CN116113432A - 通过靶向NTPDase3增强抗肿瘤免疫反应的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

靶向检查点分子的免疫疗法与常规疗法(例如靶向疗法、化学疗法和血管生成抑制剂等)组合，已在治疗实体肿瘤或液体肿瘤方面显示出前景。然而，非肿瘤细胞在瘤内微环境中的作用已指示，这些细胞的消融可为启动针对所述肿瘤的有效免疫反应的关键，所述有效免疫反应包括细胞毒性T细胞和免疫系统的其他抗肿瘤细胞的肿瘤浸润。本发明不仅引起对作为产生腺苷的酶的NTPDaseB的外核苷酸酶活性的直接抑制，而且进一步利用NTPDaseB表达来通过NTPDaseB依赖性ADCC引起瘤内细胞消融。

Description

通过靶向NTPDase3增强抗肿瘤免疫反应的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年9月10日提交的美国临时申请第63/076,427号的优先权；所述申请的全部内容通过引用整体并入本文。
发明背景
对于患有晚期癌症的人来说，希望可为宝贵但罕见的东西。近年来，称为免疫检查点抑制剂的一类新型药物已显示显著前景，即预防肿瘤并防止其生长，并允许一些接受治疗的人基本上得到治愈。但这些开创性疗法具有相当大的挑战。尽管晚期癌症免疫疗法基于针对程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、PD1配体1(PDL1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)的抑制抗体在晚期癌症中的疗法取得成功，但相当大比例的患者仍对这些治疗无反应。
随着人们越来越关注免疫抑制肿瘤微环境作为耐药性的主要驱动因素和根据免疫细胞浸润水平对“热”和“冷”肿瘤的表征，研究人员已发现构成对检查点单一疗法缺乏有效反应的若干不同机制。免疫学上“热”的肿瘤含有高水平的浸润T细胞和更多抗原，使其更加可被免疫系统识别并且有更大可能触发强烈的免疫反应。被视为免疫学上“热”的癌症中包括膀胱癌、头颈癌、肾癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌。然而，即使在这些免疫学上“热”的癌症内，受益于免疫疗法的患者仍仅为少数。相比之下，免疫学上“冷”的肿瘤是出于各种原因含有极少浸润性T细胞、似乎不会被识别为外来的并且不会引起免疫系统的强烈反应的癌症，使得这些癌症难以用当前免疫疗法治疗。传统上，免疫学上“冷”的癌症包括胶质母细胞瘤，以及卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和大部分乳腺癌。
除癌细胞之外，肿瘤的微环境含有众多细胞类型，其包括骨髓源性炎症细胞、淋巴细胞、血管、周细胞、成纤维细胞以及由胶原蛋白和蛋白聚糖构成的细胞外基质(ECM)。实际上，肿瘤药物反应不仅仅由肿瘤细胞的固有特征决定，而是因为包括成纤维细胞、间充质基质细胞(MSC)、免疫炎症细胞、血管内皮细胞、周细胞和ECM的肿瘤相关基质细胞组合对抗癌治疗作出反应。
巨噬细胞是广泛分布的先天性免疫细胞，其在针对病原体的先天性和后天性免疫反应以及组织内稳态中起着必不可少的作用。巨噬细胞可通过多种刺激活化并极化成功能不同的表型。已提出两种不同亚组的巨噬细胞，包括经典活化(M1)的巨噬细胞和替代活化(M2)的巨噬细胞。M1巨噬细胞表达一系列促炎性细胞因子、趋化因子和效应分子，例如IL-12、IL-23、TNF-α、iNOS和MHCI/II。相比之下，M2巨噬细胞表达一系列广泛的抗炎性分子，例如IL-10、TGF-β和精氨酸酶1。在大部分肿瘤中，浸润的巨噬细胞被视为属于M2表型，其提供用于肿瘤生长的免疫抑制微环境。此外，肿瘤相关巨噬细胞分泌许多细胞因子、趋化因子和蛋白酶，其促进肿瘤血管生成、生长、转移和免疫抑制。抑制和/或减少瘤内M2和M2样巨噬细胞活性和/或水平是潜在的癌症治疗方法。
发明内容
外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(NTPDase1)，也称为CD39，是ENTPD1的基因产物并且是清除和催化胞外核苷酸的细胞表面胞外酶。已靶向此外核苷酸酶以产生与所述蛋白质相关的胞外酶活性的瘤内水平降低。在如此操作时，认为这种干预提高了驱动免疫反应的胞外核苷酸浓度并降低了免疫抑制性核苷衍生物腺苷的瘤内水平。
ENTPD家族成员外核苷三磷酸二磷酸水解酶-3(NTPDase3)大量表达于一些组织如胰腺β细胞中，其在所述组织中似乎在调节葡萄糖诱导的胰岛素分泌中起作用。参见Saunders等人(2019)Cell Meta b 29(3):745-754；Lavoie等人(2010)Am J PhysiolEndocrinol Metab 299:E647-E656；Munkonda等人(2009)FEBS J.276:479-496；WO2018227176和WO2006113237。相比于CD39，现有技术中所提出的使用NTPDase3抗体很大程度上限于潜在抗糖尿病效用，或更通常限于治疗代谢疾病；以及用于诊断和成像目的。在与免疫肿瘤学相关的范围内，其他人已具体地教导不使用NTPDase3抗体，而描述选择抗CD39抗体作为选择性结合于NTPDase1而非NTPDase2或NTPDase3。参见例如WO2017157948、WO2017089334、WO2019096900和WO2019243252。
本领域中先前未知的，NTPDase3也在肿瘤微环境中在细胞上并且以类似于NTPDase1的也用以产生免疫抑制或免疫排他性环境的方式上调。例如，显示NTPDase3在M2和M2样巨噬细胞上被上调，这可在肿瘤中赋予强效免疫抑制信号。不希望受任何特定理论束缚，NTPDase3在这种情形下的作用可能涉及促进M1巨噬细胞(抗肿瘤)向M2巨噬细胞(免疫抑制)的转化。在ATP存在下，M2巨噬细胞通过产生腺苷而变为强效免疫抑制细胞。
本发明至少部分地基于使用NTPDase3抗体和那些抗体所具有的抗肿瘤活性，但作用机制会影响肿瘤的细胞组成。这些作用经由靶向抑制NTPDase3的外核苷酸酶活性或通过靶向表达蛋白质的细胞(例如M2巨噬细胞和/或肿瘤血管周围的周细胞或成纤维细胞)而操作。后者这种方法允许使用某些抗体依赖性细胞毒性(ADCC)胜任型抗NTPDase3抗体消融肿瘤中的这些细胞。这些新颖试剂可用于减少肿瘤中的M2巨噬细胞活性和/或水平，以及增强细胞毒性T细胞的浸润，并且实际上将“冷”肿瘤转化成免疫学上“热”的肿瘤。不受理论束缚，本文中已确定NTPDase3是由与肿瘤血管相关的周细胞和成纤维细胞表达，使得此类细胞的消融(例如通过ADCC)被认为通过另一种不同机制，即中断肿瘤营养供应来减少肿瘤的过度增殖。
例如，在一个方面，提供了一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个抗原结合域，所述抗原结合域在使得所述抗NTPDase3抗体形成稳定免疫复合物的位点处结合外核苷三磷酸二磷酸水解酶-3(NTPDase3)，和(a)FcγRIIIa结合部分，所述结合部分结合FcγRIIIa受体并且赋予所述抗NTPDase3抗体针对NTPDase3+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性；和/或(b)其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段抑制NTPDase3酶活性。
还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文中所描述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。
例如，在一些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段在体外ADCC测定中的EC50为至少2×10-6摩尔(M)或更低，优选地其中EC50为1×10-6M或更低、0.5×10-6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M。
在一些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段在体外NTPD3酶活性抑制测定中的EC50为至少2×10-6M或更低，优选地其中EC50为1×10-6M或更低、0.5×10-6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M，并且其中最大抑制效力为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高，或其间的任何范围，包括端点，包括30％至99％，如通过体外NTPD3酶活性抑制测定所确定。
在一些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段在体外ADCC测定中的EC50为至少4×10-6M或更低，优选地其中EC50为2×10-6M或更低、1×10-6M或更低、0.5×10- 6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M；以及在体外酶活性抑制测定中的EC50为至少4×10-6M或更低，优选地其中EC50为2×10-6M或更低、1×10-6M或更低、0.5×10-6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M，并且其中最大抑制效力为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高，或其间的任何范围，包括端点，包括30％至99％，如通过体外NTPD3酶活性抑制测定所确定。
用于测量NTPD3功能性的多种测定设定是本领域中众所周知的。例如，具有不同NTPD3表达/酶活性水平的靶细胞；不同的功能测定方法(例如，用于测量ADCC的荧光素酶报告基因测定相对于直接NK杀伤测定、用于测量酶活性或其抑制的CellTiter-
Figure BDA0004113291790000061
发光测定相对于孔雀绿磷酸盐测定、用于测量酶活性或其抑制的PBS相对于改良林格氏缓冲液(Modified Ringer Buffer)等)。替代性测定可提供略微不同的测量输出值(例如EC50、酶抑制％等)，但用于在测定之间进行比较和/或归一化的方法对于本领域普通技术人员是常规和众所周知的。
在所述抗NTPDase3抗体包括FcγRIIIa结合部分的情况下，所述抗体可选自由以下组成的组：Fc域、结合于FcγRIIIa的抗体或其片段和FcγRIIIa结合肽。
在所述抗NTPDase3抗体是抗原结合域的情况下，所述抗体也可选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)、Fav、dsFv、sc(Fv)2、Fde、sdFv、单域抗体(dAb)和双功能抗体。
此类抗NTPDase3抗体也可为单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段与药剂缀合，任选地其中所述药剂选自由以下组成的组：结合蛋白、酶、药物、化学治疗剂、生物剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、可检测部分和标签。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段具有VH域，其氨基酸序列可由在严格条件下与本文所描述的核酸序列(例如SEQ ID No.1、9、13、17、21、25、29、33、37、41、75、79或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列的核酸)杂交的核酸或其核酸序列编码；和VL域，其氨基酸序列可由在严格条件下与本文所描述的核酸序列(例如SEQ IDNo.3、11、15、19、23、27、31、35、39、43、77、81或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列的核酸)杂交的核酸或其核酸序列编码(例如在45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下杂交，并且在50-65℃下在0.2×SSC/0.1％ SDS中洗涤)。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与本文所描述的重链可变序列(例如SEQ IDNo.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列)的CDR具至少60％同一性(例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR；和轻链，所述轻链具有与本文所描述的轻链可变序列(例如SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列)的CDR具至少60％同一性(例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含与本文所描述的可变重链序列(例如SEQ ID No.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列)具至少60％同一性(例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的可变重(VH)链；和与本文所描述的可变轻链序列(例如SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列)具至少60％同一性(例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的可变轻(VL)链。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的重链以及具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链，其中的每一者与本文所描述的相应可变重链和可变轻链序列(例如对于克隆PBI#30、3E9、4F9、8E1(包括h8E1)、16D4、37H1、38D5(包括h38D5)、38D12、42D8和44H5以及其变体)的相应CDR序列具至少80％同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)。例如，(i)重链，所述重链具有与SEQID No.45具至少80％同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR1氨基酸序列，与SEQ ID No.46具至少80％(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的CDR2氨基酸序列，和与SEQ ID No.47具至少80％同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR3氨基酸序列；以及(ii)轻链，所述轻链具有与SEQ ID No.48具至少80％同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR1氨基酸序列，与SEQ ID No.49具至少80％同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR2氨基酸序列，和与SEQ ID No.50具至少80％同一性(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的CDR3氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有选自由以下组成的组的CDR：本文所描述的可变重链序列(例如SEQ ID NO.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80和表2A、2B、2C、2D和3中所列的序列)的CDR；和轻链，所述轻链具有选自由以下组成的组的CDR：本文所描述的可变轻链序列(例如SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82和表2A、2B、2C、2D和3中所列的序列)的CDR；以及人类框架序列，以形成具有能够特异性结合人类NTPDase3的抗原结合位点的人源化重链和轻链。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含IgG1、IgG3、IgG2或IgG4同种型的Fc域，任选地其中所述Fc域是人类的，优选地所述同种型是具有ADCC活性的IgG1或IgG3。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是低岩藻糖基化或无岩藻糖基化的。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是人类的或者是人源化的。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是双特异性的：包括至少一个用于肿瘤抗原、免疫检查点或共刺激受体的额外抗原结合位点。其中如果所述额外抗原结合位点是用于免疫检查点，则其充当检查点抑制剂，并且其中如果所述额外抗原结合位点是用于共刺激受体，则其充当共刺激激动剂。在另一个实施方案中，所述额外抗原结合位点结合于检查点蛋白，例如选自由以下组成的组：CD39、PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT和Siglec-15。
在另一个实施方案中，所述额外抗原结合位点结合在T细胞上上调并与T细胞耗竭相关的检查点蛋白。在另一个实施方案中，所述额外抗原结合位点结合于免疫共刺激受体，例如选自由以下组成的组：MHCI分子、BTLA受体、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。
在另一个实施方案中，所述额外抗原结合位点结合于先天性免疫的诱导剂/增强剂，例如CD47、SIRPα、CD24、Siglec-15或Siglec-10。
在某些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是治疗性抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段具有针对NTPDase3+细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
在某些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段具有针对NTPDase3+瘤内细胞如NTPDase3+免疫细胞、癌细胞和/或肿瘤血管周围的周细胞和/或成纤维细胞的ADCC活性。
在某些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段可在NTPDase3+免疫细胞如M2巨噬细胞和/或肿瘤内其他类型的NTPDase3表达细胞上诱导抗体介导的对NTPDase3的目标细胞摄食。
在某些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段可在NTPDase3+免疫细胞如M2巨噬细胞和/或肿瘤内其他类型的NTPDase3表达细胞上抑制NTPDase3酶活性。
在某些实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段以与NTPDase3单克隆抗体克隆竞争性、非竞争性或部分竞争性结合于NTPDase3的方式结合于NTPDase3，其中所述NTPDase3单克隆抗体克隆选自由本文所描述的NTPDase3克隆组成的组，包括但不限于：PBI#30和其亲和力成熟变体；3E9、4F9、8E1和其人源化对应物；16D4、37H1、38D5和其在其主链序列中具有或不具有点突变的人源化对应物；38D12、42D8和44H5。
在另一方面，提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含治疗有效量的至少一种本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲液或溶液。例如，所述药物制剂可用于提高抗肿瘤T细胞免疫性并且适合于向患有肿瘤的受试者施用，包含有效量的所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲液或溶液，其中向所述受试者施用所述抗NTPDase3抗体引起瘤内NTPDase3+细胞如M2和M2样巨噬细胞的数目的减少，并且可i)增强T细胞浸润至所述肿瘤中，ii)肿瘤中的T细胞耗竭，和/或iii)破坏肿瘤相关脉管系统，由此导致肿瘤饥饿。
在另一方面，提供了一种药物制剂，其包含治疗有效量的至少一种本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲液或溶液。例如，所述药物制剂可用于抑制肿瘤血管生成并且适合于向患有肿瘤的受试者施用，包含有效量的所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲液或溶液，其中向所述受试者施用所述抗NTPDase3抗体引起瘤内NTPDase3+细胞如周细胞和/或成纤维细胞的数目的减少，并且可破坏肿瘤相关血管结构的完整性以限制肿瘤生长。
在另一方面，提供了一种分离的核酸分子，其i)在严格条件下与编码本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸的互补序列杂交；ii)具有在其整个全长中与编码本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸具至少约90％同一性的序列；或iii)编码本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽。
在另一方面，提供了一种分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽，其由本文所描述的核酸编码。
在另一方面，提供了一种包含本文所描述的分离核酸的载体，任选地其中所述载体是表达载体。
在另一方面，一种包含本文所描述的分离核酸的宿主细胞，其：a)表达本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段；b)包含本文所描述的多肽的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽；或c)包含本文所描述的载体。
在另一方面，提供了一种装置或试剂盒，其包含至少一种本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段。所述装置或试剂盒任选地包含标记以检测所述至少一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，或包含有包含所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的复合物。
在另一方面，提供了一种装置或试剂盒，其包含本文所描述的药物组合物、分离的核酸分子、分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽、载体和/或宿主细胞。
在另一方面，提供了一种产生至少一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在适合于允许表达所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的条件下，培养转化的宿主细胞，所述宿主细胞已通过包含编码所述至少一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的序列的核酸转化；以及(ii)回收所述所表达的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，提供了一种检测NTPDase3多肽的存在或水平的方法，所述方法包括获得样品以及通过使用至少一种本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段检测所述样品中的所述多肽。例如，至少一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段可与所述NTPDase3多肽形成复合物并且所述复合物可以酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫化学测定法、蛋白质印迹(Western blot)、质谱测定法、核磁共振测定法的形式或使用细胞内流动测定法检测。
在另一方面，提供了一种用于通过耗竭瘤内NTPDase3+细胞(例如M2和M2样巨噬细胞、周细胞和/或成纤维细胞)来改进抗肿瘤疗法的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起瘤内NTPDase3+细胞的数目的减少。
在另一方面，提供了一种用于促进免疫细胞浸润至肿瘤中的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起所述肿瘤中NTPDase3+细胞的消融和减少。
在另一方面，提供了一种用于减少II型NKT细胞对瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，任选地其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起所述肿瘤中M2巨噬细胞的消融和减少。
在另一方面，一种用于减少调节T细胞(Treg)对瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，任选地其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起所述肿瘤中M2巨噬细胞的免疫抑制活性降低。
在另一方面，提供了一种用于促进抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其量足以引起所述肿瘤中NTPDase3表达细胞减少。
在另一方面，提供了一种用于促进受试者肿瘤中的T细胞介导的免疫功能的方法，所述方法包括(i)鉴定癌症受试者，其肿瘤浸润的肿瘤反应性淋巴细胞的程度低于预定阈值，以表征为非浸润或浸润不足的肿瘤表型；以及(ii)向所述受试者施用增加所述肿瘤中肿瘤反应性T细胞活性的量的本文所描述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段。
在示例性实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为抗肿瘤疗法，例如用于治疗实体肿瘤的抗肿瘤疗法的部分施用，任选地其中所述实体肿瘤是胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌或神经胶质瘤。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为用于治疗液体肿瘤的抗肿瘤疗法的部分施用，任选地其中所述液体肿瘤是白血病。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为涉及一种或多种化学治疗剂、抗血管生成剂、免疫肿瘤学药剂和/或放射的疗法的部分施用。
在另一个实施方案中，所述疗法包括施用一种或多种检查点分子的一种或多种抑制剂(拮抗剂)，任选地其中所述一种或多种检查点分子选自由以下组成的组：PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG-3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、TIGIT拮抗剂和Siglec-15拮抗剂。在另一个实施方案中，所述疗法包括施用一种或多种共刺激分子的一种或多种活化剂(激动剂)，任选地其中所述一种或多种共刺激分子选自由以下组成的组：GITR激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD137激动剂、ICOS激动剂和CD28激动剂。
在另一个实施方案中，所述疗法包括施用以下中的一者或多者：VEGFR或VEGF拮抗剂、EGFR或EGF拮抗剂、IDO抑制剂、IDO1抑制剂、HDAC抑制剂、PI3Kδ抑制剂、IL-15激动剂、CXCR4拮抗剂、CXCL12拮抗剂、DNMT抑制剂、白细胞介素-21、抗KIR抗体、抗CSF-1R抗体、抗CCR4抗体、GMCSF、抗PS抗体、抗CD30抗体-澳瑞他汀(aurstatin)E缀合物、抗CD19抗体、抗CEA IL-2抗体、抗NY-ESO-1抗体、抗NKG2A抗体、STING激动剂、TRL7/8激动剂、RIG-1激动剂和/或NRLP3抑制剂、抗CD73抗体(例如MEDI9447)、P2X7拮抗剂、腺苷A2a受体拮抗剂或抗CD39抗体。
在另一个实施方案中，所述疗法包括施用一种或多种先天性免疫诱导剂，任选地其中所述一种或多种先天性免疫诱导剂选自由以下组成的组：CD47-SIRPα轴的抑制剂(例如与CD47或SIRPα结合并抑制两个分子的相互作用的抗体或其他结合部分)、CD24-Siglec-10轴的抑制剂(例如与CD24或Siglec-10结合并抑制两个分子的相互作用的抗体或其他结合部分)、阻断HLA-E驱动的对NK和CD8+细胞的抑制的NGK2A检查点抑制剂、STING激动剂、TLR7/8激动剂和RIG-I激动剂。
在另一个实施方案中，所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为疗法的一部分施用，所述疗法包括肿瘤疫苗、过继性细胞疗法(包括CAR-T和ACTR疗法)、抗肿瘤基因疗法、抑制性核酸疗法(例如siRNA、shRNA、反义、CRISPR和TALEN疗法)和/或溶瘤病毒疗法。在另一个实施方案中，所述受试者是具有癌症的动物模型。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物，任选地其中所述哺乳动物是人类或啮齿动物。
附图说明
图1.使用人类ENTPD3(hENTPD3)阳性CHO细胞(稳定转染的细胞)通过流式细胞术测量的PBI#30的亲和力。PBI#30如所指示进行连续稀释(最高剂量333nM)并在4℃下与CHO-hENTPD3细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000151
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。Kd被计算为5.53nM。
图2.使用hENTPD3阳性CHO-7细胞(稳定转染的细胞)通过流式细胞术测量的PBI#30的亲和力。PBI#30如所指示进行连续稀释(最高剂量133nM)并在4℃下与COS7-hENTPD3细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000152
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。Kd被计算为11.9nM。
图3.使用hENTPD3阳性HEK293T细胞(稳定转染的细胞)通过流式细胞术测量的PBI#30的亲和力。PBI#30如所指示进行连续稀释(最高剂量133nM)并在4℃下与HEK293T-hENTPD3细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000165
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。Kd被计算为8.4nM。
图4.使用内源性表达hENTPD3的RT4膀胱癌细胞通过流式细胞术测量的PBI#30的亲和力。PBI#30如所指示进行连续稀释(最高剂量133nM)并在4℃下与RT4细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000161
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。Kd被计算为10.1nM。
图5.PBI#30抑制CHO细胞膜上的hENTPD3酶活性。将CHO-hENTPD3细胞在37℃下与10μg/mL人类IgG1同种型Ultra-LEAF、小鼠抗hENTPD3克隆hN3-B3s或PBI#30一起温育30分钟，接着在室温下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000162
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图6.PBI#30在饱和剂量下完全抑制CHO细胞膜上的hENTPD3酶活性。将CHO-hENTPD3细胞在37℃下与连续稀释的人类IgG1同种型Ultra-LEAF或PBI#30(最高剂量50μg/mL)一起温育30分钟，接着在室温下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000163
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP并呈现于图示中以用于比较。EC50被计算为17.30μg/mL。
图7.PBI#30抑制RT4细胞膜上的hENTPD3酶活性。将贴壁和悬浮状态的RT4细胞在37℃下与10μg/mL人类IgG1同种型Ultra-LEAF或PBI#30一起温育30分钟，接着在37℃下与ATP(25μM，贴壁；或50μM，悬浮)一起温育45分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000164
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)和在不存在细胞的情况下单独的ATP(25或50μM)，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图8.PBI#30表明针对CHO-hENTPD3细胞的ADCC活性。使用CHO-hENTPD3细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。将靶细胞在37℃下于5％CO2中如所指示与连续稀释的PBI#30一起预温育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性相对于背景的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50被计算为0.092μg/mL。
图9.使用CHO-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的人类/兔嵌合抗人类ENTPD3克隆的亲和力。用人类IgG1 Fc(人类/兔嵌合克隆；Hu/Ra)嵌合的兔抗人类ENTPD3单克隆抗体如所指示进行连续稀释(最高剂量33nM)并在4℃下与CHO-hENTPD3细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000173
488)持续30分钟，并进行流式细胞术分析。计算每个克隆的Kd并呈现。
图10.使用COS7-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的人类/兔嵌合抗人类ENTPD3克隆的亲和力。Hu/Ra嵌合抗人类ENTPD3克隆(Hu/Ra)如所指示进行连续稀释(最高剂量133nM)并在4℃下与COS7-hENTPD3细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000171
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。计算每个克隆的Kd并呈现。
图11.使用HEK293T-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的人类/兔嵌合抗人类ENTPD3克隆的亲和力。Hu/Ra嵌合抗人类ENTPD3克隆如所指示进行连续稀释(最高剂量133nM)并在4℃下与HEK293T-hENTPD3细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000172
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。计算每个克隆的Kd并呈现。
图12.使用hENTPD3阳性RT4膀胱癌细胞通过流式细胞术测量的人类/兔嵌合抗人类ENTPD3克隆的亲和力。人类/兔嵌合抗人类ENTPD3克隆(Hu/Ra)，除了作为兔单克隆抗体的3E9外，如所指示进行连续稀释(最高剂量133nM)并在4℃下与RT4细胞一起温育30分钟，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类或抗兔IgG，Alexa
Figure BDA0004113291790000182
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。计算每个克隆的Kd并呈现。
图13.在所有嵌合克隆中，克隆38D5在CHO细胞膜上发挥对hENTPD3酶活性的最高抑制能力。将CHO-hENTPD3细胞在37℃下与人类10μg/mL IgG1同种型Ultra-LEAF、小鼠抗hENTPD3克隆hN3-B3s或Hu/Ra嵌合抗人类ENTPD3克隆一起温育30分钟，接着在室温下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000183
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图14.克隆38D5即使在饱和剂量下也部分抑制CHO细胞膜上的hENTPD3酶活性。将CHO-hENTPD3细胞在37℃下与连续稀释的人类IgG1同种型Ultra-LEAF或Hu/Ra 38D5克隆(最高剂量50μg/mL)一起温育30分钟，接着在室温下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000181
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP并且呈现于图示中以用于比较。EC50被计算为15.92μg/mL。
图15.在所有嵌合克隆中，克隆38D5在RT4细胞膜上发挥对hENTPD3酶活性的最高抑制能力。将贴壁和悬浮状态的RT4细胞在37℃下与10μg/mL人类IgG1同种型Ultra-LEAF或Hu/Ra嵌合抗人类ENTPD3克隆(除了作为兔单克隆抗体的3E9外)一起温育30分钟，接着在37℃下与ATP(25μM，贴壁；或50μM，悬浮)一起温育45分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000191
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP(25或50μM)，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图16.人类/兔嵌合克隆针对CHO-hENTPD3细胞的ADCC活性。使用CHO-hENTPD3细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。将靶细胞在37℃下于5％CO2中如所指示与连续稀释的Hu/Ra嵌合抗人类ENTPD3抗体一起预温育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性相对于背景的增加指示。RLU：相对发光单位。计算每个克隆的EC50并呈现。
图17.CHO-hENTPD3细胞中所有抗人类ENTPD3单克隆抗体的表位竞争测定。将CHO-hENTPD3细胞在4℃下与20μg/ml的未缀合的人类IgG1同种型Ultra-LEAF或抗人类ENTPD3抗体一起温育30分钟。然后将细胞在4℃下与Alexa
Figure BDA0004113291790000192
647缀合的克隆3E9、38D5、38D12、44H5或PBI#30一起温育30分钟，洗涤两次并通过流式细胞术分析。计算AF647 MFI检测相对于同种型对照的倍数变化(无表位重叠＝1)。
图18.体内人类/兔嵌合克隆38D5和8E1的抗肿瘤功效。在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(5×105)皮下接种6至8周龄的C57BL6 hENTPD3 KI小鼠。然后将小鼠随机分为三组(n＝6)。在第4天，荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受20mg/kg嵌合抗hENTPD3抗体38D5或8E1或200μl生理盐水。在第7、10和14天，荷瘤小鼠接受10mg/kg 38D5或8E1抗体或200μl生理盐水。使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，每周两次。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
图19.使用CHO-hENTPD3和COS7-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的完全人类抗hENTPD3单克隆抗体PBI#30hIgG1的亲和力。一般而言，图19和下文是针对抗hENTPD3单克隆抗体克隆的分析，其已进一步优化示例性(例如针对PBI#30的亲和力成熟和同种型转换以及8E1和38D5的人源化)和相关检测方法。例如，图19显示测定结果，其中PBI#30hIgG1如所指示进行连续稀释(最高剂量33nM)并在37℃下与细胞一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000201
488)持续30分钟并进行后续流式细胞术分析。Kd对于CHO-hENTPD3细胞被计算为2.96nM并且对于COS7-hENTPD3细胞被计算为1.82nM。
图20.PBI#30hIgG1抗体抑制hENTPD3阳性CHO和COS7细胞膜上的hENTPD3酶活性。将细胞在37℃下与2μg/mL人类IgG1同种型Ultra-LEAF或PBI#30hIgG1一起温育2小时，接着在37℃下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000202
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如下文材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图21.PBI#30hIgG1针对CHO-hENTPD3细胞不具有CDC活性。将PBI#30hIgG1如所指示进行连续稀释并在37℃下与CHO-hENTPD3靶细胞一起预温育30分钟，接着与10％正常人类血清(NHS)一起温育2小时。通过流式细胞术分析靶细胞裂解并计算P/I+细胞％(细胞毒性％)。未注意到CDC活性，因此EC50被列为N/A(不适用)。
图22.测定PBI#30hIgG1的体内抗肿瘤活性。在150μl的RPMI1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(5×105)皮下接种6至8周龄的C57BL6 hENTPD3 KI小鼠。然后将小鼠随机分为两组(n＝6)。在第4天，荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受20mg/kg PBI#30hIgG1或200μl生理盐水。在第7、10和14天，荷瘤小鼠接受10mg/kg PBI#30hIgG1或200μl生理盐水。使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，每周两次。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
图23.使用CHO-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的PBI#30成熟变体的亲和力。原始克隆PBI#30hIgG1经受亲和力成熟以及同种型转换过程，从而产生八种新变体。PBI#30成熟变体如所指示进行连续稀释(最高剂量66nM)并在37℃下与CHO-hENTPD3细胞一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000211
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。使用原始PBI#30hIgG1抗体作为参考。计算每个变体的Kd并呈现。
图24.使用COS7-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的PBI#30成熟变体的亲和力。PBI#30成熟变体和原始PBI#30hIgG1抗体如所指示进行连续稀释(最高剂量66nM)并在37℃下与COS7-hENTPD3细胞一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000212
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。计算每个变体的Kd并呈现。
图25.PBI#30成熟变体强烈抑制CHO-hENTPD3细胞膜上的hENTPD3酶活性。将CHO-hENTPD3细胞在37℃下与2μg/mL PBI#30成熟变体一起温育2小时，接着在37℃下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000213
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。使用原始PBI#30hIgG1抗体作为参考。
图26.如果PBI#30hIgG1成熟变体被温育较长时间，则其在较低剂量下完全抑制CHO细胞膜上的hENTPD3酶活性。将细胞在37℃下与连续稀释的同种型对照或抗体(最高剂量10μg/mL)一起温育2小时，接着在室温下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000214
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP并呈现于图示中以用于比较。计算EC50并呈现。注意原始克隆PBI#30hIgG1的EC50与图6的差异，其中在4℃下将细胞与抗体一起温育30分钟。
图27.PBI#30成熟变体Fc胜任型af4 hIgG1而非Fc缄默型af4hIgG4具有针对CHO-hENTPD3细胞的高度ADCC活性。使用CHO-hENTPD3细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。将靶细胞在37℃下如所指示与连续稀释的同种型对照或PBI#30成熟变体一起预温育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性相对于背景的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50对于PBI#30hIgG1被计算为1.443μg/mL并且对于PBI#30af4 hIgG1被计算为0.434。相对于PBI#30hIgG1的ADCC倍数增加被测定为：成熟变体的RLU/PBI#30hIgG1的RLU(1μg/mL)。注：与亲本PBI#30hIgG1克隆相比，PBI#30af4 hIgG1成熟变体显示ADCC活性增加了2.8倍。
图28.PBI#30成熟变体针对CHO-hENTPD3细胞不具有CDC活性。将PBI#30hIgG1和其成熟变体如所指示进行连续稀释并在37℃下与CHO-hENTPD3靶细胞一起预温育30分钟，接着与10％正常人类血清(NHS)一起温育2小时。通过流式细胞术分析靶细胞裂解并计算P/I+细胞％(细胞毒性％)。未注意到CDC活性，因此EC50被列为N/A(不适用)。PC：内部阳性对照。
图29.体内两个示例性PBI#30成熟变体(af4 hIgG1和af4 hIgG4)的抗肿瘤功效。在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(1×105)皮下接种13至16周龄的C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠。然后将小鼠随机分为三组(n＝8只/组)。荷瘤小鼠经由腹膜内注射在第8、12、15、18和21天接受3mg/kg完全人类抗hENTPD3抗体PBI#3af4 hIgG1或PBI#3af4 hIgG4，或200μl生理盐水。每两天使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
图30.重复剂量暴露后体内PBI#30成熟变体(af4 hIgG1和af4hIgG4)的血浆清除率。在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(1×105)皮下接种13至16周龄的C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠。荷瘤小鼠经由腹膜内注射在第8、12、15、18和21天接受3mg/kg PBI#3af4 hIgG1或PBI#3af4 hIgG4。在第20、21、22和24天收集血浆样品，并通过流式细胞术使用COS7-hENTPD3细胞通过结合分析检测游离血浆抗体水平。使用PBI#30af4 hIgG1和hIgG4(2μg/mL)作为相应阳性对照以指示最大细胞结合。样品名称命名为：动物编号+收集日期。应注意，在重复剂量暴露之后，PBI#30af4 hIgG1抗体在小鼠血液中被快速清除(8只小鼠中仅3只检测到血浆抗体水平)，而PBI#30af4 hIgG4保持稳定(100％小鼠具有可检测血浆抗体水平和良好体外结合动力学)。
图31.使用hENTPD3阳性CHO、COS7和HEK293T细胞通过流式细胞术测量的8E1人类/兔嵌合克隆和其人源化(hIgG1)对应物的亲和力。用人类IgG1 Fc(人类/兔嵌合克隆；8E1Hu/Ra)嵌合的8E1兔抗人类ENTPD3单克隆抗体和其人源化对应物(8E1 hIgG1)如所指示进行连续稀释(最高剂量66nM)并在37℃下与细胞一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000231
488)持续30分钟，并进行流式细胞术分析。计算每个克隆的Kd并呈现于表中。注：这三种细胞系表达不同水平的hENTPD3：HEK293T-hENTPD3(极高)>CHO-hENTPD3(高)>COS7-hENTPD3(中度)。HEK293T-hENTPD3细胞含有极高的hENTPD3表达/酶活性水平并且不视为生理学上相关的。COS7-hENTPD3细胞上的表达水平类似于RT4膀胱癌细胞(内源性表达hENTPD3)上的表达水平。由于用RT4细胞培养/操作的技术困难，选择与ENTPD3表达匹配的两个生理学相关细胞系COS7-hENTPD3和CHO-hENTPD3用于体外结合和功能测定，分别表示瘤内ENTPD3+和ENTPD3高细胞。
图32.8E1 Hu/Ra克隆和其人源化(hIgG1)对应物显示对hENTPD3阳性CHO、COS7和HEK293T细胞膜上的hENTPD3酶活性的最小抑制。将细胞在37℃下与2μg/mL 8E1 Hu/Ra或其人源化对应物(8E1 hIgG1)一起温育2小时，接着在37℃下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000241
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。注：HEK293T-hENTPD3细胞含有极高hENTPD3酶活性，因此极快速降解外源性ATP。这种功能特征不被视为生理学上相关的。
图33.8E1 Hu/Ra克隆和其人源化(hIgG1)对应物甚至在较高剂量下也显示对CHO细胞膜上的hENTPD3酶活性的最小抑制。将细胞在37℃下与连续稀释的同种型对照或抗体(最高剂量10μg/mL)一起温育2小时，接着在室温下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000242
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP并呈现于图示中以用于比较。无法计算EC50，因此将其列为N/A(不适用)。
图34.人源化8E1克隆(8E1 hIgG1)表明针对CHO-hENTPD3细胞的明显较高的ADCC活性。使用CHO-hENTPD3细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。将靶细胞在37℃下如所指示与连续稀释的8E1 Hu/Ra或其人源化对应物(8E1 hIgG1)一起预温育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性相对于背景的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50对于8E1 Hu/Ra被计算为0.075μg/mL并且对于8E1 hIgG1被计算为0.047。相对于8E1 Hu/Ra的ADCC倍数增加被测定为：人源化克隆的RLU/嵌合克隆的RLU(1μg/mL)。应注意，与亲本8E1 Hu/Ra嵌合克隆相比，人源化8E1 hIgG1显示ADCC活性增加了1.5倍。
图35.人源化8E1克隆(8E1 hIgG1)展现针对CHO-hENTPD3细胞的明显较高的CDC活性。将8E1人类/兔嵌合克隆(8E1 Hu/Ra)和其相应人源化克隆(8E1 hIgG1)如所指示连续稀释并在37℃下与CHO-hENTPD3细胞靶细胞一起预温育30分钟，接着与10％正常人类血清(NHS)一起温育2小时。通过流式细胞术分析靶细胞裂解并计算EC50和P/I+细胞％(细胞毒性％)。最大细胞毒性相对于背景的百分比测定为：对于每个克隆，最大细胞毒性％(1μg/mL)-背景细胞毒性％(10-3μg/mL)。应注意，与亲本8E1 Hu/Ra嵌合克隆相比，人源化8E1hIgG1显示最大CDC细胞毒性的2倍增加。
图36.使用hENTPD3阳性CHO、COS7和HEK293T细胞通过流式细胞术测量的38D5人类/兔嵌合克隆和其人源化(hIgG1)对应物的亲和力。用人类IgG1 Fc(人类/兔嵌合克隆；38D5 Hu/Ra)嵌合的38D5兔抗人类ENTPD3单克隆抗体和其人源化对应物(38D5 hIgG1)如所指示进行连续稀释(最高剂量66nM)并在37℃下与细胞一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000251
488)持续30分钟，并进行流式细胞术分析。计算每个克隆的Kd并呈现。
图37.38D5 Hu/Ra克隆和其人源化(hIgG1和hIgG4)对应物对在膜上表达不同水平的hENTPD3的细胞施加不同酶活性抑制效力。将分别表达高、中度和极高hENTPD3膜水平的CHO、COS7和HEK293T细胞在37℃下与2μg/mL 38D5 Hu/Ra或其人源化对应物(38D51hIgG1或38D5 hIgG4)一起温育2小时，接着在37℃下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000252
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图38.38D5 Hu/Ra克隆和其人源化(hIgG1)对应物以与剂量无关的相同速率适当抑制CHO细胞膜上的hENTPD3酶活性。将细胞在37℃下与连续稀释的同种型对照或抗体(最高剂量10μg/mL)一起温育2小时，接着在室温下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000261
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP并呈现于图示中以用于比较。EC50对于38D5 Hu/Ra被计算为0.31μg/mL并且对于38D5 hIgG1被计算为0.22μg/mL。
图39.人源化38D5克隆(38D5 hIgG1)表明针对CHO-hENTPD3细胞的较高ADCC活性。使用CHO-hENTPD3细胞作为靶细胞。使用稳定表达荧光素酶和hCD16a-158V的Jurkat细胞作为效应细胞。将靶细胞在37℃下如所指示与连续稀释的38D5 Hu/Ra或其人源化对应物(38D5 hIgG1)一起预温育30分钟，接着与效应细胞(T:E＝1:6)一起共培养6小时。ADCC活性由荧光素酶活性相对于背景的增加指示。RLU：相对发光单位。EC50对于38D5 Hu/Ra被计算为0.1041μg/mL并且对于38D5 hIgG1被计算为0.1036μg/mL。相对于38D5 Hu/Ra的ADCC倍数增加测定为：人源化克隆的RLU/嵌合克隆的RLU(1μg/mL)。应注意，与亲本38D5 Hu/Ra嵌合克隆相比，人源化38D5hIgG1显示ADCC活性增加了1.2倍。
图40.人源化38D5 hIgG1展现针对CHO-hENTPD3细胞的较高CDC活性。将38D5人类/兔嵌合克隆(38D5 Hu/Ra)和其相应人源化克隆(38D5 hIgG1)如所指示连续稀释并在37℃下与CHO-hENTPD3细胞靶细胞一起预温育30分钟，接着与10％正常人类血清(NHS)一起温育2小时。通过流式细胞术分析靶细胞裂解并计算P/I+细胞％(细胞毒性％)。计算每个克隆的EC50并呈现。最大细胞毒性相对于背景的百分比测定为：对于每个克隆，最大细胞毒性％(1μg/mL)-背景细胞毒性％(10-3μg/mL)。
图41.使用CHO-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的人源化38D5 hIgG1主链点突变变体的亲和力。人源化38D5(38D5 hIgG1)在轻链(L)或重链(H)的主链处经历点突变，产生八种新变体。将38D5hIgG1克隆变体如所指示进行连续稀释(最高剂量66nM)并在37℃下与细胞一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000271
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。使用原始人源化38D5 hIgG1抗体作为参考。计算每个克隆的Kd并呈现。
图42.使用COS7-hENTPD3细胞通过流式细胞术测量的人源化38D5 hIgG1克隆变体的亲和力。将38D5人源化(38D5 hIgG1)克隆变体如所指示进行连续稀释(最高剂量66nM)并在37℃下与细胞一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000272
488)持续30分钟并进行流式细胞术分析。使用原始人源化38D5 hIgG1抗体作为参考。计算每个克隆的Kd并呈现。
图43.人源化38D5 hIgG1克隆变体显示对CHO-hENTPD3细胞膜的中度hENTPD3酶活性抑制效力。将细胞在37℃下与2μg/mL人类IgG1同种型Ultra-LEAF或38D5 hIgG1变体或原始人源化38D5hIgG1抗体一起温育2小时，接着在37℃下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000273
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图44.人源化38D5 hIgG1克隆变体部分抑制COS7-hENTPD3细胞膜上的hENTPD3酶活性。将细胞在37℃下与2μg/mL人类IgG1同种型Ultra-LEAF或38D5 hIgG1变体或原始人源化38D5 hIgG1抗体一起温育2小时，接着在37℃下与ATP(250μM)一起温育15分钟。然后收集上清液并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790000274
通过发光检测ATP水平。也并行检测不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下单独的ATP，以便计算如材料与方法中所描述的酶活性抑制％。
图45.体内Fc胜任型人源化38D5 hIgG1的抗肿瘤功效。在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(5×105)皮下接种6至8周龄的C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠。然后将小鼠随机分为两组(n＝5只/组)。在第4天，荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受20mg/kg人源化38D5 hIgG1抗体或200μl生理盐水。在第7、10和14天，荷瘤小鼠接受10mg/kg 38D5 hIgG1抗体或200μl生理盐水。使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，每周两次。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
图46.分析Fc缄默型人源化38D5 hIgG4在体内肿瘤杀伤测定中的作用。在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(5×105)皮下接种6至8周龄的C57BL6 hENTPD3KI雌性小鼠。然后将小鼠随机分为两组(n＝5只/组)。在第4天，荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受20mg/kg人源化38D5 hIgG4抗体或200μl生理盐水。在第7、10和14天，荷瘤小鼠接受10mg/kg 38D5 hIgG4抗体或200μl生理盐水。使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，每周两次。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
图47.在单次剂量暴露后，Fc胜任型人源化38D5 hIgG1是体内稳定的。9周龄C57BL6 hENTPD3 KI无肿瘤雌性小鼠经由腹膜内注射接受一次剂量的1或10mg/kg 38D5hIgG1。然后在24和48h后从每只小鼠收集血浆样品，并通过流式细胞术使用COS7-hENTPD3细胞通过结合分析来检测游离血浆抗体水平。使用38D5 hIgG1(2μg/mL)作为阳性对照以指示最大细胞结合。在此实验中使用总共两只小鼠，各剂量一只小鼠。样品名称命名为：注射剂量+收集时间。
图48.在重复剂量暴露后，Fc胜任型人源化38D5 hIgG1保持体内稳定。在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(1×105)皮下接种9周龄的C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠。荷瘤小鼠经由腹膜内注射在第12、15、18和21天接受3mg/kg 38D5 hIgG1。在第19、21和23天收集血浆样品，并通过流式细胞术使用COS7-hENTPD3细胞通过结合分析来检测游离血浆抗体。使用38D5hIgG1(2μg/mL)作为阳性对照以指示最大细胞结合。样品名称命名为：动物编号+收集日期。
图49.8E1、38D5和PBI#30hIgG1的不同结合动力学概况影响细胞亲和力。将抗体如所指示进行连续稀释(最高剂量33nM)并在4℃下与CHO-hENTPD3细胞一起温育20min或在37℃下一起温育2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa
Figure BDA0004113291790000291
488)持续30分钟并进行后续流式细胞术分析。计算每个克隆的Kd并呈现。应注意，38D5和PBI#30克隆的Kd显著增加，但在延长温育时间后，克隆8E1的Kd没有增加。
图50.抗体稳定性：COS7-hENTPD3细胞上示例性Fc胜任型抗ENTPD3单克隆抗体的抗原免疫复合物。如所指示的本发明中的示例性抗人类ENTDP3抗体(6μg/ml)在37℃下于5％ CO2中与贴壁的COS7-hENTPD3细胞一起温育24小时或2小时，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa Fluor 488)持续30分钟。然后将细胞洗涤，胰蛋白酶化并通过流式细胞术分析。2小时与24小时处理之间的AF488 MFI差异表示细胞膜上如材料与方法中所描述计算的人类ENTPD3的损失。8E1和38D5 Hu/Ra：人类/兔嵌合抗体；8E1和38D5 hIgG1：人源化兔抗体；PBI#30hIgG1和PBI#30af4hIgG1：完全人类抗体和其亲和力成熟变体。
图51.抗体稳定性：其他主题ADCC高度单克隆抗ENTPD3抗体对CHO-hENTPD3细胞的抗原免疫复合物。将人类/兔嵌合抗体(2μg/ml)在37℃下在5％ CO2中与CHO-hENTPD3细胞一起温育24小时或在4℃下温育20min，接着在4℃下进行二级抗体染色(抗人类IgG(Fc特异性)，Alexa Fluor 488)持续30分钟。然后将细胞洗涤并通过流式细胞术分析。20分钟与24小时处理之间的AF488 MFI差异表示细胞膜上如材料与方法中所描述计算的人类ENTPD3的损失。
具体实施方式
I.概述
肿瘤微环境由于其促进恶性细胞的增殖和存活、血管生成、癌转移、异常免疫性以及对激素和化学治疗剂的反应减少而视为非常重要的治疗目标。在许多研究中，已证实肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境中的主要因素和血管生成的重要调节因子，所述肿瘤相关巨噬细胞通过向低氧肿瘤位点供应氧和营养而对肿瘤进展来说是必需的。因此，当癌症患者中肿瘤周围存在大量肿瘤相关巨噬细胞时，已报道患者的预后和存活率不良。肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用仍是高度争论的。
肿瘤相关巨噬细胞分类为肿瘤抑制因子M1或肿瘤支持M2巨噬细胞的两种表型。M1型肿瘤相关巨噬细胞具有强呈递抗原的能力并且通常呈递CD86和TNF-α。相比之下，M2型肿瘤相关巨噬细胞具有低抗原呈递能力和高吞噬作用潜力。
已知M2型巨噬细胞通过释放各种细胞外基质组分、血管生成和趋化性因子促进免疫抑制、肿瘤发生和血小管生成。M2型肿瘤相关巨噬细胞通过表达一些标志物如CD163、CD204、CD206和IL-10而区别于M1型肿瘤相关巨噬细胞。在大部分肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和皮肤黑色素瘤中，肿瘤微环境包括IL-10，其能够诱导引入CSF-1、VEGF、CCL2、IL-4、IL-13、TGF-β和单核细胞并诱导具有与M2类似的表型的分化。
先前研究已表明，通过囊封的氯膦酸耗竭巨噬细胞可能限制肿瘤组织中的血管生成。此外，因为经由CSF-1R和CCR2抗体阻止巨噬细胞的浸润，所以有可能限制和降低肿瘤启动特性并增加细胞毒性T淋巴细胞的活性。因此，当高水平的M2型肿瘤相关巨噬细胞存在于肿瘤微环境中时，肿瘤的生长、分化和转移均得到活化。因此，靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞的创新元件可提供预防肿瘤生长和转移的潜在疗法。
本发明至少部分地基于以下发现：针对NTPDase3的某些限定抗体能够选择性地靶向和消融(例如通过ADCC)肿瘤微环境中的此类NTPDase3表达细胞。这通过靶向NTPDase3+巨噬细胞(尤其是M2/M2样巨噬细胞)和/或肿瘤的其他NTPDase3+细胞组成，例如NTPDase3+瘤内细胞(如癌细胞)以及肿瘤血管周围的周细胞和/或成纤维细胞更有效地发生。随着增强的T细胞浸润出现至肿瘤中，瘤内NTPDase3+细胞数目的所得减少可引起肿瘤发炎表型的此类变化。这些也可能降低肿瘤中的T细胞耗竭水平，减少II型NKT细胞对瘤内免疫细胞功能的抑制和/或调节T细胞(Treg)抑制瘤内免疫细胞功能的限制，和/或破坏肿瘤相关脉管系统，从而限制营养物供应至肿瘤(例如肿瘤饥饿)。
本发明的另一方面至少部分地基于以下发现：针对NTPDase3的某些抗体能够抑制NTPDase的酶活性并且从而降低腺苷在特定位点处的瘤内浓度。胞外腺苷已被称为免疫功能的抑制剂。尽管胞内腺苷参与能量代谢、核酸代谢和甲硫氨酸循环，但在肿瘤微环境中，胞外腺苷在抑制免疫信号传导中起重要作用。免疫抑制性腺苷3'5'-单磷酸(cAMP)介导的通路，即经由腺苷A2A受体(A2AR)进行信号传导，可抑制低氧、发炎和癌性微环境中的T淋巴细胞和自然杀手(NK)细胞(Ohta等人(2006)Proc Natl Acad Sci USA,103:13132-7)。
临床前证据以及近期和不断发展的积极临床试验数据证实，施用A2AR抑制剂可为免疫疗法的潜在新颖策略。另外，阻断涉及CD39/CD73的腺苷产生途径也在实验动物模型中诱导乳腺癌、结直肠癌和黑色素瘤的消退。在抗CD39和抗CD73抗体疗法的情况下，焦点主要在于抑制或减少ATP和衍生物核苷酸代谢，最终经由结合至这些细胞表面腺苷产生酶(外核苷酸酶)并抑制酶活性或从细胞表面去除酶活性来变为腺苷。
如示例性方法中更详细地描述并且附图中所说明，产生本文所描述的抗ENTPD3抗体，包括作为经特定设计以具有含IgG1域的人类恒定区的完全人类抗体或人源化抗体的抗体，并测定多种功能。基于IgG1域的设计为本发明的抗ENTPD3抗体赋予FcγRIIIa受体依赖性细胞活性，例如针对ENTPD3+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，和/或抗体介导的对瘤内ENTPD3+细胞的目标细胞摄食。因此，此类细胞活性导致肿瘤中的ENTPD3高细胞的消融和减少。另外，我们的一些抗ENTPD3抗体也能够单独抑制ENTPD3+细胞上的ENTPD3酶活性或伴随抑制ADCC/CDC/目标细胞摄食活性，因此导致肿瘤内部的ENTPD3酶活性整体降低。
主题抗ENTPD3单克隆抗体的示例性特征、不根据文献教导并且迄今为止尚未描述于现有技术中的治疗性抗ENTPD3单克隆抗体中所用的特征概述、列举于表1中，并且进一步论述于下文中。
表1
Figure BDA0004113291790000321
Figure BDA0004113291790000331
Figure BDA0004113291790000332
Figure BDA0004113291790000341
“N/A”指示不适用。
*未体内测试，但据信并预期此克隆具有有利的体内肿瘤杀伤活性。
**在所测定的特定条件下，亲本PBI#30hIgG1抗体由于其不令人满意的结合动力学而不以体内抗肿瘤活性形式存在，因此产生亲和力成熟变体以优化结合亲和力和功能性。
***亲和力成熟变体PBI#30af4 IgG1在小鼠血液中被快速清出，从而限制其体内抗肿瘤活性。据信并预期，如果被工程化而在体内更稳定，则其将具有体内肿瘤杀伤活性。
与ENTPD3表达/酶活性匹配的生理学相关细胞系被用于本发明中的结合和功能测定。
建立三种稳定转染的细胞系，包括CHO-hENTPD3、COS7-hENTPD3和HEK293T-hENTPD3细胞，用于如本文进一步描述的结合和功能测定。这三种细胞系含有不同表达水平/酶活性水平的靶抗原hENTPD3：HEK293T-hENTPD3(极高)>CHO-hENTPD3(高)>COS7-hENTPD3(中度)。HEK293T-hENTPD3细胞系表达极高水平的hENTPD3酶活性，因此极快速降解外源性ATP，不将此视为生理学上相关的。COS7-hENTPD3细胞上的hENTPD3表达/酶活性水平类似于RT4人类膀胱癌细胞(内源性表达hENTPD3)上的那些。CHO-hENTPD3细胞代表肿瘤微环境中的ADCC目标ENTPD3高细胞。由于用RT4细胞培养/操作的技术困难，因此选择与ENTPD3表达/酶活性匹配的两个生理学相关转染细胞系，即COS7-hENTPD3和CHO-hENTPD3细胞，用于体外结合和功能测定，分别表示瘤内ENTPD3+和ENTPD3高细胞。
形成抗ENTPD3抗体与靶细胞膜上的抗原的稳定免疫复合物赋予抗体高ADCC活性。
如图50和图51中所示，对于本文所描述的所有亲本主题抗ENTPD3抗体检查抗体:抗原免疫复合物在靶细胞表面上的稳定性，所述抗体最初基于其高ADCC活性选择(图8和图16)。所有测试克隆与靶细胞膜上的抗原ENTPD3形成稳定免疫复合物(即，细胞膜上人类ENTPD3的最高损失不超过30％)(图50和图51)。此外，具有改进的ADCC功能性的工程化克隆变体(例如分别关于克隆8E1和PBI#30的图27和图34)表明比相应亲本克隆更有利地增加免疫复合物稳定性(图50；8E1 Hu/Ra相对于人源化8E1 hIgG1并且PBI#30hIgG1相对于成熟变体PBI#30af4 hIgG1)。我们的数据明显地表明抗体的ADCC活性与其在靶细胞膜上的免疫复合物稳定性正相关。
主题单克隆抗体经由FcγRIIIa受体依赖性细胞活性(例如ADCC)靶向肿瘤中的ENTPD3+细胞。
作为工作实施例，原始8E1人类/兔嵌合克隆(8E1 Hu/Ra，hIgG1同种型)显示对ENTPD3酶活性的极小抑制(图33)，但具有针对体外ENTPD3高细胞的极高ADCC活性(图34；EC50＝0.075μg/ml)，其足以阻断体内肿瘤生长(图18)。经设计以降低任何可能免疫原性以用于潜在治疗用途的这种克隆(8E1 hIgG1)的代表性人源化型式具有ADCC活性，显示出相比于亲本嵌合克隆8E1 Hu/Ra的1.5倍增加(图34；EC50＝0.047μg/ml)。在不受理论束缚的情况下，因此据信人源化8E1 hIgG1具有有利的体内肿瘤杀伤活性。实际上，对于具有ADCC杀伤活性的抗体的治疗性用途，对抗体的IgG Fc工程化(例如Fc域的去岩藻糖基化)是优选的，因为这种方法可使抗体的ADCC效应功能增强至大约100倍(Shields等人(2002)JBC.277(30):26733-26740；Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng.9月5日,87(5):614-622；Mori等人(2007)Cytotechnology 55:109-114；和Lonza的
Figure BDA0004113291790000361
CHOK1SC细胞系，用于制造无岩藻糖基化治疗性抗体)。因此，预期无岩藻糖基化8E1 hIgG1的体外和体内ADCC肿瘤杀伤活性的显著增强。
另一个工作实施例是克隆38D5：原始人类/兔嵌合克隆(38D5Hu/Ra，hIgG1同种型)含有高ADCC活性(图39；EC50＝0.1041μg/ml)和针对体外ENTPD3高细胞的中度酶活性抑制能力(图37和图38；EC50＝0.31μg/ml，具有最大抑制的约40％)，其与体内抗肿瘤活性相关(图18)。这种克隆(38D5 hIgG1)的人源化提高了其体外ADCC活性(图39；EC50＝0.1036μg/ml，其中相比于亲本嵌合克隆38D5 Hu/Ra增加1.2倍)，同时保留其酶活性抑制能力(图38)。人源化38D5 hIgG1显示有利的体内肿瘤杀伤活性(图45)和体内血浆稳定性(图47和图48)。有趣的是，从Fc胜任型38D5 IgG1切换至Fc缄默型IgG4型式，38D5 hIgG4抗体未能阻断体内肿瘤生长(图46)，但仍保留其体外酶活性抑制能力(图37)。
这些数据再次证实仅较高ADCC活性(EC50约为0.1μg/ml)足以赋予抗体体外和体内肿瘤杀伤活性，而不管其ENTPD3酶活性抑制能力；并且仅含有中度水平酶活性抑制能力的抗体不足以具有体内抗肿瘤活性。
主题单克隆抗体经由直接抑制ENTPD3酶活性靶向肿瘤中的ENTPD3+细胞。
工作实施例是完全人类克隆PBI#30：原始克隆PBI#30hIgG1显示高水平的体外ADCC活性(图27；EC50＝1.443μg/ml)并且也显示针对体外ENTPD3高细胞的高度酶活性抑制效力(图26；EC50＝2.51μg/mL，具有最大抑制的约80％)。然而，其在体内在一个设置中测试时(图22)由于其不令人满意的结合动力学而不具有肿瘤杀伤活性(图1-4)。
产生PBI#30hIgG1的亲和力成熟变体(包括PBI#30af4、6、7和8hIgG1)以及其同种型切换型式(例如Fc胜任型IgG1同种型切换至Fc缄默型IgG4型式)(例如PBI#30af4、6、7和8hIgG4)。使用变体PBI#30af4作为实例，亲和力成熟(PBI#30af4 hIgG1)提高亲本PBI#30hIgG1抗体的功能性能，例如酶活性抑制能力(图26；EC50＝0.82μg/mL，具有最大抑制的约100％)和ADCC活性(图27；EC50＝0.434μg/ml)。如所预期，Fc缄默型IgG4型式(PBI#30af4hIgG4)不具有任何ADCC活性(图27)但其酶活性抑制能力仍保持在极高水平下(图26；EC50＝1.33μg/ml，具有最大抑制的约100％)。
有趣的是，在PBI#30af4 hIgG1和PBI#30af4 hIgG4抗体体内测试时，hIgG4型式抗体展现有利的抗肿瘤功效(图29)，从而表明在一些情况下，如果保持在极高水平下，则仅酶活性抑制能力就足以施加体内肿瘤破坏活性。
在另一个重要的值得注意的情况下，进一步观测到PBI#30af4hIgG1在小鼠血液中被快速清除，因此限制肿瘤组织中的抗体可用性(图30)并最终抵消其体内抗肿瘤活性(图29)。因此，据信如果PBI#30af4 hIgG1被工程化而在体内更稳定，则其将赋予这种抗体有利的体内ADCC肿瘤杀伤活性。
主题抗ENTPD3单克隆抗体被工程化以增强功能性和/或降低对人类的免疫原性以用于潜在治疗性用途。
作为一个代表性实例，完全人类克隆PBI#30经由引入点突变至抗体CDR区中而不破坏抗体框架区通过亲和力成熟被工程化。其亲和力成熟变体显示功能结果的改进(图25-27)。
作为另一个实例，兔克隆8E1和38D5被人源化(经由抗体框架区的人源化而不破坏抗体CDR区)，使得抗体的功能性未显著减弱或甚至改进(图32-35和图37-40)，同时保留亲本抗体的特异性和亲和力。这种抗体工程化方法是降低抗体对人类的免疫原性。
作为另一个实例，人源化38D5抗体例如经由在抗体主链序列中引入点突变而不破坏抗体重链和轻链的可变域，也不显著破坏抗体的生理和功能属性(图41-44)而被进一步工程化以进一步降低对于人类的潜在免疫原性以用于治疗用途。
主题单克隆抗体由不同的抗ENTPD3抗体构成，所述抗体结合于不同表位并显示不同的细胞结合动力学。
作为实例，图17显示本发明中我们的抗ENTPD3抗体池由结合于不同表位的多种不同抗体组成，即克隆PBI#30与克隆38D12完全竞争而与所有其他克隆部分竞争。相比之下，克隆38D5仅仅与克隆44H5完全竞争，与克隆PBI#30和42D8部分竞争，而不与其余克隆竞争。8E1与克隆3E9完全竞争，与克隆PBI#30和38D12部分竞争，并且不与克隆38D5和44H5竞争。
我们的抗ENTPD3抗体池也含有具有不同结合动力学概况的抗体。作为图49中所示的实例，一些克隆具有慢速缔合速率(例如38D5和PBI#30)，而一些具有快速缔合速率(例如8E1)。
我们的抗ENTPD3单克隆抗体池的此类生理多样性为选择用于潜在治疗用途的最佳主要候选物提供更大机会。
II.定义
为促进对本发明的理解，下文定义多个术语和短语。
“NTPDase3”由ENTPD3基因编码，并且是经由对应NDP中间体将细胞外NTP水解为NMP的质膜结合外核苷酸酶。代表性人类NTPDase3 cDNA和蛋白质序列是本领域中众所周知的并且公开可获自国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)。例如，含有两个细胞质域、两个跨膜域和大型胞外区的人类NTPDase3序列以UniProtKB作为O75355(ENTP3_HUMAN)提供。仅含有一个细胞质域和一个跨膜域(短形式)的人类NTPDase3的两种潜在同功型也已以UniProtKB作为C9J0J3(C9J0J3_HUMAN)和A0A3B3IT06(A0A3B3IT06_HUMAN)报道。
人类NTPDase3蛋白质的晶体结构和结构-功能关系在本领域中基本上未知。就此而言，唯一可获得的信息是通过使NTPDase3的胞外部分的一级序列螺纹穿过大鼠NTPDase2的胞外部分的晶体结构的人类NTPDase3的3D模型(Munkonda等人(2009)FEBS J.276:479-496；Ivanenkov等人(2010)Protein Engineering,Design&Selection 23(7):579-588)。
NTPDase3活性的调节(例如降低)可以任何数目的方式(例如根据本文所描述的量度，包括使用对照、比率、与基线的比较等)测量。例如，在测试剂存在下与此类外核苷酸酶的水平相比，NTPDase3活性调节剂可降低外核苷酸酶的催化活性或总体NTPDase3活性。在一个实施方案中，通过分析样品中腺苷的浓度来确定NTPDase3活性。可评估随时间推移的浓度。在另一个实施方案中，在所测试的样品中添加ATP并测定或评估ATP、ADP、AMP或腺苷的浓度。此上下文中的调节(例如降低)可意指降低1％、5％、10％>、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％、150％、200％、500％、1000％或更多。在一个实施方案中，检测随时间推移的所述增加。
“NTPDase3抗体”(或者，“抗NTPDase3抗体”)是指选择性结合于NTPDase3蛋白质的一个或多个表位的抗体，并且包括单互补位抗体以及双互补位和其他多互补位格式抗体。
a.抗体和其他多肽
如本文所用，术语“抗体”是指识别并经由至少一个抗原结合位点特异性结合靶标(例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述任一者的组合)的免疫球蛋白分子，其中抗原结合位点通常位于免疫球蛋白分子的可变区内。如本文所用，所述术语涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体(条件是这些片段已格式化以包括Fc或其他FcγRIII结合域)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白(经格式化以包括Fc或其他FcγRIII结合域)和任何其他经修饰的包含抗原结合位点的免疫球蛋白分子，只要抗体展现所需生物活性即可。
在本发明的上下文中，“抗体介导的目标细胞摄食”是指抗体介导的从NTPDase3+细胞的表面耗竭NTPDase3，而不显著减少NTPDase3+细胞的数目，即经由除诱导NTPDase3+细胞死亡以外的过程。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合于抗原(例如人类NTPDase3)的能力。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来进行。涵盖于术语抗体(例如本文所描述的抗NTPDase3抗体)的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含通过铰链区处的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个分离CDR的组合，其可任选地通过合成接头接合。此类单链抗体也意欲涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。这些和其他可能的构建体描述于Chan和Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10:301中。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且以与完整抗体相同的方式来筛选供使用的片段。抗原结合部分可通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。
术语抗体的“可变区”是指单独或组合形式的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。通常，重链和轻链的可变区各自由四个框架区(FR)和三个互补决定区(CDR，也称为“高变区”)组成。每条链中的CDR由框架区紧密固持在一起并且与来自其他链的CDR共同促进抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于交叉物种序列变化性的方法(即Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,National Institutes of Health,Bethesda Md.)，和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶研究的方法(Al Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。另外，这两种方法的组合有时用于本领域中以测定CDR。
虽然抗体可为五种主要类别的免疫球蛋白中的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于其重链恒定域的标识分别称为α、δ、ε、γ和μ，优选的NTPDase3抗体是IgG1和IgG3同种型以便最有效地(即以10-7或更小的kd)接合FcγRIII。
在某些实施方案中，抗体为“低岩藻糖基化”并且可甚至为“无岩藻糖基化”。“低岩藻糖基化”抗体制剂是指其中小于50％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖的抗体制剂。通常，在“低岩藻糖基化”抗体制剂中，小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、或小于5％或小于1％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖。“无岩藻糖基化”抗体在与IgG重链的CH2域连接的碳水化合物中缺乏α-1,6-岩藻糖。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体或其中所有抗体对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体组合物。通常此类单克隆抗体将来源于编码抗体的单细胞或核酸，并且在无意引入任何序列改变下传送。因此，术语“人类单克隆抗体”是指具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人类单克隆抗体是由杂交瘤产生，所述杂交瘤例如通过将从转基因或转染色体非人类动物(例如，具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)获得的B细胞与永生化细胞融合来获得。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人类(例如鼠类)抗体的形式，其为含有最小非人类序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗体是其中CDR的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的残基置换的具有所需特异性、亲和力和/或结合能力的人类免疫球蛋白。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人类物种的抗体中的相应残基置换。人源化抗体可利用Fv框架区和/或所置换的非人类残基内的其他残基的取代而进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或结合能力。人源化抗体可包含含有与非人类免疫球蛋白对应的全部或基本上全部CDR的可变域，而全部或基本上全部框架区是人类免疫球蛋白序列的框架区。在一些实施方案中，可变域包含人类免疫球蛋白序列的框架区。在一些实施方案中，可变域包含人类免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体也可包含免疫球蛋白恒定区或域(Fc)，通常人类免疫球蛋白恒定区或域的至少一部分。通常认为人源化抗体与嵌合抗体不同。
如本文所用，术语“人类抗体”是指由人类产生的抗体，或使用本领域中已知的任何技术制备并且氨基酸序列对应于由人类产生的抗体的抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体。通常，轻链和重链两者的可变区以所需特异性、亲和力和/或结合能力对应于源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区与源自另一物种(通常人类)的抗体中的序列同源以避免引发所述物种中的免疫反应。
“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。结合于IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和交替剪接形式。FcγR家族由三种活化性受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人类中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIB)组成。
“FcγRIII结合部分”是肽、蛋白质、核酸或其他部分，其当与抗NTPDase3抗体的抗原结合位点缔合时能够结合于FcγRIII(CD16)并介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。含有IgG1和IgG3同种型的CH2和CH3域的重链Fc片段是FcγRIII结合部分。
术语“表位”与“抗原决定基”在本文中可互换地使用并且是指能够由特定抗体识别并特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可由通过蛋白质的三级折叠而并列的相邻氨基酸和非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在蛋白质变性时丧失。表位在独特空间构象中通常包括至少3个，并且更通常至少5个、6个、7个或8-10个氨基酸。
如本文所用，术语“特异性结合”或“对......具有特异性”是指可测量和可再现相互作用，例如靶标与抗体之间的结合，其在异质分子(包括生物分子)群体存在下决定靶标的存在。例如，特异性结合于靶标(其可为表位)的抗体是结合这种靶标的亲和力、亲合力、容易性和/或持续时间强于其结合至其他靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体与无关靶标的结合程度小于抗体与靶标的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，特异性结合于靶标的抗体的解离常数(Kd)小于或等于1μM、100nM、10nM、1nM或甚至0.1nM。在某些实施方案中，抗体特异性结合于在来自不同物种的蛋白质当中为保守的蛋白质上的表位。在另一个实施方案中，特异性结合可包括排他性结合，但并非必需。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为线性或分枝的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可间杂有非氨基酸。所述术语也涵盖已经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，例如与标记组分缀合。定义内也包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应理解，因为本发明所涵盖的多肽可基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员，所以在某些实施方案中，多肽可以单一链或相关链形式出现。
术语“同一”或“同一性”百分比在两种或更多种核酸或多肽的情形中是指两个或更多个序列或子序列当根据最大对应性比较和比对(必要时引入空位)时为相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的一部分。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件是本领域中众所周知的。这些算法和软件包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package和其变化形式。在一些实施方案中，本发明涵盖的两种核酸或多肽基本上同一，意指当根据最大对应性比较和比对时，其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％并且在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用序列比较算法或通过目视检查所测量。在一些实施方案中，同一性存在于氨基酸序列的一个区域上，所述区域的长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40-60个残基、至少约60-80个残基或其间的任何整数值。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个残基更长(例如至少约80-100个残基)的区域上，并且在一些实施方案中，序列在所比较的序列(例如靶蛋白或抗体的编码区)的全长上基本上同一。在一些实施方案中，同一性存在于核苷酸序列的一个区域上，所述区域的长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40-60个残基、至少约60-80个残基或其间的任何整数值。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个碱基长的区域上，例如至少约80-1000个碱基或更多，并且在一些实施方案中，序列在所比较的序列(例如编码所关注蛋白质的核苷酸序列)的全长上基本上同一。
“保守性氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有类似侧链的另一个氨基酸残基置换的取代。本领域中通常已定义具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。通常，本发明涵盖的多肽、可溶性蛋白质和/或抗体的序列中的保守取代并未消除含有氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白质或抗体与目标结合位点的结合。鉴定不消除结合的氨基酸保守性取代的方法是本领域中众所周知的。
“分离”的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈未在自然界中发现的形式的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已纯化至一定程度的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物，其不再呈其在自然界中发现的形式。在一些实施方案中，分离的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文所用，术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
如本文所用，术语“融合蛋白质”或“融合多肽”是指由包含至少两种基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白质。
如本文所用，术语“接头”或“接头区”是指在第一多肽(例如抗NTPDase3抗体)与第二多肽(例如Fc或其他FcγRIII结合部分；scFV、Vhh域等，其结合不同蛋白质以产生维持NTPDse3的二价的双特异性抗体格式)之间插入的接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。接头不应不利地影响多肽的表达、分泌或生物活性。优选地，接头无抗原性并且不引起免疫反应。
b.核酸
术语“多核苷酸”和“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换地使用并且是指具有任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物中的任何底物。
如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷酸的一条链的核苷酸的次序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的次序决定沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的次序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。
当关于核苷酸序列使用时，如本文所用的“序列”、术语语法和其他形式可包含DNA或RNA，并且可为单链或双链。核酸序列可经突变。核酸序列可具有任何长度，例如2至1,000,000或更多个核苷酸(或超过其或在其之间的任何整数值)，例如长度为约100至约10,000的核酸，或约200个核苷酸至约500个核苷酸。
如本文所用，术语“载体”意指能够递送并通常在宿主细胞中表达一个或多个所关注基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、黏粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，和囊封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
如本文所用，术语“转染”是指外源核酸进入真核细胞中。转染可通过本领域中已知的各种手段实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪技术(基因枪)。
如本文所用，术语“载剂”是分离的核酸，包含可用于将组合物递送至细胞内部的分离的核酸。本领域中已知多种载剂，包括但不限于线性多核苷酸、与离子性或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语也应理解为包括促进核酸转移至非质粒和非病毒化合物(例如聚赖氨酸化合物、脂质体等)的细胞中。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
如本文所用，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接的表达控制序列和待表达的核苷酸序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件(cis-acting element)；其他用于表达的元件可由宿主细胞或体外表达系统供应。表达载体包括本领域中已知的所有载体，例如黏粒、质粒(例如裸质粒或脂质体中所含的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指调节序列与异源核酸序列之间的功能键联连接至连接处，引起异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列和第二核酸序列是第一核酸序列与可操作地连接的第二核酸序列之间的函数关系时。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区接合在同一阅读框架中。
如本文所用，术语“启动子”定义为多核苷酸序列的细胞特异性转录的合成机制所需的合成机制识别或引入的启动子DNA序列。
如本文所用，术语“组成性表达”是指全部在生理条件下表达。
如本文所用，术语“诱导性表达”是指在某些条件下的表达，例如在T细胞抗原结合时发生的条件。熟悉惯例的技术人员如何“诱导表达”。
术语“电穿孔”是指使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中的微观路径(孔)；其存在使得生物分子(例如质粒或其他寡核苷酸)能够从细胞膜的一侧传递至另一侧。
c.检查点抑制剂、共刺激激动剂、先天性免疫诱导剂和化学治疗剂
“检查点分子”是指由组织和/或免疫细胞表达并且以取决于检查点分子的表达水平的方式降低免疫反应的功效的蛋白质。当这些蛋白质被阻断时，免疫系统上的“制动器”解除并且例如T细胞能够更有效地杀灭癌细胞。T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白质的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT、CD39和Siglec-15。
“检查点抑制剂”是指逆转来自检查点分子的免疫抑制性信号传导的药物实体。
“共刺激分子”是指免疫细胞(例如T细胞)同源结合伴侣，其特异性结合于共刺激配体，从而介导共刺激，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或配体以外的促进有效免疫反应的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHCI分子、BTLA受体和Toll配体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。共刺激分子的实例包括但不限于：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
“共刺激激动剂”是指一种药物实体，其活化(激动)共刺激分子，例如共刺激配体所做，并且产生免疫刺激信号或以其他方式增加免疫反应的效力或功效。
“先天性免疫诱导剂”是模拟先天性免疫反应的药剂，包括巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞等的发炎活性的活化和/或抗炎活性的失活。先天性免疫诱导剂包括CD47-SIRPα轴的抑制剂，例如抗体或与CD47或SIRPα结合并抑制两个分子的相互作用以促进抗肿瘤巨噬细胞活性的其他结合部分。先天性免疫诱导剂包括CD24-Siglec-10轴的抑制剂，例如抗体或与CD24或Siglec-10结合并抑制两个分子的相互作用以促进抗肿瘤巨噬细胞活性的其他结合部分。在其他实施方案中，先天性免疫活化剂可为阻断HLA-E驱动的对NK和CD8+细胞的抑制的NGK2A检查点抑制剂。先天性免疫的小分子诱导剂包括此类药剂STING激动剂、TLR7/8激动剂和RIG-I激动剂。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(pipo sulfan)；氮丙啶，例如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰基喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；培美曲塞(pemetrexed)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；TLK-286；CDP323，口服α-4整合素抑制剂；沙考地汀(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1I(calicheamicin gamma1I)和卡奇霉素ΩI1(calicheamicin omegaI1)(参见例如Nicolaou等人,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，其包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authrarnycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycins)、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括阿德力霉素(ADRIAMYCINN)、吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射液(DOXIL)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、埃达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)和伊马替尼(imatinib)(2-苯基氨基嘧啶衍生物)以及其他c-Kit抑制剂；抗肾上腺药，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHSNatural Products，Eu gene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(ELDISINE，FILD ESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷类(taxoids)，例如紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇的经白蛋白工程化的纳米粒子制剂(ABRAXANE)和多西他赛(doxetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氯芥(chlorambucil)；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；奥沙利铂(oxaliplatin)；甲酰四氢叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；诺消灵(novantron e)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄素，例如视黄酸；以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述中的两者或更多者的组合，例如CHOP，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙(prednisolone)的组合疗法的缩写，和FOLFOX，利用奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATIN)以及5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案的缩写。
此定义中也包括用来调控、减少、阻断或抑制可能会促进癌症生长的激素的影响的抗激素剂，并且其通常呈全身性或整个身体治疗形式。它们本身可为激素。实例包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷诺昔芬(raloxifene)(EVISTA)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，例如氟维司群(fulvestrant)(FASLODEX)；用以遏制或关闭卵巢的药剂，例如黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，例如乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)(LUPRON和ELIGARD)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲特瑞林(tripterelin)；抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和芳香酶(aromatase)抑制剂，其抑制芳香酶，其调节肾上腺中的雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)(RIVISOR)、来曲唑(letrozole)(FEMARA)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化学治疗剂的此类定义包括：双膦酸盐，例如氯屈膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸盐(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)(ZOMETA)、阿仑膦酸盐(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIA)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制基因在涉及异常细胞增殖的信号传导通路中表达的反义寡核苷酸，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN)；抗雌激素，例如氟维司群；Kit抑制剂，例如伊马替尼或EXEL-0862(酪氨酸激酶抑制剂)；EGFR抑制剂，例如埃罗替尼(erlotinib)或西妥昔单抗(cetuximab)；抗VEGF抑制剂，例如贝伐单抗(bevacizumab)；伊立替康(arinotecan)；rmRH(例如ABARELIX)；拉帕替尼(lapatinib)和二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；17AAG(格尔德霉素(geldanamycin)衍生物，其为热休克蛋白(Hsp)90毒物)和以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
如本文所用，术语“细胞因子”通常是指由一个细胞群体释放的蛋白质，其作用于作为细胞间介体的另一细胞或对产生蛋白质的细胞具有自分泌作用。此类细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子；白细胞介素(“IL”)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A-F、IL-18至IL-29(例如IL-23)、IL-31，包括PROLEUKIN rIL-2；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β，TGF-β1-3；和其他多肽因子，包括白血病抑制因子(“LIF”)、睫状神经营养因子(“CNTF”)、类CNTF细胞因子(“CLC”)、心营养素(“CT”)和kit配体(“KL”)。
如本文所用，术语“趋化因子”是指具有选择性诱导白细胞的趋化和活化的能力的可溶因子(例如细胞因子)。它们也引起血管生成、炎症、伤口愈合和肿瘤形成过程。实例趋化因子包括IL-8，一种鼠类角质细胞化学引诱剂(KC)的人类同源物。
d.治疗
“肿瘤免疫性”是指其中肿瘤躲避免疫识别和清除的过程。因此，作为治疗概念，肿瘤免疫性在所述躲避作用减弱并且肿瘤由免疫系统识别和攻击时得以“治疗”。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤缩小和肿瘤清除。
“持续反应”是指在停止治疗之后，对降低肿瘤生长的持续作用。例如，与施用阶段开始时的尺寸相比，肿瘤尺寸可保持相同或更小。在一些实施方案中，持续反应的持续时间长度至少与治疗持续时间相同、为治疗持续时间的至少1.5倍、2.0倍、2.5倍或3.0倍。
如本文所用，术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理学疾患，其中细胞群体的特征在于不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌瘤、母细胞瘤、肉瘤和血液癌，例如淋巴瘤和白血病。
如本文所用，术语“肿瘤”和“赘瘤”是指任何由过度细胞生长或增殖产生的组织块状物，其为良性(非癌性)或恶性(癌性)，包括癌前病灶。肿瘤生长通常是不受控制和进行性的，不诱导或抑制正常细胞的增殖。肿瘤可影响多种细胞、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨骼、脑部、乳房、软骨、神经胶质细胞、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨胳肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、尿道、子宫、阴道器官或组织或相应细胞。肿瘤包括癌症，例如肉瘤、癌瘤、浆细胞瘤或(恶性浆细胞)。本发明涵盖的肿瘤可包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性骨髓-单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症)、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症疾病、重链病和实体肿瘤，例如肉瘤癌症(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌瘤、支气管癌、髓性癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食道癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。优选地，“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和神经胶质瘤。
如本文所用，术语“转移”是指癌症从原发部位扩散或转移至身体其他区域，同时在新位置处产生类似癌性病灶的过程。“转移性”或“转移”细胞是丧失与相邻细胞的粘着性接触并且经由血流或淋巴从原发性疾病部位迁移以侵袭相邻身体结构的细胞。
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指来源于癌症或肿瘤或癌前病灶的总细胞群体，包括占癌细胞群体大部分的非致瘤性细胞与致瘤性干细胞(癌症干细胞)。如本文所用，当仅仅指缺乏更新和分化能力的那些细胞以将肿瘤细胞与癌症干细胞区分开时，术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”将由术语“非致瘤性”修饰。
如本文所用，术语“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
如本文所用，“完全反应”或“CR”是指所有目标病灶消失；“部分反应”或“PR”是指以基线SLD作为参考，目标病灶的最长直径的总和(SLD)降低至少30％；并且“稳定疾病”或“SD”是指以治疗开始时的最小SLD作为参考，目标病灶既未充分收缩至认定为PR，也未充分增加至认定为PD。
如本文所用，“进展性疾病”或“PD”是指以自治疗开始或存在一个或多个新病灶时所记录的最小SLD作为参考，目标病灶的SLD增加至少20％。
如本文所用，“无进展存活期”(PFS)是指在治疗期间和治疗之后，所治疗的疾病(例如癌症)不会恶化的持续时间长度。无进展存活期可包括患者经历完全反应或部分反应的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。
如本文所用，“总反应率”(ORR)是指完全反应(CR)率与部分反应(PR)率的总和。
如本文所用，“总存活率”是指可能在特定持续时间之后存活的组中个体的百分比。
如本文所用，术语“治疗”是指用于改变由细胞干预(可能为临床病理学的预防性干预过程)引起的临床疾病的过程或治疗的个别尝试。包括但不限于预防疾病发生或复发、缓解症状、减少任何疾病的直接或间接病理性结果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或缓解疾病缓解或改进预后的治疗。
术语“受试者”是指作为特定治疗的接受者的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物等。通常，关于人类受试者的术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“激动剂”和“激动”是指或描述能够直接地或间接地基本上诱导、活化、促进、增加或增强靶标和/或通路的生物活性的治疗部分。本文中使用的术语“激动剂”包括任何部分或完全诱导、活化、促进、增加或增强蛋白质或其他所关注靶标的活性的药剂。
如本文所用，术语“拮抗剂”和“拮抗性”是指或描述能够直接地或间接地部分或完全阻断、抑制、降低或中和靶标和/或通路的生物活性的治疗部分。本文中使用的术语“拮抗剂”包括任何部分或完全阻断、抑制、降低或中和蛋白质或其他所关注靶标的活性的药剂。
如本文所用，术语“调节(modulation)”和“调节(modulate)”是指生物活性的改变或变化。调节包括但不限于刺激活性或抑制活性。调节可为活性增加或活性降低、结合特征的变化或与蛋白质、通路、系统或其他所关注生物学靶标的活性相关的生物学、功能性或免疫特性的任何其他变化。
如本文所用，术语“免疫反应”包括来自先天性免疫系统和后天性免疫系统的反应。其包括细胞介导的免疫反应和/或体液免疫反应。其包括T细胞和B细胞反应，以及来自免疫系统的其他细胞(例如自然杀手(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞等)的反应。
术语“药学上可接受”是指经联邦政府或州政府的监管机构批准或可经其批准或在美国药典或其他通常公认的药典中列出用于动物(包括人类)的物质。
术语“药学上可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的药物载剂”是指可与本公开的至少一种药剂一起施用至受试者并且当施用剂量足以递送治疗作用时不破坏所述药剂的药理学活性并且无毒性的赋形剂、载剂或佐剂。一般而言，本领域技术人员和U.S.FDA认为药学上可接受的赋形剂、载剂或佐剂是任何制剂的非活性成分。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗作用”是指在受试者(例如哺乳动物)中可有效“治疗”疾病或病症的抗NTPDase3抗体的量。在癌症或肿瘤的情况下，抗NTPDase3抗体的治疗有效量具有治疗作用并因此可增强免疫反应、增强抗肿瘤反应、增加免疫细胞的细胞溶解活性、增加免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤、降低肿瘤细胞的数目；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；降低癌症干细胞的数目或出现频率；降低肿瘤尺寸；减小癌细胞群体；抑制或停止癌细胞浸润至周边器官中，包括例如癌症分散至软组织和骨骼中；抑制和停止肿瘤或癌细胞转移；抑制和停止肿瘤或癌细胞生长；在一定程度上缓解一种或多种与癌症相关的症状；降低致病率和死亡率；提高生活质量；或此类作用的组合。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“缓解(alleviating)”或“缓解(to alleviate)”是指以下两者：(1)使诊断的病理性疾患或病症治愈、减缓、症状减轻和/或进程停止的治疗性措施，和(2)预防或减缓靶向病理性疾患或病症的发展的预防性或防治性措施。因此，需要治疗的那些包括已经患有病症的那些；易于患有病症的那些；和其中待预防病症的那些。在癌症或肿瘤的情况下，如果患者显示以下各项中的一者或多者，则根据本发明涵盖的方法成功地“治疗”受试者：增加免疫反应，增加抗肿瘤反应，增加免疫细胞的细胞溶解活性，增加免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤，减少癌细胞的数目或使其完全不存在；减小肿瘤尺寸；抑制或缺乏癌细胞浸润至周边器官中，包括癌细胞扩散至软组织和骨骼中；抑制或缺乏肿瘤或癌细胞转移；抑制或缺乏癌症生长；缓解与特定癌症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；降低致瘤性；减少癌症干细胞的数目或频率；或此类作用的某种组合。
e.杂项
应理解，当本文中用语言“包含”描述实施方案时，也提供用术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。也应理解，当本文中用语言“基本上由……组成”描述实施方案时，也提供用术语“由……组成”描述的其他类似实施方案。
如本文所用，对“约”或“大约”值或参数的提及包括(和描述)与所述值或参数相关的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如在例如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”在本文中旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
III.抗NTPDase3抗体
a.单克隆抗体
抗NTPDase3抗体可为单克隆抗体。此类单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，例如由Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)所描述的那些方法。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他适当宿主动物典型地用免疫剂免疫以诱使淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合于所述免疫剂的抗体。或者，淋巴细胞可经体外免疫。
免疫剂将典型地包括NTPDase3多肽或其融合蛋白。通常，如果需要人类来源的细胞，则使用周边血液淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人类哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞[Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59-103页]。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛科动物和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适培养基中培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合、永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质会阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
优选的永生化细胞系是高效融合，支持所选产抗体细胞对抗体的稳定高表达水平并且对例如HAT培养基的培养基敏感的永生化细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠类骨髓瘤系，其可例如获自San Diego,Calif.的沙克研究所细胞分配中心(Salk Institute CellDistribution Center)和Manassas,Va.的美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection)。还已描述人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系用于产生人类单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)第51-63页]。
然后可测定其中培养杂交瘤细胞的培养基中针对多肽的单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性是通过免疫沉淀或通过体外结合测定法(例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))来确定。此类技术和测定法是本领域中已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析确定。
在鉴定出所需杂交瘤细胞后，可通过限制性稀释程序亚克隆所述克隆并通过标准方法使其生长[Goding,同上]。适用于此目的的培养基包括例如杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以腹水形式体内生长于哺乳动物中。
亚克隆所分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法从培养基或腹水分离或纯化。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法制得，例如美国专利第4,816,567号中描述的方法。编码本发明涵盖的单克隆抗体的DNA可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合于编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。本发明涵盖的杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染至不以其他方式产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。DNA也可例如通过用人类重链和轻链恒定域的编码序列取代同源鼠类序列[美国专利第4,816,567号；Morrison等人,同上]或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价接合至免疫球蛋白编码序列来修饰。此类非免疫球蛋白多肽可用本发明涵盖的抗体的恒定域取代，或者可用本发明涵盖的抗体的一个抗原组合位点的可变域取代以产生嵌合二价抗体。
b.人类和人源化抗体
本发明所涵盖的抗NTPDase3抗体还可包含人源化抗体或人类抗体。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的例如小鼠、大鼠或兔的非人类物种(供者抗体)的CDR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人类残基置换。人源化抗体也可包含在接受者抗体中以及在所输入的CDR或框架序列中均不存在的残基。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有至少一个和通常两个可变域，其中所有或基本上所有CDR区与非人类免疫球蛋白的那些区相对应并且所有或基本上所有FR区是人类免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体最佳也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人类免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
用于人源化非人类抗体的方法是本领域中众所周知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人类来源引入至其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入”残基，其典型地从“输入”可变域获得。人源化可基本上遵循Winter和同事的方法[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人类抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于完整人类可变域已被来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。
人类抗体也可使用本领域中已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人类单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)和Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地，可通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如，内源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的小鼠)中来制备人类抗体。激发后，观测到人类抗体产生，其在所有方面与在人类中所见极其类似，包括基因重排、组装和抗体谱系。这种方法描述于例如美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号，和以下科学出版物中：Marks等人,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368,812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
抗体也可使用如上文所描述的已知选择和/或突变诱发方法进行亲和力成熟。优选的亲和力成熟抗体的亲和力比用于制备成熟抗体的起始抗体(通常是鼠类、人源化或人类)高五倍，更优选10倍，甚至更优选20或30倍。
c.双特异性抗体
本文所描述的抗NTPDase3抗体包括双特异性分子。抗NTPDase3抗体或其抗原结合部分可衍生成或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如另一抗体或受体的配体)，以产生结合于至少两个不同结合位点或目标分子的双特异性分子。本文所描述的抗体可实际上衍生成或连接至超过一个其他功能分子以产生与超过两个不同结合位点和/或目标分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子也旨在由如本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为产生本文所描述的双特异性分子，可使本文所描述的抗体功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其他方式)至例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物的一种或多种其他结合分子以使得产生双特异性分子。
因此，本文提供了包含对NTPDase3的至少一种第一结合特异性和对第二目标表位的第二结合特异性的双特异性分子。在本文所描述的双特异性分子为多特异性的一个实施方案中，分子还可包括第三结合特异性。
在某些实施方案中，受试者双特异性(或根据情况可为多特异性)包括免疫检查点的一个或多个结合域，例如其为检查点抑制剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT、CD39和/或Siglec-15。在某些实施方案中，多特异性包括结合T细胞上的检查点蛋白的结合域，尤其是与T细胞耗竭相关的检查点，例如LAG-3、TIM-3、TIGIT或CD39。在某些实施方案中，多特异性结合于NTPDase3和一种或多种其他T细胞相关检查点并产生表达NTPDase3和其结合的其他检查点蛋白中的每一者或两者的细胞的抗体依赖性细胞毒性。
在某些实施方案中，受试者双特异性(或根据情况可为多特异性)包括免疫共刺激受体的一个或多个结合域，例如其为共刺激激动剂(活化剂)，例如MHCI分子的激动剂、BTLA受体和Toll配体和OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。可包括于多特异性的共刺激分子的实例包括但不限于：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
在某些实施方案中，受试者双特异性(或根据情况可为多特异性)包括一个或多个充当先天性免疫活化剂的结合域，例如CD47、SIRPα、CD24、Siglec-10或NKG2A的结合部分。
在一个实施方案中，本文所描述的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv作为结合特异性。抗体也可为轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或单链(scFv)构建体。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可使用本领域公认的方法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定法证实。这些测定法中的每一者通常通过采用经标记的试剂(例如抗体)来检测特别关注的蛋白质-抗体复合物的存在，所述经标记的试剂对所关注的复合物具特异性。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中所述两个重链具有不同特异性[Milstein和Cuello,Nature,305:537-539(1983)]。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，因此这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有适当双特异性结构。适当分子的纯化通常通过亲和色谱步骤实现。类似程序公开于1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。
具有所需结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原组合位点)可与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选与包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和必要时免疫球蛋白轻链的DNA插入独立表达载体中，并且共转染至合适的宿主生物体中。关于产生双特异性抗体的其他细节，参见例如Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根据WO 96/27011中描述的另一种方法，抗体分子对之间的界面可被工程化以最大化从重组细胞培养物回收的杂二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定域CH3区的至少一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换。在第二抗体分子的界面上，大氨基酸侧链被较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换产生了大小与大侧链相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了使异二聚体产量增加超过其他非所需最终产物(例如均二聚体)的机制。
双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。从抗体片段产生双特异性抗体的技术已描述于文献中。例如，可使用化学键联制备双特异性抗体。Brennan等人,Science 229:81(1985)描述了一种程序，其中完整抗体以蛋白分解方式裂解而产生F(ab')2片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下还原以使邻近二硫醇稳定并阻止分子间二硫化物形成。然后将所产生的Fab'片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通过巯基乙胺还原使Fab'-TNB衍生物之一再转化为Fab'-硫醇并与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定剂。
可从大肠杆菌直接回收Fab'片段并以化学方式偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab')2分子的产生。每个Fab'片段分别从大肠杆菌分泌并经受体外定向化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合于过度表达ErbB2受体的细胞和正常人类T细胞，以及触发人类细胞毒性淋巴细胞针对人类乳房肿瘤靶标的溶胞活性。
还已描述了直接从重组细胞培养物制备并分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合物而连接至两种不同抗体的Fab'部分。抗体均二聚体在铰链区还原而形成单体并且然后再氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于产生抗体均二聚体。由Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)所描述的“双功能抗体”技术提供了用于制备双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过接头与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)，所述接头太短而不允许同一链上的两个域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL域与另一片段的互补VL和VH域配对，由此形成两个抗原结合位点。还已报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)。
涵盖具有超过两价的抗体。作为一个非限制性实例，可制备三特异性抗体。参见例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
d.异缀合物抗体
异缀合物抗体也在本发明的范围内。异缀合物抗体由两个共价接合的抗体构成。例如，已提议此类抗体使免疫系统细胞靶向非所需细胞[美国专利第4,676,980号]和用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089]。预期抗体可使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的方法)在体外制备。例如，免疫毒素可使用双硫交换反应或通过形成硫醚键来构建。适于此目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇酯和4-巯基丁酰亚胺甲酯以及公开于例如美国专利第4,676,980号中的试剂。
e.效应功能工程化
关于效应功能可能需要修饰本发明涵盖的抗体，以便增强例如抗NTPDase3抗体治疗癌症的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，由此允许此区域中形成链间双硫键。因此产生的均二聚抗体可具有改进的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀灭作用和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,J.Exp Med.,176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。在某些优选的实施方案中，被工程化的效应功能是抗NTPDase3抗体诱导FcγRIII结合依赖性去除(例如通过抗NTPDase3抗体介导的目标细胞摄食)免疫细胞中的NTPDse3，即在不借助于细胞杀死耗竭免疫细胞群体的情况下的能力。
具有增强的抗肿瘤活性的均二聚抗体也可使用异双功能性交联剂制备，如Wolff等人,Cancer Research,53:2560-2565(1993)中所描述。或者，抗体可被工程化以具有双重Fc区并且可从而具有增强的NTPDase3啃噬能力。参见Stevenson等人,Anti-Cancer DrugDesign,3:219-230(1989)。
f.代表性抗NTPDase3抗体序列
在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体是完全人类抗体，例如由人类抗体文库产生的完全人类抗体。示例性完全人类抗NTPDase3抗体是克隆PBI#30，重链和轻链可变域(VH和VL)序列提供如下：
核酸序列 氨基酸序列
VH域 SEQ ID No.1(VH) SEQ ID No.2(VH)
VL域 SEQ ID No.3(VL) SEQ ID No.4(VL)
克隆PBI#30的重链和轻链的全长序列，包括恒定域，如下提供：
核酸序列 氨基酸序列
VH域 SEQ ID No.5(VH) SEQ ID No.6(VH)
VL域 SEQ ID No.7(VL) SEQ ID No.8(VL)
对于PBI#30克隆，VH和VL域中的每一者的CDR(氨基酸序列)为：
CDR1 CDR2 CDR3
VH SEQ ID No.45 SEQ ID No.46 SEQ ID No.47
VL SEQ ID No.48 SEQ ID No.49 SEQ ID No.50
在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体是被工程化的完全人类抗体，例如亲和力成熟变体。示例性的工程化的完全人类抗NTPDase3抗体是经由引入点突变至抗体CDR区中而不破坏抗体框架区的克隆PBI#30亲和力成熟变体。表2A-2D中如下提供四种PBI#30亲和力成熟变体克隆的VH和VL域中的每一者的CDR的示例性序列(氨基酸序列)：
表2A
PBI#30af4 CDR1 CDR2 CDR3
VH SEQ ID No.51 SEQ ID No.52 SEQ ID No.53
VL SEQ ID No.54 SEQ ID No.55 SEQ ID No.56
表2B
PBI#30af6 CDR1 CDR2 CDR3
VH SEQ ID No.57 SEQ ID No.58 SEQ ID No.59
VL* SEQ ID No.60 SEQ ID No.61 SEQ ID No.62
注：*对于PBI#30af6成熟变体，由于PCR扩增错误，VL域框架中的一个氨基酸残基从缬氨酸(Val)变为异亮氨酸(I)，但这种变化对功能结果无影响。
表2C
PBI#30af7 CDR1 CDR2 CDR3
VH SEQ ID No.63 SEQ ID No.64 SEQ ID No.65
VL SEQ ID No.66 SEQ ID No.67 SEQ ID No.68
表2D
PBI#30af8 CDR1 CDR2 CDR3
VH SEQ ID No.69 SEQ ID No.70 SEQ ID No.71
VL SEQ ID No.72 SEQ ID No.73 SEQ ID No.74
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链可变域，其与本文所描述的VH域序列如SEQ ID No.2具至少60％同一性并且甚至更优选与本文所描述的VH域序列如SEQ ID No.2具至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一性，并且能够特异性结合人类NTPDase3。
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含至少一个轻链可变域，其与本文所描述的VL域序列如SEQ ID No.4具至少60％同一性并且甚至更优选与本文所描述的VL域序列如SEQ ID No.4具至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一性，并且能够特异性结合人类NTPDase3。
在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体是人类或人源化抗体，其包含具有与本文所描述的VH域的CDR(例如SEQ ID No.45、46和47中)和本文所描述的相应VL域的CDR(例如SEQID No.48、49和50中)相关的人类框架序列的VH域。抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的CDR优选地与本文所描述的CDR相同，但可在每个CDR之间变化1、2或3个氨基酸，只要所得抗体结合人类NTPDase3即可。
在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体的重链和轻链具有可变域，其可由在严格条件(例如在45℃下用6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，和在50-65℃下在0.2×SSC/0.1％ SDS中洗涤)下与本文所描述的VH和VL域(相应地)编码序列(例如SEQ ID No.1(VH)和SEQ IDNo.3(VL)中所示的那些)同一或与其杂交的核酸编码。
在一些实施方案中，在兔中产生抗NTPDase3抗体，并且这些抗体的重链和轻链的可变域是兔序列。兔抗NTPDase3抗体的VH和VL域的示例性序列是：
Figure BDA0004113291790000711
Figure BDA0004113291790000721
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体是人源化兔抗体(经由抗体框架区的人源化而不破坏抗体CDR区)，并且这些抗体的重链和轻链的可变域是人类序列。人源化抗NTPDase3抗体的VH和VL域的示例性序列提供如下：
Figure BDA0004113291790000722
Figure BDA0004113291790000731
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体被进一步工程化为人源化抗体(经由在抗体主链序列中引入点突变而不破坏抗体重链和轻链的可变域，以进一步降低对人类的潜在免疫原性以用于治疗用途。引入至人源化38D5克隆的VH和VL域中的示例性点突变显示于下表3中：
表3
Figure BDA0004113291790000732
注：LC和HC分别代表人源化38D5克隆的轻链和重链。
在一些实施方案中，本文所提供的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段促进：(i)针对NTPDase3+细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性；(ii)抗体介导的对NTPDase3+免疫细胞(优选M2巨噬细胞)上的NTPDase3的目标细胞摄食；(iii)对NTPDase3+细胞的NTPDase3酶活性抑制；和/或(iv)以与NTPDase3单克隆抗体克隆竞争性、非竞争性或部分竞争性结合于NTPDase3的方式结合于NTPDase3，其中NTPDase3单克隆抗体克隆选自由以下组成的组：PBI#30和其亲和力成熟变体；3E9、4F9、8E1和其人源化对应物；16D4、37H1、38D5和其在其主链序列中具有或不具有点突变的人源化对应物；38D12、42D8和44H5。
上文所描述的代表性抗NTPDase3抗体序列根据序列识别号对应如下(其中行<210>对应于序列识别号，例如<210>1对应于SEQ IDNO:1，<210>2对应于SEQ ID NO:2，等等)：
Figure BDA0004113291790000741
Figure BDA0004113291790000751
Figure BDA0004113291790000761
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Figure BDA0004113291790001001
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Figure BDA0004113291790001311
为用于人类患者，将需要人源化这些抗体，用人类恒定区置换重链和轻链的恒定区，以及用人类抗体框架区置换可变区的框架区。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是兔抗体的人源化型式。
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含至少一种重链可变，其与SEQ ID No.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列具至少60％同一性，并且甚至更优选与SEQ ID No.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列具至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一性，并且能够特异性结合人类NTPDase3。
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含至少一种轻链可变，其与SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列具至少60％同一性，并且甚至更优选与SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列具至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一性，并且能够特异性结合人类NTPDase3。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，对非人类抗体进行人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)来源于非人类抗体，并且FR(或其部分)来源于人类抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代，以例如恢复或改进抗体特异性或亲和力。
在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体是包含VH域的人源化抗体，所述VH域的人类框架序列与选自SEQ ID No.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80和表2A、2B、2C、2D和3中所列的序列的VH域的CDR，和选自SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82和表2A、2B、2C、2D和3中所列的序列的对应VL域的CDR相关。CDR优选相同，但可在每个CDR之间改变1、2或3个氨基酸，只要所得抗体特异性结合人类NTPDase3即可。
人源化抗体和其制造方法评述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导引选择”方法)。
可用于人源化的人类框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有轻链或重链可变区的特定子群的人类抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)框架区或人类生殖系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施方案中，本文所提供的抗NTPDase3抗体是人类抗体。可使用本领域中已知的各种技术产生人类抗体。人类抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
例如，人类抗体可通过向已经修饰以响应于抗原攻击而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。此类动物典型地含有人类免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。对于从转基因动物获得人类抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSE技术的美国专利第6,075,181号和第6,150,584号；描述HuMAB技术的美国专利第5,770,429号；描述K-M MOUSE技术的美国专利第7,041,870号；和描述VELOCIMOUSE技术的美国专利申请公开第US 2007/0061900号)。由此类动物产生的完整抗体的人类可变区可被进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合。
人类抗体也可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系已有描述。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人类-人类杂交瘤)中所描述的那些方法。人类杂交瘤技术(三源杂交瘤技术(Trioma technology))也描述于Vollmers和Brandlein,Histology andHistopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人类抗体也可通过分离选自人类衍生的噬菌体、酵母或细菌展示文库的Fv克隆可变域序列产生。此类可变域序列然后可与所需人类恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选择人类抗体的技术。
为进行说明，本发明涵盖的抗NTPDase3抗体可通过针对具有一种或多种所需活性的抗体筛选组合文库来分离。例如，本领域中已知多种用于产生噬菌体或酵母展示文库以及针对具有所需结合特征的抗体筛选此类文库的方法。此类方法评述于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,N.J.,2001)中，并且进一步描述于例如McCafferty等人,Nature348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)中；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
作为噬菌体展示方法的实例，VH和VL基因的谱系分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其然后可如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述，针对抗原结合噬菌体进行筛选。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式展示抗体片段。来自免疫来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆原始谱系(例如从人类)以提供抗各种非自身抗原以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫接种，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后，原始文库也可以合成方式通过以下来制备：从干细胞克隆未重排V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变CDR3区和实现体外重排，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人类抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利第5,750,373号，以及美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。
从人类抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中视为人类抗体或人类抗体片段。
FcγRIII结合也可通过根据目前先进技术的方法增加，例如通过修饰抗体的Fc部分的氨基酸序列或Fc部分的糖基化(参见例如EP2235061)。在某些实施方案中，主题抗体是由细胞产生，其中当被糖基化时，抗体上小于50％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖。通常，在“低岩藻糖基化”抗体制剂中，小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、或小于5％或小于1％的寡糖链含有α-1,6-岩藻糖。“无岩藻糖基化”抗体在与IgG重链的CH2域连接的碳水化合物中缺乏α-1,6-岩藻糖。Mori,K等人,Cytotechnology 55(2007)109和Satoh M等人,Expert Opin Biol Ther.6(2006)1161-1173涉及用于产生无岩藻糖基化抗体的FUT8(α-1,6-岩藻糖基转移酶)基因剔除CHO系。
IV.表达载体
在某些实施方案中，重组表达载体用于扩增和表达编码本文所描述的抗NTPDase3抗体的DNA。例如，重组表达载体可为可复制DNA构建体，其具有编码与来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适转录和/或翻译调节元件可操作地连接的抗NTPDase3抗体的多肽链的合成或cDNA衍生DNA片段。转录单元通常包含以下各者的组装：(1)在基因表达方面具有调控作用的一种或多种基因元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列，和(3)适当的转录和翻译起始和终止序列。调节元件可包括控制转录的操纵子序列。另外可并入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力和促进转化体识别的选择基因。DNA区域当其在功能上彼此相关时“可操作地连接”。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则其可操作地连接于多肽的DNA；如果启动子控制编码序列的转录，则其可操作地连接于所述序列；或者如果核糖体结合位点经定位从而允许翻译，则其可操作地连接于编码序列。在一些实施方案中，旨在用于酵母表达系统中的结构元件包括使得能够使翻译蛋白质由宿主细胞在细胞外分泌的前导序列。在其他实施方案中，在无前导或输送序列下表达重组蛋白的情况下，其可包括N端甲硫氨酸残基。此残基可任选地随后从表达的重组蛋白裂解以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主细胞的选择。可采用广泛多种表达宿主/载体组合。适用于真核宿主的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。适用于细菌宿主的表达载体包括已知细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物；以及较宽宿主范围质粒，例如M13和其他丝状单链DNA噬菌体。
适用于表达抗NTPDase3抗体(或用作靶标的蛋白质)的多肽链的宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核生物、酵母细胞、昆虫细胞或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括如下文所描述的已确立的哺乳动物来源细胞系。也可采用无细胞翻译系统。适用于与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的克隆和表达载体是本领域技术人员众所周知的。
各种哺乳动物细胞培养系统用于表达重组多肽。重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达可为优选的，因为此类蛋白质通常正确折叠、适当修饰并具有生物学功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7(猴肾衍生)、L-929(鼠类成纤维细胞衍生)、C127(鼠类乳房肿瘤衍生)、3T3(鼠类成纤维细胞衍生)、CHO(中国仓鼠卵巢衍生)、HeLa(人类宫颈癌衍生)、BHK(仓鼠肾成纤维细胞衍生)，和HEK-293(人类胚胎肾衍生)细胞系和其变体。哺乳动物表达载体可包含非转录元件，例如复制起点、连接至待表达基因的合适启动子和增强子，以及其他5'或3'侧接非转录序列，以及5'或3'未翻译序列，例如必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供者和受者位点，以及转录终止序列。
在昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表达重组蛋白也提供用于产生正确折叠和生物功能性蛋白质的稳定方法。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统是本领域技术人员众所周知的。
在某些实施方案中，多核苷酸包含编码抗体重链的多核苷酸，所述抗体重链包含与本文所描述的重链可变区(例如SEQ ID No.2)具至少60％同一性，并且甚至更优选与本文所描述的重链可变区(例如SEQ ID No.2)具至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一性的可变区，并且能够特异性结合人类NTPDase3。
在某些实施方案中，多核苷酸包含编码抗体轻链的多核苷酸，所述抗体轻链包含与本文所描述的轻链可变区(例如SEQ ID No.4)具至少60％同一性，并且甚至更优选与本文所描述的轻链可变区(例如SEQ ID No.4)具至少65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同一性的可变区，并且能够特异性结合人类NTPDase3。
V.用于体内递送的经编码的抗NTPDase3抗体
用于递送待在患者中表达的抗NTPDase3抗体的编码序列的治疗载体可为病毒、非病毒或物理的。参见例如Rosenberg等人,Science,242:1575-1578,1988，和Wolff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9011-9014(1989)。用于基因疗法的方法和组合物的论述包括Eck等人,Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第九版,Hardman等人编,McGraw-Hill,New York,(1996),第5章,第77-101页；Wilson,Clin.Exp.Immunol.107(增刊1):31-32,1997；Wivel等人,Hematology/Oncology Clinicsof North America,Gene Therapy,S.L.Eck编,12(3):483-501,1998；Romano等人,StemCells,18:19-39,2000和其中所引用的参考文献。美国专利第6,080,728号也提供了关于广泛多种基因递送方法和组合物的论述。递送途径包括例如全身性施用和原位施用。众所周知的病毒递送技术包括使用腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、泡沫病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺相关病毒载体。
a.病毒载体
优选的病毒载体是基于非细胞病变真核病毒，其中非必需基因已由运载编码表位的核酸序列并靶向所关注序列的核酸构建体置换。本发明涵盖的某些实施方案的优选病毒是腺病毒和腺相关(AAV)病毒，其为已批准用于基因疗法中的人类用途的双链DNA病毒。此外，用于耐受化的优选载体不包括免疫刺激序列。
腺病毒载体
一种用于体内递送一个或多个核酸序列的说明性方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意在包括含有腺病毒序列的那些构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持构建体包装和(b)表达已以有义或反义取向克隆于其中的多核苷酸。当然，在反义构建体的情形下，表达不需要合成基因产物。在一个具体实施方案中，递送载体涉及可商购的细胞色素b5还原酶3(CYB5R3)的ORF，腺病毒载体pAd中的转录变体1，具有C端标记和His标签(Vigene Biosciences产品码AH889428)。WIPO专利申请WO/2015/050364也教导了具有包括Cyb5r3基因的表达构建体的载体。
腺病毒载体是高度免疫原性的并因此对于施用以通过呈递抗原或在自身免疫疾病情况下诱导耐受性来说是不太优选的。然而，这些载体可用于例如在治疗感染性疾病等(包括例如流感、HBV、HCV和HIV)中诱导免疫性。
腺相关病毒载体(AAV)
AAV由于其安全性(即，经基因工程化(重组)而不整合至宿主基因组中)而成为递送媒介物的良好选择。同样，AAV不是病原性的并且不与任何疾病相关联。去除病毒编码序列使对病毒基因表达的免疫反应降至最低，并且因此rAAV不引起发炎反应。根据特一个具体实施方案，包含含有本文所描述的核酸构建体的表位序列的AAV载体可用于转导APC。
通常，包含含有核酸构建体的表位的病毒载体由编码所需表位的多核苷酸、合适调节元件和介导细胞转导的表位表达所需的元件组装。在一个实施方案中，采用腺相关病毒(AAV)载体。在一个更具体的实施方案中，AAV载体是AAV1、AAV6或AAV8。
具有由AAV ITR界定的所关注DNA分子的AAV表达载体可通过将所选择的序列直接插入至已从其切除主要AAV开放阅读框架(“ORF”)的AAV基因组中来构建。可包括于本发明的AAV中的组成型启动子的实例包括但不限于示例的CMV立即早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
对于真核细胞，表达控制序列通常包括启动子、增强子(例如来源于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子)和多腺苷酸化序列，其可包括剪接供者和受者位点。通常在转基因序列之后和3'ITR序列之前插入多腺苷酸化序列。在一个实施方案中，可使用牛生长激素polyA。
这些和其他共同载体和调节元件的选择是常规的，并且可获得许多此类序列。参见例如Sambrook等人，和其中在例如第3.18-3.26页和第16.17-16.27页所引用的参考文献，以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NewYork,1989)。当然，并非所有载体和表达控制序列将同样发挥良好的功能以表达本发明的所有转基因。然而，本领域技术人员可在不脱离本发明范围的情况下在这些表达控制序列中进行选择。可由本领域技术人员使用由本申请提供的指导来选择合适的启动子/增强子序列。此类选择是常规事项并且不是分子或构建体的限制。
逆转录病毒载体
在某些实施方案中，病毒载体可为逆转录病毒载体。“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒。在特定实施方案中，逆转录病毒载体含有病毒基因组的包装和整合所必需的所有顺式作用序列，即(a)载体的每个端处的长末端重复序列(LTR)或其部分；(b)用于负链和正链DNA合成的引物结合位点；和(c)将基因组RNA并入至病毒粒子中所必需的包装信号。关于逆转录病毒载体的更多细节可见于Boesen等人,1994,Biotherapy 6:291-302；Clowes等人,1994,J.Clin.Invest.93:644-651；Kiem等人,1994,Blood 83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141；Miller等人,1993,Meth.Enzymol.217:581-599；以及Grossman和Wilson,1993,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114中。
“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的属。示例性γ逆转录病毒包括小鼠干细胞病毒、鼠类白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽类网状内皮细胞增生病毒。
广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和其组合的那些载体(参见例如Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739,1992；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640,1992；Sommerfelt等人,Virol.176:58-59,1990；Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378,1989；Miller等人,J.Virol.65:2220-2224,1991；和PCT/US94/05700)。
慢病毒载体是指能够感染分裂细胞和未分裂细胞并通常产生高病毒滴度的逆转录病毒属。慢病毒的若干实例包括HIV(人类免疫缺陷病毒：包括1型HIV和2型HIV)；马感染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在特定实施方案中，可使用其他逆转录病毒载体。这些载体包括例如基于人类泡沫病毒(HFV)或泡沫病毒(Spumavirus)属中的其他病毒的载体。泡沫病毒(FV)是迄今已知的最大的逆转录病毒并广泛分布于不同哺乳动物中，包括所有非人类灵长类动物物种，但不存在于人类中。这种完全致病机制使得FV载体能够作为用于人类中的基因疗法的理想基因转移媒介物，并且明确区分作为基因递送系统的FV载体与HIV衍生以及γ逆转录病毒衍生的载体。
非细胞病变病毒包括逆转录病毒(例如慢病毒)，其生命周期涉及将基因组病毒RNA逆转录成DNA，随后将前病毒整合至宿主细胞DNA中。已批准逆转录病毒用于人类基因疗法试验。最有用的是复制缺陷型逆转录病毒(即，能够引导所需蛋白质的合成，但不能制造感染性粒子)。此类经基因更改的逆转录病毒表达载体具有用于体内高效转导基因的一般效用。用于制备复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括以下步骤：将外源性基因物质并入质粒中、转染内衬有质粒的包装细胞、通过包装细胞系产生重组逆转录病毒、从组织培养基收集病毒粒子以及用病毒粒子感染靶细胞)是本领域技术人员已知的。
逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的三种基因gag、pol和env。在gag基因上游发现的序列含有用于将基因组包装至病毒粒子中的信号。逆转录病毒载体是其中异源核酸存在于两个逆转录病毒LTR之间的基因转移质粒。逆转录病毒载体典型地含有适当包装信号，其使得逆转录病毒载体或使用逆转录病毒载体转录的RNA作为模板能够在适当包装细胞系中包装至病毒粒子中(参见例如美国专利第4,650,764号)。这两个长末端重复序列(LTR)序列存在于病毒基因组的5'和3'端。这些序列含有强启动子和增强子序列并且也是整合于宿主细胞基因组中所需(Coffin,1990)。为了构建逆转录病毒载体，将编码一个或多个所关注的寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸代替某些病毒序列插入至病毒基因组中，以产生具有复制缺陷性的病毒。还包括基于慢病毒(例如一种类型的逆转录病毒)的游离型或非整合形式的逆转录病毒载体。
慢病毒载体在需要稳定表达时适用，但慢病毒载体可具有免疫原性，并且可能具有其他非所需的作用。因此，尽管慢病毒载体方便用于研究，但在将其用于人类施用时，特别是在需要诱导耐受性而非免疫性的情况下应注意。慢病毒适用于离体工程改造T细胞或树突状细胞或其他抗原呈递细胞以用于癌症疗法，但mRNA电穿孔更安全。然而，两种近期发展已使得使用慢病毒更安全并且临床上更可转化。首先，自杀基因以及抗原的共表达，其产物在施用药物时变得具有功能性。典型实例是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-Tk)。表达这些基因的细胞可将药物更昔洛韦(ganciclovir)代谢成诱导细胞死亡的细胞毒性产物。因此，在一些转导细胞变得恶性的情况下，可将其根除。存在约12个此类系统(Duarte等人,Cancer Letters,324:160-170,2012)。其次，现存在正在开发的非整合慢病毒载体，因此其为非致癌的(Nightingal等人,2006,Mol.Ther.,13:1121-1132)。这些方法可根据本领域技术人员的判断而与本发明一起使用。
适用于本文中的逆转录病毒载体描述于例如美国专利第5,399,346号和第5,252,479号；以及WIPO公开WO 92/07573、WO 90/06997、WO 89/05345、WO 92/05266和WO 92/14829中，其提供了用于使用此类逆转录病毒载体将核酸有效引入至人类细胞中的方法的说明。其他逆转录病毒载体包括例如小鼠乳房肿瘤病毒载体(例如Shackleford等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:9655-9659,1998)、慢病毒等。示例性病毒载体是plentilox-IRES-GFP。
包括可容易经调适用于递送编码抗NTPDase3抗体剂的转基因的其他逆转录病毒递送系统仅用以说明公开的PCT申请WO/2010/045002、WO/2010/148203、WO/2011/126864、WO/2012/058673、WO/2014/066700、WO/2015/021077、WO/2015/148683、WO/2017/040815，其中的每一者的说明书和附图通过引用并入本文。
在某些实施方案中，逆转录病毒是重组型复制胜任型逆转录病毒，其包含：编码逆转录病毒GAG蛋白质的核酸序列；编码逆转录病毒POL蛋白质的核酸序列；编码逆转录病毒包膜的核酸序列；肿瘤逆转录病毒多核苷酸序列，其在肿瘤逆转录病毒多核苷酸序列的5'和3'端处包含长末端重复(LTR)序列；盒，其包含可操作地连接至抗NTPDase3抗体剂的编码序列的内部核糖体入口位点(IRES)，其中所述盒位于针对3'LTR的U3区的5'和针对编码逆转录病毒包膜的序列的3'；和用于靶细胞中的逆转录、包装和整合的顺式作用序列。
在某些实施方案中，逆转录病毒是重组型复制胜任型逆转录病毒，其包含：逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多核苷酸，其包含逆转录病毒多核苷酸序列的3'端处的长末端重复(LTR)序列、逆转录病毒多核苷酸的5'端处的启动子序列、适用于哺乳动物细胞中的表达的启动子、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域；盒，其包含与异源多核苷酸可操作地连接的抗NTPDase3抗体剂编码序列，其中所述盒位于针对3'LTR的5'和针对编码逆转录病毒包膜的env核酸域的3'；以及靶细胞中的逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
在重组型复制胜任型逆转录病毒的某些优选实施方案中，包膜选自双嗜性、多嗜性、嗜异性、10A1、GALV、狒狒内源性病毒(Baboon endogenous virus)、RD114、棒状病毒、α病毒、麻疹或流感病毒包膜中的一者。
在重组型复制胜任型逆转录病毒的某些优选的实施方案中，逆转录病毒多核苷酸序列是从选自由以下组成的组的病毒工程改造：鼠类白血病病毒(MLV)、莫罗尼鼠类白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)、狒狒内源性逆转录病毒(BEV)、猪内源性病毒(PERV)、猫源逆转录病毒RD114、松鼠猴逆转录病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)、禽类网状内皮细胞增生病毒(REV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
在重组型复制胜任型逆转录病毒的某些优选的实施方案中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。
在重组型复制胜任型逆转录病毒的某些优选的实施方案中，存在第二盒，其例如在盒下游包含第二治疗性蛋白质，例如另一检查点抑制剂多肽、共刺激多肽和/或免疫刺激性细胞因子(仅作为实例)的编码序列。在某些实例中，第二盒可包括与第二治疗性蛋白质的编码序列可操作地连接的内部核糖体入口位点(IRES)或微型启动子或polIII启动子。
在重组型复制胜任型逆转录病毒的某些优选的实施方案中，其为非细胞溶性、双嗜性逆转录病毒复制载体，其优选地在肿瘤微环境的细胞中选择性感染和复制。
作为表达构建体的其他病毒载体
其他病毒载体可用作本发明内所涵盖的实施方案中的表达构建体，用于将寡核苷酸或多核苷酸序列递送至宿主细胞。可采用来源于病毒(例如牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒)的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供若干有吸引力的特征。还包括乙型肝炎病毒。
b.非病毒载体
质粒载体
其他载体包括质粒载体。质粒载体在本领域中已广泛描述并且是本领域技术人员众所周知的。参见例如上文所引用的Sambrook等人,1989。在过去的数年中，已使用质粒载体作为DNA疫苗以用于向细胞体内递送抗原编码基因。所述质粒载体对此特别有利，因为它们不具有与许多病毒载体相同的安全性问题。然而，这些具有与宿主细胞相容的启动子的质粒可表达由质粒内的核酸编码的肽表位。其他质粒是本领域普通技术人员众所周知的。此外，质粒可使用限制酶和接合反应定制设计以去除和添加特定DNA片段。可通过多种肠胃外、粘膜和局部途径递送质粒。例如，可通过肌肉内、皮内、皮下或其他途径注射DNA质粒。其也可通过鼻内喷雾剂或滴剂、直肠栓剂和经口施用。其也可使用基因枪施用至表层或粘膜表面。质粒可在水溶液中提供，在金粒子上干燥或与另一种DNA递送系统(包括但不限于脂质体、树枝状聚合物、脂质卷和微囊封)结合。
因此，在一个方面，质粒经提供以用于表达含有包括表达盒的核酸构建体的表位；也称为转录单元。当将质粒置于适合于表位表达的环境中时，转录单元将表达多核苷酸，其包括编码表位的序列、ETS和MHCII激活子序列或编码表位和分泌信号序列的序列以及在构建体中另外编码的任何物质。转录单元包括转录控制序列，其以转录方式与细胞免疫反应元件编码序列连接。转录控制序列可包括启动子/增强子序列，例如巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子序列。然而，本领域技术人员应认识到，多种其他适用于在真核细胞中表达的启动子序列是已知的并且可类似地用于本文公开的构建体中。核酸产物的表达水平将取决于相关启动子以及相关增强子元件的存在和活化。
在某些实施方案中，编码所需表位和靶向序列的序列可克隆至表达质粒中，所述表达质粒含有用于转录、翻译、RNA稳定性和复制的调节元件(即包括转录控制序列)。此类表达质粒是本领域中众所周知的并且普通技术人员将能够以可表达细胞免疫反应元件的方式设计具有包括编码细胞免疫反应元件或其片段的序列的多核苷酸的适当表达构建体。存在合适的表达质粒的许多实例，包括序列的多核苷酸可克隆至所述表达质粒中，例如pCI-neo、pUMVC或pcDNA3。
具有用于表达细胞免疫反应元件或其片段的质粒的大量细菌宿主可经发酵并且质粒可经纯化以供后续使用。使用质粒的当前人类临床试验利用这种方法。重组DNA咨询委员会数据管理报告(Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report),Human Gene Therapy 6:535-548,1994。本领域中已知的当前DNA分离方法包括从用于繁殖质粒的细菌除去作为污染物的脂多糖(内毒素)。这个步骤最优选被用于使用致耐受性DNA疫苗，因为内毒素充当强佐剂并且可能产生不需要的免疫刺激。
质粒的目的是向细胞或组织中有效递送核酸序列和在细胞或组织中表达治疗性表位。特别是，质粒的目的可为实现高拷贝数、避免质粒不稳定性的潜在起因和提供质粒选择手段。至于表达，核酸盒含有盒内核酸表达的必需元件。表达包括用质粒对插入的基因、核酸序列或核酸盒的有效转录。表达产物可为蛋白质、多肽或RNA。核酸序列可含于核酸盒中。核酸的表达可为连续的或经调节的。
微型环
本文所描述的核酸构建体的实施方案可以微型环DNA形式处理。微型环DNA涉及已从所有原核载体部分释放的小型(2-4kb)环形质粒衍生物。因为微型环DNA载体不含细菌DNA序列，因此它们不大可能被感知为外来的并且被破坏。(典型的转基因递送方法涉及含有外源DNA的质粒。)因此，与常规质粒(数天至数周)相比，这些载体可表达较长时段(按数周或数月)。微型环的较小尺寸也扩展其克隆能力并且有助于其递送至细胞中。用于制备微型环DNA的试剂盒是本领域中已知和可商购的(System Biosciences,Inc.,Palo Alto,Calif.)。关于微型环DNA的信息提供于Dietz等人,Vector Engineering and DeliveryMolecular Therapy(2013)；21 8,1526-1535和Hou等人,Molecular Therapy-Methods&Clinical Development,Article number:14062(2015)doi:10.1038/mtm.2014.62中。更多关于微型环的信息提供于Chen Z Y,He C Y,Ehrhardt A,Kay M A.Mol Ther.2003年9月；8(3):495-500中并且微型环DNA载体实现由活性染色质和转录水平反映的持续表达。GraceyManiar L E,Maniar J M,Chen Z Y,Lu J,Fire A Z,Kay M A.Mol Ther.2013年1月；21(1):131-8。
作为最终获得由核酸编码的产物的表达的方法中的初始步骤，为实现核酸被细胞吸收。核酸被细胞吸收取决于多种因素，其中之一是核酸接近细胞表面期间的时间长度。例如，在肌肉内(i.m.)施用缓冲液形式的质粒DNA后，如果肌肉经按摩，则观测到基因表达显著降低，推测归因于DNA直接或经由淋巴血管从肌肉漏出(Human Gene Therapy 4:151-159；1993)。因此，可能需要用化合物来配制核酸，所述化合物应阻滞核酸扩散速率或使其离开需要对核酸进行细胞摄取的位点。此外，这些化合物可适合于通过例如注射的方式向生物体施用，同时维持或恢复增加核酸的细胞摄取所需的物理特征。
为了实现寡核苷酸或多核苷酸序列的表达，表达构建体必须被递送至细胞中。在本发明所涵盖的某些实施方案中，包含一个或多个寡核苷酸或多核苷酸序列的表达构建体可简单地由裸重组DNA或质粒组成。
为了引发免疫性，任何类型的DNA疫苗载体优选被工程化为富CpG的(以刺激免疫细胞上的TLR9)或相反被工程化以去除CpG，并且在可能时，用GpG基序置换CpG基序(Ho等人,J.Immunol.71(9):4920-6,2003；Ho等人,J.Immunol.175(9):6226-34,2005)。DNA疫苗可被工程化以含有抗原/表位，并且也可含有额外基因以与抗原共表达以充当佐剂或免疫调节剂(多个启动子载体)。已发现这些DNA疫苗在临床上是安全的，例如在T1D患者中(Roep等人,Sci.Transl.Med.5(191):191ra82,2013)。
机械递送系统
其他非病毒递送方法包括但不限于可体外使用的机械递送系统，例如描述于Woffendin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(24):11581,1994中的方法；沉积光聚合水凝胶材料或使用电离辐射(参见例如美国专利第5,206,152号和WO 92/11033)；使用手持式基因转移粒子枪(参见例如美国专利第5,149,655号)；和使用电离辐射用于激活转移基因(参见例如美国专利第5,206,152号和WO 92/11033)。递送装置也可为生物相容的，并且也可为可生物降解的。制剂优选地提供相对恒定水平的活性组分释放。另一方面，可能需要在施用后立即释放的速率更快。此类组合物的制剂完全在本领域普通技术人员使用已知技术的水平内。
增强递送的物理方法包括电穿孔(其中高电压的短脉冲携带核酸穿过膜)、基因枪(其中DNA装载至金粒子上并迫使实现DNA穿透至细胞中)、声致穿孔、磁转染、流体动力递送等，所有方法都是本领域技术人员已知的。DNA也可囊封于脂质体、优选地阳离子脂质体或聚合物囊泡(合成脂质体)中，所述脂质体可与细胞膜相互作用并且融合或经历内饮作用以实现DNA转移至细胞中。DNA也可与聚合物(多聚物)或与树枝状聚合物形成复合物，所述聚合物或树枝状聚合物可将其负载直接释放至细胞的细胞质中。
在此方面适用的说明性载体包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、乳胶、淀粉、纤维素、葡聚糖等的微粒。其他说明性延迟释放载体包括超分子生物载体，其包含非液体亲水性核心(例如交联多糖或寡糖)和任选地外部层，其包含两亲性化合物，例如磷脂(参见例如美国专利第5,151,254号和PCT申请WO 94/20078、WO/94/23701和WO 96/06638)。持续释放制剂中所含的活性剂的量取决于植入位点、释放的速率和预期持续时间以及所治疗或预防的疾患的性质。
可使用可生物降解的微球体(例如聚丙交酯聚羟乙酸酯)作为组合物的载体。合适的可生物降解的微球体公开于例如美国专利第4,897,268号；第5,075,109号；第5,928,647号；第5,811,128号；第5,820,883号；第5,853,763号；第5,814,344号；第5,407,609号；和第5,942,252号中。经修饰的乙型肝炎核心蛋白载体系统，例如WO/9940934和其中所引用的参考文献中所描述，也将适用于许多应用。另一种说明性载体/递送系统采用包含微粒-蛋白质复合物的载体，例如美国专利第5,928,647号中所描述的那些，其在瘤内使用以递送抗NTPDase3抗体剂的编码序列时可具有额外的益处，所述抗NTPDase3抗体剂能够诱导靶向患者肿瘤组织的MHC I限制性细胞毒性T淋巴细胞反应。
可生物降解的聚合纳米粒子促进非病毒核酸转移至细胞中。通过阳离子性、可水解降解的聚(β-氨基酯)和质粒DNA的自组装来形成小型(约200nm)、带正电(约10mV)粒子。
也可通过直接显微注射、暂时性细胞渗透(例如阻遏子和/或激活子与细胞渗透剂的共施用)、与膜易位肽融合等来向细胞施用多核苷酸。
在本公开的某些特定实施方案中，经由电穿孔将基因构建体引入至靶细胞中。电穿孔涉及细胞(或组织)和DNA(或DNA复合物)暴露于高电压放电。体内电穿孔是已成功地用于将质粒DNA有效递送至许多不同组织中的基因递送技术。研究已报道，施用体内电穿孔用于将质粒DNA递送至B16黑色素瘤和其他肿瘤组织。由质粒编码的基因或cDNA的全身和局部表达可通过施用体内电穿孔来获得。使用体内电穿孔增强肿瘤组织中的质粒DNA吸收，引起肿瘤内的表达并且向肌肉组织递送质粒，引起分泌蛋白(例如细胞因子)的全身性表达(参见例如US8026223)。用于体内将抗NTPDase3抗体剂转基因电穿孔至细胞中的示例性技术、载体和装置包括PCT公开WO/2017/106795、WO/2016/161201、WO/2016/154473、WO/2016/112359和WO/2014/066655。
美国专利第7,245,963号描述了模块化电极系统和其用于促进将生物分子引入身体或植物中的所选择组织的细胞中的用途。模块化电极系统包括多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可程序化恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接；和电源。操作员可握紧安装在支撑结构上的多个针电极并将其牢固地插入身体或植物中的所选择组织中。然后，经由皮下注射针将生物分子递送至所选择的组织中。启动可程序化恒定电流脉冲控制器并向多个针电极施加恒定电流电脉冲。所施加的恒定电流电脉冲有助于将生物分子引入至多个电极之间的细胞中。美国专利第7,245,963号的全部内容通过引用并入本文。
美国专利公开2005/0052630描述了一种电穿孔装置，其可用于有效地促进将生物分子引入至身体或植物中的所选择组织的细胞中。电穿孔装置包括由软件或固件指定操作的电动力学装置(“EKD装置”)。EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列可程序化恒定电流脉冲模式，并且实现电流波形数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换的电极盘，用于注射针的中心注射通道和可移式导引盘(参见例如美国专利公开2005/0052630)，特此通过引用并入。
美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中所描述的电极阵列和方法经调适以用于不仅深度渗透至例如肌肉的组织中，并且也可深度渗透至其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，也在由电极预先划定的区域将注射针(用于递送所选生物分子)完全插入目标器官中，并且垂直于所述目标物体施用注射。
典型地，体内细胞电穿孔所需的电场通常在量值上与体外细胞所需的电场类似。在一个实施方案中，电场的量值在大约10V/cm至约1500V/cm、优选地约300V/cm至1500V/cm并且优选地约1000V/cm至1500V/cm范围内。或者，电场强度越低(约10V/cm至100V/cm，并且更优选约25V/cm至75V/cm)，脉冲长度越长。例如，当标称电场为约25-75V/cm时，优选地脉冲长度为约10msec。
脉冲长度可为约10s至约100ms。可存在任何所需数目的脉冲，通常每秒一至100次脉冲。脉冲集合之间的延迟可为任何所需时间，例如一秒。波形、电场强度和脉冲持续时间也可取决于经由电穿孔进入细胞的细胞类型和分子类型。
也涵盖合并有电化学阻抗光谱仪(“EIS”)的电穿孔装置。特别是，此类装置提供关于体内瘤内电穿孔效率的实时信息，从而实现条件的优化。合并有EIS的电穿孔装置的实例可见于例如WO2016/161201中，其特此通过引用并入。
本发明涵盖的非病毒递送载体的吸收也可通过等离子体电穿孔(也称为雪崩转染)增强。简言之，微秒放电在电极表面产生空化微泡。与扩散介导的与常规电穿孔相关的传送相比，由崩溃微泡产生的机械力与磁场组合用于提高跨越细胞膜的传送效率。等离子体电穿孔的技术描述于美国专利第7,923,251号和第8,283,171号中。这种技术也可体内用于细胞的转化。Chaiberg等人(2006)Investigative Ophthalmology&Visual Science 47:4083-4090；2012年1月24日颁布的Chaiberg等人,美国专利第8,101,169号。
也涵盖其他替代性电穿孔技术。也可使用冷等离子体进行体内质粒递送。等离子体是四种基本物质状态之一，其他三种是固体、液体和气体。等离子体是未结合的正性和负性粒子的电中性介质(即，等离子体的总电荷约为零)。等离子体可通过加热气体或使其经历由雷射或微波发生器施加的强电磁场来产生。这减少或增加电子数目，产生称为离子的正性或负性带电粒子(Luo等人(1998)Phys.Plasma5:2868-2870)，并且伴有分子键(如果存在)的解离。
通过将脉冲式高电压信号递送至合适的电极来产生冷等离子体(即，非热等离子体)。冷等离子体装置可呈喷气装置或介质阻挡放电(DBD)装置形式。冷温度等离子体由于在相对低气体温度下提供等离子体而吸引了大量注意和关注。在此类温度下提供等离子体与多种应用相关，包括伤口愈合、抗菌过程、各种其他医学疗法和灭菌。如先前所指出，通过将脉冲式高电压信号递送至合适的电极来产生冷等离子体(即，非热等离子体)。冷等离子体装置可呈喷气装置、介质阻挡放电(DBD)装置或多频富含谐波的电源形式。
介质阻挡放电装置依赖于用于产生冷等离子体的不同方法。介质阻挡放电(DBD)装置含有至少一个由介电层覆盖的传导性电极。电返回路径是由可由经历冷等离子体处理的目标基板提供的地面或通过提供电极的固有地面来形成。介质阻挡放电装置的能量可由高电压电源(例如上文提及的电源)提供。更一般而言，将能量以脉冲式DC电压形式输入介质阻挡放电装置以形成等离子体放电。借助于介电层，使放电与传导性电极分离并且减少电极蚀刻和气体加热。可改变脉冲式DC电压的幅度和频率以实现不同操作方案。任何合并有此类冷等离子体产生原理的装置(例如DBD电极装置)都属于本发明涵盖的各种实施方案的范围内。
冷等离子体已用于转染具有外源核酸的细胞。特别是，肿瘤细胞的转染(参见例如Connolly等人(2012)Human Vaccines&Immune-therapeutics 8:1729-1733；和Connolly等人(2015)Bioelectrochemistr y 103:15-21)。
在某些说明性实施方案中，使用电穿孔装置递送编码本发明涵盖的抗NTPDase3抗体剂的转基因构建体，所述电穿孔装置包括：施用器；从施用器延伸的多个电极，所述电极与覆盖区相关联；与电极电连通的电源，所述电源经配置以对覆盖区内的细胞产生一个或多个电穿孔信号；以及与电极耦合的引导部件，其中所述引导部件经配置以调节电极的覆盖区。至少一部分电极可以锥形排列形式安置在施用器内。一个或多个电穿孔信号可各自与电场相关联。装置还可包括与电源和电极耦合的电位计。电位计可经配置以将电场大致上保持在预定范围内。
一个或多个电穿孔信号可各自与电场相关联。装置还可包括与电源和电极耦合的电位计。电位计可经配置以将电场保持在预定范围内，以便基本上防止覆盖区内细胞的永久性损伤和/或基本上使疼痛最小化。例如，电位计可经配置以保持电场为约1300V/cm。
电源可向第一电极提供第一电信号并且向第二电极提供第二电信号。第一和第二电信号可组合以产生具有差频的波。第一和第二电信号可各自具有单极波形和双极波形中的至少一者。第一电信号可具有第一频率和第一振幅。第二电信号可具有第二频率和第二振幅。第一频率可与第二频率不同或相同。第一振幅可与第二振幅不同或相同。
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗具有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括：向肿瘤注射有效剂量的编码抗NTPDase3抗体剂的质粒；以及向肿瘤施用电穿孔疗法。在某些实施方案中，电穿孔疗法还包括在约100微秒至约20毫秒的脉冲宽度内施用至少一个约200V/cm至约1500V/cm的电压脉冲。
在某些实施方案中，质粒(或第二电穿孔质粒)进一步编码至少一种免疫刺激性细胞因子，例如选自编码IL-12、IL-15以及IL-12和IL-15的组合的组。
用于递送编码核酸构建体的抗NTPDase3抗体的脂质和聚阳离子分子
体外和体内脂质介导的核酸递送和外源核酸(包括mRNA)的表达已是极成功的。基于脂质的非病毒制剂提供了腺病毒基因疗法的替代物。当前体内脂质递送方法使用皮下、皮内、瘤内或颅内注射。脂质制剂的发展已改进了体内基因转移效率(参见PCT申请WO98/07408)。例如，由等摩尔比的l,2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)和胆固醇构成的脂质制剂可显著增强全身性体内基因转移。DOTAP:胆固醇脂质制剂形成称为“夹心脂质体”的独特结构。这种制剂经报道为在内陷双层或‘瓶状’结构之间“包夹”DNA。这些脂质结构的有利特征包括阳性p、通过胆固醇实现的胶态稳定化、二维核酸填充和增加的血清稳定性。
阳离子脂质体技术是基于两性脂质的能力，具有带正电头基和疏水性脂质尾，以结合于带负电DNA或RNA和形成通常通过内饮作用进入细胞的粒子。一些阳离子脂质体也含有中性共脂质，认为其可增强哺乳动物细胞的脂质体吸收。类似地，其他聚阳离子(例如聚-l-赖氨酸和聚乙烯-亚胺)经由电荷相互相用与核酸复合并有助于DNA或RNA缩合成纳米粒子，其然后成为内体介导的吸收的底物。[8]已研发若干种这些阳离子-核酸复合物技术作为潜在临床产品，包括与质粒DNA (pDNA)、寡脱氧核苷酸和各种形式的合成RNA的复合物。
本文中所公开的核酸构建体可与用于增强细胞中的吸收的聚阳离子分子相关联。使核酸构建体与聚阳离子分子复合也有助于包装构建体，因为其尺寸减小，据信这有助于细胞吸收。一旦位于内体中，复合物由于较低pH值而解离，并且聚阳离子分子可破坏内体的膜以促进DNA在其可降解之前逃逸至细胞质中。初步资料证实当与聚阳离子分子聚赖氨酸或聚乙二亚胺复合时，与DC相比，核酸构建体实施方案在SC中具有增强的吸收。
适用于与核酸构建体复合的聚阳离子分子的一个实例包括细胞穿透肽(CPP)，实例包括聚赖氨酸(上文所描述)、聚精氨酸和Tat肽。细胞穿透肽(CPP)是小型肽，其可结合于DNA并且在释放后，穿透细胞膜以促进DNA从内体逃逸至细胞质中。CPP的另一个实例涉及27残基嵌合肽，称为MPG，在前段时间证实以稳定方式结合ss-和ds-寡核苷酸，产生保护核酸避免由DNA酶降解的非共价复合物并且将寡核苷酸有效体外递送至细胞中(Mahapatro A等人,J Nanobiotechnol,2011,9:55)。当研究不同肽:DNA比率以及10:1和5:1比率(分别为150nm和1μm)时，复合物形成约150nm至1μm的小粒子。另一种CPP涉及经修饰的四肽[含有胍基羰基吡咯(GCP)基团的四赖氨酸(TL-GCP)]，报道其以高亲和力与6.2kb质粒DNA结合，产生700-900nm的带正电荷聚集物(Li等人,Agnew Chem Int Ed Enl 2015；54(10):2941-4)。RNA也可通过此类聚阳离子分子复合以用于体内递送。
可与本文所描述的核酸构建体复合的聚阳离子分子的其他实例包括可以
Figure BDA0004113291790001551
和In Vivo JET(Polypus-transfection,S.A.,Illkirch,France)商购的聚阳离子聚合物。
VI.使用方法和药物组合物
本发明涵盖的抗NTPDase3抗体适用于多种应用，包括但不限于治疗性处理方法，例如用于癌症的免疫疗法。在某些实施方案中，本文所描述的抗NTPDase3抗体适用于活化、促进、增加和/或增强免疫反应、抑制肿瘤生长、降低肿瘤体积、诱导肿瘤消退、增加肿瘤细胞的细胞凋亡和/或降低肿瘤的致瘤性。在某些实施方案中，本发明涵盖的抗NTPDase3抗体和衍生物也适用于针对病原体如病毒的免疫疗法。在某些实施方案中，本文所描述的抗NTPDase3抗体适用于抑制病毒感染、减少病毒感染、增加病毒感染的细胞凋亡和/或增加病毒感染细胞的杀伤。使用方法可为体外、离体或体内方法。
本发明提供了使用本文所描述的抗NTPDase3抗体激活受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所描述的抗NTPDase3抗体促进受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所描述的抗NTPDase3抗体增加受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所描述的抗NTPDase3抗体增强受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括增加细胞介导的免疫。
在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括减少肿瘤中M2或M2样巨噬细胞的数目。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括降低M2巨噬细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高M1巨噬细胞活性。
在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括降低肿瘤中腺苷的水平。
在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括增加Th1型反应。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高T细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高CD4+T细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高CD8+T细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高CTL活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高T细胞活性和提高NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高CU活性和提高NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括抑制或降低Treg细胞的抑制活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括抑制或降低骨髓衍生的抑制性细胞(MDSC)的抑制活性。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括增加记忆T细胞的百分比的数值。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高长期免疫记忆功能。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括提高长期记忆。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括不存在显著副作用和/或基于免疫的毒性的迹象。在一些实施方案中，免疫反应的激活、促进、增加和/或增强包括不存在细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的迹象。在一些实施方案中，免疫反应是抗原刺激的结果。在一些实施方案中，抗原刺激是肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原刺激是癌症。在一些实施方案中，抗原刺激是病原体。在一些其他实施方案中，抗原刺激可为经病毒感染的细胞。
用于确定抗NTPDase3抗体是否调节、激活或抑制免疫反应的体内和体外测定法是本领域中已知的或正在开发。
在本文所描述的方法的某些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生的持续性或长期免疫性的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗NTPDase3抗体。
在一些实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是选自由以下组成的组的肿瘤：结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝脏肿瘤、乳房肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤和头颈部肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是结直肠肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是胰腺或胰岛肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是黑色素瘤肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是膀胱或尿道上皮肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤是液体肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是白血病，例如骨髓性或粒细胞白血病、淋巴、淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病和真性红细胞增多症或红细胞增多。
在一些实施方案中，肿瘤表达或过度表达抗NTPDase3抗体所靶向的肿瘤抗原，例如包含特异性结合肿瘤抗原的抗原结合位点的双特异性药剂。
本发明进一步提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的抗NTPDase3抗体。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体抑制或限制癌症生长。
本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者(例如需要治疗的受试者)施用治疗有效量的本文所描述的抗NTPDase3抗体。在某些实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，受试者患有癌性肿瘤。在某些实施方案中，受试者已去除肿瘤。
在某些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的癌症：结直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、脑癌、胶质母细胞瘤和头颈癌。在某些实施方案中，癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，癌症是结直肠癌。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，癌症是肺癌。在某些实施方案中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是膀胱癌。
本发明提供了包含本文所描述的抗NTPDase3抗体的组合物。本发明还提供了药物组合物，其包含本文所描述的抗NTPDase3抗体和药学上可接受的媒介物。在一些实施方案中，药物组合物可用于免疫疗法中。在一些实施方案中，药物组合物可用于免疫肿瘤学中。在一些实施方案中，组合物可用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，药物组合物可用于抑制受试者(例如人类患者)中的肿瘤生长。在一些实施方案中，组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，药物组合物可用于治疗受试者(例如人类患者)的癌症。
通过组合本发明涵盖的纯化药剂与药学上可接受的媒介物(例如载剂或赋形剂)制备制剂以供储存和使用。本领域技术人员通常将药学上可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂考虑为制剂或药物组合物的非活性成分。
在一些实施方案中，将抗NTPDase3抗体冻干和/或以冻干形式储存。在一些实施方案中，将包含本文所描述的抗NTPDase3抗体的制剂冻干。
合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于无毒性缓冲液，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟苯甲酸烷酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如小于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、双糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物，例如Zn-蛋白质复合物；和非离子表面活性剂，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版增刊,2012,Pharmaceutical Press,London.)。
本发明涵盖的药物组合物可以任何数目的方式施用以用于局部或全身治疗。施用可为局部的，通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂；经肺的，通过吸入或吹入散剂或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内和鼻内；口服；或肠胃外，包括静脉内、动脉内、瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或室内)。
治疗制剂可呈单位剂型。此类制剂包括片剂、丸剂、胶囊、散剂、颗粒剂、于水或非水性介质中的溶液或悬浮液，或栓剂。在例如片剂的固体组合物中，主要活性成分与药物载剂混合。常规压片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和稀释剂(例如水)。这些可用于形成固体预配制组合物，其含有本发明涵盖的化合物的均质混合物或其无毒性的药学上可接受的盐。然后，将固体预配制组合物细分成上文所描述的类型的单位剂型。制剂或组合物的片剂、丸剂等可经包衣或以其他方式经混配以提供具有延长作用的优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包含由外部组分覆盖的内部组合物。此外，两种组分可由用于抵抗崩解并允许内部组分完整地通过胃或延迟释放的肠溶层间隔开。多种材料可用于此类肠溶层或肠溶衣，此类材料包括多种聚合酸和聚合酸与例如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的此类材料的混合物。
抗NTPDase3抗体也可包埋于微胶囊中。此类微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别为羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，制备成胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或制备成巨乳液，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版增刊,2012,Pharmaceutical Press,London中所描述。
在某些实施方案中，药物制剂包括与脂质体复合的抗NTPDase3抗体。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可通过反相蒸发，用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体可经具有限定孔隙尺寸的过滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。
在某些实施方案中，可产生包含抗NTPDase3抗体的持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗NTPDase3抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，其中基质呈成形制品(例如薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的实例包括聚酯；水凝胶，例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚乳酸交酯；L-谷氨酸和7-L-谷氨酸乙酯的共聚物；不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德构成的可注射微球体)；蔗糖乙酸酯异丁酸盐；和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
在某些实施方案中，除施用抗NTPDase3抗体之外，方法或治疗还包括施用至少一种额外免疫反应刺激剂。在一些实施方案中，额外免疫反应刺激剂包括但不限于集落刺激因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF))、白细胞介素(例如IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、检查点抑制剂、阻断免疫抑制性功能的抗体(例如抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体)、toll样受体(例如TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族的成员(例如CD80、CD86)。其他免疫反应刺激剂可在施用抗NTPDase3抗体之前、同时和/或之后施用。还提供了包含抗NTPDase3抗体和免疫反应刺激剂的药物组合物。在一些实施方案中，免疫反应刺激剂包含1种、2种、3种或更多种免疫反应刺激剂。
在某些实施方案中，除施用抗NTPDase3抗体之外，方法或治疗还包括施用至少一种额外治疗剂。额外治疗剂可在施用抗NTPDase3抗体之前、同时和/或之后施用。还提供了包含抗NTPDase3抗体和额外治疗剂的药物组合物。在一些实施方案中，至少一种额外治疗剂包含1种、2种、3种或更多种额外治疗剂。
具有两种或更多种治疗剂的组合疗法通常使用通过不同作用机制起作用的药剂，尽管这不是所需的。使用具有不同作用机制的药剂的组合疗法可引起累加或协同作用。组合疗法可允许与单一疗法中所用相比更低剂量的每种药剂，由此降低毒性副作用和/或增加抗NTPDase3抗体的治疗指数。组合疗法可降低耐药癌细胞发展的可能性。在一些实施方案中，组合疗法包含影响免疫反应(例如增强或激活反应)的治疗剂和影响(例如抑制或杀伤)肿瘤/癌细胞的治疗剂。
在本文所描述的方法的一些实施方案中，抗NTPDase3抗体与至少一种额外治疗剂的组合引起加成或协同结果。在一些实施方案中，组合疗法使得抗NTPDase3抗体的治疗指数提高。在一些实施方案中，组合疗法使得额外治疗剂的治疗指数提高。在一些实施方案中，组合疗法使得抗NTPDase3抗体的毒性和/或副作用降低。在一些实施方案中，组合疗法使得额外治疗剂的毒性和/或副作用降低。
适用类别的治疗剂包括例如抗微管蛋白剂、奥瑞他汀(auristatins)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如铂复合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂复合物和卡铂)、蒽环霉素、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、多卡霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、莱克希托普森(lexitropsin)、亚硝基脲、顺氯氨铂(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、辐射敏化剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在某些实施方案中，第二治疗剂是烷基化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可与本文所描述的抗NTPDase3抗体组合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方案中，方法或治疗涉及施用抗NTPDase3抗体与化学治疗剂的组合或与化学治疗剂的混合液的组合。用抗NTPDase3抗体进行的治疗可在施用化学疗法之前、同时或之后进行。组合施用可包括以单一药物制剂或使用单独制剂共施用，或以任一次序但通常在一段时间内连续施用以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。此类化学治疗剂的制备和给药时程可根据制造商说明书使用或由本领域技术人员根据经验来确定。此类化学疗法的制剂和给药时程也描述于The Chemotherapy Source Book,第4版增刊,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa中。
适用于根据本发明内所涵盖的实施方案的化学治疗剂包括但不限于：烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯唑多巴、卡波醌、米特多巴和尤利多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷诺莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-侧氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、埃达霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；艾福米辛(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿拉伯糖苷(Ara-C)；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE)；苯丁酸氯芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨(XELODA)；以及以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂也包括用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷诺昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；和抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，额外治疗剂是顺铂。在某些实施方案中，额外治疗剂是卡铂。
在本文所描述的方法的某些实施方案中，化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的作用的化学疗法剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸道诺霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸拓扑替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康(irinotecan)以及这些中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些实施方案中，化学治疗剂是抗代谢物。抗代谢物是具有与正常生物化学反应所需的代谢物类似的结构，但不同足以干扰细胞的一种或多种正常功能，例如细胞分裂的化学物质。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨(cladribine)以及这些中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在本文所描述的方法的某些实施方案中，化学治疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的药剂。在一些实施方案中，药剂是紫杉烷。在某些实施方案中，药剂是紫杉醇或多西他赛或紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，药剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、白蛋白结合型紫杉醇(nab-紫杉醇；ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方案中，抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶的抑制剂，例如奥洛拉(Aurora)A或Plk1。
在本文所描述的方法的某些实施方案中，预期主题抗NTPDase3抗体将与诱导ATP在肿瘤中释放和/或引起NTPDase3或CD73瘤内上调的那些化学治疗剂具有更大组合作用(可能甚至协同作用)。存在多种化学治疗剂，其导致ATP在其诱导肿瘤细胞死亡时释放至胞外空间中，例如(但不限于)蒽环霉素(例如多柔比星、道诺霉素、表柔比星和埃达霉素)、基于铂的药物(例如顺铂、卡铂和奥沙利铂)和蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib))。放射疗法和光动力疗法(PDT)也可引起ATP释放和/或上调NTPDase3、CD73和/或CD39的瘤内水平。
在本文所描述的方法的一些实施方案中，额外治疗剂包含例如小分子的药剂。例如，治疗可涉及组合施用抗NTPDase3抗体与充当针对肿瘤相关抗原(包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)和/或VEGF)的抑制剂的小分子。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体与选自由以下组成的组的蛋白激酶抑制剂组合施用：吉非替尼(gefitinib)(IRESSA)、埃罗替尼(TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib)(RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)和帕唑帕尼(pazopanib)(GW786034B)。在一些实施方案中，额外治疗剂包含mTOR抑制剂。
在本文所描述的方法的某些实施方案中，额外治疗剂是抑制癌症干细胞通路的小分子。在一些实施方案中，额外治疗剂是Notch通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是Wnt通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是BMP通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是Hippo通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是mTOR/AKR通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是RSPO/LGR通路的抑制剂。
在本文所描述的方法的一些实施方案中，额外治疗剂包含生物学分子，例如抗体。例如，治疗可涉及组合施用抗NTPDase3抗体与针对肿瘤相关抗原的抗体，包括但不限于结合EGFR、HER2/ErbB2和/或VEGF的抗体。在某些实施方案中，额外治疗剂是对癌症干细胞标志物具有特异性的抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂是结合Not ch通路的组分的抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂是结合Wnt通路的组分的抗体。在某些实施方案中，额外治疗剂是抑制癌症干细胞通路的抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂是Notch通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是Wnt通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是BMP通路的抑制剂。在一些实施方案中，额外治疗剂是抑制β-连环蛋白信号传导的抗体。在某些实施方案中，额外治疗剂是作为血管生成抑制剂的抗体(例如抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方案中，额外治疗剂是贝伐单抗(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARG)、帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁姆单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(cetuximab)(ERBITUX)。
I/O组合-代表性检查点抑制剂和共刺激激动剂
在本文所描述的方法的一些实施方案中，额外治疗剂是调节免疫反应的抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体和抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体或抗Siglec-15抗体。
例如，疗法还可包括施用免疫检查点分子的抑制剂或共刺激分子的活化剂，或其组合。免疫检查点的示例性抑制剂包括以下中的一者或多者的抑制剂：PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、NLRP1、NRLP3、STING、TGFβ或Siglec-15。共刺激分子的示例性活化剂包括以下中的一者或多者的激动剂：OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配体。免疫检查点的示例性抑制剂和共刺激分子的示例性活化剂可见于PCT公开WO 2016/054555中，所述公开通过引用并入本文。
PD-1拮抗剂
PD-1基因是作为Ig基因超家族的一部分的55kDa I型跨膜蛋白(Agata等人(1996)Int Immunol 8:765-72)。PD-1含有膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和基于膜末端酪氨酸的转换基序(ITSM)(Thomas,M.L.(1995)J Exp Med 181:1953-6；Vivier,E和Daeron,M(1997)Immunol Today 18:286-91)。已鉴定PD-1的两种配体，PD-L1和PD-L2，其已显示在与PD-1结合后即下调T细胞活化(Freeman等人(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人(2001)Nat Immunol2:261-8；Carter等人(2002)Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1和PD-L2都是结合至PD-1，但不结合至其他CD28家族成员的B7同源物。PD-L1在多种人类癌症中丰富(Dong等人(2002)Nat.Med.8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用引起肿瘤浸润淋巴细胞的减少、T细胞受体介导的增殖和通过癌细胞进行的免疫逃避的减少(Dong等人(2003)J.Mol.Med.81:281-7；Blank等人(2005)CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用逆转免疫抑制，并且当也阻断PD-1与PD-L2的相互作用时，所述效应是加性的(Iwai等人(2002)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA99:12293-7；Brown等人(2003)J.Immunol.170:1257-66)。
如本文所用，术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用并且包括人类PD-1的变体、同功型、物种同源物和具有至少一个与人类PD-1共同的表位的类似物。完整人类PD-1序列可见于GenBank登录号U64863。
如本文所用，术语“程序性细胞死亡1配体1”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCD1L1”、“PDCD1LG1”、“CD274”、“B7同源物1”、“B7-H1”、“B7-H”和“B7H1”可互换使用并且包括人类PDL-1的变体、同功型、物种同源物和具有至少一个与人类PDL-1共同的表位的类似物。完整人类PD-L1氨基酸序列(同功型a前体)可见于Genbank登录号NP_054862.1。完整人类PD-L1氨基酸序列(同功型b前体)可见于GenBank登录号NP_001254635.1.Fencode。术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指抑制PD-1轴结合伴侣与其结合伴侣中的一者或多者的相互作用的分子，以便去除由PD-1信号传导轴上的信号传导产生的T细胞功能障碍，其结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。如本文所使用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其结合伴侣中的一者或多者(例如PD-L1、PD-L2)的相互相用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其结合伴侣的结合的分子。在一个特定方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用产生的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂减少通过或经由表达于经由PD-1的信号传导介导的T淋巴细胞上的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，使得功能异常T细胞不太异常(例如增强对抗原识别的效应反应)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所描述的MDX-1106。在另一个特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所描述的Merck 3745。在另一个特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所描述的CT-011。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合伴侣中的一者或多者(例如PD-1、B7-1)的相互相用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合伴侣的结合的分子。在一个特定方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合伴侣中的一者或多者(例如PD-1、B7-1)的相互相用引起的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂减少通过或经由表达于经由PD-L1的信号传导介导的T淋巴细胞上的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，使得功能异常T细胞不太异常(例如增强对抗原识别的效应反应)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个特定方面，抗PD-L1抗体是本文所描述的YW243.55.S70。在另一个特定方面，抗PD-L1抗体是本文描述的MDX-1105。在另一个特定方面，抗PD-L1抗体是本文所描述的MPDL3280A。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合伴侣中的一者或多者(例如PD-1)的相互相用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合伴侣的结合的分子。在一特定方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合伴侣中的任一者或多者(例如PD-1)的相互相用引起的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂减少通过或经由表达于经由PD-L2的信号传导介导的T淋巴细胞上的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号，使得功能异常T细胞不太异常(例如增强对抗原识别的效应反应)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
PD-1通路：PD-1通路的成员是与PD-1信号传导相关的所有蛋白质。一方面，这些可为诱导PD-1上游的PD-1信号传导的蛋白质，例如PD-1的配体PD-L1和PD-L2和信号转导受体PD-1。另一方面，这些可为PD-1受体下游的信号转导蛋白质。在本发明涵盖的情形下的PD-1通路的成员尤其优选地为PD-1、PD-L1和PD-L2。
PD-1通路抑制剂：在本发明涵盖的情形下，PD-1通路抑制剂优选地在本文中定义为能够削弱PD-1通路信号传导、优选地由PD-1受体介导的信号传导的化合物。因此，PD-1通路抑制剂可为针对能够拮抗PD-1通路信号传导的PD-1通路的任何成员的任何抑制剂。在此情形下，抑制剂可为如本文所定义的拮抗抗体，其靶向PD-1通路的任何成员，优选地针对PD-1受体、PD-L1或PD-L2。这种拮抗抗体也可由核酸编码。此类经编码的抗体也称为如本文所定义的“胞内抗体”。另外，PD-1通路抑制剂可为阻断PD1配体的活性的PD-1受体或PD1受体的片段。B7-1或其片段也可充当PD1抑制配体。此外，PD-1通路抑制剂可为针对PD-1通路的成员，优选地PD-1、PD-L1或PD-L2的siRNA(小干扰RNA)或反义RNA。另外，PD-1通路抑制剂可为蛋白质，其包含能够结合于PD-1但例如通过抑制PD-1和B7-H1或B7-DL相互作用来阻止PD-1信号传导的氨基酸序列(或编码其的核酸)。另外，PD-1通路抑制剂可为能够抑制PD-1通路信号传导的小分子抑制剂，例如PD-1结合肽或小有机分子。
在某些实施方案中，本发明涵盖的PD-1拮抗剂包括在不参与经由PD-1受体的信号转导的情况下结合于PD-1的配体并干扰、减少或抑制一种或多种配体与PD-1受体的结合或直接结合于PD-1受体的药剂。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂直接结合于PD-1并阻断PD-1抑制信号转导。在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂结合于PD-1的一种或多种配体(例如PD-L1和PD-L2)并减少或抑制配体经由PD-1触发抑制信号转导。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂直接结合于PD-L1，抑制或阻止PD-L1结合于PD-1，由此阻断PD-1抑制信号转导。
本发明涵盖的方法和组合物中使用的PD-1拮抗剂包括PD-1结合支架蛋白并且包括但不限于PD配体、抗体和多价药剂。在一个特定实施方案中，拮抗剂是融合蛋白，例如AMP-224。在另一个实施方案中，拮抗剂是抗PD-1抗体(“PD-1抗体”)。适用于本发明的抗人类PD-1抗体(或自其衍生的VH和/或VL域)可使用本领域中众所周知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗PD-1抗体。例如，可使用抗体MK-3475或CT-011。另外，可使用WO 2006/121168中所描述的单克隆抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4，其教导内容特此通过引用并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中的任一者竞争结合于PD-1的抗体。
在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-L1抗体。适用于本发明的抗人类PD-L1抗体(或自其衍生的VH和/或VL域)可使用本领域中众所周知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗PD-L1抗体。例如，可使用MEDI4736(也称为抗B7-H1)或MPDL3280A(也称为RG7446)。另外，可使用WO 2007/005874和美国专利第7,943,743号中所描述的单克隆抗体12A4、3G10、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4，所述文献的教导内容特此通过引用并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中的任一者竞争结合于PD-L1的抗体。
示例性抗PD-L1抗体是12A4(WO 2007/005874和美国专利第7,943,743号)。
抗PD-1或抗PD-L1抗体可分别以10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M或更小的KD结合于PD-1或PD-L1。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是选自纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)或匹地利珠单抗(Pidilizumab)的抗PD-1抗体。优选的PD-1抑制剂是纳武单抗。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的替代性名称包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗是完全人类IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PDl。纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合于PDl的其他人类单克隆抗体公开于US 8,008,449(通过引用并入)和WO 2006/121168(通过引用并入)。在其他实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(商标名
Figure BDA0004113291790001721
先前为拉立珠单抗(Lambrolizumab)，也称为Merck 3745、MK-3475或SCH-900475)是结合于PD1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗公开于例如Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134-44，WO 2009/114335(通过引用并入)和US 8,354,509(通过引用并入)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是匹地利珠单抗。匹地利珠单抗(CT-011；CureTech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体公开于WO2009/101611中。其他抗PD1抗体公开于US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中。其他抗PDl抗体包括AMP 514(Amplimmune)。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是与恒定区{例如免疫球蛋白序列的Fc区)融合的免疫粘附素{例如包含PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抑制剂是YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是MDX-1105。MDX-1105(也称为BMS-936559)是WO2007/005874中所描述的抗PD-Ll抗体。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体是WO 2010/077634中所描述的抗PD-Ll(通过引用并入)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是MDPL3280A(Genentech/Roche)。MDPL3280A是人类Fc优化IgG1单克隆抗体，其结合于PD-L1。MDPL3280A和PD-L1的其他人类单克隆抗体公开于美国专利第7,943,743号(通过引用并入)和美国公开第2012/0039906号(通过引用并入)。在其他实施方案中，PD-L2抑制剂是AMP-224。AMP-224是阻断PD1与B7-H1(B7-DCIg；Amplimmune；例如公开于WO 2010/027827(通过引用并入)和WO 2011/066342(通过引用并入))之间的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
在某些实施方案中，PD-1通路抑制剂是PD-1通路信号传导的小分子拮抗剂。此类小分子拮抗剂包括结合于PD-1、PD-1L和/或PD-1L2中的一者或多者并抑制PD-1与PD-1L1和/或PD-1L2的相互作用的那些药剂。
PD-1通路信号传导的示例性小分子拮抗剂可尤其见于公开的美国申请2014/0294898和2014/0199334以及公开的PCT申请WO 2013/132317和WO 2012/168944中，所述申请中的每一者通过引用并入本文。
仅为了说明，主题组合疗法可使用选自由以下组成的组的小分子拮抗剂来实践：
Figure BDA0004113291790001741
在其他实施方案中，小分子拮抗剂以如下通式表示
Figure BDA0004113291790001742
其中，
R1是Ser的游离C端或酰胺化C端；
L是选自-NH(CH2)nNH-或-NH(CH2CH2O)nNH-的接头；
R4选自氢、氨基(C1-C20)烷基、-NHCOCH3或-NHCONH2；
或其逆类似物或药学上可接受的立体异构体或药学上可接受的盐。
在其他实施方案中，小分子拮抗剂以如下通式表示
Figure BDA0004113291790001751
其中，
R1是Ser的N端；或被Ser的羟基或氨基取代的(C1-C20)酰基；
L是选自以下的接头：—NH(CH2)nNH—、—NH(CH2)nCH(NH2)CO—、—OOC(CH2)mCOO—、—NH(CH2)nCO—、—NH(CH2CH2O)nNH—、—NH(CH2CH2O)nCO—或—CO(CH2CH2O)nCO—；
R2是Am2的游离C端、酰胺化C端或N端；或Y-R5；
Y是选自以下的任选的接头：—OOC(CH2)mCOO—、—CO(CH2)nNH—、—CO(CH2CH2O)nNH—或—COCH2(OCH2CH2)nNH—；
R5是白蛋白结合部分，例如马来酰亚胺基丙酸；
R3是OH或NH2；
R4是Phe的苯基上的取代基并且选自氢、氨基(C1-C20)烷基、-NHCOCH3或-NHCONH2；
n是具有选自2至10的值(包括两端)的整数；
m是具有选自0至8的值(包括两端)的整数；并且
Ser-Asn、Asn-Thr或Thr-Ser的肽键(-CONH-)中的一者可经以下的经修饰的肽键置换：
Figure BDA0004113291790001752
其中Q是氢、-CO(C1-C20)烷基或-COO(C1-C20)烷基；其中一个或多个或所有氨基酸可呈D构型；
或其逆类似物或药学上可接受的立体异构体或药学上可接受的盐。
例如，小分子拮抗剂可选自由以下组成的组：
Figure BDA0004113291790001761
Figure BDA0004113291790001771
Figure BDA0004113291790001781
Figure BDA0004113291790001791
Figure BDA0004113291790001801
Figure BDA0004113291790001811
Figure BDA0004113291790001821
CTLA-4拮抗剂
在某些实施方案中，本文所描述的组合也包括CTLA-4抑制剂。示例性抗CTLA-4抗体包括曲美单抗(Tremelimumab)(IgG2单克隆抗体，购自Pfizer，先前称为替西单抗(ticilimumab)，CP-675,206)；和伊匹单抗(CTLA-4抗体，也称为MDX-010，CAS号477202-00-9)。
关于用于本文所提供的方法的曲美单抗(或其抗原结合片段)的信息可见于US 6,682,736(通过引用并入)(其中其被称为11.2.1)，其公开内容通过引用整体并入本文。曲美单抗(也称为CP-675,206、CP-675、CP-675206和替西单抗)是人类IgG2单克隆抗体，其对CTLA-4具高度选择性并阻断CTLA-4与CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的结合。其已显示在体外引起免疫活化，并且一些用曲美单抗治疗的患者已显示肿瘤消退。
用于本文所提供的方法的曲美单抗包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于本文所提供的方法的曲美单抗或其抗原结合片段包含有包含上文所示的氨基酸序列的轻链可变区和包含上文所示的氨基酸序列的重链可变区。在一个特定方面，用于本文所提供的方法的曲美单抗或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含上文所示的Kabat定义的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述轻链可变区包含上文所示的Kabat定义的CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域普通技术人员应能容易地鉴定Chothia定义、Abm定义的CDR定义或本领域普通技术人员已知的其他CDR定义。在一个特定方面，用于本文所提供的方法的曲美单抗或其抗原结合片段包含如US 6,682,736中所公开的抗体的可变重链和可变轻链CDR序列，所述文献通过引用整体并入本文。
本发明还涵盖利用CTLA-4的小分子抑制剂，例如由Huxley等人2004CellChemical Biology 11:1651-1658所描述，所述CTLA-4的小分子抑制剂包括下式的化合物：
Figure BDA0004113291790001831
Figure BDA0004113291790001832
其他小分子CTLA-4拮抗剂包括
Figure BDA0004113291790001841
在一个实施方案中，组合包括免疫-DASH抑制剂、抗PD-1抗体分子(例如如本文所描述)和抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)。可使用的示例性剂量包括约1mg/kg至10mg/kg、例如3mg/kg的抗PD-1抗体分子的剂量，和约3mg/kg的抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)的剂量。
其他示例性抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利第5,811,097号中。
在本文所描述的方法的一些实施方案中，额外治疗剂是调节免疫反应的抗体。在一些实施方案中，额外治疗剂是抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体或抗Siglec-15抗体。
在一些实施方案中，LAG3抗体是IMP701、IMP731、BMS-986016、LAG525和GSK2831781。在一些实施方案中，LAG3拮抗剂包括可溶性LAG3受体，例如IMP321。
在一些实施方案中，免疫反应刺激剂选自由以下组成的组：CD28激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD27激动剂、CD80激动剂、CD86激动剂、CD40激动剂和GITR激动剂。在一些实施方案中，OX40激动剂包括OX40配体或其OX40结合部分。例如，OX40激动剂可为MEDI6383。在一些实施方案中，OX40激动剂是特异性结合OX40的抗体。在一些实施方案中，结合OX40的抗体是MEDI6469、MEDI0562或MOXR0916(RG7888)。在一些实施方案中，OX40激动剂是能够表达OX40配体的载体(例如表达载体或病毒，例如腺病毒)。在一些实施方案中，表达OX40的载体是δ-24-RGDOX或DNX2401。
在一些实施方案中，4-1BB(CD137)激动剂是结合分子，例如抗运载蛋白。在一些实施方案中，抗运载蛋白是PRS-343。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是特异性结合4-1BB的抗体。在一些实施方案中，结合4-1BB的抗体是PF-2566(PF-05082566)或乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)。
在一些实施方案中，CD27激动剂是特异性结合CD27的抗体。在一些实施方案中，结合CD27的抗体是瓦里木单抗(varlilumab)(CDX-1127)。
在一些实施方案中，GITR激动剂包含GITR配体或其GITR结合部分。在一些实施方案中，GITR激动剂是特异性结合GITR的抗体。在一些实施方案中，结合GITR的抗体是TRX518、MK-4166或INBRX-110。
在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体与STING激动剂组合，优选地作为药物组合物的一部分。环状二核苷酸(CDN)环状二-AMP(由单核细胞增多性李氏菌(Listeriamonocytogenes)和其他细菌产生)以及其类似物环状二-GMP和环状GMP-AMP由宿主细胞识别为病原体相关分子模式(PAMP)，其结合于称为干扰素基因刺激剂(STING)的病原体识别受体(PRR)。STING是宿主哺乳动物细胞的细胞质中的转接蛋白，其激活TANK结合激酶(TBK1)-IRF3和NF-κB信号传导轴，引起IFN-β和其他强烈激活先天性免疫性的基因产物的诱导。现在公认STING是宿主胞浆监督通路的组分(Vance等人,2009)，宿主胞浆监督通路感测细胞内病原体的感染并且作为响应而诱导IFN-β的产生，引起由抗原特异性CD4+和CD8+T细胞以及病原体特异性抗体组成的适应性保护性病原体特异性免疫反应的产生。美国专利第7,709,458号和第7,592,326号；PCT公开第WO2007/054279号、第WO2014/093936号、第WO2014/179335号、第WO2014/189805号、第WO2015/185565号、第WO2016/096174号、第WO2016/145102号、第WO2017/027645号、第WO2017/027646号和第WO2017/075477号；以及Yan等人,Bioorg.Med.Chem Lett.18:5631-4,2008。
示例性组合
在一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与抗肿瘤铂配位复合物的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、脑癌和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于顺铂、奥沙利铂、卡铂、四硝酸三铂(BBR3464)、沙铂(satraplatin)、四铂、奥米铂(ormiplatin)、异丙铂(iproplatin)、奈达铂(nedaplatin)和洛铂(lobaplatin)。特别优选的是抗NTPDase3抗体与顺铂、奥沙利铂、卡铂、四硝酸三铂、沙铂、四铂、奥米铂、异丙铂、奈达铂和洛铂的组合，并且甚至更优选的是与顺铂和奥沙利铂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与抗代谢物的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、食道癌、脑癌、肛门癌、白血病和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞(raltitrexed)、克拉屈滨、氯法拉滨(clofarabine)、巯基嘌呤、喷司他丁和硫代鸟嘌呤。特别优选的是抗NTPDase3抗体与5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷、卡培他滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、克拉屈滨、氯法拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁和硫代鸟嘌呤的组合，并且甚至更优选的是与5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷和甲氨蝶呤的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与有丝分裂抑制剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞宾。特别优选的是抗NTPDase3抗体与紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞宾的组合，并且甚至更优选的是与紫杉醇、多西他赛、长春新碱和长春瑞宾的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与抗癌抗生素的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗以下：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、神经母细胞瘤、脑癌、肛门癌、睾丸癌、白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于道诺霉素、多柔比星、表柔比星、埃达霉素、米托蒽醌、匹蒽醌(pixantrone)、戊柔比星(valrubicin)、丝裂霉素C、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素A和光神霉素(mithramycin)。特别优选的是抗NTPDase3抗体与道诺霉素、多柔比星、表柔比星、埃达霉素、米托蒽醌、匹蒽醌、戊柔比星、丝裂霉素C、博莱霉素、放线菌素D和光神霉素的组合，并且甚至更优选的是与道诺霉素、多柔比星、丝裂霉素C和放线菌素D的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗以下：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与拓扑异构酶I和/或II抑制剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗以下：肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、神经母细胞瘤、脑癌、宫颈癌、睾丸癌、白血病和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于拓扑替康、SN-38、伊立替康、喜树碱、卢比替康(rubitecan)、依托泊苷、安吖啶和替尼泊苷。特别优选的是PM00104或其药学上可接受的盐与拓扑替康、SN-38、伊立替康、喜树碱、卢比替康、依托泊苷、安吖啶和替尼泊苷的组合，并且甚至更优选的是与拓扑替康、伊立替康和依托泊苷的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与蛋白酶体抑制剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、脑癌、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于硼替佐米、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)和盐孢菌酰胺A。特别优选的是抗NTPDase3抗体与硼替佐米、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯和盐孢菌酰胺A的组合，并且甚至更优选的是与硼替佐米的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌和脑癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、脑癌和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于罗米地辛(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、伏立诺他(vorinostat)、莫替司他(mocetinostat)、贝利司他(belinostat)、恩替司他(entinostat)、雷米诺他(resminostat)、PCI-24781、AR-42、CUDC-101和丙戊酸。特别优选的是抗NTPDase3抗体与罗米地辛、帕比司他、伏立诺他、莫替司他、贝利司他、恩替司他、雷米诺他、PCI-24781、AR-42、CUDC-101和丙戊酸的组合，并且甚至更优选的是与伏立诺他的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与氮芥烷基化剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、肉瘤、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于美法仑、异环磷酰胺、苯丁酸氯芥、环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀和苯达莫司汀(bendamustine)。特别优选的是抗NTPDase3抗体与美法仑、异环磷酰胺、苯丁酸氯芥、环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀、雌莫司汀和苯达莫司汀的组合，并且甚至更优选的是与环磷酰胺的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、肉瘤、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌和肾癌。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与亚硝基脲烷基化剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于洛莫司汀、司莫司汀(semustine)、卡莫司汀、福莫司汀和链脲佐菌素。特别优选的是抗NTPDase3抗体与洛莫司汀、司莫司汀、卡莫司汀、福莫司汀和链脲佐菌素的组合，并且甚至更优选的是与卡莫司汀的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、卵巢癌和乳腺癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与非经典烷基化剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、脑癌、白血病和淋巴瘤。这种化学治疗剂组包括但不限于丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺(temozolomide)和六甲蜜胺(altretamine)。特别优选的是抗NTPDase3抗体与丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺和六甲蜜胺的组合，并且甚至更优选的是与达卡巴嗪和替莫唑胺的组合用于治疗肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与雌激素拮抗剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗乳腺癌。这种化学治疗剂组包括但不限于托瑞米芬、氟维司群、他莫昔芬和萘氧啶(nafoxidine)。特别优选的是抗NTPDase3抗体与托瑞米芬、氟维司群、他莫昔芬和萘氧啶的组合，并且甚至更优选的是与他莫昔芬的组合用于治疗乳腺癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与雄激素拮抗剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗前列腺癌。这种化学治疗剂组包括但不限于比卡鲁胺、氟他胺、MDV3100和尼鲁米特。特别优选的是抗NTPDase3抗体与比卡鲁胺、氟他胺、MDV3100和尼鲁米特的组合，并且甚至更优选的是与氟他胺的组合用于治疗前列腺癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与mTOR抑制剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。这种化学治疗剂组包括但不限于西罗莫司(sirolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、KU-0063794和WYE-354。特别优选的是抗NTPDase3抗体与西罗莫司、替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司、KU-0063794和WYE-354的组合，并且甚至更优选的是与替西罗莫司的组合用于治疗肺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌和脑癌。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及抗NTPDase3抗体与酪氨酸激酶抑制剂的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。这种化学治疗剂组包括但不限于埃罗替尼、索拉非尼、阿西替尼(axitinib)、伯舒替尼(bosutinib)、西地尼布、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、吉非替尼、伊马替尼、卡奈替尼(canertinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来他替尼(lestaurtinib)、来那替尼(neratinib)、尼罗替尼(nilotinib)、司马沙尼(semaxanib)、舒尼替尼、瓦他拉尼(vatalanib)和凡德他尼。特别优选的是抗NTPDase3抗体与埃罗替尼、索拉非尼、阿西替尼、伯舒替尼、西地尼布、克唑替尼、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、卡奈替尼、拉帕替尼、来他替尼、来那替尼、尼罗替尼、司马沙尼、舒尼替尼、瓦他拉尼和凡德他尼的组合，并且甚至更优选的是与埃罗替尼的组合用于治疗癌症，并且更特别是用于治疗选自以下的癌症：肺癌、肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌和脑癌。
本发明涵盖的另一方面涉及前述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用MAP激酶通路抑制剂或WNT通路抑制剂。
在一些实施方案中，MAP激酶通路抑制剂选自由以下组成的组：BRAF抑制剂、MEK抑制剂、PI3K抑制剂和c-KIT抑制剂。
在一些实施方案中，BRAF抑制剂选自由以下组成的组：GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)、达拉非尼(dabrafenib)和LGX818。
在一些实施方案中，MEK抑制剂选自由以下组成的组：GSK1120212、司美替尼(selumetinib)和MEK162。
在一些实施方案中，WNT通路抑制剂是β-连环蛋白抑制剂或卷曲蛋白抑制剂。
在一些实施方案中，β-连环蛋白抑制剂选自由以下组成的组：氯硝柳胺、XAV-939、FH 535和ICG 001。
本发明涵盖的另一方面涉及前述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用癌症疫苗。在一些实施方案中，癌症疫苗是树突状细胞疫苗。
本发明涵盖的另一方面涉及前述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用过继性细胞转移。
在一些实施方案中，过继性细胞转移是CAR-T细胞疗法。
本发明涵盖的另一方面涉及前述方法中的任一者，所述方法还包括向患者施用抗体疗法。
本发明涵盖的另一方面涉及前述方法中的任一者，其中施用抗NTPDase3抗体增强抗体疗法的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
在一些实施方案中，抗体疗法选自由以下组成的组：曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗(rituximab)。
此外，用抗NTPDase3抗体治疗可包括用其他生物分子，例如一种或多种细胞因子(例如淋巴因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)进行组合治疗或者可伴有肿瘤的手术去除、癌细胞去除或主治医师认为必需的任何其他疗法。在一些实施方案中，额外治疗剂是免疫反应刺激剂。
在本文所描述的方法的一些实施方案中，抗NTPDase3抗体可与选自由以下组成的组的生长因子组合：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、红细胞生成素(EPO)、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、NGF、神经营养素、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、P1GF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。
在本文所描述的方法的一些实施方案中，额外治疗剂是免疫反应刺激剂。在一些实施方案中，免疫反应刺激剂选自由以下组成的组：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素1(IL-1)或白细胞介素2(IL-2)。
施用时程
在本文所描述的方法的某些实施方案中，治疗涉及施用抗NTPDase3抗体与放射疗法的组合。用抗NTPDase3抗体进行的治疗可在施用放射疗法之前、同时或之后进行。此类放射疗法的给药时程可通过熟练医学专业人员确定。
在本文所描述的方法的某些实施方案中，治疗涉及施用抗NTPDase3抗体与抗病毒疗法的组合。用抗NTPDase3抗体进行的治疗可在施用抗病毒疗法之前、同时或之后进行。组合疗法中使用的抗病毒药物将取决于受试者感染的病毒。
组合施用可包括以单一药物制剂或使用单独制剂共施用，或以任一次序但通常在一段时间内连续施用以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。
应了解，抗NTPDase3抗体与至少一种额外治疗剂的组合可以任何次序或同时施用。在一些实施方案中，将向先前已经受第二治疗剂治疗的患者施用抗NTPDase3抗体。在某些其他实施方案中，抗NTPDase3抗体和第二治疗剂将基本上同时或并行施用。例如，可向受试者给与抗NTPDase3抗体，同时经受用第二治疗剂(例如化学疗法)进行的治疗过程。在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体将在用第二治疗剂进行治疗的1年内施用。在某些替代实施方案中，抗NTPDase3抗体将在用第二治疗剂进行的任何治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在某些其他实施方案中，抗NTPDase3抗体将在用第二治疗剂进行任何治疗的4、3、2或1周内施用。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体将在用第二治疗剂进行任何治疗的5、4、3、2或1天内施用。应进一步了解，两种(或更多种)药剂或治疗可在数小时或数分钟内(即，基本上同时)向受试者施用。
为了治疗疾病，适当剂量的抗NTPDase3抗体取决于以下：待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性、抗NTPDase3抗体是否出于治疗性或预防性目的施用、先前疗法、患者的临床病史等，所有均由治疗医师酌情处理。抗NTPDase3抗体可一次性施用或在持续数天至数月的一系列治疗期间施用，或直至实现治愈或实现疾病状况的减弱(例如肿瘤尺寸减小)。最佳给药时程可由患者体内药物积聚的测量结果来计算，并且将根据个别药剂的相关效力而变化。施用医师可确定最佳剂量、给药方法和重复率。在某些实施方案中，剂量为每kg体重0.01μg至100mg、每kg体重0.1μg至100mg、每kg体重1μg至100mg、每kg体重1mg至100mg、每kg体重1mg至80mg、每kg体重10mg至100mg、每kg体重10mg至75mg或每kg体重10mg至50mg。在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约0.1mg至约20mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约0.1mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约0.25mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约0.5mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约1mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约1.5mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约2mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约2.5mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约5mg。在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约7.5mg。
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约10mg。
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约12.5mg。
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体的剂量为每kg体重约15mg。
在某些实施方案中，剂量可每天、每周、每月或每年给予一次或多次。
在某些实施方案中，每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次给与抗NTPDase3抗体。
在一些实施方案中，抗NTPDase3抗体可以初始较高“负载”剂量，接着是一种或多种较低剂量施用。在一些实施方案中，也可改变施用频率。在一些实施方案中，给药方案可包括一周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用初始剂量，接着是额外剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可包括施用初始负载剂量，接着是例如二分之一初始剂量的每周维持剂量。或者给药方案可包括施用初始负载剂量，接着是例如每隔一周二分之一初始剂量的维持剂量。或者给药方案可包括施用三个初始剂量持续3周，接着是例如每隔一周相同量的维持剂量。
如本领域技术人员已知，施用任何治疗剂都可引起副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性过于严重以致排除以治疗有效剂量施用特定药剂。在一些情况下，药物疗法必须中断，并且可尝试其他药剂。然而，相同治疗类别中的许多药剂通常显示类似副作用和/或毒性，意指患者必须停止疗法，或者如果有可能，则遭受与治疗剂相关联的不适副作用。
在一些实施方案中，给药时程可限于特定数目的施用或“周期”。在一些实施方案中，施用抗NTPDase3抗体持续3、4、5、6、7、8或更多个周期。例如，每2周施用抗NTPDase3抗体持续6个周期，每3周施用抗NTPDase3抗体持续6个周期，每2周施用抗NTPDase3抗体持续4个周期，每3周施用抗NTPDase3抗体持续4个周期等。给药时程可由本领域技术人员决定并且随后修改。
因此，本发明提供了向受试者施用本文所描述的抗NTPDase3抗体的方法，所述方法包括使用间歇性给药策略施用一种或多种药剂，其可减少与施用抗NTPDase3抗体、化学治疗剂等相关的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者中的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的抗NTPDase3抗体与治疗有效剂量的化学治疗剂的组合，其中药剂中的一者或两者根据间歇性给药策略施用。在一些实施方案中，间歇性给药策略包括向受试者施用初始剂量的抗NTPDase3抗体，以及约每2周一次施用后续剂量的抗NTPDase3抗体。在一些实施方案中，间歇性给药策略包括向受试者施用初始剂量的抗NTPDase3抗体，以及约每3周一次施用后续剂量的抗NTPDase3抗体。在一些实施方案中，间歇性给药策略包括向受试者施用初始剂量的抗NTPDase3抗体，以及约每4周一次施用后续剂量的抗NTPDase3抗体。在一些实施方案中，使用间歇性给药策略施用抗NTPDase3抗体并且每周施用化学治疗剂一次。
抗感染治疗组合
在一个实施方案中，本发明提供了使用抗NTPDase3抗体治疗受试者的方法，其中受试者患有病毒感染。在一个实施方案中，病毒感染是感染选自由以下组成的组的病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒。
在一个实施方案中，本发明提供了使用抗NTPDase3抗体治疗受试者的方法，其中受试者患有细菌感染。在一个实施方案中，细菌感染是感染选自由以下组成的组的细菌：披衣菌(Chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷菌属(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌属(Legionella)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙门氏菌(Salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、炭疽杆菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)和包柔体属(Borriella)。
在一个实施方案中，本发明提供了使用抗NTPDase3抗体治疗受试者的方法，其中受试者患有真菌感染。在一个实施方案中，真菌感染是感染选自由以下组成的组的真菌：念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albican)、克鲁斯念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲菌属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌属(Genus Mucorales)(白霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉菌属(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
在一个实施方案中，本发明提供了使用抗NTPDase3抗体治疗受试者的方法，其中受试者患有寄生虫感染。在一个实施方案中，寄生虫感染是感染选自由以下组成的组的寄生虫：溶组织内阿米巴(Enta moeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、福勒氏耐格里原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba)、兰比亚梨形鞭毛虫(Giardia lambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium)、肺炎肺囊虫(Pn eumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴倍虫(Ba besia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanoso ma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、刚地弓形虫(Tox oplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。
VII.抗NTPDase3抗体缀合物
本文所公开的抗NTPDase3抗体也可与化学部分缀合。化学部分可尤其是聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。
例如，本发明提供了与治疗部分(即药物)缀合的抗NTPDase3抗体。治疗部分可为例如细胞毒素、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激剂、裂解肽或放射性同位素。此类缀合物在本文中称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”。因此，在一个方面，根据任何上述方面或实施方案的抗NTPDase3抗体与治疗部分缀合。示例性治疗部分包括细胞毒性部分、放射性同位素、细胞因子和裂解肽。
在某些实施方案中，抗NTPDase3抗体能够通过使缀合于细胞毒性部分或与细胞毒性部分相关的抗体内化来诱导在表达NTPDase3的细胞中的细胞毒性。细胞毒性部分可例如选自由以下组成的组：紫杉醇；细胞迟缓素B；短杆菌素D；溴化乙锭；吐根素；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷(tenoposide)；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；多柔比星；道诺霉素；二羟基炭疽菌素二酮；微管蛋白抑制剂如美登素或其类似物或衍生物；抗有丝分裂剂如单甲基奥瑞他汀E或F或其类似物或衍生物；海兔毒素(dolastatin)10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光神霉素；放线菌素D；1-去氢睾固酮；糖皮质激素；普鲁卡因(procaine)；四卡因；利多卡因；普萘洛尔(propranolol)；嘌呤霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢物如甲氨蝶呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、达卡巴嗪、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨；烷基化剂如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C；铂衍生物如顺铂或卡铂；多卡霉素A、多卡霉素SA、拉奇霉素(rachelmycin)(CC-1065)或其类似物或衍生物；抗生素如放线菌素、博莱霉素、道诺霉素、多柔比星、埃达霉素、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素(plicamycin)、安曲霉素(anthramycin)(AMC))；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(PDB)；白喉毒素和相关分子如白喉A链和其活性片段和杂合分子，蓖麻毒素如蓖麻毒素A或去糖基化蓖麻毒素A链毒素、霍乱毒素、志贺(Shiga)样毒素如SLT I、SLT II、SLT IIV、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、阿洛林(alorin)、沙泊宁(saporin)、莫迪素(modeccin)、格兰宁(gelanin)、相思子毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(例如PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素和伊诺霉素(enomycin)毒素；核糖核酸酶(RNase)；DNase I、葡萄球菌肠毒素A；美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白；白喉毒素；和假单胞菌内毒素。
在一个实施方案中，抗NTPDase3抗体缀合于奥瑞他汀或其肽类似物、衍生物或前药。奥瑞他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解和细胞核分裂与细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)并具有抗癌活性(US5663149)和抗真菌活性(Pettit等人,(1998)Antimicrob.Agents and Chemother.42:2961-2965)。例如，可使奥瑞他汀E与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应以分别产生AEB和AEVB。其他典型的奥瑞他汀衍生物包括AFP、MMAF(单甲基奥瑞他汀F)和MMAE(单甲基奥瑞他汀E)。合适的奥瑞他汀和奥瑞他汀类似物、衍生物和前药以及适用于奥瑞他汀缀合至Ab的接头描述于例如美国专利第5,635,483号、第5,780,588号和第6,214,345号以及国际专利申请公开WO02088172、WO2004010957、WO2005081711、WO2005084390、WO2006132670、WO03026577、WO200700860、WO207011968和WO205082023中。
在另一个实施方案中，抗NTPDase3抗体缀合于吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(PDB)或其类似物、衍生物或前药。合适的PDB和PDB衍生物以及相关技术描述于例如Hartley J.A.等人,Cancer Res 2010；70(17):6849-6858；Antonow D.等人,Cancer J2008；14(3):154-169；Howard P.W.等人,Bioorg Med Chem Lett 2009；19:6463-6466以及Sagnou等人,Bioorg Med Chem Lett 2000；10(18):2083-2086中。
在另一个实施方案中，抗NTPDase3抗体缀合于选自由以下组成的组的细胞毒性部分：蒽环霉素、美登素、卡奇霉素、多卡霉素、拉奇霉素(CC-1065)、海兔毒素10、海兔毒素15、伊立替康、单甲基奥瑞他汀E、单甲基奥瑞他汀F、PDB或其任一者的类似物、衍生物或前药。
在一个特定实施方案中，抗NTPDase3抗体缀合于蒽环霉素或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于美登素或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于卡奇霉素或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于多卡霉素或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于拉奇霉素(CC-1065)或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于海兔毒素10或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于海兔毒素15或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于单甲基奥瑞他汀E或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于单甲基奥瑞他汀F或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓或其类似物、衍生物或前药。在另一个特定实施方案中，抗体缀合于伊立替康或其类似物、衍生物或前药。
在一个实施方案中，本发明所涵盖的抗NTPDase3抗体缀合于核酸或核酸相关分子。在一个此类实施方案中，缀合核酸是细胞毒性核糖核酸酶(RNase)或脱氧核糖核酸酶(例如DNase I)、反义核酸、抑制性RNA分子(例如siRNA分子)或免疫刺激核酸(例如免疫刺激性含CpG基序的DNA分子)。在另一个实施方案中，本发明涵盖的NTPDase3特异性抗体缀合于适体或核酶。
在一个实施方案中，本发明涵盖的抗NTPDase3抗体例如以融合蛋白形式缀合于裂解肽，例如CLIP、爪蟾抗菌肽(Magainin)2、蜂毒肽(mellitin)、杀菌肽(Cecropin)和P18。
在一个实施方案中，抗NTPDase3抗体缀合于细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因子、安西司亭(ancestim)和TNFα。
在某些实施方案中，化学部分是增加抗体或片段在受试者体内的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括但不限于亲水性聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如PEG的分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人,(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等人,(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)公开了具有PEG的连接至放射金属螯合剂(二亚乙基三胺四乙酸(DTPA))的缀合抗体。
抗NTPDase3抗体也可与标记缀合，例如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th、40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe。
抗NTPDase3抗体也可与荧光或化学发光标记缀合，所述标记包括荧光团如稀土螯合剂、荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、异硫氰酸酯、藻红素、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹酰基(dansyl)、伞酮(umbelliferone)、荧光素、鲁米诺标记(luminal label)、异鲁米诺标记、芳族吖锭酯标记、咪唑标记、吖锭盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记(aequorin label)、2,3-二氢酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记和稳定自由基。
可采用本领域中已知的用于本发明涵盖的抗体和其抗原结合片段与各种部分缀合的任何方法，包括以下所描述的那些方法：Hunter等人,(1962)Nature 144:945；David等人,(1974)Biochemistry 13:1014；Pain等人,(1981)J.Immunol.Meth.40:219；和Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407。用于缀合抗体和片段的方法是本领域中常规并且极为熟知的。
VIII.药物组合物
本发明所涵盖的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体可以组合物、尤其是药物组合物形式配制。此类组合物包含本发明涵盖的治疗或预防有效量的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体，其与合适载剂(例如药学上可接受的药剂)混合。典型地，本发明涵盖的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体被充分纯化以在以药物组合物形式配制之前向动物施用。
本发明药物组合物中使用的药学上可接受的药剂包括载剂、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲液、递送媒介物、张力剂、共溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。
中性缓冲生理盐水或与血清白蛋白混合的生理盐水是示例性的适当载剂。药物组合物可包括抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如吐温(Tween)、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。也举例来说，合适的渗性增强剂包括碱金属卤化物(优选地氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇(phenethyl alcohol)、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸等。过氧化氢也可用作防腐剂。合适的共溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基-丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或润湿剂包括脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)等。缓冲液可为常规缓冲液，例如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸盐缓冲液可为约pH 4-5.5，并且Tris缓冲液可为约pH 7-8.5。额外医药剂阐述于Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,A.R.Gennaro编,Mack Publishing Company,1990中。
组合物可呈液体形式或呈冻干或冷冻干燥形式并且可包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或增量剂(参见例如美国专利6,685,940、6,566,329和6,372,716)。在一个实施方案中，包括冻干保护剂，其为例如蔗糖、乳糖或海藻糖的非还原糖。通常包括冻干保护剂的量使得在重构之后，所得制剂将为等张的，但高张或稍微低张的制剂也可为合适的。另外，冻干保护剂的量应足以防止在冻干之后蛋白质的降解和/或聚集的量不可接受。冻干前制剂中的糖类(例如蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂浓度为约10mM至约400mM。在另一个实施方案中，包括表面活性剂，例如非离子表面活性剂和离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；聚(乙二醇)苯醚(例如Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油烯基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油烯基-或硬脂基-肌氨酸；亚油烯基、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-、椰油酰氨基丙基-、亚油酰氨基丙基-、肉豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油酰基钠或甲基油醇基-牛磺酸二钠；和MONAQUATTM.系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇，和乙二醇与丙二醇的共聚物(例如普朗尼克(Pluronics)、PF68等)。可存在于冻干前制剂中的表面活性剂的示例量为约0.001-0.5％。高分子量结构添加剂(例如填充剂、粘合剂)可包括例如阿拉伯胶、白蛋白、褐藻酸、磷酸氢钙、纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、葡聚糖、糊精、葡萄糖结合剂、蔗糖、甲基纤维素(tylose)、预胶凝化淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、麦芽糖、山梨糖醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔胶(guar gum)、液态葡萄糖、可压缩糖、硅酸镁铝、麦芽糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮(povidone)、褐藻酸钠、黄蓍、微晶纤维素、淀粉和玉米蛋白。高分子量结构添加剂的示例性浓度为0.1重量％至10重量％。在其他实施方案中，可包括增量剂(例如甘露糖醇、甘氨酸)。
组合物可适于肠胃外施用。示例性组合物适合于通过可供本领域技术人员使用的任何途径注射或输注至动物中，例如关节内、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内或病灶内途径。肠胃外制剂典型地将为无菌、无热原质的等张水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。
非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。通常参见Remington's Pharmaceutical Science,第16版.,Mack Eds.,1980，所述文献通过引用并入本文。
本文所描述的药物组合物可在特定局部环境中提供产物(例如药团、储槽作用)的局域浓度和/或增加稳定性或半衰期的方式配制成供控制或维持递送。组合物可包括本发明涵盖的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体与以下的制剂：聚合物化合物(例如聚乳酸、聚乙醇酸等)的微粒制剂，以及例如以下的药剂：可生物降解基质、可注射微球体、微胶囊粒子、微胶囊、生物溶蚀性粒子珠粒、脂质体，和提供活性剂的控制或持续释放、然后可以储槽式注射剂递送的可植入递送装置。用于配制此类持续或受控递送装置的技术是已知的，并且已开发多种聚合物并其用于药物的受控释放和递送。此类聚合物典型地是可生物降解的和生物相容的。聚合物水凝胶(包括通过对映异构体聚合物或多肽区段复合而形成的那些)和具有温度或pH敏感特性的水凝胶可为提供药物储槽效应所需的，因为捕集生物活性蛋白质药剂(例如抗体)牵涉到温和和水性条件。参见例如PCT申请公开WO 93/15722中关于递送药物组合物的受控释放多孔聚合物微粒的描述。
适用于此目的的材料包括聚丙交酯(参见例如美国专利3,773,919)；聚-(a-羟基羧酸)的聚合物，例如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988A)；L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22:547-556(1983))；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))；乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(～)～3-羟基丁酸。其他可生物降解聚合物包括聚(内酯)、聚(缩醛)、聚(原酸酯)和聚(原碳酸酯)。持续释放组合物还可包括可通过本领域中已知的若干方法中的任一者制备的脂质体(参见例如Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-92(1985))。载剂本身或其降解产物对目标组织应无毒并且不应进一步加重疾患。这可通过对目标病症的动物模型进行常规筛选来确定，或者如果此类模型不可获得，则利用正常动物确定。[00196]已成功地用人类生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN--)、白细胞介素-2和MNrgpl20进行持续释放的重组蛋白的微囊化。Johnson等人,Nat.Med.,2:795-799(1996)；Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993)；Hora等人,Bio/Technology.8:755-758(1990)；Cleland,“Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”,于Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach中,Powell和Newman编,(PlenumPress:New York,1995),第439-462页；WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399；和美国专利第5,654,010号。由于其生物相容性和宽范围的可生物降解特性，这些蛋白质的持续释放制剂是使用聚乳酸-共乙醇酸(PLGA)聚合物来开发。PLGA、乳酸和乙醇酸的降解产物可在人体内快速清除。另外，这种聚合物的可降解性可以取决于其分子量和组成。Lewis,“Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”,于M.Chasin和R.Langer(编),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems中(Marcel Dekker:New York,1990),第1-41页。持续释放组合物的额外实例包括例如EP 58,48IA、美国专利第3,887,699号、EP 158,277A、加拿大专利第1176565号；U.Sidman等人,Biopolymers 22,547[1983]；R.Langer等人,Chem.Tech.12,98[1982]；Sinha等人,J.Control.Release 90,261[2003]；Zhu等人,Nat.Biotechnol.18,24[2000]；和Dai等人,Colloids Surf B Biointerfaces 41,117[2005]。
也涵盖用于本发明涵盖的组合物或与本发明涵盖的组合物一起使用的生物粘着聚合物。生物粘着剂是能够粘着至生物底物持续延长时段的合成和天然存在的材料。例如，卡波姆(Carbopol)与聚卡波非(polycarbophil)都是聚(丙烯酸)的合成交联衍生物。基于天然存在物质的生物粘着递送系统包括例如玻糖醛酸，也称为玻尿酸。玻糖醛酸是天然存在的粘多糖，其由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的残基组成。玻糖醛酸发现于脊椎动物的细胞外组织基质中，包括结缔组织以及滑液以及眼玻璃体和眼房液中。玻糖醛酸的酯化衍生物已用于产生供用于递送的具有生物相容性和可生物降解的微球体(参见例如Cortivo等人,Biomaterials(1991)12:727-730；欧洲公开第517,565号；国际公开第WO 96/29998号；Ilium等人,J.Controlled ReI.(1994)29:133-141)。本发明涵盖的含有示例性玻糖醛酸的组合物包含约0.1％至约40％(w/w)的量的IL-1/3结合抗体或片段与玻糖醛酸聚合物的玻糖醛酸酯聚合物。[00198]可生物降解和不可生物降解聚合物基质两者都可用于递送本发明涵盖的组合物，并且此类聚合物基质可包含天然或合成聚合物。优选为可生物降解基质。释放发生的时段是基于聚合物的选择。典型地，在几个小时与三至十二个月之间的范围内的时段内释放是最需要的。可于形成可生物降解递送系统的示例性合成聚合物包括：乳酸与乙醇酸的聚合物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷二醇、聚氧化烯、聚对苯二甲酸烷二酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚酸酐、聚氨基甲酸酯和其共聚物、聚(丁酸)、聚(戊酸)、烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯脂)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯醇)、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。示例性的天然聚合物包括褐藻酸盐和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物(取代、添加化学基团，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、白蛋白和其他亲水性蛋白质、玉米蛋白和其他醇溶蛋白和疏水性蛋白质、其共聚物和混合物。一般而言，这些材料通过酶水解或在体内暴露于水、通过表面或整体侵蚀而降解。聚合物任选地呈水凝胶形式(参见例如WO 04/009664、WO 05/087201；Sawhney等人,Macromolecules,1993,26,581-587)，其在水中可以吸收多达其重量的约90％并且任选地进一步与多价离子或其他聚合物交联。
递送系统也包括非聚合物系统，其为脂质，包括固醇，例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸；或中性脂肪，例如单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合的植入物；等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中产物容纳于基质内的形式中，例如美国专利第4,452,775号、第4,675,189号和第5,736,152号中所描述的那些，和(b)扩散系统，其中产物以受控速率从聚合物渗透，例如美国专利第3,854,480号、第5,133,974号和第5,407,686号中所描述。含有产物的脂质体可通过方法已知方法制备，例如(DE 3,218,121；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP 102,324)。
或者或另外，组合物可经由植入至已吸收或囊封有本发明所涵盖的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体的膜、海绵或其他适当材料的受影响区域中来局部施用。在使用植入装置的情况下，可将装置植入至任何合适的组织或器官中，并且本发明所涵盖的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体的递送可通过装置经由推注直接进行，或经由连续施用进行，或经由导管使用连续输注进行。
包含本发明所涵盖的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体的药物组合物可经配制以用于吸入，例如以干燥粉末形式。吸入溶液也可配制于液化推进剂中用于气溶胶递送。在另一种制剂中，溶液可经雾化。用于经肺施用的额外药物组合物包括例如PCT申请公开WO94/20069中所描述的那些药物组合物，所述文献公开了经化学修饰的蛋白质的经肺传递。对于经肺递送，粒度应适合于递送至远程肺。例如，粒度可为1μm至5μm；然而，例如如果每个粒子相当多孔，则可使用较大粒子。
本发明涵盖的含有抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体的某些制剂可经口施用。以这种方式施用的制剂可用或不用通常用于混配固体剂型(例如片剂和胶囊)的那些载剂来配制。例如，胶囊可经设计以使制剂的活性部分在胃肠道的某处释放，此时生物可用性最大化并且全身前降解最小化。可包括额外药剂以促进选择性粘合剂的吸收。也可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一种制剂可涉及有效量的本发明所涵盖的抗NTPDase3抗体、抗体片段、核酸或载体与适用于制造片剂的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶解在无菌水或另一适当媒介物中，可以单位剂型制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
IX.示例性方法
材料与方法
试剂
除非另外陈述，否则所有化学试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，细胞培养基来自Life Technologies(Carlsbad,CA)，细胞培养消耗品来自
Figure BDA0004113291790002091
Scientific Products(Shirley,MA)，并且市售抗体来自Biolegend(San Diego,CA)。二级抗体，包括Alexa
Figure BDA0004113291790002092
488缀合的AffinityPure驴抗人类IgG(Fc特异性)(#709-545-098)、Alexa
Figure BDA0004113291790002093
488缀合的抗兔IgG(H+L)(#711-545-152)、生物素-SP缀合的AffinPureF(ab')2片段驴抗兔IgG(H+L)(#711-066-152)、生物素-SP缀合的AffinPure F(ab')2片段驴抗人类IgG(H+L)(#709-066-149)，均获自Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA)；CellTiter-
Figure BDA0004113291790002094
(#G7571)和Bio-GloTM(#G7941)来自Promega(Madison,WI)，小鼠抗hENTPD3克隆hN3-B3s来自Ectonocleotidases-ab(目录#hN3-B3s；Quebec,Canada)。
细胞培养
人类ENTPD3稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-hENTPD3)维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素的DMEM中。内源性表达hENTPD3的人类膀胱癌细胞(RT4；ECACC；Sigma#91091914)生长于McCoy的5a加10％FBS、1％青霉素-链霉素中。所有细胞系都在37℃下在5％ CO2气氛中、以100％湿度维持于培养烧瓶中，不同之处在于Jurkat细胞/NFAT-luc+FcγRIIIA(Promega目录#：G7011)，其在使用之前在37℃下于水浴中解冻用于实验。
单克隆抗体对表达人类ENTPD3的细胞系的亲和力
经hENTPD3转染的细胞或内源性表达hENTPD3的细胞(1×105个细胞)在4℃下与连续稀释的单克隆抗体一起温育30分钟，接着用细胞染色缓冲液洗涤两次。将细胞然后与抗人类IgG(Fc特异性)Alexa
Figure BDA0004113291790002103
488(1:5000)一起在4℃下温育30分钟，接着用细胞染色缓冲液洗涤两次并通过CytekTMAurora流式细胞术(Cytek Biosciences，Fremont,CA)分析。检测Alexa
Figure BDA0004113291790002101
488(AF488)中值荧光强度(MFI)并通过FCS Express 7软件(De NovoSoftware，Los Angeles,CA)分析数据。
对完整细胞上的人类ENTPD3酶活性的抑制
将CHO-hENTPD3细胞(8×104个细胞/孔)和RT4膀胱癌细胞(3×105个细胞/孔)胰蛋白酶化，计数并接种于96孔U底板中。将悬浮细胞然后用改良林格氏缓冲液(RB)(120mMNaCl、5mM KCl、2.5mM CaCl2、1.2mM MgSO4、25mM NaHCO3、10mM右旋糖、80mM Tris-HCl，pH7.4)洗涤两次并在37℃下与单克隆抗体一起温育30分钟。将CHO-hENTPD3细胞然后在室温下与250μM的ATP一起温育15分钟，而将RT4在37℃下与50μM的ATP一起温育45分钟。最后将上清液收集至96孔不透明壁的多孔板(BRAND板#781968)并使用CellTiter-
Figure BDA0004113291790002102
通过发光来检测ATP水平。发光值以SynergyTMNeo2多模读取器(BioTeK Instruments公司，Winooski,VT)读取并且与ATP水平直接相关。不具有抗体的细胞(细胞+ATP)或在不存在细胞的情况下的单独ATP充当对照。结果表述为相对发光单位(RLU)或通过以下计算的酶活性抑制％：[(细胞+ATP+Ab)-(细胞+ATP)/(ATP)-(细胞+ATP)]×100。所有步骤均在RB中进行。
以相同方式进行贴壁RT4细胞的酶活性分析，但将细胞(1.5×105个细胞/孔)接种于96孔平底板中，温育过夜并在37℃下暴露于25μM的ATP中持续45分钟。为清楚起见，本文所描述的NTPD3酶活性抑制的所有百分比值指示相对于100％的抑制百分比(例如，如图5中所示的值41指示酶活性相比于100％活性的基线降低41％)。
NFAT荧光素酶报告基因Jurkat系统(ADCC测定)
将靶细胞(CHO-hENTPD3)接种于96孔板(8×103个细胞/100μl/孔)(BRAND板#781965)中并生长24小时。将细胞然后用ADCC测定缓冲液(补充有4％超低IgG血清的DMEM培养基)洗涤两次并与连续稀释的单克隆抗体一起在37℃下温育30分钟。然后将效应细胞(Jurkat细胞/NFAT-luc+FcγRIIIA)(3×106个细胞/毫升)添加至孔中并且在37℃下温育混合物(T:E＝1:6)6小时。最终将Bio-GloTM添加至孔中并使用SynergyTMNeo2多模读取器(BioTeK Instruments公司)在5、15和30分钟时读取发光值。ADCC活性由荧光素酶活性相对于背景的增加指示。
表位竞争测定
抗hENTPD3单克隆抗体(克隆3E9、38D5、38D12、44H5和PBI#30)根据制造商说明书(Thermo Fisher Scientific#A20186)使用抗体标记试剂盒与Alexa
Figure BDA0004113291790002111
647缀合。将未缀合的人类IgG1同种型对照或抗hENTPD3单克隆抗体(20μg/mL)与CHO-hENTPD3细胞(1×105个细胞)一起在4℃下温育30分钟。接下来，将Alexa
Figure BDA0004113291790002112
647缀合的抗hENTPD3单克隆抗体(3E9 1:1000；38D5、38D12和44H5 1:800；和PBI#30 1:400)添加至每个孔并在4℃下温育30分钟。将细胞然后用细胞染色缓冲液洗涤两次并通过CytekTMAurora流式细胞术(CytekBiosciences)分析。检测Alexa
Figure BDA0004113291790002121
647(AF647)中值荧光强度(MFI)并通过FCS Express7软件(De Novo Software)分析数据。计算AF647MFI检测相对于同种型对照的倍数变化(无表位重叠＝1)。
动物研究
C57BL6 hENTPD3 KI小鼠由贝斯以色列女执事医疗中心(Beth Israel DeaconessMedical Center)授权。6至8周龄雌性小鼠用于肿瘤接种。在补充有10％ FBS、青霉素(100单位/毫升)和链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培养基中维持同基因型鼠类MC38结直肠癌细胞。通过胰蛋白酶消化收获5×105个MC38细胞并用150μl补充有10％ FBS的RPMI 1640再悬浮以用于注射。将MC38细胞皮下注射至hENTPD3KI小鼠的右侧腹中。然后将小鼠随机分为三组(n＝6)。在第4天，荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受20mg/kg的嵌合抗体38D5或8E1或200μl的生理盐水。在第7、10和14天，荷瘤小鼠接受10mg/kg 38D5或8E1抗体或200μl生理盐水。使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，每周两次。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
统计分析
使用GraphPad Prism 8(GraphPad Software，San Diego,CA)进行统计分析。
进一步使用额外测定方法，包括测定所选抗ENTPD3抗体功能性的功能性，例如亲本克隆(如克隆PBI#30、8E1和38D5)的人源化、亲和力成熟和/或同种型转换变体，并且如下详述补充实验程序：
试剂
正常人类血清(#A113)购自Quidel公司(San Diego,CA)以用于CDC测定。
细胞培养
人类ENTPD3稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO-hENTPD3)、COS7(COS7-hENTPD3)和HEK293T(HEK293T-hENTPD3)细胞维持于补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素的DMEM中。所有细胞系都在37℃下在5％ CO2气氛中以100％湿度维持于培养烧瓶中。这三种细胞系表达不同水平的hENTPD3：HEK293T-hENTPD3(极高)>CHO-hENTPD3(高)>COS7-hENTPD3(中度)。HEK293T-hENTPD3细胞含有极高水平的hENTPD3酶活性，因此极快速降解外源性ATP，不将此视为生理学上相关的。COS7-hENTPD3细胞上的hENTPD3表达/酶活性水平类似于RT4人类膀胱癌细胞(内源性表达hENTPD3)上的那些。由于用RT4细胞培养/操作的技术困难，因此选择与ENTPD3表达/酶活性匹配的两个生理学相关细胞系COS7-hENTPD3和CHO-hENTPD3细胞，用于体外结合和功能测定，分别表示肿瘤微环境中的ENTPD3+和ENTPD3高细胞。
单克隆抗体对表达人类ENTPD3的细胞系的亲和力
将用hENTPD3转染的细胞(1×105个细胞)与连续稀释的单克隆抗体一起在37℃下温育2小时，接着用细胞染色缓冲液洗涤两次。所有后续程序和分析都与上文所描述相同。
对完整细胞上的人类ENTPD3酶活性的抑制
使细胞胰蛋白酶化，计数并接种(8×104个细胞/孔)于96孔U底板中。将悬浮细胞然后与单克隆抗体一起在37℃下在完全培养基中温育2h。所有后续程序和分析都与上文所描述相同。
补体依赖性细胞毒性(CDC)测定
将CHO-hENTPD3细胞用无血清RPMI 1640培养基洗涤两次，以2×106/ml的最终浓度再悬浮于CDC测定缓冲液(具有4％超低IgG FBS的RPMI 1640培养基)中并在冰上静置2-3小时。将细胞然后与连续稀释的单克隆抗体一起在37℃下在5％ CO2中温育30分钟。然后将正常人类血清(NHS 10％)添加至细胞中并在37℃下在5％ CO2中温育2小时。在温育后，将细胞在室温下用碘化丙锭(P/I)(200ng/mL)染色10分钟，并且通过Cytek Aurora流式细胞术(Cytek Biosciences)分析靶细胞死亡。结果表述为细胞毒性％(P/I+细胞)和相对于背景的最大细胞毒性％(1μg/mL下的最大细胞毒性％-背景细胞毒性％)。
稳定免疫复合物测定
对于本发明中的示例性抗ENTPD3单克隆抗体的图50，使COS7-hENTPD3细胞胰蛋白酶化，计数，接种(3×104个细胞/孔)于48孔板中并生长过夜。将贴壁细胞然后与抗人类ENTPD3抗体(6μg/ml)一起温育或在37℃下在5％ CO2中保持未经处理24小时。第二天，将未经处理的细胞暴露于一组相同单克隆抗体(6μg/ml)，但在37℃下暴露2小时以获得基础的ENTPD3表达水平。将细胞然后用细胞染色缓冲液洗涤两次并在4℃下用抗人类IgG(Fc特异性)Alexa Fluor488(1:2000)染色30分钟，接着再用PBS 1X洗涤两次和进行胰蛋白酶化。一旦细胞分离，就将培养基添加至板中并且将细胞转移至未经处理的96U孔板(Corning#3365)中。最后，将细胞以1200rpm减速离心5min，重悬于细胞染色缓冲液中，并通过CytekAurora流式细胞术(Cytek Biosciences)分析。检测到Alexa Flour 488(AF488)MFI，并且通过FCS Express 7软件(De Novo Software)分析数据。在24小时时，细胞膜上的人类ENTPD3损失百分比被计算为：[(2小时的MFI-24h的MFI/2小时的MFI)]×100。
对于本发明中的其他主题抗ENTPD3单克隆抗体的图51，使CHO-hENTPD3细胞胰蛋白酶化，计数并接种(5×105个细胞/mL)于未经处理的96U孔板(Corning#3365)中以避免细胞贴壁。将细胞然后与抗人类ENTPD3人类/兔嵌合抗体(2μg/ml)一起温育或在37℃下在5％CO2中保持未经处理24小时。第二天，将未经处理的细胞暴露于一组相同单克隆抗体(2μg/ml)，但在4℃下暴露20分钟以获得基础的ENTPD3表达水平。将细胞然后用细胞染色缓冲液洗涤两次并在4℃下用抗人类IgG(Fc特异性)Alexa Fluor 488(1:2000)染色30分钟，接着再洗涤两次并且在室温下用多聚甲醛(PFA，2％)固定10分钟。最后，将细胞洗涤两次并通过Cytek Aurora流式细胞术(Cytek Biosciences)分析。检测到Alexa Flour 488(AF488)MFI，并且通过FCS Express 7软件(De Novo Software)分析数据。在24小时时，细胞膜上的人类ENTPD3损失百分比被计算为：[(20min的MFI-24h的MFI/20min的MFI)]×100。
重复抗体治疗后，检测荷瘤小鼠的血浆中的游离抗体
对于PBI#30成熟变体：在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(1×105)皮下接种C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠(13至16周龄)。荷瘤小鼠经由腹膜内注射在第8、12、15、18和21天接受3mg/kg完全人类抗hENTPD3抗体PBI#3af4 hIgG1或PBI#3af4hIgG4。在第20、21、22和24天收集血浆样品并保持在-80℃下直至进一步分析。在给药日在剂量施用之前收集血浆并且对两只不同动物进行每个收集日的样品分析(样品名称命名为动物编号+收集日期)。通过将连续稀释的血浆与COS7-hENTPD3细胞一起温育并分析细胞结合活性来检测血浆中估计的游离抗体水平，如以上“单克隆抗体对表达人类ENTPD3的细胞系的亲和力”的新部分中所描述。
对于人源化38D5 hIgG1：在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(1×105)皮下接种C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠(9周龄)。荷瘤小鼠经由腹膜内注射在第12、15、18和21天接受3mg/kg 38D5 hIgG1。在第19、21和23天收集血浆样品并保持在-80℃下直至进一步分析。在给药日在剂量施用之前收集血浆并且对两至三只不同动物进行每个收集日的样品分析(样品名称命名为动物编号+收集日期)。以与针对上文所描述的PBI#30成熟变体相同的方式检测血浆中的所估计游离抗体水平。
单次剂量抗体治疗后，检测无肿瘤小鼠的血浆中的游离抗体
C57BL6 hENTPD3 KI无肿瘤雌性小鼠(9周龄)经由腹膜内注射接受一次剂量的1或10mg/kg 38D5 hIgG1。在此实验中使用总共两只小鼠，各剂量一只小鼠。然后在24h和48h后从每只小鼠收集血浆样品并保持在-80℃下直至进一步分析(样品名称命名为：所注射的剂量+收集时间)。如以上部分中所描述检测血浆中的所估计游离抗体水平。
动物研究
对于PBI#30hIgG1和其亲和力成熟变体PBI#30af4 hIgG1和PBI#3af4 hIgG4以及人源化38D5 hIgG1和38D5 hIgG4，进行额外体内研究。C57BL6 hENTPD3 KI小鼠由贝斯以色列女执事医疗中心授权并且在Purinomia Animal Facility处内部饲养。在补充有10％FBS、青霉素(100单位/毫升)和链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培养基中维持同基因型鼠类MC38结直肠癌细胞。
对于PBI#3af4 hIgG1和PBI#3af4 hIgG4成熟变体：在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(1×105)皮下接种13至16周龄C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠。然后将小鼠随机分为三组(n＝8只/组)。荷瘤小鼠经由腹膜内注射在第8、12、15、18和21天接受3mg/kg完全人类抗hENTPD3抗体PBI#3af4 hIgG1或PBI#3af4 hIgG4，或200μl生理盐水。每两天使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
对于PBI#30hIgG1和人源化38D5 hIgG1和38D5 hIgG4抗体：在150μl的RPMI 1640培养基中用MC38结直肠癌细胞(5×105)皮下接种6至8周龄C57BL6 hENTPD3 KI雌性小鼠。然后将小鼠随机分为两组(n＝5只/组)。在第4天，荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受20mg/kgPBI#30hIgG1或人源化38D5 hIgG1或38D5 hIgG4抗体，或200μl生理盐水。在第7、10和14天，荷瘤小鼠接受10mg/kg相应抗ENTPD3抗体或200μl生理盐水。使用数字卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)，每周两次。肿瘤体积(mm3)测定为L*W*W*0.52。
表4.检测抗体
Figure BDA0004113291790002171
通过引用并入
本文中所提及的所有出版物、专利和专利申请特此通过引用整体并入并入，如同每一个别出版物、专利或专利申请具体地且个别地指示为通过引用并入一样。在有冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
引用与公用数据库中的条目相关的登录号的任何多核苷酸和多肽序列，例如通过万维网(World Wide Web)上的基因组研究所(The Institute for Genomic Research；TIGR)和/或万维网上的国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation；NCBI)维持的那些也通过引用整体并入。
等同物和范围
本发明涵盖的一个或多个实施方案的细节阐述于以上说明书中。尽管上文已描述优选的材料和方法，但与本文所描述的那些材料和方法类似或等同的任何材料和方法可用于本发明所涵盖的实施方案的实践或测试中。与本发明相关的其他特征、目标和优点从本说明书显而易见。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在有冲突的情况下，将以上文所提供的本说明书为准。
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所描述的本发明涵盖的特定实施方案的许多等同物。本发明所涵盖的范围并不旨在限于本文所提供的描述，并且此类等同物旨在由所附权利要求书涵盖。
除非相反地指示或以其他方式从上下文显而易见，否则本文中使用冠词“一(a/an)”是指一个或超过一个(即至少一个)的所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元件”意指一个元件或超过一个元件。除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则如果一个、超过一个或所有群组成员存在于、用于给定产物或方法中或以其他方式与给定产物或方法有关，则在群组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书视为满足。本发明包括群组中恰好一个成员存在于、用于给定产物或方法中或以其他方式与给定产物或方法相关的实施方案。本发明也包括超过一个或所有群组成员存在于、用于给定产物或方法中或以其他方式与给定产物或方法相关的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在是开放的并且容许但不要求包括额外元件或步骤。当本文中使用术语“包含”时，也因此涵盖并公开术语“由……组成”。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解，除非另外指示或以其他方式从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则表示为范围的值可在本发明涵盖的不同实施方案中采用所陈述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则精确到所述范围下限的单位的十分之一。
另外，应理解，本发明所涵盖的属于现有技术的任何特定实施方案均可明确地从权利要求中的任一者或多者排除。由于认为此类实施方案是本领域普通技术人员已知的，因此可排除所述实施方案，即使未在本文中明确地阐述排除。本发明涵盖的组合物的任何特定实施方案(例如任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等)均可出于任何原因从任何一个或多个权利要求排除，无论是否与现有技术的存在相关。
应理解，已使用的词语是描述性而非限制性词语，并且可在不偏离本发明涵盖的真实范围和精神的情况下，在其较广泛方面在所附权利要求的范围内作出改变。
尽管已经相对于若干所描述的实施方案以一定长度和一些特殊性描述了本发明，但并非意指本发明应受限于任何此类细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应该参考所附权利要求进行解释，以便鉴于现有技术提供对此类权利要求的尽可能最广泛的解释，并且因此有效地涵盖本发明涵盖的预期范围。

Claims (44)

1.一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个抗原结合域，所述抗原结合域在使得所述抗NTPDase3抗体形成稳定免疫复合物的位点处结合外核苷三磷酸二磷酸水解酶-3(NTPDase3)，和
(a)FcγRIIIa结合部分，所述结合部分结合FcγRIIIa受体并赋予所述抗NTPDase3抗体针对NTPDase3+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性；和/或
(b)其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段抑制NTPDase3酶活性，任选地
其中
(i)所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段在体外ADCC测定中的EC50为至少2×10-6摩尔(M)或更低，优选地其中所述EC50为1×10-6M或更低、0.5×10-6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M；
(ii)所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段在体外NTPD3酶活性抑制测定中的EC50为至少2×10-6M或更低，优选地其中所述EC50为1×10-6M或更低、0.5×10-6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M，并且其中最大抑制效力为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高，或其间的任何范围，包括端点，包括30％至99％，如通过体外NTPD3酶活性抑制测定所确定；或
(iii)所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段在体外ADCC测定中的EC50为至少4×10- 6M或更低，优选地其中所述EC50为2×10-6M或更低、1×10-6M或更低、0.5×10-6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M；以及在体外酶活性抑制测定中的EC50为至少4×10-6M或更低，优选地其中所述EC50为2×10-6M或更低、1×10-6M或更低、0.5×10-6M或更低、1×10-7M或更低、7.5×10-8M或更低、5×10-8M或更低、2.5×10-8M、1×10-8M或更低、7.5×10-9M或更低、5×10-9M或更低、2.5×10-9M或更低、1×10-9M或更低、7.5×10-10M或更低、5×10-10M或更低、2.5×10-10M或更低、1×10-10M或更低、7.5×10-11M或更低、5×10-11M或更低、2.5×10-11M或更低、1×10-11M或更低、7.5×10-12M或更低、5×10-12M或更低、2.5×10-12M或更低、或1×10-12M或更低，或其间的任何范围，包括端点，包括1×10-6M至1×10-12M、5×10-7至5×10-9M和1×10-7至1×10-9M，并且其中最大抑制效力为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高，或其间的任何范围，包括端点，包括30％至99％，如通过体外NTPD3酶活性抑制测定所确定。
2.如权利要求1所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是治疗性抗体，和/或进一步促进：
(i)针对NTPDase3+细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性；和/或
(ii)针对NTPDase3+瘤内细胞和/或肿瘤血管周围的NTPDase3+周细胞和/或成纤维细胞的ADCC活性；和/或
(iii)抗体介导的对NTPDase3+免疫细胞(优选地M2巨噬细胞)上的NTPDase3的目标细胞摄食；和/或
(iv)以与NTPDase3单克隆抗体克隆竞争性、非竞争性或部分竞争性结合于NTPDase3的方式结合于NTPDase3，其中所述NTPDase3单克隆抗体克隆选自由以下组成的组：PBI#30和其亲和力成熟变体；3E9、4F9、8E1和其人源化对应物；16D4、37H1、38D5和其在其主链序列中具有或不具有点突变的人源化对应物；38D12、42D8和44H5。
3.如权利要求1或2所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述FcγRIIIa结合部分选自由以下组成的组：Fc域、结合于FcγRIIIa的抗体或其片段和FcγRIIIa结合肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合域选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)、Fav、dsFv、sc(Fv)2、Fde、sdFv、单域抗体(dAb)和双功能抗体片段，和/或其中所述抗NTPDase3抗体或抗原结合片段是单克隆的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段与药剂缀合，任选地其中所述药剂选自由以下组成的组：结合蛋白、酶、药物、化学治疗剂、生物剂、毒素、放射性核素、免疫调节剂、可检测部分和标签。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段具有VH域，其氨基酸序列可由在严格条件下与SEQ IDNo.1、9、13、17、21、25、29、33、37、41、75、79或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列的核酸杂交的核酸编码；和VL域，其氨基酸序列可由在严格条件下与SEQ ID No.3、11、15、19、23、27、31、35、39、43、77、81或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列的核酸杂交的核酸编码。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有与SEQ ID No.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列的CDR具至少60％同一性的CDR；和轻链，所述轻链具有与SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列的CDR具至少60％同一性的CDR。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID No.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列具至少60％同一性的可变重(VH)链；和与SEQ IDNo.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82或表2A、2B、2C、2D或3中所列的序列具至少60％同一性的可变轻(VL)链。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含：
(i)重链，所述重链具有与SEQ ID No.45具至少80％同一性的CDR1氨基酸序列，与SEQID No.46具至少80％同一性的CDR2氨基酸序列和与SEQ ID No.47具至少80％同一性的CDR3氨基酸序列；和
(ii)轻链，所述轻链具有与SEQ ID No.48具至少80％同一性的CDR1氨基酸序列，与SEQID No.49具至少80％同一性的CDR2氨基酸序列和与SEQ ID No.50具至少80％同一性的CDR3氨基酸序列。
10.如权利要求1-8中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链具有选自由以下组成的组的CDR：SEQID NO.2、10、14、18、22、26、30、34、38、42、76、80和表2A、2B、2C、2D和3中所列的序列的CDR；和轻链，所述轻链具有选自由以下组成的组的CDR：SEQ ID No.4、12、16、20、24、28、32、36、40、44、78、82和表2A、2B、2C、2D和3中所列的序列的CDR；以及人类框架序列，以形成具有能够特异性结合人类NTPDase3的抗原结合位点的人源化重链和轻链。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段包含IgG1、IgG3、IgG2或IgG4同种型的Fc域，任选地其中所述Fc域是人类的，优选地所述同种型是具有ADCC活性的IgG1或IgG3。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是低岩藻糖基化或无岩藻糖基化的。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是人类的或者是人源化的。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段是双特异性的，包括至少一个用于肿瘤抗原、免疫检查点或共刺激受体的额外抗原结合位点，其中如果所述额外抗原结合位点是用于免疫检查点，则其充当检查点抑制剂，并且其中如果所述额外抗原结合位点是用于共刺激受体，则其充当共刺激激动剂。
15.如权利要求14所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述额外抗原结合位点结合于选自由以下组成的组的检查点蛋白：PD-1、PD-L1、CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT、CD39和Siglec-15。
16.如权利要求14或15所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述额外抗原结合位点结合在T细胞上上调并与T细胞耗竭相关的检查点蛋白。
17.如权利要求14所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述额外抗原结合位点结合于选自由以下组成的组的免疫共刺激受体：MHCI分子、BTLA受体、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。
18.如权利要求14所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其中所述额外抗原结合位点结合于CD47、SIRPα、CD24或Siglec-10。
19.一种药物制剂，所述药物制剂包含治疗有效量的至少一种权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲液或溶液。
20.如权利要求19所述的药物制剂，所述药物制剂用于提高抗肿瘤T细胞免疫性并且适合于向患有肿瘤的受试者施用，包含有效量的所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲液或溶液，其中向所述受试者施用所述抗NTPDase3抗体引起瘤内NTPDase3+细胞(例如M2和/或M2样巨噬细胞、周细胞和/或成纤维细胞)的数目的减少，并且任选地i)增强T细胞浸润至所述肿瘤中，ii)减少所述肿瘤中的T细胞耗竭，和/或iii)破坏肿瘤相关脉管系统，由此导致肿瘤饥饿。
21.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子
i)在严格条件下与编码权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸的互补序列杂交；
ii)具有在其整个全长中与编码权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的核酸具至少约90％同一性的序列；或
iii)编码权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽。
22.一种分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽，所述多肽由权利要求21所述的核酸编码。
23.一种载体，所述载体包含权利要求21所述的分离核酸，任选地其中所述载体是表达载体。
24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求21所述的分离核酸，所述宿主细胞：
a)表达权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段；
b)包含权利要求22所述的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽；和/或
c)包含权利要求23所述的载体。
25.一种装置或试剂盒，所述装置或试剂盒包含至少一种权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，所述装置或试剂盒任选地包含标记以检测至少一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，或包含有包含所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的复合物。
26.一种装置或试剂盒，所述装置或试剂盒包含权利要求19-24中任一项所述的药物组合物、分离的核酸分子、分离的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽、载体和/或宿主细胞。
27.一种产生至少一种权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在适合于允许表达所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的条件下，培养转化的宿主细胞，所述宿主细胞已通过包含编码至少一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的序列的核酸转化；以及(ii)回收所述表达的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段。
28.一种检测NTPDase3多肽的存在或水平的方法，所述方法包括获得样品以及通过使用至少一种权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段检测所述样品中的所述多肽。
29.如权利要求28所述的方法，其中至少一种抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段与所述NTPDase3多肽形成复合物并且所述复合物以酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫化学测定法、蛋白质印迹、质谱测定法、核磁共振测定法的形式或使用细胞内流动测定法检测。
30.一种用于通过耗竭瘤内NTPDase3+细胞来提高抗肿瘤T细胞免疫性的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，
其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起瘤内NTPDase3+细胞(例如M2和M2样巨噬细胞、周细胞和/或成纤维细胞)的数目的减少，并且增强T细胞浸润至所述肿瘤中或减少所述肿瘤中的T细胞耗竭或两者兼有；并且任选地破坏肿瘤相关脉管系统，从而引起肿瘤饥饿。
31.一种用于促进免疫细胞浸润至肿瘤中的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，
其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起所述肿瘤中NTPDase3+细胞的消融和减少。
32.一种用于减少II型NKT细胞对瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，任选地
其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起所述肿瘤中M2巨噬细胞的消融和减少。
33.一种用于减少调节T细胞(Treg)对瘤内免疫细胞功能的抑制的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，任选地
其中施用所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段引起所述肿瘤中M2巨噬细胞的免疫抑制活性降低。
34.一种用于促进抗肿瘤免疫反应的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其量足以引起所述肿瘤中NTPDase3表达细胞减少。
35.一种用于促进受试者肿瘤中的抗肿瘤免疫功能的方法，所述方法包括
(i)鉴定癌症受试者，其肿瘤浸润的肿瘤反应性淋巴细胞的程度低于预定阈值，以表征为非浸润或浸润不足的肿瘤表型；以及
(ii)向所述受试者施用权利要求1-18中任一项所述的抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段，其量减少所述肿瘤中M2巨噬细胞的细胞数目或免疫抑制活性。
36.如权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为抗肿瘤疗法的部分施用。
37.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为用于治疗实体肿瘤的抗肿瘤疗法的部分施用，任选地其中所述实体肿瘤是胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌或神经胶质瘤。
38.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为用于治疗液体肿瘤的抗肿瘤疗法的部分施用，任选地其中所述液体肿瘤是白血病。
39.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为涉及一种或多种化学治疗剂、抗血管生成剂、免疫肿瘤学药剂和/或放射的疗法的部分施用。
40.如权利要求30-39中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用一种或多种检查点分子的一种或多种抑制剂(拮抗剂)，任选地其中所述一种或多种检查点分子选自由以下组成的组：PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG-3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、TIGIT拮抗剂和Siglec-15拮抗剂。
41.如权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用一种或多种共刺激分子的一种或多种活化剂(激动剂)，任选地其中所述一种或多种共刺激分子选自由以下组成的组：GITR激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD137激动剂、ICOS激动剂和CD28激动剂。
42.如权利要求30-41中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用以下中的一者或多者：VEGFR或VEGF拮抗剂、EGFR或EGF拮抗剂、IDO抑制剂、IDO1抑制剂、HDAC抑制剂、PI3Kδ抑制剂、IL-15激动剂、CXCR4拮抗剂、CXCL12拮抗剂、DNMT抑制剂、白细胞介素-21、抗KIR抗体、抗CSF-1R抗体、抗CCR4抗体、GMCSF、抗PS抗体、抗CD30抗体-澳瑞他汀E缀合物、抗CD19抗体、抗CEAIL-2抗体、抗NY-ESO-1抗体、抗NKG2A抗体、STING激动剂、TRL7/8激动剂、RIG-1激动剂和/或NRLP3抑制剂、抗CD73抗体(例如MEDI9447)、P2X7拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂或抗CD39抗体。
43.如权利要求30-42中任一项所述的方法，其中所述疗法包括施用一种或多种先天性免疫诱导剂，任选地其中所述一种或多种先天性免疫诱导剂选自由以下组成的组：CD47-SIRPα轴的抑制剂、CD24-Siglec-10轴的抑制剂、阻断HLA-E驱动的对NK和CD8+细胞的抑制的NGK2A检查点抑制剂、STING激动剂、TLR7/8激动剂和RIG-I激动剂。
44.如权利要求30-42中任一项所述的方法，其中所述抗NTPDase3抗体或其抗原结合片段作为疗法的一部分施用，所述疗法包括肿瘤疫苗、过继性细胞疗法、抗肿瘤基因疗法、抑制性核酸疗法和/或溶瘤病毒疗法。
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