TW201617367A - 使用cd123嵌合抗原受體治療癌症 - Google Patents
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Abstract
本發明提供治療與CD123表現相關聯之疾病之組合物及方法。本發明亦關於特異於CD123之嵌合抗原受體(CAR)、編碼其之載體及包含該CD123 CAR之重組細胞。本發明亦包括投與表現包含CD123結合域之CAR之遺傳修飾細胞的方法。
Description
本申請案主張2014年8月19日申請的PCT申請案第PCT/CN2014/084696號及2014年11月6日申請的PCT申請案第PCT/CN2014/090508號之優先權。此等申請案中每一者之全部內容以引用的方式併入本文中。
本申請案含有序列表,該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。2015年8月18日創建之該ASCII複本命名為N2067-7064WO5_SL.txt且為625,588字節大小。
本發明大體上係關於經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)用於治療與分化123蛋白叢集(CD123)之表現相關聯的疾病之用途。
大多數患有急性骨髓白血病(AML)之患者使用標準療法不可治癒(Mrozek等人,2012,J Clin Oncol,30:4515-23)且患有復發性或難治性AML(RR-AML)之患者具有尤其不良之預後(Kern等人,2003,Blood 2003,101:64-70;Wheatley等人,1999,Br J Haematol,107:69-79)。
基因工程改造可賦予T細胞以對選定靶之特異性。T細胞可經編
碼抗體之單鏈可變片段(scFv)之遺傳物質結合信號傳導分子轉導,藉此使用互補決定區(CDR)以非MHC限制方式識別細胞表面抗原。此等細胞稱為嵌合抗原受體(CAR)T細胞。在多種惡性腫瘤中靶向至少20種不同表面分子之臨床前及臨床嘗試已展示一些活性,然而此等嘗試通常受輸注之CAR T細胞產物之持久性差限制(Sadelain等人,2009,Curr Opin Immunol 2009,21:215-23)。患有晚期CLL與ALL之患者中抗CD19重導向T細胞之近期成功(Porter等人,2011,N Engl J Med,365:725-33;Kalos等人,2011,Science Transl Med,3:95ra73;Grupp與Kalos,2013,N Engl J Med,368:1509-18)說明此等細胞可在單次輸注之後根除大量腫瘤負荷,迄今為止緩解持續高達3年,強調CAR T細胞療法之巨大潛力。極少有臨床前嘗試靶向動物模型中之AML(Marin等人,2010,Haematologica,95:2144-52;Tettamanti等人,2013,Br J Haematol,161:389-401),儘管最近公佈之小臨床試驗說明產生T細胞且將T細胞輸注至患有侵襲性惡性腫瘤之患者為可行的(Ritchie等人,2013,Mol Ther,21:2122-9)。除遺傳修飾T細胞上之嵌合抗原受體識別及破壞靶細胞之能力以外,成功的治療性T細胞療法需要能夠隨時間推移而增殖及保持,且進一步監測復發。T細胞可由於能力缺失、抑制或衰竭而為可變有效,但熟練從業者此時對此等特徵具有有限控制。為有效,經CAR轉型之患者T細胞需要保持及維持回應於抗原之增殖能力。已展示,ALL患者T細胞運行可用包含鼠類scFv之CART19執行此(參見例如Grupp等人,NEJM 368:1509-1518(2013))。
在第一態樣中,本發明提供一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之分離之核酸分子,其中CAR包含CD123結合域(例如,人類或人類化CD123結合域)、跨膜域及胞內信號傳導域(例如,包含共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域)。在一個實施例中,CAR包含本文所描
述之CD123結合域(例如,本文所描述之人類或人類化CD123結合域)、本文所描述之跨膜域及本文所描述之胞內信號傳導域(例如,包含共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域)。
在一個實施例中,編碼之CD123結合域包含本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3);及/或本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如包含一或多個(例如,所有三個)LC CDR及一或多個(例如,所有三個)HC CDR之CD123結合域。在一個實施例中,編碼之CD123結合域(例如,人類或人類化CD123結合域)包含本文所描述之輕鏈可變區(例如,在表2、表6或表9中)及/或本文所描述之重鏈可變區(例如,在表2、表6或表9中)。在一個實施例中,編碼之CD123結合域為包含表2、表6或表9之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含:輕鏈可變區,其包含具有表2、表6或表9中所提供之輕鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與表2、表6或表9之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列;及/或重鏈可變區,其包含具有表2、表6或表9中所提供之重鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與表2、表6或表9之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在其他實施例中,編碼之CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中,CD33結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及
LC CDR3。在實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中,編碼之CD123結合域包含表2或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3中之一者、兩者或全部,及表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3中之一者、兩者或全部。
在一個實施例中,編碼之CD123結合域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483及485。在一實施例中,編碼之CD123結合域(例如,scFv)包含具有157-160、184-215、478、480、483及485之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483及485之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在另一實施例中,編碼之CD123結合域包含重鏈可變區,其包含選自由SEQ ID NO:216-219或243-274組成之群的胺基酸序列,或具有SEQ ID NO:216-219或243-274之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:216-219或243-274具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,編碼之CD123結合域包含重鏈可變區,其包含對應於SEQ ID NO:478、480、483或485之重鏈可變區之胺基酸序列,或具有SEQ ID NO:478、480、483或485之相應部分之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與
SEQ ID NO:478、480、483或485之相應部分具有95-99%一致性的序列。
在另一實施例中,編碼之CD123結合域包含輕鏈可變區,其包含選自由SEQ ID NO:275-278或302-333組成之群的胺基酸序列,或具有SEQ ID NO:275-278或302-333之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:275-278或302-333具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,編碼之CD123結合域包含輕鏈可變區,其包含對應於SEQ ID NO:478、480、483或485之輕鏈可變區之胺基酸序列,或具有SEQ ID NO:478、480、483或485之相應部分之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:478、480、483或485之相應部分具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,編碼scFv之核酸分子包含選自由SEQ ID NO:479、481、482、484組成之群的核苷酸序列,或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,核酸分子包含編碼重鏈可變區及/或輕鏈可變區之核苷酸序列,其中該核苷酸序列包含選自由SEQ ID NO:479、481、482及484組成之群的核苷酸序列之一部分,或對應於重鏈可變區及/或輕鏈可變區之與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,核酸分子包含編碼重鏈可變區及/或輕鏈可變區之核苷酸序列,其中編碼之胺基酸序列選自由SEQ ID NO:157-160組成之群,或為與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,核酸分子編碼包含選自由SEQ ID NO:184-215組成之群的胺基酸序列或與其具有95-99%一致性的序列之scFv。在一個實施例中,核酸分子包含編碼重鏈可變區及/或輕鏈可變區之序列,其中編碼之胺基酸序列選自由SEQ ID NO:184-215組成之群或為與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,編碼之CD123結合域包括(Gly4-Ser)n連接子,其中n為1、2、3、4、5或6,較佳為3或4(SEQ ID NO:26)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者:輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區,或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一個實施例中,編碼之CAR包括跨膜域,其包含例如選自由以下組成之群的蛋白質(例如,本文所描述之蛋白質)之跨膜域:T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中,編碼之跨膜域包含SEQ ID NO:6之序列。在一個實施例中,編碼之跨膜域包含含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼跨膜域之核酸序列包含SEQ ID NO:17之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,編碼之CD123結合域藉由鉸鏈區(例如本文所描述之鉸鏈區)連接至跨膜域。在一個實施例中,編碼之鉸鏈區包含SEQ ID NO:2或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼鉸鏈區之核酸序列包含SEQ ID NO:13之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,分離之核酸分子進一步包含編碼共刺激域(例如本文所描述之共刺激域)之序列。在實施例中,胞內信號傳導域包含共刺激域。在實施例中,胞內信號傳導域包含主要信號傳導域。在實施例中,胞內信號傳導域包含共刺激域及主要信號傳導域。
在一個實施例中,編碼之共刺激域為來自例如本文所描述、例如選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域:MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信
號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。
在一個實施例中,4-1BB之編碼之共刺激域包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。在一個實施例中,編碼之共刺激域包含具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:7之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼共刺激域之核酸序列包含SEQ ID NO:18之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,CD28之編碼之共刺激域包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列。在一個實施例中,編碼之共刺激域包含具有SEQ ID NO:43之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:43之胺基酸序列具有95-99%一致性的序
列。在一個實施例中,編碼CD28之共刺激域之核酸序列包含SEQ ID NO:44之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,CD27之編碼之共刺激域包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列。在一個實施例中,編碼之共刺激域包含具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:8之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼CD27之共刺激域之核酸序列包含SEQ ID NO:19之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,ICOS之編碼之共刺激域包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列。在一個實施例中,ICOS之編碼之共刺激域包含具有SEQ ID NO:45之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:45之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼ICOS之共刺激域之核酸序列包含SEQ ID NO:46之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,分離之核酸分子進一步包含編碼胞內信號傳導域(例如,本文所描述之胞內信號傳導域)之序列。
在一些實施例中,編碼之主要信號傳導域包含CD3 ξ之功能性信號傳導域。在實施例中,CD3 ξ之功能性信號傳導域包含SEQ ID NO:9(突變CD3 ξ)或SEQ ID NO:10(野生型人類CD3 ξ)之胺基酸序列,或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,4-1BB之編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:7之序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ胺基酸序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或
5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:7之序列及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。在一個實施例中,編碼胞內信號傳導域之核酸序列包含SEQ ID NO:18之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列,及/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21之CD3 ξ核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含CD27之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,CD27之編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ胺基酸序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:8之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:8之序列及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。在一個實施例中,編碼CD27之胞內信號傳導域之核酸序列包含SEQ ID NO:19之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列,及/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21之CD3 ξ核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含CD28之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,CD28之編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ胺基酸序列。在一個實施例中,胞
內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:43之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:43之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:43之序列及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。在一個實施例中,編碼CD28之胞內信號傳導域之核酸序列包含SEQ ID NO:44之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列,及/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21之CD3 ξ核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含ICOS之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,ICOS之編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ胺基酸序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:45之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:45之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:45之序列及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。在一個實施例中,編碼ICOS之胞內信號傳導域之核酸序列包含SEQ ID NO:46之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列,及/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21之CD3 ξ核苷酸序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在另一態樣中,本發明係關於一種編碼CAR構築體之分離之核酸分子,CAR構築體包含前導序列,例如本文所描述之前導序列,例如SEQ ID NO:1之胺基酸序列;本文所描述之CD123結合域,例如包含本文所描述之LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3之CD123結合域,例如表2、表6或表9中所描述之人類或人類化CD123結合域,或與其具有95-99%一致性的序列;本文所描述之鉸鏈區,例如包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的鉸鏈區;本文所描述之跨膜域,例如包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的鉸鏈區;及胞內信號傳導域,例如本文所描述之胞內信號傳導域。在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含共刺激域,例如本文所描述之共刺激域(例如,包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的4-1BB共刺激域,或包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的CD27共刺激域);及/或主要信號傳導域,例如本文所描述之主要信號傳導域(例如,包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列的CD3 ξ刺激域)。在一個實施例中,編碼CAR構築體之分離之核酸分子包括由SEQ ID NO:12之核酸序列編碼之前導序列或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,分離之核酸分子包含(例如,由其組成)編碼以下各者之CAR胺基酸序列之核酸:SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、
SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:156;或具有以下各者之胺基酸序列之一個、兩個或三個修飾(例如,取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸:SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:156;或與以下各者之胺基酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列:SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:156。
在一個實施例中,分離之核酸分子包含(例如由其組成)以下各者之核酸序列:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ
ID NO:42、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97;或與以下各者之核酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的核酸序列:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97。
在一個態樣中,本發明係關於一種編碼CD123結合域之分離之核酸分子,其中CD123結合域包含:本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3);及/或本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如包含一或多個(例如,全部三個)LC CDR及一或多個(例
如,全部三個)HC CDR之人類或人類化CD123結合域。
在其他實施例中,編碼之CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中,CD123結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中,編碼之CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3中之一者、兩者或全部,及表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3中之一者、兩者或全部。
在一個實施例中,編碼之CD123結合域包含本文所描述之輕鏈可變區(例如,在SEQ ID NO:275-278或302-333中)及/或本文所描述之重鏈可變區(例如,在SEQ ID NO:216-219或243-274中)。在一個實施例中,編碼之CD123結合域為包含SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483或485之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含:輕鏈可變區,其包含具有SEQ ID NO:275-278或302-333中所提供之輕鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如,取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:275-278或302-333之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列;及/或重鏈可變區,其包含具有SEQ ID NO:216-219或243-274中所提供之重鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:216-219或243-274之胺基酸序列具有95-99%一
致性的序列。
在一個實施例中,編碼之CD123結合域包含選自由以下組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:480、SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:485;或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼之CD123結合域為scFv,且包含本文所描述之例如表2、表6或表9中之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子(例如,本文所描述之連接子)附接至包含本文所描述之例如表2、表6或表9中之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中,編碼之CD123結合域包括(Gly4-Ser)n連接子,其中n為1、2、3、4、5或6,較佳為4(SEQ ID NO:26)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者:輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區,或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在另一態樣中,本發明係關於一種由核酸分子編碼之分離之多肽分子。在一個實施例中,分離之多肽分子包含選自由以下組成之群之序列:SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ
ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:156;或具有任一前述序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列;或與任一前述序列具有95-99%一致性的序列。
在另一態樣中,本發明係關於一種分離之嵌合抗原受體(CAR)分子(例如,多肽),其包含CD123結合域(例如,特異性結合至CD123之人類或人類化抗體或抗體片段)、跨膜域及胞內信號傳導域(例如,包含共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域)。在一個實施例中,CAR包含抗體或抗體片段,其包括本文所描述之CD123結合域(例如,特異性結合至如本文所描述之CD123的人類或人類化抗體或抗體片段)、本文所描述之跨膜域及本文所描述之胞內信號傳導域(例如,包含本文所描述之共刺激域及/或主要信號傳導域的胞內信號傳導域)。
在一個實施例中,CD123結合域包含本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3);及/或本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如包含一或多個(例如,全部三個)LC CDR及一或多個(例
如,全部三個)HC CDR之CD123結合域。在一個實施例中,CD123結合域包含本文所描述之輕鏈可變區(例如,在表2、表6或表9中)及/或本文所描述之重鏈可變區(例如,在表2、表6或表9中)。在一個實施例中,CD123結合域為包含表2、表6或表9中所列之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含:輕鏈可變區,其包含具有表2、表6或表9中所提供之輕鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與表2、表6或表9中所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列;及/或重鏈可變區,其包含具有表2、表6或表9中所提供之重鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與表2、表6或表9中所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在其他實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所提供之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中,CD123結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3中之一者、兩者或全部,及表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3中之一者、兩者或全部。
在一個實施例中,CD123結合域包含選自由以下組成之群之胺基
酸序列:SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:480、SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:485;或具有任一前述序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列;或與任一前述序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,CD123結合域為scFv,且包含本文所描述之例如表2、表6或表9中之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子(例如,本文所描述之連接子)附接至包含本文所描述之例如表2、表6或表9中之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中,CD123結合域包括(Gly4-Ser)n連接子,其中n為1、2、3、4、5或6,較佳為4(SEQ ID NO:26)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者:輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區,或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一個實施例中,分離之CAR分子包含例如選自由以下組成之群的蛋白(例如本文所描述之蛋白)之跨膜域:T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中,跨膜域包含SEQ ID NO:6之序列。在一個實施例中,
跨膜域包含具有SEQ ID NO:6之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,CD123結合域藉由鉸鏈區(例如本文所描述之鉸鏈區)連接至跨膜域。在一個實施例中,編碼之鉸鏈區包含SEQ ID NO:2或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,分離之CAR分子進一步包含編碼共刺激域(例如,本文所描述之共刺激域)之序列。
在一些實施例中,分離之CAR分子之胞內信號傳導域包含共刺激域。在實施例中,分離之CAR分子之胞內信號傳導域包含主要信號傳導域。在實施例中,分離之CAR分子之胞內信號傳導域包含共刺激域及主要信號傳導域。
在一個實施例中,共刺激域包含選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域:MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1
(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。
在一個實施例中,4-1BB之共刺激域包含SEQ ID NO:7之序列。在一個實施例中,共刺激域包含具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:7之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,CD28之共刺激域包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列。在一個實施例中,共刺激域包含具有SEQ ID NO:43之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:43之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,CD27之共刺激域包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列。在一個實施例中,共刺激域包含具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:8之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在另一實施例中,ICOS之共刺激域包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列。在一個實施例中,共刺激域包含具有SEQ ID NO:45之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:45之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在實施例中,主要信號傳導域包含CD3 ξ之功能性信號傳導域。在實施例中,CD3 ξ之功能性信號傳導域包含SEQ ID NO:9(突變CD3 ξ)或SEQ ID NO:10(野生型人類CD3 ξ)或與其具有95-99%一致性的序
列。
在一個實施例中,胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。
在一個實施例中,胞內信號傳導域包含CD27之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,CD27之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ胺基酸序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:8之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:8之序列及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。
在一個實施例中,胞內信號傳導域包含CD28之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,CD28之編碼
之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ胺基酸序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:43之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:43之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:43之序列及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。
在一個實施例中,胞內信號傳導域包含ICOS之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,ICOS之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ胺基酸序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO:45之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:381之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,編碼之胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:45之序列及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,其中構成胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。
在一個實施例中,分離之CAR分子進一步包含前導序列,例如本文所描述之前導序列。在一個實施例中,前導序列包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在另一態樣中,本發明係關於一種分離之CAR分子,其包含:前導序列,例如本文所描述之前導序列,例如SEQ ID NO:1或與其具有
95-99%一致性的前導序列;本文所描述之CD123結合域,例如包含本文所描述之LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3之CD123結合域,例如表2或表6中所描述之CD123結合域,或與其具有95-99%一致性的序列;鉸鏈區,例如本文所描述之鉸鏈區,例如SEQ ID NO:2或與其具有95-99%一致性的鉸鏈區;跨膜域,例如本文所描述之跨膜域,例如具有SEQ ID NO:6之序列或與其具有95-99%一致性的序列的跨膜域;胞內信號傳導域,例如本文所描述之胞內信號傳導域(例如,包含共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域)。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含共刺激域,例如本文所描述之共刺激域,例如具有SEQ ID NO:7之序列或與其具有95-99%一致性的4-1BB共刺激域;及/或主要信號傳導域,例如本文所描述之主要信號傳導域,例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列或與其具有95-99%一致性的CD3 ξ刺激域。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含共刺激域,例如本文所描述之共刺激域,例如具有SEQ ID NO:7之序列的4-1BB共刺激域;及/或主要信號傳導域,例如本文所描述之主要信號傳導域,例如具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列的CD3 ξ刺激域。
在一個實施例中,分離之CAR分子包含(例如,由其組成)以下各者之胺基酸序列:SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、
SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:156;或具有以下各者之胺基酸序列之至少一個、兩個、三個、四個、五個、10個、15個、20個或30個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過60、50或40個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列:SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:156;或與以下各者之胺基酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列:SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:156。
在一個態樣中,本發明係關於一種CD123結合域,其包含:本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3);及/或本文所描述之CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如包含一或多個(例如,全部三個)LC CDR及一或多個(例如,全部三個)HC CDR(例如,根據表3、表7、表10或表12之一個、兩個或三個HC CDR;及/或根據表4、表8、表11或表13之一個、兩個或三個LC CDR)之CD123結合域。
在其他實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在實施例中,CD123結合域進一步包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。在實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
在一些實施例中,CD123結合域包含表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3中之一者、兩者或全部,及表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3中之一者、兩者或全部。
在一個實施例中,CD123結合域包含本文所描述之輕鏈可變區(例如,在SEQ ID NO:275-278或302-333中)及/或本文所描述之重鏈可變區(例如,在SEQ ID NO:216-219或243-274中)。在一個實施例中,CD123結合域為包含SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483或485之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含:輕鏈可變區,其包含具有SEQ ID NO:275-
278或302-333中所提供之輕鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如,取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:275-278或302-333之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列;及/或重鏈可變區,其包含具有SEQ ID NO:216-219或243-274中所提供之重鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如取代,例如保守取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代,例如保守取代)之胺基酸序列,或與SEQ ID NO:216-219或243-274之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中,CD123結合域包含選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:480、SEQ ID NO:483及SEQ ID NO:485;或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,CD123結合域為scFv,且包含本文所描述之例如表2、表6或表9中之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子(例如,本文所描述之連接子)附接至包含本文所描述之例如表2、表6或表9中之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中,CD123結合域包括(Gly4-Scr)n連接子,其中n為1、2、3、
4、5或6,較佳為4(SEQ ID NO:26)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者:輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區,或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
本文所描述之核酸分子可為DNA分子、RNA分子或其組合。在一個實施例中,核酸分子為編碼如本文所描述之CAR多肽之mRNA。在其他實施例中,核酸分子為包括任一前述核酸分子之載體。
在另一態樣中,本發明係關於一種載體,其包含本文所描述之核酸分子,例如編碼本文所描述之CAR之核酸分子。在一個實施例中,載體選自由DNA分子或RNA分子組成之群(例如,質體、慢病毒載體、腺病毒載體或反轉錄病毒載體)。
在一個實施例中,載體為慢病毒載體。在一個實施例中,載體進一步包含啟動子。在一個實施例中,啟動子為EF-1啟動子。在一個實施例中,EF-1啟動子包含SEQ ID NO:11之序列。在另一實施例中,啟動子為PGK啟動子,例如如本文所描述之截短PGK啟動子。
在一個實施例中,載體為活體外轉錄載體,例如轉錄本文所描述之核酸分子之RNA的載體。在一個實施例中,載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾,例如本文所描述之聚A尾(例如,包含約150個腺苷鹼基(SEQ ID NO:705))。在一個實施例中,載體中之核酸序列進一步包含3'UTR,例如本文所描述之3'UTR,例如包含衍生自人類β-球蛋白的3'UTR之至少一個重複序列。在一個實施例中,載體中之核酸序列進一步包含啟動子,例如T2A啟動子。
在另一態樣中,本發明係關於一種細胞,其包含核酸分子或載體或表現如本文所描述之CAR多肽。在一個實施例中,細胞為本文所描述之細胞,例如免疫效應子細胞(例如,人類T細胞或NK細胞,例如如本文所描述之人類T細胞或NK細胞或其細胞群體)。在一個實施
例中,人類T細胞為CD8+ T細胞。在一些實施例中,細胞表現CAR核酸或多肽,或在某一時刻表現CAR核酸或多肽(例如,短暫表現之CAR分子)。
在一些實施例中,本文所描述之細胞(例如,表現CAR之細胞)可進一步表現另一試劑,例如增強表現CAR之細胞之活性的試劑。舉例而言,在一個實施例中,試劑可為包含抑制性分子或其結構域之嵌合分子。抑制性分子之實例包括例如如本文所描述之PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFRβ)。在一個實施例中,嵌合分子包含第一多肽,例如抑制性分子,其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所描述之胞內信號傳導域)相關聯。在一個實施例中,試劑包含:第一多肽,例如抑制性分子,諸如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFRβ),或此等中任一者之片段(例如,此等中任一者之胞外域之至少一部分);及第二多肽,其為本文所描述之胞內信號傳導域(例如,包含共刺激域(例如,如本文所描述之41BB、CD27或CD28)及/或主要信號傳導域(例如,本文所描述之CD3 ξ信號傳導域))。在一個實施例中,試劑包含PD1或其片段(例如,PD1之胞外域之至少一部分)之第一多肽,及本文所描述之胞內信號傳導域(例如,本文所描述之CD28信號傳導域及/或本文所描述之CD3 ξ信號傳導域)之第二多
肽。
在另一態樣中,本發明係關於一種製得細胞,例如免疫效應子細胞之方法。該方法包括將本文所描述之核酸分子(例如RNA分子,例如mRNA)或包含編碼CAR(例如,本文所描述之CAR)之核酸分子的載體引入(例如轉導至)免疫效應子細胞中。
本發明亦提供一種產生細胞(例如,短暫表現外源性RNA之經RNA工程改造之細胞)群體之方法。該方法包括將如本文所描述之RNA(例如,活體外轉錄RNA或合成RNA;編碼如本文所描述之CAR多肽的mRNA序列)引入細胞中。在實施例中,RNA短暫表現CAR多肽。在一個實施例中,細胞為如本文所描述之細胞,例如免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞或細胞群體)。
在另一態樣中,本發明係關於一種提供哺乳動物中抗腫瘤免疫之方法,其包含向哺乳動物投與有效量之表現CAR分子之細胞,例如表現本文所描述之CAR分子的細胞。在一個實施例中,細胞為自體免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞。在一個實施例中,細胞為同種異體免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞。在一個實施例中,哺乳動物為人類,例如患有血液癌之患者。
在另一態樣中,本發明係關於一種治療患有與CD123表現相關聯之疾病(例如,增殖性疾病、癌前病狀或與CD123表現相關聯之非癌症相關適應症)的哺乳動物之方法。該方法包括向哺乳動物投與有效量之表現CAR分子(例如,本文所描述之CAR分子)之細胞。在一個實施例中,哺乳動物為人類,例如患有血液癌之患者。
在一個實施例中,疾病為本文所描述之疾病。在一個實施例中,與CD123表現相關聯之疾病選自:增殖性疾病,諸如癌症或惡性腫瘤;癌前病狀,諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群
(myelodysplastic syndrome)或白血病前期;或與CD123表現相關聯之非癌症相關適應症。在一個實施例中,疾病為血液癌。在其他實施例中,疾病選自一或多種急性白血病,包括(但不限於)急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(B細胞急性淋巴白血病(B-cell acute lymphoid leukemia),BALL)及急性淋巴母細胞性T細胞白血病(T細胞急性淋巴白血病(T-cell acute lymphoid leukemia,TALL));骨髓發育不良症候群;骨髓增殖性贅瘤;組織細胞病症(例如,肥大細胞病症或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤);肥大細胞病症,例如全身性肥大細胞增多症或肥大細胞白血病;慢性骨髓白血病(CML);及母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤。在其他實施例中,與CD123表現相關聯之疾病包括(但不限於)表現CD123之非典型及/或非經典之癌症、惡性腫瘤、癌前病狀或增殖性疾病及其組合。
在一個實施例中,疾病選自以下各者中之一或多者:急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(B細胞急性淋巴白血病,BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(T細胞急性淋巴白血病(TALL))、B細胞前淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓白血病(CML)、毛細胞白血病、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、肥大細胞病症、組織細胞病症、骨髓發育不良症候群、骨髓增殖性贅瘤、漿細胞骨髓瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或其組合。在一個實施例中,疾病為白血病,例如ALL(例如,復發性及難治性ALL)或AML。在其他實施例中,疾病為CD19陰性癌症,例如CD19陰性復發性癌症。
在任一前述方法之一些實施例中,細胞(例如免疫效應子細胞之群體)包含載體,例如慢病毒載體,其包含編碼如本文所描述之CAR多肽之核酸分子。
在任一前述方法之其他實施例中,細胞(例如免疫效應子細胞之群體)包含編碼如本文所描述之CAR多肽之mRNA。在一個實施例中,細胞為表現CAR之經RNA工程改造的細胞之群體,例如短暫表現細胞之群體。
在任一前述方法之一些實施例中,該方法進一步包括向哺乳動物(例如,患有癌症、例如如本文所描述之血液癌(例如,AML或ALL)之哺乳動物)投與一或多個劑量之細胞(例如,含有如本文所描述之CAR核酸或CAR多肽之免疫細胞)。在一些實施例中,一或多個劑量之CAR細胞(例如,CD123CAR細胞)包含至少約1×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109或5×109個細胞。
在一個實施例中,投與至多10、9、8、7、6、5、4、3或2個劑量之細胞。在其他實施例中,例如以一週、兩週、三週、四週或四週以上之治療間隔向哺乳動物投與一種、兩種、三種、四種、五種或6個劑量之細胞。在一個實施例中,以兩週投與至多6個劑量。劑量可相同或不同。在一個實施例中,最初投與較低劑量,隨後一或多個較高劑量。在一個例示性實施例中,較低劑量為約1×105至1×109個細胞/kg或1×106至1×108個細胞/kg;且較高劑量為約2×105至2×109個細胞/kg或2×106至2×108個細胞/kg,隨後3-6個劑量之約4×105至4×109個細胞/kg或4×106至4×108個細胞/kg。
在一個實施例中,在一或多種淋巴細胞耗盡療法,例如淋巴細胞耗盡化學療法之後投與一或多個劑量之細胞。在一個實施例中,淋巴細胞耗盡療法包括化學療法(例如,環磷醯胺)。
在一個實施例中,一或多個劑量之後為細胞移植,例如同種異體造血幹細胞移植。舉例而言,同種異體造血幹細胞移植發生在約20天至約35天,例如約23天與約33天之間。
在一些實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)之群體與如本文所描述之一或多種治療劑或程序組合投與。
在一個實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)之群體與增加表現CAR分子之細胞的功效之試劑(例如,本文所描述之試劑)組合投與。
在一個實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)之群體與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑組合投與。儘管不希望受理論束縛,但咸信用低免疫增強劑量(例如,不足以完全抑制免疫系統但足以改善免疫功能之劑量)治療伴隨PD-1陽性T細胞減少或PD-1陰性細胞增加。PD-1陽性T細胞(而非PD-1陰性T細胞)可能藉由與表現PD-1配位體(例如,PD-L1或PD-L2)之細胞接合而衰竭。
在一實施例中,此方法可用於使個體中本文所描述之CAR細胞之效能最佳化。儘管不希望受理論束縛,但咸信,在一實施例中,內源性非修飾免疫效應子細胞(例如,T細胞)之效能提高。儘管不希望受理論束縛,但咸信,在一實施例中,表現CD123 CAR之細胞之效能提高。在其他實施例中,已或將工程改造以表現CAR之細胞(例如,T細胞)可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)數目或增加PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)/PD1陽性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸而經離體處理。
在一實施例中,起始投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑,例如立體異位抑制劑(例如,RAD001)或催化抑制劑,隨後投與本文所描述之表現CAR的細胞,例如T細胞或NK細胞。在一實施例中,在足夠時間或足夠劑量之mTOR抑制劑之後投與CAR細胞,使得PD1陰性免
疫效應子細胞(例如,T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)/PD1陽性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之比率已至少短暫增加。
在一實施例中,在足夠時間之後或在足夠給藥低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之後,採集經工程改造以表現CAR之細胞,例如免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞),使得個體中或自個體採集之PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)的含量或PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)/PD1陽性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之比率已至少短暫增加。
在一實施例中,本發明提供一種用於治療個體之mTOR抑制劑,其中該mTOR抑制劑增強該個體之免疫反應,且其中該個體已接收、正接收或即將接收表現如本文所描述之CD123 CAR之免疫效應子細胞。
在另一實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)群體與改善與表現CAR分子的細胞之投與相關聯之一或多種副作用的試劑(例如,本文所描述之試劑)組合投與。
在一個實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)群體與治療與CD123相關聯之疾病的試劑(例如,本文所描述之試劑)組合投與。
在一個實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)群體與第二治療劑或選自以下各者中之一或多者的程序組合投與:化學療法、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、手術程序、輻射程序、共刺激分子促效劑、免疫檢查點分子抑制劑、疫苗或基於第二CAR之免疫療法。
在一個實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文
所描述之CAR分子的細胞)群體與共刺激分子促效劑組合投與,例如共刺激分子促效劑選自以下各者中之一或多者:OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配位體或其組合。
在其他實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)群體與免疫檢查點分子抑制劑組合投與,免疫檢查點分子抑制劑選自以下各者中之一或多者:PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷、TGFR(例如,TGFR β)或其組合。
在一個實施例中,免疫檢查點分子抑制劑或共刺激分子促效劑為抗體分子,例如單特異性抗體分子或雙特異性抗體分子。舉例而言,細胞,例如免疫效應子細胞群體可與PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、CEACAM-1抑制劑或其組合進行組合投與。在一個實施例中,PD-1抑制劑與TIM-3抑制劑以組合形式投與。在其他實施例中,TIM-3抑制劑與CEACAM-1抑制劑以組合形式投與。
在一些實施例中,在投與細胞(例如,免疫效應子細胞群體)之後,例如在投與細胞(例如,免疫效應子細胞群體)之後約3-7天投與免疫檢查點分子抑制劑。
如本文實例中所描述,表現CAR123之免疫效應子細胞已展示為CD19陰性復發(例如,CD19陰性B-ALL)之有效治療。在不受理論束縛的情況下,CAR123抑制與CD19抑制(例如,表現CAR19之免疫效
應子細胞)之組合方法可用於治療CD19陽性疾病,同時延遲或預防抗原缺失復發。
因此,在任一前述方法之又其他實施例中,細胞(例如免疫效應子細胞群體)與CD19抑制劑(例如,如本文所描述之CD19抑制劑)組合投與。
在一些實施例中,CD19抑制劑為表現CD19 CAR之細胞或抗CD19抗體分子。在一個實施例中,疾病為白血病,例如ALL(例如,復發性及難治性ALL)。在其他實施例中,疾病為AML。在其他實施例中,疾病為CD19陰性癌症,例如CD19陰性復發性癌症。
或者提供一種預防哺乳動物(例如,患者)中CD19陰性復發之方法,或與任一前述方法組合。該方法包括投與有效量之細胞,例如免疫效應子細胞(例如,表現本文所描述之CAR分子的細胞)群體。在一些實施例中,該方法進一步包括投與CD19抑制劑,例如表現CD19CAR之細胞。在一些實施例中,疾病為白血病,例如急性淋巴母細胞性白血病(例如,復發性及難治性ALL)或AML。
在一些實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞群體在投與CD19抑制劑之前、並行或之後投與。在一個實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞群體在投與CD19之後投與。在其他實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞群體與CD19抑制劑並行投與。
在一些實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞群體表現CD19 CAR及CD123 CAR(例如,如本文所描述之CAR)。
在不希望受理論束縛的情況下,已發現某些白血病細胞(例如,B-ALL韌皮細胞)共表現CD19及CD123,而造血幹細胞(HSC)通常為CD123陽性(CD123+)但CD19陰性(CD19-)。為了靶向共表現CD19及CD123之白血病細胞(例如,B-ALL韌皮細胞)同時減量HSC,可在官能性胞內域於CAR19與CAR123之間分離時使用分裂CAR。相較於表
現CD19或CD123中之一者的細胞(例如HSC),此類CAR分子將優先在靶細胞共表現CD19及CD123(例如,B-ALL韌皮細胞)時使免疫細胞完全活化。
因此,在一些實施例中,CD19 CAR或CD123 CAR包含分裂胞內信號傳導域,使得與在CD19 CAR及CD123 CAR與表現CD19或CD123中之一者的靶細胞(例如,造血幹細胞)結合時活化相比,在CD19 CAR及CD123 CAR與靶細胞,例如靶CD19+CD123+細胞(例如,B-ALL母細胞)結合時發生細胞(例如,免疫效應子細胞群體)完全活化。在一個實施例中,CD123 CAR包含4-1BB信號傳導域且CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。CD123 CAR及CD19 CAR可視情況與例如一或多個肽裂解位點(諸如P2A)連接。
在又其他實施例中,本文所揭示之方法進一步包括在用細胞(例如,如本文所描述之免疫效應子細胞)治療後投與T細胞耗盡劑,藉此減少(例如,耗盡)表現CAR之細胞(例如,表現CD123 CAR之細胞)。此類T細胞耗盡劑可用於有效耗盡表現CAR之細胞(例如,表現CD123 CAR之細胞)以減輕毒性。
舉例而言,或者揭示一種在CAR療法(例如,本文所揭示之CAR123療法)之後減少(例如,耗盡)表現CAR之細胞的方法,或與本文所揭示之方法組合。該方法包括以減少(例如,耗盡)表現CAR之細胞之量向哺乳動物投與T細胞耗盡劑。在一些實施例中,T細胞耗盡劑在用細胞,例如免疫效應子細胞群體(例如,表現CAR之細胞群體)治療哺乳動物之後投與,藉此減少(例如,耗盡)細胞(例如,表現CAR之細胞)。
在一些實施例中,該方法進一步包括將細胞(例如,造血幹細胞)或骨髓移植至哺乳動物中。
在一些實施例中,哺乳動物患有白血病,例如急性淋巴母細胞
性白血病。
在一些實施例中,在投與本文所描述之細胞(例如,免疫效應子細胞群體)之後,T細胞耗盡劑投與一週、兩週、三週、四週或五週。
在一個實施例中,T細胞耗盡劑為例如藉由誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體誘導之細胞死亡使表現CAR之細胞耗盡之試劑。舉例而言,本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現由能夠誘導細胞死亡(例如,ADCC或補體誘導之細胞死亡)之分子識別之抗原(例如,靶抗原)。舉例而言,本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現能夠藉由抗體或抗體片段靶向之靶蛋白(例如,受體)。此類靶蛋白之實例包括(但不限於)EpCAM、VEGFR、整合素(例如,整合素ανβ3、α4、αI¾β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族之成員(例如,TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白(basigin)、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及EGFR,及其截短型式(例如,保存一或多個胞外抗原決定基但缺乏細胞質域內之一或多個區域的型式)。
在一些實施例中,表現CAR之細胞共表現CAR及靶蛋白,例如自然表現靶蛋白或經工程改造以表現靶蛋白。舉例而言,細胞,例如免疫效應子細胞群體可包括包含CAR核酸(例如,如本文所描述之CAR核酸)之核酸(例如,載體)及編碼靶蛋白之核酸。
在一個實施例中,T細胞耗盡劑為CD52抑制劑,例如抗CD52抗
體分子,例如阿侖單抗(alemtuzumab)。
在其他實施例中,細胞,例如免疫效應子細胞群體表現如本文所描述之CAR分子(例如,CD123 CAR)及由T細胞耗盡劑識別之靶蛋白。在一個實施例中,靶蛋白為CD20。在實施例中,當靶蛋白為CD20時,T細胞耗盡劑為抗CD20抗體,例如利妥昔單抗(rituximab)。
在任一前述方法之其他實施例中,該等方法進一步包括將細胞(例如,造血幹細胞)或骨髓移植至哺乳動物中。
在另一態樣中,本發明提供一種在細胞移植之前調理哺乳動物之方法。該方法包括向哺乳動物投與有效量之包含如本文所描述之CAR核酸或如本文所描述之多肽的細胞。在一些實施例中,細胞移植為幹細胞移植(例如,造血幹細胞移植)或骨髓移植。在其他實施例中,細胞移植之前調理個體包括減少個體中表現CD123之細胞,例如表現CD123之正常細胞或表現CD123之癌細胞的數目。
在另一態樣中,本發明係關於編碼本發明之CAR的分離之核酸分子、本發明之CAR的分離之多肽分子、包含本發明之CAR的載體及包含本發明之CAR的細胞例如如本文所描述作為藥物之用途(例如,用於治療與CD123表現相關聯之疾病)。
在另一態樣中,本發明係關於編碼本發明之CAR的分離之核酸分子、本發明之CAR的分離之多肽分子、包含本發明之CAR的載體及包含本發明之CAR的細胞用於治療表現CD123之疾病(例如,如本文所描述之表現CD123之疾病)。在某些實施例中,疾病為例如如本文所描述之血液癌。在一些實施例中,疾病選自急性白血病,包括(但不限於)急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(B細胞急性淋巴白血病,BALL)及急性淋巴母細胞性T細胞白血病(T細胞急性淋巴白血病(TALL));骨髓發育不良症候群;骨髓增殖性贅瘤;組織細胞病症(例如,肥大細胞病症或
母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤);肥大細胞病症,例如全身性肥大細胞增多症或肥大細胞白血病;慢性骨髓白血病(CML);或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤。
前述組合物及方法之額外特徵及實施例包括以下中之一或多者:在某些實施例中,CD123 CAR分子(例如,如本文所描述之CD123 CAR核酸或CD123 CAR多肽)或如本文所描述之CD123結合域包括:表3中所提供之來自重鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,HC CDR1、HC CDR2及/或HC CDR3);及/或表4中所提供之來自輕鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,LC CDR1、LC CDR2及/或LC CDR3)(例如,表3或表4中所提供之CAR123-1、CAR123-2、CAR123-3、CAR123-4之一個、兩個或三個HC CDR1、HC CDR2或HC CDR3及/或一個、兩個或三個LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3);或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多5、4、3、2或1個胺基酸改變,例如取代(例如,保守取代))之序列。
在某些實施例中,CD123 CAR分子(例如,如本文所描述之CD123 CAR核酸或CD123 CAR多肽)或如本文所描述之抗CD123抗原結合域包括:表10中所提供之來自重鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,HC CDR1、HC CDR2及/或HC CDR3);及/或表11中所提供之來自輕鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,表10或表11中所提供之CAR123-1、CAR123-2、CAR123-3、CAR123-4之一個、兩個或三個HC CDR1、HC CDR2或HC CDR3及/或一個、兩個或三個LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3);或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多5、4、3、2或1個胺基酸改變,例如取代(例如,保守取代))之序列。
在某些實施例中,CD123 CAR分子或抗CD123抗原結合域包括:
表12中所提供之來自重鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,HC CDR1、HC CDR2及/或HC CDR3);及/或表13中所提供之來自輕鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,表12或表13中所提供之CAR123-1、CAR123-2、CAR123-3、CAR123-4之一個、兩個或三個HC CDR1、HC CDR2或HC CDR3及/或一個、兩個或三個LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3);或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多5、4、3、2或1個胺基酸改變,例如取代(例如,保守取代))之序列。
在某些實施例中,CD123 CAR分子或抗CD123抗原結合域包括(i)表2、表6或表9中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3,或表4、表8、表11或表13中之LC CDR;及/或(ii)表2、表6或表9中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3,或表3、表7、表10或表12中之HC CDR。在某些實施例中,CD123 CAR分子(例如,如本文所描述之CD123 CAR核酸或CD123 CAR多肽)或如本文所描述之抗CD123抗原結合域包括:(1)選自以下各者中之一者的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR:(i)CAR123-1之SEQ ID NO:418之LC CDR1、SEQ ID NO:446之LC CDR2及SEQ ID NO:474之LC CDR3;(ii)CAR123-2之SEQ ID NO:419之LC CDR1、SEQ ID NO:447之LC CDR2及SEQ ID NO:475之LC CDR3;(iii)CAR123-3之SEQ ID NO:420之LC CDR1、SEQ ID NO:448之LC CDR2及SEQ ID NO:476之LC CDR3;(iv)CAR123-4之SEQ ID NO:421之LC CDR1、SEQ ID NO:449之
LC CDR2及SEQ ID NO:477之LC CDR3;及/或(2)選自以下各者中之一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR:(i)CAR123-1之SEQ ID NO:334之HC CDR1、SEQ ID NO:362之HC CDR2及SEQ ID NO:390之HC CDR3;(ii)CAR123-2之SEQ ID NO:335之HC CDR1、SEQ ID NO:363之HC CDR2及SEQ ID NO:391之HC CDR3;(iii)CAR123-3之SEQ ID NO:336之HC CDR1、SEQ ID NO:364之HC CDR2及SEQ ID NO:392之HC CDR3;(iv)CAR123-4之SEQ ID NO:337之HC CDR1、SEQ ID NO:365之HC CDR2及SEQ ID NO:393之HC CDR3。
在某些實施例中,CD123 CAR分子(例如,如本文所描述之CD123 CAR核酸或CD123 CAR多肽)或如本文所描述之抗CD123抗原結合域包括:(1)選自以下各者中之一者的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR:(i)CAR123-1之SEQ ID NO:501之LC CDR1、SEQ ID NO:506之LC CDR2及SEQ ID NO:511之LC CDR3;(ii)CAR123-2之SEQ ID NO:502之LC CDR1、SEQ ID NO:507之LC CDR2及SEQ ID NO:512之LC CDR3;(iii)CAR123-3之SEQ ID NO:503之LC CDR1、SEQ ID NO:508之LC CDR2及SEQ ID NO:513之LC CDR3;(iv)CAR123-4之SEQ ID NO:504之LC CDR1、SEQ ID NO:509之LC CDR2及SEQ ID NO:514之LC CDR3;及/或(2)選自以下各者中之一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR:(i)CAR123-1之SEQ ID NO:486之HC CDR1、SEQ ID NO:491之
HC CDR2及SEQ ID NO:496之HC CDR3;(ii)CAR123-2之SEQ ID NO:487之HC CDR1、SEQ ID NO:492之HC CDR2及SEQ ID NO:497之HC CDR3;(iii)CAR123-3之SEQ ID NO:488之HC CDR1、SEQ ID NO:493之HC CDR2及SEQ ID NO:498之HC CDR3;(iv)CAR123-4之SEQ ID NO:489之HC CDR1、SEQ ID NO:494之HC CDR2及SEQ ID NO:499之HC CDR3。
在某些實施例中,CD123 CAR分子(例如,如本文所描述之CD123 CAR核酸或CD123 CAR多肽)或如本文所描述之抗CD123抗原結合域包括:(1)選自以下各者中之一者的一個、兩個或三個輕鏈(LC)CDR:(i)CAR123-1之SEQ ID NO:531之LC CDR1、SEQ ID NO:536之LC CDR2及SEQ ID NO:541之LC CDR3;(ii)CAR123-2之SEQ ID NO:532之LC CDR1、SEQ ID NO:537之LC CDR2及SEQ ID NO:542之LC CDR3;(iii)CAR123-3之SEQ ID NO:533之LC CDR1、SEQ ID NO:538之LC CDR2及SEQ ID NO:543之LC CDR3;(iv)CAR123-4之SEQ ID NO:534之LC CDR1、SEQ ID NO:539之LC CDR2及SEQ ID NO:544之LC CDR3;及/或(2)選自以下各者中之一者的一個、兩個或三個重鏈(HC)CDR:(i)CAR123-1之SEQ ID NO:516之HC CDR1、SEQ ID NO:521之HC CDR2及SEQ ID NO:526之HC CDR3;(ii)CAR123-2之SEQ ID NO:517之HC CDR1、SEQ ID NO:522之HC CDR2及SEQ ID NO:527之HC CDR3;(iii)CAR123-3之SEQ ID NO:518之HC CDR1、SEQ ID NO:523
之HC CDR2及SEQ ID NO:528之HC CDR3;(iv)CAR123-4之SEQ ID NO:519之HC CDR1、SEQ ID NO:524之HC CDR2及SEQ ID NO:529之HC CDR3。
除非另外定義,否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料的方法及材料可用於實踐或測試本發明,但下文描述適合方法及材料。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。另外,材料、方法及實例僅為說明性且並不意欲為限制。標題、子標題或編號或標上字母之要素,例如(a)、(b)、(i)等,僅為易於閱讀而呈現。此文獻中標題或編號或標上字母之要素的使用不需要步驟或要素以字母次序來進行,或步驟或要素彼此必定為離散的。本發明之其他特徵、目標及優點將自實施方式及圖式及自申請專利範圍顯而易知。
本發明之較佳實施例之以下詳細描述將在結合附圖閱讀時受到更好理解。出於說明本發明之目的,在圖式中展示當前較佳之實施例。然而,應理解,本發明不限於圖式中所展示之實施例之精確配置及手段。
圖1展示如藉由FACS評估且報導為展示信號高於使用蛋白質L作為偵測試劑的未轉導(CAR陰性)細胞中信號含量之細胞的百分比之經抗CD123 CAR構築體轉導之JNL細胞中CAR表現之圖示。
圖2A至圖2C展示JNL細胞中CD123 CAR活性之圖示。使用含有由NFAT啟動子驅動之螢光素酶報導子之Jurkat細胞株(稱為JNL細胞)評估抗CD123 CAR構築體之活性。CAR活性量測為此NFAT驅動之報導子的活化。
圖3展示初級T細胞中CD123 CAR表現之圖示。藉由使用蛋白質L
作為偵測試劑在BD LSRFortessa或BD-FACSCanto上之流動式細胞檢測分析來測定轉導之細胞(細胞表面上表現抗CD123 CAR)與其相對螢光強度表現之百分比。信號高於未染色細胞之來自彼FACS的相對螢光強度之閘控直方圖展示轉導之T細胞之百分比。轉導導致CAR陽性細胞之範圍為12-42%。
圖4展示CD123-CART介導之細胞殺死之圖示。T細胞殺死導向穩定表現螢光素酶之表現CD123之MOLM13急性骨髓性白血病細胞。未轉導之T細胞用於確定非特異性背景殺死量。當效應子定義為表現抗CD123嵌合受體之T細胞時,CART-CD123之細胞溶解活性在4:1之效應子:靶細胞比率及T細胞2倍向下稀釋之範圍內量測。藉由混合適當數目之T細胞與恆定數目之靶細胞來起始分析。20小時後,使用Bright-GloTM螢光素酶分析在EnVision儀器上量測螢光素酶信號。
圖5A與圖5B展示具有CD123-CAR之T細胞之轉導效率。圖5A展示具有1172及1176之T細胞之轉導效率。圖5B展示具有CD123 CAR 2-4之T細胞之轉導效率。
圖6展示CD123 CAR 2-4及1172及1176之流動式細胞量測術用於確定CD4:CD8比率。
圖7-1至圖7-3展示CD123 CAR2-4及351172及1176在暴露於CD123+腫瘤細胞之後之脫粒。
圖8展示螢光素酶分析用於評估CART細胞(NVS 2-4、1172及1176純系)對腫瘤靶細胞(MOLM14)之細胞毒性之圖示。
圖9展示注射有表現螢光素酶之MOLM14細胞之NSG小鼠中腫瘤負荷在D6(CART注射之前)及在第13天(6天注射有NVS 2-4、1172或1176純系後)或在第20天之比較。
圖10展示霍奇金氏淋巴瘤細胞株HDLM-中之CD30及CD123之表現。
圖11A至圖11B展示經由偵測dsRed、CD123藉由T2A共表現之替代標記而經pELNS抗CD123-41BB-CD3ζ轉導之T細胞中之CD123 CAR表現。dsRed經由流動式細胞量測術偵測。
圖12展示4個霍奇金氏淋巴瘤細胞株(HDLM2、KMH2、L428、SUPHD1)、CD123+ MOLM14(陽性對照)及A375(陰性對照)中之CD123表現之Q-PCR。GUSB用作管家基因。Ct臨限值為40。
圖13展示IL3抗體對霍奇金氏淋巴瘤之活體內模型之作用。過度表現包括IL-3(NSG-S小鼠)之人類細胞激素之NOD-SCID-γ鏈KO小鼠移植有表現螢光素酶之HDLM-2細胞株。靜脈內注射之後,贅生性細胞逐漸形成散播性軟組織腫塊。連續注射中和抗IL3抗體減緩腫瘤生長。
圖14展示CD107a脫粒分析。未轉導之T細胞(UTD)或CART123與HDLM-2(CD123+ HL細胞株)以5個靶細胞與1個T細胞之比率在抗CD28抗體、抗CD49d抗體及莫能菌素存在下一起培育4小時。抗CD30 CAR T細胞用作額外對照。CART123而非UTD展示如藉由流動式細胞量測術偵測之CD107a脫粒增加。
圖15展示圖20中所展示之脫粒分析之圖示。
圖16說明表現CD123 CAR之T細胞展示內細胞質細胞激素產量(IL-2、TNF)顯著增加。
圖17說明CART123而非UTD展示如藉由基於螢光素酶之24hr殺死分析中之生物發光減少所展示之劑量依賴性殺死。T細胞與螢光素酶+ HDML-2細胞以不同比率(0.3:1至10:1)共培育。
圖18展示CART123與CART30細胞而非UTD之增殖分析,展示在與霍奇金氏淋巴瘤細胞株共培養時穩固增殖。T細胞與HL細胞株(CD123+)或對照(Jurkat CD123-、MOLM-14 CD123+)或PMA/離子黴素(陽性對照)或細胞培養基(陰性對照)在5天T細胞增殖分析中一起培
育。
圖19A至圖19D展示誘導IFNg(圖19A)、IL-2(圖19B)、TNFa(圖19C)及MIP1b(圖19D)路明克斯(luminex)MFI之穩固產量之CART123。
圖20展示霍奇金氏淋巴瘤之活體內模型之示意性圖示。在第0天靜脈內注射1百萬個螢光素酶+ HDML-2細胞。隨後進行所展現之連續生物發光成像(BLI)以觀測腫瘤水準。在第7天觀測到低腫瘤水準,隨後腫瘤負荷在大約6週內逐漸增加,再現人類疾病之惰性性質。在第43天當腫瘤負荷高於基線20倍時,小鼠經150萬個CART123細胞或對照T細胞治療。
圖21展示根據圖28中之示意圖,BLI用於偵測經CART123細胞(對照T細胞)治療或未經治療之小鼠中在數天注射後之HDLM-2。
圖22展示根據圖28中所展示之示意圖經治療之小鼠的存活率,CART123在14天內誘導散播性腫瘤之完全且持久根除,導致100%無復發且在6個月100%總存活率。
圖23展示連續周邊血液出血中如藉由流動式細胞量測術偵測到腫瘤消除與廣泛CAR T細胞擴增之間的關聯。擴增之T細胞為大約50% CD8及50% CD4細胞。T細胞數目隨時間推移隨著腫瘤負荷降低而縮小。
圖24包含圖24A、圖24B及圖24C,為展示在與靶細胞MOLM13、PL21及U87以所指示比率培養時表現CAR123構築體(CD123-2、CD123-3及CD123-4)之T細胞的細胞激素產量之柱狀圖。圖24A展示IL-2之產量;圖24B展示IFN-γ之產量;且圖24C展示TNF-α之產量。
圖25為展示表現CAR123-2之慢病毒轉導T細胞(LV CAR123-2)或對照抗GH在靶細胞MOLM13(其表現CD123)、K562-人類CD123(其表現人類CD123)或K562(其不表現CD123)存在下培養時之增殖能力
之條形圖。
圖26包含圖26A、26B及26C,展示表現CAR123 CAR之慢病毒轉導T細胞(LV CAR123-2)或對照(抗GH)或未轉導之細胞(UTD)在各種靶細胞:效應子細胞比率下在靶細胞為表現CD123之MOLM13(圖26A)或PL21(圖26B)細胞或CD123陰性U87細胞(圖26C)時殺死靶細胞之能力。
圖27包含圖27A及圖27B,為展示表現CAR123之慢病毒轉導T細胞(LV CAR123-2)或對照(抗GH)在靶細胞MOLM13(其表現CD123)及U87(其不表現CD123)存在下培養時之細胞激素產量之圖。圖27A展示IFNγ及TNFα之細胞激素產量;圖27B展示IL-2之細胞激素產量。
圖28展示霍奇金淋巴瘤之活體內小鼠模型中之腫瘤負荷,其中攜有腫瘤之小鼠被投與表現以下各種CAR123構築體之T細胞:1172、1176、NVS2(在本文中亦稱為CAR123-2)、NVS3(在本文中亦稱為CAR123-3)及NVS4(在本文中亦稱為CAR123-4)。量測在第6天、第14天、第20天及第27天之腫瘤負荷且藉由生物發光成像(BLI)表示。
圖29展示活體內小鼠模型中之腫瘤負荷,其中攜有腫瘤之小鼠被投與表現以下各者之T細胞:自慢病毒載體引入之CAR123-2(CART123 LV)、引入作為RNA之CAR123-2(CART123 RNA(NVS))及引入作為RNA之工具CAR123(CART123 RNA(Penn))。未轉導之T細胞用作對照(UTD)。腫瘤負荷藉由生物發光成像(BLI)單元表示。
圖30包含圖30A、圖30B、圖30C及圖30D,展示活體內小鼠模型中之腫瘤之生物發光成像。圖30A展示投與未轉導之細胞的小鼠;圖30B展示投與表現RNA CAR123-2之T細胞的小鼠;圖30C展示投與表現CAR123-2之慢病毒轉導T細胞的小鼠;圖30D展示投與表現RNA工具CAR123之T細胞的小鼠。
圖31包含圖31A、圖31B、圖31C、圖31D、圖31E及圖31F,展示
CART19治療後發生之CD19陰性B細胞急性淋巴母細胞性白血病復發中高度表現CD123。圖31A展示42個復發性/難治性ALL樣本中CD123與CD19相比之表現。圖31B展示B-ALL母細胞中之CD123與CD19共表現。母細胞閘控(SSC低,單重態,活的,CD45弱)。圖31C展示白血病幹細胞(LSC)之閘控策略。此亞群中高度表現CD123。圖32D展示CD123與CD19共表現及來自FISH分析之結果。圖31E及圖31F展示在基線或在復發之後CD19表現與CD123表現之比較。
圖32包含圖32A、圖32B、圖32C、圖32D、圖32E及圖32F,展示來自使用表現CD19 CAR(CAR19)或CD123 CAR(CAR123)之T細胞之各種活體外分析之結果。圖32A展示CD19及CD123表現;圖32B展示CD107a脫粒分析;圖32C展示靶細胞殺死能力;圖32D及圖32E展示增殖能力;圖32F展示所指示細胞激素之細胞激素產量。
圖33包含圖33A、圖33B及圖33C,展示表現CD19 CAR(CAR19)或CD123 CAR(CAR123)之CART細胞在活體內小鼠模型中具有抗腫瘤作用。圖33A展示藉由生物發光成像表示之腫瘤負荷;圖33B展示接收CART療法之小鼠之總存活率曲線;且圖33C展示周邊血液中CART123細胞之擴增。
圖34包含圖34A、圖34B、圖34C、圖34D、圖34E及圖34F,展示抗原缺失復發之活體內小鼠模型中CART123為活性的。圖34A展示實驗概要;圖34B展示相對於CD19表現(頂部圖)及回應於用CART19療法治療(底部圖)之如藉由基線中之生物發光成像表示之疾病進展及復發疾病;圖34C展示投與未轉導之T細胞或CART19細胞之小鼠的生物發光影像;圖34D展示經CART19或CART123治療之實驗概要;圖34E展示疾病進展;且圖34F展示經治療小鼠之總存活率。
圖35包含圖35A、圖35B及圖35C,展示異種移植小鼠之顱骨骨髓中之ALL-CART相互作用。圖35A展示實驗概要;圖35B展示CART19
細胞之代表性多光子XY平面影像,及與經工程改造以表現CD19及CD123或單獨CD123之ALL腫瘤相互作用之CART123細胞(運動細胞指示於虛線圓圈中,非運動細胞用箭頭指示);且圖35C為顯微鏡影像之圖示。
圖36包含圖36A、圖36B及圖36C,展示使用CART19及CART123預防CD19陰性復發。圖36A展示實驗概要;圖36B展示經未轉導之T細胞(頂部圖)、CART19(中間圖)或CART19與CART123之組合(底部圖)治療之小鼠的疾病進展(如藉由BLI表示之腫瘤負荷);且圖36C展示來自此實驗之總存活率。
圖37包含圖37A及圖37B,展示表現CAR19及CAR123之T細胞(圖37A)及來自脫粒分析之結果(圖37B)。
圖38包含圖38A及圖38B,展示ALL母細胞之特徵化。圖38A展示各種標記CD19、CD123、CD10、CD34及CD20之表現;且圖38B展示用於分選CD19-CD123+細胞之閘控策略。
圖39包含圖39A、圖39B、圖39C及圖39D,展示CART123之抗白血病活性。圖39A展示NALM6細胞上CD19及CD123之表現;圖39B展示回應於CART19或CART123療法之腫瘤負荷(如藉由BLI表示);圖39C展示投與CART19或CART123之小鼠之總存活率;且圖39D展示投與不同劑量之CART123的小鼠之總存活率。
圖40包含圖40A及圖40B,展示抗原缺失復發之活體內模型之特徵化。圖40A展示CD19陰性復發疾病中之CD123表現;且圖40B展示在用基線或復發細胞活體外培養時CART19或CART123細胞之脫粒分析。
圖41包含圖41A、圖41B及圖41C,展示初級AML細胞上PD1 L1之表現(圖41A)及T細胞上PD1(圖41B)及TIM3(圖41C)之表現。
圖42包含圖42A、圖42B、圖42C及圖42D,展示CD8+ T細胞上免
疫檢查點PD1(圖42A)、TIM3(圖42B)、LAG3(圖42C)及CTLA4(圖42D)之表現。
圖43展示AML基線(左)及復發性(右)樣本之TIM3表現之流動式細胞量測術分析。
圖44展示與用未轉導(UTD)細胞治療相比CART123治療之後之腫瘤負荷(藉由生物發光成像表示,光子/秒)。
圖45展示CD123治療之後緩解或復發之後異種移植物之T細胞上TIM3及PD1之表現。
圖46包含圖46A及圖46B,展示在與檢查點抑制劑,例如PD1抑制劑、TIM3抑制劑、PD1與TIM3抑制劑之組合或TIM3與CEACAM-1抑制劑之組合共培養之後來自復發性小鼠之骨髓的特徵化。在不存在(圖46A)或存在(圖46B)PMA/IONO下偵測表現GMCSF、IFNg、Ki67及MIP1b之T細胞之百分比。
圖47展示用未轉導之細胞及PD1抑制劑或TIM3抑制劑治療AML異種移植物之實驗概要。
圖48展示圖47中所描繪之實驗之腫瘤負荷(藉由BLI表示,光子/秒)。
圖49展示用CART123與TIM3及/或PD1抑制劑之組合來治療AML異種移植物之實驗概要。
圖50包含圖50A、圖50B、圖50C及圖50D,展示圖49中所描繪之實驗之腫瘤負荷(藉由BLI表示,光子/秒)。圖50A比較CART123與CART123與PD1抑制劑之組合;圖50B比較CART123與CART123與PD1抑制劑及TIM3抑制劑之組合;圖50C比較CART123與CART123與TIM3抑制劑之組合,且圖50D展示圖50A至圖50C中所呈現之資料之代表性曲線圖。
圖51包含圖51A、圖51B、圖51C、圖51D及圖51E,展示單個載
體之各種組態,例如其中U6調控之shRNA位於EF1 α調控之CAR編碼要素之上游或下游。在圖51A及圖51B中所描繪之例示性構築體中,轉錄經由U6及EF1 α啟動子在相同方向上進行。在圖51C及圖51D中所描繪之例示性構築體中,轉錄經由U6及EF1 α啟動子在不同方向上進行。在圖51E中,shRNA(及相應U6啟動子)在第一載體上,且CAR(及相應EF1 α啟動子)在第二載體上。
圖52描繪兩種例示性RCAR組態之結構。抗原結合成員包含抗原結合域、跨膜域及開關域。胞內結合成員包含開關域、共刺激信號傳導域及主要信號傳導域。兩種組態說明本文所描述之第一與第二開關域可相對於抗原結合成員及胞內結合成員呈不同定向。本文進一步描述其他RCAR組態。
圖53展示在細胞培養系統中表現CAR之轉導T細胞之增殖藉由低劑量RAD001增強。CART與Nalm-6細胞在不同濃度RAD001存在下共培養。在共培養4天後評估CAR陽性之CD3陽性T細胞(黑色)及總T細胞(灰色)之數目。
圖54描繪在以0.3、1、3及10mg/kg(mpk)每日RAD001劑量或媒劑劑量之情況下NALM6-luc細胞之腫瘤生長量測。圓圈指示媒劑;正方形指示10mg/kg劑量之RAD001;三角形指示3mg/kg劑量之RAD001,倒三角形指示1mg/kg劑量之RAD001;且菱形指示0.3mg/kg劑量之RAD001。
圖55包含圖55A及圖55B,展示顯示患有NALM6腫瘤之NSG小鼠的血液中RAD001之量之藥物動力學曲線。圖55A展示第一次給藥RAD001之後第0天PK。圖55B展示最終RAD001給藥之後第14天PK。菱形指示10mg/kg劑量之RAD001;正方形指示1mg/kg劑量之RAD001;三角形指示3mg/kg劑量之RAD001;且x指示10mg/kg劑量之RAD001。
圖56包含圖56A及圖56B,展示具有及不具有RAD001給藥之人類化CD19 CART細胞之活體內增殖。每日低劑量RAD001(0.003mg/kg)導致CAR T細胞增殖增強,超過huCAR19增殖之正常水準。圖56A展示CD4+ CAR T細胞;圖56B展示CD8+ CAR T細胞。圓圈指示PBS;正方形指示huCTL019;三角形指示使用3mg/kg RAD001之huCTL019;倒三角形指示使用0.3mg/kg RAD001之huCTL019;菱形指示使用0.03mg/kg RAD001之huCTL019;且圓圈指示使用0.003mg/kg RAD001之huCTL019。
圖57為終止CART123活性之策略中表現CAR123及CD20之慢病毒載體之向量圖,其中CAR123序列與CD20序列藉由P2A序列連接。
圖58展示CART123細胞相比於CART123 P2A CD20細胞之CD107脫粒分析結果。
圖59包含圖59A、圖59B、圖59C及圖59D,展示CART123細胞與CART123 P2A CD20細胞相比之GM-CSF(圖59A)、TNFα(圖59B)、IFNγ(圖59C)及IL-2(圖59D)之產量。
圖60展示在以所指示之效應子:靶細胞比率培育時CART123細胞與CART123 P2A CD20細胞相比之細胞毒性能力(如由%比溶胞率表示)。
圖61包含圖61A及圖61B,展示對CART123細胞(圖61A)及CART123 P2A CD20細胞(圖61B)用所指示劑量之利妥昔單抗治療後之T細胞耗盡。
圖62展示在15%補體存在下對CART123 P2A CD20細胞用所指示劑量之利妥昔單抗治療後之T細胞耗盡。
圖63包含圖63A及圖63B,說明表現CAR19及CAR123之雙CART細胞之策略。圖63A為含有經由P2A序列連接之CAR19與CAR123之向量圖。圖63B展示表現CAR19、CAR123(Q3)及CAR19(Q1)與CAR123
(Q2)兩者之細胞之百分比。
圖64包含圖64A及圖64B,說明表現CAR19及CAR123之分裂CART細胞之策略。圖64A為含有經由P2A序列連接之CAR19與CAR123之向量圖。CAR19包括CD3ζ域,而CAR123包括4-1BB域。圖64B展示表現CAR19、CAR123(Q3)及CAR19(Q1)與CAR123(Q2)兩者之細胞之百分比。
圖65展示初級HSC、AML及BPDCN樣本上之CD123表現。
圖66包含圖66A及圖66B,展示在表現CD123之靶細胞存在下以所指示之效應子:標靶比率培育時CART123純系32716(圖66A)及26292(圖66A)之細胞毒性分析。
圖67展示CART123細胞與HSC一起培育相較於與BPDCN一起培育時之CD107脫粒分析。
圖68包含圖68A及圖68B,展示如藉由經同型抗體(圖68A)(作為對照)或CD123抗體(圖68B)染色所偵測之來自患有肥大細胞白血病/全身性肥大細胞增多症之患者的血液之單核細胞上的CD123表現。
圖69包含圖69A及圖69B,展示CD107脫粒分析,其中CART123細胞單獨與PMA及離子黴素(圖69A)或與來自患有肥大細胞白血病/全身性肥大細胞增多症之患者的血液之單核細胞(圖69B)培養。
圖70展示在患有難治性或復發性AML之個體中投與RNA CART123之臨床研究中個體群1之實驗概要。
圖71展示在患有難治性或復發性AML之個體中投與RNA CART123之臨床研究中個體群2之實驗概要。除了CART療法之外,此等患者還接收淋巴細胞耗盡化學療法之給藥。
圖72包含圖72A、圖72B及圖72C,展示MOLM14異種移植模型中用慢病毒轉導之CART123細胞治療後使用抗CD52抗體阿侖單抗進行T細胞消融之結果。在第1週向小鼠投與CART123細胞或未轉導(UTD)
細胞。在第2週、第3週或第4週向接收CART123細胞之小鼠投與阿侖單抗,且評估24週之腫瘤負荷。在12週引入「MOLM14」再攻擊。圖72A展示如藉由生物發光成像(光子/秒)偵測之腫瘤負荷;圖72B展示周邊血液中偵測到的CART細胞之百分比;且圖72C展示總存活率。
圖73包含圖73A及圖73B,展示兒科AML異種移植模型中用慢病毒轉導之CART123細胞治療後使用阿侖單抗進行T細胞消融之結果。在初級AML細胞移植(第0週)之後6週向小鼠投與CART123細胞或未轉導(UTD)細胞。在第4週向接收CART123治療之小鼠投與阿侖單抗。圖73A展示如藉由生物發光成像(光子/秒)偵測之腫瘤負荷;圖73B展示周邊血液中偵測到的CART細胞之百分比。
圖74包含圖74A及圖74B,展示如圖73中所進行,在CART123及阿侖單抗治療之後脾(圖74A)及骨髓(圖74B)中之AML細胞之分析。
圖75展示三種終止策略之比較:(1)藉由阿侖單抗治療進行CART細胞消融;(2)CAR/CD20共表現於T細胞中且藉由利妥昔單抗消融;及(3)AML異種移植模型中之腫瘤負荷(藉由生物發光成像表示,光子/秒)上之RNA電穿孔CART細胞。
除非另外定義,否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明有關技術者通常理解之含義相同的含義。
術語「一(a/an)」係指冠詞之一個或一個以上(亦即,至少一個)語法對象。藉助於實例,「要素」意謂一個要素或一個以上要素。
當涉及諸如量、暫態持續時間及其類似物之可量測值時,術語「約」意欲涵蓋相較於指定值±20%,或在一些情況下±10%,或在一些情況下±5%,或在一些情況下±1%,或在一些情況下±0.1%之變化,因為此類變化適合於進行所揭示之方法。
術語「嵌合抗原受體」或者「CAR」係指包含至少胞外抗原結合域、跨膜域及包含來源於如下所定義之刺激分子之功能性信號傳導域之細胞質信號傳導域(在本文中亦稱為「胞內信號傳導域」)的重組多肽構築體。在一些實施例中,CAR多肽構築體中之結構域在相同多肽鏈中,例如包含嵌合融合蛋白。在一些實施例中,CAR多肽構築體中之結構域不彼此鄰接,例如在不同多肽鏈中,例如如本文所描述之RCAR中所提供。
在一個態樣中,CAR之刺激分子為與T細胞受體複合物締合之ξ鏈。在一個態樣中,細胞質信號傳導域包含主要信號傳導域(例如,CD3-ξ之主要信號傳導域)。在一個態樣中,細胞質信號傳導域進一步包含一或多個來源於至少一個如下所定義之共刺激分子的功能性信號傳導域。在一個態樣中,共刺激分子選自4-1BB(亦即,CD137)、CD27、ICOS及/或CD28。在一個態樣中,CAR包含嵌合融合蛋白,該蛋白包含胞外抗原識別域、跨膜域及包含來源於刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個態樣中,CAR包含嵌合融合蛋白,該蛋白包含胞外抗原識別結合域、跨膜域及包含來源於共刺激分子之功能性信號傳導域及來源於刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個態樣中,CAR包含嵌合融合蛋白,該蛋白包含胞外抗原識別域、跨膜域及包含兩個來源於一或多個共刺激分子之功能性信號傳導域及一個來源於刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個態樣中,CAR包含嵌合融合蛋白,該蛋白包含胞外抗原識別域、跨膜域及包含至少兩個來源於一或多個共刺激分子之功能性信號傳導域及一個來源於刺激分子之功能性信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個態樣中,CAR在CAR融合蛋白之胺基端(N端)包含視情況存在之前導序列。在一個態樣中,CAR在胞外抗原識別域之N端進一步包含前導序列,其中前導序列在細胞處理及CAR定位至細胞膜
期間視情況自抗原識別域(例如,aa scFv)裂解。
包含特異性結合特定腫瘤標記X之抗原結合域(例如,scFv、單域抗體或TCR(例如,TCR α結合域或TCR β結合域))的CAR亦稱為XCAR,其中X可為如本文所描述之腫瘤標記。舉例而言,包含特異性結合CD123之抗原結合域的CAR稱為CD123 CAR。CAR可在任何細胞,例如如本文所描述之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)中表現。
術語「信號傳導域」係指藉由在細胞內傳輸資訊以藉由產生第二信使或藉由回應於此類信使充當效應子經由所定義之信號傳導路徑調控細胞活性而起作用之蛋白質功能部分。
如本文所用,術語「IL-3受體之α次單元」、「IL3Rα」、「CD123」、「IL3Rα鏈」及「IL3Rα次單元」可互換地指已知可在白血病前驅體細胞上偵測之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可在諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot之公共資料庫中找到。舉例而言,人類IL3Rα之胺基酸序列可在寄存編號NP 002174處找到,且編碼人類IL3Rα之核苷酸序列可在寄存編號NM 005191處找到。在一個態樣中,CAR之抗原結合部分辨識且結合CD123蛋白之胞外域內之抗原決定基。在一個態樣中,CD123蛋白在癌細胞上表現。如本文所用,「CD123」包括包含全長野生型CD123之突變(例如,點突變)、片段、插入、缺失及剪接變異體之蛋白質。
如本文所用之術語「抗體」係指蛋白質或來源於特異性結合抗原之免疫球蛋白分子的多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整之免疫球蛋白,且可來源於天然來源或重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子之四聚體。
術語「抗體片段」係指完整抗體或其重組變異體之至少一個部分,且指足以使抗體片段識別且特異結合諸如抗原之靶的抗原結合
域,例如完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段;scFv抗體片段;線性抗體;單域抗體,諸如sdAb(VL或VH)、駱駝VHH域;及由抗體片段形成之多特異性抗體,抗體片段諸如在鉸鏈區及分離之CDR包含藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段或抗體之其他抗原決定基結合片段。抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體(maxibody)、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體(intrabody)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv中(參見例如Hollinger及Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原結合片段亦可移植至基於多肽之骨架,諸如III型纖維結合蛋白(Fn3)(參見美國專利第6,703,199號,其描述纖維結合蛋白多肽微型抗體)。
術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白,其中輕鏈及重鏈可變區經由短的可撓性多肽連接子連續連接且能夠表現為單鏈多肽,且其中scFv保留其所來源之完整抗體的特異性。除非指定,否則如本文所用,scFv可例如相對於多肽之N端及C端末端具有任何次序之VL及VH可變區,scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
如本文所用之術語「互補決定區」或「CDR」係指在抗體可變區內之胺基酸序列,其賦予抗原特異性及結合親和力。舉例而言,一般各重鏈可變區中存在三個CDR(例如,HCDR1、HCDR2及HCDR3)且各輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)。給定CDR之精確胺基酸序列邊界可使用多種熟知方案中之任一者確定,該等方案包括由Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案);Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號方案)所描述之方案或
其組合。根據Kabat編號方案,在一些實施例中,重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3);且輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)。根據Chothia編號方案,在一些實施例中,VH中之CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)及95-102(HCDR3);且VL中之CDR胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)及91-96(LCDR3)。在組合之Kabat與Chothia編號方案中,在一些實施例中,CDR對應於作為Kabat CDR、Chothia CDR或兩者之一部分的胺基酸殘基。舉例而言,在一些實施例中,CDR對應於VH(例如哺乳動物VH,例如人類VH)中之胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3);及VL(例如哺乳動物VL,例如人類VL)中之胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)。
本發明之包含抗體或其抗體片段之CAR組合物之部分可以多種形式存在,其中抗原結合域表示為鄰接多肽鏈之一部分,包括例如單域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)及人類化或人類抗體(Harlow等人,1999,於:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY中;Harlow等人,1989,於:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York中;Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一個態樣中,本發明之CAR組合物之抗原結合域包含抗體片段。在另一態樣中,CAR包含含scFv之抗體片段。
如本文所用,術語「結合域」或「抗體分子」(在本文中亦稱為「抗靶(例如,CD123)結合域」)係指蛋白質,例如免疫球蛋白鏈或其片段,包含至少一個免疫球蛋白可變域序列。術語「結合域」或「抗體分子」涵蓋抗體及抗體片段。在一個實施例中,抗體分子為多特異
性抗體分子,例如其包含複數個免疫球蛋白可變域序列,其中該多者中之第一免疫球蛋白可變域序列具有針對第一抗原決定基之結合特異性,且該多者中之第二免疫球蛋白可變域序列具有針對第二抗原決定基之結合特異性。在一個實施例中,多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對於不超過兩個抗原具有特異性。雙特異性抗體分子之特徵為具有針對第一抗原決定基之結合特異性的第一免疫球蛋白可變域序列及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的第二免疫球蛋白可變域序列。
術語「抗體重鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中且通常決定抗體所屬類別的兩種類型多肽鏈中之較大者。
術語「抗體輕鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中的兩種類型多肽鏈中之較小者。卡帕(κ)及拉姆達(λ)輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。
術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體,諸如由噬菌體或酵母表現系統所表現之抗體。該術語亦應理解為意謂已藉由合成編碼抗體之DNA分子(且該DNA分子表現抗體蛋白)或指定抗體之胺基酸序列產生之抗體,其中該DNA或胺基酸序列已使用此項技術中可獲得且熟知之重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者應理解,包括幾乎所有蛋白質或肽之任何大分子可充當抗原。此外,抗原可來源於重組或基因組DNA。熟習此項技術者應理解,包含編碼引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因此編碼如本文所用之術語「抗原」。此外,熟習此項技術者應理解,抗原不必僅藉由基因之全長核苷酸序列編碼。易於顯而易知,本發明包括(但不限於)一種以上基因之部分核苷酸序列之用途及此等核苷酸
序列以各種組合排列以編碼引發所需免疫反應之多肽。此外,熟習此項技術者應理解,抗原根本不必藉由「基因」編碼。易於顯而易知,抗原可合成產生或可來源於生物樣本或可為除多肽以外之大分子。此類生物樣本可包括(但不限於)組織樣本、腫瘤樣本、細胞或具有其他生物組分之流體。
術語「抗腫瘤作用」係指可藉由各種手段體現之生物作用,其包括(但不限於)例如腫瘤體積減小,腫瘤細胞數目減少,癌轉移數目減少,預期壽命增加,腫瘤細胞增殖減少,腫瘤細胞存活率降低,或與癌性病狀相關聯之各種生理症狀改善。「抗腫瘤作用」亦可藉由本發明之肽、聚核苷酸、細胞及抗體首先預防腫瘤出現之能力來體現。
術語「抗癌作用」係指可藉由各種手段體現之生物作用,其包括(但不限於)例如腫瘤體積減小,腫瘤細胞數目減少,癌轉移數目減少,預期壽命增加,癌細胞增殖減少,癌細胞存活率降低,或與癌性病狀相關聯之各種生理症狀改善。「抗癌作用」亦可藉由肽、聚核苷酸、細胞及抗體首先預防癌症出現之能力體現。
術語「抗腫瘤作用」係指可藉由多種手段體現之生物作用,其包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活率降低。
術語「自體」係指來源於與稍後可重新引入個體中相同的個體之任何材料。
術語「同種異體」係指來源於與引入材料之個體相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座處之基因不相同時,兩個或兩個以上個體稱為彼此同種異體。在一些態樣中,來自相同物種之個體的同種異體材料在基因上可足夠不同從而以抗原方式相互作用。
術語「異種」係指來源於不同物種之動物的移植物。
如本文所用之術語「清除術」係指此項技術公認之體外過程,
藉由該過程,供體或患者之血液自供體或患者移除且通過將所選特定成分分離出之設備且例如藉由回輸法使剩餘部分返回至供體或患者之循環。因此,在「清除術樣本」之情況下係指使用清除術獲得之樣本。
術語「組合」係指呈一種單位劑型之固定組合,或其中本發明化合物與組合搭配物(例如,如以下解釋之另一藥物,亦稱為「治療劑」或「輔劑」)可同時獨立投與或在時間間隔內分開投與,尤其其中此等時間間隔允許組合搭配物展示協作(例如協同效應)之組合投與。單一組分可包裝在套組中或分開包裝。在投與之前組分中之一或兩者(例如,粉末或液體)可復原或稀釋至所需劑量。如本文所用之術語「共投與」或「組合投與」或其類似術語意欲涵蓋向有需要之單一個體(例如患者)投與所選組合搭配物,且意欲包括其中試劑不一定藉由相同投與途徑投與或同時投與之治療方案。如本文所用之術語「醫藥組合」意謂由混合或組合一種以上活性成分所產生之產物且包括活性成分之固定與不固定組合。術語「固定組合」意謂活性成分,例如本發明化合物及組合搭配物均以單一實體或劑量形式同時投與患者。術語「非固定組合」意謂活性成分,例如本發明化合物及組合搭配物,均以獨立實體形式同時、並行或依次投與患者而無特定時間限制,其中此類投與在患者體內提供治療有效水準之兩種化合物。後者亦適用於混合物療法,例如投與三種或三種以上活性成分。
術語「癌症」係指藉由異常細胞之快速且不受控制的生長表徵之疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。本文描述各種癌症之實例,且包括(但不限於)乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及其類似癌症。術語「腫瘤」與「癌症」在本文中可互換使用,例如兩個術語均涵蓋實體及液體,例如彌漫性
或循環腫瘤。如本文所用,術語「癌症」或「腫瘤」包括惡化前以及惡性癌症及腫瘤。
如本文所用之術語「來源於」指示第一與第二分子之間的關係。其一般指第一分子與第二分子之間的結構相似性,且不涵蓋或包括對來源於第二分子之第一分子的過程或來源限制。舉例而言,在來源於CD3ζ分子之胞內信號傳導域之情況下,胞內信號傳導域保留足夠CD3ζ結構,使得具有所需功能,亦即在適當條件下產生信號之能力。其不涵蓋或包括對產生胞內信號傳導域之特定方法之限制,例如其並不意謂,為提供胞內信號傳導域,吾人必須以CD3ζ序列開始且缺失不必要序列,或施加突變以達成胞內信號傳導域。
如本文所用之片語「與CD123表現相關聯之疾病」包括(但不限於)與CD123表現相關聯之疾病或與表現CD123(例如,野生型或突變CD123)之細胞相關聯之病狀,包括例如增殖性疾病,諸如癌症或惡性腫瘤;癌前病狀,諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期;或與表現CD123(例如,野生型或突變CD123)之細胞相關聯之非癌症相關適應症。在一個態樣中,與CD123(例如,野生型或突變CD123)表現相關聯之癌症為血液癌。在一個態樣中,疾病包括AML、ALL、毛細胞白血病、前淋巴細胞性白血病、慢性骨髓白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、淋巴母細胞性B細胞白血病(B細胞急性淋巴白血病,BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(T細胞急性淋巴白血病(TALL));骨髓發育不良症候群;骨髓增殖性贅瘤;組織細胞病症(例如,肥大細胞病症或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤);肥大細胞病症,例如全身性肥大細胞增多症或肥大細胞白血病;及其類似疾病。與CD123表現相關聯之其他疾病包括(但不限於)例如與CD123表現相關聯之非典型及/或非經典之癌症、惡性腫瘤、癌前病狀或增殖性疾病。亦可包括與CD123表現
相關聯之非癌症相關適應症。
在一些實施例中,表現腫瘤抗原(例如,CD123-或CD19-)之細胞表現或在任何時間表現編碼腫瘤抗原之mRNA。在一實施例中,表現腫瘤抗原(例如,CD123或CD19)之細胞產生腫瘤抗原蛋白(例如,野生型或突變的),且腫瘤抗原蛋白可以正常水準或降低水準存在。在一實施例中,表現腫瘤抗原(例如,CD123-或CD19-)之細胞在一個時刻產生可偵測水準之腫瘤抗原蛋白,且隨後產生實質上不可偵測的腫瘤抗原蛋白。
術語「保守序列修飾」係指胺基酸修飾不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。修飾可藉由此項技術中已知之標準技術(諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發)引入本發明之抗體或抗體片段中。保守取代為胺基酸殘基置換為具有類似側鏈之胺基酸殘基的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族在此項技術中已定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如,離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如,天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如,甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如,丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如,蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如,酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此,本發明CAR內之一或多個胺基酸殘基可經來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換,且可使用本文所描述之功能性分析來測試改變之CAR。
術語「刺激」係指藉由結合刺激分子(例如,TCR/CD3複合物)與其同源配位體,藉此介導信號轉導事件,諸如(但不限於)經由TCR/CD3複合物進行信號轉導來誘導之主要反應。刺激可介導某些分
子之改變表現,諸如下調TGF-β,及/或重組細胞骨架結構,及其類似者。
術語「刺激分子」係指藉由提供主要細胞質信號傳導序列之T細胞表現之分子,主要細胞質信號傳導序列對於T細胞信號傳導路徑之至少一些態樣以刺激方式調控TCR複合物之主要活化。在一個態樣中,藉由例如結合TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子來起始主要信號,且其導致介導T細胞反應,包括(但不限於)增殖、活化、分化及其類似者。以刺激方式起作用之主要細胞質信號傳導序列(亦稱為「主要信號傳導域」)可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。在本發明中具有特定用途之含有ITAM的主要細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)來源於以下各者之彼等序列:TCR ξ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(亦稱為「ICOS」)、FcεRI、CD66d、DAP10及DAP12。在本發明之特異性CAR中,本發明之任一個或一個以上CARS中之胞內信號傳導域包含胞內信號傳導序列,例如CD3-ξ之主要信號傳導序列。在本發明之特異性CAR中,CD3-ξ之主要信號傳導序列為提供為SEQ ID NO:9之序列,或來自非人類物種(例如,小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。在本發明之特異性CAR中,CD3-ξ之主要信號傳導序列為如SEQ ID NO:10中所提供之序列,或來自非人類物種(例如,小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。
術語「抗原呈現細胞」或「APC」係指在其表面上顯示與主要組織相容複合物(MHC)複合之外來抗原的免疫系統細胞,諸如輔助細胞(例如,B細胞、樹突狀細胞及其類似細胞)。T細胞可使用其T細胞受體(TCR)識別此等複合物。APC處理抗原且將其呈現給T細胞。
如本文所用之術語「胞內信號傳導域」係指分子之胞內部分。
胞內信號傳導域可產生促進含CAR細胞(例如,CART細胞或表現CAR之NK細胞)之免疫效應子功能的信號。免疫效應子功能(例如,在CART細胞或表現CAR之NK細胞中)之實例包括細胞溶解活性及輔助活性,包括分泌細胞激素。在實施例中,胞內信號域轉導效應子功能信號且導引細胞執行專門功能。儘管可採用整個胞內信號傳導域,但在多數情況下,不必使用整條鏈。至於使用胞內信號傳導域之截短部分的程度,此類截短部分只要轉導效應子功能信號即可用於替代完整鏈。術語胞內信號傳導域因此意欲包括足以轉導效應子功能信號之胞內信號傳導域的截短部分。
在一實施例中,胞內信號傳導域可包含主要胞內信號傳導域。例示性主要胞內信號傳導域包括來源於負責主要刺激或抗原依賴性模擬之分子的彼等者。在一實施例中,胞內信號傳導域可包含共刺激胞內域。例示性共刺激胞內信號傳導域包括來源於負責共刺激信號或抗原獨立刺激之分子的彼等者。舉例而言,在表現CAR之免疫效應子細胞(例如,CART細胞或表現CAR之NK細胞)之情況下,主要胞內信號傳導域可包含T細胞受體之細胞質序列,且共刺激胞內信號傳導域可包含來自共受體或共刺激分子之細胞質序列,主要胞內信號傳導域可包含稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。含有ITAM之主要細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)來源於以下各者之彼等序列:CD3 ξ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」)、FcεRI、CD66d、DAP10及DAP12。
術語「ξ」或者「ξ鏈」、「CD3-ξ」或「TCR-ξ」定義為如GenBan Acc寄存編號BAG36664.1提供之蛋白質或來自非人類物種(例如,小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基,且「ξ刺激域」或者「CD3-ξ刺激域」或「TCR-ξ刺激域」定義為來自ξ鏈之細胞質域的胺
基酸殘基,其足以在功能上傳輸T細胞活化所必需之初始信號。在一個態樣中,ξ之細胞質域包含Genbank寄存編號BAG36664.1之殘基52至164或作為其功能性直系同源物的來自非人類物種(例如,小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。在一個態樣中,「ξ刺激域」或「CD3-ξ刺激域」為提供為SEQ ID NO:9之序列。在一個態樣中,「ξ刺激域」或「CD3-ξ刺激域」為提供為SEQ ID NO:10之序列。
術語「共刺激分子」係指T細胞上之同源結合搭配物,其特異性結合共刺激配位體,藉此藉由T細胞(諸如(但不限於))增殖介導共刺激反應。共刺激分子為除抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子,其為有效免疫反應所需。共刺激分子包括(但不限於)MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與
CD83特異性結合之配位體。
共刺激胞內信號傳導域係指共刺激分子之胞內部分。胞內信號傳導域可包含其所源自之分子的整個胞內部分或整個原生胞內信號傳導域,或其功能片段。
術語「4-1BB」係指如GenBank寄存編號AAA62478.2提供之具有胺基酸序列之TNFR超家族的成員或來自非人類物種(例如,小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基;且「4-1BB共刺激域」定義為GenBank寄存編號AAA62478.2之胺基酸殘基214-255或來自非人類物種(例如,小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。在一個態樣中,「4-1BB共刺激域」為提供為SEQ ID NO:7之序列或來自非人類物種(例如,小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。
如本文所用之術語「免疫效應子細胞」係指參與免疫反應,例如促進免疫效應反應之細胞。免疫效應子細胞之實例包括T細胞(例如,α/β T細胞及γ/δ T細胞)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T(NKT)細胞、肥大細胞及骨髓衍生之吞噬細胞。
如本文所用之術語「免疫效應子功能或免疫效應子反應」係指例如免疫效應子細胞之增強或促進靶細胞之免疫侵襲的功能或反應。舉例而言,免疫效應子功能或反應係指T或NK細胞促進靶細胞殺死或抑制生長或增殖之特性。在T細胞之情況下,主要刺激及共刺激為免疫效應子功能或反應之實例。
術語「效應子功能」係指細胞之專門功能。T細胞之效應子功能例如可為細胞溶解活性或輔助活性,包括分泌細胞激素。
術語「編碼」係指諸如基因、cDNA或mRNA之聚核苷酸中之特異性核苷酸序列在生物過程中充當合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性,該等聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列(例如,rRNA、tRNA及mRNA)或已確定之胺基酸序列,及自其獲得之生物特
性。因此,若與基因相對應之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質,則基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中之編碼鏈與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼鏈均可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。
除非另外規定,否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子,其達到編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些型式中含有內含子之程度。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用,且指如本文所描述能有效實現特定生物結果之化合物、調配物、物質或組合物之量。
術語「內源性」係指來自或在生物體、細胞、組織或系統內部產生之任何物質。
術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生之任何物質。
術語「表現」係指啟動子驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
術語「轉移載體」係指包含經分離之核酸且可用於將經分離之核酸遞送至細胞內部之物質組合物。許多載體為此項技術中已知,包括(但不限於)線性聚核苷酸、與離子性或兩親媒性化合物相關聯之聚核苷酸、質體及病毒。因此,術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物,諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。
術語「表現載體」係指包含重組性聚核苷酸之載體,該重組性聚核苷酸包含與待表現之核苷酸序列可操作地連接之表現控制序列。表現載體包含足夠順式作用要素用於表現;用於表現之其他要素可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體,包括併入重組性聚核苷酸之黏質體、質體(例如,裸露或含於脂質體中)及病毒(例如,慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用之術語「載體」係指可用於遞送及/或表現核酸分子之任何媒劑。其可為如本文所描述之轉移載體或表現載體。
術語「慢病毒」係指反轉錄病毒科家族之屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的,因為其能夠感染未分化細胞;其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中,因此其為基因遞送載體之最有效方法中之一者。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」係指來源於慢病毒基因組之至少一部分的載體,尤其包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中所提供之自身不活化慢病毒載體。臨床中可使用之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAXTM載體系統及其類似物。非臨床類型之慢病毒載體亦可獲得且將為熟習此項技術者所已知。
術語「同源」或「一致性」係指在兩個聚合分子之間,例如在諸如兩個DNA分子或兩個RNA分子之兩個核酸分子之間,或在兩個多肽分子之間的次單元序列一致性。當兩個分子中之次單元位置被相同單體次單元佔據時;例如若兩個DNA分子中之每一者中之位置均被腺嘌呤佔據,則其在彼位置處為同源或一致的。兩個序列之間的同源性為匹配或同源位置數目之直接函數;例如若兩個序列中之位置有一半(例如,長度為十個次單元之聚合物中之五個位置)同源,則該兩個序
列為50%同源;若90%之位置(例如,10個中之9個)匹配或同源,則該兩個序列為90%同源。
非人類(例如,鼠類)抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如,Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。大多數情況下,人類化抗體及其抗體片段為人類免疫球蛋白(接受者抗體或抗體片段),其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基置換為來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠或兔之非人類物種(供體抗體)之CDR的殘基。在一些情況下,人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外,人類化抗體/抗體片段可包含既不存在於接受者抗體中亦不存在於所輸入之CDR或構架序列中之殘基。此等修飾可進一步使抗體或抗體片段效能優化及最佳化。一般而言,人類化抗體或其抗體片段將包含實質上所有至少一個及通常兩個可變域,其中所有或實質上所有CDR區與非人類免疫球蛋白之CDR區相對應且所有或絕大部分FR區為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分,該恆定區通常為人類免疫球蛋白之恆定區。關於其他細節,參見Jones等人,Nature,321:522-525,1986;Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988;Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
術語「完全人類」係指諸如抗體或抗體片段之免疫球蛋白,其中整個分子具有人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致的胺基酸序列組成。
術語「經分離」意謂自天然狀態改變或移除。舉例而言,天然存在於活動物中之核酸或肽並非「經分離」,但自其天然狀態之共存材料部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離」。經分離之核酸或蛋白質可以實質上純化形式存在,或可存在於諸如宿主細胞之非原生
環境中。
在本發明之上下文中,使用以下通常存在之核酸鹼基之縮寫。「A」係指腺苷,「C」係指胞嘧啶,「G」係指鳥苷,「T」係指胸苷且「U」係指尿苷。
術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列與異源核酸序列之間的功能鍵,其導致異源核酸序列之表現。舉例而言,當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能性關係時,第一核酸序列可操作地連接第二核酸序列。舉例而言,若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現,則啟動子可操作地連接於編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接,且例如若接合兩個蛋白質編碼區時必要,則在同一閱讀框架中。
術語「非經腸」投與免疫原性組合物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射、瘤內或輸注技術。
術語「核酸」、「聚核苷酸」或「核酸分子」係指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA),或其DNA或RNA之組合,及其呈單鏈或雙鏈形式之聚合物。術語「核酸」包括基因cDNA或mRNA。在一個實施例中,核酸分子為合成(例如,化學合成)或重組的。除非特定限制,否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之類似物或衍生物的核酸,其與參考核酸具有類似結合特性且以類似於天然存在之核苷酸的方式代謝。除非另外指示,否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定言之,簡併密碼子取代可藉由產生一或多個(或所有)所選密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列實現(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);及Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用,且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基組成之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸,且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸的最大數目無限制。多肽包括包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或兩個以上胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所使用,該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物)及長鏈(其在此項技術中一般稱為蛋白質,其存在多種類型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變異體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指由細胞合成機制或引入之合成機制識別、起始聚核苷酸序列之特異性轉錄所需之DNA序列。
術語「啟動子/調控序列」係指表現可操作地連接於啟動子/調控序列之基因產物所需的核酸序列。在一些情況下,此序列可為核心啟動子序列,且在其他情況下,此序列亦可包括強化子序列及表現基因產物所需的其他調控要素。啟動子/調控序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物之啟動子/調節序列。
術語「組成性」啟動子係指當與編碼或特異於基因產物之聚核苷酸可操作地連接時,在細胞之大多數或全部生理學條件下引起基因產物在細胞中產生之核苷酸序列。
術語「誘導性」啟動子係指當與編碼或特異於基因產物之聚核苷酸可操作地連接時,僅當細胞中存在對應於啟動子之誘導劑時才引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當與編碼或特異於基因之聚核苷酸可操作地連接時,僅當細胞為對應於啟動子之組織類型的細胞時才引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。
術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」互換地係指全部或以片段形式(例如,MHC/肽)在癌細胞表面上表現之分子(通常蛋白質、碳水化合物或脂質),且其適用於將藥理學試劑較佳靶向癌細胞。在一些實施例中,腫瘤抗原為正常細胞及癌細胞表現之標記,例如譜系標記,例如B細胞上之CD19或CD123。在一些實施例中,腫瘤抗原為在癌細胞中相較於在正常細胞中過度表現之細胞表面分子,例如相較於正常細胞1倍過度表現、2倍過度表現、3倍或3倍以上過度表現。在一些實施例中,腫瘤抗原為癌細胞中不適當合成之細胞表面分子,例如相較於正常細胞上表現之分子含有缺失、添加或突變之分子。在一些實施例中,腫瘤抗原將全部或以片段形式(例如,MHC/肽)專門表現於癌細胞之細胞表面上,且在正常細胞表面上不合成或表現。在一些實施例中,本發明之CAR包括包含與MHC呈現之肽結合的抗原結合域(例如,抗體或抗體片段)之CAR。通常,來源於內源性蛋白質之肽填充主要組織相容複合物(MHC)I類分子之凹穴,且由CD8+T淋巴細胞上之T細胞受體(TCR)識別。MHC I類複合物由所有成核細胞組成性表現。在癌症中,病毒特異性及/或腫瘤特異性肽/MHC複合物表示免疫療法之獨特類別之細胞表面標靶。已描述在人類白血球抗原(HLA)-A1或HLA-A2之情況下靶向來源於病毒或腫瘤抗原的肽之TCR樣抗體(參見例如Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942;Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272;Verma等人,J Immunol 2010 184(4):2156-2165;Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608;Dao等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33;Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。舉例而言,TCR樣抗體可自篩選諸如人類scFv噬菌體顯示庫之庫來鑑別。
如scFv之情況下所用之術語「可撓性多肽連接子」係指由單獨或組合使用之胺基酸(諸如甘胺酸及/或絲胺酸)殘基組成之肽連接子,其
將可變重鏈區與可變輕鏈區連接在一起。在一個實施例中,可撓性多肽連接子為Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:38),其中n為等於或大於1之正整數。舉例而言,n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一個實施例中,可撓性多肽連接子包括(但不限於)(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一實施例中,連接子包括多個重複序列(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)。本發明之範疇內亦包括以引用的方式併入本文中之WO2012/138475中所描述之連接子。
如本文所用,5'封端(亦稱為RNA封端、RNA 7-甲基鳥苷封端或RNA m7G封端)為經修飾之鳥嘌呤核苷酸,其在開始轉錄後不久即添加至真核信使RNA之「前部」或5'端。5'封端由與第一轉錄核苷酸連接之端基組成。其存在對於核糖體識別及保護免於RNase至關重要。封端添加與轉錄偶合,且以共轉錄方式進行,使得各自彼此影響。開始轉錄後不久,所合成之mRNA之5'端由與RNA聚合酶相關聯之封端合成複合物結合。此酶促複合物催化mRNA封端所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應形式繼續進行。封端部分可經修飾以調節mRNA之功能性,諸如其轉譯穩定性或效率。
如本文所用,「活體外轉錄RNA」係指已活體外合成之RNA,較佳mRNA。一般而言,活體外轉錄之RNA自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄之RNA的模板。
如本文所用,「聚(A)」為藉由聚腺苷酸化附接至mRNA之一連串腺苷。在短暫表現構築體之較佳實施例中,聚A為50至5000(SEQ ID NO:30),較佳大於64,更佳大於100,最佳大於300或400。聚(A)序列可經化學修飾或酶修飾以調節mRNA功能性,諸如轉譯之位置、穩定性或效率。
如本文所用,「聚腺苷酸化」係指聚腺苷部分或其經修飾之變異
體與信使RNA分子共價連接。在真核生物中,大多數信使RNA(mRNA)分子在3'端經聚腺苷酸化。3'聚(A)尾為經由酶(聚腺苷酸化聚合酶)之作用添加至前mRNA的腺嘌呤核苷酸之長序列(通常幾百)。在高級真核生物中,聚(A)尾添加至含有特異性序列(聚腺苷酸化信號)之轉錄物上。聚(A)尾及其結合之蛋白質輔助保護mRNA免於被核酸外切酶降解。聚腺苷酸化對於轉錄封端、mRNA自細胞核輸出及轉譯亦為重要的。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生,但另外亦可稍後在細胞質中發生。轉錄已終止後,mRNA鏈經由與RNA聚合酶相關聯之核酸內切酶複合物的作用裂解。裂解位點之特徵通常在於在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。mRNA已裂解後,腺苷殘基添加至裂解位點之游離3'端。
如本文所用,「短暫」係指表現非整合轉殖基因持續幾小時、幾天或幾週之時段,其中若整合至基因組中或含於宿主細胞中之穩定質體複製子內時,則表現時間段小於基因表現時間段。
如本文所用,術語「治療(treat/treatment/treating)」係指由投與一或多種療法(例如,一或多種治療劑,諸如本發明之CAR)造成減少或改善增殖性病症之進展、嚴重程度及/或持續時間,或改善增殖性病症之一或多種症狀(較佳一或多種可辨別症狀)。在特定實施例中,術語「治療」係指改善增殖性病症之患者不一定可辨別之至少一種可量測物理參數,諸如腫瘤生長。在其他實施例中,術語「治療」係指在物理上藉由例如穩定可辨別症狀、在生理上藉由例如穩定物理參數或兩者來抑制增殖性病症之進展。在其他實施例中,術語「治療」係指減小或穩定腫瘤尺寸或癌細胞計數。
術語「信號轉導路徑」係指在將信號自細胞之一個部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠跨越細胞膜接收信號及傳輸信號之分
子及分子複合物。
術語「個體」意欲包括可引發免疫反應之活生物體(例如,哺乳動物、人類)。
術語「實質上純化」之細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化之細胞亦指已與在其天然存在之狀態下通常與其相關聯之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下,實質上純化之細胞群體係指細胞之同源群體。在其他情況下,此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然相關聯之細胞分離的細胞。在一些態樣中,該等細胞在活體外培養。在其他態樣中,該等細胞不在活體外培養。
如本文所用之術語「療法」意謂治療。藉由減輕、抑制、緩解或根除疾病病況來獲得療法效果。
如本文所用之術語「預防」意謂疾病或疾病病況之預防或保護性治療。
在本發明之上下文中,「腫瘤抗原」或「過度增殖性病症抗原」或「與過度增殖性病症相關聯之抗原」係指特定過度增殖性病症常見的抗原。在某些態樣中,本發明之過度增殖性病症抗原來源於以下癌症,其包括(但不限於)原發性或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌,諸如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌及其類似癌症。
術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指外源性核酸藉以轉移或引入至宿主細胞中的過程。「轉染」或「轉型」或「轉導」細胞為已經外源性核酸轉染、轉型或轉導之細胞。該細胞包括初級個體細胞及其後代。
術語「特異性結合」係指識別且結合存在於樣本中之同源結合搭配物(例如,存在於T細胞上之刺激及/或共刺激分子)蛋白質之抗體
或配位體,但該抗體或配位體不實質上識別或結合樣本中之其他分子。
如本文所用,「可調控嵌合抗原受體(RCAR)」係指一組多肽,在最簡單實施例中通常為兩個,其在免疫效應子細胞中時,為細胞提供針對靶細胞(通常癌細胞)之特異性及可調控之胞內信號產生。在一些實施例中,RCAR包含至少一個胞外抗原結合域、跨膜域及細胞質信號傳導域(在本文中亦稱為「胞內信號傳導域」),在CAR分子之情況下細胞質信號傳導域包含來源於如本文所定義之刺激分子及/或共刺激分子之功能性信號傳導域。在一些實施例中,RCAR中多肽組不彼此鄰接,例如在不同多肽鏈中。在一些實施例中,RCAR包括二聚開關,其在二聚分子存在時可將多肽彼此偶合,例如可將抗原結合域與胞內信號傳導域偶合。在一些實施例中,RCAR在如本文所描述之細胞(例如,免疫效應子細胞),例如表現RCAR之細胞(在本文中亦稱為「RCARX細胞」)中表現。在一實施例中,RCARX細胞為T細胞,且稱為RCART細胞。在一實施例中,RCARX細胞為NK細胞,且稱為RCARN細胞。RCAR可為表現RCAR之細胞提供針對靶細胞(通常癌細胞)之特異性,及可調控之胞內信號產生或增殖,可使表現RCAR之細胞之免疫效應特性最佳化。在實施例中,RCAR細胞至少部分依賴於抗原結合域以對包含與抗原結合域結合之抗原的靶細胞提供特異性。
如本文所用之術語「膜錨」或「膜繫栓域」係指足以將胞外域或胞內域錨定於質膜之多肽或部分(例如肉豆蔻醯基)。
如本文所用之術語「開關域」例如當涉及RCAR時係指在二聚分子存在下與另一開關域相關聯之實體,通常基於多肽之實體。該關聯導致連接至(例如,融合至)第一開關域之第一實體與連接至(例如,融合至)第二開關域之第二實體功能性偶合。第一與第二開關域統稱為二聚開關。在實施例中,第一與第二開關域彼此相同,例如其為具有
相同一級胺基酸序列之多肽且統稱為均二聚開關。在實施例中,第一與第二開關域彼此不同,例如其為具有不同一級胺基酸序列之多肽且統稱為雜二聚開關。在實施例中,開關為胞內的。在實施例中,開關為胞外的。在實施例中,開關域為基於多肽(例如,基於FKBP或FRB)之實體,且二聚分子為小分子,例如雷帕羅吉(rapalogue)。在實施例中,開關域為基於多肽之實體,例如結合myc肽之scFv,且二聚分子為多肽、其片段或多肽之多聚體,例如myc配位體或與一或多個myc scFv結合之myc配位體多聚體。在實施例中,開關域為基於多肽之實體,例如myc受體,且二聚分子為抗體或其片段,例如myc抗體。
如本文所用之術語「二聚分子」例如在涉及RCAR時係指促進第一開關域與第二開關域關聯之分子。在實施例中,二聚分子不天然存在於個體中,或不以將導致顯著二聚之濃度存在。在實施例中,二聚分子為小分子,例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕羅吉,例如RAD001。
術語「生物等效」係指產生等效於由參考劑量或參考量之參考化合物(例如,RAD001)產生之效果的效果所需之一定量的試劑(參考化合物(例如,RAD001)除外)。在一實施例中,該效果為mTOR抑制水準或藉由西方墨點法量測之磷酸化S6水準,該mTOR抑制水準例如如藉由P70 S6激酶抑制所量測,例如如在活體內或活體外分析中所評估,例如如本文所描述之分析(例如,Boulay分析)所量測。在一實施例中,該效果為如藉由細胞分選所量測之PD-1陽性/PD-1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之比率的變化。在一實施例中,mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為達到與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之P70 S6激酶抑制的量或劑量。在一實施例中,mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為達到與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之PD-1陽性/PD-1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞
或NK細胞)之比率的變化之量或劑量。
當與例如立體異位mTOR抑制劑(例如,RAD001或雷帕黴素)或催化mTOR抑制劑之mTOR抑制劑一起使用時,術語「低免疫增強劑量」係指例如如藉由P70 S6激酶活性抑制所量測之部分(而非完全)抑制mTOR活性之mTOR抑制劑的劑量。本文論述例如藉由P70 S6激酶之抑制來評估mTOR活性之方法。該劑量不足以導致完全免疫抑制但足以增強免疫反應。在一實施例中,低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致PD-1陽性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之數目減少,及/或PD-1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之數目增加,或PD-1陰性T細胞/PD-1陽性免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之比率增加。
在一實施例中,低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致原始免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之數目增加。在一實施例中,低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致以下中之一或多者:舉例而言,在例如記憶T細胞前驅體之記憶T細胞上以下標記中之一或多者之表現增加:CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2;舉例而言,在例如記憶T細胞前驅體之記憶T細胞上KLRG1表現減少;及記憶T細胞前驅體之數目增加,該等細胞例如具有以下特徵中之任一者或組合之細胞:CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1降低及BCL2增加;其中,例如相比於未經治療之個體,上文所描述之變化中之任一者例如至少短暫出現。
如本文所用,「難治性」係指對治療不作出回應之疾病,例如癌症。在實施例中,難治性癌症在治療開始前或在治療開始時可對治療具抗性。在其他實施例中,難治性癌症可在治療期間變得具抗性。難
治性癌症亦稱為抗性癌症。
如本文所用,「復發(Relapsed/relapse)」係指在一定時段改善或反應之後,例如在例如癌症療法之療法的先前治療之後,疾病(例如,癌症)或諸如癌症之疾病的徵象及症狀的再現。初始反應時段可涉及癌細胞含量降至某一臨限值以下,例如20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以下。再現可涉及癌細胞含量上升至某一臨限值以上,例如20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以上。舉例而言,例如在B-ALL之情況下,再現可涉及例如完全反應之後血液、骨髓(>5%)或任何髓外位點中之母細胞再現。完全反應在此情況下可涉及<5% BM母細胞。更一般而言,在一實施例中,反應(例如,完全反應或部分反應)可涉及不存在可偵測MRD(微小殘留病)。在一實施例中,初始反應時段持續至少1、2、3、4、5或6天;至少1、2、3或4週;至少1、2、3、4、6、8、10或12個月;或至少1、2、3、4或5年。
在一些實施例中,包括CD19抑制劑之療法,例如CD19 CAR療法可能復發或難以治療。復發或抗性可由CD19缺失(例如,抗原缺失突變)或降低CD19含量(例如,由CD19陰性純系之純系選擇引起)之其他CD19變化引起。懷有此類CD19缺失或變化之癌症在本文中稱為「CD19陰性癌症」或「CD19陰性復發性癌症」。應理解,CD19陰性癌症不必具有100% CD19缺失,但降低CD19療法之有效性的足夠降低使得癌症復發或變得難治。在一些實施例中,CD19陰性癌症由CD19 CAR療法造成。
範圍:在本發明通篇中,本發明之各種態樣可以範圍格式呈現。應理解,範圍格式中之描述僅為方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明範疇之固定限制。因此,範圍之描述應被視為已特定揭示所有可能的子範圍以及彼範圍內之個別數值。舉例而言,諸如1至6之範圍
描述應被視為已特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等之子範圍以及彼範圍內之個別數字,例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例,諸如95-99%一致性之範圍包括具有95%、96%、97%、98%或99%一致性之範圍,且包括子範圍,諸如96-99%、96-98%、96-97%、97-99%、97-98%及98-99%之一致性。不管範圍之寬度此均適用。
本文提供物質組合物及使用CD123嵌合抗原受體(CAR)治療或預防諸如癌症之疾病之使用方法。
在一個態樣中,本發明提供多種嵌合抗原受體(CAR),其包含經工程改造以特異性結合至CD123蛋白質或其片段之抗體或抗體片段。
在一個態樣中,本發明提供一種經工程改造以表現CAR之細胞(例如免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞),其中表現CAR之細胞(例如,「CART」或表現CAR之NK細胞)展現抗腫瘤特性。在一個態樣中,細胞經CAR轉型且在細胞表面上表現至少部分CAR。在一些實施例中,細胞(例如免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞)經編碼CAR之病毒載體轉導。在一些實施例中,病毒載體為反轉錄病毒載體。在一些實施例中,病毒載體為慢病毒載體。在一些此類實施例中,細胞可穩定表現CAR。在另一實施例中,細胞(例如免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞)經編碼CAR之核酸(例如,mRNA、cDNA、DNA)轉染。在一些此類實施例中,細胞可短暫表現CAR。
在一個態樣中,CAR之CD123結合域,例如人類或人類化CD123結合域為scFv抗體片段。在一個態樣中,此類抗體片段之功能在於其保持等效結合親和力,例如其結合具有類似功效之相同抗原,因為IgG抗體具有相同重鏈及輕鏈可變區。在一個態樣中,此類抗體片段之功能在於其提供可包括(但不限於)以下如熟習此項技術者將理解之
生物反應:活化免疫反應、抑制來自其靶抗原之信號轉導起源、抑制激酶活性及其類似物。
在一些態樣中,本發明抗體併入嵌合抗原受體(CAR)中。在一個態樣中,CAR包含本文提供為SEQ ID NO:98-101及125-156之多肽序列。
在一個態樣中,本發明CAR之CD123結合域(例如,人類化或人類CD123結合域)部分藉由序列已經密碼子最佳化以在哺乳動物細胞中表現之轉殖基因編碼。在一個態樣中,本發明之整個CAR構築體由整個序列已針對在哺乳動物細胞中表現經密碼子最佳化之轉殖基因編碼。密碼子最佳化係指發現同義密碼子(亦即,編碼相同胺基酸之密碼子)在編碼DNA中之出現頻率在不同物種中有偏向。此類密碼子簡併允許相同多肽由多種核苷酸序列編碼。多種密碼子最佳化方法為此項技術中已知,且包括例如至少美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所揭示之方法。
在一個態樣中,CAR之抗原結合域包含人類CD123抗體或抗體片段。在一個態樣中,CAR之抗原結合域包含人類化CD123抗體或抗體片段。在一個態樣中,CAR之抗原結合域包含含scFv之人類CD123抗體片段。在一個態樣中,CAR之抗原結合域為人類CD123 scFv。在一個態樣中,CAR之抗原結合域包含含scFv之人類化CD123抗體片段。在一個態樣中,CAR之抗原結合域為人類化CD123 scFv。
在一個態樣中,CAR123結合域包含SEQ ID NO:157-160及184-215中所提供之scFv部分。在一個態樣中,scFv部分為人類。在一個態樣中,人類CAR123結合域包含SEQ ID NO:157-160中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ ID NO:157中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ ID NO:158中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ
ID NO:159中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ ID NO:160中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ ID NO:478中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ ID NO:480中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ ID NO:483中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類CD123結合域包含SEQ ID NO:485中所提供之scFv部分。
在一個態樣中,scFv部分經人類化。在一個態樣中,人類化CAR123結合域包含SEQ ID NO:184-215中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:184中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:185中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:186中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:187中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:188中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:189中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:190中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:191中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:192中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:193中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:194中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:195中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:196中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:197中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:
198中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:199中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:200中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:201中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:202中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:203中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:204中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:205中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:206中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:207中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:208中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:209中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:210中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:211中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:212中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:213中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:214中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:215中所提供之scFv部分。在一個態樣中,人類化CD123結合域包含SEQ ID NO:556-587中所提供之scFv部分。
此外,本發明提供CD123 CAR組合物及其用於在其他疾病中治療涉及表現CD123之細胞或組織的癌症或任何惡性或自體免疫疾病之藥物或方法之用途。
在一個態樣中,本發明之CAR可用於根除表現CD123之正常細
胞,藉此適用於用作細胞移植前之細胞調理療法。在一個態樣中,表現CD123之正常細胞為表現CD123之骨髓祖細胞,且細胞移植為幹細胞移植。
在一個態樣中,本發明提供一種經工程改造以表現本發明之嵌合抗原受體(例如,表現CAR之免疫效應子細胞,例如CART或表現CAR之NK細胞)的細胞(例如免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞),其中該細胞(例如,「CART」)展現抗腫瘤特性。因此,本發明提供一種CD123-CAR,其包含CD123結合域且經工程改造成免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞;及其用於授受性療法之方法。
在一個態樣中,CD123-CAR包含例如本文所描述、例如選自以下之群的至少一個胞內域:CD137(4-1BB)信號傳導域、CD28信號傳導域、CD3ζ信號域及其任何組合。在一個態樣中,CD123-CAR包含來自除CD137(4-1BB)或CD28以外的一或多個共刺激分子之至少一個胞內信號傳導域。
本發明涵蓋包含編碼CAR之序列的重組DNA構築體,其中CAR包含特異性結合至CD123或其片段(例如,人類CD123)之抗原結合域(例如,抗體、抗體片段),其中CD123結合域(例如,抗體或抗體片段)之序列與編碼胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。胞內信號傳導域可包含共刺激信號傳導域及/或主要信號傳導域,例如ξ鏈。共刺激信號傳導域係指包含共刺激分子之胞內域的至少一部分的CAR之一部分。
在特定態樣中,本發明之CAR構築體包含選自由以下組成之群的scFv域:SEQ ID NOS:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587,其中scFv前面可為諸如SEQ ID NO:1中所提供之視情況存在之前導序列,且隨後為諸如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID
NO:4或SEQ ID NO:5中所提供之視情況存在之鉸鏈序列、諸如SEQ ID NO:6中所提供之跨膜區、包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8之胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之CD3 ξ序列,例如其中該等結構域與相同閱讀框架鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。在一些實施例中,scFv域為選自由以下組成之群的人類scFv域:SEQ ID NOS:157-160、478、480、483及485。在一些實施例中,scFv域為選自由以下組成之群的人類化scFv域:SEQ ID NO:184-215及556-587。本發明中亦包括一種核苷酸序列,其編碼選自由以下組成之群的scFv片段中之每一者之多肽:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587。本發明中亦包括一種核苷酸序列,其編碼選自由以下組成之群的scFv片段中之每一者之多肽:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587,及SEQ ID NOS:1、2及6-9之結構域中之每一者加本發明之編碼之CD123 CAR。
在一個態樣中,例示性CD123 CAR構築體包含視情況存在之前導序列、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域及胞內刺激域。在一個態樣中,例示性CD123 CAR構築體包含視情況存在之前導序列、胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、胞內共刺激域及胞內刺激域。
在一些實施例中,全長CD123 CAR序列在本文中亦提供為SEQ ID NOS:98-101及125-156,如表2或表6中所展示。
例示性前導序列提供為SEQ ID NO:1。例示性鉸鏈/間隔序列提供為SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。例示性跨膜域序列提供為SEQ ID NO:6。4-1BB蛋白質之例示性胞內信號傳導域序列提供為SEQ ID NO:7。CD27之例示性胞內信號傳導域序列提供為SEQ ID NO:8。例示性CD3ξ域序列提供為SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。CD28之例示性胞內信號傳導域序列提供為SEQ ID
NO:43。ICOS之例示性胞內信號傳導域序列提供為SEQ ID NO:45。
在一個態樣中,本發明涵蓋一種包含編碼CAR之核酸分子的重組核酸構築體,其中核酸分子包含編碼例如本文所描述之CD123結合域的核酸序列,其例如與編碼胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。在一個態樣中,CD123結合域選自以下各者中之一或多者:SEQ ID NOS:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587。在一些實施例中,CD123結合域為選自由以下組成之群的人類CD123結合域:SEQ ID NOS:157-160、478、480、483及485。在一些實施例中,CD123結合域為選自由以下組成之群的人類化CD123結合域:SEQ ID NOS:184-215及556-587。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:157。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:158。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:159。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:160。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:184。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:185。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:186。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:187。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:188。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:189。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:190。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:191。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:192。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:193。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:194。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:195。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:196。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:197。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:198。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:199。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:200。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:
201。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:202。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:203。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:204。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:205。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:206。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:207。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:208。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:209。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:210。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:211。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:212。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:213。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:213。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:215。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:478。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:480。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:483。在一個態樣中,CD123結合域為SEQ ID NO:485。
在一個態樣中,本發明涵蓋一種包含編碼CAR之核酸分子的重組核酸構築體,其中核酸分子包含編碼CD123結合域之核酸序列,例如其中該序列與編碼胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。可用於CAR中之例示性胞內信號傳導域包括(但不限於)例如CD3-ξ、CD28、4-1BB、ICOS及其類似物之一或多個胞內信號傳導域。在一些情況下,CAR可包含CD3-ξ、CD28、4-IBB、ICOS及其類似物之任何組合。
在一個態樣中,本發明之CAR構築體的核酸序列選自SEQ ID NO:39-42及66-97中之一或多者。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:39。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:40。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:41。在一個
態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:42。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:66。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:67。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:68。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:69。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:70。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:71。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:72。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:73。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:74。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:75。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:76。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:77。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:78。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:79。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:80。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:81。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:82。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:83。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:84。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:85。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:86。在一個態樣中,CAR構築體
之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:87。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:88。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:89。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:90。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:91。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:92。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:93。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:94。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:95。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:96。在一個態樣中,CAR構築體之核酸序列包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:97。編碼所要分子之核酸序列可使用此項技術中已知之重組方法獲得,諸如藉由使用標準技術自表現基因之細胞篩選庫、自已知包括基因之載體獲得基因或自含有基因之細胞及組織直接分離。或者,所關注的核酸可以合成方式產生而非選殖。
本發明包括表現可直接轉導至細胞中之CAR的反轉錄病毒及慢病毒載體構築體。
本發明亦包括可直接轉染至細胞中之RNA構築體。產生用於轉染之mRNA之方法涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板,隨後添加聚A,產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'封端及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現之核酸及長度通常為50-2000個鹼基之聚A尾(SEQ ID NO:35)的構築體。如此產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個實施例中,模板包括CAR之序列。在一實施例中,RNA CAR載體藉由電穿孔轉導至T細胞中。
在一個態樣中,本發明之CAR包含另外稱為抗原結合域之靶特異性結合要素。部分之選擇視界定靶細胞之表面的配位體類型及數目而定。舉例而言,可選擇抗原結合域來識別在與特定疾病病況相關聯之靶細胞上充當細胞表面標記之配位體。
在一個態樣中,CAR介導之T細胞反應可藉助於將特異性結合所需抗原之抗原結合域工程改造至CAR中來導向所關注的抗原。
在一個態樣中,包含抗原結合域的CAR之部分包含靶向CD123或其片段之抗原結合域。在一個態樣中,抗原結合域靶向人類CD123或其片段。
抗原結合域可為與包括(但不限於)以下之抗原結合的任何結構域:單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段,包括(但不限於)單域抗體,諸如重鏈可變域(VH)、輕鏈可變域(VL)及駱駝衍生之奈米抗體之可變域(VHH),且抗原結合域可為與此項技術中已知之替代骨架結合以充當抗原結合域的任何結構域,諸如重組纖維結合蛋白結構域及其類似物。在一些情況下,抗原結合域來源於將最終使用CAR之相同物種為有益的。舉例而言,為用於人類,CAR之抗原結合域包含抗體或抗體片段之抗原結合域的人類或人類化殘基可為有益的。
在一些情況下,抗原結合域來源於將最終使用CAR之相同物種為有益的。舉例而言,為用於人類,CAR之抗原結合域包含抗體或抗體片段之抗原結合域的人類或人類化殘基可為有益的。因此,在一個態樣中,抗原結合域包含人類抗體或抗體片段。在一個實施例中,人類CD123結合域包含本文所描述之人類CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3),及/或本文所描述之人類CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC
CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如包含一或多個(例如,全部三個)LC CDR及一或多個(例如,全部三個)HC CDR之人類CD123結合域。在一個實施例中,人類CD123結合域包含本文所描述之人類CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如人類CD123結合域具有兩個可變重鏈區,各自包含本文所描述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中,人類CD123結合域包含本文所描述之人類輕鏈可變區(例如,在表2或表9中)及/或本文所描述之人類重鏈可變區(例如,在表2或表9中)。在一個實施例中,人類CD123結合域包含本文所描述之人類重鏈可變區(例如,在表2或表9中),例如至少兩個本文所描述之人類重鏈可變區(例如,在表2或表9中)。在一個實施例中,CD123結合域為包含表2或表9之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含:輕鏈可變區,其包含具有表2或表9中所提供之輕鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如,取代)但不超過30、20或10個修飾(例如,取代)之胺基酸序列,或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列;及/或重鏈可變區,其包含具有表2或表9中所提供之重鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如,取代)但不超過30、20或10個修飾(例如,取代)之胺基酸序列,或與表2或表9之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,人類CD123結合域包含選自由SEQ ID NO:157-160、478、480、483及485組成之群的序列或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,人類CD123結合域為scFv,且包含本文所描述之例如表2或表9中之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子(例如,本文所描述之連接子)附接至包含本文所描述之例如表2中之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中,
人類CD123結合域包括(Gly4-Ser)n連接子,其中n為1、2、3、4、5或6,較佳為3或4(SEQ ID NO:26)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者:輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區,或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一些態樣中,非人類抗體經人類化,其中抗體之特定序列或區域經修飾以增加與人類或其片段中天然產生之抗體的相似性。因此,在一個態樣中,抗原結合域包含人類化抗體或抗體片段。在一個實施例中,人類化CD123結合域包含本文所描述之人類化CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3),及/或本文所描述之人類化CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如包含一或多個(例如,全部三個)LC CDR及一或多個(例如,全部三個)HC CDR的人類化CD123結合域。在一個實施例中,人類化CD123結合域包含本文所描述之人類化CD123結合域之一或多個(例如,全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3),例如人類化CD123結合域具有兩個可變重鏈區,各自包含本文所描述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中,人類化CD123結合域包含本文所描述之人類化輕鏈可變區(例如,在表6中)及/或本文所描述之人類化重鏈可變區(例如,在表6中)。在一個實施例中,人類化CD123結合域包含本文所描述之人類化重鏈可變區(例如,在表6中),例如至少兩個本文所描述之人類化重鏈可變區(例如,在表6中)。在一個實施例中,CD123結合域為包含表6之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含:輕鏈可變區,其包含具有表4中所提供之輕鏈可變區之胺基酸序列的至
少一個、兩個或三個修飾(例如,取代)但不超過30、20或10個修飾(例如,取代)之胺基酸序列,或與表6之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列;及/或重鏈可變區,其包含具有表6中所提供之重鏈可變區之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾(例如,取代)但不超過30、20或10個修飾(例如,取代)之胺基酸序列,或與表6之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,人類化CD123結合域包含選自由SEQ ID NO:184-215及302-333組成之群的序列或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中,人類化CD123結合域為scFv,且包含本文所描述之例如表6中之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子(例如,本文所描述之連接子)附接至包含本文所描述之例如表6中之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中,人類化CD123結合域包括(Gly4-Ser)n連接子,其中n為1、2、3、4、5或6,較佳為3或4(SEQ ID NO:26)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下定向中之任一者:輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區,或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
人類化抗體可使用此項技術中已知之多種技術產生,該等技術包括(但不限於)CDR移植(參見例如歐洲專利第EP 239,400號;國際公開案第WO 91/09967號;及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號,其中每一者均以全文引用的方式併入本文中)、鑲飾或表面重修(參見例如歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號;Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498;Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814;及Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973,其中每一者均以全文引用的方式併入本文中)、鏈改組(參見例如美國專利第5,565,332號,其以全文引用的方式併入本文中)及揭示於以下各者中之技術:例如美國專利申請公開案第US2005/0042664號;美國專利申請公開案第US2005/0048617號;美國
專利第6,407,213號;美國專利第5,766,886號;國際公開案第WO 9317105號;Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002);Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000);Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000);Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997);Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996);Couto等人,Cancer Res.,55(23增刊):5973s-5977s(1995);Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995);Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994);及Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994),其中每一者均以全文引用的方式併入本文中。通常,構架區中之構架殘基將經來自CDR供體抗體之相應殘基取代以改變,例如提高抗原結合。此等構架取代藉由此項技術中熟知之方法鑑別,例如藉由建模CDR與構架殘基之相互作用來鑑別對於抗原結合為重要之構架殘基,且進行序列比較以鑑別特定位置處的異常構架殘基。(參見例如Queen等人之美國專利第5,585,089號;及Riechmann等人,1988,Nature,332:323,其均以全文引用的方式併入本文中。)
人類化抗體或抗體片段中保留有一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基,其通常取自「輸入」可變域。如本文所提供,人類化抗體或抗體片段包含來自非人類免疫球蛋白分子之一或多個CDR,及其中構成構架之胺基酸殘基完全或大部分來源於人類生殖系的構架區。用於將抗體或抗體片段人類化之多種技術為此項技術中熟知且基本上可根據Winter及同事之方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)),藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列,亦即CDR移植(EP 239,400;PCT公開案第WO 91/09967號;及美國專利第4,816,567號、第6,331,415號、第5,225,539號、第5,530,101號、
第5,585,089號、第6,548,640號,其內容均以全文引用的方式併入本文中)來進行。在此類人類化抗體及抗體片段中,實質上少於完整之人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。人類化抗體通常為其中一些CDR殘基及可能一些構架(FR)殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。抗體及抗體片段之人類化亦可藉由鑲飾或表面重修(EP 592,106;EP 519,596;Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498;Studnicka等人,Protein Engineering,7(6):805-814(1994);及Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或鏈改組(美國專利第5,565,332號)實現,以上所有者之內容均以全文引用的方式併入本文中。
用於製得人類化抗體之人類可變域(輕鏈與重鏈)的選擇將降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合」方法,對照已知人類可變域序列之整個庫來篩選嚙齒動物抗體之可變域序列。隨後最接近嚙齒動物之序列的人類序列被接受作為人類化抗體之人類構架(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987),其內容均以全文引用的方式併入本文中)。另一方法使用來源於輕鏈或重鏈之特定子組的所有人類抗體之共同序列的特定構架。相同構架可用於幾種不同人類化抗體(參見例如Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997);Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993),其內容均以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中,重鏈可變區之構架區(例如,全部四個構架區)來源於VH4_4-59生殖系序列。在一個實施例中,構架區可包含例如來自相應鼠類序列處之胺基酸的一個、兩個、三個、四個或五個修飾(例如,取代)。在一個實施例中,輕鏈可變區之構架區(例如,全部四個構架區)來源於VK3_1.25生殖系序列。在一個實施例中,構架區可包含例如來自相應鼠類序列處
之胺基酸的一個、兩個、三個、四個或五個修飾(例如,取代)。
在一些態樣中,包含抗體片段之本發明CAR組合物之部分經人類化,保持對靶抗原之高親和力及其他有利生物特性。根據本發明之一個態樣,人類化抗體及抗體片段藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種概念性人類化產物之方法製備。三維免疫球蛋白模型通常可獲得,且為熟習此項技術者所熟悉。可利用說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構形結構之電腦程式。檢測此等顯示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用,亦即分析影響候選免疫球蛋白結合靶抗原之能力的殘基。以此方式,可自接受及輸入序列選擇FR殘基且組合,從而實現所需抗體或抗體片段特徵,諸如對靶抗原之親和力增加。一般而言,CDR殘基直接且最實質上參與影響抗原結合。
人類化抗體或抗體片段可保留與例如本發明中之原始抗體類似的抗原特異性、結合人類CD123或其片段之能力。在一些實施例中,人類化抗體或抗體片段與人類CD123或其片段結合之親和力及/或特異性可提高。
在一個態樣中,抗原結合域部分包含一或多個選自以下各者之序列:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587。在一個態樣中,包括人類CD123結合域之CD123 CAR選自一或多個選自以下各者之序列:SEQ ID NO:157-160、478、480、483及485。在一個態樣中,包括人類化CD123結合域之CD123 CAR選自一或多個選自以下各者之序列:SEQ ID NO:184-215及556-587。
在一個態樣中,CD123結合域之特徵為抗體或抗體片段之特定功能特徵或特性。舉例而言,在一個態樣中,包含抗原結合域之本發明CAR組合物之部分特異性結合人類CD123或其片段。在一個態樣中,本發明係關於一種包含抗體或抗體片段之抗原結合域,其中抗體結合
域特異性結合至CD123蛋白質或其片段,其中抗體或抗體片段包含包括以下各者之胺基酸序列的可變輕鏈及/或可變重鏈:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587。在一個態樣中,抗原結合域包含選自以下各者之scFv胺基酸序列:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587。在某些態樣中,scFv與前導序列鄰接且在相同閱讀框架中。在一個態樣中,前導序列為提供為SEQ ID NO:1之多肽序列。
在一個態樣中,CD123結合域為片段,例如單鏈可變片段(scFv)。在一個態樣中,CD123結合域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如,雙特異性)雜交抗體(例如Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一個態樣中,本發明之抗體及其片段以野生型或增強的親和力結合CD123蛋白質或其片段。
在一些情況下,人類scFv可來源於顯示庫。顯示庫為實體集;各實體包括可及多肽組分及編碼或鑑別多肽組分之可回收組分。多肽組分為變化的,從而呈現不同胺基酸序列。多肽組分可具有任何長度,例如三個胺基酸至超過300個胺基酸。顯示庫實體可包括一種以上多肽組分,例如Fab之兩條多肽鏈。在一個例示性實施例中,顯示庫可用於鑑別人類CD123結合域。在選擇時,用CD123或其片段探測庫各成員之多肽組分,且若多肽組分與CD123結合,則通常藉由保持在支撐物上來鑑別顯示庫成員。
自支撐物回收保留之顯示庫成員且進行分析。分析可包括擴增及隨後在類似或相異條件下選擇。舉例而言,陽性及陰性選擇可交替。分析亦可包括測定多肽組分(亦即,抗CD123結合域)之胺基酸序列,及純化多肽組分以便詳細特徵化。
顯示庫可使用多種格式。實例包括噬菌體顯示。在噬菌體顯示中,蛋白質組分通常共價連接至噬菌體鞘蛋白。由轉譯編碼與鞘蛋白
融合之蛋白質組分的核酸產生連接。連接可包括可撓性肽連接子、蛋白酶位點或因抑制終止密碼子而併入之胺基酸。噬菌體顯示例如描述於U.S.5,223,409;Smith(1985)Science 228:1315-1317;WO 92/18619;WO 91/17271;WO 92/20791;WO 92/15679;WO 93/01288;WO 92/01047;WO 92/09690;WO 90/02809;de Haard等人(1999)J.Biol.Chem 274:18218-30;Hoogenboom等人(1998)Immunotechnology 4:1-20;Hoogenboom等人(2000)Immunol Today 2:371-8及Hoet等人(2005)Nat Biotechnol.23(3)344-8中。顯示蛋白質組分之噬菌體可使用標準噬菌體製備方法(例如,自生長培養基PEG沈澱)生長及採集。選擇個別顯示噬菌體之後,可在擴增後自感染所選噬菌體之細胞或噬菌體自身分離編碼所選蛋白質組分之核酸。可挑選個別菌落或斑塊,分離核酸且測序。
其他顯示格式包括基於細胞之顯示(參見例如WO 03/029456)、蛋白質-核酸融合(參見例如US 6,207,446)、核糖體顯示(參見例如Mattheakis等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022及Hanes等人(2000)Nat Biotechnol.18:1287-92;Hanes等人(2000)Methods Enzymol.328:404-30;及Schaffitzel等人(1999)J Immunol Methods.231(1-2):119-35)及大腸桿菌周質顯示(2005年11月22日;PMID:16337958)。
在一些情況下,scFv可根據此項技術中已知之方法製備(參見例如Bird等人,(1988)Science 242:423-426及Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。可藉由使用可撓性多肽連接子將VH區與VL區連接在一起產生ScFv分子。scFv分子包含具有最佳長度及/或胺基酸組成之連接子(例如Ser-Gly連接子)。連接子長度可大大影響scFv可變區之摺疊及相互作用方式。實際上,若採用短多肽連接子(例如,5-10個之間的胺基酸),則要防止鏈內摺疊。亦需要鏈間摺
疊使兩個可變區一起形成功能性抗原決定基結合位點。對於連接子定向及尺寸之實例,參見例如Hollinger等人1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448;美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號;及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號,其以引用的方式併入本文中。
scFv可在其VL區與VH區之間包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個或50個以上之胺基酸殘基的連接子。連接子序列可包含任何天然存在之胺基酸。在一些實施例中,連接子序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中,連接子序列包含甘胺酸及絲胺酸重複序列之集合,諸如(Gly4Ser)n,其中n為等於或大於1之正整數(SEQ ID NO:25)。在一個實施例中,連接子可為(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。連接子長度之變化可保持或增強活性,在活性研究中產生優良功效。
本文所揭示之例示性CD123 CAR構築體包含scFv(例如,本文在表2、表6及表9中所揭示之人類scFv,視情況前面有視情況存在之前導序列(例如,分別為例示性前導胺基酸序列及核苷酸序列之SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:12)。本文在表2中提供人類scFv片段之序列(SEQ ID NO:157-160之胺基酸序列)。本文在表9中提供人類scFv片段之序列(不含前導序列)(SEQ ID NO:479、481、482及484之核苷酸序列,及SEQ ID NO:478、480、483及485之胺基酸序列)。CD123 CAR構築體可進一步包括視情況存在之鉸鏈域,例如CD8鉸鏈域(例如,包括SEQ ID NO:2之胺基酸序列或藉由SEQ ID NO:13之核酸序列編碼);跨膜域,例如CD8跨膜域(例如,包括SEQ ID NO:6之胺基酸序
列或藉由SEQ ID NO:17之核苷酸序列編碼);胞內域,例如4-1BB胞內域(例如,包括SEQ ID NO:7之胺基酸序列或藉由SEQ ID NO:18之核苷酸序列編碼);及功能性信號傳導域,例如CD3 ξ域(例如,包括SEQ ID NO:9或10之胺基酸序列,或藉由SEQ ID NO:20或21之核苷酸序列編碼)。在某些實施例中,結構域與閱讀框架鄰接且在相同閱讀框架中以形成單一融合蛋白。在其他實施例中,結構域在分離多肽中,例如如本文所描述之RCAR分子中。
在某些實施例中,全長CD123 CAR分子包括表2、表6或表9中所提供之以下各者之胺基酸序列或藉由以下各者之核苷酸序列編碼:CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31或hzCD123-32,或與其實質上相同(例如,95-99%)的序列。
在某些實施例中,CD123 CAR分子或CD123抗原結合域包括表2、表6或表9中所提供之以下各者之scFv胺基酸序列:CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、
hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31或hzCD123-32;或包括以下各者之scFv胺基酸序列或藉由以下各者之核苷酸序列編碼:CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31或hzCD123-32,或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多20、15、10、8、6、5、4、3、2或1個胺基酸改變)的序列。
在某些實施例中,CD123 CAR分子或CD123抗原結合域包括表2或表6中所提供之以下各者之重鏈可變區及/或輕鏈可變區:CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31或hzCD123-32,或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多20、15、10、8、6、5、4、3、2或1個胺基酸改變)的序列。
在某些實施例中,CD123 CAR分子或CD123抗原結合域包括來自表3或表7中所提供之重鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,
HCDR1、HCDR2及/或HCDR3);及/或來自表4或表8中所提供之以下各者之輕鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,LCDR1、LCDR2及/或LCDR3):CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31或hzCD123-32;或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多5、4、3、2或1個胺基酸改變)的序列。
在某些實施例中,CD123 CAR分子或CD123抗原結合域包括表10中所提供之來自重鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,HCDR1、HCDR2及/或HCDR3);及/或來自表11中所提供之以下各者之輕鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,LCDR1、LCDR2及/或LCDR3):CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31或hzCD123-32;或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多5、4、3、2或1個胺基酸改變)的序列。
在某些實施例中,CD123分子或CD123抗原結合域包括表12中所提供之來自重鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,HCDR1、
HCDR2及/或HCDR3);及/或來自表13中所提供之以下各者之輕鏈可變區的一個、兩個或三個CDR(例如,LCDR1、LCDR2及/或LCDR3):CD123-1、CD123-2、CD123-3、CD123-4、hzCD123-1、hzCD123-2、hzCD123-3、hzCD123-4、hzCD123-5、hzCD123-6、hzCD123-7、hzCD123-8、hzCD123-9、hzCD123-10、hzCD123-11、hzCD123-12、hzCD123-13、hzCD123-14、hzCD123-15、hzCD123-16、hzCD123-17、hzCD123-18、hzCD123-19、hzCD123-20、hzCD123-21、hzCD123-22、hzCD123-23、hzCD123-24、hzCD123-25、hzCD123-26、hzCD123-27、hzCD123-28、hzCD123-29、hzCD123-30、hzCD123-31或hzCD123-32;或與任一前述序列實質上相同(例如,95-99%相同,或至多5、4、3、2或1個胺基酸改變)的序列。
scFv域之CDR序列之序列對於重鏈可變域而言展示於表3、表7、表10及表12中,且對於輕鏈可變域而言展示於表4、表8、表11及表13中。「ID」代表各CDR之各別SEQ ID NO。
表3、表4、表7及表8中所提供之CDR係根據Kabat與Chothia編號方案之組合。
表13. 根據Chothia編號方案之輕鏈可變域CDR(Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948)
在實施例中,產生CD123單鏈可變片段且選殖至具有胞內CD3ζ域及胞內4-1BB共刺激域之慢病毒CAR表現載體中。例示性完全人類CD123 scFv之名稱描繪於表1中。
在實施例中,scFv中VL域及VH域出現之次序為變化的(亦即,VL-VH或VH-VL定向),且其中各次單元包含序列GGGGS(SEQ ID NO:25)之「G4S」(SEQ ID NO:25)次單元之三個或四個複本(例如,(G4S)3(SEQ ID NO:28)或(G4S)4(SEQ ID NO:27))連接可變域以產生整個scFv域,如表2、表6及表9中所展示。
CD123 scFv域及CD123 CAR分子之胺基酸及核酸序列提供於表2、表6及表9中。各scFv之可變重鏈及可變輕鏈之胺基酸序列亦提供於表2及表6中。應指出,本發明亦涵蓋具有前導序列(例如,SEQ ID
NO:1之胺基酸序列或SEQ ID NO:12之核苷酸序列)及不具有前導序列(SEQ ID NO:478、480、483、485及556-587)之scFv片段(SEQ ID NO:157-160及184-215)。
前導(胺基酸序列)(SEQ ID NO:1)MALPVTALLLPLALLLHAARP
前導(核酸序列)(SEQ ID NO:12)
CD8鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO:2)
CD8鉸鏈(核酸序列)(SEQ ID NO:13)
CD8跨膜(胺基酸序列)(SEQ ID NO:6)IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
CD8跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO:17)
4-1BB胞內域(胺基酸序列)(SEQ ID NO:7)
4-1BB胞內域(核酸序列)(SEQ ID NO:18)
CD28胞內域(胺基酸序列)(SEQ ID NO:43)
CD28胞內域(核苷酸序列)(SEQ ID NO:44)
ICOS胞內域(胺基酸序列)(SEQ ID NO:45)
ICOS胞內域(核苷酸序列)(SEQ ID NO:46)
CD3 ξ域(胺基酸序列)(SEQ ID NO:9)
CD3 ξ(核酸序列)(SEQ ID NO:20)
CD3 ξ域(胺基酸序列;NCBI參考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO:10)
CD3 ξ(核酸序列;NCBI參考序列NM_000734.3);(SEQID NO:21)
IgG4鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO:36)
IgG4鉸鏈(核苷酸序列)(SEQ ID NO:37)
在實施例中,此等純系在來源於CD3ζ鏈之共同刺激域的信號域中均含有Q/K殘基變化。
在實施例中,本文所描述之CAR分子包含特異性結合至CD123之scFv,且不含有前導序列,例如胺基酸序列SEQ ID NO:1。以下表9
提供不含有前導序列SEQ ID NO:1之CD123 scFv序列的胺基酸及核苷酸序列。
在實施例中,隨後將CAR scFv片段選殖至慢病毒載體中以在單個編碼框架中產生全長CAR構築體,且使用EF1 α啟動子用於表現(SEQ ID NO:11)。
EF1 α啟動子
Gly/Ser(SEQ ID NO:25)GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:26):此序列可涵蓋1-6個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:27)GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:28)GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:29)GGGS
聚A:(A)5000 (SEQ ID NO:30)
此序列可涵蓋50-5000個腺嘌呤。
聚A:(T)100 (SEQ ID NO:31)
聚A:(T)5000 (SEQ ID NO:32)
此序列可涵蓋50-5000個胸腺嘧啶。
聚A:(A)5000 (SEQ ID NO:33)
此序列可涵蓋100-5000個腺嘌呤。
聚A:(A)400 (SEQ ID NO:34)
此序列可涵蓋100-400個腺嘌呤。
聚A:(A)2000 (SEQ ID NO:35)
此序列可涵蓋50-2000個腺嘌呤。
Gly/Ser(SEQ ID NO:709):此序列可涵蓋1至10個「Gly Gly Gly Ser」重複單元GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
CAR scFv片段可選殖至慢病毒載體中以在單個編碼框架中產生全長CAR構築體,且使用EF1 α啟動子用於表現(SEQ ID NO:11)。
CAR構築體可包括具有以下序列中之一或多者的Gly/Ser連接子:GGGGS(SEQ ID NO:25);涵蓋1-6個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元,例如GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:26)、GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGS GGGGS(SEQ ID NO:28)、GGGS(SEQ ID NO:29);或涵蓋1-10個「Gly Gly Gly Ser」重複單元,例如GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS(SEQ ID NO:709)。在實施例中,CAR構築體包括聚A序列,例如涵蓋50-5000個或100-5000個腺嘌呤之序列(例如,SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35)或涵蓋50-5000個胸腺嘧啶之序列(例如,SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32)。或者,CAR構築體可包括例如包括序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG之連接子(SEQ ID NO:704)。
在一實施例中,多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對於不超過兩個抗原具有特異性。雙特異性抗體分子之特徵為具有針對第一抗原決定基之結合特異性的第一免疫球蛋白可變域序列及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的第二免疫球蛋白可變域序列。在一實施例中,第一及第二抗原決定基在相同抗原,例如相同蛋白質(或多聚蛋白質之次單元)上。在一實施例中,第一抗原決定基與第二抗原決定基重疊。在一實施例中,第一抗原決定基與第二抗原決定基不重疊。在一實施例中,第一及第二抗原決定基在不同抗原,例如不同蛋白質(或多聚蛋白質之不同次單元)上。在一個實施例中,雙特異性抗體分子包含具有針對第一抗原決定基之結合特異性的重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列,及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列。在一實施例中,雙特異性抗體分子包含具有針對第一抗原決定基之結合特異性的半抗體及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的半抗體。在一實施例中,雙特異性抗體分子包含具有針對第一抗原決定基之結合特異性的半抗體或其片段及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的半抗體或其片段。在一實施例中,雙特異性抗體分子包含具有針對第一抗原決定基之結合特異性的scFv或其片段及具有針對第二抗原決定基之結合特異性的scFv或其片段。
在某些實施例中,抗體分子為多特異性(例如,雙特異性或三特異性)抗體分子。產生雙特異性或雜二聚抗體分子之協定為此項技術中已知;包括(但不限於)例如:「旋鈕孔」方法,例如US 5731168中所描述;靜電轉向Fc配對,如例如WO 09/089004、WO 06/106905及WO 2010/129304中所描述;鏈交換工程改造結構域(SEED)雜二聚體形成,如例如WO 07/110205中所描述;Fab臂交換,如例如WO
08/119353、WO 2011/131746及WO 2013/060867中所描述;雙抗體共軛,例如使用具有胺反應性基團及硫氫基反應性基團之異雙官能試劑藉由抗體交聯產生雙特異性結構,如例如US 4433059中所描述;經由兩個重鏈之間的二硫鍵之還原及氧化循環藉由重組來自不同抗體的半抗體(重-輕鏈對或Fab)產生雙特異性抗體決定子,如例如US 4444878中所描述;三功能抗體,例如經由硫氫基反應性基團交聯之三個Fab'片段,如例如US5273743中所描述;生物合成結合蛋白,例如經由C端尾部、較佳經由二硫化物或胺反應性化學交聯而交聯之一對scFv,如例如US5534254中所描述;雙官能抗體,例如已置換恆定域之具有經由白胺酸拉鏈(例如,c-fos及c-jun)二聚之不同結合特異性的Fab片段,如例如US5582996中所描述;雙特異性及寡特異性單價及寡價受體,例如經由一個抗體之CH1區與另一抗體之VH區之間的多肽間隔基連接之兩個抗體(兩個Fab片段)的VH-CH1區,通常具有相關輕鏈,如例如US5591828中所描述;雙特異性DNA-抗體共軛物,例如抗體或Fab片段經由雙鏈DNA段交聯,如例如US5635602中所描述;雙特異性融合蛋白,例如含有兩個scFv(在其之間具有親水性螺旋肽連接子)及完整恆定區之表現構築體,如例如US5637481中所描述;多價及多特異性結合蛋白,例如具有含Ig重鏈可變區之結合區的第一結構域及含Ig輕鏈可變區之結合區的第二結構域之多肽二聚體,一般稱為雙功能抗體(亦涵蓋高階結構,創造雙特異性、三特異性或四特異性分子,如例如US5837242中所描述;連接之VL及VH鏈進一步與肽間隔基連接至抗體鉸鏈區及CH3區之微型抗體構築體,其可經二聚形成雙特異性/多價分子,如例如US5837821中所描述;在任一定向上與短肽連接子(例如,5或10個胺基酸)或完全無連接子連接之VH域及VL域,其可形成二聚體以形成雙特異性雙功能抗體、三聚體及四聚體,如例如US5844094中所描述;藉由在進一步與VL域相關聯之C端肽與可交
聯基團連接而連接之VH域(或家族成員中之VL域)鏈帶以形成一連串FVs(或scFv),如例如US5864019中所描述;及單鏈結合多肽,其中經由肽連接子連接之VH域及VL域經由非共價或化學交聯組合成多價結構,使用scFV或雙功能抗體類型格式形成例如同二價、異二價、三價及四價結構,如例如US5869620中所描述。額外例示性多特異性及雙特異性分子及其製造方法可見於例如US5910573、US5932448、US5959083、US5989830、US6005079、US6239259、US6294353、US6333396、US6476198、US6511663、US6670453、US6743896、US6809185、US6833441、US7129330、US7183076、US7521056、US7527787、US7534866、US7612181、US2002004587A1、US2002076406A1、US2002103345A1、US2003207346A1、US2003211078A1、US2004219643A1、US2004220388A1、US2004242847A1、US2005003403A1、US2005004352A1、US2005069552A1、US2005079170A1、US2005100543A1、US2005136049A1、US2005136051A1、US2005163782A1、US2005266425A1、US2006083747A1、US2006120960A1、US2006204493A1、US2006263367A1、US2007004909A1、US2007087381A1、US2007128150A1、US2007141049A1、US2007154901A1、US2007274985A1、US2008050370A1、US2008069820A1、US2008152645A1、US2008171855A1、US2008241884A1、US2008254512A1、US2008260738A1、US2009130106A1、US2009148905A1、US2009155275A1、US2009162359A1、US2009162360A1、US2009175851A1、US2009175867A1、US2009232811A1、US2009234105A1、US2009263392A1、US2009274649A1、EP346087A2、WO0006605A2、WO02072635A2、WO04081051A1、
WO06020258A2、WO2007044887A2、WO2007095338A2、WO2007137760A2、WO2008119353A1、WO2009021754A2、WO2009068630A1、WO9103493A1、WO9323537A1、WO9409131A1、WO9412625A2、WO9509917A1、WO9637621A2、WO9964460A1中。上文提及之申請案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在雙特異性抗體分子之各抗體或抗體片段(例如,scFv)內,VH可為VL之上游或下游。在一些實施例中,上游抗體或抗體片段(例如,scFv)配置成其VH(VH1)在其VL(VL1)上游,且下游抗體或抗體片段(例如,scFv)配置成其VL(VL2)在其VH(VH2)上游,使得整個雙特異性抗體分子具有配置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他實施例中,上游抗體或抗體片段(例如,scFv)配置成其VL(VL1)在其VH(VH1)上游,且下游抗體或抗體片段(例如,scFv)配置成其VH(VH2)在其VL(VL2)上游,使得整個雙特異性抗體分子具有配置VL1-VH1-VH2-VL2。視情況,若構築體配置為VH1-VL1-VL2-VH2,則連接子安置在兩個抗體或抗體片段(例如,scFv),例如VL1與VL2之間,或若構築體配置為VL1-VH1-VH2-VL2,則安置在VH1與VH2之間。連接子可為如本文所描述之連接子,例如(Gly4-Ser)n連接子,其中n為1、2、3、4、5或6,較佳為4(SEQ ID NO:64)。一般而言,兩個scFv之間的連接子應足夠長以避免兩個scFv之域之間錯配。視情況,連接子安置在第一scFv之VL與VH之間。視情況,連接子安置在第二scFv之VL與VH之間。在具有多個連接子之構築體中,任何兩個或兩個以上連接子可相同或不同。因此,在一些實施例中,雙特異性CAR在如本文所描述之配置中包含VL、VH及視情況一或多個連接子。
在一個態樣中,雙特異性抗體分子之特徵為第一免疫球蛋白可變域序列(例如,scFv),其具有針對CD123之結合特異性,例如包含
如本文所描述之scFv(例如,如表2、表6或表9中所描述),或包含來自本文所描述之CD123 scFv的輕鏈CDR及/或重鏈CDR;及第二免疫球蛋白可變域序列,其具有針對不同抗原上的第二抗原決定基之結合特異性。在一些態樣中,第二免疫球蛋白可變域序列具有針對在AML細胞上表現之抗原(例如,除CD123以外的抗原)之結合特異性。舉例而言,第二免疫球蛋白可變域序列具有針對CLL-1之結合特異性。作為另一實例,第二免疫球蛋白可變域序列具有針對CD33之結合特異性。作為另一實例,第二免疫球蛋白可變域序列具有針對CD34之結合特異性。作為另一實例,第二免疫球蛋白可變域序列具有針對FLT3之結合特異性。舉例而言,第二免疫球蛋白可變域序列具有針對葉酸受體β之結合特異性。在一些態樣中,第二免疫球蛋白可變域序列具有針對在B細胞上表現之抗原(例如,CD19、CD20、CD22或ROR1)之結合特異性。
在一個態樣中,本發明之CD123抗體及抗體片段(例如,表2、表6或表9中所揭示之CD123抗體及抗體片段)可移植至T細胞受體(「TCR」)鏈(例如,TCR α或TCR β鏈)之一或多個恆定域,產生特異性結合至CD123之嵌合TCR。在不受理論束縛的情況下,咸信嵌合TCR在抗原結合時將經由TCR複合物進行信號傳導。舉例而言,如本文所揭示之CD123 scFv可移植至TCR鏈(例如,TCR α鏈及/或TCR β鏈)之恆定域(例如,至少一部分胞外恆定域)、跨膜域及細胞質域。作為另一實例,CD123抗體片段(例如,如本文所描述之VL域)可移植至TCR α鏈之恆定域,且CD123抗體片段(例如,如本文所描述之VH域)可移植至TCR β鏈之恆定域(或者,VL域可移植至TCR β鏈之恆定域且VH域可移植至TCR α鏈)。作為另一實例,CD123抗體或抗體片段之CDR,例如如表3、表4、表5、表6、表7、表8、表10、表11、表12或
表13中所描述之CD123抗體或抗體片段之CDR可移植至TCR α及/或β鏈中以產生特異性結合至CD123之嵌合TCR。舉例而言,本文所揭示之LCDR可移植至TCR α鏈之可變域,且本文所揭示之HCDR可移植至TCR β鏈之可變域,或反之亦然。此類嵌合TCR可藉由此項技術中已知之方法產生(例如Willemsen RA等人,Gene Therapy 2000;7:1369-1377;Zhang T等人,Cancer Gene Ther 2004;11:487-496;Aggen等人,Gene Ther.2012年4月;19(4):365-74)。
CD123結合域,例如scFv分子(例如,可溶性scFv)之穩定性可參考習知對照scFv分子或全長抗體之生物物理學特性(例如,熱穩定性)評估。在一個實施例中,在所描述之分析中,人類scFv之熱穩定性比對照結合分子(例如,習知scFv分子)高約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10攝氏度、約11攝氏度、約12攝氏度、約13攝氏度、約14攝氏度或約15攝氏度。
隨後賦予整個CART123構築體以CD123結合域(例如,scFv)的改良之熱穩定性,導致CART123構築體之治療特性改良。與習知抗體相比,CD123結合域(例如,scFv)之熱穩定性可提高至少約2℃或3℃。在一個實施例中,與習知抗體相比,CD123結合域(例如,scFv)之熱穩定性提高1℃。在另一實施例中,與習知抗體相比,CD123結合域(例如,scFv)之熱穩定性提高2℃。在另一實施例中,與習知抗體相比,scFv之熱穩定性提高4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃。可例如在本文所揭示之scFv分子與全長抗體之間進行比較。可使用此項技術中已知之方法量測熱穩定性。舉例而言,在一個實施例中,可量測Tm。下文更詳細描述量測Tm之
方法及測定蛋白質穩定性之其他方法。
scFv之突變改變scFv之穩定性且改良scFv及CART123構築體之整體穩定性。使用諸如Tm、溫度變性及溫度聚集之量測值來確定人類化或人類scFv之穩定性。
突變scFv之結合能力可使用實例中所描述之分析測定。
在一個實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含至少一個突變,使得突變之scFv賦予CART123構築體以改良之穩定性。在另一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個由人類化過程引起之突變,使得突變之scFv賦予CART123構築體以改良之穩定性。
可使用例如下文描述之方法評估抗原結合域之穩定性。此類方法允許測定多個熱展開轉變,其中最不穩定之結構域首先展開或限制合作展開之多域單元(例如,展現單一展開轉變之多域蛋白質)之整體穩定性臨限值。最不穩定結構域可用多種額外方式鑑別。可對結構域限制整體穩定性之探針進行突變誘發。另外,多域蛋白質之蛋白酶抗性可在最不穩定結構域已知經由DSC或其他光譜方法固有地展開之條件下進行(Fontana等人,(1997)Fold.Des.,2:R17-26;Dimasi等人(2009)J.Mol.Biol.393:672-692)。一旦鑑別最不穩定結構域,則編碼此結構域之序列(或其一部分)可用作該等方法中之測試序列。
組合物之熱穩定性可使用此項技術中已知之多種非限制性生物物理學或生物化學技術分析。在某些實施例中,熱穩定性藉由分析光譜法評估。
一種例示性分析光譜法為差示掃描熱量測定(DSC)。DSC採用對伴隨大多數蛋白質或蛋白質域之展開之熱量吸收率敏感的熱量計(參
見例如Sanchez-Ruiz等人,Biochemistry,27:1648-52,1988)。為測定蛋白質之熱穩定性,將蛋白質樣本插入熱量計中且溫度升高,直至Fab或scFv展開。使蛋白質展開之溫度指示整體蛋白質穩定性。
另一例示性分析光譜法為圓二色性(CD)光譜法。CD光譜測定法量測組合物之光學活性隨溫度增加的變化。圓二色性(CD)光譜法量測由於結構不對稱性而出現的左旋偏振光對比右旋偏振光之吸收差異。無序或展開結構產生極不同於有序或摺疊結構之CD光譜。CD光譜反映蛋白質對增加溫度之變性作用的敏感性且因此指示蛋白質之熱穩定性(參見例如van Mierlo及Steemsma,J.Biotechnol.,79(3):281-98,2000)。
用於量測熱穩定性之另一例示性分析光譜法為螢光發射光譜法(參見van Mierlo及Steemsma,上文)。用於量測熱穩定性之又一例示性分析光譜法為核磁共振(NMR)光譜法(參見例如Mierlo及Steemsma,上文)。
組合物之熱穩定性可以生物化學方式量測。用於評估熱穩定性之一例示性生物化學方法為熱攻擊分析。在「熱攻擊分析」中,組合物經受一系列高溫,歷時設定時間段。舉例而言,在一個實施例中,測試scFv分子或包含scFv分子之分子經受一系列遞增溫度,例如1-1.5小時。隨後藉由相關生物化學分析來分析蛋白質之活性。舉例而言,若蛋白質為結合蛋白(例如,scFv或含scFv之多肽),則該結合蛋白之結合活性可藉由功能或定量ELISA測定。
此類分析可以高通量格式及實例中所揭示之彼等格式,使用大腸桿菌及高通量篩選來進行。可使用此項技術中已知之方法產生CD123結合域,例如scFv變異體之庫。可誘導CD123結合域(例如,scFv)表現,且CD123結合域(例如,scFv)可經受熱攻擊。可分析所攻擊之測試樣本的結合情況,且穩定的彼等CD123結合域(例如,scFv)
可按比例擴大且進一步特徵化。
藉由使用以上技術(例如分析光譜法技術)中任一者量測組合物之熔融溫度(Tm)來評估熱穩定性。熔融溫度為熱轉變曲線之中點的溫度,其中組合物之50%分子呈摺疊狀態(參見例如Dimasi等人(2009)J.Mol Biol.393:672-692)。在一個實施例中,CD123結合域(例如,scFv)之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一個實施例中,IgG之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一個實施例中,多價抗體之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。
熱穩定性亦藉由使用分析量熱技術(例如DSC)量測組合物之比熱
或熱容量(Cp)來評估。組合物之比熱為1mol水之溫度升高1℃所需的能量(例如,以kcal/mol為單位)。由於大Cp為變性或失活蛋白質組合物之特點。藉由在組合物熱轉變之前及之後測定其比熱來量測組合物之熱容量變化(△Cp)。熱穩定性亦可藉由量測或測定其他熱力學穩定性參數來評估,所述參數包括展開之吉布斯(Gibbs)自由能(△G)、展開焓(△H)或展開熵(△S)。以上生物化學分析(例如,熱攻擊分析)中之一或多者用於測定使50%組合物保留其活性(例如,結合活性)之溫度(亦即,Tc值)。
另外,與未突變之CD123結合域(例如,scFv)相比,CD123結合域(例如,scFv)之突變改變CD123結合域(例如,scFv)之熱穩定性。當人類化或人類CD123結合域(例如,scFv)併入CART123構築體中時,CD123結合域(例如,人類化或人類scFv)賦予整個CD123 CART構築體以熱穩定性。在一個實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含賦予CD123結合域(例如,scFv)熱穩定性之單一突變。在另一實施例中,CD123結合域(例如,scFv)包含賦予CD123結合域(例如,scFv)熱穩定性之多個突變。在一個實施例中,CD123結合域(例如,scFv)之多個突變對CD123結合域(例如,scFv)之熱穩定性具有累加效應。
組合物之穩定性可藉由量測其聚集之傾向來測定。聚集可藉由許多非限制性生物化學或生物物理技術量測。舉例而言,組合物之聚集可使用層析法,例如尺寸排阻層析法(SEC)評估。SFC基於尺寸分離分子。管柱填充有將准許離子及小分子進入其內部但不准許大分子進入的聚合凝膠之半固體珠粒。當蛋白質組合物施加至管柱頂部時,緊密摺疊蛋白質(亦即,未聚集蛋白質)分佈在比可用於大蛋白聚集物大的體積之溶劑中。因此,大聚集物更快速移動穿過管柱,且以此方式,混合物可分離或分級分離成其組分。各溶離份在自凝膠溶離時可
分開定量(例如藉由光散射)。因此,組合物之聚集%可藉由比較溶離份之濃度與施加至凝膠之蛋白質之總濃度來測定。穩定組合物呈基本上單一溶離份自管柱溶離且在溶離型態或層析圖中以基本上單一峰形式出現。
組合物之穩定性可藉由測定其靶結合親和力來評估。測定結合親和力之多種方法為此項技術中已知。測定結合親和力之一例示性方法採用表面電漿子共振。表面電漿子共振為一種光學現象,其允許藉由例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)偵測生物感測器基質中之蛋白質濃度改變來分析即時生物特異性相互作用。對於進一步描述,參見Jonsson,U.等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques 11:620-627;Johnsson,B.等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131;及Johnnson,B.等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
在一個態樣中,CAR之抗原結合域包含與本文所描述之抗原結合域胺基酸序列同源之胺基酸序列,且抗原結合域保留本文所描述之CD123抗體片段之所需功能特性。在一個特定態樣中,本發明之CAR組合物包含抗體片段。在另一態樣中,彼抗體片段包含scFv。
在各種態樣中,CAR之抗原結合域藉由修飾一個或兩個可變區(例如,VH及/或VL)內,例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內之一或多個胺基酸來工程改造。在一個特定態樣中,本發明之CAR組合物包含抗體片段。在另一態樣中,彼抗體片段包含scFv。
一般技術者應理解,本發明之抗體或抗體片段可進一步經修飾,使得其胺基酸序列(例如,來自野生型)而非所需活性變化。舉例而言,可對蛋白質作出在「非必需」胺基酸殘基處導致胺基酸取代之額外核苷酸取代。舉例而言,分子中之非必需胺基酸殘基可經來自相
同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。在另一實施例中,胺基酸鏈帶可經側鏈家族成員之次序及/或組成不同的結構上類似之鏈帶置換,例如可進行其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的保守取代。
此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族,包括鹼性側鏈(例如,離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如,天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如,甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如,丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如,蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如,酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
在兩個或兩個以上核酸或多肽序列情況下的百分比一致性係指相同的兩個或兩個以上序列。當在比較窗或指定區上比較及比對最大對應時,如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由手動比對及目視檢查所量測,若兩個序列具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(例如,在整個指定區或未指定時整個序列上60%一致性,視情況70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性),則兩個序列「實質上相同」。視情況,一致性存在於至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)長度之區域上,或更佳100至500個或1000個或1000個以上核苷酸(或20、50、200個或200個以上胺基酸)長度之區域上。
就序列比較而言,通常一個序列充當參考序列,測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時,將測試序列及參考序列輸入電腦中,必要時指定子序列座標,且指定序列演算法程式參數。可使用預
設程式參數,或可指定替代參數。序列比較演算法隨後基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列之百分比序列一致性。用於比較之序列比對方法為此項技術中所熟知。可進行用於比較之最佳序列比對,例如藉由Smith及Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c之局部同源演算法,藉由Needleman及Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443之同源比對演算法,藉由Pearson及Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444之相似性方法搜索,藉由此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA),或藉由手動比對及目視檢查(參見例如Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。
適合於測定百分比序列一致性及序列相似性之兩個演算法實例為BLAST及BLAST 2.0演算法,其分別描述於Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402;及Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
亦可使用E.Meyers及W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中),使用PAM120權數殘基表(weight residue table)、12分之空隙長度罰分及4分之空隙罰分來測定兩個胺基酸序列之間的百分比一致性。另外,兩個胺基酸序列之間的百分比一致性可使用Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)演算法(其已併入GCG軟體套件(在www.gcg.com可獲得)中之GAP程式中),使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣,及16、14、12、10、8、6或4之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來測定。
在一個態樣中,本發明涵蓋產生功能上等效分子之起始抗體或
片段(例如,scFv)胺基酸序列之修飾。舉例而言,CAR中所包含之CD123結合域(例如,scFv)之VH或VL可經修飾以保留CD123結合域(例如,scFv)之起始VH或VL構架區的至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。本發明涵蓋整個CAR構築體之修飾,例如CAR構築體之各個結構域之一或多個胺基酸序列的修飾,以便產生功能上等效分子。CAR構築體可經修飾以保留起始CAR構築體之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。
在各種實施例中,關於跨膜域,CAR可經設計以包含附接至CAR之胞外域的跨膜域。跨膜域可包括與跨膜區相鄰之一或多個額外胺基酸,例如與衍生跨膜之蛋白質之胞外區域相關聯的一或多個胺基酸(例如,胞外區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15個胺基酸)及/或與衍生跨膜蛋白之蛋白質之胞內區域相關聯的一或多個額外胺基酸(例如,胞內區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15個胺基酸)。在一個態樣中,跨膜域為與所用CAR之其他結構域中之一者相關聯之跨膜域。在一些情況下,跨膜域可經胺基酸取代選擇或修飾以避免此類結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合,例如使得與受體複合物之其他成員的相互作用降至最低。在一個態樣中,跨膜域能夠與另一CAR在表現CAR之細胞(例如,CART細胞)之細胞表面上均二聚。在不同態樣中,跨膜域之胺基酸序列可經修飾或經取代以使與相同的表現CAR之細胞(例如,CART細胞)中存在之原生結合搭配
物之結合域的相互作用降至最低。
跨膜域可來源於天然或重組來源。在來源為天然時,該結構域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中,不管CAR是否與靶結合,跨膜域均能夠向胞內域進行信號傳導。特定用於本發明中之跨膜域可至少包括以下之跨膜區:例如T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如,CD8 α、CD8 β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些實施例中,跨膜域可至少包括以下之跨膜區:例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C及CD19。
在一些情況下,跨膜域可經由鉸鏈(例如,來自人類蛋白質之鉸鏈)附接至CAR之胞外區,例如CAR之抗原結合域。舉例而言,在一個實施例中,鉸鏈可為人類Ig(免疫球蛋白)鉸鏈,例如IgG4鉸鏈,或CD8a鉸鏈。在一個實施例中,鉸鏈或間隔基包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一個態樣中,跨膜域包含(例如,由其組成)SEQ ID NO:6之跨膜域。
在一個態樣中,鉸鏈或間隔基包含IgG4鉸鏈。舉例而言,在一個實施例中,鉸鏈或間隔基包含以下胺基酸序列之鉸鏈:
(SEQ ID NO:3)。在一些實施例中,鉸鏈或間隔基包含由以下之核苷酸序列編碼之鉸鏈:
(SEQ ID NO:14)。
在一個態樣中,鉸鏈或間隔基包含IgD鉸鏈。舉例而言,在一個
實施例中,鉸鏈或間隔基包含以下胺基酸序列之鉸鏈:
(SEQ ID NO:4)。在一些實施例中,鉸鏈或間隔基包含由以下之核苷酸序列編碼之鉸鏈:
(SEQ ID NO:15)。
在一個態樣中,跨膜域可為重組的,在該情況下,其將主要包含疏水性殘基,諸如白胺酸及纈胺酸。在一個態樣中,重組跨膜域之各端可發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。
視情況,長度為2至10個胺基酸之短寡肽或多肽連接子可在CAR之跨膜域與細胞質區之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供尤其適合之連接子。舉例而言,在一個態樣中,連接子包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)之胺基酸序列。在一些實施例中,連接子由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:16)之核苷酸序列編碼。
在一個態樣中,鉸鏈或間隔基包含KIR2DS2鉸鏈。
本發明CAR之細胞質域或區包括胞內信號傳導域。胞內信號傳導域能夠使已引入CAR之免疫細胞之至少一種正常效應子功能活化。
用於本發明之CAR的胞內信號傳導域之實例包括共同作用以在抗原受體接合後起始信號轉導的T細胞受體(TCR)及共受體之細胞質序列,以及此等序列及具有相同功能性能力之任何重組序列的任何衍生物或變異體。
已知單獨經由TCR產生之信號不足以完全活化T細胞且亦需要次要及/或協同刺激信號。因此,T細胞活化可稱為由兩個不同類別之細胞質信號傳導序列介導:經由TCR起始抗原依賴性主要活化者(主要胞內信號傳導域)及以抗原獨立方式起作用以提供次要或協同刺激信號者(次要細胞質域,例如共刺激域)。
主要信號傳導域以刺激方式或抑制方式調控TCR複合物之主要活化。以刺激方式起作用之主要胞內信號傳導域可含有稱為基於免疫受
體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。
含有具有特定用於本發明中的主要胞內信號傳導域之ITAM之實例包括TCR ξ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(亦稱為「ICOS」)、FcεRI、DAP10、DAP12及CD66d之彼等ITAM。在一個實施例中,本發明之CAR包含胞內信號傳導域,例如CD3-ξ之主要信號傳導域。
在一個實施例中,主要信號傳導域包含經修飾之ITAM域,例如突變之ITAM域,其與原生ITAM域相比具有改變(例如,增加或降低)的活性。在一個實施例中,主要信號傳導域包含含有經修飾ITAM之主要胞內信號傳導域,例如含有最佳化及/或截短ITAM之主要胞內信號傳導域。在一實施例中,主要信號傳導域包含一個、兩個、三個、四個或四個以上ITAM基元。
特定用於本發明中之含有主要胞內信號傳導域之分子的其他實例包括DAP10、DAP12及CD32之彼等分子。
CAR之胞內信號傳導域可包含主要信號傳導域(例如,CD3-ξ信號傳導域)本身或其可與適用於本發明之CAR情況的任何其他所需胞內信號傳導域組合。舉例而言,CAR之胞內信號傳導域可包含主要信號傳導域(例如,CD3 ξ鏈部分)及共刺激信號傳導域。共刺激信號傳導域係指包含共刺激分子之胞內域的CAR之一部分。共刺激分子為除淋巴細胞對抗原有效反應所需之抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子。此類分子之實例包括MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、
SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。舉例而言,CD27共刺激已展現活體外提高人類CART細胞之擴增、效應子功能及存活率且活體內加強人類T細胞持久性及抗腫瘤活性(Song等人.Blood.2012;119(3):696-706)。
本發明之CAR的細胞質部分內之胞內信號傳導序列可以隨機或指定次序彼此連接。視情況,長度為例如2至10個胺基酸(例如,2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)之短寡肽或多肽連接子可在胞內信號傳導序列之間形成連接。在一個實施例中,甘胺酸-絲胺酸二聯體可用作適合連接子。在一個實施例中,例如丙胺酸、甘胺酸之單個胺基酸可用作適合連接子。
在一個態樣中,胞內信號傳導域經設計以包含兩個或兩個以上,例如2、3、4、5個或5個以上共刺激信號傳導域。在一實施例中,兩個或兩個以上(例如,2、3、4、5個或5個以上)共刺激信號傳導域藉由連接子分子(例如,本文所描述之連接子分子)分離。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含兩個共刺激信號傳導域。在一些實施例中,連接子分子為甘胺酸殘基。在一些實施例中,連接子為丙胺酸
殘基。
在一個態樣中,胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及CD28之信號傳導域。在一個態樣中,胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及4-1BB之信號傳導域。在一個態樣中,4-1BB之信號傳導域為SEQ ID NO:7之信號傳導域。在一個態樣中,CD3-ξ之信號傳導域為SEQ ID NO:9(突變CD3-ξ)或SEQ ID NO:10(野生型人類CD3-ξ)之信號傳導域。
在一個態樣中,胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及CD27之信號傳導域。在一個態樣中,CD27之信號傳導域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:8)之胺基酸序列。在一個態樣中,CD27之信號傳導域由以下之核酸序列編碼:
(SEQ ID NO:19)。
在一個態樣中,CD27之信號傳導域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:8)之胺基酸序列。
在一個態樣中,CD27之信號傳導域由以下之核酸序列編碼:
(SEQ ID NO:19)。
在一個態樣中,胞內經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及CD28之信號傳導域。在一個態樣中,CD28之信號傳導域包含SEQ ID NO:379之胺基酸序列。在一個態樣中,CD28之信號傳導域由SEQ ID NO:380之核酸序列編碼。
在一個態樣中,胞內經設計以包含CD3-ξ之信號傳導域及ICOS之信號傳導域。在一個態樣中,CD28之信號傳導域包含SEQ ID NO:381之胺基酸序列。在一個態樣中,ICOS之信號傳導域由SEQ ID NO:382之核酸序列編碼。
在一個態樣中,本文所描述之表現CAR之細胞可進一步包含第二CAR,例如包括不同抗原結合域之第二CAR,例如對於相同靶(CD123)或不同靶(例如,CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸受體β)。在一個實施例中,第二CAR包括在急性骨髓白血病細胞上表現之靶(諸如,CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸受體β)的抗原結合域。在一個實施例中,表現CAR之細胞包含靶向第一抗原且包括具有共刺激信號傳導域而非主要信號傳導域之胞內信號傳導域的第一CAR,及靶向第二不同抗原且包括具有主要信號傳導域而非共刺激信號傳導域之胞內信號傳導域的第二CAR。儘管不希望受理論束縛,共刺激信號傳導域(例如,4-1BB、CD28、CD27、ICOS或OX-40)置放至第一CAR上且主要信號傳導域(例如,CD3 ξ)置放於第二CAR上可限制對表現兩個靶的細胞之CAR活性。在一個實施例中,表現CAR之細胞包含第一CD123 CAR,其包括CD123結合域、跨膜域及共刺激域;及第二CAR,其靶向除CD123以外的抗原(例如在AML細胞上表現之抗原,例如CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸受體β)且包括抗原結合域、跨膜域及主要信號傳導域。在另一實施例中,表現CAR之細胞包含第一CD123 CAR,其包括CD123結合域、跨膜域及主要信號傳導域;及第二CAR,其靶向除CD123以外的抗原(例如在AML細胞上表現之抗原,例如CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸受體β)且包括抗原之抗原結合域、跨膜域及共刺激信號傳導域。
在一個實施例中,表現CAR之細胞包含本文所描述之CD123 CAR及抑制性CAR。在一個實施例中,抑制性CAR包含結合在正常細
胞(例如,亦表現CD123之正常細胞)而非癌細胞上發現之抗原的抗原結合域。在一個實施例中,抑制性CAR包含抑制性分子之抗原結合域、跨膜域及胞內域。舉例而言,抑制性CAR之胞內域可為PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFR β)之胞內域。
在一個實施例中,當表現CAR之細胞包含兩個或兩個以上不同CAR時,不同CAR之抗原結合域可使得抗原結合域不彼此相互作用。舉例而言,表現第一及第二CAR之細胞可具有第一CAR之抗原結合域,例如呈片段形式,例如scFv,其不與第二CAR之抗原結合域形式關聯,例如第二CAR之抗原結合域為VHH。
在一些實施例中,抗原結合域包含單域抗原結合(SDAB)分子,包括互補決定區為單域多肽之部分的分子。實例包括(但不限於)重鏈可變域、天然缺乏輕鏈之結合分子、來源於習知4-鏈抗體之單域、工程改造結構域及除來源於抗體之骨架以外的單域骨架。SDAB分子可為此項領域中之任一者,或任何未來單域分子。SDAB分子可來源於任何物種,包括(但不限於)小鼠、人類、駱駝、大羊駝、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔及牛。此術語亦包括天然存在之單域抗體分子,其來自除駱駝科及鯊魚類以外的物種。
在一個態樣中,SDAB分子可來源於魚中存在之免疫球蛋白的可變區,諸如來源於鯊魚血清中存在的稱為新穎抗原受體(NAR)之免疫球蛋白同型者。製造來源於NAR(「IgNAR」)之可變區的單域分子之方法描述於WO 03/014161及Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中。
根據另一態樣,SDAB分子為天然存在之單域抗原結合分子,其稱為缺乏輕鏈之重鏈。此類單域分子揭示於例如WO 9404678及Hamers-Casterman,C.等人,(1993)Nature 363:446-448中。為清晰之原因,此來源於天然缺乏輕鏈之重鏈分子的可變域在本文中稱為VHH或奈米抗體,以與四鏈免疫球蛋白之習知VH區分。此類VHH分子可來源於駱駝科物種,例如駱駝、大羊駝、單峰駝、羊駝及原駝。除駱駝科以外的其他物種可產生天然缺乏輕鏈之重鏈分子;此類VHH在本發明之範疇內。
SDAB分子可重組、CDR移植、人類化、駱駝化、去免疫及/或活體外產生(例如,藉由噬菌體顯示選擇)。
亦已發現,具有複數個嵌合膜嵌入受體(包含在受體之抗原結合域之間相互作用的抗原結合域)之細胞可能不合需要,因為例如其抑制抗原結合域中之一或多者結合其同源抗原之能力。因此,本文揭示具有第一及第二非天然存在之嵌合膜嵌入受體(包含使此類相互作用降至最低的抗原結合域)之細胞。本文亦揭示編碼第一及第二非天然存在之嵌合膜嵌入受體(包含使此類相互作用降至最低的抗原結合域)之核酸,以及製成及使用此類細胞及核酸之方法。在一實施例中,該第一、該第二非天然存在之嵌合膜嵌入受體中之一者的抗原結合域包含scFv,且另一者包含單VH域,例如駱駝、鯊魚或七鰓鰻單VH域,或來源於人類或小鼠序列之單VH域。
在一些實施例中,所主張之本發明包含第一及第二CAR,其中該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域不包含可變輕鏈域及可變重鏈域。在一些實施例中,該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域為scFv,且另一者不為scFv。在一些實施例中,該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域包含單VH域,例如駱駝、鯊魚或七鰓鰻單VH域,或來源於人類或小鼠序列之單VH域。在一些
實施例中,該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域包含奈米抗體。在一些實施例中,該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域包含駱駝VHH域。
在一些實施例中,該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域包含scFv,且另一者包含單VH域,例如駱駝、鯊魚或七鰓鰻單VH域,或來源於人類或小鼠序列之單VH域。在一些實施例中,該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域包含scFv,且另一者包含奈米抗體。在一些實施例中,該第一CAR、該第二CAR中之一者的抗原結合域包含scFv,且另一者包含駱駝VHH域。
在一些實施例中,當存在於細胞表面上時,該第一CAR之抗原結合域與其同源抗原之結合不因存在該第二CAR而實質上降低。在一些實施例中,該第一CAR之抗原結合域與其同源抗原在該第二CAR存在下之結合為該第一CAR之抗原結合域與其同源抗原在該第二CAR不存在下之結合的85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一些實施例中,當存在於細胞表面上時,該第一CAR、該第二CAR之抗原結合域的彼此關聯小於兩者均為scFv抗原結合域之情況。在一些實施例中,該第一CAR、該第二CAR之抗原結合域的彼此關聯小於兩者均為scFv抗原結合域之情況的85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
在另一態樣中,本文所描述之表現CAR之細胞可進一步表現另一試劑,例如增強表現CAR之細胞之活性的試劑。舉例而言,在一個實施例中,試劑可為抑制抑制性分子之試劑。在一些實施例中,抑制性分子(例如,PD1)可降低表現CAR之細胞建立免疫效應反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、
CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFR β)。在一個實施例中,抑制抑制性分子(例如,為本文所描述之分子)之試劑,例如包含第一多肽(例如,抑制性分子)之試劑,第一多肽與向細胞提供正信號之第二多肽(例如,本文所描述之胞內信號傳導域)相關聯。在一個實施例中,試劑包含:第一多肽,例如抑制性分子,諸如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFR β),或此等中任一者之片段(例如,此等中任一者之胞外域之至少一部分);及第二多肽,其為本文所描述之胞內信號傳導域(例如,包含共刺激域(例如,如本文所描述之41BB、CD27或CD28)及/或主要信號傳導域(例如,本文所描述之CD3 ξ信號傳導域))。在一個實施例中,試劑包含PD1或其片段(例如,PD1之胞外域的至少一部分)之第一多肽及本文所描述之胞內信號傳導域(例如,本文所描述之CD28信號傳導域及/或本文所描述之CD3 ξ信號傳導域)之第二多肽。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞包含開關共刺激受體,例如如以全文引用的方式併入本文中的WO 2013/019615中所描述。PD1為CD28受體家族之一抑制性成員,該受體家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在經活化之B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol 8:765-75)。已展示PD1之兩個配位體PD-L1及PD-L2在與PD1結合後下調T細胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med 192:1027-34;Latchman等人2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter等人2002 Eur J Immunol 32:634-43)。人類癌症中PD-L1極豐富
(Dong等人2003 J Mol Med 81:281-7;Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314;Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。
在一個實施例中,試劑包含抑制性分子之胞外域(ECD),例如程式化死亡1(PD1),其可與跨膜域及胞內信號傳導域(諸如41BB及CD3 ξ)融合(在本文中亦稱為PD1 CAR)。在一個實施例中,PD1 CAR在與本文所描述之CD123 CAR組合使用時改良表現CAR之細胞(例如,T細胞或NK細胞)的持久性。在一個實施例中,CAR為包含如SEQ ID NO:24中帶下劃線所指示之PD1胞外域之PD1 CAR。在一個實施例中,PD1 CAR包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列。
(SEQ ID NO:24)。
在一個實施例中,PD1 CAR包含下文所提供之胺基酸序列(SEQ ID NO:22)。
(SEQ ID NO:22)。
在一個實施例中,試劑包含編碼PD1 CAR(例如,本文所描述之PD1 CAR)之核酸序列。在一個實施例中,PD1 CAR之核酸序列展示於下文中,在SEQ ID NO:23中以下帶下劃線的PD1 ECD
(SEQ ID NO:23)。
在另一態樣中,本發明提供一種表現CAR之細胞(例如,CART細胞或表現CAR之NK細胞)的群體。在一些實施例中,表現CAR之細胞的群體包含表現不同CAR之細胞的混合物。舉例而言,在一個實施例中,表現CAR之細胞(例如,CART細胞或表現CAR之NK細胞)的群體可包括表現具有本文所描述之CD123結合域的CAR之第一細胞,及表現具有不同CD123結合域(例如,本文所描述之不同於由第一細胞表現之CAR中的CD123結合域之CD123結合域)的CAR之第二細胞。作為另一實例,表現CAR之細胞的群體可包括表現包括例如如本文所描述之CD123結合域的CAR之第一細胞,及表現包括除CD123以外的靶(例如,CD33、CD34、CLL-1、FLT3或葉酸受體β)之抗原結合域的CAR之第二細胞。在一個實施例中,表現CAR之細胞的群體包括例如表現包括主要胞內信號傳導域的CAR之第一細胞,及表現包括次要信號傳導域(例如,共刺激信號傳導域)的CAR之第二細胞。
在另一態樣中,本發明提供一種細胞群體,其中群體中之至少一個細胞表現具有本文所描述之CD123域的CAR,且第二細胞表現另一試劑,例如增強表現CAR之細胞之活性的試劑。舉例而言,在一個
實施例中,試劑可為抑制抑制性分子之試劑。在一些實施例中,抑制性分子可例如降低表現CAR之細胞建立免疫效應反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFR β)。在一個實施例中,抑制抑制性分子(例如,為本文所描述之分子)之試劑,例如包含第一多肽(例如,抑制性分子)之試劑,第一多肽與向細胞提供正信號之第二多肽(例如,本文所描述之胞內信號傳導域)相關聯。在一個實施例中,試劑包含:第一多肽,例如抑制性分子,諸如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFR β),或此等中任一者之片段(例如,此等中任一者之胞外域之至少一部分);及第二多肽,其為本文所描述之胞內信號傳導域(例如,包含共刺激域(例如,如本文所描述之41BB、CD27或CD28)及/或主要信號傳導域(例如,本文所描述之CD3 ξ信號傳導域))。在一個實施例中,試劑包含PD1或其片段(例如,PD1之胞外域之至少一部分)之第一多肽,及本文所描述之胞內信號傳導域(例如,本文所描述之CD28信號傳導域及/或本文所描述之CD3 ξ信號傳導域)之第二多肽。
在一個態樣中,本發明提供如下方法,其包含投與表現CAR之細胞(例如,CART細胞或表現CAR之NK細胞)的群體(例如表現不同CAR之細胞的混合物)與另一試劑(例如激酶抑制劑,諸如本文所描述之激
酶抑制劑)之組合。在另一態樣中,本發明提供如下方法,其包含投與細胞群體與另一試劑(例如激酶抑制劑,諸如本文所描述之激酶抑制劑)之組合,其中該群體中之至少一個細胞表現具有如本文所描述之抗癌相關聯抗原結合域的CAR,且第二細胞表現另一試劑,例如增強表現CAR之細胞之活性的試劑。
在一個實施例中,本文所描述之CAR分子包含自然殺手細胞受體(NKR)之一或多種組分,藉此形成NKR-CAR。NKR組分可為來自以下自然殺手細胞受體中任一者之跨膜域、鉸鏈域或細胞質域:殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR),例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1及KIR3DP1;天然細胞毒性受體(NCR),例如NKp30、NKp44、NKp46;免疫細胞受體之信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM)家族,例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME及CD2F-10;Fc受體(FcR),例如CD16及CD64;及Ly49受體,例如LY49A、LY49C。本文所描述之NKR-CAR分子可與銜接分子或胞內信號傳導域(例如,DAP12)相互作用。包含NKR組分之CAR分子的例示性組態及序列描述於國際公開案第WO2014/145252號中,其內容以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中,表現CAR之細胞使用分裂CAR。分裂CAR方法更詳細描述於以引用的方式併入本文中之公開案WO2014/055442及WO2014/055657中。簡言之,分裂CAR系統包含表現具有第一抗原結合域及共刺激域(例如,41BB)的第一CAR之細胞,且該細胞亦表現具有第二抗原結合域及胞內信號傳導域(例如,CD3 ξ)之第二CAR。當
細胞遇到第一抗原時,活化共刺激域且細胞增殖。當細胞遇到第二抗原時,活化胞內信號傳導域且開始細胞殺死活性。因此,表現CAR之細胞僅在兩個抗原存在下完全活化。在實施例中,第一抗原結合域識別CD123,例如包含本文所描述之抗原結合域,且第二抗原結合域識別在急性骨髓白血病細胞上表現之抗原,例如CLL-1、CD33、CD34、FLT3或葉酸受體β。在實施例中,第一抗原結合域識別CD123,例如包含本文所描述之抗原結合域,且第二抗原結合域識別在B細胞上表現之抗原,例如CD19、CD20、CD22或ROR1。
存在許多可調控CAR活性之方式。在一些實施例中,需要CAR活性可受控制的可調控CAR(RCAR)使CAR療法之安全性及功效最佳化。舉例而言,使用例如與二聚結構域融合之卡斯蛋白酶誘導細胞凋亡(參見例如Di等人,N Engl.J.Med.2011年11月3日;365(18):1673-1683)可用作本發明之CAR療法中的安全開關。在另一實例中,表現CAR之細胞亦可表現誘導性卡斯蛋白酶-9(iCaspase-9)分子,該分子在投與二聚體藥物(例如,瑞米杜西(rimiducid)(亦稱為AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))之後導致卡斯蛋白酶-9活化及細胞之細胞凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介導二聚之二聚化學誘導劑(CID)結合域。此導致表現CAR之細胞之誘導性及選擇性耗盡。在一些情況下,iCaspase-9分子由與CAR編碼載體分離之核酸分子編碼。在一些情況下,iCaspase-9分子由與CAR編碼載體相同之核酸分子編碼。iCaspase-9可提供安全開關以避免表現CAR之細胞之任何毒性。參見例如Song等人Cancer Gene Ther.2008;15(10):667-75;Clinical Trial Id.第NCT02107963號;及Di Stasi等人N.Engl.J.Med.2011;365:1673-83。
調控本發明之CAR療法之替代策略包括利用例如藉由使表現CAR
之細胞缺失,例如藉由誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)去活化或切斷CAR活性的小分子或抗體。舉例而言,本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現藉由能夠誘導細胞死亡(例如,ADCC或補體誘導之細胞死亡)的分子識別之抗原。舉例而言,本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現能夠由抗體或抗體片段靶向之受體。此類受體之實例包括EpCAM、VEGFR、整合素(例如,整合素ανβ3、α4、αI¾β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受體超家族之成員(例如,TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受體、干擾素受體、葉酸受體、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受體、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受體、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基礎免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及EGFR,及其截短型式(例如,保存一或多個胞外抗原決定基但缺乏細胞質域內之一或多個區域的型式)。
舉例而言,本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現缺乏信號傳導能力但保留由能夠誘導ADCC之分子(例如,西妥昔單抗(ERBITUX®))識別之抗原決定基的截短之表皮生長因子受體(EGFR),使得西妥昔單抗之投與誘導ADCC且隨後表現CAR之細胞耗盡(參見例如WO2011/056894,及Jonnalagadda等人,Gene Ther.2013;20(8)853-860)。另一策略包括表現使來自本文所描述之表現CAR之細胞中的CD32及CD20抗原之靶抗原決定基組合之高度緊密標記/自殺基因,其結合利妥昔單抗例如藉由ADCC導致表現CAR之細胞的選擇性耗盡(參見例如Philip等人,Blood.2014;124(8)1277-1287)。使本文所描述之表現CAR之細胞耗盡的其他方法包括投與單株抗CD52抗體CAMPATH,
其選擇性結合及靶向成熟淋巴細胞(例如,表現CAR之細胞)以例如藉由誘導ADCC進行破壞。在其他實施例中,表現CAR之細胞可使用CAR配位體,例如抗個體基因型抗體進行選擇性靶向。在一些實施例中,抗個體基因型抗體可引起效應子細胞活性,例如ADCC或ADC活性,藉此減少表現CAR之細胞的數目。在其他實施例中,CAR配位體(例如,抗個體基因型抗體)可偶合至誘導細胞殺死之試劑(例如,毒素),藉此減少表現CAR之細胞的數目。或者,CAR分子自身可經組態使得活性可調控,例如打開及切斷,如下文所描述。
在其他實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞亦可表現藉由T細胞耗盡劑識別之靶蛋白。在一個實施例中,靶蛋白為CD20且T細胞耗盡劑為抗CD20抗體(例如,利妥昔單抗)。在此類實施例中,在期望減少或消除表現CAR之細胞,例如減輕CAR誘導之毒性時投與T細胞耗盡劑。在其他實施例中,T細胞耗盡劑為抗CD52抗體,例如阿侖單抗,如本文實例中所描述。
在其他實施例中,RCAR包含一組多肽,在最簡單實施例中通常為兩個,其中本文所描述之標準CAR之組分,例如抗原結合域及胞內信號傳導域分配於分離多肽或成員上。在一些實施例中,多肽組包括當存在二聚分子時可使多肽彼此偶合,例如可使抗原結合域與胞內信號傳導域偶合之二聚開關。本文及國際公開案第WO2015/090229號(以全文引用的方式併入本文中)中提供此類可調控CAR之額外描述及例示性組態。
在一態樣中,RCAR包含兩個多肽或成員:1)胞內信號傳導成員,其包含胞內信號傳導域(例如,本文所描述之主要胞內信號傳導域)及第一開關域;2)抗原結合成員,其包含如本文所描述之抗原結合域(例如,特異性結合本文所描述之腫瘤抗原)及第二開關域。視情況,RCAR包含本文所描述之跨膜域。在一實施例中,跨膜域可安置
於胞內信號傳導成員、抗原結合成員或兩者上。(除非另外指示,否則當本文描述RCAR的成員或要素時,次序可如所提供,但亦包括其他次序。換言之,在一實施例中,次序如本文所陳述,但在其他實施例中,次序可不同。舉例而言,跨膜區之一側上的要素次序可不同於實例,例如開關域相對於胞內信號傳導域之位置可不同,例如為反向的)。
在一實施例中,第一及第二開關域可形成胞內或胞外二聚開關。在一實施例中,二聚開關可為均二聚開關,例如其中第一及第二開關域相同,或雜二聚開關,例如其中第一及第二開關域彼此不同。
在實施例中,RCAR可包含「多重開關」。多重開關可包含雜二聚開關域或均二聚開關域。多重開關在第一成員(例如,抗原結合成員)及第二成員(例如,胞內信號傳導成員)上獨立地包含複數個(例如,2、3、4、5、6、7、8、9或10個)開關域。在一實施例中,第一成員可包含複數個第一開關域,例如基於FKBP之開關域,且第二成員可包含複數個第二開關域,例如基於FRB之開關域。在一實施例中,第一成員可包含第一及第二開關域,例如基於FKBP之開關域及基於FRB之開關域,且第二成員可包含第一及第二開關域,例如基於FKBP之開關域及基於FRB之開關域。
在一實施例中,胞內信號傳導成員包含一或多個胞內信號傳導域,例如主要胞內信號傳導域,及一或多個共刺激信號傳導域。
在一實施例中,抗原結合成員可包含一或多個胞內信號傳導域,例如一或多個共刺激信號傳導域。在一實施例中,抗原結合成員包含複數個(例如,2或3個)本文所描述之共刺激信號傳導域,例如選自4-1BB、CD28、CD27、ICOS及OX40,且在實施例中,無主要胞內信號傳導域。在一實施例中,抗原結合成員包含以下自胞外至胞內方向之共刺激信號傳導域:4-1BB-CD27;4-1BB-CD27;CD27-4-1BB;
4-1BB-CD28;CD28-4-1BB;OX40-CD28;CD28-OX40;CD28-4-1BB;或4-1BB-CD28。在此類實施例中,胞內結合成員包含CD3ζ域。在一個此類實施例中,RCAR包含(1)抗原結合成員,其包含抗原結合域、跨膜域及兩個共刺激域及第一開關域;及(2)胞內信號傳導域,其包含跨膜域或膜繫栓域及至少一個主要胞內信號傳導域及第二開關域。
實施例提供RCAR,其中抗原結合成員不繫栓至CAR細胞之表面。此使得具有胞內信號傳導成員之細胞方便地與一或多個抗原結合域配對,而不用編碼抗原結合成員之序列使細胞轉型。在此類實施例中,RCAR包含:1)胞內信號傳導成員,其包含:第一開關域、跨膜域、胞內信號傳導域(例如,主要胞內信號傳導域)及第一開關域;及2)抗原結合成員,其包含:抗原結合域及第二開關域,其中抗原結合成員不包含跨膜域或膜繫栓域,且視情況不包含胞內信號傳導域。在一些實施例中,RCAR可進一步包含3)第二抗原結合成員,其包含:第二抗原結合域,例如結合與抗原結合域所結合不同之抗原的第二抗原結合域;及第二開關域。
本文亦提供RCAR,其中抗原結合成員包含雙特異性活化及靶向能力。在此實施例中,抗原結合成員可包含複數個(例如,2、3、4或5個)抗原結合域(例如,scFv),其中各抗原結合域結合至靶抗原,例如不同抗原或相同抗原,例如相同抗原之相同或不同抗原決定基。在一實施例中,複數個抗原結合域串聯,且視情況在抗原結合域中之每一者之間安置連接子或鉸鏈區。本文描述適合之連接子及鉸鏈區。
一個實施例提供具有允許增殖開關之組態的RCAR。在此實施例中,RCAR包含:1)胞內信號傳導成員,其包含:視情況跨膜域或膜繫栓域;一或多個共刺激信號傳導域,例如選自4-1BB、CD28、CD27、ICOS及OX40,及開關域;及2)抗原結合成員,其包含:抗原
結合域、跨膜域及主要胞內信號傳導域,例如CD3ζ域,其中抗原結合成員不包含開關域,或不包含與胞內信號傳導成員上之開關域二聚化的開關域。在一實施例中,抗原結合成員不包含共刺激信號傳導域。在一實施例中,胞內信號傳導成員包含來自均二聚開關之開關域。在一實施例中,胞內信號傳導成員包含雜二聚開關之第一開關域,且RCAR包含第二胞內信號傳導成員,其包含雜二聚開關之第二開關域。在此類實施例中,第二胞內信號傳導成員包含與胞內信號傳導成員相同之胞內信號傳導域。在一實施例中,二聚開關為胞內的。在一實施例中,二聚開關為胞外的。
在本文所描述之任何RCAR組態中,第一及第二開關域包含如本文所描述之基於FKBP-FRB之開關。
本文亦提供包含本文所描述之RCAR的細胞。經工程改造以表現RCAR之任何細胞均可用作RCARX細胞。在一實施例中,RCARX細胞為T細胞,且稱為RCART細胞。在一實施例中,RCARX細胞為NK細胞,且稱為RCARN細胞。
本文亦提供包含RCAR編碼序列之核酸及載體。編碼RCAR之多種要素的序列可安置於相同核酸分子上,例如相同質體或載體,例如病毒載體,例如慢病毒載體。在一實施例中,(i)編碼抗原結合成員之序列及(ii)編碼胞內信號傳導成員之序列可存在於同一核酸(例如,載體)上。可例如藉由使用獨立啟動子或藉由使用雙順反子轉錄產物(其可導致藉由裂解單個轉譯產物或藉由轉譯兩個獨立蛋白質產物產生兩個蛋白質)實現相應蛋白質的製造。在一實施例中,編碼可裂解肽之序列(例如,P2A或F2A序列)安置於(i)與(ii)之間。在一實施例中,編碼IRES(例如,EMCV或EV71IRES)之序列安置於(i)與(ii)之間。在此等實施例中,(i)及(ii)以單個RNA形式轉錄。在一實施例中,第一啟動子可操作地連接於(i)且第二啟動子可操作地連接於(ii),使得(i)及
(ii)以獨立mRNA形式轉錄。
或者,編碼RCAR之多種要素的序列可安置於不同核酸分子上,例如不同質體或載體,例如病毒載體,例如慢病毒載體。舉例而言,(i)編碼抗原結合成員之序列可存在於第一核酸(例如,第一載體)上,且(ii)編碼胞內信號傳導成員之序列可存在於第二核酸(例如,第二載體)上。
二聚開關可為非共價或共價的。在非共價二聚開關中,二聚分子促進開關域之間的非共價相互作用。在共價二聚開關中,二聚分子促進開關域之間的共價相互作用。
在一實施例中,RCAR包含基於FKBP/FRAP或FKBP/FRB之二聚開關。FKBP12(FKBP或FK506結合蛋白)為充當天然產物免疫抑制藥物雷帕黴素之初始胞內靶的豐富細胞質蛋白質。雷帕黴素結合至FKBP及大型PI3K同源物FRAP(RAFT,mTOR)。FRB為足以結合FKBP-雷帕黴素複合物之FRAP之93個胺基酸部分(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.& Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue.Proc Natl Acad Sci U S A 92:4947-51)。
在實施例中,基於FKBP/FRAP(例如,FKBP/FRB)之開關可使用二聚分子,例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物。
FKBP之胺基酸序列如下:
(SEQ ID NO:588)
在實施例中,FKBP開關域可包含能夠在雷帕黴素或雷帕黴素類
似物存在下結合FRB或其片段或類似物之FKBP片段,例如SEQ ID NO:588之帶下劃線的部分,其為:
(SEQ ID NO:589)
FRB之胺基酸序列如下:
(SEQ ID NO:590)
如本文所用之術語「基於FKBP/FRAP(例如,FKBP/FRB)之開關」係指包含以下之二聚開關:第一開關域,其包含能夠在雷帕黴素或雷帕黴素類似物(例如,RAD001)存在下結合FRB或其片段或類似物之FKBP片段或其類似物,且與SEQ ID NO:54或55之FKBP序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或不超過30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個胺基酸殘基不同;及第二開關域,其包含能夠在雷帕黴素或雷帕黴素類似物存在下結合FRB或其片段或類似物之FRB片段或其類似物,且與SEQ ID NO:56之FRB序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或不超過30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個胺基酸殘基不同。在一實施例中,本文所描述之RCAR包含含SEQ ID NO:588(或SEQ ID NO:589)中所揭示之胺基酸殘基的一個開關域,及含SEQ ID NO:590中所揭示之胺基酸殘基的一個開關域。
在實施例中,FKBP/FRB二聚開關包含展現基於FRB之開關域之間的改變(例如,增強)複合物形成之經修飾之FRB開關域,例如經修飾之FRB開關域、基於FKBP之開關域及二聚分子,例如雷帕黴素或雷帕羅吉,例如RAD001。在一實施例中,經修飾之FRB開關域包含一或多個突變,例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上選自
胺基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105及F2108處之突變,其中野生型胺基酸突變成任何其他天然存在之胺基酸。在一實施例中,突變FRB在E2032處包含突變,在E2032處突變成苯丙胺酸(E2032F)、甲硫胺酸(E2032M)、精胺酸(E2032R)、纈胺酸(E2032V)、酪胺酸(E2032Y)、異白胺酸(E2032I)(例如SEQ ID NO:591),或白胺酸(E2032L)(例如SEQ ID NO:592)。在一實施例中,突變FRB在T2098處包含突變,在T2098處突變成苯丙胺酸(T2098F)或白胺酸(T2098L),例如SEQ ID NO:593。在一實施例中,突變FRB在E2032及T2098處包含突變,在E2032處突變成任何胺基酸,且在T2098處突變成任何胺基酸,例如SEQ ID NO:594。在一實施例中,突變FRB包含E2032I及T2098L突變,例如SEQ ID NO:595。在一實施例中,突變FRB包含E2032L及T2098L突變,例如SEQ ID NO:596。
其他適合二聚開關包括基於GyrB-GyrB之二聚開關、基於赤黴素(Gibberellin)之二聚開關、標籤/黏合劑二聚開關及鹵基-標籤/捕捉-標籤二聚開關。遵照本文提供之指導,此類開關及相關二聚分子對於一般技術者將顯而易知。
二聚分子促進開關域之間的關聯。在二聚分子相互作用或開關域之間的關聯存在下,允許與第一開關域相關聯(例如,與其融合)之多肽及與第二開關域相關聯(例如,與其融合)之多肽之間的信號轉導。舉例而言,如本文所描述之系統中所量測,在非限制性含量之二聚分子存在下,信號轉導增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍。
雷帕黴素及雷帕黴素類似物(有時稱為雷帕羅吉),例如RAD001可用作本文所描述之基於FKBP/FRB之二聚開關中的二聚分子。在一實施例中,二聚分子可選自雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus))、RAD001(依維莫司(everolimus))、佐他莫司(zotarolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、AP-23573(地磷莫司(ridaforolimus))、拜利莫司(biolimus)及AP21967。適合於與基於FKBP/FRB之二聚開關一起使用的額外雷帕黴素類似物進一步描述於名稱為「組合療法」之部分或名稱為「與低劑量mTOR抑制劑之組合」的子部分中。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞進一步包含趨化因子受體分子。T細胞中趨化因子受體CCR2b或CXCR2之轉殖基因表現增強運輸至分泌CCL2或CXCL1之包括黑素瘤及神經母細胞瘤的實體腫瘤中(Craddock等人,J Immunother.2010 Oct;33(8):780-8及Kershaw等人,Hum Gene Ther.2002年11月1日;13(16):1971-80)。因此,在不希望受理論束縛的情況下,咸信表現CAR之細胞中表現之識別由腫瘤(例如,實體腫瘤)分泌的趨化因子之趨化因子受體可改良表現CAR之細胞向腫瘤歸巢、促進表現CAR之細胞向腫瘤浸潤及增強表現CAR之細胞的抗腫瘤功效。趨化因子受體分子可包含天然存在或重組之趨化因子受體或其趨化因子結合片段。適合於在本文所描述之表現CAR之細
胞中表現的趨化因子受體分子包括CXC趨化因子受體(例如,CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7)、CC趨化因子受體(例如,CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11)、CX3C趨化因子受體(例如,CX3CR1)、XC趨化因子受體(例如,XCR1)或其趨化因子結合片段。在一個實施例中,基於由腫瘤分泌之趨化因子來選擇待用本文所描述之CAR表現之趨化因子受體分子。在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞進一步包含(例如,表現)CCR2b受體或CXCR2受體。在一實施例中,本文所描述之CAR及趨化因子受體分子位於相同載體或兩個不同載體上。在本文所描述之CAR及趨化因子受體分子位於相同載體上之實施例中,CAR及趨化因子受體分子各自在兩個不同啟動子之控制下或在相同啟動子之控制下。
本文揭示製造活體外轉錄之RNA CAR的方法。本發明亦包括可直接轉染至細胞中之CAR編碼RNA構築體。一種產生用於轉染之mRNA的方法,其可涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板,隨後添加聚A,產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'封端及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現之核酸及長度通常為50-2000個鹼基(SEQ ID NO:35)之聚A尾的構築體。如此產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個態樣中,模板包括CAR之序列。
在一個態樣中,CD123 CAR由信使RNA(mRNA)編碼。在一個態樣中,將編碼CD123 CAR之mRNA引入T細胞中用於產生CART細胞。
在一個實施例中,活體外轉錄之RNA CAR可以短暫轉染形式引入細胞中。藉由使用聚合酶鏈反應(PCR)產生之模板活體外轉錄產生RNA。來自任何來源之所關注的DNA可藉由PCR使用適當引子及RNA聚合酶直接轉化成用於活體外mRNA合成的模板。DNA來源可為例如
基因組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他適當DNA來源。用於活體外轉錄之所要模板為本發明之CAR。舉例而言,RNA CAR之模板包含含抗腫瘤抗體之單鏈可變域的胞外區;鉸鏈區、跨膜域(例如,CD8a之跨膜域);及細胞質區,其包括胞內信號傳導域(例如,包含CD3-ξ之信號傳導域及4-1BB之信號傳導域)。
在一個實施例中,待用於PCR之DNA含有開放閱讀框架。DNA可來自生物體基因組的天然存在之DNA序列。在一個實施例中,核酸可包括一些或全部5'及/或3'未轉譯區域(UTR)。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中,待用於PCR之DNA為人類核酸序列。在另一實施例中,待用於PCR之DNA為包括5'及3' UTR之人類核酸序列。DNA或者可為通常不表現於天然存在之生物體中的人工DNA序列。例示性人工DNA序列為含有接合在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框架的基因部分之序列。接合在一起之DNA部分可來自單個生物體或一種以上生物體。
使用PCR產生用於活體外轉錄用於轉染之mRNA之模板。進行PCR之方法為此項技術中所熟知。用於PCR之引子經設計以具有與待用作PCR模板之DNA區域實質上互補的區域。「實質上互補」如本文所用係指引子序列中之大部分或全部鹼基互補或一或多個鹼基不互補或錯配之核苷酸序列。實質上互補序列能夠與預期DNA靶在用於PCR之黏接條件下黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板之任何部分實質上互補。舉例而言,引子可經設計以擴增通常在細胞中轉錄之核酸部分(開放閱讀框架),包括5'及3' UTR。引子亦可經經設計以擴增編碼所關注的特定結構域之核酸部分。在一個實施例中,引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區,包括全部或部分5'及3' UTR。適用於PCR之引子可藉由此項技術中熟知之合成方法產生。「正向引子」為含有與
DNA模板上在待擴增DNA序列之上游的核苷酸實質上互補之核苷酸區的引子。「上游」在本文中用於指待擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置5。「反向引子」為含有與在待擴增DNA序列之下游的雙鏈DNA模板實質上互補之核苷酸區的引子。「下游」在本文中用於指待擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置3'。
適用於PCR之任何DNA聚合酶可用於本文所揭示之方法中。試劑及聚合酶可購自多個來源。
亦可使用能夠促進穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一個實施例中,5' UTR之長度為1至3000個核苷酸。待添加至編碼區的5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法改變,包括(但不限於)設計黏接至UTR之不同區域的PCR引子。使用此方法,一般技術者可在經轉錄之RNA轉染後改變實現最佳轉譯效率所需的5'及3' UTR長度。
對於所關注的核酸,5'及3' UTR可為天然存在之內源性5'及3' UTR。或者,可藉由將UTR序列併入正向及反向引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加所關注的核酸之非內源性UTR序列。所關注的核酸之非內源性UTR序列之用途可適用於改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言,已知3' UTR序列中之AU富集要素可降低mRNA之穩定性。因此,可選擇及設計3' UTR以基於此項技術中熟知之UTR特性提高經轉錄之RNA的穩定性。
在一個實施例中,5' UTR可含有內源性核酸之克紮克序列(Kozak sequence)。或者,當藉由如上文所描述之PCR添加所關注的核酸之非內源性5' UTR時,共同克紮克序列可藉由添加5'UTR序列重新設計。克紮克序列可提高一些RNA轉錄物之轉譯效率,但似乎並非為所有RNA所需使能夠有效轉譯。此項技術中已知許多mRNA需要克紮克序列。在其他實施例中,5' UTR可為RNA基因組在細胞中穩定之RNA病
毒之5'UTR。在其他實施例中,多種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR以阻礙mRNA之核酸外切酶降解。
為能夠在不需要基因選殖之情況下自DNA模板合成RNA,轉錄啟動子應附接至待轉錄序列上游之DNA模板。當充當RNA聚合酶之啟動子的序列添加至正向引子之5'端時,RNA聚合酶啟動子併入待轉錄之開放閱讀框架上游的PCR產物中。在一個較佳實施例中,啟動子為如本文別處所描述之T7聚合酶啟動子。其他有用啟動子包括(但不限於)T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。此項技術中已知T7、T3及SP6啟動子之共同核苷酸序列。
在一較佳實施例中,mRNA在5'端及3'聚(A)尾均具有封端,確定細胞中之核糖體結合、轉譯起始及mRNA穩定性。在圓形DNA模板(例如,質體DNA)上,RNA聚合酶產生不適合於在真核細胞中表現之長多聯產物。在3' UTR之末端經線性化之質體DNA的轉錄產生正常尺寸之mRNA,其即使在轉錄後經聚腺苷酸化仍在真核轉染中無效。
在線性DNA模板上,噬菌體T7 RNA聚合酶可使轉錄之3'端延伸超過模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985);Nacheva及Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
將聚A/T伸長部整合至DNA模板中之習知方法為分子選殖。然而,整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定,此為獲自細菌細胞之質體DNA模板通常高度混雜有缺失及其他畸變之原因。此使選殖程序不僅費力且費時,但通常不可靠。此為一種允許用聚A/T 3'伸長部構築DNA模板而不高度需要選殖的方法之原因。
可在PCR期間藉由使用含有聚T尾(諸如100T尾(SEQ ID NO:31))之反向引子(尺寸可為50-5000 T(SEQ ID NO:32))或在PCR之後藉由包括(但不限於)DNA接合或活體外重組之任何其他方法產生轉錄DNA
模板之聚A/T片段。聚(A)尾亦向RNA提供穩定性且減少其降解。一般而言,聚(A)尾之長度與經轉錄之RNA的穩定性正相關。在一個實施例中,聚(A)尾為100至5000個腺苷(SEQ ID NO:33)。
RNA之聚(A)尾在使用聚(A)聚合酶(諸如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))活體外轉錄之後可進一步延伸。在一個實施例中,將聚(A)尾之長度由100個核苷酸增至300至400個核苷酸(SEQ ID NO:34),導致RNA之轉譯效率提高約兩倍。另外不同化學基團與3'端之附接可提高mRNA穩定性。此類附接可含有經修飾/人工核苷酸、適體及其他化合物。舉例而言,ATP類似物可使用聚(A)聚合酶併入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步提高RNA穩定性。
5'封端亦向RNA分子提供穩定性。在一較佳實施例中,本文所揭示之方法產生的RNA包括5'封端。使用此項技術中已知及本文所描述之技術提供5'封端(Cougot等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001);Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001);Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
藉由本文所揭示之方法產生的RNA亦可含有內部核糖體入口位點(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒、染色體或人工設計序列,其引發封端獨立性核糖體結合於mRNA且促進轉譯之起始。可包括適合於細胞電穿孔之任何溶解物,其可含有促進細胞滲透性及存活力之因素,諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及界面活性劑。
RNA可使用多種不同方法中之任一者引入靶細胞中,例如包括(但不限於)以下之市售方法:電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或基因脈衝發生器II(Gene Pulser II)(BioRad,Denver,Colo.)、細胞融合儀(Multiporator)(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂質體轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚
合物囊封、肽介導之轉染或生物彈粒子遞送系統(諸如「基因槍」)(參見例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
在一些態樣中,非病毒方法可用於將編碼本文所描述之CAR的核酸遞送至細胞或組織或個體中。
在一些實施例中,非病毒方法包括使用轉座子(亦稱為可轉座要素)。在一些實施例中,轉座子為自身可插入基因組中之位置的DNA片,例如能夠自我複製且將其複本插入基因組中之DNA片,或可自較長核酸剪接且插入基因組中之另一位置的DNA片。舉例而言,轉座子包含由用於轉位之倒置重複側接基因組成之DNA序列。
使用轉座子之核酸遞送的例示性方法包括睡美人轉座子系統(Sleeping Beauty transposon system;SBTS)及piggyBac(PB)轉座子系統。參見例如Aronovich等人Hum.Mol.Genet.20.R1(2011):R14-20;Singh等人Cancer Res.15(2008):2961-2971;Huang等人Mol.Ther.16(2008):580-589;Grabundzija等人Mol.Ther.18(2010):1200-1209;Kebriaei等人Blood.122.21(2013):166;Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16;Bell等人Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65;及Ding等人Cell.122.3(2005):473-83,以上所有者均以引用的方式併入本文中。
SBTS包括兩個組分:1)含有轉殖基因之轉座子及2)轉座酶來源。轉座酶可將來自載體質體(或其他供體DNA)之轉座子轉至靶DNA,諸如宿主細胞染色體/基因組。舉例而言,轉座酶與載體質體/供體DNA結合,切割質體以外的轉座子(包括轉殖基因),且將其插入宿主細胞之基因組中。參見例如Aronovich等人,上文。
例示性轉座子包括基於pT2之轉座子。參見例如Grabundzija等人Nucleic Acids Res.41.3(2013):1829-47;及Singh等人Cancer Res.
68.8(2008):2961-2971,以上兩者均以引用的方式併入本文中。例示性轉座酶包括Tc1/水手型轉座酶,例如SB10轉座酶或SB11轉座酶(一種高活性轉座酶,其可例如自巨細胞病毒啟動子表現)。參見例如Aronovich等人;Kebriaei等人;及Grabundzija等人,以上所有者均以引用的方式併入本文中。
SBTS之使用允許轉殖基因,例如編碼本文所描述之CAR的核酸之有效整合及表現。本文提供例如使用諸如SBTS之轉座子系統,產生穩定表現本文所描述之CAR的細胞(例如,T細胞或NK細胞)之方法。
根據本文所描述之方法,在一些實施例中,將含有SBTS組分之一或多個核酸(例如,質體)遞送至細胞(例如,T或NK細胞)。舉例而言,藉由核酸(例如,質體DNA)遞送之標準方法,例如本文所描述之方法,例如電穿孔、轉染或脂質體轉染來遞送核酸。在一些實施例中,核酸含有包含轉殖基因,例如編碼本文所描述之CAR的核酸之轉座子。在一些實施例中,核酸含有包含轉殖基因(例如,編碼本文所描述之CAR的核酸)以及編碼轉座酶之核酸序列的轉座子。在其他實施例中,提供具有兩種核酸之系統,例如雙質體系統,例如其中第一質體含有包含轉殖基因之轉座子,且第二質體含有編碼轉座酶之核酸序列。舉例而言,第一及第二核酸共遞送至宿主細胞中。
在一些實施例中,藉由使用利用SBTS之基因插入與使用核酸酶(例如,鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系統或經工程改造之大範圍核酸酶再工程改造歸巢核酸內切酶)之基因編輯的組合,產生表現本文所描述之CAR的細胞,例如T或NK細胞。
在一些實施例中,使用非病毒遞送方法允許細胞(例如,T或NK細胞)程式化及細胞直接輸注至個體中。非病毒載體之優點包括(但不
限於)容易及相對低成本地產生滿足患者群體所需的足夠量、儲存期間之穩定性及缺乏免疫原性。
本發明亦提供編碼一或多個本文所描述之CAR構築體的核酸分子。在一個態樣中,核酸分子作為信使RNA轉錄物提供。在一個態樣中,核酸分子作為DNA構築體提供。
因此,在一個態樣中,本發明係關於一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之分離之核酸分子,其中CAR包含CD123結合域(例如,人類化或人類CD123結合域)、跨膜域及包含刺激域(例如,共刺激信號傳導域)及/或主要信號傳導域(例如,ξ鏈)之胞內信號傳導域。在一個實施例中,CD123結合域為本文所描述之CD123結合域,例如包含選自由以下組成之群的序列之CD123結合域:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587,或與其具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中,CD123結合域包含人類CD123結合域,其包含選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:157-160、478、480、483及485。在一個實施例中,CD123結合域包含人類化CD123結合域,其包含選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:184-215及556-587。在一個實施例中,跨膜域為例如本文所描述、例如選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域:T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中,跨膜域包含SEQ ID NO:6之序列或與其具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中,CD123結合域藉由鉸鏈區(例如,本文所描述之鉸鏈)連接至跨膜域。在一個實施例中,鉸鏈區包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5,或與其具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中,分離之核酸分子進一步包含編碼共刺激域之序
列。在一個實施例中,共刺激域為例如本文所描述、例如選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域:MHCI類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。
在一個實施例中,共刺激域包含SEQ ID NO:7之序列或與其具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及CD3 ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8之序列,或與其具有95-99%一致性之序列,及SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列,或與其具有95-99%一致性之序列,其中包含胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。
在另一態樣中,本發明係關於一種編碼CAR構築體之分離之核酸分子,CAR構築體包含:SEQ ID NO:1之前導序列;scFv域,其具有選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587(或與其具有95-99%一致性之序列);SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5(或與其具有95-99%一致性之序列)之鉸鏈區;具有SEQ ID NO:6之序列(或與其具有95-99%一致性之序列)的跨膜域;具有SEQ ID NO:7之序列的4-1BB共刺激域或具有SEQ ID NO:8之序列(或與其具有95-99%一致性之序列)的CD27共刺激域,或具有SEQ ID NO:43之序列(或與其具有95-99%一致性之序列)的CD28共刺激域,或具有SEQ ID NO:45之序列(或與其具有95-99%一致性之序列)的ICOS共刺激域;及具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列(或與其具有95-99%一致性之序列)的CD3 ξ刺激域。
在另一態樣中,本發明係關於一種由核酸分子編碼之分離之多肽分子。在一個實施例中,分離之多肽分子包含選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:98-101及125-156,或與其具有95-99%一致性之序列。
在另一態樣中,本發明係關於一種編碼嵌合抗原受體(CAR)分子之核酸分子,嵌合抗原受體分子包含CD123結合域、跨膜域及包含刺激域之胞內信號傳導域,且其中該CD123結合域包含選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485及556-587,或與其具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中,CD123結合域包含含選自由以下組成之群的序列之人類CD123結合域:SEQ ID NO:157-160、478、480、483及485,或與其具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中,CD123結合域包含含選自由以下組成之群的序列之人類化CD123結合域:SEQ ID NO:184-215及556-
587,或與其具有95-99%一致性之序列。
在一個實施例中,編碼之CAR分子進一步包含編碼共刺激域之序列。在一個實施例中,共刺激域為選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導域:MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。在一個實施例中,共刺激域包含SEQ ID NO:7之序列。
在一個實施例中,跨膜域為選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域:T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋
白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。
在一個實施例中,跨膜域包含SEQ ID NO:6之序列。在一個實施例中胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及ξ之功能性信號傳導域。在一個實施例中,胞內信號傳導域包含SEQ ID NO:7之序列及SEQ ID NO:9之序列,其中包含胞內信號傳導域之序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。在一個實施例中,CD123結合域藉由鉸鏈區連接至跨膜域。在一個實施例中,鉸鏈區包含SEQ ID NO:2。在一個實施例中,鉸鏈區包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
在另一態樣中,本發明係關於一種編碼之CAR分子,其包含:
SEQ ID NO:1之前導序列;scFv域,其具有選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:157-160、184-215、478、480、483、485、556-587,或與其具有95-99%一致性之序列;SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之鉸鏈區;具有SEQ ID NO:6之序列的跨膜域;具有SEQ ID NO:7之序列的4-1BB共刺激域或具有SEQ ID NO:8之序列的CD27共刺激域,或具有SEQ ID NO:43之序列的CD28共刺激域或具有SEQ ID NO:45之序列的ICOS共刺激域;及具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之序列的CD3 ξ刺激域。在一個實施例中,編碼之CAR分子包含選自由以下組成之群的序列:SEQ ID NO:98-101及125-156,或與其具有95-99%一致性之序列。
編碼所要分子之核酸序列可使用此項技術中已知之重組方法獲得,諸如藉由使用標準技術自表現基因之細胞篩選庫、自已知包括基因之載體獲得基因或自含有基因之細胞及組織直接分離。或者,所關注的核酸可以合成方式產生而非選殖。
本發明亦提供插入有本發明之DNA的載體。來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為實現長期基因轉移之適合工具,因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之繁殖。慢病毒載體具有優於來源於致癌反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體的額外優點,因為其可轉導非增殖性細胞,諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之額外優點。反轉錄病毒載體亦可為例如γ反轉錄病毒載體。γ反轉錄病毒載體可包括例如啟動子、封裝信號(ψ)、引子結合位點(PBS)、一或多個(例如,兩個)長末端重複序列(LTR)及所關注的轉殖基因(例如,編碼CAR之基因)。γ反轉錄病毒載體可能缺乏病毒結構一族,諸如gag、pol及env。例示性γ反轉錄病毒載體包括鼠類白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)及骨髓增殖肉瘤病毒(MPSV)及由其衍生之載體。其他γ反轉錄病毒載體描述於例如Tobias Maetzig等人,
「Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application」Viruses.2011 Jun;3(6):677-713中。
在另一實施例中,包含編碼本發明之所要CAR之核酸的載體為腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中,編碼CAR之核酸的表現可使用轉座子,諸如睡美人(sleeping beauty)、克瑞斯鉑(crisper)、CAS9及鋅指核酸酶來實現。參見以下June等人2009Nature Reviews Immunology 9.10:704-716,其以引用的方式併入本文中。
簡言之,編碼CAR之天然或合成核酸之表現通常藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子且將構築體併入表現載體來實現。載體可適合於複製及整合真核生物。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調控所要核酸序列之表現的啟動子。
本發明之表現構築體亦可用於使用標準基因遞送協定之核酸免疫接種及基因療法。基因遞送方法為此項技術中已知。參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號,其以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中,本發明提供基因療法載體。
核酸可選殖至多種類型之載體中。舉例而言,核酸可選殖至包括(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體之載體中。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。
此外,表現載體可以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術為此項技術中所熟知且描述於例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)及其他病毒學與分子生物學手冊中。適用作載體之病毒包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒、腺相關聯病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言,適合載體含有至少一種生物體中起作用
之複製起點、啟動子序列、適宜限制核酸內切酶位點及一或多個可選標記(例如,WO 01/96584;WO 01/29058;及美國專利第6,326,193號)。
已研發出多種基於病毒之系統用於基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言,反轉錄病毒為基因遞送系統提供適宜平台。所選基因可插入載體中且使用此項技術中已知之技術封裝於反轉錄病毒粒子中。重組病毒可隨後經分離且活體內或離體遞送至個體之細胞中。多個反轉錄病毒系統為此項技術中已知。在一些實施例中,使用腺病毒載體。多個腺病毒載體為此項技術中已知。在一個實施例中,使用慢病毒載體。
額外啟動子要素(例如,強化子)調控轉錄起始頻率。通常,此等定位於起始位點上游30-110bp區中,儘管多個啟動子已展示含有亦在起始位點下游之功能性要素。啟動子要素之間的間距通常為靈活的,使得當要素倒置或相對於彼此移動時時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中,啟動子要素之間的間距在活性開始減退之前可增加至相隔50bp。視啟動子而定,個別要素似乎可合作地或獨立地起活化轉錄作用。
能夠表現哺乳動物T細胞中之CAR轉殖基因的啟動子之一實例為EF1a啟動子。原生EF1a啟動子驅動伸長因子-1複合物之α次單元的表現,該複合物負責將胺基醯基tRNA酶促遞送至核糖體。EF1a啟動子已廣泛用於哺乳動物表現質體且已展示有效驅動CAR表現轉殖基因選殖至慢病毒載體中。參見例如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)。在一個態樣中,EF1a啟動子包含提供為SEQ ID NO:11之序列。
啟動子之另一實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅動任何可操作地連接至其上之聚核苷酸序列之高
表現量之強組成性啟動子序列。然而,亦可使用其他組成性啟動子序列,包括(但不限於)猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter),以及人類基因啟動子,諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、伸長因子-1α啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。此外,本發明應不限於組成性啟動子之使用。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之部分。誘導型啟動子之使用提供分子開關,該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列表現或在不需要表現時關閉表現。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
啟動子之另一實例為磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在實施例中,可能需要截短PGK啟動子(例如,相較於野生型PGK啟動子序列具有一或多個,例如1、2、5、10、100、200、300或400個核苷酸缺失之PGK啟動子)。以下提供例示性PGK啟動子之核苷酸序列。
(SEQ ID NO:597)
PGK100:
(SEQ ID NO:598)
PGK200:
(SEQ ID NO:599)
PGK300:
(SEQ ID NO:600)
PGK400:
(SEQ ID NO:601)
載體亦可包括例如促進分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(例如,來自牛生長激素(BGH)基因)、允許游離型複製及在原核生物中複製之要素(例如,SV40起點及ColE1或此項技術中已知之其他要素)及/或允許選擇之要素(例如,耐安比西林(ampicillin)基因及/或勻黴素(zeocin)標記)。
為了評估CAR多肽或其部分之表現,待引入細胞中之表現載體亦可含有可選標記基因或報導基因或兩者以促進自設法經病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中,可選標記可攜載於獨立DNA片上且用於共轉染程序。可選標記及報導基因均可側接適當調控序列以使能夠在宿主細胞中表現。有用可選標記包括例如耐抗生素基因,諸如neo及其類似者。
報導基因用於鑑別潛在經轉染細胞及評估調控序列功能性。一般而言,報導基因為接受者生物體或組織中不存在或表現且編碼表現
藉由一些可易於偵測之特性(例如,酶促活性)體現之多肽的基因。在DNA已引入接受者細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌之鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人,2000 FEBS Letters 479:79-82)。適合表現系統為熟知的且可使用已知技術製備或商購獲得。一般而言,具有展示報導基因最高表現量之最小5'側接區的構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區域可連接至報導基因且用於評估能夠調節啟動子驅動之轉錄的試劑。
在一個實施例中,載體可進一步包含編碼第二CAR之核酸。在一個實施例中,第二CAR包括在急性骨髓白血病細胞上表現之靶(諸如,CD33、CD34、CLL-1、FLT3或葉酸受體β)的抗原結合域。在一個實施例中,載體包含:編碼第一CAR之核酸序列,第一CAR靶向第一抗原且包括具有共刺激信號傳導域而非主要信號傳導域之胞內信號傳導域;及編碼第二CAR之核酸,第二CAR靶向不同的第二抗原且包括具有主要信號傳導域而非共刺激信號傳導域之胞內信號傳導域。在一個實施例中,載體包含:編碼第一CD123 CAR之核酸,第一CD123 CAR包括CD123結合域、跨膜域及共刺激域;及編碼第二CAR之核酸,第二CAR靶向除CD123以外的抗原(例如在AML細胞上表現之抗原,例如CD33、CD34、CLL-1、FLT3或葉酸受體β)且包括抗原結合域、跨膜域及主要信號傳導域。在另一實施例中,載體包含:編碼第一CD123 CAR之核酸,第一CD123 CAR包括CD123結合域、跨膜域及主要信號傳導域;及編碼第二CAR之核酸,第二CAR靶向除CD123以外的抗原(例如在AML細胞上表現之抗原,例如CD33、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸受體β)且包括抗原之抗原結合域、跨膜域及共刺激信號傳導域。
在一個實施例中,載體包含編碼本文所描述之CD123 CAR的核
酸及編碼抑制性CAR之核酸。在一個實施例中,抑制性CAR包含結合在正常細胞(例如,亦表現CD123之正常細胞)而非癌細胞上發現之抗原的抗原結合域。在一個實施例中,抑制性CAR包含抑制性分子之抗原結合域、跨膜域及胞內域。舉例而言,抑制性CAR之胞內域可為PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR(例如,TGFR β)之胞內域。
在實施例中,載體可包含兩個或兩個以上編碼CAR之核酸序列,CAR例如本文所描述之CD123 CAR及第二CAR,例如抑制性CAR或特異性結合至除CD123以外的抗原(例如,在AML細胞上表現之抗原,例如CLL-1、CD33、CD34、FLT3或葉酸受體β)之CAR。在此類實施例中,兩個或兩個以上編碼CAR之核酸序列由相同框架中且呈單個多肽鏈形式之單一核分子編碼。在此態樣中,兩個或兩個以上CAR可例如藉由一或多個肽裂解位點分離。(例如,胞內蛋白酶之自動裂解位點或受質)。肽裂解位點之實例包括以下,其中GSG殘基為視情況存在的:
T2A:(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:602)
P2A:(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:603)
E2A:(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:604)
F2A:(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:605)
向細胞中引入及表現基因之方法為此項技術中已知。在表現載體之情況下,載體易於藉由此項技術中之任何方法引入宿主細胞(例如,哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。舉例而言,表現載體可藉由物理、化學或生物方式轉移至宿主細胞中。
將聚核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。製造包含載體及/或外源性核酸之細胞的方法為此項技術中熟知。參見例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。將聚核苷酸引入宿主細胞中之一較佳方法為磷酸鈣轉染。
將所關注的聚核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入哺乳動物(例如,人類)細胞中之方法。其他病毒載體可來源於慢病毒、痘病毒、I型單純疱疹病毒、腺病毒及腺相關聯病毒及其類似病毒。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
將聚核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統,諸如大分子複合物、奈米囊劑、微球、珠粒及基於脂質之系統,包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之一例示性膠態系統為脂質體(例如,人工膜泡)。可獲得的目前先進技術中靶向遞送核酸之其他方法,諸如用靶向奈米粒子或其他適合之亞微米尺寸的遞送系統遞送聚核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情況下,例示性遞送媒劑為脂質體。涵蓋使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中,核酸可與脂質相關聯。與脂質相關聯之核酸可囊封於脂質體之水性內部中,穿插於脂質體之脂質雙層內,經由與脂質體及寡核苷酸相關聯之連接分子附接至脂質體、包覆於脂質體中,與脂質體複合,分散於含有脂質之溶液中,與脂質混合,與脂質組合,以懸浮液形式含於脂質中,含有微胞或與微胞複合,或以其他方式與脂質相關聯。與組合物相關聯之脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言,其可存在於雙層結構
中,呈微胞形式或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地穿插於溶液中,可能形成尺寸或形狀不均勻的聚集物。脂質為可為天然存在之脂質或合成脂質的脂肪物質。舉例而言,脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。
適合於使用之脂質可獲自商業來源。舉例而言,二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可獲自Sigma,St.Louis,MO;磷酸三十二烷基酯(「DCP」)可獲自K & K Laboratories(Plainview,NY);膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring;二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)。氯仿或氯仿/甲醇中之脂質儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿用作唯一的溶劑,因為其比甲醇更易於蒸發。「脂質體」為涵蓋藉由產生封閉脂質雙層或聚集物所形成之多種單層及多層脂質媒劑的通用術語。脂質體之特徵可為具有囊泡結構,其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分離之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前經歷自身重組且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶解物(Ghosh等人,1991 Glycobiology 5:505-10)。然而,亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同之結構的組合物。舉例而言,脂質可呈現微胞結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋脂染胺-核酸複合物。
不管用於將外源性核酸引入宿主細胞或以其他方式使細胞暴露於本發明之抑制劑的方法,為了確認宿主細胞中重組DNA序列之存在,可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知之「分子生物」分析,諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR;「生物化學」分析,諸如偵測特定肽之存在或不存在,例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所描述之分析來鑑別在本發明之範
疇內的試劑。
本發明進一步提供包含編碼CAR之核酸分子的載體。在一個態樣中,CAR載體可直接轉導至細胞(例如免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞)中。在一個態樣中,載體為選殖或表現載體,例如包括(但不限於)以下之載體:一或多個質體(例如,表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一個態樣中,載體能夠表現哺乳動物免疫效應子細胞,例如哺乳動物T細胞或哺乳動物NK細胞中之CAR構築體。在一個態樣中,哺乳動物T細胞為人類T細胞。
在擴增及基因修飾之前,自個體獲得細胞來源(例如免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞)。術語「個體」意欲包括可引發免疫反應之活生物體(例如,哺乳動物)。個體之實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。T細胞可獲自多種來源,包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、肋膜積液、脾組織及腫瘤。
在本發明之某些態樣中,可使用此項技術中可用的多個免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)株。在本發明之某些態樣中,T細胞可獲自使用熟習此項技術者已知之多種技術(諸如FicollTM分離)自個體收集之血液單元。在一個較佳態樣中,藉由清除術獲得來自個體之循環血液的細胞。清除術產物通常含有淋巴細胞,包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一個態樣中,藉由清除術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且將細胞置放於適當緩衝劑或培養基中以用於後續處理步驟。在本發明之一個態樣中,用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一替代態樣中,洗滌溶液缺乏鈣且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若並非全部二價陽離子)。在
鈣不存在下之初始活化步驟可能導致放大之活化。如一般技術者將易於瞭解,洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知之方法實現,諸如藉由根據製造商說明書使用半自動「流通」離心機(例如,Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics細胞保存器5)。洗滌後,可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝劑中,諸如不含Ca不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有緩衝劑之鹽水溶液。或者,可移除清除術樣本之非所要組分且將細胞直接再懸浮於培養基中。
認識到本申請案之方法可利用包含5%或5%以下(例如2%)人類AB血清之培養基條件,且採用已知培養基條件及組合物,例如Smith等人,「Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement」Clinical & Translational Immunology(2015)4,e31;doi:10.1038/cti.2014.31中所描述之培養基條件及組合物。
在一個態樣中,藉由溶解紅血球及例如藉由經PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核細胞,自周邊血液淋巴細胞分離T細胞。T細胞之特異性亞群,諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+ T細胞可藉由正選擇或負選擇技術進一步分離。舉例而言,在一個態樣中,藉由與抗CD3/抗CD28(例如,3x28)共軛珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以正選擇所要T細胞之時間段來分離T細胞。在一個態樣中,該時間段為約30分鐘。在另一態樣中,該時間段在30分鐘至36小時或更長及其間所有整數值範圍內。在另一態樣中,該時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在又一較佳態樣中,該時間段為10至24小時。在一個態樣中,培育時間段為24小時。在相較於其他細胞類型存在極少T細胞的任何情況下可使用較長培育時間分離T細胞,諸如自腫瘤組織或免疫功能不全個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。此外,使用較長培育時間可
提高捕捉CD8+ T細胞之效率。因此,藉由簡單縮短或延長時間使T細胞與CD3/CD28珠粒結合及/或藉由增加或降低珠粒與T細胞之比率(如本文進一步描述),對於或針對在培養起始時或在該方法期間之其他時間點可優先選擇T細胞之亞群。另外,藉由增加或降低珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比率,對於或針對在培養起始時或在其他所要時間點可優先選擇T細胞之亞群。熟習此項技術者將認識到本發明之上下文中亦可使用多個選擇回合。在某些態樣中,可能需要進行選擇程序且在活化及擴增過程中使用「未經選擇之」細胞。「未經選擇之」細胞亦可進行其他選擇回合。
藉由負選擇增濃T細胞群體可使用針對負選擇之細胞所獨特之表面標記的抗體之組合來實現。一種方法為經由負磁性免疫黏附或流動式細胞量測術分選及/或選擇細胞,該負磁性免疫黏附或流動式細胞量測術使用針對負選擇細胞上存在之細胞表面標記之單株抗體混合物。舉例而言,為藉由負選擇增濃CD4+細胞,單株抗體混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中,可能需要增濃或正選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+之調控T細胞。或者,在某些態樣中,藉由抗C25共軛之珠粒或其他類似選擇方法耗盡調控T細胞。
本文所描述之方法可包括例如使用例如本文所描述之負選擇技術選擇免疫效應子細胞(例如,作為調控T細胞耗盡群體之T細胞、CD25+耗盡細胞)的特定亞群。較佳地,T調控耗盡細胞群體含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%之CD25+細胞。
在一個實施例中,使用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配位體、IL-2自群體移除調控T細胞(例如,CD25+ T細胞)。在一個實施例中,抗CD25抗體或其片段或CD25結合配位體與例如珠粒之受質共
軛,或以其他方式塗佈於例如珠粒之受質上。在一個實施例中,抗CD25抗體或其片段與如本文所描述之受質共軛。
在一個實施例中,使用來自MiltenyiTM之CD25耗盡劑自群體移除調控T細胞,例如CD25+ T細胞。在一個實施例中,細胞與CD25耗盡劑之比率為1e7個細胞/20微升,或1e7個細胞/15微升,或1e7個細胞/10微升,或1e7個細胞/5微升,或1e7個細胞/2.5微升,或1e7個細胞/1.25微升。在一個實施例中,例如調控T細胞使用例如大於5億個細胞/毫升之CD25+耗盡。在另一態樣中,使用6、7、8或9億個細胞/毫升之細胞濃度。
在一個實施例中,待耗盡之免疫效應子細胞的群體包括約6×109個CD25+ T細胞。在其他態樣中,待耗盡之免疫效應子細胞的群體包括約1×109至1×1010個CD25+ T細胞及其間任何整數值。在一個實施例中,所得T調控耗盡細胞群體具有2×109個調控T細胞(例如,CD25+細胞),或2×109個以下(例如,1×109、5×108、1×108、5×107、1×107或1×107以下個CD25+細胞)。
在一個實施例中,使用具有耗盡導管組(諸如,導管162-01)之CliniMAC系統自群體移除調控T細胞(例如,CD25+細胞)。在一個實施例中,CliniMAC系統在諸如DEPLETION2.1之耗盡設置上操作。
在不希望受特定理論束縛之情況下,在個體中在清除術前或在製造表現CAR之細胞產物期間降低免疫細胞之負調控因子含量(例如,減少不必要免疫細胞、例如TREG細胞之數目)可降低個體復發風險。舉例而言,耗盡TREG細胞之方法為此項技術中已知。減少TREG細胞之方法包括(但不限於)環磷醯胺、抗GITR抗體(本文所描述之抗GITR抗體)、CD25耗盡及其組合。
在一些實施例中,製造方法包含在製造表現CAR之細胞前減少TREG細胞數目(例如,耗盡)舉例而言,製造方法包含樣本(例如,清除
術樣本)與抗GITR抗體及/或抗CD25抗體(或其片段,或CD25結合配位體)接觸,例如以在製造表現CAR之細胞(例如,T細胞、NK細胞)產物前耗盡TREG細胞。
在一實施例中,在收集細胞用於表現CAR之細胞產物製造前將個體用一或多種減少TREG細胞之療法預治療,藉此降低個體面對表現CAR之細胞治療復發的風險。在一實施例中,減少TREG細胞之方法包括(但不限於)向個體投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡或其組合中之一或多者。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25耗盡或其組合中之一或多者可在表現CAR之細胞產物輸注之前、期間或之後進行。
在一實施例中,在收集細胞用於表現CAR之細胞產物製造前將個體用環磷醯胺預治療,藉此降低個體面對表現CAR之細胞治療復發的風險。在一實施例中,在收集細胞用於表現CAR之細胞產物製造前將個體用抗GITR抗體預治療,藉此降低個體面對表現CAR之細胞治療復發的風險。
在一個實施例中,待移除之細胞群體既非調控T細胞或腫瘤細胞,亦非以其他方式負面影響CART細胞之擴增及/或功能的細胞,例如表現CD14、CD11b、CD33、CD15或藉由潛在免疫抑制細胞表現之其他標記之細胞。在一個實施例中,設想此類細胞與調控T細胞及/或腫瘤細胞並行移除,或在該耗盡後移除,或以另一次序移除。
本文所描述之方法可包括一個以上選擇步驟,例如一個以上耗盡步驟。藉由負選擇增濃T細胞群體可例如使用針對負選擇之細胞所獨特之表面標記的抗體之組合來實現。一種方法為經由負磁性免疫黏附或流動式細胞量測術分選及/或選擇細胞,該負磁性免疫黏附或流動式細胞量測術使用針對負選擇細胞上存在之細胞表面標記之單株抗體混合物。舉例而言,為藉由負選擇增濃CD4+細胞,單株抗體混合物可包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
本文所描述之方法可進一步包括自表現腫瘤抗原,例如不包含CD25之腫瘤抗原(例如,CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)之群體移除細胞,藉此提供適合於表現CAR(例如,本文所描述之CAR)的T調控耗盡(例如,CD25+耗盡)及腫瘤抗原耗盡之細胞的群體。在一個實施例中,表現腫瘤抗原之細胞與調控T(例如,CD25+)細胞同時移除。舉例而言,抗CD25抗體或其片段及抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至可用於移除細胞之相同受質(例如,珠粒),或抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至混合物可用於移除細胞之獨立珠粒。在其他實施例中,調控T細胞(例如,CD25+細胞)之移除及表現腫瘤抗原之細胞的移除為連續的,且可例如以任一次序進行。
亦提供如下方法,其包括自群體移除表現檢查點抑制劑(例如,本文所描述之檢查點抑制劑)之細胞,例如PD1+細胞、LAG3+細胞及TIM3+細胞中之一或多者,藉此提供T調控耗盡(例如,CD25+耗盡)細胞及檢查點抑制劑耗盡細胞(例如,PD1+、LAG3+及/或TIM3+耗盡細胞)之群體。例示性檢查點抑制劑包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA及LAIR1。在一個實施例中,表現檢查點抑制劑之細胞與調控T(例如,CD25+)細胞同時移除。舉例而言,抗CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可附接至可用於移除細胞之相同珠粒,或抗CD25抗體或其片段或抗檢查點抑制劑抗體或其片段可附接至混合物可用於移除細胞之獨立珠粒。在其他實施例中,調控T細胞(例如,CD25+細胞)之移除及表現檢查點抑制劑之細胞的移除為連續的,且可例如以任一次序進行。
在一個實施例中,可選擇表現以下中之一或多者的T細胞群體:
IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B及穿孔素,或其他適當分子,例如其他細胞激素。可例如藉由PCT公開案第WO 2013/126712號中所描述之方法確定篩選細胞表現之方法。
為藉由正選擇或負選擇分離所要細胞群體,細胞濃度及表面(例如粒子,諸如珠粒)可變化。在某些態樣中,可能需要顯著減小珠粒與細胞混合在一起的體積(例如,增加細胞濃度)以確保細胞與珠粒最大接觸。舉例而言,在一個態樣中,使用20億個細胞/毫升之濃度。在一個態樣中,使用10億個細胞/毫升之濃度。在另一態樣中,使用大於1億個細胞/毫升。在另一態樣中,使用1000萬、1500萬、2000萬、2500萬、3000萬、3500萬、4000萬、4500萬或5000萬個細胞/毫升之細胞濃度。在又一個態樣中,使用7500萬、8000萬、8500萬、9000萬、9500萬或1億個細胞/毫升之細胞濃度。在其他態樣中,可使用1.25億或1.5億個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外,使用高細胞濃度允許更有效捕捉可能微弱表現所關注的靶抗原之細胞(諸如CD28陰性T細胞),或自存在許多腫瘤細胞之樣本(例如,白血病血液、腫瘤組織等)更有效捕捉細胞。此類細胞群體可具有治療價值且將需要獲得。舉例而言,使用高細胞濃度允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在相關態樣中,可能需要使用較低細胞濃度。藉由顯著稀釋T細胞及表面(例如粒子,諸如珠粒)之混合物,使粒子與細胞之間的相互作用降至最低。此選擇表現大量待結合於粒子之所要抗原的細胞。舉例而言,CD4+ T細胞表現較大量CD28且在稀濃度下比CD8+ T細胞更有效捕捉。在一個態樣中,所用細胞濃度為5×10e6/ml。在其他態樣中,所用濃度可為約1×105/ml至1×106/ml,及其間任何整數值。
在其他態樣中,細胞可在2-10℃或室溫下以不同速度在旋轉器上
培育不同時間長度。
用於刺激之T細胞亦可在洗滌步驟後冷凍。不希望受理論束縛,冷凍及隨後解凍步驟藉由在細胞群體中移除粒細胞及一定程度上移除單核細胞來提供更均勻產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後,細胞可懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為此項技術中已知且將適用於此情況,但一種方法涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS,或含有10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO,或31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基,或含有例如Hespan及PlasmaLyte A之其他適合細胞冷凍培養基,隨後細胞在每分鐘1°之速率下冷凍至-80℃且以氣相儲存於液氮儲存槽中。可使用受控冷凍以及在-20℃下或在液氮中不受控立即冷凍之其他方法。
在某些態樣中,將冷凍保存之細胞如本文所描述解凍及洗滌,且使其在室溫下靜置一小時,隨後使用本發明之方法活化。
本發明之上下文中亦涵蓋在可能需要如本文所描述之擴增細胞之前一段時間自個體收集血液樣本或清除術產物。因此,待擴增之細胞的來源可在任何必要時間點收集,且所要細胞(諸如免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞)經分離及冷凍以稍後用於將受益於細胞療法(例如T細胞療法,諸如本文所描述之彼等療法)之多種疾病或病狀的T細胞療法。在一個態樣中,血液樣本或清除術取自一般健康個體。在某些態樣中,血液樣本或清除術取自處於產生疾病之風險中但尚未產生疾病的一般健康個體,且所關注的細胞經分離及冷凍以供稍後使用。在某些態樣中,免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞可擴增、冷凍且在稍後時間使用。在某些態樣中,在診斷出如本文所描述之特定疾病後不久但在任何治療之前自患者收集樣本。在另一態樣
中,自來自個體的血液樣本或清除術分離細胞,隨後進行多種相關治療模態,包括(但不限於)用以下試劑治療:諸如那他珠單抗(natalizumab)、艾法珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑、化學療法、輻射、免疫抑制劑(諸如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫燒蝕劑(諸如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉賓(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228)及照射。
在本發明之另一態樣中,T細胞在給個體留下功能性T細胞之治療後直接獲自患者。就此而言,已觀測到在某些癌症治療之後,特定言之使用破壞免疫系統之藥物治療之後,在患者通常將自治療恢復的時段期間治療之後不久,獲得之T細胞品質可最佳或其離體擴增之能力得到改良。同樣,在使用本文所描述之方法離體操縱之後,此等細胞之增強移植及活體內擴增可呈較佳狀態。因此,本發明之上下文內涵蓋在此恢復階段期間收集血細胞(包括T細胞)、樹突狀細胞或造血譜系之其他細胞。此外,在某些態樣中,移動(例如,用GM-CSF移動)及調理方案可用於建立個體內之條件,其中尤其在治療之後的界定時間窗期間,特定細胞類型之再增殖、再循環、再生及/或擴增為有利的。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
在一個實施例中,表現CAR分子(例如,本文所描述之CAR分子)之免疫效應子細胞獲自已接收低免疫增強劑量之mTOR抑制劑的個體。在一實施例中,在足夠時間之後或在足夠給藥低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之後,採集經工程改造以表現CAR之免疫效應子細胞(例如,T細胞)的群體,使得個體中或自個體採集之PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞)的含量或PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞)/PD1陽性免疫效應子細胞(例如,T細胞)之比率已至少短暫增加。
在其他實施例中,已或將經工程改造以表現CAR之免疫效應子細胞(例如,T細胞)的群體可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞)數目或增加PD1陰性免疫效應子細胞(例如,T細胞)/PD1陽性免疫效應子細胞(例如,T細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸而經離體處理。
在一個實施例中,T細胞群體缺乏甘油二酯激酶(DGK)。DGK缺乏細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質或具有降低或抑制之DGK活性的細胞。DGK缺乏細胞可藉由基因方法產生,例如投與RNA干擾劑(例如,siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止DGK表現。或者,DGK缺乏細胞可藉由用本文所描述之DGK抑制劑處理產生。
在一個實施例中,T細胞群體缺乏Ikaros。Ikaros缺乏細胞包括不表現Ikaros RNA或蛋白質或具有降低或抑制之Ikaros活性的細胞,Ikaros缺乏細胞可藉由基因方法產生,例如投與RNA干擾劑(例如,siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止Ikaros表現。或者,Ikaros缺乏細胞可藉由用Ikaros抑制劑(例如,來那度胺(lenalidomide))處理產生。
在實施例中,T細胞群體缺乏DGK且缺乏Ikaros,例如不表現DGK及Ikaros,或具有降低或抑制之DGK及Ikaros活性。此類DGK及Ikaros缺乏細胞可藉由本文所描述之任何方法產生。
在一實施例中,NK細胞獲自個體。在另一實施例中,NK細胞為NK細胞株,例如NK-92細胞株(Conkwest)。
在本文所描述之實施例中,免疫效應子細胞可為同種異體免疫效應子細胞,例如T細胞或NK細胞。舉例而言,細胞可為同種異體T細胞,例如缺乏功能性T細胞受體(TCR)及/或人類白血球抗原(HLA)(例如HLA I類及/或HLA II類)表現之同種異體T細胞。
缺乏功能性TCR之T細胞可例如經工程改造使得其不在其表面上表現任何功能性TCR,經工程改造使得其不表現包含功能性TCR的一或多個次單元(例如,經工程改造使得其不表現(或展現降低之表現)TCR α、TCR β、TCR γ、TCR δ、TCR ε及/或TCR ξ),或經工程改造使得其在其表面上產生極少功能性TCR。或者,T細胞可表現實質上受損之TCR,例如藉由表現一或多個TCR次單元之突變或截短形式。術語「實質上受損之TCR」意謂此TCR將不會在宿主中引發不利免疫反應。
本文所描述之T細胞可例如經工程改造使得其不在其表面上表現功能性HLA。舉例而言,本文所描述之T細胞可經工程改造使得HLA(例如,HLA 1類及/或HLA II類)之細胞表面表現下調。在一些態樣中,HLA下調可藉由減少或消除β-2微球蛋白(B2M)之表現來實現。
在一些實施例中,T細胞可缺乏功能性TCR及功能性HLA(例如,HLA I類及/或HLA II類)。
缺乏功能性TCR及/或HLA表現之經修飾之T細胞可藉由任何適合方式獲得,包括一或多個TCR或HLA次單元之基因剔除或阻斷基因表現。舉例而言,T細胞可包括使用siRNA、shRNA、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)阻斷TCR及/或HLA基因表現。
在一些實施例中,同種異體細胞可為不表現或例如藉由本文所描述之任何方法低量表現抑制性分子之細胞。舉例而言,細胞可為不表現或低量表現抑制性分子之細胞,該抑制性分子例如可降低表現CAR之細胞建立免疫效應反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4
(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β。抑制性分子之抑制,例如在DNA、RNA或蛋白質含量上之抑制,可使表現CAR之細胞效能最佳化。在實施例中,可使用例如如本文所描述之抑制性核酸(例如抑制性核酸,例如dsRNA,例如siRNA或shRNA)、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)。
在一些實施例中,細胞中TCR表現及/或HLA表現可使用靶向編碼TCR及/或HLA之核酸的siRNA或shRNA及/或本文所描述之抑制性分子(例如,PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)抑制。
可使用任何習知表現系統(例如,慢病毒表現系統)實現T細胞中siRNA及shRNAs之表現。
下調TCR之一或多種組分表現之例示性shRNA描述於例如美國公開案第2012/0321667號中。下調HLA I類及/或HLA II類基因表現之例示性siRNA及shRNA描述於例如美國公開案第US 2007/0036773號中。
如本文所用之「CRISPR」或「TCR及/或HLA之CRISPR」或「抑制TCR及/或HLA之CRISPR」係指一組叢集規律性間隔之短回文重複序列或包含此組重複序列之系統。如本文所用,「Cas」係指CRISPR相關聯蛋白質。「CRISPR/Cas」系統係指來源於可用於使TCR及/或HLA基因靜默或突變之CRISPR及Cas及/或本文所描述之抑制性分子
(例如,PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)的系統。
天然存在之CRISPR/Cas系統在大約40%定序真細菌基因組及90%定序古菌中發現。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8:172此系統為原核免疫系統類型,其賦予外來遺傳要素(諸如質體及噬菌體)以抗性且提供後天性免疫形式。Barrangou等人(2007)Science 315:1709-1712;Marragini等人(2008)Science 322:1843-1845。
CRISPR/Cas系統已經修飾以用於在諸如小鼠或靈長類動物之真核生物中的基因編輯(靜默、增強或改變特異性基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature 482:331-8此藉由向真核細胞中引入含有特異性設計之CRISPR及一或多個適當Cas的質體來實現。
CRISPR序列有時稱為CRISPR基因座,包含交替重複序列及間隔基。在天然存在之CRISPR中,間隔基通常包含細菌外源之序列,諸如質體或噬菌體序列;在TCR及/或HLA CRISPR/Cas系統中,間隔基來源於TCR或HLA基因序列。
來自CRISPR基因座之RNA藉由Cas蛋白質組成性表現及處理成小RNA。此等包含側接重複序列之間隔基。RNA導引其他Cas蛋白質在RNA或DNA水準下使外源性遺傳要素靜默。Horvath等人(2010)Science 327:167-170;Makarova等人(2006)Biology Direct 1:7間隔基因此充當RNA分子之模板,類似於siRNA。Pennisi(2013)Science 341:833-836。
由於此等天然存在於許多不同類型之細菌中,因此CRISPR之精確排列及Cas基因之結構、功能及數目及其產物在各物種之間略有不
同。Haft等人(2005)PLoS Comput.Biol.1:e60;Kunin等人(2007)Genome Biol.8:R61;Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.60:174-182;Bolotin等人(2005)Microbiol.151:2551-2561;Pourcel等人(2005)Microbiol.151:653-663;及Stern等人(2010)Trends.Genet.28:335-340。舉例而言,Cse(Cas亞型,大腸桿菌)蛋白質(例如,CasA)形成功能性複雜級聯,其將CRISPR RNA轉錄物處理成保留級聯之間隔基-重複單元。Brouns等人(2008)Science 321:960-964。在其他原核生物中,Cas6處理CRISPR轉錄物。大腸桿菌中基於CRISPR之噬菌體不活化需要級聯及Cas3,而非Cas1或Cas2。強烈火球菌(Pyrococcus furiosus)及其他原核生物中之Cmr(Cas RAMP模組)蛋白質與識別及裂解互補靶RNA的小CRISPR RNA形成功能性複合物。較簡單CRISPR系統依賴於蛋白質Cas9,其為具有兩個活性切割位點之核酸酶,雙螺旋的每條鏈各一個。組合Cas9與經修飾之CRISPR基因座RNA可用於基因編輯系統中。Pennisi(2013)Science 341:833-836。
CRISPR/Cas系統可因此用於編輯TCR及/或HLA基因(添加或缺失鹼基對),或引入過早停止,因此降低TCR及/或HLA表現。或者可使用CRISPR/Cas系統,如RNA干擾,以可逆方式關閉TCR及/或HLA基因。在哺乳動物細胞中,例如RNA可將Cas蛋白質導引至TCR及/或HLA啟動子,空間上阻斷RNA聚合酶。
可使用此項技術中已知之技術產生抑制TCR及/或HLA之人工CRISPR/Cas系統,例如美國公開案第20140068797號及Cong(2013)Science 339:819-823中所描述。亦可產生此項技術中已知之抑制TCR及/或HLA之其他人工CRISPR/Cas系統,例如Tsai(2014)Nature Biotechnol.,32:6569-576;美國專利第8,871,445號;第8,865,406號;第8,795,965號;第8,771,945號及第8,697,359號中所描述。
「TALEN」或「HLA及/或TCR之TALEN」或「抑制HLA及/或TCR之TALEN」係指轉錄活化因子樣效應核酸酶,可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶,及/或本文所描述之抑制性分子(例如,PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)。
藉由使TAL效應子DNA結合域與DNA裂解域融合來人工製造TALEN。轉錄活化因子樣作用(TALE)可經工程改造以結合任何所要DNA序列,包括HLA或TCR基因之一部分。藉由組合經工程改造之TALE與DNA裂解域,可產生特異於任何所要DNA序列(包括HLA或TCR序列)之限制酶。此等可隨後引入細胞中,其中其可用於基因組編輯。Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6;及Boch等人(2009)Science 326:1509-12;Moscou等人(2009)Science 326:3501。
TALE為黃單胞菌屬(Xanthomonas)細菌分泌之蛋白質。DNA結合域含有高度保存之重複33-34個胺基酸序列,第12及第13胺基酸除外。此等兩個位置高度變化,展示與特異性核苷酸識別之強相關性。其可因此經工程改造以結合於所要DNA序列。
為製造TALEN,TALE蛋白質融合至核酸酶(N),其為野生型或突變FokI核酸內切酶。已對FokI作出若干突變使其用於TALEN;此等例如改良裂解特異性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.39:e82;Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8;Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.29:731-734;Wood等人(2011)Science 333:307;Doyon等人(2010)Nature Methods 8:74-79;Szczepek等人(2007)Nature Biotech.25:786-793;及Guo等人(2010)J.Mol.Biol.
200:96。
FokI域充當二聚體,需要兩個具有獨特DNA結合域之構築體,以便靶基因組中之位點具有適當定向及間距。TALE DNA結合域與FokI裂解域之間的胺基酸殘基數目及兩個個別TALEN結合位點之間的鹼基數目似乎均為實現高活性水準之重要參數。Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8。
可在細胞內部使用HLA或TCR TALEN產生雙鏈斷裂(DSB)。若修復機制經由非同源端接合不恰當地修復斷裂,則可在斷裂處引入突變。舉例而言,不當修復可能引入框移突變。或者,外來DNA可與TALEN一起引入細胞中;視外來DNA序列及染色體序列而定,此過程可用於校正HLA或TCR基因中之缺陷或將此類缺陷引入wt HLA或TCR基因中,因此降低HLA或TCR表現。
特異於HLA或TCR中之序列的TALEN可使用此項技術中已知之任何方法構築,包括多種使用模組組分之方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29:149-53;Geibler等人(2011)PLoS ONE 6:e19509。
「ZFN」或「鋅指核酸酶」或「HLA及/或TCR之ZFN」或「抑制HLA及/或TCR之ZFN」係指鋅指核酸酶,可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶,及/或本文所描述之抑制性分子(例如,PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷及TGFR β)。
與TALEN一樣,ZFN包含融合至DNA結合域之FokI核酸酶域(或
其衍生物)。在ZFN之情況中,DNA結合域包含一或多個鋅指。Carroll等人(2011)Genetics Society of America 188:773-782;及Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160。
鋅指為藉由一或多個鋅離子穩定之小蛋白質結構基元。鋅指可包含例如Cys2His2,且可識別大約3-bp序列。具有已知特異性之多個鋅指可組合產生多指多肽,其識別約6、9、12、15或18-bp序列。多種選擇及模組總成技術可用於產生識別特異性序列(包括噬菌體顯示)、酵母單雜交系統、細菌單雜交及雙雜交系統及哺乳動物細胞之鋅指(及其組合)。
與TALEN一樣,ZFN必須二聚以裂解DNA。因此,需要一對ZFN來靶向非回文DNA位點。兩種個別ZEN必須結合DNA之相對鏈,將其核酸酶適當地隔開。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5。
亦與TALEN一樣,ZFN可在DNA中形成雙鏈斷裂,其在未適當修復的情況下可產生框移突變,導致細胞中之HLA及/或TCR的表現及量降低。ZFN亦可與同源重組一起用於在HLA或TCR基因中突變。
特異於HLA及/或TCR中之序列的ZFN可使用此項技術中已知之任何方法構築。Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7;Guo等人(2010)J.Mol.Biol.400:96;美國專利公開案2011/0158957;及美國專利公開案2012/0060230。
儘管不希望受任何特定理論束縛,但在一些實施例中,由於T細胞中之縮短端粒,治療T細胞在患者中具有短期持久性;因此,經端粒酶基因轉染可延長T細胞之端粒且提高患者中T細胞之持久性。參見Carl June,「Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic」,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此,在一實
施例中,免疫效應子細胞(例如,T細胞)異位表現端粒酶次單元,例如端粒酶之催化次單元,例如TERT,例如hTERT。在一些態樣中,本發明提供一種產生表現CAR之細胞的方法,其包含使細胞與編碼端粒酶次單元(例如端粒酶之催化次單元,例如TERT,例如hTERT)之核酸接觸。細胞可在與編碼CAR之構築體接觸之前、同時或之後與核酸接觸。
在一個態樣中,本發明提供一種製成免疫效應子細胞(例如,T細胞、NK細胞)群體之方法。在一實施例中,該方法包含:提供免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)群體,使該免疫效應子細胞群體與編碼CAR之核酸接觸;及在允許CAR及端粒酶表現之條件下使該免疫效應子細胞群體與編碼端粒酶次單元(例如,hTERT)之核酸接觸。
在一實施例中,編碼端粒酶次單元之核酸為DNA。在一實施例中,編碼端粒酶次單元之核酸包含能夠驅動端粒酶次單元表現之啟動子。
在一實施例中,hTERT具有如下GenBank蛋白質ID AAC51724.1之胺基酸序列(Meyerson等人,「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization」Cell第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795頁):
(SEQ ID NO:606)
在一實施例中,hTERT具有與SEQ ID NO:606之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在一實施例中,hTERT具有SEQ ID NO:606之序列。在一實施例中,hTERT在N端、C端或兩個端包含缺失(例如,不超過5、10、15、20或30個胺基酸)。在一實施例中,hTERT在N端、C端或兩個端包含轉殖基因胺基酸序列(例如,不超過5、10、15、20或30個胺基酸)。
在一實施例中,hTERT由GenBank寄存編號AF018167之核酸序列編碼(Meyerson等人,「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization」Cell第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795頁):
(SEQ ID NO:607)
在一實施例中,hTERT由序列與SEQ ID NO:607之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核酸編碼。
在一實施例中,hTERT由SEQ ID NO:607之核酸編碼。
細胞一般可使用如下各者中所描述之方法活化及擴增,例如美國專利6,352,694;6,534,055;6,905,680;6,692,964;5,858,358;6,887,466;6,905,681;7,144,575;7,067,318;7,172,869;7,232,566;7,175,843;5,883,223;6,905,874;6,797,514;6,867,041;及美國專利申請公開案第20060121005號。
一般而言,本發明之T細胞可藉由與其上附接有刺激CD3/TCR複合物相關聯信號之試劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子的配位體之表面接觸來擴增。特定言之,T細胞群體可如本文所描述刺激,諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段、或固定於表面上之抗CD2抗體接觸,或藉由與蛋白激酶C活化因子(例如,苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸。為共刺激T細胞表面上之輔助分子,使用結合輔助分子之配位體。舉例而言,T細胞群體可與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖,可使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besançon,France),可按此項技術中通常已知之其他方法使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998;Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999;Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些態樣中,T細胞之主要刺激信號及協同刺激信號可藉由不同協定提供。舉例而言,提供各信號之試劑可在溶液中或偶合至表面。當偶合至表面時,試劑可偶合至同一表面(亦即,呈「順」形式)或獨立表面(亦即,呈「反」形式)。或者,一種試劑可偶合至表面且另一試劑在溶液中。在一個態樣中,提供協同刺激信號之試劑結合至細胞表面且提供主要活化信號之試劑在溶液中或偶合至表面。在某些
態樣中,兩種試劑均可在溶液中。在一個態樣中,該等試劑可呈可溶性形式,且隨後交聯至表面(諸如表現Fc受體之細胞,或抗體,或將結合於該等試劑之其他結合劑)。就此而言,參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號,本發明中涵蓋人工抗原呈現細胞(aAPC)用於活化及擴增T細胞。
在一個態樣中,兩種試劑固定於珠粒上,在同一珠粒上,亦即「順」;或在獨立珠粒上,亦即「反」。藉助於實例,提供主要活化信號之試劑為抗CD3抗體或其抗原結合片段,且提供協同刺激信號之試劑為抗CD28抗體或其抗原結合片段;且兩種試劑均以等效分子量共同固定於同一珠粒。在一個態樣中,使用1:1比率之結合於用於CD4+ T細胞擴增及T細胞生長之珠粒的各抗體。在本發明之某些態樣中,使用一定比率之結合於珠粒之抗CD3:CD28抗體,使得觀測到T細胞擴增相較於使用1:1比率所觀測到的擴增增加。在一個特定態樣中,相較於使用1:1比率觀測到的擴增,觀測到約1倍至約3倍增加。在一個態樣中,結合於珠粒之CD3:CD28抗體之比率在100:1至1:100及其間全部整數值範圍內。在本發明之一個態樣中,結合於粒子之抗CD28抗體比抗CD3抗體多,亦即CD3:CD28之比率小於1。在本發明之某些態樣中,結合於珠粒之抗CD28抗體與抗CD3抗體之比率大於2:1。在一個特定態樣中,使用1:100之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中,使用1:75之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在另一態樣中,使用1:50之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中,使用1:30之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個較佳態樣中,使用1:10之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在一個態樣中,使用1:3之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。在又一個態樣中,使用3:1之結合於珠粒的抗體CD3:CD28比率。
可使用1:500至500:1及其間任何整數值的粒子與細胞之比率來刺
激T細胞或其他靶細胞。如一般技術者可易於瞭解,粒子與細胞之比率可視相對於靶細胞之粒徑而定。舉例而言,小尺寸珠粒可僅結合少數細胞,而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中,細胞與粒子之比率在1:100至100:1及其間任何整數值範圍內,且在其他態樣中,包含1:9至9:1及其間任何整數值之比率亦可用於刺激T細胞。導致T細胞刺激之抗CD3及抗CD28偶合粒子與T細胞之比率可如上所述變化,然而某些較佳值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1及15:1,其中一個較佳比率為至少1:l粒子/T細胞。在一個態樣中,使用1:1或1:1以下之粒子與細胞之比率。在一個特定態樣中,較佳粒子:細胞比率為1:5。在其他態樣中,粒子與細胞之比率可視刺激天數而變化。舉例而言,在一個態樣中,粒子與細胞之比率在第一天為1:1至10:1,且其後每天或每隔一天向細胞添加額外粒子直至10天,最終比率為1:1至1:10(以添加當天之細胞數計)。在一個特定態樣中,粒子與細胞之比率在刺激第一天為1:1且在刺激第三天及第五天調整至1:5。在一個態樣中,在每天或每隔一天基礎上添加粒子直至第一天的最終比率為1:1,且在刺激第三天及第五天為1:5。在一個態樣中,粒子與細胞之比率在刺激第一天為2:1且在刺激第三天及第五天調整至1:10。在一個態樣中,在每天或每隔一天基礎上添加粒子直至第一天的最終比率為1:1,且在刺激第三天及第五天為1:10。熟習此項技術者將瞭解多種其他比率可適合用於本發明。特定言之,比率將視粒徑及細胞尺寸及類型而變化。在一個態樣中,第一天使用之大多數典型比率在1:1、2:1及3:1的鄰域中。
在本發明之其他態樣中,細胞(諸如T細胞)與試劑塗佈之珠粒組合,隨後分離珠粒與細胞,且隨後培養細胞。在一替代態樣中,在培養之前,試劑塗佈之珠粒及細胞不分離,而是一起培養。在另一態樣
中,珠粒及細胞首先藉由施加力(諸如磁力)集中,導致細胞表面標記之接合增加,藉此誘導細胞刺激。
藉助於實例,細胞表面蛋白質可藉由使附接有抗CD3及抗CD28之順磁性珠粒(3×28珠粒)與T細胞接觸而接合。在一個態樣中,在例如PBS之緩衝劑(不具有二價陽離子,諸如鈣及鎂)中組合細胞(例如,104至109個T細胞)與珠粒(例如,1:1比率之DYNABEADS® M-450CD3/CD28 T順磁性珠粒)。此外,一般技術者可易於瞭解可使用任何細胞濃度。舉例而言,樣本中的靶細胞可能極少且僅占樣本之0.01%,或全部樣本(亦即,100%)可包含所關注的靶細胞。因此,任何細胞數目均在本發明之上下文中。在某些態樣中,可能需要顯著降低粒子與細胞混合在一起的體積(亦即,增加細胞濃度)以確保細胞與粒子最大接觸。舉例而言,在一個態樣中,使用約100億個細胞/毫升、90億個細胞/毫升、80億個細胞/毫升、70億個細胞/毫升、60億個細胞/毫升、50億個細胞/毫升或20億個細胞/毫升之濃度。在一個態樣中,使用大於1億個細胞/毫升。在另一態樣中,使用1000萬、1500萬、2000萬、2500萬、3000萬、3500萬、4000萬、4500萬或5000萬個細胞/毫升之細胞濃度。在又一個態樣中,使用7500萬、8000萬、8500萬、9000萬、9500萬或1億個細胞/毫升之細胞濃度。在其他態樣中,可使用1.25億或1.5億個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外,使用高細胞濃度允許更有效捕捉可能微弱表現所關注的靶抗原之細胞,諸如CD28陰性T細胞。此類細胞群體可具有治療價值且在某些態樣中將需要獲得。舉例而言,使用高細胞濃度允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一個實施例中,經編碼CAR(例如,本文所描述之CAR)之核酸轉導之細胞例如藉由本文所描述之方法擴增。在一個實施例中,細胞
在培養物中擴增幾小時(例如,約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小時)至約14天(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)之時段。在一個實施例中,細胞擴增4至9天之時段。在一個實施例中,細胞擴增8天或8天以下,例如7、6或5天之時段。在一個實施例中,細胞(例如,本文所描述之CD123 CAR細胞)在培養物中擴增5天,且所得細胞比在培養物中在相同培養條件下擴增9天之相同細胞更有效。效力可例如藉由各種T細胞功能,例如增殖、靶細胞殺死、細胞激素產生、活化、遷移或其組合來界定。在一個實施例中,擴增5天之細胞(例如,本文所描述之CD123 CAR細胞)展示與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比,在抗原刺激時細胞加倍至少一、二、三或四倍。在一個實施例中,細胞(例如,表現本文所描述之CD123 CAR的細胞)在培養物中擴增5天,且所得細胞展現比在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞更高的促炎性細胞激素產量,例如IFN-γ及/或GM-CSF含量。在一個實施例中,擴增5天之細胞(例如,本文所描述之CD123 CAR細胞)展示與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比,促炎性細胞激素產量(以pg/ml計),例如IFN-γ及/或GM-CSF含量增加至少一、二、三、四、五、十倍或十倍以上。
在本發明之一個態樣中,混合物可培養幾小時(約3小時)至約14天或其間任何小時整數值。在一個態樣中,混合物可培養21天。在本發明之一個態樣中,珠粒與T細胞一起培養約八天。在一個態樣中,珠粒與T細胞一起培養2-3天。亦可能需要若干刺激循環使得T細胞培養時間可為60天或60天以上。適於T細胞培養之條件包括可含有增殖及存活力必需之因素的適當培養基(例如,最低限度必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15(Lonza)),包括血清(例如,胎兒牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、
IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習此項技術者已知之用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)界面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑,諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、優化劑(Optimizer),添加有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素,無血清或補充有適量血清(或血漿)或限定激素組,及/或足以T細胞生長及擴增之量的細胞激素。抗生素(例如,青黴素及鏈黴素)僅包括於實驗培養物中,而不在待輸注至個體之細胞培養物中。靶細胞保持於支持生長所必需之條件下,例如適當溫度(例如,37℃)及氛圍(例如,空氣加5% CO2)。
在一個實施例中,細胞在包括一或多種介白素之適當培養基(例如,本文所描述之培養基)中擴增,導致例如如藉由本文所描述之方法(諸如流動式細胞量測術)所量測,在14天擴增時段內,細胞增加至少200倍(例如,200倍、250倍、300倍、350倍)。在一個實施例中,細胞在IL-15及/或IL-7(例如,IL-15及IL-7)存在下擴增。
在實施例中,本文所描述之方法,例如表現CAR之細胞製造方法包含例如使用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配位體、IL-2自細胞群體移除調控T細胞(例如,CD25+ T細胞)。本文描述自細胞群體移除調控T細胞(例如,CD25+ T細胞)之方法。在實施例中,該等方法(例如,製造方法)進一步包含使細胞群體(例如,已耗盡調控T細胞(諸如CD25+ T細胞)之細胞群體;或已預先接觸抗CD25抗體、其片段或CD25結合配位體之細胞群體)與IL-15及/或IL-7接觸。舉例而言,細胞群體(例如,已預先接觸抗CD25抗體、其片段或CD25結合配位體)在IL-15及/或IL-7存在下擴增。
在一些實施例中,在例如離體製造表現CAR之細胞期間,使本文所描述之表現CAR之細胞與包含介白素-15(IL-15)多肽、介白素-15受
體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽與IL-15Ra多肽之組合(例如,hetIL-15)的組合物接觸。在實施例中,在例如離體製造表現CAR之細胞期間使本文所描述之表現CAR之細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在實施例中,在例如離體製造表現CAR之細胞期間使本文所描述之表現CAR之細胞與包含IL-15多肽與IL-15 Ra多肽兩者之組合的組合物接觸。在實施例中,在例如離體製造表現CAR之細胞期間使本文所描述之表現CAR之細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。
在一個實施例中,在離體擴增期間使本文所描述之表現CAR之細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。在一實施例中,在離體擴增期間使本文所描述之表現CAR之細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在一實施例中,在離體擴增期間使本文所描述之表現CAR之細胞與包含IL-15多肽與IL-15Ra多肽之組合物接觸。在一個實施例中,接觸導致淋巴細胞亞群,例如CD8+ T細胞存活且增殖。
已暴露於不同刺激時間之T細胞可展現不同特徵。舉例而言,典型血液或球形周邊血液單核細胞產物具有大於細胞毒素或抑制T細胞群體(TC、CD8+)之輔助T細胞群體(TH、CD4+)。藉由刺激CD3及CD28受體離體擴增T細胞產生在約第8天至第9天之前主要由TH細胞組成之T細胞群體,而在約第8天至第9天之後,T細胞群體包含愈來愈大的TC細胞群體。因此,視治療目的而定,向個體輸注主要包含TH細胞之T細胞群體可能有利。類似地,若已分離TC細胞之抗原特異性亞群,則在更大程度上擴增此亞群可為有益的。
此外,除了CD4及CD8標記之外,其他表型標記顯著變化,但大部分在細胞擴增製程之過程期間可再現。因此,此類再現性使能夠針對特定目的調整活化T細胞產物。
構築CD123 CAR之後,各種分析可用於評估分子活性,諸如(但不限於)在抗原刺激之後擴增T細胞、在再刺激不存在下持續T細胞擴
增之能力及在適當活體外及動物模型中之抗癌活性。下文進一步詳細描述評估CD123 CAR之作用的分析。
初級T細胞中CAR表現之西方墨點分析可用於偵測單體及二聚體之存在。參見例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)簡言之,表現CAR之T細胞(CD4+及CD8+ T細胞之1:1混合物)活體外擴增超過10天,隨後在還原條件下溶解且SDS-PAGE。藉由西方墨點法使用TCR-ζ鏈之抗體偵測含有全長TCR-ζ細胞質域及內源性TCR-ζ鏈之CAR。在非還原條件下使用相同T細胞亞群用於SDS-PAGE分析以允許評估共價二聚體形成。
可藉由流動式細胞量測術量測CAR+ T細胞在抗原刺激後之活體外擴增。舉例而言,CD4+及CD8+ T細胞之混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激,隨後在待分析之啟動子控制下經表現GFP之慢病毒載體轉導。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在培養第6天藉由流動式細胞量測術評估CD4+及/或CD8+ T細胞亞群之GFP螢光。參見例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。或者,在第0天用αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激CD4+及CD8+ T細胞之混合物,且在第1天使用表現CAR之雙順反子慢病毒載體同時使用2A核糖體跳躍序列經CAR轉導。洗滌之後,在抗CD3及抗CD28抗體(K562-BBL-3/28)存在下,用CD19+ K562細胞(K562-CD19)、野生型K562細胞(K562野生型)或表現hCD32及4-1BBL之K562細胞再刺激培養物。每隔一天向培養物添加100IU/ml外源性IL-2。藉由流動式細胞量測術使用基於珠粒之計數列舉GFP+ T細胞。參見例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)可使用抗CD123 T細胞(參見例如Gill等人Blood 2014;123:2343)或用抗CD123 CAR T細胞進行類似分析。
亦可量測在再刺激不存在下的持續CAR+ T細胞擴增。參見例如
Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)簡言之,在第0天用αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激且在第1天經指定CAR轉導之後,在培養第8天使用庫爾特顆粒粒度分析儀(Coulter Multisizer)III粒子計數器、耐克龍雙螢光細胞圖像分析儀(Nexcelom Cellometer Vision)或密理博手持式細胞計數器(Millipore Scepter)量測平均T細胞體積(fl)。
動物模型亦可用於量測CART活性。舉例而言,可使用利用人類CD19特異性CAR+ T細胞治療免疫缺乏小鼠之原發性人類前B ALL之異種移植模型。參見例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)簡言之,在建立ALL之後,將小鼠隨機分為治療組。不同數目之αCD19-ζ及αCD19-BB-ζ工程改造之T細胞以1:1比率共注射至攜有B-ALL之NOD-SCID-γ-/-小鼠。在T細胞注射後之各個時間,評估來自小鼠之脾DNA中αCD19-ζ及αCD19-BB-ζ載體之複本數目。以1週之時間間隔評估動物之白血病。在注射αCD19-ζ CAR+ T細胞或模擬轉導之T細胞之小鼠中量測周邊血液CD19+ B-ALL母細胞計數。使用對數等級檢驗(log-rank test)比較該等組之存活率曲線。另外,亦可分析NOD-SCID-γ-/-小鼠中T細胞注射之後4週的絕對周邊血液CD4+及CD8+ T細胞計數。小鼠注射白血病細胞且3週後注射經工程改造以藉由編碼連接至eGFP的CAR之雙順反子慢病毒載體表現CAR之T細胞。藉由在注射前與模擬轉導之細胞混合,將T細胞標準化為45-50%輸入GFP+ T細胞,且藉由流動式細胞量測術確認。以1週之時間間隔評估動物之白血病。使用對數等級檢驗比較CAR+ T細胞組之存活率曲線。可用CD123 CARTS進行類似實驗。
可評估劑量依賴性CAR治療反應。參見例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)舉例而言,在第21天注射CAR T細胞、等效數目之模擬轉導之T細胞或無T細胞之小鼠中建立白
血病之後35-70天獲得周邊血液。對來自各組之小鼠隨機抽血以測定周邊血液CD19+ ALL母細胞計數且隨後在第35天及第49天殺死。在第57天及第70天評估剩餘動物。可用CD123 CARTS進行類似實驗。
上文已描述細胞增殖及細胞激素產量之評估,例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。簡言之,藉由混合經洗滌之T細胞與表現CD19(K19)或CD32及CD137(KT32-BBL)之K562細胞使得最終T細胞:K562之比率為2:1在微量滴定盤中進行CAR介導之增殖的評估。K562細胞在使用之前經γ輻射照射。抗CD3(純系OKT3)及抗CD28(純系9.3)單株抗體添加至含KT32-BBL細胞之培養物中充當陽性對照用於刺激T細胞增殖,因為此等信號支持長期CD8+ T細胞離體擴增。如製造商所描述使用CountBrightTM螢光珠粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)及流動式細胞量測術在培養物中列舉T細胞。藉由GFP表現使用以eGFP-2A連接的表現CAR之慢病毒載體工程改造之T細胞鑑別CAR+ T細胞。對於不表現GFP之CAR+ T細胞,用生物素標記之重組CD123蛋白質及二級抗生素蛋白-PE共軛物偵測CAR+ T細胞。T細胞上之CD4+及CD8+表現亦同時使用特異性單株抗體(BD Biosciences)偵測。根據製造商說明書使用人類TH1/TH2細胞激素流式微珠陣列套組(cytokine cytometric bead array kit)(BD Biosciences,San Diego,CA)或使用路明克斯(Luminex)30叢套組(Invitrogen)在再刺激後24小時收集之上清液上進行細胞激素量測。使用BD Fortessa流式細胞儀評估螢光,且根據製造商說明書分析資料。可用CD123 CARTS進行類似實驗。
可藉由標準51Cr釋放分析來評估細胞毒性。參見例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)簡言之,在37℃下在頻繁攪拌下靶細胞(K562株及初級促B-ALL細胞)負載有51Cr(呈NaCrO4形式,New England Nuclear,Boston,MA)2小時,在完全RPMI中洗滌
兩次且接種至微量滴定盤中。在各孔中,在完全RPMI中,以不同效應子細胞:靶細胞(E:T)比率混合效應T細胞與靶細胞。亦製備僅含有培養基(自發釋放,SR)或1% triton-X 100清潔劑溶液(總釋放,TR)之額外孔。在37℃下培育4小時後,自各孔採集上清液。隨後使用γ粒子計數器(Packard Instrument Co.,Waltham,MA)量測釋放之51Cr。各條件至少一式三份進行,且使用下式計算溶解百分比:溶解%=(ER-SR)/(TR-SR),其中ER表示各實驗條件釋放之平均51Cr。
成像技術可用於評估攜有腫瘤之動物模型中CAR之特定運輸及增殖。此類分析已描述於例如Barrett等人,Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011)中。簡言之,NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠靜脈內注射Nalm-6細胞,隨後在7天後,在用CAR構築體電穿孔之後4小時注射T細胞。將T細胞用慢病毒構築體穩定轉染以表現螢火蟲螢光素酶,且使小鼠針對生物發光成像。或者,Nalm-6異種移植模型中單一注射CAR+ T細胞之療法功效及特異性可如下量測:NSG小鼠注射經轉導穩定表現螢火蟲螢光素酶之Nalm-6,隨後在7天後單一尾靜脈注射用CD123 CAR電穿孔之T細胞。在注射後各時間點使動物成像。舉例而言,可產生第5天(治療前2天)及第8天(CAR+ PBL後24hr)代表性小鼠中螢火蟲螢光素酶陽性白血病之光子密度熱圖。
其他分析,包括本文實例部分中所描述之分析及此項技術中已知之分析亦可用於評估本發明之CD123 CAR構築體。
或者,或與本文所揭示之方法組合,揭示用於以下一或多者之方法及組合物:偵測及/或定量表現CAR之細胞(例如,活體外或活體內(例如,臨床監測));免疫細胞擴增及/或活化;及/或CAR特異性選擇,其涉及CAR配位體之使用。在一個例示性實施例中,CAR配位體為結合於CAR分子,例如結合於CAR之胞外抗原結合域之抗體(例如結合於抗原結合域之抗體,例如抗個體基因型抗體;或結合於胞外結
合域之恆定區的抗體)。在其他實施例中,CAR配位體為CAR抗原分子(例如,如本文所描述之CAR抗原分子)。
在一個態樣中,揭示一種偵測及/或定量表現CAR之細胞的方法。舉例而言,CAR配位體可用於在活體外或活體內偵測及/或定量表現CAR之細胞(例如,患者中表現CAR之細胞之臨床監測,或患者給藥)。該方法包括:提供CAR配位體(視情況,標記之CAR配位體,例如包括標籤、珠粒、放射性或螢光標記之CAR配位體);獲取表現CAR之細胞(例如,獲取含有表現CAR之細胞的樣本,諸如製造樣本或臨床樣本);在發生結合之條件下使表現CAR之細胞與CAR配位體接觸,藉此偵測存在之表現CAR之細胞的含量(例如,量)。可使用諸如FACS、ELISA及其類似者之標準技術偵測表現CAR之細胞與CAR配位體之結合。
在另一態樣中,揭示一種擴增及/或活化細胞(例如,免疫效應子細胞)之方法。該方法包括:提供表現CAR之細胞(例如,表現第一CAR之細胞或短暫表現CAR之細胞);在發生免疫細胞擴增及/或增殖之條件下,使該表現CAR之細胞與CAR配位體(例如,如本文所描述之CAR配位體)接觸,藉此產生活化及/或擴增之細胞群體。
在某些實施例中,CAR配位體存在於(例如,固定或附接至受質,例如非天然存在之受質)上。在一些實施例中,受質為非細胞受質。非細胞受質可為選自以下之固體支撐物:例如盤(例如,微量滴定盤)、膜(例如,硝化纖維膜)、基質、晶片或珠粒。在實施例中,CAR配位體存在於受質中(例如,受質表面上)。CAR配位體可固定、
附接或共價或非共價締合(例如,交聯)於受質。在一個實施例中,CAR配位體附接(例如,共價附接)至珠粒。在前述實施例中,免疫細胞群體可活體外或離體擴增。該方法可進一步包括例如使用本文所描述之任一方法在CAR分子之配位體存在下培養免疫細胞群體。
在其他實施例中,擴增及/或活化細胞之方法進一步包含添加第二刺激分子,例如CD28。舉例而言,CAR配位體及第二刺激分子可固定至受質,例如一或多個珠粒,藉此提供增加之細胞擴增及/或活化。
在又一態樣中,提供一種選擇或增濃表現CAR之細胞的方法。該方法包括使表現CAR之細胞與如本文所描述之CAR配位體接觸;及基於CAR配位體之結合來選擇細胞。
在又其他實施例中,提供一種耗盡、減少及/或殺死表現CAR之細胞的方法。該方法包括使表現CAR之細胞與如本文所描述之CAR配位體接觸;及基於CAR配位體之結合來靶向細胞,藉此減少表現CAR之細胞的數目及/或殺死表現CAR之細胞。在一個實施例中,CAR配位體偶合至毒性劑(例如,毒素或細胞消融藥物)。在另一實施例中,抗個體基因型抗體可引起效應子細胞活性,例如ADCC或ADC活性。
可用於本文所揭示之方法之例示性抗CAR抗體描述於例如WO 2014/190273及Jena等人,「Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials」,PLOS 2013年3月8:3 e57838中,其內容以引用的方式併入。在一個實施例中,抗個體基因型抗體分子識別抗CD19抗體分子,例如抗CD19 scFv。舉例而言,抗個體基因型抗體分子可競爭與Jena等人,PLOS 2013年3月8:3 e57838中描述之CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號結合;可具有與CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號相同之CDR(例如,使用Kabat定義、Chothia定義或Kabat
與Chothia定義之組合,VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者,例如全部);可具有一或多個(例如,2個)如CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號之可變區,或可包含CD19特異性CAR mAb純系第136.20.1號。在一些實施例中,根據Jena等人中所描述之方法製得抗個體基因型抗體。在另一實施例中,抗個體基因型抗體分子為WO 2014/190273中所描述之抗個體基因型抗體分子。在一些實施例中,抗個體基因型抗體分子具有與WO 2014/190273之抗體分子(諸如136.20.1)相同之CDR(例如,VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者,例如全部);可具有一或多個(例如,2個)WO 2014/190273之抗體分子之可變區,或可包含WO 2014/190273之抗體分子,諸如136.20.1。在其他實施例中,抗CAR抗體結合於例如如WO 2014/190273中所描述之CAR分子之胞外結合域之恆定區。在一些實施例中,抗CAR抗體結合於CAR分子之胞外結合域之恆定區,例如重鏈恆定區(例如,CH2-CH3鉸鏈區)或輕鏈恆定區。舉例而言,在一些實施例中,抗CAR抗體競爭與WO 2014/190273中所描述之2D3單株抗體結合,具有與2D3相同之CDR(例如,VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者,例如全部),或具有一或多個(例如,2個)2D3可變區,或包含如WO 2014/190273中所描述之2D3。
在一些態樣及實施例中,本文組合物及方法針對T細胞之特異性亞型最佳化,例如如描述於2014年7月31日申請的美國第62/031,699號中,其內容以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中,與對照T細胞,例如表現相同構築體之不同類型(例如,CD8+或CD4+)的T細胞相比,最佳化之T細胞亞群顯示增強的持久性。
在一些實施例中,CD4+ T細胞包含本文所描述之CAR,該CAR包
含適合於(例如最佳化,例如導致增強的持久性)CD4+ T細胞之胞內信號傳導域,例如ICOS域。在一些實施例中,CD8+ T細胞包含本文所描述之CAR,該CAR包含適合於(例如最佳化,例如導致增強的持久性)CD8+ T細胞之胞內信號傳導域,例如4-1BB域、CD28域或除ICOS域以外的另一共刺激域。在一些實施例中,本文所描述之CAR包含本文所描述之抗原結合域,例如CAR包含特異性結合CD123之抗原結合域,例如表2或表6之CAR。
在一態樣中,本文描述一種治療個體,例如患有癌症之個體的方法。該方法包括向該個體投與有效量之:1)包含CAR(CARCD4+)之CD4+ T細胞CAR包含:抗原結合域,例如本文所描述之抗原結合域,例如特異性結合CD123之抗原結合域,例如表2、表6或表9之抗原結合域;跨膜域;及胞內信號傳導域,例如第一共刺激域,例如ICOS域;及2)包含CAR(CARCD8+)之CD8+ T細胞,CAR包含:抗原結合域,例如本文所描述之抗原結合域,例如特異性結合CD123之抗原結合域,例如表2、表6或表9之抗原結合域;跨膜域;及胞內信號傳導域,例如第二共刺激域,例如4-1BB域、CD28域或除ICOS域以外的另一共刺激域;其中CARCD4+與CARCD8+彼此不同。
視情況,該方法進一步包括投與:3)包含CAR(第二CARCD8+)之第二CD8+ T細胞,CAR包含:抗原結合域,例如本文所描述之抗原結合域,例如特異性結合CD123之抗原結合域,例如表2、表6或表9之抗原結合域;
跨膜域;及胞內信號傳導域,其中第二CARCD8+包含不存在於CARCD8+上之胞內信號傳導域,例如共刺激信號傳導域,且視情況不包含ICOS信號傳導域。
本發明尤其提供治療與CD123表現相關聯之疾病或與表現CD123之細胞相關聯的病狀之組合物及方法,該等疾病或病狀包括例如增殖性疾病,諸如癌症或惡性腫瘤;或癌前病狀,諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期;或與表現CD123之細胞相關聯的非癌症相關適應症。在一個態樣中,與CD123表現相關聯之癌症為血液癌。在一個態樣中,血液癌包括(但不限於)AML、骨髓發育不良症候群、ALL、慢性骨髓白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、骨髓增殖性贅瘤、霍奇金淋巴瘤及其類似癌症。與CD123表現相關之其他疾病包括(但不限於)例如非典型及/或非經典之與CD123表現相關聯的癌症、惡性腫瘤、癌前病狀或增殖性疾病。亦可包括與CD123表現相關聯之非癌症相關適應症。
在一個態樣中,本發明提供治療與CD123表現相關聯之疾病的方法。在一個態樣中,本發明提供治療其中一部分腫瘤為CD123陰性且一部分腫瘤為CD123陽性之疾病的方法。舉例而言,本發明之CAR適用於治療已經歷與CD123表現升高相關聯之疾病的治療之個體,其中已經歷CD123含量升高之治療的個體展現與CD123含量升高相關聯之疾病。在實施例中,本發明之CAR適用於治療已經歷與CD123表現相關聯之疾病的治療之個體,其中已經歷與CD123表現相關之治療的個體展現與CD123表現相關聯之疾病。
在一個態樣中,本發明係關於一種載體,其包含可操作地連接
於啟動子以在哺乳動物免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)中表現之CD123 CAR。在一個態樣中,本發明提供一種表現CD123 CAR之重組T細胞用於治療表現CD123之腫瘤,其中表現CD123 CAR之重組免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)稱為表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞)。在一個態樣中,本發明之CD123 CART能夠使腫瘤細胞與在其表面上表現之至少一個本發明CD123 CAR接觸,使得表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞)靶向腫瘤細胞,且腫瘤生長得到抑制。
在一個態樣中,本發明係關於一種抑制表現CD123之腫瘤細胞的生長之方法,其包含使腫瘤細胞與本發明之表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞)接觸,使得表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞)回應於抗原而活化且靶向癌細胞,其中腫瘤生長得到抑制。
在一個態樣中,本發明係關於一種治療個體中癌症之方法。該方法包含向個體投與本發明之表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞),使得個體中癌症得到治療。可由本發明之表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞)治療的癌症之一實例為與CD123表現相關聯之癌症。可由本發明之表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞)治療的癌症之一實例包括(但不限於)AML、霍奇金淋巴瘤、骨髓發育不良症候群、慢性骨髓白血病及其他骨髓增殖性贅瘤或母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤及其類似癌症。
本發明包括一種類型之細胞療法,其中免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR),且表現CD123 CAR之細胞(例如,CD123 CART或表現CD123 CAR之NK細胞)
輸注至有需要之接受者。輸注之細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。不同於抗體療法,CAR修飾之免疫效應子細胞,例如CAR修飾之T細胞或CAR修飾之NK細胞)能夠活體內複製導致長期持久性,可導致持續腫瘤控制。在各種態樣中,在向患者投與免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之後,向患者投與之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)或其後代在患者中存留至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年或五年。
本發明亦包括一種類型之細胞療法,其中免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)例如經活體外轉錄之RNA修飾以短暫表現嵌合抗原受體(CAR),且表現CAR之細胞,例如CAR T細胞或CAR NK細胞)輸注至有需要之接受者。輸注之細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。因此,在各種態樣中,在向患者投與免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)之後,向患者投與之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)存在少於一個月,例如三週、兩週、一週。
在不希望受任何特定理論束縛之情況下,由CAR修飾之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)引發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應,或者可歸因於直接與間接免疫反應。在一個態樣中,CAR轉導之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)展現特定促炎性細胞激素分泌及回應於表現CD123之人類癌細胞之有效細胞溶解活性,抵抗可溶性CD123抑制,介導旁觀者殺死且介導已建立之人類腫瘤的消退。舉例而言,表現CD123之腫瘤之異質領域內的抗原較少之腫瘤細胞可易受先前已針對相鄰抗原陽性癌細胞反應之CD123重導向免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)間接破壞。
在一個態樣中,本發明之完全人類CAR修飾之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)可為用於哺乳動物中離體免疫接種及/或活體內療法之類型的疫苗。在一個態樣中,哺乳動物為人類。
相對於離體免疫接種,在向哺乳動物中投與例如T細胞或NK細胞之細胞之前至少發生以下中之一者:i)細胞擴增;ii)將編碼CAR之核酸引入細胞;或iii)低溫保存細胞。
離體程序為此項技術中熟知且在下文中更完全論述。簡言之,細胞自哺乳動物(例如,人類)分離且經表現本文所揭示之CAR的載體遺傳修飾(亦即,活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人類,且CAR修飾之細胞相對於接受者可為自體的。或者,細胞相對於接受者可為同種異體、同基因型或異種的。
用於離體擴增造血幹細胞及祖細胞之程序描述於以引用的方式併入本文中之美國專利第5,199,942號中,且可應用於本發明之細胞。其他適合方法為此項技術中已知,因此本發明不限於任何特定離體擴增細胞之方法。簡言之,T細胞之離體培養及擴增包含:(1)藉由周邊血液採集或骨髓外植體自哺乳動物收集CD34+造血幹細胞及祖細胞;及(2)離體擴增此類細胞。除了美國專利第5,199,942號中所描述之細胞生長因子之外,諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-套組配位體之其他因素可用於培養及擴增細胞。
除了在離體免疫接種方面使用基於細胞之疫苗之外,本發明亦提供用於活體內免疫接種以針對患者中之抗原引發免疫反應之組合物及方法。
一般而言,如本文所描述之活化及擴增之細胞可用於治療及預防免疫功能不全之個體中產生的疾病。特定言之,本發明之CAR修飾之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)用於治療與CD123表現相
關聯之疾病、病症及病狀。在某些態樣中,本發明之細胞用於治療處於產生與CD123表現相關聯之疾病、病症及病狀風險中的患者。因此,本發明提供治療或預防與CD123表現相關聯之疾病、病症及病狀的方法,其包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之CAR修飾之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)。
在一個態樣中,本發明之表現CAR之細胞(CART細胞或表現CAR之NK細胞)可用於治療增殖性疾病,諸如癌症或惡性疾病,或癌前病狀,諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期。在一個態樣中,與CD123表現相關聯之癌症為血液癌白血病前期、過度增殖性病症、增生或發育不良,其特徵為細胞異常生長。
在一個態樣中,本發明之表現CAR之細胞(CART細胞或表現CAR之NK細胞)用於治療癌症,其中癌症為血液癌。血液癌病狀為諸如白血病及惡性淋巴組織增殖病狀之影響血液、骨髓及淋巴系統之癌症類型。
在一個態樣中,本發明組合物及表現CAR之細胞(CART細胞或表現CAR之NK細胞)特別適用於治療骨髓白血病、AML及其亞型、慢性骨髓白血病(CML)、骨髓發育不良症候群(MDS)、骨髓增殖性贅瘤(MPN)、組織細胞病症及肥大細胞病症。
白血病可分類為急性白血病及慢性白血病。急性白血病可進一步分類為急性骨髓性白血病(AML)及急性淋巴白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)及慢性淋巴白血病(CLL)。其他相關病狀包括骨髓發育不良症候群(MDS,以前稱為「白血病前期」),其為由骨髓血細胞無效產生(或發育不良)及轉型為AML之風險聯合之血液病狀的不同集合。
淋巴瘤為自淋巴細胞發展之一組血細胞腫瘤。例示性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤及霍奇金淋巴瘤。
在AML中,異常分化之長期存活的骨髓祖細胞之惡性轉型及不受控增殖導致高循環數目之不成熟血液形式,且正常骨髓經惡性細胞置換。症狀包括疲乏、皮膚蒼白、易於撞傷及出血、發熱及感染;白血病浸潤之症狀僅在約5%患者中存在(通常呈皮膚表現形式)。周邊血液刮片及骨髓之檢查為診斷性的。現有治療包括實現緩解之誘導化學療法及避免復發之緩解後化學療法(具有或不具有幹細胞移植)。
AML具有多種亞型,彼此藉由形態、免疫表型及細胞化學來區別。基於主要細胞類型,描述五個類別,包括骨髓細胞、骨髓單核細胞、單核細胞、紅細胞及巨核細胞。
緩解誘導率在50%至85%範圍內。據報導,長期無病存活在20%至40%患者中發生,且在用幹細胞移植治療之較年輕患者中增加至40%至50%。
預後因素幫助確定治療方案及強度;通常給與具有強陰性預測特徵之患者更強力形式之療法,因為認為潛在益處證明增加之治療毒性。最重要之預後因素為白血病細胞核型;有利的核型包括t(15;17)、t(8;21)及inv16(p13;q22)。負面因素包括年齡增加、前述骨髓發育不良期、繼發性白血病、高WBC計數及不存在奧氏小體(Auer rod)。
初始療法嘗試誘導緩解且大多數與ALL不同,因為AML對較少藥物有反應。基礎誘導方案包括阿糖胞苷連續靜脈內輸注或高量給藥持續5至7天;在此時間期間道諾黴素(daunorubicin)或艾達黴素(idarubicin)靜脈內給與3天。一些方案包括6-硫鳥嘌呤、依託泊苷(etoposide)、長春新鹼(vincristine)及潑尼松(prednisone),但其作用不明確。治療通常導致顯著骨髓抑制,伴有感染或出血;在骨髓恢復前存在顯著延遲。在此時間期間,細緻的預防性及支持性護理為至關重要的。
慢性骨髓性(或骨髓)白血病(CML)亦稱為慢性粒細胞性白血病且特徵為白血球之癌症。CML之常見治療方案包括Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑、伊馬替尼(imatinib,Gleevec®)、達沙替尼(dasatinib)及尼羅替尼(nilotinib)。Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑特別適用於具有費城染色體易位(Philadelphia chromosome translocation)之CML患者。
骨髓發育不良症候群(MDS)為特徵為混亂及無效的血細胞生成或血液產生之血液醫學病狀。因此,形成血液細胞之數目及品質不可逆地下降。一些MDS患者可產生嚴重貧血,而其他無征狀。MDS之分類方案為此項技術中已知,其中標準指明特定血細胞類型,例如骨髓母細胞、單核細胞及紅血球前驅體之比率或頻率。MDS包括難治性貧血、伴有環狀鐵粒幼紅細胞之難治性貧血、伴有過量母細胞之難治性貧血、伴有過量母細胞轉型之難治性貧血、慢性骨髓單核細胞性白血病(CML)。
MDS之治療隨症狀之嚴重程度變化。經歷嚴重症狀之患者的侵襲性治療形式包括骨髓移植及使用血液產物支持(例如,輸血)及造血生長因子(例如,紅血球生成素)之支持性護理。其他試劑經常用於治療MDS:5-氮胞苷、地西他賓(decitabine)及來那度胺。在一些情況下,亦可投與鐵螯合劑去鐵胺(Desferal®)及地拉羅司(deferasirox,Exjade®)。
在另一實施例中,本發明之表現CAR之細胞(例如,CART細胞或表現CAR之NK細胞)用於治療具有白血病幹細胞之癌症或白血病。舉例而言,白血病幹細胞為CD34+/CD38-白血病細胞。
本發明尤其提供治療癌症之組合物及方法。在一個態樣中,癌症為血液癌,包括(但不限於)白血病(諸如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴白血病、慢性淋巴白血病及骨髓發育不良症候群)及惡性淋巴組織增殖病狀,包括淋巴瘤(諸如多發性骨髓瘤、霍奇
金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)及小細胞及大細胞濾泡性淋巴瘤)。
在一個態樣中,本發明之表現CAR之細胞(例如,CART細胞或表現CAR之NK細胞)可用於治療其他癌症及惡性腫瘤,諸如(但不限於)例如急性白血病,包括(但不限於)例如B細胞急性淋巴白血病(「B-ALL」)、T細胞急性淋巴白血病(「T-ALL」)、急性淋巴白血病(ALL);一或多種慢性白血病,包括(但不限於)例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL);額外血液癌或血液病狀,包括(但不限於)例如B細胞前淋巴細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、伯基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增殖病狀、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia),及「白血病前期」,其為由骨髓血細胞無效產生(或發育不良)聯合之血液病狀的不同集合,及其類似者。本發明之CAR修飾之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)可單獨或以與稀釋劑及/或其他組分(諸如IL-2)或其他細胞激素或細胞群體組合之醫藥組合物形式投與。
本發明亦提供抑制增殖或減少表現CD123之細胞群體之方法,該等方法包含使包含表現CD123之細胞的細胞群體與本發明之結合至表現CD123之細胞的表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)接觸。在一特定態樣中,本發明提供抑制增殖或減少表現CD123之癌細胞群體之方法,該等方法包含使表現CD123之癌細胞群體與本發明之結合至表現CD123之細胞的表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)接觸。在一個
態樣中,本發明提供抑制增殖或減少表現CD123之癌細胞群體之方法,該等方法包含使表現CD123之癌細胞群體與本發明之結合至表現CD123之細胞的表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)接觸。在某些態樣中,在患有骨髓白血病或與表現CD123之細胞相關聯的另一癌症之個體或動物模型中,本發明之表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)相對於陰性對照降低至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%的細胞及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比。在一個態樣中,個體為人類。
本發明亦提供預防、治療及/或管理與表現CD123之細胞相關聯的疾病(例如,表現CD123之血液癌或非典型癌症)之方法,該等方法包含向有需要之個體投與本發明之結合至表現CD123之細胞的表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)。在一個態樣中,個體為人類。與表現CD123之細胞相關聯的病症之非限制性實例包括自體免疫病症(諸如狼瘡)、發炎性病症(諸如過敏及哮喘)及癌症(諸如表現CD123之血液癌或非典型癌症)。
本發明亦提供預防、治療及/或管理與表現CD123之細胞相關聯的疾病之方法,該等方法包含向有需要之個體投與本發明之結合至表現CD123之細胞的表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)。在一個態樣中,個體為人類。
本發明提供預防與表現CD123之細胞相關聯的癌症復發之方法,該等方法包含向有需要之個體投與本發明之結合至表現CD123之細胞的表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)。在一個態樣中,該等方法包含向有需要之個體投與有效量之本文所描述之結合至表現CD123之細胞的表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)以及有效量之另一療
法。
在一個態樣中,本發明提供用於骨髓消融之組合物及方法。舉例而言,在一個態樣中,本發明提供用於根除個體中存在之骨髓的至少一部分之組合物及方法。本文描述在某些情況下,包含本發明之CD123 CAR的CART123細胞根除CD123陽性骨髓之骨髓祖細胞。
在一個態樣中,本發明提供一種骨髓消融方法,其包含向需要骨髓消融之個體投與本發明之表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)。舉例而言,本發明方法可用於根除患有疾病或病症之個體存在之骨髓的一些或全部,其中骨髓移植或骨髓再調理為有益治療策略。在一個態樣中,本文別處描述之包含投與表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)的本發明之骨髓消融方法在個體中在骨髓移植之前進行。因此,在一個態樣中,本發明方法提供在骨髓或幹細胞移植之前的細胞調理方案。在一個態樣中,骨髓移植包含幹細胞移植。骨髓移植可包含自體或同種異體細胞之移植。
本發明提供一種治療疾病或病症之方法,其包含投與本發明之表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)以根除存在之骨髓的至少一部分。該方法可用作治療任何疾病或病症之治療方案的至少一部分,其中骨髓移植為有益的。亦即,本發明方法可用於需要骨髓移植之任何個體。在一個態樣中,包含投與表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)之骨髓消融適用於治療AML。在某些態樣中,骨髓消融藉助於本發明方法適用於治療血液癌、實體腫瘤、血液病、代謝障礙、HIV、HTLV、溶酶體儲存病症及免疫缺乏症。
本文所揭示之組合物及方法可用於根除存在之骨髓的至少一部
分以治療血液癌,包括(但不限於)白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、ALL、AML、CLL、CML、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤及多發性骨髓瘤。
本文所揭示之組合物及方法可用於治療血液病,尤其包括(但不限於)骨髓發育不良、貧血、陣發性夜間血紅素尿症、再生不全性貧血、後天性純紅血球貧血、狄-勃二氏貧血(Diamon-Blackfan anemia)、范康尼氏貧血(Fanconi anemia)、細胞減少症、巨核細胞血小板減少症、骨髓增殖性病症、真性紅血球增多症、原發性血小板增多症、骨髓纖維化、血紅素病、鐮狀細胞病、β重度地中海貧血症。
本文所揭示之組合物及方法可用於治療溶酶體儲存病症,包括(但不限於)脂質沈積、神經鞘脂質代謝障礙症、腦白質營養不良、黏多糖病、糖蛋白累積病、嬰兒神經元蠟樣脂褐質沈積症、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)、尼-皮二氏病(Niemann-Pick disease)、戈謝病(Gaucher disease)、腎上腺腦白質營養不良、異染性腦白質營養不良、克拉培病(Krabbe disease)、赫爾勒症候群(Hurler syndrome)、沙伊症候群(Scheie syndrome)、赫-沙二氏症候群(Hurler-Scheie syndrome)、亨特症候群(hunter syndrome)、聖菲利波症候群(Sanfilippo syndrome)、莫奎症候群(Morquio syndrome)、馬-拉二氏症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)、斯利症候群(Sly syndrome)、黏多糖症、岩藻糖脂沈積症、天冬胺醯葡萄糖胺尿症、α-甘露糖症及沃爾曼病(Wolman disease)。
本文所揭示之組合物及方法可用於治療免疫缺乏症,包括(但不限於)T細胞缺乏症、T細胞與B細胞聯合缺乏症、吞噬細胞病症、免疫失調疾病、先天性免疫缺乏症、共濟失調毛細管擴張症、迪喬治症候群(DiGeorge syndrome)、嚴重聯合免疫缺乏症(SCID)、偉-爾二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、柯士文症候群(Kostmann
syndrome)、舒-戴二氏症候群(Shwachman-Diamond syndrome)、格里瑟里症候群(Griscelli syndrome)及NF-κ-B原發性調節物(NEMO)缺乏症。
在一個態樣中,本發明提供一種治療癌症之方法,其包含骨髓調理,其中個體之至少一部分骨髓藉由本發明之表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)根除。舉例而言,在某些情況下,個體之骨髓包含可藉由表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)活性靶向及消除之惡性前驅體細胞。在一個態樣中,骨髓調理療法包含向個體投與骨髓或幹細胞移植,隨後根除原生骨髓。在一個態樣中,骨髓再調理療法與一或多種其他抗癌療法組合,包括(但不限於)抗腫瘤CAR療法、化學療法、輻射及其類似療法。
在一個態樣中,可能需要在輸注骨髓或幹細胞移植之前根除所投與之表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)。根除表現CAR之細胞(例如,CD123 CART細胞或表現CD123 CAR之NK細胞)可使用任何適合之策略或治療實現,包括(但不限於)使用自殺基因、使用RNA編碼之CAR之有限CAR持久性或包括抗體之抗T細胞模態或化學療法。
本文所描述之表現CAR之細胞可與其他已知試劑及療法組合使用。如本文所用,「組合」投與意謂在個體受病症折磨之病程期間向個體遞送兩種(或兩種以上)不同治療,例如在個體已診斷患有病症之後及在病症已治癒或消除或出於其他原因治療停止之前,遞送兩種或兩種以上治療。在一些實施例中,當開始遞送第二種治療時,一種治療之遞送仍存在以使得在投與方面存在重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「並行遞送」。在其他實施例中,一種治療之遞送在另一
種治療遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中,治療由於組合投與而更有效。舉例而言,相較於在第一治療不存在下投與第二治療將可見,第二治療更有效,例如使用較少第二治療即可見等效效果,或第二治療減少症狀的程度更大,或對於第一治療可見類似情況。在一些實施例中,遞送使得症狀減少,或與病症相關之其他參數大於一種治療在另一種治療不存在下遞送所觀測到的參數。兩種治療之作用可部分相加,完全相加或大於相加。遞送可使得所遞送之第一治療之作用在遞送第二治療時仍可偵測。
本文所描述之表現CAR之細胞及至少一種額外治療劑可在相同或獨立組合物中同時投與或依次投與。對於依次投與,本文所描述之表現CAR之細胞可首先投與,且其次可投與額外試劑,或投與次序可顛倒。
CAR療法及/或其他治療劑、程序或模態在病症活躍期期間或在疾病緩解或不太活躍期期間投與。CAR療法可在其他治療之前、與治療並行、治療後或在病症緩解期間投與。
當組合投與時,CAR療法及額外試劑(例如,第二或第三試劑)或全部可以比單獨(例如,以單一療法)使用之各試劑之量或劑量更高、更低或與其相同的量或劑量投與。在某些實施例中,CAR療法、額外試劑(例如,第二或第三試劑)或全部之投與量或劑量比單獨(例如,以單一療法)使用之各試劑之量或劑量低(例如,至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。在其他實施例中,CAR療法、額外試劑(例如,第二或第三試劑)或全部產生所要效果(例如,治療癌症)之量或劑量比實現相同療法效果所需的單獨(例如,以單一療法)使用之各試劑之量或劑量低(例如,低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。
在其他態樣中,本文所描述之表現CAR之細胞可與手術、細胞激素、輻射或化學療法組合用於治療方案,化學療法諸如環磷醯胺、氟
達拉賓、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、去甲基化劑或肽疫苗,諸如描述於Izumoto等人2008 J Neurosurg 108:963-971中。
在某些情況下,本發明之化合物與其他治療劑組合,諸如其他抗癌劑、抗過敏劑、抗噁心劑(或抗嘔吐劑)、疼痛舒解劑、細胞保護劑及其組合。
在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞可與化學治療劑組合使用。例示性化學治療劑包括蒽環黴素(例如,小紅莓(例如,脂質體小紅莓))。例示性化學治療劑包括蒽環黴素(例如,小紅莓(例如,脂質體小紅莓))、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(例如,長春鹼(vinblastine)、長春新鹼、長春地辛(vindesine)、長春瑞賓(vinorelbine))、烷基化劑(例如,環磷醯胺、達卡巴嗪(decarbazine)、美法侖(melphalan)、異環磷醯胺、替莫唑胺(temozolomide))、免疫細胞抗體(例如,阿侖單抗、吉妥單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗、奧法木單抗(ofatumumab)、托西莫單抗(tositumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab))、抗代謝物(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑(例如,氟達拉賓))、mTOR抑制劑、TNFR糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白質(GITR)促效劑、蛋白酶體抑制劑(例如,阿克拉黴素A(aclacinomycin A)、膠毒素或硼替佐米(bortezomib))、免疫調節劑(諸如沙立度胺(thalidomide)或沙立度胺衍生物(例如,來那度胺))。
考慮用於組合療法之一般化學治療劑包括阿那曲唑(anastrozole,Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide,Casodex®)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate,Blenoxane®)、白消安(busulfan,Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他賓(capecitabine,Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-脫氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡鉑(carboplatin,Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine,BiCNU®)、苯丁酸
氮芥(chlorambucil,Leukeran®)、順鉑(cisplatin,Platinol®)、克拉屈賓(cladribine,Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(dacarbazine,DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin;放線菌素D,Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride,Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、多西他賽(docetaxel,Taxotere®)、鹽酸阿黴素(doxorubicin hydrochloride;Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(etoposide,Vepesid®)、磷酸氟達拉賓(fludarabine phosphate,Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(flutamide,Eulexin®)、替紮他賓(tezacitibine)、吉西他賓(Gemcitabine,二氟去氧胞苷)、羥基脲(hydroxyurea,Hydrea®)、艾達黴素(Idarubicin,Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(irinotecan,Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲醯四氫葉酸鈣(leucovorin calcium)、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺喋呤(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone,Novantrone®)、麥羅塔(mylotarg)、紫杉醇(paclitaxel,Taxol®)、菲尼克斯(phoenix,Yttrium90/MX-DTPA)、噴司他汀(pentostatin)、含卡莫司汀植入物之聚苯丙生20(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate,Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide,Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine,Tirazone®)、注射用鹽酸拓朴替康(topotecan hydrochloride,Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞賓(Navelbine®)。
尤其受關注之與本發明化合物組合之抗癌劑包括:蒽環黴素;烷基化劑;抗代謝物;抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調神經磷酸酶或p70S6
激酶FK506)或抑制p70S6激酶之藥物;mTOR抑制劑;免疫調節劑;蒽環黴素;長春花生物鹼;蛋白酶體抑制劑;GITR促效劑;蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑;CDK4激酶抑制劑;BTK抑制劑;MKN激酶抑制劑;DGK激酶抑制劑;或溶瘤病毒。
例示性抗代謝物包括(但不限於)嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑:甲胺喋呤(Rheumatrex®、Trexall®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®、Fluoroplex®)、氟尿苷(FUDF®)、阿糖胞苷(Cytosar-U®、Tarabine PFS)、6-巰基嘌呤(Puri-Nethol®)、6-硫鳥嘌呤(Thioguanine Tabloid®)、磷酸氟達拉賓(Fludara®)、噴司他汀(Nipent®)、培美曲塞(Alimta®)、雷替曲塞(Tomudex®)、克拉屈賓(Leustatin®)、氯法拉賓(Clofarex®、Clolar®)、阿紮胞苷(azacitidine,Vidaza®)、地西他賓及吉西他賓(Gemzar®)。較佳抗代謝物包括阿糖胞苷、氯法拉賓及氟達拉賓。
例示性烷基化劑包括(但不限於)氮芥(nitrogen mustard)、乙烯亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯):尿嘧啶氮芥(Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil nitrogen mustard®、Uracillost®、Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®)、氮芥(chlormethine,Mustargen®)、環磷醯胺(Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、RevimmuneTM)、異環磷醯胺(Mitoxana®)、美法侖(Alkeran®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、哌泊溴烷(pipobroman;Amedel®、Vercyte®)、曲他胺(triethylenemelamine;Hemel®、Hexalen®、Hexastat®)、三伸乙基硫代磷胺、替莫唑胺(Temodar®)、噻替派(Thioplex®)、白消安(Busilvex®、Myleran®)、卡莫司汀(BiCNU®)、洛莫司汀(lomustine,CeeNU®)、鏈脲菌素(streptozocin,Zanosar®)及達卡巴嗪(DTIC-
Dome®)。額外例示性烷基化劑包括(但不限於)奧沙利鉑(Oxaliplatin,Eloxatin®);替莫唑胺(Temodar®及Temodal®);更生黴素(亦稱為放線菌素-D,Cosmegen®);美法侖(亦稱為L-PAM、L-溶肉瘤素及苯丙胺酸氮芥,Alkeran®);六甲蜜胺(Altretamine/hexamethylmelamine(HMM);Hexalen®);卡莫司汀(BiCNU®);苯達莫司汀(Bendamustine,Treanda®);白消安(Busulfex®及Myleran®);卡鉑(Paraplatin®);洛莫司汀(亦稱為CCNU,CeeNU®);順鉑(亦稱為CDDP;Platinol®及Platinol®-AQ);苯丁酸氮芥(Leukeran®);環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®);達卡巴嗪(亦稱為DTIC、DIC及咪唑甲醯胺;DTIC-Dome®);六甲蜜胺(Altretamine/hexamethylmelamine(HMM);Hexalen®);異環磷醯胺(Ifex®);普莫司汀;丙卡巴肼(Procarbazine,Matulane®);氮芥(Mechlorethamine/nitrogen mustard/mustine/鹽酸氮芥(mechloroethamine hydrochloride);Mustargen®);鏈脲菌素(Zanosar®);噻替派(亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA;Thioplex®);環磷醯胺(Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®);及鹽酸苯達莫司汀(Treanda®)。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與氟達拉賓、環磷醯胺及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與氟達拉賓、環磷醯胺及利妥昔單抗(FCR)組合投與個體。在實施例中,個體患有CLL。舉例而言,個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p),例如白血病細胞中)。在其他實例中,個體不具有del(17p)。在實施例中,個體包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中包含突變之白血病細胞。在其他實施例中,個體不包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中包含突變之白血病細胞。在實施例中,氟達拉賓以約10-50mg/m2(例如,約10-15、15-20、20-25、25-
30、30-35、35-40、40-45或45-50mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中,環磷醯胺以約200-300mg/m2(例如,約200-225、225-250、250-275或275-300mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中,利妥昔單抗以約400-600mg/m2(例如,400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與苯達莫司汀及利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中,個體患有CLL。舉例而言,個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p),例如白血病細胞中)。在其他實例中,個體不具有del(17p)。在實施例中,個體包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中包含突變之白血病細胞。在其他實施例中,個體不包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中包含突變之白血病細胞。在實施例中,苯達莫司汀以約70-110mg/m2(例如,70-80、80-90、90-100或100-110mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中,利妥昔單抗以約400-600mg/m2(例如,400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗、環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及/或皮質類固醇(例如,潑尼松)組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗、環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼松(R-CHOP)組合投與個體。在實施例中,個體患有彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在實施例中,個體患有體積不大之侷限期DLBCL(例如,包含尺寸/直徑小於7cm之腫瘤)。在實施例中,個體用輻射與R-CHOP組合治療。舉例而言,向個體投與R-CHOP(例如,1-6個週期,例如1、2、3、4、5或6個R-CHOP週期),隨後輻射。在一些情況下,在輻射後向個體投與R-CHOP(例如,1-6個週期,例如1、2、3、4、5或6個R-CHOP週期)。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與依託泊苷、潑尼
松、長春新鹼、環磷醯胺、小紅莓及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與依託泊苷、潑尼松、長春新鹼、環磷醯胺、小紅莓及利妥昔單抗(EPOCH-R)組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與劑量調整之EPOCH-R(DA-EPOCH-R)組合投與個體。在實施例中,個體患有B細胞淋巴瘤,例如Myc重排之侵襲性B細胞淋巴瘤。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗及/或來那度胺組合投與個體。來那度胺((RS)-3-(4-胺基-1-側氧基1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)為一種免疫調節劑。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗及來那度胺組合投與個體。在實施例中,個體患有濾泡性淋巴瘤(FL)或套細胞淋巴瘤(MCL)。在實施例中,個體患有FL且先前未用癌症療法治療。在實施例中,來那度胺以約10-20mg(例如,10-15或15-20mg)之劑量例如每日投與。在實施例中,利妥昔單抗以約350-550mg/m2(例如,350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。
例示性mTOR抑制劑包括例如替西羅莫司;地磷莫司(正式稱為迪福莫司(deferolimus),二甲基亞膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-戊側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己酯,亦稱為AP23573及MK8669,且描述於PCT公開案第WO 03/064383號中);依維莫司(Afinitor®或RAD001);雷帕黴素(AY22989,Sirolimus®);斯馬匹莫(simapimod)(CAS 164301-51-3);安羅莫司(emsirolimus),(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055);2-胺基-8-[反-4-
(2-羥乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS 1013101-36-4);及N 2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并哌喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-(SEQ ID NO:706)內鹽(SF1126,CAS 936487-67-1)及XL765。
例示性免疫調節劑包括例如阿夫妥珠單抗(afutuzumab)(可購自Roche®);派非格司亭(pegfilgrastim)(Neulasta®);來那度胺(CC-5013,Revlimid®);沙立度胺(Thalomid®);艾可米得(actimid)(CC4047);及IRX -2(包括介白素1、介白素2及干擾素γ之人類細胞激素之混合物,CAS 951209-71-5,可購自IRX Therapeutics)。
例示性蒽環黴素包括例如小紅莓(Adriamycin®及Rubex®);博萊黴素(lenoxane®);道諾黴素(鹽酸道諾黴素、柔紅黴素(daunomycin)及鹽酸紅比黴素(rubidomycin hydrochloride),Cerubidine®);道諾黴素脂質體(檸檬酸道諾黴素脂質體,DaunoXome®);米托蒽醌(DHAD,Novantrone®);表柔比星(epirubicin)(EllenceTM);艾達黴素(Idamycin®、Idamycin PFS®);絲裂黴素C(mitomycin C)(Mutamycin®);格爾德黴素(geldanamycin);除莠黴素(herbimycin);拉維黴素(ravidomycin);及去乙醯基拉維黴素(desacetylravidomycin)。
例示性長春花生物鹼包括例如酒石酸長春瑞賓(Navelbine®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春地辛(Eldisine®));長春鹼(亦稱為硫酸長春鹼、長春花鹼及VLB,Alkaban-AQ®及Velban®);及長春瑞賓(Navelbine®)。
例示性蛋白酶體抑制劑包括硼替佐米(Velcade®);卡非佐米(carfilzomib)(PX-171-007,(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基環氧乙烷-2-基)-1-側氧基戊-2-基)胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)-
2-((S)-2-(2-嗎啉基乙醯胺基)-4-苯基丁醯胺基)-戊醯胺);馬瑞佐米(marizomib)(NPI-0052);檸檬酸依薩佐米(ixazomib citrate)(MLN-9708);迪蘭佐米(delanzomib)(CEP-18770);及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-絲胺醯基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-環氧乙烷基]-2-側氧基-1-(苯基甲基)乙基]-L-絲胺醯胺(ONX-0912)。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與貝倫妥單抗組合投與個體。貝倫妥單抗為抗CD30抗體與單甲基奧瑞他汀E(auristatin E)之抗體-藥物共軛物。在實施例中,個體患有霍奇金氏淋巴瘤(HL),例如復發性或難治性HL。在實施例中,個體包含CD30+ HL。在實施例中,個體已經歷自體幹細胞移植(ASCT)。在實施例中,個體尚未經歷ASCT。在實施例中,貝倫妥單抗例如每3週以約1-3mg/kg(例如,約1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)之劑量例如經靜脈內投與。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與貝倫妥單抗及達卡巴嗪組合或與貝倫妥單抗及苯達莫司汀組合投與個體。達卡巴嗪為烷基化劑,化學名稱為5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)咪唑-4-甲醯胺。苯達莫司汀為烷基化劑,化學名稱為4-[5-[雙(2-氯乙基)胺基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸。在實施例中,個體患有霍奇金氏淋巴瘤(HL)。在實施例中,個體先前未用癌症療法治療。在實施例中,個體之年齡為至少60歲,例如60、65、70、75、80、85或更老。在實施例中,達卡巴嗪以約300-450mg/m2(例如,約300-325、325-350、350-375、375-400、400-425或425-450mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中,苯達莫司汀以約75-125mg/m2(例如,75-100或100-125mg/m2 ,例如約90mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。在實施例中,貝倫妥單抗例如每3週以約1-3mg/kg(例如,約1-1.5、1.5-2、2-2.5或2.5-3mg/kg)之劑量例如經靜脈內投與。
在一些實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與CD20抑制
劑,例如抗CD20抗體(例如,抗CD20單特異性或雙特異性抗體)或其片段組合投與個體。例示性抗CD20抗體包括(但不限於)利妥昔單抗、奧法木單抗、奧克珠單抗(ocrelizumab)、維托珠單抗(veltuzumab)、歐比托珠單抗(obinutuzumab)、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)及Pro131921(Genentech)。參見例如Lim等人Haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些實施例中,抗CD20抗體包含利妥昔單抗。利妥昔單抗為結合於CD20且使表現CD20之細胞進行細胞溶解的嵌合小鼠/人類單株抗體IgG1 κ,例如如描述於www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s53111b1.pdf中。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中,個體患有CLL或SLL。
在一些實施例中,利妥昔單抗經靜脈內,例如以靜脈內輸注形式投與。舉例而言,各輸注提供約500-2000mg(例如,約500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900或1900-2000mg)利妥昔單抗。在一些實施例中,利妥昔單抗以150mg/m2至750mg/m2,例如約150-175mg/m2、175-200mg/m2、200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2、475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600mg/m2、600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2或675-700mg/m2之劑量投與,其中m2指示個體之體表面積。在一些實施例中,利妥昔單抗以至少4天,例如4、7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言,
利妥昔單抗以至少0.5週,例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8週或8週以上之給藥時間間隔投與。在一些實施例中,利妥昔單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段,例如至少2週,例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週。舉例而言,利妥昔單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與,每一治療循環總共至少4劑(例如,每一治療循環至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16劑或16劑以上)。
在一些實施例中,抗CD20抗體包含奧法木單抗。奧法木單抗為分子量為大約149kDa之抗CD20 IgG1κ人類單株抗體。舉例而言,使用轉殖基因小鼠及融合瘤技術產生奧法木單抗,且自重組鼠類細胞株(NS0)表現及純化。參見例如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf;及臨床試驗標識號NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352及NCT01397591。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與奧法木單抗組合投與個體。在實施例中,個體患有CLL或SLL。
在一些實施例中,奧法木單抗以靜脈內輸注形式投與。舉例而言,各輸注提供約150-3000mg(例如,約150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000mg)奧法木單抗。在實施例中,奧法木單抗以約300mg之起始劑量,隨後2000mg投與,例如約11劑,例如24週。在一些實施例中,奧法木單抗以至少4天,例如4、7、14、21、28、35天或35天以上之給藥時間間隔投與。舉例而言,奧法木單抗以至少1週,例如1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30週或30週以上之給藥時間間隔投與。在一些實施例中,奧法木單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與一定時間段,例如至少1週,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60週或更多週,或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月,或1、2、3、4、5年或更多年。舉例而言,奧法木單抗以本文所描述之劑量及給藥時間間隔投與,每一治療循環總共至少2劑(例如,每一治療循環至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20劑或20劑以上)。
在一些情況下,抗CD20抗體包含奧克珠單抗。奧克珠單抗為人類化抗CD20單株抗體,例如如描述於臨床試驗標識號NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570及Kappos等人Lancet.19.378(2011):1779-87中。
在一些情況下,抗CD20抗體包含維托珠單抗。維托珠單抗為針對CD20之人類化單株抗體。參見例如臨床試驗標識號NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581及Goldenberg等人Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55。
在一些情況下,抗CD20抗體包含GA101。GA101(亦稱為歐比托珠單抗或RO5072759)為人類化及經糖基工程改造之抗CD20單株抗體。參見例如Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96;臨床試驗標識號NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422及NCT01414205;及www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情況下,抗CD20抗體包含AME-133v。AME-133v(亦稱為LY2469298或奧卡拉珠單抗)為針對CD20之人類化IgG1單株抗體,與利妥昔單抗相比,其對FcγRIIIa受體之親和力增加且抗體依賴性細胞
毒性(ADCC)活性增強。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011):13-25;及Forero-Torres等人Clin Cancer Res.18.5(2012):1395-403。
在一些情況下,抗CD20抗體包含PRO131921。PRO131921為人類化抗CD20單株抗體,與利妥昔單抗相比,其經工程改造以更好地結合於FcγRIIIa且ADCC增強。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011):13-25;及Casulo等人Clin Immunol.154.1(2014):37-46;及臨床試驗標識號NCT00452127。
在一些情況下,抗CD20抗體包含TRU-015。TRU-015為來源於針對CD20之抗體的結構域之抗CD20融合蛋白。TRU-015小於單株抗體,但保留Fc介導之效應子功能。參見例如Robak等人BioDrugs 25.1(2011):13-25。TRU-015含有連接於人類IgG1鉸鏈、CH2域及CH3域但缺乏CH1域及CL域之抗CD20單鏈可變片段(scFv)。
在一些實施例中,本文所描述之抗CD20抗體與治療劑共軛或以其他方式結合,治療劑例如本文所描述之化學治療劑(例如,環磷醯胺、氟達拉賓、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、去甲基化劑、肽疫苗、抗腫瘤抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、烷基化劑、抗微管或抗有絲分裂劑)、抗過敏劑、抗噁心劑(或抗嘔吐劑)、疼痛舒解劑或細胞保護劑。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與B細胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制劑(例如,維托拉斯(venetoclax),亦稱為ABT-199或GDC-0199)及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與維托拉斯及利妥昔單抗組合投與個體。維托拉斯為抑制抗細胞凋亡蛋白質、BCL-2之小分子。維托拉斯之結構(4-(4-{[2-(4-氯苯基))-4,4-二甲基環己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氫-2H-哌喃-4-基甲基)胺基]苯基}磺醯基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲醯胺)展示於下文中。
在實施例中,個體患有CLL。在實施例中,個體患有復發性CLL,例如個體先前已投與癌症療法。在實施例中,維托拉斯例如每日以約15-600mg(例如,15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、400-500或500-600mg)之劑量投與。在實施例中,利妥昔單抗例如每月以約350-550mg/m2(例如,350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。
在一些實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與溶瘤病毒組合投與。在實施例中,溶瘤病毒能夠在癌細胞中選擇性地複製,且觸發癌細胞死亡或減緩癌細胞生長。在一些情況下,溶瘤病毒對非癌細胞無作用或作用最小。溶瘤病毒包括(但不限於)溶瘤腺病毒、溶瘤單純疱疹病毒、溶瘤反轉錄病毒、溶瘤小病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤新必斯病毒(oncolytic Sinbis virus)、溶瘤流感病毒或溶瘤RNA病毒(例如,溶瘤呼腸孤病毒、溶瘤新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水泡性口炎病毒(VSV))。
在一些實施例中,溶瘤病毒為以全文引用的方式併入本文中之US2010/0178684 A1中所描述之病毒,例如重組溶瘤病毒。在一些實施例中,重組溶瘤病毒包含編碼免疫或發炎性反應之抑制劑的核酸序列(例如,異源核酸序列),例如如描述於US2010/0178684 A1中,其以全文引用的方式併入本文中。在實施例中,重組溶瘤病毒(例如,溶瘤NDV)包含促細胞凋亡蛋白質(例如,凋亡蛋白)、細胞激素(例如,GM-CSF、干擾素-γ、介白素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α)、免疫
球蛋白(例如,針對ED-B纖維連接蛋白之抗體)、腫瘤相關聯抗原、雙特異性銜接蛋白質(例如,針對NDV HN蛋白質及T細胞共刺激受體(諸如CD3或CD28)之雙特異性抗體或抗體片段;或人類IL-2與針對NDV HN蛋白質之單鏈抗體之間的融合蛋白)。參見例如Zamarin等人Future Microbiol.7.3(2012):347-67,其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中,溶瘤病毒為各自以全文引用的方式併入本文中之US 8591881 B2、US 2012/0122185 A1或US 2014/0271677 A1中所描述之嵌合溶瘤NDV。
在一些實施例中,溶瘤病毒包含條件性複製型腺病毒(CRAd),其經設計以僅在癌細胞中複製。參見例如Alemany等人Nature Biotechnol.18(2000):723-27在一些實施例中,溶瘤腺病毒包含以全文引用的方式併入本文中之Alemany等人第725頁上表1中所描述之溶瘤腺病毒。
例示性溶瘤病毒包括(但不限於)以下:B組溶瘤腺病毒(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(參見例如臨床試驗標識符:NCT02053220);ONCOS-102(先前稱為CGTG-102),其為包含粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之腺病毒(Oncos Therapeutics)(參見例如臨床試驗標識符:NCT01598129);VCN-01,其為編碼人類PH20玻尿酸酶之遺傳修飾溶瘤人類腺病毒(VCN Biosciences,S.L.)(參見例如臨床試驗標識符:NCT02045602及NCT02045589);條件性複製型腺病毒ICOVIR-5,其為來源於野生型人類腺病毒血清型5(Had5)之已經修飾以在癌細胞中藉由失調視網膜母細胞瘤/E2F路徑選擇性複製之病毒(Institut Català d'Oncologia)(參見例如臨床試驗標識符:NCT01864759);
Celyvir,其包含骨髓衍生之感染有ICOVIR5之自體間葉細胞幹細胞(MSC),一種溶瘤腺病毒(Hospital Infantil Universitario Niño Jesús,Madrid,Spain/Ramon Alemany)(參見例如臨床試驗標識符:NCT01844661);CG0070,其為條件性複製溶瘤血清型5腺病毒(Ad5),其中人類E2F-1啟動子驅動原發性E1a病毒基因表現,藉此限制缺乏Rb路徑之腫瘤細胞的病毒複製及細胞毒性(Cold Genesys,Inc.)(參見例如臨床試驗標識符:NCT02143804);或DNX-2401(以前稱為δ-24-RGD),其為已經工程改造以在缺乏視網膜母細胞瘤(Rb)路徑之細胞中選擇性複製且更有效感染表現某些RGD結合整合素之細胞的腺病毒(Clinica Universidad de Navarra,Universidad de Navarra/DNAtrix,Inc.)(參見例如臨床試驗標識符:NCT01956734)。
在一些實施例中,本文所描述之溶瘤病毒藉由注射,例如皮下、動脈內、靜脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射投與。在實施例中,本文所描述之溶瘤病毒經瘤內、經皮、經黏膜、經口、經鼻內或經由肺部投與來投與。
在一實施例中,表現本文所描述之CAR之細胞與減少Treg細胞群體之分子組合投與個體。減少(例如,耗盡)Treg細胞數目之方法為此項技術中已知且包括例如CD25耗盡、環磷醯胺投與、調節GITR功能。在不希望受理論束縛之情況下,咸信在清除術前或在投與本文所描述之表現CAR之細胞前減少個體中Treg細胞數目減少腫瘤微環境中不必要免疫細胞(例如,Treg)數目且減少個體復發風險。
在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與靶向GITR及/或調節GITR功能之分子(諸如,GITR促效劑及/或耗盡調控T細胞(Treg)之GITR抗體)組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現
CAR之細胞與環磷醯胺組合投與個體。在一個實施例中,在投與表現CAR之細胞前投與GITR結合分子及/或調節GITR功能之分子(例如,GITR促效劑及/或耗盡Treg之GITR抗體)。舉例而言,在一個實施例中,GITR促效劑可在細胞清除術之前投與。在實施例中,環磷醯胺在投與(例如,輸注或再輸注)表現CAR之細胞前或在細胞清除術前投與個體。在實施例中,環磷醯胺及抗GITR抗體在投與(例如,輸注或再輸注)表現CAR之細胞前或在細胞清除術前投與個體。在一個實施例中,個體患有癌症(例如,實體癌或血液癌(諸如ALL或CLL))。在一實施例中,個體患有CLL。在實施例中,個體患有ALL。在實施例中,個體患有實體癌,例如本文所描述之實體癌。例示性GITR促效劑包括例如GITR融合蛋白及抗GITR抗體(例如,二價抗GITR抗體),諸如美國專利第6,111,090號、歐洲專利第090505B1號、美國專利第8,586,023號、PCT公開案第WO 2010/003118號及第2011/090754號中所描述之GITR融合蛋白,或例如美國專利第7,025,962號、歐洲專利第1947183B1號、美國專利第7,812,135號、美國專利第8,388,967號、美國專利第8,591,886號、歐洲專利第EP 1866339號、PCT公開案第WO 2011/028683號、PCT公開案第WO 2013/039954號、PCT公開案第WO2005/007190號、PCT公開案第WO 2007/133822號、PCT公開案第WO2005/055808號、PCT公開案第WO 99/40196號、PCT公開案第WO 2001/03720號、PCT公開案第WO99/20758號、PCT公開案第WO2006/083289號、PCT公開案第WO 2005/115451號、美國專利第7,618,632號及PCT公開案第WO 2011/051726號中所描述之抗GITR抗體。
在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與GITR促效劑(例如,本文所描述之GITR促效劑)組合投與個體。在一個實施例中,GITR促效劑在表現CAR之細胞之前投與。舉例而言,在一個實施例
中,GITR促效劑可在細胞清除術之前投與。
在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與mTOR抑制劑(例如本文所描述之mTOR抑制劑,例如雷帕黴素類似物,諸如依維莫司)組合投與個體。在一個實施例中,mTOR抑制劑在表現CAR之細胞之前投與。舉例而言,在一個實施例中,mTOR抑制劑可在細胞清除術之前投與。
在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑(例如,本文所描述之蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑)組合投與個體。在一個實施例中,蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑為SHP-1抑制劑,例如本文所描述之SHP-1抑制劑,諸如葡萄糖酸銻鈉。在一個實施例中,蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑為SHP-2抑制劑。
在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞可與激酶抑制劑組合使用。在一個實施例中,激酶抑制劑為CDK4抑制劑,例如本文所描述之CDK4抑制劑,例如CD4/6抑制劑,諸如6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基胺基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮鹽酸鹽(亦稱為帕博西里(palbociclib)或PD0332991)。在一個實施例中,激酶抑制劑為BTK抑制劑,例如本文所描述之BTK抑制劑,諸如依魯替尼(ibrutinib)。在一個實施例中,激酶抑制劑為mTOR抑制劑,例如本文所描述之mTOR抑制劑,諸如雷帕黴素、雷帕黴素類似物、OSI-027。mTOR抑制劑可為例如mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑,例如本文所描述之mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑。在一個實施例中,激酶抑制劑為MNK抑制劑,例如本文所描述之MNK抑制劑,諸如4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制劑可為例如MNK1a、MNK1b、MNK2a及/或MNK2b抑制劑。在一個實施例中,激酶抑制劑為DGK抑制劑,例如本文所描述之DGK抑制劑,諸如DGKinh1(D5919)或DGKinh2(D5794)。在一個實施例中,激酶抑制
劑為選自以下之CDK4抑制劑:阿洛新A(aloisine A);夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275,2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-哌啶基]-4-烯酮;克卓替尼(crizotinib)(PF-02341066;2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(2R,3S)-2-(羥甲基)-1-甲基-3-吡咯啶基]-4H-1-苯并哌喃-4-酮鹽酸鹽(P276-00);1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265);依地蘇蘭(indisulam)(E7070);羅斯維汀(roscovitine)(CYC202);帕博西里(PD0332991);戴那西里(dinaciclib)(SCH727965);N-[5-[[(5-第三丁基噁唑-2-基)甲基]硫基]噻唑-2-基]哌啶-4-甲醯胺(BMS 387032);4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮呯-2-基]胺基]-苯甲酸(MLN8054);5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322);4-(2,6-二氯苯甲醯胺基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(哌啶-4-基)醯胺(AT7519);4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺醯基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438);及XL281(BMS908662)。
在一個實施例中,激酶抑制劑為CDK4抑制劑,例如帕博西里(PD0332991),且帕博西里以每日約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如,75mg、100mg或125mg)之劑量投與一定時間段,例如每日以上述劑量持續28天週期中之14天至21天或每日以上述劑量持續21天週期中之7天至12天。在一個實施例中,投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的帕博西里。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與週期素依賴性激酶(CDK)4或6抑制劑,例如本文所描述之CDK4抑制劑或CDK6抑制劑組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與CDK4/6
抑制劑(例如,靶向CDK4與CDK6之抑制劑),例如本文所描述之CDK4/6抑制劑組合投與個體。在一實施例中,個體患有MCL。MCL為不佳回應於當前可用療法,亦即基本上不可治癒之侵襲性癌症。在MCL之多數情況下,週期素D1(CDK4/6之調控因子)在MCL細胞中表現(例如,歸因於涉及免疫球蛋白及週期素D1基因之染色體易位)。因此,在不受理論束縛之情況下,認為MCL細胞以高特異性對CDK4/6抑制高度敏感(亦即,對正常免疫細胞之作用最小)。單獨CDK4/6抑制劑對治療MCL具有一些功效,但僅實現部分緩解且具有高復發率。示例性CDK4/6抑制劑為LEE011(亦稱為瑞博斯利(ribociclib)),其結構展示於下文。
在不受理論束縛之情況下,咸信本文所描述之表現CAR之細胞與CDK4/6抑制劑(例如,LEE011或本文所描述之其他CDK4/6抑制劑)一起投與可實現更高反應,例如與單獨CDK4/6抑制劑相比,例如緩解率更高及/或復發率更低。
在一個實施例中,激酶抑制劑為選自以下之BTK抑制劑:依魯替尼(PCI-32765);GDC-0834;RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;及LFM-A13。在一較佳實施例中,BTK抑制劑不降低或抑制介白素-2-誘導型激酶(ITK)之激酶活性,且選自GDC-0834;RN-486;CGI-560;CGI-1764;HM-71224;CC-292;ONO-4059;CNX-774;及LFM-A13。
在一個實施例中,激酶抑制劑為BTK抑制劑,例如依魯替尼(PCI-32765)。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與Btk抑制劑(例如,依魯替尼)組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與依魯替尼(亦稱為PCI-32765)組合投與個體。依魯替尼之
結構(1-[(3R)-3-[4-胺基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)展示於下文中。
在實施例中,個體患有CLL、套細胞淋巴瘤(MCL)或小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)。舉例而言,個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p),例如白血病細胞中)。在其他實例中,個體不具有del(17p)。在實施例中,個體患有復發性CLL或SLL,例如個體先前已投與癌症療法(例如,先前投與一種、兩種、三種或四種先前癌症療法)。在實施例中,個體患有難治性CLL或SLL。在其他實施例中,個體患有濾泡性淋巴瘤,例如復發性或難治性濾泡性淋巴瘤。在一些實施例中,依魯替尼以約300-600毫克/天(例如約300-350、350-400、400-450、450-500、500-550或550-600毫克/天,例如約420毫克/天或約560毫克/天)之劑量例如經口投與。在實施例中,依魯替尼以每日約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如,250mg、420mg或560mg)之劑量投與一定時間段,例如每日以上述劑量投與21天週期或每日以上述劑量投與28天週期。在一個實施例中,投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的依魯替尼。在一些實施例中,依魯替尼與利妥昔單抗組合投與。參見例如Burger等人(2013)Ibrutinib In Combination With Rituximab(iR)Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia
(CLL):New,Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients,Abstract 675 presented at 55th ASH Annual Meeting and Exposition,New Orleans,LA 7-10 Dec。在不受理論束縛之情況下,認為添加依魯替尼增強T細胞增殖性反應且可將T細胞自T輔助-2(Th2)變成T輔助-1(Th1)表型。Th1及Th2為輔助T細胞之表型,其中Th1對比Th2,導引不同免疫反應路徑。Th1表型與促炎性反應相關聯,例如用於殺死細胞,諸如細胞內病原體/病毒或癌細胞,或使自體免疫反應永存。Th2表型與嗜伊紅血球累積及消炎反應相關聯。
在本文中之方法、用途及組合物之一些實施例中,BTK抑制劑為國際申請案WO/2015/079417中所描述之BTK抑制劑,該申請案以全文引用的方式併入本文中。舉例而言,在一些實施例中,BTK抑制劑為式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽;
其中,R1為氫、視情況經羥基取代之C1-C6烷基;R2為氫或鹵素;R3為氫或鹵素;R4為氫;R5為氫或鹵素;或R4與R5彼此附接且代表一鍵-CH2-、-CH2-CH2-、-CH=CH-、-CH=CH-CH2-;-CH2-CH=CH-;或-CH2-CH2-CH2-;
R6及R7彼此獨立地代表H、視情況經羥基取代之C1-C6烷基、視情況經鹵素或羥基取代之C3-C6環烷基或鹵素;R8、R9、R、R'、R10及R11彼此獨立地代表H或視情況經C1-C6烷氧基取代之C1-C6烷基;或R8、R9、R、R'、R10及R11中之任何兩者與其所結合之碳原子一起可形成3-6員飽和碳環;R12為氫或視情況經鹵素或C1-C6烷氧基取代之C1-C6烷基;或R12與R8、R9、R、R'、R10或R11中之任一者與其所結合之原子一起可形成4、5、6或7員氮雜環,該環可視情況經鹵素、氰基、羥基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代;n為0或1;且R13為視情況經C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或N,N-二-C1-C6烷胺基取代之C2-C6烯基;視情況經C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代之C2-C6炔基;或視情況經C1-C6烷基取代之C2-C6伸烷基氧化物。
在一些實施例中,式I之BTK抑制劑選自:N-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-3-基)氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(E)-N-(3-(6-胺基-5-((1-(丁-2-烯醯基)氮雜環丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-((1-丙炔醯基氮雜環丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-((1-(丁-2-炔醯基)氮雜環丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(5-((1-丙烯醯基哌啶-4-基)氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丙烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(E)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丙炔醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(E)-
N-(3-(6-胺基-5-(2-(4-甲氧基-N-甲基丁-2-烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(2-((4-胺基-6-(3-(4-環丙基-2-氟苯甲醯胺基)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基環氧乙烷-2-甲醯胺;N-(2-((4-胺基-6-(3-(6-環丙基-8-氟-1-側氧基異喹啉-2(1H)-基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯醯胺;N-(3-(5-(2-丙烯醯胺基乙氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-乙基丙烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-(2-氟乙基)丙烯醯胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(5-((1-丙烯醯胺基環丙基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(5-(2-丙烯醯胺基丙氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(丁-2-炔醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丙烯醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(6-胺基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(3-(N-甲基丙烯醯胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(6-胺基-5-((1-(丁-2-炔醯基)吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-2-(3-(5-((1-丙烯醯基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羥甲基)苯基)-6-環丙基-3,4-二氫異喹啉-1(2H)-酮;N-(2-((4-胺基-6-(3-(6-環丙基-1-側氧基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-5-氟-2-(羥甲基)苯
基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯醯胺;N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔醯基)-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;2-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羥甲基)苯基)-6-環丙基-3,4-二氫異喹啉-1(2H)-酮;N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯醯基-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-4-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-氟吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(6-胺基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔醯基)-4-氟吡咯啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-N-(3-(6-胺基-5-((1-丙炔醯基氮雜環丁-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(S)-2-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羥甲基)苯基)-6-環丙基-3,4-二氫異喹啉-1(2H)-酮;(R)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基氮雜環丁-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;(R)-N-(3-(5-((1-丙烯醯基哌啶-3-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(5-(((2R,3S)-1-丙烯醯基-3-甲氧基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯醯基-4-氰基吡咯啶-2-基)甲氧基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺;或N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯醯基-4-氰基吡咯啶-2-基)甲氧
基)-6-胺基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-環丙基-2-氟苯甲醯胺。
除非以其他方式提供,否則以上用於描述式I之BTK抑制劑的化學術語根據如國際申請案WO/2015/079417(其以全文引用的方式併入本文中)中陳述之其含義使用。
在一個實施例中,激酶抑制劑為選自以下之mTOR抑制劑:替西羅莫司;地磷莫司二甲基亞膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-戊側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己酯,亦稱為AP23573及MK8669;依維莫司(RAD001);雷帕黴素(AY22989);斯馬匹莫;(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055);2-胺基-8-[反-4-(2-羥乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502);及N 2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并哌喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-(SEQ ID NO:706)內鹽(SF1126);及XL765。
在一個實施例中,激酶抑制劑為mTOR抑制劑,例如雷帕黴素,且雷帕黴素以每日約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如,6mg)之劑量投與一定時間段,例如每日以上述劑量投與21天週期或每日以上述劑量投與28天週期。在一個實施例中,投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的雷帕黴素。在一個實施例中,激酶抑制劑為mTOR抑制劑,例如依維莫司,且依維莫司以約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如,10mg)之劑量投與一定時間段,例如每日以上述劑量投與28天週
期。在一個實施例中,投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的依維莫司。
在一個實施例中,激酶抑制劑為選自以下之MNK抑制劑:CGP052088;4-胺基-3-(對氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380);尾孢醯胺(cercosporamide);ETC-1780445-2;及4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(例如,本文所描述之PI3K抑制劑,例如艾德斯布(idelalisib)或杜維力絲(duvelisib))及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與艾德斯布及利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與杜維力絲及利妥昔單抗組合投與個體。艾德斯布(亦稱為GS-1101或CAL-101;Gilead)為阻斷PI3K之δ同功異型物之小分子。艾德斯布之結構(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌吟-6-基胺基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)展示於下文中。
杜維力絲(亦稱為IPI-145;Infinity Pharmaceuticals and Abbvie)為阻斷PI3K-δ、PI3K-γ之小分子。杜維力絲之結構(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基胺基)乙基]-1(2H)-異喹啉酮)展示於下文中。
在實施例中,個體患有CLL。在實施例中,個體患有復發性CLL,例如個體先前已投與癌症療法(例如,先前已投與抗CD20抗體或先前已投與依魯替尼)。舉例而言,個體在染色體17之短臂中具有缺失(del(17p),例如白血病細胞中)。在其他實例中,個體不具有del(17p)。在實施例中,個體包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中包含突變之白血病細胞。在其他實施例中,個體不包含在免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中包含突變之白血病細胞。在實施例中,個體在染色體11之長臂中具有缺失(del(11q))。在其他實施例中,個體不具有del(11q)。在實施例中,艾德斯布以約100-400mg(例如,100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375或375-400mg)之劑量例如BID投與。在實施例中,杜維力絲以約15-100mg(例如,約15-25、25-50、50-75或75-100mg)之劑量例如一日兩次投與。在實施例中,利妥昔單抗以約350-550mg/m2(例如,350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)之劑量例如經靜脈內投與。
在一個實施例中,激酶抑制劑為選自以下之雙磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)及mTOR抑制劑:2-胺基-8-[反-4-(2-羥乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502);N-[4-[[4-(二甲胺基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384、PKI-587);2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235);阿匹托里斯(apitolisib)(GDC-0980、RG7422);2,4-
二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-噠嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺(GSK2126458);8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮順丁烯二酸(NVP-BGT226);3-[4-(4-嗎啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103);5-(9-異丙基-8-甲基-2-(N-嗎啉基)-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584、SB2343);及N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)胺基]喹喏啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]胺基苯基磺醯胺(XL765)。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑組合投與個體。例示性ALK激酶包括(但不限於)克卓替尼(crizotinib)(Pfizer)、色瑞替尼(ceritinib)(Novartis)、艾樂替尼(alectinib)(Chugai)、布加替尼(brigatinib)(亦稱為AP26113;Ariad)、恩曲替尼(entrectinib)(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(參見例如臨床試驗標識號NCT02048488)、CEP-37440(Teva)及X-396(Xcovery)。在一些實施例中,個體患有實體癌,例如本文所描述之實體癌,例如肺癌。
克卓替尼之化學名稱為3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。色瑞替尼之化學名稱為5-氯-N 2-[2-異丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N 4-[2-(異丙基磺醯基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾樂替尼之化學名稱為9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-(N-嗎啉基)哌啶-1-基)-11-側氧基-6,11-二氫-5H-苯并[b]咔唑-3-甲腈。布加替尼之化學名稱為5-氯-N2-{4-[4-(二甲胺基)-1-哌啶基]-2-甲氧基苯基}-N4-[2-(二甲基磷醯基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。恩曲替尼之化學名稱為N-(5-3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)苯甲醯胺。PF-06463922之化學名稱為(10R)-7-胺基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-側氧基-10,15,16,17-四氫-2H-8,4-(亞甲橋)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并噁二氮雜環四癸炔-3-甲腈。CEP-37440之化學結
構為(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-2-基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)-N-甲基苯甲醯胺。X-396之化學名稱為(R)-6-胺基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)噠嗪-3-甲醯胺。
亦可使用抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調神經磷酸酶(環孢靈(cyclosporine)及FK506)或抑制對生長因子誘導之信號傳導為重要之p70S6激酶之藥物(雷帕黴素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991;Henderson等人,Immun.73:316-321,1991;Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另一態樣中,本發明之細胞組合物可與以下結合(例如之前、同時或之後)投與患者:骨髓移植、使用諸如氟達拉賓之化學療法試劑的T細胞消融療法、外光束放射療法(XRT)、環磷醯胺,及/或諸如OKT3或CAMPATH之抗體。在一個態樣中,本發明之細胞組合物在B細胞消融療法(諸如與CD20反應之試劑,例如美羅華(Rituxan))之後投與。舉例而言,在一個實施例中,個體可經歷使用高劑量化學療法,隨後周邊血液幹細胞移植之標準治療。在某些實施例中,在移植後,個體接收本發明之擴增免疫細胞輸注。在另一實施例中,在手術之前或之後投與擴增之細胞。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑組合投與個體。IDO為催化胺基酸、L-色胺酸降解為犬尿胺酸之酶。許多癌症過度表現IDO,例如前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、頭部癌及肺癌。pDC、巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)可表現IDO。在不受理論束縛之情況下,認為L-色胺酸減少(例如,藉由IDO催化)藉由誘導T細胞能力缺失及細胞凋亡而導致免疫抑制環境。因此,在不受理論束縛之情況下,認為IDO抑制劑可例如藉由減少表現CAR之免疫細胞的抑制或死亡來增強本文所描述之表現CAR之細胞的功效。在實施例中,個體患有實體腫瘤,
例如本文所描述之實體腫瘤,例如前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、頭部癌或肺癌。例示性IDO抑制劑包括(但不限於)1-甲基-色胺酸、吲哚莫德(indoximod)(NewLink Genetics)(參見例如臨床試驗標識號NCT01191216、NCT01792050)及INCB024360(Incyte Corp.)(參見例如臨床試驗標識號NCT01604889、NCT01685255)。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)之調節劑組合投與個體。MDSC積聚在周邊及許多實體腫瘤之腫瘤位點。此等細胞抑制T細胞反應,藉此阻礙表現CAR之細胞療法之功效。在不受理論束縛之情況下,認為投與MDSC調節劑增強本文所描述之表現CAR之細胞的功效。在一實施例中,個體患有實體腫瘤,例如本文所描述之實體腫瘤,例如神經膠母細胞瘤。例示性MDSC調節劑包括(但不限於)MCS110及BLZ945。MCS110為針對巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之單株抗體(mAb)。參見例如臨床試驗標識號NCT00757757。BLZ945為群落刺激因子1受體(CSF1R)之小分子抑制劑。參見例如Pyonteck等人Nat.Med.19(2013):1264-72BLZ945之結構展示於下文中。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與抑制或減少免疫抑制漿細胞活性之試劑組合投與個體。已展示免疫抑制漿細胞阻礙T細胞依賴性免疫原性化學療法,諸如奧沙利鉑(oxaliplatin)(Shalapour等人,Nature 2015,521:94-101)。在一實施例中,免疫抑制漿細胞可表現IgA、介白素(IL)-10及PD-L1中之一或多者。在一實施例中,試劑為表現CD19 CAR之細胞或表現BCMA CAR之細胞。
在一些實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與介白素-15(IL-15)多肽、介白素-15受體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽與IL-15Ra多肽兩者之組合(例如,hetIL-15(Admune Therapeutics,LLC)組合投與個體。hetIL-15為IL-15與IL-15Ra之雜二聚非共價複合物。hetIL-15描述於例如以引用的方式併入本文中之U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413及U.S.2011/0081311中。在實施例中,het-IL-15經皮下投與。在實施例中,個體患有癌症,例如實體癌,例如黑素瘤或結腸癌。在實施例中,個體患有轉移性癌症。
在實施例中,向患有本文所描述之疾病(例如血液病症,例如AML或MDS)的個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及試劑(例如,細胞毒性劑或化學療法試劑)、生物療法(例如抗體,例如單株抗體,或細胞療法)或抑制劑(例如,激酶抑制劑)。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及細胞毒性劑,例如CPX-351(Celator Pharmaceuticals)、阿糖胞苷、道諾黴素、沃薩洛辛(vosaroxin)(Sunesis Pharmaceuticals)、沙帕他賓(sapacitabine)(Cyclacel Pharmaceuticals)、艾達黴素或米托蒽醌。CPX-351為包含5:1莫耳比之阿糖胞苷及道諾黴素的脂質體調配物。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及低甲基化劑,例如DNA甲基轉移酶抑制劑,例如阿紮胞苷或地西他賓。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及生物療法,例如抗體或細胞療法,例如225Ac-林妥珠單抗(225Ac-lintuzumab)(Actimab-A;Actinium Pharmaceuticals)、IPH2102(Innate Pharma/Bristol Myers Squibb)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)或吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg;Pfizer)。SGN-CD33A為包含吡咯并苯并二氮呯二聚體附接於抗-CD33抗體之抗體-藥物結合物
(ADC)。Actimab-A為經錒標記之抗CD33抗體(林妥珠單抗)。IPH2102為靶向殺手免疫球蛋白樣受體(KIR)之單株抗體。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及FLT3抑制劑,例如索拉非尼(sorafenib)(Bayer)、米哚妥林(midostaurin)(Novartis)、喹雜替尼(quizartinib)(Daiichi Sankyo)、克瑞拉尼(crenolanib)(Arog Pharmaceuticals)、PLX3397(Daiichi Sankyo)、AKN-028(Akinion Pharmaceuticals)或ASP2215(Astellas)。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及異檸檬酸脫氫酶(IDH)抑制劑,例如AG-221(Celgene/Agios)或AG-120(Agios/Celgene)。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及細胞週期調節劑,例如polo樣激酶1(Plk1)之抑制劑,例如沃拉替尼(volasertib)(Boehringer Ingelheim);或週期素依賴性激酶9(Cdk9)之抑制劑,例如阿昔迪布(alvocidib)(Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis)。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及B細胞受體信號傳導網路抑制劑,例如B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)之抑制劑,例如維托拉斯(venetoclax)(Abbvie/Roche);或布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)之抑制劑,例如依魯替尼(Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical)。在實施例中,向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞以及M1胺基肽酶之抑制劑,例如托多斯塔(tosedostat)(CTI BioPharma/Vernalis);組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)之抑制劑,例如普拉斯塔(pracinostat)(MEI Pharma);多激酶抑制劑,例如瑞格斯替(rigosertib)(Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio);或肽CXCR4反向促效劑,例如BL-8040(BioLineRx)。在實施例中,向個體投與靶向CD123之表現CAR之細胞以及靶向除CD123以外的抗原(例如,CLL-1、BCMA、CD33、CD19、FLT -3或葉酸受體β)之表現CAR之細胞。
在另一實施例中,在細胞移植(例如,同種異體幹細胞移植)之前,個體接收本發明之表現CD123 CAR之細胞組合物的輸注。在一較佳實施例中,表現CD123-CAR之細胞例如藉由mRNA CD123 CAR之電穿孔來短暫表現CD123 CAR,從而CD123表現在輸注供體幹細胞之前終止以避免移植失敗。
一些患者可在投與期間或之後經歷對本發明化合物及/或其他抗癌劑之過敏反應;因此,通常投與抗過敏劑以使過敏反應之風險降至最低。適合抗過敏劑包括皮質類固醇,諸如地塞米松(例如,Decadron®)、倍氯米松(beclomethasone)(例如,Beclovent®)、氫化可的松(hydrocortisone)(亦稱為可的松、氫化可的松丁二酸鈉、氫化可的松磷酸鈉,且以商品名Ala-Cort®、磷酸氫化可的松、Solu-Cortef®、Hydrocort Acetate®及Lanacort®出售)、潑尼松龍(prednisolone)(以商品名Delta-Cortel®、Orapred®、Pediapred®及Prelone®出售)、潑尼松(以商品名Deltasone®、Liquid Red®、Meticorten®及Orasone®出售)、甲潑尼龍(methylprednisolone)(亦稱為6-甲潑尼龍、乙酸甲潑尼龍、甲潑尼龍丁二酸鈉,以商品名Duralone®、Medralone®、Medrol®、M-Prednisol®及Solu-Medrol®出售);抗組織胺,諸如苯海拉明(diphenhydramine)(例如,Benadryl®)、安泰樂(hydroxyzine)及塞庚啶(cyproheptadine);及支氣管擴張劑,諸如β-腎上腺素激導性受體促效劑、舒喘寧(albuterol)(例如,Proventil®)及特布他林(terbutaline)(Brethine®)。
一些患者在投與本發明化合物及/或其他抗癌劑期間及之後可經歷噁心;因此,將抗嘔吐劑用於防止噁心(上胃)及嘔吐。適合抗嘔吐劑包括阿瑞匹坦(aprepitant)(Emend®)、昂丹司瓊(ondansetron)(Zofran®)、鹽酸格拉司瓊(granisetron HCl)(Kytril®)、勞拉西泮(lorazepam)(Ativan®)、地塞米松(Decadron®)、丙氯拉嗪
(prochlorperazine)(Compazine®)、卡索匹坦(casopitant)(Rezonic®及Zunrisa®)及其組合。
通常規定緩解治療時段期間所經歷之疼痛的藥療以使患者更舒適。通常使用常見非處方鎮痛劑,諸如Tylenol®。然而,類鴉片鎮痛劑藥物,諸如氫可酮(hydrocodone)/撲熱息痛(paracetamolor)或氫可酮/乙醯胺苯酚(例如,Vicodin®)、嗎啡鹼(morphine)(例如,Astramorph®或Avinza®)、羥考酮(oxycodone)(例如,OxyContin®或Percocet®)、鹽酸羥嗎啡酮(oxymorphone hydrochloride)(Opana®)及芬太尼(fentanyl)(例如,Duragesic®)亦適用於中度或嚴重疼痛。
在致力於保護正常細胞免於治療毒性且限制器官毒性中,細胞保護劑(諸如,神經保護劑、自由基清除劑、心臟保護劑、蒽環黴素溢出中和劑、營養物及其類似者)可用作輔助療法。適合之細胞保護劑包括胺磷汀(Amifostine)(Ethyol®)、麩醯胺酸、地美司鈉(dimesna)(Tavocept®)、美司鈉(mesna)(Mesnex®)、右雷佐生(dexrazoxane)(Zinecard®或Totect®)、紮利羅登(xaliproden)(Xaprila®)及甲醯四氫葉酸(leucovorin)(亦稱為甲醯四氫葉酸鈣、檸膠因子及醛葉酸)。
藉由編碼序號、類屬或商標名鑑別之活性化合物之結構可自正版標準綱要「默克索引(The Merck Index)」,或自資料庫,例如專利國際(Patents International)(例如,IMS世界公開案(IMS World Publications))獲得。
可與本發明化合物組合使用之上文所提及之化合物可如此項技術中,諸如上文所引用之文獻中所描述來製備及投與。
在一個實施例中,本發明提供醫藥組合物,其包含至少一種本發明化合物(例如,本發明化合物)或其醫藥學上可接受之鹽以及適合於投與人類或動物個體之醫藥學上可接受之載劑,單獨或與其他抗癌劑一起。
在一個實施例中,本發明提供治療罹患細胞增殖性疾病(諸如癌症)之人類或動物個體之方法。本發明提供治療需要此類治療之人類或動物個體之方法,其包含向該個體投與治療有效量之本發明化合物(例如,本發明化合物)或其醫藥學上可接受之鹽,單獨或與其他抗癌劑組合。
特定言之,組合物將以組合治療劑形式調配在一起或分開投與。
在組合療法中,本發明化合物及其他抗癌劑可同時、並行或依次投與,無特定時間限制,其中此類投與在患者體內提供治療有效含量之兩種化合物。
在一較佳實施例中,本發明化合物及其他抗癌劑一般藉由輸注或經口按任何次序依次投與。給藥方案可視疾病階段、患者之身體健康狀況、個別藥物之安全型態及個別藥物之耐受性以及投與該組合之主治醫師及行醫者熟知之其他標準而變化。視用於治療之特定週期而定,本發明化合物及其他抗癌劑可彼此相隔幾分鐘、幾小時、幾天或甚至幾週投與。另外,週期可包括在治療週期期間一種藥物比其他藥物更頻繁地投與且每次藥物投與劑量不同。
在本發明之另一態樣中,提供包括一或多種本發明化合物及如本文所揭示之組合搭配物之套組。代表性套組包括(a)本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽,(b)至少一種組合搭配物,例如如上文所指示,從而此類套組可包含藥品說明書或包括投與指導之其他標籤。
本發明化合物亦可用於與已知治療方法,例如激素或尤其輻射之投與組合獲利。本發明化合物可尤其用作放射增敏劑,尤其用於治療對放射線療法展現不佳敏感性之腫瘤。
在一個實施例中,可向個體投與減輕或改善與投與表現CAR之細胞相關聯之副作用的試劑。與投與表現CAR之細胞相關聯之副作用包
括(但不限於)CRS及噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH),亦稱為巨噬細胞活化症候群(MAS)。CRS之症狀包括高熱、噁心、短暫低血壓、低氧及其類似症狀。CRS可包括臨床體質性病徵及症狀,諸如發熱、疲乏、食慾不振、肌痛、關節疼痛、噁心、嘔吐及頭痛。CRS可包括臨床皮膚病征及症狀,諸如皮疹。CRS可包括臨床腸胃病征及症狀,諸如噁心、嘔吐及腹瀉。CRS可包括臨床呼吸道病徵及症狀,諸如呼吸急促及低血氧症。CRS可包括臨床心血管病徵及症狀,諸如心動過速、加寬之脈衝壓力、低血壓、增加之心輸出量(早期)及潛在減少之心輸出量(晚期)。CRS可包括臨床凝血病徵及症狀,諸如升高之d-二聚體、具有或不具有出血之低纖維蛋白原血症。CRS可包括臨床腎臟病徵及症狀,諸如氮血症。CRS可包括臨床肝臟病徵及症狀,諸如轉胺酶升高(transaminitis)及高膽紅素血症。CRS可包括臨床神經病征及症狀,諸如頭痛、精神狀態變化、意識模糊、譫妄、喚詞困難或弗蘭克失語症(frank aphasia)、幻覺、顫抖、癡呆(dymetria)、步態改變及癲癇。因此,本文所描述之方法可包含向個體投與本文所描述之表現CAR之細胞及進一步投與一或多種管理可溶性因子含量升高之試劑,該含量升高由使用表現CAR之細胞治療引起。在一個實施例中,個體中升高之可溶性因子為IFN-γ、TNFα、IL-2及IL-6中之一或多者。在一實施例中,個體中升高之因子為IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5及人趨化因子(fraktalkine)中之一或多者。因此,投與以治療此副作用之試劑可為抵消此等可溶性因子中之一或多者之試劑。在一個實施例中,抵消此等可溶性形式中之一或多者的試劑為抗體或其抗原結合片段。此類試劑之實例包括(但不限於)類固醇(例如,皮質類固醇)、TNFα抑制劑及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之一實例為抗TNFα抗體分子,諸如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗片段產品(certolizumab pegol)及戈利木單抗(golimumab)。
TNFα抑制劑之另一實例為融合蛋白,諸如依那西普(entanercept)。TNFα之小分子抑制劑包括(但不限於)黃嘌呤衍生物(例如,己酮可可鹼(pentoxifylline))及安非他酮(bupropion)。IL-6抑制劑之一實例為抗IL-6抗體分子,諸如托珠單抗(tocilizumab,toc)、賽瑞單抗(sarilumab)、艾思莫單抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301及FM101。在一個實施例中,抗IL-6抗體分子為托珠單抗。基於IL-1R之抑制劑之一實例為阿那白滯素(anakinra)。
在一些實施例中,向個體投與皮質類固醇,尤其諸如甲潑尼龍、氫化可的松。
在一些實施例中,向個體投與血管加壓劑,諸如去甲腎上腺素、多巴胺(dopamine)、苯腎上腺素、腎上腺素、血管加壓素或其組合。
在一實施例中,可向個體投與退熱劑。在一實施例中,可向個體投與鎮痛劑。
在一個實施例中,可向個體投與增強表現CAR之細胞之活性的試劑。舉例而言,在一個實施例中,該試劑可為抑制抑制性分子之試劑,例如該試劑為檢查點抑制劑。在一些實施例中,抑制性分子(例如,程式化死亡1(PD1))可降低表現CAR之細胞建立免疫效應反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。抑制性分子之抑制,例如在DNA、RNA或蛋白質含量上之抑制,可使表現CAR之細胞效能最佳化。在實施例中,抑制性核酸,例如抑制性核酸,例如dsRNA,例如如本文所描述之siRNA或shRNA、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN),可用於抑制表現CAR之細胞中抑
制性分子之表現。在一實施例中,抑制劑為shRNA。在一實施例中,抑制性分子在表現CAR之細胞內受到抑制。在此等實施例中,抑制抑制性分子表現之dsRNA分子連接於編碼CAR組分(例如,全部組分)之核酸。
在一實施例中,編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子可操作地連接於啟動子,例如H1衍生或U6衍生之啟動子,使得調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現之dsRNA分子表現,例如在表現CAR之細胞內表現。參見例如Tiscornia G.,「Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,」第3章,於 Gene Transfer:Delivery and Expression of DNA and RNA (Friedmann及Rossi編)中。Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA,2007;Brummelkamp TR等人(2002)Science 296:550-553;Miyagishi M等人(2002)Nat.Biotechnol.19:497-500在一實施例中,編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子存在於包含編碼CAR組分(例如,全部組分)之核酸分子的相同載體(例如,慢病毒載體)上。在此類實施例中,編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子位於編碼CAR組分(例如,全部組分)之核酸的5'或3'載體(例如,慢病毒載體)上。編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子可在與編碼CAR組分(例如,全部組分)之核酸相同或不同之方向上轉錄。在一實施例中,編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子存在於除包含編碼CAR組分(例如,全部組分)之核酸分子的載體以外之載體上。在一實施例中,編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子在表現CAR之細胞內短暫表現。在一實施例中,編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例
如,抑制)T細胞功能之分子表現)之核酸分子穩定整合至表現CAR之細胞之基因組中。圖51A至圖51E描繪用於表現CAR組分(例如,全部組分)之載體的實例,其具有抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現之dsRNA分子。
下文提供適用於抑制調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子表現之dsRNA分子之實例,其中調節或調控(例如,抑制)T細胞功能之分子為PD-1。
下表16中提供PDCD1(PD1)RNAi試劑之名稱(來源於其在小鼠PDCD1基因序列NM_008798.2中之位置),以及表示DNA序列之SEQ ID NO:216-263。有義(S)及反義(AS)序列在此表中均以19mer及21mer序列形式呈現。亦應注意,位置(PoS,例如176)來源於小鼠PDCD1基因序列NM_008798.2中之位置編號。SEQ ID NO在對應於「有義19」SEQ ID NO:608-619;「有義21」SEQ ID NO:620-631;「反義21」SEQ ID NO:632-643;「反義19」SEQ ID NO:644-655之12個組中指示。
下表17中提供PDCD1(PD1)RNAi試劑之名稱(來源於其在人類PDCD1基因序列中之位置),以及表示DNA序列之SEQ ID NO.264-311。有義(S)及反義(AS)序列在此表中均以19mer及21mer序列形式呈現。SEQ ID NO在對應於「有義19」SEQ ID NO:656-667;「有義21」SEQ ID NO:668-679;「反義21」SEQ ID NO:680-691;「反義19」SEQ ID NO:692-703之12個組中指示。
在一個實施例中,抑制性信號之抑制劑可為例如結合至抑制性分子之抗體或抗體片段。舉例而言,該試劑可為與PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4結合之抗體或抗體片段(例如,伊匹單抗(ipilimumab)(亦稱為MDX-010及MDX-101,且以Yervoy®市售,Bristol-Myers Squibb;曲美單抗(Tremelimumab)(可購自Pfizer之IgG2單株抗體,以前稱為替西單抗(ticilimumab),CP-675,206))。在一實施例中,該試劑為與TIM3結合之抗體或抗體片段。在一實施例中,該試劑為與LAG3結合之抗體或抗體片段。在實施例中,增強表現CAR之細胞的活性之試劑,例如抑制性分子之抑制劑與同種異體CAR、例如本文所描述之同種異體CAR(例如,描述於本文同種異體CAR部分中)組合投與。
PD-1為CD28受體家族之一抑制性成員,該受體家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在經活化之B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol 8:765-75)。已展示PD-1之兩個配位體PD-L1及PD-L2在與PD-1結合後下調T細胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med 192:1027-34;Latchman等人2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter等人2002 Eur J Immunol 32:634-43)。人類癌症中PD-L1極豐富(Dong等人2003 J Mol Med 81:281-7;Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother 54:307-314;Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制可藉由抑制PD-1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。
PD-1、PD-L1及PD-L2之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技
術中可獲得且可與本文所描述之本發明car組合使用。舉例而言,尼沃單抗(nivolumab)(亦稱為BMS-936558或MDX1106;Bristol-Myers Squibb)為特異性阻斷PD-1之完全人類IgG4單株抗體。與PD-1特異性結合之尼沃單抗(純系5C4)及其他人類單株抗體揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。皮立珠單抗(Pidilizumab)(CT-011;Cure Tech)為與PD-1結合之人類化IgG1k單株抗體。皮立珠單抗及其他人類化抗PD-1單株抗體揭示於WO2009/101611中。派立珠單抗(Pembrolizumab)(先前稱為拉立珠單抗(lambrolizumab),且亦稱為MK03475;Merck)為與PD-1結合之人類化IgG4單株抗體。派立珠單抗及其他人類化抗PD-1抗體揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。MEDI4736(Medimmune)為與PDL1結合且抑制配位體與PD1相互作用之人類單株抗體。MDPL3280A(Genentech/Roche)為與PD-L1結合之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。MDPL3280A及其他針對PD-L1之人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。其他抗PD-L1結合劑包括YW243.55.S70(重鏈及輕鏈可變區展示於WO2010/077634中之SEQ ID NO 20及21中)及MDX-1 105(亦稱為BMS-936559,及例如WO2007/005874中所揭示之抗PD-L1結合劑)。AMP-224(B7-DCIg;Amplimmune;例如揭示於WO2010/027827及WO2011/066342中)為阻斷PD-1與B7-H1之間的相互作用之PD-L2 Fc融合可溶性受體。其他抗PD-1抗體包括AMP 514(Amplimmune),尤其例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗PD-1抗體。
在一個實施例中,抗PD-1抗體或其片段為如以全文引用的方式併入本文中之標題為「Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof」的US 2015/0210769中所描述之抗PD-1抗體分子。在一個實施例中,抗PD-1抗體分子包括來自選自以下中任一者之抗體之重鏈及
輕鏈可變區的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR(或總體而言全部CDR):BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-純系-A、BAP049-純系-B、BAP049-純系-C、BAP049-純系-D或BAP049-純系-E;或如US 2015/0210769之表1中所描述,或由表1中之核苷酸序列編碼,或與任一前述序列實質上相同(例如,至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列;或密切相關CDR,例如相同或具有至少一個胺基酸改變但不超過兩個、三個或四個改變(例如,取代、缺失或插入,例如保守取代)之CDR。
在又一實施例中,抗PD-1抗體分子包含來自本文所描述之抗體,例如選自以下中任一者之抗體的至少一個、兩個、三個或四個可變區:BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-純系-A、BAP049-純系-B、BAP049-純系-C、BAP049-純系-D或BAP049-純系-E;或如US 2015/0210769之表1中所描述,或由表1中之核苷酸序列編碼;或與任一前述序列實質上相同(例如,至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列。
TIM3(T細胞免疫球蛋白-3)尤其在分泌IFN-g之CD4+ T輔助1及CD8+ T細胞毒性1細胞中亦負調控T細胞功能,且在T細胞耗竭中起關鍵作用。抑制TIM3與其配位體(例如,半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂
醯絲胺酸(PS)及HMGB1)之間的相互作用可提高免疫反應。TIM3及其配位體之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所描述之CD19 CAR組合使用。舉例而言,靶向TIM3之抗體、抗體片段、小分子或肽抑制劑與TIM3之IgV域結合以抑制與其配位體之相互作用。抑制TIM3之抗體及肽揭示於WO2013/006490及US20100247521中。其他抗TIM3抗體包括RMT3-23之人類化型式(揭示於Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551中)及純系8B.2C12(揭示於Monney等人,2002,Nature,415:536-541中)。抑制TIM3及PD-1之雙特異性抗體揭示於US20130156774中。
在一個實施例中,抗TIM3抗體或其片段為如以全文引用的方式併入本文中之標題為「Antibody Molecules to TIM3 and Uses Thereof」的US 2015/0218274中所描述之抗TIM3抗體分子。在一個實施例中,抗TIM3抗體分子包括來自選自以下中任一者之抗體之重鏈及輕鏈可變區的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR(或總體而言全部CDR):ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23;或如US 2015/0218274之表1至表4中所描述;或由表1至4中之核苷酸序列編碼;或與任一前述序列實質上相同(例如,至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列;或密切相關CDR,例如相同或具有至少一個胺基酸改變但不超過兩個、三個或四個改變(例如,取代、缺失或插入,例如保守取代)之CDR。
在又一實施例中,抗TIM3抗體分子包含來自本文所描述之抗體,例如選自以下中任一者之抗體的至少一個、兩個、三個或四個可變區:ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23;或如US 2015/0218274之表1至4中所描述;或由表1至4中之核苷酸序列編碼;或與任一前述序列實質上相同(例如,至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高相同)之序列。
在其他實施例中,增強表現CAR之細胞的活性之試劑為CEACAM抑制劑(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5抑制劑)。在一個實施例中,CEACAM抑制劑為抗CEACAM抗體分子。例示性抗CEACAM-1抗體描述於WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251及WO 2014/022332中,例如單株抗體34B1、26H7及5F4;或其重組形式,例如US 2004/0047858、US 7,132,255及WO 99/052552中所描述。在其他實施例中,抗CEACAM抗體與CEACAM-5結合,如例如Zheng等人,PLoS One.2010年9月2日;5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所描述,或與CEACAM-1及CEACAM-5交叉反應,如例如WO 2013/054331及US 2014/0271618中所描述。
在不希望受理論束縛之情況下,咸信癌胚抗原細胞黏附分子(CEACAM)(諸如CEACAM-1及CEACAM-5)至少部分地介導抗腫瘤免疫反應之抑制(參見例如Markel等人J Immunol.2002年3月15
日;168(6):2803-10;Markel等人J Immunol.2006年11月1日;177(9):6062-71;Markel等人Immunology.2009年2月;126(2):186-200;Markel等人Cancer Immunol Immunother.2010年2月;59(2):215-30;Ortenberg等人Mol Cancer Ther.2012年6月;11(6):1300-10;Stern等人J Immunol.2005年6月1日;174(11):6692-701;Zheng等人PLoS One.2010年9月2日;5(9).pii:e12529)。舉例而言,CEACAM-1已描述為TIM-3之異嗜性配位體且在TIM-3介導之T細胞耐受性及耗竭中起作用(參見例如WO 2014/022332;Huang等人(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在實施例中,已展示CEACAM-1與TIM-3之共阻斷增強異種移植結腸直腸癌模型中之抗腫瘤免疫反應(參見例如WO 2014/022332;Huang等人(2014),見上文)。在其他實施例中,CEACAM-1與PD-1之共阻斷使T細胞耐受性降低,如例如WO 2014/059251中所描述。因此,CEACAM抑制劑可與本文所描述之其他免疫調節劑(例如,抗PD-1及/或抗TIM-3抑制劑)一起使用以增強針對癌症之免疫反應,癌症例如黑素瘤、肺癌(例如,NSCLC)、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌及如本文所描述之其他癌症。
LAG3(淋巴細胞活化基因-3或CD223)為在經活化之T細胞及B細胞上表現之細胞表面分子,已展示其在CD8+ T細胞耗竭中起作用。LAG3及其配位體之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所描述之CD19 CAR組合使用。舉例而言,BMS-986016(Bristol-Myers Squib)為靶向LAG3之單株抗體。IMP701(Immutep)為拮抗劑LAG3抗體,且IMP731(Immutep及GlaxoSmithKline)為耗盡LAG3抗體。其他LAG3抑制劑包括IMP321(Immutep),其為LAG3及Ig之可溶性部分的重組融合蛋白,其與MHC II類分子結合且活化抗原呈現細胞(APC)。其他抗體揭示於例如WO2010/019570中。
在一些實施例中,增強表現CAR之細胞的活性之試劑可為例如包
含第一結構域及第二結構域之融合蛋白,其中第一結構域為抑制性分子或其片段,且第二結構域為與正信號相關聯之多肽,例如包含如本文所描述之胞內信號傳導域的多肽。在一些實施例中,與正信號相關聯之多肽可包括CD28、CD27、ICOS之共刺激域,例如CD28、CD27及/或ICOS之胞內信號傳導域,及/或例如本文所描述(例如,CD3 ξ)之主要信號傳導域。在一個實施例中,融合蛋白由表現CAR之相同細胞表現。在另一實施例中,融合蛋白由不表現CD123 CAR之細胞(例如,T細胞)表現。
在一個實施例中,增強本文所描述之表現CAR之細胞的活性之試劑為miR-17-92。
在一個實施例中,增強本文所描述之CAR之活性的試劑為細胞激素。細胞激素具有與T細胞擴增、分化、存活及穩態相關之重要功能。可投與接收本文所描述之表現CAR之細胞的個體之細胞激素包括:IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18及IL-21或其組合。在較佳實施例中,投與之細胞激素為IL-7、IL-15或IL-21或其組合。細胞激素可一天投與一次或一天投與一次以上,例如一天兩次、一天三次或一天四次。細胞激素可投與一天以上,例如細胞激素投與2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週或4週。舉例而言,細胞激素一天投與一次,歷時7天。
在實施例中,細胞激素與表現CAR之T細胞組合投與。細胞激素可與表現CAR之T細胞同時或並行投與,例如在同一天投與。細胞激素可製備在與表現CAR之T細胞相同的醫藥組合物中,或可製備在獨立醫藥組合物中。或者,細胞激素可在投與表現CAR之T細胞之後不久,例如在投與表現CAR之T細胞之後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天投與。在細胞激素在一天以上發生之給藥方案中投與之實施例中,細胞激素給藥方案之第一天可在與表現CAR之T細胞投與相同
的一天,或細胞激素給藥方案之第一天可為在投與表現CAR之T細胞之後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一個實施例中,在第一天,表現CAR之T細胞投與個體,且在第二天,細胞激素一天投與一次,歷時隨後7天。在一較佳實施例中,待與表現CAR之T細胞組合投與之細胞激素為IL-7、IL-15或IL-21。
在其他實施例中,在投與表現CAR之細胞之後一定時間段,例如在投與表現CAR之細胞之後至少2週、3週、4週、6週、8週、10週、12週、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或1年或1年以上投與細胞激素。在一個實施例中,在評估個體對表現CAR之細胞的反應之後投與細胞激素。舉例而言,根據本文所描述之劑量及方案向個體投與表現CAR之細胞。使用本文所描述之任一方法,包括腫瘤生長抑制、循環腫瘤細胞減少或腫瘤消退,在投與表現CAR之細胞之後2週、3週、4週、6週、8週、10週、12週、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或1年或1年以上評估個體對表現CAR之細胞療法的反應。對表現CAR之細胞療法未展現足夠反應之個體可被投與細胞激素。細胞激素投與對表現CAR之細胞療法具有次佳反應之個體提高表現CAR之細胞功效或抗癌活性。在一較佳實施例中,在投與表現CAR之細胞之後投與之細胞激素為IL-7。
本文所揭示之方法及組合物可與CD19抑制劑組合使用。CD19抑制劑包括(但不限於)表現CD19 CAR之細胞,例如CD19 CART細胞,或抗CD19抗體(例如,抗CD19單特異性或雙特異性抗體)或其片段或共軛物。
在一個實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與CD19 CAR細胞(例如,CART細胞)(例如CTL019,例如如以引用的方式併入本文
中之WO2012/079000中所描述)組合投與個體。
在其他實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與包括以引用的方式併入本文中之WO2014/153270(例如,WO2014/153270之表3)中所描述之人類化抗原結合域的CD19 CAR細胞(例如,CART細胞)組合投與個體。
在實施例中,個體患有急性骨髓白血病(AML),例如CD19陽性AML或CD19陰性AML。在實施例中,個體患有CD19+淋巴瘤,例如CD19+非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、CD19+ FL或CD19+ DLBCL。在實施例中,個體患有復發性或難治性CD19+淋巴瘤。在實施例中,淋巴細胞耗盡化學療法在CD19 CART細胞投與(例如,輸注)之前、與其並行或之後投與個體。在一實例中,淋巴細胞耗盡化學療法在投與CD19 CART細胞之前投與個體。舉例而言,淋巴細胞耗盡化學療法在CD19 CART細胞輸注前1-4天(例如,1、2、3或4天)結束。在實施例中,例如如本文所描述,投與多劑CD19 CART細胞。舉例而言,單次劑量包含約5×108個CD19 CART細胞。在實施例中,淋巴細胞耗盡化學療法在投與(例如,輸注)本文所描述之表現CAR之細胞,例如非表現CD19 CAR之細胞之前、與其並行或之後投與個體。在實施例中,CD19 CART在投與(例如,輸注)非表現CD19 CAR之細胞,例如本文所描述之非表現CD19 CAR之細胞之前、與其並行或之後投與個體。
在一些實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞與表現CD19 CAR之細胞(例如CTL019,例如如以引用的方式併入本文中之WO2012/079000中所描述)組合投與個體,以治療與CD123表現相關聯之疾病,例如本文所描述之癌症。在不受理論束縛之情況下,咸信組合投與表現CD19 CAR之細胞與表現CAR之細胞藉由靶向早期譜系癌細胞(例如,癌症幹細胞)調節免疫反應、耗盡調控B細胞及/或改善腫
瘤微環境,來提高本文所描述之表現CAR之細胞的功效。舉例而言,表現CD19 CAR之細胞靶向表現早期譜系標記之癌細胞(例如,癌症幹細胞)及表現CD19之細胞,而本文所描述之表現CAR之細胞靶向表現晚期譜系標記(例如,CD123)之癌細胞。此預處理方法可提高本文所描述之表現CAR之細胞的功效。在此類實施例中,表現CD19 CAR之細胞在投與(例如,輸注)本文所描述之表現CAR之細胞之前、與其並行或之後投與。
在實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞亦表現靶向CD19之CAR,例如CD19 CAR。在一實施例中,本文所描述之表現CAR之細胞及CD19 CAR投與個體以治療本文所描述之癌症,例如AML。在一實施例中,CAR分子中之一或兩者之組態包含主要胞內信號傳導域及共刺激信號傳導域。在另一實施例中,CAR分子中之一或兩者之組態包含主要胞內信號傳導域及兩個或兩個以上(例如,2、3、4或5個或5個以上)共刺激信號傳導域。在此類實施例中,本文所描述之CAR分子及CD19 CAR可具有相同或不同之主要胞內信號傳導域、相同或不同之共刺激信號傳導域或相同數目或不同數目之共刺激信號傳導域。或者,本文所描述之CAR及CD19 CAR經組態為分裂CAR,其中CAR分子之一包含抗原結合域及共刺激域(例如,4-1BB),而另一CAR分子包含抗原結合域及主要胞內信號傳導域(例如,CD3 ξ)。
在一實施例中,本文所描述之CAR及第二CAR(例如,CD19 CAR)在相同載體或兩個不同載體上。在本文所描述之CAR及第二CAR(例如,CD19 CAR)在相同載體上之實施例中,編碼本文所描述之CAR及第二CAR(例如,CD19 CAR)之核酸序列在相同框架中,且藉由一或多個肽裂解位點(例如,P2A)分離。
在其他實施例中,本文所揭示之表現CAR之細胞與抗CD19抗體抑制劑組合投與。在一個實施例中,抗CD19抗體為如以引用的方式
併入本文中之WO2014/153270(例如,WO2014/153270之表3)中所描述之人類化抗原結合域,或其共軛物。其他例示性抗CD19抗體或其片段或共軛物包括(但不限於)布林莫單抗(blinatumomab)、SAR3419(Sanofi)、MEDI-551(MedImmune LLC)、Combotox、DT2219ARL(Masonic Cancer Center)、MOR-208(亦稱為XmAb-5574;MorphoSys)、XmAb-5871(Xencor)、MDX-1342(Bristol-Myers Squibb)、SGN-CD19A(Seattle Genetics)及AFM11(Affimed Therapeutics)。參見例如Hammer.MAbs.4.5(2012):571-77。布林莫單抗為由兩個scFv組成之雙特異性抗體,一個scFv與CD19結合且一個scFv與CD3結合。布林莫單抗導引T細胞攻擊癌細胞。參見例如Hammer等人;臨床試驗標識號NCT00274742及NCT01209286。MEDI-551為具有經工程改造以具有增強的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之Fc之人類化抗CD19抗體。參見例如Hammer等人;及臨床試驗標識號NCT01957579。Combotox為與CD19及CD22結合之免疫毒素的混合物。免疫毒素由融合至去糖基化蓖麻毒素A鏈之scFv抗體片段組成。參見例如Hammer等人;及Herrera等人J.Pediatr.Hematol.Oncol.31.12(2009):936-41;Schindler等人Br.J.Haematol.154.4(2011):471-6。DT2219ARL為靶向CD19及CD22、包含兩個scFv及截短白喉毒素之雙特異性免疫毒素。參見例如Hammer等人;及臨床試驗標識號NCT00889408。SGN-CD19A為由連接至合成細胞毒性細胞殺死劑單甲基奧瑞他汀F(MMAF)之抗CD19人類化單株抗體組成之抗體-藥物共軛物(ADC)。參見例如Hammer等人;及臨床試驗標識號NCT01786096及NCT01786135。SAR3419為包含經由可裂解連接子與美登素(maytansine)衍生物共軛之抗CD19人類化單株抗體之抗CD19抗體-藥物共軛物(ADC)。參見例如Younes等人J.Clin.Oncol.30.2(2012):2776-82;Hammer等人;臨床試驗標識號
NCT00549185;及Blanc等人Clin Cancer Res.2011;17:6448-58。XmAb-5871為Fc工程改造之人類化抗CD19抗體。參見例如HammerMDX-1342為具有增強的ADCC之人類Fc工程改造之抗CD19抗體。參見例如Hammer等人。在實施例中,抗體分子為雙特異性抗CD19及抗CD3分子。舉例而言,AFM11為靶向CD19及CD3之雙特異性抗體。參見例如Hammer等人;及臨床試驗標識號NCT02106091。在一些實施例中,本文所描述之抗CD19抗體共軛或以其他方式結合於治療劑(例如,化學治療劑)、肽疫苗(諸如Izumoto等人2008 J Neurosurg 108:963-971中所描述之肽疫苗)、免疫抑制劑或免疫燒蝕劑,例如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯、FK506、CAMPATH、抗CD3抗體、細胞毒素、氟達拉賓、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228或細胞激素。
本文所描述之方法使用低免疫增強劑量之mTOR抑制劑,例如立體異位mTOR抑制劑,包括雷帕黴素類似物,諸如RAD001。投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如,不足以完全抑制免疫系統但足以提高免疫功能之劑量)可最佳化個體中免疫效應子細胞(例如,T細胞或表現CAR之細胞)之效能。用於量測mTOR抑制之方法、劑量、治療方案及適合醫藥組合物描述於以引用的方式併入本文中之美國專利申請案第2015/01240036號中。
在一實施例中,投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可導致以下中之一或多者:i)PD-1陽性免疫效應子細胞之數目減少;ii)PD-1陰性免疫效應子細胞之數目增加;iii)PD-1陰性免疫效應子細胞/PD-1陽性免疫效應子細胞之比率增加;
iv)原始T細胞之數目增加;v)舉例而言,在例如記憶T細胞前驅體之記憶T細胞上以下標記中之一或多者之表現增加:CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2;vi)舉例而言,在例如記憶T細胞前驅體之記憶T細胞上KLRG1表現減少;或vii)記憶T細胞前驅體之數目增加,該等細胞例如具有以下特徵中之任一者或組合之細胞:CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1降低及BCL2增加;且其中例如與未經治療之個體相比,前述任一者,例如i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)或vii),例如至少短暫發生。
在另一實施例中,例如與未經治療之表現CAR之細胞或未經治療之個體相比,投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致例如培養物或個體中表現CAR之細胞增殖增加或延長。在實施例中,增加之增殖與表現CAR之細胞的數目增加相關聯。用於量測增殖增加或延長之方法描述於實例9及10中。在另一實施例中,例如與未經治療之表現CAR之細胞或未經治療之個體相比,投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致例如培養物或個體中表現CAR之細胞對癌細胞之殺死增加。在實施例中,癌細胞殺死增加與腫瘤體積減小相關聯。量測癌細胞殺死增加之方法描述於實例2中。
在一個實施例中,表現CAR分子(例如,本文所描述之CAR分子)之細胞與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如立體異位mTOR抑制劑,例如RAD001)或催化mTOR抑制劑組合投與。舉例而言,投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可在投與本文所描述之表現CAR之細胞前起始;在投與本文所描述之表現CAR之細胞前完成;與投與本文所描述之表現CAR之細胞同時起始;與投與本文所描述之表現CAR之細胞重疊;或在投與本文所描述之表現CAR之細胞後持續。
或者或另外,投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可最佳化待工程改造以表現本文所描述之CAR分子的免疫效應子細胞。在此類實施例中,投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如立體異位抑制劑,例如RAD001)或催化抑制劑,在自個體採集待工程改造以表現本文所描述之CAR分子的免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)前起始或完成。
在另一實施例中,例如在自個體採集之後待工程改造以表現本文所描述之CAR分子的免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞),或例如在向個體投與之前表現CAR之免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)可在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑存在下培養。
在一實施例中,向個體投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑包含例如每週一次例如以立即釋放劑型投與0.1至20mg、0.5至10mg、2.5至7.5mg、3至6mg或約5mg之RAD001,或其生物等效劑量。在一實施例中,向個體投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑包含例如每週一次例如以持續釋放劑型投與0.3至60mg、1.5至30mg、7.5至22.5mg、9至18mg或約15mg之RAD001,或其生物等效劑量。
在一實施例中,mTOR抑制劑之劑量與mTOR抑制相關聯,或提供以下之mTOR抑制:至少5%但不超過90%,至少10%但不超過90%,至少15%但不超過90%,至少20%但不超過90%,至少30%但不超過90%,至少40%但不超過90%,至少50%但不超過90%,至少60%但不超過90%,至少70%但不超過90%,至少5%但不超過80%,至少10%但不超過80%,至少15%但不超過80%,至少20%但不超過80%,至少30%但不超過80%,至少40%但不超過80%,至少50%但不超過80%,至少60%但不超過80%,至少5%但不超過70%,至少10%但不超過70%,至少15%但不超過70%,至少20%但不超過70%,至少30%但不超過70%,至少40%但不超過70%,至少50%但不超過70%,至少
5%但不超過60%,至少10%但不超過60%,至少15%但不超過60%,至少20%但不超過60%,至少30%但不超過60%,至少40%但不超過60%,至少5%但不超過50%,至少10%但不超過50%,至少15%但不超過50%,至少20%但不超過50%,至少30%但不超過50%,至少40%但不超過50%,至少5%但不超過40%,至少10%但不超過40%,至少15%但不超過40%,至少20%但不超過40%,至少30%但不超過40%,至少35%但不超過40%,至少5%但不超過30%,至少10%但不超過30%,至少15%但不超過30%,至少20%但不超過30%,或至少25%但不超過30%。
mTOR抑制程度可傳達為或對應於P70 S6激酶抑制程度,例如mTOR抑制程度可藉由P70 S6激酶活性水準降低,例如藉由P70 S6激酶受質磷酸化減少來測定。mTOR抑制水準可藉由各種方法評估,諸如如以引用的方式併入本文中之美國專利申請案第2015/01240036號中所描述或如以引用的方式併入本文中之美國專利第7,727,950號中所描述,藉由佈雷分析(Boulay assay)量測P70 S6激酶活性;藉由西方墨點法量測磷酸化S6水準;或評估PD1陰性免疫效應子細胞與PD1陽性免疫效應子細胞之比率的變化。
如本文所用,術語「mTOR抑制劑」係指抑制細胞中之mTOR激酶的化合物或配位體或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中,mTOR抑制劑為立體異位抑制劑。立體異位mTOR抑制劑包括中性三環化合物雷帕黴素(西羅莫司);雷帕黴素相關化合物,亦即具有類似於雷帕黴素之結構及功能的化合物,包括例如雷帕黴素衍生物、雷帕黴素類似物(rapamycin analog/rapalog);及抑制mTOR活性之其他巨環內酯化合物。在一實施例中,mTOR抑制劑為催化抑制劑。
雷帕黴素為由具有式A中所展示之結構的吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)產生的已知巨環內酯抗生素。
參見例如McAlpine,J.B.等人,J.Antibiotics(1991)44:688;Schreiber,S.L.等人,J.Am.Chem.Soc.(1991)113:7433;美國專利第3,929,992號。雷帕黴素存在已提出之各種編號方案。為避免混淆,當在本文中命名特異性雷帕黴素類似物時,該等名稱參考使用式A之編號方案的雷帕黴素。
適用於本發明之雷帕黴素類似物為例如經O取代之類似物,其中雷帕黴素之環己基環上之羥基經OR1置換,其中R1為羥烷基、羥基烷氧基烷基、醯胺基烷基或胺基烷基;例如RAD001,亦稱為依維莫司,如US 5,665,772及WO94/09010中所描述,其內容以引用的方式併入。其他適合之雷帕黴素類似物包括在26或28位置處經取代之雷帕黴素類似物。雷帕黴素類似物可為上文所提及之類似物之差向異構體,尤其在位置40、28或26經取代之類似物之差向異構體,且可視情況進一步經氫化,例如如US 6,015,815、WO95/14023及WO99/15530中所描述,其內容以引用的方式併入;例如ABT578,亦稱為佐他莫司或雷帕黴素類似物,描述於US 7,091,213、WO98/02441及WO01/14387中,其內容以引用的方式併入;例如AP23573,亦稱為地磷莫司。
適用於本發明之來自US 5,665,772之雷帕黴素類似物的實例包括
(但不限於)40-O-苄基-雷帕黴素、40-O-(4'-羥甲基)苄基-雷帕黴素、40-O-[4'-(1,2-二羥乙基)]苄基-雷帕黴素、40-O-烯丙基-雷帕黴素、40-O-[3'-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4(S)-基)-丙-2'-烯-1'-基]-雷帕黴素、(2'E,4'S)-40-O-(4',5'-二羥基戊-2'-烯-1'-基)-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙氧基羰甲基-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(3-羥基)丙基-雷帕黴素、40-O-(6-羥基)己基-雷帕黴素、40-O-[2-(2-羥基)乙氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊環-3-基]甲基-雷帕黴素、40-O-[(2S)-2,3-二羥基丙-1-基]-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-菸鹼醯基氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-(N-嗎啉基))乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-(2-N-咪唑基乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-甲基-N'-哌嗪基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、39-O-去甲基-39,40-O,O-伸乙基-雷帕黴素、(26R)-26-二氫-40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-菸鹼醯胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2'-基乙氧羰醯胺基)乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙氧基甲醯胺乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-甲苯基磺醯胺乙基)-雷帕黴素及40-O-[2-(4',5'-二乙氧羰基-1',2',3'-三唑-1'-基)-乙基]-雷帕黴素。
已知適用於本發明之其他雷帕黴素類似物為雷帕黴素之環己基環上之羥基及/或在28位置處之羥基經羥基酯基置換的類似物,例如見於US RE44,768中之雷帕黴素類似物,例如替西羅莫司。
適用於本發明之其他雷帕黴素類似物包括彼等類似物:其中在16位置處之甲氧基經較佳為(視情況經羥基取代)炔基氧基、苄基、鄰甲氧基苄基或氯苄基之另一取代基置換,及/或其中在39位置處之甲氧基與39碳一起缺失使得雷帕黴素之環己基環變為缺少39位置甲基氧基之環戊基環;例如如WO95/16691及WO96/41807中所描述,其內容以引用的方式併入。類似物可進一步經修飾以使得雷帕黴素之40位置
處之羥基經烷基化及/或32-羰基減少。
來自WO95/16691之雷帕黴素類似物包括(但不限於)16-去甲氧基-16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(4-羥基-丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苯甲氧基-40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苯甲氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-鄰-甲氧基苄基-雷帕黴素、16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-甲醯基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羥甲基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羧基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(嗎啉-4-基)羰基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-[N-甲基,N-(2-吡啶-2-基-乙基)]胺甲醯基-42-去甲基-雷帕黴素及39-去甲氧基-40-去氧基-39-(對甲苯磺醯基亞肼基甲基)-42-去甲基-雷帕黴素。
來自WO96/41807之雷帕黴素類似物包括(但不限於)32-脫氧-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-40-O-(2-羥基-乙基)-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素、32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕黴素及32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素。
另一適合雷帕黴素類似物為如US2005/0101624中所描述之烏米莫司(umirolimus),其內容以引用的方式併入。
RAD001另外稱為依維莫司(Afinitor®),其具有化學名稱(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羥乙氧基)-3-甲氧基環己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧雜-
4-氮雜-三環[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮。
立體異位mTOR抑制劑之其他實例包括西羅莫司(雷帕黴素,AY-22989)、40-[3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕黴素(亦稱為替西羅莫司或CCI-779)及地磷莫司(AP-23573/MK-8669)。立體異位mTor抑制劑之其他實例包括佐他莫司(ABT578)及烏米莫司。
或者或另外,已發現催化ATP-競爭性mTOR抑制劑直接靶向mTOR激酶域且靶向mTORC1及mTORC2兩者。此等相較於諸如雷帕黴素之立體異位mTOR抑制劑亦為mTORC1之更有效抑制劑,因為其調節耐雷帕黴素之mTORC1輸出,諸如4EBP1-T37/46磷酸化及封端依賴性轉譯。
催化抑制劑包括:BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-側氧基-8-喹啉-3-基-2,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈,或單甲苯磺酸鹽形式。BEZ235之合成描述於WO2006/122806中;CCG168(另外稱為AZD-8055,Chresta,C.M.等人,Cancer Res,2010,70(1),288-298),其具有化學名稱{5-[2,4-雙-((S)-3-甲基-嗎啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇;3-[2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲醯胺(WO09104019);3-(2-胺基苯并[d]噁唑-5-基)-1-異丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043及WO2013023184);N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)胺基)喹喏啉-2-基)胺磺醯基)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲醯胺(WO07044729及WO12006552);PKI-587(Venkatesan,A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645),其具有化學名稱1-[4-[4-(二甲胺基)哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二(N-嗎啉基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲;GSK-2126458(ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43),其具有化學名稱2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-噠嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺;5-(9-異丙基-8-
甲基-2-(N-嗎啉基)-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484);(E)-N-(8-(6-胺基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亞基)氰胺(WO12007926)。
催化mTOR抑制劑之其他實例包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO2006/122806)及Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人,Biochem J.,2009,421(1),29-42。Ku-0063794為哺乳動物雷帕黴素標靶(mTOR)之特異性抑制劑。WYE-354為催化mTOR抑制劑之另一實例(YuK等人,(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin.Cancer Res.69(15):6232-6240)。
根據本發明適用之mTOR抑制劑亦包括前述任一者之其前藥、衍生物、醫藥學上可接受之鹽或類似物。
基於此項技術中公認之方法,基於本文所描述之特定劑量,諸如RAD001之mTOR抑制劑可經調配以便遞送。特定言之,美國專利6,004,973(以引用的方式併入本文中)提供可與本文所描述之mTOR抑制劑一起使用的調配物之實例。
在另一態樣中,本發明提供一種評估或監測個體(例如患有癌症,例如血液癌症之個體)中表現CAR之細胞療法(例如,CD123 CAR療法)之有效性或樣本(例如,清除術樣本)對於CAR療法(例如,CD123 CAR療法)之適合性的方法。該方法包括獲取CAR療法有效性或樣本適合性之值,其中該值指示表現CAR之細胞療法之有效性或適合性。
在實施例中,CAR療法之有效性或樣本適合性之值包含以下一者、兩者、三者、四者、五者、六者或六者以上(全部)的量測:
(i)樣本(例如,清除術樣本或所製造之表現CAR之細胞產物樣本)中靜止TEFF細胞、靜止TREG細胞、較年輕T細胞(例如,較年輕CD4或CD8細胞,或γ/δ T細胞)或早期記憶T細胞或其組合中之一者、兩者、三者或三者以上(例如,全部)的含量或活性;(ii)樣本(例如,清除術樣本或所製造之表現CAR之細胞產物樣本)中活化TEFF細胞、活化TREG細胞、較老T細胞(例如,較老CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞或其組合中之一者、兩者、三者或三者以上(例如,全部)的含量或活性;(iii)樣本(例如,清除術樣本或所製造之表現CAR之細胞產物樣本)中免疫細胞耗竭標記,例如一種、兩種或兩種以上免疫檢查點抑制劑(例如,PD-1、PD-L1、TIM-3及/或LAG-3)之含量或活性。在一個實施例中,免疫細胞具有耗竭表型,例如共表現至少兩個耗竭標記,例如共表現PD-1及TIM-3。在其他實施例中,免疫細胞具有耗竭表型,例如共表現至少兩個耗竭標記,例如共表現PD-1及LAG-3;(iv)樣本(例如,清除術樣本或所製造之表現CAR之細胞產物樣本)中例如CD4+或CD8+ T細胞群體中CD27及/或CD45RO-(例如CD27+ CD45RO-)免疫效應子細胞之含量或活性;(v)選自CCL20、IL-17a及/或IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1之生物標記中一者、兩者、三者、四者、五者、十者、二十者或二十者以上之含量或活性;(vi)表現CAR之細胞產物樣本,例如表現CD123之細胞產物樣本中細胞激素含量或活性(例如,細胞激素庫之品質);或(vii)所製造之表現CAR之細胞產物樣本中表現CAR之細胞之轉導效率。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,表現CAR之細胞療法
包含複數個(例如,一群)表現CAR之免疫效應子細胞,例如複數個(例如,一群)T細胞或NK細胞,或其組合。在一個實施例中,表現CAR之細胞療法為CD123 CAR療法。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,自獲自個體之清除術樣本獲得(i)-(vii)中之一或多者的量測。可在輸注或再輸注前評估清除術樣本。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,自所製造之表現CAR之細胞產物樣本,例如表現CD123 CAR之細胞產物樣本獲得(i)-(vii)中之一或多者的量測。可在輸注或再輸注前評估所製造之表現CAR之細胞產物。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,在接收表現CAR之細胞療法之前、期間或之後評估個體。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,(i)-(vii)中之一或多者的量測評估基因表現、流動式細胞量測術或蛋白質表現中之一或多者的型態。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,該方法進一步包含基於(i)-(vii)中之一或多者的量測將個體鑑別為反應者、無反應者、復發者或非復發者。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,反應者(例如,完全反應者)具有或鑑別為具有與無反應者相比更大的GZMK、PPF1BP2或原始T細胞中一者、兩者或兩者以上(全部)之含量或活性。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,無反應者具有或鑑別為具有與反應者相比更大的IL22、IL-2RA、IL-21、IRF8、IL8、CCL17、CCL22、效應T細胞或調控T細胞中一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或七者以上(例如,全部)之含量或活性。
在一實施例中,復發者為如下患者,其具有或鑑別為具有與非
復發者相比增加的以下基因中之一或多者(例如,2、3、4者或全部)之表現量:MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C及HLA-DQB1,及/或與非復發者相比,減少的以下基因中之一或多者(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部)之表現量:PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1及EIF1AY。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,完全反應者具有或鑑別為具有與參考值(例如,CD8+ T細胞之無反應者百分比)相比更大(例如,統計學上顯著更大)百分比之CD8+ T細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,完全反應者具有或鑑別為具有與參考值(例如,CD27+ CD45RO-免疫效應子細胞之無反應者數目)相比例如CD8+群體中更大百分比之CD27+ CD45RO-免疫效應子細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,完全反應者或部分反應者具有或鑑別為具有與參考值(例如,CD4+ T細胞之無反應者百分比)相比更大(例如,統計學上顯著更大)百分比之CD4+ T細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,完全反應者具有或鑑別為具有與參考值,例如靜止TEFF細胞、靜止TREG細胞、較年輕T細胞(例如,較年輕CD4或CD8細胞)或早期記憶T細胞之無反應者數目相比,更大百分比之靜止TEFF細胞、靜止TREG細胞、較年輕T細胞(例如,較年輕CD4或CD8細胞,或γ/δ T細胞)或早期記憶T細胞或其組合中一者、兩者、三者或三者以上(例如,全部)。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,無反應者具有或鑑別為具有與參考值,例如活化TEFF細胞、活化TREG細胞、較老T細胞(例如,較老CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞之反應者數目相比,更大百分比之活化TEFF細胞、活化TREG細胞、較老T細胞(例如,較老
CD4或CD8細胞)或晚期記憶T細胞或其組合中一者、兩者、三者或三者以上(例如,全部)。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之免疫細胞耗竭標記,例如一種、兩種或兩種以上免疫檢查點抑制劑(例如,PD-1、PD-L1、TIM-3及/或LAG-3)。在一個實施例中,無反應者具有或鑑別為具有與來自反應者之表現PD-1或LAG-3之免疫效應子細胞之百分比相比,更大百分比之表現PD-1、PD-L1或LAG-3之免疫效應子細胞(例如,CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)(例如,表現CAR之CD4+細胞及/或CD8+ T細胞)。
在一個實施例中,無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗竭表型之免疫細胞,例如共表現至少兩種耗竭標記,例如共表現PD-1、PD-L1及/或TIM-3之免疫細胞。在其他實施例中,無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗竭表型之免疫細胞,例如共表現至少兩種耗竭標記,例如共表現PD-1及LAG-3之免疫細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,無反應者具有或鑑別為具有與針對表現CAR之細胞療法的反應者(例如,完全反應者)相比,在表現CAR之細胞群體(例如,CD123 CAR+細胞群體)中更大百分比之PD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,部分反應者具有或鑑別為具有與反應者相比,在表現CAR之細胞群體(例如,CD123 CAR+細胞群體)中更高百分比之PD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,無反應者具有或鑑別為具有在表現CAR之細胞群體(例如,CD123 CAR+細胞群體)中PD1/PD-L1+ CAR+之耗竭表型及LAG3之共表現。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,無反應者具有或鑑別為具有與反應者(例如,完全反應者)相比在表現CAR之細胞群體(例
如,CD123 CAR+細胞群體)中更大百分比之PD-1/PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,部分反應者具有或鑑別為具有與反應者相比在表現CAR之細胞群體(例如,CD123 CAR+細胞群體)中更高百分比之PD-1/PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,清除術樣本中CD8+ CD27+ CD45RO- T細胞之存在為個體對表現CAR之細胞療法(例如,CD123 CAR療法)反應之正向預測因子。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,清除術樣本中高百分比之PD1+ CAR+及LAG3+或TIM3+ T細胞為個體對表現CAR之細胞療法(例如,CD123 CAR療法)反應之不良預後預測因子。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,反應者(例如,完全或部分反應者)具有以下型態中之一者、兩者、三者或三者以上(或全部):(i)具有與參考值,例如CD27+免疫效應子細胞之無反應者數目相比,更大數目之CD27+免疫效應子細胞;(ii)具有與參考值,例如CD8+ T細胞之無反應者數目相比,更大數目之CD8+ T細胞;(iii)具有與參考值,例如表現一或多種檢查點抑制劑之細胞之無反應者數目相比,較低數目之表現一或多種檢查點抑制劑,例如選自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或KLRG-1或組合之檢查點抑制劑之免疫細胞;或(iv)具有與參考值,例如靜止TEFF細胞、靜止TREG細胞、原始CD4細胞、非刺激性記憶細胞或早期記憶T細胞之無反應者數目相比,更大數目之靜止TEFF細胞、靜止TREG細胞、原始CD4細胞、非刺激性記憶細胞或早期記憶T細胞或其組合中一者、兩者、三者、四者
或四者以上(全部)。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,(vi)之細胞激素含量或活性選自細胞激素CCL20/MIP3a、IL17A、IL6、GM-CSF、IFNγ、IL10、IL13、IL2、IL21、IL4、IL5、IL9或TNFα或其組合中之一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或八者以上(或全部)。細胞激素可選自IL-17a、CCL20、IL2、IL6或TNFa中之一者、兩者、三者、四者或四者以上(全部)。在一個實施例中,選自IL-17a及CCL20中之一或兩者的細胞激素之含量或活性增加指示反應增加或復發減少。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,(vii)中15%或更高之轉導效率指示反應增加或復發減少。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中,(vii)中少於15%之轉導效率指示反應減少或復發增加。
在實施例中,藉由本文之方法鑑別之反應者、無反應者、復發者或非復發者可根據臨床標準進一步評估。舉例而言,完全反應者為或鑑別為患有疾病(例如,癌症)、對治療展現完全反應(例如,完全緩解)之個體。如本文所描述,可例如使用NCCN Guidelines®或Cheson等人,J Clin Oncol 17:1244(1999)及Cheson等人,「Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma」,J Clin Oncol 25:579-586(2007)(均以全文引用的方式併入本文中)鑑別完全反應。部分反應者為或鑑別為患有疾病(例如,癌症)、對治療展現部分反應(例如,部分緩解)之個體。可例如使用如本文所描述之NCCN Guidelines®或Cheson標準來鑑別部分反應。無反應者為或鑑別為患有疾病(例如,癌症)、對治療不展現反應之個體,例如患者患有穩定疾病或進行性疾病。可例如使用如本文所描述之NCCN Guidelines®或Cheson標準來鑑別無反應者。
或者,或與本文所揭示之方法組合,回應於該值,進行以下中之一者、兩者、三者、四者或四者以上:例如向反應者或非復發者投與表現CAR之細胞療法;投與改變劑量之表現CAR之細胞療法;改變表現CAR之細胞療法之進度或時程;例如向無反應者或部分反應者投與額外試劑與表現CAR之細胞療法,例如檢查點抑制劑,例如本文所描述之檢查點抑制劑之組合;在用表現CAR之細胞療法治療之前向無反應者或部分反應者投與增加個體中較年輕T細胞之數目的療法;例如針對鑑別為無反應者或部分反應者之個體,修改表現CAR之細胞療法之製造方法,例如在引入編碼CAR之核酸之前增濃較年輕T細胞,或提高轉導效率;例如針對無反應者或部分反應者或復發者,投與替代療法;或若個體為或鑑別為無反應者或復發者,則例如藉由CD25耗盡、投與環磷醯胺、抗GITR抗體或其組合中之一或多者,減少TREG細胞群體及/或TREG基因簽名。
在某些實施例中,個體經抗GITR抗體預治療。在某一實施例中,個體在輸注或再輸注之前經抗GITR抗體治療。
在一些實施例中,一或多個如本文所揭示之表現CAR之細胞可經由生物聚合物骨架,例如生物聚合物植入物投與或遞送至個體。生物聚合物骨架可支撐或增強本文所描述之表現CAR之細胞之遞送、擴增及/或分散。生物聚合物骨架包含可天然存在或合成之生物相容性(例如,不實質上誘導發炎性或免疫反應)及/或生物可降解之聚合物。
適合生物聚合物之實例包括(但不限於)單獨或與任何其他聚合物組合物以任何濃度及任何比率組合的瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鹽、海藻
酸鹽/磷酸鈣水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-五乙醯基a-D-半乳糖)、纖維素、甲殼素、聚葡萄胺糖、膠原蛋白、彈性蛋白、明膠、玻尿酸膠原蛋白、羥基磷灰石、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基-己酸酯)(PHBHHx)、聚(丙交酯)、聚(己內酯)(PCL)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚氧化乙烯(PEO)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚氧化丙烯(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、絲、大豆蛋白及分離大豆蛋白。可用促進附著或遷移之分子,例如結合於淋巴細胞之膠原蛋白受體的膠原蛋白模擬肽,及/或增強待遞送之細胞之遞送、擴增或功能(例如,抗癌活性)的刺激分子來強化或改質生物聚合物。生物聚合物骨架可為可注射劑,例如凝膠或半固體,或固體組合物。
在一些實施例中,在遞送至個體之前,本文所描述之表現CAR之細胞接種至生物聚合物骨架上。在實施例中,生物聚合物骨架進一步包含本文所描述之一或多種額外治療劑(例如,另一表現CAR之細胞、抗體或小分子)或增強表現CAR之細胞之活性的試劑,例如併入或共軛於骨架之生物聚合物。在實施例中,生物聚合物骨架例如瘤內注射或以手術方式植入腫瘤或植入足以介導抗腫瘤作用之腫瘤附近位置內。生物聚合物組合物及其遞送方法之額外實例描述於Stephan等人,Nature Biotechnology,2015,33:97-101;及WO2014/110591中。
本發明之醫藥組合物可包含表現CAR之細胞(例如,複數個如本文所描述之表現CAR之細胞)與一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的組合。此類組合物可包含緩衝劑,諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及其類似物;碳水化合物,諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇;蛋白質;多肽或胺基酸,諸如甘胺酸;抗氧化劑;螯合劑,諸如EDTA或麩胱甘肽;佐劑(例如,氫氧化鋁);及防腐劑。在一個態樣中,本發明組合物經調配用於靜
脈內投與。
本發明之醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。儘管可藉由臨床試驗確定適當劑量,但投與數量及頻率將由諸如以下之因素決定:患者之條件,及患者之疾病的類型及嚴重程度。
在一個實施例中,醫藥組合物實質上不含,例如不存在可偵測含量之例如選自由以下組成之群的污染物:內毒素、黴漿菌、複製勝任型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘留抗CD3/抗CD28塗佈之珠粒、小鼠抗體、合併之人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體封裝細胞或質體組分、細菌及真菌。在一個實施例中,細菌為選自由以下組成之群的至少一者:糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流行性嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時,待投與之本發明組合物之精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉移程度及患者(個體)條件的差異來決定。一般可規定包含本文所描述之T細胞之醫藥組合物可以104至109個細胞/公斤體重,在一些情況下105至106個細胞/公斤體重(包括彼等範圍內之全部整數值)之劑量投與。T細胞組合物亦可以此等劑量多次投與。
在一些實施例中,CAR細胞(例如,CD123 CAR細胞)之劑量包含約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108或5×108個細胞/公斤。在一些實施例中,CAR細胞(例如,CD123 CAR細胞)之劑量包含至少約1×106、
1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108或5×108個細胞/公斤。在一些實施例中,CAR細胞(例如,CD123 CAR細胞)之劑量包含至多約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108或5×108個細胞/公斤。在一些實施例中,CAR細胞(例如,CD123 CAR細胞)之劑量包含約1.1×106-1.8×107個細胞/公斤。在一些實施例中,CAR細胞(例如,CD123 CAR細胞)之劑量包含約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109或5×109個細胞。在一些實施例中,CAR細胞(例如,CD123 CAR細胞)之劑量包含至少約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109或5×109個細胞。在一些實施例中,CAR細胞(例如,CD123 CAR細胞)之劑量包含至多約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109或5×109個細胞。
細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些態樣中,可能需要向個體投與活化之T細胞,且隨後根據本發明自其再抽血(或進行清除術)、活化T細胞,且使患者再輸注此等活化及擴增之T細胞。此過程可每幾週進行多次。在某些態樣中,T細胞可自抽取的10cc至400cc血液活化。在某些態樣中,T細胞自抽取的20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc血液活化。
可以任何適宜方式進行標的組合物之投與,包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝入、輸注、植入或移植。可藉由反式動脈內、皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內向患者投與本文所描述之組合物。在一個態樣中,本發明之表現CAR之細胞(例如,T細胞或NK細胞)組合物藉由皮內或皮下注射投與患者。在一
個態樣中,本發明之表現CAR之細胞(例如,T細胞或NK細胞)組合物藉由靜脈內注射投與。表現CAR之細胞(例如,T細胞或NK細胞)組合物可直接注射至腫瘤、淋巴結或感染位點中。
在一特定例示性態樣中,個體可經歷白細胞去除術,其中離體收集、增濃或耗盡白細胞以選擇及/或分離所關注的細胞,例如免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)。此等免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)分離株可藉由此項技術中已知之方法擴增且經處理使得可引入一或多個本發明CAR構築體,藉此產生本發明之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)。有需要之個體可隨後經歷用高劑量化學療法隨後周邊血液幹細胞移植之標準治療。在某些態樣中,移植之後或與移植並行,個體接收本發明之擴增之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)的輸注。在一額外態樣中,在手術之前或之後投與擴增之細胞。
上述待向患者投與的治療之劑量將隨所治療之精確病狀性質及治療接受者而變化。可根據此項技術中接受之實踐對用於人類投與之劑量進行按比例調整。CAMPATH之劑量例如對成年患者而言一般將在1mg至約100mg範圍內,通常每日投與持續1至30天之時段。較佳每日劑量為每日1mg至10mg,然而在一些情況下,可使用高達每日40mg之較大劑量(描述於美國專利第6,120,766號中)。
在一個實施例中,例如使用活體外轉錄將CAR引入免疫效應子細胞(例如,T細胞或NK細胞)中,且個體(例如,人類)接收本發明之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)的初始投與,及本發明之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)的一或多次隨後投與,其中一或多次隨後投與在先前投與之後投與少於15天,例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天。在一個實施例中,每週向個體(例如,人類)投與本發明之表現CAR之細
胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)的一次以上投與,例如每週投與本發明之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)的2、3或4次投與。在一個實施例中,個體(例如,人類個體)每週接收表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)的一次以上投與(例如,每週2、3或4次投與)(在本文中亦稱為週期),隨後一週不投與表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞),且隨後向個體投與表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)的一或多次額外投與(例如,每週一次以上投與表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞))。在另一實施例中,個體(例如,人類個體)接收一個以上週期之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞),且各週期之間的時間少於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中,表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)每隔一天投與持續每週3次投與。在一個實施例中,本發明之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)投與至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或八週以上。
在一個態樣中,使用慢病毒病毒載體(諸如慢病毒)產生表現CD123 CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)。彼方式產生之表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)將具有穩定CAR表現。
在一個態樣中,使用諸如γ反轉錄病毒載體(例如,本文所描述之γ反轉錄病毒載體)之病毒載體產生表現CAR之細胞,例如CART或表現CAR之NK細胞。使用此等載體產生之表現CAR之細胞(例如,CART或表現CAR之NK細胞)可具有穩定CAR表現。
在一個態樣中,表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)在轉導之後短暫表現CAR載體持續4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15天。可藉由RNA CAR載體遞送實現CAR短暫表現。在一個態樣中,CAR RNA藉由電穿孔轉導至細胞(例如,T細胞或NK細胞)中。
在使用短暫表現CAR細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)治療之患者中(尤其在攜有CAR之鼠類scFv之情況下)可產生之潛在問題為多次治療後全身性過敏反應。
在不受此理論束縛之情況下,咸信此類過敏性反應可由產生體液抗CAR反應(亦即,具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。當存在十天至十四天之暴露於抗原中斷時,認為患者之抗體生成細胞經歷IgG同型(不引起全身性過敏反應)至IgE同型之類別轉換。
若患者在短暫CAR療法過程期間處於產生抗CAR抗體反應之高風險(諸如由RNA轉導產生之彼等風險)下,則表現CAR之細胞(例如,CAR T細胞或表現CAR之NK細胞)輸注中斷不應持續超過十天至十四天。
參考以下實驗性實例來進一步詳細描述本發明。除非另外規定,否則提供此等實例僅出於說明的目的,且不意欲限制。因此,本發明決不應解釋為限於以下實例,但確切而言應解釋為涵蓋由於本文所提供之教示而變得顯而易見之任何及所有變化。
無需進一步描述,咸信一般熟習此項技術者可使用前述描述及以下說明性實例製造及利用本發明組合物且實踐所主張之方法。以下實施例特定指出本發明之各種態樣,且不應解釋為以任何方式限制本發明之剩餘部分。
使完全人類抗CD123單鏈可變片段分離。藉由CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子將抗CD123 ScFv選殖至慢病毒CAR表現載體中。藉由STBL3
細胞中之細菌轉型,隨後藉由使用無內毒素之凱傑質體梅基套組(Qiagen Plasmid Maki kit)之大量提取(Maxiprep)來擴增含CAR質體(實施方式中所提供之表1)。使用標準技術在293T細胞中產生慢病毒上清液。
scFv中VL域及VH域出現之次序為變化的(亦即,VL-VH或VH-VL定向),且其中各次單元包含序列GGGGS(SEQ ID NO:25)之「G4S」(SEQ ID NO:25)次單元之三個或四個複本(例如,(G4S)3(SEQ ID NO:28)或(G4S)4(SEQ ID NO:27))連接可變域以產生整個scFv域,如表2(提供於實施方式中)中所展示。
CAR構築體序列及其結構域序列列於實施方式中。人類CAR構築體之分析如例如實例2、實例3及實例6中所描述進行。
使用含有由NFAT啟動子驅動之螢光素酶報導子之Jurkat細胞株(稱為JNL細胞)評估人類抗CD123 CAR構築體之活性。量測四個本文所描述之CAR構築體(CD123 CAR1-4)及鼠類CD123 CAR構築體1172及1176之CD123 CAR活性。1172及1176構築體之胺基酸序列提供於下文中,且進一步描述及表徵於PCT/US2014/017328中。
1172構築體:CD123 4-1BBCD3z-CAR(胺基酸序列)(SEQ ID NO:707)
1176構築體:CD123 4-1BBCD3z-CAR(26292)(胺基酸序列)(SEQ ID NO:708)
CAR活性量測為此NFAT驅動之報導子的活化。將含有CART構築體之慢病毒上清液添加至JNL細胞以進行轉導。轉導後4-6天,藉由如下文所描述之FACS評估JNL細胞之CAR表現,或JNL細胞與靶陽性(MOLM3,經工程改造以表現CD123之K562細胞(CD123-K562))或靶陰性(K562)細胞株以3:1之效應子(JNL)與靶細胞株比率(E:T)混合以觸發活化(圖1)。共培育20小時後,如圖2中所展示使用Bright-GloTM螢光素酶分析在EnVision儀器上量測螢光素酶信號。
基於CD123 CAR轉導之T細胞(「CART-CD123」或「CART-CD123 T細胞」)回應於表現CD123(「CD123+」)之標靶的效應T細胞反應之數量及品質來選擇最佳抗CD123 CAR構築體。效應T細胞反應包括(但不限於)細胞擴增、增殖、倍增、細胞激素產生及靶細胞殺死或細胞溶解活性(脫粒)。
編碼慢病毒轉移載體之人類scFv用於產生封裝至VSVg假型慢病毒粒子中之基因組材料。將慢病毒轉移載體DNA與三種封裝組分VSVg、gag/pol及rev以及脂染胺試劑混合以將其一起轉染至Lenti-X 293T細胞(Clontech)中。
30小時後,收集培養基,過濾且儲存在-80C下。藉由以來自正常清血供體之血液為起始物質產生治療性CART-CD123,該供體之原始T細胞藉由負選擇T細胞、CD4+及CD8+淋巴細胞來獲得。在37℃、5% CO2下,在RPMI 1640、10%熱不活化胎牛血清(FCS)、2mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉(NaPyruvate)、10mM Hepes及55μM 2-巰基乙醇中,藉由1:3比率之CD3×28珠粒(Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28,Invitrogen)活化此等細胞。T細胞以於24孔板每孔0.5mL培養基中1×106個T細胞培養。24小時之後,T細胞爆發且添加0.5mL病毒上清液。隨後T細胞開始以對數生長模式分裂,此藉由量測每毫升細胞計數來監測,且T細胞每兩天在新鮮培養基中稀釋。在大約10天後,隨著T細胞開始停止,對數生長衰減。減緩生長速率與接近約300fl的T細胞尺寸之組合確定T細胞狀態為冷凍保存用於稍後分析。
在冷凍保存之前,使用蛋白質L作為偵測試劑藉由流式細胞學分析在BD LSRFortessa或BD-FACSCanto上測定轉導之細胞(在細胞表面上表現抗CD123 CAR)及其相對螢光表現強度之百分比。信號高於未染色細胞之來自彼FACS的相對螢光強度之閘控直方圖展現轉導之T細胞之百分比。轉導導致如圖2中所展示一系列12-42%之CART陽性細胞。
評估CART-CD123重導向T細胞之細胞溶解活性。
為評估CART-CD123 T細胞殺死表現標靶之細胞的功能性能力,將細胞解凍且使其恢復隔夜。
T細胞殺死導向穩定表現螢光素酶之表現CD123之MOLM13急性骨髓性白血病細胞株。未轉導之T細胞用於確定非特異性背景殺死量。當效應子定義為表現抗CD123嵌合受體之T細胞時,CART-CD123之細胞溶解活性以4:1之效應子:靶細胞比率及T細胞2倍向下稀釋之滴
定法量測。藉由混合適當數目之T細胞與恆定數目之靶細胞來起始分析。20小時後,使用Bright-GloTM螢光素酶分析在EnVision儀器上量測螢光素酶信號。隨著表現CD123-CART之細胞與未轉導之T細胞之比例增加,CD123細胞殺死類似地增加。本文所呈現之資料表明彼等表現CD123之細胞僅受表現CD123-CART之細胞而非未轉導之T細胞破壞。圖3。
為量測CD123 CART細胞之細胞激素產量,將表現CD123-2、CD123-3或CD123-4之細胞解凍且使其恢復隔夜。表現同型對照(稱為「同型」)之T細胞用作背景T細胞作用之非特異性對照。T細胞導向MOLM13、PL21或U87細胞(稱為靶細胞)。分析如所指出測試效應子:標靶之比率為1.25:1或20:1,其中效應子定義為表現CD123 CAR之T細胞。該分析在細胞混合之後操作24小時,在移除培養基時使用CBA-Flex套組分析細胞激素IL-2(圖24A)、IFN-γ(圖24B)及TNF-α(圖24C)以用於人類細胞激素偵測。當表現CD123 CAR之T細胞與表現CD123之癌細胞一起培養時,所有CD123-CART產生細胞激素回應於表現標靶之細胞。
選擇人類抗人類CD123純系NVS 2(表現CAR123-2)、NVS 3(表現CAR123-3)、NVS 4(表現CAR123-4)用於進一步研究。此等純系均針對食蟹獼猴CD123交叉反應。其活性與小鼠純系1172及1176進行比較,包含CD8鉸鏈域、CD8跨膜域及41BB共刺激域呈輕鏈至重鏈定向之VH域及VL域。1176亦針對食蟹獼猴CD123交叉反應。1172並非如此。
將質體轉型為勝任細胞,在500cc培養液中生長,藉由大量提取
分離,且使用標準方法轉導至293T細胞中。在24小時及48小時收集慢病毒上清液,使用超速離心集中,且冷凍。
將慢病毒滴定於SupT1細胞上,且測定適當量之病毒用於在MOI為3下轉導初級T細胞。使用抗CD3/CD28珠粒(Dynal,Invitrogen)及介白素-2 100U/ml刺激初級正常供體CD4+CD8細胞6天,隨後切除胎圈且冷凍一次。T細胞之細胞體積降至<300fL(大約10-12天後)。
所有純系之T細胞轉導效率幾乎為100%(圖5A及圖5B)。CD4:CD8比率在NVS純系中為大約1:1,且在1172及1176純系中為3:2(圖6)。
為評估脫粒,將CART細胞(NVS 2-4、1172及1176純系)解凍,以T細胞培養基中2e6個細胞/毫升之濃度靜置隔夜。隨後第二天將細胞計數且在1e6個細胞/毫升下再懸浮。腫瘤靶細胞(TCM、PMA/iono、MOLM14或JURKAT)在5e6個細胞/毫升下再懸浮。細胞以1e5個T細胞:5e5個腫瘤細胞之比率接種於48孔板中且在抗CD107a PECy7、抗CD49d純化及抗CD28純化之抗體存在下培育2小時。隨後收集細胞,用抗CD3 APC染色,且使用BD LSR Fortessa獲取(圖7)。
在圖7之各圖右上方象限中指示T細胞脫粒。本文所呈現之結果表明在2hr活體外分析期間藉由類似脫粒體現之CD123+標靶之類似T細胞識別。C1176之脫粒為65%,與其他純系之大約80%相比更差。
為評估細胞毒性,將CART細胞(NVS 2-4、1172及1176純系)解凍,且在T細胞培養基中2e6個細胞/毫升下靜置隔夜。第二天將細胞計數且在1e6個細胞/毫升下再懸浮。腫瘤靶細胞(MOLM14)在1e6個細胞/毫升下再懸浮。如所指示以降低之E:T比率一式兩份地將細胞接種於黑色平底96孔板中(圖8)。培育20小時之後,添加螢光素且使板成
像以確定光子通量作為殘留活細胞之量測。在20小時在大多數效應子:標靶比率下所有純系之間的MOLM14細胞殺死為等效的。
在D0將NSG小鼠靜脈內注射表現1e6螢光素酶之MOLM14細胞。在D6使小鼠之腫瘤負荷成像(IVIS光譜)且隨機分為治療組。將具有最低腫瘤負荷之小鼠指派至對照組(未轉導之T細胞,UTD)。在D7靜脈內注射CART細胞(NVS 2-4、1172及1176純系)或對照T細胞(1e6)。來自在D13進行之成像的資料展示於圖9中。注射之後六天,所有抗CD123構築體提供與活體外資料一致之相等抗腫瘤效果。
產生基於針對食蟹獼猴CD123交叉反應之鼠類1176之人類化抗CD123單鏈可變片段(scFv),且藉由胞內CD3ζ鏈及4-1BB胞內共刺激域選殖至慢病毒表現載體中,且給出表5(提供於實施方式中)中所描繪之名稱。
scFv中VL域及VH域出現之次序為變化的(亦即,VL-VH或VH-VL定向),且其中各次單元包含序列GGGGS(SEQ ID NO:25)之「G4S」(SEQ ID NO:25)次單元之三個或四個複本(例如,(G4S)3(SEQ ID NO:28)或(G4S)4(SEQ ID NO:27))連接可變域以產生整個scFv域,如表6(提供於實施方式中)中所展示。
人類化scFv片段CAR之序列(SEQ ID NO:184-215)在本文中提供於表6中。此等純系在來源於CD3ζ鏈之共刺激域的信號域中均含有Q/K殘基變化。隨後將CAR scFv片段選殖至慢病毒載體中以在單個編碼框中產生全長CAR構築體,且使用EF1 α啟動子用於表現(SEQ ID NO:11)。
藉由流動式細胞量測術已知CD123在約50%經典霍奇金氏淋巴瘤
(HL)中表現。已知外源性投與IL3至霍奇金氏淋巴瘤細胞株培養物促進生長,且能夠藉由血清去除部分解救細胞免於細胞凋亡。已知藉由SL-401抑制CD123(IL-3Ra)降低CD123++ HL細胞株(HDLM-2、L428)之存活力。
藉由免疫組織化學分析8名患有HL之患者之CD123表現。如表15中所展示,4/8樣本展示里德-斯德伯格細胞及/或微環境免疫細胞呈陽性。
流動式細胞量測術展示熟知霍奇金氏淋巴瘤細胞株HDLM-中之CD30及CD123的表現(圖10)。B細胞標記CD19及CD20不存在。
以下實驗使用具有小鼠抗人類CD123 scFv之輕鏈至重鏈或重鏈至輕鏈定向之pELNS抗CD123-41BB-CD3ζ(CAR123)質體DNA。T細胞獲自正常供體(ND052,Human Immunology Core),使用CD3/CD28磁性珠粒(Invitrogen)擴增,且在第2天經CAR123慢病毒轉導。在第6天,經由藉由T2A共表現偵測CD123之替代標記dsRed來偵測CD123。經由流動式細胞量測術偵測dsRed(圖11A至圖11B)。
隨後進行4個霍奇金氏淋巴瘤細胞株(HDLM2、KMH2、L428、SUPHD1)、CD123+ MOLM14(陽性對照)及A375(陰性對照)中之CD123表現之Q-PCR。CD123在所有霍奇金氏淋巴瘤細胞株中表現(圖12)。GUSB用作管家基因。Ct臨限值為40。
由於CD123為IL3受體α鏈且IL-3在造血生長及分化中具有重要作用,因此研究IL3信號傳導在霍奇金氏淋巴瘤細胞株生長中是否為重要的。過度表現包括IL-3(NSG-S小鼠)之人類細胞激素之NOD-SCID-γ鏈KO小鼠移植有表現螢光素酶之HDLM-2細胞株。靜脈內注射之後,贅生性細胞逐漸形成散播性軟組織腫塊。連續注射中和抗IL3抗體減緩腫瘤生長。本文所呈現之結果表明CD123可為霍奇金氏淋巴瘤中之尤其相關標靶。腫瘤負荷藉由BLI展示(圖13)。
未轉導之T細胞(UTD)或CART123與HDLM-2(CD123+ HL細胞株)以5個靶細胞與1個T細胞之比率在抗CD28抗體、抗CD49d抗體及莫能菌素存在下一起培育4小時。抗CD30 CAR T細胞用作額外對照。
CART123而非UTD展示如藉由流動式細胞量測術偵測CD107a脫粒增加(圖14及圖15)。此外,CART123展示內細胞質細胞激素產量(IL-2、TNF)顯著增加(圖16)。
進行基於螢光素酶之24hr殺死分析。T細胞與螢光素酶+ HDML-2細胞以不同比率(0.3:1至10:1)共培育。CART123而非UTD展示如由生物發光減少所展示之劑量依賴性殺死。有趣地,CD30特異性CAR T細胞展示最小活性(圖17)。
T細胞與HL細胞株(CD123+)或對照(Jurkat CD123-、MOLM-14 CD123+)或PMA/離子黴素(陽性對照)或細胞培養基(陰性對照)在5天T細胞增殖分析中一起培育。CART123及CART30細胞而非UTD展示在與HL細胞株共培養時穩固增殖(圖18)。
在72hr之後收集來自增殖分析之上清液,且藉由路明克斯分析來分析30個細胞激素之存在。CART123展示多個細胞激素之穩固產量
(IFNg、IL-2、TNFa及MIP1b路明克斯MFI分別展示於圖19A至圖19D中)。
為確認本文所呈現之活體外資料,研發活體內模型。在第0天靜脈內注射1百萬個螢光素酶+ HDML-2細胞。隨後進行所展現之連續生物發光成像(BLI)以觀測腫瘤水準(圖20)。在第7天觀測到低腫瘤水準,隨後腫瘤負荷在大約6週內逐漸增加,再現人類疾病之惰性性質。在第43天當腫瘤負荷高於基線20倍時,小鼠經150萬個CART123細胞或對照T細胞治療。
CART123在14天內誘導散播性腫瘤之完全且持久根除,在6個月導致100%無復發及100%總存活率(圖21及圖22)。
在連續周邊血液出血中,如藉由流動式細胞量測術偵測到腫瘤消除與廣泛CAR T細胞擴增相關聯(圖23)。擴增之T細胞為大約50% CD8及50% CD4細胞。T細胞數目隨時間推移隨著腫瘤負荷降低而縮小。
進行額外活體外分析以評估經慢病毒轉導以表現CAR123-2構築體(在本文中亦稱為LV CAR123-2)之初級T細胞。表現CAR之T細胞(LV CAR123-2)與充當陰性對照之表現針對巨細胞病毒(hCMV)醣蛋白H(gH)(在本文中稱為抗GH)的scFv之T細胞進行比較。主要活體外分析包括細胞激素產量、增殖及細胞殺死分析。增殖分析藉由培育T細胞(LV CAR123-2或抗GH)與表現CD123(抗原+)之細胞株(例如,表現人類CD123之MOLM13或K562)或CD123陰性(抗原-)對照細胞株(例如,K562)來進行。T細胞生長4個天。如圖25中所展示,表現CAR之細胞與陰性對照相比在表現CD123之細胞存在下培養時展現穩固增殖。
以標靶:效應子細胞比率範圍為1:20且兩倍稀釋至1:0.3125之滴定法量測表現CAR123-2之T細胞殺死靶細胞之能力。所測試之靶細胞為穩定表現螢光素酶之表現CD123之MOLM13細胞株、穩定表現螢光素酶之PL21細胞及穩定表現螢光素酶之U87細胞。如圖26A及圖26B中所展示,表現CD123-CAR之細胞表明靶向表現CD123之癌細胞(MOLM13及PL21)殺死,而陰性對照(表現抗GH之細胞)及未轉導之細胞(UTD)不表明靶向殺死。在圖26C中,UTD、陰性對照(抗GH)及表現CD123 CAR之細胞不表明U87細胞(其不表現CD123)之特異性殺死。
細胞激素產量分析藉由分析來自包含T細胞(表現CAR123-2或抗GH)與抗原陽性(MOLM13)或抗原陰性(U87)細胞之共培養物的上清液來進行。CD123-CAR T細胞展示IFN-γ(圖27A)及IL-2(圖27B)之穩固細胞激素產量。
化療難治性或復發性(r/r)B細胞急性淋巴母細胞性白血病(B-ALL)與不良預後相關聯,但如最近所展現仍對免疫系統極其敏感。特定言之,抗CD19嵌合抗原受體T細胞(CART19、CTL019)及雙特異性抗CD19/CD3抗體(布林莫單抗)在此患者群體中產生前所未有的完全反應率45-90%。兩種方法均重導引自體T細胞識別表現CD19之細胞。布林莫單抗使用組合抗CD19單鏈可變片段(scFv)與抗CD3 scFv之雙特異性構築體之連續長期輸注;在CART19之情況下,T細胞經遺傳修飾以表現與藉由內建式共刺激域信號傳導之T細胞受體融合之抗CD19 scFv。近期研究展示90%患有r/r B-ALL之患者經CTL019治療達到完全緩解(CR),6個月之總存活率(OS)為78%。CART19之令人鼓舞的結果亦在患有其他B細胞贅瘤(諸如,慢性淋巴細胞性白血病及非霍奇金
淋巴瘤)之患者中獲得。
然而,一小類用CART19或布林莫單抗治療之患者產生復發,且此等復發之顯著部分之特徵為CD19缺失。在B-ALL中,已報導10-20%患者在CART19或布林莫單抗療法之後CD19陰性復發,且其尚未描述於其他治療情形中;整體上在布林莫單抗之後約30%復發及在CART19之後高達50%為CD19陰性。CD19為自B細胞發展為成熟B細胞之極最早階段表現之原型B細胞標記。CD19在B細胞生物學中起重要作用,因為缺乏CD19之B細胞展現選擇性生長缺點。因此,CD19缺失為B-ALL中之極異常發現,且已在有效CD19導向之免疫療法時代之前在僅罕見患者中報導。抗原缺失之可能機制當前正處於研究且最可能由此等強大抗CD19試劑對白血病亞純系之選擇性壓力引起。由於FDA近期批准布林莫單抗及根據CTL019之突破狀態,有可能增加將用此等試劑治療之患有r/r B-ALL之患者數目。因此,需要新穎有效策略以便能夠治療在CART19或布林莫單抗之後將復發CD19陰性母細胞之彼等患者。理想地,新方法將不僅治療患有活性抗原缺失復發之患者,而且在預先採用時可潛在防止其發生。
介白素-3受體α(或CD123)參與血細胞生成且已展示表現於幾種血液贅瘤中,包括急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴白血病(ALL)、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、毛細胞白血病及霍奇金淋巴瘤。不同於譜系相關聯表面抗原,諸如CD33(骨髓)或CD19(B-淋巴),CD123階層式表現於造血祖細胞上,且在AML中,CD123表現於參與抗化學療法且在初始治療之後復發之白血病幹細胞上。由於此等特徵,CD123已對靶向療法產生極大關注,且正研發多種試劑,諸如IL3-白喉毒素融合蛋白(SL-401、DT388IL3)、裸抗CD123單株抗體(CSL-360、CSL-362)、抗體-藥物共軛物、雙特異性抗體或CD3Fv-IL3融合構築體及最近抗CD123嵌合抗原受體T細胞。一些此等方法當前正在臨床試驗中
驗證且更多方法將在隨後幾年在臨床中測試。靶向具有嵌合抗原受體T細胞(CART123)之CD123可導致人類原發性AML異種移植物之深度且長期反應,且可建立抗白血病T細胞記憶。此處,CD123在CD19導向療法後發生復發之CD19陰性B-ALL中表現,且與CART19(CTL019)組合之CAR-123 T細胞為治療及預防B-ALL異種移植物之抗原缺失復發的有效療法。
細胞株及初級樣本。細胞株最初獲自ATCC(Manassas,VA)(K-562)或DSMZ(Braunschweig,Germany)(MOLM-14及NALM-6)。測試所有細胞株之黴漿菌污染之存在(MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit,LT07-318,Lonza,Basel,Switzerland)。對於一些實驗,細胞株經螢火蟲螢光素酶/eGFP轉導且隨後分選,獲得>99%陽性群體。螢光素酶陽性K-562細胞株亦經截短CD19或截短CD123轉導,獲得不表現兩者、僅表現CD19或CD123之細胞株。MOLM-14及K562如相關圖中所指示用作對照。細胞株維持在補充有10%胎牛血清(FBS,Gemini,100-106,West Sacramento,CA)及50UI/ml青黴素/鏈黴素(Gibco,LifeTechnologies,15070-063)之含RPMI培養基1640(Gibco,11875-085,LifeTechnologies,Grand Island,NY)之培養物中。去鑑別之原發性人類ALL骨髓(BM)及周邊血液(PB)樣品獲自賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)/費城兒童醫院(Children's Hospital of Philadelphia)根據機構審查委員會(Institutional Review Board,IRB)協定進行之臨床實踐,購自賓夕法尼亞大學之幹細胞及異種移植中心(Stem Cells and Xenograft Core of the University of Pennsylvania)或當前CTL019臨床試驗之研究樣本(賓夕法尼亞大學之轉譯與相關研究實驗室(Translation and Correlative Study Laboratory))。對於所有功能性研究,初級細胞在實驗之前解凍至少12小時且在37℃下靜置。
初級B-ALL母細胞之活體內擴增。方法揭示於D.M.Barrett,A.E.Seif,C.Carpenito,D.T.Teachey,J.D.Fish,C.H.June,S.A.Grupp,G.S.Reid,Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia:a strategy for preclinical modeling.Blood 118,e112-117(2011)中。
螢光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)及免疫組織化學。根據標準方法且如所描述進行FISH分析及免疫組織化學。(M.A.Belaud-Rotureau,M.Parrens,P.Dubus,J.C.Garroste,A.de Mascarel,J.P.Merlio,A comparative analysis of FISH,RT-PCR,PCR,and immunohistochemistry for the diagnosis of mantle cell lymphomas.Modern pathology:an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology,Inc 15,517-525(2002))根據標準方法進行FISH分析。簡言之將所收集之ALL細胞懸浮於固定劑(乙酸及甲醇)中,沈積於載片上,且保持乾燥。將雙色基因融合探針BCR/ABL(Abbott Molecular)施加於雜交緩衝溶液中。將載片蓋滑動、密封且在HYBrite室內在37℃下靜置6hr。在移除密封劑及蓋玻片之後,將載片洗滌兩次,吸乾,乾燥,且用DAPI複染。在螢光顯微鏡下檢查載片,各樣品中評估最少200個細胞核。
產生CAR構築體及CAR T細胞。如先前所描述產生鼠類抗CD19嵌合抗原受體(CD8鉸鏈、4-1BB共刺激域及CD3 ξ信號傳導域)。(Milone等人,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 17,1453-1464(2009)及Imai等人,Leukemia 18,676-684(2004))此為賓夕法尼亞大學當前用於CTL019臨床試驗之相同構築體。對於CAR123 scFv使用抗CD123(1172構築體(SEQ ID NO:707,及如描述於PCT/US2014/017328中)及相同CAR19主鏈構築體。如先前所描述進行表現CAR之T細胞之生產。(Gill等人,Blood 123,2343-
2354(2014))正常供體CD4及CD8 T細胞或PB單核細胞(PBMC)獲自賓夕法尼亞大學之人類免疫學中心(Human Immunology Core of the University of Pennsylvania)。使用在培養第1天添加且在第6天移除之抗CD3/CD28戴諾珠粒(Dynabead)(Life Technologies,11161D)將T細胞在1:1之CD4:CD8比率下以1×106/ml接種且擴增於X-活體內15份培養基(Lonza,04-418Q)中,培養基補充有人類AB血清5%(Gemini,100-512)、青黴素/鏈黴素(Gibco,15070063)及格魯塔瑪(Glutamax)(Gibco,35050061)。T細胞在第2天經慢病毒轉導。T細胞在培養物中擴增8-15天,且在中值細胞體積低於300fl時收集。隨後將T細胞在含10% DMSO之FBS中冷凍保存用於未來實驗。在所有實驗之前,將T細胞解凍且在37℃下靜置隔夜。
多參數流動式細胞量測術。流動式細胞量測術如先前所描述進行(Kenderian等人,Leukemia,(2015))。抗人類抗體購自Biolegend、eBioscience或Becton Dickinson。細胞自活體外培養物或動物分離,在補充有2%胎牛血清之PBS中洗滌一次,且在室溫下染色15分鐘。對於細胞數目定量,根據製造商之說明書使用Countbright(Invitrogen)珠粒。在所有分析中,基於前向相對側向散射特徵,閘控所關注的群體,隨後單峰閘控,且使用活死水劑(Live Dead Fixable Aqua)(Invitrogen)閘控活細胞。包括時間閘控用於品質控制。使用抗個體基因型抗體如先前所描述偵測CAR19之表面表現。使用山羊抗小鼠抗體(Jackson Laboratories)或CD123-Fc/His(Sino Biologicals)及抗His-APC(R&D)或PE(AbCam)進行CAR123之偵測。流動式細胞量測術在四雷射Fortessa-LSR II細胞計數器(Becton-Dickinson)上進行且用FlowJo X 10.0.7r2(Tree Star)分析。
活體外T細胞效應子功能分析。脫粒、CFSE增殖、細胞毒性分析及細胞激素量測如先前所描述進行。(Gill等人,Blood 123,2343-
2354(2014)及Kalos等人,Science translational medicine 3,95ra73(2011))。
脫粒分析。簡言之,T細胞與靶細胞以1:5比率在T細胞培養基中一起培育。將抗CD107a-PECY7(Biolegend)、抗CD28(BD Biosciences)、抗CD49d(BD Biosciences)抗體及莫能菌素(BD Biosciences)添加至共培養物中。4小時後,收集細胞,且染色用於CAR表現、CD3、CD8及活死水劑染色(英傑公司)。使細胞固定且滲透(Invitrogen Fix/Perm緩衝劑),且隨後進行胞內染色以偵測多個細胞激素(IFN、TNFα、IL-2、GM-CSF、MIP1β)。
增殖分析。將T細胞洗滌且以1×107/ml再懸浮於100ul PBS中,且在37℃下用100ul CFSE 2.5uM(Invitrogen)染色5分鐘。隨後用冷培養基淬滅反應,且細胞洗滌三次。標靶以100 Gy之劑量照射。T細胞與照射之靶細胞以1:1比率培育120小時,在24小時添加培養基。隨後收集細胞,染色CD3、CAR及活死水劑(Invitrogen),且在流式細胞學分析之前添加Countbright珠粒(Invitrogen)用於絕對定量。
細胞毒性分析。螢光素酶/eGFP+細胞株如先前所描述用於細胞毒性分析。簡言之,標靶與效應T細胞以所指示之比率一起培育24小時。藉由Xenogen IVIS-200光譜相機上之生物發光成像來計算殺死。
細胞激素量測。效應子細胞與靶細胞以1:1比率在T細胞培養基中共培育24。收集上清液,且根據製造商之協定(Invitrogen)藉由30叢路明克斯陣列(Luminex Corp,FLEXMAP 3D)分析。
動物實驗。活體內實驗如先前所描述進行。(Kenderian等人,Leukemia,(2015))。所用異種移植模型之概要詳細論述於相關圖結果中。最初獲自Jackson Laboratories之NOD-SCID-γ鏈-/-(NSG)購自賓夕法尼亞大學之幹細胞及異種移植中心。根據符合實驗室動物護理及使用(Care and Use of Laboratory Animals)之NIH指南的機構動物護理及
使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)批准之協定(#803230)進行所有實驗。細胞(白血病細胞株或T細胞)以在200ul PBS中之所指示濃度注射至小鼠尾靜脈中。生物發光成像使用Xenogen IVIS-200光譜相機進行且用LivingImage軟體4.3.1版(Caliper LifeSciencies)分析。使動物在實驗結束時或在其根據IACUC協定滿足預先指定端點時安樂死。
多光子顯微鏡。小鼠經麻醉且維持在37℃中心溫度下。在移除頭皮且固定顱骨之後使骨髓成像。使用裝備有皮秒雷射(相干的)之Leica SP5雙光子顯微鏡系統(Leica Microsystems)進行成像。每次成像採集持續20min,隨後評估小鼠鎮靜。使用850nm雷射光激發CellTrace Violet、GFP及CellTrace Orange(或TRITC)。使用20×水浸漬透鏡獲得影像。使用Volocity軟體(PerkinElmer)分析所得影像。
統計分析。使用格拉夫帕德窗口稜鏡6(GraphPad Prism 6 for Windows)6.04版(La Jolla,CA)如所指示進行所有統計。學生t檢驗用於比較兩個組;在比較多個組之分析中,藉由霍爾姆-思達校正(Holm-Sida correction)進行單因子變異數分析(ANOVA)以便進行多個比較。當在多個時間點/比率下比較多個組時,使用每個時間點/比率之學生t檢驗或ANOVA。使用對數等級檢驗比較存活率曲線。在圖中,星號用於表示p值(*=<0.05、**=<0.01、***=<0.001、****=<0.0001),且「ns」意謂「不顯著」(p>0.05)。各實驗之其他統計細節列於圖例中。
為了評估B細胞急性淋巴母細胞性白血病中之CD123表現,分析來自成人及小兒ALL患者之42個樣本,包括參與吾等當前CTL019臨床試驗之14個個體。如圖31A、圖31B及圖38A中所展示,CD123高度
且均勻表現於大多數ALL母細胞表面上,代表用於靶向療法之理想候選。此外,亦發現CD123在假定的白血病幹細胞(LSC)中表現,鑑別為CD34+ CD38-(圖31C)。可在一些B-ALL患者中鑑別CD19陰性母細胞之小亞群,且此等細胞在其含有惡性表型細胞時可促進抗原缺失復發。為了評估CD19陰性亞群中疾病之存在,分選來自費城染色體陽性B-ALL大群體之CD19- CD123+細胞(CD45弱,圖38B展示閘控策略)。已發現此等細胞對於BCR-ABL易位為純系的,即使是在比CD19+母細胞更低的頻率下(圖31D)。此發現指示在一些情況下靶向單獨CD19可導致來源於CD19- CD123+細胞之亞純系復發。此外,此發現表明靶向CD123可經由消除LSC及可能CD19陰性白血病純系導致較深度反應。
最後,亦評估在CD19缺失下在CTL019之後復發之B-ALL患者的樣本中之CD123表現。重要的是,與CD19完全缺失對比,大部分患者在復發時維持CD123表現(圖31E、圖31F及圖38C)。此等發現指示CD123表示在CART19或布林莫單抗之後出現的標靶CD19陰性ALL母細胞之理想標記。
產生(37個)抗CD123嵌合抗原受體T細胞(CART123),其經慢病毒轉導且用抗CD3/CD28磁性珠粒擴增。如本文所描述評估CART123對抗B-急性淋巴母細胞性白血病之活體外及活體內活性。
使用B-ALL細胞株NALM-6,亦即CD19++及CD123+(圖32A及圖39A)及初級B-ALL樣本。當T細胞與NALM-6或原發性ALL共培養時,CART123與CART19之間的頂部對頂部活體外比較顯示類似的CD107a脫粒速率(圖32B)。CART123亦能夠以劑量依賴性方式殺死NALM-6細胞,具有與CART19類似的功效(圖32C)。在更長期實驗時,CART123在與NALM-6或原發性ALL共培養3-5天時增殖(圖32D及圖32E)且產生
多個細胞激素(圖32F)。此等結果指示CART123展現與針對多個B-ALL標靶之CART-19等效的效力。
為了在活體內模型中確認此等資料,使用初級ALL模型。在此模型中,獲自B-ALL患者之初級母細胞在NOD-SCID-γ鏈基因剔除(NSG)小鼠中傳代且經含有eGFP及叩頭蟲螢光素酶(GFP/Luc)之報導子構築體轉導。NSG小鼠靜脈內注射GFP/Luc+初級ALL母細胞(JH331、CD19+、CD123+、添加表型),且在移植之後使小鼠隨機化接收CART19、CART123或對照未轉導之T細胞(UTD)。用對照T細胞治療之小鼠快速死於疾病,而用CART19或CART123治療之小鼠展示腫瘤根除及長期存活(圖33A及圖33B)。CAR123 T細胞與對照T細胞相比在小鼠之周邊血液(PB)中顯著擴增,且表現高CAR123含量(圖33C)。CART123之抗白血病活性為特異性的且基於如在吾等移植給小鼠CD123-CD19+白血病(AV576)時母細胞表面之CD123識別,僅CART19展示抗白血病活性,而CART123與對照UTD相比無效果(圖39B及圖39C)。
為了偵測CART123劑量與抗腫瘤活性之可能相關性,研發攜有高白血病負擔之小鼠之活體內模型(使用NALM-6細胞株)。在此模型中,標準劑量CART123(2百萬個CAR+細胞)不能夠清除腫瘤。此等小鼠注射不同劑量之CART123(125萬、200萬及500萬個CAR+細胞),且觀測劑量相關之抗白血病活性(圖39D)。
為了測試新策略標靶CD19陰性復發,研發抗原缺失復發之新穎活體內模型。獲自參與吾等CTL019臨床試驗之一的患者(CHP101)之B細胞母細胞在疾病為CD19++及CD123+時在基線(在CTL019療法之前)收集,且在患者產生CD19陰性疾病(CD123仍表現,圖40A)時在CTL019之後復發時收集。母細胞隨後在NSG小鼠中擴增,且對於基
線疾病(CD19+)而言經叩頭蟲綠色螢光素酶(CBG)轉導,或對於復發(CD19-)而言經叩頭蟲紅色螢光素酶(CBR)轉導(參見方法部分)。重要的是,在活體內擴增期間,母細胞保留除CD19以外的B細胞身分標記(資料未展示)。在第一實驗中,NSG小鼠移植有基線疾病CD19+(CBG,綠色)或CD19陰性(CBR,紅色)白血病。使兩組隨機化接收CART19或對照T細胞(UTD)(圖34A)。如圖34B中所展示,在用UTD治療之兩組小鼠中獨立地藉由CD19表現展示基線及復發疾病之快速進展。相反,在用CART19治療之一組小鼠中,僅移植有基線疾病(CD19陽性)之小鼠回應於CART19治療,而移植有復發性疾病(CD19陰性)之小鼠展示如預期的難治性。此亦在CD107a脫粒分析中在活體外再現(圖40B)。為了活體內模擬表現CD19或缺乏其之不同純系之存在,NSG小鼠移植有基線與復發疾病之1:1混合物;在第8天使小鼠隨機化接收CART19或對照T細胞。藉由可辨別活體內CD19+(CBG,綠色)/CD19-(CBR,紅色)白血病之間相對生長之生物發光成像監測腫瘤負荷。如圖43C中所展示,在接收UTD之小鼠中,在第6天存在之CD19+(綠色)及CD19-(紅色)白血病在第11天類似地增加,而在用CART19治療之小鼠中,基線疾病(綠色)完全清除同時復發性疾病(紅色)展示進展。
使用初級CD19陰性B-ALL及CART19失敗之此獨特異種移植模型來評估CART123在治療抗原缺失復發中之作用。將初級CD19陰性母細胞(CBR陽性)注射至NSG小鼠中(圖34D),且使小鼠隨機化接收CART19、CART123或對照T細胞。CART19及對照T細胞展示完全缺乏抗腫瘤活性,而CART123導致此等小鼠中疾病完全根除及長期存活(圖34E及圖34F)。實際上,在CART19難治之原發性B-ALL之臨床前模型中,新穎CART123能夠根除疾病且賦予長期存活。
為了理解CART19及CART123在此活體內模型中在單細胞水準下
之差異行為,藉由以下進行一系列實驗:向攜有CD19陽性初級母細胞(GFP)或CD19陰性復發性母細胞(GFP)之小鼠注射有差異地標記之CART19(CellTrace Violet,藍色)與CART123(CellTracker Orange或TRITC,紅色)之混合物,且在注射之後大約24小時使用顱骨骨髓之活體內雙光子顯微鏡追蹤其行為(實驗概要,圖35A)。此等研究展示CART19及CART123運輸至含有白血病之骨髓空間,且CART細胞識別同源抗原與活動力阻滯相關。特定言之,在移植有基線CD19+CD123+白血病之小鼠中,發現62.9% +/- 3.8之CART19及81.1%+/-1.2之CART123以與母細胞相鄰之變圓形態停止,而在移植有復發性CD19-CD123+白血病之小鼠中,僅CART123細胞緊挨著腫瘤細胞停滯(CART123 80.9%+/-5.1對比CART19 12.4%+/- 2.2)(圖35B及圖35C)。此等發現指示在CD19陰性復發性ALL中僅CART123能夠與白血病細胞建立多產突觸(GFP)且因此降低其活動力,而CART19細胞繼續取樣且在環境中移動而不識別白血病母細胞。
CART123證明有效治療在CART19抗性之臨床前模型中CD19導向療法之後發生的CD19陰性復發。然而,組合方法可治療活性CD19陽性疾病而同時預防抗原缺失復發。為了測試此假定,藉由將原發性CD19-及CD19+疾病一起注射至NSG小鼠中來建模可能有CD19陰性逃逸之B-ALL之新出現的臨床問題。隨後使小鼠隨機化接收與T細胞相同總劑量之對照T細胞(UTD)、CART19或CART19與CART123之組合(圖36A)。如圖36B中所展示,用對照T細胞治療之小鼠具有白血病純系及CART19之進展,展示大多CD19陰性疾病(紅色)快速進展。相反,用CART123與CART19之組合治療之小鼠展示疾病清除及總存活率提高,如圖36C中所展示。在實驗結束時處死之小鼠之分析無證據展示合併CART細胞組中之殘留白血病。相比之下,在CART19單一療
法之後患有進行性疾病之小鼠保留預期之CD19陰性表型(圖36D)。
最後,T細胞經2個慢病毒轉導,一個攜載CAR19且另一個攜載CAR123,以便研發能夠藉由CD19及/或CD123活化之CART。如圖37A中所展示,偵測四個不同地轉導之T細胞亞群:CAR19及CAR123雙陰性、CAR19單陽性、CAR123單陽性及雙陽性CAR19/CAR123 T細胞。分選此等四個亞群且測試其針對K562-WT、K562 CD19+或K562 CD123+之功能性及特異性。圖37B展示CD107a脫粒分析之結果,其中單陽性亞群回應於其特異性標靶,而僅雙陽性群體能夠在表現CD19及CD123之K562存在下脫粒。另外,雙重刺激CART細胞與等效數目之單刺激CART細胞相比展現針對雙陽性標靶之細胞毒性更有效,表明藉由使用由兩個不同抗原觸發之CAR可能增加功效。(圖37C)
CD19導向之免疫療法正在改變復發性及難治性急性淋巴母細胞性白血病之治療的範例。具有先前糟糕結果之患者現有實際可能實現完全反應及長期疾病緩解。然而,如在用其他形式之有效靶向療法治療白血病之一些情況下所展示,白血病細胞能夠產生導致抗性及復發之抗原缺失突變。在CART19之情況下,已觀測到兩種主要復發模式。經由持久性失敗具有早期CART19缺失之患者處於原始純系復發之風險下;實際上,微小殘留病分析指示在1至6個月之間可能需要持續CART活性來完全根除惡性腫瘤。相比之下,儘管CART19存留,約50%復發發生,且其特徵為發生aCD19陰性白血病。後者觀測暗示CART19之有效選擇性壓力。值得注意地,CD19陰性復發亦在布林莫單抗療法之後發生,儘管此等表示少數復發在此可認為不太有效療法之後發生。存在產生CD19陰性疾病之多個可能機制。此等之一為以極低頻率在基線存在之CD19陰性純系之選擇及相對存活優點,且此
最初考慮為最可能導致CD19陰性復發之因素。最近,其他機制,諸如CD19編接失調亦被考慮為重要的。此處,首次展示B-ALL中之罕見CD19-ve母細胞可含有在更常見CD19陽性白血病母細胞中發現之標誌細胞遺傳學異常,確認此為CD19陰性復發之可能機制。吾等藉由展現CD123+CD19-ve母細胞可在免疫缺乏小鼠中移植,指示CD123與其在AML中一樣可為B-ALL中白血病幹細胞之標記來確認此等發現。
此研究之目的為界定新穎策略來治療在CD19導向療法之後具有復發性抗原缺失之患者。CD123高度表現於大部分B-ALL中,且特定言之,CD123仍表現於彼等復發性CD19陰性疾病中。展現CD19-CD123+群體中存在純系白血病細胞指示靶向CD123以及CART19可增加根除次純系之可能性,次純系可能由於CART19壓力之選擇性優點而增殖。CD123先前已驗證為AML中白血病幹細胞之標記。此處,展示待表現於ALL中免疫表型界定之白血病幹細胞(LSC)中之CD123提高CD123靶向LSC的可能性,可促進ALL根除。
為研究CART 123在抗原缺失復發中之作用,自來源於參與賓夕法尼亞大學/費城兒童醫院之CTL019試驗之一的B-ALL患者(CHP101)之初級母細胞產生CD19陰性復發之新穎異種移植模型。此患者在基線具有經典CD19+CD123+表型,但隨後在用CART19治療CD19- CD123+疾病之後復發。使用此模型,展現CART123可根除復發性疾病,且與CART19組合可預防抗原缺失復發。此為臨床上相關之患者導出模型中雙CART組合之第一個示範。另外,經由使用活體內成像,展示CART細胞在靜脈內注射之後在少於24小時內進入骨髓,搜尋其標靶且減速,以便與攜有同源抗原之細胞相互作用。此外,展示雙信號傳導CART123/19比單獨CART或合併之兩個CAR更有效,與先前公佈之結果一致。
先前展示抗CD123嵌合抗原受體治療急性骨髓白血病之臨床前功
效。CART123由於識別造血幹細胞及祖細胞上之CD123而造成造血毒性,潛在重度攻擊臨床轉譯,因為深刻的幹細胞毒性可能導致永久清髓(myeloablation)。假設為使造血毒性降至最低,僅在共接合CD19與CD123之後活化T細胞之新穎構築體可同時除去此造血毒性。此處,已發現接收來自CD19識別之活化信號及來自CD123識別之刺激信號之CART細胞可殺死B-ALL細胞以及避免吾等先前所描述之深刻的造血毒性。儘管先前使用CD19/PSMA識別之人工系統公佈此概念,此臨床相關構築體表示該領域中之重大進步,具有相對清晰路徑用以臨床轉譯。值得注意地,儘管此類雙CAR設計將可能與降低之毒性相關聯,其可能藉由使CAR識別之限制性更大而非更小而留下未解決之抗原缺失復發問題。然而,若靶向CD123成功根除ALL幹細胞,則此方法可為安全且有效的。
概言之,此處展現一種藉由靶向CD123治療B-ALL之新穎且有效策略。此方法尤其有吸引力,因為CD123表現於一些患有B-ALL之患者中罕見CD19陰性惡性細胞中,且保留於在CD19導向免疫療法之後發生的抗原缺失復發中。此外,CART19與CART123之組合可預防CD19陰性復發發生。
嵌合抗原受體T細胞(CART)療法已在過去幾年內發展為血液惡性腫瘤之強大且潛在治癒性療法。CD19導向之CART細胞已導致大部分患者持久之急性淋巴母細胞性白血病中之給人深刻印象的約90%完全反應率。然而,諸如慢性淋巴細胞性白血病之其他惡性腫瘤中之總反應率為約50%。此可能與白血病細胞誘導之CART耗竭及功能障礙部分地相關。在此實例中,評估抑制性受體/路徑在誘導血液惡性腫瘤中之CART細胞功能障礙及耗竭中之作用。
作為腫瘤模型,用CD33或CD123導向之CART細胞(包含41BB及
CD3z刺激域及慢病毒載體、1172構築體(SEQ ID NO:707))治療急性骨髓白血病(AML)細胞株(MOLM14)及初級AML樣本。
培育初級AML樣本或MOLM14細胞株與CD33或CD123導向之CART導致腫瘤細胞上之PDL1在培育24小時之後顯著上調(第0天0%對比第1天80%,P<0.001),且T細胞上之PD1及TIM3在共培養3-7天後上調(第0天8% T細胞表現PD1對比第3天43%,P=0.03;且第0天13% T細胞表現TIM3對比第3天71%,p=0.001;圖41A、圖41B及圖41C)。進一步流動式細胞量測術分析展現CD8+ T細胞(圖42A、圖42B、圖42C及圖42D)及CD4+ T細胞中檢查點抑制劑PD1、TIM3及額外檢查點抑制劑LAG3及CTLA4上調。重要的是,在暴露於靶細胞(初級AML或MOLM14細胞)之後在第3天至第7天之間觀測到最大表現。
對於活體內實驗,NSG(NOD-SCID-g-/-)小鼠移植有MOLM14細胞株。用次優劑量之CD33或CD123 CART治療此等AML異種移植物導致初始抗腫瘤反應,隨後40-60%之小鼠復發疾病(圖44)。
T細胞自此等小鼠之骨髓分離且分析抑制性受體之差異表現。自患有復發性疾病之小鼠分離之T細胞相比於自CART細胞療法後緩解之小鼠分離之T細胞,其上之PD1及TIM-3受體顯著增加上調(圖43及圖45)。
隨後,研究CART細胞療法後添加檢查點抑制劑改善離體T細胞功能之作用。自CART細胞療法之後復發之小鼠的骨髓分離之T細胞在腫瘤存在下與PD-1抑制劑(BioXcell,目錄編號為BE0193且純系號為J110)、TIM3抑制劑(Biolegend,純系F38-2E2,目錄編號345010)、CEACAM抑制劑(Sigma-Aldrich,目錄編號SAB1403604-100UG)或PD1抑制劑與TIM3抑制劑之組合或PD1抑制劑與CEACAM1抑制劑之組合共培養。檢查點抑制劑以10ug/ml之濃度投與。如藉由在檢查點抑制劑存在下細胞激素產量(例如,IFN-γ)及Ki-67增殖標記所量測,
CART細胞效應子功能改善。CART細胞效應子功能之改善在PD1抑制劑與TIM3抑制劑組合時更明顯(圖46A及圖46B)。
最後,測試組合檢查點抑制劑與CART是否將提高抗腫瘤活性,例如增加治療指數及預防AML異種移植物復發。在此方法中,用次優劑量之CD33或CD123導向之CART或對照未轉導之T細胞(UTD)在具有或不具有檢查點抑制劑之不同組合下治療MOLM14異種移植物。NSG小鼠移植有MOLM14 AML細胞株。移植藉由生物發光成像確認。隨後用次優劑量(靜脈內總計0.25-0.5×106個T細胞)之CD33或CD123導向之CART或對照未轉導之T細胞(UTD)治療AML異種移植物。小鼠之第3天、第6天、第9天及第12天後的T細胞亦接收PD-1阻斷、TIM3阻斷或兩者之組合。小鼠隨後進行連續成像以評估疾病負擔。實驗概要概述於圖47及圖49中。
添加檢查點抑制劑至未轉導之T細胞不導致抗白血病效果(圖48)。然而,添加PD1或TIM3阻斷導致協同抗腫瘤活性,如圖50A、圖50B、圖50C及圖50D中所展示。持久完全反應率為:用單獨CART123治療時為45%(圖50A、圖50B及圖50C),用CART123+PD1抑制治療時為80%(圖50A),用CART123+TIM3抑制治療時為100%(圖50B),及用CART123+ PD1及TIM3抑制治療時為80%(圖50C)。
因此,用CART123與檢查點抑制劑組合治療導致抗腫瘤活性比在投與CART123時觀測到的抗腫瘤效果以及在投與任一單獨檢查點抑制劑時觀測到的抗腫瘤效果更大。此等結果指示PD1及TIM3路徑參與AML中之CART耗竭及功能障礙。檢查點抑制劑與CART細胞之組合可導致AML及其他血液惡性腫瘤中之功能增強。
藉由將表現CART之細胞與靶細胞在不同濃度之RAD001存在下共培養來評估低劑量RAD001對活體外CART細胞增殖之作用。
人類化抗人類CD19 CAR(huCART19)慢病毒轉移載體用於產生封裝至VSVg假型慢病毒粒子中之基因組材料。人類化抗人類CD19 CAR(huCART19)之胺基酸及核苷酸序列為2014年3月15日申請的PCT公開案WO2014/153270中所描述之CAR 1、ID 104875,且其中命名為SEQ ID NO.85及31。
將慢病毒轉移載體DNA與三種封裝組分VSVg env、gag/pol及rev以及脂染胺試劑混合以轉染Lenti-X 293T細胞。在其後24h及30h之後改變培養基,收集含病毒之培養基,過濾且儲存在-80℃下。藉由將藉由健康供體血液或leukopak之陰性磁性選擇所獲得的新鮮或冷凍原始T細胞轉導來產生CART。藉由與抗CD3/抗CD28珠粒一起培育24h來活化T細胞,其後將病毒上清液或濃病毒(分別MOI=2或10)添加至培養物中。使經修飾之T細胞擴增約10天。藉由在第7天與第9天之間進行流式細胞學分析來測定轉導之細胞百分比(在細胞表面上表現CAR)及CAR表現量(相對螢光強度,幾何平均值)。生長速率減緩與T細胞尺寸接近約350fL之組合確定待冷凍保存之T細胞的狀態以供稍後分析。
為評估CART之功能性,將T細胞解凍且計數,且藉由細胞計數儀(Cellometer)評估存活力。使用未轉導之T細胞(UTD)標準化各培養物中CAR陽性細胞之數目。以50nM開始,用RAD001滴定來測試RAD001對CART之影響。用於所有共培養實驗中之靶細胞株為Nalm-6,其為表現CD19且經轉導以表現螢光素酶之人類前B細胞急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞株。
為量測CART之增殖,將T細胞與靶細胞以1:1之比率一起培養。
分析操作4天,此時將細胞染色用於CD3、CD4、CD8及CAR表現。藉由流動式細胞量測術使用計數珠粒作為參考來評估T細胞數目。
在4天共培養分析中測試CART細胞之增殖能力。在CAR轉導及未轉導之T細胞與Nalm-6一起培養之後,評估CAR陽性CD3陽性T細胞(暗條)及總CD3陽性T細胞(淺條)之數目(圖53)。當在少於0.016nM RAD001存在下培養時huCART19細胞擴增,且在更高濃度該化合物下擴增程度更小。重要的是,在0.0032nM及0.016nM之RAD001下,增殖均高於不添加RAD001所觀測到的增殖。未轉導之T細胞(UTD)不展示可偵測擴增。
此實例評估huCAR19細胞在活體內在不同濃度RAD001下增殖之能力。
NALM6-luc細胞:NALM6人類急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞株由患有復發性ALL之患者之周邊血液產生。隨後將細胞用螢火蟲螢光素酶標記。此等懸浮細胞在補充有10%熱不活化胎牛血清之RPMI中生長。
小鼠:6週齡NSG(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tmIWjl /SzJ)小鼠自Jackson Laboratory(庫存編號005557)收到。
腫瘤植入:NALM6-luc細胞在補充有10%熱不活化胎牛血清之RPMI中在活體外生長及擴增。隨後將細胞轉移至15ml錐形管且用冷無菌PBS洗滌兩次。隨後對NALM6-luc細胞計數且以每毫升PBS10×106個細胞之濃度再懸浮。將細胞置於冰上且立刻(一小時內)植入小鼠中。NALM6-luc細胞以100μl體積經由尾靜脈經靜脈內注射,每一小鼠總計1×106個細胞。
CAR T細胞給與:在腫瘤植入之後7天投與小鼠5×106個CAR T細胞。細胞在37℃水浴中部分解凍,且隨後藉由向含有細胞之管子中添加1ml冷無菌PBS完全解凍。將解凍之細胞轉移至15ml離心管中且用PBS調整至10ml之最終體積。在1000rpm下洗滌細胞兩次,每次10分鐘,且隨後在血球計上計數。隨後將T細胞以每毫升冷PBS 50×106個CAR T細胞之濃度再懸浮,且保持於冰上直至給與小鼠。小鼠經由尾靜脈經靜脈內注射100μl CAR T細胞,每一小鼠劑量為5×106個CAR T 細胞。將每組八隻小鼠用100μl單獨PBS(PBS)或人類化CD19 CAR T 細胞治療。
RAD001給與:調配等於1mg RAD001之50mg濃微乳劑,且隨後在給與時再懸浮於D5W(5%右旋糖水溶液)中。小鼠每日經口給與(經由口服管飼)200μl所需劑量RAD001。
PK分析:小鼠在腫瘤植入後第7天開始每日給與RAD001。劑量組如下:0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg及10mg/kg。在第0天及第14天,第一劑及最後一劑RAD001後的以下時間點,對小鼠抽血以供PK分析:15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時及24小時。
在患有NALM6-luc腫瘤之NSG小鼠中測試RAD001之擴增及藥物動力學。單獨RAD001之每日口服給與未影響NALM6-luc腫瘤之生長(圖54)。RAD001之藥物動力學分析展示其在攜有腫瘤之小鼠之血液中相當穩定(圖55A及圖55B)。第0天與第14天PK分析均展示血液中之RAD001濃度超過10nm,即使在最低測試劑量(0.3mg/kg)下在給與之後24小時。
基於此等劑量,在具有及不具有RAD001下給與huCAR19 CAR T細胞以確定此等細胞之增殖能力。基於給與24小時後血液中RAD001
之含量,所用最高劑量為3mg/kg。在最後一劑RAD001之後24小時RAD001濃度超過10nM時,幾個較低劑量之RAD001用於CAR T細胞之活體內研究。在開始每日口服給與RAD001前一天,靜脈內給與CAR T細胞。經由FACS監測小鼠之T細胞擴增。
最低劑量之RAD001展示CAR T細胞之增殖增強(圖56)。此增強之增殖在CD4+ CAR T細胞下比CD8+ CAR T細胞更明顯且更長久。然而,在CD8+ CAR T細胞下,在CAR T細胞給與後早期時間點可見增強之增殖。在實施例中,RNA CART細胞亦可與檢查點抑制劑組合使用。
尤其關注封端策略用於使CART123療法之毒性降至最低。降低CART123活性之一種策略涉及藉由共表現CAR123與CD20且使用抗CD20抗體利妥昔單抗靶向CART123細胞破壞來消融表現CD123 CAR之T細胞。在此實例中,產生共表現CD20之CART123細胞,且藉由各種活體外分析表徵,諸如脫粒及細胞激素生產能力。
構築表現CD123 CAR及CD20之表現載體。載體圖展示於圖57中。NVS2 CAR123(在本文中亦稱為CAR123-2)由針對CD123之人類化單鏈可變片段、CD8鉸鏈、CD8跨膜域、41BB及CD3刺激域組成。NVS2 CAR123在EF1α啟動子下且藉由P2A蛋白質可操作地連接於完整CD20分子。僅表現CAR123之細胞在本文中稱為CART123細胞,且共表現CAR123及CD20之細胞在本文中稱為CART123P2ACD20細胞。
對於CD107脫粒分析,CART123及CART123P2A CD20細胞單獨與CD123陽性細胞株MOLM14、CD123陰性對照細胞株Jurkat及作為陽性對照之PMA/離子黴素在CD28、CD49d共刺激分子及莫能菌素存在下培養。培育4小時之後藉由流動式細胞量測術量測CD107a。CART123 P2A CD20細胞類似於CART123細胞經歷回應於CD123陽性
標靶之穩固特異性CD107a脫粒(圖58),藉此展現引入CD20分子並未不利地影響CART123細胞脫粒。
亦評估CART123P2A CD20細胞之細胞激素產量。CART123及CART123P2A CD20細胞單獨與CD123陽性細胞株MOLM14、CD123陰性對照細胞株Jurkat及作為陽性對照之PMA/離子黴素在CD28、CD49d共刺激分子及莫能菌素存在下培養。四個小時之後收集該等細胞,固定且滲透,染色細胞激素GM-CSF、TNFα、IFNγ或IL-2,且進行流式細胞學分析。來自此等分析之結果展現大部分CART123 P2A CD20細胞類似於CART123細胞回應於CD123陽性標靶產生GM-CSF(圖59A)、TNFα(圖59B)、IFNγ(圖59C)及IL-2(圖59D)。
在細胞毒性分析中,CART123及CART123P2A CD20細胞與MOLM14-luc以如所指示之不同E:T比率一起培育24h,且隨後進行生物發光成像作為殘留活細胞之量測。結果展示CART123 P2A CD20細胞類似於CART123細胞導致特異性殺死CD123陽性標靶MOLM14(圖60)。
隨後評估CART123 P2A CD20細胞之利妥昔單抗介導之細胞毒性。CART123及CART123 P2A CD20與利妥昔單抗以各種濃度0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml培育。在0、4、12及48小時收集細胞,且染色CD3。計算T細胞耗盡百分比。利妥昔單抗在100ug/ml濃度下且在CART123P2A CD20細胞(圖61B)而非CART123細胞(圖61A)中培育48小時之後導致直接細胞毒性。
研究介導CART123P2ACD20細胞耗盡之機制。CART123 P2A CD20細胞與利妥昔單抗以不同濃度0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml在15%兔補體存在下培育。如圖62中所展示,利妥昔單抗1ug/ml或10ug/ml導致大部分CART123 P2A CD20細胞在培育12小時之後耗盡。利妥昔單抗100ug/ml導致大部分CART123 P2A CD20細胞在
培育4小時之後耗盡。CART123 P2A CD20細胞耗盡藉由補體依賴性細胞毒性介導。
許多具有急性骨髓白血病(AML)復發或當前治療模態不可治癒之兒童及成人突出顯示需要替代療法。靶向CD123之嵌合抗原受體T細胞(CART123)已在人類AML之鼠類異種移植模型中展現有效抗白血病活性。然而,移植有正常人類造血細胞之小鼠之CART123治療導致深刻清髓,對可用此類療法治療之患有AML之患者中嚴重血液毒性的關注提高。此處,評估在CART123誘導之AML根除之後T細胞缺失是否可能使此旁觀者毒性降至最低而不損害白血病對照,且藉此增加抗AML CAR T細胞免疫療法之治療窗。
檢測人類AML異種移植模型中之三種封端策略:(1)在用1×105-1×106個經抗CD123-41BB-CD3ζ CART123慢病毒轉導之T細胞治療後用抗CD52抗體阿侖單抗進行T細胞消融;(2)在用1×105-1×106個經工程改造以共表現CD20之CART123(CART123/CD20)治療後用抗CD20抗體利妥昔單抗進行T細胞消融;及(3)用「生物可降解」抗CD123 mRNA電穿孔CAR T細胞(RNA-CART123)治療。移植有表現螢光素酶之人類AML細胞株(MOLM14、MOLM13、U937)或初級AML樣品(n=3)之小鼠用如上所述CD123重定向之CAR T細胞治療。此實驗使用之CD123 CAR構築體為1172構築體(SEQ ID NO:707),且在第1週投與小鼠。對於T細胞耗盡研究,在第2週、第3週或第4週(例如,CART123之後1、2或3週)腹膜內注射1mg/kg或5mg/kg阿侖單抗以確定T細胞消融之最佳劑量及時序。在隨後研究中,在CART123/CD20之後4週腹膜內注射10mg/kg利妥昔單抗,或在AML移植之後5、9及16天經靜脈內注射1×107個RNA-CART123。隨後,每週對小鼠之血
液、脾及/或骨髓進行生物發光成像及/或定量流動式細胞量測術分析。
CART123治療CD123+ AML異種移植物誘導之活體內顯著T細胞擴增及白血病根除導致長期動物存活(p<0.0001對比未轉導之T細胞治療之對照)。觀測到最小的異種移植物抗宿主效果。
異種移植模型中CART123藉由阿侖單抗投與連續消融之結果展示於圖72A中。亦在相應時間點進行CART123細胞之定量(圖72B),且展示單次劑量之阿侖單抗快速消除CART123細胞。一次劑量之阿侖單抗在所有測試模型中快速消除T細胞,最佳功效為在第4週(例如,CART123之後3週)5mg/kg劑量。總存活率之分析展示於圖72C中,展現在第3週或第4週接收阿侖單抗之小鼠與在第2週接收阿侖單抗之小鼠相比展示存活率提高。
CART123/CD20根除之AML具有類似於CART123之AML的動力學,且在CART123/CD20輸注後4週1劑利妥昔單抗快速消除T細胞同時保持白血病緩解。具有CART123或CART123/CD20誘導之AML緩解的小鼠在阿侖單抗或利妥昔單抗投與時間保持無白血病12週(圖72A),且動物存活率不會不同於不經歷T細胞耗盡之CD123重定向之CAR T細胞治療之小鼠(p=1.00)。相反,在早期阿侖單抗投與時間具有殘留AML之CART123治療之小鼠經歷快速AML進展,與有效先前T細胞消除一致(圖72A)。
此外,用先前阿侖單抗或利妥昔單抗消融之T細胞進行動物之AML再攻擊(「復發」)導致快速AML增殖而無T細胞再出現,確認T細胞耗盡之完整性。非消融小鼠展現在排斥CD123+再攻擊之情況下CAR T細胞再擴增(p<0.0001)(圖72A)。
亦在第二活體內模型,小兒患者導出之異種移植模型中檢測阿
侖單抗治療。在此模型中,小鼠注射AML290細胞。AML移植之後六週,向小鼠投與鹽水、未轉導之T細胞或CART123細胞(在第0週呈現)。在第4週向一小類接收CART123細胞之小鼠投與5mg/kg阿侖單抗。展示阿侖單抗治療完全消除周邊血液中之CART123 T細胞(圖73B)腫瘤進展之分析展示接收CART123之小鼠展現在CART123治療之後高達8週緩解。在第4週接收阿侖單抗治療及CART123細胞消融之小鼠保持緩解(圖73A)。藉由流動式細胞量測術確定CART123給與後存在於不同異種移植物器官中之AML之分析。用CART123細胞治療導致脾(圖74A)及骨髓(圖74B)中之AML細胞消融。CART123給與後4週用阿侖單抗治療保存緩解,如由脾(圖74A)及骨髓(圖74B)中之AML細胞持續消融所展現。
儘管RNA-CART123比CART123或CART123/CD20具有預計更短的活體內持久性,RNA-CART123最快速消除AML且促進長期動物存活。單獨阿侖單抗或利妥昔單抗對比僅AML對照(p=1.00)不抑制非CART123治療之異種移植模型中之AML增殖。
描述於此實例中之三種封端方法之比較展示於圖75中。
阿侖單抗及利妥昔單抗完全消除人類AML異種移植模型中之CD123重定向之CAR T細胞。持續白血病緩解需要CART123或CART123/CD20持續4週,隨後T細胞分別在CART123或CART123/CD20之後經由5mg/kg阿侖單抗或10mg/kg利妥昔單抗封端。進行中的研究正在研究額外初級AML異種移植模型中及針對其他抗AML CAR T細胞免疫療法之T細胞消除功效。此等T細胞封端策略可能增加CAR T細胞療法在患有AML之患者中之功效,尤其在潛在造血幹細胞移植之前。
大多數B-急性淋巴母細胞性白血病(B-ALL)母細胞共表現CD19及CD123。同時靶向兩個抗原可導致抗腫瘤活性增加及復發率降低。如實例8中所描述,CAR19與CAR123之組合已增加治療功效。在此實例中,研究投與CAR19與CAR123之組合的不同構築體。
投與CAR19與CAR123之組合的一種策略為經由雙CART,其中T細胞表現CAR19及CAR123構築體。攜載CAR19及CAR123之序列之單個慢病毒載體(而非2個獨立載體)經構築以促進雙CART生產以供臨床使用(圖63A)。此慢病毒構築體包括經由EF1啟動子下方之P2A域連接之CAR19及CAR123。T細胞經慢病毒構築體轉導,培養6天,且隨後用CD19 scFv特異性抗體及CD123-His肽及抗His-PE抗體染色,以用於流動式細胞量測術分析。結果展示偵測到表現CAR19及CAR123之T細胞(圖63B)。
在另一策略中,使用分裂CAR策略來表現CAR19及CAR123。在此策略中,構築載體,其中包含共刺激域4-1BB之CAR123經由P2A域連接至包含主要信號傳導域CD3ζ之CAR19(圖64A)。特定言之,CAR123包含CD123 scFv、CD8鉸鏈及CD8跨膜域及4-1BB域。CAR19包含CD19 scFv、CD8鉸鏈及CD8跨膜域及CD3 ξ域。在此策略中,僅藉由CAR之各別scFv部分識別CD19及CD123將導致分裂CART細胞活化。T細胞經慢病毒構築體轉導,培養6天,且隨後用CD19 scFv特異性抗體及CD123-His肽及抗His-PE抗體染色,以用於流動式細胞量測術分析。結果展示偵測到表現CAR19及CAR123之T細胞(圖64B)。
CD123 CART療法可適用於組織細胞病症,諸如BPDCN或肥大細胞病症。在此實例中,進行實驗來評估在母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤(BPDCN)及肥大細胞病症(諸如全身性肥大細胞增多症及肥大細胞白血病)之情況下的CART123功能。
BPDCN為自pDC前驅體產生之罕見且侵襲性血液贅瘤,分類為組織細胞/樹突狀細胞贅瘤。所有BPDCN均表現CD123。CD123似乎對於BPDCN存活為關鍵的,因為BPDCN母細胞需要IL-3用於成功離體繁殖。儘管對化學療法之最初高反應率,長期存活通常為極差的,且無關於初始表現之中值存活期為9-13個月。
藉由流動式細胞量測術測定造血幹細胞(HSC)、急性骨髓白血病細胞株(AML)或兩個不同BPDCN上之CD123表現。指示中值螢光強度。AML、正常骨髓CD34+細胞及兩例BPDCN上之CD123表現展示於圖65中。此等資料指示BPDCN相比於正常骨髓上之CD123表現量高10-20倍。
使用替代抗CD123純系(32716(在本文中亦稱為1172構築體)及26292(在本文中亦稱為1176構築體)產生額外CART123構築體,兩個構築體描述且表徵於PCT/US2014/017328中。類似於實例2或實例3中所描述之分析進行細胞殺死分析。純系26292導致正常CD34細胞相比於陽性對照AML或BPDCN之殺死減少,指示產生可能產生增強之治療窗之具有減弱活性的CART-123為可行的(圖66B)。相比之下,純系32716展示CD34細胞及BPDCN之類似殺死(圖66A)。
類似於實例2或實例3中所描述之分析進行諸如脫粒及細胞激素產生之T細胞功能之敏感性分析。純系26292 CART123與CD34+ HSC(圖67,頂列)或BPDCN(圖67,底列)一起培育四個小時。評估CD107脫粒。來自脫粒分析之結果展示純系26292之效應子功能仍可藉由CD34+ HSC(圖67,頂列)觸發。
肥大細胞病症,包括全身性肥大細胞增多症及肥大細胞白血病,為與不良預後相關聯之罕見組織細胞惡性腫瘤。肥大細胞表現高含量CD123,且因此肥大細胞病症可用CART123治療。
進行肥大細胞病症上CD123表現之分析。來自患有肥大細胞白血
病/全身性肥大細胞增多症之患者的血液之單核細胞經活/死水劑(LDAQ,圖68A及圖68B中之x軸)及同型(圖68A)或CD123 PE(圖68B)染色。大多數SM細胞表現CD123。
進行CD107脫粒分析來評估在肥大細胞白血病細胞存在下之CART123活性。CART123細胞單獨與PMA及離子黴素(圖69A)或來自患有肥大細胞白血病/全身性肥大細胞增多症之患者的血液之單核細胞(圖69B)在抗CD107a抗體存在下培養兩個小時。使用抗CD3閘控T細胞。使用CART123單獨管閘控CD107a陽性。CART123對SM細胞之反應等效於陽性對照PMA+離子黴素產生之反應。
在此實例中,進行分析來測試表現CD123 CAR之細胞對腫瘤微環境之作用。此等分析可用於評估CART123對霍奇金氏淋巴瘤中之腫瘤微環境之作用。
進行第一分析以判定惡性細胞,例如霍奇金淋巴瘤細胞(HL細胞)是否導致腫瘤微環境(例如,單核)中細胞之免疫抑制表型。單核細胞及HL細胞在包含上部及下部腔室之傳斯維爾板(transwell plate)中生長。單核細胞及惡性細胞在以下組態下培養:(1)單核細胞在一個腔室(例如,下部腔室)中生長,且HL細胞在另一腔室(例如,上部腔室)中生長;(2)單核細胞與HL細胞一起在傳斯維爾板之同一側中生長;或(3)單核細胞單獨生長(對照)。細胞培養所需時間段,且隨後收集細胞用於流動式細胞量測術分析或即時定量PCR以藉由評估諸如CD14及HLADR之標記的含量來偵測單核細胞表型,例如免疫抑制表型。
進行第二分析來判定免疫抑制腫瘤微環境細胞,例如單核細胞是否可抑制CART細胞介導之抗腫瘤T細胞免疫。此分析可以兩種不同方式進行,在抗腫瘤T細胞免疫疑似經由可溶性因子抑制時使用傳斯維爾板,或在抗腫瘤T細胞免疫之抑制疑似為接觸介導時使用標準
細胞培養容器。對於抗腫瘤T細胞免疫可經由可溶性因子抑制之分析,細胞在包含上部及下部腔室之傳斯維爾板中生長。細胞在以下組態下培養:(1)HL細胞在一個腔室(例如,上部腔室)中,且CART19細胞及表現CD19之腫瘤細胞(例如,B細胞腫瘤)在另一腔室(例如,下部腔室)中;(2)單核細胞在一個腔室(例如,上部腔室)中,且CART19細胞及表現CD19之腫瘤細胞(例如,B細胞腫瘤)在另一腔室中;及(3)HL細胞及單核細胞在一個腔室(例如,上部腔室)中,且CART19細胞及表現CD19之腫瘤細胞(例如,B細胞腫瘤)在另一腔室中。對於抗腫瘤T細胞免疫之抑制可為接觸介導之分析,細胞在以下組態下培養:(1)HL細胞、CART19細胞及表現CD19之腫瘤細胞;(2)單核細胞、CART19細胞及表現CD19之腫瘤細胞;及(3)HL細胞、單核細胞、CART19細胞及表現CD19之腫瘤細胞。細胞培養所需時間段,且隨後評估CART19功能。評估CART19功能之分析包括增殖及殺死分析,例如如描述於實例2及實例3中。
進行第三分析來確定CART123靶向腫瘤微環境中之免疫抑制細胞。此分析可以兩種不同方式進行,在抗腫瘤T細胞免疫疑似經由可溶性因子抑制時使用傳斯維爾板,或在抗腫瘤T細胞免疫之抑制疑似為接觸介導時使用標準細胞培養容器。對於抗腫瘤T細胞免疫可經由可溶性因子抑制之分析,細胞在包含上部及下部腔室之傳斯維爾板中生長。細胞在上文所描述之第二分析之三種傳斯維爾板組態下培養,且另外,在以下包括CART123細胞之組態下培養:(4)HL細胞及CART123細胞在一個腔室(例如,上部腔室)中,且CART19細胞及CD19+CD123-腫瘤細胞(例如,B細胞腫瘤)在另一腔室(例如,下部腔室)中;(5)單核細胞及CART123細胞在一個腔室(例如,上部腔室)中,且CART19細胞及CD19+CD123-腫瘤細胞(例如,B細胞腫瘤)在另一腔室中;及(6)HL細胞、單核細胞及CART123細胞在一個腔室(例
如,上部腔室)中,且CART19細胞及CD19+CD123-腫瘤細胞(例如,B細胞腫瘤)在另一腔室中。對於抗腫瘤T細胞免疫之抑制可為接觸介導之分析,細胞在上文所描述之第二分析之三個標準細胞培養容器中培養,且另外,在以下包括CART123細胞之組態下培養:(4)HL細胞、CART19細胞、CART123細胞及CD19+CD123-腫瘤細胞;(5)單核細胞、CART19細胞、CART123細胞及CD19+CD123-腫瘤細胞;及(6)HL細胞、單核細胞、CART19細胞、CART123細胞及CD19+CD123-腫瘤細胞。細胞培養所需時間段,且隨後評估CART19功能。評估CART19功能之分析包括增殖及殺死分析,例如如描述於實例2及實例3中。
此研究解決急性骨髓白血病(AML)個體中經靜脈內投與、RNA電穿孔之表現抗CD123嵌合抗原受體(表現串聯TCRζ及4-1BB(TCRζ/4-1BB)共刺激域)之自體T細胞(稱為「RNA CART123」)之可行性、安全性及功效。此研究評估15個個體。可評估個體為接收至少一劑RNA CART123細胞之個體。有效協定干預之持續時間為距篩選問診大約2個月。個體在其第一次輸注之後被追蹤6個月。
此研究之主要目標為藉由記錄不良事件之頻率及嚴重程度來評估在AML個體中RNA CART123之安全性,包括(但不限於)估計細胞激素釋放症候群(cytokine release syndrome,CRS)及巨噬細胞活化症候群(macrophage activation syndrome,MAS)之頻率。此研究之次要目標包括:(1)確定RNA CART123細胞之持久性及運輸;(2)藉由量測周邊血液及骨髓中之母細胞計數減少來估計至少1劑RNA CART123細胞在AML個體中之功效;(3)藉由量測在28 +/- 5天之總反應率(ORR),使用(i)標準形態學完全反應標準(<5%惡性母細胞具有計數恢復)、(ii)<5%惡性母細胞不具有計數恢復及(iii)微小殘留病評估來估
計至少1劑RNA CART123細胞在AML個體中之功效;(4)確定直至RNA CART123細胞輸注之後6個月所有個體之總存活率(OS)及無進展存活率(PFS)及死亡原因;(5)確定直至RNA CART123細胞輸注之後6個月作出反應之個體之反應持續時間(DOR);及(6)確定繼續進行同種異體HCT(或第二同種異體HCT)之個體百分比。
符合條件的個體為18歲以內患有AML或骨髓發育不良症候群而無可用治癒性治療方案之使用當前可用療法之男性或女性。具有第二次或隨後復發、難以補救之任何復發或在至少兩株療法之後患有持續性疾病之個體。個體必須患有可評估疾病>5%母細胞在骨髓抽出物或活組織檢查上或在篩選之前2週內髓外疾病(禁止CNS受累)。
藉由在2週內靜脈內投與總計高達六劑RNA抗CD123 CAR T細胞來治療個體。劑量根據個體重量具有個體內劑量遞增。個體分成兩個群組。群組1包括最先3個個體接收RNA CART123細胞,及接收遞增之3劑RNA CART123細胞,在輸注之前無淋巴細胞耗盡化學療法(圖70)。群組2包括該研究之剩餘12個個體,且以遞增劑量靜脈內接收高達六劑RNA CART123細胞(圖71)。群組2可給與淋巴細胞耗盡化學療法4天(+/- 1天),隨後第一次CART123細胞輸注(若ALC>500/uL)。可在第四劑RNA CART123細胞之前重複淋巴細胞耗盡化學療法(若ALC>500/uL)。淋巴細胞耗盡化學療法包括單次劑量之環磷醯胺(1mg/m2)。RNA CART123治療方案內之淋巴細胞耗盡化學療法劑量經設計以藉由增強恆穩空間來增強隨後T細胞劑量之移植。
CART細胞按重量計之劑量提供於下表中:
用於給藥之重量可為清除術程序之前獲得之重量。細胞數目係基於具有藉由流動式細胞量測術測定之CAR表現的CAR+細胞。個體
重量之改變將不改變劑量。所指示之劑量考慮到製造變化為+/- 20%。樣本RNA CART123給藥時程提供於下文:
基線及後續腫瘤評估將根據AML之護理臨床實踐標準進行。若在第一次環磷醯胺給藥之前超過2週進行個體之最後一次骨髓,則可進行基線AML骨髓評估。個體將在第16+/-2天(或在最後一次接收RNA CART123輸注之7天內)、第28+/-5天及在3個月及6個月(對於不繼續進行alloHCT之個體)具有針對白血病反應之骨髓評估。CART細胞含量及細胞激素將藉由TCSL研究實驗室之適當測試確定。疾病反應定義可作為AML標準。
所有患有骨髓發育不全之個體在D28+/-5(或在最後一次T細胞輸注之後14天,無論發生前後)將經歷同種異體造血細胞移植(alloHCT)作為解救策略。因此,所有個體應具有先前鑑別之幹細胞供體。骨髓發育不全定義為細胞性相對於正常年齡減少>75%,以及ANC<0.5k/ul或血小板<50k/ul。
治療限制性毒性(TLT)定義為有可能、可能或的確與T細胞輸注相關之任何出人意料的事件,包括如章節5.5中所定義之非血液學3級或大於3級之不良事件及任何3級或大於3級之過敏反應及自體免疫反應。以下事件不包含TLT:發熱及感染、任何等級之血球減少症、腫瘤溶解症候群、細胞激素釋放症候群或在七天內解析為2級或更低級之任何代謝或實驗室異常。
不良事件報導在開始第一劑RNA CART123細胞時開始,且將持續4個月或直至調理HCT或起始另一替代療法,無論發生前後。可連續再評估個體之急性及累積毒性之證據。
本文所引用之每一專利、專利申請案及公開案之揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。雖然已參考特定態樣揭示本發明,但顯而易見熟習此項技術者可在不背離本發明之真實精神及範疇的情況下設計本發明之其他態樣及變化。所附申請專利範圍意欲理解為包括所有此類態樣及等效變化。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 585
<210> 586
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 586
<210> 587
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 587
<210> 588
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 588
<210> 589
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 589
<210> 590
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 590
<210> 591
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 591
<210> 592
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 592
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<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 593
<210> 594
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> 任何胺基酸
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<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 595
<210> 596
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 596
<210> 597
<211> 521
<212> DNA
<213> 智人
<400> 597
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<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成聚核苷酸”
<400> 598
<210> 599
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成聚核苷酸”
<400> 599
<210> 600
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成聚核苷酸”
<400> 600
<210> 601
<211> 422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成聚核苷酸”
<400> 601
<210> 602
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(21)
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<400> 602
<210> 603
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> /置換=
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(22)
<223> /備註=“序列中所提供之變異殘基對於針對變異位置之註釋中之彼等殘基不具有偏好”
<400> 603
<210> 604
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成肽”
<220>
<221> VARIANTT
<222> (1)..(3)
<223> /置換=
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(23)
<223> /備註=“序列中所提供之變異殘基對於針對變異位置之註釋中之彼等殘基不具有偏好”
<400> 604
<210> 605
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> /置換=
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(25)
<223> /備註=“序列中所提供之變異殘基對於針對變異位置之註釋中之彼等殘基不具有偏好”
<400> 605
<210> 606
<211> 1132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 606
<210> 607
<211> 4027
<212> DNA
<213> 智人
<400> 607
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<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 608
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<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 609
<210> 610
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 610
<210> 611
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 611
<210> 612
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 612
<210> 613
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 613
<210> 614
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 614
<210> 615
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 615
<210> 616
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 616
<210> 617
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 617
<210> 618
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 618
<210> 619
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 619
<210> 620
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 620
<210> 621
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 621
<210> 622
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 622
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<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
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<210> 624
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 624
<210> 625
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 625
<210> 626
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 626
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 627
<210> 628
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
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<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
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<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
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<210> 631
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
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<210> 632
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 632
<210> 633
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 633
<210> 634
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 634
<210> 635
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 635
<210> 636
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 636
<210> 637
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 637
<210> 638
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 638
<210> 639
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 639
<210> 640
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 640
<210> 641
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 641
<210> 642
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 642
<210> 643
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 643
<210> 644
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 644
<210> 645
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 645
<210> 646
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 646
<210> 647
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
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<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
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<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 649
<210> 650
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 650
<210> 651
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
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<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
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<211> 19
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 小鼠
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<210> 655
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 655
<210> 656
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 656
<210> 657
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 657
<210> 658
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 658
<210> 659
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 659
<210> 660
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 660
<210> 661
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 661
<210> 662
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 662
<210> 663
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 663
<210> 664
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 664
<210> 665
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 665
<210> 666
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 666
<210> 667
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 667
<210> 668
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 668
<210> 669
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 669
<210> 670
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 670
<210> 671
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 671
<210> 672
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 672
<210> 673
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 673
<210> 674
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 674
<210> 675
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 675
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<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 676
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<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 677
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<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 678
<210> 679
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 679
<210> 680
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 680
<210> 681
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 681
<210> 682
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 682
<210> 683
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 683
<210> 684
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 684
<210> 685
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 685
<210> 686
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 686
<210> 687
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 687
<210> 688
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 688
<210> 689
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 689
<210> 690
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 690
<210> 691
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 691
<210> 692
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 692
<210> 693
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 693
<210> 694
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 694
<210> 695
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 695
<210> 696
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 696
<210> 697
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 697
<210> 698
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 698
<210> 699
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 699
<210> 700
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 700
<210> 701
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 701
<210> 702
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 702
<210> 703
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 703
<210> 704
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成肽”
<400> 704
<210> 705
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成聚核苷酸”
<400> 705
<210> 706
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成肽”
<400> 706
<210> 707
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 707
<210> 708
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<400> 708
<210> 709
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述:合成多肽”
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> /備註=“此序列可涵蓋1-10個"Gly Gly Gly Ser"重複單元”
<400> 709
Claims (102)
- 一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之分離之核酸分子,其中該CAR包含CD123結合域、跨膜域及胞內信號傳導域,且其中該CD123結合域包含表9、表2或表6中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
- 如請求項1之分離之核酸分子,其中該CD123結合域進一步包含表9、表2或表6中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
- 如請求項2之分離之核酸分子,其中該LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3為表11、表13、表4或表8中所列之LC CDR序列。
- 如請求項1至3中任一項之分離之核酸分子,其中該HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3為表10、表12、表3或表7中所列之HC CDR序列。
- 如請求項1至4中任一項之分離之核酸分子,其編碼包含以下之CAR:(i)表9或表2中所列之任何輕鏈可變區之胺基酸序列;(ii)具有表9或表2中所提供之該等輕鏈可變區任一者之該胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列;或(iii)與表9或表2中所提供之該等輕鏈可變區任一者之該胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至5中任一項之分離之核酸分子,其編碼包含以下之CAR: (i)表9或表2中所列之任何重鏈可變區之胺基酸序列;(ii)具有表9或表2中所提供之該等重鏈可變區任一者之該胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列;或(iii)與表9或表2中所提供之該等重鏈可變區任一者之該胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項之分離之核酸分子,其編碼包含表9或表2中所列之任何輕鏈可變區之該胺基酸序列及表9或表2中所列之任何重鏈可變區之該胺基酸序列的CAR。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中該編碼之CD123結合域包含:(i)選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278或275;(ii)相對於以下任一者具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列:SEQ ID NO:480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278或275;或(iii)與以下任一者具有95-99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278或275。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中該CD123結合域包含選自由SEQ ID NO:479、481、482、484組成之群的核苷酸序列或與其具有95-99%一致性之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中該編碼之CAR包括跨膜域,其包含選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域:T細 胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中:(i)該編碼之跨膜域包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列、包含該SEQ ID NO:6之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列或與該SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列;或(ii)編碼該跨膜域之核酸序列包含SEQ ID NO:17之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中該編碼之CD123結合域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域。
- 如請求項12之核酸分子,其中:(i)編碼之鉸鏈區包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列,或包含至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與其具有95-99%一致性之胺基酸序列;或(ii)編碼該鉸鏈區之核酸序列包含SEQ ID NO:13之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中編碼之共刺激域為自選自由以下組成之群的蛋白質獲得之功能性信號傳導域:MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、 KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。
- 如請求項14之分離之核酸分子,其中該編碼之共刺激域包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列,或具有該SEQ ID NO:7之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與該SEQ ID NO:7之胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如請求項14之分離之核酸分子,其中編碼該共刺激域之核酸序列包含SEQ ID NO:18之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中該編碼之胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中該編碼之胞內信號傳導域包含該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9 或SEQ ID NO:10之胺基酸序列;或具有該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或該SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列;或與該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或該SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中該編碼之胞內信號傳導域包含該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及該SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列,其中構成該胞內信號傳導域之該等序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其中編碼該胞內信號傳導域之核酸序列包含SEQ ID NO:18之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性之核苷酸序列,及/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21之核苷酸序列或與其具有95-99%一致性之核苷酸序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其進一步包含編碼SEQ ID NO:1之胺基酸序列之前導序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其編碼包含以下之CAR:(i)SEQ ID NO:99、100、101或98中任一者之胺基酸序列;(ii)相對於SEQ ID NO:99、100、101或98中任一者具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列;或(iii)與SEQ ID NO:99、100、101或98中任一者具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之分離之核酸分子,其包含SEQ ID NO:39、40、41或38中任一者之核苷酸序列,或與SEQ ID NO:39、40、41或38中任一者具有95-99%一致性之核苷酸序列。
- 一種分離之多肽分子,其由如請求項1至23中任一項之核酸分子編碼。
- 一種分離之嵌合抗原受體(CAR)多肽,其中該CAR包含包括CD123結合域、跨膜域及包含共刺激域及/或主要信號傳導域之胞內信號傳導域的抗體或抗體片段,且其中該CD123結合域包含表9、表2或表6中所列之任何CD123重鏈結合域胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
- 如請求項25之分離之CAR多肽,其中該CD123結合域進一步包含表9、表2或表6中所列之任何CD123輕鏈結合域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)。
- 如請求項26之分離之CAR多肽,其中該LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3為表11、表13、表4或表8中所列之LC CDR序列。
- 如請求項25至27中任一項之分離之CAR多肽,其中該HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3為表10、表12、表3或表7中所列之HC CDR序列。
- 如請求項25至28中任一項之分離之CAR多肽,其包含:(i)表9或表2中所列之任何輕鏈可變區之胺基酸序列;(ii)具有表9或表2中所提供之該輕鏈可變區任一者之該胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列;或(iii)與表9或表2中所提供之該輕鏈可變區任一者之該胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如請求項25至29中任一項之分離之CAR多肽,其包含:(i)表2或表9中所列之任何重鏈可變區之胺基酸序列; (ii)具有表2或表9中所提供之該重鏈可變區任一者之該胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列;或(iii)與表2或表9中所提供之該重鏈可變區任一者之該胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如請求項25至30中任一項之分離之CAR多肽,其包含表2或表9中所列之任何輕鏈可變區之該胺基酸序列及表2或表9所列之任何重鏈可變區之該胺基酸序列。
- 如請求項25至31中任一項之分離之CAR多肽,其包含:(i)選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278或275;(ii)相對於以下任一者具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列:SEQ ID NO:480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278或275;或(iii)與以下任一者具有95-99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278或275。
- 如請求項25至32中任一項之分離之CAR多肽,其中該跨膜域包含來自選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜域:T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
- 如請求項25至33中任一項之分離之CAR多肽,其中:(i)該跨膜域包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列, (ii)胺基酸序列包含該SEQ ID NO:6之胺基酸序列之至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾,或(iii)與該SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。
- 如請求項25至34中任一項之分離之CAR多肽,其中該CD123結合域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域。
- 如請求項35之分離之CAR多肽,其中該鉸鏈區包含SEQ ID NO:2或與其具有95-99%一致性之序列。
- 如請求項25至36中任一項之分離之CAR多肽,其中該共刺激域為自選自由以下組成之群的蛋白質獲得之功能性信號傳導域:MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、 IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體。
- 如請求項25至37中任一項之分離之CAR多肽,其中該共刺激域包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列,或具有該SEQ ID NO:7之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列,或與該SEQ ID NO:7之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。
- 如請求項25至37中任一項之分離之CAR多肽,其中該胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導域。
- 如請求項25至39中任一項之分離之CAR多肽,其中該胞內信號傳導域包含該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列;或具有該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或該SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列的至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列;或與該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及/或該SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如請求項25至40中任一項之分離之CAR多肽,其中該胞內信號傳導域包含該SEQ ID NO:7之胺基酸序列及該SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10之胺基酸序列,其中構成該胞內信號傳導域之該等胺基酸序列在相同框架中表現且以單個多肽鏈形式表現。
- 如請求項25至41中任一項之分離之CAR多肽,其進一步包含含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之前導序列。
- 如請求項25至42中任一項之分離之CAR多肽,其包含:(i)SEQ ID NO:99、100、101或98中任一者之胺基酸序列; (ii)相對於SEQ ID NO:99、100、101或98中任一者具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列;或(iii)與SEQ ID NO:99、100、101或98中任一者具有95-99%一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至23中任一項之核酸分子,其為DNA分子、RNA分子或其組合。
- 如請求項44之核酸分子,其為編碼如請求項24至43之CAR多肽之mRNA。
- 一種包含如請求項1至23中任一項之核酸分子或編碼如請求項24至43中任一項之CAR多肽之核酸的載體,其中該載體為DNA載體或RNA載體。
- 如請求項46之載體,其選自由以下組成之群:質體、慢病毒載體、腺病毒載體及反轉錄病毒載體。
- 如請求項46或47之載體,其進一步包含含SEQ ID NO:11之序列之EF-1啟動子。
- 一種細胞,例如免疫效應子細胞,其包含如請求項1至23或44至45中任一項之核酸分子、如請求項24至43中任一項之CAR多肽或如請求項46至48中任一項之載體。
- 一種製成細胞、例如免疫效應子細胞之方法,其包含向免疫效應子細胞中引入,例如轉導如請求項1至23或44至45之核酸分子或如請求項46至48中任一項之載體。
- 一種產生細胞群體之方法,其包含將RNA引入細胞中,其中該RNA包含如請求項1至23或44至45中任一項之核酸分子或編碼如請求項24至43中任一項之CAR多肽的核酸。
- 一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫之方法,其包含向該哺乳動 物投與有效量之包含如請求項1至23中任一項之核酸分子或如請求項24至43中任一項之CAR多肽的細胞,例如免疫效應子細胞群體。
- 如請求項52之方法,其中該細胞為自體T細胞或同種異體T細胞。
- 一種治療患有與CD123表現相關聯之疾病的哺乳動物之方法,其包含向該哺乳動物投與有效量之包含如請求項1至23或44至45中任一項之核酸分子或如請求項24至43中任一項之CAR多肽的細胞,例如免疫效應子細胞群體。
- 如請求項54之方法,其中與CD123表現相關聯之該疾病為:(i)癌症或惡性腫瘤,(ii)癌前病狀,或(ii)與CD123表現相關聯之非癌症相關適應症。
- 如請求項54或55之方法,其中該疾病為血液癌或白血病前期。
- 如請求項54至56中任一項之方法,其中該疾病選自以下各者中之一或多者:急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性淋巴母細胞性B細胞白血病(B細胞急性淋巴白血病,BALL)、急性淋巴母細胞性T細胞白血病(T細胞急性淋巴白血病(TALL))、B細胞前淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓白血病(CML)、毛細胞白血病、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、組織細胞病症、肥大細胞病症、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、骨髓增殖性贅瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或其組合。
- 如請求項52至57中任一項之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體與以下各者中之一或多者組合投與:(i)增加包含該CAR核酸或CAR多肽之該細胞之功效的試劑; (ii)改善與投與包含該CAR核酸或CAR多肽之該細胞相關聯之一或多種副作用的試劑;或(iii)治療與該CD123表現相關聯之該疾病的試劑。
- 如請求項52至58中任一項之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體包含編碼如請求項24至43之CAR多肽之mRNA。
- 如請求項52至58中任一項之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體包含含如請求項1至23中任一項之核酸分子或編碼如請求項24至43之CAR多肽的慢病毒載體。
- 如請求項52至57之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體與第二治療劑或選自以下各者中之一或多者的程序組合投與:化學療法、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞激素、手術程序、輻射程序、共刺激分子促效劑、免疫檢查點分子抑制劑、疫苗或基於第二CAR之免疫療法。
- 如請求項52至61之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體與選自以下各者中之一或多者的共刺激分子之促效劑組合投與:OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配位體。
- 如請求項52至61之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體與選自以下各者中之一或多者的免疫檢查點分子之抑制劑組合投與:PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷或TGFR,例如TGFRβ。
- 如請求項61之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體與PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、CEACAM-1抑制劑或其組合進行組合投與。
- 如請求項64之方法,其中該PD-1抑制劑與該TIM-3抑制劑以組合形式投與。
- 如請求項64之方法,其中該TIM-3抑制劑與該CEACAM-1抑制劑以組合形式投與。
- 如請求項61至66中任一項之方法,其中該促效劑或該抑制劑為抗體分子,例如單特異性抗體分子或雙特異性抗體分子。
- 如請求項61至67中任一項之方法,其中該抑制劑在投與該細胞,例如該免疫效應子細胞群體之後投與。
- 如請求項68之方法,其中該抑制劑在投與該細胞,例如該免疫效應子細胞群體之後約3-7天投與。
- 如請求項52至57之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體與CD19抑制劑組合投與。
- 如請求項70之方法,其中該CD19抑制劑為表現CD19 CAR之細胞或抗CD19抗體分子。
- 如請求項54至71中任一項之方法,其中該疾病為CD19陰性癌症,例如CD19陰性復發性癌症。
- 一種預防哺乳動物中CD19陰性復發之方法,其包含向該哺乳動物投與有效量之包含如請求項1至23或44至45中任一項之核酸或如請求項24至43中任一項之多肽的細胞,例如免疫效應子細胞群體。
- 如請求項73之方法,其進一步包含投與CD19抑制劑,例如表現CD19 CAR之細胞。
- 如請求項54至74中任一項之方法,其中該疾病為白血病,例如 急性淋巴母細胞性白血病(例如,復發性及難治性ALL)或AML。
- 如請求項70至75中任一項之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體在投與該CD19抑制劑之後投與。
- 如請求項70至75中任一項之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體與該CD19抑制劑並行投與。
- 如請求項52至75或77中任一項之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體表現CD19 CAR及CD123 CAR。
- 如請求項77或78之方法,其中該CD19 CAR或CD123 CAR包含分裂胞內信號傳導域,使得與在該CD19 CAR及CD123 CAR與表現CD19或CD123中之一者的靶細胞(例如,造血幹細胞)結合時活化相比,在該CD19 CAR及CD123 CAR與靶細胞,例如標靶CD19+CD123+細胞(例如,B-ALL母細胞)結合時發生該細胞,例如該免疫效應子細胞群體完全活化。
- 如請求項79之方法,其中該CD123 CAR包含4-1BB信號傳導域且該CD19 CAR包含CD3 ξ信號傳導域。
- 如請求項52至60中任一項之方法,其進一步包含在用該細胞,例如該免疫效應子細胞群體治療後投與T細胞耗盡劑,藉此減少(例如,耗盡)該細胞(例如,該表現CD123 CAR之細胞)。
- 一種在CAR療法之後減少(例如,耗盡)表現CD123 CAR之細胞的方法,其包含在用包含如請求項1至23或44至45中任一項之核酸分子或如請求項24至43中任一項之CAR多肽的細胞,例如免疫效應子細胞群體治療哺乳動物後向該哺乳動物投與T細胞耗盡劑,藉此減少(例如,耗盡)該細胞(例如,該表現CD123 CAR之細胞)。
- 如請求項81或82之方法,其中該T細胞耗盡劑在投與該細胞,例如該免疫效應子細胞群體之後一週、兩週、三週、四週或五週 投與。
- 如請求項81至83中任一項之方法,其中該哺乳動物患有白血病,例如ALL或AML。
- 如請求項81至84中任一項之方法,其中該T細胞耗盡劑為CD52抑制劑。
- 如請求項85之方法,其中該CD52抑制劑為抗CD52抗體分子,例如阿侖單抗(alemtuzumab)。
- 如請求項81至86中任一項之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體表現CD123CAR多肽及由該T細胞耗盡劑識別之靶蛋白。
- 如請求項87之方法,其中該靶蛋白為CD20。
- 如請求項88之方法,其中該T細胞耗盡劑為抗CD20抗體,例如利妥昔單抗(rituximab)。
- 如請求項87至89之方法,其中該細胞,例如該免疫效應子細胞群體包含含該CD123CAR核酸之核酸(例如,載體)及編碼該靶蛋白之核酸。
- 如請求項52至90中任一項之方法,其進一步包含將細胞,例如造血幹細胞或骨髓移植至該哺乳動物中。
- 如請求項1至23或44至45中任一項之分離之核酸分子、如請求項24至43中任一項之多肽、如請求項46至48中任一項之載體或如請求項49之細胞,其用作藥物。
- 如請求項1至23或44至45中任一項之分離之核酸分子、如請求項24至43中任一項之多肽、如請求項46至48中任一項之載體或如請求項49之細胞,其用於治療與CD123表現相關聯之疾病。
- 如請求項1至23或44至45中任一項之分離之核酸分子、如請求項24至43中任一項之多肽、如請求項46至48中任一項之載體或如 請求項49之細胞,其用於治療癌症。
- 如請求項93之用途,其中該疾病選自AML、ALL、B-ALL、T-ALL、B細胞前淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、CML、毛細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、肥大細胞病症、骨髓發育不良症候群、骨髓增殖性贅瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或其組合。
- 如請求項49之細胞,例如免疫效應子細胞群體,其進一步表現嵌合分子,該嵌合分子包含含抑制性分子之至少一部分之第一多肽,該第一多肽與包含來自胞內信號傳導域之正信號之第二多肽相關聯。
- 如請求項96之細胞,其中該嵌合分子包含含PD1之至少一部分之第一多肽及包含共刺激域及主要信號傳導域之第二多肽。
- 如請求項58之方法,其中該試劑為mTOR抑制劑且向該個體投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑,例如RAD001或雷帕黴素(rapamycin)。
- 如請求項98之方法,其中投與該mTOR抑制劑持續足以在該個體之周邊血液中或自該個體分離之T細胞製劑中降低PD-1陽性T細胞之比例、增加PD-1陰性T細胞之比例或增加PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率的時間量。
- 一種在細胞移植前調理個體之方法,其包含向該個體投與有效量之包含如請求項1至23或44至45中任一項之CAR核酸分子或如請求項24至43中任一項之多肽的細胞。
- 如請求項100之方法,其中該細胞移植為幹細胞移植,例如造血幹細胞移植,或骨髓移植。
- 如請求項100或101中任一項之方法,其中在細胞移植之前調理個體包含減少個體中表現CD123之細胞,例如表現CD123之正常細胞或表現CD123之癌細胞的數目。
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