KR20230065974A - NTPDase3의 표적화를 통해 항종양 면역 반응을 강화하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

NTPDase3의 표적화를 통해 항종양 면역 반응을 강화하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

종래의 요법(예를 들어, 표적 요법, 화학 요법 및 혈관신생 저해제 등)과 조합하여, 관문 분자를 표적화하는 면역요법은 고체 또는 액체 종양의 치료 가능성을 보여주었다. 하지만, 종양내 미세환경에서 비-종양 세포의 역할은 이들 세포의 제거가 면역계의 세포독성 T 세포 및 다른 항종양 세포의 종양 침윤을 포함하는 종양에 대한 효과적인 면역 반응을 시작하는 열쇠가 될 수 있음을 나타냈다. 본 발명은 아데노신을 생성하는 효소로서 NTPDaseB의 엑토뉴클레오티다제 활성에 대한 직접적인 저해를 유발할 뿐만 아니라, 더 나아가 NTPDaseB 발현을 활용하여 NTPDaseB 의존적 ADCC에 의한 종양내 세포 제거를 야기한다.

Description

NTPDase3의 표적화를 통해 항종양 면역 반응을 강화하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 10일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제63/076,427호에 대한 우선권의 이익을 주장하며; 상기 출원의 전체 내용은 이 참고문헌으로서 전체가 본원에 포함된다.
발명의 배경
진행성 암 환자에게 희망은 귀중하지만 드문 것일 수 있다. 최근에 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor)라는 약물의 새로운 부류는 종양의 발생을 막고 성장하지 않도록 방지하며 치료 받은 일부 사람들에게는 본질적으로 치유되도록 하는 놀라운 전망을 보여주었다. 그러나, 이러한 획기적인 요법에는 상당한 문제가 있다. 진행성 암에서 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD1), PD1 리간드 1(PDL1) 및 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4) 요법에 대한 저해성 항체를 기반으로 하는 진행성 암의 면역요법이 성공적임에도 불구하고, 상당한 비율의 환자는 이 치료에 무반응성을 유지한다.
면역 세포 침윤 수준에 따른 "핫(hot)" 종양과 "콜드(cold)" 종양의 특성화 및 내성의 주요 동인으로서 면역억제성 종양 미세환경에 대한 관심이 증가함에 따라, 연구자들은 관문 단독요법에 대한 효과적인 반응의 결여를 뒷받침하는 몇 가지 상이한 메커니즘을 발견했다. 면역학적 "핫" 종양은 높은 수준의 침윤성 T 세포 및 더 많은 항원을 함유하여, 면역계가 더욱 잘 인식할 수 있게 하고 강한 면역 반응을 유발할 가능성을 더 크게 한다. 면역학적으로 "핫"인 것으로 간주되는 암 중에는 방광암, 두경부암, 신장암, 흑색종 및 비소세포 폐암이 있다. 하지만, 이러한 면역학적 "핫" 암 내에서도 면역요법의 혜택을 받는 환자는 여전히 소수만이다. 이와 대조적으로, 면역학적 "콜드" 종양은 다양한 이유로 인해 침윤성 T 세포가 거의 없고, 외래로 인식되는 것으로 보이지 않으며 면역계가 강한 반응을 촉발하지 않는 암이어서, 이러한 암은 현행 면역요법으로 치료하기가 어려워진다. 고전적으로 면역학적 "콜드"인 암으로는 교모세포종, 뿐만 아니라, 난소암, 전립선암, 췌장암 및 대부분의 유방암을 포함한다.
종양의 미세환경은 암 세포 외에, 골수 유래 염증 세포, 림프구, 혈관, 혈관주위세포, 섬유아세포, 및 콜라겐과 프로테오글리칸으로 구성된 세포외 기질(ECM)을 포함하는 수많은 세포 유형을 함유한다. 실제로, 종양 약물 반응은 항암 치료에 대한 반응으로 섬유아세포, 중간엽 간질 세포(MSC), 면역 염증 세포, 혈관 내피 세포, 혈관주위세포 및 ECM을 포함한 종양 연관 간질 세포가 조합하기 때문에 종양 세포의 고유의 특성에 의해서만 결정되는 것은 아니다.
대식세포는 병원체에 대한 선천적 및 적응적 면역 반응과 조직내 항상성에 필수적인 역할을 하는 널리 분포된 선천적 면역 세포이다. 대식세포는 다양한 자극에 의해 활성화되고 기능적으로 상이한 표현형으로 분화될 수 있다. 고전적으로 활성화된(M1) 대식세포와 대안적으로 활성화된(M2) 대식세포를 포함하여 대식세포의 2가지 별개의 하위세트가 제안되었다. M1 대식세포는 일련의 전염증성 사이토카인, 케모카인 및 이펙터 분자, 예컨대, IL-12, IL-23, TNF-α, iNOS 및 MHCI/II를 발현한다. 대조적으로, M2 대식세포는 IL-10, TGF-β 및 아르기나제1과 같은 다양한 항염증 분자를 발현한다. 대부분의 종양에서 침윤된 대식세포는 종양 성장을 위한 면역억제성 미세환경(microenvironment)을 제공하는 M2 표현형인 것으로 간주된다. 게다가, 종양 연관 대식세포는 종양 혈관신생, 성장, 전이 및 면역억제를 촉진하는 많은 사이토카인, 케모카인 및 프로테아제를 분비한다. 종양내 M2 및 M2-유사 대식세포 활성 및/또는 수준을 저해 및/또는 감소시키는 것은 암에 대한 잠재적 치료법이다.
CD39로도 알려진 엑토-뉴클레오사이드 트리포스페이트 다이포스포하이드롤라아제(ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase)-1(NTPDase1)은 ENTPD1의 유전자 산물이며 세포외 뉴클레오타이드를 청소하고 촉매하는 세포 표면 엑토-효소이다. 이 엑토뉴클레오티다제(ectonucleotidase)는 이 단백질과 연관된 엑토-효소 활성의 종양내 수준을 저하시키는 것을 표적으로 했다. 그렇게 함으로써, 이 개입은 면역 반응을 유도하고 면역억제성 뉴클레오사이드 유도체인 아데노신의 종양내 수준을 저하시키는 세포외 뉴클레오타이드 농도를 높이는 것으로 간주된다.
ENTPD 계열 구성원인 엑토-뉴클레오사이드 트리포스페이트 다이포스포하이드롤라아제-3(NTPDase3)은 췌장 β 세포와 같은 일부 조직에서 풍부하게 발현되며, 여기서, 이는 포도당-유도 인슐린 분비를 조절하는 역할을 하는 것으로 보인다. Saunders 등(2019) Cell Metab 29(3):745-754, Lavoie 등(2010) Am J Physiol Endocrinol Metab 299: E647-E656, Munkonda 등(2009) FEBS J. 276:479-496, WO2018227176 및 WO2006113237을 참조한다. CD39와 대조적으로, 종래 기술에서 제안된 NTPDase3 항체의 사용은 잠재적인 항당뇨병 유용성, 또는 보다 일반적으로는 대사 질환의 치료; 뿐만 아니라 진단 및 영상화 목적용으로 주로 제한되었다. 면역-종양학과 관련된 범위까지, 다른 사람들은 NTPDase3 항체의 사용을 구체적으로 교시하여 선별된 항-CD39 항체가 NTPDase1에 선택적으로 결합하고 NTPDase2 또는 NTPDase3에는 결합하지 않는다고 설명했다. 예를 들어, WO2017157948, WO2017089334, WO2019096900 및 WO2019243252을 참조한다.
관련 기술분야에서 이전에 알려지지 않은 것으로서, NTPDase3는 또한 세포 상의 종양 미세환경에서, 그리고 또한 면역억제 또는 면역 배제 환경을 생성하는 역할을 하는 NTPDase1과 유사한 방식으로 상향조절된다. 예를 들어, 본 발명자들은 종양에서 강력한 면역 억제 신호를 부여할 수 있는 M2 및 M2-유사 대식세포에서 NTPDase3가 상향조절되는 것을 보여준다. 임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 이러한 맥락에서 NTPDase3의 역할은 M1 대식세포(항종양)에서 M2 대식세포(면역억제)로의 전환을 촉진하는데 잠재적으로 관여한다. ATP의 존재 하에, M2 대식세포는 아데노신을 생성하여 강력한 면역 억제 세포가 된다.
본 발명은 적어도 부분적으로 NTPDase3 항체의 사용에 기초하고 종양의 세포 구성에 영향을 미치는 작용 메카니즘을 통해 이들 항체의 항종양 활성을 보유한다. 이러한 작용은 NTPDase3의 엑토뉴클레오티다제 활성의 표적화된 저해를 통해 또는 단백질을 발현하는 세포(예컨대, M2 대식세포 및/또는 종양 혈관 주위의 혈관주위세포 또는 섬유아세포)를 표적으로 하여 작동한다. 이 후자의 접근 방식은 특정 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC) 적격 항-NTPDase3 항체를 사용하여 종양에서 이들 세포의 절제를 허용한다. 이 새로운 시약은 종양에서 M2 대식세포 활동 및/또는 수준을 감소시키고 세포독성 T 세포의 침윤을 향상시켜, 사실상 "콜드" 종양을 면역학적으로 "핫" 종양으로 전환시키는 데 사용될 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, NTPDase3은 종양 혈관과 연관된 혈관주위세포 및 섬유아세포에 의해 발현되어, 이러한 세포의 절제(예를 들어, ADCC에 의한)가 여전히 다른 메커니즘, 즉 종양 영양소 공급의 중단에 의해 종양의 과증식을 감소시키는 것으로 여겨지는 것으로 본원에서 결정되었다.
예를 들어, 일 측면으로, 항-NTPDase3 항체가 안정한 면역 복합체를 형성하도록 하는 부위에서 엑토뉴클레오사이드 트리포스페이트 다이포스포하이드롤라제-3(NTPDase3)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 및 (a) FcγRIIIa 수용체에 결합하고 NTPDase3+ 세포에 대한 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 활성을 항-NTPDase3 항체에 부여하는 FcγRIIIa 결합 모이어티를 포함하며; 및/또는 (b) NTPDase3 효소 활성을 저해하는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
본 발명의 임의의 측면에 적용될 수 있고/있거나 본원에 기재된 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있는 수많은 실시양태가 추가로 제공된다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시험관내 ADCC 검정에서 적어도 2x10-6 몰(M) 이하의 EC50을 가지며, 바람직하게는 여기서 EC50은 1x10-6 M 이하, 0.5x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 7.5x10-8 M 이하, 5x10-8 M 이하, 2.5x10-8 M, 1x10-8 M 이하, 7.5x10-9 M 이하, 5x10-9 M 이하, 2.5x10-9 M 이하, 1x10-9 M 이하, 7.5x10-10 M 이하, 5x10-10 M 이하, 2.5x10-10 M 이하, 1x10-10 M 이하, 7.5x10-11 M 이하, 5x10-11 M 이하, 2.5x10-11 M 이하, 1x10-11 M 이하, 7.5x10-12 M 이하, 5x10-12 M 이하, 2.5x10-12 M 이하, 또는 1x10-12 M 이하이거나, 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대, 1x10-6 M 내지 1x10-12 M, 5x10-7 내지 5x10-9 M, 및 1x10-7 내지 1x10-9 M 사이이다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 시험관내 NTPD3 효소 활성 저해 검정에서 적어도 2x10-6　M 이하의 EC50을 가지며, 바람직하게는, 여기서 EC50은 1x10-6 M 이하, 0.5x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 7.5x10-8 M 이하, 5x10-8 M 이하, 2.5x10-8 M, 1x10-8 M 이하, 7.5x10-9 M 이하, 5x10-9 M 이하, 2.5x10-9 M 이하, 1x10-9 M 이하, 7.5x10-10 M 이하, 5x10-10 M 이하, 2.5x10-10 M 이하, 1x10-10 M 이하, 7.5x10-11 M 이하, 5x10-11 M 이하, 2.5x10-11 M 이하, 1x10-11 M 이하, 7.5x10-12 M 이하, 5x10-12 M 이하, 2.5x10-12 M 이하, 또는 1x10-12 M 이하이거나, 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대, 1x10-6 M 내지 1x10-12 M, 5x10-7 내지 5x10-9 M, 및 1x10-7 내지 1x10-9 M 사이이고, 시험관내 NTPD3 효소 활성 저해 검정에 의해 결정된 것으로서, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 초과, 또는 이들 사이의 임의의 범위, 예컨대, 30% 내지 99%의 최대 저해 효능을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 시험관내 ADCC 검정에서 적어도 4x10-6　M 이하의 EC50을 갖고, 바람직하게는, 여기서 EC50은 2x10-6 M 이하, 1x10-6 M 이하, 0.5x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 7.5x10-8 M 이하, 5x10-8 M 이하, 2.5x10-8 M, 1x10-8 M 이하, 7.5x10-9 M 이하, 5x10-9 M 이하, 2.5x10-9 M 이하, 1x10-9 M 이하, 7.5x10-10 M 이하, 5x10-10 M 이하, 2.5x10-10 M 이하, 1x10-10 M 이하, 7.5x10-11 M 이하, 5x10-11 M 이하, 2.5x10-11 M 이하, 1x10-11 M 이하, 7.5x10-12 M 이하, 5x10-12 M 이하, 2.5x10-12 M 이하, 또는 1x10-12 M 이하이거나, 또는 그 사이의 임의의 범위, 예컨대, 1x10-6 M 내지 1x10-12 M, 5x10-7 내지 5x10-9 M, 및 1x10-7 내지 1x10-9 M 사이이고; 게다가 시험관내 효소 활성 저해 검정에서 적어도 4x10-6　M 이하의 EC50을 가지며, 바람직하게는, 여기서, EC50은 2x10-6　M 이하, 1x10-6　M 이하, 0.5x10-6　M 이하, 1x10-7　M 이하, 7.5x10-8　M 이하, 5x10-8　M 이하, 2.5x10-8　M, 1x10-8　M 이하, 7.5x10-9　M 이하, 5x10-9　M 이하, 2.5x10-9　M 이하, 1x10-9　M 이하, 7.5x10-10　M 이하, 5x10-10　M 이하, 2.5x10-10　M 이하, 1x10-10　M 이하, 7.5x10-11　M 이하, 5x10-11　M 이하, 2.5x10-11　M 이하, 1x10-11　M 이하, 7.5x10-12　M 이하, 5x10-12　M 이하, 2.5x10-12　M 이하, 또는 1x10-12　M 이하이거나, 또는 이들 사이의 임의의 범위, 예컨대, 1x10-6　M 내지 1x10-12　M, 5x10-7　내지 5x10-9　M, 및 1x10-7　내지 1x10-9　M이고, 시험관내 NTPD3 효소 활성 저해 검정에 의해 결정된 것으로서, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 초과, 또는 이들 사이의 임의의 범위, 예컨대, 30% 내지 99%의 최대 저해 효능을 갖는다.
NTPD3 기능성을 측정하기 위한 다양한 검정 설정은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상이한 수준의 NTPD3 발현/효소 활성을 갖는 표적 세포; 별개의 기능 검정 방법(예를 들어, ADCC 측정을 위한 루시페라제 리포터 검정 대 직접 NK-살해 검정, 효소 활성 또는 이의 저해를 측정하기 위한 CellTiter-Glo® 발광 검정 대 말라카이트 그린 포스페이트 검정, 효소 활성 또는 이의 저해를 측정하기 위한 PBS 대 개량 링거 완충액 등). 대안적 검정은 약간 다른 측정 산출량(예를 들어, EC50, 효소 저해 % 등)을 제공할 수 있지만, 검정 사이를 비교 및/또는 정규화하는 방법은 일상적이며 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
항-NTPDase3 항체가 FcγRIIIa 결합 모이어티를 포함하는 경우, 이는 Fc 도메인, FcγRIIIa에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 FcγRIIIa 결합 펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
항-NTPDase3 항체가 항원 결합 도메인인 경우, 이는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv(scFv), Fav, dsFv, sc(Fv)2, Fde, sdFv, 단일 도메인 항체(dAb), 및 다이아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다.
이러한 항-NTPDase3 항체는 단클론 항체일 수도 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 작용제(agent)에 접합되고, 선택적으로 작용제는 결합 단백질, 효소, 약물, 화학요법제, 생물학적 작용제, 독소, 방사성핵종, 면역조정제, 검출가능한 모이어티, 및 태그로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 75, 79, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 나열된 서열의 핵산과 같은 본원에 기술된 핵산 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산, 또는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 3, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 77, 81, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 나열된 서열의 핵산과 같은 본원에 기술된 핵산 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는(예컨대, 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 하의 혼성화, 및 50 내지 65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS에서 세척) 핵산 또는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 나열된 서열과 같은 본원에 기술된 중쇄 가변 서열의 CDR에 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 나열된 서열과 같은 본원에 기술된 가변 경쇄 서열의 CDR과 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 나열된 서열과 같은 본원에 기술된 가변 중쇄 가변 서열과 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 가변 중쇄(VH), 및 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 나열된 서열과 같은 본원에 기술된 가변 경쇄 서열과 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 갖는 경쇄를 포함하고, 이들 각각은, 예컨대, 클론 PBI#30, 3E9, 4F9, 8E1 (예컨대, h8E1), 16D4, 37H1, 38D5 (예컨대, h38D5), 38D12, 42D8, 및 44H5, 및 이들의 변이체인 경우, 본원에 기술된 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열의 각각의 CDR 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일하다. 예를 들어, (i) 서열번호 45와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 46과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 47과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 48과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 49와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 50과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 및 표 2A, 2B, 2C, 2D, 및 3에 나열된 서열과 같은 본원에 기술된 가변 중쇄 서열의 CDR로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 및 표 2A, 2B, 2C, 2D, 및 3에 나열된 서열과 같은 본원에 기술된 가변 경쇄 서열의 CDR로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 가진 인간화 중쇄 및 경쇄를 형성하는 인간 프레임워크 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG3, IgG2, 또는 IgG4 아이소타입의 Fc 도메인을 포함하고, 선택적으로, Fc 도메인은 인간이고, 바람직하게는 아이소타입은 ADCC 활성인 IgG1 또는 IgG3이다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 저-푸코실화(hypo-fucosylate) 또는 비푸코실화(afucosylate)된다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간이거나 인간화된다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 항원, 면역 관문 또는 공동자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성이다. 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 관문용인 경우에는 관문 저해제로서 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동자극 수용체용인 경우에는 공동자극 작동제로서 기능한다. 또 다른 실시양태에서, 추가 항원 결합 부위는 CD39, PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA, TIGIT 및 Siglec-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것과 같은 관문 단백질에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포 상에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 연관된 관문 단백질에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 추가 항원 결합 부위는 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것과 같은 면역 공동자극 수용체에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 추가 항원 결합 부위는 CD47, SIRPα, CD24, Siglec-15 또는 Siglec-10과 같은 선천적 면역의 유도제/강화제에 결합한다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 치료 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 NTPDase3+ 세포에 대해 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NTPDase3+ 면역 세포, 암 세포 및/또는 종양 혈관 주위의 혈관주위세포 및/또는 섬유아세포와 같은 NTPDase3+ 종양내 세포에 대해 ADCC 활성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NTPDase3+ 면역 세포, 예컨대, M2 대식세포 및/또는 종양 내의 다른 유형의 NTPDase3 발현 세포 상에서 NTPDase3의 항체-매개 표적 사이토시스를 유도할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NTPDase3+ 면역 세포, 예컨대 M2 대식세포 및/또는 종양 내의 다른 유형의 NTPDase3 발현 세포 상에서 NTPDase3 효소 활성을 저해할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NTPDase3에 결합하는 NTPDase3 단클론 항체 클론과 경쟁적, 비경쟁적 또는 부분 경쟁적인 방식으로 NTPDase3에 결합하며, 여기서 NTPDase3 단클론 항체 클론은 PBI#30 및 이의 친화도 성숙 변이체, 3E9, 4F9, 8E1 및 이의 인간화 대응물, 16D4, 37H1, 38D5 및 이들의 백본 서열에 점 돌연변이가 있거나 없는 이의 인간화 대응물, 38D12, 42D8 및 44H5를 포함하나, 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 NTPDase3 클론으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면으로, 본원에 기재된 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량, 및 하나 이상의 약제학적 허용성 부형제, 완충액 또는 용액을 포함하는 약제학적 제제가 제공된다. 예를 들어, 약제학적 제제는 항-종양 T 세포 면역성을 개선시키고 종양이 있는 대상체에게 투여하기에 적합한 것일 수 있고, 유효량의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적 허용성 부형제, 완충액 또는 용액을 포함하고, 여기서 대상체에 대한 항-NTPDase3 항체의 투여는 종양내 NTPDase3+ 세포, 예컨대, M2 및 M2-유사 대식세포의 수를 감소시키고, i) 종양 내로 T-세포 침윤을 향상시킬 수 있고, ii) 종양에서 T-세포 고갈, 및/또는 iii) 종양-연관 혈관구조를 파괴하여 종양 기아를 초래할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 치료적 유효량의 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 완충액 또는 용액을 포함하는 약제학적 제제가 제공된다. 예를 들어, 약제학적 제제는 유효량의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 완충액 또는 용액을 포함하는, 종양 혈관신생을 저해하고, 종양이 있는 대상체에게 투여하기에 적합한 것일 수 있고, 여기서 대상체에게 항-NTPDase3 항체의 투여는 혈관주위세포 및/또는 섬유아세포와 같은 종양내 NTPDase3+ 세포의 수를 감소시키고, 종양-연관 혈관 구조의 무결성을 파괴하여 종양 성장을 제한할 수 있다.
또 다른 측면으로, i) 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 보체와 엄격한 조건 하에 혼성화하거나; ii) 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대해 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 서열을 갖거나; 또는 iii) 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는, 단리된 핵산 분자가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 핵산에 의해 암호화되는 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 제공되며, 선택적으로 벡터는 발현 벡터이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포는 a) 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하거나; b) 본원에 기재된 폴리펩타이드의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하거나; 또는 c) 본원에 기재된 벡터를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 장치 또는 키트가 제공된다. 장치 또는 키트는 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 검출하기 위한 표지를 선택적으로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물, 단리된 핵산 분자, 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 장치 또는 키트가 제공된다.
또 다른 측면에서, 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서, (i) 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된, 형질전환된 숙주 세포를 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 허용하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, NTPDase3 폴리펩타이드의 존재 또는 수준을 검출하는 방법으로서, 샘플을 수득하고, 본원에 기재된 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 샘플 중 상기 폴리펩타이드를 검출하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NTPDase3 폴리펩타이드와 복합체를 형성할 수 있고, 이 복합체는 효소 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역 검정(RIA), 면역화학 검정, 웨스턴 블롯, 질량분석 검정, 핵 자기 공명 검정의 형식으로, 또는 세포내 유동 검정을 사용하여 검출할 수 있다.
또 다른 측면에서, 종양이 있는 대상체에게 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양내 NTPDase3+ 세포(예컨대, M2 및 M2-유사 대식세포, 혈관주위세포, 및/또는 섬유아세포)를 고갈시켜 항-종양 요법을 개선시키는 방법으로서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 종양내 NTPDase3+ 세포 수의 감소를 초래하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 종양이 있는 대상체에게 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양 내로 면역 세포 침윤을 촉진시키는 방법으로서, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 종양 내 NTPDase3+ 세포의 제거 및 감소를 초래하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 종양이 있는 대상체에게 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양내 면역 세포 기능의 II형 NKT 세포 억제를 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 종양내 M2 대식세포의 제거 및 감소를 초래하는 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 종양이 있는 대상체에게 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양내 면역 세포 기능의 조절성 T 세포(Treg) 억제를 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 종양내 M2 대식세포의 감소된 면역억제 활성을 초래하는 방법.
여전히 다른 측면에서, 종양이 있는 대상체에게 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 내 NTPDase3 발현 세포의 감소를 초래하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 항-종양 면역 반응을 촉진시키는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 대상체의 종양 내 T 세포 매개의 면역 기능을 촉진시키는 방법으로서, (i) 종양 침윤된 종양-반응성 림프구의 정도가 비-침윤 또는 과소-침윤성 종양 표현형인 것으로서 특징지어질 정도로 소정의 역치 미만인 암 대상체를 식별하는 단계; 및 (ii) 상기 대상체에게 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을, 종양 내 종양-반응성 T 세포 활성을 증가시키는 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
예시적인 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고형 종양을 치료하기 위한 항종양 요법과 같은 항종양 요법의 일부로서 투여되고, 선택적으로 고형 종양은 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종이다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로서 투여되고, 선택적으로 액체 종양은 백혈병이다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 화학요법제, 항-혈관신생제, 면역종양제 및/또는 방사선을 수반하는 요법의 일부로서 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 요법은 하나 이상의 관문 분자의 하나 이상의 저해제(길항제)를 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 관문 분자는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제, TIGIT 길항제 및 Siglec-15 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 요법은 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작동제)를 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 공동자극 분자는 GITR 작동제, CD27 작동제, 4-1BB 작동제, OX40 작동제, CD137 작동제, ICOS 작동제 및 CD28 작동제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 저해제, IDO1 저해제, HDAC 저해제, PI3K 델타 저해제, IL-15 작동제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 저해제, 인터루킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작동제, TRL7/8 작동제, RIG-1 작동제 및/또는 NRLP3 저해제, 항-CD73 항체(예컨대, MEDI9447), P2X7 길항제, 아데노신 A2a 수용체 길항제, 또는 항-CD39 항체 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 요법은 하나 이상의 선천성 면역 유도제를 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 선천성 면역 유도제는 CD47-SIRPα 축의 저해제(예를 들어, CD47 또는 SIRPα에 결합하고 두 분자의 상호작용을 저해하는 항체 또는 다른 결합 모이어티), CD24-Siglec-10 축의 저해제(예를 들어, CD24 또는 Siglec-10에 결합하고 두 분자의 상호작용을 저해하는 항체 또는 다른 결합 모이어티), NK 및 CD8+ 세포의 HLA-E 유도 저해를 차단하는 NGK2A 관문 저해제, STING 작동제, TLR7/8 작동제 및 RIG-I 작동제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 백신, 입양 세포 요법(CAR-T 및 ACTR 요법 포함), 항종양 유전자 요법, 저해성 핵산 요법(예컨대, siRNA, shRNA, 안티센스, CRISPR 및 TALEN 요법) 및/또는 종양용해성 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로서 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 암의 동물 모델이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 포유동물이고, 선택적으로 포유동물은 인간 또는 설치류이다.
도 1. 인간 ENTPD3(hENTPD3) 양성 CHO 세포(안정하게 형질감염된 세포)를 사용하여 유세포분석으로 측정한 PBI#30의 친화도. PBI#30은 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 333 nM), CHO-hENTPD3 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리(incubate)한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. Kd는 5.53 nM로 계산되었다.
도 2. hENTPD3 양성 COS-7 세포(안정하게 형질감염된 세포)를 사용하여 유세포 분석으로 측정한 PBI#30의 친화도. PBI#30은 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 133 nM), COS7-hENTPD3 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. Kd는 11.9 nM로 계산되었다.
도 3. hENTPD3 양성 HEK293T 세포(안정하게 형질감염된 세포)를 사용하여 유세포 분석으로 측정한 PBI#30의 친화도. PBI#30은 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 133 nM), HEK293T-hENTPD3 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. Kd는 8.4 nM로 계산되었다.
도 4. hENTPD3을 내인적으로 발현하는 RT4 방광암 세포를 사용하여 유세포 분석으로 측정한 PBI#30의 친화도. PBI#30은 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 133 nM), RT4 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. Kd는 10.1 nM로 계산되었다.
도 5. PBI#30은 CHO 세포 막에서 hENTPD3 효소 활성을 저해한다. CHO-hENTPD3 세포를 10 μg/mL의 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF, 마우스 항-hENTPD3 클론 hN3-B3s, 또는 PBI#30과 37℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, ATP(250 μM)와 실온에서 15분 동안 항온처리했다. 그 다음, 상청액을 수집하고, ATP 수준을 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 검출했다. 또한, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산하기 위해 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독을 나란히 검출했다.
도 6. PBI#30은 포화 용량에서 CHO 세포 막에서 hENTPD3 효소 활성을 완전히 저해한다. CHO-hENTPD3 세포를 연속 희석된 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 PBI#30(최고 용량 50 μg/mL)과 37℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, ATP(250 μM)와 실온에서 15분 동안 항온처리했다. 그 다음, 상청액을 수집하고, ATP 수준을 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 검출했다. 또한, 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독을 나란히 검출하고, 비교하기 위해 그래프로 제시했다. EC50은 17.30 μg/mL로 계산되었다.
도 7. PBI#30은 RT4 세포 막에서 hENTPD3 효소 활성을 저해한다. RT4 세포를 부착된 것 및 현탁된 것 모두로서, 10 μg/mL의 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 PBI#30과 37℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, ATP(25μM, 부착된 것; 또는 50μM, 현탁액)와 37℃에서 45분 동안 항온처리했다. 그 다음, 상청액을 수집하고, ATP 수준을 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 검출했다. 또한, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산하기 위해 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독(25 또는 50μM)을 나란히 검출했다.
도 8. PBI#30은 CHO-hENTPD3 세포에 대한 ADCC 활성을 입증한다. CHO-hENTPD3 세포를 표적 세포로 사용했다. 루시페라제 및 hCD16a-158V를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포를 이펙터(effector) 세포로 사용했다. 표적 세포를 나타낸 대로 연속 희석된 PBI#30과 5% CO2에서 37℃ 하에 30분 동안 사전 항온처리한 다음, 6시간 동안 이펙터 세포(T:E=1:6)와 공동배양했다. ADCC 활성은 배경에 비해 루시페라제 활성의 증가에 의해 나타났다. RLU: 상대 발광 단위. EC50은 0.092 μg/mL로 계산되었다.
도 9. CHO-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정한 인간/토끼 키메라성 항-인간 ENTPD3 클론의 친화도. 인간 IgG1 Fc에 의해 키메라화된 토끼 항-인간 ENTPD3 단클론 항체(인간/토끼 키메라 클론; Hu/Ra)를 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 33 nM), CHO-hENTPD3 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고 유세포 분석으로 분석했다. 각 클론에 대해 Kd를 계산했고 제시했다.
도 10. COS7-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정한 인간/토끼 키메라 항-인간 ENTPD3 클론의 친화도. Hu/Ra 키메라 항-인간 ENTPD3 클론(Hu/Ra)을 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 133 nM), COS7-hENTPD3 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. 각 클론에 대해 Kd를 계산했고 제시했다.
도 11. HEK293T-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정한 인간/토끼 키메라 항-인간 ENTPD3 클론의 친화도. Hu/Ra 키메라 항-인간 ENTPD3 클론을 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 133 nM), HEK293T-hENTPD3 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. 각 클론에 대해 Kd를 계산했고 제시했다.
도 12. hENTPD3 양성 RT4 방광암 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정한 인간/토끼 키메라 항-인간 ENTPD3 클론의 친화도. 토끼 단클론 항체인 3E9를 제외한 인간/토끼 키메라 항-인간 ENTPD3 클론(Hu/Ra)을 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 133 nM), RT4 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 또는 항-토끼 IgG, Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. 각 클론에 대해 Kd를 계산했고 제시했다.
도 13. 클론 38D5는 모든 키메라 클론 중에서 CHO 세포막에서 hENTPD3 효소 활성의 가장 높은 저해 능력을 발휘한다. CHO-hENTPD3 세포는 37℃에서 30분 동안 인간 10 μg/mL IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF, 마우스 항-hENTPD3 클론 hN3-B3s 또는 Hu/Ra 키메라 항-인간 ENTPD3 클론과 함께 항온처리한 다음, ATP(250μM)와 실온에서 15분 동안 항온처리했다. 그런 다음, 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독도 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산하기 위해 나란히 검출했다.
도 14. 클론 38D5는 포화 용량에서도 CHO 세포막에서 hENTPD3 효소 활성을 부분적으로 저해한다. CHO-hENTPD3 세포를 연속 희석된 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 Hu/Ra 38D5 클론(최고 용량 50μg/mL)과 함께 37℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, ATP(250μM)과 실온에서 15분 동안 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독도 나란히 검출했고, 비교를 위해 그래프로 제시했다. EC50은 15.92μg/mL로 계산되었다.
도 15. 클론 38D5는 모든 키메라 클론 중에서 RT4 세포막에서 hENTPD3 효소 활성의 가장 높은 저해 능력을 발휘한다. 부착된 RT4 세포 및 현탁액 상태의 RT4 세포 둘 모두를 토끼 단클론 항체인 3E9를 제외한 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 Hu/Ra 키메라 항-인간 ENTPD3 클론 10 μg/mL와 함께 37℃에서 30분 동안 항온처리하고, 37℃에서 45분 동안 ATP(25 μM, 부착된 것 또는 50 μM, 현탁액 상태)와 함께 항온처리했다. 그런 다음, 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독(25 또는 50 μM)도 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산하기 위해 나란히 검출했다.
도 16. CHO-hENTPD3 세포에 대한 인간/토끼 키메라 클론의 ADCC 활성. CHO-hENTPD3 세포를 표적 세포로 사용했다. 루시페라제 및 hCD16a-158V를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포를 이펙터 세포로 사용했다. 표적 세포를 표시된 바와 같이 연속 희석된 Hu/Ra 키메라 항-인간 ENTPD3 항체와 함께 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 예비-항온처리했고, 그 다음 이펙터 세포(T:E=1:6)와 함께 6시간 동안 공동배양했다. ADCC 활성은 배경 대비 루시페라제 활성의 증가로 표시되었다. RLU: 상대 발광 단위. 각 클론에 대해 EC50을 계산하여 제시했다.
도 17. CHO-hENTPD3 세포에서 모든 항-인간 ENTPD3 단클론 항체에 대한 에피토프 경쟁 검정. CHO-hENTPD3 세포를 20 μg/ml의 비접합 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 항-인간 ENTPD3 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리했다. 그런 다음, 세포를 Alexa Fluor® 647-접합된 클론 3E9, 38D5, 38D12, 44H5 또는 PBI#30과 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, 2회 세척하고 유세포분석으로 분석했다. 아이소타입 대조군과 관련하여 AF647 MFI 검출의 배수 변화를 계산했다(에피토프 중첩 없음 = 1).
도 18. 인간/토끼 키메라 클론 38D5 및 8E1의 생체내 항-종양 효능. 6 내지 8주령의 C57BL6 hENTPD3 KI 마우스에게 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(5X105)를 피하로 접종했다. 그런 다음, 마우스를 무작위로 3그룹으로 나누었다(n = 6). 4일째에, 종양 보유 마우스는 복강내 주사를 통해 20 mg/kg의 키메라 항-hENTPD3 항체 38D5 또는 8E1, 또는 200 μl의 식염수를 투여받았다. 7, 10 및 14일째에, 종양 보유 마우스는 10 mg/kg의 38D5 또는 8E1 항체, 또는 200μl의 식염수를 투여받았다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 주 2회 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
도 19. CHO-hENTPD3 및 COS7-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정한 완전 인간 항-hENTPD3 단클론 항체 PBI#30 hIgG1의 친화도. 일반적으로, 도 19 및 하기는 추가로 최적화된 예시적인 항-hENTPD3 단클론 항체 클론의 분석(예를 들어, PBI#30에 대한 친화도 성숙 및 아이소타입 전환, 및 8E1 및 38D5의 인간화) 및 관련 검출 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 도 19는 PBI#30 hIgG1이 표시된 바와 같이 연속 희석되고(최고 용량 33nM) 세포와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리된 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 이어서 유세포 분석으로 분석된 검정의 결과를 보여준다. Kd는 CHO-hENTPD3 세포의 경우 2.96nM, 및 COS7-hENTPD3 세포의 경우 1.82nM로 계산되었다.
도 20. PBI#30 hIgG1 항체는 hENTPD3 양성 CHO 및 COS7 세포막 둘 모두에서 hENTPD3 효소 활성을 저해한다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 2 μg/mL의 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 PBI#30 hIgG1과 함께 항온처리한 다음, 37℃에서 15분 동안 ATP(250 μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재하에 ATP 단독도 이하 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산하기 위해 나란히 검출했다.
도 21. PBI#30 hIgG1은 CHO-hENTPD3 세포를 향해 CDC 활성을 갖지 않는다. PBI#30 hIgG1을 표시된 바와 같이 연속 희석하고 CHO-hENTPD3 표적 세포와 37℃에서 30분 동안 사전-항온처리한 다음, 2시간 동안 10% 정상 인간 혈청(NHS)과 함께 항온처리했다. 표적 세포 용해는 유세포 분석으로 분석했고, P/I+ 세포 %(세포독성 %)를 계산했다. CDC 활성이 확인되지 않았으므로 EC50은 N/A(해당 사항 없음)로 열거했다.
도 22. 생체내 항종양 활성에 대한 PBI#30 hIgG1 검정. 6 내지 8주령 C57BL6 hENTPD3 KI 마우스에게 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(5X105)를 피하로 접종했다. 그런 다음, 마우스를 무작위로 2그룹으로 나누었다(n=6). 4일째에, 종양 보유 마우스는 복강내 주사를 통해 20 mg/kg의 PBI#30 hIgG1 또는 식염수 200 μl를 투여받았다. 7일, 10일 및 14일째에, 종양 보유 마우스에 10 mg/kg의 PBI#30 hIgG1 또는 200μl의 식염수를 투여했다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 주 2회 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
도 23. CHO-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석으로 측정한 PBI#30 성숙 변이체의 친화도. 원래의 클론 PBI#30 hIgG1을 친화도 성숙뿐만 아니라 아이소타입 전환 과정으로 처리하여 8개의 새로운 변이체를 생성했다. PBI#30 성숙 변이체를 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 66nM), CHO-hENTPD3 세포와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. 원래의 PBI#30 hIgG1 항체는 기준으로 사용했다. 각 변이체에 대해 Kd를 계산하여 제시했다.
도 24. COS7-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정된 PBI#30 성숙 변이체의 친화도. PBI#30 성숙 변이체와 원래의 PBI#30 hIgG1 항체를 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 66 nM), COS7-hENTPD3 세포와 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 다음, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. 각 변이체에 대해 Kd를 계산하여 제시했다.
도 25. PBI#30 성숙 변이체는 CHO-hENTPD3 세포막에서 hENTPD3 효소 활성을 강력하게 저해한다. CHO-hENTPD3 세포를 37℃에서 2시간 동안 2 μg/mL의 PBI#30 성숙 변이체와 함께 항온처리한 다음, 37℃에서 15분 동안 ATP(250 μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고, CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독도 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산하기 위해 나란히 검출했다. 원래의 PBI#30 hIgG1 항체는 기준으로 사용했다.
도 26. PBI#30 hIgG1 성숙 변이체는 더 긴 시간 동안 항온처리된 경우, 더 낮은 용량에서 CHO 세포막에서의 hENTPD3 효소 활성을 완전히 저해한다. 세포를 연속 희석된 아이소타입 대조군 또는 항체(최고 용량 10 μg/mL)와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 다음, 실온에서 15분 동안 ATP(250μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음, 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포의 부재 하에 ATP 단독도 나란히 검출하여 비교를 위해 그래프로 제시했다. EC50을 계산하여 제시했다. 세포가 항체와 4℃에서 30분 동안 항온처리된 도 6의 원래 클론 PBI#30 hIgG1의 EC50에 있어서의 차이에 유의한다.
도 27. PBI#30 성숙 변이체 Fc-적격 af4 hIgG1은 Fc-침묵 af4 hIgG4와 달리 CHO-hENTPD3 세포에 대해 높은 ADCC 활성을 갖는다. CHO-hENTPD3 세포를 표적 세포로 사용했다. 루시페라제 및 hCD16a-158V를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포를 이펙터 세포로 사용했다. 표적 세포를 표시된 바와 같이 연속 희석된 아이소타입 대조군 또는 PBI#30 성숙 변이체와 함께 37℃에서 30분 동안 사전-항온처리한 후, 6시간 동안 이펙터 세포(T:E=1:6)와 공동배양했다. ADCC 활성은 배경 대비 루시페라제 활성의 증가로 표시되었다. RLU: 상대 발광 단위. EC50은 PBI#30 hIgG1의 경우 1.443 μg/mL로, PBI#30af4 hIgG1의 경우 0.434로 계산되었다. PBI#30 hIgG1과 관련된 ADCC 배수 증가는 다음과 같이 결정했다: 성숙 변이체의 RLU/1 μg/mL에서 PBI#30 hIgG1의 RLU. 주: PBI#30af4 hIgG1 성숙 변이체는 부모 PBI#30 hIgG1 클론 대비 ADCC 활성의 2.8배 증가를 보여준다.
도 28. PBI#30 성숙 변이체는 CHO-hENTPD3 세포를 향해 CDC 활성을 갖지 않는다. PBI#30 hIgG1 및 이의 성숙 변이체는 표시된 바와 같이 연속 희석했고, 37℃에서 30분 동안 CHO-hENTPD3 표적 세포와 사전-항온처리한 다음, 2시간 동안 10% 정상 인간 혈청(NHS)과 함께 항온처리했다. 표적 세포 용해는 유세포 분석에 의해 분석하고, P/I+ 세포 %(세포독성 %)를 계산했다. CDC 활성은 확인되지 않았으므로, EC50은 N/A(해당 사항 없음)로 열거했다. PC: 사내 양성 대조군.
도 29. 2개의 예시적인 PBI#30 성숙 변이체(af4 hIgG1 및 af4 hIgG4)의 생체내 항종양 효능. 13 내지 16주령의 C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(1X105)를 피하 접종했다. 그런 다음 마우스를 무작위로 3그룹으로 나누었다(그룹당 n = 8). 종양 보유 마우스는 8일, 12일, 15일, 18일 및 21일째에 복강내 주사를 통해 완전 인간 항-hENTPD3 항체 PBI#3af4 hIgG1 또는 PBI#3af4 hIgG4 3 mg/kg 또는 식염수 200 μl를 투여받았다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 2일마다 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
도 30. 반복 용량 노출 후 생체내 PBI#30 성숙 변이체(af4 hIgG1 및 af4 hIgG4)의 혈장 제거율. 13 내지 16주령의 C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(1X105)를 피하 접종했다. 종양 보유 마우스는 8일, 12일, 15일, 18일 및 21일째에 복강내 주사를 통해 3mg/kg의 PBI#3af4 hIgG1 또는 PBI#3af4 hIgG4를 투여받았다. 혈장 샘플을 20일, 21일, 22일 및 24일째에 수집하고, 유리 혈장 항체 수준을 유세포분석으로 COS7-hENTPD3 세포를 사용하여 결합 분석에 의해 검출했다. PBI#30af4 hIgG1 및 hIgG4(2μg/mL)를 각각의 양성 대조군으로 사용하여 최대 세포 결합을 나타내었다. 샘플명은 동물 번호 + 수집 날짜로 지정한다. 반복 용량 노출 후 PBI#30af4 hIgG1 항체는 마우스 혈액에서 급속하게 제거되는 반면(혈장 항체 수준은 8마리 마우스 중 3마리에서만 검출됨), PBI#30af4 hIgG4는 안정적으로 유지된다(100% 마우스가 우수한 시험관내 결합 역학을 갖는 검출가능한 혈장 항체 수준을 가짐).
도 31. hENTPD3 양성 CHO, COS7 및 HEK293T 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정된 8E1 인간/토끼 키메라 클론 및 이의 인간화(hIgG1) 대응물의 친화도. 인간 IgG1 Fc로 키메라화된 8E1 토끼 항-인간 ENTPD3 단클론 항체(인간/토끼 키메라 클론; 8E1 Hu/Ra) 및 이의 인간화 대응물(8E1 hIgG1)을 표시된 바와 같이 연속 희석(최고 용량 66nM)하고 세포와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리하고, 그 다음 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)을 4℃에서 30분 동안 수행하고 유세포 분석으로 분석했다. Kd는 각 클론에 대해 계산하여 표에 제시했다. 주: 이 3가지 세포주는 hENTPD3의 차등 수준을 발현한다: HEK293T-hENTPD3(매우 높음) > CHO-hENTPD3(높음) > COS7-hENTPD3(중간). HEK293T-hENTPD3 세포는 매우 높은 수준의 hENTPD3 발현/효소 활성을 함유하며 생리학적으로 관련된 것으로 간주되지 않는다. COS7-hENTPD3 세포의 발현 수준은 RT4 방광암 세포(hENTPD3를 내인적으로 발현함)의 발현 수준과 유사하다. RT4 세포를 이용한 배양/작업의 기술적인 어려움으로 인해, ENTPD3 발현에 대해 일치하는 2개의 생리학적 관련 세포주 COS7-hENTPD3 및 CHO-hENTPD3을 시험관내 결합 및 기능 검정을 위해 선택했고, 각각 종양내 ENTPD3+ 및 ENTPD3high 세포를 나타낸다.
도 32. 8E1 Hu/Ra 클론 및 이의 인간화(hIgG1) 대응물은 hENTPD3 양성 CHO, COS7 및 HEK293T 세포막에서 hENTPD3 효소 활성의 최소 저해를 보여준다. 세포를 2 μg/mL의 8E1 Hu/Ra 또는 이의 인간화 대응물(8E1 hIgG1)과 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 후, ATP(250 μM)와 함께 37℃에서 15분 동안 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고, CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포가 없는 ATP 단독도 나란히 검출하여 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산했다. 주: HEK293T-hENTPD3 세포는 매우 높은 hENTPD3 효소 활성을 함유하여, 외인성 ATP를 매우 급속하게 분해한다. 이 기능 특징은 생리학적으로 관련이 있는 것으로 간주되지 않는다.
도 33. 8E1 Hu/Ra 클론 및 이의 인간화(hIgG1) 대응물은 고용량에서도 CHO 세포막에서 hENTPD3 효소 활성의 최소 저해를 보여준다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 연속 희석된 아이소타입 대조군 또는 항체(최고 용량 10μg/mL)와 함께 항온처리한 다음, 실온에서 15분 동안 ATP(250μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포가 없는 ATP 단독도 나란히 검출하여 비교용 그래프에 제시했다. EC50은 계산할 수 없었기 때문에 N/A(해당 없음)로 열거했다.
도 34. 인간화 8E1 클론(8E1 hIgG1)은 CHO-hENTPD3 세포에 대해 현저하게 높은 ADCC 활성을 입증한다. CHO-hENTPD3 세포를 표적 세포로 사용했다. 루시페라제 및 hCD16a-158V를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포를 이펙터 세포로 사용했다. 표적 세포를 37℃에서 30분 동안 표시된 바와 같이 연속 희석된 8E1 Hu/Ra 또는 이의 인간화 대응물(8E1 hIgG1)과 사전-항온처리한 후, 6 시간 동안 이펙터 세포(T:E=1:6)와 함께 공동배양했다. ADCC 활성은 배경 대비 루시페라제 활성의 증가로 표시되었다. RLU: 상대 발광 단위. EC50은 8E1 Hu/Ra의 경우 0.075 μg/mL로, 8E1 hIgG1의 경우 0.047로 계산되었다. 8E1 Hu/Ra와 관련하여 ADCC 배수 증가는 다음과 같이 결정되었다: 인간화 클론의 RLU/1 μg/mL에서 키메라 클론의 RLU. 인간화 8E1 hIgG1은 부모 8E1 Hu/Ra 키메라 클론에 비해 ADCC 활성의 1.5배 증가를 보여준다는 점을 유의한다.
도 35. 인간화 8E1 클론(8E1 hIgG1)은 CHO-hENTPD3 세포를 향해 현저하게 더 높은 CDC 활성을 나타낸다. 8E1 인간/토끼 키메라 클론(8E1 Hu/Ra) 및 이의 각각의 인간화 클론(8E1 hIgG1)을 표시된 바와 같이 연속 희석하고 37℃에서 30분 동안 CHO-hENTPD3 세포 표적 세포와 사전-항온처리한 다음, 2시간 동안 10% 정상 인간 혈청(NHS)과 항온처리했다. 표적 세포 용해는 유세포 분석으로 분석하고 EC50 및 P/I+ 세포 %(세포독성 %)를 계산했다. 배경 대비 최대 세포독성 %는 다음과 같이 결정되었다: 1 μg/mL에서 최대 세포독성 % - 각 클론에 대한 배경 세포독성 %(10-3 μg/mL에서). 인간화 8E1 hIgG1은 부모 8E1 Hu/Ra 키메라 클론에 비해 최대 CDC 세포독성의 2배 증가를 보여준다는 점을 유의한다.
도 36. hENTPD3 양성 CHO, COS7 및 HEK293T 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정된 38D5 인간/토끼 키메라 클론 및 이의 인간화(hIgG1) 대응물의 친화도. 인간 IgG1 Fc로 키메라화된 38D5 토끼 항-인간 ENTPD3 단클론 항체(인간/토끼 키메라 클론; 38D5 Hu/Ra) 및 이의 인간화 대응물(38D5 hIgG1)을 표시된 바와 같이 연속 희석(최고 용량 66nM)하고 세포와 함께 37℃에서 2시간 동안 항온처리했고, 이어서 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고 유세포 분석으로 분석했다. Kd는 각 클론에 대해 계산하여 제시했다.
도 37. 38D5 Hu/Ra 클론 및 이의 인간화(hIgG1 및 hIgG4) 대응물은 막에서 상이한 수준의 hENTPD3을 발현하는 세포에서 차등적 효소 활성 저해 효능을 발휘한다. 높은, 중간 및 매우 높은 hENTPD3 막 수준을 각각 발현하는 CHO, COS7 및 HEK293T 세포를 37℃에서 2시간 동안 2 μg/mL의 38D5 Hu/Ra 또는 이의 인간화 대응물(38D51 hIgG1 또는 38D5 hIgG4)과 함께 항온처리했고, 그 다음, 37℃에서 15분 동안 ATP(250 μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포가 없는 ATP 단독도 나란히 검출하여 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산했다.
도 38. 38D5 Hu/Ra 클론 및 이의 인간화(hIgG1) 대응물은 용량에 관계없이 동일한 비율로 CHO 세포막에서 hENTPD3 효소 활성을 중간 정도로 저해한다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 연속 희석된 아이소타입 대조군 또는 항체(최고 용량 10μg/mL)와 함께 항온처리한 다음, 실온에서 15분 동안 ATP(250μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고, CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포가 없는 ATP 단독도 나란히 검출하여 비교용 그래프에 제시했다. EC50은 38D5 Hu/Ra의 경우 0.31μg/mL, 38D5 hIgG1의 경우 0.22μg/mL로 계산되었다.
도 39. 인간화 38D5 클론(38D5 hIgG1)은 CHO-hENTPD3 세포에 대해 더 높은 ADCC 활성을 입증한다. CHO-hENTPD3 세포를 표적 세포로 사용했다. 루시페라제 및 hCD16a-158V를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포를 이펙터 세포로 사용했다. 표적 세포를 37℃에서 30분 동안 표시된 바와 같이 연속 희석된 38D5 Hu/Ra 또는 이의 인간화 대응물(38D5 hIgG1)과 함께 사전-항온처리한 후, 6 시간 동안 동안 이펙터 세포(T:E=1:6)와 함께 공동배양했다. ADCC 활성은 배경에 비해 루시페라제 활성의 증가로 표시되었다. RLU: 상대 발광 단위. EC50은 38D5 Hu/Ra의 경우 0.1041 μg/mL, 38D5 hIgG1의 경우 0.1036 μg/mL로 계산되었다. 38D5 Hu/Ra와 관련하여 ADCC 배수 증가는 다음과 같이 결정되었다: 인간화 클론의 RLU/1 μg/mL에서 키메라 클론의 RLU. 인간화 38D5 hIgG1은 부모 38D5 Hu/Ra 키메라 클론에 비해 ADCC 활성의 1.2배 증가를 보여준다는 것을 유의한다.
도 40. 인간화 38D5 hIgG1은 CHO-hENTPD3 세포를 향해 더 높은 CDC 활성을 나타낸다. 38D5 인간/토끼 키메라 클론(38D5 Hu/Ra) 및 각각의 인간화 클론(38D5 hIgG1)을 표시된 바와 같이 연속 희석하고 37℃에서 30분 동안 CHO-hENTPD3 세포 표적 세포와 사전-항온처리한 다음, 2시간 동안 10% 정상 인간 혈청(NHS)과 항온처리했다. 표적 세포 용해는 유세포 분석으로 분석하고 P/I+ 세포 %(세포독성 %)를 계산했다. 각 클론에 대해 EC50을 계산하여 제시했다. 배경에 비해 최대 세포독성 %는 다음과 같이 결정되었다: 1 μg/mL에서 최대 세포독성 % - 각 클론에 대한 배경 세포독성 %(10-3 μg/mL에서).
도 41. CHO-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정한 인간화 38D5 hIgG1 백본 점 돌연변이 변이체의 친화도. 인간화 38D5(38D5 hIgG1)는 경쇄(L) 또는 중쇄(H)의 백본에서 점 돌연변이로 처리되어 8개의 새로운 변이체를 생성했다. 38D5 hIgG1 클론 변이체를 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 66nM), 37℃에서 2시간 동안 세포와 함께 항온처리한 후, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)을 수행하고, 유세포 분석으로 분석했다. 원래의 인간화 38D5 hIgG1 항체를 기준으로 사용했다. Kd는 각 클론에 대해 계산하여 제시했다.
도 42. COS7-hENTPD3 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정한 인간화 38D5 hIgG1 클론 변이체의 친화도. 38D5 인간화(38D5 hIgG1) 클론 변이체를 표시된 바와 같이 연속 희석(최고 용량 66nM)하고 37℃에서 2시간 동안 세포와 함께 항온처리한 후, 4℃에서 30분 동안 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)하고, 유세포 분석으로 분석했다. 원래의 인간화 38D5 hIgG1 항체를 기준으로 사용했다. Kd는 각 클론에 대해 계산하고 제시했다.
도 43. 인간화 38D5 hIgG1 클론 변이체는 CHO-hENTPD3 세포막에서 중간 정도의 hENTPD3 효소 활성 저해 효능을 보여준다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 38D5 hIgG1 변이체 또는 원래의 인간화 38D5 hIgG1 항체 2 μg/mL와 함께 항온처리한 다음, 37℃에서 15분 동안 ATP(250 μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포가 없는 ATP 단독도 나란히 검출하여 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산했다.
도 44. 인간화 38D5 hIgG1 클론 변이체는 COS7-hENTPD3 세포 막에서 hENTPD3 효소 활성을 부분적으로 저해한다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 인간 IgG1 아이소타입 Ultra-LEAF 또는 38D5 hIgG1 변이체 또는 원래의 인간화 38D5 hIgG1 항체 2 μg/mL와 함께 항온처리한 다음, 37℃에서 15분 동안 ATP(250 μM)와 함께 항온처리했다. 그런 다음 상청액을 수집하고 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광에 의해 ATP 수준을 검출했다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포가 없는 ATP 단독도 나란히 검출하여, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 효소 활성 저해 %를 계산했다.
도 45. Fc-적격 인간화 38D5 hIgG1의 생체내 항종양 효능. 6 내지 8주령 C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(5X105)를 피하 접종했다. 그런 다음 마우스를 무작위로 2그룹으로 나누었다(그룹당 n = 5). 4일째에, 종양 보유 마우스는 복강내 주사를 통해 인간화 38D5 hIgG1 항체 20 mg/kg 또는 식염수 200 μl를 투여받았다. 7일, 10일 및 14일째에 종양 보유 마우스에 10 mg/kg의 38D5 hIgG1 항체 또는 200μl의 식염수를 투여했다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 주 2회 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
도 46. 생체내 종양 살해 검정에서 Fc-침묵 인간화 38D5 hIgG4 효과의 분석. 6 내지 8주령 C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(5X105)를 피하 접종했다. 그런 다음 마우스를 무작위로 2그룹으로 나누었다(그룹당 n = 5). 4일째에, 종양 보유 마우스는 복강내 주사를 통해 20 mg/kg의 인간화 38D5 hIgG4 항체 또는 200 μl의 식염수를 투여받았다. 7일, 10일 및 14일째에 종양 보유 마우스에 10mg/kg의 38D5 hIgG4 항체 또는 200μl의 식염수를 투여했다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 주 2회 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
도 47. Fc-적격 인간화 38D5 hIgG1은 단일 용량 노출 후 생체내에서 안정적이다. 9주령 C57BL6 hENTPD3 KI 무종양 암컷 마우스에 복강내 주사를 통해 38D5 hIgG1 1 또는 10 mg/kg의 1회 용량을 투여했다. 이어서 혈장 샘플을 각각의 마우스로부터 24시간 및 48시간 후에 수집하고, 유리 혈장 항체 수준을 유세포 분석에 의해 COS7-hENTPD3 세포를 사용한 결합 분석에 의해 검출했다. 38D5 hIgG1(2 μg/mL)을 양성 대조군으로 사용하여 최대 세포 결합을 나타내었다. 이 실험에는 각 용량당 1마리씩 총 2마리의 마우스를 사용했다. 샘플명은 주입 용량 + 수집 시간으로 지정되었다.
도 48. Fc-적격 인간화 38D5 hIgG1은 반복 용량 노출 후 생체내에서 안정적으로 유지된다. 9주령 C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(1X105)를 피하 접종했다. 종양 보유 마우스는 복강내 주사를 통해 12일, 15일, 18일 및 21일째에 3 mg/kg의 38D5 hIgG1을 투여받았다. 혈장 샘플을 19일, 21일 및 23일째에 수집하고, 유리 혈장 항체를 유세포 분석에 의해 COS7-hENTPD3 세포를 사용하여 결합 분석에 의해 검출했다. 38D5 hIgG1(2 μg/mL)을 양성 대조군으로 사용하여 최대 세포 결합을 나타내었다. 샘플명은 동물 번호 + 수집 날짜로 지정된다.
도 49. 8E1, 38D5 및 PBI#30 hIgG1의 상이한 결합 동역학 프로필은 세포 친화도에 영향을 미친다. 항체를 표시된 바와 같이 연속 희석하고(최고 용량 33nM), 4℃에서 20분 동안 또는 37℃에서 2시간 동안 CHO-hENTPD3 세포와 함께 항온처리한 다음, 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor® 488)을 4℃에서 30분 동안 수행한 후, 유세포 분석으로 분석했다. Kd는 각 클론에 대해 계산하여 제시했다. 38D5 및 PBI#30 클론의 경우 Kd의 유의미한 증가를 보였지만, 클론 8E1의 경우에는 항온처리 시간의 연장 후에도 그렇지 않음을 유의한다.
도 50. COS7-hENTPD3 세포에서 예시적인 Fc-적격 항-ENTPD3 단클론 항체의 항체:항원 면역 복합체의 안정성. 표시된 바와 같은 본 발명의 예시적인 항-인간 ENTDP3 항체(6 μg/ml)를 부착된 COS7-hENTPD3 세포와 함께 24시간 또는 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리한 후, 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor 488)을 4℃에서 30분 동안 수행했다. 이어서 세포를 세척하고, 트립신처리하고, 유세포 분석으로 분석했다. 2시간 처리와 24시간 처리 간에 AF488 MFI의 차이는 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 계산된 세포막에서의 인간 ENTPD3의 손실을 나타낸다. 8E1 및 38D5 Hu/Ra: 인간/토끼 키메라 항체; 8E1 및 38D5 hIgG1: 인간화 토끼 항체; PBI#30 hIgG1 및 PBI#30af4 hIgG1: 완전 인간 항체 및 이의 친화도 성숙 변이체.
도 51. CHO-hENTPD3 세포에서 다른 대상 ADCC-높은 단클론 항-ENTPD3 항체의 항체:항원 면역 복합체의 안정성. 인간/토끼 키메라 항체(2 μg/ml)를 CHO-hENTPD3 세포와 함께 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서, 또는 20분 동안 4℃에서 항온처리한 후, 2차 항체 염색(항-인간 IgG(Fc 특이적), Alexa Fluor 488)을 4℃에서 30분 동안 수행했다. 그런 다음 세포를 세척하고 유세포 분석으로 분석했다. 20분 처리와 24시간 처리 간에 AF488 MFI의 차이는 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 계산된 세포막에서의 인간 ENTPD3 손실을 나타낸다.
I. 개요
종양 미세환경은 악성 세포의 증식과 생존, 혈관신생, 전이, 비정상적인 면역, 및 호르몬과 화학요법제에 대한 반응 감소에 기여하기 때문에 매우 유의미한 치료 표적으로 간주된다. 많은 연구에서 종양-연관 대식세포(TAM)는 종양 미세환경의 주요 인자이며, 저산소성 종양 부위에 산소와 영양소를 공급하여 종양 진행에 필수적인 혈관신생의 중요한 조절인자인 것으로 입증되었다. 따라서, 암 환자의 종양 주위에 다수의 종양-연관 대식세포가 존재하는 경우, 환자의 예후 및 생존율은 좋지 않은 것으로 보고되었다. 종양 미세환경에서 종양-연관 대식세포의 역할은 여전히 논란의 여지가 많다.
종양-연관 대식세포는 종양 억제인자 M1 또는 종양 지지 M2 대식세포의 2가지 표현형으로 분류된다. M1형 종양-연관 대식세포는 항원을 제시하는 능력이 강하며 일반적으로 CD86과 TNF-α를 제시한다. 반대로, M2형 종양-연관 대식세포는 항원 제시 능력이 낮고 식균작용에 높은 잠재성이 있다.
M2형 대식세포는 다양한 세포외 기질 성분, 혈관신생 및 주화성 인자를 방출하여 면역억제, 종양형성 및 혈관형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. M2형 종양-연관 대식세포는 CD163, CD204, CD206 및 IL-10과 같은 일부 마커를 발현함으로써 M1형의 종양-연관 대식세포와 구별된다. 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암 및 피부 흑색종과 같은 대부분의 종양에서 종양 미세환경은 CSF-1, VEGF, CCL2, IL-4, IL-13, TGF-β 및 단핵구의 도입을 유도할 수 있고 M2와 유사한 표현형으로 분화를 유도할 수 있는 IL-10을 포함한다.
이전 연구에서는 캡슐화된 클로드로네이트에 의한 대식세포의 고갈이 종양 조직에서 혈관신생을 제한할 수 있음을 보여주었다. 또한, 대식세포의 침윤은 CSF-1R 및 CCR2 항체를 통해 방지되므로, 이는 종양 개시 특성을 제한 및 감소시키고 세포독성 T 림프구의 활성을 증가시키는 것이 가능하다. 따라서, M2형 종양-연관 대식세포의 높은 수준이 종양 미세환경에 존재하는 경우, 종양의 성장, 분화, 및 전이는 모두 활성화된다. 따라서, M2형 종양-연관 대식세포의 혁신적인 요소를 표적화하면, 종양 성장 및 전이를 예방하기 위한 잠재적인 요법을 제공할 수 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로 NTPDase3에 대한 특정한 항체가 종양 미세환경에서 상기 NTPDase3 발현 세포를, 예컨대, ADCC에 의해, 선택적으로 표적화 및 제거할 수 있다는 발견에 기초한다. 이것은 NTPDase3+ 대식세포(특히 M2/M2-유사 대식세포) 및/또는 종양의 다른 NTPDase3+ 세포 구성, 예컨대, 암세포와 같은 NTPDase3+ 종양내 세포, 뿐만 아니라 종양 혈관 주위의 혈관주위세포 및/또는 섬유아세포를 표적화함으로써 보다 효율적으로 일어난다. 결과적인 종양내 NTPDase3+ 세포 수의 감소는 종양 내로 T 세포 침윤이 증가할 때 종양의 염증성 표현형의 그러한 변화로 이어질 수 있다. 이들은 또한 종양내 T 세포 고갈의 수준 감소, 종양내 면역 세포 기능의 II형 NKT 세포 억제의 감소 및/또는 종양내 면역 세포 기능의 조절 T 세포(Treg) 억제의 제한, 및/또는 종양에 영양소 공급을 제한하는 종양-연관 혈관구조의 파괴(예를 들어, 종양 기아)에 잠재성이 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 적어도 부분적으로 NTPDase3에 대한 특정 항체가 그 효소의 NTPDase 활성을 저해하여 특정 부위에서 아데노신의 종양내 농도를 감소시킬 수 있다는 발견에 기초한다. 세포외 아데노신은 면역 기능의 저해제로 알려져 있다. 세포내 아데노신은 에너지 대사, 핵산 대사 및 메티오닌 순환에 관여하는 반면, 종양 미세 환경에서 세포외 아데노신은 면역 신호전달을 억제하는데 중요한 역할을 한다. 아데노신 A2A 수용체(A2AR)를 통해 신호를 전달하는 면역억제성 아데노신 3'5'-모노포스페이트(cAMP) 매개 경로는 저산소, 염증성 및 암성 미세환경에서 T 림프구 및 자연 살해(NK) 세포를 저해할 수 있다(Ohta 등(2006). Proc Natl Acad Sci USA, 103:13132-7).
최근 발전하는 긍정적인 임상 시험 데이터와 함께 전임상 증거는 A2AR 저해제의 투여가 면역요법에 잠재적인 새로운 전략일 수 있음을 입증한다. 또한, CD39/CD73을 수반하는 아데노신 생성 경로의 차단은 실험 동물 모델에서 유방암, 결장직장암 및 흑색종의 퇴행도 유도한다. 항-CD39 및 항-CD73 항체 요법의 경우, 주로 ATP 및 유도체 뉴클레오타이드 이화작용의 저해 또는 감소, 궁극적으로 이러한 세포 표면 아데노신 생성 효소(엑토뉴클레오티다제)에 대한 결합 및 효소 활성 저해 또는 세포 표면으로부터 효소 활성 제거를 통한 아데노신에 초점이 맞춰져 있다.
예시적 방법에서 더 상세히 설명되고 도면에 예시된 바와 같이, IgG1 Fc 도메인이 있는 인간 불변 영역을 갖도록 특별히 설계된, 완전 인간 항체 또는 인간화 항체인 것을 비롯한, 본원에 기재된 항-ENTPD3 항체가 생성되었고, 다양한 기능에 대해 검정되었다. IgG1 도메인-기반의 설계는 FcγRIIIa 수용체 의존적 세포 활성, 예를 들어, ENTPD3+ 세포에 대한 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(CDC), 및/또는 종양내 ENTPD3+ 세포의 항체 매개의 표적 사이토시스를 본 발명의 항-ENTPD3 항체에 부여한다. 결과적으로, 이러한 세포 활성은 종양 내 ENTPD3high 세포의 제거 및 감소를 초래한다. 또한, 본 발명자들의 항-ENTPD3 항체의 일부는 단독으로 또는 ADCC/CDC/표적 사이토시스 활성과 동반되어, ENTPD3+ 세포에서 ENTPD3 효소 활성을 저해할 수도 있고, 이에 따라 종양내 ENTPD3 효소 활성의 전반적인 감소로 이어진다.
문헌과 반대 교시이고 현재까지 종래 기술에 기재된 적이 없는, 치료용 항-ENTPD3 단클론 항체에 사용하기 위한 특징인 당해 항-ENTPD3 단클론 항체의 예시적인 특징은 요약되어, 표 1에 열거되고, 이하에 더 상세히 논의된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
"N/A"는 해당 사항 없음을 나타낸다.
* 생체내에서 테스트되지 않았지만, 이 클론은 유리한 생체내 종양-살해 활성을 가진 것으로 여겨지고 예상됨.
** 검정된 특정 조건 하에서, 부모 PBI#30 hIgG1 항체는 만족스럽지 못한 결합 동역학으로 인해 생체내 항종양 활성을 나타내지 않았고, 따라서 결합 친화도 및 기능성을 최적화하기 위해 친화도 성숙 변이체가 생성되었다.
*** 친화도 성숙 변이체 PBI#30af4 IgG1은 마우스 혈액에서 급속하게 제거되어 생체내 항종양 활성을 제한한다. 생체내에서 보다 안정적이도록 조작하면 생체내 종양-살해 활성을 가질 것으로 여겨지고 예상됨.
ENTPD3 발현/효소 활성에 대해 일치된 생리학적 관련 세포주를 본 발명의 결합 및 기능 검정에 사용했다.
CHO-hENTPD3, COS7-hENTPD3 및 HEK293T-hENTPD3 세포를 포함하는 3개의 안정적으로 형질감염된 세포주는 본원에서 추가로 기재된 바와 같이 결합 및 기능 검정에 사용하기 위해 확립시켰다. 이들 3개의 세포주는 표적 항원 hENTPD3의 발현/효소 활성의 차등적인 수준을 함유한다: HEK293T-hENTPD3(매우 높음) > CHO-hENTPD3(높음) > COS7-hENTPD3(중간). HEK293T-hENTPD3 세포주는 매우 높은 수준의 hENTPD3 효소 활성을 발현하므로, 외인성 ATP를 매우 급속하게 분해하며, 이는 생리학적으로 관련된 것으로 간주되지 않는다. COS7-hENTPD3 세포에 대한 hENTPD3 발현/효소 활성 수준은 RT4 인간 방광암 세포(hENTPD3을 내인적으로 발현함)에 대한 것과 유사하다. CHO-hENTPD3 세포는 종양 미세환경에서 ADCC 표적 ENTPD3high 세포를 대표한다. RT4 세포와의 배양/작업의 기술적 어려움으로 인해, ENTPD3 발현/효소 활성에 대해 일치하는 2개의 생리학적으로 관련된 형질감염 세포주인 COS7-hENTPD3 및 CHO-hENTPD3 세포를 시험관내 결합 및 기능 검정을 위해 각각 종양내 ENTPD3+ 및 ENTPD3high 세포를 나타내는 것으로 선택했다.
표적 세포막 상의 항원과 항-ENTPD3 항체의 안정한 면역 복합체의 형성은 항체에 높은 ADCC 활성을 부여한다.
도 50 및 51에 나타낸 바와 같이, 표적 세포 표면 상의 항체:항원 면역 복합체의 안정성은 본원에 기술된 모든 부모 대상 항-ENTPD3 항체에 대해 조사했고, 이들의 높은 ADCC 활성에 기초하여 초기에 선택되었다(도 8 및 16). 테스트된 모든 클론은 표적 세포막에서 항원 ENTPD3과 안정한 면역 복합체를 형성한다(즉, 세포막에서 인간 ENTPD3의 최고 손실은 30% 이하이다)(도 50 및 51). 더욱이, 개선된 ADCC 기능성을 갖는 조작된 클론 변이체(예를 들어, 각각 클론 8E1 및 PBI#30에 대한 도 27 및 34)는 각각의 부모 클론에 비해 유리하게 증가된 면역 복합체 안정성을 입증한다(도 50; 8E1 Hu/Ra 대 인간화 8E1 hIgG1 및 PBI#30 hIgG1 대 성숙 변이체 PBI#30af4 hIgG1). 본 발명자들의 데이터는 표적 세포막에서 항체의 ADCC 활성과 항체의 면역 복합체 안정성과의 양(positive)의 상관관계를 분명하게 보여준다.
대상 단클론 항체는 FcγRIIIa 수용체-의존적 세포 활성(예를 들어, ADCC)을 통해 종양 내 ENTPD3+ 세포를 표적화한다.
작업 예로서, 원래의 8E1 인간/토끼 키메라 클론(8E1 Hu/Ra, hIgG1 아이소타입)은 ENTPD3 효소 활성의 최소 저해를 보이지만(도 33), 시험관내에서 ENTPD3high 세포에 대해 매우 높은 ADCC 활성을 가지며(도 34; EC50 = 0.075 μg/ml), 이는 생체내에서 종양 성장을 차단하기에 충분한 것이다(도 18). 잠재적인 치료 용도를 위해 임의의 가능한 면역원성을 감소시키도록 설계된 이 클론의 대표적인 인간화 버전(8E1 hIgG1)은 부모 키메라 클론 8E1 Hu/Ra에 비해 1.5배 증가를 보여주는 ADCC 활성을 갖는다(도 34; EC50 = 0.047 μg/ml). 이론에 얽매임이 없이, 따라서 인간화 8E1 hIgG1은 생체내에서 유리한 종양-살해 활성을 갖는 것으로 여겨진다. 실제로, ADCC 살해 활성을 갖는 항체의 치료적 용도를 위해, 예를 들어, 항체의 IgG Fc 조작, 예를 들어, Fc 도메인의 탈푸코실화는 이 접근 방식이 항체의 ADCC 이펙터 기능을 대략 100배까지 향상시킬 수 있기 때문에 바람직하다(Shields 등 (2002) JBC. 277 (30):26733-26740; Yamane-Ohnuki 등 (2004) Biotechnol Bioeng. Sep 5, 87(5):614-622; Mori 등 (2007) Cytotechnology 55:109-114; 및 Lonza's Potelligent® CHOK1SC Cell Line for manufacture of afucosylated therapuetic antibodies). 따라서, 비푸코실화된 8E1 hIgG1의 시험관내 및 생체내 ADCC 종양-살해 활성 둘 모두의 상당한 증대가 예상된다.
또 다른 작업 예는 클론 38D5이다: 원래 인간/토끼 키메라 클론(38D5 Hu/Ra, hIgG1 아이소타입)은 생체내 항종양 활성(도 18)과 연관된 시험관내 ENTPD3high 세포를 향해 높은 ADCC 활성(도 39; EC50 = 0.1041 μg/ml)과 중간 정도의 효소 활성 저해 능력(도 37 및 38; EC50 = 0.31 μg/ml, 최대 저해의 대략 40%임)을 함유한다. 이 클론(38D5 hIgG1)의 인간화는 이의 시험관내 ADCC 활성을 개선시키고(도 39; EC50 = 0.1036 μg/ml, 부모 키메라 클론 38D5 Hu/Ra에 비해 1.2배 증가), 반면 이의 효소 활성 저해 능력은 유지한다(도 38). 인간화 38D5 hIgG1은 유리한 생체내 종양-살해 활성(도 45) 및 생체내 혈장 안정성(도 47 및 48)을 전시한다. 흥미롭게도, Fc-적격 38D5 IgG1에서 Fc-침묵 IgG4 버전으로의 전환체인 38D5 hIgG4 항체는 생체내에서 종양 성장을 차단하지 못하지만(도 46), 이의 시험관내 효소 활성 저해 능력은 유지한다(도 37).
이들 데이터는 높은 ADCC 활성(0.1 μg/ml의 대략적인 EC50에서)만으로도 ENTPD3 효소 활성 저해 능력에 관계없이 시험관내 및 생체내 모두에서 항체에 종양-살해 활성을 부여하기에 충분하다는 것을 다시 한 번 입증하고; 중간 수준의 효소 활성 저해 능력만을 함유하는 항체는 생체내 항종양 활성을 갖기에 충분하지 않다.
대상 단클론 항체는 ENTPD3 효소 활성의 직접적인 저해를 통해 종양 내 ENTPD3+ 세포를 표적화한다.
작업 예는 완전 인간 클론 PBI#30이다: 원래 클론 PBI#30 hIgG1은 시험관내에서 높은 수준의 ADCC 활성을 보이며(도 27; EC50 = 1.443 μg/ml), 또한 시험관내에서 ENTPD3high 세포에 대해 높은 효소 활성 저해 효능(도 26; EC50 = 2.51 μg/ml, 최대 저해의 대략 80%임)을 전시한다. 그러나, 만족스럽지 못한 결합 동역학(도 1-4)으로 인해, 하나의 생체내 설정(도 22)에서 테스트되었을 때 종양-살해 활성을 갖지 않는다.
PBI#30 hIgG1의 친화도 성숙 변이체(예를 들어, PBI#30af4, 6, 7 및 8 hIgG1), 뿐만 아니라 이의 아이소타입 전환 버전(예를 들어, Fc-침묵 IgG4 버전으로 전환된 Fc-적격 IgG1 아이소타입)(예를 들어, PBI#30af4, 6, 7 및 8 hIgG4)을 생성했다. 일 예로서 변이체 PBI#30af4를 사용하면, 친화도 성숙(PBI#30af4 hIgG1)은 부모 PBI#30 hIgG1 항체의 기능적 성능, 예컨대, 효소 활성 저해 능력(도 26: EC50=0.82 μg/ml, 최대 저해의 대략 100%임) 및 ADCC 활성(도 27; EC50 = 0.434 μg/ml)을 개선시킨다. 예상된 바와 같이, Fc-침묵 IgG4 버전(PBI#30af4 hIgG4)은 임의의 ADCC 활성을 갖지 않지만(도 27), 이의 효소 활성 저해 능력은 매우 높은 수준으로 여전히 유지된다(도 26; EC50 = 1.33 μg/ml, 최대 저해의 대략 100%임).
흥미롭게도, PBI#30af4 hIgG1 및 PBI#30af4 hIgG4 항체가 생체내에서 테스트될 때, hIgG4 버전 항체는 유리한 항종양 효능을 입증하며(도 29); 이는 몇몇 경우에 효소 활성 저해 능력 단독이 매우 높은 수준으로 유지된다면, 생체내 종양파괴 활성을 발휘하기에 충분하다는 것을 시사한다.
또 다른 중요한 점으로서, PBI#30af4 hIgG1이 마우스 혈액에서 신속하게 제거되어 종양 조직에서 항체 이용가능성을 제한하고(도 30), 궁극적으로 이의 생체내 항종양 활성을 상쇄한다는 것이 추가로 관찰되었다(도 29). 따라서, PBI#30af4 hIgG1이 생체내에서 더 안정적이도록 조작된다면, 이 항체에 유리한 생체내 ADCC 종양-살해 활성을 부여할 수 있을 것으로 여겨진다.
대상 항-ENTPD3 단클론 항체는 잠재적인 치료 용도를 위해 인간에 대한 기능성을 향상시키고/시키거나 면역원성을 감소시키도록 조작된다.
대표적인 예로서, 완전 인간 클론 PBI#30을 항체 프레임워크 영역을 파괴함이 없이 항체 CDR 영역에 점 돌연변이를 도입함으로써 친화도 성숙에 의해 조작했다. 이의 친화도 성숙 변이체는 기능 결과에 대한 개선을 보여준다(도 25-27).
또 다른 예로서, 토끼 클론 8E1 및 38D5를 인간화(항체 CDR 영역을 파괴함이 없이 항체 프레임워크 영역의 인간화를 통해)하여 항체의 기능성이 현저하게 손상되거나 심지어 개선되지 않지만(도 32-35 및 37-40), 부모 항체의 특이성 및 친화도를 유지하도록 했다. 이 항체 조작 접근 방식은 인간에 대한 항체의 면역원성을 감소시키는 것이다.
또 다른 예로서, 인간화 38D5 항체는 치료 용도를 위해, 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 파괴함이 없이 또는 항체의 생물물리학적 및 기능적 속성을 극적으로 손상시킴이 없이, 항체 백본 서열에 점 돌연변이를 도입함을 통해, 치료 용도를 위해 인간에 대한 잠재적인 면역원성을 추가로 감소시키도록 추가로 조작되었다(도 41-44).
대상 단클론 항체는 상이한 에피토프에 결합하고 상이한 세포 결합 동역학을 전시하는 다양한 항-ENTPD3 항체를 포함한다.
예로서, 도 17은 본 발명에서 본 발명자들의 항-ENTPD3 항체 풀(pool)이 상이한 에피토프에 결합하는 다양한 여러 항체로 이루어진다는 것을 보여주며, 즉, 클론 PBI#30은 클론 38D12와 완전히 경쟁하는 반면, 다른 모든 클론과 부분적으로 경쟁한다. 대조적으로, 클론 38D5는 클론 44H5와만 완전히 경쟁하고, 클론 PBI#30 및 42D8과 부분적으로 경쟁하는 반면, 나머지 클론과는 경쟁하지 않는다. 8E1은 클론 3E9와 완전히 경쟁하고, 클론 PBI#30 및 38D12와 부분적으로 경쟁하며, 클론 38D5 및 44H5와 경쟁하지 않는다.
본 발명자들의 항-ENTPD3 항체 풀은 또한 결합 동역학 프로필이 상이한 항체도 함유한다. 도 49에 나타낸 예로서, 일부 클론은 느린 결합 속도(예를 들어, 38D5 및 PBI#30)를 갖는 반면 일부 클론은 빠른 결합 속도(예를 들어, 8E1)를 갖는다.
본 발명자들의 항-ENTPD3 단클론 항체 풀의 이러한 생물물리학적 다양성은 잠재적인 치료 용도를 위한 최상의 선도적인 후보를 선택할 수 있는 더 큰 기회를 제공한다.
II. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 많은 용어 및 문구가 이하에 정의된다.
"NTPDase3"는 ENTPD3 유전자에 의해 암호화되며, 세포외 NTP를 상응하는 NDP 중간체를 통해 NMP로 가수분해하는 원형질막-결합된 엑토뉴클레오티다제이다. 대표적인 인간 NTPDase3 cDNA 및 단백질 서열은 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)에서 공개적으로 이용가능하다. 예를 들어, 2개의 세포질 도메인, 2개의 막관통 도메인 및 큰 세포외 영역을 함유하는 인간 NTPDase3 서열은 UniProtKB에서 O75355(ENTP3_HUMAN)로서 제공된다. 단 하나의 세포질 도메인과 하나의 막관통 도메인(짧은 형태)을 함유하는 인간 NTPDase3의 2가지 잠재적인 동형도 UniProtKB에서 C9J0J3(C9J0J3_HUMAN) 및 A0A3B3IT06(A0A3B3IT06_HUMAN)으로서 보고되어 있다.
인간 NTPDase3 단백질의 결정 구조 및 구조-기능 관계는 관련 기술분야에 거의 알려져 있지 않다. 이와 관련하여 유일하게 이용가능한 정보는 래트 NTPDase2의 세포외 부분의 결정 구조를 통해 NTPDase3의 세포외 부분의 1차 서열을 스레딩함에 의한 인간 NTPDase3의 3D 모델이다(Munkonda 등 (2009) FEBS J. 276:479-496; Ivanenkov 등(2010) Protein Engineering, Design & Selection 23(7):579-588).
NTPDase3 활성의 조정(예를 들어, 저하)은 임의의 방식 수로 측정될 수 있다(예를 들어, 대조군, 비율, 기준선에 대한 비교 등을 사용하는 것을 포함하는 본원에 기재된 측정에 따라). 예를 들어, NTPDase3 활성 조정제는 엑토뉴클레오티다제의 촉매 활성 또는 전체 NTPDase3 활성을 테스트 작용제의 존재 하에 상기 엑토뉴클레오티다제의 수준과 비교하여 저하시킬 수 있다. 일 실시양태에서, NTPDase3 활성은 샘플 중 아데노신의 농도를 분석함으로써 결정된다. 농도는 시간 경과에 따라 평가될 수 있다. 다른 실시양태에서, ATP는 테스트된 샘플에 첨가되고 ATP, ADP, AMP 또는 아데노신의 농도가 결정되거나 평가된다. 이러한 정황에서 저하와 같은 조정은 1%, 5%, 10%>, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 120%, 150%, 200%, 500%, 1000%, 또는 그 이상의 저하를 의미할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 증가는 시간 경과에 따라 검출된다.
"NTPDase3 항체"(대안적으로 "항-NTPDase3 항체")는 NTPDase3 단백질의 하나 이상의 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체를 지칭하며, 단일파라토프 항체 뿐만 아니라 이중파라토프 및 다른 다중파라토프 형식의 항체를 포함한다.
a. 항체 및 다른 폴리펩타이드
본원에 사용된 용어 "항체"는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 통해 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질 또는 이들 중 임의의 조합과 같은 표적을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭하며, 여기서 항원 결합 부위는 일반적으로 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는 온전한 다클론 항체, 온전한 단클론 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단편이 Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 형식화된 경우 단일 사슬 Fv(scFv) 항체, 다중특이성 항체, 이중특이성 항체, 단일특이성 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 융합 단백질(Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 형식화됨), 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다.
본 발명의 정황에서 "항체-매개 표적 사이토시스"는 NTPDase3+ 세포의 수의 실질적인 감소 없이, 즉, NTPDase3+ 세포 사멸의 유도 외에 다른 과정을 통해, NTPDase3+ 세포의 표면으로부터 NTPDase3의 항체-매개의 고갈을 지칭한다.
본원에 사용된, 용어 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"은 항원(예를 들어, 인간 NTPDase3)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체와 같은 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연합될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 및 다른 잠재적 작제물은 Chan & Carter(2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301에 기재되어 있다. 이들 항체 단편은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별된다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
항체의 "가변 영역"이라는 용어는 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합으로 지칭한다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 프레임워크 영역(FR) 및 "초가변 영역"으로도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)으로 이루어진다. 각 사슬의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 밀접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 기술에는 적어도 2가지가 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기반한 접근법(즉, Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.), 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근법(Al Lazikani 등, 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). 또한, CDR을 결정하기 위해 이러한 2가지 접근법의 조합이 본 기술분야에서 때로 사용된다.
항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 각각 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 정체(identity)를 기반으로 하여, 5가지 주요 부류의 면역글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 임의의 것 또는 이들의 하위부류(아이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있지만, 바람직한 NTPDase3 항체는 FcγRIII을 가장 효과적으로 체결(즉, Kd가 10-7 이하)하기 위한 IgG1 및 IgG3 아이소타입이다.
특정 실시양태에서, 항체는 "저푸코실화"되고, 심지어 "비푸코실화"될 수 있다. "저푸코실화된" 항체 제제는 올리고당 사슬의 50% 미만이 α-1,6-푸코스를 함유하는 항체 제제를 지칭한다. 전형적으로, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 1% 미만의 올리고당 사슬이 "저푸코실화된" 항체 제제에서 α-1,6-푸코스를 함유한다. "비푸코실화된" 항체에는 IgG 중쇄의 CH2 도메인에 부착된 탄수화물에 α-1,6-푸코스가 결여되어 있다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는 항체 또는 모든 항체가 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는 항체 조성물을 지칭한다. 전형적으로 이러한 단클론 항체는 항체를 암호화하는 단일 세포 또는 핵산으로부터 유래될 것이고, 임의의 서열 변경을 의도적으로 도입함이 없이 전파될 것이다. 따라서, 용어 "인간 단클론 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 선택적인 불변 영역을 갖는 단클론 항체를 지칭한다. 일 실시양태에서, 인간 단클론 항체는, 예를 들어 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비-인간 동물(예를 들어, 인간 중쇄 전이유전자(transgene) 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스)로부터 수득되는 B 세포를 불멸화 세포에 융합시킴으로써 수득되는, 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 특이적 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린, 또는 최소의 비-인간 서열을 함유하는 단편인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 CDR의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR 유래의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 비-인간 종의 항체에 있는 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 개량하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR을 함유하는 가변 도메인을 포함할 수 있는 반면, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인의 적어도 일부(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 일반적으로 키메라 항체와 별개인 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 또는 본 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 만든 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2종 이상에서 유래되는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 1종의 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 등)에서 유래된 항체의 가변 영역에 해당하는 반면, 불변 영역은 그 종의 면역 반응의 유발을 피하기 위해 다른 종(일반적으로 인간)에서 유래된 항체의 서열에 상동성이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 FcγR 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3개의 활성화(마우스의 경우 FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV; 인간의 경우 FcγRIA, FcγRIIA 및 FcγRIIIA) 및 하나의 저해성(FcγRIIB) 수용체로 이루어진다.
"FcγRIII 결합 모이어티"는 펩타이드, 단백질, 핵산 또는 다른 모이어티이며, 이는 항-NTPDase3 항체의 항원 결합 부위와 연관되는 경우, FcγRIII(CD16)에 결합할 수 있고 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있다. IgG1 및 IgG3 아이소타입의 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 중쇄 Fc 단편은 FcγRIII 결합 모이어티이다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 일부를 지칭한다. 항원이 폴리펩타이드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 및 비인접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(선형 에피토프라고도 함)는 전형적으로 단백질 변성 시에 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프(형태적 에피토프라고도 함)는 전형적으로 단백질 변성 시에 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 형태에 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5, 6, 7, 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적인"은 표적과 항체 사이의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함하는 이종성 분자 집단의 존재 하에 표적의 존재에 결정적이다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 이 표적에 더 큰 친화도, 결합력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 결합하는 항체이다. 일 실시양태에서, 비관련 표적에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역검정(RIA)에 의해 측정된 표적에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 또는 심지어 0.1 nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항체는 상이한 종의 단백질 중에서 보존되는 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만 이를 필요로 하지는 않는다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 변형되거나, 또는 개입; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 구성요소와의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 이 정의에는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 포함) 뿐만 아니라 본 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드도 포함된다. 본 발명에 의해 포괄되는 폴리펩타이드는 항체 또는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 다른 구성원을 기반으로 할 수 있기 때문에, 특정 실시양태에서 폴리펩타이드는 단일 사슬 또는 연관된 사슬로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드의 정황에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 동일하거나, 또는 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려함이 없이, 최대 상응도로 비교 및 정렬(필요한 경우 갭을 도입시킴)한 경우 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는, 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 육안 검사를 통해 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 이들로는 BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, 및 이의 변형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄되는 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드는 실질적으로 동일하며, 이는 이들이 최대 상응도로 비교 및 정렬된 경우, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 육안 검사를 통해 측정했을 때, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 일부 실시양태에 따르면, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 적어도 약 10개의 잔기, 적어도 약 20개의 잔기, 적어도 약 40-60개 잔기, 적어도 약 60-80개 잔기 길이 또는 이 사이의 임의의 정수 값인 아미노산 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개 잔기보다 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-100개 잔기에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 서열의 전체 길이, 예컨대, 표적 단백질 또는 항체의 암호 영역 상에서 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 동일성은 적어도 약 10개의 염기, 적어도 약 20개의 염기, 적어도 약 40-60개의 염기, 적어도 약 60-80개의 염기 길이 또는 이들 사이의 임의의 정수 값인 뉴클레오타이드 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60-80개 염기보다 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-1000개 염기 또는 그 이상에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서 서열은 비교되는 서열의 전체 길이, 예컨대 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지성 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 본 기술분야에 일반적으로 정의되어 있다. 예를 들어, 티로신 대신에 페닐알라닌의 치환은 보존적 치환이다. 일반적으로, 본 발명에 의해 포괄되는 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 및/또는 항체의 서열에서 보존적 치환은 표적 결합 부위에 대한 그 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 또는 항체의 결합을 저지하지 않는다. 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 식별하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.
"단리된" 것인 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도까지 정제된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본 명세서에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(즉, 오염물이 없음), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩타이드"는 적어도 2개의 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 혼성 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "링커" 또는 "링커 영역"은 제1 폴리펩타이드(예를 들어, 항-NTPDase3 항체)와 제2 폴리펩타이드(예를 들어, Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 모이어티; NTPDase3에 대해 이가성(bivalency)을 유지하는 이중특이성 항체 형식을 생성하는 상이한 단백질에 결합하는 scFv, Vhh 도메인 또는 이의 유사물) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 링커는 폴리펩타이드의 발현, 분비 또는 생체활성에 부정적인 영향을 미치지 않아야 한다. 바람직하게는, 링커는 항원성이 아니며 면역 반응을 유발하지 않는다.
b. 핵산
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "암호화하는 핵산 분자", "암호화하는 DNA 서열" 및 "암호화하는 DNA"라는 용어는 데옥시리보핵산 데옥시리보뉴클레오타이드의 가닥을 따른 뉴클레오타이드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오타이드의 순서는 폴리펩타이드(단백질) 사슬을 따른 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, 핵산 서열은 아미노산 서열을 암호화한다.
본 명세서에 사용된 "서열"은 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 사용되는 경우, 이 용어의 문법적 및 다른 형태는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 서열은 돌연변이될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 2 내지 1,000,000개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드(또는 초과하거나 그 사이의 임의의 정수 값) 핵산, 예를 들어, 약 100 내지 약 10,000개, 또는 약 200개 뉴클레오타이드 내지 약 500개 뉴클레오타이드의 길이)를 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고 일반적으로 발현할 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하지만. 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "형질감염"은 진핵 세포로의 외인성 핵산을 지칭한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공침, DEAE- 덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 유전자총 기술(biolistics)을 포함하는, 본 기술분야에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "담체"는 세포의 내부로 조성물을 전달하기 위해 사용될 수 있는 단리된 핵산을 포함하는 단리된 핵산이다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양쪽친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 담체는 본 기술분야에 알려져 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등이 세포 내로 핵산의 전달을 용이하게 하는 것을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"라는 용어는 작동가능하게 연결된 발현될 뉴클레오타이드 서열과 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 사용되는 충분한 시스 작용성 요소(시스 작용성 요소)를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 노출형 또는 리포솜에 함유됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)와 같은 본 기술분야에 공지된 모든 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이에서 후자의 발현으로 연결 결과물에 연결되는 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 기능적 관계인 경우, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이는 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 암호 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 전형적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하며, 필요에 따라 동일한 판독 프레임에서 2개의 단백질 암호 영역을 연합시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 도입되거나 폴리뉴클레오타이드 서열의 세포 특이적 전사의 합성 기구에 필요한, 합성 기구에 의해 인식되는 프로모터 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용되는 용어 "구성적 발현"은 생리학적 조건 하에서 발현되는 모든 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유도성 발현"은 "발현을 유도하는" 루틴에 숙련된 방식으로 T 세포 항원이 결합할 때 발생하는 것과 같은 조건인 특정 조건 하에서의 발현을 지칭한다.
"전기천공"이라는 용어는 생체막에 미세한 경로(기공)를 유도하기 위한 막관통 전기장 펄스의 사용을 지칭하며; 이들의 존재는 플라스미드 또는 다른 올리고뉴클레오타이드와 같은 생체분자가 세포막의 한쪽에서 다른 쪽으로 통과할 수 있도록 한다.
c. 관문 저해제, 공동자극 작동제, 선천성 면역 유도제 및 화학요법제
"관문 분자"는 조직 및/또는 면역 세포에 의해 발현되고 관문 분자의 발현 수준에 의존적인 방식으로 면역 반응의 효능을 감소시키는 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질이 차단되면 면역계 상에 "브레이크"가 해제되어, 예를 들어 T 세포는 암세포를 더 효과적으로 죽일 수 있다. T 세포 또는 암세포에서 발견되는 관문 단백질의 예로는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA, TIGIT, CD39 및 Siglec-15를 포함한다.
"관문 저해제"는 관문 분자로부터 면역억제 신호전달을 역전시키는 약물 실체(entity)를 지칭한다.
"공동자극 분자"는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여, 비제한적으로 증식과 같은 공동자극을 매개하는 T 세포 동족 결합 파트너와 같은 면역 세포를 지칭한다. 공동자극 분자는 효과적인 면역 반응을 촉진하는 항원 수용체 또는 리간드와 다른 세포 표면 분자이다. 공동자극 분자로는 MHCI 분자, BTLA 수용체 및 Toll 리간드, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 공동자극 분자의 예로는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244,2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a 및 CD83 리간드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"공동자극 작동제"는 공동자극 리간드와 같이 공동자극 분자를 활성화(작동작용)시키고 면역자극 신호를 생성하거나, 그렇지 않으면 면역 반응의 효력 또는 효능을 증가시키는 약물 실체를 지칭한다.
"선천성 면역 유도제"는 염증 활성의 활성화 및/또는 대식세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 호중구 등의 항염증 활성의 비활성화를 포함하는, 선천적 면역 반응을 모방하는 작용제이다. 선천성 면역 유도제는 CD47 또는 SIRPα에 결합하고 이 두 분자의 상호작용을 억제하여 항종양 대식세포 활성을 촉진하기 위한 항체 또는 다른 결합 모이어티와 같은 CD47-SIRPα 축의 저해제를 포함한다. 선천성 면역 유도제는 CD24 또는 Siglec-10에 결합하여 두 분자의 상호작용을 저해하여 항종양 대식세포 활성을 촉진하는 항체 또는 다른 결합 모이어티와 같은 CD24-Siglec-10 축의 저해제를 포함한다. 다른 실시양태에서, 선천성 면역 활성제는 NK 및 CD8+ 세포의 HLA-E 유도 저해를 차단하는 NGK2A 관문 저해제일 수 있다. 선천성 면역의 소분자 유도제는 STING 작동제, TLR7/8 작동제 및 RIG-1 작동제와 같은 작용제를 포함한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN)와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판, 및 피포술판과 같은 알킬술폰산염; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에티일렌티오포스포아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토제닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 페메트렉시드; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; TLK-286; 경구 알파-4 인테그린 저해제인 CDP323; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 아이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴과 같은 니트로스우레아; 엔다이인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1(예를 들어, Nicolaou 등, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994) 참조))와 같은 항생제; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(ADRIAMYCIN, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사(DOXIL) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 아이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트, 젬시타빈(GEMZAR), 테가푸르(UFTORAL), 카페시타빈(XELODA), 에포틸론 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘 및 아이마티닙(2-페닐아미노피리미딘 유도체)과 같은 피리미딘 유사체 및 기타 c-Kit 저해제; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항부신; 폴린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜친; 다이아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 아사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK 다당류 복합체(JHS Natural Products, 오리건주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE, FILDESIN); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(TAXOL), 파클리탁셀의 알부민 조작된 나노입자 제형(ABRAXANE) 및 도세탁셀(TAXOTERE); 클로람부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴(VELBAN); 백금; 에토포사이드(VP-16); 아이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 아이반드로네이트; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레틴산과 같은 레티노이드; 상기 중 임의의 것의 약제학적 허용성 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATIN)을 사용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX와 같은 상기 2 이상의 조합을 포함한다.
또한, 이 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 저해하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 온몸 치료 형태인 항호르몬제가 포함된다. 이는 호르몬 자체일 수 있다. 예로는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제(SERM)를 포함하며, 예를 들어 타목시펜(NOLVADEX 타목시펜 포함), 랄록시펜(EVISTA), 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(FARESTON); 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제(ERD); 풀베스트란트(FASLODEX)와 같은 에스트로겐 수용체 길항제; 난소를 억제하거나 차단하는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 류프롤리드 아세테이트(LUPRON 및 ELIGARD), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린과 같은 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 작동제; 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드와 같은 항안드로겐; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 저해하는 아로마타제 저해제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트(MEGASE), 엑세메스탄(AROMASIN), 포르메스타니, 파드로졸, 보로졸(RIVISOR), 레트로졸(FEMARA) 및 아나스트로졸(ARIMIDEX)을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOS 또는 OSTAC), 에티드로네이트(DIDROCAL), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(ZOMETA), 알렌드로네이트(FOSAMAX), 파미드로네이트(AREDIA), 틸루드로네이트(SKELID), 또는 리세드로네이트(ACTONEL); 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-다이옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체(EGF-R)와 같은 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것; THERATOPE 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 ALLOVECTIN 백신, LEUVECTIN 백신 및 VAXID 백신과 같은 백신; 토포아이소머라제 1 저해제(예를 들어, LURTOTECAN); 풀베스트란트와 같은 항에스트로겐; 아이마티닙 또는 EXEL-0862(티로신 키나제 저해제)와 같은 키트 저해제; 에를로티닙 또는 세툭시맙과 같은 EGFR 저해제; 베바시주맙과 같은 항-VEGF 저해제; 아리노테칸; rmRH(예를 들어, ABARELIX); 라파티닙 및 라파티닙 다이토실레이트(GW572016로도 알려진 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 17AAG(열 충격 단백질(Hsp) 90 독약인 겔다나마이신 유도체), 및 상기 임의의 것의 약제학적 허용성 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "사이토카인"은 일반적으로 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하거나 단백질을 생산하는 세포에 자가분비 효과가 있는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 지칭한다. 이러한 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인; IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, IL-18 내지 IL-29(예컨대, IL-23), IL-31과 같은 인터루킨("IL"), 예를 들어, PROLEUKIN rIL-2; TNF-α 또는 TNF-β, TGF-β1-3과 같은 종양 괴사 인자; 및 백혈병 저해 인자("LIF"), 섬모상 신경영양 인자("CNTF"), CNTF-유사 사이토카인("CLC"), 카디오트로핀("CT"), 및 키트 리간드("KL")를 포함하는 다른 폴리펩타이드 인자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "케모카인"은 백혈구의 화학주성 및 활성화를 선택적으로 유도하는 능력을 갖는 가용성 인자(예를 들어, 사이토카인)를 지칭한다. 이들은 또한 혈관 신생, 염증, 상처 치유 및 종양형성의 과정을 촉발시킨다. 케모카인의 예로는 뮤린 각질세포 화학유인물질(KC)의 인간 상동체인 IL-8을 포함한다.
d. 치료
"종양 면역"은 종양이 면역 인식 및 제거(clearance)를 회피하는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료 개념으로서 종양 면역은 그러한 회피가 약화되면 "치료"되고, 종양이 면역계에 의해 인식되고 공격을 받는다. 종양 인식의 예로는 종양 결합, 종양 수축 및 종양 제거를 포함한다.
"지속적인 반응"은 치료 중단 후 종양 성장 감소에 대한 지속적인 효과를 지칭한다. 예를 들어, 종양 크기는 투여 단계 초기의 크기와 비교하여 동일하거나 더 작게 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속적인 반응은 적어도 치료 기간과 동일하거나, 치료 기간의 적어도 1.5x, 2.0x, 2.5x, 또는 3.0x 길이인 기간을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 묘사한다. 암의 예로는 암종, 모세포종, 육종, 및 림프종과 백혈병 같은 혈액암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "종양" 및 "신생물"은 전암성 병변을 포함하는 양성(비암성) 또는 악성(암성)인 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인한 임의의 조직 덩어리를 지칭한다. 종양 성장은 일반적으로 제어되지 않고 진행성이며, 정상 세포의 증식을 유도하거나 저해하지 않는다. 종양은 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 신경교 세포, 식도, 나팔관, 담낭, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 요도, 요관, 요도, 자궁, 질 기관 또는 조직 또는 해당 세포로부터 선택되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 다양한 세포, 조직 또는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 종양은 육종, 암종, 형질세포종 또는 (악성 형질 세포)와 같은 암을 포함한다. 본 발명에 의해 포괄되는 종양은 백혈병(예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수성 - 단핵구 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성적혈구증가증), 림프종(호지킨병, 비호지킨병), 원발성 거대글로불린혈증, 중쇄 질환 및 육종암(예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 내피육종, 림프관육종, 혈관육종, 림프관내피육종, 생체활막종, 중피종, 유잉종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유두 암종, 유두 선암종, 암종, 기관지 암종, 수질 암종, 신세포 암종, 간세포암, 나일관암, 융모막암, 정원세포 종양, 배아 암종, 빌름스종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청각신경종, 희소돌기아교종, 신경초종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종), 식도암, 담낭, 신장암, 다발성 골수종을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, "종양"은 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 및 신경교종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 암이 새로운 위치에서 유사한 암 병변의 발달과 함께 기원 부위로부터 신체의 다른 영역으로 퍼지거나 전달되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이하는" 세포는 인접 세포와의 부착 접촉을 상실하고 질병의 주요 부위로부터 혈류 또는 림프를 통해 이동하여 이웃하는 신체 구조에 침범하는 것이다.
"암 세포" 및 "종양 세포"라는 용어는 다량의 암 세포 집단을 포함하는 비-종양유발성 세포, 및 종양유발성 줄기 세포(암 줄기 세포) 둘 모두를 포함하는 암 또는 종양 또는 전암성 병변에서 유래되는 세포의 총 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"는 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별하기 위해 재생 및 분화 능력이 결여된 세포만을 지칭하는 경우, 용어 "비-종양유발성"에 의해 수식될 것이다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 지칭한다.
본원에 사용된 "완전한 반응" 또는 "CR"은 모든 표적 병변의 소멸을 지칭하고; "부분 반응" 또는 "PR"은 기준선 SLD를 기준으로 하여 표적 병변의 최장 직경(SLD) 합계가 적어도 30% 저하된 것을 지칭하고; "안정된 질환" 또는 "SD"는 치료가 시작된 이후 가장 작은 SLD를 기준으로 하여, PR 자격을 갖기에 충분한 표적 병변의 수축, 또는 PD 자격을 갖기에 충분한 증가가 전혀 없는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "진행성 질환" 또는 "PD"는 치료가 시작된 이후에 기록된 가장 작은 SLD 또는 하나 이상의 새로운 병변의 존재를 기준으로 하여 표적 병변의 SLD가 적어도 20% 증가한 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "무진행 생존"(PFS)은 치료되는 질병(예를 들어, 암)이 악화되지 않는 치료 중 및 치료 후의 시간 길이를 지칭한다. 무진행 생존에는 환자가 완전 반응 또는 부분 반응을 경험한 시간의 양, 뿐만 아니라 환자가 안정된 질병을 경험한 시간의 양이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "전체 반응률"(ORR)은 완전한 반응(CR) 비율과 부분 반응(PR) 비율의 합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "전체 생존률"은 특정 기간 후에 생존할 가능성이 있는 그룹 내 개체의 백분율을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "치료"는 임상 병리학의 예방적 개입 과정일 수 있는, 세포의 개입에 의해 유발되는 임상 질환의 과정 또는 치료를 변화시키려는 개체를 지칭한다. 질환의 발생 또는 재발을 방지하기 위한 치료, 증상 완화, 임의의 질환의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 저속화, 질환 완화 또는 개선된 예후의 호전 또는 차도를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"대상체"라는 용어는 특정 치료의 수용체이어야 하는 인간, 비-인간 영장류, 개과, 고양이과, 설치류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "작동제(agonist)" 및 "작동작용성(agonistic)"은 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 실질적으로 유도, 활성화, 촉진, 증가 또는 향상시킬 수 있는 치료 모이어티를 지칭하거나 나타낸다. "작동제"라는 용어는 단백질 또는 다른 관심 표적의 활성을 부분적으로 또는 완전히 유도, 활성화, 촉진, 증가 또는 향상시키는 임의의 작용제(agent)를 포함하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 용어 "길항제" 및 "길항작용성"은 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해, 감소 또는 중화시킬 수 있는 치료 모이어티를 지칭하거나 나타낸다. 용어 "길항제"는 단백질 또는 다른 관심 표적의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해, 감소 또는 중화시키는 임의의 작용제를 포함하기 위해 본원에서 사용된다.
본 명세서에서 "조정(modulation)" 및 "조정하다"라는 용어는 생물학적 활성의 변화 또는 변경을 지칭한다. 조정은 활성을 자극하거나 활성을 저해하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 조정은 활성의 증가 또는 활성의 감소, 결합 특성의 변화, 또는 단백질, 경로, 시스템 또는 다른 생물학적 관심 표적의 활성과 연관된 생물학적, 기능적 또는 면역학적 특성의 임의의 다른 변화일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 선천 면역계 및 적응 면역계 둘 모두로부터의 반응을 포함한다. 이는 세포 매개 및/또는 체액성 면역 반응을 모두 포함한다. 이는 T 세포 및 B 세포 반응, 뿐만 아니라 천연 킬러(NK) 세포, 단핵구, 대식세포 등과 같은 면역계의 다른 세포로부터의 반응을 포함한다.
"약제학적 허용성"이라는 용어는 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인될 수 있거나, 인간을 포함한 동물에 사용하기 위한 것으로 미국 약전 또는 기타 공인된 약전에 등재된 물질을 지칭한다.
용어 "약제학적 허용성 부형제, 담체 또는 보조제" 또는 "허용되는 약제학적 담체"는 본 개시내용의 적어도 하나의 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고 약리학적 활성을 파괴하지 않고 치료 효과를 전달하기에 충분한 용량으로 투여된 경우 무독성인 부형제, 담체 또는 보조제를 지칭한다. 일반적으로, 본 기술분야의 기술자 및 미국 FDA는 약제학적 허용성 부형제, 담체 또는 보조제를 임의의 제형의 비활성 성분으로 간주한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "치료 효과"는 포유동물과 같은 대상체에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 항-NTPDase3 항체의 양을 지칭한다. 암 또는 종양의 경우, 항-NTPDase3 항체의 치료적 유효량은 치료 효과가 있고, 이 자체가 면역 반응을 증대시키고, 항종양 반응을 증대시키며, 면역 세포의 세포용해 활성을 증가시키고, 면역 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 증가시키고, 종양 세포의 수를 감소시키며; 종양형성성, 종양형성 빈도 또는 종양형성 능력을 저하시키고; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시키며; 종양 크기를 감소시키고; 암 세포 집단을 감소시키고; 예를 들어, 연조직 및 뼈로의 암 확산을 비롯한 말초 기관으로의 암세포 침윤을 저해 또는 중지시키며; 종양 또는 암 세포 전이를 저해 및 중지시키고; 종양 또는 암 세포 성장을 저해 및 중지시키고; 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시키고; 이환율 및 사망률을 감소시키고; 삶의 질을 개선시키고; 또는 이러한 효과의 조합을 나타낼 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위해" 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키기 위해"라는 용어는 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하거나, 둔화시키거나, 증상을 줄이거나 및/또는 진행을 중지시키는 치료적 조치 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 예방하거나 지연시키는 예방적 또는 방어적 조치 둘 모두를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 자로는 이미 장애가 있는 자; 장애를 갖기 쉬운 자; 및 장애가 예방되어야 하는 자를 포함한다. 암 또는 종양의 경우, 대상체는 다음 중 하나 이상을 환자가 나타내는 경우 본 발명에 의해 포괄되는 방법에 따라 성공적으로 "치료"된다: 증가된 면역 반응, 증가된 항종양 반응, 면역 세포의 증가된 세포용해 활성, 면역 세포에 의한 종양 세포의 증가된 사멸, 암 세포 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 연조직 및 뼈 내로 암세포의 확산을 포함하는, 말초 기관 내로 암 세포 침윤의 저해 또는 부재; 종양 또는 암 세포 전이의 저해 또는 부재; 암 성장의 저해 또는 부재; 특이 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 이환율 및 사망률 감소; 삶의 질 개선; 종양형성 감소; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소; 또는 일부 효과의 조합.
e. 기타
실시양태가 "포함하는"이란 표현과 함께 본원에 기재되는 경우, "로 이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"이란 용어로 기재된 달리 유사한 실시양태도 제공되는 것으로 이해한다. 또한, 실시양태가 "본질적으로 이루어지는"이란 표현과 함께 본원에 기재된 경우, "로 이루어진"이란 용어로 기재된 달리 유사한 실시양태도 제공되는 것으로 이해한다.
본원에 사용된, "약" 또는 "대략적인" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수에 관한 실시양태를 포함(및 설명)하는 것이다. 예를 들어, "약 X"에 관한 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 모두; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 이와 유사하게, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 다음 실시양태를 각각 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
III. 항-NTPDase3 항체
a. 단클론 항체
항-NTPDase3 항체는 단클론 항체일 수 있다. 이러한 단클론 항체는 Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495(1975)에 기재된 것과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 기타 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제에 의해 면역화되어, 그 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도해 낸다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 전형적으로 NTPDase3 폴리펩타이드 또는 이의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 필요한 경우에는 말초 혈액 림프구("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 필요한 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 림프구는 그 다음 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 불멸화 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체의 안정적인 높은 수준의 발현을 지원하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는 뮤린 골수종 세포주이며, 이는 예를 들어 캘리포니아주 샌디에이고에 소재하는 Salk Institute Cell Distribution Center 및 버지니아주 마나사스에 소재하는 American Type Culture Collection에서 얻을 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 단클론 항체의 생산에서 기술된 바 있다[Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 폴리펩타이드에 대해 지향된 단클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대, 방사성면역검정(RIA) 또는 효소 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 검정은 본 기술분야에 공지되어 있다. 단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어, Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)에 의해 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포가 식별된 후, 클론은 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다[Goding, 상기 문헌 참조]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물의 복수로서 생체내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단클론 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
단클론 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 단클론 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용)를 사용하여 쉽게 단리되고 서열결정될 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 그 다음 면역글로불린 단백질을 달리 생성하지 않는 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체의 합성을 얻을 수 있다. DNA는 또한 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 암호 서열을 치환함으로써[미국 특허 제4,816,567호; Morrison 등, 상기 문헌 참조] 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 암호 서열에 공유 연합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 본 발명에 의해 포괄되는 항체의 불변 도메인에 치환될 수 있거나, 본 발명에 의해 포괄되는 항체의 하나의 항원 조합 부위의 가변 도메인에 치환되어 키메라성 2가 항체를 생성할 수 있다.
b. 인간 및 인간화 항체
본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)으로서, 비-인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유한다. 인간화 항체로는 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR 유래의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용체 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용체 항체 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어디서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 그 일부를 포함할 것이다[Jones 등, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature, 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)].
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입(import)" 잔기라고 하며, 이는 전형적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 Winter와 동료들의 방법[Jones 등, Nature, 321:522-525(1986); Riechmann 등, Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen 등, Science, 239:1534-1536 (1988)]에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열 대신에 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 본질적으로 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이며, 여기서는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비-인간 종의 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리[Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581(1991)]를 포함하는 본 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. Cole 등 및 Boerner 등의 기술도 인간 단클론 항체의 제조에 이용가능하다(Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985) 및 Boerner 등, J. Immunol., 147(1):86-95(1991)]. 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스에 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 항원 공격 시, 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 포함하는 모든 관점에서 인간에서 발견된 것과 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 다음 과학 간행물: Marks 등, Bio/Technology 10, 779-783(1992); Lonberg 등, Nature 368 856-859(1994); Morrison, Nature 368, 812-13(1994); Fishwild 등, Nature Biotechnology 14, 845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826(1996); Lonberg 및 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)에 기재되어 있다.
항체는 또한 상기 기재된 바와 같은 공지된 선택 및/또는 돌연변이유발 방법을 사용하여 친화도 성숙될 수 있다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 이 성숙 항체가 제조되는 출발 항체(일반적으로 뮤린, 인간화 또는 인간)보다 5배, 보다 바람직하게는 10배, 훨씬 더 바람직하게는 20배 또는 30배 더 큰 친화도를 갖는다.
c. 이중특이성 항체
본원에 기재된 항-NTPDase3 항체는 이중특이성 분자를 포함한다. 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 유도체화되거나, 또 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 서로 다른 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이성 분자를 생성할 수 있다. 본원에 기재된 항체는 실제로 유도체화되거나 하나보다 많은 다른 기능 분자에 연결되어 2개보다 많은 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자는 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이성 분자"에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 이중특이성 분자를 생성하기 위해, 본원에 기재된 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 연관 등에 의해)할 수 있고, 이중특이성 분자가 초래된다.
따라서, 본원에는 NTPDase3에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 분자가 제공된다. 이중특이성 분자가 다중-특이성인 본원에 기재된 실시양태에서, 분자는 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 당해의 이중특이성(또는 경우에 따라 다중특이성)은, 예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA, TIGIT, CD39 및/또는 Siglec-15와 같은 관문 저해제인, 면역 관문에 대한 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중-특이성은 T-세포 상의 관문 단백질, 특히 LAG-3, TIM-3, TIGIT, 또는 CD39와 같은 T-세포 고갈과 연관된 관문에 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중-특이성은 NTPDase3 및 하나 이상의 다른 T-세포 연관 관문에 결합하고 NTPDase3 및 이것이 결합하는 다른 관문 단백질 각각 또는 둘 모두를 발현하는 세포의 항체-의존적 세포의 세포독성을 야기한다.
특정 실시양태에서, 당해의 이중특이성(또는 경우에 따라 다중특이성)은 면역 공동자극 수용체, 예를 들어, 즉 공동자극 작동제(활성화제), 예컨대, MHCI 분자, BTLA 수용체 및 Toll 리간드의 작동제, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)에 대한 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 다중특이성에 포함될 수 있는 공동자극 분자의 예로는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a 및 CD83 리간드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 당해의 이중특이성(또는 경우에 따라 다중특이성)은 CD47, SIRPα, CD24, Siglec-10 또는 NKG2A에 대한 결합 모이어티와 같은 선천성 면역 활성화제로서 작용하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이성 분자는 결합 특이성으로서 적어도 하나의 항체, 또는 이의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv를 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편, 예컨대, Fv 또는 단일 사슬(scFv) 작제물일 수도 있다.
특정 표적에 대한 이중특이성 분자의 결합은 효소 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), FACS 분석, 생물검정(예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 본 기술분야에서 인정된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 이들 각각의 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 사용하여 특정 관심이 있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
이중특이성 항체를 제조하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다[Milstein 및 Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 모음으로 인해, 이러한 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 서로 다른 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 유사한 절차는 1993년 5월 13일에 공개된 WO 93/08829 및 Traunecker 등, EMBO J., 10:3655-3659(1991)에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 적어도 하나의 융합체에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 공동형질감염된다. 이중특이성 항체 생성에 대한 추가 세부사항은 예를 들어 Suresh 등, Methods in Enzymology, 121:210(1986)을 참고한다.
WO 96/27011에 기술된 또 다른 접근법에 따르면, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하기 위해 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면이 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서는 제1 항체 분자의 계면에서 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 제2 항체 분자의 계면에 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동"이 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물보다 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이성 항체는 전체 길이의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이성 항체)으로 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. Brennan 등, Science 229:81(1985)은 온전한 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 설명한다. 이 단편은 다이티올 복합화제인 아비산나트륨(sodium arsenite)의 존재하에 환원되어 근접(vicinal) 다이티올을 안정화하고 분자간 이황화물 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 그 다음 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 그 다음 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이성 항체를 형성한다. 생성된 이중특이성 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
Fab' 단편은 E.콜라이(E. coli)로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 이중특이성 항체를 형성할 수 있다. Shalaby 등, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)는 완전 인간화 이중특이성 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술한다. 각각의 Fab' 단편은 E. 콜라이로부터 별도로 분비되었고 시험관내에서 지향성 화학적 커플링으로 처리되어 이중특이성 항체를 형성했다. 이렇게 형성된 이중특이성 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이성 항체 단편을 만들고 분리하기 위한 다양한 기술은 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다. Kostelny 등, J. Immunol. 148(5):1547-1553(1992). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음 재산화되어 항체 이종이량체를 형성했다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에도 활용될 수 있다. Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)에 기재된 "다이아바디" 기술은 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 메카니즘을 제공했다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이룰 수 밖에 없어, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체의 사용에 의해 이중특이성 항체 단편을 만들기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되어 있다. Gruber 등, J. Immunol. 152:5368(1994) 참조.
2개보다 많은 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 하나의 비제한적인 예로서, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, Tutt 등, J. Immunol. 147:60(1991) 참조.
d. 이종접합체 항체
이종접합체 항체도 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합체 항체는 공유 연합된 2개의 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포로 표적화하기 위해[미국 특허 제4,676,980호], 그리고 HIV 감염의 치료를 위해[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] 제안되었다. 이 항체는 가교제를 수반하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 이황화 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 작제될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것들을 포함한다.
e. 이펙터 기능 조작
암 치료에서 항-NTPDase3 항체의 효과 등을 향상시키기 위해, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명에 의해 포괄되는 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역으로 도입되어, 이 영역에서 사슬간 이황화 결합 형성을 허용할 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개의 세포 사멸 및 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. Caron 등, J. Exp Med., 176: 1191-1195(1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922(1992)을 참조한다. 바람직한 특정 실시양태에서, 조작되는 이펙터 기능은 면역 세포로부터 NTPDase3의 FcγRIII 결합-의존적 제거(예컨대, 항-NTPDase3 항체 매개 표적 사이토시스에 의해)를, 즉, 세포 사멸에 의해 면역 세포 집단을 고갈시킴이 없이, 유도하는 항-NTPDase3 항체의 능력이다.
향상된 항종양 활성을 갖는 동종이량체성 항체는 또한 Wolff 등 Cancer Research, 53: 2560-2565(1993)에 기재된 바와 같은 이종이작용기성 가교제를 사용하여 제조할 수도 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 가져 향상된 NTPDase3 트로고사이토시스(trogocytosis) 능력을 가질 수 있는 항체가 조작될 수 있다. Stevenson 등, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230(1989)을 참조한다.
f. 대표적인 항-NTPDase3 항체 서열
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 인간 항체 라이브러리로부터 생성된 것과 같은 완전한 인간 항체이다. 예시적인 완전한 인간 항-NTPDase3 항체는 클론 PBI#30이며, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL) 서열은 다음과 같이 제공된다:
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불변 도메인을 포함한, 클론 PBI#30의 중쇄 및 경쇄에 대한 전체 길이의 서열은 다음과 같이 제공된다:
Figure pct00004
PBI#30 클론의 경우, 각 VH 및 VL 도메인에 대한 CDR(아미노산 서열)은 다음과 같다:
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특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 조작된 완전 인간 항체, 예를 들어 친화도 성숙 변이체이다. 예시적인 조작된 완전 인간 항-NTPDase3 항체는 항체 프레임워크 영역을 파괴함이 없이, 항체 CDR 영역에 점 돌연변이의 도입을 통한 클론 PBI#30 친화도 성숙 변이체이다. 각각의 VH 및 VL 도메인(아미노산 서열)에 대한 4개의 PBI#30 친화도 성숙 변이체 클론의 CDR의 예시적인 서열은 표 2A-2D에 다음과 같이 제공된다:
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일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2와 같은 본원에 기재된 VH 도메인 서열과 적어도 60% 동일한, 및 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 2와 같은 본원에 기재된 VH 도메인 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 심지어 90% 동일하고, 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4와 같이 본원에 기재된 VL 도메인 서열과 적어도 60% 동일한, 및 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 4와 같은 본원에 기재된 VL 도메인 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 심지어 90% 동일하고 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 서열번호 45, 46 및 47과 같은 본원에 제시된 VH 도메인의 CDR과 연관된 인간 프레임워크 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 48, 49 및 50과 같은 본원에 제시된 상응하는 VL 도메인의 CDR을 포함하는 인간 또는 인간화 항체이다. 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CDR은 바람직하게는 본원에 기재된 CDR과 동일하지만, 최종 생성된 항체가 인간 NTPDase3에 결합하는 한, 각 CDR을 따라 1, 2 또는 3개의 아미노산이 달라질 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 중쇄 및 경쇄는 엄격한 조건(예컨대, 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC), 및 50-65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS로 세척) 하에, 서열번호 1(VH) 및 서열번호 3(VL)에 제시된 것과 같은 본원에 기재된 VH 및 VL 도메인(상응함) 암호 서열에 혼성화하거나 동일한 핵산에 의해 암호화될 수 있는 가변 도메인을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 토끼에서 생성되었고, 이들 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 토끼 서열이다. 토끼 항-NTPDase3 항체의 VH 및 VL 도메인에 대한 예시적인 서열은 다음과 같다:
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일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 인간화 토끼 항체(항체 CDR 영역을 파괴함이 없이 항체 프레임워크 영역의 인간화를 통해)였고, 이들 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 인간 서열이다. 인간화 항-NTPDase3 항체의 VH 및 VL 도메인에 대한 예시적인 서열은 다음과 같이 제공된다:
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 추가로 조작된 인간화 항체였다(치료 용도를 위해 인간에 대한 잠재적인 면역원성을 추가로 감소시키기 위해 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 파괴함이 없이 항체 백본 서열에 점 돌연변이의 도입을 통해). 인간화 38D5 클론의 VH 및 VL 도메인에 도입된 예시적인 점 돌연변이는 이하 표 3에 제시된다:
Figure pct00013
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) NTPDase3+ 세포에 대한 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성; (ii) NTPDase3+ 면역 세포(바람직하게는 M2 대식세포)에 대한 NTPDase3의 항체-매개 표적 사이토시스; (iii) NTPDase3+ 세포에 대한 NTPDase3 효소 활성 저해; 및/또는 (iv) NTPDase3에 결합하는 NTPDase3 단클론 항체 클론과 경쟁적, 비경쟁적 또는 부분 경쟁적인 방식으로 NTPDase3에 대한 결합을 촉진하며, 여기서 NTPDase3 단클론 항체 클론은 PBI#30 및 이의 친화도 성숙 변이체, 3E9, 4F9, 8E1 및 이의 인간화 대응물, 16D4, 37H1, 38D5 및 이들의 백본 서열에 점 돌연변이가 있거나 없는 이의 인간화 대응물, 38D12, 42D8 및 44H5로 이루어진 군으로부터 선택된다.
서열 식별 번호에 따라 상기 기재된 대표적인 항-NTPDase3 항체 서열은 다음에 상응한다(여기서 <210> 줄은 서열 식별 번호에 상응하고, 예컨대, <210> 1은 서열번호: 1에 상응하고, <210> 2는 서열번호: 2에 상응함 등):
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인간 환자에서 사용하기 위해, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 모두 인간 불변 영역으로 대체하고, 뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 영역을 인간 항체 프레임워크 영역으로 대체하여 이들 항체를 인간화하는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 토끼 항체의 인간화 버전이다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열과 적어도 60% 동일하고, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 심지어 90% 동일하고, 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변부(variable)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열과 적어도 60% 동일하고, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 심지어 90% 동일하고, 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변부를 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR, (또는 이의 일부)가 비-인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 추가로 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 복원 또는 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열로부터 선택되는 VH 도메인의 CDR과 연관된 인간 프레임워크 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열로부터 선택되는 상응하는 VL 도메인의 CDR을 포함하는 인간화 항체이다. CDR은 바람직하게는 동일하지만, 최종 생성된 항체가 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합하는 한, 각 CDR을 따라 1, 2 또는 3개의 아미노산이 달라질 수 있다.
인간화 항체 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되어 있고, 예를 들어, Riechmann 등, Nature 332:323-329(1988); Queen 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; Kashmiri 등, Methods 36:25-34(2005)(특이성 결정 영역(SDR) 접목을 설명함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498(1991)("재표면화"를 설명함); Dall'Acqua 등, Methods 36:43-60(2005)("FR 셔플링"을 설명함); 및 Osbourn 등, Methods 36:61-68(2005) 및 Klimka 등, Br. J. Cancer, 83:252-260(2000)(FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법을 설명함)에 추가 설명되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적화(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어, Sims 등 J. Immunol. 151:2296(1993) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, Carter 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992); 및 Presta 등 J. Immunol., 151:2623(1993) 참조); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들어, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008) 참조); 및 FR 라이브러리 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, Baca 등, J. Biol. Chem. 272:10678-10684(1997) 및 Rosok 등, J Biol. Chem. 271:22611-22618(1996) 참조)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-NTPDase3 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 본 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk 및 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459(2008)에 설명되어 있다.
예를 들어, 인간 항체는 항원 공격에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되어 있다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법을 검토하기 위해 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125(2005)를 참조한다. 또한, 예를 들어, XENOMOUSE 기술을 설명하는 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HuMAB 기술을 설명하는 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE 기술을 설명하는 미국 특허 제7,041,870호, 및 VELOCIMOUSE 기술을 설명하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900)도 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마 기반 방법으로도 만들 수 있다. 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133: 3001(1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 등, J. Immunol., 147: 86 (1991) 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체도 Li 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 103:3557-3562(2006)에 기재되어 있다. 추가 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 기재함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268(2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마 기술)은 또한 Vollmers 및 Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937(2005) 및 Vollmers 및 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91(2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간 유래 파지, 효모 또는 박테리아 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 그 다음 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 이하에 설명된다.
예시하는 것으로, 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 이러한 라이브러리를 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 선별하기 위한 다양한 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, Hoogenboom 등 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, McCafferty 등, Nature 348:552-554; Clackson 등, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1992); Marks 및 Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu 등, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004); Lee 등, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093(2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472(2004); 및 Lee 등, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 설명되어 있다.
파지 디스플레이 방법의 예로서, VH 및 VL 유전자 목록은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고, 파지 라이브러리에 무작위로 재조합하며, 그 다음 Winter 등, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)에 기재된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일 사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 디스플레이(display)한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브(naive) 목록은 Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734(1993)에 기재된 바와 같이 임의의 면역화없이, 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 단일 항체 공급원을 제공하도록 클로닝(예를 들어, 인간으로부터)될 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)에 기재된 바와 같이, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 달성하도록 합성적으로 만들 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하는 특허 공보로는, 예를 들어, 미국 특허 제5,750,373호 및 미국 특허 공개번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
FcγRIII 결합은 또한 최신 기술에 따른 방법, 예를 들어 항체의 Fc 부분의 아미노산 서열의 변형 또는 Fc 부분의 글리코실화(예를 들어, EP2235061 참조)에 의해 증가될 수도 있다. 특정 실시양태에서, 당해의 항체는 글리코실화된 경우 항체 상의 올리고당 사슬 중 50% 미만이 α-1,6-푸코스를 함유하는 것이 세포에 의해 생성된다. 전형적으로, 올리고당 사슬의 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 5% 미만 또는 1% 미만은 "저푸코실화된" 항체 제제에서 α-1,6-푸코스를 함유한다. "비푸코실화된" 항체는 IgG 중쇄의 CH2 도메인에 부착된 탄수화물에 α-1,6-푸코스가 결여되어 있다. Mori, K 등, Cytotechnology 55 (2007)109 및 Satoh M, 등, Expert Opin Biol Ther. 6 (2006) 1161-1173은 비푸코실화된 항체 생성을 위한 FUT8(α-1,6-푸코실트랜스퍼라제) 유전자 녹아웃 CHO 계열에 관한 것이다.
IV. 발현 벡터
특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 암호화하는 DNA를 증폭 및 발현시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 및/또는 해독 조절 요소에 작동가능하게 연결된 항-NTPDase3 항체의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 작제물일 수 있다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들어 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 해독되는 구조 또는 암호 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 해독 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함한다. 조절 요소는 전사를 제어하기 위한 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 복제 기점에 의해 부여되는, 숙주에서 복제하는 능력 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 혼입될 수 있다. DNA 영역은 서로 기능적으로 관련되어 있을 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 신호 펩타이드(분비 리더(secretory leader))의 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구체로 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터는 서열의 전사를 제어한다면, 암호 서열에 작동가능하게 연결된 것이며; 또는 리보솜 결합 부위가 해독을 허용하도록 위치된다면, 리보솜 결합 부위는 암호 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일부 실시양태에서, 효모 발현 시스템에 사용하기 위한 구조적 요소로는 숙주 세포에 의해 해독된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 선택적으로 최종 생성물을 제공하기 위해 발현된 재조합 단백질로부터 후속적으로 절단될 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 따라 달라진다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 사용될 수 있다. 진핵생물 숙주에 유용한 발현 벡터로는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 거대세포바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터로는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대, E.콜라이 유래의 플라스미드, 예를 들면, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체, 및 숙주 범위가 더 넓은 플라스미드, 예컨대, M13 및 기타 사상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
항-NTPDase3 항체(또는 표적으로 사용하기 위한 단백질)의 폴리펩타이드 사슬의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하에 원핵생물, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 원핵생물로는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 E. 콜라이 또는 바실러스(Bacillus)를 포함한다. 고등 진핵세포는 하기에 기재된 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 해독 시스템도 사용할 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.
다양한 포유동물 세포 배양 시스템은 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 사용된다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현은 이러한 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고 적절하게 변형되고 생물학적으로 기능적이기 때문에 바람직할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 COS-7(원숭이 신장 유래), L-929(뮤린 섬유아세포 유래), C127(뮤린 유선 종양 유래), 3T3(뮤린 섬유아세포 유래), CHO(중국 햄스터 난소 유래), HeLa(인간 자궁경부암 유래), BHK(햄스터 신장 섬유아세포 유래), 및 HEK-293(인간 배아 신장 유래) 세포주 및 이의 변이체를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비-전사 요소, 예컨대, 복제 기점, 발현될 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 인접 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-해독 서열, 예컨대, 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용체 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
곤충 세포 배양 시스템(예를 들어, 바큘로바이러스)에서 재조합 단백질의 발현은 또한 정확하게 폴딩된 생물학적 기능성 단백질을 생산하기 위한 강력한 방법을 제공한다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생산하기 위한 바큘로바이러스 시스템은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 서열번호 2와 같은 본원에 기재된 중쇄 가변 영역에 적어도 60% 동일하고, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 2와 같은 본원에 기재된 중쇄 가변 영역에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 심지어 90% 동일하고 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4와 같은 본원에 기재된 경쇄 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 4와 같은 본원에 기재된 경쇄 가변 영역에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 심지어 90% 동일하고 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 영역을 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
V. 생체내 전달을 위한 암호화된 항-NTPDase3 항체
환자에서 발현될 항-NTPDase3 항체에 대한 암호 서열을 전달하기 위한 치료 벡터는 바이러스성, 비-바이러스성 또는 물리적(physical)일 수 있다. 예를 들어, Rosenberg 등, Science, 242:1575-1578, 1988 및 Wolff 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989) 참조. 유전자 요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물에 대한 논의는 Eck 등, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman 등, eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107(Suppl. 1):31-32, 1997; Wivel 등, Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck, ed., 12(3):483-501, 1998; Romano 등, Stem Cells, 18:19-39, 2000, 및 본원에 인용된 참고 문헌을 포함한다. 미국 특허 제6,080,728호는 또한 광범위한 유전자 전달 방법 및 조성물에 대한 논의를 제공한다. 전달 경로는, 예를 들어, 전신 투여 및 동일계내 투여를 포함한다. 잘 알려진 바이러스 전달 기술로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 거품형 바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노 연관 바이러스 벡터의 사용을 포함한다.
a. 바이러스 벡터
바람직한 바이러스 벡터는 비필수 유전자가 관심 표적 서열 및 에피토프를 암호화하는 핵산 서열을 운반하는 핵산 작제물로 대체된 비-세포변성 진핵생물 바이러스를 기반으로 한다. 본 발명에 의해 포괄되는 특정 실시양태에 바람직한 바이러스는 유전자 요법에서 인간 사용에 대해 이미 승인된 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스 및 아데노 연관(AAV) 바이러스이다. 또한, 관용(tolerance)화에 바람직한 벡터는 면역 자극 서열을 포함하지 않는다.
아데노바이러스 벡터
하나 이상의 핵산 서열을 생체내 전달하기 위한 하나의 예시적인 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 수반한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 패키징을 지원하고 (b) 그 안에 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 센스 또는 안티센스 배향으로 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 물론, 안티센스 작제물의 정황에서, 발현은 유전자 산물이 합성되어야 할 것을 필요로 하지 않는다. 특정 실시양태에서, 전달 벡터는 시토크롬 b5 리덕타제 3(CYB5R3)의 상업적으로 입수가능한 ORF, 아데노바이러스 벡터 pAd의 전사체 변이체 1, 및 C 말단 Flag 및 His 태그와 관련이 있다(Vigene Biosciences 제품 코드 AH889428). WIPO 특허 출원 WO/2015/050364는 또한 Cyb5r3 유전자를 포함하는 발현 작제물을 갖는 벡터를 교시한다.
아데노바이러스 벡터는 고도로 면역원성이어서, 항원을 제시하여 관용성을 유도하는 투여 또는 자가면역 질환의 경우에는 덜 바람직하다. 이들 벡터는, 하지만, 예를 들어, 인플루엔자, HBV, HCV 및 HIV를 포함하는 감염 질환 등의 치료에서 면역을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
아데노 연관 바이러스 벡터(AAV)
AAV는 안전성으로 인해 전달 비히클의 양호한 선택으로서, 즉, 유전자 조작물(재조합체)이 숙주 게놈 내로 통합되지 않는다. 마찬가지로, AAV는 병원성이 아니며 어떤 질환과도 연관되지 않는다. 바이러스 암호 서열의 제거는 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화하므로, rAAV는 염증 반응을 유발하지 않는다. 특정 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 핵산 작제물을 함유하는 에피토프 서열을 함유하는 AAV 벡터는 APC를 형질도입시키는데 유용하다.
전형적으로, 에피토프 함유 핵산 작제물을 함유하는 바이러스 벡터는 원하는 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 적합한 조절 요소 및 세포 형질도입을 매개하는 에피토프 발현에 필수적인 요소로부터 조립된다. 일 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터가 사용된다. 보다 구체적인 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV6, 또는 AAV8이다.
AAV ITR과 경계를 이룬 관심 DNA 분자를 수용하는 AAV 발현 벡터는 주요 AAV 오픈 리딩 프레임("ORF")이 절제된 AAV 게놈 내로 선택된 서열(들)을 직접 삽입하여 작제할 수 있다. 본 발명의 AAV에 포함될 수 있는 구성적 프로모터의 예로는 예시된 CMV 즉시 조기 인핸서/닭 β-액틴(CBA) 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
진핵 세포의 경우, 발현 제어 서열은 전형적으로 프로모터, 인핸서, 예컨대, 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스 등에서 유래된 것, 및 스플라이스 공여자 및 수용체 부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 전이유전자 서열 다음에, 그리고 3' ITR 서열 앞에 삽입된다. 일 실시양태에서, 소 성장 호르몬 polyA가 사용될 수 있다.
이들 및 다른 공통 벡터 및 조절 요소의 선택은 통상적이며, 이러한 많은 서열이 이용가능하다. 예를 들어, Sambrook 등, 및 페이지 3.18-3.26 및 16.17-16.27와 같이 이 문헌에 인용된 참고문헌 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989 참조. 물론, 본 발명의 모든 전이유전자를 발현하기 위해 모든 벡터 및 발현 조절 서열이 동등하게 잘 기능하지는 않을 것이다. 그러나, 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 범위에서 벗어남이 없이, 이들 발현 제어 서열 중에서 선택할 수 있을 것이다. 적합한 프로모터/인핸서 서열은 본 출원에 의해 제공된 지침을 사용하여 본 기술분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 선택은 일상적인 문제이며 분자 또는 작제물의 제한사항이 아니다.
레트로바이러스 벡터
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. "레트로바이러스"는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 통합에 필수적인 모든 시스-작용성 서열, 즉 (a) 벡터의 각 말단에 있는 장말단 반복체(LTR) 또는 이의 일부; (b) 음성 및 양성 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위; 및 (c) 비리온 내로 게놈 RNA의 통합에 필수적인 패키징 신호를 함유한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 더 자세한 사항은 Boesen, 등, 1994, Biotherapy 6:291-302; Clowes, 등, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem, 등, 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons 및 Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; Miller, 등, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599; 및 Grossman 및 Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114에서 찾아볼 수 있다.
"감마레트로바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 예시적인 감마레트로바이러스는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다.
널리 사용되는 레트로바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 이들의 조합에 기반한 것을 포함한다(예를 들어, Buchscher 등, J. Virol. 66:2731-2739, 1992; Johann 등, J. Virol. 66: 1635-1640, 1992; Sommerfelt 등, Virol. 176:58-59, 1990; Wilson 등, J. Virol. 63:2374-2378, 1989; Miller 등, J. Virol. 65:2220-2224, 1991; 및 PCT/US94/05700 참조).
렌티바이러스 벡터는 분열 세포 및 비분열 세포를 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇 가지 예로는 HIV(인간 면역결핍 바이러스: HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 시미안 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 다른 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이들로는, 예를 들어, 인간 거품형 바이러스(HFV) 또는 스푸마바이러스(Spumavirus) 속의 다른 바이러스를 기반으로 하는 벡터를 포함한다. 거품형 바이러스(FV)는 오늘날 알려진 가장 큰 레트로바이러스이며, 인간이 아닌 모든 영장류 종을 비롯한 여러 포유류 중에 널리 퍼져 있지만, 인간에는 존재하지 않는다. 이 완전한 비병원성은 FV 벡터를 인간의 유전자 요법에 이상적인 유전자 전달 비히클로서의 자격을 부여하고, 유전자 전달 시스템으로서 FV 벡터를 HIV 유래 및 또한 감마레트로바이러스 유래 벡터와 명확하게 구별짓는다.
비-세포변성 바이러스는 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스)를 포함하며, 이의 라이프 사이클은 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사 및 후속적으로 숙주 세포 DNA 내로 프로바이러스 통합을 수반한다. 레트로바이러스는 인간 유전자 요법 시험용으로 승인되어 있다. 가장 유용한 것은 복제-결손성(즉, 원하는 단백질의 합성을 유도할 수 있지만, 감염성 입자를 제조할 수 없는)인 레트로바이러스이다. 이러한 유전자 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내 유전자의 고효율 형질도입에 일반적인 유용성이 있다. 복제-결손성 레트로바이러스를 생산하기 위한 표준 프로토콜(외인성 유전자 물질을 플라스미드에 통합, 플라스미드에 의한 패키징 세포주의 형질감염, 패키징 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스의 생산, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자의 수집, 및 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 감염 단계를 포함함)은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다.
레트로바이러스 게놈은 각각 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 엔벨로프 구성요소를 암호하는 3개의 유전자, gag, pol 및 env를 함유한다. gag 유전자의 상류에서 발견된 서열은 게놈을 비리온으로 패키징하기 위한 신호를 함유한다. 레트로바이러스 벡터는 이종 핵산이 2개의 레트로바이러스 LTR 사이에 존재하는 유전자 전달 플라스미드이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 레트로바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터를 주형으로 사용하여 전사된 RNA가 적절한 패키징 세포주에서 바이러스 비리온으로 패키징되도록 할 수 있는 적절한 패키징 신호를 함유한다(예를 들어, 미국 특허 제4,650,764호 참조). 이 2개의 장말단 반복체(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 단부에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 함유하며, 숙주 세포 게놈에 통합하기 위해서도 필요하다(Coffin, 1990). 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 관심 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입되어 복제-결손성인 바이러스를 생성한다. 또한, 렌티바이러스(예를 들어, 레트로바이러스 유형)에 기반한 레트로바이러스 벡터의 에피솜 또는 비통합 형태도 포함된다.
렌티바이러스 벡터는 안정적인 발현이 필요할 때 유용하지만, 렌티바이러스 벡터는 면역원성일 수 있으며, 아마도 다른 부적절한 영향도 갖고 있다. 따라서, 렌티바이러스 벡터는 연구에 편리하지만, 인간 투여에 사용하는 경우, 특히 면역보다 관용성을 유도하려는 경우에는 주의를 기울여야 한다. 렌티바이러스는 mRNA 전기천공법이 더 안전할지라도, 암 요법을 위해 T 세포, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 생체외에서 조작하는데 적합하다. 하지만, 2가지 최근 발전은 렌티바이러스의 사용을 더욱 안전하고 더욱 임상적으로 해독가능하도록 만들었다. 첫째, 약물이 투여될 때 산물이 기능성이 되는 항원과 함께 자살 유전자의 공동발현. 전형적인 예는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSV-Tk)이다. 이러한 유전자를 발현하는 세포는 약물 간시클로비르를 세포 사멸을 유도하는 세포독성 산물로 대사할 수 있다. 따라서, 일부 형질도입된 세포가 악성이 되는 경우, 이들은근절될 수 있다. 약 12개의 이러한 시스템이 존재한다(Duarte 등, Cancer Letters, 324:160-170, 2012). 둘째, 현재 개발 중인 비-통합성 렌티바이러스 벡터로서, 따라서, 이는 따라서, 비-발암성이다(Nightingale 등, 2006, Mol. Ther., 13:1121-1132). 이들 방법은 본 기술분야의 기술자의 판단에 따라 본 발명에 사용될 수 있다.
본원에서 사용하기에 적합한 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호 및 제5,252,479호; 및 WIPO 공보 WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 및 WO 92/14829에 기재되어 있고, 이들은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 인간 세포에 핵산을 효율적으로 도입시키는 방법에 대한 설명을 제공한다. 다른 레트로바이러스 벡터로는, 예를 들어, 마우스 유방 종양 바이러스 벡터(예를 들어, Shackleford 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659, 1998), 렌티바이러스 등을 포함한다. 예시적인 바이러스 벡터는 플렌틸록스(plentilox)-IRES-GFP이다.
항-NTPDase3 항체 작용제를 암호화하는 전이유전자의 전달을 위해 용이하게 개조될 수 있는 추가 레트로바이러스 바이러스 전달 시스템은 각 명세서 및 도면이 본원에 참고로 포함되는, 공개된 PCT 출원 WO/2010/045002, WO/2010/148203, WO/2011/126864, WO/2012/058673, WO/2014/066700, WO/2015/021077, WO/2015/148683, WO/2017/040815를 단지 예시용으로 포함한다.
특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 레트로바이러스 GAG 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 레트로바이러스 POL 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 레트로바이러스 엔벨로프를 암호화하는 핵산 서열; 종양레트로바이러스 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 및 3' 단부에 장말단 반복체(LTR) 서열을 포함하는 종양레트로바이러스 폴리뉴클레오타이드 서열; 항-NTPDase3 항체 작용제를 위한 암호 서열에 작동가능하게 연결된 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 카세트, 여기서 카세트는 3' LTR의 U3 영역에 대해 5'에 위치하고 레트로바이러스 엔벨로프를 암호화하는 서열에 대해 3'에 위치함; 및 표적 세포에서 역전사, 패키징 및 통합하기 위한 시스-작용성 서열을 포함하는 재조합 복제 적격(competent) 레트로바이러스이다.
특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 하기를 포함하는 재조합 복제 적격 레트로바이러스이다: 레트로바이러스 GAG 단백질; 레트로바이러스 POL 단백질; 레트로바이러스 엔벨로프; 레트로바이러스 폴리뉴클레오타이드 서열의 3' 단부에 장말단 반복체(LTR) 서열, 포유류 세포에서 발현용으로 적합한 프로모터인, 레트로바이러스 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부에 있는 프로모터 서열, gag 핵산 도메인, pol 핵산 도메인, 및 env 핵산 도메인을 포함하는 레트로바이러스 폴리뉴클레오타이드; 이종 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 항-NTPDase3 항체 작용제 암호 서열을 포함하는 카세트로서, 3' LTR에 대해 5'에 위치하고 레트로바이러스 엔벨로프를 암호화하는 env 핵산 도메인에 대해 3'에 위치하는 카세트; 및 표적 서열에 역전사, 패키징 및 통합하는데 필수적인 시스 작용성 서열.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 바람직한 특정 실시양태에서, 엔벨로프는 양쪽향성(amphotropic), 다중향성(polytropic), 이종향성(xenotropic), 10A1, GALV, 개코원숭이 내인성 바이러스, RD114, 랍도바이러스, 알파바이러스, 홍역 또는 인플루엔자 바이러스 엔벨로프 중 하나로부터 선택된다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 바람직한 특정 실시양태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오타이드 서열은 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BEV), 돼지 내인성 바이러스(PERV), 고양이 유래 레트로바이러스 RD114, 다람쥐원숭이 레트로바이러스, 이종향성 뮤린 백혈병 바이러스 관련 바이러스(XMRV), 조류 세망내피증 바이러스(REV) 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 조작된다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 바람직한 특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스이다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 바람직한 특정 실시양태에서, 다른 관문 저해제 폴리펩타이드, 공동자극 폴리펩타이드 및/또는 면역자극 사이토카인(단지 예로서)과 같은 제2 치료 단백질에 대한 암호 서열을, 예를 들어, 카세트의 하류에 포함하는 제2 카세트가 존재한다. 특정 경우에, 제2 카세트는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 제2 치료 단백질에 대한 암호 서열에 작동가능하게 연결된 미니프로모터 또는 polIII 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 바람직한 특정 실시양태에서, 비용해성, 양쪽향성 레트로바이러스 복제 벡터는 바람직하게는 종양 미세환경의 세포를 선택적으로 감염시키고 복제한다.
발현 작제물로서 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포로 전달하기 위한 본 발명에 포괄되는 실시양태의 발현 작제물로서 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스 및 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유류 세포에 대해 여러 가지 매력적인 특징을 제공한다. B형 간염 바이러스도 포함된다.
b. 비-바이러스성 벡터
플라스미드 벡터
다른 벡터로는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 본 기술분야에 광범위하게 설명되어 있으며 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 위에서 인용된 Sambrook 등, 1989 참조. 지난 몇 년 동안 플라스미드 벡터는 생체내 세포에 항원 암호화 유전자를 전달하기 위한 DNA 백신으로서 사용되었다. 이들은 많은 바이러스 벡터와 동일한 안전성 문제가 없기 때문에 특히 유리하다. 하지만, 숙주 세포와 화합성인 프로모터를 갖는 이들 플라스미드는 플라스미드 내의 핵산에 의해 암호화되는 펩타이드 에피토프를 발현할 수 있다. 다른 플라스미드는 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 또한, 플라스미드는 제한 효소 및 결찰 반응을 사용하여 맞춤 설계되어 DNA의 특정 단편을 제거 및 첨가할 수 있다. 플라스미드는 다양한 비경구, 점막 및 국소 경로로 전달될 수 있다. 예를 들어, DNA 플라스미드는 근육내, 피내, 피하 또는 기타 경로로 주사될 수 있다. 또한, 비강내 스프레이 또는 점적제, 직장 좌약 및 경구로 투여될 수 있다. 또한, 유전자 총을 사용하여 표피 또는 점막 표면 내로 투여될 수 있다. 플라스미드는 수성 용액으로 제공되거나, 금 입자 상에 건조되거나 또는 리포솜, 덴드리머, 나선형 및 미세캡슐을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 DNA 전달 시스템과 연관되어 제공될 수 있다.
따라서, 일 측면으로, 발현 카세트를 포함하는 핵산 작제물을 함유하는 에피토프의 발현을 위한 플라스미드가 제공되며; 이는 또한 전사 단위라고도 지칭된다. 플라스미드가 에피토프 발현에 적합한 환경에 배치되는 경우, 전사 단위는 에피토프, ETS 및 MHCII 활성인자 서열을 암호화하는 서열, 또는 에피토프 및 분비 신호 서열을 암호화하는 서열, 및 작제물에서 암호화되는 기타 모든 것을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현할 것이다. 전사 단위는 세포 면역 반응 요소 암호 서열과 전사적으로 연결된 전사 제어 서열을 포함한다. 전사 제어 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인핸서 서열과 같은 프로모터/인핸서 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 본 기술분야의 기술자는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 다양한 다른 프로모터 서열이 공지되어 있고 본원에 개시된 작제물에 유사하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 핵산 생성물의 발현 수준은 연관된 프로모터 및 연관된 인핸서 요소의 존재 및 활성화에 의존적일 것이다.
특정 실시양태에서, 원하는 에피토프 및 표적화 서열을 암호화하는 서열은 전사, 해독, RNA 안정성 및 복제를 위한 조절 요소(즉, 전사 제어 서열 포함)를 함유하는 발현 플라스미드 내에 클로닝될 수 있다. 이러한 발현 플라스미드는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 통상의 기술자는 세포 면역 반응 요소가 발현될 수 있는 방식으로 세포 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 적절한 발현 작제물을 설계할 수 있을 것이다. pCI-neo, pUMVC 또는 pcDNA3과 같이, 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 클로닝될 수 있는 적합한 발현 플라스미드의 많은 예가 있다.
세포 면역 반응 요소 또는 이의 단편의 발현을 위한 플라스미드를 수용하는 다량의 박테리아 숙주는 발효될 수 있고 플라스미드는 후속 사용을 위해 정제될 수 있다. 플라스미드를 사용하는 현행 인간 임상 실험은 이 접근법을 활용한다. Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report, Human Gene Therapy 6: 535-548, 1994. 본 기술분야에 알려진 현행 DNA 단리 방법으로는 플라스미드를 전파시키는 데 사용되는 박테리아로부터 오염물질인 지질다당류(내독소)를 제거하는 것을 포함한다. 이 단계는 내독소가 강력한 보조제로서 작용하고 원하지 않는 면역 자극을 생성할 수 있기 때문에 내독소로서 관용원성 DNA 백신을 사용하는 경우에 취하는 것이 가장 바람직하다.
플라스미드의 목적은 핵산 서열을 세포 또는 조직에 효율적으로 전달하고 치료 에피토프를 발현시키는 것이다. 특히, 플라스미드의 목적은 높은 카피 수를 달성하고 플라스미드 불안정성의 잠재적 원인을 피하며 플라스미드 선택 수단을 제공하는 것일 수 있다. 발현의 경우, 핵산 카세트는 카세트 내에 핵산의 발현에 필수적인 요소를 포함한다. 발현은 플라스미드를 사용한 삽입된 유전자, 핵산 서열 또는 핵산 카세트의 효율적인 전사를 포함한다. 발현 산물은 단백질, 폴리펩타이드 또는 RNA일 수 있다. 핵산 서열은 핵산 카세트에 함유될 수 있다. 핵산의 발현은 연속적이거나 조절될 수 있다.
미니서클
본 명세서에 기재된 핵산 작제물의 실시양태는 미니서클 DNA 형태로 처리될 수 있다. 미니서클 DNA는 모든 원핵생물 벡터 부분으로부터 제거된 작은(2-4kb) 원형 플라스미드 유도체에 속한다. 미니서클 DNA 벡터는 박테리아 DNA 서열을 전혀 함유하지 않기 때문에 이물질로 인지되어 파괴될 가능성이 적다. (전형적인 전이유전자 전달 방법은 외래 DNA를 함유하는 플라스미드를 수반한다.) 결과적으로, 이러한 벡터는 종래의 플라스미드(수 일에서 수 주)에 비해 더 장기간(수 주 또는 수 개월 정도) 동안 발현될 수 있다. 더 작은 크기의 미니서클은 또한 클로닝 능력을 확장시켜 세포로의 전달을 촉진한다. 미니서클 DNA를 생산하기 위한 키트는 본 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다(System Biosciences, Inc., 캘리포니아주 팔로알토 소재). 미니서클 DNA에 대한 정보는 Dietz 등, Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy(2013); 21 8, 1526-1535 및 Hou 등, Molecular Therapy -Methods & Clinical Development, Article number: 14062 (2015) doi:10.1038/mtm.2014.62에 제공되어 있다. 미니서클에 대한 추가 정보는 Chen Z Y, He C Y, Ehrhardt A, Kay MA. Mol Ther. 2003 September; 8(3):495-500에 제공되어 있고, 미니서클 DNA 벡터는 활성 염색질 및 전사 수준에 의해 반영되는 지속적인 발현을 달성한다. Gracey Maniar L E, Maniar J M, Chen Z Y, Lu J, Fire A Z, Kay M A. Mol Ther. 2013 January; 21(1):131-8
핵산에 의해 암호화된 생성물의 발현을 궁극적으로 수득하기 위한 과정의 초기 단계로서, 세포에 의한 핵산의 흡수를 실시하는 것이다. 세포에 의한 핵산의 흡수는 다수의 요인에 따라 달라지며, 그 중 하나는 핵산이 세포 표면에 근접해 있는 동안의 시간 길이이다. 예를 들어, 완충액 중 플라스미드 DNA를 근육내(im) 투여한 후에는 근육을 마사지하면 유전자 발현의 현저한 감소가 관찰되었는데, 이는 아마도 근육으로부터 직접적으로 또는 림프관을 통한 DNA의 누출 때문인 것으로 추정된다(Human Gene Therapy 4: 151-159; 1993). 따라서, 핵산의 세포 흡수가 요구되는 부위로부터 핵산이 멀리 운반되거나 핵산이 확산하는 속도를 지연시킬 수 있는 화합물과 함께 핵산을 제형화하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이들 화합물은 핵산의 세포 흡수를 증가시키는 데 필수적인 물리적 특성을 유지하거나 회복하면서 주사와 같은 수단에 의해 유기체에 투여하기에 적합할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 달성하기 위해, 발현 작제물은 세포 내로 전달되어야 한다. 본 발명에 의해 포괄되는 특정 실시양태에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 작제물은 간단히 노출형 재조합 DNA 또는 플라스미드로 이루어질 수 있다.
면역성을 프라이밍하기 위해, 임의의 유형의 DNA 백신 벡터는 바람직하게는 CpG가 풍부(면역 세포 상의 TLR9를 자극하기 위해)해지도록 조작되거나, 반대로 CpG를 제거하고, 가능한 경우 CpG 모티프를 GpG 모티프로 대체하도록 조작된다(Ho 등, J. Immunol. 71(9):4920-6, 2003; Ho 등, J. Immunol. 175(9):6226-34, 2005). DNA 백신은 항원(들)/에피토프(들)를 함유하도록 조작될 수 있으며, 또한 보조제 또는 면역조정제로 작용하도록 항원과 공동발현시키기 위한 추가 유전자를 함유할 수 있다(다중 프로모터 벡터). 이러한 DNA 백신은, 예를 들어, T1D 환자에서 임상적으로 안전한 것으로 밝혀졌다(Roep 등, Sci. Transl. Med. 5(191):191ra82, 2013).
기계적 전달 시스템
추가적인 비-바이러스 전달 방법은 Woffendin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581, 1994에 기재된 접근법; 광중합된 하이드로겔 물질의 침착 또는 이온화 방사선의 사용(예를 들어, 미국 특허 제5,206,152호 및 WO 92/11033 참조); 휴대용 유전자 전달 입자 총의 사용(예를 들어, 미국 특허 제5,149,655호 참조); 및 전달된 유전자를 활성화하기 위한 이온화 방사선의 사용(예를 들어, 미국 특허 제5,206,152호 및 WO 92/11033 참조)과 같이 시험관내에서 사용될 수 있는 기계적 전달 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 전달 장치는 또한 생체화합성일 수 있으며, 생분해성일 수도 있다. 이 제형은 바람직하게는 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 다른 한편으로, 투여 직후 더 빠른 방출 속도가 바람직할 수 있다. 이러한 조성물의 제형화는 공지된 기술을 사용하는 본 기술분야의 기술자의 수준 안에 있다.
전달을 향상시키는 물리적 방법으로는 전기천공법(고전압의 짧은 펄스가 막을 가로질러 핵산을 운반하는 경우), 유전자 총(DNA가 금 입자 상에 부하되고 DNA가 세포 내로 강제 침투되도록 함), 초음파천공법, 자기감염(magnetofection), 유체역학적 전달 등을 포함하며, 이들 모두는 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. DNA는 또한 세포막과 상호작용할 수 있고 세포 내로 DNA 전달을 달성하기 위해 세포내이입을 겪거나 융합할 수 있는, 리포솜, 바람직하게는 양이온성 리포솜, 또는 폴리머솜(합성 리포솜)에 캡슐화될 수 있다. DNA는 또한 세포의 세포질 내로 그의 부하물(load)을 직접 방출시킬 수 있는 덴드리머와, 또는 중합체(폴리플렉스)와의 복합체로 형성될 수 있다.
이와 관련하여 유용한 예시적인 담체는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로오스, 덱스트란 등의 미세입자를 포함한다. 다른 예시적인 지연 방출 담체로는 비-액체 친수성 코어(예를 들어, 가교 다당류 또는 올리고당), 및 선택적으로 인지질과 같은 양친매성 화합물을 포함하는 외부 층을 포함하는 초분자 생물벡터를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 출원 WO 94/20078, WO/94/23701 및 WO 96/06638 참조). 지속 방출 제형 내에 함유된 활성제의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 방출 예상 기간, 및 치료 또는 예방할 상태의 본성에 따라 달라진다.
생분해성 미세구체(microsphere)(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)가 조성물의 담체로 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 미세구체는 예를 들어 미국 특허 제4,897,268호; 제5,075,109호; 제5,928,647호; 제5,811,128호; 제5,820,883호; 제5,853,763호; 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호에 개시되어 있다. WO/99 40934 및 여기에 인용된 참고문헌에 기술된 바와 같은 변형된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템은 또한 많은 적용예에 유용할 것이다. 또 다른 예시적인 담체/전달 시스템은 미국 특허 제5,928,647호에 기재된 것과 같은 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체를 사용하며, 이는 환자의 종양 조직을 표적으로 하는 MHC I-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있는 항-NTPDase3 항체 작용제에 대한 암호 서열을 전달하기 위해 종양내로 사용되는 경우, 추가적인 이점을 가질 수 있다.
생분해성 중합체 나노입자는 세포로의 비바이러스성 핵산 전달을 용이하게 한다. 플라스미드 DNA와 양이온성, 가수분해적으로 분해가능한 폴리(베타-아미노 에스테르)의 자가조립에 의해 작은(약 200 nm), 양하전된(약 10 mV) 입자가 형성된다.
폴리뉴클레오타이드는 또한 직접 미세주사, 일시적 세포 투과화(예를 들어, 억제인자 및/또는 활성화제와 세포 투과화제의 공동 투여), 막 전위 펩타이드와 융합 등에 의해 세포로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 특별한 특정 실시양태에서, 유전자 작제물은 전기천공을 통해 표적 세포 내로 도입된다. 전기천공은 세포(또는 조직)와 DNA(또는 DNA 복합체)를 고전압 방전에 노출시키는 것을 수반한다. 생체내 전기천공은 플라스미드 DNA를 많은 다른 조직으로 효율적으로 전달하는 데 성공적으로 사용된 유전자 전달 기술이다. 연구에 따르면, B16 흑색종 및 기타 종양 조직으로 플라스미드 DNA를 전달하기 위한 생체내 전기천공 투여가 보고되어 있다. 플라스미드에 의해 암호화된 유전자 또는 cDNA의 전신 및 국소 발현은 생체내 전기천공의 투여로 수득될 수 있다. 생체내 전기천공의 사용은 종양 조직에서 플라스미드 DNA 흡수를 향상시켜 종양 내 발현을 초래하고, 플라스미드를 근육 조직으로 전달하여 사이토카인과 같은 분비 단백질의 전신 발현을 초래한다(예를 들어, US8026223 참조). 항-NTPDase3 항체 작용제 전이유전자를 생체내 세포로 전기천공하기 위한 예시적인 기술, 벡터 및 장치는 PCT 공개 WO/2017/106795, WO/2016/161201, WO/2016/154473, WO/2016/112359 및 WO/2014/066655를 포함한다.
미국 특허 제7,245,963호는 모듈형 전극 시스템 및 신체 또는 식물의 선택된 조직의 세포 내로 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 이들의 용도를 기술한다. 모듈형 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 주사바늘; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함한다. 조작자는 지지 구조물에 장착된 복수의 바늘 전극을 잡아 신체 또는 식물의 선택된 조직 내로 확실하게 삽입할 수 있다. 그 다음, 생체분자는 피하 주사 바늘을 통해 선택된 조직으로 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로 생체분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
미국 특허 공개번호 2005/0052630은 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생체분자의 도입을 효과적으로 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 전기천공 장치를 설명한다. 이 전기천공 장치는 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 작동이 특정되는 전기-동역학 장치("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 매개변수 입력을 기반으로 어레이의 전극 간에 일련의 프로그래밍가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 수집을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극 어레이를 갖는 교체가능한 전극 디스크, 주사 바늘용 중앙 주사 채널, 및 제거가능한 가이드 디스크(예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 공개번호 2005/0052630 참조)를 포함한다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개번호 2005/0052630에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직이나 장기 내로 심부 침투하기 위해 개조된다. 전극 어레이의 구성으로 인해, 주사 바늘(선택한 생체분자 전달용)도 표적 기관에 완전히 삽입되고, 주사는 전극에 의해 미리 윤곽이 그려진 영역에서 표적 조직에 수직으로 투여된다.
전형적으로, 생체내 세포 전기천공에 필요한 전기장은 일반적으로 시험관내 세포에 필요한 전기장과 크기가 유사하다. 일 실시양태에서, 전기장의 크기는 대략 10 V/cm 내지 약 1500 V/cm, 바람직하게는 약 300 V/cm 내지 1500 V/cm, 바람직하게는 약 1000 V/cm 내지 1500 V/cm 범위이다. 대안적으로, 더 낮은 전계 강도(약 10 V/cm 내지 100 V/cm, 보다 바람직하게는 약 25 V/cm 내지 75 V/cm)에서 펄스 길이는 길다. 예를 들어, 공칭 전기장이 약 25-75 V/cm인 경우, 펄스 길이는 약 10 msec인 것이 바람직하다.
펄스 길이는 약 10s 내지 약 100ms일 수 있다. 임의의 원하는 수의 펄스가 있을 수 있으며, 전형적으로 초당 1에서 100펄스이다. 펄스 세트 사이의 지연은 1초와 같이 임의의 원하는 시간일 수 있다. 파형, 전기장 강도 및 펄스 지속 시간은 또한 세포 유형 및 전기천공을 통해 세포에 들어가야 하는 분자 유형에 따라 달라질 수 있다.
또한, 전기화학적 임피던스 분광법("EIS")를 포함시킨 전기천공 장치도 포괄된다. 이러한 장치는 생체내, 특히 종양내 전기천공 효율에 대한 실시간 정보를 제공하여 조건을 최적화할 수 있다. EIS를 포함시킨 전기천공 장치의 예는, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO2016/161201에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 의해 포괄되는 비-바이러스 전달 벡터의 흡수는 또한 애벌란시(avalanche) 형질감염이라고도 하는 플라즈마 전기천공에 의해 향상될 수 있다. 간단히 말해서, 마이크로초 방전은 전극 표면에 캐비테이션 미세기포를 생성한다. 자기장과 조합된 붕괴성 미세기포에 의해 생성된 기계적 힘은 기존의 전기천공과 연관된 확산 매개 수송과 비교하여 세포막을 통한 수송 효율을 증가시키는 역할을 한다. 플라즈마 전기천공 기술은 미국 특허 제7,923,251호 및 제8,283,171호에 설명되어 있다. 이 기술은 또한 세포의 형질전환을 위해 생체내에서 사용될 수 있다. Chaiberg, 등(2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090; 2012년 1월 24일 발행된 Chaiberg 등 미국 특허 제8,101 169호.
다른 대안적 전기천공 기술도 고려된다. 생체내 플라스미드 전달은 저온 플라즈마를 사용하여 수행할 수도 있다. 플라즈마는 물체의 4가지 기본 상태 중 하나이며, 나머지는 고체, 액체 및 기체이다. 플라즈마는 결합되지 않은 양성 및 음성 입자의 전기적 중성 매질이다(즉, 플라즈마의 총 전하는 대강 0임). 플라즈마는 가스를 가열하거나, 또는 레이저 또는 마이크로파 발생기를 사용하여 강한 전자기장을 가하여 생성할 수 있다. 이것은 전자의 수를 감소시키거나 증가시켜 이온이라고 하는 양전하 또는 음전하 입자를 생성하고(Luo, 등 (1998) Phys. Plasma 5:2868-2870), 존재하는 경우, 분자 결합의 해리를 동반한다.
저온 플라즈마(즉, 비-가열 플라즈마)는 펄스형 고전압 신호를 적절한 전극에 전달함으로써 생성된다. 저온 플라즈마 장치는 가스 제트 장치 또는 유전체 장벽 방전(dielectric barrier discharge, DBD) 장치의 형태를 취할 수 있다. 저온 플라즈마는 상대적으로 낮은 가스 온도에서 플라즈마를 제공함으로써 엄청난 열광과 관심을 불러일으켰다. 이러한 온도에서 플라즈마의 제공은 상처 치유, 항균 과정, 다양한 기타 의료 요법 및 살균을 비롯한 다양한 적용예에서 관심을 끌고 있다. 앞서 언급한 바와 같이 저온 플라즈마(즉, 비-가열 플라즈마)는 펄싱된 높은 전압 신호를 적절한 전극에 전달함으로써 생성된다. 저온 플라즈마 장치는 가스 제트 장치, 유전체 장벽 방전(DBD) 장치 또는 다중 주파수 고조파-풍부 전원 공급장치의 형태를 취할 수 있다.
유전체 장벽 방전 장치는 저온 플라즈마를 생성하는 상이한 공정에 의존적이다. 유전체 장벽 방전(DBD) 장치는 유전체 층으로 덮인 적어도 하나의 전도성 전극을 함유한다. 전기적 복귀 경로는 저온 플라즈마 처리를 겪는 표적 기재에 의해 제공될 수 있는 접지(ground)에 의해 형성되거나 전극에 대한 내장 접지(in-built ground)를 제공함으로써 형성된다. 유전체 장벽 방전 장치를 위한 에너지는 전술한 바와 같은 고전압 전원 공급장치에 의해 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 에너지는 펄싱된 DC 전기 전압의 형태로 유전체 장벽 방전 장치에 투입되어 플라즈마 방전을 형성한다. 유전층으로 인해 전도성 전극으로부터 방전이 분리되고, 전극 에칭 및 가스 가열이 감소한다. 펄싱된 DC 전기 전압은 다양한 작동 체제를 달성하기 위해 진폭과 주파수가 변동될 수 있다. 이러한 저온 플라즈마 생성 원리를 포함시킨 임의의 장치(예를 들어, DBD 전극 장치)는 본 발명에 의해 포괄되는 다양한 실시형태의 범주에 속한다.
저온 플라즈마는 외래 핵산으로 세포를 형질감염시키는 데 사용되었다. 구체적으로, 종양 세포의 형질감염(예를 들어, Connolly, 등(2012) Human Vaccines & Immune-therapeutics 8: 1729-1733; 및 Connolly 등(2015) Bioelectrochemistry 103: 15-21 참조).
특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체 작용제를 암호화하는 전이유전자 작제물은 다음을 포함하는 전기천공 장치를 사용하여 전달된다: 어플리케이터; 어플리케이터로부터 연장되는 복수의 전극 - 전극은 커버 영역과 연관되어 있음; 전극과 전기적으로 소통하는 전원 공급장치, 여기서 전원 공급 장치는 커버 영역 내의 세포에 대해 하나 이상의 전기천공 신호를 생성하도록 구성됨; 및 전극에 커플링된 가이드 부재, 여기서 가이드 부재는 전극의 커버 영역을 조정하도록 구성됨. 전극의 적어도 일부는 원추형 배열 중 어플리케이터 내에 위치될 수 있다. 하나 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 연관될 수 있다. 장치는 전원 공급장치 및 전극에 커플링된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 전기장을 실질적으로 소정의 범위 내에 유지하도록 구성될 수 있다.
하나 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 연관될 수 있다. 장치는 전원 공급장치 및 전극에 커플링된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 커버 영역 내의 세포의 영구적인 손상을 실질적으로 방지하고/하거나 통증을 실질적으로 최소화하도록 전기장을 소정의 범위 내에서 유지하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 전위차계는 전기장을 약 1300 V/cm로 유지하도록 구성될 수 있다.
전원 공급장치는 제1 전극에 제1 전기 신호를 제공하고 제2 전극에 제2 전기 신호를 제공할 수 있다. 제1 및 제2 전기 신호는 비트 주파수를 갖는 파동을 생성하도록 조합될 수 있다. 제1 및 제2 전기 신호는 각각 단극성 파형 및 이극성 파형 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 제1 전기 신호는 제1 주파수 및 제1 진폭을 가질 수 있다. 제2 전기 신호는 제2 주파수 및 제2 진폭을 가질 수 있다. 제1 주파수는 제2 주파수와 상이하거나 동일할 수 있다. 제1 진폭은 제2 진폭과 상이하거나 동일할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 항-NTPDase3 항체 작용제를 암호화하는 플라스미드의 유효량을 종양에 주사하는 단계; 및 종양에 전기천공 요법을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전기천공 요법은 약 100 마이크로초 내지 약 20 밀리초의 펄스 폭에 걸쳐 약 200 V/cm 내지 약 1500 V/cm의 적어도 하나의 전압 펄스를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 플라스미드(또는 제2의 전기천공 플라스미드)는 IL-12, IL-15, 및 IL-12와 IL-15의 조합을 암호화하는 군으로부터 선택된 것과 같은 적어도 하나의 면역자극성 사이토카인을 추가로 암호화한다.
항-NTPDase3 항체 암호화 핵산 작제물을 전달하기 위한 지질 및 다가양이온 분자
시험관내 및 생체내에서 mRNA를 포함한 외래 핵산의 지질-매개의 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다. 지질 기반의 비-바이러스 제형은 아데노바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 현행의 생체내 지질 전달 방법은 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 사용한다. 지질 제형의 발전은 생체내 유전자 전달의 효율을 개선시켰다(PCT 출원 WO 98/07408 참조). 예를 들어, 등몰 비율의 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판(DOTAP)과 콜레스테롤로 구성된 지질 제형은 전신 생체 내 유전자 전달을 유의적으로 향상시킬 수 있다. DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포솜(sandwich liposome)"이라고 하는 독특한 구조를 형성한다. 이 제형은 함입된 이중층 또는 '베이즈(vase)' 구조 사이에 DNA를 "샌드위치"하는 것으로 보고된다. 이러한 지질 구조의 유익한 특성은 양성 p, 콜레스테롤에 의한 콜로이드 안정화, 2차원 핵산 패킹 및 증가된 혈청 안정성을 포함한다.
양이온성 리포솜 기술은 양전하를 띤 머리 기와 소수성 지질 꼬리를 소유하는 양쪽친매성 지질이 음전하를 띤 DNA 또는 RNA에 결합하고 일반적으로 세포내이입에 의해 세포에 들어가는 입자를 형성하는 능력을 기반으로 한다. 일부 양이온성 리포솜은 또한 포유동물 세포에 의한 리포솜 흡수를 향상시키는 것으로 생각되는 중성 공지질(co-lipid)도 함유한다. 유사하게, 폴리-l-리신 및 폴리에틸렌-이민과 같은 다른 다가양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체를 형성하고, 엔도솜-매개 흡수를 위한 기질이 되는 나노입자로 DNA 또는 RNA의 응축에 도움을 준다.[8] 이러한 양이온-핵산 복합체 기술 중 몇몇은 플라스미드 DNA(pDNA), 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 포함하는 잠재적 임상 제품으로서 개발되었다.
본원에 개시된 핵산 작제물은 세포 내로 흡수를 향상시키는 역할을 하는 다가양이온 분자와 연관될 수 있다. 다가양이온 분자를 이용하여 핵산 작제물을 복합체화하는 것은 또한 크기가 감소되도록 작제물을 패키징하는 데 도움이 되며, 이는 세포 흡수를 돕는 것으로 여겨진다. 일단 엔도솜에 들어가면, 복합체는 더 낮은 pH로 인해 해리되고 다가양이온 분자는 엔도솜 막을 붕괴시켜 DNA가 분해될 수 있기 전에 세포질로 DNA 탈출을 용이하게 할 수 있다. 예비 데이터는 핵산 작제물 실시양태가 다가양이온 분자 폴리라이신 또는 폴리에틸렌이민과 복합체화되는 경우, DC보다 SC로의 흡수가 향상되었음을 보여준다.
핵산 작제물과 복합체화에 유용한 다가양이온 분자의 일 예는 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)를 포함하고, 예로는 폴리라이신(상기 기재됨), 폴리아르기닌 및 Tat 펩타이드를 포함한다. 세포 투과 펩타이드(CPP)는 DNA에 결합할 수 있고, 일단 방출되면 세포막을 투과하여 엔도솜으로부터 세포질로 DNA의 탈출을 용이하게 할 수 있는 작은 펩타이드이다. CPP의 또 다른 예는 MPG라고 하는 27개 잔기의 키메라 펩타이드에 관한 것으로서, 이는 얼마 전에 ss- 및 ds-올리고뉴클레오타이드에 안정적인 방식으로 결합하여 DNase에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고 시험관내에서 올리고뉴클레오타이드를 세포로 효과적으로 전달하는 비공유 복합체를 초래하는 것으로 밝혀졌다(Mahapatro A, 등, J Nanobiotechnol, 2011, 9:55). 이 복합체는 서로 다른 펩타이드:DNA 비율이 조사되었을 때, 그리고 10:1 및 5:1 비율(각각 150nm 및 1um)일 때 약 150 nm 내지 1 um의 작은 입자를 형성했다. 또 다른 CPP는 변형된 테트라펩타이드[구아니디노카보닐피롤(GCP) 기를 함유하는 테트라라이신(TL-GCP)]에 관한 것으로, 6.2kb 플라스미드 DNA에 높은 친화도로 결합하여 700-900 nm의 양전하 응집체를 초래하는 것으로 보고되었다. Li 등, Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4). RNA는 또한 생체내 전달을 위해 이러한 다가양이온 분자에 의해 복합체화될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 작제물과 복합체화될 수 있는 다가양이온 분자의 다른 예는 JETPRIME® 및 In Vivo JET(Polypus-transfection, S.A., 프랑스 일키르히 소재)로서 상업적으로 입수가능한 다가양이온 중합체를 포함한다.
VI. 사용 방법 및 약제학적 조성물
본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체는 암에 대한 면역요법과 같은 치료적 치료 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 적용예에 유용하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체는 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키고, 종양 성장을 저해하며, 종양 부피를 감소시키고, 종양 퇴행을 유도하고, 종양 세포 아폽토시스를 증가시키고, 및/또는 종양의 종양형성성을 감소시키는 데 유용하다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체 및 유도체는 또한 바이러스와 같은 병원체에 대한 면역요법에 유용하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체는 바이러스 감염을 저해하고, 바이러스 감염을 감소시키며, 바이러스 감염된 세포 아폽토시스를 증가시키고, 및/또는 바이러스 감염된 세포의 사멸을 증가시키는데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체의 면역 반응을 활성화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체의 면역 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체의 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 세포 매개 면역을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 종양 내 M2 또는 M2-유사 대식세포의 수를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 M2 대식세포 활성을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 M1 대식세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 종양 내 아데노신의 수준을 저하시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 Th1형 반응을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 T-세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CD4+ T-세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CD8+ T-세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CTL 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 NK 세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 T-세포 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CU 활성의 증가 및 NK 세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 Treg 세포의 억제 활성을 저해 또는 저하시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 억제 활성을 저해 또는 저하시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 기억 T-세포의 백분율 수를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 장기간 면역 기억 기능의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 장기간 기억의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 실질적인 부작용 및/또는 면역 기반 독성의 증거 없음을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 증거 없음을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 자극의 결과이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 암이다. 일부 실시양태에서, 항원 자극은 병원체이다. 일부 다른 실시양태에서, 항원 자극은 바이러스 감염된 세포일 수 있다.
항-NTPDase3 항체가 면역 반응을 조정, 활성화 또는 저해하는지 여부를 결정하기 위한 생체내 및 시험관내 검정은 본 기술분야에 공지되어 있거나 개발 중에 있다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 저해하는 지속적 또는 장기간 면역을 유도하는 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 항-NTPDase3 항체를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 신경내분비 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종, 림프종 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 또는 췌장 섬 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 방광 또는 요로상피 종양이다.
일부 실시양태에서, 종양은 액체 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 백혈병, 예컨대, 골수성 또는 과립구 백혈병, 림프성, 림프구성 또는 림프모구 백혈병, 및 진성 적혈구증가증 또는 적혈구증가증이다.
일부 실시양태에서, 종양은 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 제제와 같은 항-NTPDase3 항체에 의해 표적화된 종양 항원을 발현하거나 과발현한다.
본 발명은 본원에 기재된 치료적 유효량의 항-NTPDase3 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 암의 성장을 저해하거나 제한한다.
본 발명은 본원에 기재된 치료적 유효량의 항-NTPDase3 항체를 대상체(예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암성 종양이 있는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양이 제거된 적이 있다.
특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 신경내분비암, 방광암, 뇌암, 교모세포종, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다.
본 발명은 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체 및 약제학적 허용성 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 면역요법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 면역종양학에 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 성장을 저해하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 환자)의 종양 성장을 저해하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 환자)의 암을 치료하는 데 사용된다.
제형은 본 발명에 의해 포괄되는 정제된 제제를 약제학적으로 허용성 비히클(예를 들어, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 본 기술분야의 기술자는 일반적으로 약제학적 허용성 담체, 부형제 및/또는 안정화제를 제형 또는 약제학적 조성물의 비활성 성분으로 간주한다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 동결건조되고/되거나 동결건조된 형태로 저장된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 포함하는 제형은 동결건조된다.
적합한 약제학적 허용성 비히클은 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 무독성 완충액; 염화나트륨과 같은 염류; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸과 같은 보존제; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 포도당, 만노스 또는 덱스트린과 같은 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; Zn-단백질 복합체와 같은 금속 복합체; 및 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).
본 발명에 의해 포괄되는 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국소 투여; 분무기, 기관내 및 비강내를 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 폐 투여; 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내(예를 들어, 주사 또는 주입), 또는 두개내(예를 들어, 척추강내 또는 뇌실내)를 포함하는 비경구 투여일 수 있다.
치료 제형은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제형은 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비수성 매질 중의 용액 또는 현탁액, 또는 좌제를 포함한다. 정제와 같은 고체 조성물에서 주요 활성 성분은 약제학적 담체와 혼합된다. 기존의 정제 성분으로는 옥수수 전분, 유당, 자당, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 희석제(예를 들어, 물)를 포함한다. 이들은 본 발명에 의해 포괄되는 화합물의 균일한 혼합물 또는 이의 무독성 약제학적 허용성 염을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성하는데 사용될 수 있다. 이어서, 고체 예비제형 조성물은 전술한 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 제형 또는 조성물의 정제, 환제 등은 코팅되거나 달리 배합되어 장기간 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분에 의해 덮인 내부 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 두 성분은 분해에 저항하는 역할을 하고 내부 성분이 위를 온전하게 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장용 층 또는 코팅에는 다양한 재료가 사용될 수 있고, 이러한 재료에는 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물이 포함된다.
항-NTPDase3 항체는 또한 미세캡슐(microcapsule)에 포획될 수 있다. 이러한 미세캡슐은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London에 기재된 바와 같은 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 미세캡슐 각각에 제조되거나, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구체, 미세에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 제조되거나, 또는 마크로에멀젼(macroemulsion)에 제조된다.
특정 실시양태에서, 약제학적 제형은 리포솜과 복합체화된 항-NTPDase3 항체를 포함한다. 리포솜을 생산하는 방법은 본 기술분야의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정해진 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포솜을 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체를 포함하는 지속 방출 제제가 생산될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예로는 항-NTPDase3 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형 물품(예를 들어, 필름 또는 미세캡슐)의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔, 예컨대, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알코올), 폴리락타이드, L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대, LUPRON DEPOT(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구체), 수크로스 아세테이트 아이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체를 투여하는 것 외에도, 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가 면역 반응 자극제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 면역 반응 자극제는 콜로니 자극 인자(예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 줄기 세포 인자(SCF)), 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), 관문 저해제, 면역억제 기능을 차단하는 항체(예를 들어, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체), 톨 유사(toll-like) 수용체(예를 들어, TLR4, TLR7, TLR9), 또는 B7 패밀리의 구성원(예를 들어, CD80, CD86)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가 면역 반응 자극제는 항-NTPDase3 항체의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 투여될 수 있다. 항-NTPDase3 항체 및 면역 반응 자극제(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 1, 2, 3개 또는 그 이상의 면역 반응 자극제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체를 투여하는 것 외에도, 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 치료제는 항-NTPDase3 항체의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 투여될 수 있다. 항-NTPDase3 항체 및 추가 치료제(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 1, 2, 3개, 또는 그 초과의 추가 치료제를 포함한다.
2개 이상의 치료제를 사용한 조합 요법은 종종 상이한 작용 기전에 의해 작용하는 작용제를 사용하지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 작용 기전이 상이한 작용제를 사용하는 조합 요법은 부가적 또는 상승적 효과를 초래할 수 있다. 조합 요법은 단독요법에서 사용되는 것보다 더 낮은 용량의 각 작용제를 허용할 수 있으므로, 독성 부작용을 감소시키고/시키거나 항-NTPDase3 항체의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암세포가 발생할 가능성을 저하시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 면역 반응에 영향을 미치는(예를 들어, 반응을 향상시키거나 활성화시키는) 치료제 및 종양/암 세포에 영향을 미치는(예를 들어, 저해 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 및 적어도 하나의 추가 치료제의 조합은 부가적 또는 상승적 결과를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 항-NTPDase3 항체의 치료 지수의 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가 치료제(들)의 치료 지수의 증가를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 항-NTPDase3 항체의 독성 및/또는 부작용의 저하를 초래한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가 치료제(들)의 독성 및/또는 부작용의 저하를 초래한다.
치료제의 유용한 부류는, 예를 들어, 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬화제(예를 들어, 백금 복합체, 예컨대, 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 삼중핵 백금 복합체 및 카보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항엽산, 항대사물질, 화학요법 증감제, 듀오카르마이신, 에토포사이드, 플루오르화 피리미딘, 이온전달물질, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 항대사물질, 퓨로마이신, 방사선증감제, 스테로이드, 탁산, 토포아이소머라제 저해제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 억제제, 토포아이소머라제 저해제, 또는 혈관신생 저해제이다.
본원에 기재된 항-NTPDase3 항체와 조합으로 투여될 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법 또는 치료는 화학요법제와 조합으로 또는 화학요법제의 칵테일과 조합으로 항-NTPDase3 항체를 투여하는 것을 수반한다. 항-NTPDase3 항체를 사용한 치료는 화학요법의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 일어날 수 있다. 조합 투여는 단일 약제학적 제형으로 또는 별도의 제형을 사용한 공동투여, 또는 어느 한 순서이지만 일반적으로 모든 활성제가 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있을 정도의 시간 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투약 일정은 제조자의 지시에 따라 또는 숙련된 실무자에 의해 경험적으로 결정된 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법을 위한 제제 및 투약 일정은 또한 The Chemotherapy Source Book, 4.sup.th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.에 기재되어 있다.
본 발명에 포괄되는 실시양태에 따른 유용한 화학요법제는 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN)와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘류; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 아이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로우레아; 아클라시노미신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 아이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항부신; 엽산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜친; 다이아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드(Ara-C); 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(TAXOL) 및 도세탁셀(TAXOTERE); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 아이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 아이반드로네이트; CPT11; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레틴산; 에스페라미신; 카페시타빈(XELODA); 및 상기 중 임의의 것의 약제학적 허용성 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 화학요법제는 또한 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(FARESTON)을 포함하는 항에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드 및 고세렐린과 같은 항안드로겐; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적 허용성 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항호르몬제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 시스플라틴이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 카보플라틴이다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포아이소머라제 저해제이다. 토포아이소머라제 저해제는 토포아이소머라제 효소(예를 들어, 토포아이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포아이소머라제 저해제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포사이드, 토포테칸 HCl, 테니포사이드(VM-26), 및 아이리노테칸, 뿐만 아니라 이들의 임의의 약제학적 허용성 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물질이다. 항대사물질은 정상적인 생화학 반응에 필요한 대사물질과 유사하지만 세포 분열과 같은 세포의 하나 이상의 정상적인 기능을 방해할 만큼 충분히 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물질로는 젬시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 나트륨, 랄리트렉시드, 페메트렉시드, 테가푸르, 사이토신 아라비노사이드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 및 클라드리빈, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 약제학적 허용성 염, 산, 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 작용제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 약제학적 허용성 염, 산, 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀(TAXOL), 도세탁셀(TAXOTERE), 알부민-결합된 파클리탁셀(nab-파클리탁셀; ABRAXANE), DHA-파클리탁셀, 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 또는 빈데신, 또는 이의 약제학적 허용성 염, 산, 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 저해제 또는 유사분열 키나제의 저해제, 예컨대, Aurora A 또는 Plk1이다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 당해의 항-NTPDase3 항체는 종양에서 ATP의 방출을 유도하고/하거나 종양내적으로 NTPDase3 또는 CD73의 상향조절을 유발하는 화학요법제와 더 큰 조합 효과(아마도 심지어 상승작용)를 가질 것으로 예상된다. 종양 세포 사멸을 유도할 때 세포외 공간 내로 ATP의 방출을 유발하는 광범위한 화학요법제가 있으며, 그 예로는(비제한적으로) 안트라사이클린(예컨대, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 아이다루비신), 백금 기반 약물(예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 및 옥살리플라틴), 및 프로테아솜 저해제(예컨대, 보르테조밉)이다. 방사선요법 및 광역학요법(PDT)은 또한 ATP 방출 및/또는 NTPDase3, CD73 및/또는 CD39의 종양내 수준의 상향 조절을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 소분자와 같은 작용제를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2(ErbB2) 및/또는 VEGF를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 종양 연관 항원에 대한 저해제로서 작용하는 소분자와 항-NTPDase3 항체의 조합 투여를 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 게피티닙(IRESSA), 에를로티닙(TARCEVA), 수니티닙(SUTENT), 라파타닙, 반데타닙(ZACTIMA), AEE788, CI-1033, 세디라닙(RECENTIN), 소라페닙(NEXAVAR), 및 파조파닙(GW786034B)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 키나제 저해제와 조합으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 mTOR 저해제를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 암 줄기 세포 경로를 저해하는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 Notch 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 Wnt 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 BMP 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 Hippo 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 mTOR/AKR 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 RSPO/LGR 경로의 저해제이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항체와 같은 생물학적 분자를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2/ErbB2 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양 관련 항원에 대한 항체와 항-NTPDase3 항체의 조합 투여를 수반할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 Notch 경로의 구성요소에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 Wnt 경로의 구성요소에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 암 줄기 세포 경로를 저해하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 Notch 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 Wnt 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 BMP 경로의 저해제이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 β-카테닌 신호전달을 저해하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 혈관신생 저해제인 항체(예를 들어, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)이다. 특정 실시양태에서, 추가 치료제는 베바시주맙(AVASTIN), 라무시루맙, 트라스투주맙(HERCEPTIN), 페르투주맙(OMNITARG), 파니투무맙(VECTIBIX), 니모투주맙, 잘루투무맙 또는 세툭시맙(ERBITUX)이다.
I/O 조합 - 대표적인 관문 저해제 및 공동자극 작동제
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 면역 반응을 조정하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 및 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체 또는 항-Siglec-15 항체이다.
예를 들어, 요법은 면역 관문 분자의 저해제 또는 공동자극 분자의 활성화제, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 면역 관문 저해제로는 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CEACAM, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, NLRP1, NRLP3, STING, TGFR 베타 또는 Siglec-15 중 하나 이상의 저해제를 포함한다. 공동자극 분자의 예시적인 활성화제로는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 또는 CD83 리간드 중 하나 이상의 작동제를 포함한다. 예시적인 면역 관문 저해제 및 예시적인 공동자극 분자의 활성화제는 본원에 참고로 포함되는 PCT 공개 WO 2016/054555에서 찾아볼 수 있다.
PD-1 길항제
PD-1 유전자는 Ig 유전자 슈퍼패밀리의 일부인 55kDa I형 막관통 단백질이다(Agata 등 (1996) Int Immunol 8:765-72). PD-1은 막 근위 면역수용체 티로신 저해 모티프(immunoreceptor tyrosine inhibitory motif, ITIM) 및 막 원위 티로신 기반 스위치 모티프(ITSM)를 포함한다(Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181:1953-6; Vivier, E 및 Daeron, M(1997) Immunol Today 18:286-91). PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2가 식별되었으며, 이는 PD-1에 결합 시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 밝혀졌다(Freeman 등 (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman 등(2001) Nat Immunol 2:261-8, Carter 등(2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 및 PD-L2는 모두 PD-1에 결합하지만 다른 CD28 패밀리 구성원에는 결합하지 않는 B7 동족체이다. PD-L1은 다양한 인간 암에서 풍부하다(Dong 등 (2002) Nat. Med. 8:787-9). PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구의 저하, T-세포 수용체 매개 증식의 저하, 및 암세포에 의한 면역 회피를 초래한다(Dong 등 (2003) J. Mol. Med. 81:281-7, Blank 등(2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi 등(2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소적 상호작용을 저해함으로써 역전될 수 있으며, PD-1과 PD-L2의 상호작용이 또한 차단되는 경우, 그 효과는 부가적이다(Iwai 등(2002) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:12293-7, Brown 등(2003) J. Immunol. 170: 1257-66).
본원에 사용된 용어 "프로그램된 사멸 1", "프로그램된 세포 사멸 1", "단백질 PD-1", "PD-1," PD1, "PDCD1," "hPD-1" 및 "hPD-1"은 상호교환적으로 사용되며, 인간 PD-1의 변이체, 동형, 종 동족체, 및 인간 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 인간 PD-1 서열은 GenBank 수탁 번호 U64863 하에 찾을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1", "PD-L1", "PDL1", "PDCD1L1", "PDCD1LG1", "CD274", "B7 동족체 1", "B7-H1", " B7-H" 및 "B7H1"은 상호교환적으로 사용되며, 인간 PDL-1의 변이체, 동형, 종 동족체, 및 인간 PDL-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 인간 PD-L1 아미노산 서열 - 동형 전구체 - 는 GenBank 수탁 번호 NP_054862.1 하에 찾을 수 있다. 완전한 인간 PD-L1 아미노산 서열 - 동형 b 전구체 -는 GenBank 수탁 번호 NP_001254635.1에서 찾을 수 있다. 펜코드. 용어 "PD-1 축 결합 길항제"는 PD-1 축 결합 파트너와 이의 결합 파트너 중 하나 이상과의 상호작용을 저해하여 PD-1 신호전달 축에 대한 신호전달로부터 기인하는 T-세포 기능이상을 제거하는 분자를 지칭하며, 결과적으로 T-세포 기능(예를 들어, 증식, 사이토카인 생산, 표적 세포 사멸)을 복원 또는 향상시킨다. 본원에 사용된 PD-1 축 결합 길항제로는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.
용어 "PD-1 결합 길항제"는 PD-1과 이의 결합 파트너, 예컨대, PD-L1, PD-L2 중 하나 이상과의 상호작용에 기인하는 신호 전달을 저하, 차단, 저해, 저지 또는 방해하는 분자이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 결합 파트너에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합을 저해한다. 예를 들어, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 PD-L1 및/또는 PD-L2와의 상호작용에 기인하는 신호 전달을 저하, 차단, 저해, 저지 또는 방해하는 항-PD-1 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩타이드 및 다른 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1을 통한 T 림프구 매개의 신호전달에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 음성 공동-자극 신호를 감소시켜 기능이상 T-세포가 덜 기능이상성이 되도록 한다(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 향상시킴). 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정 측면에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 MDX-1106이다. 또 다른 특정 측면에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 Merck 3745이다. 또 다른 특정 측면에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 CT-011이다.
용어 "PD-L1 결합 길항제"는 PD-L1과 PD-1, B7-1과 같은 하나 이상의 결합 파트너와의 상호작용으로 인한 신호 전달을 저하, 차단, 저해, 저지 또는 방해하는 분자이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 이의 결합 파트너에 결합하는 것을 저해하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-1 및/또는 B7-1에 대한 PD-L1의 결합을 저해한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1과 하나 이상의 이의 결합 파트너, 예컨대, PD-1, B7-1과의 상호작용으로 인한 신호 전달을 저하, 차단, 저해, 저지 또는 방해하는 항-PD-L1 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩타이드 및 다른 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1을 통한 T 림프구 매개 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 음성 공동-자극 신호를 감소시켜 기능장애성 T 세포가 덜 기능장애성이 되도록 한다(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 향상시킴). 일부 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 특정 측면에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 YW243.55.S70이다. 또 다른 특정 측면에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MDX-1105이다. 또 다른 특정 측면에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MPDL3280A이다.
용어 "PD-L2 결합 길항제"는 PD-L2와 하나 이상의 이의 결합 파트너, 예컨대, PD-1과의 상호작용으로 인한 신호 전달을 저하, 차단, 저해, 저지 또는 방해하는 분자이다. 일부 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2와 이의 결합 파트너와의 결합을 저해하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-1에 대한 PD-L2의 결합을 저해한다. 일부 실시양태에서, PD-L2 길항제는 PD-L2와 하나 이상의 이의 결합 파트너, 예컨대 PD-1과의 상호작용으로 인한 신호 전달을 저하, 차단, 저해, 저지 또는 방해하는 항-PD-L2 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩타이드 및 다른 분자를 포함한다. 일 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2를 통한 T 림프구 매개 신호전달에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 음성 공동-자극 신호를 감소시켜 기능장애성 T 세포가 덜 기능장애성이 되도록 한다(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응을 향상시킴). 일부 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 면역부착소이다.
PD-1 경로: PD-1 경로의 구성원은 PD-1 신호전달과 연관된 모든 단백질이다. 한편, 이들은 PD-1의 상류에서 PD-1 신호전달을 유도하는 단백질, 예를 들어, PD-1의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2, 및 신호 전달 수용체 PD-1일 수 있다. 다른 한편, 이들은 PD-1 수용체의 하류에 있는 신호 전달 단백질일 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 정황에서 PD-1 경로의 구성원으로서 특히 바람직한 것은 PD-1, PD-L1 및 PD-L2이다.
PD-1 경로 저해제: 본 발명에 의해 포괄되는 정황에서, PD-1 경로 저해제는 바람직하게는 PD-1 경로 신호전달, 바람직하게는 PD-1 수용체에 의해 매개되는 신호전달을 손상시킬 수 있는 화합물로서 본원에서 정의된다. 따라서, PD-1 경로 저해제는 PD-1 경로 신호전달에 길항작용할 수 있는 PD-1 경로의 임의의 구성원에 대해 지향성인 임의의 저해제일 수 있다. 이러한 정황에서, 저해제는 PD-1 경로의 임의의 구성원을 표적화하는, 바람직하게는, PD-1 수용체, PD-L1 또는 PD-L2에 대해 지향성인, 본원에 정의된 바와 같은 길항작용성 항체일 수 있다. 이 길항작용성 항체는 또한 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 암호화된 항체는 또한 본원에 정의된 바와 같은 "인트라바디(intrabody)"라고도 불린다. 또한, PD-1 경로 저해제는 PD-1 리간드의 활성을 차단하는 PD1-수용체 또는 PD1 수용체의 단편일 수 있다. B7-1 또는 이의 단편은 또한 PD1-저해 리간드로서 작용할 수 있다. 더욱이, PD-1 경로 저해제는 PD-1 경로의 구성원, 바람직하게는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 대해 지향성인 siRNA(작은 간섭 RNA) 또는 안티센스 RNA일 수 있다. 추가로, PD-1 경로 저해제는 PD-1에 결합할 수 있지만, 예를 들어 PD-1과 B7-H1 또는 B7-DL 상호작용을 저해함으로써 PD-1 신호전달을 방지할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 단백질(또는 이를 암호화하는 핵산)일 수 있다. 또한, PD-1 경로 저해제는 PD-1 경로 신호전달을 저해할 수 있는 소분자 저해제, 예를 들어, PD-1 결합 펩타이드 또는 작은 유기 분자일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄되는 PD-1 길항제는 PD-1의 리간드에 결합하여, PD-1 수용체에 대한 하나 이상의 리간드의 결합을 방해, 감소 또는 저해하거나, 또는 PD-1 수용체를 통한 신호 전달에 관여함이 없이, PD-1 수용체에 직접 결합하는 작용제를 포함한다. 일 실시양태에서, PD-1 길항제는 PD-1에 직접 결합하고 PD-1 저해성 신호 전달을 차단한다. 또 다른 실시양태에서, PD-1 길항제는 PD-1의 하나 이상의 리간드(예를 들어, PD-L1 및 PD-L2)에 결합하고, 이 리간드(들)가 PD-1을 통해 저해성 신호 전달을 촉발하는 것을 감소시키거나 저해한다. 일 실시양태에서, PD-1 길항제는 PD-L1에 직접 결합하여, PD-L1이 PD-1에 결합하는 것을 저해하거나 방지하여, PD-1 저해성 신호 전달을 차단한다.
본 발명에 의해 포괄되는 방법 및 조성물에 사용되는 PD-1 길항제는 PD-1 결합 스캐폴드 단백질을 포함하고, PD-리간드, 항체 및 다가 작용제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 길항제는 AMP-224와 같은 융합 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, 길항제는 항-PD-1 항체("PD-1 항체")이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항-인간-PD-1 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 본 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 본 기술분야에서 인식된 항-PD-1 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 MK-3475 또는 CT-011이 사용될 수 있다. 추가로, 교시 내용이 본원에 참고로 포함되는 WO 2006/121168에 기재된 단클론 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4가 사용될 수 있다. PD-1에 대한 결합에 대해 이들 기술분야에서 인식된 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, PD-1 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항-인간-PD-L1 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 본 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 본 기술분야에서 인식된 항-PD-L1 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, MEDI4736(항-B7-H1이라고도 알려짐) 또는 MPDL3280A(RG7446이라고도 알려짐)가 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 교시내용이 참고로 포함되는 WO 2007/005874 및 미국 특허 제7,943,743호에 기재된 단클론 항체 12A4, 3G10, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7, 및 13G4가 사용될 수 있다. PL-L1에 대한 결합에 대해 본 기술분야에서 인식된 이들 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다.
예시적인 항-PD-L1 항체는 12A4이다(WO 2007/005874 및 미국 특허 제7,943,743호).
항 PD-1 또는 항 PD-L1 항체는 각각 PD-1 또는 PD-L1에, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 또는 10-10 M 이하의 KD로 결합할 수 있다.
일 실시양태에서, PD-1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 피딜리주맙으로부터 선택되는 항-PD-1 항체이다. 바람직한 PD-1 저해제는 니볼루맙이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(Nivolumab)이다. 니볼루맙의 대체 이름으로는 MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538 또는 BMS-936558을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(CAS 등록 번호: 946414-94-4)이다. 니볼루맙은 PDI를 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 단클론 항체이다. PDI에 특이적으로 결합하는 니볼루맙(클론 5C4) 및 기타 인간 단클론 항체는 미국 특허 제8,008,449호(참고로 포함됨) 및 WO 2006/121168(참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)이다. 펨브롤리주맙(상표명 KEYTRUDA®, 구 명칭, 람브롤리주맙(Lambrolizumab), Merck 3745, MK-3475 또는 SCH-900475로도 알려짐)은 PD1에 결합하는 인간화 IgG4 단클론 항체이다. 펨브롤리주맙은, 예를 들어, Hamid, O. 등(2013) New England Journal of Medicine 369(2): 134-44, WO 2009/114335(참고로 포함됨), 및 US 8,354,509(참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 피딜리주맙(Pidilizumab)이다. 피딜리주맙(CT-011; Cure Tech)은 PD1에 결합하는 인간화 IgG1k 단클론 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 단클론 항체는 WO2009/101611에 개시되어 있다. 다른 항-PD1 항체는 US 8,609,089, US 2010028330, 및/또는 US 20120114649에 개시되어 있다. 다른 항-PD1 항체는 AMP 514(Amplimmune)를 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 면역부착소{예를 들어, 불변 영역{예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역부착소)이다. 일부 실시양태에서, PD-1 저해제는 AMP-224이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 저해제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 저해제는 YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C 또는 MDX-1105이다.
일 실시양태에서, PD-L1 저해제는 MDX-1105이다. BMS-936559로도 알려진 MDX-1105는 WO 2007/005874에 기재된 항-PD-LI 항체이다. 일 실시양태에서, PD-L1 저해제는 YW243.55.S70이다. YW243.55.S70 항체는 WO 2010/077634(참고로 포함됨)에 기재된 항-PD-LI이다.
일 실시양태에서, PD-L1 저해제는 MDPL3280A(Genentech/Roche)이다. MDPL3280A는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 단클론 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 단클론 항체는 미국 특허 제7,943,743호(참고로 포함됨) 및 미국 공개 번호 2012/0039906(참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 다른 실시양태에서, PD-L2 저해제는 AMP-224이다. AMP-224는 PD1과 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다(B7-DCIg; Amplimmune; 예를 들어, WO 2010.027827(참고로 포함됨) 및 WO 2011/066342(참고로 포함됨)에 개시됨).
특정 실시양태에서, PD-1 경로 저해제는 PD-1 경로 신호전달의 소분자 길항제이다. 이러한 소분자 길항제는 PD-1, PD-1L 및/또는 PD-1L2 중 하나 이상에 결합하고 PD-1과 PD-1L1 및/또는 PD-1L2의 상호작용을 저해하는 길항제를 포함한다.
PD-1 경로 신호전달의 예시적인 소분자 길항제는 특히 공개된 미국 출원 2014/0294898 및 2014/0199334, 및 공개된 PCT 출원 WO 2013/132317 및 WO 2012/168944에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
단지 예시하기 위한 것으로서, 당해의 조합 요법은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자 길항제를 가지고 수행될 수 있다:
Figure pct00073
.
다른 실시양태에서, 소분자 길항제는 하기 화학식으로 표시되는 것, 또는 이의 레트로 유사제 또는 약제학적 허용성 입체이성질체 또는 약제학적 허용성 염이다:
Figure pct00074
여기서,
R1은 Ser의 유리 C-말단 또는 아미드화된 C-말단이고;
L은 -NH(CH2)nNH- 또는 -NH(CH2CH2O)nNH-로부터 선택되는 링커이고;
R4는 수소, 아미노(C1-C20)알킬, -NHCOCH3 또는 -NHCONH2로부터 선택됨.
또 다른 실시양태에서, 소분자 길항제는 하기 화학식으로 표시되는 것, 또는 이의 레트로 유사제 또는 약제학적 허용성 입체이성질체 또는 약제학적 허용성 염이다:
Figure pct00075
여기서,
R1은 Ser의 N-말단; 또는 Ser의 하이드록실 기 또는 아미노 기로 치환된 (C1-C20)아실이고;
L은 ―NH(CH2)nNH―, ―NH(CH2)nCH(NH2)CO―, ―OOC(CH2)mCOO―, ―NH(CH2)nCO―, ―NH(CH2CH2O)nNH―, ―NH(CH2CH2O)nCO― 또는 ―CO(CH2CH2O)nCO―로부터 선택되는 링커이고;
R2는 Am2의 유리 C-말단, 아미드화된 C-말단 또는 N-말단; 또는 Y―R5이며;
Y는 ―OOC(CH2)mCOO―, ―CO(CH2)nNH―, ―CO(CH2CH2O)nNH― 또는 ―COCH2(OCH2CH2)nNH―로부터 선택되는 선택적인 링커이고;
R5는 알부민 결합 모이어티, 예컨대 말레이미도 프로피온산이며;
R3은 OH 또는 NH2이고;
R4는 Phe의 페닐 기 상의 치환체로서, 수소, 아미노(C1-C20)알킬, ―NHCOCH3　또는 ―NHCONH2로부터 선택되고;
n은 2와 10을 모두 포함한 2 내지 10으로부터 선택되는 값을 갖는 정수이고;
m은 0 및 8을 모두 포함한 0 내지 8로부터 선택되는 값을 갖는 정수이며;
Ser-Asn, Asn-Thr 또는 Thr-Ser의 펩타이드 결합(―CONH―) 중 하나는 변형된 펩타이드 결합
Figure pct00076
에 의해 대체될 수 있으며;
여기서, Q는 수소, ―CO(C1-C20)알킬 또는 ―COO(C1-C20)알킬 기이고; 여기서 하나 이상 또는 모든 아미노산은 D-배열일 수 있음.
예를 들어, 소분자 길항제는 하기 식으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
CTLA-4 길항제
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조합은 또한 CTLA-4 저해제를 포함한다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙(화이자로부터 입수가능한 IgG2 단클론 항체, 이전에 티실리무맙으로 공지됨, CP-675,206); 및 이필리무맙(CTLA-4 항체, MDX-010으로도 알려짐, CAS 번호 477202-00-9).
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙(또는 이의 항원 결합 단편)에 관한 정보는 US 6,682,736(참고로 포함됨)(여기서 11.2.1로 지칭됨)에서 찾을 수 있으며, 이의 개시 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다. 트레멜리무맙(CP-675,206, CP-675, CP-675206 및 티실리무맙으로도 알려짐)은 CTLA-4에 대해 고도로 선택적이고, CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 대한 CTLA-4의 결합을 차단하는 인간 IgG2 단클론 항체이다. 이는 시험관내 면역 활성화를 초래하는 것으로 나타났으며 트레멜리무맙으로 처리된 일부 환자에서는 종양 퇴행이 나타났다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원 결합 단편은 상기에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 상기에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 상기에 제시된 Kabat-정의의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기에 제시된 Kabat-정의의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 본 기술분야의 기술자는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 Chothia 정의, Abm 정의 또는 다른 CDR 정의를 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원 결합 단편은 전문이 본원에 참고로 포함되는 US 6,682,736에 개시된 바와 같은 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 하기 식의 화합물을 포함하는, Huxley 등 2004 Cell Chemical Biology 11:1651-1658에 기재된 것과 같은 CTLA-4의 소분자 저해제를 이용하는 것을 고려한다.
Figure pct00090
다른 소분자 CTLA-4 길항제로는 다음을 포함한다:
Figure pct00091
일 실시양태에서, 조합은 면역-DASH 저해제, 항-PD-1 항체 분자, 예를 들어 본원에 기재된 것, 및 항-CTLA-4 항체, 예를 들어 이필리무맙을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 용량은 약 1 내지 10 mg/kg, 예를 들어, 3 mg/kg의 항-PD-1 항체 분자의 용량, 및 약 3 mg/kg의 항-CTLA-4 항체, 예를 들어, 이필리무맙의 용량을 포함한다.
다른 예시적인 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제5,811,097호에 개시되어 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 면역 반응을 조정하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3 항체, 항-TIGIT 항체 또는 항-Siglec-15 항체이다.
일부 실시양태에서, LAG3 항체는 IMP701, IMP731, BMS-986016, LAG525, 및 GSK2831781이다. 일부 실시양태에서, LAG3 길항제는 가용성 LAG3 수용체, 예를 들어 IMP321을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 CD28 작동제, 4-1BB 작동제, OX40 작동제, CD27 작동제, CD80 작동제, CD86 작동제, CD40 작동제, 및 GITR 작동제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, OX40 작동제는 OX40 리간드, 또는 이의 OX40-결합 부분을 포함한다. 예를 들어, OX40 작동제는 MEDI6383일 수 있다. 일부 실시양태에서, OX40 작동제는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, OX40에 결합하는 항체는 MEDI6469, MEDI0562 또는 MOXR0916(RG7888)이다. 일부 실시양태에서, OX40 작동제는 OX40 리간드를 발현할 수 있는 벡터(예를 들어, 발현 벡터 또는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스)이다. 일부 실시양태에서, OX40-발현 벡터는 Delta-24-RGDOX 또는 DNX2401이다.
일부 실시양태에서, 4-1BB(CD137) 작동제는 안티칼린과 같은 결합 분자이다. 일부 실시양태에서, 안티칼린은 PRS-343이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 작동제는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB에 결합하는 항체는 PF-2566(PF-05082566) 또는 우렐루맙(BMS-663513)이다.
일부 실시양태에서, CD27 작동제는 CD27에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, CD27에 결합하는 항체는 바릴루맙(CDX-1127)이다.
일부 실시양태에서, GITR 작동제는 GITR 리간드 또는 이의 GITR-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, GITR 작동제는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, GITR에 결합하는 항체는 TRX518, MK-4166 또는 INBRX-110이다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 STING 작동제와, 바람직하게는 약제학적 조성물의 일부로서 조합된다. 사이클릭-다이-뉴클레오타이드(CDNs)인 사이클릭-다이-AMP( 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 다른 박테리아에 의해 생성됨) 및 이의 유사체인 사이클릭-다이-GMP 및 사이클릭-GMP-AMP는 Interferon Genes의 자극제(STING)로 알려진 병원체 인식 수용체(PRR)에 결합하는 병원체 연관 분자 패턴(PAMP)으로서 숙주 세포에 의해 인식된다. STING은 숙주 포유동물 세포의 세포질에 있는 어댑터 단백질로서, TANK 결합 키나제(TBK1)-IRF3 및 NF-κB 신호전달 축을 활성화시켜, 선천성 면역을 강하게 활성화시키는 IFN-β 및 다른 유전자 산물의 유도를 초래한다. 현재, STING은 숙주 시토졸 감시 경로(Vance 등, 2009)의 구성요소로서, 이는 세포내 병원체의 감염을 감지하고 반응에서 IFN-β의 생성을 유도하여, 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두뿐만 아니라 병원체-특이적 항체로 이루어지는 병원체-특이적 적응 보호 면역 반응의 발달을 야기하는 것으로 인식되어 있다. 미국 특허 제7,709,458호 및 제7,592,326호; PCT 공개 번호 WO2007/054279, WO2014/093936, WO2014/179335, WO2014/189805, WO2015/185565, WO2016/096174, WO2016/145102, WO2017/027645, WO2017/027646, 및 WO2017/075477; Yan 등, Bioorg. Med. Chem Lett. 18:5631-4, 2008.
예시적 조합
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암 및 림프종으로부터 선택되는 암의 치료에 사용되는, 항종양 백금 배위 복합체와 항-NTPDase3 항체의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트(BBR3464), 사트라플라틴, 테트라플라틴, 오르미플라틴, 아이프로플라틴, 네다플라틴 및 로바플라틴이 포함되지만, 이에 제한되지는 않다. 암 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암으로부터 선택되는 암의 치료에 특히 바람직한 것은 항-NTPDase3 항체와 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 사트라플라틴, 테트라플라틴, 오르미플라틴, 아이프로플라틴, 네다플라틴 및 로바플라틴과의 조합이고, 특히 더 바람직한 것은 시스플라틴 및 옥살리플라틴과의 조합이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 방광 암종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 식도암, 뇌암, 항문암, 백혈병 및 림프종으로부터 선택되는 암의 치료에 항대사물질과 항-NTPDase3 항체의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 시타라빈, 카페시타빈, 데시타빈, 플록스우리딘, 플루다라빈, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 랄티트렉시드, 클라드리빈, 클로파라빈, 머캅토퓨린, 펜토스타틴, 및 티오구아닌이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 암 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병 및 림프종으로부터 선택되는 암의 치료에 특히 바람직한 것은 항-NTPDase3 항체와 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 시타라빈, 카페시타빈, 데시타빈, 플록스우리딘, 플루다라빈, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 랄티트렉시드, 클라드리빈, 클로파라빈, 머캅토퓨린, 펜토스타틴 및 티오구아닌의 조합이고, 특히 더욱 바람직한 것은 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 시타라빈 및 메토트렉세이트와의 조합이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 전립선암, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병 및 림프종으로부터 선택되는 암의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 유사분열 저해제의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 암 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 전립선암, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 및 뇌암으로부터 선택되는 암의 치료에 특히 바람직한 것은 항-NTPDase3 항체와 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈의 조합이고, 특히 더 바람직한 것은 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴 및 비노렐빈과의 조합이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 방광 암종, 전립선암, 췌장 암종, 갑상선암, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 신경모세포종, 뇌암, 항문암, 고환암, 백혈병, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 항암 항생제의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 미톡산트론, 픽산트론, 발루비신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 악티노마이신 A 및 미트라마이신이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 미톡산트론, 픽산트론, 발루비신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 악티노마이신 D 및 미트라마이신과의 조합이, 보다 더욱 바람직하게는 다우노루비신, 독소루비신, 미토마이신 C 및 악티마이신 D와의 조합이 암의 치료, 보다 구체적으로, 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병, 및 림프종의 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 신경모세포종, 뇌암, 자궁경부암, 고환암, 백혈병 및 림프종의 치료에 항-NTPDase3 항체와 토포아이소머라제 I 및/또는 II 저해제의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 토포테칸, SN-38, 아이리노테칸, 캄프토테신, 루비테칸, 에토포사이드, 암사크린 및 테니포사이드가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는 PM00104, 또는 이의 약제학적 허용성 염과 토포테칸, SN-38, 아이리노테칸, 캄프토테신, 루비테칸, 에토포사이드, 암사크린 및 테니포사이드와의 조합이, 보다 더 바람직하게는 토포테칸, 아이리노테칸 및 에토포사이드와의 조합이 암 치료에, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암의 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 간세포암, 결장직장암, 뇌암, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 프로테오솜 저해제와의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 보르테조밉, 다이설피람, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 살리노스포라미드 A가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 보르테조밉, 다이설피람, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 살리노스포라미드 A의 조합이, 보다 더 바람직게는 보르테조밉과의 조합이 암 치료, 특히 폐암, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 간세포암, 결장직장암 및 뇌암 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암 및 림프종의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 히스톤 데아세틸라제 저해제와의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 로미뎁신, 파노비노스타트, 보리노스타트, 모세티노스타트, 벨리노스타트, 엔티노스타트, 레스미노스타트, PCI-24781, AR-42, CUDC-101 및 발프로산이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 로미뎁신, 파노비노스타트, 보리노스타트, 모세티노스타트, 벨리노스타트, 엔티노스타트, 레스미노스타트, PCI-24781, AR-42, CUDC-101 및 발프로산의 조합이, 보다 더 바람직하게는 보리노스타트와의 조합이 암 치료에, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암의 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 방광 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 백혈병, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 질소 머스타드 알킬화제와의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 멜팔란, 아이포스파미드, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 우라무스틴, 에스트라무스틴 및 벤다무스틴이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 멜팔란, 아이포스파미드, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 우라무스틴, 에스트라무스틴 및 벤다무스틴과의 조합이, 보다 더 바람직하게는 사이클로포스파미드와의 조합이 암 치료, 보다 특히 폐암, 육종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암 및 신장암의 치료에 좋다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 난소암, 유방암, 뇌암, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 니트로소우레아 알킬화제의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 로무스틴, 세무스틴, 카르무스틴, 포테무스틴 및 스트렙토조토신이 포함되지만, 이에 제한되지는 않다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 로무스틴, 세무스틴, 카르무스틴, 포테무스틴 및 스트렙토조토신의 조합이, 보다 더 바람직하게는 카르무스틴과의 조합이 암 치료, 보다 구체적으로, 폐암, 난소암 및 유방암의 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 폐암, 육종, 악성 흑색종, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병 및 림프종의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 비고전적 알킬화제의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 프로카바진, 다카바진, 테모졸로미드 및 알트레타민이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 프로카바진, 다카바진, 테모졸로미드 및 알트레타민의 조합이, 보다 더 바람직하게는, 다카바진과 테졸로미드와의 조합이 폐암, 육종, 악성 흑색종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암의 치료에 좋다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암 치료, 더욱 특히 유방암 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 에스트로겐 길항제와의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 토레미펜, 풀베스트란트, 타목시펜 및 나폭시딘이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 토레미펜, 풀베스트란트, 타목시펜 및 나폭시딘의 조합이, 보다 더 바람직하게는 타목시펜과의 조합이 유방암 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암 치료, 더욱 특히 전립선암 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 안드로겐 길항제의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 바이칼루타미드, 플루타미드, MDV3100 및 닐루타미드가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 바이칼루타미드, 플루타미드, MDV3100 및 닐루타미드와의 조합이, 보다 더 바람직하게는 플루타미드와의 조합이 전립선암의 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 더욱 특히 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 mTOR 저해제와의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, KU-0063794 및 WYE-354가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, KU-0063794 및 WYE-354의 조합이, 보다 더 바람직하게는, 템시롤리무스와의 조합이 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암 및 뇌암의 치료에 좋다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료, 더욱 특히, 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암으로부터 선택되는 암의 치료에 사용되는 항-NTPDase3 항체와 티로신 키나제 저해제와의 조합에 관한 것이다. 이 화학요법 그룹에는 에를로티닙, 소라페닙, 악시티닙, 보수티닙, 세디라닙, 크리조티닙, 다사티닙, 제피티닙, 아이마티닙, 카네르티닙, 라파티닙, 레스타우르티닙, 네라티닙, 닐로티닙, 세막사닙, 수니티닙, 바탈라닙 및 반데타닙이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 바람직하게는, 항-NTPDase3 항체와 에를로티닙, 소라페닙, 악시티닙, 보수티닙, 세디라닙, 크리조티닙, 다사티닙, 제피티닙, 아이마티닙, 카네르티닙, 라파티닙, 레스타우르티닙, 네라티닙, 닐로티닙, 세막사닙, 수니티닙, 바탈라닙 및 반데타닙과의 조합이, 보다 더 바람직하게는 에를로티닙과의 조합이 암의 치료에, 더욱 특히 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암으로부터 선택되는 암의 치료에 좋다.
본 발명에 의해 포괄되는 또 다른 측면은 MAP 키나제 경로 저해제 또는 WNT 경로 저해제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 한 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, MAP 키나제 경로 저해제는 BRAF 저해제, MEK 저해제, PI3K 저해제 및 c-KIT 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, BRAF 저해제는 GDC-0879, PLX-4720, 소라페닙 토실레이트, 다브라페닙 및 LGX818로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, MEK 저해제는 GSK1120212, 셀루메티닙 및 MEK162로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, WNT 경로 저해제는 β-카테닌 저해제 또는 프리즐드(frizzled) 저해제이다.
일부 실시양태에서, β-카테닌 저해제는 니클로사미드, XAV-939, FH 535 및 ICG 001로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 의해 포괄되는 또 다른 측면은 암 백신을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 한 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암 백신은 수지상 세포 백신이다.
본 발명에 의해 포괄되는 또 다른 측면은 환자에게 입양 세포 전이를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 한 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 입양 세포 전이는 CAR-T 세포 요법이다.
본 발명에 의해 포괄되는 또 다른 측면은 항체 요법을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의해 포괄되는 또 다른 측면은 항-NTPDase3 항체의 투여가 항체 요법의 항체-의존적 세포-매개 세포독성을 향상시키는, 전술한 방법 중 어느 한 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 항체 요법은 트라스투자맙, 세툭시맙, 베바시주맙 및 리툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 항-NTPDase3 항체를 사용한 치료는 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, 림포카인, 인터루킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)과 같은 다른 생물학적 분자와의 조합 치료를 포함할 수 있거나, 또는 종양의 외과적 제거, 암 세포의 제거, 또는 치료 의사가 필요하다고 간주하는 임의의 다른 요법에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 면역 반응 자극제이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴(EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 미오스타틴(GDF-8), NGF, 뉴로트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, P1GF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장 인자와 조합될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 면역 반응 자극제이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응 자극제는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 인터루킨 3(IL-3), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 1(IL-1) 또는 인터루킨 2(IL-2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
투여 일정
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 치료는 항-NTPDase3 항체를 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것을 수반한다. 항-NTPDase3 항체를 사용한 치료는 방사선 요법의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 발생할 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대한 투약 일정은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 치료는 항-바이러스 요법과 조합된 항-NTPDase3 항체의 투여를 수반한다. 항-NTPDase3 항체를 사용한 치료는 항바이러스 요법의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 발생할 수 있다. 조합 요법에 사용되는 항바이러스 약물은 대상체에게 감염된 바이러스에 따라 달라질 것이다.
조합 투여는 단일 약제학적 제형으로 또는 별도의 제형을 사용한 공동 투여, 또는 어느 한 가지 순서지만, 일반적으로 모든 활성제가 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 시간 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다.
항-NTPDase3 항체와 적어도 하나의 추가 치료제와의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 이전에 제2 치료제로 치료를 받은 환자에게 투여될 것이다. 특정 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 함께 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제(예를 들어, 화학요법)로 치료하는 동안 항-NTPDase3 항체를 제공받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 제2 치료제로 치료한 지 1년 이내에 투여될 것이다. 특정 대안적 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료 후 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 특정 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료 후 4, 3, 2, 또는 1주 이내에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 제2 치료제를 사용한 임의의 치료 후 5, 4, 3, 2, 또는 1일 이내에 투여될 것이다. 또한, 2개(또는 그 이상)의 작용제 또는 치료는 대략 몇 시간 또는 몇 분 이내에(즉, 실질적으로 동시에) 대상체에게 투여될 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
질병 치료의 경우, 항-NTPDase3 항체의 적절한 투여량은 치료할 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 질병의 반응성, 항-NTPDase3 항체가 치료 또는 예방 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 등에 따라 모두 담당 의사의 재량 하에 달라진다. 항-NTPDase3 항체는 한번에, 또는 수 일 내지 수 개월에 걸쳐 지속되는 일련의 치료 동안, 또는 치유가 이루어지거나 질병 상태의 축소(예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투약 일정은 환자의 체내 약물 축적 측정값으로부터 계산할 수 있으며 개별 작용제의 상대적 효능에 따라 달라진다. 담당 의사는 최적의 투여량, 투약 방법 및 반복률을 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여량은 0.01 μg 내지 100 mg/kg 체중, 0.1 μg 내지 100 mg/kg 체중, 1 μg 내지 100 mg/kg 체중, 1 mg 내지 100 mg/kg 체중, 1 mg 내지 80 mg/kg 체중, 10 mg 내지 100 mg/kg 체중, 10 mg 내지 75 mg/kg 체중, 또는 10 mg 내지 50 mg/kg 체중이다. 특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 0.1 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 0.25 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 0.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 1 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 1.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 2 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 2.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 7.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 10 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 12.5 mg/kg 체중이다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체의 투여량은 약 15 mg/kg 체중이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회 제공된다.
일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 초기에 더 높은 "부하(loading)" 용량으로 투여된 후, 1회 이상 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도도 변화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투약 요법은 초기 용량을 투여한 후, 추가 용량(또는 "유지" 용량)을 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 월 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투약 요법은 초기 부하 용량을 투여한 후, 매주 유지 용량을, 예를 들어, 초기 용량의 1/2로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투약 요법은 초기 부하 용량을 투여한 후, 유지 용량을, 예를 들어 초기 용량의 1/2로 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투약 요법은 3주 동안 3회의 초기 용량을 투여한 후, 유지 용량을, 예를 들어, 동일한 양으로 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 기술분야의 기술자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제의 투여는 부작용 및/또는 독성을 야기할 수 있다. 일부 경우에, 부작용 및/또는 독성은 너무 심하여, 특정 제제를 치료학적 유효량으로 투여하지 못하게 한다. 일부 경우에는 약물 요법을 중단해야 하며 다른 작용제가 시도될 수 있다. 하지만, 동일한 치료 부류의 많은 작용제는 종종 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내며, 이는 환자가 요법을 중단해야 하거나, 가능하다면 치료제와 연관된 불쾌한 부작용을 겪어야 한다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 투약 일정은 투여 또는 "주기"의 특정 수로 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상의 주기 동안 투여된다. 예를 들어, 항-NTPDase3 항체는 6주기 동안 2주마다 투여되고, 항-NTPDase3 항체는 6주기 동안 3주마다 투여되며, 항-NTPDase3 항체는 4주기 동안 2주마다 투여되고, 항-NTPDase3 항체는 4주기 동안 3주마다 등으로 투여된다. 투약 일정은 본 기술분야의 기술자에 의해 결정되고 후속적으로 수정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 항-NTPDase3 항체, 화학요법제 등의 투여와 연관된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 작용제를 투여하기 위한 간헐적 투약 전략을 사용하는 것을 포함하는 본원에 기재된 항-NTPDase3 항체를 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 치료적 유효량의 항-NTPDase3 항체를 치료적 유효량의 화학요법제와 조합으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 작용제 하나 또는 둘 모두는 간헐적 투약 전략에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투약 전략은 항-NTPDase3 항체의 초기 용량을 대상체에게 투여하고, 항-NTPDase3 항체의 후속 용량을 약 2주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투약 전략은 항-NTPDase3 항체의 초기 용량을 대상체에게 투여하고, 항-NTPDase3 항체의 후속 용량을 약 3주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투약 전략은 항-NTPDase3 항체의 초기 용량을 대상체에게 투여하고, 항-NTPDase3 항체의 후속 용량을 약 4주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 간헐적 투약 전략을 사용하여 투여하고 화학요법제는 매주 투여한다.
항감염 치료 조합
일 실시양태에서, 본 발명은 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 바이러스 감염을 앓고 있다. 일 실시양태에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 간염 바이러스(A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 라이노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 연체동물 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 또는 아르보바이러스성 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의한 감염이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 박테리아 감염을 앓고 있다. 일 실시양태에서, 박테리아 감염은 클라미디아, 리케차 박테리아, 마이코박테리아, 포도상구균, 연쇄상 구균, 폐렴구균, 수막구균 및 임균, 크렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 코리네박테리아 디프테리애, 살모넬라, 바실리, 비브리오 콜레라, 클로스트리디움 테타니, 클로스트리디움 보툴리눔, 바실러스 안트리시스, 예르시니아 페스티스, 마이코박테리움 레프레, 마이코박테리움 레프로마토시스, 및 보리엘라로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아에 의한 감염이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 진균 감염을 앓고 있다. 일 실시양태에서, 진균 감염은 칸디다(알비칸스, 크루세이, 글라브라타, 트로피칼리스 등), 크립토코커스 네오포르만스, 아스퍼질러스(후미가투스, 나이거 등), 무코랄레스 속(뮤코, 아비시디아, 리조푸스), 스포로트릭스 셴키(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스, 파라콕시디오이데스 브라질리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라즈마 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 진균에 의한 감염이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 항-NTPDase3 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 기생충 감염을 앓고 있다. 일 실시양태에서, 기생충 감염은 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 네글레리아 파울러리(Naegleria fowleri), 아칸타모에바( Acanthamoeba), 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트립파노소마 크루지, 리슈마니아 도노바니, 톡소플라즈마 곤디 및 니포스트롱기루스 브라질리엔시스로 이루어진 군으로부터 선택되는 기생충에 의한 감염이다.
VII. 항-NTPDase3 항체 접합체
본원에 개시된 항-NTPDase3 항체는 또한 화학적 모이어티에 접합될 수 있다. 화학적 모이어티는 특히 중합체, 방사성핵종 또는 세포독성 인자일 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 치료 모이어티, 즉 약물에 접합된 항-NTPDase3 항체를 제공한다. 치료 모이어티는, 예를 들어, 세포독소, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제제, 면역 자극제, 용해 펩타이드 또는 방사성동위원소일 수 있다. 이러한 접합체는 본원에서 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭된다. 따라서, 일 측면에서, 임의의 상기 기재된 측면 또는 실시양태에 따른 항-NTPDase3 항체는 치료 모이어티에 접합된다. 예시적인 치료 모이어티는 세포독성 모이어티, 방사성 동위원소, 사이토카인, 및 용해성 펩타이드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 세포독성 모이어티에 접합되거나 연관된 항체의 내재화에 의해 NTPDase3-발현 세포에서 세포독성을 유도할 수 있다. 세포독성 모이어티는, 예를 들어, 탁솔; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 에티듐 브로마이드; 에메틴; 미토마이신; 에토포사이드; 테노포사이드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜히친; 독소루비신; 다우노루비신; 다이하이드록시 안트라신 다이온; 메이탄신 또는 이의 유사체 또는 유도체와 같은 튜불린-저해제; 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 F 또는 이의 유사체 또는 유도체와 같은 유사분열 방지제; 돌라스타틴 10 또는 15 또는 이의 유사체; 아이리노테칸 또는 이의 유사체; 미톡산트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-데하이드로테스토스테론; 글루코코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리케아미신 또는 이의 유사체 또는 유도체; 메토트렉세이트, 6 머캅토퓨린, 6 티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5 플루오로우라실, 데카바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 젬시타빈 또는 클라드리빈과 같은 항대사물질; 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카바진(DTIC), 프로카바진, 미토마이신 C와 같은 알킬화제; 시스플라틴 또는 카보플라틴과 같은 백금 유도체; 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 SA, 라첼마이신(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 닥티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 아이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신(AMC)과 같은 항생제; 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀(PDB); 디프테리아 독소 및 관련 분자, 예컨대, 디프테리아 A 사슬 및 이의 활성 단편 및 혼성 분자, 리신 독소, 예컨대, 리신 A 또는 탈글리코실화된 리신 A 사슬 독소, 콜레라 독소, 시가(Shiga)-유사 독소, 예컨대, SLT I, SLT II, SLT IIV, LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크 프로테아제 저해제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, PAPI, PAPII 및 PAP-S와 같은 피톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I, 포도상구균 장독소 A; 포케위드 항바이러스 단백질; 디프테린 독소; 및 슈도모나스 내독소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 아우리스타틴 또는 이의 펩타이드 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해 및 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 밝혀졌으며(Woyke 등 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584), 항암(US5663149) 및 항진균 활성(Pettit 등, (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965)이 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라-아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴 유도체로는 AFP, MMAF(모노메틸 아우리스타틴 F), 및 MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E)를 포함한다. 적합한 아우리스타틴 및 아우리스타틴 유사체, 유도체 및 전구약물, 뿐만 아니라 아우리스타틴을 Ab에 접합시키기에 적합한 링커는, 예를 들어, 미국 특허 제5,635,483호, 제5,780,588호 및 제6,214,345호 및 국제 특허 출원 공개 WO02088172, WO2004010957, WO2005081711, WO2005084390, WO2006132670, WO03026577, WO200700860, WO207011968 및 WO205082023에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀(PDB) 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 적합한 PDB 및 PDB 유도체, 및 관련 기술은, 예를 들어, Hartley J. A. 등, Cancer Res 2010; 70(17): 6849-6858; Antonow D. 등, Cancer J 2008; 14(3):154-169; Howard P. W. 등, Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 6463-6466 및 Sagnou 등, Bioorg Med Chem Lett 2000; 10(18): 2083-2086에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 안트라사이클린, 메이탄신, 칼리케아미신, 듀오카르마이신, 라켈마이신(CC-1065), 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 아이리노테칸, 모노메틸 아우리스타틴 E, 모노메틸 아우리스타틴 F, PDB, 또는 이들의 임의의 유사체, 유도체 또는 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포독성 모이어티에 접합된다.
특정 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는 안트라사이클린 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 메이탄신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 칼리케아미신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 듀오카르마이신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 라켈마이신(CC-1065) 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 돌라스타틴 10 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 돌라스타틴 15 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 모노메틸 아우리스타틴 F 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 아이리노테칸 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다.
일 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체는 핵산 또는 핵산 연관 분자에 접합된다. 이러한 하나의 실시양태에서, 접합된 핵산은 세포독성 리보뉴클레아제(RNase) 또는 데옥시-리보뉴클레아제(예를 들어, DNase I), 안티센스 핵산, 저해성 RNA 분자(예를 들어, siRNA 분자) 또는 면역자극성 핵산(예를 들어, 면역자극성 CpG 모티프 함유 DNA 분자)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄되는 NTPDase3-특이적 항체는 앱타머 또는 리보자임에 접합된다.
일 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체는, 예를 들어, 융합 단백질로서, CLIP, Magainin 2, 멜리틴, Cecropin 및 P18과 같은 용해 펩타이드에 접합된다.
일 실시양태에서, 항-NTPDase3 항체는, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기세포 인자, 안세스팀 및 TNFα와 같은 사이토카인에 접합된다.
특정 실시양태에서, 화학적 모이어티는 대상체의 신체에서 항체 또는 단편의 반감기를 증가시키는 중합체이다. 적합한 중합체로는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, 분자량이 2kDa, 5kDa, 10kDa, 12kDa, 20kDa, 30kDa, 또는 40 kDa인 PEG), 덱스트란 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 친수성 중합체를 포함한다. Lee, 등, (1999)(Bioconj. Chem. 10:973-981)은 PEG 접합된 단일 사슬 항체를 개시한다. Wen, 등, (2001)(Bioconj. Chem. 12:545-553)은 방사성금속 킬레이터(다이에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA))에 부착된 PEG와의 접합 항체를 개시한다.
항-NTPDase3 항체는 또한 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, 및 56Fe와 같은 표지와 접합될 수도 있다.
항-NTPDase3 항체는 또한 형광단, 예컨대, 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 아이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈라데하이드, 플루오레스카민, 152Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 아이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디뮴 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 에쿠오린 표지, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 유리 라디칼을 포함하는 형광 또는 화학발광 표지와 접합될 수 있다.
본 발명에 의해 포괄되는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 다양한 모이어티에 접합시키기 위한 본 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 이는 Hunter, 등, (1962) Nature 144:945; David, 등, (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, 등, (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407에 기재된 방법을 포함한다. 항체 및 단편을 접합시키는 방법은 통상적이고 본 기술분야에 매우 잘 알려져 있다.
VIII. 약제학적 조성물
본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터는 조성물, 특히 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터의 치료적 또는 예방적 유효량을 적합한 담체, 예를 들어, 약제학적 허용성 작용제와의 혼합물로 포함한다. 전형적으로, 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터는 약제학적 조성물로 제형화되기 전에 동물에 투여하기에 충분하게 정제된다.
본 약제학적 조성물에 사용하기 위한 약제학적 허용성 작용제는 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁화제, 용매, 충전제, 증량제, 완충액, 전달 비히클, 장성 작용제, 공용매, 습윤제, 복합체화제, 완충액, 항미생물제 및 계면활성제를 포함한다.
중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 예시적인 적절한 담체이다. 약제학적 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 및/또는 Tween, 플루로닉(pluronics), 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 또한, 예로서, 적합한 장성 향상제로는 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 보존제로는 염화벤잘코늄, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 등을 포함한다. 과산화수소도 보존제로 사용될 수 있다. 적합한 공용매로는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 PEG를 포함한다. 적합한 복합체화제는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시-프로필-베타-사이클로덱스트린을 포함한다. 적합한 계면활성제 또는 습윤화제로는 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 80, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔 등을 포함한다. 완충액은 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 인산염, 중탄산염 또는 Tris-HCl과 같은 통상적인 완충액일 수 있다. 아세트산염 완충액은 약 pH 4-5.5일 수 있고, Tris 완충액은 약 pH 7-8.5일 수 있다. 추가 약제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990에 설명되어 있다.
조성물은 액체 형태 또는 동결건조(lyophilized) 또는 동결 건조(freeze-dried) 형태일 수 있고, 하나 이상의 동결보호제, 부형제, 계면활성제, 고분자량 구조 첨가제 및/또는 증량제를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,685,940호, 제6,566,329호 및 제6,372,716호 참조). 일 실시양태에서, 수크로스, 락토스 또는 트레할로스와 같은 비환원당인 동결보호제가 포함된다. 일반적으로 포함되는 동결보호제의 양은 재구성 시 최종 생성된 제형이 등장성일 정도이지만, 고장성 또는 약간 저장성 제형도 적합할 수 있다. 또한, 동결보호제의 양은 동결건조 시 단백질의 허용할 수 없는 양의 분해 및/또는 응집을 방지하기에 충분해야 한다. 사전 동결건조된 제형에서 당(예를 들어, 수크로스, 락토스, 트레할로스)의 예시적인 동결보호제 농도는 약 10mM 내지 약 400mM이다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제, 예를 들어 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 폴리(에틸렌 글리콜) 페닐 에테르(예를 들어, Triton); 소듐 도데실 설페이트(SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 놀레아미도프로필-(Hnoleamidopropyl-), 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 아이소스테아르아미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 아이소스테아르아미도프로필-다이메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 다이소듐 메틸 오페일-타우레이트; 및 MONAQUAT™. 시리즈(Mona Industries, Inc., 뉴저지주 페터슨 소재), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들어, Pluronics, PF68 등)가 포함된다. 사전-동결건조된 제형에 존재할 수 있는 계면활성제의 예시적인 양은 약 0.001-0.5%이다. 고분자량 구조 첨가제(예를 들어, 충전제, 결합제)는, 예를 들어, 아카시아, 알부민, 알긴산, 인산칼슘(이염기성), 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 덱스트란, 덱스트린, 덱스트레이트, 자당, 틸로스, 사전젤라틴전분, 황산칼슘, 아밀로스, 글리신, 벤토나이트, 말토스, 소르비톨, 에틸셀룰로오스, 인산수소이나트륨, 인산이나트륨, 피로아황산이나트륨, 폴리비닐알코올, 젤라틴, 포도당, 구아검, 액상포도당, 압축당, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 말토덱스트린, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리메타크릴레이트, 포비돈, 알긴산나트륨, 트라가칸트 미세결정질 셀룰로오스, 전분 및 제인을 포함할 수 있다. 고분자량 구조 첨가제의 예시적인 농도는 0.1 중량% 내지 10 중량%이다. 다른 실시양태에서, 증량제(예를 들어, 만니톨, 글리신)가 포함될 수 있다.
조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 예시적인 조성물은 관절내, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내 또는 병변내 경로와 같은 숙련된 작업자에게 이용가능한 임의의 경로에 의해 동물에 주사 또는 주입하기에 적합하다. 비경구 제형은 전형적으로 약제학적 허용성 보존제를 선택적으로 함유하는 멸균된, 발열원 없는 등장성 수성 용액일 것이다.
비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체로는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어, 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락트산 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클로는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대, 링거 덱스트로스를 기반으로 하는 것 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제도 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds., 1980을 참조한다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 생성물의 국소 농도(예를 들어, 볼러스, 데포 효과)를 제공하고 및/또는 특정 국소 환경에서 증가된 안정성 또는 반감기를 제공하는 방식으로 제어 또는 지속 전달용으로 제형화될 수 있다. 조성물은 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터의 제형을, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제제, 뿐만 아니라 생분해성 매트릭스, 주사가능한 미세구체, 미세캡슐 입자, 미세캡슐, 생체침식성 입자 비드, 리포솜, 및 이후에 데포 주사로 전달될 수 있는 활성제의 제어 또는 지속 방출을 제공하는 이식가능한 전달 장치와 같은 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 지속 또는 제어 전달 수단을 제형화하는 기술이 알려져 있고 약물의 제어 방출 및 전달을 위해 다양한 중합체가 개발되어 사용되고 있다. 이러한 중합체는 전형적으로 생분해성 및 생체적합성이다. 거울상이성질체 중합체 또는 폴리펩타이드 단편의 복합체화에 의해 형성된 것을 포함하는 중합체 하이드로겔, 및 온도 또는 pH 민감성 특성을 갖는 하이드로겔은 생체활성 단백질 작용제(예를 들어, 항체)의 포획에 연루된 온화한 수성 조건 때문에 약물 데포 효과를 제공하는 데 바람직할 수 있다. 예를 들어, PCT 출원 공개 WO 93/15722에 있는 약제학적 조성물의 전달을 위한 제어 방출 다공성 중합체 미세입자의 설명을 참조한다.
이러한 목적에 적합한 물질은 폴리락타이드(예를 들어, 미국 특허 제3,773,919호 참조), 폴리-(a-하이드록시카복실산)의 중합체, 예컨대 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 133,988A), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman 등, Biopolymers, 22:547-556(1983)), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer 등, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981), 및 Langer, Chem. Tech., 12: 98-105(1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(~)~3-하이드록시부티르산을 포함한다. 다른 생분해성 중합체로는 폴리(락톤), 폴리(아세탈), 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(오르토카보네이트)를 포함한다. 지속 방출 조성물은 또한 본 기술분야에 공지된 임의의 여러 방법에 의해 제조될 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다(예를 들어, Eppstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985) 참조). 담체 자체 또는 이의 분해 산물은 표적 조직에서 무독성이어야 하며 상태를 더 이상 악화시키지 않아야 한다. 이것은 표적 장애의 동물 모델에서 또는 이러한 모델이 이용가능하지 않다면, 정상 동물에서 일상적인 선별에 의해 결정될 수 있다. [00196] 지속 방출을 위한 재조합 단백질의 미세캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN--), 인터루킨-2 및 MNrgpl20으로 성공적으로 수행되었다. Johnson 등, Nat. Med., 2:795-799(1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223(1993); Hora 등, Bio/Technology. 8:755-758(1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 및 Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국 특허 제5,654,010호. 이러한 단백질의 지속 방출 제형은 생체적합성 및 광범위한 생분해 특성으로 인해 폴리-락트산-코글리콜산(PLGA) 중합체를 사용하여 개발되었다. PLGA, 락트산 및 글리콜산의 분해 산물은 인체 내에서 신속하게 제거될 수 있다. 또한, 이 중합체의 분해성은 분자량 및 조성에 따라 달라질 수 있다. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin 및 R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41. 지속 방출 조성물의 추가 예는, 예를 들어, EP 58,48 IA, 미국 특허 제3,887,699호, EP 158,277A, 캐나다 특허 제1176565호, U. Sidman 등, Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langer 등, Chem. Tech. 12, 98 [1982], Sinha 등, J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu 등, Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000] 및 Dai 등, Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 [2005]를 포함한다.
생체접착성 중합체는 또한 본 발명에 의해 포괄되는 조성물에 또는 조성물과 함께 사용하기 위해 고려된다. 생체접착제는 장기간 동안 생물학적 기질에 접착할 수 있는 합성 및 자연 발생 물질이다. 예를 들어, 카보폴(Carbopol) 및 폴리카보필(polycarbophil)은 모두 폴리(아크릴산)의 합성 가교 유도체이다. 자연 발생 물질을 기반으로 하는 생체접착성 전달 시스템은, 예를 들어, 히알루로난으로도 알려진 히알루론산을 포함한다. 히알루론산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 잔기로 이루어지는 자연 발생의 뮤코다당류이다. 히알루론산은 척추동물의 세포외 조직 기질, 예를 들어, 결합 조직, 뿐만 아니라 활액, 및 눈의 유리체 및 수양액에서 발견된다. 히알루론산의 에스테르화된 유도체는 생체적합성 및 생분해성 전달에 사용하기 위한 미세구체를 생성하는 데 사용되었다(예를 들어, Cortivo 등, Biomaterials(1991) 12:727-730; 유럽 공개 번호 517,565; 국제 공개 번호 WO 96/29998, Ilium 등, J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141 참조). 본 발명에 의해 포괄되는 예시적인 히알루론산 함유 조성물은 히알루론산 중합체에 대해 대략 0.1% 내지 약 40%(w/w)의 IL-1/3 결합 항체 또는 단편의 양으로 히알루론산 에스테르 중합체를 포함한다. [00198] 생분해성 및 비-생분해성 중합체 매트릭스는 모두 본 발명에 의해 포괄되는 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 중합체 매트릭스는 천연 또는 합성 중합체를 포함할 수 있다. 생분해성 매트릭스가 바람직하다. 방출이 일어나는 기간은 중합체의 선택을 기반으로 한다. 전형적으로, 몇 시간에서 3개월 내지 12개월 사이의 기간 동안의 방출이 가장 바람직하다. 생분해성 전달 시스템을 형성하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 합성 중합체는 다음을 포함한다: 락트산과 글리콜산의 중합체, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리-비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리무수물, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체, 폴리(부트산), 폴리(발레르산), 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 니트로 셀룰로오스, 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 중합체, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 하이드록시부틸 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 카복실에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트, 셀룰로오스 설페이트 나트륨 염, 폴리(메틸 메타크릴레이트) , 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(아이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(아이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸렌 옥사이드), 폴리에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리비닐 아세테이트, 폴리 비닐 클로라이드, 폴리스티렌 및 폴리비닐피롤리돈. 예시적인 천연 중합체로는 알기네이트 및 덱스트란 및 셀룰로스를 포함하는 다른 다당류, 콜라겐, 이의 화학적 유도체(화학적 기의 치환, 첨가, 예를 들어, 알킬, 알킬렌, 하이드록실화, 산화, 및 본 기술분야의 기술자에 의해 일상적으로 이루어지는 다른 변형), 알부민 및 다른 친수성 단백질, 제인 및 다른 프롤라민 및 소수성 단백질, 이들의 공중합체 및 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 이러한 물질은 효소 가수분해 또는 생체내 물에 대한 노출, 표면 또는 벌크 침식에 의해 분해된다. 중합체는 선택적으로, 하이드로겔 형태(예를 들어, WO 04/009664, WO 05/087201, Sawhney, 등, Macromolecules, 1993, 26, 581-587)이며, 이는 물에서 자신의 중량의 최대 약 90%를 흡수할 수 있고, 또한, 선택적으로 다가 이온 또는 다른 중합체와 가교된다.
전달 시스템은 또한 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르와 같은 스테롤 및 지방산, 또는 중성 지방, 예컨대, 모노-, 다이- 및 트리-글리세라이드를 포함하는 지질인 비중합체 시스템; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩타이드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용한 압축 정제; 부분적으로 융합된 임플란트 등을 포함한다. 구체적인 예로는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: (a) 미국 특허 제4,452,775호, 제4,675,189호 및 제5,736,152호에 기재된 것과 같은 매트릭스 내의 형태로 생성물이 함유된 침식성 시스템, 및 (b) 미국 특허 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호에 기재된 것과 같은 중합체로부터 제어된 속도로 생성물이 투과하는 확산 시스템. 생성물을 함유하는 리포솜은, 예를 들어, (DE 3,218,121; Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034(1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허출원 83-118008; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324)와 같은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 조성물은 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터가 상부에 흡수되거나 캡슐화된, 막, 스폰지 또는 다른 적절한 물질이 환부 영역 내로 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관에 이식될 수 있으며, 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터의 전달은 볼루스를 통해, 연속 투여를 통해, 또는 연속 주입을 사용하는 카테터를 경유하여 장치를 통해 직접적으로 이루어질 수 있다.
본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 건조 분말 등으로서 흡입용으로 제형화될 수 있다. 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위해 액화 추진제에 제형화될 수 있다. 또 다른 제형에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여를 위한 추가 약제학적 조성물은, 예를 들어, 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 개시하는 PCT 출원 공개 WO 94/20069에 기재된 것을 포함한다. 폐 전달의 경우 입자 크기는 원위 폐까지 전달되기 위해 적당해야 한다. 예를 들어, 입자 크기는 1μm 내지 5μm일 수 있지만; 예를 들어, 각 입자가 상당히 다공성인 경우에는 더 큰 입자가 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터를 함유하는 특정 제형은 경구 투여될 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 제형은 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여 형태의 배합에 통상적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 사전전신 분해가 최소화되는 위장관의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 선택적 결합제의 흡수를 용이하게 하기 위해 추가 작용제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
다른 제제는 정제의 제조에 적합한 무독성 부형제와의 혼합물에 본 발명에 의해 포괄되는 항-NTPDase3 항체, 항체 단편, 핵산, 또는 벡터의 유효량을 수반할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 다른 적절한 비히클에 용해시켜 용액을 단위 용량 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘과 같은 불활성 희석제; 또는 전분, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제; 또는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 탈크와 같은 윤활제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
IX. 예시적인 방법
재료 및 방법
시약
모든 화학 시약은 달리 명시되지 않는 한, Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입했고, 세포 배양 배지는 Life Technologies(캘리포니아주 칼스배드 소재)에서, 세포 배양 소모품은 CELLTREAT® Scientific Products(매사추세츠주 셜리 소재)에서, 상업용 항체는 Biolegend(캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 구입했다. Alexa Fluor® 488-접합된 AffinityPure 당나귀 항-인간 IgG(Fc 특이적)(#709-545-098, Alexa Fluor® 488-접합된 항토끼 IgG(H+L)(#711-545-152), 비오틴-SP-접합된 AffinPure F(ab')2 단편 당나귀 항토끼 IgG(H+L)(#711-066-152), 비오틴-SP-접합된 AffinPure F(ab')2 단편 당나귀 항인간 IgG(H+L)(#709-066-149)를 포함하는 2차 항체는 Jackson ImmunoResearch(펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)에서 입수했고, CellTiter-Glo®(#G7571) 및 Bio-Glo™(#G7941)는 Promega(위스콘신주 매디슨 소재)에서 입수했고, 마우스 항-hENTPD3 클론 hN3-B3s는 Ectonocleotidases-ab(Cat# hN3-B3s; 캐나다 퀘벡)에서 입수했다.
세포 배양
인간 ENTPD3이 안정적으로 형질감염된 중국 햄스터 난소 세포(CHO-ENTPD3)를 10% 소태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. hENTPD3을 내인적으로 발현하는 인간 방광 암종 세포(RT4; ECACC; Sigma #91091914)를 McCoy's 5a + 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신에서 성장시켰다. 실험에 사용하기 전에 37℃ 수조에서 해동시킨, Jurkat 세포/NFAT-luc+FcγRIIIA(Promega Cat#: G7011)를 제외한, 모든 세포주는 37℃, 5% CO2 대기, 100% 습도의 배양 플라스크에 유지시켰다.
인간 ENTPD3을 발현하는 세포주에 대한 단클론 항체 친화도
hENTPD3으로 형질감염되거나 내인적으로 발현하는 세포(1X105 세포)를 4℃에서 30분 동안 연속 희석된 단클론 항체와 함께 항온처리하고, 그 다음 세포 염색 완충액으로 2회 세척했다. 세포를 그 다음 항-인간 IgG(Fc 특이적) Alexa Fluor® 488(1:5000)과 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, 그 다음, 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고 Cytek™ Aurora 유세포 분석(Cytek Biosciences, 캘리포니아주 프레몬트 소재)으로 분석했다. Alexa Fluor® 488(AF488) 중앙 형광 강도(MFI)를 검출했고 데이터는 FCS Express 7 소프트웨어(De Novo Software, 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)로 분석했다.
온전한 세포에 대한 인간 ENTPD3 효소 활성의 저해
CHO-hENTPD3 세포(8X104 세포/웰) 및 RT4 방광 암세포(3X105 세포/웰)를 트립신처리하고, 계수하고, 96웰 플레이트 U 바닥에 플레이팅했다. 현탁 세포를 변형된 링거 완충액(RB)(120mM NaCl, 5mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 25mM NaHCO3, 10mM 덱스트로스, 80mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 2회 세척하고, 단클론 항체와 함께 37℃에서 30분 동안 항온처리했다. 그 다음, CHO-hENTPD3 세포를 실온에서 15분 동안 ATP 250μM과 함께 항온처리하는 한편, RT4는 ATP 50μM과 함께 37℃에서 45분 동안 항온처리했다. 상청액은 최종적으로 96웰 불투명 벽의 다중웰 플레이트(BRANDplates #781968)에 수집했고, ATP 수준을 CellTiter-Glo®를 사용하여 발광으로 검출했다. 발광 값은 Synergy™ Neo2 다중 모드 판독기(BioTeK Instruments Inc., 버몬트주 위누스키 소재)에서 판독했고, ATP 수준과 직접적인 상관관계가 있다. 항체가 없는 세포(세포 + ATP) 또는 세포가 없는 ATP 단독을 대조군으로 제공했다. 결과는 상대적 발광 단위 (RLU) 또는 [(세포 + ATP + Ab) - (세포 + ATP)/(ATP) - (세포 + ATP)] X 100에 의해 계산된 효소 활성 저해 %로 표현되었다. 모든 단계는 RB에서 수행되었다.
부착된 RT4 세포에 대한 효소 활성은 세포(1.5X105 세포/웰)를 96웰 평편 바닥 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 항온처리하고, 25μM의 ATP에 37℃에서 45분 동안 노출시키는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 수행했다. 명확히 하기 위해, 본원에 기재된 NTPD3 효소 활성 저해의 모든 백분율 값은 100% 대비 저해 백분율을 나타낸다(예를 들어, 도 5에 나타낸 41의 값은 100% 활성의 기준선과 비교하여 41%의 효소 활성의 저하를 나타낸다).
NFAT 루시페라제 리포터 Jurkat 시스템(ADCC 검정)
표적 세포(CHO-hENTPD3)를 96웰 플레이트에 접종(8X103 세포/100μl/웰)(BRANDplates #781965)에 접종하고 24 시간 동안 성장시켰다. 그 다음, 세포를 ADCC 검정 완충액(4% 초저 IgG 혈청이 보충된 DMEM 배지)으로 2회 세척하고 연속 희석된 단클론 항체와 함께 37℃에서 30분 동안 항온처리했다. 이펙터 세포(Jurkat 세포/NFAT-luc+FcγRIIIA)(3X106 세포/ml)를 그 다음 웰에 첨가하고 혼합물(T:E=1:6)을 37℃에서 6시간 동안 항온처리했다. Bio-Glo™를 최종적으로 웰에 첨가하고 Synergy™ Neo2 Multi-Mode Reader(BioTeK Instruments Inc.)를 사용하여 5, 15 및 30분에 발광 값을 판독했다. ADCC 활성은 배경에 비해 루시페라제 활성의 증가로 나타내었다.
에피토프 경쟁 검정
항-hENTPD3 단클론 항체(클론 3E9, 38D5, 38D12, 44H5 및 PBI#30)를 제조업체의 지침(Thermo Fisher Scientific #A20186)에 따라 항체 라벨링 키트를 사용하여 Alexa Fluor® 647과 접합시켰다. 접합되지 않은 인간 IgG1 아이소타입 대조군 또는 항-hENTPD3 단클론 항체(20 μg/mL)를 4℃에서 30분 동안 CHO-hENTPD3 세포(1X105 세포)와 함께 항온처리했다. 다음으로, Alexa Fluor® 647-접합 항-hENTPD3 단클론 항체(3E9 1:1000; 38D5, 38D12 및 44H5 1:800; 및 PBI#30 1:400)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 항온처리했다. 그런 다음 세포를 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고 Cytek™ Aurora 유세포 분석(Cytek Biosciences)로 분석했다. Alexa Fluor® 647(AF647) 중앙 형광 강도(MFI)가 검출되었고 FCS Express 7 소프트웨어(De Novo Software)로 데이터를 분석했다. 아이소타입 대조군과 관련하여 AF647 MFI 검출의 배수 변화를 계산했다(에피토프 중첩 없음 = 1).
동물 연구
C57BL6 hENTPD3 KI 마우스는 Beth Israel Deaconess Medical Center로부터 허가를 받았다. 6 내지 8주령의 암컷 마우스를 종양 접종에 사용했다. 동계 뮤린 MC38 결장직장암 세포는 10% FBS, 페니실린(100 단위/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다. MC38 세포 5X105개를 트립신 처리로 수확하고 주사용을 위해 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 150μl로 재현탁했다. MC38 세포를 hENTPD3 KI 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사했다. 그런 다음 마우스를 무작위로 3그룹으로 나누었다(n = 6). 4일째에, 종양 보유 마우스는 20 mg/kg의 키메라 항체 38D5 또는 8E1, 또는 200 μl의 식염수를 복강내 주사를 통해 투여받았다. 7, 10 및 14일에 종양 보유 마우스에 10 mg/kg의 38D5 또는 8E1 항체 또는 200μl의 식염수를 투여했다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 주 2회 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
통계 분석
GraphPad Prism 8(GraphPad Software, 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 통계 분석을 수행했다.
클론 PBI#30, 8E1 및 38D5와 같은 부모 클론의 인간화, 친화도 성숙 및/또는 아이소타입 전환 변이체와 같은 선별된 항-ENTPD3 항체 기능성의 기능성 검정을 포함하는 추가 검정 방법을 추가로 사용하고 보완된 실험 절차는 다음과 같다:
시약
정상 인간 혈청(#A113)은 CDC 검정을 위해 Quidel Corporation(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입했다.
세포 배양
인간 ENTPD3이 안정적으로 형질감염된 중국 햄스터 난소(CHO-hENTPD3), COS7(COS7-hENTPD3) 및 HEK293T(HEK293T-hENTPD3) 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. 모든 세포주는 배양 플라스크에서 37℃, 5% CO2 대기, 100% 습도로 유지시켰다. 이들 3개의 세포주는 상이한 수준의 hENTPD3을 발현한다: HEK293T-hENTPD3(매우 높음) > CHO-hENTPD3(높음) > COS7-hENTPD3(중간). HEK293T-hENTPD3 세포는 매우 높은 수준의 hENTPD3 효소 활성을 함유하여, 외인성 ATP를 매우 급속하게 분해하며, 이는 생리학적으로 관련이 없는 것으로 간주된다. COS7-hENTPD3 세포에 대한 hENTPD3 발현/효소 활성 수준은 RT4 인간 방광암 세포(hENTPD3를 내인적으로 발현함)에 대한 것과 유사하다. RT4 세포의 배양/작업의 기술적 어려움으로 인해, ENTPD3 발현/효소 활성에 대해 일치하는 2개의 생리학적으로 관련된 세포주 COS7-hENTPD3 및 CHO-hENTPD3 세포를 각각 종양 미세환경에서 ENTPD3+ 및 ENTPD3high 세포를 대표하는 것으로서, 시험관내 결합 및 기능 검정을 위해 선택했다.
인간 ENTPD3을 발현하는 세포주에 대한 단클론 항체 친화도
hENTPD3(1X105개 세포)로 형질감염된 세포를 37℃에서 2시간 동안 연속 희석된 단클론 항체와 함께 항온처리한 후, 세포 염색 완충액으로 2회 세척했다. 모든 후속 절차 및 분석은 위에서 설명한 것과 동일했다.
온전한 세포에 대한 인간 ENTPD3 효소 활성의 저해
세포를 트립신처리하고, 계수하고, 96-웰 플레이트-U 바닥에 플레이팅했다(8X104개 세포/웰). 현탁 세포는 그 다음 완전 배양 배지에서 37℃에서 2시간 동안 단클론 항체와 함께 항온처리했다. 모든 후속 절차 및 분석은 위에서 설명한 것과 동일했다.
보체 의존적 세포독성(CDC) 검정
CHO-hENTPD3 세포를 무혈청 RPMI 1640 배지로 2회 세척하고, 2X106/ml의 최종 농도로 CDC 검정 완충액(4% 초저 IgG FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지)에 재현탁시키고, 얼음 위에서 2 내지 3시간 동안 방치했다. 그 다음, 세포를 연속 희석된 단클론 항체와 함께 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 항온처리했다. 그 다음, 정상 인간 혈청(NHS 10%)을 세포에 첨가하고 5% CO2, 37℃에서 2시간 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 세포를 실온에서 10분 동안 요오드화 프로피듐(P/I)(200 ng/mL)으로 염색하고, 표적 세포 사멸을 Cytek Aurora 유세포 분석법(Cytek Biosciences)으로 분석했다. 결과는 세포독성 %(P/I+ 세포) 및 배경 대비 최대 세포독성 %(1 μg/mL에서의 최대 세포독성 % - 배경 세포독성 %)로 표현했다.
안정적인 면역복합체 검정
도 50은 본 발명의 예시적인 항-ENTPD3 단클론 항체에 대한 것으로, COS7-hENTPD3 세포를 트립신처리하고, 계수하고, 48-웰 플레이트에 플레이팅(3X104개 세포/웰)하고, 밤새 성장시켰다. 부착된 세포를 그 다음 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항-인간 ENTPD3 항체(6 μg/ml)와 함께 항온처리하거나 처리하지 않은 상태로 두었다. 다음날, 처리되지 않은 세포를 동일한 패널의 단클론 항체(6 μg/ml)에 노출시켰지만, 37℃에서 2시간 동안 노출시켜 ENTPD3 발현의 기본 수준을 수득했다. 그런 다음, 세포를 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고 4℃에서 30분 동안 항-인간 IgG(Fc 특이적) Alexa Fluor 488(1:2000)로 염색한 다음, PBS 1X로 2회 추가 세척하고 트립신처리했다. 세포가 분리되면, 배양 배지를 플레이트에 첨가하고 세포를 96 U-웰 미처리 플레이트(Corning #3365)로 옮겼다. 마지막으로, 세포를 1200rpm에서 5분 동안 스핀다운시키고, 세포 염색 완충액에 재현탁하고, Cytek Aurora 유세포 분석(Cytek Biosciences)로 분석했다. Alexa Flour 488(AF488) MFI가 검출되었고 FCS Express 7 소프트웨어(De Novo Software)로 데이터를 분석했다. 24시간째에 세포막에서 인간 ENTPD3 손실의 백분율은 [(2시간 MFI - 24시간 MFI/2시간 MFI)]X100으로 계산했다.
도 51은 본 발명의 다른 대상 항-ENTPD3 단클론 항체에 대한 것으로, CHO-hENTPD3 세포를 트립신 처리하고, 계수하고, 세포 부착을 피하기 위해 96 U-웰 미처리 플레이트(Corning #3365)에 플레이팅(5X105개 세포/mL)했다. 그런 다음 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항-인간 ENTPD3 인간/토끼 키메라 항체(2 μg/ml)와 함께 항온처리하거나 처리되지 않은 상태로 두었다. 다음 날, 처리되지 않은 세포는 단클론 항체의 동일한 패널(2 μg/ml)에 노출시켰지만 ENTPD3 발현의 기본 수준을 얻기 위해 4℃에서 20분 동안 노출시켰다. 그 다음, 세포를 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고 항-인간 IgG(Fc 특이적) Alexa Fluor 488(1:2000)로 4℃에서 30분 동안 염색한 후, 추가로 2회 세척하고 파라포름알데하이드(PFA, 2%)로 실온에서 10분 동안 고정시켰다. 마지막으로, 세포를 2회 세척하고 Cytek Aurora 유세포분석법(Cytek Biosciences)으로 분석했다. Alexa Fluor 488(AF488) MFI를 검출했고, 데이터는 FCS Express 7 소프트웨어(De Novo Software)로 분석했다. 24시간째에 세포막에서 인간 ENTPD3의 손실 백분율은 [(20분 MFI - 24시간 MFI/20분 MFI)]X100으로 계산했다.
반복 항체 처리 후 종양 보유 마우스의 혈장 중의 유리 항체 검출
PBI#30 성숙 변이체인 경우: C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스(13-16주령)에 150μl의 RPMI 1640 배지 중 MC38 결장직장암 세포(1X105)를 피하 접종했다. 종양 보유 마우스는 3 mg/kg의 완전 인간 항-hENTPD3 항체 PBI#3af4 hIgG1 또는 PBI#3af4 hIgG4를 8일, 12일, 15일, 18일 및 21일째에 복강내 주사를 통해 투여받았다. 혈장 샘플을 20일, 21일, 22일 및 24일째에 수집했고, 추가 분석까지 -80℃에 보관했다. 투약일에 용량 투여 전에 혈장을 수집했고, 수집일마다 샘플 분석에 2마리의 다른 동물을 처리했다(샘플명은 동물 번호 + 수집 날짜로 지정함). 상기 "인간 ENTPD3을 발현하는 세포주에 대한 단클론 항체 친화도"라는 새로운 섹션에 기재된 바와 같이 연속 희석된 혈장을 COS7-hENTPD3 세포와 함께 항온처리하고 세포 결합 활성을 분석하여 혈장에서 추정되는 유리 항체 수준을 검출했다.
인간화 38D5 hIgG1의 경우: C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스(9주령)에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(1X105)를 피하 접종했다. 종양 보유 마우스는 복강내 주사를 통해 12일, 15일, 18일 및 21일째에 3 mg/kg의 38D5 hIgG1을 투여받았다. 혈장 샘플을 19일, 21일 및 23일에 수집하고, 추가 분석까지 -80℃에서 보관했다. 투약일에 용량 투여 전 혈장을 수집했고, 수집일마다 샘플 분석에 2 내지 3마리의 다른 동물을 처리했다(샘플명은 동물 번호 + 수집 날짜로 지정함). 전술한 PBI#30 성숙 변이체에서와 같은 방식으로 혈장에서 추정되는 유리 항체 수준을 검출했다.
단일 용량 항체 처리 후 무종양 마우스의 혈장에서 유리 항체의 검출
C57BL6 hENTPD3 KI 무종양 암컷 마우스(9주령)는 복강내 주사를 통해 38D5 hIgG1의 1 또는 10 mg/kg 용량을 1회 용량으로 투여받았다. 이 실험에는 각 투여량에 대해 1마리씩 총 2마리의 마우스를 사용했다. 혈장 샘플은 24시간 및 48시간 후 각 마우스로부터 수집했고 추가 분석까지 -80℃에 보관했다(샘플명은 주입된 용량 + 수집 시간으로 지정됨). 혈장에서 추정되는 유리 항체 수준은 상기 섹션에 기재된 바와 같이 검출했다.
동물 연구
추가 생체내 연구는 PBI#30 hIgG1 및 이의 친화도 성숙 변이체 PBI#30af4 hIgG1 및 PBI#3af4 hIgG4, 뿐만 아니라 인간화 38D5 hIgG1 및 38D5 hIgG4에 대해 수행했다. C57BL6 hENTPD3 KI 마우스는 Beth Israel Deaconess Medical Center로부터 허가를 받았으며 Purinomia Animal Facility에서 사내 사육되었다. 동계 뮤린 MC38 결장직장암 세포는 10% FBS, 페니실린(100 단위/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지되었다.
PBI#3af4 hIgG1 및 PBI#3af4 hIgG4 성숙 변이체의 경우: 13 내지 16주령의 C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(1X105)를 피하 접종했다. 그런 다음 마우스를 무작위로 3 그룹으로 나누었다(그룹당 n = 8). 종양 보유 마우스는 8일, 12일, 15일, 18일 및 21일째에 복강내 주사를 통해 3 mg/kg의 완전 인간 항-hENTPD3 항체 PBI#3af4 hIgG1 또는 PBI#3af4 hIgG4 또는 식염수 200 μl를 투여받았다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 2일마다 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
PBI#30 hIgG1 및 인간화 38D5 hIgG1 및 38D5 hIgG4 항체의 경우: 6 내지 8주령의 C57BL6 hENTPD3 KI 암컷 마우스에 150μl의 RPMI 1640 배지 중의 MC38 결장직장암 세포(5X105)를 피하 접종했다. 그런 다음 마우스를 무작위로 2그룹으로 나누었다(그룹당 n = 5). 4일째에, 종양 보유 마우스는 20 mg/kg의 PBI#30 hIgG1 또는 인간화 38D5 hIgG1 또는 38D5 hIgG4 항체, 또는 200μl의 식염수를 복강내 주사를 통해 투여받았다. 7일, 10일 및 14일째에 종양 보유 마우스에 각각의 항-ENTPD3 항체 10 mg/kg 또는 식염수 200μl를 투여했다. 종양 길이(L)와 폭(W)은 주 2회 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 부피(mm3)는 L*W*W*0.52로 결정되었다.
Figure pct00092
참고 통합
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 특이적이고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시되었을 지라도 전체가 참고로 포함된 것이다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함한 본 출원이 우선한다.
또한, 월드와이드웹(World Wide Web) 상의 The Institute for Genomic Research(TIGR) 및/또는 월드와이드웹 상의 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 유지 관리하는 것과 같은 공개 데이터베이스의 항목과 상호관련된 수탁 번호를 참조하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 전체가 본원에 참조로 포함된다.
등가물 및 범주
본 발명에 의해 포괄되는 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 상기 설명에 제시된다. 바람직한 재료 및 방법은 위에서 설명되었지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 재료 및 방법이 본 발명에 의해 포괄되는 실시양태의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본 발명과 관련된 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명으로부터 명백하게 보인다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 위에 제공된 본 발명의 설명이 우선한다.
본 기술분야의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명에 의해 포괄되는 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명에 의해 포괄되는 범주는 본원에 제공된 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않으며 이러한 등가물은 첨부된 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
관사 "a" 및 "an"은 달리 나타내거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 관사의 문법적 대상의 하나 또는 2 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나보다 많은 요소를 의미한다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 달리 표시되거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 그룹 구성원 중 하나, 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 달리 관련이 있다면, 만족하는 것으로 간주한다. 본 발명은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나 이용되거나, 달리 관련이 있는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 또한 하나보다 많은 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 또는 그렇지 않으면 관련이 있는 실시양태를 포함한다.
또한, "포함하는"이라는 용어는 개방적인 것으로 의도되고 허용되지만, 추가 요소 또는 단계의 포함을 필요로 하지 않는다는 점에 유의해야 한다. "포함하는"이라는 용어가 본 명세서에 사용될 때, "이루어지는"이라는 용어도 이에 따라 포괄되고 개시된다.
범위가 주어지면 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 나타내지 않거나 본 기술분야의 숙련자의 이해와 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 본 발명에 의해 포괄되는 여러 실시양태에 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위범위를 문맥에서 달리 명백하게 진술하지 않는 한, 그 범위의 하한 단위의 1/10까지 추정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 종래 기술에 속하는 본 발명에 의해 포괄되는 임의의 특정 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구범위에서 명시적으로 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 실시양태는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 것으로 간주되므로, 그 배제가 본원에 명시적으로 제시되지 않을지라도 배제될 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 조성물의 임의의 특정 실시양태(예를 들어, 임의의 항생제, 치료제 또는 활성 성분; 임의의 생산 방법; 임의의 사용 방법 등)는 종래 기술의 존재와 관련 여부에 상관없이 임의의 이유로 어느 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다.
사용된 단어는 제한이 아니라 설명의 단어이며, 더 넓은 측면에서 본 발명에 의해 포괄되는 진정한 범주 및 취지에서 벗어남이 없이 첨부된 청구범위의 권한 내에서 변화가 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명이 몇 가지 설명된 실시양태와 관련하여 어느 정도의 길이, 및 약간 특정성으로 설명되었지만, 이는 임의의 그러한 특정예 또는 실시양태 또는 임의의 특별한 실시양태로 제한되어야 한다는 것을 의도하는 것이 아니라, 종래 기술에 비추어 그러한 청구항의 가장 넓은 가능한 해석을 제공하여 본 발명에 의해 포괄되는 의도된 범주를 효과적으로 포괄하는 것으로서 첨부된 청구항을 참조하여 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> PURINOMIA BIOTECH, INC. Wu, Yan <120> Methods and Compositions for Potentiating Antitumoral Immune Responses Through Targeting of NTPDase3 <130> PNC-00225 <140> PCT/US2021/049770 <141> 2021-09-10 <150> US 63/076,427 <151> 2020-09-10 <160> 146 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <400> 1 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggg gga ggt ttg ata cag cct ggg gga 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgc gca gcc tct gga ttc acc tct agt tct agt 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 gat tat gcc atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag 144 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg gtc tcg tct att agt gga agt ggc ggt agc aca tac tac gca gac 192 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 tcc gtg aag ggc cgc ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca 240 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 ctc tat gtg caa atg acc agc ctg aca gcc gag gac acg gcc gta tat 288 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 tac tgt gcg aaa gtc gtc gga tac agt atg tac gac tac tac tac cac 336 Tyr Cys Ala Lys Val Val Gly Tyr Ser Met Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 tac gct ttg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 384 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Val Val Gly Tyr Ser Met Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 3 cag cct gtg ctg act cag cca cct tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag 48 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 agg gtc acc atc tct tgt tct gga agc agc tcc aac atc gga agt aat 96 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 act gta aac tgg tac cag cag ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc 144 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat agt aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctc acc atc tct gga ctg aag 240 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 act gag gac gag gct ggc tac tac tgt cag tct tat gat acc agc aat 288 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn 85 90 95 gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag gtg acc gtc ctc 324 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 5 <211> 1377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1377) <400> 5 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggg gga ggt ttg ata cag cct ggg gga 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgc gca gcc tct gga ttc acc tct agt tct agt 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 gat tat gcc atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag 144 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg gtc tcg tct att agt gga agt ggc ggt agc aca tac tac gca gac 192 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 tcc gtg aag ggc cgc ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca 240 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 ctc tat gtg caa atg acc agc ctg aca gcc gag gac acg gcc gta tat 288 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 tac tgt gcg aaa gtc gtc gga tac agt atg tac gac tac tac tac cac 336 Tyr Cys Ala Lys Val Val Gly Tyr Ser Met Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 tac gct ttg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 384 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 gcc tcc act aag ggc cca tcc gtg ttc cca ctg gca ccc tct agt aag 432 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 140 agc aca tct ggg ggt act gcc gct ctg gga tgt ctg gtg aag gat tac 480 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 ttc cca gag cca gtc acc gtg tcc tgg aac agc ggg gcc ctg act tcc 528 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 ggt gtc cat acc ttt cca gct gtg ctg cag tca tcc ggc ctg tac agc 576 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 ctg agc tct gtg gtc acc gtc ccc agt tca tcc ctg gga aca cag act 624 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 205 tat atc tgc aac gtg aat cac aag cca tcc aat aca aaa gtc gac aag 672 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215 220 aaa gtg gaa ccc aag agc tgt gat aaa acc cat aca tgc ccc cct tgt 720 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 cct gct cca gag ctg ctg gga gga cca tcc gtg ttc ctg ttt cca ccc 768 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 aag cct aaa gac act ctg atg att tct cga acc ccc gaa gtc aca tgc 816 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 gtg gtc gtg gac gtg tcc cac gag gat cct gaa gtc aag ttc aac tgg 864 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 tac gtg gat ggc gtc gag gtg cat aat gcc aag aca aaa cca cga gag 912 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 gaa cag tac aac agt acc tat cgt gtc gtg tca gtc ctg aca gtg ctg 960 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 cac cag gac tgg ctg aac ggg aag gaa tat aag tgc aaa gtg agc aat 1008 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 aag gca ctg ccc gcc cct atc gag aaa aca att tct aag gct aaa gga 1056 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 cag cct agg gaa cca cag gtg tac act ctg cct cca tca cgg gac gag 1104 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 ctg aca aag aac cag gtc agt ctg act tgt ctg gtg aaa ggg ttc tat 1152 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 cct tct gat atc gcc gtg gag tgg gaa agt aat ggt cag cca gag aac 1200 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 aat tac aag acc aca ccc cct gtc ctg gac tct gat ggg agt ttc ttt 1248 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 ctg tat tcc aag ctg acc gtg gat aaa agc cgg tgg cag cag ggt aat 1296 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 gtc ttt agt tgt tca gtg atg cac gag gca ctg cac aat cac tac acc 1344 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 cag aaa tca ctg tca ctg tca cca ggt aaa tga 1377 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 6 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Val Val Gly Tyr Ser Met Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 140 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215 220 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 7 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(645) <400> 7 cag cct gtg ctg act cag cca cct tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag 48 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 agg gtc acc atc tct tgt tct gga agc agc tcc aac atc gga agt aat 96 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 act gta aac tgg tac cag cag ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc 144 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat agt aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctc acc atc tct gga ctg aag 240 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 act gag gac gag gct ggc tac tac tgt cag tct tat gat acc agc aat 288 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn 85 90 95 gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag gtg acc gtc ctc ggc cag cct aaa 336 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 gcc aac cca aca gtg act ctg ttt cca ccc tcc agc gag gaa ctg cag 384 Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 gct aat aag gca act ctg gtc tgt ctg att tct gac ttc tac cct gga 432 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 gct gtg acc gtc gca tgg aag gct gat ggt tcc ccc gtg aaa gca ggc 480 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 gtc gag acc aca aag cct tct aaa cag agt aac aat aag tac gcc gct 528 Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 tct agt tat ctg tct ctg aca cca gaa cag tgg aaa agt cat agg tcc 576 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 tat agc tgt cag gtc act cac gaa ggc tca act gtg gaa aaa act gtg 624 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 gct cct acc gaa tgc tca tag 645 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 9 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <400> 9 cag tcg ttg gag gag tcc ggg gga gac ctg gtc aag cct ggg gca tcc 48 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 ctg aca ctc acc tgc acg gcc tct gga ttc tcc ttc agt agc agc gac 96 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Asp 20 25 30 tgg ata tgc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg atc 144 Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gca tgc att tat gct ggt agt att ggt ggc gct tac ttc gcg agc tgg 192 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ile Gly Gly Ala Tyr Phe Ala Ser Trp 50 55 60 gtg aat ggc cga ttc acc atc tcc aga gcc tcg tcg acc acg gtg act 240 Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 ctg caa atg acc agt ctg aca gcc gcg gac acg gcc acc tat ttc tgt 288 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg aga tca agt agt aat ggt cgt ttg aaa ttg gat caa ttc gac ttg 336 Ala Arg Ser Ser Ser Asn Gly Arg Leu Lys Leu Asp Gln Phe Asp Leu 100 105 110 tgg ggc cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 369 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Asp 20 25 30 Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ile Gly Gly Ala Tyr Phe Ala Ser Trp 50 55 60 Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 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tgt caa cag ggt agt gct gct gat gtt 288 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Ala Asp Val 85 90 95 gct aat act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc aaa ggt 330 Ala Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Ser Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Arg Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Ala Asp Val 85 90 95 Ala Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 13 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 13 cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt agc tat gca 96 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 atg ggc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa ttc atc gga 144 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 atc att act tat aat ggt aac aca tac tac gcg agt tgg gcg aaa ggc 192 Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 cga ttc ccc atc tcc aag acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aaa atg 240 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 acc agt ccg aca acc gaa gac acg gcc act tat ttc tgt gcc aga gcc 288 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 cgt tat ggt ggt tat agt act aat tcc tac tat ctt aat atc tgg ggc 336 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 15 gcc gac gtc gtg atg acc cag act cca gcc tcc gtg tct gca gct gtg 48 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 ggc ggc aca gtc acc atc aac tgc cag gcc agt gag aat att tat agg 96 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 att ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aaa ctc ctg 144 Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc aat ctg gaa act ggg gtc cca tca cgg ttc aaa 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 ggc agt gga tct ggg aca gaa tac act ctc acc atc agc gac ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 tgt gac gat gct gcc act tac tat tgt caa ggt gtt ctt tat aat agt 288 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Leu Tyr Asn Ser 85 90 95 aat gat agt act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc aaa ggt 333 Asn Asp Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Leu Tyr Asn Ser 85 90 95 Asn Asp Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 17 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 17 cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt agc tat gca 96 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 atg ggc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa ttc atc gga 144 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 atc att agt tat agt ggt aac aca tac tac gcg agt tgg gcg aaa ggc 192 Ile Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 cga ttc ccc atc tcc aaa acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aaa atg 240 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 acc agt ccg aca acc gaa gac acg gcc aat tat ttc tgt gcc aga gcc 288 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 cgt tat ggt ggt tat agt act aat tcc tac tat ctt aat atc tgg ggc 336 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 19 gcc gac gtc gtg atg acc cag act cca gcc tcc gtg gag gca gct gtg 48 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 gga ggc aca gtc acc atc aac tgc cag gcc agt gag aat att tat aga 96 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 gtt ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aaa ctc ctg 144 Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc aat ctg gaa tct ggg gtc cca tca cgg ttc aaa 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 ggc agt gga tct ggg aca gac tac act ctc acc atc agc gac ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 tgt gac gat gct gcc act tac tat tgt caa ggt gtt gtt tat aat agt 288 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Val Tyr Asn Ser 85 90 95 gat gat agt gct ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc aaa ggt 333 Asp Asp Ser Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 20 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Val Tyr Asn Ser 85 90 95 Asp Asp Ser Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 21 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 21 cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt agc tat gca 96 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 atg ggc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa ttc atc gga 144 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 atc att act tat aat ggt ggc aca tac tac gcg agt tgg gcg aaa ggc 192 Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 cga ttc ccc atc tcc aag acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aaa atg 240 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 acc agt ccg aca acc gaa gac acg gcc act tat ttc tgt gcc aga gcc 288 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 cgt tat ggt ggt tat agt act aat tcc tac tat ctt aat atc tgg ggc 336 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 23 gcc gac gtc gtg atg acc cag act cca gcc tcc gtg tct gca gct gtg 48 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 ggc ggc aca gtc acc atc aac tgc cag gcc agt gag aat att tat agg 96 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 gtt ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aaa ctc ctg 144 Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc aat ctg gaa act ggg gtc cca tca cgg ttc aaa 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 ggc agt gga tct ggg aca gaa tac act ctc acc atc agc gac ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 tgt gac gat gct gcc act tac tat tgt caa ggt gtt ctt tat gat aat 288 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Leu Tyr Asp Asn 85 90 95 aat gat agt act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc aaa ggt 333 Asn Asp Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 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Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 gtg ggc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa ttc atc gga 144 Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 atc atc act tat aat ggt gcc aca tac tac gcg agt tgg gcg gaa ggc 192 Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Glu Gly 50 55 60 cga ttc ccc atc tcc aag acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aaa atg 240 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 acc agt ccg aca acc gaa gac acg gcc act tat ttc tgt gcc aga gcc 288 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 cgt tat ggt ggt tat agt act aat tcc tac tat ctt aat atc tgg ggc 336 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Glu Gly 50 55 60 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 27 gcc gac gtc gtg atg acc cag act cca gcc tcc gtg tct gca gct gtg 48 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 ggc ggc aca gtc acc atc aac tgc cag gcc agt gag aat att tat agg 96 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 att ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aag ctc ctg 144 Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 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Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt agt tat gta 96 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val 20 25 30 ata aat tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa tgg atc gga 144 Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 acc att agt agt agt ggt agc aca tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc 192 Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 cga ttc acc atc tcc aca acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aaa atc 240 Arg Phe Thr Ile Ser Thr Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 acc agt ccg aca acc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga ggg 288 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 gct gat ggt gct ttt att agt gac tac ttt aac atc tgg ggc cca ggc 336 Ala Asp Gly Ala Phe Ile Ser Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly 100 105 110 acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val 20 25 30 Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Thr Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Ala Asp Gly Ala Phe Ile Ser Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 35 gcc gac atc gtg atg acc cag act cca tcc tcc gtg tct gca gct gtg 48 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 gga ggc aca gtc acc atc aag tgc cag gcc aat gag aat att gac agt 96 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Asn Glu Asn Ile Asp Ser 20 25 30 tgg tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cgt ccc aag ctc cta 144 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat tat gca tcc act ctg gca tct ggg gtc cca tcg cgg ttc aaa 192 Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 ggc agt gga tct ggg aca gag tac act ctc acc atc agc gac ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 tgt gcc gat ggt gcc act tac tac tgt caa agc tat gat act att agt 288 Cys Ala Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ile Ser 85 90 95 gac tat ggt gtt ggt ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc aaa ggt 336 Asp Tyr Gly Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Asn Glu Asn Ile Asp Ser 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Ala Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ile Ser 85 90 95 Asp Tyr Gly Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 37 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 37 cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt agc tat gca 96 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 atg ggc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gaa ttc atc gga 144 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 atc atc act tat aat agt aac aca tac tac gcg aat tgg gcg aaa ggc 192 Ile Ile Thr Tyr Asn Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 cga ttc ccc atc tcc aag acc tcg tcg acc acg gtg gat ctg aaa atg 240 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 acc agt ccg aca acc gaa gac acg gcc act tat ttc tgt gcc aga gcc 288 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 cgt tat ggt ggt tat agt act aat tcc tac tat ctt aat atc tgg ggc 336 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Tyr Asn Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn Ile Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 39 gcc gac gtc gtg atg acc cag act cca gcc tcc gtg tct gca gct gtg 48 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 ggc ggc aca gtc acc atc aac tgc cag gcc agt gag aat att tat agg 96 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 att ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cct ccc aag ctc ctg 144 Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc aat ctg gaa act ggg gtc cca tca cgg ttc aaa 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 ggc agt gga tct ggg aca gaa tat act ctc acc atc agc gac ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 tgt gac gat gct gcc act tac tat tgt caa ggt gtt ctt tat aat agt 288 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Leu Tyr Asn Ser 85 90 95 aat gat agt act ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc aaa ggt 333 Asn Asp Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 40 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg 20 25 30 Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Leu Tyr Asn Ser 85 90 95 Asn Asp Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly 100 105 110 <210> 41 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 41 cag gag cag ctg gag gag tcc ggg gga gac ctg gtc aag cct gag gga 48 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 tcc ctg aca ctc acc tgc act gcc tct gga ttt gac tcc agt agc acc 96 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ser Ser Ser Thr 20 25 30 tac tac atg tgc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 agc gga tgc att tat act ggt ggt ctt aca tac tac gcg agc tgg gcg 192 Ser Gly Cys Ile Tyr Thr Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 aaa ggc cga ttc acc atc tcc aaa acc tcg tcg acc acg gtg act ctg 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 caa atg acc agt ctg aca gcc gcg gac acg gcc acc tat ttc tgt gcg 288 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 agt tat att ggt agt cgt ttt tat atg ccc ggt ttt agc ttg tgg ggc 336 Ser Tyr Ile Gly Ser Arg Phe Tyr Met Pro Gly Phe Ser Leu Trp Gly 100 105 110 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ser Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ser Gly Cys Ile Tyr Thr Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Ser Tyr Ile Gly Ser Arg Phe Tyr Met Pro Gly Phe Ser Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human-rabbit hybrid <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 43 gcc atc gtg atg acc cag act cca tct tcc aag tct gtc cct gtg gga 48 Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly 1 5 10 15 gac aca gtc acc atc aat tgc cag gcc agt gag agt att tac agt aac 96 Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 aat cgc tta gcc tgg ttt caa caa aaa cca ggg cag cct ccc aag ctc 144 Asn Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 ctg atc tat ctg gca tcc act ctg gca tct ggg gtc cca tcg cgg ttc 192 Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 aaa ggc agt gga tct ggg aca cag ttc act ctc acc atc agc gat gtg 240 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val 65 70 75 80 gtg tgt gac gat gct gcc act tac tac tgt gca gga tat aaa ggt agt 288 Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Gly Ser 85 90 95 agt act gat ggt act gcg ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg gtc aaa 336 Ser Thr Asp Gly Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 ggt 339 Gly <210> 44 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Asn Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val 65 70 75 80 Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Gly Ser 85 90 95 Ser Thr Asp Gly Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 Gly <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Gly Phe Thr Ser Ser Ser Ser Asp Tyr Ala 1 5 10 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 47 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ala Lys Val Val Gly Tyr Ser Met Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Asp Val <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 49 <211> 3 <212> PRT <213> 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Met Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Asp Val <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 61 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ser Asn Asn 1 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Gln Ser Asp Asp Thr Ser Asn Val Val 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gly Phe Thr Thr Ser Ser Ser Asp Tyr Ala 1 5 10 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 65 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Ala Lys Asp Val Gly Tyr Ser Thr Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Asp Val <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 67 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ser Asp Asp 1 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn Val Val 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gly Phe Gln Ser Asp Ser Ser Asp Tyr Ala 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acagcgacga tagcgccttc 300 ggcggcggca caaaggtgga gatcaag 327 <210> 78 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Val 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Val Val Tyr Asn Ser Asp 85 90 95 Asp Ser Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 79 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 gagcagcagc tgctggagtc cggcggaggc ctggtgcagc caggaggaag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggcat cgacttcaat aattacggca tctcctgggt gagacaggcc 120 cctggcaagg gcctggagtg gatcgcctac aagtaccccg gcttcggcat cagaaattac 180 gccaatagcg tgaagggcag attcaccatc tcctccgata acagcaagaa caccgtgtac 240 ctgcagatga atagcctgag ggccgaggat accgccgtgt acttttgcgc caggggcgcc 300 agatacagac acgatgacta cggcgccctg aatctgtggg gccccggcac actggtgacc 360 gtgtccagc 369 <210> 80 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Glu Gln Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Tyr Lys Tyr Pro Gly Phe Gly Ile Arg Asn Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Arg Tyr Arg His Asp Asp Tyr Gly Ala Leu Asn Leu 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 gacatccaga tgacccagtc ccccagcaca ctgtccgcca gcgtgggcga cagagtgaca 60 atcacctgcc aggccagcca gtccgtgacc aatctgctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaagcccc ctaagctgct gatctacggc gcctccaatc tggagagcgg cgtgcccagc 180 aggttttccg gctccggcag cggcacagag tttacactga ccatctcctc cctgcagcct 240 gatgacttcg ccacctacta ctgtcagagc ggctactaca gcgccaacac ctttggcccc 300 ggcaccaagg tggatatcaa g 321 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggtggc ttgatacagc ctggtggatc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctctagt tctagtgatt atgccatgag ttgggtcagg 120 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcgtccatca gtggtagtgg cgttagcaca 180 tactacgcag actccgtgaa gggtcgcttc accatctcca gagacaattc caagaacaca 240 ctctatgtgc aaatgaccag cctgacagcc gaggacacgg ccgtgtacta ctgtgcgaag 300 gtcgtcggtt acagtgttta cgactactac taccactacg ctttggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 ggattcacct ctagttctag tgattatgcc 30 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 atcagtggta gtggcgttag caca 24 <210> 86 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gcgaaggtcg tcggttacag tgtttacgac tactactacc actacgcttt ggacgtc 57 <210> 87 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Val Val Gly Tyr Ser Val Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 88 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 cagcctgtgc tgactcagcc accttcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcggt agtaatactg tgaactggta ccagcagctt 120 ccaggaacgg ctcctaagct cctcatctat agtgataatc agagaccctc aggtgtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tcaccatctc tggactgaag 240 actgaggacg aggctggcta ctactgtcag tctgatgata ccagcaatgt ggtattcggt 300 ggaggcacca aggtgaccgt cctc 324 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 agctccaaca tcggtagtaa tact 24 <210> 90 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 agtgataat 9 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 cagtctgatg ataccagcaa tgtggta 27 <210> 92 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Asp Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 93 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggtggc ttgatacagc ctggtggatc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctctagt tctagtgatt atgccatgag ttgggtcagg 120 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcgtccatca gtggtagtgg cggtagcaca 180 tactacgcag actccgtgaa gggtcgcttc accatctcca gagacaattc caagaacaca 240 ctctatgtgc aaatgaccag cctgacagcc gaggacacgg ccgtgtacta ctgtgcgaag 300 gtcttcggtt acagtatgta cgactactac taccactacg ctttggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 94 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 ggattcacct ctagttctag tgattatgcc 30 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 atcagtggta gtggcggtag caca 24 <210> 96 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 gcgaaggtct tcggttacag tatgtacgac tactactacc actacgcttt ggacgtc 57 <210> 97 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Val Phe Gly Tyr Ser Met Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 98 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 cagcctgtgc tgactcagcc accttcagcg tctgggaccc ccgggcagag gatcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcggt agtaatactg tgaactggta ccagcagctt 120 ccaggaacgg ctcctaagct cctcatctat agtaataatc agagaccctc aggtgtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tcaccatctc tggactgaag 240 actgaggacg aggctggcta ctactgtcag tctgatgata ccagcaatgt ggtattcggt 300 ggaggcacca aggtgaccgt cctc 324 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 agctccaaca tcggtagtaa tact 24 <210> 100 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 agtaataat 9 <210> 101 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 cagtctgatg ataccagcaa tgtggta 27 <210> 102 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Asp Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 103 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggtggc ttgatacagc ctggtggatc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccactagt tctagtgatt atgccatgag ttgggtcagg 120 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcgtccatca gtggtagtgg gggtagcaca 180 tactacgcag actccgtgaa gggtcgcttc accatctcca gagacaattc caagaacaca 240 ctctatgtgc aaatgaccag cctgacagcc gaggacacgg ccgtgtacta ctgtgcgaag 300 gacgtcggtt acagtacgta cgactactac taccactacg ctttggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 ggattcacca ctagttctag tgattatgcc 30 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 atcagtggta gtgggggtag caca 24 <210> 106 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 gcgaaggacg tcggttacag tacgtacgac tactactacc actacgcttt ggacgtc 57 <210> 107 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Thr Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Asp Val Gly Tyr Ser Thr Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 108 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 cagcctgtgc tgactcagcc accttcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacgtcggt agtaatactg tgaactggta ccagcagctt 120 ccaggaacgg ctcctaagct cctcatctat agtaataatc agagaccctc aggtgtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tcaccatctc tggactgaag 240 actgaggacg aggctggcta ctactgtcag tcttatgata ccagcaatgt ggtattcggt 300 ggaggcacca aggtgaccgt cctc 324 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 agctccaacg tcggtagtaa tact 24 <210> 110 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 agtaataat 9 <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 cagtcttatg ataccagcaa tgtggta 27 <210> 112 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 113 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggtggc ttgatacagc ctggtggatc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ccagtctgat tctagtgatt atgccatgag ttgggtcagg 120 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcgtccatca gtggtactgg cggtagcaca 180 tactacgcag actccgtgaa gggtcgcttc accatctcca gagacaattc caagaacaca 240 ctctatgtgc aaatgaccag cctgacagcc gaggacacgg ccgtgtacta ctgtgcgaag 300 gtggtcggtt tcagtacgta cgactactac taccactacg ctttggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 ggattccagt ctgattctag tgattatgcc 30 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 atcagtggta ctggcggtag caca 24 <210> 116 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 gcgaaggtgg tcggtttcag tacgtacgac tactactacc actacgcttt ggacgtc 57 <210> 117 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Ser Asp Ser Ser 20 25 30 Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Val Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Val Val Gly Phe Ser Thr Tyr Asp Tyr Tyr Tyr His 100 105 110 Tyr Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 118 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 cagcctgtgc tgactcagcc accttcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcggt agtaatactg tgaactggta ccagcagctt 120 ccaggaacgg ctcctaagct cctcatctat agtgatgatc agagaccctc aggtgtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tcaccatctc tggactgaag 240 actgaggacg aggctggcta ctactgtcag tcttatgata ccagcaatgt ggtattcggt 300 ggaggcacca aggtgaccgt cctc 324 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 agctccaaca tcggtagtaa tact 24 <210> 120 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 agtgatgat 9 <210> 121 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 cagtcttatg ataccagcaa tgtggta 27 <210> 122 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Glu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 ggcttttccc tgagcagcta cgcc 24 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 atctcctact ccggcaacac a 21 <210> 125 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 gccagggcca ggtacggcgg ctactccacc aatagctact acctgaacat c 51 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 127 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 128 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Gly Tyr Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 Ile <210> 129 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 gagaatatct acagggtg 18 <210> 130 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 ggcgccagc 9 <210> 131 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 cagggcgtgg tgtacaacag cgacgatagc gcc 33 <210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Glu Asn Ile Tyr Arg Val 1 5 <210> 133 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Gly Ala Ser 1 <210> 134 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gln Gly Val Val Tyr Asn Ser Asp Asp Ser Ala 1 5 10 <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 ggcatcgact tcaataatta cggc 24 <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 aagtaccccg gcttcggcat caga 24 <210> 137 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 gccaggggcg ccagatacag acacgatgac tacggcgccc tgaatctg 48 <210> 138 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gly Ile Asp Phe Asn Asn Tyr Gly 1 5 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Lys Tyr Pro Gly Phe Gly Ile Arg 1 5 <210> 140 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Ala Arg Gly Ala Arg Tyr Arg His Asp Asp Tyr Gly Ala Leu Asn Leu 1 5 10 15 <210> 141 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 cagtccgtga ccaatctg 18 <210> 142 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 ggcgcctcc 9 <210> 143 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 cagagcggct actacagcgc caacacc 27 <210> 144 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Gln Ser Val Thr Asn Leu 1 5 <210> 145 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Gly Ala Ser 1 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Asn Thr 1 5

Claims (44)

  1. 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항-NTPDase3 항체가 안정한 면역 복합체를 형성하도록 하는 부위에서 엑토뉴클레오사이드 트리포스페이트 다이포스포하이드롤라제-3(NTPDase3)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 및
    (a) FcγRIIIa 수용체에 결합하고 NTPDase3+ 세포에 대한 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 활성을 상기 항-NTPDase3 항체에 부여하는 FcγRIIIa 결합 모이어티를 포함하고/하거나;
    (b) 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 NTPDase3 효소 활성을 저해하며,
    선택적으로,
    (i) 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시험관내 ADCC 검정에서 적어도 2x10-6 몰(M) 이하의 EC50을 가지며, 바람직하게는 상기 EC50은 1x10-6 M 이하, 0.5x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 7.5x10-8 M 이하, 5x10-8 M 이하, 2.5x10-8 M, 1x10-8 M 이하, 7.5x10-9 M 이하, 5x10-9 M 이하, 2.5x10-9 M 이하, 1x10-9 M 이하, 7.5x10-10 M 이하, 5x10-10 M 이하, 2.5x10-10 M 이하, 1x10-10 M 이하, 7.5x10-11 M 이하, 5x10-11 M 이하, 2.5x10-11 M 이하, 1x10-11 M 이하, 7.5x10-12 M 이하, 5x10-12 M 이하, 2.5x10-12 M 이하, 또는 1x10-12 M 이하이거나, 또는 1x10-6 M 내지 1x10-12 M, 5x10-7 내지 5x10-9 M, 및 1x10-7 내지 1x10-9 M을 포함하는 그 사이의 임의의 범위이거나;
    (ii) 상기 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 시험관내 NTPD3 효소 활성 저해 검정에서 적어도 2x10-6　M 이하의 EC50을 가지며, 바람직하게는, 상기 EC50은 1x10-6 M 이하, 0.5x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 7.5x10-8 M 이하, 5x10-8 M 이하, 2.5x10-8 M, 1x10-8 M 이하, 7.5x10-9 M 이하, 5x10-9 M 이하, 2.5x10-9 M 이하, 1x10-9 M 이하, 7.5x10-10 M 이하, 5x10-10 M 이하, 2.5x10-10 M 이하, 1x10-10 M 이하, 7.5x10-11 M 이하, 5x10-11 M 이하, 2.5x10-11 M 이하, 1x10-11 M 이하, 7.5x10-12 M 이하, 5x10-12 M 이하, 2.5x10-12 M 이하, 또는 1x10-12 M 이하이거나, 또는 1x10-6 M 내지 1x10-12 M, 5x10-7 내지 5x10-9 M, 및 1x10-7 내지 1x10-9 M을 포함하는 그 사이의 임의의 범위이고, 시험관내 NTPD3 효소 활성 저해 검정에 의해 결정된 것으로서, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 초과, 또는 30% 내지 99%를 포함하는 이들 사이의 임의의 범위의 최대 저해 효능을 갖거나; 또는
    (iii) 상기 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 시험관내 ADCC 검정에서 적어도 4x10-6　M 이하의 EC50을 가지며, 바람직하게는, 상기 EC50은 2x10-6 M 이하, 1x10-6 M 이하, 0.5x10-6 M 이하, 1x10-7 M 이하, 7.5x10-8 M 이하, 5x10-8 M 이하, 2.5x10-8 M, 1x10-8 M 이하, 7.5x10-9 M 이하, 5x10-9 M 이하, 2.5x10-9 M 이하, 1x10-9 M 이하, 7.5x10-10 M 이하, 5x10-10 M 이하, 2.5x10-10 M 이하, 1x10-10 M 이하, 7.5x10-11 M 이하, 5x10-11 M 이하, 2.5x10-11 M 이하, 1x10-11 M 이하, 7.5x10-12 M 이하, 5x10-12 M 이하, 2.5x10-12 M 이하, 또는 1x10-12 M 이하이거나, 또는 1x10-6 M 내지 1x10-12 M, 5x10-7 내지 5x10-9 M, 및 1x10-7 내지 1x10-9 M를 포함하는 그 사이의 임의의 범위이고; 게다가 시험관내 효소 활성 저해 검정에서 적어도 4x10-6　M 이하의 EC50을 가지며, 바람직하게는, 상기 EC50은 2x10-6　M 이하, 1x10-6　M 이하, 0.5x10-6　M 이하, 1x10-7　M 이하, 7.5x10-8　M 이하, 5x10-8　M 이하, 2.5x10-8　M, 1x10-8　M 이하, 7.5x10-9　M 이하, 5x10-9　M 이하, 2.5x10-9　M 이하, 1x10-9　M 이하, 7.5x10-10　M 이하, 5x10-10　M 이하, 2.5x10-10　M 이하, 1x10-10　M 이하, 7.5x10-11　M 이하, 5x10-11　M 이하, 2.5x10-11　M 이하, 1x10-11　M 이하, 7.5x10-12　M 이하, 5x10-12　M 이하, 2.5x10-12　M 이하, 또는 1x10-12　M 이하이거나, 또는 1x10-6　M 내지 1x10-12　M, 5x10-7　내지 5x10-9　M, 및 1x10-7　내지 1x10-9　M을 포함하는, 이들 사이의 임의의 범위이고, 시험관내 NTPD3 효소 활성 저해 검정에 의해 결정된 것으로서, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 초과, 또는 30% 내지 99%를 포함하는, 이들 사이의 임의의 범위의 최대 저해 효능을 갖는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 치료 항체이고/이거나 추가로
    (i) NTPDase3+ 세포에 대한 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성; 및/또는
    (ii) NTPDase3+ 종양내 세포 및/또는 종양 혈관 주위의 NTPDase3+ 혈관주위세포 및/또는 섬유아세포에 대한 ADCC 활성; 및/또는
    (iii) NTPDase3+ 면역 세포(바람직하게는 M2 대식세포)에 대한 NTPDase3의 항체-매개 표적 사이토시스(cytosis); 및/또는
    (iv) NTPDase3에 결합하는 NTPDase3 단클론 항체 클론과 경쟁적, 비경쟁적, 또는 부분 경쟁적인 방식의 NTPDase3에 대한 결합으로서, 상기 NTPDase3 단클론 항체 클론이 PBI#30 및 이의 친화도 성숙 변이체, 3E9, 4F9, 8E1 및 이의 인간화 대응물, 16D4, 37H1, 38D5 및 이들의 백본 서열에 점 돌연변이가 있거나 없는 이의 인간화 대응물, 38D12, 42D8, 및 44H5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, NTPDase3에 대한 결합
    을 촉진하는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 FcγRIIIa 결합 모이어티가 Fc 도메인, FcγRIIIa에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 FcγRIIIa 결합 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv(scFv), Fav, dsFv, sc(Fv)2, Fde, sdFv, 단일 도메인 항체(dAb), 및 다이아바디(diabody) 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 상기 항-NTPDase3 항체, 또는 항원 결합 단편이 단클론성인, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제(agent)에 접합되고, 선택적으로 상기 작용제는 결합 단백질, 효소, 약물, 화학요법제, 생물학적 작용제, 독소, 방사성핵종, 면역조정제, 검출가능한 모이어티, 및 태그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 75, 79, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열의 핵산에 엄격한 조건(stringent condition) 하에 혼성화하는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 3, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 77, 81, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열의 핵산에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 갖는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 경쇄를 포함하는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 76, 80, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열과 적어도 60% 동일한 가변 중쇄(VH), 및 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 또는 표 2A, 2B, 2C, 2D, 또는 3에 열거된 서열과 적어도 60% 동일한 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 45와 적어도 80% 동일한 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 46과 적어도 80% 동일한 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 47과 적어도 80% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및
    (ii) 서열번호 48과 적어도 80% 동일한 CDR1 아미노산 서열, 서열번호 49와 적어도 80% 동일한 CDR2 아미노산 서열, 및 서열번호 50과 적어도 80% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    를 포함하는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 42, 76, 80, 및 표 2A, 2B, 2C, 2D, 및 3에 열거된 서열의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열번호 4, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 78, 82, 및 표 2A, 2B, 2C, 2D, 및 3에 열거된 서열의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 프레임워크 서열을 포함하여 인간 NTPDase3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하는, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG3, IgG2, 또는 IgG4 아이소타입(isotype)의 Fc 도메인을 포함하며, 선택적으로 상기 Fc 도메인이 인간이고, 바람직하게는 상기 아이소타입이 ADCC 활성인 IgG1 또는 IgG3인, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 저-푸코실화 또는 비-푸코실화된, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이거나 인간화된 것인, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 항원, 면역 관문, 또는 공동자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성이며, 상기 추가 항원 결합 부위가 면역 관문용인 경우에는 관문 저해제로서 기능하고, 상기 추가 항원 결합 부위가 공동자극 수용체용인 경우에는 공동자극 작동제(agonist)로서 기능하는 것인, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추가 항원 결합 부위가 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA, TIGIT, CD39 및 Siglec-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 관문 단백질에 결합하는 것인, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 추가 항원 결합 부위가 T-세포 상에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 연관된 관문 단백질에 결합하는 것인, 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제14항에 있어서, 상기 추가 항원 결합 부위가 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 공동자극 수용체에 결합하는 것인, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제14항에 있어서, 상기 추가 항원 결합 부위가 CD47, SIRPα, CD24 또는 Siglec-10에 결합하는 것인, 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량, 및 하나 이상의 약제학적 허용성 부형제, 완충액 또는 용액을 포함하는, 약제학적 제제.
  20. 제19항에 있어서, 항-종양 T 세포 면역성을 개선시키고 종양이 있는 대상체에게 투여하기에 적합하며, 유효량의 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적 허용성 부형제, 완충액 또는 용액을 포함하며, 상기 대상체에 대한 항-NTPDase3 항체의 투여가 종양내 NTPDase3+ 세포(예컨대, M2 및/또는 M2-유사 대식세포, 혈관주위세포, 및/또는 섬유아세포)의 수를 감소시키고, 선택적으로, i) 상기 종양 내로 T-세포 침윤을 향상시키고/시키거나, ii) 상기 종양 내 T-세포 고갈을 저하시키고/시키거나, iii) 종양-연관 혈관구조를 파괴하여 종양 기아를 초래하는, 약제학적 제제.
  21. 단리된 핵산 분자로서,
    i) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 보체와 엄격한 조건 하에 혼성화하거나;
    ii) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대해 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 서열을 갖거나; 또는
    iii) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는,
    단리된 핵산 분자.
  22. 제21항의 핵산에 의해 암호화된, 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드.
  23. 제21항의 단리된 핵산을 포함하며, 선택적으로 발현 벡터인 벡터.
  24. 제21항의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포로서,
    a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하고/하거나;
    b) 제22항의 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하고/하거나;
    c) 제23항의 벡터를 포함하는,
    숙주 세포.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 장치 또는 키트로서, 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 검출하기 위한 표지를 선택적으로 포함하는, 장치 또는 키트.
  26. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 단리된 핵산 분자, 단리된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 장치 또는 키트.
  27. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서,
    (i) 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된, 형질전환된 숙주 세포를, 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 허용하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  28. NTPDase3 폴리펩타이드의 존재 또는 수준을 검출하는 방법으로서,
    샘플을 수득하는 단계 및 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 상기 샘플에서 상기 폴리펩타이드를 검출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 NTPDase3 폴리펩타이드와 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역 검정(RIA), 면역화학 검정, 웨스턴 블롯, 질량분석 검정, 핵 자기 공명 검정, 또는 세포내 유동 검정을 사용하는 형식으로 검출되는, 방법.
  30. 종양이 있는 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양내 NTPDase3+ 세포를 고갈시켜 항-종양 T 세포 면역을 개선시키는 방법으로서,
    상기 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 종양내 NTPDase3+ 세포(예컨대, M2 및 M2-유사 대식세포, 혈관주위세포, 및/또는 섬유아세포) 수의 감소를 초래하고, 상기 종양 내로 T-세포 침윤을 향상시키거나 또는 종양 내 T-세포 고갈을 저하시키거나 또는 둘 모두를 초래하고; 선택적으로 종양-연관 혈관구조를 파괴하여 종양 기아를 유발하는 것인, 방법.
  31. 종양이 있는 대상체에게, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양 내로 면역 세포 침윤을 촉진하는 방법으로서,
    상기 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 상기 종양 내 NTPDase3+ 세포의 제거 및 감소를 초래하는 것인, 방법.
  32. 종양이 있는 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양내 면역 세포 기능의 II형 NKT 세포 억제를 감소시키는 방법으로서, 선택적으로,
    상기 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 상기 종양내 M2 대식세포의 제거 및 감소를 초래하는 것인 방법.
  33. 종양이 있는 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양내 면역 세포 기능의 조절성 T 세포(Treg) 억제를 감소시키는 방법으로서, 선택적으로,
    상기 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 상기 종양내 M2 대식세포의 감소된 면역억제 활성을 초래하는 것인 방법.
  34. 종양이 있는 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 종양내 NTPDase3 발현 세포의 감소를 초래하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 항-종양 면역 반응을 촉진하는 방법.
  35. 대상체의 종양 내 항종양 면역 기능을 촉진하는 방법으로서,
    (i) 비-침윤성 또는 과소-침윤성 종양 표현형인 것으로서 특징지어지기 위한 소정의 역치 미만인 정도의 종양 침윤된 종양-반응성 림프구를 갖는 암 대상체를 식별하는 단계; 및
    (ii) 상기 대상체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-NTPDase3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 종양내 M2 대식세포의 세포 수 또는 면역억제 활성을 저하시키는 양으로 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항종양 요법의 일부로서 투여되는 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고형 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로서 투여되며, 선택적으로 상기 고형 종양은 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종인 방법.
  38. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로서 투여되며, 선택적으로 상기 액체 종양은 백혈병인 방법.
  39. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 화학요법제, 항-혈관신생제, 면역종양제 및/또는 방사선을 수반하는 요법의 일부로서 투여되는 방법.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요법은 하나 이상의 관문 분자의 하나 이상의 저해제(길항제)를 투여하는 것을 포함하며, 선택적으로 상기 하나 이상의 관문 분자는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제, TIGIT 길항제 및 Siglec-15 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요법은 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작동제)를 투여하는 것을 포함하며, 선택적으로 상기 하나 이상의 공동자극 분자는 GITR 작동제, CD27 작동제, 4-1BB 작동제, OX40 작동제, CD137 작동제, ICOS 작동제 및 CD28 작동제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 저해제, IDO1 저해제, HDAC 저해제, PI3K 델타 저해제, IL-15 작동제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 저해제, 인터루킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작동제, TRL7/8 작동제, RIG-1 작동제 및/또는 NRLP3 저해제, 항-CD73 항체(예컨대, MEDI9447), P2X7 길항제, 또는 아데노신 A2A 수용체 길항제 또는 항-CD39 항체 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  43. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요법은 하나 이상의 선천성 면역 유도제를 투여하는 것을 포함하며, 선택적으로 상기 하나 이상의 선천성 면역 유도제는 CD47-SIRPα 축의 저해제, CD24-Siglec-10 축의 저해제, NK 및 CD8+ 세포의 HLA-E 유도 저해를 차단하는 NGK2A 관문 저해제, STING 작동제, TLR7/8 작동제 및 RIG-I 작동제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  44. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-NTPDase3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 종양 백신, 입양 세포 요법, 항종양 유전자 요법, 저해성 핵산 요법 및/또는 종양용해성 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로서 투여되는 방법.
KR1020237004453A 2020-09-10 2021-09-10 NTPDase3의 표적화를 통해 항종양 면역 반응을 강화하기 위한 방법 및 조성물 KR20230065974A (ko)

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