KR20210136879A - 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 - Google Patents

암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 Download PDF

Info

Publication number
KR20210136879A
KR20210136879A KR1020210059139A KR20210059139A KR20210136879A KR 20210136879 A KR20210136879 A KR 20210136879A KR 1020210059139 A KR1020210059139 A KR 1020210059139A KR 20210059139 A KR20210059139 A KR 20210059139A KR 20210136879 A KR20210136879 A KR 20210136879A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
leu
ala
thr
cancer
Prior art date
Application number
KR1020210059139A
Other languages
English (en)
Inventor
정용윤
정인혜
Original Assignee
(주)에스엠티바이오
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)에스엠티바이오, 연세대학교 산학협력단 filed Critical (주)에스엠티바이오
Publication of KR20210136879A publication Critical patent/KR20210136879A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464404—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46448—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/464482—Carcinoembryonic antigen [CEA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70589—CD45
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/54—Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

본 발명은 신규한 키메라 항원 수용체와, 이의 용도로 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 키메라 항원 수용체{Chimera antigen receptors for treating cancer}
본 발명은 신규한 키메라 항원 수용체와, 이의 용도로 암의 치료에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(이하 본 명세서에서는 이를 「CAR」라 약칭하는 경우가 있다)를 발현하는 T 세포(이하 본 명세서에서는 이를 「CAR-T 세포」라 약칭하는 경우가 있다)는, 암 세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암 세포 표면 항원을 인식하는 수용체를 코딩하는 유전자를 T 세포에 도입하여 암 세포를 사멸시킬 수 있도록 유전자가 재조합된 T 세포를 의미한다. 이스라엘의 Weizmann Institute of Science의 화학자이면서 면역학자인 Dr. Zelig Eshhar 등이 암 세포에서 특이적으로 발현하는 항원과 결합하는 수용체를 갖는 T 세포를 인위적으로 만들면 암 세포만 표적하여 면역반응을 일으켜 암 세포를 죽일 수 있다는 지견을 도출하여, 키메라 항원 수용체를 장착한 T 세포를 만드는데 성공하였고 1989년 PNAS에 발표한 바 있다.
그러나, 초창기에 제조된 CAR-T 세포, 즉 1 세대 CAR-T 세포는 신호 전달 도메인으로서 CD3ζ만을 이용하였는데, 그 치료 효과가 미미했고, 또한, 지속 시간도 짧다는 단점이 있었다. 이에, CAR-T 세포의 반응성을 향상시키기 위한 노력이 행해졌으며, 보조 자극 도메인(CD28 또는 CD137/4-1BB)과 CD3ζ를 결합한 2세대 CAR-T 세포가 제조되었는데 1세대 CAR-T 세포와 비교하여 체내에 잔존하는 CAR-T 세포의 수가 현저히 증가하였다. 한편, 2세대 CAR-T 세포는 한 가지의 보조 자극 도메인을 이용하였는데, 두 가지의 보조 자극 도메인을 이용하는 CAR-T 세포를 3세대 CAR-T라 지칭하며, 현재 연구는 2세대 및 3세대 CAR-T 세포에 집중되어 있다.
CAR-T 세포를 이용해서 암을 치료하는 방법과 관련하여, 3명의 말기 만성림프성백혈병(CCL, chronic lymphoid leukemia) 환자에게 CD19를 인지할 수 있도록 변형된 세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell)를 주사하였더니, 그 중 2명에서 백혈병이 완전히 치료되었고, 그 상태가 10개월 정도 지속되었다는 보고가 있었다(N. Engl J Med 2011; 365:725-733 August 25, 2011, Sic. Transl. Med 2011 Aug 10;3(95):95ra73). 여기에서 사용된 CAR-T 세포는 2세대에 해당되는 것으로서 보조 자극 도메인으로서 4-1BB를, 신호 전달 도메인으로서 CD3ζ를 이용한 것이다. 상기 CAR-T 세포의 항원 결합 도메인은 백혈병 암세포의 표면에서 발견되는 CD19를 항원으로 인식한다.
또한, 급성 백혈병 환자에게 CTL019를 투여하여 치료하였더니, 환자 30명 중 27명이 완전 관해를 경험하였고, 전체 환자의 67%가 2년 동안 완전 관해, 78%가 2년간 생존하였다는 보고가 있으며, 대상 환자가 재발성 혹은 불응성 환자였음을 고려한다면, 이는 매우 놀라운 것이다(N Engl J Med 2014; 371:1507-1517, October 16, 2014).
현재, 다양한 CAR-T 세포를 이용한 치료법에 대하여 림프종(lymphoma), 골수종(myeloma) 등 다양한 암을 대상으로 임상 시험이 진행중에 있고, 사용 가능한 의약품으로서의 CAR-T 세포가 시장에 등장할 것으로 예상된다. CAR-T 세포를 이용한 암 치료는 자가 유래 방식이어서 대량 생산되는 제품은 아니지만, 환자 맞춤형으로서 그 치료효과가 기존의 항암제와 비교할 수 없을 정도로 높다.
한편, CEA (Carcino Embryonic Antigen) 항원은 1965년 결장암과 태아결장점막에 공통적으로 존재하는 항원 물질로 발견된 당 단백인데, 이 CEA 항원은 대장암, 소화기암, 췌장암, 폐암 등 여러 장기 유래 암에 폭 넓게 발현되므로 혈액을 이용한 종양 표지 검사의 한 표지자로 사용되기도 한다. CAR-T 세포를 이용하는 암의 치료에는 이용하고자 하는 CAR-T 세포가 타겟으로 하는 항원에 따라 다양한 암에 적용할 수 있는데 현재 CEA를 타겟으로 하는 CAR-T 세포 치료제의 개발은 없다.
본 발명의 일 목적은 암 세포, 특히는 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA)을 발현하는 암 세포를 타겟으로 하는 신규한 키메라 항원 수용체를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암, 특히는 암 배아 항원(CEA)를 발현하는 암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 것으로 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 면역 세포를 이용하여 암, 특히는 암 배아 항원(CEA)를 발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA) 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 암 배아 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 VH 도메인 및 서열번호 2로 표시되는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암 배아 항원 결합 도메인은 가요성 링커를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 가요성 링커는 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 서열번호 4로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 막통과 도메인을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 서열번호 5로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 보조자극 도메인을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 서열번호 6으로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 서열번호 7로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 키메라 항원 수용체는 신호 펩타이드를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 신호 펩타이드는 서열번호 8로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 또는 12로 표시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 발현 카세트는 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로모터는 SFFV 프로모터, 연장 인자 1α(elongation factor 1a; EF 1a) 프로모터 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 카세트는 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)를 부가 유전자로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 절단된 EGFR 유전자는 절단 가능한 링커로 연결될 수 있다.
본 발명에서 상기 절단 가능한 링커는 T2A 리보솜 스킵 요소일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 카세트는 서열번호 17 또는 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 발현 카세트를 포함하는, 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 벡터는 플라스미드, 트랜스포손, 코스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에서 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAC) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 벡터 또는 HSV 벡터일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 벡터가 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 20으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포 또는 폴리펩타이드를 유효 성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 암은 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형암일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 췌장암 또는 담관계암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있도록 형질 전환된 면역 세포는 암 세포, 특히는 암 배아 항원(CEA)를 발현하는 암 세포를 특이적으로 인식하고, 그 사멸을 유도하여 최종적으로 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체 카세트의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 벡터에 제한 효소 처리 후 전기 영동하여 제작 삽입된 키메라항원 수용체 카세트를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 유세포 분석을 통해 다양한 암 세포주에서 CEA 항원의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에서 Lenti-X 293 FT 세포에 Lenti-anti-CEA-h(BBζ)-EGFRt-2nd-CAR 플라스미드(plasmid)로 형질 전환시킨 뒤 말초 혈액 유래 T 세포를 활성화시켜 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4에서 HT29 세포에서 CEA 항원에 대한 면역 형광 염색 후 상기 CEA 항원의 발현 여부를 형광 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 4에서 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포가 HT29 세포를 사멸시키는 과정을 형광 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 4에서 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포의 CEA를 발현하는 HT29 세포주에 대한 공배양 비율에 따른 세포 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 4에서 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포의 CEA를 발현하는 Capan1 세포주에 대한 공배양 비율에 따른 세포 사멸율의 변화를 확인하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위해 실행 시 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 발명의 기재 및 청구 시, 하기 정의가 이용될 것이다. 본 명세서에서 사용된 전문용어는 제한인 것으로 의도되지 않고, 오히려 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위해 본 명세서에서 사용되는 것으로 또한 이해될 것이다. 관사 "하나" 및 "일"은 관사의 문법상 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나 또는 하나 이상)를 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA) 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"이란 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 수용체를 의미한다. CAR의 가장 흔한 유형이 CD3ζ 사슬과 같은 T 세포 동시수용체의 막통과 및 세포내 도메인에 융합된 단일 클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하지만, 본 명세서에 기재된 본 발명은 이들 도메인으로 제한되지 않는다. 오히려, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 임의의 세포 내 신호전달 분자를 발현하도록 조작된 임의의 수용체 및 이들에 융합되거나 연결된 세포외 항원 결합 도메인을 의미한다.
본 발명에서 상기 결합 도메인은 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA)을 특이적으로 인식할 수 있는 단쇄 가변 단편(scFv)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"란, VL과 VH 사이의 펩타이드 링커에 의한, 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 융합 단백질을 의미한다.
본 발명에서 상기 암 배아 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 VH 도메인 및 서열번호 2로 표시되는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 VH 도메인과 VL 도메인은 가요성 링커를 통해 연결될 수 있다. 본 발명에서 상기 가요성 링커는 약 10개 내지 30개의 아미노산(예를 들어, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개의 아미노산)의 글라이신/세린 링커일 수 있고, 바람직하게는 15개의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명에서 상기 링커 길이는 키메라 항원 수용체의 중요한 결정부위로 작용할 수 있어, 상기 범위보다 더 짧은 링커는 친화도를 증대시킬 수 있지만, 또한 세포내 다합체 형성을 발생시켜 CAR의 발현을 손상시킬 수 있는 반면, 상기 범위보다 더 긴 링커는 VL 및 VH CDR을 공간상 더 멀리 이동시킴으로써 항원 친화도를 감소시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 가요성 링커는 서열번호 3으로 표시되는 것이, 타겟으로 하는 암 배아 항원에의 결합 효율을 높일 수 있어 바람직하다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 (또는 스페이서) 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 항원 결합 도메인과 막통과 도메인을 연결하는 부분으로 '스페이서'라고도 불리우는데, T 세포막 또는 NK 세포막으로부터 항원 결합 도메인을 확장하기 위한 목적을 갖는다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 예를 들어 인간 또는 그의 일부를 포함하는 임의의 속으로부터의 임의의 적합한 서열로부터 얻어질 수 있으며, 혹은 본 기술분야에서 통상적으로 사용하는 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함한 인간 단백질의 힌지 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 힌지 영역은 면역글로불린에 제한하지 않으면서 면역글로불린 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD)으로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 힌지 영역은 서열번호 4로 표시되는 CD8 힌지 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포 내부에서 발견되거나 발견되도록 조작된 키메라 항원 수용체의 부분을 의미한다. 본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포의 혈장 막에서 키메라 항원 수용체를 고정하는 역할을 하는 막통과 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 동일한 단백질(예를 들어, CD3ζ)로부터 유래할 수 있고, 혹은 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 상이한 단백질(예를 들어, CD28의 막관통 도메인 및 CD3ζ 분자의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 그 반대)로부터 유래할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 세포막에 걸친 소수성 폴리펩타이드를 포함한다. 특히, 막통과 도메인은 세포막의 한 면 (세포 외)에서 세포막의 다른 면 (세포 내 또는 세포질)을 통하여 걸쳐 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 알파 나선 또는 베타 배럴, 또는 이들의 조합의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 막통과 도메인은 다수의 막통과 조각, 각 알파-나선형, 베타 시트, 또는 이들의 조합을 갖는 다원 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인으로는, 예를 들면 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인으로 예를 들어 인공적으로 설계된 것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막 변이 도메인의 각 말단에서 발견될 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인은 서열번호 5로 표시되는 CD8 막통과 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인 사이에 적어도 하나의 보조자극 도메인을 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 보조자극 신호가 전달되는 부위로서 항원 결합 도메인과 결합한 특정 항원을 인식한 CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포가 면역반응을 일으키며 자가 증식을 돕고, 체내에 잔존하는 시간을 늘리도록 신호를 전달하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 이들의 활성 단편; 이들의 기능 유도체; 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 서열번호 6으로 표시되는 4-1BB일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 면역세포 신호전달 경로의 적어도 일부 면을 자극 또는 활성화시키기 위해 면역세포의 활성화를 제공하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12), 이의 활성 단편, 이의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 서열번호 7로 표시되는 CD3 제타(ζ)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 신호 펩타이드(signal peptide)를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "신호 펩타이드"는 펩타이드 서열을 포함하는 데, 이는 임의의 분비된 또는 막통과 단백질의 일종 펩타이드로, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 세포막 및 세포 표면으로의 수송을 지시하고, 본 발명의 키메라 항원 수용체의 정확한 위치 선정을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 신호 펩타이드는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 세포막에 지지시키고, 그 점에서 상기 키메라 항원 수용체의 세포 외 부분이 세포 표면 상에 표시되며, 막통과 부분이 원형질 막에 걸쳐 있고, 활성 도메인은 세포질 부분, 또는 세포의 내부에 있게 된다.
본 발명에서 상기 신호 펩타이드로는 상기의 기능을 하는 펩타이드라면 제한없이 사용될 수 있지만, 예를 들면, 서열번호 8로 표시되는 n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(n-terminal CD8α signal peptide)일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체의 구조를 개략적으로 나타낸 것으로, 상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 9로 표시되는 폴리펩타이드로, CEA 결합 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ로 구성되거나 이를 포함할 수 있고, 혹은 서열번호 10으로 표시되는 신호 펩타이드-CEA 결합 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드는 임의의 재래적인 방법에 의해 특정된 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열로부터 용이하게 제조된다. 아미노산 서열을 부호화하는 염기 서열은 앞서 말한 NCBI RefSeq ID 또는 GenBenk의 가입 번호로부터 각 도메인의 아미노산 서열에 대해 얻을 수 있으며, 본 공개의 핵산은 표준 분자 생물학적 및/또는 화학적 절차를 사용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 염기 서열에 기초한 폴리 뉴클레오타이드는 합성될 수 있고, 중합효소연쇄반응 (PCR)을 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 얻은 DNA 단편을 조합하는 것을 통해 본 공개의 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 발현 또는 클로닝 카세트의 일부일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드의 사슬로서 정의된다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA 및 RNA를 포함한다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 따라서, 여기서 사용된 핵산 및 폴리 누클레오티드는 상호 교환 가능하다. 당업계의 기술자는 핵산이 폴리뉴클레오타이드이고 이것이 단량체 "뉴클레오타이드"로 가수 분해될 수 있다는 일반적인 지식을 갖는다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수 분해될 수 있다. 여기서 사용된 폴리뉴클레오타이드는 제한없는 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 등을 사용한 재조합 라이브러리 또는 세포유전체로부터의 핵산 서열 클로닝을 포함하는 당업계에서 이용 가능한 임의의 수단 그리고 합성 수단에 의해 획득된 모든 핵산 서열을 포함 하나 그것에 국한되는 것이 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 9로 표시되는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11로 표시될 수 있고, 상기 서열번호 10으로 표시되는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트(cassette)에 관한 것이다.
본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절할 수 있는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결요소 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 등과 같은 발현 제어 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로모터로는 예를 들어, SFFV 프로모터, 연장 인자 1α(elongation factor 1a; EF 1a) 프로모터 또는 CAG (CMV 증강인자를 갖는 닭 베타-액틴 프로모터) 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 카세트는 그 발현을 모니터링하는 데 유용한 추가 서열로, 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)를 부가 유전자로 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 EGFRt는 비-면역성 선별 툴(tool)로, 예를 들면, 비오티닐화된 세툭시맙(biotinylated cetuximab)과 항-비오틴 마이크로비드를 이용한 면역자기 선별(immunomagnetic selection) 시 EGFRt-를 포함하는 카세트가 형질 전환된 T 세포 또는 NK 세포를 선별하는 데에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, T 세포 또는 NK 세포 추적을 위한 유세포 분석 시 추적 마커로 사용할 수 있으며, 세툭시맙/얼비툭스® 중재 항체 의존적 세포 상해 활성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 경로를 통한 자살 유전자로 활용될 수 있다.
본 발명에서 상기 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)는 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자로 이루어지거나, 서열번호 14로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)과 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 Fcγ 수용체 결합 도메인의 일 말단과 절단 가능한 링커인 리보솜 스킵 요소에 의해 연결될 수 있다.
본 발명에서 상기 "리보솜 스킵"이란 특이적 펩타이드가 새로운 삽입된 아미노산을 공유로 연결하는 것으로부터 세포의 리보솜을 막고, 대신에 이것이 계속해서 번역되는 것을 허용하여서 폴리단백질의 동시번역 절단을 생성시키는, 번역의 대안적인 기전을 의미한다. 이 과정은 "2A 리보솜 스킵" 요소 또는 시스 작용 하이드롤라제 요소(예를 들어, CHYSEL 서열)에 의해 유도된다. 몇몇 실시형태에서, 이 서열은 강한 알파 나선 경향을 가지는 비보존적 아미노산 서열, 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPG P(여기서, x는 임의의 아미노산임)를 포함한다. G와 P 사이에 명확한 절단이 발생한다. 본 발명에서 상기 리보솜 스킵 요소는 2A 리보솜 스킵 요소일 수 있고, 바람직하게는 5' T2A 리보솜 스킵 요소일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 절단 가능한 링커는 서열번호 15로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자로 이루어지거나, 서열번호 16으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체 카세트의 구조를 개략적으로 나타낸 것으로, 상기 키메라 항원 수용체 카세트는 서열번호 17로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로, EF-1α 프로모터- n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 구성되거나 이를 포함할 수 있고, 혹은 서열번호 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로, EF-1α 프로모터- n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 구성되거나 이를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 벡터로는 예를 들어, 플라스미드, 트랜스포손, 코스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들면, 파아지, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터(온코레트로바이러스(oncoretrovirus) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 슈도 타입 벡터 포함), 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAC) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 벡터 또는 HSV 벡터를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터 구조를 개략적으로 나타낸 것으로, 상기 벡터는 서열번호 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드로, EF-1α 프로모터- n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 설계될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 벡터가 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "숙주 세포"란 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의의 유형의 세포를 말한다. 숙주 세포는 진핵생물 세포(예를 들면, 식물, 동물, 진균 또는 조류(algae)), 원핵생물 세포(예를 들면, 세균 또는 원생동물) 또는 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 또는 "기성 제품(off-the-shelf)" 세포 또는 1차 세포(즉, 대상체로부터 직접 단리됨)일 수 있다. 숙주 세포는 부착성 세포 또는 현탁된 세포, 즉, 현탁액 중에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, DH5α 이. 콜라이(E. coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, 및 HEK293 세포 등이 포함된다. 재조합 발현 벡터를 증폭시키거나 복제할 목적을 위해, 숙주 세포는 원핵 생물 세포, 예를 들면, DH5α 세포일 수 있다. 또한, 본 발명에서는 재조합체 CAR을 생산할 목적을 위해, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 임의의 세포 유형일 수 있고, 임의의 유형의 조직으로부터 유래될 수 있고, 임의의 발단 단계의 것으로, 예를 들면, 체액, 조직 또는 기관, 예를 들면, 혈액(말초혈, 제대혈 등) 또는 골수로부터 수집되거나, 단리되거나, 정제되거나, 또는 유도된 세포를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포로는 면역 세포[T 세포, 수지상 세포, B 세포, 조혈 줄기세포, 대식세포, 단핵구, NK 세포 또는 조혈 세포(호중구, 호염구)], 말초혈액단핵구(PBMC), 제대혈 단핵구 세포, 섬유아세포, 전구체 지방세포, 간세포, 피부 각질세포, 간엽성 줄기세포, 지방 줄기세포, 또는 각종 암 세포주를 사용할 수 있고, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포이거나, 보다 바람직하게는 CD4+, CD8+ T 세포, 및 이팩터 T 세포, 기억 T 세포, 또는 조절 T 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 포유동물 숙주 세포를 선택하는 방법 및 세포의 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 형질 전환된 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드는 서열번호 19로 표시되는 CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt로 구성되거나 이를 포함할 수 있고, 혹은 서열번호 20으로 표시되는 n-터미널 CD8α 신호 펩타이드(signal peptide)-CEA 결합 도메인(scFv)-CD8 힌지 및 CD8 막통과 도메인(CD8 hinge and TM)-4-1BB-CD3ζ(CD3zeta)-T2A-EGFRt로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포로부터 발현되는 폴리펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 형질 전환된 숙주 세포는 암 세포에 존재하는 암 배아 항원(CEA)을 특이적으로 인식한 뒤 이를 사멸시켜 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "암" 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 암 배아 항원(CEA)을 발현하는 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있다.
본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 제제화할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 액제, 현탁제, 분산액, 유제, 겔제, 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 주사제가 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 경우, 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 주사제는 안정화제 또는 용해 보조제와 함께 주사용수에 용해시킨 후, 멸균처리, 특히 고온감압멸균법 또는 무균여과법에 의해 멸균처리하여 제조될 수 있다. 상기 주사용수로는 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH2PO4)-구연산 완충용액을 사용할 수 있다. 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다.
또한, 본 발명에서 사용되는 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite), 중아황산나트륨(NaHSO3), 메타중아황산나트륨(Na2S2O3) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함하고, 용해 보조제는 수산화나트륨(NaOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산나트륨(NaCO3) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 염기, 또는 염산(HCl) 또는 아세트산(CH3COOH)과 같은 산을 포함한다.
본 발명에 따른 주사제는 생체흡수성, 생체 분해성, 생체적합성으로 제형화될 수 있다. 생체흡수성이라 함은 주사제가 체내에서, 분산된 주사제의 분해 또는 분해 없이, 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체 분해성은 가수분해 또는 효소 분해에 의해 주사제가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미한다. 생체적 합성은 성분 모두가 체내에서 무독성임을 의미한다.
본 발명에 따른 주사제는 통상의 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제 등의 희석제, 또는 부형제 등을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 피하, 자궁내 경막, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 유효성분은 주사 또는 카테터로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 상기 약학 조성물 내에 포함되는 형질 전환된 숙주 세포가 1 x 101 ~ 1 x 1050개/kg, 바람직하게는 1 x 101 ~ 1 x 1030개/kg, 보다 바람직하게는 1 x 105 ~ 1 x 1020개/kg, 가장 바람직하게는 1 x 107 ~ 1 x 109개/kg의 범위 내로 투여될 수 있도록 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 1종 이상의 항암제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] Lenti-anti-CEA h(BBζ)-EGFRt-2 nd -CAR의 제작
서열번호 18로 표시되는 EF-1α 프로모터-CD16의 세포 외 도메인-CD8 힌지-CD8 막통과 도메인-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt로 구성되는 키메라 항원 수용체 카세트를 제작한 뒤, 도 3에서 보는 바와 같이 상기 카세트를 자가 불활성화되는 pCAR-EGFRt 렌티바이러스 벡터의 EF-1α 프로모터의 3 프라임(prime) 위치에 삽입시켰다. 이후 상기 키메라 항원 수용체 카세트가 벡터 내에 제대로 삽입되었는 지 확인하기 위하여 EcoR1/BamH1 제한 효소를 처리하여 절단한 뒤 겔 전기영동을 실시하면 삽입된 수용체 카세트가 절단되어 분리된 밴드를 확인할 수 있으며 이는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이 pCAR-EGFTt 벡터로 삽입시 제한 효소 사이트가 소멸되는 제한효소의 사용에 의해 EcoR1/BamH1 절단시 수용체-CD8-4-1BB-CD3제타-EGFRt일부가 함께 절단된 밴드가 확인됨을 볼 수 있다.
[실시예 2] 다양한 암 세포주에서의 CEA 항원의 발현 여부 분석
CEA 항원을 발현하는 인체 유래 암 세포 중 췌장암 세포인 Bxpc3, Capan2, Cfpac, Hpac, Miapaca2, Panc1과 담관계암 세포인 HuCCT1, SNU1196, 그리고 대장암 세포인 HT29, HCT119 세포주에 대하여 상기 실시예 1에서 제작된 키메라 항원 수용체가 타겟하는 CEA 세포막 항원이 발현되는 지 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 상기한 각 암 세포주의 암 세포를 배양한 후 CEA 특이 항체를 1:500의 희석 배율로 희석하여 1차 부착시켰다. PBS 용액으로 3회 세척 후 Alexa488-conjugate항체를 2차 항체로 하여 유세포 분석 (flow cytometry)의 방법으로 CEA 항원의 발현의 정도를 측정해 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 췌장암, 담관계암 및 대장암 등 다양한 암 세포에서 CEA 항원이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 이에 따라 본 발명에 따른 CEA 항원을 타겟으로 하는 CAR-T 또는 CAR-NK 세포를, CEA 항원을 발현하는 다양한 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 목적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 3] CEA 세포막 항원을 타겟으로 하는 키메라 항원 수용체가 발현된 T 세포(Anti-CEA CAR-T cell)의 제작
형질 도입(transduction)을 위해 사용할 렌티바이러스(lentivirus)의 생성을 위해 가장 수율이 높은 Lenti-X 293 FT 세포 (1X106)를 접종하여 밤새(overnight) 배양하였다. 배양 후 리포펙타민 3000 형질 도입 키트(lipofectamine 3000 transduction kit)를 이용하여 상기 실시예 1에서 제작한 Lenti-anti-CEA-h(BBζ)-EGFRt-2nd-CAR 플라스미드(plasmid)로 형질 전환을 시행하고 48 시간 동안 배양하여 293 FT 세포에서 렌티바이러스가 생성되도록 하였다.
말초혈액에서 분리된 T 세포를 CD3/CD28 macs 비드(bead)를 이용하여 활성화하여 24 시간을 배양하였고, 활성화 전, 후의 T 세포를 현미경으로 저배율(좌측)과 고배율(우측)로 관찰하여 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6의 아래 배열의 현미경 사진에서 나타낸 바와 같이, 플라스미드가 삽입되지 않아 활성화되지 않은 T 세포와는 달리, 도 6의 위 배열의 현미경 사진과 같이 많은 양의 활성화된 T 세포가 형질 도입되어 배양되는 것을 확인할 수 있다. 형질 도입의 수행 후 키메라 항원 수용체 카세트에 탑재된 EGFR 발현에 대한 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하여 EGFRt를 발현하는 세포를 확인할 수 있다.
[실시예 4] Lenti-anti-CEA-h(BBζ)-EGFRt-2 nd -CAR 플라스미드(plasmid)로 형질 전환된 CAR-T 세포의 암 세포 살상능(cytotoxicity) 평가
1. 암 세포에서 CEA 세포막 항원의 발현 여부 분석
CEA 항원을 발현하는 암 세포주가 본 발명의 실시예에 따라 제작된 CAR-T 세포에 의하여 공격받아 사멸되는 과정을 형광 현미경으로 관찰하였다. 이를 관찰하기 위한 실험은 다음과 같다. 1 X 2 cm 챔버 슬라이드(chamber slide)에 대장암 세포주인 HT29 세포를 1 X 104 세포씩 분주하여 챔버 바닥에 부착을 유도한 후 면역 형광 염색(immunofluorescence stain)을 수행하였다. 이때, CEA 특이 항체를 1:500의 희석 배율로 실험하였으며 PBS 용액으로 3회 세척 후 FITC-컨쥬게이트 항체(FITC-conjugated antibody) (1:500)를 2차 항체로 하여 1차 항체와 결합을 유도한 후 형광 현미경으로 관찰하여 그 사진을 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, HT29 세포의 90% 이상에서 CEA가 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
2. 항암 효과 평가(1)
CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포가 도 7에서 같은 세포인 HT29 세포에 대하여 암 세포를 사멸(파괴)시키는 과정을 형광 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 T 세포(키메라 항원 수용체 카세트를 삽입하지 않은 T 세포)와 비교할 때, CEA 항원을 타겟으로 하는 키메라 항원 수용체 카세트가 삽입된 항-CEA CAR-T 세포의 암 세포 사멸률이 현저히 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(붉은색 형광의 차이를 참조).
3. 항암 효과 평가(2)
또한, CEA를 발현하는 HT29 및 Capan1 세포주를 이용하여 Non-RI 세포 살상능 실험(cytotoxicity test)을 수행하였고, 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.
도 9 및 10에서 보는 바와 같이, 항-CEA CAR-T 세포(Effector): 암 세포주(Target cell)를 1:5, 1:1, 5:1의 비율로 공배양한 결과, HT-29 암 세포주에서는 각 비율 당 세포 사멸율이 6.7%, 20.3%, 65.0%의 결과를 보였고, Capan-1 암 세포주에서는 각 비율 당 세포 사멸율이 0.6%, 35.60%, 99.20%의 결과를 보였는 바, 농도 의존적으로 세포 사멸율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기한 실험 결과는, 대조군 T 세포에서 보인 미미한 세포 독성과는 대비되는 소견으로, 본 발명에 따르는 CEA를 타겟하는 항-CEA CAR-T 세포가 CEA 세포막 항원을 발현하는 암 세포주에 대하여 유효한 세포 독성을 가짐을 시사하고 있다.
실시예 1 내지 4의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 CEA 항원을 타겟하는 키메라 항원 수용체의 발현 카세트가 높은 순도의 T 세포에 안정적으로 삽입되어 키메라 항원 수용체로 발현되고 있음을 알 수 있었으며, 카세트가 삽입되지 않은 대조군 T 세포와 비교하여 CEA 세포막 항원을 발현하는 암 세포에 대한 살상능이 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SMT bio Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Chimera antigen receptors for treating cancer <130> PDPB201873k01 <150> KR 10-2020-0055248 <151> 2020-05-08 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domain <400> 1 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge region <400> 4 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transmembrane domain <400> 5 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> co-stimulatory domain <400> 6 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal transduction domain <400> 7 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 8 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 9 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antigen receptor <400> 9 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met 145 150 155 160 His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg 165 170 175 Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln Gly 180 185 190 Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 195 200 205 Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro 210 215 220 Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 290 295 300 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 305 310 315 320 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 325 330 335 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 340 345 350 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 355 360 365 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 370 375 380 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 385 390 395 400 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 405 410 415 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 420 425 430 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 435 440 445 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 450 455 460 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 10 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antigen receptor <400> 10 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu 35 40 45 Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Ser Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Ile Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu 145 150 155 160 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val 195 200 205 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala 245 250 255 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro 260 265 270 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 275 280 285 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 290 295 300 Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu 305 310 315 320 Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 325 330 335 Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 340 345 350 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 355 360 365 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 370 375 380 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 405 410 415 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 420 425 430 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 435 440 445 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 450 455 460 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 <210> 11 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antigen receptor <400> 11 gacatcgtgc tgacacagag ccctgcttct ctggccgtgt ctcttggaca gagggccacc 60 atgtcttgta gagccggcga gagcgtggac atcttcggcg tgggatttct gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc tcctaagctg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180 ggcatccctg tgcggtttag cggcacaggc agcagaaccg acttcaccct gatcatcgac 240 cccgtggaag ccgatgatgt ggccacctac tactgccagc agaccaacga ggacccctac 300 acatttggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagggtggag gtggcagcgg aggaggtggg 360 tccggcggtg gaggaagcga ggttcagctg cagcagtctg gcgctgaact ggttgaacct 420 ggcgcctctg tgaagctgag ctgtaccgcc agcggcttca acatcaagga cacctacatg 480 cactgggtca agcagaggcc tgagcaggga ctcgagtgga tcggcagaat cgatcccgcc 540 aacggcaaca gcaaatacgt gcccaagttc cagggcaaag ccaccatcac cgccgacacc 600 tctagcaaca cagcctacct gcagctcacc agcctgacct ctgaagatac cgccgtgtac 660 tactgcgccc ctttcggcta ctacgtgtcc gattacgcca tggcctattg gggccagggc 720 acaagcgtga cagtcagctc taccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 780 accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 840 gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatttgggc ccctctggct 900 ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg 960 aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1020 gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgagagtg 1080 aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 1140 gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1200 cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1260 cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1320 ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1380 gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1410 <210> 12 <211> 1473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antigen receptor <400> 12 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcg tgctgacaca gagccctgct tctctggccg tgtctcttgg acagagggcc 120 accatgtctt gtagagccgg cgagagcgtg gacatcttcg gcgtgggatt tctgcactgg 180 tatcagcaga agcccggcca gcctcctaag ctgctgatct acagagccag caacctggaa 240 agcggcatcc ctgtgcggtt tagcggcaca ggcagcagaa ccgacttcac cctgatcatc 300 gaccccgtgg aagccgatga tgtggccacc tactactgcc agcagaccaa cgaggacccc 360 tacacatttg gcggaggcac caagctggaa atcaagggtg gaggtggcag cggaggaggt 420 gggtccggcg gtggaggaag cgaggttcag ctgcagcagt ctggcgctga actggttgaa 480 cctggcgcct ctgtgaagct gagctgtacc gccagcggct tcaacatcaa ggacacctac 540 atgcactggg tcaagcagag gcctgagcag ggactcgagt ggatcggcag aatcgatccc 600 gccaacggca acagcaaata cgtgcccaag ttccagggca aagccaccat caccgccgac 660 acctctagca acacagccta cctgcagctc accagcctga cctctgaaga taccgccgtg 720 tactactgcg cccctttcgg ctactacgtg tccgattacg ccatggccta ttggggccag 780 ggcacaagcg tgacagtcag ctctaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840 cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900 ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatttg ggcccctctg 960 gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 1020 cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 1080 gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgaga 1140 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1473 <210> 13 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRt <400> 13 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser 35 40 45 Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser 50 55 60 Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys 65 70 75 80 Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu 85 90 95 Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly 100 105 110 Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn 115 120 125 Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp 130 135 140 Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn 145 150 155 160 Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser 165 170 175 Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala 180 185 190 Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val 195 200 205 Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn 210 215 220 Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile 225 230 235 240 Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr 245 250 255 Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly 260 265 270 Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn 275 280 285 Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys 290 295 300 His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys 305 310 315 320 Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly 325 330 335 Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 340 345 350 <210> 14 <211> 1056 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRt <400> 14 atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tcgcaaagtg 60 tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt 120 aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt 180 aggggtgact ccttcacaca tactcctcct ctggatccac aggaactgga tattctgaaa 240 accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac 300 ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt 360 tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata 420 agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac 480 tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa 540 aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg 600 ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg 660 gacaagtgca accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata 720 cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca 780 gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg 840 gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg 900 tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt 960 ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg 1020 ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc ttcatg 1056 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 15 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 16 gagggcaggg gaagtcttct aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg cccc 54 <210> 17 <211> 2880 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antigen receptor cassette <400> 17 gagtaattca tacaaaagga ctcgcccctg ccttggggaa tcccagggac cgtcgttaaa 60 ctcccactaa cgtagaaccc agagatcgct gcgttcccgc cccctcaccc gcccgctctc 120 gtcatcactg aggtggagaa gagcatgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc 180 gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct 240 agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc 300 ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca 360 acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct 420 ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg 480 attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa 540 ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg ccgccgcgtg 600 cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa 660 aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc 720 caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 780 tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 840 gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc 900 ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg 960 cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg 1020 ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac 1080 tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg 1140 tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200 gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260 gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320 tttcaggtgt cgtgattcga attcgccgcc accatggcct taccagtgac cgccttgctc 1380 ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc aggccggaca tcgtgctgac acagagccct 1440 gcttctctgg ccgtgtctct tggacagagg gccaccatgt cttgtagagc cggcgagagc 1500 gtggacatct tcggcgtggg atttctgcac tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct 1560 aagctgctga tctacagagc cagcaacctg gaaagcggca tccctgtgcg gtttagcggc 1620 acaggcagca gaaccgactt caccctgatc atcgaccccg tggaagccga tgatgtggcc 1680 acctactact gccagcagac caacgaggac ccctacacat ttggcggagg caccaagctg 1740 gaaatcaagg gtggaggtgg cagcggagga ggtgggtccg gcggtggagg aagcgaggtt 1800 cagctgcagc agtctggcgc tgaactggtt gaacctggcg cctctgtgaa gctgagctgt 1860 accgccagcg gcttcaacat caaggacacc tacatgcact gggtcaagca gaggcctgag 1920 cagggactcg agtggatcgg cagaatcgat cccgccaacg gcaacagcaa atacgtgccc 1980 aagttccagg gcaaagccac catcaccgcc gacacctcta gcaacacagc ctacctgcag 2040 ctcaccagcc tgacctctga agataccgcc gtgtactact gcgccccttt cggctactac 2100 gtgtccgatt acgccatggc ctattggggc cagggcacaa gcgtgacagt cagctctacc 2160 acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 2220 ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 2280 ttcgcctgtg atatctacat ttgggcccct ctggctggta cttgcggggt cctgctgctt 2340 tcactcgtga tcactcttta ctgtaagcgc ggtcggaaga agctgctgta catctttaag 2400 caacccttca tgaggcctgt gcagactact caagaggagg acggctgttc atgccggttc 2460 ccagaggagg aggaaggcgg ctgcgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 2520 cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 2580 gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 2640 aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 2700 tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 2760 cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 2820 cctcgcgagg gcaggggaag tcttctaaca tgcggggacg tggaggaaaa tcccggcccc 2880 2880 <210> 18 <211> 3939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antigen receptor cassette <400> 18 gagtaattca tacaaaagga ctcgcccctg ccttggggaa tcccagggac cgtcgttaaa 60 ctcccactaa cgtagaaccc agagatcgct gcgttcccgc cccctcaccc gcccgctctc 120 gtcatcactg aggtggagaa gagcatgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc 180 gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct 240 agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc 300 ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca 360 acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct 420 ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg 480 attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa 540 ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg ccgccgcgtg 600 cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa 660 aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc 720 caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 780 tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 840 gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc 900 ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg 960 cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg 1020 ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac 1080 tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg 1140 tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200 gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260 gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320 tttcaggtgt cgtgattcga attcgccgcc accatggcct taccagtgac cgccttgctc 1380 ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc aggccggaca tcgtgctgac acagagccct 1440 gcttctctgg ccgtgtctct tggacagagg gccaccatgt cttgtagagc cggcgagagc 1500 gtggacatct tcggcgtggg atttctgcac tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct 1560 aagctgctga tctacagagc cagcaacctg gaaagcggca tccctgtgcg gtttagcggc 1620 acaggcagca gaaccgactt caccctgatc atcgaccccg tggaagccga tgatgtggcc 1680 acctactact gccagcagac caacgaggac ccctacacat ttggcggagg caccaagctg 1740 gaaatcaagg gtggaggtgg cagcggagga ggtgggtccg gcggtggagg aagcgaggtt 1800 cagctgcagc agtctggcgc tgaactggtt gaacctggcg cctctgtgaa gctgagctgt 1860 accgccagcg gcttcaacat caaggacacc tacatgcact gggtcaagca gaggcctgag 1920 cagggactcg agtggatcgg cagaatcgat cccgccaacg gcaacagcaa atacgtgccc 1980 aagttccagg gcaaagccac catcaccgcc gacacctcta gcaacacagc ctacctgcag 2040 ctcaccagcc tgacctctga agataccgcc gtgtactact gcgccccttt cggctactac 2100 gtgtccgatt acgccatggc ctattggggc cagggcacaa gcgtgacagt cagctctacc 2160 acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 2220 ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 2280 ttcgcctgtg atatctacat ttgggcccct ctggctggta cttgcggggt cctgctgctt 2340 tcactcgtga tcactcttta ctgtaagcgc ggtcggaaga agctgctgta catctttaag 2400 caacccttca tgaggcctgt gcagactact caagaggagg acggctgttc atgccggttc 2460 ccagaggagg aggaaggcgg ctgcgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 2520 cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 2580 gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 2640 aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 2700 tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 2760 cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 2820 cctcgcgagg gcaggggaag tcttctaaca tgcggggacg tggaggaaaa tcccggcccc 2880 atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tcgcaaagtg 2940 tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt 3000 aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt 3060 aggggtgact ccttcacaca tactcctcct ctggatccac aggaactgga tattctgaaa 3120 accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac 3180 ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt 3240 tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata 3300 agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac 3360 tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa 3420 aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg 3480 ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg 3540 gacaagtgca accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata 3600 cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca 3660 gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg 3720 gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg 3780 tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt 3840 ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg 3900 ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc ttcatgtaa 3939 <210> 19 <211> 840 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 19 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met 145 150 155 160 His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg 165 170 175 Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln Gly 180 185 190 Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 195 200 205 Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro 210 215 220 Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 290 295 300 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 305 310 315 320 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 325 330 335 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 340 345 350 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 355 360 365 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 370 375 380 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 385 390 395 400 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 405 410 415 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 420 425 430 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 435 440 445 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 450 455 460 Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly 465 470 475 480 Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu 485 490 495 Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile 500 505 510 Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile 515 520 525 Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu 530 535 540 Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp 545 550 555 560 Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe 565 570 575 Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe 580 585 590 Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe 595 600 605 Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser 610 615 620 Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn 625 630 635 640 Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser 645 650 655 Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys 660 665 670 Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp 675 680 685 Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly 690 695 700 Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu 705 710 715 720 Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro 725 730 735 Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile 740 745 750 Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro 755 760 765 Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp 770 775 780 Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys 785 790 795 800 Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro 805 810 815 Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val 820 825 830 Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 835 840 <210> 20 <211> 861 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 20 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu 35 40 45 Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Ser Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Ile Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu 145 150 155 160 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val 195 200 205 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala 245 250 255 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro 260 265 270 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 275 280 285 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 290 295 300 Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu 305 310 315 320 Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 325 330 335 Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 340 345 350 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 355 360 365 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 370 375 380 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 405 410 415 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 420 425 430 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 435 440 445 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 450 455 460 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser 485 490 495 Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp Leu 500 505 510 Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Arg Lys 515 520 525 Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile 530 535 540 Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly 545 550 555 560 Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His 565 570 575 Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys 580 585 590 Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr 595 600 605 Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys 610 615 620 Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser 625 630 635 640 Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile 645 650 655 Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys 660 665 670 Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly 675 680 685 Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser 690 695 700 Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg 705 710 715 720 Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu 725 730 735 Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His 740 745 750 Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly 755 760 765 Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys 770 775 780 Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val 785 790 795 800 Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn 805 810 815 Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn 820 825 830 Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu 835 840 845 Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 850 855 860

Claims (30)

  1. 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA) 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암 배아 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 VH 도메인 및 서열번호 2로 표시되는 VL 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 암 배아 항원 결합 도메인은 가요성 링커를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 가요성 링커는 서열번호 3으로 표시되는 것인, 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 힌지 영역은 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 힌지 영역은 서열번호 4로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 막통과 도메인을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 막통과 도메인은 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 막통과 도메인은 서열번호 5로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 보조자극 도메인을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 보조자극 도메인은 서열번호 6으로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  14. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12) 또는 이들의 조합을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  15. 제5항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 서열번호 7로 표시되는, 키메라 항원 수용체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 8로 표시되는 신호 펩타이드를 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11 또는 12로 표시되는, 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제19항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 SFFV 프로모터, 연장 인자 1α(elongation factor 1a; EF 1a) 프로모터 또는 CAG 프로모터를 더 포함하는, 발현 카세트.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 절단된 EGFR 유전자(EGFRt)를 더 포함하고,
    상기 폴리뉴클레오타이드와 상기 절단된 EGFR 유전자는 절단 가능한 링커로 연결되는, 발현 카세트.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 서열번호 17 또는 18로 표시되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 카세트.
  24. 제20항의 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
  25. 제24항의 벡터가 형질 전환된 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 형질 전환된 숙주 세포.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 20으로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는, 형질 전환된 숙주 세포.
  28. 제25항의 숙주 세포를 유효 성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 암은 암 배아 항원(Carcino Embryonic Antigen, CEA)을 발현하는 것인, 약학 조성물.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물.
KR1020210059139A 2020-05-08 2021-05-07 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 KR20210136879A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20200055248 2020-05-08
KR1020200055248 2020-05-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210136879A true KR20210136879A (ko) 2021-11-17

Family

ID=78468706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210059139A KR20210136879A (ko) 2020-05-08 2021-05-07 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230227525A1 (ko)
EP (1) EP4148065A1 (ko)
KR (1) KR20210136879A (ko)
WO (1) WO2021225399A1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7273608B2 (en) * 2004-03-11 2007-09-25 City Of Hope Humanized anti-CEA T84.66 antibody and uses thereof
JP4699450B2 (ja) * 2004-04-15 2011-06-08 ジェネンコー・インターナショナル・インク Ｃａｂ分子、ｃｅａを対象とするａｄｅｐｔ構築
IL252295B2 (en) * 2014-12-19 2023-10-01 Dana Farber Cancer Inst Inc Chimeric antigen receptors and methods of using them
RU2017129455A (ru) * 2015-01-26 2019-03-04 Селлектис Сконструированные иммунные клетки с нокаутом рецептора т-клеток, снабженные химерными антигенными рецепторами, связывающимися с cd123, для лечения рецедивирующего/устойчивого острого миелоидного лейкоза или новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток
KR20180021137A (ko) * 2015-06-25 2018-02-28 아이셀 진 테라퓨틱스 엘엘씨 키메라 항원 수용체 (car), 조성물 및 이의 사용 방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021225399A1 (ko) 2021-11-11
EP4148065A1 (en) 2023-03-15
US20230227525A1 (en) 2023-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200325223A1 (en) Methods of treatments using antigen-binding proteins targeting cd56
RU2717651C2 (ru) Антитела к церамиду
CN114127113A (zh) 与钙网蛋白结合的多功能分子及其用途
US20220144960A1 (en) Cd30-binding moieties, chimeric antigen receptors, and uses thereof
US11220535B2 (en) Anti-BCMA chimeric antigen receptors
EP3868783A1 (en) Anti-l1cam antibody or antigen-binding fragment thereof and chimeric antigen receptor comprising same
KR102115236B1 (ko) 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
JP2023542080A (ja) カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
WO2023202280A1 (zh) 抗B7H6的scFv抗体、其编码基因及其应用
WO2023160260A1 (zh) Cd7-car-t细胞及其制备方法和应用
CN114026122A (zh) 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
US20230357395A1 (en) Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
WO2023024084A1 (zh) 一种嵌合抗原受体及其用途
WO2022216723A9 (en) Bispecific antibodies targeting nkp46 and cd38 and methods of use thereof
KR20210136879A (ko) 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
WO2023217062A1 (zh) 一种嵌合抗原受体及其应用
WO2023016554A1 (zh) 靶向cd22的抗原结合蛋白及其用途
TW202309091A (zh) 嵌合受體及其使用方法
JP2023527462A (ja) Ｃｄ２２に特異的な抗体およびその使用
WO2023010118A1 (en) Nfat-responsive reporter systems for assessing chimeric antigen receptor activation and methods of making and using the same
JP2023540248A (ja) Ｔｒｂｃ１またはｔｒｂｃ２を検出する方法

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal