TWI825090B - 結合pd-l1之親和體(affimer)及與其相關用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包括結合PD-L1之親和體多肽序列之蛋白質、編碼此等蛋白質之基因表現構築體、表現此等蛋白質之細胞及此等蛋白質、基因表現構築體及細胞之醫藥製劑以及在治療各種人類病狀，包括癌症中之用途。

Description

結合PD-L1之親和體(AFFIMER)及與其相關用途

人類癌症具有大量基因及表觀遺傳變化，產生潛在可由免疫系統識別之新抗原(Sjoblom等人, Science 314:268-74 (2006))。儘管在臨床前模型及患者中觀測到針對癌症之內源性免疫反應，但此反應為無效的，且已產生之癌症被免疫系統視為「自身」且容許的。為了促進此容許狀態，腫瘤可採用若干不同機制以主動抑制宿主免疫反應(Topalian等人, J Clin Oncol 29:4828-36 (2011)；Mellman等人, Nature 480:480-489 (2011))。在此等機制中，通常終止免疫反應以緩解側支組織損傷之內源性「免疫檢查點」可被腫瘤拉攏以避免免疫破壞。研發特異性免疫檢查點路徑抑制劑之成果開始提供新穎的用於治療癌症之免疫治療方法，包括研發抗CTLA-4抗體、伊派利單抗(ipilimumab)，用於治療晚期黑素瘤患者(Nodi等人, New Engl J Med 363:711-23 (2010))。

計劃性死亡-1 (PD-1)為由經活化之T及B細胞表現之關鍵免疫檢查點受體且介導免疫抑制。PD-1為CD28受體家族之成員，該受體家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1及BTLA。已鑑別PD-1之兩種細胞表面糖蛋白配位體，計劃性死亡配位體-1 (PD-L1)及計劃性死亡配位體-2 (PD-L2)，其表現於抗原呈現細胞以及多中人類癌症上且已證實在結合於PD-1時調降T細胞活化及細胞介素分泌(Freeman等人, J. Exp. Med. 192(7): 1027-34 (2000)；Latchm an等人, Nat Immunol 2:261-8 (2001))。

PD-1主要在周邊組織中起作用，在該等周邊組織中，經活化之T細胞可能遇到由腫瘤和/或基質細胞表現之免疫抑制性PD-L1 (亦稱為B7-H1或CD274)及PD-L2 (B7-DC)配位體(Flies等人, Yale J Biol Med 84:409-21 (2011)；Topalian等人, Curr Opin Immuno 24:1-6 (2012))。

在臨床前模型中，抑制PD-1/PD-L1相互作用可介導強效抗腫瘤活性(美國專利案第8,008,449號及第7,943,743號)。似乎上調PD-L1可使癌症躲避宿主免疫系統。對來自腎細胞癌患者之196份腫瘤樣本之分析發現PD-L1之高腫瘤表現與腫瘤侵襲性增加及死亡風險增加4.5倍相關聯(Thompson等人, Proc Natl Acad Sci USA 101 (49): 17174-9 (2004))。PD-L1表現較高之卵巢癌患者與表現較低之患者相比具有明顯更差之預後。PD-L1表現與上皮內CD8+ T淋巴球計數逆相關，表明腫瘤細胞上之PD-L1可抑制抗腫瘤CD8+ T細胞(Hamanishi等人, Proc Natl Acad Sci USA 104 (9): 3360-3365 (2007))。

PD-L1亦與感染性疾病，尤其慢性感染性疾病相關。細胞毒性CD8 T淋巴細胞(CTL)在感染控制中起關鍵作用。然而，經活化之CTL通常在慢性感染期間失去效應子功能。B7/CD28家族之PD-1受體及其配位體PD-L1充當T細胞共同抑制路徑且作為在人類免疫缺乏病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、疱疹病毒及其他能夠產生慢性感染之細菌、原蟲及病毒病原體之慢性感染期間使效應子CTL轉化成耗竭之CTL的主要調節因子出現。此類細菌及原蟲病原體可包括大腸桿菌(E. coli )、葡萄球菌屬(Streptococcus sp.)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis )、梨形鞭毛蟲屬(Giardia)、瘧疾(Malaria)、利什曼原蟲(Leishmania )及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )。重要的是，阻斷PD-1/PD-L1路徑能夠恢復針對耗竭之CTL之功能能力。因此，PD1/PD-L1為用於研發針對慢性細菌及病毒感染之有效預防性及治療性疫苗接種之目標(參見例如Hofmeyer等人, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 第2011卷, Article ID 451694, 第9頁, doi:10.1155/2011/451694)。

近期研究亦證實全身性免疫抑制可能降低建立神經退化性疾病中之腦部修復所需的保護性、細胞介導之免疫反應之能力。藉由使用阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)之小鼠模型，證實針對計劃性死亡-1 (PD-1)路徑之免疫檢查點阻斷引起干擾素γ依賴性全身性免疫反應，其接著使單核球衍生之巨噬細胞募集至腦部。當在具有已確定的病理學之小鼠中誘導時，此免疫反應引起大腦澱粉狀蛋白-β (Aβ)斑塊之清除及改良認知效能。此等結果表明在神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏症)中，可使用針對PD-L1之抗體在治療學上靶向免疫檢查點(參見例如Baruch等人, Nature Medicine, 2016年1月, doi:10.1038/nm.4022)。

已研發針對PD-L1之特異性抗體作為抗癌劑(參見美國專利案第9,212,224號及第8,008,449號)。使用PD-1/PD-L1相互作用之Ab抑制劑治療癌症已進入臨床試驗階段(Brahmer等人, J Clin Oncol 28:3167-75 (2010)；Flies等人, Yale J Biol Med 84:409-21 (2011)；Topalian等人, N Engl J Med 366:2443-54 (2012)；Brahmer等人, N Engl J Med 366:2455-65 (2012))。然而，需要適用於治療癌症、感染性疾病及神經退化性疾病(例如阿茲海默氏症)之其他PD-L1抑制性活性，諸如可易於與其他提供例如治療活性或PK/ADME修飾活性之多肽序列一起格式化成融合蛋白質的一部分之PD-L1抑制劑。本申請案實現此需求及其他需求。

在一些態樣中，本發明提供包含結合PD-L1之親和體多肽序列之蛋白質，該親和體多肽序列以1×10^-6 M或更低的Kd結合於PD-L1且抑制其所結合之PD-L1與PD-1之相互作用。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽結合人類PD-L1且阻斷與人類PD-1之相互作用。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽結合人類PD-L1且阻斷與人類CD80之相互作用。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以1×10^-7 M或更低之Kd、1×10^-8 M或更低之Kd、1×10^-9 M或更低之Kd或甚至1×10^-10 M或更低之Kd結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10^-3 s^-1 或更慢、10^-4 s^-1 或更慢或甚至10^-5 s^-1 或更慢之K_off 結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10³ M^-1 s^-1 或更快、10⁴ M^-1 s^-1 或更快、10⁵ M^-1 s^-1 或更快或甚至10⁶ M^-1 s^-1 或更快之K_on 結合PD-L1。在一些實施例中，在用人類PD-1進行之競爭性結合分析法中，結合PD-L1之親和體多肽以1 μM或更低、100 nM或更低、40 nM或更低、20 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低或甚至0.1 nM或更低之IC50結合PD-L1。

在一些實施例中，在用人類CD80 (B7-1)進行之競爭性結合分析法中，結合PD-L1之親和體多肽以1 μM或更低、100 nM或更低、40 nM或更低、20 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低或0.1 nM或更低之IC₅₀ 結合PD-L1。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽具有通式(I)中表示之胺基酸序列 FR1-(Xaa)_n -FR2-(Xaa)_m -FR3(I) 其中 FR1為由MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(SEQ ID NO:1) 表示之多肽序列或與其具有至少70%同源性之多肽序列； FR2為由GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(SEQ ID NO:2) 表示之多肽序列或與其具有至少70%同源性之多肽序列； FR3為由EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(SEQ ID NO:3) 表示之多肽序列或與其具有至少70%同源性之多肽序列；及 Xaa在每次出現時獨立地為胺基酸殘基；及 n及m各自獨立地為3至20之整數。

在一些實施例中，FR1可為與SEQ ID NO:1具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之多肽序列。在一些實施例中，FR2為與SEQ ID NO:2具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之多肽序列。在一些實施例中，FR3為與SEQ ID NO:2具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之多肽序列。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽具有以下通式中表示之胺基酸序列： MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)_n -Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)_m -Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQ ID NO:4) 其中 Xaa在每次出現時獨立地為胺基酸殘基； n及m各自獨立地為3至20之整數； Xaa1為Gly、Ala、Val、Arg、Lys、Asp或Glu； Xaa2為Gly、Ala、Val、Ser或Thr； Xaa3為Arg、Lys、Asn、Gln、Ser、Thr； Xaa4為Gly、Ala、Val、Ser或Thr； Xaa5為Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro； Xaa6為Gly、Ala、Val、Asp或Glu；及 Xaa7為Ala、Val、Ile、Leu、Arg或Lys。

在一些實施例中，Xaa1為Gly、Ala、Arg或Lys，甚至更佳為Gly或Arg。在一些實施例中，Xaa2為Gly或Ser。在一些實施例中，Xaa3為Arg Arg、Lys、Asn或Gln，更佳為Lys或Asn。在一些實施例中，Xaa4為Gly或Ser。在一些實施例中，Xaa5為Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro，更佳為Ile、Leu或Pro，且甚至更佳為Leu或Pro。在一些實施例中，Xaa6為Ala、Val、Asp或Glu，甚至更佳為Ala或Glu。在一些實施例中，Xaa7為Ile、Leu或Arg，更佳為Leu或Arg。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽具有以下通式中表示之胺基酸序列： MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)_n -STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)_m -ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQ ID NO:5) 其中Xaa在每次出現時獨立地為胺基酸殘基；且n及m各自獨立地為3至20之整數。 在以上序列之一些實施例中，(Xaa)_n (「環2」)為通式(II)中表示之胺基酸序列 -aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6-(II) 其中 aa1表示具有鹼性側鏈之胺基酸殘基； aa2表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，更佳小型脂族側鏈、中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基； aa3表示具有芳族或鹼性側鏈之胺基酸殘基； aa4表示具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基； aa5表示具有中性極性或帶電(酸性或鹼性)或小型脂族或芳族側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電側鏈之胺基酸殘基；及 aa6表示具有芳族或酸側鏈之胺基酸殘基。

在一些實施例中，aa1表示Lys、Arg或His，更佳為Lys或Arg。在一些實施例中，aa2表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，更佳為Ala、Gln、ASP或Glu。在一些實施例中，aa3表示Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，較佳為Phe、Tyr、Trp，更佳為His或Tyr、Trp或His。在一些實施例中，aa4表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，更佳為Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在一些實施例中，aa5表示Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，更佳為Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。在一些實施例中，aa6表示Phe、Tyr、Trp、Asp或Glu；較佳為Trp或Asp；更佳為Trp。

在以上序列之某些其他實施例中，(Xaa)_n (「環2」)為通式(III)中表示之胺基酸序列 -aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp-(III) 其中 aa1表示具有鹼性側鏈或芳族側鏈之胺基酸殘基； aa2表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，更佳小型脂族側鏈、中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基； aa3表示具有芳族或鹼性側鏈之胺基酸殘基，較佳為Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更佳為Phe、Tyr、Trp或His，且甚至更佳為Tyr、Trp或His； aa4表示具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基；更佳為Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，且甚至更佳為Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu；及 aa5表示具有中性極性或帶電(酸性或鹼性)或小型脂族或芳族側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電側鏈之胺基酸殘基；更佳為Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，且甚至更佳為Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。

在一些實施例中，aa1表示Lys、Arg、His、Ser、Thr、Asn或Gln，更佳為Lys、Arg、His、Asn或Gln，且甚至更佳為Lys或Asn。在一些實施例中，aa2表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，更佳為Ala、Gln、ASP或Glu。在一些實施例中，aa3表示Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，較佳為Phe、Tyr、Trp或His，且甚至更佳為Tyr、Trp或His。在一些實施例中，aa4表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，且甚至更佳為Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在一些實施例中，aa5表示Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，且甚至更佳為Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。

在以上序列之一些實施例中，(Xaa)_n (「環2」)為選自SEQ ID NO:6至41之胺基酸序列，或與其具有至少80%同源性之胺基酸序列，且更佳為與其具有至少85%、90%、95%或甚至98%同源性之胺基酸序列。

在以上序列之一些實施例中，(Xaa)_n (「環2」)為選自SEQ ID NO:6至41之胺基酸序列，或與其具有至少80%一致性之胺基酸序列，且更佳為與其具有至少85%、90%、95%或甚至98%一致性之胺基酸序列。

在以上序列之一些實施例中，(Xaa)_m (「環4」)為通式(IV)中表示之胺基酸序列 -aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-(IV) 其中 aa7表示具有中性極性或非極性側鏈或酸性側鏈之胺基酸殘基； aa8表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或芳族側鏈，更佳帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基； aa9表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或芳族側鏈，更佳中性極性側鏈或酸側鏈之胺基酸殘基； aa10表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或芳族側鏈，更佳中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基； aa11表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或帶電(酸性或鹼性)側鏈或非極性脂族側鏈或芳族側鏈，更佳中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基； aa12表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或非極性脂族側鏈或芳族側鏈，更佳酸側鏈之胺基酸殘基； aa13表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或非極性脂族側鏈或芳族側鏈，更佳酸側鏈之胺基酸殘基； aa14表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基；及 aa15表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或中性非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基。

在一些實施例中，aa7表示Gly、Ala、Val、Pro、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu，且甚至更佳為Gly、Ala、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu。在一些實施例中，aa8表示Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gln、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Pro、Gly、Tyr或Phe，且甚至更佳為Asp、Glu、Lys、Arg、His或Gln。在一些實施例中，aa9表示Gln、Ser、Thr、Asn、Asp、Glu、Arg、Lys、Gly、Leu、Pro或Tyr，且甚至更佳為Gln、Thr或Asp。在一些實施例中，aa10表示Asp、Glu、Arg、His、Lys、Ser、Gln、Asn、Ala、Leu、Tyr、Trp、Pro或Gly，且甚至更佳為Asp、Glu、His、Gln、Asn、Leu、Trp或Gly。在一些實施例中，aa11表示Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Arg、Lys、His、Val、Ile、Tyr或Gly，且甚至更佳為Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Lys或His。在一些實施例中，aa12表示Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Asn、Lys、Arg、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe或Gly，且甚至更佳為Asp、Glu、Ser、Tyr、Trp、Arg或Lys。在一些實施例中，aa13表示Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Pro、Asp、Glu、His、Arg、Trp、Tyr或Phe，且甚至更佳為Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Asp或Glu。在一些實施例中，aa14表示Ala、Ile、Trp、Pro、Asp、Glu、Arg、Lys、His、Ser、Thr、Gln或Asn，且甚至更佳為Ala、Pro、Asp、Glu、Arg、Lys、Ser、Gln或Asn。在一些實施例中，aa15表示His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln、Asn、Ala、Val、Leu、Gly或Phe，且甚至更佳為His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln或Asn。

在以上序列之一些實施例中，(Xaa)_n (「環4」)為選自SEQ ID NO:42至77之胺基酸序列，或與其具有至少80%同源性之胺基酸序列，且更佳為與其具有至少85%、90%、95%或甚至98%同源性之胺基酸序列。

在以上序列之一些實施例中，(Xaa)_n (「環4」)為選自SEQ ID NO:42至77之胺基酸序列，或與其具有至少80%一致性之胺基酸序列，且更佳為與其具有至少85%、90%、95%或甚至98%一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽具有選自SEQ ID NO:78至86之胺基酸序列，或與其具有至少70%同源性，且甚至更佳與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之胺基酸序列。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽具有選自SEQ ID NO:78至86之胺基酸序列，或與其具有至少70%一致性，且甚至更佳與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽具有可由核酸編碼之胺基酸序列，該核酸具有對應於SEQ ID NO:87至94中之一者之核苷酸1-336之編碼序列，或與其至少70%一致之編碼序列，且甚至更佳與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之編碼序列。

在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽具有可由具有編碼序列之核酸編碼之胺基酸序列，該編碼序列在45℃下之6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在65℃下在0.2X SSC中洗滌之嚴格條件下與SEQ ID NO:87至94中之任一者雜交。

在一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑蛋白質經由結合PD-L1之親和體多肽以與由抗PD-L1抗體阿特珠單抗(Atezolizumab)、艾維路單抗(Avelumab)及/或德瓦魯單抗(Durvalumab)結合之PD-L1競爭之方式結合PD-L1。

在一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑蛋白質包括結合PD-L1之親和體多肽，該親和體多肽與PD-L1形成晶體結構，該晶體結構包含涉及至少10個選自以下之PD-L1之殘基之界面：Ile-54、Tyr-56、Glu-58、Glu-60、Asp-61、Lys-62、Asn-63、Gln 66、Val-68、Val-76、Val-111、Arg-113、Met-115、Ile-116、Ser-117、Gly-120、Ala-121、Asp-122、Tyr-123及Arg-125。

在一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑蛋白質以取決於結合於PD-L1之結合PD-L1之親和體多肽之方式實現(a)當用葡萄球菌腸毒素B (staphylococcus enterotoxin B；SEB)處理時，增加具有某些Vfi鏈(例如人類PBMC中之VB3、VB12、VB14及VB17)之T細胞子集中之T細胞受體信號傳導；(b)在SEB分析法中增加干擾素-γ產生；及/或(c)在SEB分析法中以劑量依賴性方式增加介白素-2 (IL-2)產生。

在一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑蛋白質以取決於結合於PD-L1之結合PD-L1之親和體多肽之方式實現(a)在混合淋巴細胞反應(MLR)分析法中增加T細胞增殖；(b)在MLR分析法中增加干擾素-γ產生；及/或(c)在MLR分析法中增加介白素-2 (IL-2)分泌。

在一些實施例中，親和體試劑為融合蛋白質，其除結合PD-L1之親和體多肽以外可包括(作為說明)一或多種選自由以下組成之群之其他胺基酸序列：分泌信號序列、肽連接子序列、親和標籤、跨膜域、細胞表面滯留序列、用於轉譯後修飾之受質識別序列、用於建立經由蛋白質-蛋白質相互作用而聚集之蛋白質多聚合結構之多聚合域、延長半衰期之多肽部分、用於改變抗體之組織定位及抗原結合位點之多肽序列及一或多種結合PD-L1或不同目標之其他親和體多肽序列。

在一些實施例中，融合蛋白質包括延長半衰期之多肽部分，諸如選自由以下組成之群：Fc域或其一部分、白蛋白蛋白質或其一部分、白蛋白結合多肽部分、鐵傳遞蛋白或其一部分、鐵傳遞蛋白結合多肽部分、纖維連接蛋白或其一部分或纖維連接蛋白結合多肽部分。

當融合蛋白質包括Fc域或其一部分時，在一些實施例中，其為保持FcRn結合之Fc域。

當融合蛋白質包括Fc域或其一部分時，在一些實施例中，該Fc域或其一部分係來自IgA、IgD、IgE、IgG及IgM或其子類別(同型)，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。

在一些實施例中，融合蛋白質具有SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112之胺基酸序列，或與其具有至少70%同源性且甚至更佳與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之序列。

當融合蛋白質包括Fc域或其一部分時，在一些實施例中，Fc域或其一部分保持選自以下之效應子功能：C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、B細胞受體之調降或其組合。

在一些實施例中，當融合蛋白質包括延長半衰期之多肽部分時，與蛋白質中不存在該部分時相比，該部分使蛋白質之血清半衰期延長至少5倍，例如10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍或甚至1000倍。

在一些實施例中，本發明之融合蛋白質係以適用於人類患者中之治療用途之醫藥製劑形式提供，其進一步包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、緩衝劑、鹽或其類似物。

在本發明之另一態樣中，提供一種重組型抗體，其包含一或多個形成結合於目標抗原之一或多個抗原結合位點之V_H 及/或V_L 鏈，其中V_H 及/或V_L 鏈中之至少一者為融合蛋白質，其亦包括至少一種結合PD-L1之親和體多肽序列，該至少一種親和體多肽序列以1×10^-6 M或更低的Kd結合PD-L1且抑制PD-1與其所結合之PD-L1之相互作用。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽結合人類PD-L1且阻斷與人類PD-1之相互作用。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以1×10^-7 M或更低之Kd、1×10^-8 M或更低之Kd、1×10^-9 M或更低之Kd或甚至1×10^-10 M或更低之Kd結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10^-3 s^-1 或更慢、10^-4 s^-1 或更慢或甚至10^-5 s^-1 或更慢之K_off 結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10³ M^-1 s^-1 或更快、10⁴ M^-1 s^-1 或更快、10⁵ M^-1 s^-1 或更快或甚至10⁶ M^-1 s^-1 或更快之K_on 結合PD-L1。在一些實施例中，在用人類PD-1進行之競爭性結合分析法中，結合PD-L1之親和體多肽以1 μM或更低、100 nM或更低、40 nM或更低、20 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低或甚至0.1 nM或更低之IC50結合PD-L1。

在一些實施例中，V_H 鏈包括Fc域。

在一些實施例中，目標抗原為免疫檢查點。

在一些實施例中，目標抗原為免疫共刺激性受體且嵌合抗體促效共刺激性受體之結合。

在一些實施例中，目標抗原為血管生成因子或因此其受體且嵌合抗體拮抗血管生成因子或因此其受體。

在一些實施例中，目標抗原為腫瘤抗原。

在一些實施例中，目標抗原為可溶性免疫抑制性因子或因此其受體，且嵌合抗體抑制免疫抑制性因子充當免疫刺激性信號之免疫抑制活性。

在一些實施例中，其中目標抗原係選自由以下組成之群：PD-1、PD-L2、CTLA-4、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT、CD28、ICOS、CD137、OX40、GITR、CD27、CD30、HVEM、DNAM-1或CD28H、CEACAM-1、CEACAM-5、BTLA、LAIR1、CD160、2B4、TGFR、B7-H3、B7-H4、CD40、CD4OL、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、半乳糖凝集素-9、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、LIGHT、I類或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX4OL、PVR、SIRPα、TCR、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、VEGF、VEGF受體、EGFR、Her2/neu、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E或TSLP。

在一些實施例中，提供一種重組型親和體-伊派利單抗抗體融合蛋白質，其包含

親和體-重鏈融合蛋白質(其中視情況移除分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO: 136) )，其具有SEQ ID NO:113之胺基酸序列或與其具有至少70%同源性(例如，與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性)之序列，及

輕鏈蛋白質(其中視情況移除分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO: 136) )，其具有SEQ ID NO:114之胺基酸序列或與其至少70%同源性(例如，與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性)之序列。

在一些實施例中，提供一種重組型親和體-貝伐珠單抗(Bevacizumab)抗體融合蛋白質，其包含

親和體-重鏈融合蛋白質(其中視情況移除分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO: 136) )，其具有SEQ ID NO:115或117之胺基酸序列或與其具有至少70%同源性(例如，與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性)之序列，及

輕鏈蛋白質(其中視情況移除分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO: 136) )，其具有SEQ ID NO:116之胺基酸序列或與其至少70%同源性(例如，與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性)之序列。

在一些實施例中，本發明之重組型抗體係以適用於人類患者中之治療用途之醫藥製劑形式提供，其進一步包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、緩衝劑、鹽或其類似物。

在本發明之另一態樣中，提供一種重組型受體陷阱融合蛋白質，其包含(i)受體之配位體結合域，及(ii)結合PD-L1之親和體多肽序列，其以1×10^-6 M或更低的Kd結合於PD-L1且抑制PD-1與其所結合之PD-L1之相互作用。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以1×10^-7 M或更低之Kd、1×10^-8 M或更低之Kd、1×10^-9 M或更低之Kd或甚至1×10^-10 M或更低之Kd結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10^-3 s^-1 或更慢、10^-4 s^-1 或更慢或甚至10^-5 s^-1 或更慢之K_off 結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10³ M^-1 s^-1 或更快、10⁴ M^-1 s^-1 或更快、10⁵ M^-1 s^-1 或更快或甚至10⁶ M^-1 s^-1 或更快之K_on 結合PD-L1。在一些實施例中，在用人類PD-1進行之競爭性結合分析法中，結合PD-L1之親和體多肽以1 μM或更低、100 nM或更低、40 nM或更低、20 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低或甚至0.1 nM或更低之IC50結合PD-L1。

在一些實施例中，結合域結合於PGE2、TGF-β、VEGF、CCL2、IDO、CSF1、IL-10、IL-13、IL-23或腺苷。

在一些實施例中，重組型受體陷阱融合蛋白質包括一或多個誘導重組型受體陷阱融合蛋白質之多聚合之多聚合域，亦即，在多聚複合物中包括2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10個重組型受體陷阱融合蛋白質之複合物。

在一些實施例中，本發明之重組型受體陷阱融合蛋白質係以適用於人類患者中之治療用途之醫藥製劑形式提供，其進一步包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、緩衝劑、鹽或其類似物。

在本發明之另一態樣中，提供一種重組型受體配位體融合蛋白質，其包含(i)多肽配位體序列，其結合以促效或拮抗其同源受體，及(ii)結合PD-L1之親和體多肽序列，其以1×10^-6 M或更低的Kd結合於PD-L1且抑制PD-1與其所結合之PD-L1之相互作用。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以1×10^-7 M或更低之Kd、1×10^-8 M或更低之Kd、1×10^-9 M或更低之Kd或甚至1×10^-10 M或更低之Kd結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10^-3 s^-1 或更慢、10^-4 s^-1 或更慢或甚至10^-5 s^-1 或更慢之K_off 結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10³ M^-1 s^-1 或更快、10⁴ M^-1 s^-1 或更快、10⁵ M^-1 s^-1 或更快或甚至10⁶ M^-1 s^-1 或更快之K_on 結合PD-L1。在一些實施例中，在用人類PD-1進行之競爭性結合分析法中，結合PD-L1之親和體多肽以1 μM或更低、100 nM或更低、40 nM或更低、20 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低或甚至0.1 nM或更低之IC50結合PD-L1。

在重組型受體配位體融合蛋白質之一些實施例中，多肽配位體為共刺激性受體之配位體且在結合時促效共刺激性受體。

舉例而言，多肽配位體可選自B7.1、4-1BBL、OX40L、GITRL或LIGHT。

舉例而言，多肽配位體可為促進抗腫瘤免疫性之免疫刺激性細胞介素，諸如IFN-α2、IL-2、IL-15、IL-21及IL-12。

在一些實施例中，重組型受體配位體融合蛋白質包括一或多個誘導重組型受體配位體融合蛋白質之多聚合之多聚合域，亦即，在多聚複合物中包括2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10個重組型受體配位體融合蛋白質之複合物。

在一些實施例中，本發明之重組型受體配位體融合蛋白質係以適用於人類患者中之治療用途之醫藥製劑形式提供，其進一步包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、緩衝劑、鹽或其類似物。

在本發明之另一態樣中，提供一種多特異性T細胞接合融合蛋白質，其包含(i)結合CD3之多肽，其結合於T細胞表面上之CD3，及(ii)結合PD-L1之親和體多肽序列，其以1×10^-6 M或更低的Kd結合於PD-L1且抑制PD-1與其所結合之PD-L1之相互作用。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以1×10^-7 M或更低之Kd、1×10^-8 M或更低之Kd、1×10^-9 M或更低之Kd或甚至1×10^-10 M或更低之Kd結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10^-3 s^-1 或更慢、10^-4 s^-1 或更慢或甚至10^-5 s^-1 或更慢之K_off 結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10³ M^-1 s^-1 或更快、10⁴ M^-1 s^-1 或更快、10⁵ M^-1 s^-1 或更快或甚至10⁶ M^-1 s^-1 或更快之K_on 結合PD-L1。在一些實施例中，在用人類PD-1進行之競爭性結合分析法中，結合PD-L1之親和體多肽以1 μM或更低、100 nM或更低、40 nM或更低、20 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低或甚至0.1 nM或更低之IC50結合PD-L1。

在一些實施例中，本發明之多特異性T細胞接合融合蛋白質係以適用於人類患者中之治療用途之醫藥製劑形式提供，其進一步包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、緩衝劑、鹽或其類似物。

在本發明之另一態樣中，提供一種嵌合受體融合蛋白質，其包含(i)細胞外部分，其包括結合PD-L1之親和體多肽序列，其以1×10^-6 M或更低的Kd結合於PD-L1且抑制PD-1與其所結合之PD-L1之相互作用；(ii)跨膜域；及(c)細胞質域，其包含4-1BB信號傳導域及CD3ε信號傳導域，以及視情況存在之共刺激性信號傳導區。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以1×10^-7 M或更低之Kd、1×10^-8 M或更低之Kd、1×10^-9 M或更低之Kd或甚至1×10^-10 M或更低之Kd結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10^-3 s^-1 或更慢、10^-4 s^-1 或更慢或甚至10^-5 s^-1 或更慢之K_off 結合PD-L1。在一些實施例中，結合PD-L1之親和體多肽以10³ M^-1 s^-1 或更快、10⁴ M^-1 s^-1 或更快、10⁵ M^-1 s^-1 或更快或甚至10⁶ M^-1 s^-1 或更快之K_on 結合PD-L1。在一些實施例中，在用人類PD-1進行之競爭性結合分析法中，結合PD-L1之親和體多肽以1 μM或更低、100 nM或更低、40 nM或更低、20 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低或甚至0.1 nM或更低之IC50結合PD-L1。

在某些實施例中，本發明亦提供一種細胞，較佳為淋巴細胞且甚至更佳為T-淋巴細胞，其已經編碼嵌合受體融合蛋白質之基因工程改造，該基因在表現時引起細胞表面上嵌合受體融合蛋白質之呈現。

在本發明之另一態樣中，提供一種核酸，其包含編碼親和體試劑(諸如上文(及本文)中所描述之蛋白質)之編碼序列。

在一些實施例中，編碼序列可操作地連接至一或多種轉錄調節序列，諸如啟動子及/或強化子。

在一些實施例中，核酸包括複製、微小染色體維持元件(MME)及/或細胞核定位元件之一或多種來源。

在一些實施例中，核酸包括聚腺苷酸化信號序列，其與編碼序列可操作地連接且由其轉錄。

在一些實施例中，編碼序列包括一或多個內含子序列。

在一些實施例中，核酸包括一或多個經編碼序列轉錄之核糖體結合位點。

在一些實施例中，核酸為DNA。

在一些實施例中，核酸為RNA，諸如mRNA。

在本發明之另一態樣中，提供一種病毒載體，其包含編碼親和體試劑(諸如上文(及本文)中所描述之蛋白質)之編碼序列。

在本發明之另一態樣中，提供一種質體DNA、質體載體或微型環，其包括編碼親和體試劑(諸如上文(及本文)中所描述之蛋白質)之編碼序列。

在本發明之另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其進一步包含與其結合之結合PD-L1之親和體多肽。

在本發明之另一態樣中，本發明提供可溶性受體或其配位體結合域，其進一步包含與其結合之結合PD-L1之親和體多肽。

在本發明之另一態樣中，本發明提供生長因子、細胞介素或其趨化因子生物活性多肽片段，其進一步包含與其結合之結合PD-L1之親和體多肽。

在本發明之另一態樣中，本發明提供共刺激性促效劑多肽，其進一步包含與其結合之結合PD-L1之親和體多肽。

在本發明之另一態樣中，本發明提供檢查點抑制性多肽，其進一步包含與其結合之結合PD-L1之親和體多肽。

在本發明之另一態樣中，本發明提供親和體試劑，其包含結合PD-L1之親和體多肽及與其結合之可偵測標記、毒素或一或多種治療劑。

本文中亦提供適用於人類患者中之治療性基因傳遞之醫藥製劑，其包含本發明之核酸、病毒載體、質體DNA、質體載體或微型環，及(ii)一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、緩衝劑、鹽、轉染增強劑、電致孔增強劑或其類似物。

本文中亦提供一種方法，其包含向個體投與本文中所描述之蛋白質、重組型抗體或核酸(包含結合於PD-L1之親和體)。

在一些實施例中，個體包含表現PD-L1之癌細胞，視情況其中癌細胞為黑素瘤細胞。

在一些實施例中，蛋白質、重組型抗體或核酸係以引起混合淋巴細胞反應中T細胞之IFNγ產生增加之有效量投與。

在一些實施例中，蛋白質、重組型抗體或核酸係以與僅媒劑對照物相比使個體中之T細胞之IFNγ產生增加至少2倍之有效量投與。

在一些實施例中，個體具有腫瘤，其包含表現PD-L1之癌細胞，且在給藥後96小時，腫瘤中結合PD-L1之親和體多肽之聚集量為血漿中含量之至少5倍。

在一些實施例中，個體具有腫瘤，其包含表現PD-L1之癌細胞，且蛋白質、重組型抗體或核酸係以抑制個體中之腫瘤生長達至少10%之有效量投與。

在一些實施例中，個體具有黑素瘤。

相關申請案 本申請案主張2018年4月11日提交之大不列顛申請案第1805963.4號在35 U.S.C. § 119(a)下之權利，其以全文引用之方式併入本文中。

I. 概述 本發明係基於產生親和體，該等親和體結合於PD-L1且抑制該分子與PD-1之相互作用，且因此表示在治療癌症、化生、贅瘤及某些病毒及副細胞感染中具有效用之檢查點抑制劑。

基於天然存在之蛋白質(胱抑素)及經工程改造以穩定呈現建立結合表面之兩個環，本發明之結合PD-L1之親和體多肽與抗體、抗體片段及其他非抗體結合蛋白質相比提供多種優點。

一種為小尺寸親和體多肽本身。在其單體形式中，其為約14 kDa，或抗體尺寸之1/10。此小尺寸提供更大的增加組織滲透之潛力，尤其在未充分血管化及/或纖維化目標組織(如腫瘤)中。

親和體具有簡單的蛋白質結構(與多域抗體相比)，且由於親和體不需要二硫鍵或功能之其他轉譯後修飾，可在原核及真核系統中製造許多包括此等多肽之格式實施例。

藉由利用親和體文庫(諸如隨附實例中描述之噬菌體呈現技術)以及定點突變誘發之能力，可產生具有可調整之結合動力學之親和體，其具有理想的治療性用途範圍。舉例而言，親和體可具有針對PD-L1之高親和力，諸如單數位奈莫耳或較低K_D (單體親和體)及皮莫耳K_D 及親合力(多價格式)。可產生具有針對PD-L1之緊密結合動力學之親和體，諸如在10^-4 至10^-5 (s-1)範圍內之緩慢Koff率，其有利於目標組織定位。

本發明之結合PD-L1之親和體包括具有敏銳選擇性之親和體。

此外，結合PD-L1之親和體可易於格式化，使得易於產生及製造諸如Fc融合物、完全抗體融合物及串聯多聚體之格式。

無需二硫鍵及轉譯後修飾亦使得在治療學上能夠藉由引入患者組織中之基因遞送構築體之表現來遞送許多包括結合PD-L1之親和體(或單體親和體)之蛋白質之實施例，包括其中全身性遞送(諸如來自肌肉組織之表現)或局部遞送(諸如經由瘤內基因遞送)蛋白質之格式。

II. 定義 為了促進對本發明的理解，在下文中定義多個術語及片語。

a. 親和體 術語「Stefin多肽」係指胱抑素超家族中蛋白質之子群，胱抑素超家族為涵蓋含有多個胱抑素樣序列之蛋白質之家族。

胱抑素家族之Stefin子群為相對較小(約100個胺基酸)的單結構域蛋白質。其不接受已知的轉譯後修飾且不含二硫鍵，表明其將能夠在廣泛範圍之細胞外及細胞內環境中相同地摺疊。Stefin A本身為具有98個胺基酸之單體、單鏈、單結構域蛋白質。已知曉Stefin A之結構，促進Stefin A合理突變成親和體骨架。胱抑素之唯一已知的生物活性為抑制組織蛋白酶活性，其使得吾人能夠詳盡地測試吾人之經工程改造之蛋白質之殘餘生物活性。

術語「親和體」(或「親和體骨架」或「親和體多肽」)係指小型、高度穩定的蛋白質，其為Stefin多肽之以重組方式工程改造之變異體。親和體蛋白質顯示兩個肽環及N端序列，其皆可經隨機化從而以與單株抗體類似之方式，以高親和力及特異性結合於所需目標蛋白質。由Stefin蛋白質骨架進行之兩種肽之穩定化可限制肽之可能的構形，與游離肽之文庫相比增加結合親和力及特異性。此等經工程改造之非抗體結合蛋白質經設計以模擬不同應用中單株抗體之分子識別特徵。可進行對Stefin多肽序列之其他部分之改變，其中此類變化改良此等親和力試劑之特性，諸如增加穩定性，使其在一系列溫度及pH值以及其類似條件下穩定。較佳地，親和體包括來源於Stefin A之序列，與Stefin A野生型序列(諸如人類Stefin A)共有顯著一致性。熟習此項技術者將顯而易見，可在不偏離本發明之情況下對骨架序列進行修飾。特定言之，親和體骨架可具有與人類Stefin A之相應序列至少25%、35%、45%、55%或60%一致之胺基酸序列，較佳至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%一致，例如當序列變化不會不利地影響骨架結合於所需目標(諸如PD-L1)之能力時，及例如不會恢復或產生生物學功能，諸如由野生型Stefin A所具有，但在本文中所描述之突變變化中消除之功能。

「親和體試劑」係指一種多肽，其包括親和體多肽序列且具有任何其他修飾(例如結合、轉譯後修飾等)，以便呈現意欲用於遞送至患者之治療活性蛋白質。

「計劃性死亡配位體1」，亦稱為「PD-L1」、「分化叢集274」、「CD274」、「B7同系物1」或「B7-H1」，係指在人類之情況下由CD274基因編碼之蛋白質。人類PD-L1為40 kDa 1型跨膜蛋白，其在不同情形下在抑制免疫系統中起主要作用。代表性人類PD-L1序列由UniProtKB Primary寄存編號Q9NZQ7提供，且將包括其其他人類同功異型物。PD-L1結合於其在經活化之T細胞、B細胞及骨髓細胞上發現之受體PD-1以調節活化或抑制。PD-L1亦對共刺激性分子CD80 (B7-1)具有顯著親和力。PD-L1與T細胞上其受體PD-1 (「計劃性細胞死亡蛋白質1」或「CD279」)之接合遞送一種信號，該信號抑制TCR介導之IL-2產生及T細胞增殖之活化。在此方面，PD-L1視為檢查點，且其在腫瘤中經上調之表現有助於抑制T細胞介導之抗腫瘤反應。儘管將通常參考來自各種哺乳動物物種之PD-L1來使用PD-L1，但應理解，遍及本申請案，任何對PD-L1之參考皆包括人類PD-L1且較佳係指人類PD-L1本身。

「PD-L1親和體試劑」係指具有至少一種以至少10^-6 M之解離常數(Kd)結合於PD-L1，特定言之人類PD-L1之親和體多肽之親和體試劑。

「經編碼之親和體」係指核酸構築體，其在由患者身體中之細胞經由基因遞送過程表現時活體內產生所欲親和體試劑。

「親和體連接之結合物」係指具有一或多個經由化學結合與其結合之部分之親和體試劑，該化學結合不包括經由含有親和體多肽序列之親和體試劑的多肽部分之C端或N端形成相鄰肽鍵。親和體連接之結合物可為「親和體-藥物結合物」，其係指包括一或多個與其結合之藥理學活性部分之親和體試劑。親和體連接之結合物亦可為「親和體-標籤結合物」，其係指包括一或多個與其結合之可偵測部分(亦即，可偵測標記)之親和體試劑。

b. 多肽 術語「多肽」及「肽」及「蛋白質」在本文中可互換地使用且係指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，且其可雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋已經天然修飾或藉由介入修飾之胺基酸聚合物；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分結合。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。

術語「胺基酸殘基」及「胺基酸」可互換地使用且在多肽之情形下意指涉及多肽之一或多個肽鍵之胺基酸。一般而言，本文中用於指定胺基酸之縮寫係基於IUPAC-IUB生物化學命名委員會之建議(參見Biochemistry (1972) 11:1726-1732)。舉例而言，Met、Ile、Leu、Ala及Gly分別表示甲硫胺酸、異白胺酸、白胺酸、丙胺酸及甘胺酸之「殘基」。殘基意謂藉由消除羧基之OH部分及α-胺基之H部分而來源於相應α-胺基酸之基團。術語「胺基酸側鏈」為胺基酸中除--CH(NH2)COOH以外之該部分，如由K. D. Kopple, 「Peptides and Amino Acids」, W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, 第2及33頁所定義。

通常，本發明之應用中使用之胺基酸為在蛋白質中發現之天然存在之胺基酸，或此類胺基酸之天然存在之合成代謝或分解產物，其含有胺基及羧基。尤其適合的胺基酸側鏈包括選自以下胺基酸之側鏈之側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、半胱胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、離胺酸、精胺酸、脯胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸，以及已鑑別為肽基聚糖細菌細胞壁之成分之胺基酸及胺基酸類似物。

具有「鹼性側鏈」之胺基酸殘基包括Arg、Lys及His。具有「酸性側鏈」之胺基酸殘基包括Glu及Asp。具有「中性極性側鏈」之胺基酸殘基包括Ser、Thr、Asn、Gln、Cys及Tyr。具有「中性非極性側鏈」之胺基酸殘基包括Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Pro、Trp及Phe。具有「非極性脂族側鏈」之胺基酸殘基包括Gly、Ala、Val、Ile及Leu。具有「疏水性側鏈」之胺基酸殘基包括Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr及Trp。具有「小型疏水性側鏈」之胺基酸殘基包括Ala及Val。具有「芳族側鏈」之胺基酸殘基包括Tyr、Trp及Phe。

術語胺基酸殘基進一步包括本文中提及之任何特異性胺基酸之類似物、衍生物及同類物，作為實例，標的親和體(尤其若由化學合成產生)可包括胺基酸類似物，諸如氰基丙胺酸、刀豆胺酸、黎豆胺酸、正白胺酸、3-磷酸絲胺酸、高絲胺酸、二羥基-苯丙胺酸、5-羥基色胺酸、1-甲基組胺酸、3-甲基組胺酸、二胺基庚二酸、鳥胺酸或二胺基丁酸。在本文中適合的其他具有側鏈之天然存在之胺基酸代謝物或前驅體將由熟習此項技術者識別且包括於本發明之範疇中。

當胺基酸之結構容許立體異構形式時，亦包括此類胺基酸之(D)及(L)立體異構體。本文中之胺基酸及胺基酸殘基之組態由適合的符號(D)、(L)或(DL)指定，此外當未指定組態時，胺基酸或殘基可具有組態(D)、(L)或(DL)。應注意，一些本發明之化合物之結構包括不對稱碳原子。因此應理解，由此類不對稱性產生之異構體包括於本發明之範疇內。此類異構體可藉由經典分離技術及空間控制合成以基本上純的形式獲得。在本申請案中，除非明確地相反指出，否則所命名之胺基酸應視為包括(D)或(L)立體異構體。

術語「一致」或「一致性」百分比在兩種或更多種核酸或多肽之情形中係指兩個或更多個序列或子序列當根據最大對應性比較及比對(視需要引入空隙)時為相同的或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，不考慮任何保守性胺基酸取代作為序列一致性的一部分。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查來量測。此項技術中熟知可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對的各種演算法及軟體。此等演算法及軟體包括(但不限於)BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其變化形式。在一些實施例中，兩種本發明之核酸或多肽顯著一致，意謂當根據最大對應性比較及比對時，其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一些實施例中至少95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或胺基酸殘基一致性，如使用序列比較演算法或藉由目視檢查所量測。在一些實施例中，在長度為至少約10個殘基、至少約20個殘基、至少約40-60個殘基、至少約60-80個殘基或其間任何整數值的胺基酸序列區域存在一致性。在一些實施例中，在超過60-80個殘基之更長的區域(諸如至少約80-100個殘基)中存在一致性，且在一些實施例中，序列在所比較之序列(諸如目標蛋白質或抗體之編碼區)之全部長度內實質上一致。在一些實施例中，在長度為至少約10個鹼基、至少約20個鹼基、至少約40-60個鹼基、至少約60-80個鹼基或其間任何整數值的核苷酸序列區域內存在一致性。在一些實施例中，在超過60-80個鹼基(諸如至少約80-1000個鹼基或更多)之更長的區域內存在一致性，且在一些實施例中，序列在所比較之序列(諸如編碼相關蛋白質之核苷酸序列)之全部長度內實質上一致。

「保守性胺基酸取代」為一個胺基酸殘基經具有類似側鏈之另一個胺基酸殘基置換之取代。此項技術中通常已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例而言，用苯丙胺酸取代酪胺酸為保守性取代。通常，本發明之多肽、可溶性蛋白質及/或抗體之序列中之保守性取代不消除含有胺基酸序列之多肽、可溶性蛋白質或抗體與目標結合位點之結合。鑑別不消除結合之胺基酸保守性取代之方法此項技術中熟知的。

「經分離之」多肽、可溶性蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為呈未在自然界中發現之形式之多肽、可溶性蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物。經分離之多肽、可溶性蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物包括已純化至其不再呈其在自然界中所發現之形式的程度之多肽、可溶性蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物。在一些實施例中，經分離之多肽、可溶性蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為實質上純的。

如本文中所使用，術語「實質上純」係指至少50%純(亦即，不含污染物)、至少90%純、至少95%純、至少98%純或至少99%純的材料。

如本文中所使用，術語「融合蛋白質」或「融合多肽」係指由包含至少兩種基因之核苷酸序列之核酸分子表現之雜交蛋白質。

如本文中所使用，術語「連接子」或「連接子區域」係指在第一多肽(例如親和體之複本)與第二多肽(例如另一親和體、Fc域、配位體結合域等)之間插入之連接子。在一些實施例中，連接子為肽連接子。連接子不應不利地影響多肽之表現、分泌或生物活性。較佳地，連接子不為抗原性且不引起免疫反應。

「親和體-抗體融合物」係指包括親和體多肽部分及抗體之可變區之融合蛋白質。親和體-抗體融合物包括全長抗體，其具有例如附接至其VH及/或VL鏈中之一或多者之C端或N端之一或多個親和體多肽序列，亦即，所組裝之抗體之至少一個鏈為具有親和體多肽之融合蛋白質。親和體-抗體融合物亦包括其中一或多個親和體多肽序列係以具有抗體片段之抗原結合位點或可變區的融合蛋白質之一部分的形式提供之實施例。

如本文中所使用，術語「抗體」係指識別且經由至少一個抗原結合位點特異性結合目標(諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂質或前述中之任一者之組合)之免疫球蛋白分子，其中抗原結合位點通常位於免疫球蛋白分子之可變區內。如本文中所使用，該術語涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈Fv (scFv)抗體(限制條件為此等片段已經格式化以包括Fc或其他FcγRIII結合域)、多特異性抗體、雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原結合位點之融合蛋白質(經格式化以包括Fc或其他FcγRIII結合域)及任何其他經修飾之包含抗原結合位點之免疫球蛋白分子，只要抗體呈現所需生物活性即可。

同時基於抗體之稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈恆定域的身分，抗體可為免疫球蛋白之五種主要類別中之任一種：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其子類(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。

術語抗體之「可變區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。通常，重鏈及輕鏈之可變區各自由四個構架區(FR)及三個互補決定區(CDR，亦稱為「高變區」)組成。各鏈中之CDR由構架區緊密固持在一起且與來自其他鏈之CDR共同促進形成抗體之抗原結合位點。存在至少兩種用於測定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列變化性之方法(亦即Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, National Institutes of Health, Bethesda Md.)；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al Lazikani等人, 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948)。此外，此項技術中有時使用此等兩種方法之組合測定CDR。

如本文中所使用，術語「人類化抗體」係指非人類(例如鼠類)抗體之形式，其為含有最小非人類序列之特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人類化抗體為其中CDR之殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)之CDR的具有所需特異性、親和力及/或結合能力之殘基置換之人類免疫球蛋白。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv構架區殘基由來自非人類物種之抗體中之相應殘基置換。人類化抗體可藉由Fv構架區及/或所置換之非人類殘基內之其他殘基之取代而進一步修飾，以優化及最佳化抗體特異性、親和力及/或結合能力。人類化抗體可包含可變域，其含有全部或基本上全部對應於非人類免疫球蛋白之CDR，而全部或基本上全部構架區為人類免疫球蛋白序列之構架區。在一些實施例中，可變域包含人類免疫球蛋白序列之構架區。在一些實施例中，可變域包含人類免疫球蛋白共同序列之構架區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或域(Fc)(通常人類免疫球蛋白恆定區或域)之至少一部分。通常認為人類化抗體與嵌合抗體不同。

術語「抗原決定基」及「抗原決定子」在本文中可互換地使用且係指抗原中能夠由特定抗體、特定親和體或其他特定結合域識別及特異性結合之部分。當抗原為多肽時，抗原決定基可由藉由蛋白質之三級摺疊而並列之連續胺基酸及非相鄰胺基酸形成。由連續胺基酸(亦稱為線形抗原決定基)形成之抗原決定基通常在蛋白質變性時保留，而由三級摺疊(亦稱為構形抗原決定基)形成之抗原決定基通常在蛋白質變性時損失。抗原決定基在獨特空間構形中通常包含至少3個，且更通常至少5、6、7或8-10個胺基酸。

如本文中所使用，術語「特異性結合於」或「對……具有特異性」係指可量測及可再現的相互作用，諸如目標與親和體、抗體或其他結合搭配物之間的結合，其決定在分子(包括生物分子)之非均勻群體存在下，目標是否存在。舉例而言，特異性結合於目標之親和體為與其與其他目標之結合相比，以更大親和力、親合力(若經多聚格式化)、更易於及/或以更長持續時間結合此目標之親和體。

如本文中所使用，「結合物」、「結合」或其語法變化形式係指兩種或更多種化合物藉由此項技術中已知之任何接合或連接方法接合或連接在一起，引起形成另一種化合物。其亦可指藉由將兩種或更多種化合物接合或連接在一起產生之化合物。舉例而言，直接或間接連接至一或多個化學部分或多肽之抗PD-L1親和體為例示性結合物。此類結合物包括融合蛋白質，藉由化學結合物產生之結合物及藉由任何其他方法產生之結合物。

c. 核酸 術語「聚核苷酸」及「核酸」及「核酸分子」在本文中可互換地使用且係指具有任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/或其類似物或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之受質。

如本文中所使用，術語「核酸分子編碼」、「DNA序列編碼」及「DNA編碼」係指沿一股脫氧核糖核酸脫氧核糖核苷酸之核苷酸之次序或序列。此等脫氧核糖核苷酸之次序決定胺基酸沿多肽(蛋白質)鏈之次序。因此，核酸序列編碼胺基酸序列。

當關於核苷酸序列使用時，如本文中所使用之「序列」，該術語語法及其他形式可包含DNA或RNA，且可為單股或雙股。核酸序列可經突變。核酸序列可具有任何長度，例如2至10,000或更多個核苷酸(或超過其或在其之間的任何整數值)，例如長度為約100至約10,000之核酸，或約200個核苷酸至約500個核苷酸。

如本文中所使用，術語「載體」意指構築體，其能夠遞送且通常表現宿主細胞中之一或多種相關基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體及囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體。

如本文中所使用，術語「轉染」係指外源核酸進入真核生物細胞中。轉染可藉由此項技術中已知的各種手段實現，包括磷酸鈣-DNA共沈澱、DEAE-右旋糖苷介導之轉染、聚凝胺介導之轉染、電致孔、顯微注射、脂質體融合、脂質體轉染、原生質體融合、反轉錄病毒感染及基因槍技術(基因槍)。

如本文中所使用，術語「載體」為經分離之核酸，包含可用於將組合物遞送至細胞內部之經分離之核酸。此項技術中已知多種載體，包括(但不限於)線形聚核苷酸、與離子性或兩性化合物相關之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應視為包括促進核酸轉移至非質體及非病毒化合物(例如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物)之細胞中。病毒載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體及其類似物。

如本文中所使用，術語「表現載體」係指包含有包含表現控制序列之重組型聚核苷酸及可操作地連接之待表現之核苷酸序列之載體。表現載體包含用於表現之充足順式作用元件(順式作用元件)；其他用於表現之元件可由宿主細胞或活體外表現系統供應。表現載體包括此項技術中已知的所有載體，諸如黏質體、質體(例如裸質體或脂質體中所含的質體)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

如本文中所使用，術語「可操作地連接」係指調節序列與異源核酸序列之間的功能鍵連接至連接處，引起異源核酸序列之表現。舉例而言，當第一核酸序列及第二核酸序列為第一核酸序列與可操作地連接之第二核酸序列之間的函數關係時。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。通常，可操作地連接之DNA序列為相鄰的，且視需要接合同一個閱讀框架中之兩個蛋白質編碼區。

如本文中所使用，術語「啟動子」定義為啟動子DNA序列，其由合成機器識別為聚核苷酸序列之細胞特異性轉錄之合成機器所需的或為所引入的。

如本文中所使用，術語「組成性表現」係指在生理條件下皆經表現。

如本文中所使用，術語「誘導性表現」係指在某些條件下之表現，諸如細胞內信號傳導路徑之活化(或失活)或具有表現構築體之細胞與調節基因之表現(或表現程度)之小分子之接觸，該基因可操作地連接至對小分子之濃度敏感的可誘導啟動子。

術語「電致孔」係指使用跨膜電場脈衝誘導生物膜中之微觀路徑(孔)；其使得生物分子(諸如質體或其他寡核苷酸)能夠自細胞膜之一側傳遞至另一側。

d. 檢查點抑制劑、共刺激促效劑及化學治療劑 「檢查點分子」係指由組織及/或免疫細胞表現且以取決於檢查點分子之表現量的方式降低免疫反應之功效之蛋白質。當此等蛋白質經阻斷時，免疫系統上之「制動器」解除且例如，T細胞能夠更有效地殺傷癌細胞。在T細胞或癌細胞上發現之檢查點蛋白質之實例包括PD-1/PD-L1及CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA及TIGIT。

「檢查點抑制劑」係指逆轉自檢查點分子信號傳導之免疫抑制性之藥物實體。

「共刺激性分子」係指免疫細胞，諸如T細胞同源結合搭配物，其特異性結合於共刺激性配位體，籍此調節共刺激，諸如(但不限於)增殖。共刺激性分子為除抗原受體或配位體以外之細胞表面分子，其促進有效的免疫反應。共刺激性分子包括(但不限於)MHCI分子、BTLA受體及Toll配位體，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)。共刺激性分子之實例包括(但不限於)：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及CD83配位體。

「共刺激性促效劑」係指活化(促效)共刺激性分子之藥物實體，諸如共刺激性配位體將如此，且產生免疫刺激性信號或以其他方式提高免疫反應之效能或功效。

「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲基三聚氰胺；多聚乙醯(acetogenins)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone)；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)、MARINOL)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicines)；樺木酸；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11 (伊立替康(irinotecan)、CAMPTOSAR)、乙醯基喜樹鹼、東莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；培美曲塞(pemetrexed)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycins)(尤其克瑞托欣(cryptophycin)1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盤克斯塔叮(pancratistatin)；TLK-286；CDP323，一種口服α-4整合素抑制劑；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、氧化雙氯乙基甲胺鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素(calicheamicin)γ1I及卡奇黴素ωI1 (參見例如Nicolaou等人, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994))；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C (cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、(N-嗎啉基)-小紅莓、氰基-(N-嗎啉基)-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓、小紅莓HCl脂質體注射劑(DOXIL)及去氧小紅莓(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)(諸如絲裂黴素C)，黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、喃氟啶(tegafur)(UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA)、埃坡黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)及伊馬替尼(imatinib)(2-苯基胺基嘧啶衍生物)以及其他c-Kit抑制劑；抗腎上腺劑，諸如胺麩精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecenes)(尤其T-2毒素、弗納庫林A (verracurin A)、桿孢菌素A (roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替派(thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL)、太平洋紫杉醇之經白蛋白工程改造之奈米粒子調配物(ABRAXANE)及多西他賽(doxetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)(VELBAN)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；亮克沃林(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE)；米托蒽醌(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓樸異構酶(topoisomerase)抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上中之兩者或更多者之組合，諸如CHOP，即環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼龍之組合療法之縮寫，及FOLFOX，即用奧沙利鉑(ELOXATIN)與5-FU及亮克沃林之組合進行之治療方案之縮寫。

此定義中亦包括用於調節、減少、阻斷或抑制可能會促進癌症之生長的激素之影響之抗激素劑，且其通常呈全身性或整個身體治療形式。其本身可為激素。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷諾昔酚(raloxifene)(EVISTA)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；抗孕酮；雌激素受體調降劑(ERD)；雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX)；用於抑制或封閉卵巢之藥劑，例如黃體生成荷爾蒙釋放荷爾蒙(LHRH)促效劑，諸如乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)(LUPRON及ELIGARD)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲特瑞林(tripterelin)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制酶芳香酶之芳香酶抑制劑，其調節腎上腺中之雌激素產生，諸如4(5)-咪唑胺麩精、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(阿諾新)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)(RIVISOR)、來曲唑(letrozole)(FEMARA)及阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。此外，化學治療劑之此類定義包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate)(ZOMETA)、阿侖膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制涉及引發性細胞增殖之信號傳導路徑中的基因表現之反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；拓樸異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN)；抗雌激素，諸如氟維司群(fulvestrant)；Kit抑制劑，諸如伊馬替尼(imatinib)或EXEL-0862 (酪胺酸激酶抑制劑)；EGFR抑制劑，諸如埃羅替尼(erlotinib)或西妥昔單抗(cetuximab)；抗VEGF抑制劑，諸如貝伐珠單抗(bevacizumab)；阿利替康(arinotecan)；rmRH (例如ABARELIX)；拉帕替尼(lapatinib)及二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；17AAG (格爾德黴素(geldanamycin)衍生物，其為熱休克蛋白質(Hsp)90毒素)及以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。

如本文中所使用，術語「細胞介素」通常係指由一個細胞群體釋放之蛋白質，其作用於作為細胞間介體之另一細胞或對產生蛋白質之細胞具有自分泌作用。此類細胞介素之實例包括淋巴介質、單核球激素；白細胞間介素(「IL」)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A-F、IL-18至IL-29 (諸如IL-23)、IL-31，包括PROLEUKIN^® rIL-2；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β，TGF-β1-3；及其他多肽因子，包括白血病抑制因子(「LIF」)，睫狀神經營養因子(「CNTF」)、類CNTF細胞介素(「CLC」)、心營養素(「CT」)及套組配位體(「KL」)。

如本文所使用，術語「趨化因子」係指具有選擇性誘導白細胞之趨化及活化之能力的可溶因子(例如細胞介素)。其亦引起血管生成、發炎、傷口癒合及腫瘤形成過程。實例趨化因子包括IL-8，一種鼠角質細胞化學引誘劑(KC)之人類同源物。

e. 治療 如本文中所使用，術語「功能異常」亦包括對抗原識別具有頑抗性或不起反應，特定言之，將抗原識別轉譯成下流T細胞效應子功能(諸如增殖、細胞激素產生(例如IL-2)及/或目標細胞殺傷)之能力減弱。

術語「能力缺失」係指由經由T細胞受體之信號傳遞不完全或不充分而引起之對抗原刺激不起反應之狀態(例如在不存在ras活化之情況下細胞內Ca⁺² 升高)。在不存在共刺激之情況下，T細胞能力缺失亦可由抗原刺激引起，引起細胞變成即使在共刺激情形下仍對後續抗原活化具有抗性。無反應狀態常常可由存在介白素-2解決。能力缺失T細胞不進行純系擴增及/或獲得效應子功能。

術語「耗竭」係指T細胞耗竭，如在多種慢性感染及癌症期間發生之由持續TCR信號傳導引起之T細胞功能異常之狀態。其與能力缺失之區別在於其並非由信號傳導不完全或不足引起，而係由持續信號傳導引起。其由不良效應子功能、抑制性受體之持續表現及與功能性效應子或記憶體T細胞不同之轉錄狀態定義。耗竭可阻止感染及腫瘤之最佳控制。

「增強T細胞功能」意謂誘導、引起或刺激T細胞使其具有持續或擴增之生物功能，或更新或再活化耗竭或惰性T細胞。增強T細胞功能之實例包括：增加CD8+ T細胞之γ干擾素之分泌、增加增殖、增加抗原反應(例如病毒、病原體或腫瘤清除率)(與介入之前的此類水準相比)。在一些實施例中，增強水準為至少50%，或者60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%。量測此增強作用之方式為一般熟習此項技術者已知的。

「T細胞功能異常病症」為由對抗原刺激之反應降低表徵之T細胞病症或病狀。在特定實施例中，T細胞功能異常病症為與不當增加之PD-1含量特定相關之病症。T細胞功能異常病症亦可與腫瘤中不當增加之PD-L1含量相關，該不當增加之含量引起抑制T細胞抗腫瘤功能。在另一實施例中，T細胞功能異常病症為其中T細胞能力缺失或分泌細胞介素、增殖或進行細胞溶解活性之能力降低之病症。在特定態樣中，反應降低可引起對表現免疫原之病原體或腫瘤之控制無效。由T細胞功能異常表徵之T細胞功能異常病症之實例包括起因不明的急性感染、慢性感染及腫瘤免疫性。

「腫瘤免疫性」係指其中腫瘤躲避免疫識別及清除之過程。因此，作為治療概念，腫瘤免疫性在該躲避作用減弱且腫瘤由免疫系統識別及攻擊時被「治療」。腫瘤識別之實例包括腫瘤結合、腫瘤縮小及腫瘤清除。

「持續反應」係指在停止處理之後，對降低腫瘤生長之持續作用。舉例而言，與投藥階段開始時之尺寸相比，腫瘤尺寸可保持相同或較小。在一些實施例中，持續反應之持續時間長度至少與處理持續時間相同、為處理持續時間之1.5倍、2.0倍、2.5倍或3.0倍。

如本文中所使用，術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中之生理學病狀，其中細胞群體由不受調節之細胞生長表徵。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、母細胞瘤、肉瘤及血液癌，諸如淋巴瘤及白血病。

如本文中所使用，術語「腫瘤」及「贅瘤」係指任何由過度細胞生長或增殖產生之組織塊狀物，其為良性(非癌性)或惡性(癌性)，包括癌前病灶。腫瘤生長通常為不受控制及進行性的，不誘導或抑制正常細胞之增殖。腫瘤可影響多種細胞、組織或器官，包括(但不限於)選自膀胱、骨骼、腦部、乳房、軟骨、膠細胞、食道、輸卵管、膽囊、心臟、腸、腎臟、肝、肺、淋巴結、神經組織、卵巢、胰腺、前列腺、骨胳肌、皮膚、脊髓、脾、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、氣管、尿道、尿管、尿道、子宮、陰道器官或組織或相應細胞。腫瘤包括癌症，諸如肉瘤、癌瘤、漿細胞瘤或(惡性漿細胞)。本發明之腫瘤可包括(但不限於)白血病(例如急性白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、急性前髓細胞性白血病、急性骨髓單核球性白血病、急性單核球性白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅血球增多症)、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏病)、原發性巨球蛋白血症、重鏈疾病及實體腫瘤，諸如肉瘤癌症(例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管內皮細胞肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、癌瘤、支氣管癌、髓性癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、尼羅河導管癌(Nile duct carcinoma)、絨膜癌、精原細胞腫瘤、胚癌、威耳姆氏腫瘤(Wilms'tumor)、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌瘤、小細胞肺癌瘤、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤)、食道癌、膽囊、腎癌、多發性骨髓瘤。較佳地，「腫瘤」包括(但不限於)：胰臟癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、結腸癌、乳癌、淋巴瘤、膽囊癌、腎癌、白血病、多發性骨髓瘤、卵巢癌、子宮頸癌及神經膠質瘤。

如本文中所使用，術語「轉移」係指癌症自原發部位擴散或轉移至身體之其他區域，同時在新位置處產生類似癌性病灶之過程。「轉移性」或「轉移」細胞為喪失與相鄰細胞之黏著性接觸且經由血流或淋巴自原發性疾病位點遷移以侵襲相鄰身體結構之細胞。

術語「癌細胞」及「腫瘤細胞」係指來源於癌症或腫瘤或癌前病灶之全部細胞群體，包括非致瘤性細胞，其包含癌細胞群體之主體，及致瘤性幹細胞(癌症幹細胞)。如本文中所使用，當單獨地指缺乏更新及分化能力以區分腫瘤細胞與癌症幹細胞時，術語「癌細胞」或「腫瘤細胞」將由術語「非致瘤性」修飾。

如本文中所使用，術語「有效量」係指提供治療或預防效益之量。

如本文中所使用，「完全反應」或「CR」係指所有目標病灶消失；「部分反應」或「PR」係指目標病灶之最長直徑之總和(SLD)降低至少30%，以基線SLD作為參考；及「穩定疾病」或「SD」係指目標病灶既未充分收縮至PR合格，亦未充分增加至PD合格，以處理開始時之最小SLD作為參考。

如本文中所使用，「無進程存活率」(PF)係指在治療期間及治療之後，所治療之疾病(例如癌症)不會惡化之持續時間長度。無進程存活期可包括患者經歷完全反應或部分反應之時間量，以及患者經歷穩定疾病之時間量。

如本文中所使用，「全部反應率」(ORR)係指完全反應(CR)率與部分反應(PR)率之總和。

如本文中所使用，「全部存活期」係指可能在特定持續時間之後存活之組中個體之百分比。

如本文中所使用，術語「治療」係指用於改變由細胞介入(可能為臨床病理學之預防性介入過程)引起之臨床疾病之過程或治療之個別嘗試。包括(但不限於)用於預防疾病發生或復發、緩解症狀、減小任何疾病之直接或間接病理學後果、預防轉移、減緩疾病進程之速率、改善或緩解疾病緩解或改良之預後之治療。

術語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒動物及其類似物，其為特定治療受體。通常，關於人類個體之術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。

如本文中所使用，術語「促效劑」及「促效」係指能夠直接地或間接地顯著誘導、活化、促進、增加或增強目標或目標路徑之生物活性之藥劑。本文中使用之術語「促效劑」包括任何部分或完全誘導、活化、促進、增加或增強蛋白質或其他相關目標之活性之藥劑。

如本文中所使用，術語「拮抗劑」及「拮抗性」係指或描述能夠直接地或間接地部分或完全阻斷、抑制、降低或中和目標及/或路徑之生物活性之藥劑。本文中使用之術語「拮抗劑」包括任何部分或完全阻斷、抑制、降低或中和蛋白質或其他相關目標之活性之藥劑。

如本文中所使用，術語「調節」係指生物活性之改變或變化。調節包括(但不限於)刺激活性或抑制活性。調節可為活性增加或活性降低、結合特徵之變化或與蛋白質、路徑、系統或其他生物學相關目標之活性相關的生物學、功能性或免疫特性之任何其他變化。

如本文中所使用，術語「免疫反應」包括來自先天性免疫系統及後天性免疫系統之反應。其包括細胞介導及/或體液免疫反應。其包括T細胞及B細胞反應，以及來自免疫系統之其他細胞(諸如自然殺手(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞等)之反應。

術語「醫藥學上可接受」係指由或可由聯邦政府之管理機構或州政府批准或列舉於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常認可用於動物(包括人類)之藥典中之物質。

術語「醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或佐劑」或「可接受之醫藥學載劑」係指可與本發明之至少一種藥劑一起投與個體且當以足以遞送治療作用之劑量投與時不破壞該藥劑之藥理學活性且無毒性的賦形劑、載劑或佐劑。一般而言，熟習此項技術者及U.S. FDA認為醫藥學上可接受之賦形劑、載體或佐劑為任何調配物之非活性成分。

術語「有效量」或「治療有效量」或「治療作用」係指可有效「治療」個體(諸如哺乳動物)中之疾病或病症的本文中所描述之親和體試劑之量。在癌症或腫瘤之情況下，結合PD-L1之親和體試劑之治療有效量具有治療作用且因此可增強免疫反應、增強抗腫瘤反應、提高免疫細胞之細胞溶解活性、增加免疫細胞之腫瘤細胞殺傷、降低腫瘤細胞之數目；降低致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力；降低癌症幹細胞之數目或出現頻率；降低腫瘤尺寸；減小癌細胞群體；抑制或停止癌細胞浸潤至周邊器官中，包括例如癌症分散至軟組織及骨骼中；抑制及停止腫瘤或癌細胞轉移；抑制及停止腫瘤或癌細胞生長；在一定程度上緩解一或多種與癌症相關之症狀；降低致病率及死亡率；改良生活品質；或此類作用之組合。

術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」或「治療(to treat)」或「緩解(alleviating)」或「緩解(to alleviate)」係指以下兩者：(1)使經診斷之病理性病狀或病症之治癒、減緩、症狀減輕及/或進程停止的治療性措施，及(2)預防及/或減緩目標病理性病狀或病症之發展的預防性或防治性措施。因此，需要治療的彼等者包括已經患有病症之彼等者；易於患有病症之彼等者；及其中待預防病症之彼等者。在癌症或腫瘤之情況下，若患者展示以下中之一或多者，則根據本發明之方法成功地「治療」個體：免疫反應增加、抗腫瘤反應增加、免疫細胞之細胞溶解活性增加、免疫細胞之腫瘤細胞殺傷增加、癌細胞數目減少或完全不存在；腫瘤尺寸減小；抑制或不存在癌細胞浸潤至周邊器官中，包括癌細胞分散至軟組織及骨骼中；抑制或不存在腫瘤或癌細胞轉移；抑制或不存在癌症生長；緩解一或多種與具體癌症相關之症狀；降低致病率及死亡率；改良生活品質；降低致瘤性；降低癌症幹細胞之數目或出現頻率；或該等作用之某一組合。

f. 雜項 應理解，當本文中用語言「包含」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」描述之其他類似實施例。亦應理解，當本文中用語言「基本上由……組成」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」描述之其他類似態樣。

如本文中所使用，對「約」或「大約」之參考，值或參數包括(及描述)與該值或參數相關之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。

如在諸如「A及/或B」之片語中所使用的術語「及/或」在本文中意欲包括A及B；A或B；A (單獨)；及B(單獨)。類似地，在諸如「A、B及/或C」之片語中使用的術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。

III. 結合 PD-L1 之 親和體 親和體為基於Stefin A之骨架，意謂其具有來源於Stefin A，例如哺乳動物Stefin A，例如人類Stefin A之序列。本申請案之一些態樣提供結合PD-L1之親和體(亦稱為「抗PD-L1親和體」)，包含其中來自野生型Stefin A蛋白質之一或多個溶劑可達環具有用於提供具有結合PD-L1 (較佳選擇性且較佳以10^-6 M或更低之Kd)的能力之親和體的胺基酸序列之親和體。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體來源於具有主鏈序列之野生型人類Stefin A且其中環2[稱為(Xaa)_n ]及環4[稱為(Xaa)_m ]中之一者或兩者由替代性環序列(Xaa)_n 及(Xaa)_m 置換，以具有通式(i) FR1-(Xaa)_n -FR2-(Xaa)_m -FR3(I) 其中 FR1為由MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(SEQ ID NO:1) 表示之多肽序列或與其具有至少70%同源性之多肽序列； FR2為由GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(SEQ ID NO:2) 表示之多肽序列或與其具有至少70%同源性之多肽序列； FR3為由EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(SEQ ID NO:3) 表示之多肽序列或與其具有至少70%同源性之多肽序列；及 Xaa在每次出現時獨立地為胺基酸殘基，n及m各自獨立地為3至20之整數。

在一些實施例中，FR1為與SEQ ID NO:1具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之多肽序列。在一些實施例中，FR1為與SEQ ID NO:1具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之多肽序列。在一些實施例中，FR2為與SEQ ID NO:2具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之多肽序列。在一些實施例中，FR2為與SEQ ID NO:2具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之多肽序列。在一些實施例中，FR3為與SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之多肽序列。在一些實施例中，FR3為與SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之多肽序列。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體具有以下通式中表示之胺基酸序列： 其中 Xaa在每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n及m各自獨立地為3至20之整數；Xaa1為Gly、Ala、Val、Arg、Lys、ASP或Glu，更佳為Gly、Ala、Arg或Lys且甚至更佳為Gly或Arg；Xaa2為Gly、Ala、Val、Ser或Thr，更佳為Gly或Ser；Xaa3為Arg、Lys、Asn、Gln、Ser、Thr，更佳為Arg、Lys、Asn或Gln且甚至更佳為Lys或Asn；Xaa4為Gly、Ala、Val、Ser或Thr，更佳為Gly或Ser；Xaa5為Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro，更佳為Ile、Leu或Pro且甚至更佳為Leu或Pro；Xaa6為Gly、Ala、Val、Asp或Glu，更佳為Ala、Val、Asp或Glu且甚至更佳為Ala或Glu；及Xaa7為Ala、Val、Ile、Leu、Arg或Lys，更佳為Ile、Leu或Arg且甚至更佳為Leu或Arg。

舉例而言，抗PD-L1親和體可具有以下通式中表示之胺基酸序列： MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)_n -STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)_m -ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQ ID NO:5) ，其中Xaa在每次出現時獨立地為胺基酸殘基；n及m各自獨立地為3至20之整數。

在一些實施例中，n為3至15、3至12、3至9、3至7、5至7、5至9、5至12、5至15、7至12或7至9。

在一些實施例中，m為3至15、3至12、3至9、3至7、5至7、5至9、5至12、5至15、7至12或7至9。

在一些實施例中，Xaa在每次出現時獨立地為胺基酸，其可藉由原核或真核細胞中之重組表現添加至多肽中，且甚至更佳為20種天然存在之胺基酸中之一者。

在以上序列及式之一些實施例中，(Xaa)_n 為通式(II)中表示之胺基酸序列 -aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6-(II) 其中 aa1表示具有鹼性側鏈之胺基酸殘基，更佳為Lys、Arg或His且甚至更佳為Lys或Arg； aa2表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，更佳小型脂族側鏈、中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基，甚至更佳為Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，且甚至更佳為Ala、Gln、Asp或Glu； aa3表示具有芳族或鹼性側鏈之胺基酸殘基，較佳為Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更佳為Phe、Tyr、Trp且甚至更佳為His或Tyr、Trp或His； aa4表示具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基；更佳為Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，且甚至更佳為Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu； aa5表示具有中性極性或帶電(酸性或鹼性)或小型脂族或芳族側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電側鏈之胺基酸殘基；更佳為Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，且甚至更佳為Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg；及 aa6表示具有芳族或酸側鏈之胺基酸殘基，較佳為Phe、Tyr、Trp、Asp或Glu；更佳為Trp或Asp；且甚至更佳為Trp。

在以上序列及式之一些實施例中，(Xaa)_n 為通式(III)中表示之胺基酸序列 -aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp-(III) 其中 aa1表示具有鹼性側鏈或芳族側鏈之胺基酸殘基，較佳為Lys、Arg、His、Ser、Thr、Asn或Gln，更佳為Lys、Arg、His、Asn或Gln且甚至更佳為Lys或Asn； aa2表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，更佳小型脂族側鏈、中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基，甚至更佳為Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，且甚至更佳為Ala、Gln、Asp或Glu； aa3表示具有芳族或鹼性側鏈之胺基酸殘基，較佳為Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更佳為Phe、Tyr、Trp或His，且甚至更佳為Tyr、Trp或His； aa4表示具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基；更佳為Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，且甚至更佳為Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu；及 aa5表示具有中性極性或帶電(酸性或鹼性)或小型脂族或芳族側鏈，較佳中性極性側鏈或帶電側鏈之胺基酸殘基；更佳為Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，且甚至更佳為Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。

在以上序列及式之一些實施例中，(Xaa)_n 為選自SEQ ID NO:6至40之胺基酸序列，或與選自SEQ ID NO:6至41之序列具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，(Xaa)_n 為與選自SEQ ID NO:6至41之序列具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之胺基酸序列。

在以上序列及式之一些實施例中，(Xaa)_m 為通式(IV)中表示之胺基酸序列 -aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-(IV) 其中 aa7表示具有中性極性或非極性側鏈或酸性側鏈之胺基酸殘基；較佳為Gly、Ala、Val、Pro、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu且甚至更佳為Gly、Ala、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu； aa8表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或芳族側鏈，更佳帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基，更佳為Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gln、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Pro、Gly、Tyr或Phe，且甚至更佳為Asp、Glu、Lys、Arg、His或Gln； aa9表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或芳族側鏈，更佳中性極性側鏈或酸側鏈之胺基酸殘基，更佳為Gln、Ser、Thr、Asn、Asp、Glu、Arg、Lys、Gly、Leu、Pro或Tyr，且甚至更佳為Gln、Thr或Asp； aa10表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或芳族側鏈，更佳中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基，更佳為Asp、Glu、Arg、His、Lys、Ser、Gln、Asn、Ala、Leu、Tyr、Trp、Pro或Gly，且甚至更佳為Asp、Glu、His、Gln、Asn、Leu、Trp或Gly； aa11表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或非極性脂族側鏈或芳族側鏈，更佳中性極性側鏈或鹼性或酸側鏈之胺基酸殘基，更佳為Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Arg、Lys、His、Val、Ile、Tyr或Gly，且甚至更佳為Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Lys或His； aa12表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或非極性脂族側鏈或芳族側鏈，更佳酸側鏈之胺基酸殘基，更佳為Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Asn、Lys、Arg、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe或Gly，且甚至更佳為Asp、Glu、Ser、Tyr、Trp、Arg或Lys； aa13表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈或非極性脂族側鏈或芳族側鏈，更佳酸側鏈之胺基酸殘基，更佳為Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Pro、Asp、Glu、His、Arg、Trp、Tyr或Phe，且甚至更佳為Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Asp或Glu； aa14表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基，更佳為Ala、Ile、Trp、Pro、Asp、Glu Arg、Lys、His、Ser、Thr、Gln或Asn，且甚至更佳為Ala、Pro、Asp、Glu、Arg、Lys、Ser、Gln或Asn；及 aa15表示胺基酸殘基，較佳為具有中性極性或中性非極性側鏈或帶電(酸性或鹼性)側鏈之胺基酸殘基，更佳為His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln、Asn、Ala、Val、Leu、Gly或Phe，且甚至更佳為His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln或Asn。

在以上序列及式之一些實施例中，(Xaa)_m 為選自SEQ ID NO:42至77之胺基酸序列，或與選自SEQ ID NO:42至77之序列具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，(Xaa)_m 為與選自SEQ ID NO:42至77之序列具有至少80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體具有選自SEQ ID NO:78至86之胺基酸序列，或與選自SEQ ID NO:78至86之序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%同源性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-L1親和體具有與選自SEQ ID NO:78至86之序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體具有由具有對應於SEQ ID NO:87至94中之一者之核苷酸1-336的編碼序列之核酸編碼之胺基酸序列，或可由具有與SEQ ID NO:87至94中之一者之核苷酸1-336至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至98%一致的編碼序列之核酸編碼之胺基酸序列，或可由具有使SEQ ID NO:87至94中之一者之核苷酸1-336在嚴格條件(諸如在45℃下，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)存在下，接著在65℃下，在0.2X SSC中洗滌)下雜交的編碼序列之核酸編碼之胺基酸序列。

此外，較小修飾亦可包括除上文所描述之環2及環4插入物以外，對本文中所揭示之Stefin A或Stefin A衍生之序列進行小型刪除或添加，諸如與Stefin A或Stefin A衍生之親和體多肽相比添加或刪除至多10個胺基酸。

在一些實施例中，親和體試劑為結合PD-L1之親和體試劑，其具有以約1 μM或更低，約100 nM或更低，約40 nM或更低，約20 nM或更低，約10 nM或更低，約1 nM或更低，或約0.1 nM或更低之解離常數(K_D )，以單體形式結合人類PD-L1之親和體多肽部分。

在一些實施例中，親和體試劑為結合PD-L1之親和體試劑，其具有以約10^-3 s^-1 (亦即，以1/秒為單位)或更慢、約10^-4 s^-1 或更慢或甚至約10^-5 s^-1 或更慢之解離速率常數(K_off )(諸如藉由Biacore量測)，以單體形式結合人類PD-L1之親和體多肽部分。

在一些實施例中，親和體試劑為結合PD-L1之親和體試劑，其具有以至少約10³ M^-1 s^-1 或更快、至少約10⁴ M^-1 s^-1 或更快、至少約10⁵ M^-1 s^-1 或更快或甚至至少約10⁶ M^-1 s^-1 或更快之締合常數(K_on )(諸如藉由Biacore量測)，以單體形式結合人類PD-L1之親和體多肽部分。

在一些實施例中，親和體試劑為結合PD-L1之親和體試劑，其具有在用人類PD-1進行之競爭性結合分析法中，以1 μM或更低、約100 nM或更低、約40 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低或約0.1 nM或更低之IC50，以單體形式結合人類PD-L1之親和體多肽部分。

在一些實施例中，親和體試劑具有65℃或更高且較佳至少70℃、75℃、80℃或甚至85℃或更高之熔融溫度(Tm，亦即，同時存在摺疊及未摺疊狀態之溫度)。熔融溫度為尤其適用的蛋白質穩定性之指標。摺疊與未摺疊蛋白質之相對比例可藉由熟習此項技術者已知的多種技術測定，包括差示掃描熱量測定、UV差分光譜學、螢光、圓二色譜(CD)及NMR (Pace等人 (1997) 「Measuring the conformational stability of a protein」 in Protein structure: A practical approach 2: 299-321)。

a. 融合蛋白質 - 綜述 在一些實施例中，親和體多肽可進一步包含其他調節親和體多肽之生物活性之插入、取代或缺失。舉例而言，添加、取代或缺失可調節經修飾之親和體之一或多種特性或活性。舉例而言，添加、取代或缺失可調節親和體多肽之親和力(例如關於結合及抑制PD-1)、調節循環半衰期、調節治療半衰期、調節親和體多肽之穩定性、調節蛋白酶裂解、調節劑量、調節釋放或生物可用性、促進純化、降低脫醯胺化、改良存放期或改良或改變特定投藥途徑。類似地，親和體多肽可包含蛋白酶裂解序列、反應性基團、抗體結合域(包括(但不限於)FLAG或聚-His)或其他改良多肽之偵測、純化或其他特性之基於親和力之序列(包括(但不限於)FLAG、聚-His、GST等)或連接分子(包括(但不限於)生物素)。

在一些實例中，此等其他序列添加至呈融合蛋白質形式之親和體多肽之一端及/或另一端。因此，在本發明之某些態樣中，親和體試劑為具有至少一個親和體多肽序列及一或多個異源多肽序列(本文中，「融合域」)之融合蛋白質。可選擇融合域以提供所需性質，僅作為實例，諸如自細胞分泌或在細胞表面上滯留(亦即，對於經編碼之親和體)、充當轉譯後修飾之受質或其他識別序列、建立經由蛋白質-蛋白質相互作用聚集之多聚結構、改變(通常延長)血清半衰期或改變組織定位或組織排除及其他ADME特性。

舉例而言，一些融合域尤其適用於融合蛋白質之分離及/或純化，諸如藉由親和層析。僅作為說明，此類促進表現或純化之融合域之熟知實例包括親和標籤(諸如聚組胺酸(亦即，His₆ 標籤))、Strep II標籤、抗生蛋白鏈菌素結合肽(SBP)標籤、鈣調蛋白結合肽(CBP)、麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、S-標籤、HA標籤、c-Myc標籤、硫氧還蛋白、蛋白質A及蛋白質G。

為了分泌親和體試劑，其將通常含有引導蛋白質運輸至內質網之腔中且最終分泌(或若跨膜域或其他細胞表面滯留信號，則保持在細胞表面上)之信號序列。信號序列(亦稱為信號肽或前導序列)位於新生多肽之N端。其使多肽靶向內質網且使蛋白質分選至其目的地，例如經由分泌到達細胞器之內部空間、內膜、細胞外膜或細胞外部。在蛋白質運輸至內質網之後，大部分信號序列藉由信號肽酶自蛋白質裂解。信號序列自多肽之裂解通常在胺基酸序列中之特異性位點處發生且取決於信號序列內之胺基酸殘基。

在一些實施例中，信號肽之長度為約5至約40個胺基酸(諸如長度為約5至約7、約7至約10、約10至約15、約15至約20、約20至約25，或約25至約30、約30至約35，或約35至約40個胺基酸)。

在一些實施例中，信號肽為來自人類蛋白質之原生信號肽。在其他實施例中，信號肽為非原生信號肽。舉例而言，在一些實施例中，非原生信號肽為來自相應原生分泌型人類蛋白質之突變型原生信號肽，且可包括一或多個(諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個)取代、插入或缺失。

在一些實施例中，信號肽為來自非IgSF蛋白質家族之信號肽或其突變體，諸如來自免疫球蛋白(諸如IgG重鏈或IgG-κ輕鏈)、細胞介素(諸如介白素-2 (IL-2)或CD33)、血清白蛋白蛋白質(例如HSA或白蛋白)、人類天青殺素(azurocidin)前蛋白信號序列、螢光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原)之信號肽，或其他能夠自細胞有效分泌蛋白質之信號肽。例示性信號肽包括(但不限於)：

在分泌型親和體試劑之一些實施例中，重組型多肽在表現時包含信號肽，且信號肽(或其一部分)在分泌時自親和體試劑裂解。

標的融合蛋白質亦可包括一或多個分離異源蛋白質序列或結構域之連接子。如本文中所使用，術語「連接子」係指在第一多肽(例如親和體)與第二多肽(例如第二親和體、Fc區、受體陷阱、白蛋白等)之間插入的連接子胺基酸序列。由研究人員設計之經驗連接子通常根據其結構分為3類：可撓性連接子、剛性連接子及活體內可裂解連接體。除將功能域連接在一起(如在可撓性及剛性連接子中)或活體內釋放游離功能域(如在活體內可裂解連接體中)之基本作用以外，連接子可提供許多用於產生融合蛋白質之其他優點，諸如改良生物活性、增加表現量及實現理想藥物動力學概況。連接子不應不利地影響融合蛋白質之表現、分泌或生物活性。連接子不應為抗原性且不應引發免疫反應。

適合的連接子為熟習此項技術者已知的且通常包括甘胺酸及絲胺酸殘基之混合物，且通常包括非位阻胺基酸。可併入適用的連接子中之其他胺基酸包括蘇胺酸及丙胺酸殘基。連接子之長度可在某一範圍內，例如長度為1-50個胺基酸、長度為1-22個胺基酸、長度為1-10個胺基酸、長度為1-5個胺基酸或長度為1-3個胺基酸。在一些實施例中，連接子可包含裂解位點。在一些實施例中，連接子可包含酶裂解位點，使得第二多肽可自第一多肽分離。

在一些實施例中，連接子之特徵為可撓性。當所接合之結構域需要某種程度之移動或相互作用時，可撓性連接子通常為適用的。其通常由小型、非極性(例如Gly)或極性(例如Ser或Thr)胺基酸構成。參見例如Argos P. (1990) 「An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion」 J Mol Biol. 211:943-958。此等胺基酸之小尺寸提供可撓性且實現連接功能域之活動性。併入Ser或Thr可藉由與水分子形成氫鍵來保持連接子在水性溶液中之穩定性，且因此降低連接子與蛋白質部分之間的不利相互作用。最常用的可撓性連接子具有主要由Gly及Ser殘基之延伸部分組成之序列(「GS」連接子)。最廣泛使用的可撓性連接子之實例具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n之序列。藉由調節複本數「n」，可最佳化此GS連接子之長度以實現適合的功能域之分離，或保持必要的結構域間相互作用。除GS連接子以外，已設計許多其他可撓性連接子用於重組型融合蛋白質。由於此等可撓性連接子亦富含小型或極性胺基酸，諸如Gly及Ser，但可含有諸如Thr及Ala之其他胺基酸以保持可撓性，以及諸如Lys及Glu之極性胺基酸以改良可溶性。

在一些實施例中，連接子之特徵為剛性。儘管可撓性連接子具有被動地連接功能域及實現某種程度之移動之優勢，但此等連接子缺乏剛性在某些融合蛋白質實施例中可為一種限制，諸如在表現量或生物活性中。可撓性連接子在此等實例中無效係歸因於蛋白域之低效分離或其彼此之干擾之降低不足。在此等情形下，剛性連接子已成功地用於保持各結構域之間的固定距離及保持其獨立功能。

許多天然連接子呈現α-螺旋結構。α-螺旋結構為剛性及穩定的，具有區段內氫鍵及緊密封裝之主鏈。因此，剛性α-螺旋連接子可充當蛋白域之間的剛性間隔物。George等人 (2002) 「An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding」 Protein Eng. 15(11):871-9。一般而言，剛性連接子藉由採用α-螺旋結構或藉由含有多個Pro殘基而呈現相對剛性結構。在許多情形下，其比可撓性連接子更有效地分離功能域。可容易地藉由改變複本數來調節連接子之長度以實現各結構域之間的最佳距離。因此，當結構域之空間分離對於保持融合蛋白質之穩定性或生物活性而言重要時，選擇剛性連接子。在此方面，具有(EAAAK)n之序列的形成α螺旋之連接子已用於構築許多重組型融合蛋白質。另一種剛性連接子具有富含Pro之序列，(XP)n，其中X表示任何胺基酸，較佳為Ala、Lys或Glu。

僅作為說明，例示性連接子包括：

可用於標的融合蛋白質中之其他連接子包括(但不限於)SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n (其中n為1-7)、GRA、聚(Gly)、聚(Ala)、GGGSGGG(SEQ ID NO:166) 、ESGGGGVT(SEQ ID NO:167) 、LESGGGGVT(SEQ ID NO:168) 、GRAQVT(SEQ ID NO:169) 、WRAQVT(SEQ ID NO:170) 及ARGRAQVT(SEQ ID NO:171) 。下文所描述之Fc融合物之鉸鏈區亦可視為連接子。

各種元件可用於將蛋白質錨定在細胞之質膜上。舉例而言，I型(藉由細胞外部之N端定向)及II型(藉由胞溶質中之N端定向)整合膜蛋白質之跨膜域(TM)可用於使嵌合蛋白質靶向質膜。蛋白質亦可藉由GPI (糖磷脂醯肌醇脂質)信號與基因之3'端之融合而連接至細胞表面。短羧基末端肽之裂解實現醣脂經由醯胺鍵連接至新近暴露之C端。參見Udenfriend等人 (1995) 「How Glycosylphoshpatidylinositol Anchored Membrane Proteins are Made」 Annu Rev Biochem 64:563-591。

在一些實施例中，融合蛋白質包括跨膜多肽序列(跨膜域)。適合的跨膜多肽之區分特徵包含在上面應呈現親和體試劑之細胞表面處的表現能力。在一些實施例中，其可為免疫細胞，尤其淋巴細胞或自然殺手(NK)細胞，且與PD-L1相互作用以引導針對上面PD-L1上調之預定目標腫瘤細胞之免疫細胞之細胞反應。跨膜域可來源於天然或合成來源。跨膜域可來源於任何膜結合或跨膜蛋白。作為非限制性實例，跨膜多肽可為T細胞受體之子單元(諸如α、β、γ或δ)、組成CD3複合物之多肽、IL2受體p55 (鏈)、p75 (β鏈)或γ鏈、Fc受體之子單元鏈，尤其Fey受體III或CD蛋白質。或者，跨膜域可為合成的且可主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。

在某些其他實施例中，親和體試劑一種融合蛋白質，其包括除親和體多肽以外的進行用於糖基化磷脂醯肌醇(GPI)錨之轉譯後添加的信號傳導之序列。GPI錨為轉譯後添加至許多真核蛋白質之C端之醣脂結構。此對親和體試劑之修飾將引起其錨定(連接)在其中親和體試劑以重組型蛋白質形式(亦即，如下文所描述之經編碼之親和體)再表現之細胞之細胞膜之細胞外表面上。在此等實施例中，GPI錨域為針對親和體多肽序列之C端，且較佳位於融合蛋白質之C端。

在一些實施例中，GPI錨域為多肽，其在GPI錨之融合蛋白質為表現於真核系統中之部分時進行用於GPI錨之轉譯後添加之信號傳導。GPI錨信號序列由以下組成：錨添加位點(ω位點)處之小型胺基酸之集合，接著親水性間隔基且以疏水性延伸物結尾(Low, (1989) FASEB J. 3:1600-1608)。此信號序列之裂解在添加具有保守性中心組分，但具有可變周邊部分之錨之前，在ER中進行(Homans等人, Nature, 333:269-272 (1988))。GPI錨定之蛋白質之C端經由磷酸乙醇胺橋連接至高保守性核心聚糖，甘露糖(α1-2)甘露糖(α1-6)甘露糖(α1-4)葡糖胺(α1-6)肌醇。磷脂尾端使GPI錨連接至細胞膜。

可用於含有標的親和體之融合蛋白質中之例示性GPI錨域包括：

GPI錨連接可藉由能夠進行GPI轉譯後修飾之真核系統中含有GPI錨域的親和體融合蛋白質之表現來實現。與跨膜域融合蛋白質相同，人類細胞(包括淋巴細胞及其他涉及起始或促進抗腫瘤之細胞)因此能夠且可經工程改造以表現及編碼包括GPI錨域之親和體，以保留經工程改造之細胞表面上的含有經表現之親和體之融合物。

可對多肽序列本身或以融合蛋白質之一部分形式提供之側接多肽部分進行的其他修飾為一或多個序列，其為用於由酶進行之轉譯後修飾之位點。此等修飾可包括(但不限於)糖基化、乙醯化、醯化、脂質修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸添加、磷酸化、糖脂鍵修飾及其類似修飾。

b. 工程改造 PK 及 ADME 特性 在一些實施例中，親和體試劑可能不具有對於投藥途徑(諸如非經腸治療性給藥)而言最佳之半衰期及/或PK概況。術語「半衰期」係指物質(諸如本發明之親和體試劑)失去其一半藥理學或生理學活性或濃度所花費之時間量。生物半衰期可受物質之消除、分泌、降解(例如酶促)，或吸收及濃縮於某些身體器官或組織中影響。在一些實施例中，生物半衰期可藉由測定物質之血漿濃度達到其一半穩態水準所需之時間(「血漿半衰期」)來評估。為了克服此缺點，存在多種用於延長半衰期之一般策略，其已在其他蛋白質治療劑之情況下使用，包括合併半衰期延伸部分作為親和體試劑之一部分。

術語「半衰期延長部分」係指視情況經由非天然編碼之胺基酸、直接或經由連接子共價連接(「結合」或「融合」)至親和體多肽以形成本文中所描述之親和體試劑之醫藥學上可接受之部分、結構域或分子，其防止或減緩親和體多肽之活體內蛋白水解降解或其他降低活性之修飾、延長半衰期及/或改良或改變其他藥物動力學或生理學特性，包括(但不限於)與比較物(諸如經修飾之親和體多肽之未結合形式)相比，提高吸收率、降低毒性、改良可溶性、降低蛋白質聚集、提高經修飾之親和體多肽之生物活性及/或目標選擇性、提高可製造性及/或降低經修飾之親和體多肽之免疫原性。術語「半衰期延長部分」包括非蛋白質半衰期延長部分，諸如水溶性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)或離散PEG、羥乙基澱粉(HES)、脂質、分支鏈或未分支醯基、分支鏈或未分支C8-C30醯基、分支鏈或未分支烷基及分支鏈或未分支C8-C30烷基；及蛋白質半衰期延長部分，諸如血清白蛋白、轉鐵蛋白、纖連蛋白(例如白蛋白結合或藥物動力學延伸(PKE)之纖連蛋白)、Fc域及非結構化多肽，諸如XTEN及PAS多肽(例如由胺基酸Pro、Ala及/或Ser構成之構形無序之多肽序列)及前述中之任一者之片段。親和體之晶體結構及其與其目標(諸如圖式中展示之抗PD-L1親和體複合物與PD-1)之相互作用之檢驗可指示哪些胺基酸殘基具有對於溶劑而言完全或部分可用之側鏈。

在一些實施例中，與未與部分結合之蛋白質之半衰期相比(諸如相對於單獨的親和體多肽)，半衰期延長部分使在哺乳動物血清中循環之所得親和體試劑之半衰期延長。在一些實施例中，半衰期延長超過或大於約1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些實施例中，與不具有半衰期延長部分之蛋白質相比，在活體內給藥之後，半衰期延長超過6小時、超過12小時、超過24小時、超過48小時、超過72小時、超過96小時或超過1週。

作為進一步例示，可用於產生本發明之親和體試劑之半衰期延長部分包括： ․藥理學親和體序列與天然長半衰期蛋白質或蛋白質結構域之基因融合物(例如，Fc融合物、轉鐵蛋白[Tf]融合物或白蛋白融合物)。參見例如Beck等人 (2011) Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1-2；Czajkowsky等人 (2012) 「Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives」 EMBO Mol Med. 4:1015-28；Huang等人 (2009) Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology. Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692-9；Keefe等人 (2013) Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. Schmidt S編, Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 第345-56頁；Weimer等人 (2013) Recombinant albumin fusion proteins. Schmidt S編, Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. 第297-323頁；Walker等人 (2013) Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. Schmidt S編, Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. 第325-43頁。 ․藥理學親和體序列與惰性多肽，例如XTEN (亦稱為重組型PEG或「rPEG」)、高胺基酸聚合物(HAP；HAP化)、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物(PAS；PAS化)或類彈性蛋白肽(ELP；ELP化)之基因融合物。參見例如Schellenberger等人 (2009) A recombinant polypeptide extends thein vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186-90；Schlapschy等人 Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273-84；Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489-501；Floss等人 (2012) Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37-45；Floss等人 ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. Schmidt S編, Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. 第372-98頁。 ․藉由藥理學活性肽或蛋白質與重複化學部分，例如PEG (PEG化)或玻尿酸之化學結合來增加流體動力學半徑。參見例如Caliceti等人 (2003) 「Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates」 Adv Drug Delivery Rev. 55:1261-77；Jevsevar等人 (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113-28；Kontermann (2009) 「Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies」 BioDrugs. 23:93-109；Kang等人 (2009) 「Emerging PEGylated drugs」 Expert Opin Emerg Drugs. 14:363-80；及Mero等人 (2013) 「Conjugation of hyaluronan to proteins」 Carb Polymers. 92:2163-70。 ․藉由聚唾液酸化顯著增加融合藥理學活性肽或蛋白質之負電荷；或替代性地，(b)使已知可延長天然蛋白質(諸如人類CG b-子單元)之半衰期的帶負電之高度唾液酸化肽(例如羧基末端肽[CTP；絨膜促性腺激素(CG)b-鏈])與生物學候選藥物融合。參見例如Gregoriadis等人 (2005) 「Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids」 Int J Pharm. 2005; 300:125-30；Duijkers等人 「Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females」 (2002) Hum Reprod. 17:1987-93；及Fares等人 「Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit」 (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304-8. 35；及Fares Half-life extension through O-glycosylation。 ․經由肽或蛋白質結合域與生物活性蛋白質之連接來非共價結合於一般長半衰期蛋白質，諸如HSA、人類IgG、轉鐵蛋白或纖維連接蛋白。參見例如Andersen等人 (2011) 「Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain」 J Biol Chem. 286:5234-41；O'Connor-Semmes等人 (2014) 「GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans-PK/PD and safety」 Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704-12；Sockolosky等人 (2014) 「Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice」 PLoS One. 2014;9:e102566。

針對長期存活的血清蛋白之經典基因融合物提供與PEG或脂質之化學結合不同的替代性延長半衰期之方法。傳統上使用兩種主要蛋白質作為融合搭配物：抗體Fc域及人類血清白蛋白(HSA)。Fc融合涉及肽、蛋白質或受體胞外域與抗體之Fc部分之融合。Fc及白蛋白融合物不僅藉由增加肽藥物之尺寸，且亦皆利用人體之天然再循環機制：新生Fc受體，FcRn來實現延長之半衰期。此等蛋白質與FcRn之pH值依賴性結合可防止內體中融合蛋白質之降解。基於此等蛋白質之融合物可具有在3-16天範圍內之半衰期，遠長於典型聚乙二醇化或脂化肽。與抗體Fc域之融合可改良肽或蛋白質藥物之可溶性及穩定性。肽Fc融合物之實例為度拉糖肽(dulaglutide)，一種當前處於晚期臨床試驗中之GLP-1受體促效劑。人類血清白蛋白，由脂肪醯基化肽採用之同一種蛋白質為另一種風行的融合搭配物。阿必魯肽(albiglutide)為基於此平台之GLP-1受體促效劑。Fc與白蛋白之間的主要差異為Fc相對於HSA之單體結構之二聚性質，其引起視融合搭配物之選擇而定以二聚體或單體形式呈現經融合之肽。若親和體目標(諸如腫瘤細胞上之PD-L1)共同足夠緊密地間隔或本身為二聚體，則親和體-Fc融合物之二聚性質可產生親合力作用。此可能為合乎需要的或不取決於目標。

(i) Fc 融合物 在一些實施例中，親和體多肽可為具有免疫球蛋白Fc域(「Fc域」)或其片段或變體(諸如功能性Fc區)之融合蛋白質之一部分。在此情形中，Fc融合物(「Fc-融合物」)，諸如以親和體-Fc融合蛋白質形式產生之親和體試劑，為包含一或多個經由肽主鏈(直接地或間接地)共價連接至免疫球蛋白之Fc區之親和體序列之多肽。Fc-融合物可包含例如抗體之Fc區(其有助於效應子功能及藥物動力學)及作為相同多肽之一部分之親和體序列。免疫球蛋白Fc區亦可間接連接至一或多種親和體。各種連接子為此項技術中已知的且可視情況用於使Fc連接至包括親和體序列之多肽，以產生Fc-融合物。在一些實施例中，Fc-融合物可二聚化以形成Fc-融合物均二聚體，或使用不一致Fc域，以形成Fc-融合物雜二聚體。

存在若干種選擇人類抗體之Fc區用於產生呈親和體融合蛋白質形式之標的親和體試劑之原因。基本原理為產生穩定的蛋白質，足夠大以顯示與抗體相比類似的藥物動力學概況，及利用由Fc區賦予之特性；此包括涉及以下之救助新生FcRn受體路徑：內飲作用後FcRn介導之融合蛋白質再循環至細胞表面、避免溶酶體降解及引起釋放回血流中，因此有助於延長之血清半衰期。另一明顯優勢為Fc域與蛋白質A之結合，其可簡化在產生親和體試劑期間的後續處理及允許產生親和體試劑之高純度製劑。

一般而言，Fc域將包括抗體之除第一恆定區免疫球蛋白結構域以外的恆定區。因此，Fc域係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白域，及IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白域，及此等結構域之可撓性鉸鏈N端。對於IgA及IgM，Fc可包括J鏈。對於IgG，Fc包含免疫球蛋白域Cγ2及Cγ3以及Cγ1與Cγ2之間的鉸鏈。儘管Fc域之邊界可變化，但通常定義人類IgG重鏈Fc區以包含殘基C226或P230至其羧基端，其中編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991))。Fc可單獨指代此區域或在本文中之完全抗體、抗體片段或Fc融合蛋白質之情形下指代此區域。已在許多不同Fc位置處觀測到多形現象且亦包括作為Fc域，如本文中所使用。

在一些實施例中，如本文中所使用之Fc，「功能性Fc區」係指保持結合FcRn之能力之Fc域或其片段。功能性Fc區結合於FcRn，但不具有效應子功能。Fc區或其片段結合於FcRn之能力可藉由此項技術中已知之標準結合分析法來測定。例示性「效應子功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之調降等。此類效應子功能可使用此項技術中已知的用於評估此類抗體效應子功能之各種分析法評估。

在例示性實施例中，Fc域來源於IgG1子類，然而，亦可使用其他子類(例如IgG2、IgG3及IgG4)。可使用之人類IgG1免疫球蛋白Fc域之例示性序列為：

在一些實施例中，用於融合蛋白質中之Fc區可包含Fc分子之鉸鏈區。例示性鉸鏈區包含跨越上文所提供之例示性人類IgG1免疫球蛋白Fc域序列之位置1-16之核心鉸鏈殘基(亦即DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO:178 ))。在一些實施例中，部分由於上文中所提供之例示性人類IgG1免疫球蛋白Fc域序列之鉸鏈區內的位置6及9處之半胱胺酸殘基，含有親和體之融合蛋白質可呈多聚結構(例如二聚體)。在其他實施例中，如本文中所使用之鉸鏈區可進一步包括來源於側接上文所提供之例示性人類IgG1免疫球蛋白Fc域序列之核心鉸鏈序列之CH1及CH2區的殘基。在其他實施例中，鉸鏈序列可包含GSTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:179) 或EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:180) 或由其組成。

在一些實施例中，鉸鏈序列可包括一或多個賦予所需藥物動力學、生物物理學及/或生物特性之取代。一些例示性鉸鏈序列包括： EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO:181) ； EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO:182) ； EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:183) ； EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:184) ； DKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO:185) ；及 DKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:151) 。

在一些實施例中，上文所提供之例示性人類IgG1免疫球蛋白Fc域序列之位置18處之殘基P可由S置換以去除Fc效應子功能；此置換例示於具有序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:183) 、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:184) 及DKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:186) 之鉸鏈中。在另一實施例中，上文提供之例示性人類IgG1免疫球蛋白Fc域序列之位置1-2處之殘基DK可由GS替換以移除可能之剪切位點；此置換例示於序列EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:184) 中。在另一實施例中，人類IgG1之重鏈恆定區(亦即，域CH₁ -CH₃ )之位置103處之C可由S置換以防止在不存在輕鏈下形成不當半胱胺酸鍵；此置換例示於序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO:182) 、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:183) 及EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:184) 中。

在一些實施例中，Fc為哺乳動物Fc，諸如人類Fc，包括來源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc域。Fc區可與原生Fc區及/或親本多肽之Fc區具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，Fc區可與原生Fc區及/或親本多肽之Fc區具有至少約90%序列一致性。

在一些實施例中，Fc域包含選自SEQ ID NO:95之胺基酸序列，或來自由SEQ ID NO:96-108提供之實例之Fc序列。應瞭解，Fc域之C端離胺酸為包含Fc域之融合蛋白質之視情況存在之組分。在一些實施例中，Fc域包含選自SEQ ID NO:95-108之胺基酸序列，但省略其C端離胺酸以外。在一些實施例中，Fc域包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc域包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，但省略其C端離胺酸。

結合PD-L1之親和體與Fc之例示性Fc融合物提供於實例及圖式中，表明親和體序列可位於Fc域之N端或C端，且可直接連接或融合蛋白質可具有其他介於Fc域與親和體多肽序列之間的多肽序列。在所說明之實例中，非結構化(可撓性)連接子(Gly₄ Ser)_n 與結合PD-L1之親和體「251」(SEQ ID NO:86)及人類IgG1之Fc域(SEQ ID NO:95)一起使用，其中鉸鏈區為EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG。構築體皆包括自蛋白質之成熟版本裂解之CD33分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO: 136 ) 。

「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)的分泌性Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合於攜帶抗原之目標細胞且接著用細胞毒素殺死目標。

在一些實施例中，融合蛋白質包括Fc域序列，其使得所得親和體試劑不具有(或具有降低之)ADCC及/或補體活化或效應子功能性。舉例而言，Fc域可包含IgG2或IgG4同型之自然禁用恆定區或突變型IgG1恆定區。適合的修飾之實例描述於EP0307434中。一個實例包含位置235及237 (EU指數編號)處之丙胺酸殘基之取代。

在其他實施例中，融合蛋白質包括Fc域序列，其使得所得親和體試劑將保留一些或所有Fc功能性，例如將能夠具有ADCC及CDC活性中之一者或兩者，例如若融合蛋白質包含來自人類IgG1或IgG3之Fc域。效應子功能之水準可根據已知技術變化，例如藉由CH2結構域中之突變，例如其中IgG1 CH2結構域在選自239及332及330之位置處具有一或多個突變，例如突變係選自S239D及I332E及A330L，使得抗體具有增強之效應子功能，及/或例如改變本發明之抗原結合蛋白質之糖基化概況使得Fc區之海藻糖基化減少。

(ii) 白蛋白融合物 在其他實施例中，親和體試劑為融合蛋白質，其除至少一個親和體序列以外亦包含白蛋白序列或白蛋白片段。在其他實施例中，親和體試劑經由化學鍵與白蛋白序列或白蛋白片段結合，而非併入包括親和體之多肽序列中。在一些實施例中，白蛋白、白蛋白變異體或白蛋白片段為人類血清白蛋白(HSA)、人類血清白蛋白變異體或人類血清白蛋白片段。在例如食蟹獼猴、牛、犬、兔及大鼠中發現與HSA類似之白蛋白血清蛋白。在非人類物種中，牛血清白蛋白(BSA)在結構上與HSA最類似。參見例如Kosa等人, (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24。本發明涵蓋來自非人類物種之白蛋白之用途，包括(但不限於)來源於食蟹獼猴血清白蛋白或牛血清白蛋白之白蛋白序列。

成熟HSA，一種具有約20天之血清半衰期之585胺基酸多肽(約67 kDa)，主要負責維持膠態滲透血壓、血液pH值以及大量內源性及外源性配位體之運輸及分佈。蛋白質具有三個結構上同源的結構域(結構域I、II及III)，幾乎完全呈α-螺旋構形且由於17個二硫橋鍵而極其穩定。在一些實施例中，親和體試劑可為白蛋白融合蛋白質，其包括一或多個親和體多肽序列及成熟人類血清白蛋白之序列(SEQ ID NO:113)或其其變異體或片段，其維持成熟白蛋白之PK及/或生物分佈特性達到融合蛋白質中所需之程度。

白蛋白序列可使用如上文所描述之連接序列自親和體多肽序列或親和體試劑中之其他側接序列引發。

除非另有指示，否則本文中提及「白蛋白」或「成熟白蛋白」意指HSA。然而，應注意，全長HSA具有含有18個胺基酸之信號肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:137) )，接著具有6個胺基酸之前結構域(RGVFRR)；此24個胺基酸殘基肽可稱為預先前結構域。親和體-HSA融合蛋白質可使用重組型蛋白質編碼序列中之HSA預先前結構域表現及分泌。或者，親和體-HSA融合物可經由包含其他分泌信號序列(諸如上文所描述之序列)表現及分泌。

在替代性實施例中，不以具有親和體多肽之融合蛋白質之一部分形式提供，血清白蛋白多肽可經由除主鏈醯胺鍵以外的鍵與含有親和體之多肽共價偶合，諸如經由白蛋白多肽中之每一者上的胺基酸側鏈與含有親和體之多肽之間的化學結合來交聯。

(iii) 白蛋白結合域 在一些實施例中，親和體試劑可包括血清結合部分，其作為具有親和體多肽序列之融合蛋白質之一部分(若亦為多肽)，或經由除相鄰多肽鏈之一部分以外的位點化學結合。

在一些實施例中，結合血清之多肽為白蛋白結合部分。白蛋白含有多個疏水性結合袋且天然地充當多種不同配位體(諸如脂肪酸及類固醇)以及不同藥物之轉運子。此外，白蛋白之表面帶負電，使其具有高水溶性。

如本文中所使用，術語「白蛋白結合部分」指能夠結合於白蛋白，亦即具有白蛋白結合親和力之任何化學基團。白蛋白結合於內源性配位體，諸如脂肪酸；然而，其亦與外源性配位體(諸如華法林(warfarin)、青黴素及安定(diazepam))相互作用。由於此等藥物與白蛋白之結合為可逆的，白蛋白-藥物複合物物充當可增強藥物生物分佈及生物可用性之藥物儲存器。已使用併入可模擬內源性白蛋白結合配位體之組分(諸如脂肪酸)來增強白蛋白關聯及提高藥物功效。

在一些實施例中，可用於產生標的親和體試劑以延長蛋白質半衰期之化學修飾方法為脂質化，其涉及脂肪酸與肽側鏈之共價結合。最初作為一種用於延長胰島素半衰期之方法構思及研究，脂質化與聚乙二醇化共有相同的基本半衰期延長機制，亦即增加流體動力學半徑以降低腎過濾。然而，脂質部分本身相對較小且作用係經由脂質部分與循環白蛋白之非共價結合間接地介導。脂質化之一個結果為其降低肽之水溶性，但肽與脂肪酸之間的連接子之工程改造可調節此作用，例如藉由使用連接子內之麩胺酸或微型PEG。連接子工程改造及脂質部分之變化可影響自行聚集，其可藉由延緩生物分佈來促進半衰期延長(與白蛋白無關)。參見例如Jonassen等人 (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14。

用於產生某些親和體試劑之白蛋白結合部分之其他實例包括白蛋白結合(PKE2)纖連蛋白(參見WO2011140086，「Serum Albumin Binding Molecules」；WO2015143199，「Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains」；及WO2017053617，「Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains」)、鏈球菌菌株G148之蛋白質G之白蛋白結合域3 (ABD3)及白蛋白結合域抗體GSK2374697 (「AlbudAb」)或ATN-103 (奧利珠單抗(Ozoralizumab))之白蛋白結合奈米抗體部分。

(iv) 聚乙二醇化、 XTEN 、 PAS 及其他聚合物 廣泛多種大分子聚合物及其它分子可連接至本發明之含有親和體之多肽以調節所得親和體試劑之生物特性，及/或向親和體試劑提供新穎生物特性。此等大分子聚合物可經由天然編碼之胺基酸、非天然編碼之胺基酸或天然或非天然胺基酸之任何功能性取代基或添加至天然或非天然胺基酸之任何取代基或官能基連接至含有親和體之多肽。聚合物分子量可在包括(但不限於)約100 Da與約100,000 Da或更大之間的廣泛範圍內。聚合物之分子量可在約100 Da與約100,000 Da之間，包括(但不限於)100,000 Da、95,000 Da、90,000 Da、85,000 Da、80,000 Da、75,000 Da、70,000 Da、65,000 Da、60,000 Da、55,000 Da、50,000 Da、45,000 Da、40,000 Da、35,000 Da、30,000 Da、25,000 Da、20,000 Da、15,000 Da、10,000 Da、9,000 Da、8,000 Da、7,000 Da、6,000 Da、5,000 Da、4,000 Da、3,000 Da、2,000 Da、1,000 Da、900 Da、800 Da、700 Da、600 Da、500 Da、400 Da、300 Da、200 Da及100 Da。在一些實施例中，聚合物之分子量在約100 Da與約50,000 Da之間。在一些實施例中，聚合物之分子量在約100 Da與約40,000 Da之間。在一些實施例中，聚合物之分子量在約1,000 Da與約40,000 Da之間。在一些實施例中，聚合物之分子量在約5,000 Da與約40,000 Da之間。在一些實施例中，聚合物之分子量在約10,000 Da與約40,000 Da之間。

為此目的，已研發出各種方法，包括聚乙二醇化、聚唾液酸化、羥乙基澱粉化、糖基化或與可撓性及親水性胺基酸鏈(500至600個胺基酸)融合之重組型PEG類似物(參見Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54, 531-545；Schlapschy等人, (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283；Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876；Jevsevar等人, (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246)。

聚合物之實例包括(但不限於)聚烷基醚及其烷氧基封端類似物(例如聚氧乙烯二醇、聚氧乙烯/丙二醇及其甲氧基或乙氧基封端類似物，尤其聚氧乙烯二醇，後者亦稱為聚乙二醇或PEG)；離散PEG (dPEG)；聚乙烯吡咯啶酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉及聚羥烷基噁唑啉；聚丙烯醯胺、聚烷基丙烯醯胺及聚羥烷基丙烯醯胺(例如聚羥丙基甲基丙烯醯胺及其衍生物)；聚羥烷基丙烯酸酯；聚唾液酸及其類似物；親水性肽序列；多糖及其衍生物，包括聚葡萄糖及聚葡萄糖衍生物，例如羧基甲基聚葡萄糖、硫酸聚葡萄糖、胺基聚葡萄糖；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素、羥烷基纖維素；甲殼素及其衍生物，例如聚葡萄胺糖、丁二醯聚葡萄胺糖、羧甲基甲殼素、羧甲基聚葡萄胺糖；玻尿酸及其衍生物；澱粉；海藻酸鹽；硫酸軟骨素；白蛋白；普魯蘭(pullulan)及羧甲基普魯蘭；聚胺基酸及其衍生物，例如聚麩胺酸、聚離胺酸、聚天冬胺酸、聚天冬醯胺；順丁烯二酸酐共聚物，諸如：苯乙烯順丁烯二酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚順丁烯二酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；及前述各者之衍生物。

所選擇之聚合物可為水溶性，使得其所連接之親和體試劑不在水性環境(諸如生理學環境)中沈澱。水溶性聚合物可為任何結構形式，包括(但不限於)線形、叉狀或分支形。典型地，水溶性聚合物為聚(伸烷基二醇)，諸如聚(乙二醇)(PEG)，但亦可使用其他水溶性聚合物。作為實例，使用PEG描述本發明之一些實施例。對於親和體試劑之治療用途，聚合物可為醫藥學上可接受的。

廣泛使用術語「PEG」涵蓋任何聚乙二醇分子，與尺寸或PEG之一端處之修飾無關，且可表示為藉由下式連接至含有親和體之多肽： XO-(CH₂ CH₂ O)_n -CH₂ CH₂ - 或 XO-(CH₂ CH₂ O)_n - 其中n為2至10,000，且X為H或末端修飾，包括(但不限於)C1-4烷基、保護基或末端官能基。在一些情況下，用於本發明多肽中之PEG端接於具有羥基或甲氧基之一端上，亦即X為H或CH₃ (「甲氧基PEG」)。

應注意，PEG之另一端，其在上式中由末端「-」展示，可經由天然存在或非天然編碼之胺基酸連接至含有親和體之多肽。舉例而言，連接可經由與多肽之胺基(包括(但不限於)離胺酸之ε胺或N端)之醯胺、胺基甲酸酯或脲鍵進行。或者，聚合物藉由順丁烯二醯亞胺鍵連接至硫醇基(包括(但不限於)半胱胺酸之硫醇基)，其在連接至親和體多肽序列本身之情況下需要將親和體序列中之殘基改變成半胱胺酸。

可調節連接至含有親和體之多肽之水溶性聚合物之數目(亦即，聚乙二醇化或糖基化之程度)以提供所得親和體試劑中之經改變(包括(但不限於)增加或降低)之藥理學、藥物動力學或藥效學特徵，諸如活體內半衰期。在一些實施例中，與未經修飾之多肽相比，所得親和體試劑之半衰期延長至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少約100倍。

適用於修飾所得親和體試劑之PK或其他生物特性的聚合物系統之另一種變化為使用非結構化、親水性胺基酸聚合物，其為PEG之功能類似物，尤其作為具有親和體多肽序列之融合蛋白質之一部分。多肽平台之固有可生物降解性使得其具有作為PEG之良性可能更高的替代物之吸引力。另一優勢為與PEG之多分散性相比，重組型分子之精確分子結構。與其中需要保持融合搭配物之三維摺疊之HSA及Fc肽融合物不同，在許多情況下，與非結構化搭配物之重組型融合物可經歷更高的溫度或嚴格條件，諸如HPLC純化。

此類型之多肽中之一種更高級的多肽稱為XTEN (Amunix)且長度為864個胺基酸且包含六個胺基酸(A、E、G、P、S及T)。參見Schellenberger等人 「A recombinant polypeptide extends thein vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner」 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90。由於聚合物之可生物降解性質，此比通常使用之40 KDa PEG大得多且賦予伴隨的更大的半衰期延長。XTEN與含有親和體之多肽之融合物應引起最終親和體試劑與未經修飾之多肽相比半衰期延長60至130倍。

基於類似概念考慮因素之第二聚合物為PAS (XL-Protein GmbH)。Schlapschy等人 「PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins」 2013 Protein Eng Des Sel. 26(8):489-501。隨機纏結聚合物包含僅三種小型不帶電胺基酸(脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸)之甚至受限程度更高的集合。與Fc、HAS及XTEN相同，在表現時，PAS修飾可經親和體多肽序列遺傳編碼以產生內嵌融合蛋白質。

c. 多特異性融合蛋白質 在一些實施例中，親和體試劑為多特異性多肽，其包括例如第一抗PD-L1親和體多肽及至少一個其他結合域。作為說明，其他結合域可為選自以下之多肽序列：第二親和體多肽序列(其可與第一親和體多肽序列相同或不同)、抗體或其片段或其他抗原結合多肽、受體之配位體結合部分(諸如受體陷阱多肽)、受體結合配位體(諸如細胞介素、生長因子或其類似物)、經工程改造之T細胞受體、酶或其催化片段。

在一些實施例中，親和體試劑包括一或多個亦針對PD-L1之其他親和體多肽序列。其他抗PD-L1親和體(或其混合物)可與第一抗PD-L1親和體多肽相同或不同，以產生多特異性親和體融合蛋白質。親和體試劑可結合PD-L1上之相同或重疊位點，或可結合兩個不同位點，使得親和體試劑可同時結合同一個PD-L1蛋白質上之兩個位點(雙互補位)或超過兩個位點(多互補位)。

在一些實施例中，親和體試劑包括一或多個來自抗體之抗原結合位點。所得親和體試劑可為單鏈，包括抗PD-L1親和體及抗原結合位點(諸如在scFV之情況下)，或可為多聚蛋白質複合物，諸如在亦與抗PD-L1抗體之序列融合之由重鏈及/或輕鏈組裝之抗體中。此格式之例示性親和體/抗體融合物為圖11A中展示之伊派利單抗-AVA04-141雙特異性抗體，其對於CTLA-4及PD-L1中之每一者為二價的。另一種為圖13A中之貝伐珠單抗-AVA04-251雙特異性抗體，其對於VEGF-A及PD-L1中之每一者為二價的。

在所說明之伊派利單抗-AVA04-141雙特異性抗體之情況下，抗PD-L1親和體多肽以抗CTLA-4抗體之重鏈之C端末端處之串聯融合物形式提供，其中重鏈(包括可移除之分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:136) 及Gly₄ -Ser重複連接子)具有親和體融合物序列： 且輕鏈(包括可移除之分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:136) )具有原生伊派利單抗抗體之序列：

類似地，在所說明之貝伐珠單抗-AVA04-251雙特異性抗體之情況下，抗PD-L1親和體多肽以抗VEGF-A抗體之重鏈之C端末端處之串聯融合物形式提供，其中重鏈(包括可移除之分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO: 136) 及可撓性Gly₄ -Ser重複連接子)具有親和體融合物序列： 且輕鏈(包括可移除之分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:136) )具有原生貝伐珠單抗抗體之序列：

為了進一步說明格式化所提供之本發明之親和體中之靈活性，亦產生貝伐珠單抗-AVA04-251雙特異性抗體之版本，其中輕鏈與以上相同，但重鏈包括抗體重鏈與抗PD-L1親和體之間的剛性連接子，其中重鏈(包括可移除之分泌信號序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:136) 及剛性A(EAAAK)₃ 連接子)具有親和體融合物序列：

如熟習此項技術者將顯而易見及圖17中所說明，可在抗體之重鏈或輕鏈之N端或C端末端中之任一者或其組合/排列處添加抗PD-L1親和體多肽序列。此外，如圖9中所示，在多聚親和體之情形下，任何既定抗體鏈可包括超過一個親和體序列。

在與包含全長免疫球蛋白之多特異性親和體試劑相關之一些實施例中，親和體多肽序列與抗體之融合物將保留免疫球蛋白之Fc區之Fc功能。舉例而言，在一些實施例中，親和體試劑將能夠經由其Fc部分結合於Fc受體陽性細胞之Fc受體。在一些其他實施例中，親和體試劑可藉由結合於Fc受體陽性細胞來活化Fc受體陽性細胞，籍此起始或增加細胞介素及/或共刺激抗原之表現。此外，親和體試劑可至少經由共刺激抗原及/或細胞介素將T細胞之生理學活化所需的第二活化信號轉移至T細胞。

在一些實施例中，由於其Fc部分與其他細胞之結合，其中該等其他細胞表現來自免疫系統之效應細胞(諸如免疫細胞、肝細胞及內皮細胞)之表面上之Fc受體，親和體試劑可具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能，一種細胞介導之免疫防禦機制，藉此免疫系統之效應細胞有效溶解膜表面抗原已由抗體結合之目標細胞且因此，經由ADCC引起腫瘤細胞死亡。在一些其他實施例中，親和體試劑能夠顯示ADCC功能(圖 5C )。

如上文所描述，除Fc介導之細胞毒性以外，Fc部分可有助於保持親和體試劑之對於其體內穩定性及持久性而言重要的血清含量。舉例而言，當Fc部分結合於內皮細胞及吞噬細胞上之Fc受體時，親和體試劑可變得內化且再循環回血流中，增強其體內半衰期。

僅作為說明，其他親和體多肽之例示性目標包括(但不限於)另一免疫檢查點蛋白及免疫共刺激性受體(尤其在其他親和體可促效共刺激性受體之情況下)、受體、細胞介素、生長因子或腫瘤相關抗原。

當親和體試劑為親和體/抗體融合蛋白質時，免疫球蛋白部分可為例如免疫球蛋白，其為針對CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、VEGF、VEGF受體、EGFR或Her2/neu之單株抗體。此類免疫球蛋白之少數說明性實例包括以下中之任一者中所包含之抗體：曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕尼單抗(panitumumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、奧比珠單抗(obinutuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、異貝莫單抗(ibritumomab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、貝倫妥單抗(brentuximab)及吉妥珠單抗(gemtuzumab)。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體多肽之親和體試劑之一部分，其包括一或多個抑制諸如表現於T細胞上之免疫檢查點分子(包括(但不限於)PD-1、PD-L2、CTLA-4、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA或TIGIT)之結合域。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體多肽為親和體試劑之一部分，其包括一或多個促效諸如表現於T細胞上之免疫共刺激分子(包括(但不限於)CD28、ICOS、CD137、OX40、GITR、CD27、CD30、HVEM、DNAM-1或CD28H)之結合域。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體多肽為親和體試劑之一部分，其包括一或多種免疫共刺激性分子之配位體促效劑，諸如CD28、ICOS、CD137、OX40、GITR、CD27、CD30、HVEM、DNAM-1或CD28H之促效劑配位體。

藉由組合具有結合域之抗PD-L1親和體之PD-L1抑制活性，該等結合域阻斷一個或若干個抑制性免疫檢查點及/或活化免疫共刺激性路徑中之一或多者，多特異性親和體試劑可以其他方式救援經耗竭之抗腫瘤T細胞，增強抗腫瘤免疫且籍此引發癌症患者中之陽性反應。在一些其他實施例中，協同表現之免疫檢查點蛋白質之親和體試劑之雙重阻斷可產生加成或協同抗腫瘤活性。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體多肽為親和體試劑之一部分，其包括一或多個抑制可溶性免疫抑制分子之結合域，諸如結合於可溶性免疫抑制分子之結合域(諸如受體陷阱)或結合於相應同源受體及預防受體之配位體活化之結合域，包括(但不限於)PGE2、TGF-β、VEGF、CCL2、IDO、CSF1、IL-10、IL-13、IL-23、腺苷或STAT3活化劑之拮抗劑。在某些實例中，親和體試劑包括VEGF受體陷阱域，諸如阿柏西普(Aflibercept)之VEGF結合受體結構域。在另一實例中，親和體試劑包括TGF-β受體陷阱域，諸如MSB0011359C之TGF-β結合受體結構域。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體多肽為親和體試劑之一部分，其包括一或多個結合於腫瘤微環境中上調之蛋白質(亦即，腫瘤相關抗原)之結合域，諸如在腫瘤中之腫瘤細胞或巨噬細胞、纖維母細胞、T細胞或其他浸潤腫瘤之免疫細胞上上調。

在一些實施例中，抗PD-L1親和體多肽為親和體試劑之一部分，其包括一或多個結合於選自由以下組成之群之蛋白質之結合域：CEACAM-1、CEACAM-5、BTLA、LAIR1、CD160、2B4、TGFR、B7-H3、B7-H4、CD40、CD4OL、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、半乳糖凝集素-9、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、LIGHT、I或II類MHC、NKG2a、NKG2d、OX4OL、PVR、SIRPα、TCR、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、VEGF、VEGF受體、EGFR、Her2/neu、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E或TSLP。

d. 結合物 標的親和體試劑亦可包括一或多個意欲賦予親和體試劑可偵測性或其他藥理學活性之功能性部分。用於偵測之功能性部分為可用於活體內偵測親和體試劑與細胞或組織(諸如腫瘤細胞)之關聯之功能性部分。具有藥理學活性之功能性部分為意欲遞送至表現親和體試劑之目標(在本發明之PDL-L1親和體試劑之情況下，PD-L1)之組織且藉此使目標組織或細胞產生藥理學結果之試劑。

本發明提供親和體試劑，其包括具有多種官能基、取代基或部分之物質與此等功能性部分之結合物，該等功能性部分包括(但不限於)標記；染料；聚合物；免疫黏附分子；放射性核素；細胞毒性化合物；藥物；親和力標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反義聚核苷酸；醣；水溶性樹枝狀聚合物；環糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；奈米粒子；自旋標記；螢光團；含有金屬之部分；放射性部分；新穎官能基；與其他分子共價或非共價相互作用之基團；光籠化部分；光化輻射可激發之部分；可光致異構化部分；生物素；生物素衍生物；生物素類似物；合併有重原子之部分；可化學裂解之基團；可光裂解之基團；延長之側鏈；碳連接之糖；氧化還原活性劑；胺基硫代酸；毒性部分；經同位素標記之部分；生物物理探針；磷光基團；化學發光基團；電子緻密基團；磁性基團；插入基團；發色團；能量轉移劑；生物活性劑；可偵測標記；小分子；量子點；奈米傳遞素；放射性核苷酸；放射性傳遞素；中子捕獲劑；或上述物質之任何組合，或任何其他所需化合物或物質。

(i) 標記及可偵測部分 其中部分為可偵測標記，其可為螢光標記、放射性標記、酶標記或熟習此項技術者已知的任何其他標記。在一些實施例中，功能性部分為可偵測標記，其可作為結合物之一部分而包括以形成適用於醫學成像之某些親和體試劑。「醫學成像」意謂任何用於使人類或動物身體之內部區域視覺化以用於診斷、研究或治療性處理之目的之技術。舉例而言，可藉由放射性閃爍攝影術、磁共振成像(MRI)、電腦斷層掃描(CT掃描)、細胞核成像、包含金屬斷層攝影術對比劑之正電子發射(PET)、光學成像(諸如螢光成像，包括近紅外螢光(NIRF)成像)、生物發光成像或其組合。功能性部分視情況為X射線成像之對比劑。適用於增強此類技術之試劑為滿足以下條件之材料：實現體內特定基因座、器官或疾病位點之觀測及/或引起藉由成像技術產生之影像之品質之某種改良，提供此等影像之經改良或更容易的說明。此類試劑在本文中稱為對比劑，使用其可藉由提高影像之不同區域之間的「對比度」而有助於區分影像之不同部分。因此，術語「對比劑」涵蓋用於增強可在不存在此類試劑之情況下產生之影像之品質之試劑(如在例如MRI之情況下)，以及產生影像所必需之試劑(如在例如細胞核成像之情況下)。

在一些實施例中，可偵測標記包括用於使金屬螯合之螯合劑部分，例如用於放射金屬或順磁離子之螯合劑。在一些實施例中，可偵測標記為用於放射性核素之螯合劑，該放射性核素適用於放射療法或成像程序。適用於本發明之放射性核素包括γ-發射體、正電子發射體、俄歇電子發射體(Auger electron-emitter)、X射線發射體及螢光發射體，其中β或α-發射體用於治療用途。適用作放射療法中之毒素之放射性核素之實例包括：⁴³ K、⁴⁷ Sc、⁵¹ Cr、⁵⁷ Co、⁵⁸ Co、⁵⁹ Fe、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Ga、⁶⁷ Cu、⁶⁸ Ga、⁷¹ Ge、⁷⁵ Br、⁷⁶ Br、⁷⁷ Br、⁷⁷ As、⁸¹ Rb、⁹⁰ Y、⁹⁷ Ru、^99m Tc、¹⁰⁰ Pd、¹⁰¹ Rh、¹⁰³ Pb、¹⁰⁵ Rh、¹⁰⁹ Pd、¹¹¹ Ag、¹¹¹ In、¹¹³ In、¹¹⁹ Sb、¹²¹ Sn、¹²³ I、¹²⁵ I、¹²⁷ Cs、¹²⁸ Ba、¹²⁹ Cs、¹³¹ I、¹³¹ Cs、¹⁴³ Pr、¹⁵³ Sm、¹⁶¹ Tb、¹⁶⁶ Ho、¹⁶⁹ Eu、¹⁷⁷ Lu、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、¹⁸⁹ Re、¹⁹¹ Os、¹⁹³ Pt、¹⁹⁴ Ir、¹⁹⁷ Hg、¹⁹⁹ Au、²⁰³ Pb、²¹¹ At、²¹² Pb、²¹² Bi及²¹³ Bi。螯合劑使金屬配位之條件由例如Gansow等人, 美國專利案第4,831,175號、第4,454,106號及第4,472,509號描述。僅作為說明，螯合劑之實例包括1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N',N"-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'"-四乙酸(DOTA)、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸(TETA)。

其他可偵測之同位素可直接併入親和體多肽之胺基酸殘基中或以其他方式不需要螯合劑，包括³ H、¹⁴ C、³² P、³⁵ S及³⁶ Cl。

亦可投與適用於診斷程序之順磁離子。順磁離子之實例包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)、鉺(III)或此等順磁離子之組合。

螢光標記之實例包括(但不限於)有機染料(例如花青、螢光素、若丹明、Alexa Fluors、Dylight fluors、ATTO Dyes、BODIPY Dyes等)、生物學螢光團(例如綠色螢光蛋白(GFP)、R-藻紅素等)及量子點。

可用於本發明中之非限制性螢光化合物包括Cy5、Cy5.5 (亦稱為Cy5++)、Cy2、異硫氰酸螢光素(FITC)、異硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)、藻紅素、Cy7、螢光素(FAM)、Cy3、Cy3.5 (亦稱為Cy3++)、Texas Red、LightCycler-Red 640、LightCycler Red 705、四甲基若丹明(TMR)、若丹明、若丹明衍生物(ROX)、六氯螢光素(HEX)、若丹明6G (R6G)、若丹明衍生物JA133、Alexa Fluorescent Dyes (諸如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 555及Alexa Fluor 647)、4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙錠、AMCA、Spectrum Green、Spectrum Orange、Spectrum Aqua、Lissamine及螢光過渡金屬錯合物，諸如銪。可使用之螢光化合物亦包括螢光蛋白質，諸如GFP (綠色螢光蛋白)、增強型GFP (EGFP)、藍螢光蛋白及衍生物(BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青螢光蛋白及衍生物(CFP、ECFP、Cerulean、CyPet)及黃螢光蛋白及衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet)。WO2008142571、WO2009056282、WO9922026。

酶標記之實例包括(但不限於)辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶及β-半乳糖。

另一種熟知的標記為生物素。生物素標記通常由生物素基團、間隔臂及負責連接至蛋白質上之目標官能基之反應性基團構成。生物素可適用於使經標記之蛋白質連接至其他包含抗生素蛋白部分之部分。

(ii) 親和體 - 藥物結合物 在一些實施例中，親和體試劑包括一或多種治療劑，例如用於形成親和體-藥物結合物。如本文中所使用，術語「治療劑」係指可用於治癒、緩解、治療或預防人類或另一種動物中之疾病之物質。此類治療劑包括美國官方藥典(United States Pharmacopeia)、美國官方順勢療法藥典(official Homeopathic Pharmacopeia of the United States)、官方國家處方(official National Formulary)或其任何增刊中認可之物質，且包括(但不限於)小分子、核苷酸、寡肽、多肽等。可連接至含有親和體之多肽之治療劑包括(但不限於)細胞毒性劑、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞介素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、毒素、細胞凋亡劑或其類似物，諸如DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、內質網應力誘導劑、鉑化合物、抗代謝物、長春鹼、紫杉烷、埃博黴素(epothilone)、酶抑制劑、受體拮抗劑、治療性抗體、酪胺酸激酶抑制劑、放射增敏劑及化學治療劑組合療法，諸如說明。

DNA烷基化劑之非限制性實例為氮芥，諸如雙氯乙基甲胺、環磷醯胺(異環磷醯胺、曲磷胺)、苯丁酸氮芥(美法侖、潑尼氮芥)、苯達莫司汀、烏拉莫司汀及雌氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(司莫司汀)、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀及鏈脲菌素；磺酸烷基酯，諸如白消安(甘露舒凡、曲奧舒凡)；氮丙啶，諸如卡波醌、噻替派、三亞胺醌、三伸乙基蜜胺；肼(丙卡巴肼)；三氮烯，諸如達卡巴嗪及替莫唑胺；六甲蜜胺及二溴甘露醇。

拓樸異構酶I抑制劑之非限制性實例包括喜樹鹼衍生物，包括CPT-11 (伊立替康)、SN-38、APC、NPC、喜樹鹼、拓朴替康、甲磺酸依喜替康(exatecan mesylate)、9-硝基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、勒托替康(lurtotecan)、盧比替康(rubitecan)、司拉替康(silatecan)、吉馬替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依他替康(extatecan)、BN-80927、DX-8951f及MAG-CPT，如Pommier Y. (2006) Nat. Rev. Cancer 6(10):789-802及美國專利公開案第200510250854號中所描述；原小蘖鹼(Protoberberine)生物鹼及其衍生物，包括小檗紅鹼(berberrubine)及甲氧檗因(coralyne)，如Li等人 (2000) Biochemistry 39(24):7107-7116及Gatto等人 (1996) Cancer Res. 15(12):2795-2800中所描述；啡啉衍生物，包括苯并[i]啡啶、兩面針鹼(Nitidine)及花椒寧鹼(fagaronine)，如Makhey等人 (2003) Bioorg. Med. Chem. 11 (8): 1809-1820中所描述；四苯并咪唑及其衍生物，如Xu (1998) Biochemistry 37(10):3558-3566中所描述；及蒽環黴素衍生物，包括小紅莓、道諾黴素及米托蒽醌，如Foglesong等人 (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 30(2):123-]25、Crow等人 (1994) J. Med. Chem. 37(19):31913194及Crespi等人 (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 136(2):521-8中所描述。拓樸異構酶II抑制劑包括(但不限於)依託泊苷及替尼泊苷。雙重拓樸異構酶I及II抑制劑包括(但不限於)散特平(Saintopin)及其他四并苯醌、DACA及其他吖啶-4-甲醯胺、茚托利辛(Intoplicine)及其他苯并吡啶并吲哚、TAS-103及其他7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮、派拉瑞丁(Pyrazoloacridine)、XR 11576及其他苯并吩嗪、XR 5944及其他二聚化合物、7-側氧基-7H-二苯并[f,ij]異喹啉及7-側氧基-7H-苯并[e]呸啶及蒽基-胺基酸結合物，如Denny及Baguley (2003) Curr. Top. Med. Chem. 3(3):339-353中所描述。一些試劑抑制拓樸異構酶II且具有DNA插入活性，諸如(但不限於)蒽環黴素(阿克拉黴素、道諾黴素、小紅莓、表柔比星、伊達比星、胺柔比星(Amrubicin)、吡柔比星、伐柔比星(Valrubicin)、左柔比星)及蒽二酮(米托蒽醌及匹蒽醌(Pixantrone))。

內質網誘導誘導劑之實例包括(但不限於)二甲基-塞內昔布(dimethyl-celecoxib；DMC)、奈非那韋(nelfinavir)、塞內昔布及硼放射增敏劑(亦即萬珂(velcade)(硼替佐米(Bortezomib)))。

基於鉑之化合物之非限制性實例包括卡鉑、順鉑、奈達鉑(Nedaplatin)、奧沙利鉑、四硝酸三鉑、賽特鉑(Satraplatin)、阿羅鉑(Aroplatin)、洛鉑(Lobaplatin)及JM-216 (參見McKeage等人 (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237及通常CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM、CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES，Series Basic and Clinical Oncology, Angioli等人編, 2004中)。

抗代謝劑之非限制性實例包括基於葉酸之抗代謝劑，亦即二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如胺基喋呤、甲胺喋呤及培美曲塞；胸苷酸合成酶抑制劑，諸如雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞；基於嘌呤之抗代謝劑，亦即腺苷脫胺酶抑制劑，諸如噴司他汀；硫代嘌呤，諸如硫鳥嘌呤及巰基嘌呤；鹵化/核糖核苷酸還原酶抑制劑，諸如克拉屈濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、氟達拉濱；或鳥嘌呤/鳥苷：硫代嘌呤，諸如硫鳥嘌呤；或基於嘧啶之抗代謝劑，亦即胞嘧啶/胞嘧啶核苷：低甲基化劑，諸如阿紮胞苷及地西他濱(Decitabine)；DNA聚合酶抑制劑，諸如阿糖胞苷；核糖核苷酸還原酶抑制劑，諸如吉西他濱；或胸腺嘧啶/胸苷：胸苷酸合成酶抑制劑，諸如氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU之等效物包括前藥、類似物及其衍生物，諸如5'-脫氧-5-氟尿苷(多西弗定(doxifluoroidine))、1-四氫呋喃基-5-氟尿嘧啶(替加氟(ftorafur))、卡培他濱(截瘤達(Xeloda))、S-I (MBMS-247616，由喃氟啶及兩種調節劑(5-氯-2,4-二羥基吡啶及氧嗪酸鉀)組成)、雷替曲噻(ralititrexed)(拓優得(tomudex))、諾拉曲特(nolatrexed)(賽米他(Thymitaq)，AG337)、LY231514及ZD9331，如例如Papamicheal (1999) The Oncologist 4:478-487中所描述。

長春鹼之實例包括(但不限於)長春鹼、長春新鹼、長春氟寧(Vinflunine)、長春地辛及長春瑞賓。

紫杉烷之實例包括(但不限於)多西他賽、拉洛他賽(Larotaxel)、奧他賽(Ortataxel)、太平洋紫杉醇及替司他賽(Tesetaxel)。埃坡黴素之實例為伊沙匹隆(iabepilone)。

酶抑制劑之實例包括(但不限於)法呢基轉移酶抑制劑(替法米布(Tipifamib))；CDK抑制劑(阿昔迪布(Alvocidib)、塞利希布(Seliciclib))；蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)；磷酸二酯酶抑制劑(阿那格雷(Anagrelide)；咯利普蘭(rolipram))；IMP脫氫酶抑制劑(噻唑呋林(Tiazofurine))；及脂肪加氧酶抑制劑(馬索羅酚(Masoprocol))。受體拮抗劑之實例包括(但不限於)ERA (阿曲生坦(Atrasentan))；類視黃素X受體(貝瑟羅汀(Bexarotene))；及性類固醇(睾內酯)。

治療性抗體之實例包括(但不限於)抗HER1/EGFR (西妥昔單抗、帕尼單抗)、抗HER2/neu (erbB2)受體(曲妥珠單抗)；抗EpCAM (卡托莫西單抗(Catumaxomab)、依決洛單抗(Edrecolomab))、抗VEGF-A (貝伐珠單抗)；抗CD20 (利妥昔單抗、托西莫單抗、異貝莫單抗)；抗CD52 (阿侖單抗)；及抗CD33 (吉妥珠單抗)。美國專利案第5,776,427號及第7,601,355號。

酪胺酸激酶抑制劑之實例包括(但不限於)ErbB抑制劑：HER1/EGFR (埃羅替尼、吉非替尼(Gefitinib)、拉帕替尼、凡德他尼(Vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、來那替尼(Neratinib))；HER2/neu (拉帕替尼、來那替尼)；III類RTK：C-kit (阿西替尼(Axitinib)、舒尼替尼、索拉非尼(Sorafenib))、FLT3 (來他替尼(Lestaurtinib))、PDGFR (阿西替尼、舒尼替尼、索拉非尼)；及VEGFR (凡德他尼、司馬沙尼(Semaxanib)、西地尼布(Cediranib)、阿西替尼、索拉非尼)；bcr-abl (伊馬替尼、尼羅替尼(Nilotinib)、達沙替尼(Dasatinib))；Src (伯舒替尼(Bosutinib))及Janus激酶2 (來他替尼(Lestaurtinib))。

可連接至本發明之含有親和體之多肽之化學治療劑亦可包括安吖啶、曲貝替定(Trabectedin)、類視黃素(亞利崔托寧(Alitretinoin)、維甲酸(Tretinoin))、三氧化二砷、天冬醯胺耗盡劑天冬醯胺酶/培門冬酶)、塞內昔布、地美可辛、艾利莫耳(Elesclomol)、依沙蘆星(Elsamitrucin)、依託格魯、氯尼達明、胺甲硫蒽酮(Lucanthone)、丙脒腙、米托坦、奧利默森(Oblimersen)、坦羅莫司(Temsirolimus)及伏立諾他(Vorinostat)。

可與本發明之含有親和體之多肽連接、接合或相關聯之特異性治療劑之實例為氟氧頭孢(flomoxef)；福提黴素(fortimicin)；慶大黴素(gentamicin)；葡糖碸苯丙碸(glucosulfone solasulfone)；短桿菌素S (gramicidin S)；短桿菌素(gramicidin)；格帕沙星(grepafloxacin)；胍甲四環素(guamecycline)；海他西林(hetacillin)；異帕米星(isepamicin)；交沙黴素(josamycin)；卡那黴素(kanamycin)；氟氧頭孢(flomoxef)；福提黴素；慶大黴素；葡糖碸苯丙碸；短桿菌素S；短桿菌素；格帕沙星；胍甲四環素；海他西林；異帕米星；交沙黴素；卡那黴素；桿菌肽(bacitracin)；斑伯黴素(bambermycin)；比阿培南(biapenem)；溴莫普林(brodimoprim)；布替羅星(butirosin)；卷麯黴素(capreomycin)；卡本西林(carbenicillin)；嘉寶黴素(carbomycin)；卡蘆莫南(carumonam)；頭孢羥胺苄(cefadroxil)；頭孢孟多(cefamandole)；頭孢曲秦(cefatrizine)；頭孢拉宗(cefbuperazone)；頭孢克定(cefclidin)；頭孢地尼(cefdinir)；頭孢托侖(cefditoren)；頭孢吡肟(cefepime)；頭孢他美(cefetamet)；頭孢克肟(cefixime)；頭孢甲肟(cefinenoxime)；頭孢米諾(cefininox)；克拉屈濱(cladribine)；阿帕西林(apalcillin)；阿哌環素(apicycline)；安普黴素(apramycin)；阿貝卡星(arbekacin)；阿撲西林(aspoxicillin)；疊氮氯黴素(azidamfenicol)；氨曲南(aztreonam)；頭孢地嗪(cefodizime)；頭孢尼西(cefonicid)；頭孢哌酮(cefoperazone)；頭孢雷特(ceforamide)；頭孢噻肟(cefotaxime)；頭孢替坦(cefotetan)；頭孢替安(cefotiam)；頭孢唑蘭(cefozopran)；頭孢咪唑(cefpimizole)；頭孢匹胺(cefpiramide)；頭孢匹羅(cefpirome)；頭孢丙烯(cefprozil)；頭孢沙定(cefroxadine)；頭孢特侖(cefteram)；頭孢布烯(ceftibuten)；頭孢唑喃(cefuzonam)；頭孢力新(cephalexin)；頭孢來星(cephaloglycin)；頭孢菌素C(cephalosporinC)；頭孢拉定(cephradine)；氯黴素(chloramphenicol)；氯四環素(chlortetracycline)；克林沙星(clinafloxacin)；克林黴素(clindamycin)；羥甲金黴素(clomocycline)；可利斯汀(colistin)；環青黴素(cyclacillin)；氨苯碸(dapsone)；去甲金黴素(demeclocycline)；地百里碸(diathymosulfone)；地貝卡星(dibekacin)；雙氫鏈黴素(dihydrostreptomycin)；6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)；硫鳥嘌呤；卡培他濱；多西他賽(docetaxel)；依託泊苷；吉西他濱；拓樸替康；長春瑞濱；長春新鹼；長春鹼；替尼泊苷；美法侖；甲胺喋呤；2-對硫烷基苯胺基乙醇(2-p-sulfanilyanilinoethanol)；4,4'-二胺二苯碸(4,4'-sulfinyldianiline)；4-對胺苯磺醯胺基水楊酸(4-sulfanilamidosalicylicacid)；布托啡諾(butorphanol)；納布啡(nalbuphine)；鏈脲黴素(streptozocin)；小紅莓；道諾黴素；普卡黴素；伊達比星；絲裂黴素C(mitomycinC)；噴司他汀；米托蒽醌；阿糖胞苷(cytarabine)；磷酸氟達拉濱(fludarabinephosphate)；布托啡諾；納布啡；鏈脲黴素；小紅莓；道諾黴素；普卡黴素；伊達比星；絲裂黴素C；噴司他汀；米托蒽醌；阿糖胞苷；磷酸氟達拉濱；乙地碸(acediasulfone)；乙醯碸(acetosulfone)；阿米卡星(amikacin)；兩性黴素B (amphotericinB)；安比西林(ampicillin)；阿托伐他汀(atorvastatin)；依那普利(enalapril)；雷尼替丁(ranitidine)；環丙沙星(ciprofloxacin)；普伐他汀(pravastatin)；克拉黴素(clarithromycin)；環孢素(cyclosporin)；法莫替丁(famotidine)；亮丙立德(leuprolide)；阿昔洛韋(acyclovir)；太平洋紫杉醇；阿奇黴素(azithromycin)；拉米夫定(lamivudine)；布地奈德(budesonide)；沙丁胺醇(albuterol)；茚地那韋(indinavir)；二甲雙胍(metformin)；阿侖膦酸鹽(alendronate)；尼紮替丁(nizatidine)；齊多夫定(zidovudine)；卡鉑(carboplatin)；美托洛爾(metoprolol)；阿莫西林(amoxicillin)；雙氯芬酸(diclofenac)；賴諾普利(lisinopril)；頭孢曲松(ceftriaxone)；卡托普利(captopril)；沙美特羅(salmeterol)；羥萘甲酸鹽(xinafoate)；亞胺培南(imipenem)；西司他汀(cilastatin)；貝那普利(benazepril)；頭孢克洛(cefaclor)；頭孢他啶(ceftazidime)；嗎啡鹼(morphine)；多巴胺(dopamine)；卡馬風(bialamicol)；氟伐他汀(fluvastatin)；非那米丁(phenamidine)；鬼臼酸2-乙肼(podophyllinicacid 2-ethylhydrazine)；吖啶黃素(acriflavine)；氯阿唑丁(chloroazodin)；阿斯凡納明(arsphenamine)；阿米立德(amicarbilide)；胺基喹脲(aminoquinuride)；喹那普利(quinapril)；羥嗎啡酮(oxymorphone)；丁基原啡因(buprenorphine)；氟尿苷(floxuridine)；地紅黴素(dirithromycin)；多西環素(doxycycline)；依諾沙星(enoxacin)；恩維黴素(enviomycin)；依匹西林(Epicillin)；紅黴素(erythromycin)；白黴素(leucomycin)；林可黴素(lincomycin)；洛美沙星(lomefloxacin)；魯斯黴素(lucensomycin)；賴甲環素(lymecycline)；甲氯環素(meclocycline)；美羅培南(meropenem)；美他環素(methacycline)；小諾黴素(micronomicin)；麥迪黴素(midecamycin)；米諾環素(minocycline)；拉氧頭孢(moxalactam)；莫匹羅星(mupirocin)；那氟沙星(nadifloxacin)；納他黴素(natamycin)；新黴素(neomycin)；奈替米星(netilmicin)；諾氟沙星(norfloxacin)；竹桃黴素(oleandomycin)；土黴素(oxytetracycline)；對磺胺醯基苄胺(p-sulfanilylbenzylamine))；帕尼培南(panipenem)；巴龍黴素(paromomycin)；帕珠沙星(pazufloxacin)；青黴素N(penicillin N)；匹哌環素(pipacycline)；吡哌酸(pipemidicacid)；多黏菌素(polymyxin)；伯黴素(primycin)；喹那西林(quinacillin)；核糖黴素(ribostamycin)；利福醯胺(rifamide)；利福平(rifampin)；利福黴素SV (rifamycin SV)；利福噴丁(rifapentine)；利福昔明(rifaximin)；瑞斯托黴素(ristocetin)；利替培南(ritipenem)；羅地黴素(rokitamycin)；羅利環素(rolitetracycline)；羅沙米星(rosaramycin)；羅紅黴素(roxithromycin)；柳氮磺嘧啶(salazosulfadimidine)；山環素(sancycline)；西索米星(sisomicin)；司帕沙星(sparfloxacin)；大觀黴素(spectinomycin)；螺旋黴素(spiramycin)；鏈黴素(streptomycin)；磺胺柯定(succisulfone)；琥珀胺苯碸(sulfachrysoidine)；磺胺洛西酸(sulfaloxicacid)；磺胺柯衣定(sulfamidochrysoidine)；對胺基苯磺酸(sulfanilic acid)；索發克松(sulfoxone)；替考拉寧(teicoplanin)；替馬沙星(temafloxacin)；替莫西林(temocillin)；四氧普林(tetroxoprim)；甲碸黴素(thiamphenicol)；噻唑碸(thiazolsulfone)；硫鏈絲菌素(thiostrepton)；替卡西林(ticarcillin)；替吉莫南(tigemonam)；托普黴素(tobramycin)；妥舒沙星(tosufloxacin)；甲氧苄啶(trimethoprim)；妥布黴素(trospectomycin)；曲伐沙星(trovafloxacin)；結核放線菌素(tuberactinomycin)；萬古黴素(vancomycin)；偶氮絲胺酸(azaserine)；克念菌素(candicidin)；氯苯甘油醚(chlorphenesin)；制皮菌素(dermostatin)；非律平(filipin)；制黴色基素(fungichromin)；甲帕黴素(mepartricin)；制黴菌素(nystatin)；寡黴素(oligomycin)；培里黴素A (perimycin A)；殺結核菌素(tubercidin)；6-氮雜尿苷(6-azauridine)；6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)；阿克拉黴素(aclacinomycin)；安西他賓(ancitabine)；安麯黴素(anthramycin)；阿紮胞苷(azacitadine)；偶氮絲胺酸(azaserine)；博萊黴素(bleomycin)；雙香豆素乙酯(ethylbiscoumacetate)；亞乙基雙香豆素(ethylidenedicoumarol)；伊洛前列素(iloprost)；拉米非班(lamifiban)；他前列烯(taprostene)；噻氯香豆素(tioclomarol)；替羅非班(tirofiban)；胺普立糖(amiprilose)；布西拉明(bucillamine)；胍立莫司(gusperimus)；龍膽酸(gentisicacid)；葡美辛(glucamethacin)；乙二醇水楊酸(glycol salicylate)；甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；甲芬那酸(mefenamic acid)；美沙拉嗪(mesalamine)；尼氟滅酸(niflumic acid)；奧沙拉嗪(olsalazine)；奧沙西羅(oxaceprol)；S-腺苷基甲硫胺酸(S-enosylmethionine)；水楊酸(salicylic acid)；雙水楊酸(salsalate)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；托芬那酸(tolfenamic acid)；洋紅黴素(carubicin)；嗜癌菌素A (carzinophillin A)；氯脲黴素(chlorozotocin)；色黴素(chromomycin)；二甲葉酸(denopterin)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；依達曲沙(edatrexate)；依氟鳥氨酸(eflornithine)；依利銨(elliptinium)；依諾他濱(enocitabine)；表阿黴素(epirubicin)；甘露醇氮芥(mannomustine)；美諾立爾(menogaril)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；莫哌達醇(mopidamol)；黴酚酸(mycophenolicacid)；諾拉黴素(nogalamycin)；橄欖黴素(olivomycin)；培洛黴素(peplomycin)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；潑尼氮芥(prednimustine)；丙卡巴肼(procarbazine)；蝶羅呤(pteropterin)；嘌呤黴素(puromycin)；雷莫司汀(ranimustine)；鏈黑菌素(streptonigrin)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；黴酚酸(mycophenolicacid)；丙考達唑(procodazole)；羅莫肽(romurtide)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))；他克莫司(tacrolimus)；丁胺卡因(butethamine)；苯醇胺(fenalcomine)；羥丁卡因(hydroxytetracaine)；納依卡因(naepaine)；奧索卡因(orthocaine)；匹多卡因(piridocaine)；水楊醇(salicyl alcohol)；3-胺基-4-羥丁酸(3-amino-4-hydroxybutyric acid)；醋氯芬酸(aceclofenac)；阿明洛芬(alminoprofen)；胺芬酸(amfenac)；溴芬酸(bromfenac)；溴柳氯苯胺(bromosaligenin)；布馬地宗(bumadizon)；卡洛芬(carprofen)；雙氯芬酸(diclofenac)；二氟尼柳(diflunisal)；地他唑(ditazol)；恩芬那酸(enfenamic acid)；依託度酸(etodolac)；依託芬那酯(etofenamate)；芬度柳(fendosal)；非普地醇(fepradinol)；氟滅酸(flufenamic acid)；拓優得(Tomudex)(N-[[5-[[(1,4-二氫-2-甲基-4-側氧基-6-喹唑啉基)甲基]甲基胺基]-2-噻吩基]羰基]-L-麩胺酸)、曲美沙特(trimetrexate)，殺結核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，長春地辛(vindesine)，佐柔比星(zorubicin)；阿加曲班(argatroban)；雙香豆素醚(coumetarol)或雙香豆素(dicoumarol)。

在一些實施例中，親和體試劑包括結合型細胞毒性因子，諸如白喉毒素、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質及化合物(例如脂肪酸)、康乃馨蛋白質、美洲商陸蛋白質(Phytoiacca americana protein)PAPI 、PAPII及PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素(phenomycin)及伊諾黴素(enomycin)。

可使用此項技術中已知的任何用於使抗體及其他蛋白質結合之方法產生本發明之結合物，包括由Hunter等人, (1962) Nature 144:945；David等人, (1974) Biochemistry 13:1014；Pain等人, (1981) J. Immunol. Meth. 40:219；及Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407所描述之方法。用於使肽、多肽以及有機及無機部分與抗體及其他蛋白質結合之方法為此項技術中習知及極熟知的，且易於經調適以用於產生標的親和體試劑之此等版本。

當結合部分為肽或多肽時，該部分可與含有親和體之多肽化學交聯，或可作為具有含有親和體之多肽之融合蛋白質之一部分而包括。且說明性實例將為白喉毒素-親和體融合蛋白質。在非肽實體之情況下，對含有親和體之多肽之添加將通常借助於與含有親和體之多肽之化學結合，諸如經由胺基酸側鏈上之官能基或多肽之C端處之羧基或N端末端處之胺基。在一些實施例中，無論是否為融合蛋白質或化學交聯部分，結合部分將包括一或多個可由酶裂解之位點或以其他方式對環境條件(諸如pH值)敏感，該環境條件允許結合部分自含有親和體之多肽釋放，諸如在腫瘤或其他患病組織(或在結合部分發揮功能以保護健康組織之情況下，待保護之組織)中。

IV. 表現方法及系統 本文中所描述之重組型親和體試劑蛋白質可藉由此項技術中已知的任何適合的方法產生。此類方法之範圍為直接蛋白質合成方法至構築編碼多肽序列之DNA序列及在適合的宿主中表現此等序列。對於此等包括其他修飾(諸如化學修飾或結合)之重組型親和體試劑蛋白質，重組型親和體試劑蛋白質可在自宿主細胞分離或化學合成之後經進一步化學或酶促操作。

本發明包括重組型方法及用於以重組方式表現本發明之重組型親和體試劑蛋白質之核酸，其包含(i)將編碼該親和體試劑之胺基酸序列之聚核苷酸引入宿主細胞中，例如其中聚核苷酸位於載體中及/或可操作地連接至啟動子；(ii)在有利於表現聚核苷酸之條件下培養宿主細胞(例如真核或原核)，及(iii)視情況地，自宿主細胞及/或其中生長宿主細胞之培養基分離親和體試劑。參見例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。

在一些實施例中，可使用寡核苷酸合成器藉由化學合成來構築編碼相關重組型親和體試劑蛋白質之DNA序列。寡核苷酸可基於所需多肽之胺基酸序列且選擇在將產生相關重組型多肽之宿主細胞中有利的此等密碼子設計。可應用標準方法來合成編碼經分離之相關多肽之聚核苷酸序列。舉例而言，可使用完整胺基酸序列構築回復轉譯之基因。此外，可合成含有編碼特定經分離之多肽之核苷酸序列的DNA寡聚物。舉例而言，可合成編碼所需多肽之各部分的若干小型寡核苷酸且接著接合。個別寡核苷酸通常含有5'或3'突出物以用於互補組裝。

在獲得編碼本發明該重組型親和體試劑蛋白質之核酸序列之後，可使用此項技術中熟知的技術藉由重組型DNA技術產生用於產生重組型親和體試劑蛋白質之載體。可使用熟習此項技術者熟知之方法構築含有重組型親和體試劑編碼序列及適合的轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括例如活體外重組型DNA技術、合成技術及活體內基因重組(參見例如Sambrook等人, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.及Ausubel等人編, 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY中所描述之技術)。

可藉由習知技術(例如電致孔、脂質轉染及磷酸鈣沈澱)將包含重組型親和體試劑蛋白質之核苷酸序列之表現載體轉移至宿主細胞且接著藉由習知技術培養經轉染之細胞以產生本發明之重組型親和體試劑蛋白質。在特定實施例中，藉由組成性、誘導性或組織特異性啟動子調節重組型親和體試劑蛋白質之表現。

表現載體可包括複製起點，諸如可基於用於表現之宿主細胞之類型選擇。作為實例，來自質體pBR322 (產品號303-3s，New England Biolabs, Beverly, Mass.)之複製起點適用於大部分革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)，而來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、囊泡口炎病毒(VSV)或乳突狀瘤病毒(諸如HPV或BPV)之各種起點適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。通常，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(例如通常使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。

載體可包括一或多種可選標記基因，例如編碼在選擇性培養基中生長之宿主細胞之存活及生長所必需的蛋白質之基因元件。典型選擇標記基因編碼以下蛋白質：(a)賦予原核宿主細胞對抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、四環素或卡那黴素)之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷；或(c)供應不可自複合培養基獲得之關鍵營養物。較佳可選擇標記為卡那黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。新黴素抗性基因亦可用於原核與真核宿主細胞中之選擇。其他選擇基因可用於擴增待表現之基因。擴增為其中基因在重組細胞之連續後代之染色體內以串聯方式複製之過程，其中在產生對於生長而言重要之蛋白質方面對該等基因之需求更大。哺乳動物細胞之可選標記之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及胸苷激酶。將哺乳動物細胞轉型體置放在選擇壓力下，其中僅轉型體借助於存在於載體中之標記獨特地適應得以存活。藉由在其中培養基中之選擇劑之濃度連續變化，籍此引起選擇基因及編碼重組型親和體試劑蛋白質之DNA之擴增的條件下培養經轉型之細胞來施加選擇壓力。因此，由經擴增之DNA合成增加之量之重組型親和體試劑蛋白質。

載體亦可包括一或多個核糖體結合位點，其將轉錄至包括重組型親和體試劑蛋白質之編碼序列之mRNA中。舉例而言，此類位點之特徵在於Shine-Dalgarno序列(原核細胞)或Kozak序列(真核生物)。該元件通常位於啟動子之3'及待表現之多肽的編碼序列之5'。Shine-Dalgarno序列為變化的，但通常為多嘌呤(具有高A-G含量)。已鑑別許多Shine-Dalgarno序列，其各自可使用上述方法容易地合成且用於原核載體中。

表現載體將通常含有啟動子，其由宿主生物體識別且可操作地連接至編碼重組型親和體試劑蛋白質之核酸分子。可視用於表現之宿主細胞及所需產率而定來使用原生或異源啟動子。

可與原核宿主一起使用之啟動子包括β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統；鹼性磷酸酶，一種色胺酸(trp)啟動子系統；及雜合啟動子，諸如tac啟動子。其他已知細菌啟動子亦係適合的。其序列已公開，且其可視需要使用連接子或銜接子接合至所需核酸序列以提供限制位點。

可與酵母宿主一起使用之啟動子亦為此項技術中已知的。酵母增強子有利地與酵母啟動子一起使用。適合與哺乳動物宿主細胞一起使用之啟動子為熟知的且包括自諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳猴病毒40 (SV40)之病毒的基因組獲得之啟動子。其他適合的哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。

可用於表現本發明之選擇性結合子之其他啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子區域(Bernoist及Chambon, Nature, 290:304-310, 1981)；CMV啟動子；勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中所含的啟動子(Yamamoto等人, (1980), Cell 22: 787-97)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人, (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5)；金屬硫蛋白基因之調節序列(Brinster等人, Nature, 296; 39-42, 1982)；原核表現載體，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978)；或tac啟動子(DeBoer等人, (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5)。亦關注以下動物轉錄控制區域，其呈現組織特異性且已用於轉殖基因動物中：彈性蛋白酶I基因控制區，其在胰臟腺泡細胞中具有活性(Swift等人 (1984), Cell 38: 639-46；Ornitz等人 (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409；MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515)；胰島素基因控制區，其在胰臟β細胞中具有活性(Hanahan (1985), Nature 315: 115-22)；免疫球蛋白基因控制區，其在淋巴細胞中具有活性(Grosschedl等人 (1984), Cell 38; 647-58；Adames等人 (1985), Nature 318; 533-8；Alexander等人 (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44)；小鼠乳房腫瘤病毒控制區，其在睪丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具有活性(Leder等人 (1986), Cell 45: 485-95)；白蛋白基因控制區，其在肝臟中具有活性(Pinkert等人 (1987), Genes and Devel. 1: 268-76)；α胎蛋白基因控制區，其在肝臟中具有活性(Krumlauf等人 (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48；Hammer等人 (1987), Science, 235: 53-8)；α1-抗胰蛋白酶基因控制區，其在肝臟中具有活性(Kelsey等人 (1987), Genes and Devel. 1: 161-71)；β-血球蛋白基因控制區，其在骨髓細胞中具有活性(Mogram等人, Nature, 315 338-340, 1985；Kollias等人 (1986), Cell 46: 89-94)；髓鞘鹼性蛋白基因控制區，其在腦部中之寡樹突神經膠細胞中具有活性(Readhead等人 (1987), Cell, 48: 703-12)；肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區，其在骨胳肌中具有活性(Sani (1985), Nature, 314: 283-6)；及促性腺釋放荷爾蒙基因控制區，其在丘腦下部中具有活性(Mason等人 (1986), Science 234: 1372-8)。

可將強化子序列插入載體中以增加真核宿主細胞中之轉錄。可自哺乳動物基因獲得之若干強化子序列為已知的(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白及胰島素)。然而，通常，將使用來自病毒之強化子。SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子及腺病毒強化子為用於活化真核啟動子之例示性強化元件。

儘管可將強化子在針對多肽編碼區之5'或3'位置處剪接至載體中，但其通常位於自啟動子之5'位點。

用於表現核酸之載體包括與細菌、昆蟲及哺乳動物宿主細胞相容之載體。此類載體尤其包括pCRII、pCR3及pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.)、pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.)、pET15 (Novagen, Madison, Wis.)、pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.)、pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.)、pETL (BlueBacII; Invitrogen)、pDSR-α (PCT公開案第WO 90/14363號)及pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.)。

其他可能的載體包括(但不限於)黏質體、質體或經修飾之病毒，但載體系統必須與所選擇之宿主細胞相容。此類載體包括(但不限於)質體，諸如Bluescript®質體衍生物(基於高複本數ColEl之噬菌粒，Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.)、經設計以用於選殖Taq擴增之PCR產物之PCR選殖質體(例如TOPO™. TA Cloning® Kit, PCR2.1 plasmid derivatives, Invitrogen, Carlsbad, Calif.)及哺乳動物、酵母或病毒載體，諸如桿狀病毒表現系統(pBacPAK質體衍生物，Clontech, Palo Alto, Calif.)。可經由轉型、轉染、感染、電致孔或其他已知技術將重組型分子引入宿主細胞中。

作為用於本文中所揭示之重組型親和體試劑蛋白質之表現的真核及原核宿主細胞(包括哺乳動物細胞)為此項技術中熟知的且包括可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)獲得之許多永生化細胞株。此等細胞株尤其包括中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及許多其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。尤其較佳之細胞株係經由確定何種細胞株具有高表現量來選擇。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9細胞、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。真菌細胞包括酵母及絲狀真菌細胞，包括例如甲醇酵母(Pichia pastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、考拉姆畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小畢赤酵母(Pichia minuta) (甲醇誘導型酵母(Ogataea minuta)、林氏畢赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、千屈菜畢赤酵母(Pichia salictaria)、松櫟畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普氏畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母屬(Saccharomyces sp.)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、里氏木菌(Trichoderma reesei)、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮孢菌(Fusarium gramineum)、鐮孢黴(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)及粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa)、畢赤酵母屬，任何酵母屬、多形漢遜酵母、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌、任何麴菌屬(Aspergillus sp.)、里氏木菌、金孢子菌、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)及粗厚神經胞子菌。

多種宿主表現載體系統可用於表現本發明之重組型親和體試劑蛋白質。此類宿主表現系統表示可用於產生及接著純化重組型親和體試劑蛋白質之編碼序列之媒劑，但亦表示在經適合的核苷酸編碼序列轉型或轉染時可就地表現本發明之重組型親和體試劑蛋白質之細胞。此等包括(但不限於)經含有親和體試劑蛋白質編碼序列之重組型噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型之微生物，諸如細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌(B. subtilis))；經含有親和體試劑蛋白質編碼序列之重組型酵母表現載體轉型之酵母(例如畢赤酵母)；經含有親和體試劑蛋白質編碼序列之重組型病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；經重組型病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus；CμMV)及菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus；TMV))感染或經含有親和體試劑蛋白質編碼序列之重組型質體表現載體(例如Ti質體)轉型之植物細胞系統；或具有重組型表現構築體之哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、淋巴細胞(參見美國專利案第5,807,715號)、Per C.6細胞(由Crucell研發之大鼠視網膜細胞))，該等重組型表現構築體含有來源於哺乳動物細胞之基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)之啟動子。

在細菌系統中，可有利地視意欲用於所表現之重組型親和體試劑蛋白質之用途而選擇多種表現載體。舉例而言，當需要產生大量此類蛋白質時，對於產生重組型親和體試劑蛋白質之醫藥組合物，可能需要引導大量易於純化之融合蛋白質產物之表現之載體。此類載體包括(但不限於)大腸桿菌表現載體pUR278 (Ruther等人 (1983) 「Easy Identification Of cDNA Clones」, EMBO J. 2:1791-1794)，其中親和體試劑蛋白質編碼序列可個別地接合至具有lac Z編碼區之框內載體中以產生融合蛋白質；pIN載體(Inouye等人 (1985) "Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509)；及其類似物。pGEX載體亦可用於將外源多肽表現為具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白質。一般而言，此類融合蛋白質為可溶的，且可藉由吸附及結合於基質麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒，隨後在游離麩胱甘肽存在下溶離而容易地自溶解細胞純化。pGEX載體經設計以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，使得可自GST部分釋放經選殖之目標基因產物。

在昆蟲系統中，使用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)作為載體來表現外源基因。病毒生長於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞中。可個別地將親和體試劑蛋白質編碼序列選殖至病毒之非非必需區域(例如多角體蛋白基因)中且置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)之控制下。

在哺乳動物宿主細胞中，可利用多種基於病毒之表現系統。在使用腺病毒作為表現載體之情況下，相關親和體試劑蛋白質編碼序列可接合至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三聯前導序列。接著可藉由活體外或活體內重組合將此嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組之非必需區域(例如區域E1或E3)中將在受感染之宿主中產生活的且能夠表現免疫球蛋白分子之重組型病毒(參見例如參見Logan等人 (1984) 「Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659)。亦可能需要特異性起始信號以用於所插入之親和體試劑蛋白質編碼序列之有效轉譯。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必須與所需編碼序列之閱讀框架同相，以確保整個插入物之轉譯。此等外源性轉譯控制信號及起始密碼子可為多種來源，天然及合成兩者。可藉由包含適合的轉錄強化子元件、轉錄終止子等來增強表現效率(參見Bitter等人 (1987) 「Expression And Secretion Vectors For Yeast」, Methods in Enzymol. 153:516-544)。

此外，可選擇調節插入序列之表現或以所需特定方式修飾及處理基因產物的宿主細胞品系。蛋白質產物之此類修飾(例如糖基化)及處理(例如裂解)對該蛋白質之功能而言可為重要的。不同宿主細胞具有蛋白質及基因產物之轉譯後處理及修飾的特徵及特定機制。可選擇適合的細胞株或宿主系統以確保所表現之外源蛋白質之正確修飾及處理。為此目的，可使用具有適當處理基因產物之初級轉錄、糖基化及磷酸化的細胞機制之真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括(但不限於)CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20及T47D、CRL7030及Hs578Bst。

為長期高產率產生重組型蛋白質，希望穩定表現。舉例而言，可工程改造穩定表現本發明之抗體之細胞株。宿主細胞可用由適合的表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記轉型，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。在引入外源DNA之後，可使經工程改造之細胞在富集培養基中生長1-2天，且接著轉換成選擇性培養基。重組型質體中之可選標記賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長以形成變異區(foci)，該等變異區又可選殖及擴增至細胞株中。此方法可有利地用於工程改造表現本發明之重組型親和體試劑蛋白質之細胞株。此類經工程改造之細胞株可尤其適用於篩選及評估直接地或間接地與重組型親和體試劑蛋白質相互作用之化合物。

可使用多種選擇系統，包括(但不限於)單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人 (1977) 「Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells」, Cell 11:223-232)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska等人 (1962) 「Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人 (1980) 「Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene」, Cell 22:817-823)基因可分別用於tk、hgprt或aprt細胞。又，可使用抗代謝物抗性作為選擇以下基因之依據：dhfr，其賦予對甲胺喋呤之抗性(Wigler等人 (1980) 「Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570；O'Hare等人 (1981) 「Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531)；gpt，其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan等人 (1981) 「Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076)；neo，其賦予對胺基糖苷G-418之抗性(Tachibana等人 (1991) 「Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV.2-Neo Gene」, Cytotechnology 6(3):219-226；Tolstoshev (1993) 「Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions」, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan (1993) 「The Basic Science Of Gene Therapy」, Science 260:926-932；及Morgan等人 (1993) 「Human gene therapy」, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217)。可使用之重組型DNA技術領域中通常已知的方法描述於Ausubel等人(編), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY；及第12及13章, Dracopoli等人(編), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.；Colbere-Garapin等人 (1981) 「A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells」, J. Mol. Biol. 150:1-14中；及hygro，其賦予對潮黴素之抗性(Santerre等人 (1984) 「Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells」, Gene 30:147-156)。

可藉由載體擴增來增加重組型親和體試劑蛋白質之表現量(關於綜述，參見Bebbington及Hentschel, 「The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells」, DNA CLONING, 第3卷. (Academic Press, New York, 1987))。當表現重組型親和體試劑蛋白質之載體系統中的標記可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的含量之增加將使標記基因之複本數目增加。因為經擴增之區域與重組型親和體試劑蛋白質之核苷酸序列相關聯，重組型親和體試劑蛋白質之產量亦將增加(Crouse等人 (1983) 「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes」, Mol. Cell. Biol. 3:257-266)。

當親和體試劑為親和體抗體融合物或其他多蛋白複合物時，宿主細胞可與兩種表現載體一起共轉染，例如編碼重鏈之第一載體及編碼輕鏈衍生之多肽之第二載體，其中一者或兩者包括親和體多肽編碼序列。兩種載體可含有相同可選標記，其實現重鏈及輕鏈多肽之相等表現。或者，可使用編碼重鏈及輕鏈多肽之單一載體。在此等情形下，輕鏈應置放於重鏈之前以避免過量毒性游離重鏈(Proudfoot (1986) 「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes」, Nature 322:562-565；Kohler (1980) 「Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199)。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。

通常，在特定細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白將具有為細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，重組型親和體試劑蛋白質之特定糖基化模式將取決於用於產生蛋白質之特定細胞株或轉殖基因動物。在親和體/抗體融合物之一些實施例中，僅包含非海藻糖基化N-聚醣之糖基化模式可為有利的，因為在抗體之情況下，已證實此與海藻糖基化對應物相比活體外及活體內典型地呈現更強功效(參見例如Shinkawa等人, J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)；美國專利案第6,946,292號及第7,214,775號)。

此外，來自產生細胞株之親和體試劑之表現可使用多種已知技術增強。舉例而言，麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)為用於增強在某些條件下之表現之常用方法。完全或部分與歐洲專利案第0216846號、第0256055號及第0323997號以及歐洲專利申請案第89303964.4號論述GS系統。因此，在本發明之一些實施例中，哺乳動物宿主細胞(例如CHO)缺乏麩醯胺酸合成酶基因且在培養基中在不存在麩醯胺酸之情況下生長，然而其中編碼免疫球蛋白鏈之聚核苷酸包含麩醯胺酸合成酶基因，其補償宿主細胞中之基因不足。如本文所論述之此類含有結合子或聚核苷酸或載體之宿主細胞以及如本文所論述之用於使用此類宿主細胞製備結合子之表現方法為本發明之一部分。

昆蟲細胞培養物系統(例如桿狀病毒)中重組型蛋白質之表現亦提供用於產生正確摺疊及生物功能性蛋白質之穩定方法。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質之桿狀病毒系統為熟習此項技術者熟知的。

可根據任何適合的方法純化藉由經轉型之宿主產生之重組型親和體試劑蛋白質。標準方法包括層析(例如離子交換、親和性及篩分管柱層析)、離心、差異溶解性或用於蛋白質純化的任何其他標準技術。諸如六組胺酸、麥芽糖結合域、流感包膜序列及麩胱甘肽-S-轉移酶之親和性標籤可連接至蛋白質，以允許藉由通過適合的親和性管柱而易於純化。經分離之蛋白質亦可使用諸如蛋白水解、質譜(MS)、核磁共振(NMR)、高效液相層析(HPLC)及x射線結晶之技術以物理方式表徵。

在一些實施例中，可例如藉由最初自細胞集結粒提取，接著進行一或多個濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟來在細菌培養物中產生重組型親和體試劑蛋白質。HPLC可用於最終純化步驟。在重組型蛋白質表現中所使用之微生物細胞可藉由任何適宜方法，包括凍融循環、音波處理、機械破壞或使用細胞溶解劑來破壞。

V. 用於活體內遞送之經編碼之親和體 用於遞送治療性親和體試劑蛋白質(諸如PD-L1親和體試劑)之替代性方法為保持由身體本身產生治療性多肽。許多臨床研究已說明使用多種不同遞送系統將基因活體內轉移至細胞中之效用。活體內基因轉移試圖向患者投與經編碼之親和體核苷酸序列，而非親和體試劑。此使得患者之身體能夠長期產生相關治療性親和體試劑，及視產生位點而全身性或局部分泌相關治療性親和體試劑。基於基因之經編碼之親和體可呈現親和體試劑之多肽版本之習知產生、純化及投藥之有勞動力及成本效益之替代物。已活體內實行多種適於遞送經編碼之親和體之抗體表現平台：此等平台包括病毒載體、裸DNA及RNA。經編碼之親和體基因轉移不僅藉由降低產品及產生成本來節省成本，且亦能夠降低藥物投藥頻率。總體而言，藉由經編碼之親和體之表現進行治療性親和體試劑之長期活體內產生可有助於(i)在代價敏感性條件下親和體試劑之更廣泛的治療性或預防性應用，(ii)在發達及發展中國家中經改良之療法可行性，及(iii)更有效及負擔得起的治療模式。除活體內基因轉移以外，可自宿主(或供體)收集細胞，用經編碼之親和體序列工程改造以產生親和體試劑且再向患者投與。

已最廣泛地評估肌肉內抗體基因投藥(評述於Deal等人 (2015) 「Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy」 Curr Opin Immunol. 35:113-22.中)，且在施用於經編碼之親和體時亦具有最高臨床轉譯能力及應用。實情為，骨胳肌之固有解剖學、細胞及生理學特性使其成為用於長期經編碼之親和體表現及全身循環之穩定環境。骨骼肌易於到達，允許多次或重複投藥。充足的血管供應提供用於將治療性親和體試劑分泌至循環中之有效遞送系統。肌纖維之融合性質實現核苷酸自有限滲透位點分散至纖維內之許多相鄰細胞核。骨骼肌纖維亦為末端分化細胞，且纖維內之細胞核為後有絲分裂的。因此，宿主基因組中之整合並非實現長期mAb表現之前提條件。肝臟為另一個常用於臨床前抗體基因轉移之位點，且通常經由靜脈內注射來轉染，且亦可為用於局部遞送親和體試劑(諸如在治療肝癌及/或化生中)或產生分泌至血管中以用於全身循環之親和體試劑之經編碼之親和體之基因轉移位點。此器官具有各種生理學功能，包括血漿蛋白質之合成。此器官可尤其良好地適用於活體內經編碼之親和體表現。

腫瘤呈現另一種用於經編碼之親和體轉移之位點，經由靜脈內或直接注射/電致孔來靶向。實情為，瘤內經編碼之親和體表現可實現治療性親和體試劑之局部產生，使得無需在其他情況下滲透及影響實體腫瘤所需的高全身性親和體試劑含量。類似基本原理適用於腦部，其通常在抗體基因轉移之情形下作為目標以避免在血腦屏障遷移中之困難且可能為經編碼之親和體之遞送之目標。參見例如Beckman等人 (2015) 「Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors」 Cancer 109(2):170-9；Dronca等人 (2015) 「Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer, the better」 Clin Cancer Res. 21(5):944-6；及Neves等人 (2016) 「Antibody approaches to treat brain diseases」 Trends Biotechnol. 34(1):36-48。

基因療法之成功主要由非病毒及病毒基因轉移載體中之改良促成。已使用物理及化學非病毒方法之陣列以將DNA及mRNA轉移至哺乳動物細胞中且已研發許多此等方法作為用於離體及活體內基因療法之臨床階段技術，且易於經調適用於遞送本發明之經編碼之親和體。作為說明，可使用陽離子性脂質體技術，其係基於兩性脂質之能力，具有帶正電頭基及疏水性脂質尾區，以結合於帶負電DNA或RNA及形成通常藉由內飲作用進入細胞之粒子。一些陽離子性脂質體亦含有中性共脂質，認為其可增強哺乳動物細胞之脂質體吸收。參見例如Felgner等人 (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. MNAS 84:7413-7417；San等人 (1983) 「Safety and short term toxicity of a novel cationic lipid formulation for human gene therapy」 Hum. Gene Ther. 4:781-788；Xu等人 (1996) 「Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection」 Biochemistry 35,:5616-5623；及Legendre等人 (1992) 「Delivery of plasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes: comparison with cationic liposomes」 Pharm. Res. 9, 1235-1242。

類似地，其他聚陽離子(諸如聚-l-離胺酸及聚乙烯-亞胺)可用於遞送經編碼之親和體。此等聚陽離子經由裝填相互作用與核酸複合且有助於DNA或RNA縮合成奈米粒子，其由此成為內體介導之吸收之受質。已研發若干種此等陽離子性核酸複合物技術作為潛在臨床產品，包括與質體DNA、寡寡脫氧核苷酸及各種形式之合成RNA之複合物。亦證實經修飾(及未經修飾或「裸」)之DNA及RNA在多種情形中可介導成功的基因轉移且亦可用作用於遞送經編碼之親和體之系統。此等情形包括藉由直接肌肉內注射來使用質體DNA，使用質體DNA之瘤內注射。參見例如Rodrigo等人 (2012) 「De novo automated design of small RNA circuits for engineering synthetic riboregulation in living cells」 PNAS 109:15271-15276；Oishi等人 (2005) 「Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages」 Chembiochem. 6:718-725；Bhatt等人 (2015) 「Microbeads mediated oral plasmid DNA delivery using polymethacrylate vectors: an effectual groundwork for colorectal cancer」 Drug Deliv. 22:849-861；Ulmer等人 (1994) Protective immunity by intramuscular injection of low doses of influenza virus DNA vaccines」 Vaccine 12: 1541-1544；及Heinzerling等人 (2005) 「Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin 12 into patients with metastatic melanoma: clinical efficacy」 Hum. Gene Ther. 16:35-48。

病毒載體當前在絕大部分臨床前及臨床基因療法試驗中用作遞送媒劑且首先批准作為定向基因療法。參見Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017 (abedia.com/wiley/)。其主要驅動物為其優越的基因遞送效率，其反映天然演化發展；病毒載體系統對於基因遞送為有吸引力的，因為病毒已進化出藉由感染穿越細胞膜之能力，籍此將諸如經編碼之親和體之核酸遞送至目標細胞中。由腺病毒系統指導，病毒載體介導之抗體基因轉移領域在過去的十年中取得顯著進步。多種成功評估之投藥途徑、臨床前模型及疾病適應症使得能夠完全顯示抗體基因轉移之功能，由此熟習此項技術者將能夠容易地鑑別及調適抗體基因轉移系統及技術以用於經編碼之親和體構築體之活體內遞送。肌肉成為用於長期mAb表現之所選投藥位點且將類似地成為用於長期親和體試劑表現至適合的目標組織。在載體化瘤內經編碼之親和體基因轉移之情形下，溶瘤病毒具有不同優勢，因為其可特異性靶向腫瘤細胞、增強親和體試劑表現及擴增治療性反應，諸如關於PD-L1親和體試劑。

經編碼之親和體之活體內基因轉移亦可使用非病毒載體(諸如表現質體)實現。非病毒載體易於產生且似乎不誘導特異性免疫反應。肌肉組織最通常用作轉染之目標組織，因為肌肉組織係良好血管化且易於到達，且肌細胞為長期存活的細胞。裸質體DNA之肌肉內注射引起某一百分比之肌細胞之轉染。使用此方法，已活體內引入編碼細胞介素及細胞介素/IgG1嵌合蛋白質之質體DNA且積極地影響(自體免疫)疾病結果。

在一些實例中，為提高經由所謂的血管內遞送進行之轉染效率，其中藉由在靜脈中誘導短暫的高壓來實現增加之基因遞送及表現量。對於此類型之基因遞送，專用血壓袖帶可藉由暫時提高血管壓力來促進局部吸收且可經調適以用於人類患者。參見例如Zhang等人 (2001) 「Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates」 Hum. Gene Ther., 12:427-438。

亦可經由其他技術實現效率提高，諸如其中藉由使用化學載體，即陽離子性聚合物或脂質或經由物理方法，即基因槍遞送或電致孔來改良核酸之遞送。參見Tranchant等人 (2004) 「Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids」 J. Gene Med., 6 (增刊1):S24-S35；及Niidome等人 (2002) 「Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors」 Gene Ther., 9:1647-1652。尤其將電致孔視為用於非病毒基因遞送之相關技術。Somiari等人, (2000) 「Theory andin vivo application of electroporative gene delivery」 Mol. Ther. 2:178-187；及Jaroszeski等人 (1999) 「In vivo gene delivery by electroporation」 Adv. Drug Delivery Rev., 35:131-137。藉由電致孔，將脈衝電流施加至局部組織區域以增強細胞滲透性，引起基因轉移穿越細胞膜。研究表明在進行電致孔情況下之活體內基因遞送效率可比不進行電致孔之情況高至少10-100倍。參見例如Aihara等人 (1998) 「Gene transfer into muscle by electroporationin vivo 」 Nat. Biotechnol. 16:867-870；Mir等人, (1999) 「High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses」 PNAS 96:4262-4267；Rizzuto等人, (1999) 「Efficient and regulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscle electroporation」 PNAS 96: 6417-6422；及Mathiesen (1999) 「Electropermeabilization of skeletal muscle enhances gene transferin vivo 」 Gene Ther., 6:508-514。

經編碼之PD-L1結合親和體可藉由多種通常用於基因療法之基因遞送系統遞送，包括病毒、非病毒或物理。參見例如Rosenberg等人, Science, 242:1575-1578, 1988，及Wolff等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)。用於基因療法之方法及組合物之論述包括Eck等人, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第九版；Hardman等人編, McGraw-Hill, New York, (1996), 第5章, 第77-101頁；Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (增刊1):31-32, 1997；Wivel等人, Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck編, 12(3):483-501, 1998；Romano等人, Stem Cells, 18:19-39, 2000，及其中所引用之參考文獻。美國專利案第6,080,728號亦提供多種基因遞送方法及組合物之論述。遞送途徑包括例如全身性投藥及就地投藥。

有效的經編碼之親和體基因轉移方法必須針對有需要的特定組織/細胞，且所得轉殖基因表現應為適於特定應用之程度。啟動子為載體基因組設計內之主要順式作用元件，其可指示整體表現強度以及細胞特異性。

表 1. 例示性廣泛及細胞特異性啟動子 .

在一些情況下，需要在所有細胞類型中經編碼之親和體構築體之廣泛表現。組成性啟動子，諸如人類延長因子1α-子單元(EF1α)、即刻早期巨細胞病毒(CMV)、雞β-肌動蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖苷酸酶(GUSB)或泛蛋白C (UBC)，可用於促進大部分組織中經編碼之親和體構築體之表現。通常，CBA及CAG促進組成性啟動子中之較大表現；然而，與CMV (約0.8 kbs)或EF1α(約1.2 kbs)相比，其約1.7 kbs之尺寸可能限制在具有封裝限制之載體(諸如AAV)中之用途，尤其在藉由經編碼之親和體構築體之表現產生之親和體試劑較大之情況下。GUSB或UBC啟動子分別可在378 bps及403 bps之較小尺寸下提供廣泛基因表現，但其與CMV或CBA啟動子相比顯著較弱。因此，已進行對組成性啟動子之修飾以降低尺寸而不影響其表現，且諸如CBh (約800 bps)及微型CBA (約800 bps)之實例可促進與所選組織類似或甚至比其更高的表現(Gray等人, Hum Gene Ther. 2011 22:1143-1153)。

當經編碼之親和體構築體之表現應受限於器官內之某些細胞類型時，可使用啟動子介導此特異性。舉例而言，在神經系統內，已使用啟動子限制針對神經元、星形膠質細胞或寡樹突神經膠質細胞之表現。在神經元中，神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子與廣泛啟動子相比驅動更強的表現。此外，與NSE相比，血小板衍生之生長因子B-鏈(PDGF-β)、突觸蛋白(Syn)及甲基-CpG結合蛋白質2 (MeCP2)啟動子可在較低量下驅動神經元特異性表現。在星形膠質細胞中，膠質原纖維酸性蛋白(GFAP，2.2 kbs)啟動子之680 bps長的縮短版本[gfaABC(1)D]可提供更高的表現量，具有與GFAP啟動子相同的星形膠質細胞特異性。亦可藉由選擇髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子來實現靶向寡樹突神經膠質細胞，該啟動子之表現受限於此膠細胞；然而，其1.9 kbs之尺寸及低表現量限制其用途。

在骨骼肌細胞中表現經編碼之親和體構築體之情況下，基於肌肉肌酸激酶(MCK)及肌間線蛋白(1.7 kbs)之例示性啟動子展示高特異性比率(若需要，則最小表現在肝臟中)。與其他肌肉啟動子相比，α-肌凝蛋白重鏈(α-MHC；1.2 kbs)之啟動子展示顯著心肌特異性(Lee等人, 2011 J Cardiol. 57(1):115-22)。在造血幹細胞中，當分別與EF1α及CMV啟動子(Zhang等人, 2007 Blood. 110(5):1448-57；Koldej 2013 Hum Gene Ther Clin Dev. 24(2):77-85；Dighe等人, 2014 PLoS One. 9(8):e104805.)比較時，證實合成MND啟動子(Li等人, 2010 J Neurosci Methods. 189(1):56-64)及2AUCOE中所含之啟動子(廣泛染色體開放元件)可促進所有細胞譜系中之較高轉殖基因表現。相反，在載體介導之基因轉移之後，已證實使用限制僅針對肝細胞之表現之啟動子可降低系統中作為風險之轉殖基因特異性免疫反應，且甚至誘導對經表現之蛋白質之免疫耐受性(Zhang等人, 2012 Hum Gene Ther. 23(5):460-72)，其對於某些親和體試劑可能為有利的。在對其他組織具有最小侵襲之情刻下，α1-抗胰蛋白酶(hAAT；347 bps)及甲狀腺素結合球蛋白(TBG；約400 bps)啟動子驅動受限於肝臟之基因表現(Yan等人, 2012 Gene. 506(2):289-94；Cunningham等人, 2008 Mol Ther. 16(6):1081-8)。

在一些實施例中，通常需要用於控制活體內經編碼之親和體表現之持續時間及量之機制。存在多種誘導性啟動子，其可經調適以與病毒載體化及基於質體DNA之經編碼之親和體基因轉移一起使用。參見Fang等人 (2007) 「An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodiesin vivo 」 Mol Ther. 5(6):1153-9；及Perez等人 (2004) 「Regulatable systemic production of monoclonal antibodies byin vivo muscle electroporation」 Genet Vaccines Ther. 2(1):2。當前處於臨床評估中之例示性可調節機制為藉由小分子配位體活化之基於蛻皮激素之基因開關。Cai等人 (2016) 「Plasma pharmacokinetics of veledimex, a small-molecule activator ligand for a proprietary gene therapy promoter system, in healthy subjects」 Clin Pharmacol Drug Dev. 2016。

在經編碼之親和體構築體之一些實施例中，可使用病毒轉錄後調節元件(PRE)；需要此等順式作用元件以用於無內含子病毒RNA之細胞核輸出(Huang及Yen, 1994 J Virol. 68(5):3193-9；及1995 Mol Cell Biol. 15(7):3864-9)。實例包括HPRE (B型肝炎病毒PRE，533 bps)及WPRE (土拔鼠肝炎病毒PRE，600 bps)，其在某些實例中可使轉殖基因表現量增加達幾乎10倍(Donello等人, 1998 J Virol. 72(6):5085-92)。為了進一步說明，使用慢病毒及AAV載體，發現WPRE可提高CMV啟動子促使之轉殖基因表現，以及增加PPE、PDGF及NSE啟動子促使之轉殖基因表現。WPRE之另一作用可為保護經編碼之親和體構築體轉殖基因避免沉默(Paterna等人, 2000 Gene Ther. 7(15):1304-11；Xia等人, 2007 Stem Cells Dev. 2007年2月; 16(1):167-76)。

經轉錄之經編碼之親和體轉錄物之聚腺苷酸化亦可對於細胞核輸出、轉譯及mRNA穩定性而言為重要的。因此，在一些實施例中，經編碼之親和體構築體將包括聚腺苷酸化信號序列。存在多種研究已確定不同polyA信號對基因表現及mRNA穩定性之影響。例示性聚腺苷酸化信號序列包括SV40 late或牛生長激素polyA (bGHpA)信號序列，以及最小合成polyA (SPA)信號(Levitt等人, 1989 Genes Dev. 3(7):1019-25；Yew等人, 1997 Hum Gene Ther. 1997 8(5):575-84)。藉由位於其他polyA信號上游之SV40 late polyA信號上游強化子(USE)增加聚腺苷酸化效率(Schek等人, 1992 Mol Cell Biol. 12(12):5386-93)。在一些實施例中，僅作為說明，經編碼之親和體構築體將包括SV40 late+2xUSE polyA信號。

表 2 ：例示性聚腺苷酸化信號

在一些實施例中，經編碼之親和體構築體可能需要包括一或多個調節強化子，亦即，除任何啟動子序列以外。CMV強化子位於CMV啟動子上游之-598至-68處(Boshart等人, 1985 Cell. 41(2):521-30) (約600 bps)且含有轉錄結合位點。在一些實施例中，CMV強化子可包括於構築體中以提高組織特異性啟動子促使之轉殖基因表現，諸如使用ANF(心房利鈉因子)啟動子、CC10 (棒狀細胞10)啟動子、SP-C (界面活性蛋白質C)啟動子或PDGF-β (血小板衍生之生長因子-β)啟動子(僅作為實例)。總而言之，CMV強化子在不同細胞特異性啟動子及不同細胞類型下增加轉殖基因表現，使得其成為廣泛適用於提高轉殖基因表現量之工具。在肌肉中，舉例而言，在AAV表現系統中，使用CMV強化子及肌肉特異性啟動子之轉殖基因表現可增加由轉殖基因編碼之蛋白質之表現量，因此將尤其適用於本發明以用於表現來自引入患者之肌肉細胞中之經編碼之親和體構築體之親和體試劑。

標的經編碼之親和體構築體亦可包括一或多個內含子序列。首先描述mRNA中存在內含子或介入序列對於活體外mRNA處理及增加之轉殖基因表現而言為重要的(Huang及Gorman, 1990 Mol Cell Biol. 10(4):1805-10；Niwa等人, 1990 Genes Dev. 4(9):1552-9)。內含子可位於親和體試劑之編碼序列內及/或可位於啟動子與轉殖基因之間。對於肝轉殖基因表現，使用AAV2在小鼠中比較多種位於啟動子與轉殖基因之間的內含子(表3)(Wu等人, 2008)。MVM (小鼠之細小病毒)內含子增加轉殖基因表現超過任何其他所測試之內含子且超過無內含子之情況80倍(Wu等人, 2008)。然而，在使用AAV表現卡匣之所培養之神經元中，與WPRE相比，在具有轉殖基因與polyA信號之間的嵌合內含子(人類β-血球蛋白供體及免疫球蛋白重鏈受體)之CaMPKII啟動子下，轉殖基因表現較低(Choi等人, 2014)。總而言之，內含子可作為有價值的元件包括於表現卡匣中以提高轉殖基因表現。

表 3 ：例示性內含子

在游離型載體之情況下，標的經編碼之親和體構築體亦可包括一或多個複製起點、微小染色體維持元件(MME)及/或細胞核定位元件。本發明之游離型載體包含病毒基因組DNA中編碼複製起點(ori)之部分，其為此類載體自我複製所需的且因此，經若干代保持在宿主細胞中。此外，本發明之游離型載體亦可含有一或多個編碼複製所需之病毒蛋白質(亦即，複製蛋白質)之基因。視情況地，在含有本發明之自我複製型游離型表現載體之宿主細胞中，幫助起始複製之複製蛋白質可反式表現於另一DNA分子上，諸如在另一載體或宿主基因組DNA上。本發明之較佳自我複製型游離型含有LCR之表現載體不含真核宿主細胞中之長期穩定保持所不需要的病毒序列，諸如病毒基因組DNA中編碼核心或衣殼蛋白之區域，其將產生可能存在於全長病毒基因組DNA分子中之感染性病毒粒子或病毒致癌序列。在本文中，術語「穩定維持」係指本發明之自我複製型游離型表現載體在不存在連續選擇之情況下保持或維持非分裂細胞或分裂細胞之後代細胞中，而在兩代、三代、四代或五代或更多代中無載體之複本數之顯著損失(例如＞50%)之能力。在一些實施例中，載體將維持超過10-15代或更多代細胞。相比之下，宿主細胞中質體之「短暫」或「短期」持久性係指載體不能以穩定方式在宿主細胞中複製及分離；亦即，載體在一代或兩代之後損失，或將在連續繼代之間經歷＞51%其複本數之損失。

適用於本發明之情形中之若干代表性自我複製型含有LCR之游離型載體進一步描述於下文中。自我複製功能可替代性藉由一或多個哺乳動物序列提供，諸如由Wohlge uth等人, 1996, Gene Therapy 3:503；Vos等人, 1995, Jour. Cell. Biol., 增刊21A, 433；及Sun等人, 1994, Nature Genetics 8:33，視情況與細胞核滯留可能需要的一或多個序列組合。使用哺乳動物，尤其人類序列提供自我複製功能之優點為無需可能具有毒性或致癌特性之額外的活化因子。熟習此項技術者應理解，本發明不限於任何一個複製起點或任何一個游離型載體，但涵蓋游離型載體中之LCR之組織受限對照物之組合。亦參見WO1998007876 「Self-replicating episomal expression vectors conferring tissue-specific gene expression」及美國專利案7790446 「Vectors, cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products」。

基於埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr Virus)之自我複製型游離型表現載體。來自埃-巴二氏病毒(EBV)之潛在起點oriP描述於Yates等人, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3806-3810 (1984)；Yates等人, Nature 313:812-815 (1985)；Krysan等人, Mol . Cell . Biol . 9:1026-1033 (1989)；James等人, Gene 86: 233-239 (1990)；Peterson及Legerski, Gene 107:279-284 (1991)；及Pan等人, Som . Cell Molec. Genet . 18:163-177 (1992))中。根據本發明適用之基於EBV之游離型可含有EBV之oriP區域(其具有EBV之2.61 kb片段)及EBNA-1基因(其具有EBV之2.18 kb片段)。EBNA-1蛋白質，其為支持含有oriP之載體之反式游離型複製所需的唯一病毒基因產物，可提供於相同的含有oriP之游離型表現載體上。亦應理解，與已知支持病毒質體之反式複製所需的任何蛋白質(諸如EBNA-1)相同，基因亦可表現於另一DNA分子，諸如不同DNA載體上。

基於乳頭瘤病毒之自我複製型游離型表現載體。本發明之游離型表現載體亦可基於乳頭瘤病毒家族之複製功能，包括(但不限於)牛乳頭瘤病毒(BPV)及人類乳頭瘤病毒(HPV)。BPV及HPV在哺乳動物細胞中保持為穩定維持質體。亦鑑別由BPV及HPV編碼之-S反式作用因子(亦即El及E2)，其對於經由最小複製起點介導許多細胞類型之複製而言為必需的及足夠的(Ustav等人, EMBO J. 10: 449-457 (1991)；Ustav等人, EMBO J . 10:4231-4329, (1991)；Ustav等人, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 898-902 (1993))。

根據本發明適用之游離型載體為Piirsoo等人, EMBO J., 15:1 (1996)及WO 94/12629中描述之BPV-I載體系統。Piirsoo等人中描述之BPV-1載體系統包含具有BPV-1複製起點之質體(最小起點加染色體外維持元件)及視情況選用之El及E2基因。BPV-l El及E2基因為BPV游離型載體之穩定維持所需的。此等因子確保質體與細胞循環狀態無關地複製達到每個細胞多達三十個複本之穩定複本數。因此，基因構築體在分裂及非分裂細胞中皆保持穩定。此實現細胞(諸如造血幹細胞及定型度更高的前驅體細胞)中基因構築體之維持。

BPV複製起點位於60鹼基對(bp)DNA片段(核苷酸(nt)7914-7927)內上游調節區之31號端，其包括El及E2複製因子之結合位點。亦表徵HPV之最小複製起點且位於HPV之URR片段(nt 7022-7927)中(參見例如Chiang等人, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:5799-5803 (1992))。如本文中所使用，「El」係指由BPV亞型1之核苷酸(nt)849-2663或亞型11之HPV之nt 832-2779編碼之蛋白質、其他乳頭瘤病毒之等效El蛋白質或乳頭瘤病毒El蛋白質之功能片段或突變體，亦即，El之具有El之複製特性之片段或突變體。

如本文中所使用，「E2H」係指由BPV亞型1之nt 2594-3837或HPV亞型11之nt 2723-3823編碼之蛋白質、其他乳頭瘤病毒之等效E2蛋白質或乳頭瘤病毒E2蛋白質之功能片段或突變體，亦即，E2之具有E2之複製特性之片段或突變體。「袖珍染色體維持元件」(MME)係指與乳頭瘤病毒複製所必需的病毒或人類蛋白質結合之乳頭瘤病毒基因組之染色體外維持元件，該區域對於宿主細胞中乳頭瘤病毒MO之穩定游離型維持為重要的，如Piirsoo等人(見上文)中所描述。較佳地，MME為含有轉錄活化因子E2之多個結合位點之序列。BPV中之MME在本文中定義為BPV之位於上游調節區內之區域，其包括最少約六個有序E2結合位點，且其提供約十個有序E2結合位點之最佳穩定維持。E2結合位點9為此位點之實例序列，如下文中所描述，其中有序位點由具有約4-10個核苷酸且最佳6個核苷酸之間隔基分隔。可以順式或反式向質體提供El及E2，亦如WO 94/12629及Piirsoo等人(見上文)中所描述。

「E2結合位點」係指與E2蛋白質結合之乳頭狀瘤病毒雙股DNA之最小序列。E2結合位點可包括序列5* ACCGTTGCCGGT 3'，其BPV-1 URR之高親和力E2結合位點9；或者，E2結合位點可包括結合位點9之排列，該等排列發現於URR內且處於通用E2結合序列5' ACCN6GGT 3'內。在大部分乳突狀瘤病毒中，一或多個轉錄活化因子E2結合位點位於上游調節區中，如在BPV及HPV中。根據本發明亦適用之載體可包括BPV基因圖上6959-7945/1-470之間的BPV之區域(如WO 94/12629中所描述)，該區域包括複製起點、與相關基因可操作地相關聯之第一啟動子、與第二啟動子可操作地相關聯以促進El基因之轉錄之BPV El基因；及與第三啟動子可操作地相關聯以促進E2基因之轉錄之BPV E2基因。

來自BPV之El及E2將複製含有BPV起點或許多HPV亞型之起點之載體(Chiang等人, 見上文)。來自HPV之El及E2將經由BPV起點及經由許多HPV亞型之起點複製載體(Chiang等人, 見上文)。與本發明之所有載體相同，本發明之基於BPV之游離型表現載體保持2-5次或更多次宿主細胞分裂。

亦參見美國專利案7790446及Abroi等人 (2004) 「Analysis of chromatin attachment and partitioning functions of bovine papillomavirus type 1 E2 protein. Journal of Virology 78:2100-13」，其證實BPV1 E2蛋白質依賴性MME及EBV EBNA1依賴性FR分離/分區活性功能與質體複製無關。EBNA1/FR及E2/MME之穩定維持功能可用於確保細胞複製起點之長時間游離型維持。

基於乳多泡病毒之自我複製型游離型表現載體。本發明之載體亦可來源於人類乳多泡病毒BK基因組DNA分子。舉例而言，BK病毒基因組可用限制酶EcoRI及BamHI消化以產生5千鹼基(kb)片段，其含有BK病毒複製起點序列，其可賦予載體上之穩定維持(參見例如De Benedetti及Rhoads, Nucleic Acids Res . 19:1925 (1991))，與BK病毒之3.2 kb片段相同(Cooper及Miron, Human Gene Therapy 4:557 (1993))。

本發明之經編碼之親和體構築體可以圓形或線形核酸形式提供。圓形及線形核酸能夠引導適合的個體細胞中之親和體試劑編碼序列之表現。用於表現親和體試劑之一或多個核酸系統可為嵌合的，意謂其至少一種組分相對於其至少一種其他組分為異源的。

a. 病毒載體 易於經調適以用於本發明中之例示性病毒基因療法系統包括質體、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、反轉錄病毒、慢病毒、單純疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、呼腸孤病毒、麻疹病毒、勝利基森林病毒(Semliki Forest virus)及其類似物。較佳病毒載體係基於非細胞變性真核病毒，其中非必需基因已由運載編碼抗原決定基之核酸序列且靶向相關序列之核酸構築體置換。

作為進一步說明，可使用腺病毒及腺相關(AAV)病毒活體內遞送經編碼之親和體，該等病毒為已批准用於基因療法中之人類用途之雙股DNA病毒。

腺病毒載體 一種用於一或多個核酸序列之活體內遞送之說明性方法涉及使用腺病毒(「AdV」)表現載體。AdV為非包膜、雙股DNA病毒，其既不在宿主基因組中整合，亦不在細胞分裂期間複製。AdV介導之抗體基因轉移已在向臨床發展的多種不同疾病模式中展示治療功效。主要經由皮下且尤其靜脈內及肌肉內AdV注射實現全身性mAb表現。參見Wold等人 (2013) 「Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy」 Curr Gene Ther. 13(6):421-33；及Deal等人 「Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy」 2015 Curr Opin Immunol. 35:113-22。其他遞送途徑集中於更多的局部mAb產生，諸如經由編碼AdV之鼻內、氣管內或胸膜內投藥。使用AdV作為溶瘤載體為風行的方法，尤其對於在腫瘤位點處產生經編碼之抗體。藉由當前腺病毒基因遞送系統遞送之外源基因為游離型且因此對宿主細胞具有低基因毒性。因此，使用腺病毒基因遞送系統之基因療法可為非常安全的。本發明尤其涵蓋藉由以腺病毒載體形式遞送之經編碼之親和體構築體的表現及遞送系統進行親和體試劑之遞送。

腺病毒由於其中等尺度基因組、易於操作、高效價、寬目標細胞範圍及高感染性而通常用作基因遞送載體。病毒基因組之兩端含有100-200 bp ITR(反向末端重複序列)，其為病毒DNA複製及封裝所必需的順式元件。基因組之E1區域(E1A及E1B)編碼負責病毒基因組及少數細胞基因之轉錄之調節之蛋白質。E2區域(E2A及E2B)編碼負責病毒DNA複製之蛋白質。在目前為止研究之腺病毒載體中，通常使用具有所刪除之E1區域之複製非勝任腺病毒且代表用於產生本發明之經編碼之親和體構築體之AdV之一種例示性選擇。腺病毒載體中之所刪除之E3區域可提供轉殖基因之插入位點(Thimmappaya, B等人, Cell, 31:543-551(1982)；及Riordan, J. R.等人, Science, 245:1066-1073(1989))。

「腺病毒表現載體」意欲包括含有足以實現以下之腺病毒序列之構築體：(a)支持構築體之封裝，及(b)表現編碼多肽之聚核苷酸，該多肽包括親和體試劑，諸如結合PD-L1之親和體(經編碼之親和體序列)。在一些實施例中，可將經編碼之親和體之序列插入DA啟動子區域中。根據例示性實施例，重組型腺病毒包含所刪除之E1B及E3區域且經編碼之親和體之核苷酸序列插入所刪除之E1B及E3區域中。

腺相關病毒載體 (AAV) AAV (或對於重組型AAV，「rAAV」)為非包膜小型、單股DNA病毒，其能夠感染分裂及非分裂細胞，與AdV類似，基於AAV之載體在細胞核中保持游離狀態且顯示有限的整合風險。與AdV介導之基因轉移之通常有限的持久性不同，轉殖基因表現可在肌肉內重組型AAV (rAAV)載體遞送後保持數年。

阿利潑金(Alipogene tiparvovec，Glybera™)，一種編碼人類脂蛋白脂肪酶基因之rAAV，在2012年在歐洲批准作為第一基因療法產品。此後，各種基於rAAV之基因療法產品當前處於臨床評估中。在抗體基因轉移之情形下，多種報導表明在肌肉內注射編碼mAb之rAAV後，小鼠中抗人類免疫缺乏病毒(HIV)mAb之活體內產生。亦證明rAAV載體用於組合療法之潛力，亦即藉由表現兩個mAb。與AdV類似，最通常進行肌肉內及靜脈內rAAV投藥。評述於Deal等人 「Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy」 2015 Curr Opin Immunol. 35:113-22中。亦證明多種其他遞送位點可實現更多的局部治療作用，包括顱內、鼻內、玻璃體內、鞘內、胸膜內及腹膜內途徑。藉由所證明之rAAV用於抗體基因轉移之效用，本發明亦尤其涵蓋rAAV系統之用途，其係用於活體內遞送經編碼之親和體序列及作為rAAV構築體表現之結果，在患者體內產生親和體試劑。

AAV之一個重要特徵為此等基因轉移病毒能夠感染非分裂細胞及各種類型之細胞，使得其適用於構築本發明之經編碼之親和體遞送系統。關於例示性AAV載體之用途及製備之詳細說明見於例如美國專利案第5,139,941號及第4,797,368號，以及LaFace等人, Viology, 162:483486 (1988)；Zhou等人, Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993)；Walsh等人, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994)及Flotte等人, Gene Therapy, 2:29-37(1995)中。AAV由於其安全性(亦即，經遺傳工程改造(重組型)而不整合至宿主基因組中)而成為遞送媒劑之良好選擇。類似地，AAV不為病原性且不與任何疾病相關聯。移除病毒編碼序列可最小化對病毒基因表現之免疫反應，且因此重組型AAV不引起發炎反應。

通常，藉由共轉染含有由兩個AAV末端重複區側接之相關基因(亦即，親和體試劑之編碼序列)之質體(McLaughlin等人, J. Virol., 62:1963-1973(1988)；Samulski等人, J. Virol., 63:3822-3828(1989))及含有不具有末端重複區之野生型AAV編碼序列之表現質體(McCarty等人, J. Virol., 65:2936-2945(1991))來製備重組型AAV病毒。通常，由編碼含有親和體之多肽之聚核苷酸、適合的調節元件及介導細胞轉導之經編碼之親和體的表現所必需之元件組裝含有經編碼之親和體構築體之病毒載體。在一些實施例中，使用腺相關病毒(AAV)載體。在更特定實施例中，AAV載體為AAV1、AAV6或AAV8。

具有由AAV ITR界定之經編碼之親和體序列之AAV表現載體可藉由將所選擇之序列直接插入AAV基因組中來構築，其中已刪除該AAV基因組之主要AAV開放閱讀框架(「ORF」)。

對於真核細胞，表現控制序列通常包括啟動子、強化子(諸如來源於免疫球蛋白基因之強化子，SV40、巨細胞病毒等(參見上文))及聚腺苷酸化序列，其可包括剪接供體及受體位點。通常在轉殖基因序列之後及3' ITR序列之前插入聚腺苷酸化序列。

此等及其他共同載體及調節元件之選擇為習知的，且可獲得許多此類序列。參見例如Sambrook等人, 及其中在例如第3.18-3.26頁及第16.17-16.27頁所引用之參考文獻，及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989。當然，並非所有載體及表現控制序列將同樣發揮良好的功能以表現本發明之所有轉殖基因。然而，熟習此項技術者可在不脫離本發明之範疇的情況下在此等表現控制序列中進行選擇。可由熟習此項技術者使用由本申請案提供之指導來選擇適合的啟動子/強化子序列。此類選擇為常規事項且不為分子或構築體之限制。

反轉錄病毒載體 在遞送經編碼之親和體構築體之情形下適用的非細胞病變病毒包括反轉錄病毒，其生命週期涉及基因組病毒RNA逆轉錄至DNA中，及後續原病毒整合至宿主細胞DNA中。已批准反轉錄病毒用於人類基因療法試驗。最適用的為複製缺陷型反轉錄病毒(亦即，能夠引導所需蛋白質之合成，但不能製造感染性粒子)。此類經基因更改之反轉錄病毒表現載體具有用於活體內高效轉導基因之一般效用。用於製備複製缺陷型反轉錄病毒之標準方案(包括以下步驟：將外源性基因物質併入質體中、轉染內襯有質體之封裝細胞、藉由封裝細胞株產生重組型反轉錄病毒、自組織培養基收集病毒粒子及用病毒粒子感染目標細胞)為熟習此項技術者已知的。

為了構築反轉錄病毒載體，將親和體試劑編碼序列插入病毒基因組中代替某些病毒序列，以產生複製缺限型病毒。為了產生病毒粒子，構築含有gag、pol及env基因，但不含LTR (長末端重複序列)及psi(□)組件之封裝細胞株(Mann等人, Cell, 33:153-159(1983))。當將含有細胞介素基因、LTR及psi之重組型質體引入此細胞株中時，psi序列實現重組型質體之RNA轉錄物封裝至病毒粒子中，該等病毒粒子接著分泌至培養基中(Nicolas及Rubinstein "Retroviral vectors", Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez及Denhardt (編), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988))。接著收集含有重組型反轉錄病毒之培養基，視情況濃縮且用於基因遞送系統。

已報導使用此類第二代反轉錄病毒載體之成功的基因轉移。Kasahara等人(Science, 266:1373-1376(1994))製備莫洛尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus)之變異體，其中EPO (紅細胞生成素)序列插入包膜區域位置中，因此產生具有新穎結合特性之嵌合蛋白質。類似地，本發明之基因遞送系統可根據用於第二代反轉錄病毒載體之構築策略構築。

在一些實施例中，反轉錄病毒為「γ反轉錄病毒」，其係指反轉錄病毒科之一個屬。例示性γ反轉錄病毒包括小鼠幹細胞病毒、鼠類白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒及禽類網狀內皮細胞增生病毒。

在一些實施例中，用於本發明之反轉錄病毒載體慢病毒載體，其係指反轉錄病毒中一個能夠感染分裂及非分裂細胞且通常產生高病毒效價之屬。慢病毒之若干實例包括 (人類免疫缺乏病毒：包括1型HIV及2型HIV)；馬感染性貧血病毒；貓免疫缺乏病毒(FIV)；牛免疫缺乏病毒(BIV)；及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。

另一種廣泛使用之可用於遞送及表現經編碼之親和體之反轉錄病毒載體包括基於以下之載體：鼠類白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)及其組合(參見例如Buchscher等人, J. Virol. 66:2731-2739, 1992；Johann等人, J. Virol. 66: 1635-1640, 1992；Sommerfelt等人, Virol. 176:58-59, 1990；Wilson等人, J. Virol. 63:2374-2378, 1989；Miller等人, J. Virol. 65:2220-2224, 1991 ；及PCT/US94/05700)。

本發明中亦可使用之其他反轉錄病毒載體包括例如基於人類泡沫病毒(HFV)或泡沫病毒屬(Spumavirus genera)中之其他病毒之載體。泡沫病毒(FV)為迄今已知的最大的反轉錄病毒且廣泛分佈於不同哺乳動物中，包括所有非人類靈長類動物物種，但不存在於人類中。此完全致病機制使得FV載體能夠作為用於人類中之基因療法之理想基因轉移媒劑，且明確區分作為基因遞送系統之FV載體與HIV衍生及γ反轉錄病毒衍生之載體。

適用於本文中之反轉錄病毒載體描述於例如專利專利案第5,399,346號及第5,252,479號；及WIPO公開案WO 92/07573、WO 90/06997、WO 89/05345、WO 92/05266及WO 92/14829中，其提供用於使用此類反轉錄病毒載體將核酸有效引入人類細胞中之方法之說明。其他反轉錄病毒載體包括例如小鼠乳房腫瘤病毒載體(例如Shackleford等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659, 1998)、慢病毒及其類似物。

僅作為說明，可容易地經調適以用於遞送編碼PD-L1親和體試劑之轉殖基因之其他反轉錄病毒遞送系統包括PCT申請公開案WO/2010/045002、WO/2010/148203、WO/2011/126864、WO/2012/058673、WO/2014/066700、WO/2015/021077、WO/2015/148683、WO/2017/040815，其各自之說明書及圖式以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，反轉錄病毒載體含有病毒基因組之封裝及整合所必需的所有順式作用序列，亦即(a)載體之各端處的長末端重複序列(LTR)或其一部分；(b)用於陰性及陽性股DNA合成之引子結合位點；及(c)將基因組RNA併入病毒粒子中所必需的封裝信號。關於反轉錄病毒載體之更詳細說明可見於Boesen等人, 1994, Biotherapy 6:291-302；Clowes等人, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651 ；Kiem等人, 1994, Blood 83: 1467-1473；Salmons及Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141；Miller等人, 1993, Meth. Enzymol. 217:581- 599；及Grossman及Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-1 14中。

在一些實施例中，反轉錄病毒重組型複製勝任型反轉錄病毒，其包含：編碼反轉錄病毒GAG蛋白質之核酸序列；編碼反轉錄病毒POL蛋白質之核酸序列；編碼反轉錄病毒包膜之核酸序列；在腫瘤反轉錄病毒聚核苷酸序列，其在腫瘤反轉錄病毒聚核苷酸序列之5'及3'端處包含長末端重複(LTR)序列；卡匣，其包含可操作地連接至親和體試劑(諸如PD-L1親和體試劑)之編碼序列之內部核糖體入口位點(IRES)，其中卡匣位於針對3' LTR之U3區域之5'及針對編碼反轉錄病毒包膜之序列之3'；及用於目標細胞中之逆轉錄、封裝及整合之順式作用序列。

在一些實施例中，反轉錄病毒重組型複製勝任型反轉錄病毒，其包含：反轉錄病毒GAG蛋白質；反轉錄病毒POL蛋白質；反轉錄病毒包膜；反轉錄病毒聚核苷酸，其包含反轉錄病毒聚核苷酸序列之3'端處之長末端重複(LTR)序列、反轉錄病毒聚核苷酸之5'端處之啟動子序列、適用於哺乳動物細胞中之表現之啟動子、gag核酸結構域、pol核酸結構域及env核酸結構域；卡匣，其包含經編碼之親和體序列，其中該卡匣位於針對3' LTR之5'且可操作地連接及針對編碼反轉錄病毒包膜之env核酸結構域之3'；及目標細胞中之逆轉錄、封裝及整合所必需的順式作用序列。

在重組型複製勝任型反轉錄病毒之一些實施例中，包膜係選自雙嗜性、多變、嗜異性、10A1、GALV、狒狒內源性病毒(Baboon endogenous virus)、RD114、棒狀病毒、α病毒、麻疹或流感病毒包膜中之一者。

在重組型複製勝任型反轉錄病毒之一些實施例中，反轉錄病毒聚核苷酸序列係自選自由以下組成之群之病毒工程改造：鼠類白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)、貓白血病病毒(FeLV)、狒狒內源性反轉錄病毒(BEV)、豬內源性病毒(PERV)、貓衍生之反轉錄病毒RD114、松鼠猴反轉錄病毒、嗜異性鼠類白血病病毒相關病毒(XMRV)、禽類網狀內皮細胞增生病毒(REV)或長臂猿白血病病毒(GALV)。

在重組型複製勝任型反轉錄病毒之一些實施例中，反轉錄病毒為γ逆轉錄病毒屬。

在重組型複製勝任型反轉錄病毒之一些實施例中，存在包含第二治療性蛋白質(諸如另一種檢查點抑制劑多肽、共刺激多肽及/或免疫刺激性細胞介素(僅作為實例))之編碼序列之第二卡匣，其例如位於卡匣下游。在某些實例中，第二卡匣可包括可操作地連接至第二治療性蛋白質之編碼序列之內部核糖體入口位點(IRES)或微型啟動子或polIII啟動子。

在重組型複製勝任型反轉錄病毒之一些實施例中，其為非細胞溶性、雙嗜性反轉錄病毒複製載體，其較佳在腫瘤微環境之細胞中選擇性感染及複製。

作為表現構築體之其他病毒載體 在載體化瘤內經編碼之親和體基因轉移之情形下，溶瘤病毒具有不同優點，因為其可特異性靶向腫瘤細胞、增強治療性親和體試劑表現及擴增抗腫瘤治療反應。溶瘤病毒，其與上文所描述之某些病毒系統重疊，經由選擇性腫瘤細胞殺傷及誘導全身性抗腫瘤免疫來促進抗腫瘤反應。未完全闡明作用機制，但可能取決於經轉型之細胞內之病毒複製、原生細胞死亡之誘導、與腫瘤細胞抗病毒元件之相互作用以及先天性及適應性抗腫瘤免疫之起始。評述於Kaufman等人 2015 「Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs」 Nat Rev Drug Discov. 14(9):642-62中。當前處於臨床中之許多溶瘤病毒對由癌細胞異常表現之細胞表面蛋白質具有天然向性。迄今為止，AdV、痘病毒、柯沙奇病毒(coxsackieviruses)、脊髓灰白質炎病毒、麻疹病毒、新城雞瘟(Newcastle disease virus)、呼腸孤病毒及其他病毒已進入早期臨床試驗。在2015年，FDA及EMA批准塔里穆尼拉赫韋克(talimogene laherparepvec，T-VEC，Imlygic™)，一種用粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之基因武裝之溶瘤疱疹病毒。溶瘤病毒之自身永生化性質使其成為有吸引力的用於本發明之經編碼之親和體基因轉移之平台，因為轉殖基因產物可與病毒複製一起擴增，籍此最大化治療作用。Liu等人 2008 「Oncolytic adenoviruses for cancer gene therapy」 Methods Mol Biol. 433:243-58。

在親和體試劑為大型融合蛋白質，亦即，其包含除單一親和體結構域以外的其他蛋白域之情況下，局部瘤內表現可呈現有吸引力的用於解決實體腫瘤中之不良滲透(若且當其為一種問題時)之策略。Beckman等人 (2007) 「Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors」 Cancer 109(2):170-9；及Dronca等人 2015 「Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer, the better」 Clin Cancer Res. 21(5):944-6。類似地，當全身性遞送(或表現)親和體試劑時，在劑量限制性毒性可能以其他方式阻止達到實現功效之有效瘤內濃度之情況下，經編碼之親和體構築體之瘤內遞送及伴隨的親和體試劑之局部表現可產生更好的治療指數。

在本發明之PD-L1親和體試劑之情況下，此等親和體之免疫調節性質與溶瘤病毒之使用緊密相關。實情為，對於溶瘤病毒療法，需要更動免疫檢查點抑制劑網路且籍此在癌症內建立促炎性環境。當前正在進行大量臨床試驗以評估溶瘤病毒及習知免疫調節性mAb投藥之組合。Kaufman等人 2015 「Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs」 Nat Rev Drug Discov. 14(9):642-62；及Lichty等人 2014 「Going viral with cancer immunotherapy」 Nat Rev Cancer. 14(8):559-67。然而，用阻斷檢查點之mAb進行之全身性治療會引起嚴重的免疫相關副作用，其在標的PD-L1親和體試劑之一些實施例中亦可能成為問題，突出局部療法之機會，例如經由經編碼之用親和體武裝之溶瘤病毒。不同研究已進行此方法且可容易地經調適以與標的經編碼之親和體一起使用。Dias等人用抗人類CTLA-4 mAb武裝複製缺陷型及勝任型溶瘤AdV。Dias等人 2012 「Targeted cancer immunotherapy with oncolytic adenovirus coding for a fully human monoclonal antibody specific for CTLA-4」 Gene Ther. 19(10):988-98。另一種新近描述(且可經調適以與本發明之經編碼之親和體一起具有)之系統涉及用抗鼠類計劃性細胞死亡蛋白質1 (PD-1)Fab、scFv或全長mAb武裝溶瘤牛痘病毒。反映病毒複製，視腫瘤模型而定，腫瘤中之mAb含量在9或30 µg/ml之瘤內注射之後的3-5天達到峰值。儘管低三倍或更多倍，但血清mAb含量具有相同趨勢，儘管在5天之後失去mAb偵測。與抗PD-1 mAb蛋白質之瘤內注射相比，瘤內表現之mAb持續更長時間，隨後限於注射後11天。未報導Fab及scFv表現。用抗PD-1 scFv或mAb武裝之病毒之抗腫瘤反應優於未經武裝之病毒且與未經武裝之病毒與全身性抗PD-1 mAb蛋白質注射劑之組合同樣有效。Kleinpeter等人 2016 「Vectorization in an oncolytic vaccinia virus of an antibody, a Fab and a scFv against programmed cell death-1 (PD-1) allows their intratumoral delivery and an improved tumor-growth inhibition」 Oncoimmunology. 5(10):e1220467 (online)。又最近，用抗PD-L1微型抗體(scFv CH2-CH3融合蛋白質)武裝之溶瘤AdV及輔助依賴性AdV之組合之瘤內投藥改良小鼠中嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法之抗腫瘤作用。局部產生抗PD-L1微型抗體之優勢無法藉由抗PD-L1 IgG輸注加CAR T細胞及未經武裝之AdV之共同投藥來達成。Tanoue等人 2017 「Armed oncolytic adenovirus expressing PD-L1 mini-body enhances anti-tumor effects of chimeric antigen receptor T-cells in solid tumors」 Cancer Res. 77(8):2040-51。亦預期該系統(尤其與CAR-T細胞療法之組合)之用途用於向目標腫瘤遞送經編碼之親和體。

在本發明中，可使用其他病毒載體作為基因遞送系統。來源於諸如以下之病毒之載體可用於本發明之遞送系統中以用於將相關基因轉移至細胞中：牛痘病毒(Puhlmann M.等人, Human Gene Therapy, 10:649-657(1999)；Ridgeway, 「Mammalian expression vectors」, Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez及Denhardt編, Stoneham: Butterworth, 467-492(1988)；Baichwal及Sugden, 「Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes」, Kucherlapati R編, Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986)及Coupar等人, Gene, 68:1-10(1988))、慢病毒(Wang G.等人, J. Clin. Invest., 104(11):R55-62(1999))、單純疱疹病毒(Chamber R.等人, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:1411-1415(1995))、痘病毒(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008))、呼腸孤病毒、麻疹病毒、勝利基森林病毒及脊髓灰白質炎病毒。其提供用於各種哺乳動物細胞之若干有吸引力的特徵。亦包括B型肝炎病毒。

b. 非病毒性載體 在1990年，Wolff等人展示將裸質體DNA (pDNA)注射至小鼠之骨骼肌中如何引起所編碼之蛋白質之局部表現，促使開始研究基於DNA之治療劑領域。參見Wolff等人 1990 「Direct gene transfer into mouse musclein vivo 」 Science. 247(4949 Pt 1):1465-8。使用「pDNA」遞送本發明之經編碼之親和體使得無需病毒作為生物學載體，且呈現用於經編碼之親和體基因轉移之有吸引力的平台。與病毒載體相比，認為pDNA為低免疫原性(允許例如重複給藥)；生產、裝運及儲存成本更低；且具有顯著更長的存放期。在進入細胞核之後，pDNA保持非複製、非整合游離型狀態，且在細胞核包膜在有絲分裂時之分解期間損耗。與病毒載體相比，pDNA不具有關於轉殖基因之尺寸之既定限制，且其模組性質允許簡單的分子選殖，使得其易於操控及設計以用於治療用途。Hardee等人 2017 「Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy」 Genes. 8(2):65。約17%的正進行中或已完成的基因療法臨床試驗中使用質體，且展示良好耐受及安全性。

DNA投藥方法可顯著影響轉殖基因表現。活體內DNA介導之經編碼之親和體基因轉移可利用此類用於抗體基因轉移之物理轉染方法，諸如電致孔或流體動力學注射。電致孔呈現組織內電場之傳播，其誘導細胞膜滲透性之短暫提高。DNA之電轉移為多步驟方法，其涉及(i)DNA朝向質膜之電泳遷移，(ii)DNA聚集及與質膜之相互作用，及(iii)DNA胞內遷移至細胞核中，隨後可開始基因表現。Heller LC. 2015 「Gene electrotransfer clinical trials」 Adv Genet. 89:235-62。已在臨床試驗中評估肌肉內、瘤內及皮內投藥且亦為用於經編碼之親和體構築體之電致孔之適合的目標組織。

基於流體動力學之轉染利用大量pDNA之靜脈內注射，促使DNA分子離開血液循環且進入組織。其他潛在地侵襲性更低的物理遞送方法包括聲致穿孔及磁轉染。亦可藉由使分子與化學遞送媒劑(例如陽離子型脂質或聚合物及脂質奈米粒子)複合來改良DNA吸收率。此類技術亦可適用於活體內DNA介導之經編碼之親和體基因轉移。

除遞送方法之選擇以外，可藉由調節pDNA構築體之補償來改良經編碼之親和體轉殖基因表現。參見例如Hardee等人 2017 「Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy」 Genes 8(2):65；及Simcikova等人 2015 「Towards effective non-viral gene delivery vector」 Biotechnol Genet Eng Rev. 31(1-2):82-107。習知pDNA由轉錄單元及細菌主鏈組成。除調節元件以外，轉錄單元具有經編碼之親和體序列。細菌主鏈包括如抗生素抗性基因、複製起點、未經甲基化之CpG主結構及潛在隱性表現信號之元件。一些此等序列為質體DNA之產生所必需的。然而，一般而言，對於治療性經編碼之親和體基因療法，存在細菌主鏈將可能適得其反。然而，存在多種不同類型的可選擇之可用的最小載體，包括微型環DNA (mcDNA)，其已用於抗體基因轉移且可容易地經調適以用於經編碼之親和體基因轉移。微型環為不含細菌序列之質體分子，其經由重組、限制及/或純化之過程產生。Simcikova等人, 2015, 見上文。消除細菌主鏈在多種組織中展示更高的轉染效率及長期轉殖基因表現。

本文中亦提供線形核酸或線形表現卡匣(「LEC」)，其能夠經由電致孔有效地遞送至個體且表現其中所包括之經編碼之親和體序列。LEC可為不含任何磷酸主鏈的任何線形DNA。LEC可含有啟動子、內含子、終止密碼子及/或聚腺苷酸化信號。可由啟動子控制經編碼之親和體編碼序列之表現。

質體載體 在一些實施例中，標的經編碼之親和體構築體係以質體載體形式遞送。質體載體在此項技術中已廣泛描述且為熟習此項技術者熟知。參見例如Sambrook等人, 1989, 上文中引用。在過去的數年中，已使用質體載體作為DNA疫苗以用於活體內向細胞遞送抗原編碼基因。其在此方面尤其有利，因為其與其他載體相比減少安全性問題。然而，此等具有與宿主細胞相容之啟動子之質體可表現由質體內之核酸編碼之肽抗原決定基。其他質體為一般熟習此項技術者熟知的。此外，質體可使用限制酶及接合反應定製設計以移除及添加特定DNA片段。可藉由多種非經腸、黏膜及局部途徑遞送質體。舉例而言，可藉由肌肉內、皮內、皮下或其他途徑注射DNA質體。其亦可藉由鼻內噴霧劑或滴劑、直腸栓劑及經口投與。其亦可使用基因槍投與表層或黏膜表面。質體可在水溶液中提供，在金粒子上乾燥或與另一種DNA遞送系統(包括(但不限於)脂質體、樹枝狀聚合物、脂質卷及微囊封裝)結合。

為了提高使用質體DNA活體內向組織遞送經編碼之親和體構築體之應用及效率，可基於先前技術報導中之產生較高mAb表現或整體功效之原理進行不同方法。第一策略簡單地依賴於投與多個或重複pDNA劑量。Kitaguchi等人 2005 「Immune deficiency enhances expression of recombinant human antibody in mice after nonviralin vivo gene transfer」 Int J Mol Med 16(4):683-8；及Yamazaki等人 2011 「Passive immune-prophylaxis against influenza virus infection by the expression of neutralizing anti-hemagglutinin monoclonal antibodies from plasmids」 Jpn J Infect Dis. 64(1):40-9。另一種方法係關於使用遞送佐劑。可藉由用玻尿酸酶(一種短暫分解玻尿酸之酶)預處理肌肉、降低細胞外基質之黏度及促進DNA擴散來增強pDNA電轉移。Yamazaki等人 2011, 見上文；及McMahon等人 2001 「Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: increased expression with reduced muscle damage」 Gene Ther. 8(16):1264-70。對於抗體基因轉移，此引起mAb表現增加約3.5倍，在30 µg pDNA下實現3.5 µg/ml之血漿峰值效價，且可由熟習此項技術者調適以用於經編碼之親和體基因轉移。另一策略關注抗體或卡匣工程改造。在密碼子、RNA及前導序列最佳化之後，已藉由『最佳化』pDNA之肌肉內電轉移實現峰值血清mAb或Fab效價。參見例如Flingai等人 2015 「Protection against dengue disease by synthetic nucleic acid antibody prophylaxis/immunotherapy」 Sci Rep. 5:12616。

質體之目的為將核酸序列有效遞送至細胞或組織中且表現治療性親和體試劑。特定言之，質體之目的可為實現高複本數、避免質體不穩定性之潛在起因及提供質體選擇手段。如對於表現，核酸卡匣在卡匣內含有經編碼之親和體之表現所必需的元件。表現包括用質體進行之插入基因、核酸序列或核酸卡匣之有效轉錄。因此，在一些態樣中，提供質體以用於表現經編碼之親和體構築體，該構築體包括包含親和體試劑之編碼序列之表現卡匣；亦稱為轉錄單元。當將質體置放於適用於抗原決定基表現之環境中時，轉錄單元將表現親和體試劑及構築體中其他經編碼之物質。轉錄單元包括轉錄控制序列，其以轉錄方式與細胞免疫反應元件編碼序列連接。轉錄控制序列可包括啟動子/強化子序列，諸如巨細胞病毒(CMV)啟動子/強化子序列，諸如上文所描述。然而，熟習此項技術者將認識到，多種其他適用於哺乳動物細胞(包括人類患者細胞)中之表現之啟動子序列為已知的且可類似地用於本文中所揭示之構築體中。親和體試劑之表現量將取決於相關啟動子以及相關強化子元件之存在及活化。

在一些實施例中，可將經編碼之親和體序列(編碼所需親和體試劑)選殖至表現質體中，該表現質體含有用於轉錄、轉譯、RNA穩定性及複製之調節元件(亦即，包括轉錄控制序列)。此類表現質體為此項技術中所熟知的且一般熟習此項技術者將能夠設計適合的表現構築體以用於活體內產生重組型親和體試劑。

微型環 基於微型環(mcDNA)之抗體基因轉移亦可經調適以用於活體內向組織遞送經編碼之親和體。在某些情形下，用於非病毒基因遞送之質體DNA會導致不可接受的發炎反應。當發生此情況時，免疫毒性反應主要歸因於在質體DNA之細菌傳播之後，質體上存在未經甲基化之CpG主結構及其相關刺激序列。活體外DNA之簡單甲基化可能足以降低發炎反應，但可引起降低之基因表現。藉由選殖來移除CpG島或消除非必需序列已成為用於降低發炎反應之成功技術。Yew等人 2000 「Reduced inflammatory response to plasmid DNA vectors by elimination and inhibition of immunostimulatory CpG motifs」 Mol Ther 1(3), 255-62。

因為與哺乳動物DNA相比，細菌DNA之CpG島含量高平均4倍，一種良好解決方案為在質體產生過程期間自基因遞送載體完全消除細菌控制區域，諸如複製起點及抗生素抗性基因。因此，「母」質體再組合成「微型環」，其通常包含待遞送之基因(在此情況下，經編碼之親和體編碼序列)及用於其表現之適合的控制區域，及微型質體，其通常包含母質體之其餘部分。

移除細菌序列需要為有效的，使用最小的可能切除位點，同時在適合的，較佳哺乳動物控制區域下產生僅由基因表現元件組成之超螺旋DNA微型環。一些用於微型環產生之技術使用細菌噬菌體λ整合酶介導之重組以產生微型環DNA。參見例如Darquet等人, 1997 Gene Ther 4(12): 1341-9；Darquet等人 1999 Gene Ther 6(2): 209-18；及Kreiss等人, 1998 Appl Micbiol Biotechnol 49(5):560-7)。

因此，本文中所描述之核酸構築體之實施例可以微型環DNA形式處理。微型環DNA係關於已自所有原核載體部分釋放之小型(2-4 kb)圓形質體衍生物。因為微型環DNA載體不含細菌DNA序列，因此其不大可能被感知為外源及破壞。因此，與某些習知質體相比，此等載體可在更長時段內經表現。微型環之較小尺寸亦擴展其選殖能力且有助於其遞送至細胞中。用於製備微型環DNA之套組為此項技術中已知及可商購的(System Biosciences, Inc., Palo Alto, Calif.)。關於微型環DNA之資訊提供於Dietz等人, Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy (2013); 21 8, 1526-1535及Hou等人, Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, Article number: 14062 (2015) doi:10.1038/mtm.2014.62中。更多關於微型環之資訊提供於Chen Z Y, He C Y, Ehrhardt A, Kay M A. Mol Ther. 2003年9月; 8(3):495-500中且微型環DNA載體實現由活性染色體及轉錄量反映之持續表現。Gracey Maniar L E, Maniar J M, Chen Z Y, Lu J, Fire A Z, Kay M A. Mol Ther. 2013年1月; 21(1):131-8。

作為非限制性實例，可如下產生微型環DNA載體。表現卡匣，其包含除用於其表現之調節元件以外的經編碼之親和體編碼序列，藉由重組酶之附接位點側接。編碼重組酶之序列位於表現卡匣外部且包括用於誘導性表現之元件(諸如可誘導之啟動子)。在誘導重組酶表現時，載體DNA重組，產生兩種不同的圓形DNA分子。一種圓形DNA分子相對較小，形成包含經編碼之親和體之表現卡匣之微型環；此微型環DNA載體不含任何細菌DNA序列。第二圓形DNA序列含有其餘載體序列，包括細菌序列及編碼重組酶之序列。接著可分別分離及純化含有經編碼之親和體序列之微型環DNA。在一些實施例中，可使用與pBAD.ϕ.C31.hFIX及pBAD.ϕ.C31.RHB類似的質體產生微型環DNA載體。參見例如Chen等人 (2003) Mol. Ther. 8:495-500。

可用於產生微型環DNA載體之例示性重組酶包括(但不限於)鏈黴菌噬菌體ϕ31整合酶、Cre重組酶及λ整合酶/DNA拓樸異構酶IV複合物。此等重組酶中之每一者催化不同位點之間的重組。舉例而言，ϕ31整合酶催化相應attP與attB位點之間的重組，Cre重組酶催化loxP位點之間的重組，且λ整合酶/DNA拓樸異構酶IV複合物催化噬菌體λ attP與attB位點之間的重組。在一些實施例中，諸如ϕ31整合酶或λ整合酶在不存在λ之情況下為蛋白質，重組酶介導不可逆反應，得到獨特的圓形產物群體且因此得到高產率。在其他實施例中，諸如Cre重組酶或λ整合酶在λ蛋白質存在下，重組酶介導可逆反應，得到圓形產物之混合物且因此得到較低產率。可使用突變型loxP71及loxP66位點操作由Cre重組酶進行之可逆反應，其高效重組，得到微型環分子上之功能減弱之P71/66位點及微型環分子上之野生型loxP位點，籍此使均衡朝向產生微型環DNA產物偏移。

美國申請公開案20170342424亦描述使用母質體之系統，該母質體暴露於酶，引起在重組位點處重組，籍此形成(i)包括經編碼之親和體序列之微型環，及(ii)包含母質體之其餘部分之微型質體。一個重組位點在5'端經修飾，使得其與酶之反應之有效性低於野生型位點，且另一個重組位點在3'端經修飾，使得其與酶之反應之有效性低於野生型位點，且另一個重組位點在3'端經修飾，使得其與酶之反應之有效性低於野生型位點，在重組之後經修飾之位點皆位於微型環中。此有利於形成微型環。

c. RNA 介導之經編碼之親和體基因轉移 用於本發明之經編碼之PD-L1親和體試劑之例示性核酸或聚核苷酸包括(但不限於)核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、異赤藻糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA，包括具有β-D-核糖組態之LNA、具有-L-核糖組態之-LNA(LNA之非對映異構體)、具有2'-胺基官能基之2'-胺基-LNA及具有2'-胺基官能基之2'-胺基-a-LNA)、乙烯核酸(ENA)、環己烯基核酸(CeNA)或其混合物或組合。

mRNA呈現新興的用於抗體基因轉移之平台，其可由熟習此項技術者調適以用於遞送本發明之經編碼之親和體構築體。儘管當前結果顯著不同，但在某些實例中，mRNA構築體在所產生之血清mAb效價方面似乎能夠與病毒載體競爭。在mRNA投藥之後的數小時內，含量在治療學相關範圍內，與DNA相比具有顯著偏移速度。在一些針對應用範圍之實施例中，使用脂質奈米粒子(LNP)而非DNA通常所需的物理方法進行mRNA轉染可提供顯著優點。

在其1990年的研究中，Wolff等人(1990, 見上文)發現除pDNA以外，活體外經轉錄(IVT)之mRNA之肌肉內注射亦產生所編碼之蛋白質之局部表現。在彼時，mRNA由於其低穩定性而在活性方面不如DNA。過去數年的發展使得mRNA能夠趕上DNA及病毒載體作為用於基因轉移之工具。評述於Sahin等人 (2014) 「mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs」 Nat Rev Drug Discov. 13(10):759-80中。在概念上，此等表現平台存在若干差異。mRNA無需進入細胞核即可具有功能性。在其到達細胞質後，立即轉譯mRNA。與DNA或病毒載體介導之基因轉移相比，基於mRNA之治療劑更短暫地表現，且不具有宿主基因組中之插入突變誘發之風險。mRNA產生為相對簡單及便宜的。在投藥方面，可使用電致孔來增強mRNA吸收。Broderick等人 2017 「Enhanced delivery of DNA or RNA vaccines by electroporation」 Methods Mol Biol. 2017;1499:193-200。然而，最關注的是非物理轉染方法。實情為，已研發多種mRNA複合調配物，包括脂質奈米粒子(LNP)，已證實其為用於多種組織中及靜脈內投藥之安全及極有效的mRNA載體。Pardi等人 2015 「Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes」 J Control Release 217:345-51。根據此進展，IVT mRNA已達到臨床評估階段。

Beissert等人WO2017162266 「RNA Replicon for Versatile and Efficient Gene Expression」描述適用於本發明之親和體之有效表現之試劑及方法，諸如適用於免疫治療以用於腫瘤之預防及療法。舉例而言，可以包含5'複製識別序列(諸如來自α病毒5'複製識別序列)之RNA複製子形式提供親和體試劑編碼序列。在一些實施例中，RNA複製子包含(經修飾之)5'複製識別序列及編碼親和體試劑之開放閱讀框架，尤其位於5'複製識別序列下游，諸如5'複製識別序列與開放閱讀框架不重疊，例如5'複製識別序列不含功能性起始密碼子且在一些實施例中不含任何起始密碼子。最佳地，編碼親和體試劑之開放閱讀框架之起始密碼子係沿RNA複製子之5'→3'方向。

在一些實施例中，為預防免疫活化，可將經修飾之核苷併入活體外轉錄之mRNA中。在一些實施例中，IVT RNA可為5'封蓋，諸如m7G5'ppp5'G2'-O-Met封蓋之IVT。可藉由移除雙股RNA來確保經修飾之mRNA之有效轉譯。此外，5'及3' UTR及聚(A)尾區可經最佳化以改良細胞內穩定性及轉譯效率。參見例如Stadler等人 (2017) Nature Medicine 23:815-817及Kariko等人 WO/2017/036889 「Method for Reducing Immunogenicity of RNA」。

在一些實施例中，編碼PD-L1親和體試劑之mRNA可包括至少一種本文中所描述之化學修飾。作為非限制性實例，化學修飾可為1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶或1-甲基假尿苷及5-甲基胞嘧啶。在一些實施例中，僅使用活體外轉錄(IVT)酶促合成方法製得之編碼一或多種本發明之PD-L1親和體試劑之線形聚核苷酸稱為「IVT聚核苷酸」。製備IVT聚核苷酸之方法為此項技術中已知的且描述於PCT申請案WO2013/151666中，其內容以全文引用之方式併入本文中。

在另一實施例中，編碼本發明之PD-L1親和體試劑之聚核苷酸具有尺寸及/或化學修飾模式、化學修飾位置、化學修飾百分比或化學修飾群以及前述之組合不同之部分或區域，其稱為「嵌合聚核苷酸」。本發明之「嵌合體」為具有兩個或更多個異向或異質部分或區域之實體。如本文中所使用，聚核苷酸之「部分」或「區域」定義為聚核苷酸中任何小於聚核苷酸之整個長度之部分。此類構築體教示於例如PCT申請案WO2015/034928中。

在另一實施例中，本發明之圓形聚核苷酸稱為「圓形聚核苷酸」或「circP」。如本文中所使用，「圓形聚核苷酸」或「circP」意指單股圓形聚核苷酸，其與RNA基本上類似地起作用且具有RNA之特性。術語「圓形」亦意謂涵蓋circP之任何二級或三級組態。此類構築體教示於例如PCT申請案WO2015/034925及WO2015/034928中，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。

可用於編碼本發明之PD-L1親和體試劑之例示性mRNA (及其他聚核苷酸)包括可自例如以下之說明書及圖式調適之mRNA：PCT公開案WO2017/049275、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2016/011226、WO2015/196128、WO/2015/196130、WO/2015/196118、WO/2015/089511及WO2015/105926 (後者題為「Polynucleotides for the In vivo Production Of Antibodies」)，其各自以引用之方式併入本文中。

如下文所描述，電致孔為一種用於將mRNA或其他聚核苷酸引入細胞中之例示性方法。

已證實含有脂質之奈米粒子組合物為多種RNA (及本文中所描述之相關聚核苷酸)進入細胞及/或細胞內隔室之有效運輸媒劑。此等組合物通常包括一或多種「陽離子性」及/或可電離脂質、包括多不飽和脂質之磷脂、結構脂質(例如固醇)及含有聚乙二醇之脂質(PEG脂質)。陽離子性及/或可電離脂質包括例如可易於質子化之含有胺之脂質。

d. 將經編碼之親和體構築體遞送至目標細胞中 可經由熟習此項技術者已知之各種方法進行將基因遞送系統引入宿主細胞中。

當本發明之基因遞送系統係基於病毒載體構築來構築時，可根據此項技術中已知之習知感染方法進行遞送。

用於增強遞送病毒及非病毒經編碼之親和體構築體之物理方法包括電致孔(Neumann, E等人, EMBO J., 1:841(1982)；及Tur-Kaspa等人, Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986))、基因轟擊(Yang等人, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)，其中將DNA裝載至(例如金)粒子上且強迫實現DNA滲透至細胞中)、聲致穿孔、磁轉染、流體動力學遞送及其類似方法，其皆為熟習此項技術者已知的。

電致孔 在過去的若干年中，用於活體內產生蛋白質之質體DNA遞送技術已取得顯著進展。此包括用於人類細胞中之表現之密碼子最佳化、用於改良mRNA穩定性以及在核糖體水準下之更高效轉譯之RNA最佳化、添加特異性前導序列以增強轉譯效率、產生合成插入物以進一步增強活體內產生及使用改良之適應性電致孔(EP)遞送方案以改良活體內遞送。EP藉由產生電場來幫助質體DNA 之遞送，該電場使DNA能夠更有效地傳遞至細胞中。活體內電致孔為已成功地用於將質體DNA有效遞送至許多不同組織中之基因遞送技術。Kim等人 「Gene therapy using plasmid DNA-encoded anti-HER2 antibody for cancers that overexpress HER2」 (2016) Cancer Gene Ther. 23(10): 341-347教示用於質體之肌肉內注射及活體內電致孔之載體及電致孔系統，其引起血清中之高及持續抗體表現；Kim等人之質體及電致孔系統可容易地經調適以用於活體內遞送用於表現本發明之經編碼之結合之PD-L1之親和體之質體。

因此，在本發明之某些實施例中，經由電致孔將經編碼之親和體構築體引入目標細胞中。

可使用電致孔裝置實現經由電致孔來投與組合物，該等裝置可經組態以將可有效引起在細胞膜中形成可逆孔之能量脈衝遞送至哺乳動物之所需組織中，且較佳該能量脈衝為與由使用者輸入之預設電流類似的恆定電流。電致孔裝置可包含電致孔組件及電極總成或手柄總成。電致孔組件可包括及合併有電致孔裝置之各種元件中之一或多者，包括：控制器、電流波形產生器、阻抗測試儀、波形記錄器、輸入元件、狀態報導元件、連通埠、記憶體組件、電源及電源開關。電致孔可使用活體內電致孔裝置(例如CELLECTRA EP系統(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, Pa.)或Elgen電致孔器(Genetronics, San Diego, Calif.))實現以促進由質體進行之細胞轉染。

電致孔組件可充當電致孔裝置之一個元件，且其他元件為與電致孔組件連通之單獨的元件(或組件)。電致孔組件可充當電致孔裝置之超過一個元件，其可與電致孔裝置之其他元件連通，該等其他元件與電致孔組件分離。作為一個電機械或機械裝置之一部分的電致孔裝置之元件可不限於該等元件可充當一個裝置或作為彼此連通之單獨元件。電致孔組件能夠遞送在所需組織中產生恆定電流之能量脈衝，且包括回饋機制。電極總成可包括在空間排列中具有複數個電極之電極陣列，其中電極總成接收來自電致孔組件之能量脈衝且將其經由電極遞送至所需組織。複數個電極中之至少一者在遞送能量脈衝期間為中性的，且量測所需組織中之阻抗且將阻抗傳送至電致孔組件。回饋機制可接受所量測之阻抗且可調節由電致孔組件遞送之能量脈衝以保持恆定電流。

複數個電極可以分散模式遞送能量脈衝。複數個電極可經由在程式化序列下控制電極來以分散模式遞送能量脈衝，且該程式化序列係由使用者輸入電致孔組件中。程式化序列可包含序列中遞送之複數個脈衝，其中複數個脈衝中之每個脈衝係由至少兩個活性電極及一個量測阻抗之中性電極遞送，且其中複數個脈衝中之一個後續脈衝係由至少兩個活性電極中之另一個及一個量測阻抗之中性電極遞送。

可藉由硬體或軟體進行回饋機制。可藉由類比封閉迴路電路進行回饋機制。每50 μs、20 μs、10 μs或1 μs進行一次回饋，但在一些實施例中為即時回饋或瞬時的(亦即，大體上瞬時，如藉由用於測定回應時間之可用技術測定)。中性電極可量測所需組織中之阻抗且將阻抗傳送至回饋機制，且回饋機制對阻抗做出回應且調節能量脈衝以保持恆定電流處於與預設電流類似的值。回饋機制可在遞送能量脈衝期間保持連續及瞬時恆定電流。

可有助於遞送本發明之經編碼之親和體構築體之電致孔裝置及電致孔方法之實例包括描述於美國專利案第7,245,963號；第6,302,874號；第5,676,646號；第6,241,701號；第6,233,482號；第6,216,034號；第6,208,893號；第6,192,270號；第6,181,964號；第6,150,148號；第6,120,493號；第6,096,020號；第6,068,650號；及第5,702,359號中之裝置及方法，其內容以全文引用之方式併入本文中。可經由極小侵襲性裝置進行電致孔。

在一些實施例中，使用極小侵襲性電致孔裝置(「MID」)進行電致孔。該裝置可包含中空針、DNA卡匣及流體遞送構件，其中該裝置經調適以啟動使用流體遞送構件，以在針插入身體組織期間將經編碼之親和體核酸構築體同時(例如，自動)注入身體組織中。此具有在插入針的同時逐漸注射DNA及相關流體之能力的優點，引起身體組織中流體之更均勻分佈。在注射期間經歷之疼痛可由於所注射之DNA分佈於較大區域內而降低。

MID可在不使用針之情況下將經編碼之親和體核酸構築體注射至組織中。MID可以小型物料流或噴射物形式用力注射經編碼之親和體核酸構築體，使得核酸刺穿組織表面且進入皮下組織及/或肌肉中。小型物料流或噴射物後的動力可藉由壓縮氣體之膨脹來提供，諸如二氧化碳零點幾秒內通過微孔。極小侵襲性電致孔裝置之實例及其使用方法描述於美國專利申請公開案第20080234655號；美國專利案第6,520,950號；美國專利案第7,171,264號；美國專利案第6,208,893號；美國專利案第6,009,347號；美國專利案第6,120,493號；美國專利案第7,245,963號；美國專利案第7,328,064號；及美國專利案第6,763,264號中，其內容各自以引用之方式併入本文中。

MID可包含注射器，其產生無痛刺穿組織之液體之高速噴射物。此類無針噴射器為可商購的。可用於本文中之無針噴射器之實例包括美國專利案第3,805,783號；第4,447,223號；第5,505,697號；及第4,342,310號中描述之噴射器，其內容各自以引用之方式併入本文中。

可使用無針注射器將呈適用於直接或間接電傳送之形式的所需經編碼之親和體核酸構築體引入(例如注射)所治療之組織中，通常藉由使組織表面與注射器接觸，以便啟動藥劑之噴射物之遞送，使用足夠的力以使得核酸滲透至組織中。舉例而言，若所治療之組織為黏膜、皮膚或肌肉，則以足夠的力朝向黏膜或皮膚表面投射藥劑，以使得藥劑分別穿透角質層且進入真皮層，或進入皮下組織及肌肉。無針噴射器良好適合於向所有類型之組織遞送經編碼之親和體核酸構築體，包括進入腫瘤中(瘤內遞送)。

MID可具有對組織進行電致孔之針電極。藉由在多電極陣列(例如以矩形或正方形模式設置)中的多對電極之間施加脈衝，與一對電極之間的脈衝相比提供經改良之結果。舉例而言，題為「Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes」之美國專利案第5,702,359號揭示針陣列，其中複數對針可在治療性處理期間產生脈衝。在該申請案中，其以引用之方式併入本文中如同完全闡述一般，針以圓形陣列形式安置，但具有實現相對針電極對之間的脈衝之連接器及開關設備。可使用一對用於向細胞遞送經編碼之親和體核酸構築體之針電極。此類裝置及系統描述於美國專利案第6,763,264號中，其內容以引用之方式併入本文中。或者，可使用單個針裝置，其藉由與正常注射針類似的單個針實現DNA之注射及電致孔且施加與當前使用之裝置所遞送的相比電壓較低之脈衝，因此降低患者經歷之觸電感。

MID可包含一或多個電極陣列。陣列可包含兩個或更多個具有相同直徑或不同直徑之針。針可均勻或不均勻地間隔開。針可在0.005吋與0.03吋之間、在0.01吋與0.025吋之間；或在0.015吋與0.020吋之間。針之直徑可為0.0175吋。針可間隔0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm、2.5 mm、3.0 mm、3.5 mm、4.0 mm或更遠。

MID可由脈衝發生器及兩個或更多個針疫苗噴射器組成，其在單個步驟中遞送經編碼之親和體核酸構築體及電致孔脈衝。脈衝發生器可經由快閃記憶卡操作之個人電腦實現脈衝及注射參數之可撓性程式化，以及全面記錄及儲存電致孔及患者資料。脈衝發生器可在短時段期間遞送多種伏特之脈衝。舉例而言，脈衝發生器可遞送三個100 ms持續時間之15伏特脈衝。此類MID之實例為Inovio Biomedical Corporation之Elgen 1000系統，其描述於美國專利案第7,328,064號中，其內容以引用之方式併入本文中。

MID可為CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, Pa.)裝置及系統，其為模組化電極系統，其有助於將大分子(諸如經編碼之親和體核酸構築體)引入身體中之所選擇之組織之細胞中。模組化電極系統可包含複數個針電極；皮下注射針；電連接器，其提供自可程式化恆定電流脈衝控制器至複數個針電極之導電連接；及電源。操作員可握緊安裝在支撐結構上之複數個針電極且將其牢固地插入身體或植物中的所選擇之組織中。接著，經由皮下注射針將核酸遞送至所選擇之組織中。啟動可程式化恆定電流脈衝控制器且向複數個針電極施加恆定電流電脈衝。所施加之恆定電流電脈衝有助於將核酸引入複數個電極之間的細胞中。借助於恆定電流脈衝，藉由限制組織中之能量耗散來最小化由細胞過熱引起之細胞死亡。Cellectra裝置及系統描述於美國專利案第7,245,963號中，其內容以引用之方式併入本文中。

MID可為Elgen 1000系統(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系統可包含提供中空針之裝置；及流體遞送構件，其中該設備經調適以啟動使用流體遞送構件以便在針插入該身體組織期間同時(例如，自動)將流體(本文中所描述之經編碼之親和體核酸構築體)注射至身體組織中。優點為在插入針的同時逐漸注射DNA及相關流體之能力，引起身體組織中流體之更均勻分佈。亦咸信在注射期間經歷之疼痛由於所注射之流體之體積分佈於較大區域中而降低。

此外，流體之自動注射有助於自動監測及記錄流體之實際注射劑量。可視需要藉由控制單元儲存此資料以用於文檔編制目的。

應瞭解，注射率可為線性或非線性且可在針已插入穿過所治療之個體之皮膚之後且在其進一步插入身體組織中時進行注射。

僅作為實例，可藉由本發明之設備注射流體之適合的組織包括腫瘤組織、皮膚及其他上皮組織、肝臟組織及肌肉組織。

該設備進一步包含用於導引針插入身體組織中之針插入構件。藉由針插入率控制流體注射率。此具有可控制針插入及流體注射之優點，使得插入率可視需要與注射率匹配。其亦使得設備更易於由使用者操作。若需要，可提供用於將針自動插入身體組織中之構件。

使用者可選擇何時開始注射流體。然而理想的是，在針尖到達目標組織時開始注射且設備可包括用於感測針何時已插入足以開始注射流體之深度的構件。此意謂可促使在針到達所需深度(其將通常為開始出現肌肉組織之深度)時自動開始注射流體。可採集開始出現肌肉組織之深度作為預設針插入深度，諸如4 mm之值，認為其足以使針穿過表層。

感測構件可包含超音波探針。感測構件可包含用於感測阻抗或電阻變化之構件。在此情況下，構件可能並非由此記錄身體組織中針之深度，而實情為經調適以感測隨著針自不同類型之身體組織移動進入肌肉時的阻抗或抗性之變化。此等替代方案中之任一者提供操作感測構件開始注射之相對精確性及簡單性。可視需要進一步記錄針之插入深度且可用於控制流體注射，使得根據所記錄之針插入深度決定所注射之流體體積。

該設備可進一步包含：用於負載針之基座；及用於收納基座之外殼，其中基座可相對於外殼移動，使得當基座相對於外殼位於第一背向位置時，針縮回外殼且當基座位於外殼內之第二正向位置時，針伸展出外殼。此對於使用者而言為有利的，因為外殼可在患者之皮膚上排列，且接著可藉由相對於基座移動外殼來將針插入患者之皮膚中。

如上所陳述，需要實現受控流體注射率使得流體在針插入皮膚中時在針之長度內均勻分佈。流體遞送構件可包含經調適以受控速率注射流體之活塞驅動構件。活塞驅動構件可例如由伺服馬達啟動。然而，可藉由基座相對於外殼在軸向方向上移動來啟動活塞驅動構件。應瞭解，可提供用於流體遞送之替代性構件。因此，舉例而言，可提供可經擠壓以用於以受控或非受控速率遞送流體之封閉容器來代替注射器及活塞系統。

上文所描述之設備可用於任何類型之注射。然而，設想其尤其適用於電致孔領域，且因此其可進一步包含用於向針施加電壓之構件。此使得針不僅可用於注射，且亦在電致孔期間作為電極。此為尤其有利的，因為其意謂電場與注射流體施加至相同區域。電致孔傳統上存在極難以精確對準電極與預先注射之流體之問題，且因此使用者傾向於在較大區域內注射比所需體積更大的體積之流體且在較高區域內施加電場以嘗試確保注射物質與電場之間的重疊。使用本發明，可降低所注射之流體體積及所施加之電場尺寸，同時實現電場與流體之間的良好配合。

Draghia-Akli等人之美國專利案第7,245,963號描述模組化電極系統及其用於促進將生物分子引入身體或植物中的所選擇之組織之細胞中之用途。模組化電極系統可包含複數個針電極；皮下注射針；電連接器，其提供自可程式化恆定電流脈衝控制器至複數個針電極之導電連接；及電源。操作員可握緊安裝在支撐結構上之複數個針電極且將其牢固地插入身體或植物中的所選擇之組織中。接著，經由皮下注射針將生物分子遞送至所選擇之組織中。啟動可程式化恆定電流脈衝控制器且向複數個針電極施加恆定電流電脈衝。所施加之恆定電流電脈衝有助於將生物分子引入複數個電極之間的細胞中。美國專利案第7,245,963號之全部內容以引用之方式併入本文中。

由史密斯等人提交之美國專利公開案2005/0052630描述一種電致孔裝置，其可用於有效地促進將生物分子引入身體或植物中的所選擇之組織之細胞中。電致孔裝置包含由軟體或韌體指定操作之電動力學裝置(「EKD裝置」)。EKD裝置基於使用者控制及脈衝參數之輸入在陣列中之電極之間產生一系列可程式化恆定電流脈衝模式，且實現電流波形資料之儲存及獲取。電致孔裝置亦包含可更換的電極盤，其具有針電極陣列、用於注射針之中心注射通道及可移除的引導盤。美國專利公開案2005/0052630之全部內容以引用之方式併入本文中。

美國專利案第7,245,963號及美國專利公開案2005/0052630中所描述之電極陣列及方法可經調適以用於不僅深度滲透至諸如肌肉之組織中，且亦可滲透至其他組織或器官中。由於電極陣列之組態，亦在由電極預先劃定之區域將注射針(用於遞送所選生物分子)完全插入目標器官中，且垂直於該目標投與注射劑。舉例而言，美國專利案第7,245,963號及美國專利公開案2005/005263中描述之電極之長度為20 mm且規格為21。

使用活體內電致孔可增強腫瘤組織中之質體DNA吸收，引起腫瘤內之表現且向肌肉組織遞送質體，引起分泌蛋白(諸如細胞介素)之全身性表現(參見例如US8026223)。用於活體內進行電致孔以使得PD-L1親和體試劑轉殖基因進入細胞中之其他例示性技術、載體及裝置包括PCT公開案WO/2017/106795、WO/2016/161201、WO/2016/154473、WO/2016/112359及WO/2014/066655。

典型地，活體內細胞電致孔所需之電場通常在量值上與活體外細胞所需之電場類似。在一些實施例中，電場之量值在約10 V/cm至約1500 V/cm、300 V/cm至1500 V/cm或1000 V/cm至1500 V/cm範圍內。或者，電場強度越低(約10 V/cm至100 V/cm，且更佳為約25 V/cm至75 V/cm)，脈衝長度越長。舉例而言，當標稱電場為約25-75 V/cm時，較佳脈衝長度為約10 msec。

脈衝長度可為約10 s至約100 ms。可存在任何所需數目之脈衝，通常每秒一至100個脈衝。脈衝集合之間的延遲可為任何所需時間，諸如一秒。波形、電場強度及脈衝持續時間亦可取決於經由電致孔進入細胞之細胞類型及分子類型。

亦涵蓋合併有電化學阻抗光譜儀(「EIS」)之電致孔裝置。特定言之，此類裝置提供關於活體內瘤內電致孔效率之即時資訊，實現條件之最佳化。合併有EIS之電致孔裝置之實例可見於例如WO2016/161201中，其以引用之方式併入本文中。

本發明之經編碼之親和體核酸構築體之吸收亦可藉由電漿電致孔(亦稱為雪崩轉染)增強。簡言之，微秒放電在電極表面產生空化微泡。與擴散介導之與習知電致孔相關之傳送相比，由崩潰微泡產生之機械力與磁場組合用於提高跨越細胞膜之傳送效率。電漿電致孔之技術描述於美國專利案第7,923,251號及第8,283,171號中。此技術亦可活體內用於細胞之轉型。Chaiberg等人, (2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090；Chaiberg等人, 2012年1月24日頒佈之美國專利案第8, 101 169號。

亦涵蓋其他替代性電致孔技術。亦可使用冷電漿進行活體內核酸遞送。電漿為四種基本物質狀態之一，其他三種為固體、液體及氣體。電漿為未結合之正性及負性粒子之電中性介質(亦即，電漿之總電荷約為零)。電漿可藉由加熱氣體或使其經歷由雷射或微波發生器施加之強電磁場來產生。此減少或增加電子數目，產生稱為離子之正性或負性帶電粒子(Luo等人, (1998) Phys. Plasma 5:2868-2870)且藉由分子鍵(若存在)之解離來實現。

藉由將脈衝式高電壓信號遞送至適合的電極來產生冷電漿(亦即，非熱電漿)。冷電漿裝置可呈噴氣裝置或介電質障壁放電(DBD)裝置形式。冷溫度電漿由於在相對低氣體溫度下提供電漿而吸引了大量注意及關注。在此類溫度下提供電漿與多種應用相關，包括傷口癒合、抗菌過程、各種其他醫學療法及滅菌。如前所述，藉由將脈衝式高電壓信號遞送至適合的電極來產生冷電漿(亦即，非熱電漿)。冷電漿裝置可呈噴氣裝置、介電質障壁放電(DBD)裝置或多頻富含諧波之電源供應器形式。

介電質障壁放電裝置依賴於用於產生冷電漿之不同方法。介電質障壁放電(DBD)裝置含有至少一個由介電層覆蓋之傳導性電極。電返迴路徑係由可由經歷冷電漿處理之目標基板提供之地面或藉由提供電極之固有地面來形成。介電質障壁放電裝置之能量可由高電壓電源供應器(諸如上文提及之電源供應器)提供。更一般而言，將能量以脈衝式DC電壓形式輸入介電質障壁放電裝置以形成電漿放電。借助於介電層，分離放電與傳導性電極分離且降低電極蝕刻及氣體加熱。可改變脈衝式DC電壓之幅度及頻率以實現不同操作方案。任何合併有此類冷電漿產生原理(例如DBD電極裝置)之裝置皆屬於本發明之各種實施例之範疇內。

冷電漿已用於轉染具有外源核酸之細胞。特定言之，腫瘤細胞之轉染(參見例如Connolly等人, (2012) Human Vaccines & Immune-therapeutics 8: 1729-1733；及Connolly等人 (2015) Bioelectrochemistry 103: 15-21)。

在某些說明性實施例中，使用電致孔裝置遞送編碼本發明之PD-L1親和體試劑之轉殖基因構築體，其包含：施用器；自施用器延伸之複數個電極，該等電極與覆蓋區相關聯；與電極電連通之電源供應器，該電源供應器經組態以對覆蓋區內之細胞產生一或多個電致孔信號；及與電極耦合之引導部件，其中該引導部件經組態以調節電極之覆蓋區。至少一部分電極可以錐形排列形式安置在施用器內。一或多個電致孔信號可各自與電場相關聯。裝置可進一步包含與電源供應器及電極耦合之電位計。電位計可經配置以將電場大致上保持在預定範圍內。

一或多個電致孔信號可各自與電場相關聯。裝置可進一步包含與電源供應器及電極耦合之電位計。電位計可經配置以將電場保持在預定範圍內，以便實質上防止覆蓋區內細胞之永久性損傷及/或實質上最小化疼痛。舉例而言，電位計可經配置以保持電場為約1300 V/cm。

電源供應器可向第一電極提供第一電信號且向第二電極提供第二電信號。第一及第二電信號可組合以產生具有差頻之波。第一及第二電信號可各自具有單極波形及雙極波形中之至少一者。第一電信號可具有第一頻率及第一振幅。第二電信號可具有第二頻率及第二振幅。第一頻率可與第二頻率不同或相同。第一振幅可與第二振幅不同或相同。

在一些實施例中，本發明提供一種用於治療具有腫瘤之個體之方法，該方法包含：向腫瘤注射有效劑量之編碼PD-L1親和體試劑之質體；及向腫瘤投與電致孔療法。在一些實施例中，電致孔療法進一步包含在約100微秒至約20毫秒之脈衝寬度內投與至少一個約200 V/cm至約1500 V/cm之電壓脈衝。

在一些實施例中，質體(或第二電致孔質體)進一步編碼至少一種免疫刺激性細胞介素，諸如選自編碼IL-12、IL-15及IL-12及IL-15之組合之群。

增強轉染之調配物 經編碼之親和體核酸構築體亦可囊封於脂質體，較佳陽離子性脂質體(Wong, T. K.等人, Gene, 10:87(1980)；Nicolau及Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982)；及Nicolau等人, Methods Enzymol., 149:157-176 (1987))或聚合物囊泡(合成脂質體)中，該等脂質體可與細胞膜相互作用且融合或經歷內飲作用以實現核酸轉移至細胞中。DNA亦可與聚合物(多聚物)或樹枝狀聚合物形成複合物，該等聚合物或樹枝狀聚合物可將其負載直接釋放至細胞之細胞質中。

在此方面適用的說明性載體包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、乳膠、澱粉、纖維素、聚葡萄糖之微米粒子及其類似物。其他說明性載體包括超分子生物載體，其包含非液體親水性核心(例如交聯多醣或寡醣)及視情況選用之外部層，其包含兩親媒性化合物，諸如磷脂(參見例如美國專利案第5,151,254號及PCT申請案WO 94/20078、WO/94/23701及WO 96/06638)。持續釋放型調配物中所含的活性劑之量取決於植入位點、釋放速率及預期持續時間以及所治療或預防之病狀之性質。

可使用可生物降解之微球體(例如聚丙交酯聚羥乙酸酯)作為組合物之載體。適合的可生物降解之微球體揭示於例如美國專利案第4,897,268號；第5,075,109號；第5,928,647號；第5,811,128號；第5,820,883號；第5,853,763號；第5,814,344號；第5,407,609號；及第5,942,252號中。經修飾之B型肝炎核心蛋白載體系統，諸如WO/99 40934及其中所引用之參考文獻中所描述，亦將適用於許多應用。另一種說明性載體/遞送系統使用包含顆粒-蛋白質複合物之載體，諸如美國專利案第5,928,647號中所描述，其在瘤內用於遞送PD-L1親和體之編碼序列時可具有附加益處。

可生物降解之聚合奈米粒子促進非病毒核酸轉移至細胞中。藉由陽離子性、可水解降解之聚(β-胺基酯)及質體DNA之自組裝來形成小型(約200 nm)、帶正電(約10 mV)粒子。

亦可藉由直接顯微注射、暫時性細胞滲透(例如抑制子及/或活化因子與細胞滲透劑之共同投藥)、與薄膜易位肽融合及其類似方法來向細胞投與聚核苷酸。

活體外及活體內脂質介導之核酸遞送及外源核酸(包括mRNA)之表現已為極成功的。基於脂質之非病毒調配物提供病毒基因療法之替代物。當前活體內脂質遞送方法使用皮下、皮內、瘤內或顱內注射。脂質調配物之發展改良活體內基因轉移效率(參見PCT申請案WO 98/07408)。舉例而言，由等莫耳比之l,2-雙(油醯基氧基)-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)及膽固醇構成之脂質調配物可顯著增強全身性活體內基因轉移。DOTAP:膽固醇脂質調配物形成稱為「夾心脂質體」之獨特結構。此調配物報導為在內陷雙層或『瓶狀』結構之間「包夾」DNA。此等脂質結構之有利特徵包括陽性p、藉由膽固醇實現之膠態穩定、二維核酸填充及增加之血清穩定性。

陽離子性脂質體技術係基於兩性脂質之能力，具有帶正電頭基及疏水性脂質尾區，以結合於帶負電DNA或RNA及形成通常藉由內飲作用進入細胞之粒子。一些陽離子性脂質體亦含有中性共脂質，認為其可增強哺乳動物細胞之脂質體吸收。類似地，其他聚陽離子(諸如聚-l-離胺酸及聚乙烯-亞胺)經由裝填相互相用與核酸複合且有助於DNA或RNA縮合成奈米粒子，其接著成為內體介導之吸收之受質。已研發若干此等陽離子性核酸複合物技術作為潛在臨床產品，包括與質體DNA (pDNA)、寡脫氧核苷酸之複合物，及各種形式之合成RNA，且用作用於本發明之經編碼之親和體核酸構築體之遞送系統之一部分。

本文中所揭示之經編碼之親和體核酸構築體可與用於增強細胞中之吸收之多聚陽離子分子相關聯。使核酸構築體與聚陽離子分子複合亦有助於封裝構築體，因為其尺寸減小，咸信此有助於細胞吸收。一但位於內體中，複合物由於較低pH值而解離，且聚陽離子分子可破壞內體之膜以促進DNA在降解之前逃逸至細胞質中。初步資料證實當與聚陽離子分子聚離胺酸或聚乙二亞胺複合時，與DC相比，核酸構築體實施例在SC中具有增強之吸收。

適用於與核酸構築體複合之聚陽離子分子之一個實例包括細胞穿透肽(CPP)，實例包括聚離胺酸(上文所描述)、聚精胺酸及Tat肽。細胞穿透肽(CPP)為小型肽，其可結合於DNA且在釋放之後，穿透細胞膜以促進DNA自內體逃逸至細胞質中。CPP之另一實例係關於27殘基嵌合肽，稱為MPG，在前段時間證實以穩定方式結合ss-及ds-寡核苷酸，產生保護核酸避免由DNA酶降解之非共價複合物且活體外將寡核苷酸有效遞送至細胞中(Mahapatro A等人, J Nanobiotechnol, 2011, 9:55)。當檢驗不同肽:DNA比率以及10:1及5:1比率(分別為150 nm及1 μm)時，複合物形成約150 nm至1 μm之小顆粒。另一種CPP係關於經修飾之四肽[含有胍基羰基吡咯(GCP)基團之四離胺酸(TL-GCP)]，報導其以高親和力與6.2 kb 質體DNA結合，產生700-900 nm之陽性帶電聚集物。Li等人, Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4。RNA亦可藉由此類聚陽離子分子複合以用於活體內遞送。

可與本文中所描述之核酸構築體複合聚陽離子分子之其他實例包括可以JETPRIME®及In vivo JET (Polypus-transfection, S.A., Illkirch, France)商購之聚陽離子聚合物。

在一些實施例中，本發明涵蓋藉由投與金屬奈米粒子組合物來向患者細胞遞送編碼PD-L1親和體試劑之mRNA (或其他聚核苷酸)f之方法，該金屬奈米粒子組合物包含(i)脂質組分，其包含式(I)化合物、磷脂、結構性脂質及PEG脂質；及(ii)mRNA (或其他聚核苷酸)f，該投與包含使該哺乳動物細胞與該金屬奈米粒子組合物接觸，藉此向該細胞遞送該mRNA (或其他聚核苷酸)f。

在例示性實施例中，PEG脂質係選自由以下組成之群：經PEG改質之磷脂醯乙醇胺、經PEG改質之磷脂酸、經PEG改質之神經醯胺、經PEG改質之二烷基胺、經PEG改質之二醯基甘油及經PEG改質之二烷基甘油。在例示性實施例中，結構性脂質係選自由以下組成之群：膽固醇、植固醇、穀固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄次鹼、熊果酸及α-生育酚。在一些實施例中，結構性脂質為膽固醇。

在例示性實施例中，磷脂包括選自由以下組成之群之部分：磷脂醯基膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯基甘油、磷脂醯基絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯基膽鹼及鞘磷脂。在一些實施例中，磷脂包括一或多個選自由以下組成之群之脂肪酸部分：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、芥子酸、二十烷酸、花生四烯酸、植烷酸、二十碳五烯酸、二十二烷酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。在一些實施例中，磷脂係選自由以下組成之群：1,2-二亞油醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-丙三氧基-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二軟脂醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-雙十一醯基-sn-丙三氧基-磷酸膽鹼(DUPC)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-0-十八烯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(1 8:0二醚PC)、1-油醯基-2-膽固醇半丁二醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二次亞麻醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼、1,2-雙二十碳四烯醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼、1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼、1,2-二油醯基-sn-丙三氧基-3-磷醯基乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺(ME 1 6.0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二次亞麻醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺、1,2-雙二十碳四烯醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二二十二碳六烯醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基-rac-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)及鞘磷脂。在一些實施例中，磷脂為DOPE或DSPC。

作為進一步說明，磷脂可為DOPE及該組分可包含約35莫耳%至約45莫耳%該化合物、約10莫耳%至約20莫耳%DOPE、約38.5莫耳%至約48.5莫耳%結構性脂質及約1.5莫耳%PEG脂質。脂質組分可為約40莫耳%該化合物、約15莫耳%磷脂、約43.5莫耳%結構性脂質及約1.5莫耳%PEG脂質。

在一些實施例中，脂質組分與編碼PD-L1親和體試劑之mRNA (或其他聚核苷酸)之wt/wt比率為約5:1至約50:1，或約10:1至約40:1。

在一些實施例中，該金屬奈米粒子組合物之平均尺寸為約50 nm至約150 nm，或約80 nm至約120 nm。

在一些實施例中，該金屬奈米粒子組合物之多分散性指數為約0至約0.18，或約0.13至約0.17。

在一些實施例中，金屬奈米粒子組合物具有約-10至約+20 mV之ζ電位。

在一些實施例中，金屬奈米粒子組合物進一步包含選自由以下組成之群之陽離子性及/或可離子化脂質：3-(雙十二烷基胺基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、14,25-雙十三烷基-15,18,21,24-四氮雜-四十烷(KL25)、1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLin-DMA)、2,2-亞油醇基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二甲基胺基)丁酸三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-亞油醇基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]至二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)及(2R)-2-({8-[(3P)-膽固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))。

VI. 使用方法及醫藥組合物 本發明之親和體試劑適用於多種應用，包括(但不限於)治療性處理方法，諸如用於癌症之免疫療法。在一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑適用於活化、促進、增加及/或增強免疫反應、抑制腫瘤生長、降低腫瘤體積、誘導腫瘤消退、增加腫瘤細胞之細胞凋亡及/或降低腫瘤之致瘤性。在一些實施例中，本發明之多肽或藥劑亦適用於針對病原體(諸如病毒)之免疫療法。在一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑適用於抑制病毒感染、降低病毒感染、增加病毒感染之細胞之細胞凋亡及/或增加受病毒感染之細胞之殺傷。使用方法可為活體外、離體或活體內方法。

本發明提供使用親和體試劑活化個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用本文中所描述之親和體試劑促進個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用親和體試劑增加個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用親和體試劑增強個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高細胞介導之免疫性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加Th1型反應。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高T細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高CD4+ T細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高CD8+ T細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高CTL活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高CU活性及提高NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含抑制或降低Treg細胞之抑制活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含抑制或降低MDSC之抑制活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加記憶體T細胞之百分比之數值。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高長期免疫記憶功能。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含提高長期記憶力。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含不存在顯著副作用及/或基於免疫之毒性之跡象。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含不存在細胞介素釋放症候群(CRS)或細胞介素風暴之跡象。在一些實施例中，免疫反應為抗原刺激之結果。在一些實施例中，抗原刺激為腫瘤細胞。在一些實施例中，抗原刺激為癌症。在一些實施例中，抗原刺激為病原體。在一些實施例中，抗原刺激為病毒感染之細胞。

用於測定親和體試劑是否活化或抑制免疫反應之活體內及活體外分析法為此項技術中已知的。

在一些實施例中，增加個體之免疫反應的方法包含向個體投與治療有效量之本文中所描述之親和體試劑，其中親和體試劑結合人類PD-L1。在一些實施例中，增加個體之免疫反應的方法包含向個體投與治療有效量之本文中所描述之親和體試劑，其中親和體試劑為括特異性結合於PD-L1之含有親和體之抗體或包親和體多肽之受體陷阱融合多肽。在一些實施例中，增加個體之免疫反應的方法包含向個體投與治療有效量之經編碼之親和體，其中當在患者中表現時，經編碼之親和體產生包括抗PD-L1親和體多肽之重組型親和體試劑多肽。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，活化或增強針對腫瘤之持續性或長期免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之結合人類PD-L1之親和體試劑。在一些實施例中，活化或增強針對腫瘤之持續性免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之本文中所描述之親和體試劑，其中親和體試劑為特異性結合於PD-L1之含有親和體之抗體或包括親和體多肽之受體陷阱融合多肽。在一些實施例中，活化或增強針對腫瘤之持續性免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之經編碼之親和體，其中當在患者中表現時，經編碼之親和體產生包括抗PD-L1親和體多肽之重組型親和體試劑多肽。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，誘導可抑制腫瘤復發或腫瘤再生之持續性或長期免疫性之方法包含向個體投與治療有效量之結合人類PD-L1之親和體試劑。在一些實施例中，誘導可抑制腫瘤復發或腫瘤再生之持續性免疫性之方法包含向個體投與治療有效量之本文中所描述之親和體試劑，其中親和體試劑為結合於PD-L1之含有親和體之抗體或包括特異性親和體多肽之受體陷阱融合多肽。在一些實施例中，誘導可抑制腫瘤復發或腫瘤再生之持續性免疫性之方法包含向個體投與治療有效量之經編碼之親和體，其中當在患者中表現時，經編碼之親和體產生包括抗PD-L1親和體多肽之重組型親和體試劑多肽。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，抑制腫瘤復發或腫瘤再生之方法包含向個體投與治療有效量之結合人類PD-L1之親和體試劑。在一些實施例中，抑制腫瘤復發或腫瘤再生之方法包含向個體投與治療有效量之本文中所描述之親和體試劑，其中親和體試劑為特異性結合於PD-L1之含有親和體之抗體或包括親和體多肽之受體陷阱融合多肽。在一些實施例中，抑制腫瘤復發或腫瘤再生之方法包含向個體投與治療有效量之經編碼之親和體，其中當在患者中表現時，經編碼之親和體產生包括抗PD-L1親和體多肽之重組型親和體試劑多肽。

在一些實施例中，腫瘤表現或過表現由親和體試劑中所提供之除抗PD-L1親和體多肽以外的其他結合實體靶向之腫瘤抗原，亦即其中親和體試劑為雙特異性或多特異性試劑。

在一些實施例中，抑制腫瘤生長之方法包含向個體投與治療有效量之本文中所描述之親和體試劑。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體具有腫瘤，或個體具有已移除之腫瘤。

在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為選自由以下組成之群的腫瘤：結腸直腸腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、神經內分泌腫瘤、胃腸道腫瘤、黑素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤以及頭部及頸部腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為結腸直腸腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為卵巢腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為肺腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為胰臟腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為黑素瘤腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為膀胱腫瘤。

作為進一步說明，標的親和體試劑可用於治療患有癌症之患者，諸如骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌(Wilm's cancer)、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑素瘤、腎橫紋肌樣瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、多形性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭瘤、真性紅細胞增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌瘤癌或肝癌、乳癌或胃癌。在本發明之一些實施例中，癌症為轉移性癌症，例如上文所描述之種類之轉移性癌症。

在一些實施例中，癌症為血液癌。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：急性骨髓白血病(AML)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、多發性骨髓瘤、T細胞急性淋巴母細胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金氏淋巴瘤、彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)及皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。

本發明亦提供醫藥組合物，卻包含本文中所描述之親和體試劑及醫藥學上可接受之媒劑。在一些實施例中，醫藥組合物可用於免疫療法中。在一些實施例中，醫藥組合物可用於免疫腫瘤學中。在一些實施例中，組合物可用於抑制腫瘤生長。在一些實施例中，醫藥組合物可用於抑制個體(例如人類患者)中之腫瘤生長。在一些實施例中，組合物可用於治療癌症。在一些實施例中，醫藥組合物可用於治療個體(例如人類患者)中之癌症。

藉由組合經純化之本發明之親和體試劑與醫藥學上可接受之媒劑(例如載劑或賦形劑)來製備用於儲存及使用之調配物。熟習此項技術者通常將醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑視為調配物或醫藥組合物之非活性成分。

在一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑經凍乾及/或以凍乾形式儲存。在一些實施例中，將包含本文中所描述之親和體試劑之調配物凍乾。

適合的醫藥學上可接受之媒劑包括(但不限於)無毒性緩衝劑，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯化六羥季銨、苯紮氯銨、苄索氯銨、苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如小於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物，諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物，諸如Zn-蛋白質錯合物；及非離子性界面活性劑，諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22號增刊版本, 2012, Pharmaceutical Press, London.)。

本發明之醫藥組合物可以多種方式投與以用於局部或全身性治療。投藥可為局部的，藉由表皮或經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及散劑；經肺的，藉由吸入或吹入散劑或氣霧劑，包括藉由噴霧器；氣管內及鼻內；經口；或非經腸，包括靜脈內、動脈內、瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內(例如注射或輸注)或顱內(例如鞘內或室內)。

治療調配物可呈單位劑型。此類調配物包括錠劑、丸劑、膠囊、散劑、粒劑、於水或非水性介質中之溶液或懸浮液，或栓劑。在諸如錠劑之固體組合物中，主要活性成分將與醫藥載劑混合。習知製錠成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠及稀釋劑(例如水)。此等可用於形成固體預調配組合物，其含有本發明之化合物之均質混合物或其無毒性的醫藥學上可接受之鹽。接著，將固體預調配組合物細分成上文所描述之類型之單位劑型。調配物或組合物之錠劑或丸劑等可經包衣或以其他方式經混配以提供具有延長作用之優勢的劑型。舉例而言，錠劑或丸劑可包含由外部組分覆蓋之內部組合物。此外，兩種組分可由用於抵抗崩解及實現內部組分完整地通過胃或延遲釋放之腸溶層間隔開。多種材料可用於此類腸溶層或腸溶衣，此類材料包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、十六醇及乙酸纖維素之材料之混合物。

本文中所描述之親和體試劑亦可包埋於微膠囊中。此類微膠囊例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備，例如分別在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或巨乳液中之羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22號增刊版本, 2012, Pharmaceutical Press, London中所描述。

在一些實施例中，醫藥調配物包括本發明之親和體試劑與脂質體之複合物。用於產生脂質體之方法為熟習此項技術者已知的。舉例而言，某些脂質體可藉由反相蒸發，用包含膽鹼磷脂、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體經具有既定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。

在一些實施例中，可製備包含本文中所描述之親和體試劑之持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合的實例包括含有親和體試劑之固體疏水性聚合物之半可滲透基質，其中基質呈成形物品(例如薄膜或微膠囊)形式。持續釋放基質之實例包括聚酯；水凝膠，諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚乳酸交酯；L-麩胺酸及7-L-麩胺酸乙酯之共聚物；非可分解乙烯-乙酸乙烯酯；可分解乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)；蔗糖乙酸酯異丁酸鹽；及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

在一些實施例中，除投與本文中所描述之親和體試劑以外，方法或治療進一步包含投與至少一種其他免疫反應刺激劑。在一些實施例中，其他免疫反應刺激劑包括(但不限於)群落刺激因子(例如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、幹細胞因子(SCF))、介白素(例如IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、檢查點抑制劑、阻斷免疫抑制性功能之抗體(例如抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗CD3抗體)、toll樣受體(例如TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族之成員(例如CD80、CD86)。其他免疫反應刺激劑可在親和體試劑投藥之前、同時及/或之後投與。亦提供包含親和體試劑及免疫反應刺激劑之醫藥組合物。在一些實施例中，免疫反應刺激劑包含1、2、3種或更多種免疫反應刺激劑。

在一些實施例中，除投與本文中所描述之親和體試劑以外，方法或治療進一步包含投與至少一種其他治療劑。其他治療劑可在親和體試劑投藥之前、同時及/或之後投與。亦提供包含親和體試劑及其他治療劑之醫藥組合物。在一些實施例中，至少一種其他治療劑包含1、2、3種或更多種其他治療劑。

具有兩種或更多種治療劑之組合療法通常使用藉由不同作用機制起作用之試劑，儘管此不為所需。使用具有不同作用機制之藥劑之組合療法可引起加成或協同作用。組合療法可實現與單藥療法中所使用相比各藥劑之較低劑量，籍此降低毒性副作用及/或增加親和體試劑之治療指數。組合療法可降低產生耐受性癌細胞之可能性。在一些實施例中，組合療法包含影響免疫反應(例如增強或活化反應)之治療劑及影響(例如抑制或殺傷)腫瘤/癌細胞之治療劑。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，本文中所描述之親和體試劑與至少一種其他治療劑之組合引起加成或協同結果。在一些實施例中，組合療法引起親和體試劑之治療指數提高。在一些實施例中，組合療法引起其他治療劑之治療指數提高。在一些實施例中，組合療法引起親和體試劑之毒性及/或副作用降低。在一些實施例中，組合療法引起其他治療劑之毒性及/或副作用降低。

適用類別之治療劑包括例如抗微管蛋白劑、奧瑞他汀(auristatins)、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷基化劑(例如鉑錯合物，諸如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)及三-核鉑錯合物及卡鉑)、蒽環黴素、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學治療敏化劑、倍癌黴素、依託泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克希托普森(lexitropsin)、亞硝基脲、順氯氨鉑(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、輻射敏化劑、類固醇、紫杉烷、拓樸異構酶抑制劑、長春花生物鹼或其類似物。在一些實施例中，第二治療劑為烷基化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓樸異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。

可與本文中所描述之親和體試劑組合投與之治療劑包括化學治療劑。因此，在一些實施例中，方法或治療涉及投與本發明之親和體試劑與化學治療劑之組合或與化學治療劑之混合物之組合。親和體試劑治療可在投與化學療法之前、同時或之後進行。組合投藥可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共同投藥，或以任一順序但通常在一段時間內連續投與以使得所有活性劑可同時發揮其生物活性。此類治療劑之製劑及給藥時程可根據製造商說明書使用或由熟習此項技術者根據經驗來確定。此類化學療法之製劑及給藥時程亦描述於The Chemotherapy Source Book,第4版, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA中。

適用於本發明中之化學治療劑包括(但不限於)烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；氮芥，諸如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如醛葉酸；乙醯葡醛酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；類紫杉醇(taxoids)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL)及多烯紫杉醇(docetaxel) (TAXOTERE))；氯芥苯丁酸；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波黴素(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine) (XELODA)；及以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷諾昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(法樂通(Fareston))；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，其他治療劑為順鉑。在一些實施例中，其他治療劑為卡鉑。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，化學治療劑為拓樸異構酶抑制劑。拓樸異構酶抑制劑為干擾拓樸異構酶(例如拓樸異構酶I或II)之作用之化學療法劑。拓樸異構酶抑制劑包括(但不限於)小紅莓HCl、檸檬酸道諾黴素、米托蒽醌HCl、放線菌素D、依託泊苷、拓朴替康HCl、替尼泊甙(VM-26)及伊立替康(irinotecan)以及此等中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，其他治療劑為伊立替康。

在一些實施例中，化學治療劑為抗代謝物。抗代謝物為具有與常用生物化學反應所需之代謝物類似的結構，但不同足以干擾細胞之一或多種常用功能，諸如細胞分裂之化學物質。抗代謝物包括(但不限於)吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲唑(pemetrexed)、喃氟啶(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達拉濱及克拉屈濱(cladribine)以及此等中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，其他治療劑為吉西他濱。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，化學治療劑為抗有絲分裂劑，包括(但不限於)結合微管蛋白之藥劑。在一些實施例中，藥劑為紫杉烷。在一些實施例中，藥劑為太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇或太平洋紫杉醇或多烯他賽之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，藥劑為太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西他賽(TAXOTERE)、奈米顆粒白蛋白結合型太平洋紫杉醇(nab-太平洋紫杉醇；ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代實施例中，抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，諸如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱或長春地辛或其醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，抗有絲分裂劑為驅動蛋白Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶之抑制劑，諸如奧洛拉(Aurora) A或Plk1。在一些實施例中，其他治療劑為太平洋紫杉醇。在一些實施例中，其他治療劑為奈米顆粒白蛋白結合型太平洋紫杉醇。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，其他治療劑包含諸如小分子之藥劑。舉例而言，治療可涉及本發明之親和體試劑與小分子之組合投藥，該小分子充當針對腫瘤相關抗原(包括(但不限於)EGFR、HER2 (ErbB2)及/或VEGF)之抑制劑。在一些實施例中，本發明之親和體試劑與選自由以下組成之群的蛋白激酶抑制劑組合投與：吉非替尼(gefitinib)(IRESSA)、埃羅替尼(erlotinib)(TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib)(RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)及帕唑帕尼(pazopanib)(GW786034B)。在一些實施例中，其他治療劑包含mTOR抑制劑。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，其他治療劑為抑制癌症幹細胞路徑之小分子。在一些實施例中，其他治療劑為Notch路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為Wnt路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為BMP路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為Hippo路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為mTOR/AKR路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為RSPO/LGR路徑之抑制劑。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，其他治療劑包含生物學分子，諸如抗體。舉例而言，治療可涉及本發明之親和體試劑與針對腫瘤相關抗原之抗體(包括(但不限於)結合EGFR、HER2/ErbB2及/或VEGF之抗體)之組合投藥。在一些實施例中，其他治療劑為對癌症幹細胞標記具有特異性之抗體。在一些實施例中，其他治療劑為結合Notch路徑之組分之抗體。在一些實施例中，其他治療劑為結合Wnt路徑之組分之抗體。在一些實施例中，其他治療劑為抑制癌症幹細胞路徑之抗體。在一些實施例中，其他治療劑為Notch路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為Wnt路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為BMP路徑之抑制劑。在一些實施例中，其他治療劑為抑制β-連環蛋白信號傳導之抗體。在一些實施例中，其他治療劑為血管生成抑制劑之抗體(例如抗VEGF或VEGF受體抗體)。在一些實施例中，其他治療劑為貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕妥珠單抗(pertuzumab)(OMNITARG)、帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)或西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX)。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，其他治療劑為調節免疫反應之抗體。在一些實施例中，其他治療劑為抗PD-1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體或抗TIGIT抗體。

此外，用本文中所描述之親和體試劑進行之治療可包括用其他生物分子進行之組合治療，該等生物分子為諸如一或多種細胞介素(例如淋巴介質、白細胞間介素、腫瘤壞死因子及/或生長因子)或可藉由手術移除腫瘤、移除癌細胞或治療醫師認為必需的任何其他療法實現。在一些實施例中，其他治療劑為免疫反應刺激劑。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，親和體試劑可與選自由以下組成之群之生長因子組合：腎上腺髓素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、紅血球生成素(EPO)、FGF、GDNF、G-CSF GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、遷移刺激因子、肌肉抑制素(GDF-8)、NGF、神經營養素、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、P1GF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15及IL-18。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，其他治療劑為免疫反應刺激劑。在一些實施例中，免疫反應刺激劑係選自由以下組成之群：顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、介白素3 (IL-3)、介白素12 (IL-12)、介白素1 (IL-1)、介白素2 (IL-2)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、4-1BB配位體、抗CD3抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIGIT抗體、抗PD-1抗體、抗LAG-3抗體及抗TIM-3抗體。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，免疫反應刺激劑係選自由以下組成之群：PD-1活性調節劑、PD-L2活性調節劑、CTLA-4活性調節劑、CD28活性調節劑、CD80活性調節劑、CD86活性調節劑、4-1BB活性調節劑、OX40活性調節劑、KIR活性調節劑、Tim-3活性調節劑、LAG3活性調節劑、CD27活性調節劑、CD40活性調節劑、GITR活性調節劑、TIGIT活性調節劑、CD20活性調節劑、CD96活性調節劑、IDO1活性調節劑、細胞介素、趨化因子、干擾素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子(TNF)家族之成員及免疫刺激性寡核苷酸。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，免疫反應刺激劑係選自由以下組成之群：PD-1拮抗劑、PD-L2拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、CD80拮抗劑、CD86拮抗劑、KIR拮抗劑、Tim-3拮抗劑、LAG3拮抗劑、TIGIT拮抗劑、CD20拮抗劑、CD96拮抗劑及/或IDO1拮抗劑。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，PD-1拮抗劑為特異性結合PD-1之抗體。在一些實施例中，結合PD-1之抗體KEYTRUDA (MK-3475)、皮立珠單抗(pidilizumab)(CT-011)、尼沃單抗(nivolumab)(OPDIVO、BMS-936558、MDX-1106)、MEDI0680 (AMP-514)、REGN2810、BGB-A317、PDR-001或STI-A1110。在一些實施例中，結合PD-1之抗體描述於PCT公開案WO 2014/179664中，例如，鑑別為APE2058、APE1922、APE1923、APE1924、APE 1950或APE1963之抗體，或含有此等抗體中之任一者之CDR區之抗體。在其他實施例中，PD-1拮抗劑為融合蛋白質，其包括PD-L2，例如AMP-224。在其他實施例中，PD-1拮抗劑為肽抑制劑，例如AUNP-12。

在一些實施例中，CTLA-4拮抗劑為特異性結合CTLA-4之抗體。在一些實施例中，結合CTLA-4之抗體為伊派利單抗(YERVOY)或曲美木單抗(tremelimumab)(CP-675,206)。在一些實施例中，CTLA-4拮抗劑為CTLA-4融合蛋白質，例如KAHR-102。

在一些實施例中，LAG3拮抗劑為特異性結合LAG3之抗體。在一些實施例中，結合LAG3之抗體為IMP701、IMP731、BMS-986016、LAG525及GSK2831781。在一些實施例中，LAG3拮抗劑包括可溶性LAG3受體，例如IMP321。

在一些實施例中，KIR拮抗劑為特異性結合KIR之抗體。在一些實施例中，結合KIR之抗體為利瑞路單抗(lirilumab)。

在一些實施例中，免疫反應刺激劑係選自由以下組成之群：CD28促效劑、4-1BB促效劑、OX40促效劑、CD27促效劑、CD80促效劑、CD86促效劑、CD40促效劑及GITR促效劑。在一些實施例中，OX40促效劑包括OX40配位體或其OX40結合部分。舉例而言，OX40促效劑可為MEDI6383。在一些實施例中，OX40促效劑為特異性結合OX40之抗體。在一些實施例中，結合OX40之抗體為MEDI6469、MEDI0562或MOXR0916 (RG7888)。在一些實施例中，OX40促效劑為能夠表現OX40配位體之載體(例如表現載體或病毒，諸如腺病毒)。在一些實施例中，表現OX40之載體為δ-24-RGDOX或DNX2401。

在一些實施例中，4-1BB (CD137)促效劑為結合分子，諸如抗運載蛋白。在一些實施例中，抗運載蛋白為PRS-343。在一些實施例中，4-1BB促效劑為特異性結合4-1BB之抗體。在一些實施例中，結合4-1BB之抗體為PF-2566 (PF-05082566)或優瑞路單抗(urelumab)(BMS-663513)。

在一些實施例中，CD27促效劑為特異性結合CD27之抗體。在一些實施例中，結合CD27之抗體為瓦里木單抗(varlilumab)(CDX-1127)。

在一些實施例中，GITR促效劑包含GITR配位體或其GITR結合部分。在一些實施例中，GITR促效劑為特異性結合GITR之抗體。在一些實施例中，結合GITR之抗體為TRX518、MK-4166或INBRX-110。

在一些實施例中，免疫反應刺激劑包括(但不限於)細胞介素，諸如趨化因子、干擾素、白細胞間介素、淋巴介質及腫瘤壞死因子(TNF)家族之成員。在一些實施例中，免疫反應刺激劑包括免疫刺激性寡核苷酸，諸如CpG二核苷酸。

在一些實施例中，免疫反應刺激劑包括(但不限於)抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗CD80抗體、抗CD86抗體、抗4-1BB抗體、抗OX40抗體、抗KIR抗體、抗TIM-3抗體、抗LAG3抗體、抗CD27抗體、抗CD40抗體、抗GITR抗體、抗TIGIT抗體、抗CD20抗體、抗CD96抗體或抗IDO1抗體。

在一些實施例中，本文中所揭示之親和體試劑可單獨或與放射療法結合使用。

在一些實施例中，本文中所揭示之親和體試劑可單獨或與靶向療法結合使用。靶向療法之實例包括：激素療法、信號轉導抑制劑(例如EGFR抑制劑，諸如西妥昔單抗(cetuximab)(Erbitux)及埃羅替尼(erlotinib)(Tarceva))；HER2抑制劑(例如曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)及帕妥珠單抗(pertuzumab)(Perjeta))；BCR-ABL抑制劑(諸如伊馬替尼(imatinib)(Gleevec)及達沙替尼(dasatinib)(Sprycel))；ALK抑制劑(諸如克卓替尼(crizotinib)(Xalkori)及色瑞替尼(ceritinib)(Zykadia))；BRAF抑制劑(諸如維羅非尼(vemurafenib)Zelboraf)及達拉菲尼(dabrafenib)(Tafinlar))、基因表現調節劑、細胞凋亡誘導劑(例如硼替佐米(bortezomib)(Velcade)及卡非佐米(carfilzomib)(Kyprolis))、血管生成抑制劑(例如貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)及雷莫蘆單抗(ramucirumab)(Cyramza)、附接至毒素之單株抗體(例如貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)(Adcetris)及阿多曲妥珠單抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla))。

在一些實施例中，本發明之親和體試劑可與抗癌治療劑或免疫調節藥物(諸如免疫調節受體抑制劑，例如特異性結合於受體之抗體或其抗原結合片段)組合使用。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與Tim-3路徑拮抗劑結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與Vista路徑拮抗劑結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與BTLA路徑拮抗劑結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與LAG-3路徑拮抗劑結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與TIGIT路徑拮抗劑結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗PDL1抗體結合。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗CTLA4抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗CS1抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR2DL1/2/3抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗CD137抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗GITR抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗PD-L2抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT1抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT2抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT3抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT4抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT5抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT6抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT7抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ILT8抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗CD40抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗OX40抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR2DL1抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR2DL2/3抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR2DL4抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR2DL5A抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR2DL5B抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR3DL1抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR3DL2抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗KIR3DL3抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗NKG2A抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗NKG2C抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗ICOS抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗SIRPα抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗CD47抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗4-1BB抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗IL-10抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗TSLP抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與IL-10或聚乙二醇化IL-10結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗APRIL抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之抗PD-1抗體或其抗原結合片段與抗CD27抗體結合，例如作為醫藥組合物之一部分。

在本發明之一些實施例中，本發明之親和體試劑與STING促效劑結合，例如作為醫藥組合物之一部分。環狀二核苷酸(CDN)環狀二-AMP(由單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)及其他細菌產生)以及其類似物環狀二-GMP及環狀GMP-AMP由宿主細胞識別為病原體相關分子模式(PAMP)，其結合於稱為干擾素基因刺激劑(STING)之病原體識別受體(PRR)。STING為宿主哺乳動物細胞之細胞質中之接附蛋白質，其活化TANK結合激酶(TBK1)-IRF3及NF-κB信號傳導軸，引起IFN-β及其他強烈活化先天性免疫性之基因產物之誘導。現發現STING為宿主胞漿監督路徑之組分，宿主胞漿監督路徑感測細胞內病原體之感染且作為回應而誘導IFN-β之產生，引起由抗原特異性CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞以及病原體特異性抗體組成之適應性保護性病原體特異性免疫反應之產生。美國專利案第7,709,458號及第7,592,326號；PCT公開案第WO2007/054279號、第WO2014/093936號、第WO2014/179335號、第WO2014/189805號、第WO2015/185565號、第WO2016/096174號、第WO2016/145102號、第WO2017/027645號、第WO2017/027646號及第WO2017/075477號；及Yan等人, Bioorg. Med. Chem Lett. 18:5631-4, 2008。

在本發明之一些實施例中，本發明之親和體試劑與一或多種意欲刺激針對一或多種預定抗原之免疫反應之疫苗結合投與。抗原可直接投與個體，或可在個體內由例如自體或同種腫瘤細胞疫苗(例如GVAX)、樹突狀細胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、基於病毒之疫苗、細菌或酵母疫苗(例如單核球增多性李氏菌或釀酒酵母)等表現。參見例如Guo等人, Adv. Cancer Res. 2013; 119: 421-475；Obeid等人, Semin Oncol. 2015 August; 42(4): 549-561。目標抗原亦可為包含表中列舉之抗原之免疫活性部分的片段或融合多肽。

在本發明之一些實施例中，本發明之親和體試劑與一或多種止吐藥結合投與，該一或多種止吐藥包括(但不限於)：卡索匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)及其他NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊(palonosetron)(由MGI Pharma以Aloxi出售)、阿匹坦(aprepitant)(由Merck and Co.; Rahway, N.J.以Emend出售)、苯海拉明(diphenhydramine)(由Pfizer; New York, N.Y.以Benadryl出售)、安泰樂(hydroxyzine)(由Pfizer; New York, N.Y.以Atarax出售)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(由AH Robins Co,; Richmond, Va.以Reglan出售)、勞拉西泮(lorazepam)(以Wyeth; Madison, N.J.以Ativan出售)、阿普唑侖(alprazolam)(由Pfizer; New York, N.Y.以Xanax出售)、氟哌啶醇(haloperidol)(由Ortho-McNeil; Raritan, N.J.以Haldol出售)、氟哌啶(阿普唑侖)(Inapsine)、屈大麻酚(dronabinol)(由Solvay Pharmaceuticals, Inc.; Marietta, Ga.以Marinol出售)、地塞米松(dexamethasone)(由Merck and Co.; Rahway, N.J.以Decadron出售)、甲基潑尼龍(methylprednisolone)(由Pfizer; New York, N.Y.以Medrol出售)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)(由Glaxosmithkline; Research Triangle Park, N.C.以Compazine出售)、格拉司瓊(granisetron)(由Hoffmann-La Roche Inc.; Nutley, N.J.以Kytril出售)、昂丹司瓊(ondansetron)(由Glaxosmithkline; Research Triangle Park, N.C.以Zofran出售)、多拉司瓊(dolasetron)(由Sanofi-Aventis; New York, N.Y.以Anzemet出售)、特比司瓊(tropisetron)(由Novartis; East Hanover, N.J.以Navoban出售)。

癌症治療之其他副作用包括紅血球及白血球不足。因此，在本發明之一些實施例中，親和體試劑與治療或預防此類不足之藥劑(諸如非格司亭(filgrastim)、PEG-非格司亭、紅細胞生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa)或阿法達貝泊汀(darbepoetin alfa))結合投與。

在本發明之一些實施例中，本發明之親和體試劑與抗癌放射療法結合投與。舉例而言，在本發明之一些實施例中，放射療法為外粒子束療法(EBT)：一種用於向腫瘤位置遞送高能X射線束之方法。光束在患者外部產生(例如藉由線性加速器)且靶向腫瘤位點。此等X射線可破壞癌細胞且謹慎的治療計劃允許繞過周圍正常組織。不將放射性來源置放於患者體內。在本發明之一些實施例中，放射療法為質子光束療法：以質子代替X-射線轟擊患病組織之一種保形療法。在本發明之一些實施例中，放射療法為保形外部光束放射療法：使用先進技術將放射療法針對個體身體結構調整的程序。在本發明之一些實施例中，放射療法為近接療法：在體內暫時性放置放射性材料，通常用於對某一區域產生超劑量或增強輻射。

在本文中所描述之方法之一些實施例中，治療涉及投與本發明之親和體試劑與抗病毒療法之組合。親和體試劑治療可在投與抗病毒療法之前、同時或之後進行。組合療法中使用之抗病毒藥將取決於個體所感染之病毒。

組合投藥可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共同投藥，或以任一順序但通常在一段時間內連續投與以使得所有活性劑可同時發揮其生物活性。

應瞭解，本文中所描述之親和體試劑與至少一種其他治療劑之組合可以任何順序或同時投與。在一些實施例中，將向預先經歷第二治療劑治療之患者投與親和體試劑。在某些其他實施例中，親和體試劑及第二治療劑將大體上同時或並行投與。舉例而言，可向個體投與親和體試劑，同時進行用第二治療劑(例如化學療法)進行之治療療程。在一些實施例中，將在第二治療劑治療之1年內投與親和體試劑。在某些替代性實施例中，將在用第二治療劑進行之任何治療之10、8、6、4或2個月內投與親和體試劑。在某些其他實施例中，將在用第二治療劑進行之任何治療之4、3、2或1週內投與親和體試劑。在一些實施例中，將在用第二治療劑進行之任何治療之5、4、3、2或1天內投與親和體試劑。將進一步瞭解，可在約數小時或分鐘(亦即，實質上同時)內向個體投與兩種(或更多種)藥劑或治療。

對於疾病治療，本發明之親和體試劑之適合的劑量取決於所治療之疾病類型、疾病之嚴重度及病程、疾病反應、投與親和體試劑用於治療性或預防性目的、先前療法、患者之臨床病史等，皆由治療醫師酌情處理。親和體試劑可一次性或經持續若干天至若干個月之一系列治療投與，或直至實現治癒或實現疾病病況之減弱(例如腫瘤尺寸減小)。最佳給藥時程可由患者體內藥物積聚之量測結果來計算且將視個別藥劑之相關效能而變化。投藥醫師可決定最優劑量、給藥方法及重複率。在一些實施例中，劑量為每公斤體重0.01 μg至100 mg、每公斤體重0.1 μg至100 mg、每公斤體重1 μg至100 mg、每公斤體重1 mg至100 mg、每公斤體重1 mg至80 mg、每公斤體重10 mg至100 mg、每公斤體重10 mg至75 mg或每公斤體重10 mg至50mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約0.1 mg至約20 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約0.1 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約0.25 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約0.5 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約1 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約1.5 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約2 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約2.5 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約5 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約7.5 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約10 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約12.5 mg。在一些實施例中，親和體試劑之劑量為每公斤體重約15 mg。在一些實施例中，劑量可每天每週、每月或每年一次或多次投與。在一些實施例中，每週一次、每兩週一次、每三週一次或每四週一次投與親和體試劑。

在一些實施例中，親和體試劑可以初始較高「負載」劑量，接著一或多個較低劑量投與。在一些實施例中，亦可改變投藥頻率。在一些實施例中，給藥方案可包含一週一次、每兩週一次、每三週一次或每月一次投與初始劑量，繼而其他劑量(或「維持」劑量)。舉例而言，給藥方案可包含投與初始起始劑量，繼而例如二分之一初始劑量之每週維持劑量。或給藥方案可包含投與初始起始劑量，繼而例如每隔一週二分之一初始劑量之維持劑量。或給藥方案可包含投與三個初始劑量持續3週，繼而例如每隔一週相同量之維持劑量。

如熟習此項技術者已知，投與任何治療劑可能引起副作用及/或毒性。在一些情況下，副作用及/或毒性如此嚴重以至於妨礙以治療學上有效劑量投與特定藥劑。在一些情況下，藥物療法必須中斷，且可嘗試其他藥劑。然而，相同治療類型中之許多藥劑通常顯示類似副作用及/或毒性，意謂患者必須停止療法，或若有可能，患有與治療劑相關聯之不合意的副作用。

在一些實施例中，給藥時程可限於投藥或「循環」之特定數目。在一些實施例中，親和體試劑投與3、4、5、6、7、8或更多個循環。舉例而言，每2週投與親和體試劑6個循環、每3週投與親和體試劑6個循環、每2週投與親和體試劑4個循環、每3週投與親和體試劑4個循環等。給藥排程可由熟習此項技術者決定且接著修改。

因此，本發明提供向個體投與本文中所描述之多肽或藥劑之方法，其包含使用間歇性給藥策略投與一或多種藥劑，其可降低與親和體試劑、化學治療劑等之投藥相關聯之副作用及/或毒性。在一些實施例中，一種治療人類個體中之癌症之方法包含向個體投與治療學上有效劑量之親和體試劑與治療學上有效劑量之化學治療劑之組合，其中該等藥劑中之一者或兩者係根據間歇性給藥策略投與。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之親和體試劑，及約每2週一次投與後續劑量之親和體試劑。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之親和體試劑，及約每3週一次投與後續劑量之親和體試劑。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之親和體試劑，且約每4週一次投與後續劑量之親和體試劑。在一些實施例中，使用間歇性給藥策略投與親和體試劑且每週投與化學治療劑。

在一些實施例中，本發明亦提供使用本發明之親和體試劑治療個體之方法，其中個體罹患病毒感染。在一些實施例中，病毒感染為選自由以下組成之群之病毒的感染：人類免疫缺乏病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒、鼻病毒、科沙奇病毒、冠狀病毒、呼吸道融合性病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或蟲媒腦炎病毒。

在一些實施例中，本發明提供使用本發明之親和體試劑治療個體之方法，其中個體罹患細菌感染。在一些實施例中，細菌感染為選自由以下組成之群的細菌的感染：衣原體(Chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄狀球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷菌屬(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌屬(Legionella)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙門氏菌(Salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、破傷風梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽桿菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)、麻風分支桿菌(Mycobacterium leprae)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium lepromatosis)及包柔體屬(Borriella)。

在一些實施例中，本發明提供使用本發明之親和體試劑治療個體之方法，其中個體罹患真菌感染。在一些實施例中，真菌感染為選自由以下組成之群的真菌的感染：念珠菌屬(Candida)(白色念珠菌(albican)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus)(菸麯黴(fumigatus)、黑麯黴(niger)等)、毛黴屬(Genus Mucorales)(白黴菌屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴菌屬(rhizopus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。

在一些實施例中，本發明提供使用本發明之親和體試劑治療個體之方法，其中個體罹患寄生蟲感染。在一些實施例中，寄生蟲感染為感染選自由以下組成之群的寄生蟲的感染：溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福勒氏耐格里原蟲(Naegleria fowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴倍蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。

實例 實例 1 ： 自噬菌體呈現文庫選擇結合 PD-L1 之親和體 可藉由自具有兩個隨機環之親和體(舉例而言通常但非排他地，9個胺基酸之相同長度)進行選擇來鑑別本發明之肽，例如結合PD-L1之組分。

如上文所指示，藉由自包含基於Stefin A之序列之恆定親和體構架主鏈中所顯示的長度為九個胺基酸之隨機環序列的噬菌體呈現文庫進行選擇來鑑別本發明之結合PD-L1之肽。此類選擇程序通常為已知的。根據此類程序，噬菌體之懸浮液與目標抗原(在抗生蛋白鏈菌素珠粒上捕捉之生物素化抗原或在盤上捕捉之未經生物素標記之抗原)一起培育。接著洗去未結合之噬菌體且接著，藉由在將抗原與低pH值溶液接著高pH值溶液一起培育來溶離結合之噬菌體。接著，用大腸桿菌感染經釋放、經pH值中和之噬菌體溶液且獲得第一輪噬菌體製劑。重複進行循環，例如兩次或三次且為了富集靶向噬菌體，可在後兩輪選擇中增加嚴格度條件，例如藉由增加洗滌步驟之數目、降低抗原濃度及重新選擇經阻斷的抗生蛋白鏈菌素珠粒或經阻斷試劑塗佈之孔。

在藉由連續噬菌體擴增循環進行選擇後，藉由可溶性親和體ELISA鑑別結合PD-L1之純系。簡言之，親和體由噬菌粒載體過表現，細菌細胞溶解且溶解物用於ELISA中，用針對親和體上之His6標籤之結合抗體偵測在盤上固定之結合於PD-L1之親和體。將展示特異性結合之純系定序以鑑別環序列。

作為說明，自親和體文庫選擇結合PD-L1之噬菌體係使用自約6×10¹⁰ 多樣性之尺寸之文庫添加的約1×10¹² 個噬菌體如下文所描述進行。

在M280抗生蛋白鏈菌素或中性抗生物素蛋白珠粒(Thermo Scientific)上捕捉生物素化抗原。由R&D以Fc裂解之格式提供抗原且使用EZ Link Sulfo-NHS-LC Biotin套組(Pierce)內部生物素化。

實例 2 ： 抗 PD-L1 親和體與表現 PD-L1 之 人類癌細胞株之結合親和力 ( 圖 2) 在人類肺腺癌細胞株上使用流式細胞測量術測定AVA04親和體多肽之結合親和力。表現PD-L1之H441細胞在含有10% FBS (Gibco)之RPMI-2640 (Sigma)中與青黴素(100 U/ml，Hyclone)及鏈黴素(100 μg/ml，Hyclone)一起生長，其中自使用DPBS洗滌之組織培養物剝離。藉由在300 rpm下離心5分鐘來收集細胞。細胞再懸浮於PBS中且在圓底96孔盤中以50000個細胞/孔進行分配。用PBS洗滌細胞。親和體及對照物在染色緩衝液(R&D)中一式兩份地稀釋且在4±1℃學，在細胞上添加以用於染色約60分鐘。洗滌細胞且二級抗胱抑素A (R&D)在染色緩衝液(R&D)中以1:15稀釋，且在4±1℃下，在細胞上添加以用於染色約40分鐘。洗滌細胞且偵測抗體A488抗山羊(Biolegend)在染色緩衝液(R&D)中以1:100稀釋，且在4±1℃下，在細胞上添加以用於染色約30分鐘。最終，洗滌細胞，在4±1℃下，使用在染色緩衝液中稀釋之L/D染料Zombie Aqua (Biolegend)將活及死的細胞染色10分鐘。洗滌細胞且在4±1℃下經10分鐘向各孔添加固定緩衝液(R&D)，接著添加具有EDTA之PBS (Lonza)，隨後用流式細胞儀(Guava 12 HT，Millipore)對盤進行讀取。排除死細胞且獲得綠色螢光通道(488 nm/525/30)。使用Incyte分析結果且使用格拉夫帕德(graphpad)標繪資料。

AVA04親和體多肽之實例提供於表 4A 、4B 及5 。

表 4A. 實例 PD-L1 親和體多肽之環序列

表 4B. 實例 PD-L1 親和體多肽之完全胺基酸序列

表 5. 實例 PD-L1 親和體多肽序列

實例 3 ：大腸桿菌中親和體多聚體之表現 ( 圖 3 ) 使用製造商方案將200 ng表現質體pD861 (Atum)轉型至BL21大腸桿菌細胞(Millipore)中。將所有轉型細胞混合物塗佈於含有50 μg/ml之卡那黴素(AppliChem)之LB瓊脂盤上且在37℃下培育隔夜。

接著，將經轉型之大腸桿菌之菌苔轉移至1x培養液培養基(Melford)及50 μg/ml之卡那黴素之無菌燒瓶中且在30℃下，在250 rpm下振盪培育。在細胞達到0.8-1.0之OD600後，用10 mM鼠李糖(Alfa Aesar)誘導表現，接著在37℃下培育培養物5小時。藉由在4,500 rpm下離心1小時來收集細胞。

對於培養物體積＜500 ml，藉由再懸浮於補充有每公克濕潤細胞漿料(Millipore)、溶菌酶(Applichem)及核酸酶(Millipore)0.5 ml 10x BugBuster之1:10 NPI20緩衝液(50 mM磷酸鈉、0.5 M NaCl、20 mM咪唑(Sigma))使大腸桿菌細胞小球溶解。在瓶滾筒上，細胞在室溫下溶解1小時。對於培養物體積＞500 ml，使細胞小球再懸浮於1:10補充之NPI20中且音波處理2分鐘(10秒開/關循環)。在裂解之後，溶液在4℃下，在20,000 xg下離心1小時。

使用鎳瓊脂糖親和力樹脂 (Super-NiNTA500 ； Generon) 進行之 來自澄清上清液之 His 標記蛋白質之批料結合親和純化 用5倍管柱體積(CV)水洗滌適合體積之NiNTA樹脂(結合能力為每20 mg蛋白質1 mL)以移除儲存溶液，接著在StEP™管柱(Thompson)中使用重力流，永5 CV NPI20緩衝液平衡。樹脂與澄清大腸桿菌溶液一起在室溫下培育1小時。接著，使溶液藉由重力流通過StEP™管柱且用5 CV NPI20緩衝液洗滌樹脂。用5 CV NPI400(50 mM磷酸鈉、0.5 M NaCl、0.4 M咪唑(Sigma))自樹脂溶離出結合蛋白質。使用Centripure管柱(emp Biotech GmbH)在1x PBS中將經溶離之蛋白質脫鹽。使用Nanodrop (Thermo)A280讀取器評估蛋白質產率。在AKTA Xpress(GE)，在2.6 ml/min之流動速率下，在PBS 1x中，使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg (GE)進行製備型SEC。在200 V下，在Novex™ 20X Bolt™ MES SDS操作緩衝液(Thermo)中，用SDS-PAGE Bolt BisTris加4-12%凝膠(Thermo)操作經溶離之蛋白質樣品，其中在95℃下還原樣品緩衝液10分鐘。凝膠上之蛋白質帶用Quick Coommassie (Generon)染色。在凝膠上操作PageRuler預染色之蛋白質分子量標記(Thermo)以評估融合蛋白質之分子量。

實例 4 ： 競爭性 Elisa 分析法及 PDL-1 結合 Biacore ( 圖 4A 及圖 4B) PD-L1/PD-1 競爭性 ELISA ( 圖 4A) 藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)評估親和體多聚體之競爭性抑制。在盤上，以0.5 µg/ml塗佈hu PD-1-Fc (R&D Systems)。盤使用盤洗滌器，用150 μl洗滌緩衝液(PBS，Tween 20，0.1%)洗滌2次，且在室溫下(25±1℃)在含5%酪蛋白(Sigma)之PBS中飽和90分鐘。如先前所描述洗滌盤。接著，一式兩份地稀釋親和體及對照物(hu PD-1-Fc，R&D Systems，空白)，且與30 ng/ml之huPD-L1-Fc (R&D Systems)一起預培育30分鐘，接著在室溫(25±1℃)下裝載在盤上保持90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次。接著在稀釋緩衝液中稀釋生物素化多株抗體抗hu PD-L1 (R&D Systems)且在室溫(25±1℃)下培育90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次且在室溫(25±1℃)下培育抗生蛋白鏈菌素HRP30分鐘。洗滌盤且在盤中經10分鐘添加受質(TMB，Pierce Thermo-Scientific)。使用酸性溶液停止反應且在450-630 nm下讀取盤。接著使用內插非線性四參數標準曲線計算IC50。

PD-L1 結合 Biacore ( 圖 4B) 使用操作緩衝液HBS-EP+(GE)及S系列感測器CM5晶片對AVA04-141串聯融合(ILF)格式進行Biacore T200動力學分析，該晶片使用胺偶合試劑(GE)，用含PD-L1-Fc (R&D Systems)之10 mM乙酸鈉pH 4.0 (GE)固定。在150秒關聯時間，接著在30 µl/min之流動速率下之300秒解離時間下操作親和體單體之濃度滴定物作為分析物，。在300秒關聯時間，接著在30 µl/min之流動速率下之600秒解離時間下操作親和體二聚體、三聚體及四聚體融合蛋白質作為分析物。在20 µl/min之流動速率下，用5 mM NaOH (GE)使PD-L1-Fc固定之表面再生20秒。減去資料空白且針對1:1朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體；GE)擬合以計算表觀KD值。

實例 5 ： 親和體 Fc 融合物及效應子功能 (ADCC) 之表徵 SEC-HPLC ( 圖 5A) 根據製造商方案，使用Expifectamine試劑(Thermo)，用表現載體pD2610v14 (Atum)進行懸浮液HEK細胞(Expi293F細胞株；Thermo)轉染。在轉染後第7天，藉由在10,000xg下離心1小時來收集上清液且使用0.45 µm濾紙過濾。在AKTA Xpress (GE)上使用mabSelect Sure HiTrap管柱純化蛋白質。樹脂用5倍管柱體積(CV)水洗滌，用5 CV PBS 1x平衡。接著，使上清液以5 ml/min之流動速率流過，接著用10 CV PBS 1x洗滌。在5 CV 0.1 M甘胺酸pH 2.8中溶離結合之蛋白質，使用Centripure脫鹽管柱(empBiotech GmbH)將緩衝液更換成PBS 1x。接著，如實例3中所描述進行製備型SEC。在PBS 1x中，在0.8 ml/min下，使用在Ultimate 3000 HPLC (Thermo)上操作之MAbPac SEC-1管柱(Thermo)進行分析型SEC。

Biacore 動力學 ( 圖 5B) 如實例4中所描述進行Biacore動力學分析，其中關聯時間為700秒且解離時間為1200秒。在20 µl/min之流動速率下，用3.5 nM NaOH (GE)進行表面再生20秒以用於低濃度。對於高濃度，時間增加至30秒。

ADCC 報導子生物分析法 ( 圖 5C) ADCC報導子生物分析法為來自Promega Corp.之生物發光報導分析法，其用於定量ADCC作用機制(MOA)分析法中治療性抗體藥物之路徑活化之生物活性，在功能性IgG1 Fc上格式化之AVA04-251能夠在≥1 nM之EC50下展示ADCC功能。

簡言之，在96孔盤中，在100 μl中以20000個細胞/孔之密度接種目標細胞H441細胞(表現huPD-L1)且在潮濕的CO2培育箱中培育20小時。第二天，在ADCC緩衝液(Promega)中一式兩份地稀釋樣品及對照物。同時，解凍效應細胞(Jurkat FCgRIIIa報導子NFAT細胞，Promega)且在3.6 ml ADCC緩衝液中稀釋630 μl初始細胞懸浮液。自盤移除95 μl介質且在各孔中添加25 μl ADCC緩衝液、25 μl樣品稀釋物或對照物及25 μl效應細胞。盤在潮濕的CO2培育箱中培育6小時。接著，盤在室溫下平衡且在各反應孔中添加75 μl BioGLo Luciferase Assay試劑(Promega)且在室溫下培育5-10分鐘。接著，使用盤讀取器(Clariostar，BMG)量測發光。使用格拉夫帕德以誘導=f(log濃度)之倍數形式標繪結果。

實例 6 ： 競爭性 Elisa 分析法 ( 圖 6A-6C) PD-L1/PD-1 競爭 ELISA ( 圖 6A) 在如圖4A所描述之競爭性ELISA中測試各種親和體多肽格式化on_V.2。所有所測試之格式化親和體皆為競爭性的，其中IC50範圍為0.26至24.6 nM。對照性抗體(29E2A3，Biolegend)為競爭性的，其中IC50與格式化親和體類似(IC50=0.18 nM)。

PD-L1/CD80 競爭 ELISA ( 圖 6B) 在競爭性ELISA中測試各種親和體多肽格式化on_V.2。

所有所測試之格式化親和體皆為與CD80具有競爭性的，其中IC50範圍為0.41至12.77 nM。對照性抗體(29E2A3，Biolegend)為競爭性的，其中IC50與格式化親和體類似(IC50=0.31 nM)。

簡言之，藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)評估競爭性抑制。在盤上以1 μg/ml塗佈hu CD80-Fc (R&D Systems)。盤使用盤洗滌器，用150 μl洗滌緩衝液(PBS，Tween 20，0.1%)洗滌2次，且在室溫下(25±1℃)在含5%酪蛋白(Sigma)之PBS中飽和90分鐘。如先前所描述洗滌盤。接著一式兩份地稀釋親和體及對照物(mAb抗huPD-L1 29E.2A3，Biolegend；hu PD-L1-Fc，R&D Systems，空白)，且與1.6 nM huPD-L1-Fc (R&D Systems)一起預培育30分鐘，接著在室溫(25±1℃)下裝載於盤上保持90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次。接著在稀釋緩衝液中稀釋生物素化多株抗體抗hu PD-L1 (R&D Systems)且在室溫(25±1℃)下培育90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次且在室溫(25±1℃)下培育抗生蛋白鏈菌素HRP30分鐘。洗滌盤且在盤中經10分鐘添加受質(TMB，Pierce Thermo-Scientific)。使用酸性溶液停止反應且在450-630 nm下讀取盤。接著使用內插非線性四參數標準曲線計算IC50。

基準抗體競爭 ELISA ( 圖 6C) 在針對艾維路單抗、阿特珠單抗及德瓦魯單抗之競爭性ELISA中測試AVA04-25_V.2。AVA04-251_V.2與各基準抗體具有競爭性，其中IC50範圍為0.29至1.71 nM。

簡言之，藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)評估基準抗體之競爭性抑制。將艾維路單抗、阿特珠單抗及德瓦魯單抗以0.5 μg/ml塗佈於盤上。盤使用盤洗滌器，用150 μl洗滌緩衝液(PBS，Tween 20，0.1%)洗滌2次，且在室溫下(25±1℃)在含5%酪蛋白(Sigma)之PBS中飽和90分鐘。如先前所描述洗滌盤。接著一式兩份地稀釋親和體及對照物(基準抗體，空白)，且與0.07 nM huPD-L1-Fc (R&D Systems)一起預培育60分鐘，接著在室溫(25±1℃)下裝載於盤上保持90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次。接著在稀釋緩衝液中稀釋生物素化多株抗體抗hu PD-L1 (R&D Systems)且在室溫(25±1℃)下培育90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次且在室溫(25±1℃)下培育抗生蛋白鏈菌素HRP30分鐘。洗滌盤且在盤中經10分鐘添加受質(TMB，Pierce Thermo-Scientific)。使用酸性溶液停止反應且在450-630 nm下讀取盤。接著使用內插非線性四參數標準曲線計算IC50。

實例 7 ： 親和體半衰期延長 ( 圖 7) 及組織分佈 ( 圖 30) 之藥物動力學研究 以10 mg/kg向C57BL/6小鼠靜脈內(IV)注射AVA04-251_V.2。對6隻小鼠進行注射且在9個時間點進行收集(0小時、0.25小時、6小時、24小時、72小時、120小時、168小時、336小時及480小時)。收集各時間點之血清樣品且使用所注射之分子作為參考標準藉由夾心ELISA進行分析。在15分鐘時，結果表示為初始劑量之百分比。

此藥物動力學研究中使用之AVA04-251_V.2係使用如實例5中所描述之Expifectamine轉染自Expi293F產生。使用Endosafe Nexgen-PTS™讀取器(Charles River)進行LAL分析法以確認蛋白質樣品中之內毒素含量為0.01 EU/mg。使用製造商方案，使用HEK293 HCP 第2代ELISA (Cygnus)定量哺乳動物宿主細胞蛋白質。以每毫克蛋白質計，樣品含有5 μg/ml之HCP。

評估在向具有原位MDA-MB-231腫瘤細胞之人類化NOG小鼠靜脈內投投與125I-親和體及125I-艾維路單抗之後的總放射活性之組織分佈(圖 32A )。小鼠根據其腫瘤尺寸隨機分組且靜脈內注射艾維路單抗或AVA04-251_V.2 (n=5隻/組及時間點)。在第8及96小時處死小鼠。採集且移出血液及器官且稱重。使用經設計以用於γ放射線之偵測及定量量測的RIASTAR A5410多重偵測器γ計數器(Packard)測定生物樣品中所含的總放射活性。將經稱重之樣本之等分試樣引入5 mL聚丙烯管中。接著，將試管裝載至計數盤中以用於直接γ偵測。圖31B 展示電漿/腫瘤比。

總體而言，AVA04-251_V.2與艾維路單抗具有類似的組織分佈。

實例 9 ： 藉由人類 PBMC 刺激分析法測試免疫原性 ( 圖 8) 如實例5中所描述進行親和體母HEK細胞轉染及mabSelectSure純化，其中使用SP高效管柱(GE)及使用20 mM乙酸鈉pH 4緩衝液增加陽離子交換純化步驟。使用操作緩衝液之10 CV洗滌液及0.1%曲拉通(triton)114x (Sigma)以移除帶負電內毒素。用20 mM乙酸鈉pH 4及2 M NaCl溶離結合之蛋白質。如實例3中所描述進行製備型SEC。使用Endosafe Nexgen-PTS™讀取器(Charles River)進行LAL分析法以確認蛋白質樣品中之內毒素含量為0.04 EU/mg。使用製造商方案，使用HEK293 HCP定量套組(Cygnus)定量宿主細胞蛋白質。以每毫克蛋白質計，樣品含有30 ng/ml之HCP。

自低溫儲存器擷取自每位健康供體分離之PBMC且在不含血清之細胞培養基中解凍，且接種至經組織培養物處理之96孔圓底微量培養盤中。所有測試產物在不含血清之細胞培養基中稀釋且以50 μg/ml之最終濃度添加至孔中，在25 μg/ml下測試Stefin A。細胞在培養物中保持7天。藉由量測5-乙炔基-2´-脫氧尿苷(EdU)合併來評估CD4+ T細胞增殖。在第6天，用EdU對PBMC培養物進行脈衝約16小時。在第7天，細胞針對T細胞表面標記(CD3、CD4及CD8)進行螢光染色、固定及滲透，且用螢光疊氮化合物將併入之EdU染色。刺激指數計算為針對緩衝液之比率。SI＞2視為陽性反應。標繪各測試分子之反應百分比。

總體而言，在7天處理之後，僅陽性對照物KLH能夠刺激T細胞增殖。

實例 10 ： 在 Fc 上在各種位點處格式化親和體 ( 圖 9) 在hIgG1 Fc(AG)上，如實例5中所描述對AVA04-236-A (EAAAK)6 hIgG1 Fc (AR)、AVA04-236-A(EAAAK)6 hIgG1 Fc C端親和體(AQ)及AVA04-236二聚體進行Expi293F轉染及一階段mabSelect Sure純化。使用MAbPac SEC-1 (Thermo)進行分析型SEC且在PBS 1x移動相中，以0.8 ml/min用Ultimate 3000 HPLC (Thermo)操作。hIgG1 Fc上之AVA04-236-A(EAAAK)6 hIgG1 Fc、AVA04-236-A(EAAAK)6 hIgG1 FcC端親和體及AVA04-236二聚體之結果分別為96%、97%及92%。

實例 11 ： 動力學分析 ( 圖 10) 如實例4中所描述對單體親和體、N端hIgG1 Fc硬性連接子(AR)、N端二聚體hIgG1 Fc(AG)、C端hIgG1可撓性連接子(AQ)及N端hIgG1可撓性連接子(V.2)進行Biacore動力學分析。分析使用500秒關聯時間及800秒解離時間。在20 μl/min下，用3 mM NaOH (GE)進行再生20秒。單體親和體、N端hIgG1 Fc硬性連接子、N端二聚體hIgG1 Fc、C端hIgG1可撓性連接子及N端hIgG1可撓性連接子之K_D 結果分別為6.4 nM、0.89 nM、0.19 nM、2.01 nM及0.63 nM。

實例 12 ：伊派利單抗 ( 生物類似 ) 融合物分析 ( 圖 11A-11B) 用1:1比率之重鏈:輕鏈載體pD2610v14(Atum)對伊派利單抗及伊派利單抗-AVVA04-141進行Expi293F轉染。如實例5中所描述進行親和層析及分析型SEC HPLC。如實例3中所描述進行製備型SEC以及還原及非還原型SDS-PAGE QC。

實例 13 ： 動力學分析 ( 圖 12A-12C) 使用實例4中描述之方案進行Biacore動力學分析。使用在10 mM乙酸鈉pH 4緩衝液(GE)中偶合之胺將伊派利單抗-141融合蛋白質固定在CM5晶片表面上。滴定PD-L1-Fc或CTLA4-Fc抗原(R&D Systems)，對於PD-L1-Fc，關聯時間為300秒且解離時間為600秒，且對於CTLA4-Fc，700秒關聯及1200秒解離時間。在20 µl/min下，使用3 mM NaOH (GE)進行再生20秒。

實例 14 ： 藉由藥物動力學分析進行之雙特異性貝伐珠單抗 ( 生物類似 )-PD-L1 親和體表徵 ( 圖 13A-13C) 及半衰期測定 ( 圖 13D) 使用1:1 VH:Vk質體pD2610v14 (Atum)之轉染比率，如實例5中所描述產生貝伐珠單抗-AVA04-251雙特異性Af-mAb。使用與10 mM乙酸鈉pH 5.0 (GE)偶合之胺將具有剛性或可撓性連接子之貝伐珠單抗-AVA04-251雙特異性Af-mAb固定在CM5晶片表面上。在300秒關聯時間及600秒解離時間下操作hPDL1-Fc (R&D Systems)作為分析物，在20 µl/min下用3 mM NaOH (GE)再生20秒(圖13B)。

分別使用與10 mM乙酸鈉pH 4.5及5.5 (GE)偶合之胺將貝伐珠單抗-AVA04-251雙特異性Af-mAb或貝伐珠單抗(生物類似，抗VEGF，Invivogen)固定在CM5晶片表面上。操作hVEGF(Peprotech)作為分析物且以單一循環動力學形式分析，在700秒關聯時間及1200秒解離時間下操作x5濃度，在20 µl/min下用3.5 mM NaOH (GE)再生20秒。減去資料空白且用1:1朗格繆爾結合模型BIAcore評估軟體(GE)進行分析以計算表觀值。

圖13D. C57/Bl6小鼠中之藥物動力學研究

如圖7所描述，以10 mg/kg向小鼠靜脈內(IV)注射。對6隻小鼠進行注射且在9個時間點進行收集(0小時、0.25小時、6小時、24小時、72小時、120小時、168小時及336小時)。收集各時間點之血清樣品且使用所注射之分子作為參考標準藉由夾心ELISA進行分析。在15分鐘時，結果表示為初始劑量之百分比。在約127小時時的β階段評估親和體Af-mAb半衰期，其與Fc格式化親和體(AVA04-251_AQ.2)類似。

實例 15 ：結晶學之蛋白質產生 ( 圖 14-16) hPD-L1結合域(N端IgV結構域18-134)表現為大腸桿菌中之包涵體。在4℃下，細胞小球溶解於Tris緩衝生理鹽水(TBS)中且補充8 M脲保持16小時。用溶離緩衝液TBS、8 M脲及400 mM咪唑，如圖3中所描述使用NiNTA純化His標記之抗原。藉由向1 L再摺疊緩衝液中逐滴添加約100 mg蛋白質來再摺疊蛋白質；100 mM Tris pH 8補充有0.5 M精胺酸。接著，在4℃下攪拌0.25 mM麩胱甘肽(還原及氧化)及蛋白酶抑制劑錠劑(不含EDTA；Roche)隔夜。接著，藉由切向流過濾(TTF)濃縮蛋白質且將緩衝液更換成TBS及10%甘油。在TBS及10%甘油操作緩衝液中，使用在2.6 ml/min下操作之AKTA Xpress (GE)，使用Hiload 26/600 Superdex 75 pg純化蛋白質。使用TBS操作緩衝液，如實例3中所描述表現及純化AVA04-261。在-20℃下以2 mg/ml儲存經溶離之蛋白質，接著以等莫耳量混合AVA04-261及hPD-L1抗原。接著，如上文所描述進行製備型SEC。將經溶離之溶離份濃縮至68 mg/ml。

為進行結晶學，使用0.1 µl蛋白質及0.1 µl儲集溶液，藉由沉滴式蒸氣擴散方法設置若干市售篩網。其保持在室溫下隔夜且自許多不同緩衝液獲得六角形晶體。用在25%聚醚胺SD-2001、100 mM MES pH 5.5及100 mM丙二酸二鈉中獲得之晶體收集繞射資料。晶體在母液中，在液氮中急驟冷卻。在Diamond light source, UK收集資料。藉由來源於pdb結構3KSE、4N6T及5C3T之模型，使用分子置換，使用CCP4套件溶解AVA04-261/hPD-L1結合域蛋白質複合物結構，繞射收集至2.09 Å。主要相互相用表面為疏水性，其中AVA04-261之環2與hD-L1抗原相互作用。hPD-L1結合表面與結合PD-L1之蛋白質之文獻實例極類似(1. Lee, J.等人 (2016) Nature Communications 7, 13354，2.Zak, K.等人 (2016) Oncotarget, 7, 30323，3.Zhang F.等人 (2017) Cell Discovery, 3, 17004.)。

實例 16 ： 半衰期延長之抗人類 PD-L1 二聚體親和體串聯融合物 (ILF) ： 示意圖及 XT 命名法以及剛性或可撓性基因連接子 ( 圖 17A-17B) 如實例3中詳細描述產生親和體ILF。在製備型SEC之後，如實例3中所描述用SEC-HPLC操作蛋白質，所有融合蛋白質之純度＞95%。參見圖17A。

Biacore動力學分析表明儘管基因融合，但抗人類PD-L1及抗人類血清白蛋白親和體皆能夠接合目標蛋白質，AVA04親和體在2-6倍親和力內結合人類PD-L1且HSA親和體以5倍親和力結合HSA(如實例4中所描述進行實驗)。使用操作緩衝液HBS-EP+ (GE)進行血清白蛋白之Biacore T200動力學分析，且使用胺偶合劑(GE)，用含人類血清白蛋白(δ；A37812)之10 mM乙酸鈉pH值5.0 (GE)將S系列感測器CM5晶片固定在表面Fc2上。在30 µl/min之流動速率下，進行親和體單體之濃度滴定作為分析物。動力學資料減去空白且針對1:1朗格繆爾結合模型(BIAcore評估軟體；GE)擬合以計算表觀KD值。參見圖17B。

實例 17 ： 具有半衰期延長部分之 ILF 三聚體 ( 圖 18A 、 B 及圖 31) 在位置A、B或C中具有半衰期延長親和體之ILF AVA04-251三聚體：Biacore動力學分析證實儘管基因融合，但親和體仍能夠接合目標蛋白質。AVA04親和體二聚體在2倍251 ILF二聚體(格式BH)內結合於人類PD-L1且其他親和體接合HSA。如實例4中關於PD-L1及實例4關於HSA結合所描述進行Biacore。

圖 31. ILF親和體XT之藥物動力學。

已在C57/Bl6小鼠中之藥物動力學研究中測試具有半衰期延長部分之ILF AVA04-251三聚體。如圖7所描述，以10 mg/kg向小鼠靜脈內(IV)注射。對6隻小鼠進行注射且在9個時間點進行收集(0小時、0.25小時、6小時、24小時、72小時、120小時、168小時及336小時)。收集各時間點之血清樣品且使用所注射之分子作為參考標準藉由夾心ELISA進行分析。在15分鐘時，結果表示為初始劑量之百分比。不含半衰期延長部分(BH)之親和體ILF具有快速清除率(t_1/2 為3.2小時)，但在β階段評估ILF AVA04-251 XT格式及半衰期，範圍為23.8-24.2小時。

實例 18 ：目標結合序列之分析 ( 圖 19) 跨越環4中x9胺基酸位置掃描AVA04-251丙胺酸。1 µl經純化之變異型蛋白質之還原性SDS-PAGE操作，對於所有變異體，大腸桿菌產率為約150 mg/L。在50 nM濃度下進行hPD-L1 Biacore動力學分析，鑑別環4之位置1及4為目標結合所必需的。

實例 19 ：穩定性 ( 圖 20 ) 為測試AVA04-251 V.2之穩定性，每個月在1 ml/min下，對在PBS 1x緩衝液中操作之Yarra-3000 (Phenomenex)進行SEC-HPLC分析保持九個月。在+4℃下儲存樣品。單體純度降低3-5%。

實例 20 ： ( 圖 21) AVA04-251 CG，抗PDL1親和體藉由鉸鏈S228P突變及(G4S)4連接子連接IgG4 Fc融合蛋白質。如實例5中所描述自短暫Expi293F細胞產生蛋白質。使用在100 mM檸檬酸鈉pH 3.5緩衝液中溶離之PrismA (GE)蛋白質A親和力樹脂純化融合蛋白質。接著，如實例3中所描述進行製備型SEC。在PBS 1x緩衝液中，在1 ml/min下，使用在Ultimate 3000 HPLC (Thermo)上操作之SEC-HPLC Yarra-3000管柱評估純度。最終蛋白質＞98%純度。

實例 21 ： ( 圖 22) AVA04-251 CF為具有用於還原ADCC之L153A、L154A Fc CH1突變之IgG1 Fc融合物。如實例5中所描述自短暫Expi293F細胞產生蛋白質且純化。在PBS 1x緩衝液中，在1 ml/min下，使用在Ultimate 3000 HPLC (Thermo)上操作之SEC-HPLC Yarra-3000管柱評估純度。最終蛋白質＞99%純度。

實例 22 ： ( 圖 23) AVA04-261親和體與Fc之IgG1鉸鏈區基因融合且由大腸桿菌產生(BN格式)。如實例3中所描述純化蛋白質。進行SDS-PAGE以證實二聚物質在非還原性條件下經由鉸鏈中之半胱胺酸二聚化，且在還原性緩衝液中還原成單體物質。根據製造商說明一式兩份地進行PD-1 PD-L1阻斷生物分析(Promega)分析法，且證實當與單體AVA04-261相比時，AVA04-261 BN格式具有親合力。AVA04-261 BN格式之Biacore產生59.9 pM KD。

實例 23 ： ( 圖 24) 在AVA04-251 AZ人類IgG1 Fc融合蛋白質中，親和體與Fc鉸鏈區直接融合。如實例5中所描述自短暫Expi293F細胞產生蛋白質且純化。在PBS 1x緩衝液中，在1 ml/min下，使用在Ultimate 3000 HPLC (Thermo)上操作之SEC-HPLC Yarra-3000管柱評估純度。最終蛋白質＞99%純度。Biacore單循環動力學資料減去空白且針對1:1結合模型擬合且表明KD為31.5 pM。PD-1 PD-L1阻斷生物分析法(Promega)表明與Fc鉸鏈及親和體之間的(G4S)4連接子之V.2格式相同的活性。

實例 24 ： ( 圖 25) 具有四個抗人類PD-L1親和體之人類IgG1 Fc融合物在Fc之N或C端融合。由Expi293F細胞產生AVA04-251 AG.3、AVA04-251 BS格式且使用mabselect sure樹脂純化。接著，如圖5A中所描述進行製備型SEC。在PD-1 PD-L1阻斷生物分析法(Promega)中，兩種格式皆展示阻斷PD-L1與PD-1之結合。Biacore單循環動力學資料減去空白且針對1:1結合模型擬合以說明AVA04-251 AG.3及AVA04-251 BS之KD分別為36.2 pM及25.7 pM。

實例 25 ： ( 圖 26) 進行PD-L1結合域(14 KDa)與Fc融合物AVA04-251 V.2或AVA04-236 V (82 kDa)之交聯質譜以分析非共價結合複合物。使用特別研發之交聯混合物(Bich, C等人 Anal. Chem., 2010, 82(1), 第172-179頁)將親和體Fc融合物與過量人類PD-L1結構域混合。在+4℃下混合溶液且靜置隔夜。高質量偵測系統表徵0至1500 kDa之高質量範圍中之相互相用。MS參數，線性及正性模式，離子源1：20 kV，離子源2：17 kV。其中晶狀體12 kV脈衝，離子提取400 nsHM4，增益電壓：3.14 kV及加速電壓為20 kV。使用高質量MALDI質譜及化學交聯偵測單獨的AVA04-Fc融合蛋白質，物質結合一個(+14 kDa)及兩個PD-L1 (+28 kDa)蛋白質證實存在1:1及2:1物質之化學計量。

實例 28 ：食蟹獼猴交叉反應性 ( 圖 27 及 28) 如圖4中所描述進行使用Biacore例示之AVA04-251 V.2及CG格式之交叉反應性(圖 27 )。對人類及食蟹獼猴PD-L1 Fc抗原(R&D Systems)之親和力在2倍內，在26-47 pM範圍內。

藉由ELISA獲得之各種V.2格式化親和體之交叉反應性(圖 28 )。所測試之所有格式化親和體以0.085至0.375 nM範圍內之EC50結合於食蟹獼猴PD-L1。與最佳格式化親和體類似，在EC50=0.044 nM下偵測基準抗體。

簡言之，藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)評估交叉反應性。在盤上以2 μg/ml塗佈食蟹獼猴PD-L1 His標籤(Sino Biological)。盤使用盤洗滌器，用150 μl洗滌緩衝液(PBS，Tween 20，0.1%)洗滌2次，且在室溫下(25±1℃)在含5%酪蛋白(Sigma)之PBS中飽和90分鐘。如先前所描述洗滌盤。接著一式兩份地稀釋親和體及對照物(阿特珠單抗及空白)，且在室溫(25±1℃)下培育90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次。接著在稀釋緩衝液中稀釋多株抗體HRP抗hu Fc (Abcam)且在室溫(25±1℃)下培育90分鐘。如先前所描述洗滌盤3次且在盤中經10分鐘添加受質(TMB，Pierce Thermo-Scientific)。使用酸性溶液停止反應且在450-630 nm下讀取盤。接著使用內插非線性四參數標準曲線計算IC50。

實例 29 ：混合型淋巴細胞反應 ( 圖 29A 及 29B) 在MLR分析法中測試hFc1格式化親和體(圖 29A )。簡言之，由培養7天之CD14+單核細胞製備來源於單核細胞之樹突狀細胞(DC)。在第7天使用不成熟DC且與同種異體T細胞(陰性分離物)及參考物質或媒劑對照物共同培養。培養細胞4天且在培養物期結束時藉由ELISA量測上清液中之IFN-γ。資料呈現為平均值+/-標準差pg/ml(左側)或針對媒劑對照物正規化(右側)(n=6)。**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001，使用雙向ANOVA及鄧尼特事後檢定(Dunnett's post-test)比較測試物質與各別濃度SQT Gly V.2對照物。點線表示平均媒劑(RPMI-10)值。AVA04-251_V.2以與基準抗體(艾維路單抗)類似方式使IFNγ含量增加＞2倍。

如先前所描述在MLR分析法中測試XT格式化親和體(圖 29A )，AVA04-251 XT14及XT16以與ILF格式相同之方式增加IFNγ之含量(圖 29B )。

實例 30 ： PBMC 之葡萄球菌腸毒素 B 刺激 ( 圖 30) 在分析法開始時，來自健康人類供體(N=5)之PBMC與AVA04-251_V .2或對照抗體共同以低濃度(10及100 nM)與固定濃度之葡萄球菌腸毒素B (SEB；毒素技術)一起培養96小時。藉由HTRF分析(Cisbio)量測培養物上清液中之IL-2含量且與不含測試項目，單獨的SEB之基礎含量相比較。AVA04-251_V.2以劑量依賴性方式增加介白素-2(IL-2)產量。

實例 31 ： 具有原位 MDA-MB-231 腫瘤細胞之人類化 NOG 小鼠中 AVA04-251 Fc 之組織分佈 ( 圖 32A) 經由靜脈內途徑以10 mg/kg (500 µCi/kg)向小鼠(5隻/組)注射125I-AVA04 Fc或125I-艾維路單抗。在第8小時或第96小時處死小鼠且移出器官且稱重。使用RIASTAR A5410 (Packard)量測生物樣品中所含的總放射活性。以初始劑量之百分比(ID%)形式呈現各器官之結果電漿與腫瘤比(圖32B)展示在96小時之後，腫瘤中之聚集≥5倍的電漿中之含量且等效於艾維路單抗。

實例 32 ： C57/Bl6 小鼠 同基因型模型中 ， 人類化 PD-L1 MC38 中在 AVA04-251_V.2 處理後之 腫瘤生長抑制 ( 圖 33A-33D) 在右側腹區域中向小鼠(n=8)皮下接種人類化PD-L1 MC38腫瘤細胞株(其中小鼠PD-L1細胞外部分由hPD-L1置換)。在腫瘤≥80 mm³ 後注射產品及對照物。以10 mg/kg (AVA04-251_V.2及其對照物SQT_V.2)或5 mg/kg(對照抗體阿特珠單抗及同型對照物)之劑量每週2次進行處理持續3週。總體而言，兩種處理皆展示腫瘤生長抑制(圖 33A )。與對照物相比，所有用AVA04-251_V.2處理之小鼠具有降低之腫瘤尺寸(圖 33B )。在1500 mm³ 下之存活率曲線表明50%的注射AVA04-25_V.2之小鼠在隨機分組之後22天仍存活(圖 33C )。又，對照抗體(阿特珠單抗)之存活率曲線(圖 33D )表明50%的小鼠在D22時存活。

實例 33. NCG 小鼠中之人類化模型中，皮下 A375 人類黑素瘤之處理中，活體內功效研究中用 AVA04-251_V.2 處理之組中之腫瘤生長抑制 ( 圖 34A-34D) 自兩個健康供體分離PBMC。分離全部T細胞且在補充有IL-2之完全培養基中，在A375細胞上擴增兩輪歷時7至10天。在右側腹區域向小鼠(n=10)皮下接種含A375腫瘤細胞及經活化之T細胞之0.2 ml PBS以用於腫瘤發育。處理在細胞接種後1小時開始。每週2次投與AVA04-251_V.2持續3週。總體而言，當與對照物相比，兩種處理皆展示腫瘤生長抑制( 圖 34A) 。 與對照物相比，超過70%的用AVA04-251_V.2處理之小鼠具有降低之腫瘤尺寸( 圖 34B) 。在800 mm³ 下之存活率曲線表明所有用AVA04-25_V.2處理之小鼠在隨機分組之後的32天後達到800 mm3，其中對照組在第24天時便如此( 圖 33C) 。又，對照抗體(阿特珠單抗)之存活率曲線( 圖34D) 表明用對照抗體處理之組中的所有小鼠同樣在隨機分組之後的32天後達到800 mm³ 之腫瘤尺寸。

圖 1. 產生親和體文庫：可變結合環產生獨特的結合表面及可選親和體結合子。圖 2. 單體親和體結合。人類肺腺癌癌細胞株上藉由流式細胞測量術進行之親和體結合。圖 3. 親和體多聚體易於表現於大腸桿菌中達到高產率及純度之多種格式(甚至在振盪器燒瓶製備中)。圖 4A 及 4B. 親和體多聚體以證明除單體結合域以外的親合力之動力學結合於PD-L1。圖 5A 及 5B 及 5C. 親和體Fc融合物提供效應子功能、半衰期延長及增強之親和力。圖 6A-6C. 針對PD-1及CD80以及針對PD-L1抗體基準之競爭性ELISA。圖 7. 親和體-Fc融合物表明延長之血清半衰期。圖 8. 藉由人類PBMC刺激分析法進行之免疫原性測試表明核心親和體序列在人類中具有免疫原性之風險較低。圖 9. 概念驗證表明親和體可在人類Fc上之各種位點處格式化，且因此應轉譯成IgG-親和體融合物。典型(未最佳化)表現率在400-800 mg/l範圍內。使用分析型SEC-HPLC評估純度。圖 10. 說明使用Biacore測定之若干PD-L1親和體Fc格式之K_D ，證實用於精細調整結合動力學以滿足治療目標之高可撓性格式化。明顯觀測到二價Fc格式之親合力作用。圖 11A-11B. 在Expi293F細胞中暫時表現之伊派利單抗(生物類似)/AVA04-141，在蛋白質A純化後的經純化之產率為約160 mg/L。圖 12A-12C. 未經最佳化之Biacore表明雙特異性抗體-親和體融合物能夠接合兩個目標。圖 13A-13D. 在Expi293F細胞中暫時表現之貝伐珠單抗(生物類似)/AVA04-251可純化至超過97%產率，且Biacore表明無論構築體是否包括可撓性連接子[(G4S)3]或剛性連接子[A(EAAAK)3]，雙特異性抗體-親和體融合物皆能夠接合兩個目標。接著，已在小鼠中之藥物動力學研究中測試具有剛性連接子之構築體(圖13D)。圖 14. 展示抗PD-L1親和體AVA04-261及來源於蛋白質複合物之結晶的人類PD-L1之所計算之3維結構。圖 15. 由結合於所衍生之人類PD-L1的抗PD-L1親和體AVA04-261之晶體衍生結構，圖 15 提供兩個蛋白質之間的接觸界面處的胺基酸殘基之間的氫鍵結相互作用。圖 16. 由結合於所衍生之人類PD-L1的抗PD-L1親和體AVA04-261之晶體衍生結構，圖 16 提供涉及兩個蛋白質之間的接觸界面之胺基酸殘基之清單。圖 17A-17B. 抗PD-L1親和體格式化之說明性實例，包括Fc融合物(展示二價PD-L1結合子格式及雙特異性、二價PD-L1結合子及目標X結合子格式)、內嵌抗體融合物之各種格式、BiTE格式及具有受體陷阱結構域之抗PD-L1親和體之內嵌融合物。圖 18A-18B. 圖 18A 展示組合AVA04親和體、剛性或可撓性連接子及親和體XT (AVA03-42)之各種純系組合物。使用分析型SEC-HPLC評估各純系之純度。圖 18B. 展示rhPD-1-Fc或huSA上各種親和體XT之動力學分析結果。圖 19. 展示1 µl經純化之變異型蛋白質之SDS-PAGE操作。表格概述大腸桿菌生產產率、跨越環4中之胺基酸位置之AVA04-251丙胺酸掃描及各親和體之Biacore結合結果。圖 20. 展示當在PBS 1x緩衝液中在+4℃條件下儲存時，AVA04-251 V.2在九個月週期內之穩定性。關於在1 ml/min下，在PBS 1x緩衝液中之Yarra-3000 (Phenomenex)管柱操作之SEC-HPLC分析。圖 21. 展示AVA04-251 CG之結構及SEC-HPLC/SDS-PAGE結果。在PBS 1x緩衝液中，在1 ml/min下，在Ultimate 3000 HPLC (Thermo)上，SEC-HPLC Yarra-3000管柱操作之最終AVA04-251 CG＞98%純度。SDS-PAGE影像展示經還原與未經還原之AVA04-251 CG之間的kDa差。圖 22. 展示AVA04-251CF之SEC-HPLC及SDS-PAGE結果。在PBS 1x緩衝液中，在1 ml/min下，在Ultimate 3000 HPLC (Thermo)上，SEC-HPLC Yarra-3000管柱操作之最終AVA04-251 CF＞99%純度。SDS-PAGE影像展示經還原與未經還原之AVA04-251 CF之間的kDa差。圖 23. 展示AVA04-261 BN格式之純化及動力學分析之結果。SDS-PAGE影像展示與Biacore上之單體AVA04-261及59.9 pM K_D 相比，在非還原條件下經由鉸鏈中之半胱胺酸二聚化且在還原緩衝液AVA04-261 BN格式中還原成單體之二聚物質在PD-1 PD-L1阻斷生物分析法(Promega)中具有親合力。圖 24. 展示AVA04-251 AZ人類(在無連接子之情況下在hFc1上格式化之AVA04-251)之純化及動力學分析之結果。在PBS 1x緩衝液中，在1 ml/min下，在Ultimate 3000 HPLC (Thermo)上，SEC-HPLC Yarra-3000管柱操作之最終蛋白質＞99%純度。減去空白且針對1:1結合模型擬合之Biacore單循環動力學資料表明K_D 為31.5 pM。PD-1 PD-L1阻斷生物分析法(Promega)表明與Fc鉸鏈及親和體之間的(G4S)4連接子之V.2格式相同的活性。圖 25. 展示AVA04-251 AG.3及AVA04-251 BS格式之純化及動力學分析之結果。使用分析型SEC-HPLC評估各蛋白質之純度。減去空白且針對1:1結合模型擬合之Biacore單循環動力學資料表明AVA04-251 AG.3及AVA04-251 BS之K_D 分別為36.2 pM及25.7 pM。圖 26. 展示PD-L1結合域(14 kDa)與Fc融合物AVA04-251 V.2或AVA04-236 V (82 kDa)之交聯質譜以分析非共價結合複合物之化學計量。圖 27 及 28. 展示經格式化之AVA04-251 Fc結合於食蟹獼猴PD-L1之交叉反應性。圖 29A-29B. 展示混合淋巴細胞反應中IFNγ之含量，其在AVA04-251_V.2處理之後增加。圖 30. 展示在葡萄球菌腸毒素B刺激分析法中，在AVA04-251_V .2處理之後的IL2之增加。圖 31. 展示在C57/BL6小鼠中，在來自注射有AVA04-251 XT格式之小鼠之血清中藉由ELISA進行給藥之濃度-時間關係，從而能夠計算半衰期。圖 32A-32B. 具有原位MDA-MB-231腫瘤細胞之人類化NOG小鼠中之組織分佈實驗中AVA04-251_V.2之活體內表徵。圖 33A-33D. 展示AVA04-251_V.2之活體內功效，其減緩人類化MC38同基因型模型中之腫瘤生長。圖 34A-34D. 展示A375異種移植模型中AVA04-251_V.2之活體內功效。

<110> 英商阿法克塔生命科學有限公司(AVACTA LIFE SCIENCES LIMITED)

<120> 結合PD-L1之親和體(AFFIMER)及與其相關用途

<130> A1224.70001WO00

<140> TW 108112713

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<150> GB 1805963.4

<151> 2018-04-11

<160> 209

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成多肽

<400> 2

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<213> 人工序列

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<223> 合成多肽

<400> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為Gly、Ala、Val、Arg、Lys、Asp或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(69)

<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (53)..(69)

<223> 可能不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> Xaa為Gly、Ala、Val、Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> Xaa為Arg、Lys、Asn、Gln、Ser、Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (92)..(92)

<223> Xaa為Gly、Ala、Val、Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(93)

<223> Xaa為Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro

<220>

<221> misc_feature

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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (97)..(113)

<223> 可能不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..(114)

<223> Xaa為Gly、Ala、Val、Asp或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (116)..(116)

<223> Xaa為Ala、Val、Ile、Leu、Arg或Lys

<400> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(69)

<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (53)..(69)

<223> 可能不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (94)..(113)

<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (97)..(113)

<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸

<400> 5

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<211> 9

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<213> 人工序列

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<223> 合成多肽

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<400> 50

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 51

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 53

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 54

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 57

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 58

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 60

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 61

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 63

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 64

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 65

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 67

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 68

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 69

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 70

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<<222203>> 合成多肽

<400> 71

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 72

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<<222203>> 合成多肽

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 74

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 75

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 76

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 77

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 78

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 79

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 80

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 81

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 82

<210> 83

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 83

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 85

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 87

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 88

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 93

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 94

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 95

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<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 98

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<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 100

<210> 101

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 101

<210> 102

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 102

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<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 103

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<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 104

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<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 105

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<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 106

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<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 107

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 108

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<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 109

<210> 110

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 110

<210> 111

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 111

<210> 112

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 112

<210> 113

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 113

<210> 114

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 114

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<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 115

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 116

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<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 117

<210> 118

<211> 596

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 118

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 119

<210> 120

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 120

<210> 121

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 121

<210> 122

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 122

<210> 123

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 123

<210> 124

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 124

<210> 125

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 125

<210> 126

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 126

<210> 127

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 127

<210> 128

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 128

<210> 129

<211> 363

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 129

<210> 130

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 130

<210> 131

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 131

<210> 132

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 132

<210> 133

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 133

<210> 134

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 134

<210> 135

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 135

<210> 136

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 136

<210> 137

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 137

<210> 138

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 138

<210> 139

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 139

<210> 140

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 140

<210> 141

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 141

<210> 142

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 142

<210> 143

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 143

<210> 144

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 144

<210> 145

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 145

<210> 146

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 146

<210> 147

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 147

<210> 148

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 148

<210> 149

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 149

<210> 150

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 150

<210> 151

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 151

<210> 152

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 152

<210> 153

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 153

<210> 154

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 154

<210> 155

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 155

<210> 156

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 156

<210> 157

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 157

<210> 158

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 158

<210> 159

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 159

<210> 160

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 160

<210> 161

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 161

<210> 162

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 162

<210> 163

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 163

<210> 164

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 164

<210> 165

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 165

<210> 166

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 166

<210> 167

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 167

<210> 168

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 168

<210> 169

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 169

<210> 170

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 170

<210> 171

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 171

<210> 172

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 172

<210> 173

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 173

<210> 174

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 174

<210> 175

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 175

<210> 176

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 176

<210> 177

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 177

<210> 178

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 178

<210> 179

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 179

<210> 180

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 180

<210> 181

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 181

<210> 182

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 182

<210> 183

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 183

<210> 184

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 184

<210> 185

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 185

<210> 186

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 186

<210> 187

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 187

<210> 188

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 188

<210> 189

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 189

<210> 190

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 190

<210> 191

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 191

<210> 192

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 192

<210> 193

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 193

<210> 194

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 194

<210> 195

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 195

<210> 196

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 196

<210> 197

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 197

<210> 198

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(30)

<223> 可能不存在

<400> 198

<210> 199

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 199

<210> 200

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 200

<210> 201

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(30)

<223> 可能不存在

<400> 201

<210> 202

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(68)

<223> 可能不存在

<400> 202

<210> 203

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 203

<210> 204

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 204

<210> 205

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 205

<210> 206

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(22)

<223> 可能不存在

<400> 206

<210> 207

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 207

<210> 208

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 208

<210> 209

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(9)

<223> n為a、c、g或t

<400> 209

Claims (24)

1. 一種包含結合PD-L1之親和體多肽序列之蛋白質，該親和體多肽序列以1×10^-6M或更低的Kd結合於PD-L1且抑制其所結合之PD-L1與PD-1之相互作用，其中該結合PD-L1之親和體多肽序列係以下列通式表示：MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)_n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)_m-ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQ ID NO：5)，或與其具有至少95%一致性之胺基酸序列，其中(Xaa)_n為選自SEQ ID NO：6至40之胺基酸序列，且(Xaa)_m為選自SEQ ID NO：41至77之胺基酸序列。
2. 如請求項1之蛋白質，其包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列具有至少98%一致性之胺基酸序列。
3. 如請求項1之蛋白質，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
4. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：8之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
5. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：9之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：45之胺基酸序列。
6. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：57之胺基酸序列。
7. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：10之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：46之胺基酸序列。
8. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：7之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：43之胺基酸序列。
9. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：39之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：75之胺基酸序列。
10. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：51之胺基酸序列。
11. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：18之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：54之胺基酸序列。
12. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：41之胺基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：77之胺基酸序列。
13. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中(Xaa)_n為SEQ ID NO：38之胺 基酸序列，且(Xaa)_m為SEQ ID NO：74之胺基酸序列。
14. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中該結合PD-L1之親和體多肽序列係選自SEQ ID NO：119至128，或與其具有至少95%一致性之胺基酸序列。
15. 如請求項14之蛋白質，其中該結合PD-L1之親和體多肽序列係選自SEQ ID NO：119至128，或與其具有至少98%一致性之胺基酸序列。
16. 如請求項15之蛋白質，其中該結合PD-L1之親和體多肽序列係選自SEQ ID NO：119至128。
17. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其為包含一或多個選自由以下組成之群的其他胺基酸序列之融合蛋白質：分泌信號序列、肽連接子序列、親和標籤、跨膜域、細胞表面滯留序列、用於轉譯後修飾之受質識別序列、用於建立經由蛋白質-蛋白質相互作用聚集之蛋白質之多聚結構之多聚合域、延長半衰期之多肽部分、用於改變抗體之組織定位及抗原結合位點之多肽序列及一或多種結合PD-L1或不同目標之其他親和體多肽序列。
18. 如請求項17之蛋白質，其為包含選自由以下組成之群的延長半衰期之多肽部分之融合蛋白質：Fc域或其一部分、白蛋白蛋白質或其一部分、結合白蛋白之多肽部分、轉鐵蛋白或其一部分、結合轉鐵蛋白之多肽部分、纖維連接蛋白或其一部分或結合纖維連接蛋白之多肽部分。
19. 如請求項18之蛋白質，其包含SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：112之胺基酸序列。
20. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其進一步包含一或多個抑制免疫檢查點分子之結合域。
21. 如請求項20之蛋白質，其中該免疫檢查點分子為PD-1、PD-L2、CTLA-4、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA或TIGIT。
22. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至21中任一項之蛋白質之編碼序列。
23. 一種適用於人類患者中之治療用途之醫藥製劑，其包含如請求項1至21中任一項之蛋白質及醫藥學上可接受之賦形劑。
24. 一種適用於人類患者中之治療性基因遞送之醫藥製劑，其包含如請求項22之核酸及醫藥學上可接受之賦形劑。