사용될 수 있는 예시적인 mRNA (및 다른 폴리뉴클레오티드)는 WO2015/105926 (이는 발명의 명칭이 "항체의 생체내 생산을 위한 폴리뉴클레오티드"임)과 함께, 예를 들어 PCT 공개 WO2017/049275, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2016/011226, WO2015/196128, WO/2015/196130, WO/2015/196118, WO/2015/089511의 명세서 및 도면으로부터 적합화될 수 있는 것들을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
하기 기재된 바와 같이 전기천공은 세포 내로 mRNA 또는 다른 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 하나의 예시적인 방법이다.
지질-함유 나노입자 조성물은 다양한 RNA (및 본원에 기재된 관련된 폴리뉴클레오티드)를 위한 세포 및/또는 세포내 구획 내로의 수송 비히클로서 효과적인 것으로 입증되었다. 이들 조성물은 일반적으로 1종 이상의 "양이온성" 및/또는 이온화가능한 지질, 다중불포화된 지질을 포함한 인지질, 구조적 지질 (예를 들어, 스테롤), 및 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 지질 (PEG 지질)을 포함한다. 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질은, 예를 들어 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질을 포함한다.
d. 표적 세포 내로의 코딩된 아피머 구축물의 전달
유전자 전달 시스템의 숙주 세포 내로의 도입은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다.
본 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터 구축에 기초하여 구축되는 경우, 전달은 관련 기술분야에 공지된 통상적인 감염 방법으로서 수행될 수 있다.
바이러스 및 비-바이러스 코딩된 아피머 구축물 둘 다의 전달을 증진시키는 물리적 방법은 전기천공 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 유전자 충격 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) (여기서 DNA는 (예를 들어, 금) 입자 상에 로딩되고, 세포 내로의 DNA의 침투를 달성하도록 강제됨), 초음파천공, 마그네토펙션, 유체역학 전달 등을 포함하며, 이들 모두는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
전기천공
과거 몇 년간, 단백질의 생체내 생산에 이용되는 플라스미드 DNA 전달 기술의 큰 진보가 있었다. 이는 인간 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화, mRNA 안정성 뿐만 아니라 리보솜 수준에서 보다 효율적인 번역을 개선시키기 위한 RNA 최적화, 번역 효율성을 증진시키기 위한 특이적 리더 서열의 부가, 생체내에서의 생산을 추가로 증진시키기 위한 합성 삽입물의 생성, 및 생체내 전달을 개선시키기 위한 개선된 적응성 전기천공 (EP) 전달 프로토콜의 사용을 포함하였다. EP는 DNA가 세포 내로 보다 효율적으로 통과하는 것을 허용하는 전기장을 생성함으로써 플라스미드 DNA의 전달을 보조한다. 생체내 전기천공은 많은 상이한 조직으로의 플라스미드 DNA의 효율적인 전달에 성공적으로 사용된 유전자 전달 기술이다. 문헌 [Kim et al. "Gene therapy using plasmid DNA-encoded anti-HER2 antibody for cancers that overexpress HER2" (2016) Cancer Gene Ther. 23(10): 341-347]은 혈청에서 높고 지속적인 항체 발현을 발생시키는 플라스미드의 근육내 주사 및 생체내 전기천공을 위한 벡터 및 전기천공 시스템을 교시하며; 상기 문헌의 플라스미드 및 전기천공 시스템은 본 개시내용의 코딩된 PD-L1 결합 아피머를 발현시키기 위한 플라스미드의 생체내 전달을 위해 용이하게 적합화될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 특정 일부 실시양태에서, 코딩된 아피머 구축물은 전기천공을 통해 표적 세포 내로 도입된다.
전기천공을 통한 조성물의 투여는 포유동물의 목적하는 조직에 전달되도록 구성될 수 있는 전기천공 장치, 가역적 기공이 세포 막에서 형성되도록 하는데 유효한 에너지의 펄스를 사용하여 달성될 수 있으며, 에너지의 펄스는 사용자에 의한 미리-설정된 전류 투입과 유사한 일정한 전류인 것이 바람직하다. 전기천공 장치는 전기천공 구성요소 및 전극 어셈블리 또는 취급 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 구성요소는 제어기, 전류 파형 발생기, 임피던스 시험기, 파형 로거, 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 구성요소, 전력원 및 전력 스위치를 비롯한 전기천공 장치의 다양한 요소 중 1개 이상을 포함하고 혼입시킬 수 있다. 전기천공은 플라스미드에 의한 세포의 형질감염을 용이하게 하는 생체내 전기천공 장치, 예를 들어 셀렉트라 EP 시스템 (브이지엑스 파마슈티칼스(VGX Pharmaceuticals), 펜실베니아주 블루 벨) 또는 엘겐 전기천공기 (진트로닉스(Genetronics), 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 달성될 수 있다.
전기천공 구성요소는 전기천공 장치의 한 요소로서 기능할 수 있으며, 다른 요소는 전기천공 구성요소와 통신하는 별개의 요소 (또는 구성요소)이다. 전기천공 구성요소는 전기천공 장치의 하나 초과의 요소로서 기능할 수 있으며, 이는 전기천공 구성요소와는 별개의 전기천공 장치의 추가의 다른 요소와 통신할 수 있다. 한 전기기계적 또는 기계적 장치의 부분으로서 존재하는 전기천공 장치의 요소는 요소가 한 장치로서 또는 서로 통신하는 별개의 요소로서 기능할 수 있기 때문에 제한되지 않을 수 있다. 전기천공 구성요소는 목적하는 조직에서 일정한 전류를 생성하는 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 피드백 메카니즘을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간 배열에서 복수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있으며, 여기서 전극 어셈블리는 전기천공 구성요소로부터 에너지의 펄스를 송신하고, 이를 전극을 통해 목적하는 조직에 전달한다. 복수의 전극 중 적어도 하나는 에너지의 펄스의 전달 동안 중성이고, 목적하는 조직에서 임피던스를 측정하며, 임피던스를 전기천공 구성요소에 통신한다. 피드백 메카니즘은 측정된 임피던스를 송신할 수 있으며, 전기천공 구성요소에 의해 전달된 에너지의 펄스를 일정한 전류를 유지하도록 조정할 수 있다.
복수의 전극은 에너지의 펄스를 분산된 패턴으로 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그램화된 서열 하에서 전극의 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 프로그램화된 서열은 사용자에 의해 전기천공 구성요소로 투입된다. 프로그램화된 서열은 서열에 전달된 복수의 펄스를 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 펄스의 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 1개의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되며, 복수의 펄스의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 1개의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 상이한 1개에 의해 전달된다.
피드백 메카니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다. 피드백 메카니즘은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 피드백은 50 μs, 20 μs, 10 μs 또는 1 μs마다 일어나지만, 그러나 일부 실시양태에서 실시간 피드백 또는 순간적 (즉, 반응 시간을 측정하기 위한 이용가능한 기술에 의해 측정된 바와 같이 실질적으로 순간적)이다. 중성 전극은 목적하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 피드백 메카니즘에 통신하며, 피드백 메카니즘은 임피던스에 반응하고, 에너지의 펄스를 미리-설정된 전류와 유사한 값에서 일정한 전류를 유지하도록 조정한다. 피드백 메카니즘은 일정한 전류를 에너지의 펄스의 전달 동안 연속적으로 및 순간적으로 유지할 수 있다.
본 개시내용의 코딩된 아피머 구축물의 전달을 용이하게 할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 번호 7,245,963; 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에 기재된 것들을 포함하며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 전기천공은 최소 침습성 장치를 통해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전기천공은 최소 침습성 전기천공 장치 ("MID")를 사용하여 수행된다. 장치는 중공 바늘, DNA 카세트 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 장치는 신체 조직 내로의 바늘의 삽입 동안 코딩된 아피머 핵산 구축물을 신체 조직 내로 동시에 (예를 들어, 자동적으로) 주사하도록 사용시 유체 전달 수단을 작동시키도록 조정된다. 이는 바늘이 삽입되고 있는 동안 DNA 및 연관된 유체를 점차적으로 주사하는 능력이 신체 조직을 통한 유체의 보다 고른 분포를 초래하는 이점을 갖는다. 주사 동안 경험되는 통증은 보다 큰 면적에 걸쳐 주사되는 DNA의 분포로 인해 감소될 수 있다.
MID는 바늘을 사용하지 않고 코딩된 아피머 핵산 구축물을 조직 내로 주사할 수 있다. MID는 코딩된 아피머 핵산 구축물을 핵산이 조직의 표면을 뚫고, 기저의 조직 및/또는 근육으로 진입하는 그러한 힘을 갖는 작은 스트림 또는 제트로서 주사할 수 있다. 작은 스트림 또는 제트 뒤의 힘은 1초의 몇분의 1 내에서 마이크로-오리피스를 통한 압축된 기체, 예컨대 이산화탄소의 팽창에 의해 제공될 수 있다. 최소 침습성 전기천공 장치 및 그의 사용 방법의 예는 공개된 미국 특허 출원 번호 20080234655; 미국 특허 번호 6,520,950; 미국 특허 번호 7,171,264; 미국 특허 번호 6,208,893; 미국 특허 번호 6,009,347; 미국 특허 번호 6,120,493; 미국 특허 번호 7,245,963; 미국 특허 번호 7,328,064; 및 미국 특허 번호 6,763,264에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
MID는 조직을 통증없이 뚫는 액체의 고속 제트를 생성하는 주사기를 포함할 수 있다. 이러한 무바늘 주사기는 상업적으로 입수가능하다. 본원에서 이용될 수 있는 무바늘 주사기의 예는 미국 특허 번호 3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
직접적 또는 간접적 전기수송에 적합한 형태의 목적하는 코딩된 아피머 핵산 구축물은 통상적으로 조직 내로의 핵산의 침투를 유발하기에 충분한 힘으로, 작용제의 제트의 전달을 작동시키도록 조직 표면을 주사기와 접촉시킴으로써, 무바늘 주사기를 사용하여 치료되는 조직 내로 도입될 (예를 들어, 주사될) 수 있다. 예를 들어, 치료되는 조직이 점막, 피부 또는 근육인 경우, 작용제는 작용제가 각질층을 통해 및 진피층 내로, 또는 기저의 조직 및 근육 내로 각각 침투하도록 하는 충분한 힘으로 점막 또는 피부 표면을 향해 발사된다. 무바늘 주사기는 코딩된 아피머 핵산 구축물을 종양 내로 (종양내 전달)를 비롯한 모든 유형의 조직으로 전달하는데 매우 적합하다.
MID는 조직을 전기천공하는 바늘 전극을 가질 수 있다. 예를 들어 직사각형 또는 정사각형 패턴으로 설정된 다수의 전극 어레이에서 다수의 쌍의 전극 사이에 펄싱함으로써, 한 쌍의 전극 사이에 펄싱하는 것에 비해 개선된 결과를 제공한다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "약물 및 유전자의 매개된 전달을 위한 바늘 전극"인 미국 특허 번호 5,702,359에는 복수의 쌍의 바늘이 치유적 치료 동안 펄싱될 수 있는 바늘의 어레이가 개시되어 있다. 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함되는 그 출원에서, 바늘은 원형 어레이로 배치되었지만, 바늘 전극의 대향하는 쌍 사이의 펄싱을 가능하게 하는 커넥터 및 스위칭 장치를 갖는다. 코딩된 아피머 핵산 구축물을 세포에 전달하기 위한 한 쌍의 바늘 전극이 사용될 수 있다. 이러한 장치 및 시스템은 미국 특허 번호 6,763,264에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 통상적인 주사 바늘을 닮은 단일 바늘로의 DNA의 주사 및 전기천공을 허용하며, 현재 사용되는 장치에 의해 전달되는 것들보다 더 낮은 전압의 펄스를 인가하고, 따라서 환자에 의해 경험되는 전기적 감각을 감소시키는 단일 바늘 장치가 사용될 수 있다.
MID는 1개 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 동일한 직경 또는 상이한 직경의 2개 이상의 바늘을 포함할 수 있다. 바늘은 고르게 또는 고르지 않게 떨어진 간격일 수 있다. 바늘은 0.005 인치 내지 0.03 인치, 0.01 인치 내지 0.025 인치; 또는 0.015 인치 내지 0.020 인치일 수 있다. 바늘은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 바늘은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm 이상 떨어진 간격일 수 있다.
MID는 코딩된 아피머 핵산 구축물 및 전기천공 펄스를 단일 단계로 전달하는 펄스 생성기 및 2개 이상의-바늘 백신 주사기로 이루어질 수 있다. 펄스 생성기는 플래쉬 카드 작동된 퍼스널 컴퓨터를 통한 펄스 및 주사 파라미터의 유연한 프로그램화, 뿐만 아니라 전기천공 및 환자 데이터의 포괄적 기록 및 저장을 허용할 수 있다. 펄스 생성기는 짧은 기간 동안 다양한 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 생성기는 지속기간으로 100 ms의 3개의 15 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 이러한 MID의 예는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,328,064에 기재된 이노비오 바이오메디칼 코포레이션(Inovio Biomedical Corporation)에 의한 엘겐 1000 시스템이다.
MID는 신체에서의 선택된 조직의 세포 내로 거대분자, 예컨대 코딩된 아피머 핵산 구축물의 도입을 용이하게 하는 모듈 전극 시스템인 셀렉트라 (이노비오 파마슈티칼스(Inovio Pharmaceuticals), 펜실베니아주 플리마우스 미팅) 장치 및 시스템일 수 있다. 모듈 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전력원을 포함할 수 있다. 조작자는 지지 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극을 잡고, 이들을 신체 또는 식물의 선택된 조직 내로 단단히 삽입할 수 있다. 그 후, 핵산은 피하 바늘을 통해 선택된 조직 내로 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러는 활성화되고, 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로의 핵산의 도입을 용이하게 한다. 세포의 과다가열로 인한 세포 사멸은 정전류 펄스에 의해 조직에서 전력 소실을 제한함으로써 최소화된다. 셀렉트라 장치 및 시스템은 미국 특허 번호 7,245,963에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
MID는 엘겐 1000 시스템 (이노비오 파마슈티칼스)일 수 있다. 엘겐 1000 시스템은 중공 바늘을 제공하는 장치; 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 장치는 유체, 즉, 본원에서 기재된 코딩된 아피머 핵산 구축물을 신체 조직 내로 상기 신체 조직 내로의 바늘의 삽입 동안 동시에 (예를 들어 자동적으로) 주사하도록 사용에서 유체 전달 수단을 작동시키도록 조정된다. 이점은 바늘이 삽입되고 있는 동안 점차적으로 유체를 주사하는 능력이 신체 조직을 통한 유체의 보다 고른 분포를 초래하는 것이다. 또한, 주사 동안 경험되는 통증은 보다 큰 면적에 걸쳐 주사되는 유체의 부피의 분포로 인해 감소된다.
추가로, 유체의 자동 주사는 주사되는 유체의 실제 용량의 자동 모니터링 및 등록을 용이하게 한다. 이 데이터는 목적하는 경우에 문서화 목적을 위해 제어 유닛에 의해 저장될 수 있다.
주사의 속도는 선형 또는 비-선형 중 어느 하나일 수 있으며, 주사는 바늘이 치료되는 대상체의 피부를 통해 삽입된 후 및 이들이 신체 조직 내로 추가로 삽입되는 동안 수행될 수 있음이 인지될 것이다.
유체가 본 개시내용의 장치에 의해 주사될 수 있는 적합한 조직은 단지 예로서 종양 조직, 피부 및 다른 상피 조직, 간 조직 및 근육 조직을 포함한다.
장치는 신체 조직 내로의 바늘의 삽입을 가이드하는 바늘 삽입 수단을 추가로 포함한다. 유체 주사의 속도는 바늘 삽입의 속도에 의해 제어된다. 이는 바늘 삽입 및 유체의 주사 둘 다가, 목적하는 바에 따라 삽입 속도가 주사 속도와 매칭될 수 있도록 제어될 수 있다는 이점을 갖는다. 이는 또한 장치를 사용자가 작동하기에 보다 용이하게 만든다. 목적하는 경우에, 바늘을 신체 조직 내로 자동적으로 삽입하는 수단이 제공될 수 있다.
사용자는 유체의 주사를 시작할 때를 선택할 수 있다. 그러나, 이상적으로, 주사는 바늘의 팁이 표적 조직에 도달한 경우 시작되며, 장치는 바늘이 유체의 주사가 시작되는 충분한 깊이로 삽입된 때를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이는 바늘이 목적하는 깊이 (이는 통상적으로 근육 조직이 시작하는 깊이일 것임)에 도달한 경우 유체의 주사가 자동적으로 시작되도록 촉발될 수 있음을 의미한다. 근육 조직이 시작하는 깊이는, 예를 들어 미리-설정된 바늘 삽입 깊이, 예컨대 바늘이 피부 층을 통과하기에 충분한 것으로 간주될 4 mm의 값으로 취해질 수 있다.
감지 수단은 초음파 프로브를 포함할 수 있다. 감지 수단은 임피던스 또는 저항의 변화를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이 경우, 수단은 신체 조직에서 바늘의 깊이를 그렇게 기록하지 않을 수 있지만, 오히려 바늘이 상이한 유형의 신체 조직으로부터 근육 내로 이동함에 따라 임피던스 또는 저항의 변화를 감지하도록 조정될 것이다. 이들 대안 모두는 주사가 시작될 수 있음을 감지하는 수단을 상대적으로 정확하고 간단하게 작동하는 것을 제공한다. 바늘의 삽입의 깊이는 목적하는 경우에 추가로 기록될 수 있으며, 바늘 삽입의 깊이가 기록되고 있음과 같이 주사되는 유체의 부피가 측정되도록 유체의 주사를 제어하는데 사용될 수 있다.
장치는 바늘을 지지하기 위한 베이스; 및 그 안에 베이스를 수용하는 하우징을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 베이스는 베이스가 하우징에 비해 제1 후방 위치에 있는 경우 바늘이 하우징 내에 들어가고, 베이스가 하우징 내의 제2 전방 위치에 있는 경우 바늘이 하우징으로부터 연장되도록 하우징에 비해 이동가능하다. 이는 하우징이 환자의 피부 상으로 정렬될 수 있고, 그 후 바늘이 베이스에 비해 하우징을 이동시킴으로써 환자의 피부 내로 삽입될 수 있기 때문에 사용자에게 유리하다.
상기 언급된 바와 같이, 유체가 그것이 피부 내로 삽입됨에 따라 바늘의 길이에 걸쳐 고르게 분포되도록 유체 주사의 제어된 속도를 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 유체를 제어된 속도로 주사하도록 조정된 피스톤 운전 수단을 포함할 수 있다. 피스톤 운전 수단은 예를 들어 서보 모터에 의해 활성화될 수 있다. 그러나, 피스톤 운전 수단은 하우징에 비해 축 방향으로 이동하는 베이스에 의해 작동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안적 수단이 제공될 수 있음이 인정될 것이다. 따라서, 예를 들어, 제어된 또는 비-제어된 속도로의 유체 전달을 위해 짜내질 수 있는 폐쇄된 용기가 시린지 및 피스톤 시스템 대신 제공될 수 있다.
상기 기재된 장치는 임의의 유형의 주사에 사용될 수 있다. 그러나, 이는 전기천공의 분야에 특히 유용한 것으로 상정되며, 따라서 이는 바늘에 전압을 인가하는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이는 바늘이 주사를 위해 뿐만 아니라 전기천공 동안 전극으로서 사용되는 것을 허용한다. 이는 그것이 전기장이 주사되는 유체와 동일한 면적에 인가됨을 의미하기 때문에 특히 유리하다. 전극을 이전에 주사된 유체와 정확하게 정렬하는 것이 매우 곤란하고, 따라서 사용자는 보다 큰 면적에 걸쳐 요구되는 것보다 유체의 보다 큰 부피를 주사하고, 주사된 물질 및 전기장 사이의 중첩을 보장하려는 시도로 보다 높은 면적에 걸쳐 전기장을 인가하는 경향이 있었다는 점에서, 전통적으로 전기천공으로의 문제가 있었다. 본 개시내용을 사용하여, 주사되는 유체의 부피 및 인가되는 전기장의 크기 둘 다는 전기장 및 유체 사이의 양호한 적합을 달성하면서 감소될 수 있다.
미국 특허 번호 7,245,963 (Draghia-Akli, et al.)은 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로의 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 모듈 전극 시스템 및 그의 용도를 기재하고 있다. 모듈 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전력원을 포함할 수 있다. 조작자는 지지 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극을 잡고, 이들을 신체 또는 식물의 선택된 조직 내로 단단히 삽입할 수 있다. 그 후, 생체분자는 피하 바늘을 통해 선택된 조직 내로 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러는 활성화되고, 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로의 생체분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 번호 7,245,963의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 공개 2005/0052630 (Smith, et al. 제출)은 신체 또는 식물에서의 선택된 조직의 세포 내로의 생체분자의 도입을 효과적으로 용이하게 하는데 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기재하고 있다. 전기천공 장치는 그의 작동이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 특정되는 전기-동역학 장치 ("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 파라미터의 투입에 기초한 어레이에서의 전극 사이의 일련의 프로그램가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하며, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극의 어레이, 주사 바늘을 위한 중심 주사 채널, 및 제거가능한 가이드 디스크를 갖는 대체가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개 2005/0052630의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공개 2005/0052630에 기재된 전극 어레이 및 방법은 조직, 예컨대 근육뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로의 깊은 침투를 위해 적합화될 수 있다. 전극 어레이의 배치 때문에, 주사 바늘 (선택의 생체분자를 전달하는)은 또한 표적 기관 내로 완전히 삽입되고, 주사는 전극에 의해 미리-설명된 영역에서, 표적 문제에 수직으로 투여된다. 미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공개 2005/005263에 기재된 전극은, 예를 들어 20 mm 길이 및 21 게이지이다.
생체내 전기천공의 사용은 종양 조직에서 플라스미드 DNA 흡수를 증진시켜 종양 내에서의 발현을 유도하고, 플라스미드를 근육 조직으로 전달하여 분비된 단백질, 예컨대 시토카인의 전신 발현을 유도한다 (예를 들어, US8026223 참조). 생체내에서 세포 내로 PD-L1 아피머 작용제 트랜스진을 전기천공하기 위한 추가의 예시적인 기술, 벡터 및 장치는 PCT 공개 WO/2017/106795, WO/2016/161201, WO/2016/154473, WO/2016/112359 및 WO/2014/066655를 포함한다.
전형적으로, 생체내 세포 전기천공에 필요한 전기장은 일반적으로 시험관내에서 세포에 요구되는 장에 대한 규모에 있어서 유사하다. 일부 실시양태에서, 전기장의 규모는 대략 10 V/cm 내지 약 1500 V/cm, 300 V/cm 내지 1500 V/cm, 또는 1000 V/cm 내지 1500 V/cm의 범위이다. 대안적으로, 장 강도가 보다 낮을 수록 (약 10 V/cm 내지 100 V/cm, 및 보다 바람직하게는 약 25 V/cm 내지 75 V/cm), 펄스 길이는 길다. 예를 들어, 공칭 전기장은 약 25 내지 75 V/cm인 경우, 펄스 길이는 약 10 msec인 것이 바람직하다.
펄스 길이는 약 10 s 내지 약 100 ms일 수 있다. 임의의 목적하는 수의 펄스, 전형적으로 초당 1 내지 100 펄스가 있을 수 있다. 펄스 설정 사이의 지연은 임의의 목적하는 시간, 예컨대 1초일 수 있다. 파형, 전기장 강도 및 펄스 지속기간은 또한 세포의 유형 및 전기천공을 통해 세포에 진입하게 되는 분자의 유형에 좌우될 수 있다.
또한, 전기화학적 임피던스 분광분석법 ("EIS")을 포함하는 전기천공 장치가 포함된다. 이러한 장치는 생체내, 특히 종양내 전기천공 효율에 대한 실시간 정보를 제공하며, 이는 조건의 최적화를 허용한다. EIS를 포함하는 전기천공 장치의 예는, 예를 들어 WO2016/161201에서 찾아볼 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 코딩된 아피머 핵산 구축물의 흡수는 또한 애벌란시 형질감염으로 칭해지는 플라스마 전기천공에 의해 증진될 수 있다. 간략하게, 마이크로초 방전은 전극 표면에 캐비테이션 미세버블을 생성한다. 자기장과 조합된 붕괴하는 미세버블에 의해 생성된 기계적 힘은 통상적인 전기천공과 연관된 확산 매개 수송에 비해 세포 막을 가로지르는 수송 효율성을 증가시키는 기능을 한다. 혈장 전기천공의 기술은 미국 특허 번호 7,923,251 및 8,283,171에 기재된다. 이 기술은 또한 세포의 형질전환을 위해 생체내에서 사용될 수 있다. 문헌 [Chaiberg, et al. (2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090; Chaiberg, et al. United States Patent No 8, 101 169 Issued January 24, 2012.].
다른 대안적 전기천공 기술은 또한 고려된다. 생체내 핵산 전달은 또한 콜드 플라스마를 사용하여 수행될 수 있다. 플라스마는 물질의 4가지 근본적 상태 중 하나이며, 다른 것은 고체, 액체 및 기체이다. 플라스마는 비결합된 양성 및 음성 입자의 전기적으로 중성 매질이다 (즉, 플라스마의 전체 전하는 대략 0임). 플라스마는 기체를 가열하거나, 이를 레이저 또는 마이크로웨이브 생성기로 인가된 강한 전자기장에 처하게 함으로써 생성될 수 있다. 이는 전자의 수를 감소시키거나 증가시켜, 이온으로 불리는 양전하 또는 음전하 입자를 생성하고 (Luo, et al. (1998) Phys. Plasma 5:2868-2870), 존재하는 경우에 분자 결합의 해리를 수반한다.
콜드 플라스마 (즉, 비-열 플라스마)는 적합한 전극으로의 펄스화된 고전압 신호의 전달에 의해 생성된다. 콜드 플라스마 장치는 기체 제트 장치 또는 유전체 장벽 방전 (DBD) 장치의 형태를 취할 수 있다. 콜드 온도 플라스마는 상대적으로 낮은 기체 온도에서 플라스마의 그의 제공에 의해 대단한 열광 및 흥미를 끌었다. 이러한 온도에서의 플라스마의 제공은 상처 치유, 항박테리아 과정, 다양한 다른 의학적 요법 및 멸균을 비롯한 다양한 적용에 흥미롭다. 앞서 언급된 바와 같이, 콜드 플라스마 (즉, 비-열 플라스마)는 적합한 전극으로의 펄스화된 고전압 신호의 전달에 의해 생성된다. 콜드 플라스마 장치는 기체 제트 장치, 유전체 장벽 방전 (DBD) 장치 또는 다중-주파수 조파-풍부 전력 공급기의 형태를 취할 수 있다.
유전체 장벽 방전 장치는 콜드 플라스마를 생성하기 위해 상이한 과정에 의존한다. 유전체 장벽 방전 (DBD) 장치는 유전 층에 의해 커버된 적어도 1개의 전도성 전극을 함유한다. 전기적 리턴 경로는 콜드 플라스마 처리를 겪은 표적 기질에 의해 또는 전극에 대한 내재된 그라운드를 제공함으로써 제공될 수 있는 그라운드에 의해 형성된다. 유전체 장벽 방전 장치에 대한 에너지는, 예컨대 상기 언급된 고전압 전력 공급기에 의해 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 에너지는 플라스마 방전을 형성하는 펄스화된 DC 전기 전압의 형태로 유전체 장벽 방전 장치에 투입된다. 유전 층에 의해, 방전은 전도성 전극으로부터 분리되고, 전극 에칭 및 기체 가열은 감소된다. 펄스화된 DC 전기 전압은 작동의 다양한 체제를 달성하도록 진폭 및 주파수에 있어서 다양할 수 있다. 콜드 플라스마 생성의 이러한 원리를 포함하는 임의의 장치 (예를 들어, DBD 전극 장치)는 본 개시내용의 다양한 실시양태의 범주 내에 속한다.
콜드 플라스마는 세포를 외래 핵산으로 형질감염시키는데 사용되었다. 특히, 종양 세포의 형질감염 (예를 들어, 문헌 [Connolly, et al. (2012) Human Vaccines & Immune-therapeutics 8: 1729-1733; 및 Connolly et al. (2015) Bioelectrochemistry 103: 15-21] 참조).
특정 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는 트랜스진 구축물은 어플리케이터; 어플리케이터로부터 연장되는 복수의 전극 (전극은 커버 영역과 연관됨); 전극과 전기적 통신하는 전력 공급기 (전력 공급기는 1개 이상의 전기천공 신호를 커버 영역 내의 세포에 생성하도록 구성됨); 및 전극에 결합된 가이드 부재 (가이드 부재는 전극의 커버 영역을 조정하도록 구성됨)를 포함하는 전기천공 장치를 사용하여 전달된다. 전극의 적어도 한 부분은 원추형 배열로 어플리케이터 내에 위치될 수 있다. 1개 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 연관될 수 있다. 장치는 전력 공급기 및 전극에 결합된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 전기장을 실질적으로 미리 결정된 범위 내에서 유지하도록 구성될 수 있다.
1개 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 연관될 수 있다. 장치는 전력 공급기 및 전극에 결합된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 커버 영역 내의 세포에서 영구적 손상을 실질적으로 방지하고/거나 통증을 실질적으로 최소화하도록 전기장을 미리 결정된 범위 내에서 유지하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 전위차계는 전기장을 약 1300 V/cm으로 유지하도록 구성될 수 있다.
전력 공급기는 제1 전기 신호를 제1 전극에 및 제2 전기 신호를 제2 전극에 제공할 수 있다. 제1 및 제2 전기 신호는 조합되어 진동 주파수를 갖는 파를 생성할 수 있다. 제1 및 제2 전기 신호는 각각 단일극성 파형 및 이중극성 파형 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 제1 전기 신호는 제1 주파수 및 제1 진폭을 가질 수 있다. 제2 전기 신호는 제2 주파수 및 제2 진폭을 가질 수 있다. 제1 주파수는 제2 주파수와 상이하거나 동일할 수 있다. 제1 진폭은 제2 진폭과 상이하거나 동일할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양에 PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는 플라스미드의 유효 용량을 주사하고; 종양에 전기천공 요법을 투여하는 것을 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전기천공 요법은 약 100 마이크로초 내지 약 20 밀리초의 펄스 폭에 걸쳐 약 200 V/cm 내지 약 1500 V/cm의 적어도 하나의 전압 펄스의 투여를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 플라스미드 (또는 제2 전기천공된 플라스미드)는, 예컨대 IL-12, IL-15, 및 IL-12와 IL-15의 조합을 코딩하는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 면역자극 시토카인을 추가로 코딩한다.
형질감염 증진 제제
코딩된 아피머 핵산 구축물은 또한 리포솜, 바람직하게는 양이온성 리포솜 (Wong, T. K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)) 또는 폴리머솜 (합성 리포솜) 내에 캡슐화될 수 있으며, 이는 세포 막과 상호작용하여 융합하거나 세포내이입을 겪어 세포 내로의 핵산 전달을 수행할 수 있다. DNA는 또한 그의 로드를 세포의 세포질 내로 직접적으로 방출할 수 있는 중합체와의 (폴리플렉스) 또는 덴드리머와의 복합체로 형성될 수 있다.
이와 관련하여 유용한 예시적인 담체는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스, 덱스트란 등의 마이크로입자를 포함한다. 다른 예시적인 담체는 비-액체 친수성 코어 (예를 들어, 가교된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드) 및 임의로, 친양쪽성 화합물, 예컨대 인지질을 포함하는 외부 층을 포함하는 초분자 생체벡터를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,151,254 및 PCT 출원 WO 94/20078, WO/94/23701 및 WO 96/06638 참조). 지속 방출 제제 내에 함유되는 활성제의 양은 이식의 부위, 방출의 속도 및 예상되는 지속기간 및 치료되거나 예방되는 상태의 성질에 좌우된다.
생분해성 마이크로구체 (예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)는 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로구체는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344, 5,407,609 및 5,942,252에 개시되어 있다. 예컨대 WO/99 40934 및 그에 인용된 참고문헌에 기재된 변형된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템은 또한 많은 적용에 유용할 것이다. 또 다른 예시적인 담체/전달 시스템은 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체, 예컨대 미국 특허 번호 5,928,647에 기재된 것들을 사용하며, 이는 PD-L1 아피머에 대한 코딩 서열을 종양내로 전달하는데 사용되는 경우 추가의 이익을 가질 수 있다.
생분해성 중합체 나노입자는 세포 내로의 비-바이러스 핵산 전달을 용이하게 한다. 작은 (대략 200 nm), 양으로 하전된 (대략 10 mV) 입자는 양이온성, 가수분해적으로 분해가능한 폴리(베타-아미노 에스테르) 및 플라스미드 DNA의 자기-조립에 의해 형성된다.
폴리뉴클레오티드는 또한 직접 미세주사, 일시적 세포 투과화 (예를 들어, 세포 투과화제와 리프레서 및/또는 활성화제의 공-투여), 막 전위 펩티드에의 융합 등에 의해 세포에 투여될 수 있다.
시험관내 및 생체내에서의 mRNA를 비롯한 외래 핵산의 지질-매개 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다. 지질 기반 비-바이러스 제제는 바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 현재 생체내 지질 전달 방법은 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 사용한다. 지질 제제에서의 진보는 생체내에서 유전자 전달의 효율성을 개선시켰다 (PCT 출원 WO 98/07408 참조). 예를 들어, 등몰비의 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판 (DOTAP) 및 콜레스테롤로 구성된 지질 제제는 전신 생체내 유전자 전달을 유의하게 증진시킬 수 있다. DOTAP:콜레스테롤 지질 제제는 "샌드위치 리포솜"으로 칭해지는 독특한 구조를 형성한다. 이 제제는 함입된 이중층 또는 '화병' 구조 사이의 "샌드위치" DNA로 보고된다. 이들 지질 구조의 유익한 특징은 양의 p, 콜레스테롤에 의한 콜로이드 안정화, 2차원 핵산 패킹 및 증가된 혈청 안정성을 포함한다.
양이온성 리포솜 기술은 음으로 하전된 DNA 또는 RNA에 결합하고, 일반적으로 세포내이입에 의해 세포에 진입하는 입자를 형성하는, 양으로 하전된 머리기 및 소수성 지질 꼬리를 갖는 양친매성 지질의 능력에 기초한다. 일부 양이온성 리포솜은 또한 포유동물 세포에 의한 리포솜 흡수를 증진시키는 것으로 생각되는 중성 공동-지질을 함유한다. 유사하게, 다른 폴리카티온, 예컨대 폴리-l-리신 및 폴리에틸렌-이민은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체화되고, DNA 또는 RNA의 나노입자로의 축합을 보조하며, 이는 그 후 엔도솜-매개 흡수를 위한 기질이 된다. 이들 양이온성-핵산 복합체 기술 중 몇몇은 플라스미드 DNA (pDNA), 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 비롯한 잠재적인 임상적 제품으로서 개발되었으며, 본 개시내용의 코딩된 아피머 핵산 구축물을 위한 전달 시스템의 일부로서 사용되었다.
본원에 개시된 코딩된 아피머 핵산 구축물은 세포 내로의 흡수를 증진시키는 역할을 하는 다가양이온성 분자와 회합될 수 있다. 핵산 구축물을 다가양이온성 분자와 복합체화하는 것은 또한 그의 크기가 감소되도록 구축물을 패키징하는데 도움이 되며, 이는 세포 흡수를 돕는 것으로 믿어진다. 일단 엔도솜에서, 복합체는 보다 낮은 pH로 인해 해리되며, 다가양이온성 분자는 엔도솜의 막을 파괴하여 그것이 분해될 수 있기 전에 세포질 내로의 DNA 탈출을 용이하게 한다. 예비 데이터는 핵산 구축물 실시양태가 다가양이온성 분자 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민과 복합체화되는 경우 DC에 비해 SC 내로의 흡수를 증진시켰음을 나타낸다.
핵산 구축물과 복합체화하는데 유용한 다가양이온성 분자의 한 예는 세포 침투 펩티드 (CPP)를 포함하며, 예는 폴리리신 (상기 기재됨), 폴리아르기닌 및 Tat 펩티드를 포함한다. 세포 침투 펩티드 (CPP)는 DNA에 결합하고, 일단 방출되면, 세포 막에 침투하여 엔도솜으로부터 세포질로의 DNA의 탈출을 용이하게 할 수 있는 작은 펩티드이다. CPP의 또 다른 예는 MPG로 칭해지는 27 잔기 키메라 펩티드에 관한 것이며, 얼마 전에 ss- 및 ds-올리고뉴클레오티드에 안정한 방식으로 결합하여, 핵산을 DNase에 의한 분해로부터 보호하고, 올리고뉴클레오티드를 시험관내에서 세포에 효과적으로 전달한 비-공유 복합체를 생성하는 것으로 나타났다 (Mahapatro A, et al., J Nanobiotechnol, 2011, 9:55). 복합체는 상이한 펩티드:DNA 비, 및 10:1 및 5:1 비 (각각 150 nm 및 1 um)가 조사된 경우, 대략 150 nm 내지 1 um의 작은 입자를 형성하였다. 또 다른 CPP는 변형된 테트라펩티드 [구아니디노카르보닐피롤 (GCP) 기를 함유하는 테트라리신 (TL-GCP)]에 관한 것이며, 이는 높은 친화도로 6.2 kb 플라스미드 DNA에 결합하여 700 내지 900 nm의 양으로 하전된 응집체를 생성하는 것으로 보고되었다 (Li et al., Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4). RNA는 또한 생체내 전달을 위해 이러한 다가양이온성 분자에 의해 복합체화될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 구축물과 복합체화할 수 있는 다가양이온성 분자의 다른 예는 제트프라임(JETPRIME)® 및 인 비보 제트(In vivo JET) (폴리푸스-트랜스펙션, 에스.에이.(Polypus-transfection, S.A.), 프랑스 일키르히)로서 상업적으로 입수가능한 다가양이온성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (i) 화학식 (I)의 화합물, 인지질, 구조적 지질 및 PEG 지질을 포함하는 지질 성분; 및 (ii) mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 나노입자 조성물을 투여함으로써 (상기 투여는 상기 포유동물 세포를 상기 나노입자 조성물과 접촉시키고, 그에 의해 상기 mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)가 상기 세포에 전달되는 것을 포함함) PD-L1 아피머 작용제를 코딩하는 mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 환자의 세포에 전달하는 방법을 고려한다.
예시적인 실시양태에서, PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라미드, PEG-변형된 디알킬아민, PEG-변형된 디아실글리세롤 및 PEG-변형된 디알킬글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산 및 알파-토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 구조적 지질은 콜레스테롤이다.
예시적인 실시양태에서, 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린 및 스핑고미엘린으로 이루어진 군으로부터 선택된 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루스산, 아라키드산, 아라키돈산, 피탄산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 지방산 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린 (DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린 (DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC), 1,2-디-0-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C16 리소 PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 나트륨 염 (DOPG) 및 스핑고미엘린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인지질은 DOPE 또는 DSPC이다.
추가로 예시하자면, 인지질은 DOPE일 수 있고, 상기 성분은 약 35 mol% 내지 약 45 mol% 상기 화합물, 약 10 mol% 내지 약 20 mol% DOPE, 약 38.5 mol% 내지 약 48.5 mol% 구조적 지질, 및 약 1.5 mol% PEG 지질을 포함할 수 있다. 지질 성분은 약 40 mol% 상기 화합물, 약 15 mol% 인지질, 약 43.5 mol% 구조적 지질, 및 약 1.5 mol% PEG 지질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 지질 성분 대 PD-L1 아피머 작용제 코딩 mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)의 wt/wt 비는 약 5:1 내지 약 50:1 또는 약 10:1 내지 약 40:1이다.
일부 실시양태에서, 상기 나노입자 조성물의 평균 크기는 약 50 nm 내지 약 150 nm 또는 약 80 nm 내지 약 120 nm이다.
일부 실시양태에서, 상기 나노입자 조성물의 다분산 지수는 약 0 내지 약 0.18 또는 약 0.13 내지 약 0.17이다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 -10 내지 약 +20 mV의 제타 전위를 갖는다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 3-(디도데실아미노)-N1,N1,4-트리도데실-1-피페라진에탄아민 (KL10), 14,25-디트리데실-15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄 (KL25), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DODMA), 및 (2R)-2-({8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민 (옥틸-CLinDMA (2R))으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질을 추가로 포함한다.
VI. 사용 방법 및 제약 조성물
본 개시내용의 아피머 작용제는 치유적 치료 방법, 예컨대 암에 대한 면역요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용에 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제는 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진시키고/거나, 종양 성장을 억제하고/거나, 종양 부피를 감소시키고/거나, 종양 퇴행을 유도하고/거나, 종양 세포 아폽토시스를 증가시키고/거나, 종양의 종양발생성을 감소시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 작용제는 또한 병원체, 예컨대 바이러스에 대한 면역요법에 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제는 바이러스 감염을 억제하고/거나, 바이러스 감염을 감소시키고/거나, 바이러스-감염된 세포 아폽토시스를 증가시키고/거나, 바이러스-감염된 세포의 사멸을 증가시키는데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다.
본 개시내용은 아피머 작용제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 활성화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 아피머 작용제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 아피머 작용제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 아피머 작용제를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 세포-매개 면역의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 Th1-유형 반응의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 T-세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 CD4+ T-세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 CD8+ T-세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 CTL 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 T-세포 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 CU 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 Treg 세포의 억제 활성의 억제 또는 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 MDSC의 억제 활성의 억제 또는 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 기억 T-세포의 백분율의 수의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 장기간 면역 기억 기능의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 장기간 기억의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 실질적인 부작용 및/또는 면역-기반 독성의 증거를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 증진은 시토카인 방출 증후군 (CRS) 또는 시토카인 폭풍의 증거를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 자극의 결과이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 암이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 병원체이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 바이러스-감염 세포이다.
아피머 작용제가 면역 반응을 활성화시키는지 또는 억제하는지를 결정하기 위한 생체내 및 시험관내 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 아피머 작용제는 인간 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 아피머 작용제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아피머 폴리펩티드를 포함한 아피머-함유 항체 또는 수용체 트랩 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 코딩된 아피머를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 코딩된 아피머는 환자에서 발현되는 경우에 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드를 포함한 재조합 아피머 작용제 폴리펩티드를 생산한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 종양에 대한 지속적인 또는 장기간 면역 반응을 활성화 또는 증진시키는 방법은 대상체에게 인간 PD-L1에 결합하는 아피머 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양에 대한 지속적인 면역 반응을 활성화 또는 증진시키는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 아피머 작용제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아피머 폴리펩티드를 포함한 아피머-함유 항체 또는 수용체 트랩 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 종양에 대한 지속적인 면역 반응을 활성화 또는 증진시키는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 코딩된 아피머를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 코딩된 아피머는 환자에서 발현되는 경우에 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드를 포함한 재조합 아피머 작용제 폴리펩티드를 생산한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 억제하는 지속적인 또는 장기간 면역을 유도하는 방법은 대상체에게 인간 PD-L1에 결합하는 아피머 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 억제하는 지속적인 면역을 유도하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 아피머 작용제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아피머 폴리펩티드를 포함한 아피머-함유 항체 또는 수용체 트랩 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 억제하는 지속적인 면역을 유도하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 코딩된 아피머를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 코딩된 아피머는 환자에서 발현되는 경우에 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드를 포함한 재조합 아피머 작용제 폴리펩티드를 생산한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 억제하는 방법은 대상체에게 인간 PD-L1에 결합하는 아피머 작용제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 아피머 작용제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아피머 폴리펩티드를 포함한 아피머-함유 항체 또는 수용체 트랩 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 코딩된 아피머를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 코딩된 아피머는 환자에서 발현되는 경우에 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드를 포함한 재조합 아피머 작용제 폴리펩티드를 생산한다.
일부 실시양태에서, 종양은 항-PD-L1 아피머 폴리펩티드와 함께 아피머 작용제에 제공된 추가의 결합 개체에 의해 표적화하는 종양 항원을 발현하거나 과다발현하며, 즉 여기서 아피머 작용제는 이중특이적 또는 다중특이적 작용제이다.
일부 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 종양을 갖거나 또는 대상체는 제거된 종양을 갖는다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 신경내분비 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 방광 종양이다.
추가로 예시하자면, 대상 아피머 작용제는 암, 예컨대 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스 암, 난소암, 췌장암, 유방암 (삼중 음성 유방암 포함), 전립선암, 골암, 폐암 (예를 들어, 소세포 또는 비소세포 폐암), 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암, 유방암 또는 위암을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 암은, 예를 들어 상기 기재된 다양한 전이성 암이다.
일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 골수 백혈병 (AML), 호지킨 림프종, 다발성 골수종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병 (T-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병 (CML), 비-호지킨 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 및 피부 T-세포 림프종 (CTCL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 아피머 작용제 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 면역요법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 면역-종양학에 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 성장을 억제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암을 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 암을 치료하는데 사용된다.
제제는 본 개시내용의 정제된 아피머 작용제를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일반적으로 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제가 제제 또는 제약 조성물의 불활성 성분인 것으로 간주한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제는 동결건조되고/거나 동결건조된 형태로 저장된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제를 포함하는 제제는 동결건조된다.
적합한 제약상 허용되는 비히클은 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 염 예컨대 염화나트륨; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물; 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).
본 개시내용의 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국소 투여; 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의한, 예컨대 네뷸라이저, 기관내 및 비강내에 의한 폐 투여; 경구; 또는 비경구, 예컨대 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내 (예를 들어, 주사 또는 주입) 또는 두개내 (예를 들어, 척수강내 또는 뇌실내) 투여에 의할 수 있다.
치료 제제는 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제제는 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비-수성 매질 중 용액 또는 현탁액, 또는 좌제를 포함한다. 정제와 같은 고체 조성물에서, 주요 활성 성분은 제약 담체와 혼합된다. 통상적인 정제화 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검 및 희석제 (예를 들어, 물)를 포함한다. 이들을 사용하여 본 개시내용의 화합물 또는 그의 비-독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성할 수 있다. 이어서 고체 예비제제 조성물은 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 제제 또는 조성물의 정제, 환제 등은 코팅되거나 또는 달리 배합되어 지속 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분으로 덮힌 내부 조성물을 포함할 수 있다. 추가로, 2가지 성분은 붕해에 저항하고 내부 성분이 무손상으로 위를 통해 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 역할을 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
본원에 기재된 아피머 작용제는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐은 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조되며, 예를 들어 각각 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에 기재된 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중 또는 마크로에멀젼 중 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐이다.
일부 실시양태에서, 제약 제제는 리포솜과 복합체화된 본 개시내용의 아피머 작용제를 포함한다. 리포솜을 제조하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 세공 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제를 포함하는 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 아피머 작용제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형품 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알콜), 폴리락티드, L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것에 추가로, 방법 또는 치료는 적어도 1종의 추가의 면역 반응 자극제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 면역 반응 자극제는 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 줄기 세포 인자 (SCF)), 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), 체크포인트 억제제, 면역억제 기능을 차단하는 항체 (예를 들어, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체), 톨-유사 수용체 (예를 들어, TLR4, TLR7, TLR9), 또는 B7 패밀리의 구성원 (예를 들어, CD80, CD86)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 면역 반응 자극제는 아피머 작용제의 투여 전에, 그와 공동으로 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. 아피머 작용제 및 면역 반응 자극제(들)를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 1, 2, 3종 또는 그 초과의 면역 반응 자극제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제를 투여하는 것에 추가로, 방법 또는 치료는 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 치료제는 아피머 작용제의 투여 전에, 그와 공동으로 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. 아피머 작용제 및 추가의 치료제(들)를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 치료제는 1, 2, 3종 또는 그 초과의 추가의 치료제를 포함한다.
2종 이상의 치료제를 사용한 조합 요법은, 요구되는 것은 아니지만 종종 상이한 작용 메카니즘에 의해 작용하는 작용제를 사용한다. 상이한 작용 메카니즘을 갖는 작용제를 사용한 조합 요법은 상가적 또는 상승작용적 효과를 생성할 수 있다. 조합 요법은 단독요법에 사용되는 것보다 더 낮은 용량의 각각의 작용제를 허용하여, 아피머 작용제의 독성 부작용을 감소시키고/거나 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암 세포가 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 면역 반응에 영향을 미치는 (예를 들어, 반응을 증진 또는 활성화시키는) 치료제 및 종양/암 세포에 영향을 미치는 (예를 들어, 억제 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 작용제 및 적어도 1종의 추가의 치료제의 조합은 상가적 또는 상승작용적 결과를 생성한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 아피머 작용제의 치료 지수의 증가를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 치료제(들)의 치료 지수의 증가를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 아피머 작용제의 독성 및/또는 부작용의 감소를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 치료제(들)의 독성 및/또는 부작용의 감소를 일으킨다.
유용한 부류의 치료제는, 예를 들어 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 착물, 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 트리-핵 백금 착물 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항-폴레이트, 항대사물, 화학요법 증감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오린화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드, 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항대사물, 항유사분열제, 토포이소머라제 억제제 또는 혈관신생 억제제이다.
본원에 기재된 아피머 작용제와 조합되어 투여될 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법 또는 치료는 본 개시내용의 아피머 작용제를 화학요법제와 조합하여 또는 화학요법제의 칵테일과 조합하여 투여하는 것을 수반한다. 아피머 작용제를 사용한 치료는 화학요법의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 그 후에 일어날 수 있다. 조합 투여는 단일 제약 제제로 또는 별개의 제제를 사용하는 공-투여 또는 임의의 순서이지만 일반적으로 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 시간 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 진료의가 경험적으로 결정한 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제제 및 투여 스케줄은 또한 문헌 [The Chemotherapy Source Book, 4.sup.th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa]에 기재되어 있다.
본 개시내용에 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔) 및 도세탁셀 (탁소테레); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈 (젤로다); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 화학요법제는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐제, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤 (FARESTON)); 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 시스플라틴이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 카르보플라틴이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드 (VM-26) 및 이리노테칸, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 이리노테칸이다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물이다. 항대사물은 정상적인 생화학적 반응에 필요한 대사물과 유사하지만 세포의 1개 이상의 정상적인 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분히 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물은 겜시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 소듐, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 겜시타빈이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀 (탁소테레), 알부민-결합 파클리탁셀 (nab-파클리탁셀; 아브락산), DHA-파클리탁셀 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정의 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈데신, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 억제제 또는 유사분열 키나제의 억제제, 예컨대 오로라 A 또는 Plk1이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 nab-파클리탁셀이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 소분자와 같은 작용제를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2 (ErbB2) 및/또는 VEGF를 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양-연관 항원에 대한 억제제로서 작용하는 소분자와 본 개시내용의 아피머 작용제의 조합 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 게피티닙 (이레사), 에를로티닙 (타르세바), 수니티닙 (수텐트), 라파타닙, 반데타닙 (작티마), AEE788, CI-1033, 세디라닙 (레센틴), 소라페닙 (넥사바르) 및 파조파닙 (GW786034B)으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR 억제제를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 히포 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR/AKR 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 RSPO/LGR 경로의 억제제이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 생물학적 분자, 예컨대 항체를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2/ErbB2 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양-연관 항원에 대한 항체와 본 개시내용의 아피머 작용제의 조합 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 .베타.-카테닌 신호전달을 억제하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 혈관신생 억제제인 항체 (예를 들어, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 베바시주맙 (아바스틴), 라무시루맙, 트라스투주맙 (헤르셉틴), 페르투주맙 (옴니타르그), 파니투무맙 (벡티빅스), 니모투주맙, 잘루투무맙 또는 세툭시맙 (에르비툭스)이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역 반응을 조정하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3 항체 또는 항-TIGIT 항체이다.
추가로, 본원에 기재된 아피머 작용제를 사용한 치료는 다른 생물학적 분자, 예컨대 1종 이상의 시토카인 (예를 들어, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)을 사용한 조합 치료를 포함할 수 있거나 또는 종양의 외과적 제거, 암 세포의 제거 또는 치료 의사에 의해 필요한 것으로 간주되는 임의의 다른 요법을 동반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역 반응 자극제이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 아드레노메둘린 (AM), 안지오포이에틴 (Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴 (EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 미오스타틴 (GDF-8), NGF, 뉴로트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, P1GF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자와 조합될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역 반응 자극제이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BB 리간드, 항-CD3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIGIT 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체 및 항-TIM-3 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 PD-1 활성의 조정제, PD-L2 활성의 조정제, CTLA-4 활성의 조정제, CD28 활성의 조정제, CD80 활성의 조정제, CD86 활성의 조정제, 4-1BB 활성의 조정제, OX40 활성의 조정제, KIR 활성의 조정제, Tim-3 활성의 조정제, LAG3 활성의 조정제, CD27 활성의 조정제, CD40 활성의 조정제, GITR 활성의 조정제, TIGIT 활성의 조정제, CD20 활성의 조정제, CD96 활성의 조정제, IDO1 활성의 조정제, 시토카인, 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 종양 괴사 인자 (TNF) 패밀리의 구성원 및 면역자극 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 PD-1 길항제, PD-L2 길항제, CTLA-4 길항제, CD80 길항제, CD86 길항제, KIR 길항제, Tim-3 길항제, LAG3 길항제, TIGIT 길항제, CD20 길항제, CD96 길항제 및/또는 IDO1 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, PD-1 길항제는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-1에 결합하는 항체는 키트루다 (MK-3475), 피딜리주맙 (CT-011), 니볼루맙 (옵디보, BMS-936558, MDX-1106), MEDI0680 (AMP-514), REGN2810, BGB-A317, PDR-001 또는 STI-A1110이다. 일부 실시양태에서, PD-1에 결합하는 항체는 PCT 공개 WO 2014/179664에 기재되어 있으며, 예를 들어 APE2058, APE1922, APE1923, APE1924, APE1950 또는 APE1963으로서 확인된 항체 또는 이들 항체 중 임의의 것의 CDR 영역을 함유하는 항체이다. 다른 실시양태에서, PD-1 길항제는 PD-L2를 포함하는 융합 단백질, 예를 들어 AMP-224이다. 다른 실시양태에서, PD-1 길항제는 펩티드 억제제, 예를 들어, AUNP-12이다.
일부 실시양태에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, CTLA-4에 결합하는 항체는 이필리무맙 (예르보이) 또는 트레멜리무맙 (CP-675,206)이다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4 융합 단백질, 예를 들어 KAHR-102이다.
일부 실시양태에서, LAG3 길항제는 LAG3에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, LAG3에 결합하는 항체는 IMP701, IMP731, BMS-986016, LAG525 및 GSK2831781이다. 일부 실시양태에서, LAG3 길항제는 가용성 LAG3 수용체, 예를 들어 IMP321을 포함한다.
일부 실시양태에서, KIR 길항제는 KIR에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, KIR에 결합하는 항체는 리릴루맙이다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 CD28 효능제, 4-1BB 효능제, OX40 효능제, CD27 효능제, CD80 효능제, CD86 효능제, CD40 효능제 및 GITR 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 OX40 리간드 또는 그의 OX40-결합 부분을 포함한다. 예를 들어, OX40 효능제는 MEDI6383일 수 있다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, OX40에 결합하는 항체는 MEDI6469, MEDI0562 또는 MOXR0916 (RG7888)이다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 OX40 리간드를 발현할 수 있는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터 또는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스)이다. 일부 실시양태에서 OX40-발현 벡터는 델타-24-RGDOX 또는 DNX2401이다.
일부 실시양태에서, 4-1BB (CD137) 효능제는 결합 분자, 예컨대 안티칼린이다. 일부 실시양태에서, 안티칼린은 PRS-343이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB에 결합하는 항체는 PF-2566 (PF-05082566) 또는 우렐루맙 (BMS-663513)이다.
일부 실시양태에서, CD27 효능제는 CD27에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, CD27에 결합하는 항체는 바를리루맙 (CDX-1127)이다.
일부 실시양태에서, GITR 효능제는 GITR 리간드 또는 그의 GITR-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, GITR 효능제는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, GITR에 결합하는 항체는 TRX518, MK-4166 또는 INBRX-110이다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 시토카인, 예컨대 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자 (TNF) 패밀리의 구성원을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 면역자극 올리고뉴클레오티드, 예컨대 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 항-KIR 항체, 항-Tim-3 항체, 항-LAG3 항체, 항-CD27 항체, 항-CD40 항체, 항-GITR 항체, 항-TIGIT 항체, 항-CD20 항체, 항-CD96 항체 또는 항-IDO1 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 아피머 작용제는 단독으로 또는 방사선 요법과 함께 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 아피머 작용제는 단독으로 또는 표적화된 요법과 함께 사용될 수 있다. 표적화 요법의 예는 다음을 포함한다: 호르몬 요법, 신호 전달 억제제 (예를 들어, EGFR 억제제, 예컨대 세툭시맙 (에르비툭스) 및 에를로티닙 (타르세바)); HER2 억제제 (예를 들어, 트라스투주맙 (헤르셉틴) 및 페르투주맙 (페르제타)); BCR-ABL 억제제 (예컨대 이마티닙 (글리벡) 및 다사티닙 (스프리셀)); ALK 억제제 (예컨대 크리조티닙 (잘코리) 및 세리티닙 (지카디아)); BRAF 억제제 (예컨대 베무라페닙 (젤보라프) 및 다브라페닙 (타핀라)), 유전자 발현 조정제, 아폽토시스 유도제 (예를 들어, 보르테조밉 (벨케이드) 및 카르필조밉 (키프롤리스)), 혈관신생 억제제 (예를 들어, 베바시주맙 (아바스틴) 및 라무시루맙 (시람자), 독소에 부착된 모노클로날 항체 (예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴 (애드세트리스) 및 아도-트라스트주맙 엠탄신 (카드실라)).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 항암 치료제 또는 면역조정 약물, 예컨대 면역조정 수용체 억제제, 예를 들어 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합되어 사용될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Tim-3 경로 길항제와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비스타 경로 길항제와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BTLA 경로 길항제와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 LAG-3 경로 길항제와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TIGIT 경로 길항제와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-PDL1 항체와 함께 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMS-936559, MSB0010718C 또는 MPDL3280A와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-CTLA4 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-CS1 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR2DL1/2/3 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-CD137 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-GITR 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-PD-L2 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT1 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT2 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT3 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT4 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT5 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT6 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT7 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ILT8 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-CD40 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-OX40 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR2DL1 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR2DL2/3 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR2DL4 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR2DL5A 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR2DL5B 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR3DL1 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR3DL2 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-KIR3DL3 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-NKG2A 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-NKG2C 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-ICOS 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-SIRP.알파. 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-CD47 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-4-1 BB 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-IL-10 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-TSLP 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IL-10 또는 PEG화 IL-10과 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-APRIL 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-CD27 항체와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 STING 효능제와 함께, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 투여된다. 시클릭-디-뉴클레오티드 (CDN) 시클릭-디-AMP (리스테리아 모노시토게네스 및 다른 박테리아에 의해 생산됨) 및 그의 유사체 시클릭-디-GMP 및 시클릭-GMP-AMP는 병원체 연관 분자 패턴 (PAMP)으로서 숙주 세포에 의해 인식되며, 이는 인터페론 유전자의 자극제 (STING)로서 공지된 병원체 인식 수용체 (PRR)에 결합한다. STING는 숙주 포유동물 세포의 세포질에서 TANK 결합 키나제 (TBK1)-IRF3 및 NF-.카파.B 신호전달 축을 활성화시켜 IFN-.베타. 및 선천성 면역을 강력하게 활성화시키는 다른 유전자 생성물의 유도를 일으키는 어댑터 단백질이다. 본 발명에 이르러 STING가 숙주 시토졸 감시 경로의 성분인 것으로 인식되며, 이는 세포내 병원체에 의한 감염을 감지하고 이에 반응하여 IFN-α의 생산을 유도하여, 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다 뿐만 아니라 병원체-특이적 항체로 이루어진 적응성 보호 병원체-특이적 면역 반응의 발생을 유도한다. 미국 특허 번호 7,709,458 및 7,592,326; PCT 공개 번호 WO2007/054279, WO2014/093936, WO2014/179335, WO2014/189805, WO2015/185565, WO2016/096174, WO2016/145102, WO2017/027645, WO2017/027646 및 WO2017/075477; 및 문헌 [Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18:5631-4, 2008].
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 Akt 억제제와 함께 투여된다. 예시적인 AKT 억제제는 GDC0068 (GDC-0068, 이파타세르팁 및 RG7440으로도 공지됨), MK-2206, 페리포신 (KRX-0401로도 공지됨), GSK690693, AT7867, 트리시리빈, CCT128930, A-674563, PHT-427, Akti-1/2, 아푸레세르팁 (GSK2110183으로도 공지됨), AT13148, GSK2141795, BAY1125976, 우프로세르팁 (일명 GSK2141795), Akt 억제제 VIII (1,3-디히드로-1-[1-[[4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐]m-에틸]-4-피페리디닐]-2H-벤즈이미다졸-2-온), Akt 억제제 X (2-클로로-N,N-디에틸-10H-페녹사진-10-부탄아민, 모노히드로클로라이드), MK-2206 (8-(4-(1-아미노시클로부틸)페닐)-9-페닐-[1,2,4]트리아졸로[3,4-f][- 1,6]나프티리딘-3(2H)-온), 우프로세르팁 (N-((S)-1-아미노-3-(3,4-디플루오로페닐)프로판-2-일)-5-클로로-4-(4-클로로-1-메틸-1H-피라졸-5-일)푸란-2-카르복스아미드), 이파타세르팁 ((S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온)-, AZD 5363 (4-피페리딘카르복스아미드, 4-아미노-N-[(1S)-1-(4-클로로페닐)-3-히드록시프로필]-1-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)), 페리포신, GSK690693, GDC-0068, 트리시리빈, CCT128930, A-674563, PF-04691502, AT7867, 밀테포신, PHT-427, 호노키올, 트리시리빈 포스페이트, 및 KP372-1A (10H-인데노[2,1-e]테트라졸로[1,5-b][1,2,4]트리아진-10-온), Akt 억제제 IX (CAS 98510-80-6)를 포함한다. 추가의 Akt 억제제는 다음을 포함한다: ATP-경쟁적 억제제, 예를 들어 이소퀴놀린-5-술폰아미드 (예를 들어, H-8, H-89, NL-71-101), 아제판 유도체 (예를 들어, (-)-발라놀 유도체), 아미노푸라잔 (예를 들어, GSK690693), 헤테로시클릭 고리 (예를 들어, 7-아자인돌, 6-페닐퓨린 유도체, 피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체, CCT128930, 3-아미노피롤리딘, 아닐리노트리아졸 유도체, 스피로인돌린 유도체, AZD5363, A-674563, A-443654), 페닐피라졸 유도체 (예를 들어, AT7867, AT13148), 티오펜카르복스아미드 유도체 (예를 들어, 아푸레세르팁 (GSK2110183), 2-피리미딜-5-아미도티오펜 유도체 (DC120), 우프로세르팁 (GSK2141795); 알로스테릭 억제제, 예를 들어 2,3-디페닐퀴녹살린 유사체 (예를 들어, 2,3-디페닐퀴녹살린 유도체, 트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 유도체 (MK-2206)), 알킬인지질 (예를 들어, 에델포신 (1-O-옥타데실-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린, ET-18-OCH3) 일모포신 (BM 41.440), 밀테포신 (헥사데실포스포콜린, HePC), 페리포신 (D-21266), 에루실포스포콜린 (ErPC), 에루포신 (ErPC3, 에루실포스포호모콜린), 인돌-3-카르비놀 유사체 (예를 들어, 인돌-3-카르비놀, 3-클로로아세틸인돌, 디인돌릴메탄, 디에틸 6-메톡시-5,7-디히드로인돌로 [2,3-b]카르바졸-2,10-디카르복실레이트 (SR13668), OSU-A9), 술폰아미드 유도체 (예를 들어, PH-316, PHT-427), 티오우레아 유도체 (예를 들어, PIT-1, PIT-2, DM-PIT-1, N-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)카르보닐]-N'-(3-브로모페닐)-티오우레아), 퓨린 유도체 (예를 들어, 트리시리빈 (TCN, NSC 154020), 트리시리빈 모노-포스페이트 활성 유사체 (TCN-P),4-아미노-피리도[2,3-d]피리미딘 유도체 API-1,3-페닐-3H-이미다조[4,5-b]피리딘 유도체, ARQ 092), BAY 1125976, 3-메틸-크산틴, 퀴놀린-4-카르복스아미드, 2-[4-(시클로헥사-1,3-디엔-1-일)-1H-피라졸-3-일]페놀, 3-옥소-티루칼산, 3.알파.- 및 3.베타.-아세톡시-티루칼산, 아세톡시-티루칼산; 및 비가역적 억제제, 예를 들어 천연 생성물, 항생제, 락토퀴노마이신 B, 칼라펀진, 메데르마이신, Boc-Phe-비닐 케톤, 4-히드록시노넨알 (4-HNE), 1,6-나프티리디논 유도체, 및 이미다조-1,2-피리딘 유도체.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 MEK 억제제와 함께 투여된다. 예시적인 MEK 억제제는 AZD6244 (셀루메티닙), PD0325901, GSK1120212 (트라메티닙), U0126-EtOH, PD184352, RDEA119 (레파메티닙), PD98059, BIX 02189, MEK162 (비니메티닙), AS-703026 (피마세르팁), SL-327, BIX02188, AZD8330, TAK-733, 코비메티닙 및 PD318088을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 안트라시클린, 예컨대 독소루비신 및 시클로포스파미드 (PEG화 리포솜 독소루비신 포함) 둘 다와 함께 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 항-CD20 항체 및 항-CD3 항체 둘 다 또는 이중특이적 CD20/CD3 결합제 (CD20/CD3 BiTE 포함)와 함께 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 CD73 억제제, CD39 억제제 또는 둘 다와 함께 투여된다. 이들 억제제는 엑토뉴클레오시다제 활성을 억제하는 CD73 결합제 또는 CD39 결합제 (예컨대 항체, 항체 단편 또는 항체 모방체)일 수 있다. 억제제는 엑토뉴클레오시다제 활성의 소분자 억제제, 예컨대 6-N,N-디에틸-β-γ-디브로모메틸렌-D-아데노신-5'-트리포스페이트 삼나트륨 염 수화물, PSB069, PSB 06126,
Figure pct00023
일 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 억제제 폴리 ADP 리보스 폴리머라제 (PARP)와 함께 투여된다. 예시적인 PARP 억제제는 올라파립, 니라파립, 루카파립, 탈라조파립, 벨리파립, CEP9722, MK4827 및 BGB-290을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 종양용해 바이러스와 함께 투여된다. 예시적인 종양용해 바이러스는 탈리모겐 라허파렙벡이다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 CSF-1 길항제, 예컨대 CSF-1 또는 CSF1R에 결합하고 대식세포 상의 CSF1R과 CSF-1의 상호작용을 억제하는 작용제와 함께 투여된다. 예시적인 CSF-1 길항제는 에막투주맙 및 FPA008을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 항-CD38 항체와 함께 투여된다. 예시적인 항-CD39 항체는 다라투무맙 및 이사툭시맙을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 항-CD40 항체와 함께 투여된다. 예시적인 항-CD40 항체는 셀리크렐루맙 및 다세투주맙을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 역형성 림프종 키나제 (ALK)의 억제제와 함께 투여된다. 예시적인 ALK 억제제는 알렉티닙, 크리조티닙 및 세리티닙을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 VEGFR, PDGFR 및 FGFR의 패밀리 구성원 또는 항혈관신생 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 억제하는 멀티키나제 억제제와 함께 투여된다. 예시적인 억제제는 악시티닙, 세디라닙, 리니파닙, 모테사닙, 닌테다닙, 파조파닙, 포나티닙, 레고라페닙, 소라페닙, 수니티닙, 티보자닙, 바탈라닙, LY2874455 또는 SU5402를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 1종 이상의 미리 결정된 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 의도된 1종 이상의 백신과 함께 투여된다. 항원(들)은 개체에게 직접 투여될 수 있거나 또는 예를 들어 자가 또는 동종일 수 있는 종양 세포 백신 (예를 들어, GVAX), 수지상 세포 백신, DNA 백신, RNA 백신, 바이러스-기반 백신, 박테리아 또는 효모 백신 (예를 들어, 리스테리아 모노시토게네스 또는 사카로미세스 세레비지아에) 등으로부터 개체 내에서 발현될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Guo et al., Adv. Cancer Res. 2013; 119: 421-475; Obeid et al., Semin Oncol. 2015 August; 42(4): 549-561] 참조). 표적 항원은 또한 표에 열거된 항원의 면역학적 활성 부분을 포함하는 단편 또는 융합 폴리펩티드일 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 1종 이상의 항구토제와 함께 투여된다: 카소피탄트 (글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 네투피탄트 (엠지아이-헬신(MGI-Helsinn)) 및 다른 NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론 (엠지아이 파마(MGI Pharma)에 의해 알록시로서 판매됨), 아프레피탄트 (머크 앤 캄파니(Merck and Co.) (뉴저지주 라흐웨이)에 의해 에멘드로서 판매됨), 디펜히드라민 (화이자(Pfizer) (뉴옥주 뉴욕)에 의해 베나드릴로서 판매됨), 히드록시진 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)에 의해 아타락스로서 판매됨), 메토클로프라미드 (에이치 로빈스 캄파니(AH Robins Co.) (버지니아주 리치먼드)에 의해 레글란으로서 판매됨), 로라제팜 (와이어쓰(Wyeth) (뉴저지주 매디슨)에 의해 아티반으로서 판매됨), 알프라졸람 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)에 의해 자낙스로서 판매됨), 할로페리돌 (오르토-맥네일(Ortho-McNeil) (뉴저지주 래리탄)에 의해 할돌로서 판매됨), 드로페리돌 (이납신), 드로나비놀 (솔베이 파마슈티칼스, 인크.(Solvay Pharmaceuticals, Inc.) (조지아주 매리에타)에 의해 마리놀로서 판매됨), 덱사메타손 (머크 앤 캄파니 (뉴저지주 로웨이)에 의해 데카드론으로서 판매됨), 메틸프레드니솔론 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)에 의해 메드롤로서 판매됨), 프로클로르페라진 (글락소스미스클라인 (노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)에 의해 콤파진으로서 판매됨), 그라니세트론 (호프만-라 로슈 인크.(Hoffmann-La Roche Inc.) (뉴저지주 너틀리)에 의해 키트릴로서 판매됨), 온단세트론 (글락소스미스클라인 (노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)에 의해 조프란으로서 판매됨), 돌라세트론 (사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis) (뉴욕주 뉴욕)에 의해 안제메트로서 판매됨), 트로피세트론 (노파르티스(Novartis) (뉴저지주 이스트 하노버)에 의해 나보반으로서 판매됨).
암 치료의 다른 부작용은 적혈구 및 백혈구 결핍증이다. 따라서, 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 이러한 결핍을 치료 또는 예방하는 작용제, 예컨대, 예를 들어 필그라스팀, PEG-필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파 또는 다르베포에틴 알파와 함께 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 아피머 작용제는 항암 방사선 요법과 함께 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 방사선 요법은 고에너지 X선의 빔을 종양 위치에 전달하는 방법인 외부 빔 요법 (EBT)이다. 빔은 환자의 외부에서 생성되고 (예를 들어, 선형 가속기에 의해), 종양 부위에 표적화된다. 이들 X선은 암 세포를 파괴할 수 있고, 신중한 치료 계획은 주위 정상 조직이 보존되도록 한다. 방사선원은 환자의 신체 내부에 놓이지 않는다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 방사선 요법은 X선 대신 양성자로 이환 조직에 충격을 가하는 입체조형 요법의 한 유형인 양성자 빔 요법이다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 방사선 요법은 방사선 요법을 개체의 신체 구조에 맞추기 위해 진보된 기술을 사용하는 절차인 입체조형 외부 빔 방사선 요법이다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 방사선 요법은 방사성 물질을 신체 내에 일시적으로 배치시키고 통상적으로 추가 선량- 또는 부스트-의 방사선을 소정 영역에 제공하는데 사용되는 근접요법이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 치료는 항바이러스 요법과 조합된 본 개시내용의 아피머 작용제의 투여를 수반한다. 아피머 작용제를 사용한 치료는 항바이러스 요법의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 그 후에 일어날 수 있다. 조합 요법에 사용되는 항바이러스 약물은 대상체를 감염시킨 바이러스에 좌우될 것이다.
조합 투여는 단일 제약 제제로 또는 별개의 제제를 사용하는 공-투여 또는 임의의 순서이지만 일반적으로 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 시간 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 아피머 작용제 및 적어도 1종의 추가의 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 공동으로 투여될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 이전에 제2 치료제를 사용한 치료를 받은 환자에게 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아피머 작용제 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 공동으로 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제 (예를 들어, 화학요법)에 의한 치료 과정을 받으면서 아피머 작용제가 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 제2 치료제를 사용한 치료의 1년 이내에 투여될 것이다. 특정의 대안적 실시양태에서, 아피머 작용제는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료의 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, 아피머 작용제는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료의 4, 3, 2 또는 1주 내에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료의 5, 4, 3, 2 또는 1일 내에 투여될 것이다. 추가로, 2종 (또는 그 초과)의 작용제 또는 치료는 수시간 또는 수분 이내에 (즉, 실질적으로 동시에) 대상체에게 투여될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
질환의 치료를 위해, 본 개시내용의 아피머 작용제의 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 아피머 작용제가 치료적 또는 예방적 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 등에 좌우되며, 모두 치료 의사의 재량에 따른다. 아피머 작용제는 1회 또는 수일 내지 수개월 지속되는 일련의 치료에 걸쳐 또는 치유가 이루어지거나 질환 상태의 감소 (예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적 투여 스케줄은 환자의 신체 내 약물 축적의 측정치로부터 계산될 수 있고, 개별 작용제의 상대 효력에 따라 달라질 것이다. 투여 의사는 최적 투여량, 투여 방법론 및 반복률을 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 0.01 μg 내지 100 mg/kg 체중, 0.1 μg 내지 100 mg/kg 체중, 1 μg 내지 100 mg/kg 체중, 1 mg 내지 100 mg/kg 체중, 1 mg 내지 80 mg/kg 체중, 10 mg 내지 100 mg/kg 체중, 10 mg 내지 75 mg/kg 체중, 또는 10 mg 내지 50 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 0.1 mg 내지 약 20 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 0.1 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 0.25 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 0.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 1 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 1.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 2 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 2.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 7.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 10 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 12.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제의 투여량은 약 15 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 제공된다.
일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 초기 더 높은 "로딩" 용량에 이어서 1회 이상의 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 또한 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 초기 용량에 이어서 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회 또는 매월 1회의 추가의 용량 (또는 "유지" 용량)을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투여 요법은 초기 로딩 용량에 이어서, 예를 들어 초기 용량의 절반의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 초기 로딩 용량에 이어서 유지 용량, 예를 들어 초기 용량의 절반을 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 3주 동안 3회의 초기 용량을 투여하고, 이어서 예를 들어 격주로 동일한 양의 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제의 투여는 부작용 및/또는 독성을 유도할 수 있다. 일부 경우에, 부작용 및/또는 독성은 치료 유효 용량의 특정한 작용제의 투여를 배제할 만큼 매우 중증이다. 일부 경우에, 약물 요법은 중단되어야 하고, 다른 작용제가 시도될 수 있다. 그러나, 동일한 치료제 부류의 많은 작용제는 종종 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내며, 이는 환자가 요법을 중단해야 하거나 또는 가능하다면, 치료제와 연관된 불쾌한 부작용을 앓는다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 투여 스케줄은 구체적 투여 또는 "사이클" 횟수로 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 초과의 사이클 동안 투여된다. 예를 들어, 아피머 작용제는 6회 사이클 동안 2주마다 투여되고, 아피머 작용제는 6회 사이클 동안 3주마다 투여되고, 아피머 작용제는 4회 사이클 동안 2주마다 투여되고, 아피머 작용제는 4회 사이클 동안 3주마다 투여되는 등이다. 투여 스케줄은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정되고 후속적으로 변형될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 아피머 작용제, 화학요법제 등의 투여와 연관된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는 1종 이상의 작용제를 투여하기 위한 간헐적 투여 전략을 사용하는 것을 포함하는, 대상체에게 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 작용제를 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효 용량의 아피머 작용제를 치료 유효 용량의 화학요법제와 조합하여 투여하는 것을 포함하며, 여기서 작용제 중 하나 또는 둘 다는 간헐적 투여 전략에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 대상체에게 아피머 작용제의 초기 용량을 투여하고, 아피머 작용제의 후속 용량을 2주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 대상체에게 아피머 작용제의 초기 용량을 투여하고, 아피머 작용제의 후속 용량을 3주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 대상체에게 아피머 작용제의 초기 용량을 투여하고, 아피머 작용제의 후속 용량을 4주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아피머 작용제는 간헐적 투여 전략을 사용하여 투여되고, 화학요법제는 매주 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 아피머 작용제를 사용하여 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 간염 바이러스 (A형, B형 또는 C형), 포진 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인 바르 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 또는 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의한 감염이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 아피머 작용제를 사용하여 박테리아 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 감염은 클라미디아, 리케치아 박테리아, 미코박테리아, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 뉴모코쿠스, 메닝고코쿠스 및 고노코쿠스, 클레브시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 코리네박테리움 디프테리아에, 살모넬라, 바실루스, 비브리오 콜레라에, 클로스트리디움 테타니, 클로스트리디움 보툴리눔, 바실루스 안트라시스, 예르시니아 페스티스, 미코박테리움 레프라에, 미코박테리움 레프로마토시스 및 보렐리아로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의한 감염이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 아피머 작용제를 사용하여 진균 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 진균 감염은 칸디다 (알비칸스, 크루세이, 글라브라타, 트로피칼리스 등), 크립토코쿠스 네오포르만스, 아스페르길루스 (푸미가투스, 니거 등), 뮤코랄레스 속 (뮤코르, 압시디아, 리조푸스), 스포로트릭스 쉔크키이, 블라스토미세스 더마티티디스, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스, 콕시디오이데스 임미티스 및 히스토플라스마 캅술라툼으로 이루어진 군으로부터 선택된 진균에 의한 감염이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 아피머 작용제를 사용하여 기생충 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 기생충 감염은 엔트아메바 히스톨리티카, 발란티디움 콜라이, 네글레리아 포울렐리, 아칸트아메바, 지아르디아 람블리아, 크립토스포리디움, 뉴모시스티스 카리니이, 플라스모디움 비박스, 바베시아 미크로티, 트리파노소마 브루세이, 트리파노소마 크루지, 리슈마니아 도노바니, 톡소플라스마 곤디이 및 니포스트롱길루스 브라실리엔시스로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충에 의한 감염이다.
실시예
실시예 1: 파지 디스플레이 라이브러리로부터 PD-L1 결합 아피머의 선택
본 개시내용의 펩티드, 예를 들어 PD-L1 결합 성분은, 예를 들어 일반적으로 그러나 비독점적으로 9개 아미노산의 동일한 길이의 2개의 무작위 루프를 갖는 아피머의 라이브러리로부터 선택함으로써 확인될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 PD-L1 결합 펩티드는 스테핀 A에 대한 서열에 기초하여 불변 아피머 프레임워크 백본에 디스플레이된 9개 아미노산 길이의 무작위 루프 서열을 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택함으로써 확인되었다. 이러한 절차는 일반적으로 공지되어 있다. 이러한 절차에 따라, 파지의 현탁액을 표적 항원 (스트렙타비딘 비드 상에 포획된 비오티닐화된 항원 또는 플레이트 상에 포획된 비오티닐화되지 않은 항원)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 미결합 파지를 세척 제거하고, 후속적으로 항원을 저 pH 용액, 이어서 고 pH 용액과 함께 인큐베이션함으로써 결합된 파지를 용리시켰다. 이어서 이. 콜라이를 방출된 pH 중화된 파지 용액으로 감염시키고, 제1 라운드 파지의 제제를 수득하였다. 사이클을 반복적으로, 예를 들어 2 또는 3회 수행하고, 표적화 파지를 풍부화시키기 위해, 추후 선택 라운드에서, 예를 들어 세척 단계의 수를 증가시키고, 항원 농도를 감소시키고, 차단된 스트렙타비딘 비드 또는 차단 시약으로 코팅된 웰로 예비선택함으로써 엄격성 조건을 증가시킬 수 있었다.
연속 라운드의 파지 증폭에 의한 선택 후에, PD-L1 결합 클론을 가용성 아피머 ELISA에 의해 확인하였다. 간략하게, 아피머를 파지미드 벡터로부터 과다발현시키고, 박테리아 세포를 용해시키고, 용해물을 ELISA에 사용하여, 아피머 상의 His6 태그에 접합된 항체를 사용하여 플레이트 상에 고정화된 PD-L1에 대한 아피머 결합을 검출하였다. 특이적 결합을 나타내는 클론을 서열분석하여 루프 서열을 확인하였다.
예시하자면, 아피머 라이브러리로부터 PD-L1 결합 파지의 선택은 하기 기재된 바와 같이 대략 6 x 1010개 크기의 다양성의 라이브러리로부터 첨가된 대략 1 x 1012개 파지를 사용하여 수행하였다.
비오티닐화된 항원은 M280 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 비드 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 상에 포획되었다. 항원은 알 앤 디(R & D)에 의해 Fc-절단된 포맷으로 공급되고, EZ 링크 술포-NHS-LC 비오틴 키트 (피어스(Pierce))를 사용하여 사내 비오티닐화된 것이었다.
실시예 2: PD-L1을 발현하는 인간 암 세포주에 대한 항-PD-L1 아피머의 결합 친화도 (도 2)
AVA04 아피머 폴리펩티드의 결합 친화도를 인간 폐 선암종 세포주에서 유동 세포측정법을 사용하여 결정하였다. PD-L1을 발현하는 H441 세포를 10%의 FBS (깁코)와 페니실린 (100 U/ml, 하이클론(Hyclone)) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml, 하이클론)을 함유하는 RPMI-2640 (시그마(Sigma))에서 성장시키고, 여기서 조직 배양물로부터 탈착시키고, DPBS를 사용하여 세척하였다. 세포를 300rpm으로 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 세포를 PBS 중에 재현탁시키고, 웰당 50000개 세포를 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 보냈다. 세포를 PBS로 세척하였다. 아피머 및 대조군을 염색 완충제 (알앤디) 중에 이중으로 희석하고, 4 ±1℃에서 대략 60분 동안 염색을 위해 세포 상에 첨가하였다. 세포를 세척하고, 2차 항-시스타틴 A (알앤디)를 염색 완충제 (알앤디) 중에 1:15로 희석하고, 4 ±1℃에서 대략 40분 동안 염색을 위해 세포 상에 첨가하였다. 세포를 세척하고, 검출 항체 A488 항-염소 (바이오레전드(Biolegend))를 염색 완충제 (알앤디) 중에 1:100으로 희석하고, 4 ±1℃에서 대략 30분 동안 염색을 위해 세포 상에 첨가하였다. 최종적으로, 세포를 세척하고, 생존 및 사멸 세포를 4 ±1℃에서 10분 동안 염색 완충제 중에 희석된 L/D 염색 좀비 아쿠아 (바이오레전드)를 사용하여 염색하였다. 세포를 세척하고, 고정 완충제 (알앤디)를 4 ±1℃에서 10분 동안 각 웰에 첨가한 다음, EDTA 함유 PBS (론자(Lonza))를 첨가한 후, 플레이트를 유동 세포측정기 (구아바 12 HT, 밀리포어(Millipore)) 상에서 판독하였다. 사멸 세포를 배제하고, 형광 그린 채널 (488 nm/525/30)을 획득하였다. 인사이트를 사용하여 결과를 분석하고, 그래프패드를 사용하여 데이터를 플롯팅하였다.
AVA04 아피머 폴리펩티드의 예가 표 4A, 4B 및 5에 제공된다.
표 4A. 예시 PD-L1 아피머 폴리펩티드에 대한 루프 서열
Figure pct00024
표 4B. 예시 PD-L1 아피머 폴리펩티드에 대한 전체 아미노산 서열
Figure pct00025
표 5. 예시 PD-L1 아피머 폴리펩티드 서열
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 3: 이. 콜라이에서의 아피머 다량체의 발현 (도 3)
200ng 발현 플라스미드 pD861 (아툼(Atum))을 제조업체 프로토콜을 사용하여 BL21 이. 콜라이 세포 (밀리포어) 내로 형질전환시켰다. 총 형질전환된 세포 혼합물을 50ug/ml 카나마이신 (어플라이켐(AppliChem))을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
이어서 형질전환된 이. 콜라이 론을 1x 브로쓰 배지 (멜포드(Melford)) & 50 ug/ml 카나마이신의 멸균 플라스크로 옮기고, 250 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 세포가 0.8-1.0의 OD600에 도달하였을 때 10 mM 람노스 (알파 에이사(Alfa Aesar))를 사용하여 발현을 유도하고, 이어서 배양물을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4,500 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 수거하였다.
배양 부피 < 500 ml를 위해, 이. 콜라이 세포 펠릿을 습윤 세포 페이스트 그램당 0.5 ml 10x 버그버스터 (밀리포어), 리소자임 (어플라이켐) 및 벤조나제 (밀리포어)로 보충된 1:10 NPI20 완충제 (50mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 20mM 이미다졸 (시그마)) 중에 재현탁시킴으로써 용해시켰다. 세포를 병 롤러 상에서 실온에서 1시간 동안 용해시켰다. 배양 부피 > 500 ml를 위해, 세포 펠릿을 1:10 보충된 NPI20 중에 재현탁시키고, 2분 동안 초음파처리하였다 (10초 온/오프 사이클). 용해 후, 용액을 4℃에서 1시간 동안 20,000 xg로 원심분리하였다.
니켈 아가로스 친화성 수지 (슈퍼-NiNTA500; 제네론(Generon))를 사용하는, 정화된 상청액으로부터의 His 태그부착된 단백질의 배치 결합 친화도 정제.
적절한 부피의 NiNTA 수지 (20mg 단백질당 1mL의 결합 능력)를 5 칼럼 부피 (CV) 물로 세척하여 저장 용액을 제거하고, 이어서 StEP™ 칼럼 (톰슨(Thompson))에서 중력 유동을 사용하여 5 CV NPI20 완충제로 평형화시켰다. 수지를 정화된 이. 콜라이 용액과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 용액을 중력 유동에 의해 StEP™ 칼럼에 통과시키고, 수지를 5CV NPI20 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질을 5 CV의 NPI400 (50mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 0.4M 이미다졸 (시그마))을 사용하여 수지로부터 용리시켰다. 용리된 단백질을 센트리퓨어 칼럼 (이엠피 바이오테크 게엠베하(emp Biotech GmbH))을 사용하여 1x PBS 중으로 탈염시켰다. 나노드롭 (써모) A280 판독치를 사용하여 단백질 수율을 추정하였다. AKTA 엑스프레스 (지이(GE)) 상에서 PBS 1x 중 2.6ml/분 유량으로 전개되는 하이로드 26/600 슈퍼덱스 200pg (지이)를 사용하여 정제용 SEC를 수행하였다. 용리된 단백질 샘플을 SDS-PAGE 볼트 비스 트리스 플러스 4-12% 겔 (써모) 상에서 200V의 노벡스(Novex)™ 20X 볼트™ MES SDS 전개 완충제 (써모) 중에서 환원 샘플 완충제와 함께 95℃에서 10분 동안 전개시켰다. 겔 상의 단백질 밴드를 퀵 쿠마시 (제네론)로 염색하였다. 파게룰러 사전염색된 단백질 분자량 마커 (써모)를 겔 상에서 전개시켜 융합 단백질의 분자량을 추정하였다.
실시예 4: 경쟁적 ELISA 검정 및 PD-L1 결합 비아코어 (도 4a 및 도 4b)
PD-L1/PD-1 경쟁적 ELISA (도 4a)
아피머 다량체의 경쟁적 억제를 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 평가하였다. hu PD-1-Fc (알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 플레이트 상에 0.5μg/ml로 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 세척기를 사용하여 150 μl 세척 완충제 (PBS, 트윈 20 0.1%)로 2회 세척하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 PBS 중 카세인 5% (시그마)로 포화시켰다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 세척하였다. 이어서 아피머 및 대조군 (hu PD-1-Fc, 알앤디 시스템즈, 블랭크)을 이중으로 희석하고, 30 ng/ml의 huPD-L1-Fc (알앤디 시스템즈)와 함께 30분 동안 사전인큐베이션한 다음, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 플레이트 상에 로딩하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하였다. 이어서 비오티닐화된 폴리클로날 항체 항 hu PD-L1 (알앤디 시스템즈)을 희석 완충제 중에 희석하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 인큐베이션하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하고, 스트렙타비딘 HRP를 실온 (25 ±1℃)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 기질 (TMB, 피어스 써모-사이언티픽)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 산성 용액을 사용하여 반응을 중지시키고, 플레이트를 450-630 nm에서 판독하였다. 이어서 내삽된 비선형 4-파라미터 표준 곡선을 사용하여 IC50을 계산하였다.
PD-L1 결합 비아코어 (도 4b)
아민 커플링 시약 (지이)을 사용하여 10mM 아세트산나트륨 pH 4.0 (지이) 중 PD-L1-Fc (알앤디 시스템즈)로 고정화된 시리즈 S 센서 CM5 칩 및 전개 완충제 HBS-EP+ (지이)를 사용하여 AVA04-141 인라인 융합체 (ILF) 포맷에 대해 비아코어 T200 동역학적 분석을 수행하였다. 농도 적정의 아피머 단량체를 분석물로서 30μl/분의 유량으로 150초의 회합 시간에 이어 300초의 해리 시간으로 전개시켰다. 아피머 이량체, 삼량체 및 사량체 융합 단백질을 분석물로서 30μl/분의 유량으로 300초의 회합 시간에 이어 600초의 해리 시간으로 전개시켰다. PD-L1-Fc 고정화된 표면을 5mM NaOH (지이)를 사용하여 20 μl/분 유량으로 20초 동안 재생시켰다. 데이터 블랭크를 차감하고, 1:1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어; 지이)에 피팅시켜 겉보기 KD 값을 계산하였다.
실시예 5: 아피머 Fc 융합체 및 이펙터 기능 (ADCC)의 특징화
SEC-HPLC (도 5a)
현탁 HEK 세포 (Expi293F 세포주; 써모) 형질감염을 발현 벡터 pD2610v14 (아툼)에 의해 엑스피펙타민 시약 (써모)을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 형질감염 7일 후에 10,000xg로 1시간 동안 원심분리함으로써 상청액을 수거하고, 0.45μm 여과지를 사용하여 여과하였다. AKTA 엑스프레스 (지이) 상에서 맙셀렉트 슈어 하이트랩 칼럼을 사용하여 단백질을 정제하였다. 수지를 5 칼럼 부피 (CV) 물로 세척하고, 5 CV PBS 1x로 평형화시켰다. 이어서 상청액을 5ml/분의 유량으로 통과시키고, 이어서 10 CV PBS 1x로 세척하였다. 결합된 단백질을 5 CV 0.1M 글리신 pH 2.8 중에서 용리시키고, 센트리퓨어 탈염 칼럼 (이엠피 바이오테크 게엠베하)을 사용하여 PBS 1x 중으로 완충제 교환하였다. 그 후, 정제용 SEC를 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 얼티메이트 3000 HPLC (써모) 상에서 PBS 1x 중 0.8ml/분으로 전개되는 MAbPac SEC-1 칼럼 (써모)을 사용하여 분석용 SEC를 수행하였다.
비아코어 동역학 (도 5b)
비아코어 동역학적 분석을 700초의 회합 시간 및 1200초의 해리 시간으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 저 농도의 경우, 3.5 nM NaOH (지이)를 사용하여 20μl/분의 유량으로 20초 동안 표면 재생을 수행하였다. 고 농도의 경우, 시간을 30초로 증가시켰다.
ADCC 리포터 생물검정 (도 5c)
ADCC 리포터 생물검정은 ADCC 작용 메카니즘 (MOA) 검정에서 치료 항체 약물에 의한 경로 활성화에 대한 생물학적 활성을 정량화하기 위한 프로메가 코포레이션으로부터의 생물발광 리포터 검정이다. 기능적 IgG1 Fc 상에 포맷화된 AVA04-251은 ≥1 nM의 EC50으로 ADCC 기능을 나타낼 수 있었다.
간략하게, 표적 세포 H441 세포 (huPD-L1을 발현함)를 96 웰 플레이트에 웰당 20,000개 세포의 밀도로 100 ul 중에 시딩하고, 가습 CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 다음 날, 샘플 및 대조군을 ADCC 완충제 (프로메가) 중에 이중으로 희석하였다. 그 동안, 이펙터 세포를 해동시키고 (Jurkat FCgRIIIa 리포터 NFAT 세포, 프로메가), 630 ul의 초기 세포 현탁액을 3.6 ml의 ADCC 완충제 중에 희석하였다. 95 ul의 배지를 플레이트로부터 제거하고, 25ul의 ADCC 완충제, 25 ul의 샘플 희석물 또는 대조군 및 25 ul의 이펙터 세포를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 가습 CO2 인큐베이터에서 6시간 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 실온에서 평형화시키고, 75 ul의 바이오글로 루시페라제 검정 시약 (프로메가)을 각 반응 웰에 첨가하고, 실온에서 5-10분 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트 판독기 (클라리오스타, 비엠지(BMG))를 사용하여 발광을 측정하였다. 그래프패드를 사용하여 유도 배수=f(로그 농도)로서 결과를 플롯팅하였다.
실시예 6: 경쟁적 ELISA 검정 (도 6a-6c)
PD-L1/ PD-1 경쟁 ELISA (도 6a)
V.2로 포맷화된 다양한 아피머 폴리펩티드를 도 4a에 기재된 바와 같이 경쟁적 ELISA에서 시험하였다. 시험된 모든 포맷화된 아피머는 0.26 내지 24.6 nM 범위의 IC50으로 경쟁하였다. 대조군 항체 (29E2A3, 바이오레전드)는 포맷화된 아피머와 대등한 IC50으로 경쟁하였다 (IC50=0.18 nM).
PD-L1/ CD80 경쟁 ELISA (도 6b)
V.2로 포맷화된 다양한 아피머 폴리펩티드를 경쟁적 ELISA에서 시험하였다.
시험된 모든 포맷화된 아피머는 0.41 내지 12.77 nM 범위의 IC50으로 CD80과 경쟁하였다. 대조군 항체 (29E2A3, 바이오레전드)는 포맷화된 아피머와 대등한 IC50으로 경쟁하였다 (IC50=0.31 nM).
간략하게, 경쟁적 억제를 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 평가하였다. hu CD80-Fc (알앤디 시스템즈)를 플레이트 상에 1 ug/ml로 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 세척기를 사용하여 150 μl 세척 완충제 (PBS, 트윈 20 0.1%)로 2회 세척하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 PBS 중 카세인 5% (시그마)로 포화시켰다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 세척하였다. 이어서 아피머 및 대조군 (mAb 항 huPD-L1 29E.2A3, 바이오레전드; hu PD-L1-Fc, 알앤디 시스템즈, 블랭크)을 이중으로 희석하고, 1.6 nM의 huPD-L1-Fc (알앤디 시스템즈)와 함께 30분 동안 사전인큐베이션한 다음, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 플레이트 상에 로딩하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하였다. 이어서 비오티닐화된 폴리클로날 항체 항 hu PD-L1 (알앤디 시스템즈)을 희석 완충제 중에 희석하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 인큐베이션하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하고, 스트렙타비딘 HRP를 실온 (25 ±1℃)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 기질 (TMB, 피어스 써모-사이언티픽)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 산성 용액을 사용하여 반응을 중지시키고, 플레이트를 450-630 nm에서 판독하였다. 이어서 내삽된 비선형 4-파라미터 표준 곡선을 사용하여 IC50을 계산하였다.
기준 항체 경쟁 ELISA (도 6c)
AVA04-25_V.2를 아벨루맙, 아테졸리주맙 및 두르발루맙에 대한 경쟁적 ELISA에서 시험하였다. AVA04-251_V.2는 0.29 내지 1.71 nM 범위의 IC50으로 각각의 기준 항체와 경쟁하였다.
간략하게, 기준 항체와의 경쟁적 억제를 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 평가하였다. 아벨루맙, 아테졸리주맙 및 두르발루맙을 플레이트 상에 0.5 ug/ml로 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 세척기를 사용하여 150 μl 세척 완충제 (PBS, 트윈 20 0.1%)로 2회 세척하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 PBS 중 카세인 5% (시그마)로 포화시켰다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 세척하였다. 이어서 아피머 및 대조군 (기준 항체, 블랭크)을 이중으로 희석하고, 0.07 nM의 huPD-L1-Fc (알앤디 시스템즈)와 함께 60분 동안 사전인큐베이션한 다음, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 플레이트 상에 로딩하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하였다. 이어서 비오티닐화된 폴리클로날 항체 항 hu PD-L1 (알앤디 시스템즈)을 희석 완충제 중에 희석하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 인큐베이션하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하고, 스트렙타비딘 HRP를 실온 (25 ±1℃)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 기질 (TMB, 피어스 써모-사이언티픽)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 산성 용액을 사용하여 반응을 중지시키고, 플레이트를 450-630 nm에서 판독하였다. 이어서 내삽된 비선형 4-파라미터 표준 곡선을 사용하여 IC50을 계산하였다.
실시예 7: 반감기 연장된 아피머의 약동학적 연구 (도 7) 및 조직 분포 (도 30)
AVA04-251_V.2를 10 mg/kg으로 C57BL/6 마우스에게 정맥내로 (IV) 주사하였다. 6마리의 마우스에게 주사하고, 9개 시점을 수집하였다 (0h, 0.25h, 6h, 24h, 72h, 120, 168h, 336h 및 480h). 각각의 시점에 대한 혈청 샘플을 풀링하고, 참조 표준물로서 주사된 분자를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 결과를 15분에서의 초기 용량의 백분율로서 표현하였다.
본 약동학적 연구에서 사용된 AVA04-251_V.2는 실시예 5에 기재된 바와 같이 Expi293F로부터 엑스피펙타민 형질감염을 사용하여 제조하였다. 엔도세이프 넥스젠(Endosafe NexGen)-PTS™ 판독기 (찰스 리버(Charles River))를 사용하여 LAL 검정을 수행함으로써 단백질 샘플 중 내독소 수준을 0.01EU/mg으로서 확인하였다. HEK293 HCP 제2 세대 ELISA (시그누스(Cygnus))를 제조업체 프로토콜에 따라 사용하여 포유동물 숙주 세포 단백질을 정량화하였다. 샘플은 단백질 mg당 5ug/ml HCP를 함유하였다.
동소 MDA-MB-231 종양 세포를 보유하는 인간화 NOG 마우스에게 125I-아피머 및 125I-아벨루맙을 정맥내 투여한 후 총 방사능의 조직 분포를 평가하였다 (도 32a). 마우스를 그의 종양 크기에 따라 무작위화하고, 아벨루맙 또는 AVA04-251_V.2를 IV 주사하였다 (군 및 시점당 n=5). 마우스를 8 및 96시간에 희생시켰다. 혈액 및 기관을 취하고, 제거하고, 칭량하였다. 감마 방사선의 검출 및 정량적 측정을 위해 설계된 RIASTAR A5410 다중검출기 감마 계수기 (팩커드(Packard))를 사용하여 생물학적 샘플에 함유된 총 방사능을 결정하였다. 칭량된 시편의 분취물을 5-mL 폴리프로필렌 튜브 내에 도입하였다. 이어서 직접적 감마 검출을 위해 튜브를 계수 트레이 내에 로딩하였다. 도 31b는 혈장/종양 비를 보여준다.
종합하면, AVA04-251_V.2는 아벨루맙과 유사한 조직 분포를 가졌다.
실시예 9: 인간 PBMC 자극 검정에 의한 면역원성 시험 (도 8)
아피머 모 HEK 세포 형질감염 및 맙셀렉트슈어 정제를 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하되, SP 고성능 칼럼 (지이)을 사용하고 20mM 아세트산나트륨 pH4 완충제를 사용하는 양이온 교환 정제 단계를 추가하여 수행하였다. 전개 완충제 및 0.1% 트리톤 114x (시그마)의 10CV 세척액을 사용하여 음으로 하전된 내독소를 제거하였다. 결합된 단백질을 20mM 아세트산나트륨 pH4 및 2M NaCl로 용리시켰다. 정제용 SEC를 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 엔도세이프 넥스젠-PTS™ 판독기 (찰스 리버)를 사용하여 LAL 검정을 수행함으로써 단백질 샘플 중 내독소 수준을 0.04EU/mg으로서 확인하였다. HEK293 HCP 정량화 키트 (시그누스)를 제조업체 프로토콜에 따라 사용하여 숙주 세포 단백질을 정량화하였다. 샘플은 단백질 mg당 30 ng/ml HCP를 함유하였다.
각각의 건강한 공여자로부터 단리된 PBMC를 극저온 저장으로부터 회수하고, 무혈청 세포 배양 배지에서 해동시키고, 조직-배양 처리된 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트 내에 시딩하였다. 모든 시험 생성물을 무혈청 세포 배양 배지 중에 희석하고, 웰에 50 μg/ml의 최종 농도로 첨가하고, 스테핀 A를 25 μg/ml로 시험하였다. 세포를 7일 동안 배양물 중에 유지시켰다. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU) 혼입을 측정함으로써 CD4+ T 세포 증식을 평가하였다. 제6일에 PBMC 배양물을 대략 16시간 동안 EdU로 펄싱하였다. 제7일에 세포를 T 세포 표면 마커 (CD3, CD4 및 CD8)에 대해 형광 염색하고, 고정시키고, 투과화시키고, 혼입된 EdU를 형광 아지드로 염색하였다. 자극 지수를 완충제에 대한 비로서 계산하였다. SI>2를 양성 반응으로 간주하였다. 시험된 각각의 분자에 대해 반응자의 %를 플롯팅하였다.
종합하면, 양성 대조군 KLH만이 처리 7일 후에 T 세포 증식을 자극할 수 있었다.
실시예 10: Fc 상의 다양한 부위에서의 아피머 포맷화 (도 9)
AVA04-236-A(EAAAK)6 (서열식별번호: 196) hIgG1 Fc (AR), AVA04-236-A(EAAAK)6 (서열식별번호: 196) hIgG1 Fc C 말단 아피머 (AQ), 및 hIgG1 Fc 상의 AVA04-236 이량체 (AG)에 대해 Expi293F 형질감염 및 1 단계 맙셀렉트 슈어 정제를 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 분석용 SEC를 MAbPac SEC-1 (써모)을 사용하여 수행하고, 얼티메이트 3000 HPLC (써모) 상에서 PBS 1x 이동상 중 0.8ml/분으로 전개시켰다. AVA04-236-A(EAAAK)6 (서열식별번호: 196) hIgG1 Fc, AVA04-236-A(EAAAK)6 (서열식별번호: 196) hIgG1 Fc C 말단 아피머, 및 hlgG1 Fc 상의 AVA04-236 이량체에 대한 결과는 각각 96%, 97% 및 92%였다.
실시예 11: 동역학적 분석 (도 10)
단량체 아피머, N-말단 hIgG1 Fc 강직 링커 (AR), N-말단 이량체 hIgG1 Fc (AG), C-말단 hIgG1 가요성 링커 (AQ), 및 N-말단 hIgG1가요성 링커 (V.2)에 대해 비아코어 동역학적 분석을 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 분석은 500초의 회합 시간 및 800초의 해리 시간을 사용하였다. 3mM NaOH (지이)를 사용하여 20ul/분으로 20초 동안 재생을 수행하였다. 단량체 아피머, N-말단 hIgG1 Fc 강직 링커, N-말단 이량체 hIgG1 Fc, C-말단 hIgG1 가요성 링커, 및 N-말단 hIgG1가요성 링커에 대한 KD 결과는 각각 6.4 nM, 0.89 nM, 0.19 nM, 2.01 nM 및 0.63 nM이었다.
실시예 12: 이필리무맙 (바이오시밀러) 융합체 분석 (도 11a-11b)
이필리무맙 및 이필리무맙-AVVA04-141에 대해 1:1 비의 중쇄:경쇄 벡터 pD2610v14 (아툼)를 사용하여 Expi293F 형질감염을 수행하였다. 친화성 크로마토그래피 및 분석용 SEC HPLC를 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정제용 SEC 및 환원 및 비-환원 SDS-PAGE QC를 실시예 3에 기재된 바와 같이 전개시켰다.
실시예 13: 동역학적 분석 (도 12a-12c)
비아코어 동역학적 분석을 실시예 4에 기재된 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 이필리무맙-141 융합 단백질을 10mM 아세트산나트륨 pH4 완충제 (지이) 중에서 아민 커플링을 사용하여 CM5 칩 표면 상에 고정화시켰다. PD-L1-Fc 또는 CTLA4-Fc 항원 (알앤디 시스템즈)을 PD-L1-Fc의 경우 300초의 회합 시간 및 600초의 해리 시간 및 CTLA4-Fc의 경우 700초의 회합 시간 및 1200초의 해리 시간 동안 적정하였다. 3mM NaOH (지이)를 사용하여 20μl/분으로 20초 동안 재생을 수행하였다.
실시예 14: 이중특이적 베바시주맙 (바이오시밀러)-PD-L1 아피머 특징화 (도 13a-13c) 및 약동학적 분석에 의한 반감기 결정 (도 13d)
베바시주맙-AVA04-251 이중특이적 Af-mAb를 1:1 VH:Vk 플라스미드 pD2610v14 (아툼)의 형질감염 비를 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하였다. 강성 또는 가요성 링커를 갖는 베바시주맙-AVA04-251 이중특이적 Af-mAb를 10mM 아세트산나트륨 pH5.0 (지이)과의 아민 커플링을 사용하여 CM5 칩 표면 상에 고정화시켰다. hPDL1-Fc (알앤디 시스템즈)를 분석물로서 300초의 회합 시간 및 600초의 해리 시간으로 전개시키고, 3 mM NaOH (지이)를 사용하여 20μl/분으로 20초 동안 재생시켰다 (도 13b).
베바시주맙-AVA04-251 이중특이적 Af-mAb 또는 베바시주맙 (바이오시밀러, 항-VEGF, 인비보젠(Invivogen))을 각각 10mM 아세트산나트륨 pH4.5 및 5.5 (지이)와의 아민 커플링을 사용하여 CM5 칩 표면 상에 고정화시켰다. hVEGF (페프로테크(Peprotech))를 분석물로서 전개시키고, 단일 사이클 동역학으로서 분석하고, x5 농도를 700초의 회합 시간 및 1200초의 해리 시간으로 전개시키고, 3.5 mM NaOH (지이)를 사용하여 20μl/분으로 20초 동안 재생시켰다. 데이터 블랭크를 차감하고, 1:1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어; 지이)로 분석하여 겉보기 KD 값을 계산하였다.
도 13d: C57/Bl6 마우스에서의 약동학적 연구: 도 7에 기재된 바와 같이, 마우스에게 10 mg/kg을 정맥내로 (IV) 주사하였다. 6마리의 마우스에게 주사하고, 9개 시점을 수집하였다 (0h, 0.25h, 6h, 24h, 72h, 120, 168h 및 336h). 각각의 시점에 대한 혈청 샘플을 풀링하고, 참조 표준물로서 주사된 분자를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 결과를 15분에서의 초기 용량의 백분율로서 표현하였다. 아피머 Af-mAb 반감기는 베타 상에서 Fc 포맷화된 아피머 (AVA04-251_AQ.2)와 대등한 약 127시간으로 추정되었다.
실시예 15: 결정학을 위한 단백질 생산 (도 14-16)
hPD-L1 결합 도메인 (N-말단 IgV 도메인 18-134)을 이. 콜라이에서 봉입체로서 발현시켰다. 세포 펠릿을 트리스 완충 염수 (TBS) 중에 가용화시키고, 4℃에서 16시간 동안 8 M 우레아로 보충하였다. His 태그부착된 항원을 용리 완충제 TBS, 8 M 우레아 및 400 mM 이미다졸과 함께 도 3에 기재된 바와 같이 NiNTA를 사용하여 정제하였다. ~100mg 단백질을 1L 재폴딩 완충제 (0.5 M 아르기닌으로 보충된 100 mM 트리스 pH 8)에 적가하여 단백질을 재폴딩시켰다. 이어서 0.25 mM 글루타티온 (환원 및 산화) 및 프로테아제 억제제 정제 (EDTA 무함유; 로슈(Roche))를 4℃에서 밤새 교반하였다. 이어서 단백질을 접선 유동 여과 (TTF)에 의해 농축시키고, TBS & 10% 글리세롤 중으로 완충제 교환하였다. AKTA 엑스프레스 (지이)를 사용하여 TBS & 10% 글리세롤 전개 완충제 중 2.6 ml/분으로 전개되는 하이로드 26/600 슈퍼덱스 75 pg를 사용하여 단백질을 정제하였다. AVA04-261을 TBS 전개 완충제를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 용리된 단백질을 -20℃에서 2 mg/ml로 저장하고, 이어서 AVA04-261을 hPD-L1 항원과 등몰량으로 혼합하였다. 이어서 정제용 SEC를 상기 기재된 바와 같이 전개시켰다. 용리된 분획을 68 mg/ml로 농축시켰다.
결정학을 수행하기 위해, 0.1μl 단백질 및 0.1μl 저장 용액을 사용하여 시팅 드롭 증기 확산 방법에 의해 여러 상업용 스크린을 설정하였다. 이들을 밤새 실온에 두고, 많은 상이한 완충제로부터 육각형 결정을 수득하였다. 25% 제파민 SD-2001, 100 mM MES pH 5.5 및 100 mM 이염기성 말론산나트륨 중에서 수득된 결정에 대해 회절 데이터를 수집하였다. 결정을 모액 중에서 액체 질소 하에 급속-냉각시켰다. 다이아몬드 라이트 소스(Diamond light source) (영국)에서 데이터를 수집하였다. AVA04-261/hPD-L1 결합 도메인 단백질 복합체 구조를 pdb 구조 3KSE, 4N6T 및 5C3T로부터 유래된 모델로의 분자 대체를 사용하여 CCP4 스위트를 사용하여 해석하고, 회절을 2.09 Å로 수집하였다. 주요 상호작용 표면은 소수성이었으며 AVA04-261의 루프 2가 hD-L1 항원과 상호작용하였다. hPD-L1 결합 표면은 PD-L1에 결합하는 단백질의 문헌 실시예와 매우 유사하였다 (1. 문헌 [Lee, J. et al. (2016) Nature Communications 7, 13354], 2. 문헌 [Zak, K. et al. (2016) Oncotarget, 7, 30323], 3. 문헌 [Zhang F. et al. (2017) Cell Discovery, 3, 17004].)
실시예 16: 반감기 연장된 항-인간 PD-L1 이량체 아피머 인-라인 융합체 (ILF): 강성 또는 가요성 유전자 링커를 사용한 개략적 표현 및 XT 명명법 (도 17a-17b)
아피머 ILF를 실시예 3에 상술된 바와 같이 제조하였다. 정제용 SEC 후, 단백질을 실시예 3에 기재된 바와 같이 SEC-HPLC 상에서 전개시켰으며, 모든 융합 단백질에 대해 >95% 순도였다. 도 17a를 참조한다.
비아코어 동역학적 분석은 항-인간 PD-L1 및 항-인간 혈청 알부민 아피머 둘 다가 유전자 융합되는 동안 표적 단백질을 결속시킬 수 있고, AVA04 아피머는 2-6배 친화도 내에서 인간 PD-L1에 결합하고 HSA 아피머는 5배 친화도로 HSA에 결합한다는 것을 입증하였다 (실험을 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다). 전개 완충제 HBS-EP+ (지이)를 사용하여 혈청 알부민에 대해 비아코어 T200 동역학적 분석을 수행하고, 시리즈 S 센서 CM5 칩을 아민 커플링 시약 (지이)을 사용하여 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 (지이) 중 인간 혈청 알부민 (시그마; A37812)으로 표면 Fc2 상에서 고정화시켰다. 농도 적정의 아피머 단량체를 분석물로서 30μl/분의 유량으로 전개시켰다. 동역학적 데이터를 블랭크 차감하고, 1:1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어; 지이)에 피팅시켜 KD 값을 계산하였다. 도 17b를 참조한다.
실시예 17: 반감기 연장이 있는 ILF 삼량체 (도 18a, b 및 도 31)
위치 A, B 또는 C에서 반감기 연장 아피머를 갖는 ILF AVA04-251 삼량체: 비아코어 동역학적 분석은 아피머가 유전자 융합되는 동안 표적 단백질을 결속시킬 수 있다는 것을 제시하였다. AVA04 아피머 이량체는 인간 PD-L1에 251 ILF 이량체 (포맷 BH)의 2배 내에서 결합하였고, 다른 아피머는 HSA를 결속시켰다. 비아코어를 PD-L1에 대해 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하고, HSA 결합에 대해 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 31: ILF 아피머 XT의 약동학: 반감기 연장이 있는 ILF AVA04-251 삼량체를 C57/Bl6 마우스에서의 약동학적 연구에서 시험하였다. 도 7에 기재된 바와 같이, 마우스에게 10mg/kg을 정맥내로 (IV) 주사하였다. 6마리의 마우스에게 주사하고, 9개 시점을 수집하였다 (0h, 0.25h, 6h, 24h, 72h, 120, 168h 및 336h). 각각의 시점에 대한 혈청 샘플을 풀링하고, 참조 표준물로서 주사된 분자를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. 결과를 15분에서의 초기 용량의 백분율로서 표현하였다. 반감기 연장이 없는 아피머 ILF (BH)는 빠른 클리어런스를 나타냈지만 (t1/2 3.2h), ILF AVA04-251 XT 포맷 반감기는 베타 상에서 23.8-24.2시간 범위로 추정되었다.
실시예 18: 표적 결합 서열의 분석 (도 19)
루프 4 내의 x9 아미노산 위치에 걸친 AVA04-251 알라닌 스캐닝. 1μl의 정제된 변이체 단백질을 환원 SDS-PAGE 전개시켰으며, 이. 콜라이 생산 수율은 모든 변이체에 대해 대략 150 mg/L이었다. hPD-L1 비아코어 동역학적 분석을 50 nM 농도에서 실행하여, 루프 4의 위치 1 및 4를 표적 결합에 필수적인 것으로 확인하였다.
실시예 19: 안정성 (도 20)
AVA04-251 V.2의 안정성을 시험하기 위해, 9개월 동안 매월 PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 야라-3000 (페노메넥스) 칼럼 상에서 SEC-HPLC 분석을 수행하였다. 샘플을 +4℃에서 저장하였다. 단량체 순도는 3-5%만큼 감소하였다.
실시예 20: (도 21)
AVA04-251 CG, 항-PDL1 아피머에 힌지 S228P 돌연변이 및 (G4S)4 (서열식별번호: 197) 링커를 갖는 IgG4 Fc 융합 단백질을 부착시켰다. 단백질을 실시예 5에 기재된 바와 같이 일시적 Expi293F 세포로부터 생산하였다. 융합 단백질을 100mM 시트르산나트륨 pH 3.5 완충제 중에서 용리되는 PrismA (지이) 단백질 A 친화도 수지를 사용하여 정제하였다. 이어서 정제용 SEC를 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 얼티메이트 3000 HPLC (써모) 상에서 PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 SEC-HPLC 야라-3000 칼럼을 사용하여 순도를 평가하였다. 최종 단백질은 >98% 순도였다.
실시예 21: (도 22)
AVA04-251 CF는 ADCC를 감소시키기 위한 L153A, L154A Fc CH1 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 융합체였다. 단백질을 일시적 Expi293F 세포로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 정제하였다. 얼티메이트 3000 HPLC (써모) 상에서 PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 SEC-HPLC 야라-3000 칼럼을 사용하여 순도를 평가하였다. 최종 단백질은 >99% 순도였다.
실시예 22: (도 23)
AVA04-261 아피머를 Fc의 IgG1 힌지 영역에 유전자 융합시키고, 이. 콜라이로부터 생산하였다 (BN 포맷). 단백질을 실시예 3에 기재된 바와 같이 정제하였다. SDS-PAGE를 전개시켜 이량체 종이 비-환원 조건 하에 힌지 내의 시스테인을 통해 이량체화되고 환원 완충제 중에서 단량체 종으로 환원된다는 것을 밝혀냈다. PD-1 PD-L1 차단 생물검정 (프로메가) 검정을 제조업체의 지침에 따라 이중으로 실행하고, AVA04-261 BN 포맷이 단량체 AVA04-261과 비교하였을 때 결합력을 가졌다는 것을 밝혀냈다. AVA04-261 BN 포맷의 비아코어는 59.9pM KD를 생성하였다.
실시예 23: (도 24)
AVA04-251 AZ 인간 IgG1 Fc 융합 단백질에서, 아피머를 Fc 힌지 영역에 직접 융합시켰다. 단백질을 일시적 Expi293F 세포로부터 생산하고, 실시예 5에 기재된 바와 같이 정제하였다. 얼티메이트 3000 HPLC (써모) 상에서 PBS 1x 완충제 중 1ml/분으로 전개되는 SEC-HPLC 야라-3000 칼럼을 사용하여 순도를 평가하였다. 최종 단백질은 >99% 순도였다. 데이터 블랭크 차감되고 1:1 결합 모델에 피팅된 비아코어 단일 사이클 동역학은 31.5pM의 KD를 나타냈다. PD-1 PD-L1 차단 생물검정 (프로메가)은 Fc 힌지와 아피머 사이의 (G4S)4 (서열식별번호: 197) 링커의 V.2 포맷과 동일한 활성을 입증하였다.
실시예 24: (도 25)
4개의 항-인간 PD-L1 아피머와의 인간 IgG1 Fc 융합체를 Fc의 N 또는 C 말단에서 융합시켰다. AVA04-251 AG.3, AVA04-251 BS 포맷을 Expi293F 세포로부터 생산하고, 맙셀렉트 슈어 수지를 사용하여 정제하였다. 이어서 정제용 SEC를 도 5a에 기재된 바와 같이 수행하였다. PD-1 PD-L1 차단 생물검정 (프로메가)에서 둘 다의 포맷은 PD-1에 대한 PD-L1 결합의 차단을 나타냈다. 데이터 블랭크 차감되고 1:1 결합 모델에 피팅된 비아코어 단일 사이클 동역학은 AVA04-251 AG.3 및 AVA04-251 BS에 대해 각각 36.2pM 및 25.7pM의 KD를 나타냈다.
실시예 25: (도 26)
PD-L1 결합 도메인 (14KDa)과 Fc 융합체 AVA04-251 V.2 또는 AVA04-236 V (82kDa)의 가교 질량 분광측정법을 수행하여 비-공유 결합 복합체를 분석하였다. 특수하게 개발된 가교 혼합물을 사용하여 과량의 인간 PD-L1 도메인과 아피머 Fc 융합체를 혼합하였다 (Bich, C et al. Anal. Chem., 2010, 82(1), pp 172-179). 용액을 +4℃에서 혼합하고 밤새 두었다. 고-질량 검출 시스템은 0 내지 1500 kDa의 고-질량 범위의 상호작용을 특징으로 하였다. MS 파라미터, 선형 및 양성 모드 둘 다, 이온 공급원 1: 20 kV, 이온 공급원 2: 17 kV. 렌즈 12 kV 펄스, 이온 추출 400 nsHM4, 획득 전압 3.14 kV 및 가속 전압 20 kV. 고-질량 MALDI 질량 분광측정법 및 화학적 가교를 사용하여 AVA04-Fc 융합 단백질 단독을 검출하였으며, 1개 PD-L1 (+14kDa) 및 2개 PD-L1 (+28kDa) 단백질에 결합하는 종은 화학량론 1:1 및 2:1 종의 존재를 확인시켜 주었다.
실시예 28: 시노몰구스 교차 반응성 (도 27 및 28)
도 4에 기재된 바와 같이 수행된 비아코어를 사용하여 예시된 AVA04-251 V.2 및 CG 포맷의 교차 반응성 (도 27). 인간 및 시노몰구스 PD-L1 Fc 항원 (알앤디 시스템즈)에 대한 친화도는 26-47pM 범위로 2배 이내였다.
ELISA에 의한 다양한_V.2 포맷화된 아피머의 교차 반응성 (도 28). 시험된 모든 포맷화된 아피머는 시노몰구스 PD-L1에 0.085 내지 0.375 nM 범위의 EC50으로 결합하였다. 기준 항체는 가장 잘 포맷화된 아피머와 유사한 EC50 = 0.044 nM에서 검출되었다.
간략하게, 교차 반응성을 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 평가하였다. 시노몰구스 PD-L1 His 태그 (시노 바이올로지칼(Sino Biological))를 플레이트 상에 2 ug/ml로 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 세척기를 사용하여 150 μl 세척 완충제 (PBS, 트윈 20 0.1%)로 2회 세척하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 PBS 중 카세인 5% (시그마)로 포화시켰다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 세척하였다. 이어서 아피머 및 대조군 (아테졸리주맙 및 블랭크)을 이중으로 희석하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하였다. 이어서 폴리클로날 항체 HRP 항 hu Fc (압캠(Abcam))를 희석 완충제 중에 희석하고, 실온 (25 ±1℃)에서 90분 인큐베이션하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 3회 세척하고, 기질 (TMB, 피어스 써모-사이언티픽)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 산성 용액을 사용하여 반응을 중지시키고, 플레이트를 450-630 nm에서 판독하였다. 이어서 내삽된 비선형 4-파라미터 표준 곡선을 사용하여 EC50을 계산하였다.
실시예 29: 혼합 림프구 반응 (도 29a 및 29b)
hFc1 포맷화된 아피머를 MLR 검정에서 시험하였다 (도 29a). 간략하게, 단핵구로부터 유래된 수지상 세포 (DC)를 7일 동안 배양된 CD14+ 단핵구로부터 제조하였다. 미성숙 DC를 제7일에 사용하고, 동종이형 T 세포 (음성 단리) 및 참조 물질 또는 비히클 대조군과 함께 배양하였다. 세포를 4일 동안 배양하고, 배양 기간 말기에 ELISA에 의해 상청액 중 IFN-γ를 측정하였다. 데이터는 평균 +/- S.E.M. pg/ml로서 제시되거나 (좌측) 또는 비히클 대조군에 대해 정규화된다 (우측) (n=6). **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, 시험 물질을 각각의 농도 SQT Gly V.2 대조군과 비교하는, 던넷 사후 검정을 동반한 이원 ANOVA를 사용. 점선은 평균 비히클 (RPMI-10) 값을 나타낸다. AVA04-251_V.2는 기준 항체 (아벨루맙)와 대등한 방식으로 IFNγ의 수준을 >2배만큼 증가시켰다.
XT 포맷화된 아피머를 이전에 기재된 바와 같이 MLR 검정에서 시험하였고 (도 29a), AVA04-251 XT14 및 XT16은 ILF 포맷으로서 IFNγ의 수준을 증가시켰다 (도 29b).
실시예 30: PBMC의 스타필로코쿠스 장독소 B 자극 (도 30)
건강한 인간 공여자 (N = 5)로부터의 PBMC를 검정의 개시시에 고정 농도의 스타필로코쿠스 장독소 B (SEB; 톡신 테크놀로지(Toxin Technology))와 함께 저농도 (10 및 100nM)의 AVA04-251_V.2 또는 대조군 항체와 함께 96시간 동안 배양하였다. 배양 상청액 중 IL-2 수준을 HTRF 분석 (시스바이오(Cisbio))에 의해 측정하고, 시험 품목 없이 SEB 단독만 있는 기저 수준과 비교하였다. AVA04-251_V.2는 용량 의존성 방식으로 인터류킨-2 (IL-2) 생산을 증가시켰다.
실시예 31: 동소 MDA-MB-231 종양 세포를 보유하는 인간화 NOG 마우스에서의 AVA04-251 Fc의 조직 분포 (도 32a)
마우스 (5마리/군)에게 125I-AVA04 Fc 또는 125I-아벨루맙을 10 mg/kg (500 μCi/kg)으로 IV 경로를 통해 주사하였다. 마우스를 8시간 또는 96시간에 희생시키고, 기관을 제거하고, 칭량하였다. RIASTAR A5410 (팩커드)을 사용하여 생물학적 샘플에 함유된 총 방사능을 측정하였다. 결과를 각각의 기관에 대해 초기 용량의 백분율 (ID %)로서 제시한다. 종양 대비 혈장의 비 (도 32b)는 종양 내의 축적이 96시간 후 혈장 내의 수준의 ≥5배이고 아벨루맙과 등가임을 나타낸다.
실시예 32: C57/Bl6 마우스 동계 모델에서의 인간화 PD-L1 MC38에서의 AVA04-251_V.2로의 처리 후 종양 성장 억제 (도 33a-33d)
마우스 (n=8)에게 인간화 PD-L1 MC38 종양 세포주 (마우스 PD-L1 세포외 부분이 hPD-L1에 의해 대체됨)를 우측 측복부 영역에 피하로 접종하였다. 종양이 ≥80 mm3이었을 때 생성물 및 대조군을 주사하였다. 10 mg/kg (AVA04-251_V.2 및 그의 대조군 SQT_V.2) 또는 5 mg/kg (대조군 항체인 아테졸리주맙 및 이소형 대조군)의 용량으로 3주 동안 1주 2회 처리를 제공하였다. 종합하면, 두 처리에 대해 종양 성장 억제가 나타났다 (도 33a). AVA04-251_V.2로 처리된 모든 마우스는 대조군과 비교하여 감소된 종양 크기를 가졌다 (도 33b). 1500 mm3에서의 생존 곡선은 AVA04-25_V.2 주사된 마우스의 50%가 무작위화 22일 후에 여전히 살아있었다는 것을 보여주었다 (도 33c). 또한, 대조군 항체 (아테졸리주맙)에 대한 생존 곡선 (도 33d)은 마우스의 50%가 D22에 살아있었다는 것을 보여주었다.
실시예 33. NCG 마우스에서의 피하 A375 인간 흑색종 인간화 모델의 처리에 대한 생체내 효능 연구에 있어서 AVA04-251_V.2로 처리된 군에서의 종양 성장 억제 (도 34a-34d)
PBMC를 2명의 건강한 공여자로부터 단리하였다. 총 T 세포를 단리하고, IL-2로 보충된 완전 배지에서 7 내지 10일 동안 2 라운드로 A375 세포에 대해 확장시켰다. 마우스 (n=10)에게 종양 발생을 위해 0.2ml PBS 중 A375 종양 세포 및 활성화된 T 세포를 우측 측복부 영역에 피하로 접종하였다. 세포 접종 1시간 후에 처리를 시작하였다. AVA04-251_V.2를 3주 동안 1주 2회 제공하였다. 종합하면, 대조군과 비교하였을 때 두 처리에 대해 종양 성장 억제가 나타났다 (도 34a). AVA04-251_V.2로 처리된 마우스의 70% 초과는 대조군과 비교하여 감소된 종양 크기를 가졌다 (도 34b). 800 mm3에서의 생존 곡선은 AVA04-25_V.2로 처리된 모든 마우스가 무작위화 32일 후에 800 mm3에 도달하였으며, 대조군의 경우 24일 후에 도달하였다는 것을 보여주었다 (도 33c). 또한, 대조군 항체 (아테졸리주맙)에 대한 생존 곡선 (도 34d)은 대조군 항체로 처리된 군 내의 모든 마우스가 동일하게 무작위화 32일 후에 800 mm3의 종양 크기에 도달하였다는 것을 보여주었다.
실시예 34. 마우스 동종이형 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서의 마우스 대용물 AVA04-182 V.2의 활성
마우스 PD-L1에 길항작용하는 마우스 대용물 아피머 AVA04-182 V.2는 C57/블랙6 마우스로부터 제조된 골수 수지상 세포 (BMDC)를 사용하여 작용 메카니즘을 입증하였다. BMDC를 수거하고, Balb/C 마우스의 비장으로부터 단리된 CD4+ T 세포와 혼합하였다. BMDC 및 CD4+ T 세포를 아벨루맙 및 이소형 대조군 mAb의 경우 70 nM 및 AVA04-182 V.2 및 SQT Gly V.2의 경우 7, 70 및 700 nM의 각각의 시험 분자와 4일 동안 공동-배양하였다. 상청액 중 마우스 IFN-γ (도 35a) 및 IL-2 (도 35b) 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
실시예 35. 마우스 PD-L1에 길항작용하는 마우스 대용물 아피머 AVA04-182 V.2를 사용하는 종양 성장 억제. AVA04-182 V.2 및 아벨루맙을 사용하는 생체내 MB49 마우스 방광 암종 동계 모델 (도 36a-36b).
MB49 종양 세포주를 마우스의 우측 측복부에 피하로 접종하였다. 종양이 50 mm3에 도달하였을 때 처리를 개시하고, IP 경로를 통해 3주 동안 격주로 투여하였다 (n=10). 시험된 분자는 이소형 mab 대조군 hIgG1 (10mg/kg), 아피머 대조군 SQT-Gly V.2 (10 및 20 mg/kg), 마우스 PD-L1 길항제 AVA04-182 V.2 (10 및 20 mg/kg), 아벨루맙 (10mg/kg) 및 비히클 대조군 (PBS)이었다. 종양의 성장 곡선을 측정하고, 실험 과정에 걸쳐 플롯팅하였다 (도 36a). AVA04-182 V.2는 비히클 및 아피머 대조군 (SQT-GlyV.2)과 비교하여 10 및 20 mg/kg 둘 다에서 종양 성장률을 유의하게 (통계적으로 유의함) 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 36b).
SEQUENCE LISTING <110> Avacta Group PLC <120> PD-L1 BINDING AFFIMERS, AND USES RELATED THERETO <130> A1224.70001WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> GB 1805963.4 <151> 2018-04-11 <160> 209 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met 1 5 10 15 His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu 20 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Glu Asp Leu Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Gly Phe 20 <210> 4 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, or Glu <220> <221> misc_feature <222> (50)..(69) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(69) <223> May be absent <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> Xaa is Gly, Ala, Val, Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (91)..(91) <223> Xaa is Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr <220> <221> misc_feature <222> (92)..(92) <223> Xaa is Gly, Ala, Val, Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (93)..(93) <223> Xaa is Ala, Val, Ile, Leu, Gly or Pro <220> <221> misc_feature <222> (94)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (97)..(113) <223> May be absent <220> <221> misc_feature <222> (114)..(114) <223> Xaa is Gly, Ala, Val, Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> Xaa is Ala, Val, Ile, Leu, Arg or Lys <400> 4 Met Ile Pro Xaa Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly 65 70 75 80 Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Asp Xaa Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp 115 120 125 Asp Glu Leu Thr Gly Phe 130 <210> 5 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (50)..(69) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(69) <223> May be absent <220> <221> misc_feature <222> (94)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (97)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly 65 70 75 80 Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp 115 120 125 Asp Glu Leu Thr Gly Phe 130 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Lys Ala Trp Gly Pro Lys Gln Trp Trp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Lys Pro Tyr Gly Pro Arg Asp Trp Asp 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Trp Trp 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 16 Asn Gln His Phe Pro His Ser Phe Trp 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Asn Ala His Phe Gly Pro Arg Phe Trp 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 18 Asn Thr Trp Phe Pro Glu Ser Phe Trp 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Asn Gln His Phe Pro Gln Ser Phe Trp 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 20 Lys Gln Tyr Gly Pro Asp Asp Trp Trp 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 21 Lys Asp Trp Gly Pro Ser Asn Trp Trp 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 22 Lys Gln Phe Gly Pro Lys Asp Trp Trp 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> 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Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 141 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 142 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 142 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 143 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 143 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 144 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 144 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser <210> 145 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 145 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 146 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 146 Met Glu Phe Gly Leu 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184 Glu Pro Lys Ser Ser Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser 20 <210> 185 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 185 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser <210> 186 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 186 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ser <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 187 Ala Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu 1 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 188 Trp Ala Pro Phe Pro His Gln Gln Leu 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 189 Trp Val Ala Phe Pro His Gln Gln Leu 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 190 Trp Val Pro Ala Pro His Gln Gln Leu 1 5 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 191 Trp Val Pro Phe Ala His Gln Gln Leu 1 5 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 192 Trp Val Pro Phe Pro Ala Gln Gln Leu 1 5 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 193 Trp Val Pro Phe Pro His Ala Gln Leu 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 194 Trp Val Pro Phe Pro His Gln Ala Leu 1 5 <210> 195 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 195 Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Ala 1 5 <210> 196 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 196 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 20 25 30 <210> 197 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 197 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 198 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(30) <223> May be absent <400> 198 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 199 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 199 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 200 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 200 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 201 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(30) <223> May be absent <400> 201 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 20 25 30 <210> 202 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(68) <223> May be absent <400> 202 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 35 40 45 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 50 55 60 Ala Pro Ala Pro 65 <210> 203 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 203 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 204 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 204 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 205 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 205 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 206 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(22) <223> May be absent <400> 206 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 20 <210> 207 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 207 Arg Gly Val Phe Arg Arg 1 5 <210> 208 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 208 accgttgccg gt 12 <210> 209 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 209 accnnnnnng gt 12

Claims (71)

  1. PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열을 포함하는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 화학식 (I)에 나타내어진 아미노산 서열을 갖고:
    FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
    여기서
    FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열식별번호: 1)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
    FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열식별번호: 2)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
    FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열식별번호: 3)에 의해 나타내어진 폴리펩티드 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열이고;
    Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고;
    n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수인
    단백질.
  3. 제2항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 하기 화학식에 나타내어진 아미노산 서열을 갖고:
    MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 4)
    여기서
    Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고;
    n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이고;
    Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp 또는 Glu이고;
    Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
    Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr이고;
    Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
    Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이고;
    Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고;
    Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys인
    단백질.
  4. 제2항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 하기 화학식에 나타내어진 아미노산 서열을 갖고:
    MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADR VLTGYQVDKNKDDELTGF (서열식별번호: 5)
    여기서
    Xaa는 각 경우에 개별적으로 아미노산 잔기이고;
    n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수인
    단백질.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 화학식 (II)에 나타내어진 아미노산 서열이고:
    -aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6- (II)
    여기서
    aa1은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 보다 바람직하게는 소형 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa4는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 소형 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa6은 방향족 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내는 것인
    단백질.
  6. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 화학식 (III)에 나타내어진 아미노산 서열이고:
    -aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp- (III)
    여기서
    aa1은 염기성 측쇄 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 보다 바람직하게는 소형 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 보다 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Tyr, Trp 또는 His를 나타내고;
    aa4는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu를 나타내고;
    aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 소형 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 보다 바람직하게는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 보다 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg를 나타내는 것인
    단백질.
  7. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 서열식별번호: 6 내지 41로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열인 단백질.
  8. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)n이 서열식별번호: 6 내지 41로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 단백질.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)m이 화학식 (IV)에 나타내어진 아미노산 서열이고:
    -aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15- (IV)
    여기서
    aa7은 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa8은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa9는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa10은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa11은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa12는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa13은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 보다 바람직하게는 산 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa14는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
    aa15는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 중성 비-극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내는 것인
    단백질.
  10. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)m이 서열식별번호: 42 내지 77로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열인 단백질.
  11. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (Xaa)m이 서열식별번호: 42 내지 77로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 서열식별번호: 78 내지 86으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 서열식별번호: 78 내지 86으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 서열식별번호: 87 내지 94 중 하나의 뉴클레오티드 1-336에 상응하는 코딩 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 동일한 코딩 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에 이어 65℃에서 0.2X SSC 중 세척의 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 87 내지 94 중 어느 하나에 혼성화되는 코딩 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1에 결합하는 단백질의 결합이 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙, 아벨루맙 및/또는 두르발루맙에 의한 PD-L1 결합과 경쟁적인 것인 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드가 Ile-54, Tyr-56, Glu-58, Glu-60, Asp-61, Lys-62, Asn-63, Gln-66, Val-68, Val-76, Val-111, Arg-113, Met-115, Ile-116, Ser-117, Gly-120, Ala-121, Asp-122, Tyr-123 및 Arg-125로부터 선택된 PD-L1의 적어도 10개의 잔기를 수반하는 계면을 포함하는 PD-L1과의 결정 구조를 형성하는 것인 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1에 대한 결합이 (a) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 T-세포 증식을 증가시키고/거나; (b) MLR 검정에서 인터페론-γ 생산을 증가시키고/거나; (c) MLR 검정에서 인터류킨-2 (IL-2) 분비를 증가시키는 것인 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 분비 신호 서열, 펩티드 링커 서열, 친화성 태그, 막횡단 도메인, 세포 표면 보유 서열, 번역후 변형을 위한 기질 인식 서열, 단백질-단백질 상호작용을 통해 응집하는 단백질의 다량체 구조를 생성하는 다량체화 도메인, 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티, 항체의 조직 국재화 및 항원 결합 부위를 변경시키기 위한 폴리펩티드 서열, 및 PD-L1 또는 상이한 표적에 결합하는 1개 이상의 추가의 아피머 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 추가의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질인 단백질.
  20. 제19항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분, 알부민 단백질 또는 그의 부분, 알부민-결합 폴리펩티드 모이어티, 트랜스페린 또는 그의 부분, 트랜스페린-결합 폴리펩티드 모이어티, 피브로넥틴 또는 그의 부분, 또는 피브로넥틴-결합 폴리펩티드 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티를 포함하는 융합 단백질인 단백질.
  21. 제20항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분이 FcRn 결합을 보유하는 것인 단백질.
  22. 제20항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분이 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 또는 그의 하위부류 (이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2인 단백질.
  23. 제20항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분이 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; B 세포 수용체의 하향 조절 또는 그의 조합으로부터 선택된 이펙터 기능을 보유하는 것인 단백질.
  24. 제20항에 있어서, 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티가 단백질에서 그것이 부재하는 경우에 비해 단백질의 혈청 반감기를 적어도 5배만큼 증가시키는 것인 단백질.
  25. 제22항에 있어서, 서열식별번호: 112 또는 서열식별번호: 113의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 단백질.
  26. 표적 항원에 결합하는 1개 이상의 항원 결합 부위를 형성하는 1개 이상의 VH 및/또는 VL 쇄를 포함하는 재조합 항체이며, 여기서 VH 및/또는 VL 쇄 중 적어도 1개는 PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 억제하는 적어도 1개의 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열을 또한 포함하는 융합 단백질인 재조합 항체.
  27. 제26항에 있어서, VH 쇄가 Fc 도메인을 포함하는 것인 재조합 항체.
  28. 제26항에 있어서, 표적 항원이 면역 체크포인트인 재조합 항체.
  29. 제26항에 있어서, 표적 항원이 면역 공동자극 수용체이고, 키메라 항체가 결합시 공동자극 수용체에 효능작용하는 것인 재조합 항체.
  30. 제26항에 있어서, 표적 항원이 혈관신생 인자 또는 그에 대한 수용체이고, 키메라 항체가 혈관신생 인자 또는 그에 대한 수용체에 길항작용하는 것인 재조합 항체.
  31. 제26항에 있어서, 표적 항원이 종양 항원인 재조합 항체.
  32. 제26항에 있어서, 표적 항원이 가용성 면역억제 인자 또는 그에 대한 수용체이고, 키메라 항체가 면역억제 인자의 면역억제 활성을 억제하여 면역자극 신호로서 작용하는 것인 재조합 항체.
  33. 제26항에 있어서, 표적 항원이 PD-1, PD-L2, CTLA-4, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA, TIGIT, CD28, ICOS, CD137, OX40, GITR, CD27, CD30, HVEM, DNAM-1 또는 CD28H, CEACAM-1, CEACAM-5, BTLA, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR, B7-H3, B7-H4, CD40, CD4OL, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, 갈렉틴-9, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, LIGHT, MHC 부류 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX4OL, PVR, SIRPα, TCR, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, VEGF, VEGF 수용체, EGFR, Her2/neu, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E 또는 TSLP로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 항체.
  34. (i) 서열식별번호: 112의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 서열을 갖는 아피머-중쇄 융합 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨), 및
    (ii) 서열식별번호: 113의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨)
    을 포함하는 재조합 아피머-이필리무맙 항체 융합 단백질.
  35. (i) 서열식별번호: 116 또는 118의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 서열을 갖는 아피머-중쇄 융합 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨), 및
    (ii) 서열식별번호: 116의 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 단백질 (여기서 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열식별번호: 136)은 임의로 제거됨)
    을 포함하는 재조합 아피머-베바시주맙 항체 융합 단백질.
  36. (i) 수용체의 리간드 결합 도메인, 및 (ii) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 재조합 수용체 트랩 융합 단백질.
  37. 제36항에 있어서, 결합 도메인이 PGE2, TGF-β, VEGF, CCL2, IDO, CSF1, IL-10, IL-13, IL-23 또는 아데노신에 결합하는 것인 재조합 수용체 트랩 융합 단백질.
  38. 제36항에 있어서, 재조합 수용체 트랩 융합 단백질의 다량체화를 유도하는 다량체화 도메인을 추가로 포함하는 재조합 수용체 트랩 융합 단백질.
  39. (i) 동족 수용체에 결합하여 효능작용 또는 길항작용하는 폴리펩티드 리간드 서열, 및 (ii) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 재조합 수용체 리간드 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 리간드가 공동-자극 수용체에 대한 리간드이고, 결합시 공동-자극 수용체에 효능작용하는 것인 재조합 수용체 리간드 융합 단백질.
  41. 제40항에 있어서, 폴리펩티드 리간드가 B7.1, 4-1BBL, OX40L, GITRL 또는 LIGHT로부터 선택된 것인 재조합 수용체 리간드 융합 단백질.
  42. 제39항에 있어서, 재조합 수용체 리간드 융합 단백질의 다량체화를 유도하는 다량체화 도메인을 추가로 포함하는 재조합 수용체 리간드 융합 단백질.
  43. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 리간드가 항종양 면역을 촉진하는 면역자극 시토카인인 재조합 수용체 리간드 융합 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 폴리펩티드 리간드가 IFN-α2, IL-2, IL-15, IL-21 및 IL-12로부터 선택된 것인 재조합 수용체 리간드 융합 단백질.
  45. (i) T-세포의 표면 상의 CD3에 결합하는 CD3 결합 폴리펩티드, 및 (ii) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 다중특이적 T-세포 결속화 융합 단백질.
  46. (i) PD-L1에 1x10-6M 이하의 Kd로 결합하고 결합된 PD-L1에 대한 PD-1의 상호작용을 억제하는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 서열(들)을 포함하는 세포외 부분; (ii) 막횡단 도메인; 및 (c) 4-1BB 신호전달 도메인 및 CD3ε 신호전달 도메인 및 임의적인 공동자극 신호전달 영역을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체 융합 단백질.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산.
  48. 제47항에 있어서, 코딩 서열이 1개 이상의 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서에 작동가능하게 연결된 것인 핵산.
  49. 제47항에 있어서, 1개 이상의 복제 기점, 미니염색체 유지 요소 (MME) 및/또는 핵 국재화 요소를 포함하는 핵산.
  50. 제47항에 있어서, 코딩 서열과 작동가능하게 연결되고 코딩 서열과 함께 전사되는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 핵산.
  51. 제47항에 있어서, 코딩 서열이 1개 이상의 인트론 서열을 포함하는 것인 핵산.
  52. 제47항에 있어서, 코딩 서열과 함께 전사되는 1개 이상의 리보솜 결합 부위를 포함하는 핵산.
  53. 제47항에 있어서, DNA인 핵산.
  54. 제47항에 있어서, RNA인 핵산.
  55. 제47항의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터.
  56. 제47항의 핵산을 포함하는 플라스미드 DNA, 플라스미드 벡터 또는 미니서클.
  57. 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  58. 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 가용성 수용체 또는 그의 리간드 결합 도메인.
  59. 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 성장 인자, 시토카인 또는 케모카인 또는 그의 생물학적 활성 폴리펩티드 단편.
  60. 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 공동자극 효능제 폴리펩티드.
  61. 접합된 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드를 추가로 포함하는 체크포인트 억제 폴리펩티드.
  62. PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 및 그에 접합된 검출가능한 표지, 독소 또는 1종 이상의 치료제를 포함하는 아피머 작용제.
  63. (i) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 재조합 단백질, 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 재조합 항체, 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항의 재조합 수용체 트랩 융합 단백질, 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항의 재조합 수용체 리간드 융합체, 제45항의 다중특이적 T-세포 결속화 융합 단백질, 제46항의 키메라 수용체 융합 단백질, 제57항의 항체, 제58항의 가용성 수용체, 제59항의 성장 인자, 시토카인 또는 케모카인, 제60항의 공동자극 효능제 폴리펩티드, 제61항의 체크포인트 억제 폴리펩티드 또는 제62항의 아피머 작용제, 및 (ii) 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염 등을 포함하는, 인간 환자에서의 치료 용도에 적합한 제약 제제.
  64. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항의 핵산, 제55항의 바이러스 벡터 또는 제56항의 플라스미드 DNA, 플라스미드 벡터 또는 미니서클, 및 (ii) 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 완충제, 염, 형질감염 증진제, 전기천공 증진제 등을 포함하는, 인간 환자에서의 치료 유전자 전달에 적합한 제약 제제.
  65. 대상체에게 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 단백질, 재조합 항체 또는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 대상체가 PD-L1을 발현하는 암 세포를 포함하고, 임의로 여기서 암 세포는 흑색종 세포인 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 단백질, 재조합 항체 또는 핵산이 혼합 림프구 반응을 도출하는 유효량으로 투여되는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 단백질, 재조합 항체 또는 핵산이 비히클-단독 대조군에 비해 대상체에서 T 세포에 의한 IFNγ 생산을 적어도 2배만큼 증가시키는 유효량으로 투여되는 것인 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 PD-L1을 발현하는 암 세포를 포함하는 종양을 갖고, 종양 내 PD-L1 결합 아피머 폴리펩티드 축적의 수준이 투여 96시간 후에 혈장 내 수준의 적어도 5배인 방법.
  70. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 PD-L1을 발현하는 암 세포를 포함하는 종양을 갖고, 단백질, 재조합 항체 또는 핵산이 대상체에서 종양의 성장을 적어도 10%만큼 억제하는 유효량으로 투여되는 것인 방법.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 흑색종을 갖는 것인 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023153876A1 (ko) * 2022-02-10 2023-08-17 주식회사 아피셀테라퓨틱스 Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201710973D0 (en) 2017-07-07 2017-08-23 Avacta Life Sciences Ltd Scaffold proteins
CN112601554A (zh) * 2018-06-04 2021-04-02 塔夫茨大学信托人 肿瘤微环境活化的药物-结合剂缀合物和与其相关的用途
WO2021102624A1 (en) * 2019-11-25 2021-06-03 Hangzhou Branch Of Technical Institute Of Physics And Chemistry, Chinese Academy Of Sciences Covalent protein drugs developed via proximity-enabled reactive therapeutics (perx)
TW202221031A (zh) * 2020-07-30 2022-06-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 血清半衰期延長之pd-l1抑制多肽
TW202221030A (zh) * 2020-07-30 2022-06-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 血清白蛋白結合多肽
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
WO2022140661A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Cascade Prodrug Inc. Combination therapy with a vinca alkaloid n-oxide and an immune checkpoint inhibitor
CN112979782B (zh) * 2021-03-08 2023-07-18 深圳市乐土生物医药有限公司 一种多肽及其用途
CN113061192B (zh) * 2021-04-12 2023-08-22 佰思巢(上海)生物科技有限公司 一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用
WO2022234003A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Avacta Life Sciences Limited Cd33 binding polypeptides with stefin a protein
CN113652427B (zh) * 2021-08-20 2023-08-29 深圳市恩辑生物科技有限公司 一种迷你启动子pATP1B1及其应用
TW202334196A (zh) * 2021-10-07 2023-09-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 Pd-l1結合多肽
WO2023057946A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 Avacta Life Sciences Limited Serum half-life extended pd-l1 binding polypeptides
WO2023218243A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Avacta Life Sciences Limited Lag-3/pd-l1 binding fusion proteins
CN117164719A (zh) * 2022-05-28 2023-12-05 启愈生物技术(上海)有限公司 靶向SIRPα和PD-L1的双特异性抗体或其抗原结合片段及应用
WO2024064754A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Receptor-mediated endocytosis for targeted degradation and delivery of therapeutic agents
CN117129668B (zh) * 2023-10-27 2024-01-09 江西赛基生物技术有限公司 一种用于化学发光免疫分析的清洗液及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019517557A (ja) * 2016-06-10 2019-06-24 アイオー セラピューティクス インコーポレイテッド 癌免疫療法のための受容体選択的レチノイドおよびレキシノイド化合物および免疫調節因子
WO2018056824A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Stichting Het Nederlands Kanker Manipulation of immune activity by modulation of expression - stub1

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023153876A1 (ko) * 2022-02-10 2023-08-17 주식회사 아피셀테라퓨틱스 Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도

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