CN116135876A - 一种多肽及其在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

一种多肽及其在制备抗肿瘤药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多肽及其在制备抗肿瘤药物中的用途，所述多肽包含如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明的多肽能够有效通过竞争性抑制STRIPAK复合物中两条分子手臂(SIKE‑SLAMP和STRIP1/2)与核心支架蛋白STRN的结合，有效打破与STRN的互作界面，通过激活Hippo信号通路中MST1/2激酶活性，抑制肿瘤细胞DSB损伤修复，实现肿瘤抑制的效果；并且，联用多肽SAIP‑1和SAIP‑2、PARP抑制剂中的一种或多种，能够提高消化系统肿瘤对PARP抑制剂的敏感性，并对临床治疗中出现的耐药性提供解决方案，具有广泛的应用前景。

Description

一种多肽及其在制备抗肿瘤药物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽及其在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶(Poly ADP-Ribose Polymerase，PARP)的抗肿瘤药物，它能够抑制DNA单链断裂修复。当细胞中存在同源重组修复(HomologousRecombination Repair，HRR)的缺陷时，能够导致双链断裂无法修复或由错误性的非同源末端连接(Non-homologous End Joining，NHEJ)进行修复，产生合成致死效应，起到抑制肿瘤生长的作用。美国FDA在2014年正式批准奥拉帕尼用于治疗BRCA1/2缺陷的晚期卵巢癌，这是全球首个被批准的PARP抑制剂。后续尼拉帕尼、卢卡帕尼和他拉唑帕尼也相继被批准。目前，PARP抑制剂只能在特定DNA修复缺陷的人群中产生合成致死效应，起到抑制肿瘤生长的作用。但是患者体内肿瘤细胞存在这一特定DNA修复缺陷的人群仅占少数，多数的肿瘤患者对PARP抑制剂不敏感，无法通过合成致死效应实现有效抗肿瘤的作用，其耐药性和普适性问题并没有得到解决。
消化系统肿瘤是威胁我国国民健康的重大疾病，放化疗是目前临床常用的治疗手段，但面临肿瘤细胞对放化疗耐受这一巨大挑战。已有研究表明，肿瘤细胞DNA损伤修复的异常活化是导致化疗耐药的重要成因。然而，目前对胃肠道耐药型肿瘤细胞中DNA损伤修复的异常活化与耐药形成两者之间的分子细胞信号机制知之甚少。
因此，寻找新的药物用于肿瘤的治疗，特别是寻找新的药物用于具有耐药性的患者中的治疗具有十分重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种功能性多肽SAIP-1和SAIP-2，其为STRIPAK复合物分子臂组装抑制剂，能够应用于肿瘤的治疗，特别是与PARP抑制剂联用于消化系统肿瘤和耐药性肿瘤治疗中具有较好的效果。
本发明还提出一种上述多肽制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明还提出一种包含上述多肽的药物、药物组合物，以及编码或合成上述多肽的多核苷酸、载体和重组细胞。
根据本发明的一个方面，提出了一种多肽，所述多肽包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。具体的，氨基酸序列为GQRVDLPEDFQMNYDLWLEREVFS。
根据本发明的一个方面，提出了一种多肽，所述多肽包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。具体的，氨基酸序列为QNSQLTWKQGRQLLRQYLQEVGYTD。
在本发明的一些实施方式中，所述多肽SAIP-1的设计原则是选取STRIP1-STRN3二者结合位点中STRIP1的第804-827位氨基酸进行人工合成。该小分子多肽SAIP-1能够竞争性打破STRIPAK复合物中STRIP1-STRN3相互作用界面中。
在本发明的一些实施方式中，所述多肽SAIP-2的设计原则是选取SIKE1-STRN3二者结合位点中STRN3的第166-190位氨基酸进行人工合成。该小分子多肽SAIP-2能够竞争性打破STRIPAK复合物中SIKE1-STRN3相互作用界面中。
在本发明中，STRIPAK(Striatin-interacting phosphatase and kinase)复合物是进化上高度保守的一类超大分子复合物，广泛参与调控一系列细胞信号转导，在细胞凋亡、增殖、极性以及膜泡运输等过程中发挥重要作用，且与肿瘤等人类疾病的发生密切相关。研究发现STRIPAK组装完整性对DNA损伤修复和基因组稳定至关重要，它可以动态响应DNA损伤刺激；此外，还发现Hippo活性与胃肠道肿瘤PRAP抑制剂放化疗敏感性正相关，STRIPAK介导的MST1/2失活可增强肿瘤细胞的PRAP抑制剂耐药性。在本发明中，以STRIPAK复合物中两条分子臂与STRN3结合界面为靶标，通过创新性地设计蛋白-蛋白相互作用的小分子多肽抑制剂SAIP-1和SAIP-2，从而打破STRIAPK与两条分子臂的组装，解除对MST1/2激酶的负性调控效应，使得后者能够显著抑制肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，增强肿瘤细胞对放化疗的治疗敏感性。
根据本发明的再一个方面，提出了上述多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
在本发明的一些实施方式中，所述抗肿瘤药物为抗消化系统肿瘤药物。
优选地，所述抗消化系统肿瘤药物为抗胃肠道肿瘤药物。
更优选地，所述胃肠道肿瘤包括胃癌和肠癌中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述抗肿瘤药物为治疗对PARP抑制剂具有耐药性肿瘤疾病的药物。
在本发明的一些实施方式中，所述抗肿瘤药物还包括PARP抑制剂。在本发明中，多肽SAIP-1、SAIP-2和PARP抑制剂联合使用能够通过合成致死效应在体内体外高效的杀伤胃癌和肠癌肿瘤细胞，极大地提高了消化系统肿瘤对PARP抑制剂的敏感性。因此，本发明通过创新性地开发DNA损伤修复的抑制性多肽药物，可以极大地拓宽PARP抑制剂的临床应用范围，并对目前PARP抑制剂临床治疗中面临的耐药性问题提供了新的解决方案，具有极高的临床应用价值和广泛市场转化潜力。
优选地，所述PARP抑制剂包括奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕尼中的至少一种。
根据本发明的再一个方面，提出了所述的多肽在制备用于抑制STRIPAK复合物两条分子臂组装的药物中的用途；和/或
所述多肽在制备用于抑制Hippo信号通路中激酶MST1/2活性的药物中的用途。
优选地，所述多肽SAIP-1能够竞争性抑制STRIP1与STRNs-PP2A复合物的结合。
优选地，所述多肽SAIP-1能够打破STRIPAK复合物中STRIP1-STRN相互作用界面。
优选地，所述多肽SAIP-2能够竞争性抑制SIKE1与STRNs-PP2A复合物的结合。
优选地，所述多肽SAIP-2能够打破STRIPAK复合物中SIKE1-STRN相互作用界面。
优选地，所述多肽SAIP-1/2能够激活Hippo信号通路中MST1/2激酶活性。
优选地，所述多肽SAIP-1/2与PARP抑制剂联用能够抑制肿瘤细胞DSB损伤修复(DNA双链断裂，DNA Double Strand Break，DSB)，实现肿瘤抑制的效果。
根据本发明的再一个方面，提出了一种药物，所述药物上述多肽及其药学上可接受的盐和/或载体。
根据本发明的再一个方面，提出了一种药物组合物，所述药物组合物上述多肽和PARP抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述PARP抑制剂包括奥拉帕尼(Olaparib)、卢卡帕尼(Rucaparib)和维利帕尼(Niraparib)中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物能够应用于消化系统肿瘤治疗。
优选地，多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂的联用能够在DNA损伤修复状态正常的情况下，通过合成致死效应起到抑制肿瘤生长的作用。
优选地，多肽SAIP-1/2与PARP抑制剂联合用药能够在PARP抑制剂耐受的消化系统肿瘤细胞中，通过合成致死效应提高消化系统肿瘤对PARP抑制剂的敏感性。
根据本发明的再一个方面，提供了编码或合成上述多肽的多核苷酸、载体和重组细胞，包括：
一种多核苷酸，述多核苷酸包括编码上述多肽的核苷酸序列。
一种载体，所述载体包含上述多核苷酸的核苷酸序列。
一种重组细胞，所述重组细胞能够产生上述多肽。
本发明至少具有以下有益效果：(1)所述多肽SAIP-1和SAIP-2能够有效通过竞争性抑制STRIP1、SIKE1与STRN3的结合，有效打破STRIPAK复合物中两条分子臂组装的互作界面，通过激活Hippo信号通路中MST1/2激酶活性，抑制肿瘤细胞DSB损伤修复，实现肿瘤抑制的效果；(2)联用多肽SAIP-1/2、PARP抑制剂中的一种或多种，能够提高消化系统肿瘤对PARP抑制剂的敏感性，并对临床治疗中出现的耐药性提供解决方案；(3)所述多肽SAIP-1和SAIP-2序列短，成本低、易于合成和大规模生产应用，该多肽能够有效应用于肿瘤治疗，特别是对于耐药性的肿瘤患者，具有广泛的应用前景。
一般定义和术语
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。若存在矛盾，则以本文提供的定义为准。
术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的±10％内，或更宽范围内。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。本领域技术人员应当理解，上述术语如“包括”涵盖“由…组成”的含义。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。
当在本文中描述数值或范围端值时，应理解所公开的内容包括所引用的特定值或端值。
本文所使用的术语“一种或多种”或“至少一种”指一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种。
术语“药学上可接受”的物质指这样的物质，其在正常的医学判断范围内适用于与患者的组织接触而不会有不适当毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的利弊比，且能有效用于其目的用途。术语“药学上可接受的盐”是指与药学上可接受的无毒的碱或酸，包括无机或有机碱和无机或有机酸制成的盐。
术语“氨基酸”意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。术语“多肽”意指氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等，通常由10～100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10000Da，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中多肽SAIP-1和SAIP-2对STRIPAK复合物中两条分子臂组装互作界面的影响的实验结果图，其中，A为根据SIKE1、STRIP1与STRN3的结合位点设计多肽SAIP-1、SAIP-2序列的示意图，B为多肽SAIP-1的Pull-down实验结果图，C为STRN3的Pull-down实验结果图，D为Co-IP实验结果图；
图2为本发明实施例2中多肽SAIP-1对Hippo激酶及PARP抑制剂的影响的实验结果图，其中，A为三种PARP抑制剂对11种胃肠道肿瘤细胞系中的最大半数抑制浓度图，B为11种细胞的Hippo激酶活性测试图，C为Hippo激酶活性与PARP抑制剂敏感性线性回归分析图，D显示了多肽抑制剂显著提高MST1/2磷酸化水平，E为多肽SAIP-1和SAIP-2联合奥拉帕尼或卢卡帕尼在AZ-521细胞中细胞活性结果图；
图3为本发明实施例3中联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂对小鼠体内肿瘤细胞的合成致死效应的实验结果图，其中，A为小鼠肿瘤照片，B为小鼠肿瘤重量变化图，C为小鼠肿瘤体积变化图；
图4为本发明实施例4中联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂对患者来源胃癌细胞系的肿瘤杀伤作用的实验结果图，其中，A为对胃癌细胞系的多肽SAIP-1、多肽SAIP-2、奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕尼的IC50值图，B为多肽SAIP-1/2与奥拉帕尼联合使用实验的细胞杀伤效率结果图，C为多肽SAIP-1/2与卢卡帕尼联合使用实验的细胞杀伤效率结果图；
图5为本发明实施例5中联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂对患者来源肠癌细胞系的肿瘤杀伤作用的实验结果图，其中，A为不同患者来源肠癌细胞系的多肽SAIP-1、多肽SAIP-2、奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕尼的IC50值图，B为不同细胞系的Hippo激酶活性图，C为SAIP-1对PDC35细胞的联合用药细胞活性实验图，D为SAIP-2对PDC35细胞的联合用药细胞活性实验图,E为SAIP-1对PDC9细胞的联合用药细胞活性实验图，F为SAIP-2对PDC9细胞的联合用药细胞活性实验图；
图6为本发明实施例中多肽SAIP-1和SAIP-2的细胞通路和药理作用图，其中，A为多肽SAIP-1/2对STRIPAK复合物两条分子臂组装起抑制作用的细胞通路图，B为多肽SAIP-1/2与PARP抑制剂联合用药在PARP抑制剂耐受的消化系统肿瘤患者中展现出合成致死效应示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明的实施例中使用的基础实验操作方法，如细胞培养、免疫印迹和细胞活性实验等的基本操作方法如下所述，但不限于此种方式。
基础实验方法：
(1)细胞培养：
AGS、AZ-521、BGC-823、MGC-803、HGC-27等细胞株均取自中国科学院细胞库。SNU-216、KATO-III、MKN-45、SH-10-TC、GES1细胞分别购自ATCC和RIKEN生物资源中心。PDC细胞系来源于上海市第一人民医院。AGS、AZ-521、BGC-823、MGC-803、HGC-27、PDCs分别培养于RPMI1640培养基(Invitrogen)。HEK293FT、293A分别培养于DMEM培养基(Invitrogen)。培养液中添加10％血清，100μg/ml青霉素，100μg/ml链霉素。细胞培养于37℃，二氧化碳浓度为5％的培养箱中。
(2)免疫印迹：
根据实验要求制备蛋白样品，95℃变性10分钟，13800rpm离心3分钟，取等量的上清加到合适浓度SDS-PAGE胶的上样孔中。蛋白样品在浓缩胶中时80V电泳20分钟，在分离胶中时120V电泳60分钟。电泳结束后，取下凝胶，按以下顺序安装转膜装置：(负极)、滤纸、SDS-PAGE凝胶、PVDF膜、滤纸、(正极)。将转膜装置放入4°℃冷库中，100V恒压转印1h。转膜完成后，取出PVDF膜，将膜放置于PBST缓冲溶液配制的5％脱脂牛奶中，室温下在摇床上孵育1h。PVDF膜用PBST缓冲溶液洗3次，每次5分钟。
加入按规定比例用5％BSA溶液稀释的一抗，在4℃冷库的摇床上孵育过夜。用PBST缓冲溶液洗膜，10min×3次。加入按规定比例用5％脱脂牛奶稀释的二抗，室温下在摇床上孵育1h。PVDF膜用PBST缓冲溶液洗3次，每次10分钟。将ECL显色液覆盖在硝酸纤维素膜上，室温显色1-2分钟，用化学发光成像仪进行拍摄。
(3)细胞活性实验：
使用ATP细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖(CellTiter-Lum Plus发光法细胞活力检测试剂盒，碧云天)。在96孔板上准备好带培养基的细胞，100μL/孔，细胞数1000-5000/孔，待第二天贴壁后单独或共同加不同浓度的多肽SAIP-1、SAIP-2和PARP抑制剂，同时准备仅含培养基不含细胞的对照孔，以得到背景发光值。根据不同实验培养若24-48小时后，将孔板拿出培养箱平衡到室温，向每孔中加入与细胞培养基体积相等的CellTiter-Lum Plus试剂100μL。室温震荡2分钟，诱导细胞的裂解，然后将平板室温孵育10分钟，使荧光信号值稳定，使用功能酶标仪进行化学发光信号检测。
在本发明的一些实施例中，提供了两种STRIPAK复合物组装抑制剂多肽SAIP-1和SAIP-2。一种多肽为SAIP-1，可打破STRIPAK复合物中STRIP1-STRN3互作界面的结合，其氨基酸序列为GQRVDLPEDFQMNYDLWLEREVFS(SEQ ID No.1)；另一种多肽为SAIP-2，可打破STRIPAK复合物中SIKE1-STRN3互作界面的结合，其氨基酸序列为QNSQLTWKQGRQLLRQYLQEVGYTD(SEQ ID No.2)。
小分子多肽SAIP-1能够竞争性打破STRIPAK复合物中STRIP1-STRN3相互作用界面中，其多肽设计的原则是选取STRIP1-STRN二者结合位点中STRIP1的第804-827位氨基酸进行人工合成。在另一些实施例中，采用固相合成法、化学合成法或微生物表达等方法来合成多肽SAIP-1。
小分子多肽SAIP-2能够竞争性打破STRIPAK复合物中SIKE1-STRN3相互作用界面中，其多肽设计的原则是选取SIKE1-STRN3二者结合位点中STRN3的第166-190位氨基酸进行人工合成。在另一些实施例中，采用固相合成法、化学合成法或微生物表达等方法来合成多肽SAIP-2。
以下实施例具体展示了小分子多肽SAIP-1和SAIP-2的药理作用机制研究。
实施例1：多肽SAIP-1/2对STRIP1-STRN3和SIKE1-STRN3互作界面的影响
本实施例研究多肽SAIP-1/2(指SAIP-1和SAIP-2)对SIKE1-STRN3和STRIP1-STRN3相互作用界面的影响，证明多肽SAIP-1和SAIP-2能够分别打破STRIPAK复合物中STRIP1-STRN3和SIKE1-STRN3相互作用界面，具体实验步骤和方法如下：
a)Pull-down实验：分别将具有MBP标签的SAIP-1和STRN3重组质粒转化到BL21菌株中，待培养基OD600达到0.6左右时，加入IPTG进行诱导表达。之后离心收集菌体，加入相应体积的裂解液涡旋混匀，利用高压破碎仪处理30min，待裂解液澄清后加入MBP beads孵育过夜，4℃，4000rpm离心5min，弃去上清，并进一步利用梯度浓度麦芽糖洗脱MBP融合蛋白。类似地，本实施例通过亲和层析纯化得到His-STRN3和His-SIKE1蛋白。分别将His-STRN3、His-SIKE1蛋白与MBP标签的SAIP-1、STRN3SAIP-1蛋白混匀，并在His-SIKE1与MBP-STRN3混合物中加入不同浓度SAIP-2多肽(SAIP-2通过化学合成方法得到)，孵育2h后离心弃去上清，沉淀加入1×蛋白电泳上样缓冲液，金属浴5min，并进一步通过SDS-PAGE进行检测。
b)Co-IP实验：采用PDPA包被法促进SAIP-1和SAIP-2进入细胞。其原理是脂质体PDPA在超声条件下会打开双层膜，吸收体系里的多肽分子，形成稳定的PDPA-多肽混合物。利用PDPA、SAIP-1和SAIP-2处理细胞48h，离心收集细胞沉淀，加入相应体积的NETN裂解液(20mM pH8.0 Tris HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％NP-40)，裂解30min后同时加入STRN3抗体和Protein A/G beads进行孵育，于此同时对照组加入IgG和Protein A/G beads。第二天利用PBS清洗抗体/珠子复合体几次，离心弃去上清，沉淀加入1×蛋白电泳上样缓冲液，并进一步通过蛋白免疫印迹进行检测。
实验结果及分析：
基于SIKE1-STRN3和STRIP1-STRN3互作界面，我们分别设计了靶向复合物组装的SAIP-1和SAIP-2多肽。多肽SAIP-1的氨基酸序列为STRIP1-STRN3二者结合位点中STRIP1的第804-827位，具体氨基酸序列为GQRVDLPEDFQMNYDLWLEREVFS；多肽SAIP-2的氨基酸序列为SIKE1-STRN3二者结合位点中STRN3的第166-190位，具体氨基酸序列为QNSQLTWKQGRQLLRQYLQEVGYTD(图1中A)。从体外Pull-down实验的实验结果可以看出，多肽SAIP-1能够直接与STRN3分子结合，表明该多肽的确可以靶向STRIP1和STRN3的互作界面(图1中B)；多肽SAIP-2能够打破SIKE1-STRN3互作界面(图1中C)。本实施例利用Co-IP实验检测多肽SAIP-1和SAIP-2是否能够打破STRIPAK复合物组装，结果中可以看出SAIP-1处理细胞后STRN3和STRIP1结合显著减弱，但它与复合物另一个分子臂的关键组分SIKE1和SLMAP结合无明显变化；SAIP-2处理细胞后STRN3与SIKE1、SLMAP结合显著减弱，但它与复合物另一个关键组分STRIP1结合无明显变化。结果表明，AZ-521细胞中多肽SAIP-1能够有效靶向打破STRN3和STRIP1的结合，多肽SAIP-2能够有效靶向打破STRN3和SIKE1的结合(图1中D)。
实施例2：多肽SAIP-1/2对Hippo激酶及PARP抑制剂的影响
本实施例研究多肽SAIP-1和多肽SAIP-2对Hippo激酶活性及PARP抑制剂敏感性的作用，具体实验步骤和方法如下：
a)细胞活性实验：AGS、AZ-521、BGC-823、MGC-803、HGC-27、SNU-216、KATO-3、MKN-28、MKN-45、SH-10-TC、GES1等细胞培养方法如基本实验方法(1)所述。配制不同浓度的PARP抑制剂，包括奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕尼，实验方法同基本实验方法3，测定不同细胞的IC50值。
b)蛋白免疫印迹：AGS、AZ-521、BGC-823、MGC-803、HGC-27、SNU-216、KATO-3、MKN-28、MKN-45、SH-10-TC、GES1等细胞培养方法如基本实验方法(1)所述。细胞培养24小时后，收集并用裂解液处理细胞，如基本实验方法1所述处理裂解后的蛋白样品，进行蛋白免疫印迹实验。其中一抗分别为：用MST1抗体(#3682,CST,1:1000)、MST2抗体(ab52641,Abcam,1:1000)、磷酸化MST1(Thr183)/MST2(Thr180)抗体(#3681,CST,1:500),和β-actin抗体(#A5441,Sigma,1:5000)。用Image J软件分别对化学发光成像后图片的条带进行灰度分析。
c)多肽SAIP-1和SAIP-2对PARP抑制剂耐受株AZ-521对Hippo激酶的作用：AZ-521细胞系的细胞培养方法同基本实验方法(1)。细胞用20μM多肽SAIP-1和SAIP-2处理后，收集并用裂解液处理细胞，同基本实验方法(1)处理裂解后的蛋白样品，进行蛋白免疫印迹实验。其中一抗分别为：用MST2抗体(ab52641,Abcam,1:1000)、磷酸化MST1(Thr183)/MST2(Thr180)抗体(#3681,CST,1:500),和β-actin抗体(#A5441,Sigma,1:5000)。
d)多肽SAIP-1/2对PARP抑制剂耐受株AZ-521的细胞活力实验：AZ-521细胞系的细胞培养方法同基本实验方法(1)。多肽SAIP-1浓度为5μM，多肽SAIP-2浓度为5μM。
实验结果及分析：
本实施例利用细胞活性实验计算了三种FDA批准的PARP抑制剂(即奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕利)在这11种胃肠道肿瘤细胞系中的最大半数抑制浓度(IC50)(图2中A)。在此基础上，本实施例根据细胞系对三种PARP抑制剂的敏感程度将细胞系分为PARP抑制剂敏感组(IC50<20μM)、PARP抑制剂耐受组(IC50>20μM)。MST1/2激酶激活可明显抑制DSB修复，为PARP抑制剂杀死肿瘤细胞创造了DNA修复缺陷的环境。相反，在肿瘤细胞中经常伴随Hippo激酶活性的缺失，这可能诱导PARP抑制剂耐药。本实施例通过蛋白免疫印迹检测了AZ-521、BGC-823、MGC-803、HGC-27、SNU-216、KATO-3、MKN-28、MKN-45、SH-10-TC、GES1等细胞的Hippo激酶活性(pMST1/2)。结果发现，Hippo激酶活性较高的细胞系，如GES1、HGC-27和SNU-216对PAPRi更敏感，而MST1/2磷酸化水平较低的细胞系，如AZ521、AGS和BGC-823，对PAPRi治疗更耐药(图2中B)。进一步的线性回归分析显示，Hippo激酶活性与PARP抑制剂敏感性之间存在显著的正相关关系(图2中C)。上述结果表明Hippo激酶活性可被用作PARP抑制剂敏感性的一种评判标准。
此外，在AZ-521细胞中，使用多肽SAIP-1和SAIP-2抑制剂可以显著提高MST1/2磷酸化水平(图2中D)，表明上述多肽抑制剂可以提高Hippo激酶活性。结合为了评估SAIP-1/2与PARP抑制剂在胃肠道肿瘤细胞中是否具有合成致死效应，本实施例分别测定了SAIP-1/2联合奥拉帕尼或卢卡帕尼在AZ-521细胞中细胞活性(图2中E)。单独使用SAIP-1/2或PARP抑制剂治疗显示出较低的肿瘤细胞杀伤效率，但联合使用SAIP-1/2与奥拉帕尼或卢卡帕尼可产生约70％的肿瘤细胞死亡，显示显著的对肿瘤细胞的合成致死效果。
实施例3：联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂对小鼠体内肿瘤细胞的合成致死效应
本实施例研究多肽SAIP-1和PARP抑制剂联用在体内水平对肿瘤细胞的合成致死效应，具体实验步骤和方法如下：
a)建立小鼠肿瘤模型：健康雄性裸鼠(3-4周)从上海实验动物中心获得，并按照中科院生物化学和细胞生物学研究所(SIBCB，上海)机构动物护理和使用委员会的指导原则保持在无病原体的条件下。动物使用许可证号为No.SIBCB-SIBCB-NAF-14-004-S329-023，由SIBCB动物核心设施发布。在肿瘤形成实验中，首先将AZ-521细胞以5×106个/只的剂量皮下注射到小鼠腋窝下以诱导肿瘤形成。
b)联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂：当肿瘤体积达到100mm3左右，小鼠瘤内连续注射PARP抑制剂卢卡帕尼(10mg/kg)和/或多肽SAIP-1/2(10mg/kg)5天。每3天测量一次肿瘤长、宽，计算肿瘤体积(肿瘤体积＝宽2×长×0.523)。两周后，对小鼠进行安乐死，解剖出小鼠肿瘤，并测量肿瘤重量。
实验结果及分析：
在体内异种移植小鼠模型中，本实施例检测了多肽SAIP-1和PARP抑制剂联用在对肿瘤生长的影响。多肽SAIP-1和SAIP-2与PARP抑制剂卢卡帕尼联用时，可以显著降低小鼠肿瘤的体积和重量(图3)，表明多肽SAIP-1和PARP抑制剂联用对小鼠肿瘤有良好的合成致死效应，多肽SAIP-1能够在体内水平改善PARP抑制剂耐受，显著提高对肿瘤细胞的杀伤能力。
实施例4：联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂对患者来源胃癌细胞系的肿瘤杀伤作用
本发明探究提出的合成致命性治疗的临床相关性，为后续临床应用提供理论基础，具体实验步骤和方法如下：
a)细胞活性实验：患者来源细胞系ZGC-1的细胞培养方法同基本实验方法(1)。配制不同浓度的多肽SAIP-1和SAIP-2，以及不同浓度的PARP抑制剂，包括奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕尼，实验方法同基本实验方法(3)，测定不同细胞的IC50值。
b)肿瘤杀伤实验：患者来源细胞系ZGC-1的细胞培养方法同基本实验方法(1)。分别配制PARP抑制剂奥拉帕尼、卢卡帕尼、多肽SAIP-1和多肽SAIP-2，实验方法同基本实验方法(3)，测定单独和联合用药时对患者来源的胃癌细胞系ZGC-1的细胞杀伤作用。
实验结果及分析：
为了证明联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂产生合成致死效应在临床上具有较大的发展潜力，本实施例在患者来源细胞系中检测这种协同肿瘤杀伤作用。ZGC-1是一种胃癌患者来源细胞系，该细胞系的Hippo激酶活性较低。本实施例检测了ZGC-1细胞的多肽SAIP-1、多肽SAIP-2、奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕尼的IC50值(图4中A)，根据实施例2的标准，其属于PARP抑制剂耐受的细胞系。后续本实施例在低毒浓度下分别或联用肽SAIP-1/2和PARP抑制剂，并检测其对ZGC-1细胞的肿瘤杀伤能力，图4中B显示联用后导致60％以上的肿瘤细胞死亡，与实施例2中的趋势一致。上述结果表明，同时靶向抑制STRIPAK复合物中两条分子臂组装并联用PARP抑制剂可以在胃癌中产生合成致死效应，提高PARP抑制剂耐受人群的肿瘤治疗效果。
实施例5：联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂对患者来源肠癌细胞系的肿瘤杀伤作用
探究联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂的合成致死效应在消化道肿瘤的普适性，为后续临床应用提供理论基础。
a)细胞活性实验：患者来源肠癌细胞系PDC9，PDC28，PDC35和PDC55细胞的细胞培养方法同基本实验方法(1)。配制不同浓度的PARP抑制剂，包括奥拉帕尼和卢卡帕尼，实验方法同基本实验方法(3)，测定不同细胞的IC50值。
b)蛋白免疫印迹：PDC9，PDC28，PDC35和PDC55等结肠癌患者来源细胞系的细胞培养方法同基本实验方法(1)。细胞培养24小时后，收集并用裂解液处理细胞，如基本实验方法1所述处理裂解后的蛋白样品，进行蛋白免疫印迹实验。其中一抗分别为：MST2抗体(ab52641,Abcam,1:1000)、磷酸化MST1(Thr183)/MST2(Thr180)抗体(#3681,CST,1:500),和β-actin抗体(#A5441,Sigma,1:5000)。
c)肿瘤杀伤实验：患结肠癌患者来源细胞系PDC9和PDC35的细胞培养方法同基本实验方法(1)。分别配制不同浓度的PARP抑制剂(奥拉帕尼、卢卡帕尼)和多肽SAIP-1/2，实验方法同基本实验方法(3)，测定单独和联合用药时对结肠癌患者来源细胞系PDC9和PDC35的细胞杀伤作用。
实验结果及分析：
为了进一步探究联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂的合成致死效应在消化道肿瘤的普适性，证明该联用疗法在临床上具有较大的发展潜力，本实施例在结肠癌患者来源细胞系中检测这种协同肿瘤杀伤作用。首先，本实施例检测了结肠癌患者来源细胞系对奥拉帕尼、卢卡帕尼的敏感性，即通过细胞活性实验分别计算其IC50值(图5中A)，其IC50值在0.22-27.7μM之间。本实施例通过蛋白免疫印迹检测了PDC9、PDC28、PDC35和PDC55等结肠癌患者来源细胞系的Hippo激酶活性(图5中B)。结果发现，Hippo激酶活性较高的细胞系，如PDC28和PDC55对PAPR抑制剂更敏感，而MST1/2磷酸化水平较低的细胞系，如PDC9和PDC35，对PAPR抑制剂治疗更耐受(图5中A和B)。
后续本实施例在低毒浓度下分别或联用肽SAIP-1和PARP抑制剂，并检测其对PDC9和PDC35细胞的肿瘤杀伤能力，图5中C和E显示联用后可以显著提高对肿瘤细胞的杀伤。同时，本实施例在低毒浓度下分别或联用肽SAIP-2和PARP抑制剂，并检测其对PDC9和PDC35细胞的肿瘤杀伤能力，图5中D和F显示联用后同样可以显著提高对肿瘤细胞的杀伤。上述结果表明，同时靶向抑制STRIPAK复合物中STRN3和两条分子臂界面结合并联用PARP抑制剂可以在结肠癌中产生良好合成致死效应，扩展了联用多肽SAIP-1/2和PARP抑制剂的合成致死效应在消化道肿瘤的适用性。
本发明实施例中的小分子多肽SAIP-1和多肽SAIP-2，通过靶向抑制STRIPAK中两条分子臂的组装，提高了PARP抑制剂的敏感性。图6中A为小分子多肽SAIP-1对和多肽SAIP-2对STRIPAK组装起抑制作用的示意图，具体为：通过小分子多肽SAIP-1/2靶向抑制STRIPAK与两条分子臂组装，将释放的MST1/2激酶转位入核，抑制ZMYND8依赖的DSB修复能力，当多肽SAIP-1或SAIP-2与PARP抑制剂联合使用时，引发肿瘤细胞的合成致死效应。图6中B为多肽SAIP-1/2与PARP抑制剂联合用药能够在PARP抑制剂耐受(即DNA损伤修复状态正常)的消化系统肿瘤患者中展现出合成致死效应，提高消化系统肿瘤对PARP抑制剂的敏感性，为临床治疗中出现的耐药问题提供解决方案。
本发明以STRIPAK复合物中两条分子臂与STRN3结合界面为靶标，通过创新性地设计蛋白-蛋白相互作用的小分子多肽抑制剂SAIP-1和SAIP-2，从而打破STRIAPK与两条分子臂的组装，解除对MST1/2激酶的负性调控效应，使得后者能够显著抑制肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，增强肿瘤细胞对放化疗的治疗敏感性。更重要的是，SAIP-1或SAIP-2和PARP抑制剂联合使用能够通过合成致死效应在体内体外高效的杀伤胃癌和肠癌肿瘤细胞，极大地提高了消化系统肿瘤对PARP抑制剂的敏感性。因此，本发明通过创新性地开发DNA损伤修复的抑制性多肽药物，可以极大地拓宽PARP抑制剂的临床应用范围，并对目前PARP抑制剂临床治疗中面临的耐药性问题提供了新的解决方案，具有极高的临床应用价值和广泛市场转化潜力。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (13)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.一种如权利要求1所述的多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗消化系统肿瘤药物。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗对PARP抑制剂具有耐药性肿瘤疾病的药物。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包括PARP抑制剂。
6.一种如权利要求1所述的多肽在制备用于抑制STRIP1、SIKE1与STRN界面结合的药物中的用途。
7.一种如权利要求1所述的多肽在制备用于激活Hippo信号通路中MST1/2激酶活性的药物中的用途。
8.一种药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1所述多肽的一种或多种及其药学上可接受的盐和/或载体。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1所述的多肽和PARP抑制剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述PARP抑制剂包括奥拉帕尼、卢卡帕尼和维利帕尼中的至少一种。
11.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。
12.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求11所述的多核苷酸的核苷酸序列。
13.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞能够产生如权利要求1所述的多肽。
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