KR20210016372A - 종양 미세환경-활성화된 약물-결합제 접합체, 및 이와 관련된 용도 - Google Patents

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매튜 빈센트
훙-센 라이
암릭 바스란
윌리엄 더블유. 바초브친
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트러스티즈 오브 터프츠 칼리지
아박타 라이프 사이언시스 리미티드
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Abstract

결합제와 유리 약물 모이어티가 둘 다 약학적 활성을 갖는, 세포외에서 활성화된 결합제-약물 접합체가 개시된다.

Description

종양 미세환경-활성화된 약물-결합제 접합체, 및 이와 관련된 용도
관련 출원
본 출원은 2018년 6월 4일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/680,300호에 대한 우선권의 유익을 주장한다.
PD-1-PD-L1 상호작용은 항-PD-1/PD-L1 항체에 의해 차단될 수 있는 T 세포 기능장애를 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 연구는 또한 PD-1-PD-L1 축의 기능이 복잡한 면역 조절 네트워크에 의해 영향받는다는 것을 나타내었다. 가장 진행된 암에서, 호지킨 림프종(높은 PD-L1/L2 발현을 가짐) 및 흑색종(높은 종양 돌연변이 부담을 가짐)을 제외하고, 항-PD-1/PD-L1 단일요법에 의한 객관적 반응률은 단지 약 20%이며, 면역-관련 독성 및 급성 종양 진행은 PD-1/PD-L1 차단 요법 동안 환자의 소집단에서 일어날 수 있다. 최대 80%의 환자에서 효능의 결여는 음의 PD-1 및 PD-L1 발현과 반드시 연관되지는 않는데, 이는 면역 억제 및 항체의 작용 메커니즘에서 PD-1/PD-L1의 역할이 더 양호하게 정해진 채로 남아있다는 것을 시사한다. 마찬가지로, CTLA-4 및 다른 관문 경로에 의해 유사한 제한이 관찰되었다. 따라서, PD-1/PD-L1, CTLA-4 및 다른 관문 네트워크 내 또는 외의 중요한 상승적 면역 조절 메커니즘은 면역 관문 차단 요법의 반응 속도를 증가시키는 것, 일부 경우에 독성을 감소시키는 것을 목표로 할 필요가 있다.
이와 관련하여, 선천성 면역 반응을 유발하는 제제, 예컨대 STING, RIG-I 및 TLR 작용제는 면역-종양학 관문 저해제의 유효성을 증가시키는 잠재력을 갖는 것으로 여겨진다. 그러나, 용량 제한 독성이 신체 전체적으로 선천성 면역 활성화의 산물이기 때문에 이들 유형의 제제는 종종 전신 용도에 대해 독성이 되며, 많은 환자에서 최대 허용 용량이 치료적 용량을 달성하지는 않는다.
본 발명은 성분 중 하나, 특히 선천성 면역 유발자의 전신 독성 문제를 처리하지만, 종양 미세환경에서 프로테아제에 의해 방출될 때까지 약학적으로 비활성인 형태를 보유하는 형식으로, 특히, 2가지 부류의 치료적 제제-1종 이상의 관문 저해제와 함께 강한 면역 반응을 일으키는 종양에서 국소화된 염증 사건을 야기하는 선천성 면역의 유도자 또는 후천성 면역 반응을 촉진하거나 유지하는 공자극 작용제-의 공동 전달을 위한 새로운 시스템에 기반한다. 더 간단히 말하면, 하나의 제제는 항종양 면역 반응을 유도하고, 다른 하나의 제제는 이것이 종양에 도달될 때 작동되도록 한다. TME 효소와 함께 관문 저해제 또는 공자극 작용제는 종양 내에 약물을 위치시키도록 방출하며, 성분 약물에 대한 치료 지표를 개개로 개선시킨다.
본 발명의 일 양상은 하기를 포함하는 결합제-약물 접합체에 관한 것이다:
(i) 질환 상태의 조직에서 표적 세포 상의 세포 표면 특징에 결합하는 세포 결합 모이어티로서, 세포 표면 특징은 결합제-약물 접합체에 의해 결합될 때 느린 내재화를 겪는, 상기 세포 결합 모이어티;
(ii) 상기 표적 세포에 근접한 방관자 세포(bystander cell) 상에서 약학적 효과를 갖는 약물 모이어티로서, 약물 모이어티가 결합제-약물 접합체의 부분일 때에는 상기 결합제-약물 접합체로부터 방출된 유리 약물 모이어티에 비해 적어도 10배만큼 약화된 약학적 효과에 대한 EC50을 갖는, 상기 약물 모이어티; 및
(iii) 폴리펩타이드 결합제 모이어티를 약물 모이어티에 공유적으로 연결시키는 링커 모이어티로서, 링커 모이어티가 상기 질환 조직에서 세포외에 존재하는 효소에 의해 절단 가능한 기질 인식 서열을 포함하되, 상기 효소의 존재 하에 상기 링커 모이어티는 절단되고 상기 유리 약물 모이어티로부터 방출될 수 있는, 상기 링커 모이어티.
특정 실시형태에서, 약물 모이어티는 유리 약물 모이어티에 대한 결합제-약물 접합체의 부분이 결합제-약물 접합체로부터 방출될 때 적어도 5배만큼 약화되고, 더 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 심지어 1000배 약화된 약학적 효과에 대한 EC50을 가진다.
특정 실시형태에서, 질환 조직은 종양이다. 특정 실시형태에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 특정 실시형태에서, 표적 세포는 대식세포, 단핵구 유래 억제 세포(monocyte derived suppressor cell: MDSC), 수지상 세포, 섬유아세포, T-세포, NK 세포, 비만 세포, 과립구, 호산구 및 B-세포이다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는, 표적 세포 상의 표면 특징과 결합할 때, 내재화 반감기가 적어도 6시간, 더 바람직하게는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 36, 48, 60, 75 또는 심지어 100시간이다.
특정 실시형태에서, 세포 표면 특징은 건강한 상태의 조직으로부터의 정상 세포에 비해 질환 조직에서의 표적 세포에 의해 선택적으로 발현되거나 상향조절되는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 조직으로부터의 정상 세포보다 2배 더 높은 수준, 훨씬 더 바람직하게는 조직으로부터의 정상 세포보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 심지어 1000-배 더 높은 수준에서 표적 세포의 표면 상에서 검출 가능하다.
특정 실시형태에서, 세포 표면 특징은 다른 조직으로부터의 세포, 특히 중요한 기관으로부터의 세포에 비해 질환 조직에서 표적 세포에 의해 선택적으로 발현되거나 상향조절된 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 다른 조직으로부터의 세포보다 2배 더 높은 수준, 훨씬 더 바람직하게는 다른 조직으로부터의 세포보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 심지어 1000-배 더 높은 수준에서 표적 세포의 표면 상에서 검출 가능하다.
특정 실시형태에서, 세포 표면 특징은 관문 단백질이고, 결합제 모이어티는 해당 관문의 길항제이다. 관문 단백질의 예는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, BTLA, KIR, TIM-3, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, GAL9, CD160, VISTA, BTNL2, TIGIT, PVR, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A2 및 CSF-1R, 더 바람직하게는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, VISTA, HVEM, TIGIT, PVR, PD-L1 및 CD160으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 표면 특징은 공자극 수용체이고, 결합제 모이어티는 수용체의 공자극 작용제이다. 예는 4-1BB, 4-1BB-L, OX40, OX40-L, GITR, CD28, CD40, CD40-L, ICOS, ICOS-L, LIGHT, 및 CD27, 더 바람직하게는 4-1BB, OX40, GITR, CD40 및 ICOS로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 수용체 또는 리간드인 표면 특징을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 결합 모이어티는 항체, 예컨대 인간화된 항체, 인간 항체, 또는 키메라 항체이거나, 또는 세포 표면 특징, 예컨대 Fab, F(ab)2, F(ab'), F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv, 이황화 연결된 Fv, dAb 또는 sdAb(또는 나노바디), CDR, scFv, (scFv)2, 다이-scFv, 바이-scFv, tascFv(탠덤 scFv), 아비바디(AVIBODY)(예를 들어, 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 테트라바디), T-세포 관여자(BiTE), scFv-Fc, Fcab, mAb2, 소형 모듈 면역약제(SMIP), Genmab/유니바디(unibody) 또는 듀오바디(duobody), V-NAR 도메인, IgNAR, 미니바디, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, 인트라바디 또는 다중특이성 항체에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다.
다른 실시형태에서, 결합제 모이어티는, 예컨대 애피바디(Affibody), 아피머(Affimer), 아필린(Affilin), 안티칼린(Anticalin), 아트리머(Atrimer), 아비머(Avimer), DARPin, FN3 스캐폴드(예를 들어, 어드넥틴(Adnectin) 및 센티린(Centyrin)), 파이노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인, 나노피틴(Nanofitin), 프로넥틴(Pronectin), 오바디(OBody), 트라이바디(tribody), 아비머, 이환식 펩타이드 및 Cys-노트(Cys-knot)로부터 선택된, 비-항체 스캐폴드이다.
특정 실시형태에서, 링커 모이어티는 질환 조직에 존재하는 동일 또는 상이한 효소에 의해 절단 가능한 2, 3 또는 심지어 4개의 기질 인식 서열을 포함하되(이 중 적어도 하나는 세포 외에 존재함), 다양한 효소의 동시 또는 연속적 존재 하에, 링커 모이어티는 유리 약물 모이어티를 방출하기 위해 완전히 절단될 수 있다. 예를 들어, MMP와 FAPα 둘 다에 의한 절단을 필요로 하는 두 상이한 기질 인식 서열을 갖는 링커가 생성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 두 효소 중 하나에 의한 절단은 다른 효소에 의해 처음 일어나는 절단을 필요로 하며 - 즉, MMP 절단은 무손상일 때 FAPα에 대한 불량한 기질인 링커를 생성함으로써 FAPα 절단 전에 필요할 수 있고, MMP 절단이 일어난 후에 FAPα에 의한 절단을 위한 기질로서 개선된다.
추가로 설명하기 위해, 결합제-약물 접합체는 하기 화학식 중 하나로 나타낼 수 있다:
Figure pct00001
식 중,
CBM은 각각의 경우에 대해 동일 또는 상이할 수 있는 세포 결합 모이어티를 나타내고;
L1은 스페이서 또는 결합을 나타내며;
SRS는 기질 인식 서열을 나타내고;
L2는 자기 희생(self immolative) 링커 또는 결합을 나타내며;
DM은 약물 모이어티를 나타내고;
m은 1 내지 6의 정수를 나타내며; 그리고
n은 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 100, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
특정 실시형태에서, L1은 탄화수소(직쇄 또는 환식), 예컨대 6-말레이미도카프로일, 말레이미도프로판오일 및 말레이미도메틸 사이클로헥산-1-카복실레이트이거나, 또는 L1은 N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트, N- 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트, N-석신이미딜(4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트이다.
특정 실시형태에서, L1은 폴리에터, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 다른 친수성 링커이다. 예를 들어, CBM이 티올(예컨대 시스테인 잔기)을 포함하는 경우에, L1은, 예컨대 하기 화학식에 나타내는 말레이미드 모이어티를 통해 티올기에 결합된 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다:
Figure pct00002
식 중, p는 1 내지 100, 바람직하게는 6 내지 50, 더 바람직하게는 6 내지 12의 정수를 나타낸다.
다른 실시형태에서, CBM이 티올을 포함하고 L1이 말레이미드 모이어티를 통해 티올기에 결합된 탄화수소 모이어티인 경우에, L1은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00003
p는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
본 발명의 결합제-약물 접합체의 특정 실시형태에서, 기질 인식 서열은 세포외 프로테아제, 바람직하게는 세린 프로테아제, 메탈로프로테아제 또는 표적 조직의 세포외 도메인에 위치된 프로테아제 활성을 갖는 시스테인 프로테아제에 의해 - 즉, 세포-표면 프로테아제 또는 분비된/방출된 프로테아제로서 절단된다.
특정 실시형태에서, 환자의 질환 상태의 조직에서 세포외에 존재하는 프로테아제는 환자의 건강한 상태의 조직에서 세포외에 존재하는 것보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 심지어 1000-배 더 높은 수준이다.
특정 실시형태에서, 환자에서 질환 상태의 조직에서 세포외에 존재하는 프로테아제는 환자의 다른 조직보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 심지어 1000-배 더 높은 수준이다.
특정 실시형태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase)이다. 매트릭스 메탈로프로테이나제는 막 결합된 매트릭스 메탈로프로테이나제(예컨대 MMP14-17 및 MMP24-25) 또는 분비된 매트릭스 메탈로프로테이나제(예컨대 MMP1-13 및 MMP18-23 및 MMP26-28)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 메탈로프로테이나제는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP4, MMP9, MMP11, MMP13, MMP14, MMP17 또는 MMP19이고, 더 바람직하게는 MMP2, MMP9 또는 MMP14이다.
특정 실시형태에서, 프로테아제는 A 디스인테그린(A Disintegrin) 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 또는 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 A 디스인테그린 또는 메탈로프로테이나제(ADAMTS)이다.
특정 실시형태에서, 프로테아제는 레구메인, 매트립타제(MT-SP1), 호중구 엘라스타제, TMPRSS, 트롬빈, u-형 플라스미노겐 활성체(uPA, 유로키나제로도 지칭됨), PSMA 또는 CD10(CALLA)이다.
특정 실시형태에서, 프로테아제는 프롤린 후 절단 프로테아제, 예컨대 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)이다.
대상 결합제-약물 접합체의 특정 실시형태에서, 기질 인식 서열은 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)에 의해 절단되며, 하기 식으로 나타낸다:
Figure pct00004
식 중,
R2는 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 H이며;
R3은 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 또는 아이소프로필, 및 더 바람직하게는 메틸이고;
R4는 존재하지 않거나 또는 (C1-C6) 알킬, -OH, -NH2, 또는 할로겐을 나타내며;
X는 O 또는 S를 나타내고; 그리고
-NH-는 L2가 자기 희생 링커라면 L2의 부분이거나 또는 L2가 결합이라면 DM의 부분인 아민을 나타낸다.
특정 실시형태에서, R2는 H이며, R3은 메틸이고, R4는 존재하지 않으며, X는 O이다.
특정 실시형태에서, L2는 -NH-(CH2)4-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, p-아미노벤질옥시카보닐(PABC) 및 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린으로 이루어진 군으로부터 선택된 자기 희생 링커이다. 특정 실시형태에서, p-아미노벤질옥시카보닐(PABC)이 FAP□에 대한 P'1 특이성 요구를 충족시키기 때문에, 특히 FAP□에 의해 절단되는 대상 인식 서열의 경우에, L2는 p-아미노벤질옥시카보닐(PABC)이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티가 세포내 표적와 상호작용하고, 약물 모이어티의 약학적 효과가 세포 침투성인 유리 약물 모이어티에 의존하고, 즉, 세포내 표적과 상호작용할 수 있는 반면, 결합제-약물 접합체의 부분일 때, 약물 모이어티는 실질적으로 세포 침투성이다. 예를 들어, 세포내로 결합제-약물 접합체의 축적 비율은 유리 약물 모이어티의 50% 미만의 비율, 더 바람직하게는 25%, 10%, 5%, 1% 미만 또는 심지어 유리 약물 모이어티에 대해 0.1% 미만의 비율이다. 예를 들어, 유리 약물 모이어티의 약학적 효과에 대한 EC50는 결합제-약물 접합체(보다 더 강력)의 적어도 2배 미만이고, 더 바람직하게는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500 또는 심지어 1000 미만의 결합제-약물 접합체이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 세포외 표적과 상호작용하며, 약물 모이어티의 약학적 효과는 L1에 공유적으로 연결될 때 실질적으로 약화된다. 예를 들어, 유리 약물 모이어티의 약학적 효과에 대한 EC50는 결합제-약물 접합체(보다 더 강력)의 적어도 2배 미만이고, 더 바람직하게는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500 또는 심지어 1000 미만의 결합제-약물 접합체이다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 유리 약물 모이어티의 전신 전달보다 적어도 2배 더 크고, 훨씬 더 바람직하게는 유리 약물 모이어티의 전신 전달보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500 또는 심지어 1000배 더 큰 전신으로 전달될 때의 치료 지수를 가진다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 선천성 면역 경로 반응의 면역 활성제 및/또는 유도체로서 작용하는 약물을 포함하는 면역조절제이다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 IFN-α의 생산을 유도한다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 전염증 사이토카인의 생산을 유도한다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 IL-1β의 생산을 유도한다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 IL-18의 생산을 유도한다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 NK, γδT 및 CD8+ T 세포를 유도하는 효과기 세포의 확장 및 생존을 촉진시킨다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 DPP8 및 DPP9의 효소 활성을 저해하고, 시험관내 및/또는 생체내 대식세포 파이롭토시스를 유도하는 면역-DASH 저해제이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 손상-연관 분자 패턴 분자이다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 병원균-연관 분자 패턴 분자이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 STING 작용제이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 RIG-1 작용제이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 Toll-유사 수용체(Toll-like receptor: TLR) 작용제, 예컨대 TLR1/2 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6/2 작용제, TLR7 작용제, TLR7/8 작용제, TLR7/9 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, 및 TLR11 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 TLR3 작용제, TLR7 작용제, TLR7/8 작용제, 및 TLR9 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 환식 다이뉴클레오타이드이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 ADU-S100이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 RIG-I 작용제이되, RIG-I 작용제는 KIN700, KIN1148, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400, KIN2000 또는 SB-9200이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 S-27609, CL307, UC-IV150, 이미퀴모드(imiquimod), 가르디퀴모드(gardiquimod), 레시퀴모드(resiquimod), 모톨리모드, VTS-1463GS-9620, GSK2245035, TMX-101, TMX-201, TMX-202, 이사토리빈(isatoribine), AZD8848, MEDI9197, 3M-051, 3M-852, 3M-052, 3M-854A, S-34240, KU34B 또는 CL663으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 암 연관 섬유아세포(CAF)이다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 M1 대식세포에 대해 종양 연관 대식세포 집단을 양극화하고/하거나 M2 대식세포 면역억제 활성을 저해한다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 T-세포 프라이밍 및/또는 수지상 세포 수송을 가속화한다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는, 예컨대, 면역억제 작용 또는 림프절 및/또는 종양 미세환경으로의 이동을 차단시킴으로써 Treg 세포를 저해하거나 고갈시킨다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 치료 지수(TI)가 전신으로 제공될 때, 유리 약물 모이어티에 대한 치료 지수보다 적어도 5배 더 크고, 더 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 75 또는 심지어 100배 더 크다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 저분자량 저해제이며, 즉, 분자량이 5000amu 미만, 바람직하게는 2500amu 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1500amu 미만이다.
본 발명의 다른 양상은 하나 이상의 작은 도메인 결합 폴리펩타이드 서열(예컨대 항체 단편 또는 비-항체 스캐폴드), 바람직하게는 종양 내 세포 상의 세포 표면 단백질에 결합하는 하나 이상의 아피머(affimer) 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 하나 이상의 약물-접합체 모이어티가 현수된 결합제-약물 접합체를 제공하며, 약물-접합체 모이어티는 하기 화학식으로 나타낸다:
Figure pct00005
식 중,
L1은 스페이서 또는 결합을 나타내며;
SRS는 종양의 세포외 공간에서 발현되는 세포외 프로테아제에 대한 기질 인식 서열을 나타내고;
L2는 자기 희생 링커 또는 결합을 나타내며;
DM은 약물 모이어티를 나타내고;
m은 1 내지 6의 정수를 나타내며, 바람직하게는 1, 2 또는 3이고; 그리고
n은 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 100, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
결합제-약물 접합체는, 표적 세포 상의 표면 특징과 결합할 때, 내재화 반감기가 적어도 6시간, 더 바람직하게는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 36, 48, 60, 75 또는 심지어 100시간이다.
특정 실시형태에서, 작은 도메인 결합 폴리펩타이드 서열 중 적어도 하나는 PD-L1 결합 모이어티이다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 폴리펩타이드는 1×10-6M 이하인 Kd(더 바람직하게는 1×10-7M, 1×10-8M, 1×10-9M, 1×10-10M, 또는 심지어 1×10-11M 이하이며, 특히 실시형태에서, 폴리펩타이드가 PD-L1 결합에 대해 2가 또는 더 고차의 다가인, Kd)로 PD-L1에 결합하고, 이것이 결합하는 PD-L1과 PD-L1의 상호작용을 저해한다.
본 발명의 다른 양상은
(i) 종양에서 두 상이한 세포 유형 상의 두 상이한 세포 표면에 선택적으로 결합하는 둘 이상의 상이한 결합 도메인 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및
(ii) 하기 화학식으로 나타내는 폴리펩타이드에 현수된 하나 이상의 약물-접합체 모이어티
를 포함하는 다중특이성 결합제-약물 접합체를 제공한다:
Figure pct00006
식 중,
L1은 스페이서 또는 결합을 나타내며;
SRS는 종양의 세포외 공간에서 발현되는 세포외 프로테아제에 대한 기질 인식 서열을 나타내고;
L2는 자기 희생 링커 또는 결합을 나타내며;
DM은 약물 모이어티를 나타내고;
m은 1 내지 6의 정수를 나타내며, 바람직하게는 1, 2 또는 3이고; 그리고
n은 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 100, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
다중특이성 결합제-약물 접합체는, 표면 단백질 중 하나와 결합할 때, 내재화 반감기가 적어도 6시간, 더 바람직하게는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 36, 48, 60, 75 또는 심지어 100시간이다.
다중특이성 결합제-약물 접합체의 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 종양 세포 항원에 선택적으로 결합하는 제1 결합 도메인 폴리펩타이드 서열 및 대식세포, 단핵구 유래 억제 세포(MDSC), 수지상 세포, 섬유아세포, NK 세포, 비만 세포, 과립구, 호산구 및 B-세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포에 선택적으로 결합하는 제2 결합 도메인 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
다중특이성 결합제-약물 접합체의 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 관문 저해제 또는 공자극 작용제이며 종양 침윤성 림프구 상에서 발현된 관문 단백질 또는 공자극 수용체(예컨대 관문의 경우에 LAG-3, TIM-3, TIGIT, PD-1, BTLA 또는 CTLA-4, 및 공자극 단백질의 경우에 CD28, ICOS, OX40, GITR, CD137 또는 CD27)에 결합하는, 제1 결합 도메인 폴리펩타이드 서열, 및 종양 세포 상에서 발현된 관문에 결합하는 관문 저해제(예컨대 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, CD155, HVEM 또는 갈렉틴(galectin)-9)인, 제2 결합 도메인 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 선천성 면역 반응의 무익한(sterile) 유도제(예컨대 면역-DASH 저해제, STING 작용제, TRL7/8 작용제 또는 RIG-1 작용제)인 PD-L1 결합 폴리펩타이드 및 이에 접합된 약물 모이어티를 포함하는 PD-L1 저해제/선천성 면역 자극제 조합물에 관한 것이되, PD-L1 결합 폴리펩타이드는 환자의 다른 조직에 대해 종양 내 PD-L1 저해제/선천성 자극제의 축적을 야기하고, 약물 모이어티는 환자의 다른 조직에 대해 종양 미세환경에서 PD-L1 결합 폴리펩타이드로부터 선택적으로 방출된다.
본 발명의 약물-접합체의 특정 실시형태에서, 분자는 1×10-6M 이하의 Kd로(더 바람직하게는 1×10-7M, 1×10-8M 1×10-9M 1×10-10M 이하의 Kd로) PD-L1에 결합하는 아피머 폴리펩타이드 서열인 PD-L1 결합 모이어티를 포함하며, 이것이 결합하는 PD-L1과 PD-1와의 상호작용을 저해한다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 인간 PD-L1에 결합하고, 인간 PD-1과의 상호작용을 차단한다. 특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 1×10-7M 이하의 Kd, 1×10-8M 이하의 Kd, 1×10-9M 이하의 Kd, 또는 심지어 1×10-10M 이하의 Kd로 PD-L1에 결합한다. 특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 10-3 s-1 또는 더 느린, 10-4 s-1 또는 더 느린, 또는 심지어 10-5 s-1 또는 더 느린 Koff로 PD-L1에 결합한다. 특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 103 M-1s-1 또는 더 빠른, 104 M-1s-1 또는 더 빠른, 105 M-1s-1 또는 더 빠른, 또는 심지어 106 M-1s-1 또는 더 빠른 Kon로 PD-L1. 특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 1μM 이하, 100nM 이하, 40nM 이하, 20nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 또는 심지어 0.1nM 이하의 인간 PD-1과의 경쟁적 결합 분석에서의 IC50으로 PD-L1에 결합한다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 Tm이 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상, 80℃ 이상 또는 85℃ 이상이다. 특정 실시형태에서, 단백질은 Tm이 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상, 80℃ 이상 또는 85℃ 이상이다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 식 (I)로 나타내는 아미노산 서열을 가진다:
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
식 중,
FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(서열번호 1)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열이고;
FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(서열번호 2)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드이며;
FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(서열번호 3)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
Xaa는 각각의 경우에 대해 개별적으로 아미노산 잔기이며; 그리고
n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이다.
특정 실시형태에 대해, FR1은 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다. 특정 실시형태에 대해, FR2는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다. 특정 실시형태에 대해, FR3은 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 FR1, FR2 및/또는 FR3에 대응하는 아피머 서열 영역의 일부에서, 더 바람직하게는 아피머 내 아미노산 잔기로의 치환으로 제공될 것이며, 이의 측쇄는 용매 접근 가능하며, 아피머의 다른 부분과의 수소 결합에 관여하지 않는다. 일반적으로, 시스테인은 루프 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 내로 도입되지 않을 것이다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 하기 식으로 나타내는 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00007
식 중,
Xaa는 각각의 경우에 대해 개별적으로 아미노산 잔기이며;
n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이고;
Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp 또는 Glu이며;
Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser 또는 Thr이며;
Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이며;
Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고; 그리고
Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이다.
특정 실시형태에 대해, Xaa1은 Gly, Ala, Arg 또는 Lys이고, 훨씬 더 바람직하게는 Gly 또는 Arg이다. 특정 실시형태에 대해, Xaa2는 Gly 또는 Ser이다. 특정 실시형태에 대해, Xaa3은 Arg Arg, Lys, Asn 또는 Gln, 더 바람직하게는 Lys 또는 Asn이다. 특정 실시형태에 대해, Xaa4는 Gly 또는 Ser이다. 특정 실시형태에 대해, Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro, 더 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Pro, 훨씬 더 바람직하게는 Leu 또는 Pro이다. 특정 실시형태에 대해, Xaa6은 Ala, Val, Asp 또는 Glu, 훨씬 더 바람직하게는 Ala 또는 Glu이다. 특정 실시형태에 대해, Xaa7은 Ile, Leu 또는 Arg, 더 바람직하게는 Leu 또는 Arg이다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 바람직하게는 루프 서열 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 이외의 아피머 서열의 일부에서 제공될 것이다. 따라서, 서열번호 4는 해당 서열의 변하는 위치에서 아미노산 잔기 대신에 1 내지 5개의 시스테인을 포함할 것이다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 하기 식으로 나타내는 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00008
식 중, Xaa는 각각의 경우에 대해 개개로 아미노산 잔기이고; n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 바람직하게는 루프 서열 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 이외의 아피머 서열의 일부에서 제공될 것이다. 따라서, 서열번호 5는 해당 서열의 변하는 위치에서 아미노산 잔기 대신에 1 내지 5개의 시스테인을 포함할 것이다.
상기 서열의 특정 실시형태에서, (Xaa)n("루프 2")는 하기 식 (II)에 나타낸 아미노산 서열이다
-aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6- (II)
식 중,
aa1은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된(산성 또는 염기성) 측쇄, 더 바람직하게는 작은 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된(산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 작은 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고; 그리고
aa6은 방향족 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다.
특정 실시형태에 대해, aa1은 Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Lys 또는 Arg을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa2는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa3은 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, 더 바람직하게는 His 또는 Tyr, Trp 또는 His을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa4는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa5는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa6은 Phe, Tyr, Trp, Asp 또는 Glu; 바람직하게는 Trp 또는 Asp; 더 바람직하게는 Trp을 나타낸다.
상기 서열의 특정 다른 실시형태에서, (Xaa)n("루프 2")는 하기 식 (III)에 나타낸 아미노산 서열이다
-aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp- (III)
식 중,
aa1은 염기성 측쇄 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된(산성 또는 염기성) 측쇄, 더 바람직하게는 작은 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Tyr, Trp 또는 His을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 a 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 더 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu을 갖는 아미노산 잔기를 나타내며; 그리고
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 작은 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄; 더 바람직하게는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg을 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다.
특정 실시형태에 대해, aa1은 Lys, Arg, His, Ser, Thr, Asn 또는 Gln, 더 바람직하게는 Lys, Arg, His, Asn 또는 Gln, 훨씬 더 바람직하게는 Lys 또는 Asn을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa2는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa3은 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Tyr, Trp 또는 His을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa4는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa5는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg을 나타낸다.
상기 서열의 특정 실시형태에서, (Xaa)n ("루프 2")는 서열번호 6 내지 40으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 서열의 특정 실시형태에서, (Xaa)n ("루프 2")는 서열번호 6 내지 40으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 서열의 특정 실시형태에서, (Xaa)m("루프 4")은 하기 식 (IV)에 나타낸 아미노산 서열이다
-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15- (IV)
식 중,
aa7은 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa8은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된(산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa9는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa10은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa11은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa12는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa13은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa14는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타내고; 그리고
aa15는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 중성 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다.
특정 실시형태에 대해, aa7은 Gly, Ala, Val, Pro, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu, 훨씬 더 바람직하게는 Gly, Ala, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa8은 Asp, Glu, Lys, Arg, His, Gln, Ser, Thr, Asn, Ala, Val, Pro, Gly, Tyr 또는 Phe, 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, Lys, Arg, His 또는 Gln을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa9는 Gln, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Arg, Lys, Gly, Leu, Pro 또는 Tyr, 훨씬 더 바람직하게는 Gln, Thr 또는 Asp을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa10은 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Gln, Asn, Ala, Leu, Tyr, Trp, Pro 또는 Gly, 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, His, Gln, Asn, Leu, Trp 또는 Gly을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa11은 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Arg, Lys, His, Val, Ile, Tyr 또는 Gly 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Lys 또는 His을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa12는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Asn, Lys, Arg, Val, Leu, Ile, Trp, Tyr, Phe 또는 Gly 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Tyr, Trp, Arg 또는 Lys을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa13은 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Pro, Asp, Glu, His, Arg, Trp, Tyr 또는 Phe, 훨씬 더 바람직하게는 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Asp 또는 Glu을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa14는 Ala, Ile, Trp, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, His, Ser, Thr, Gln 또는 Asn 훨씬 더 바람직하게는 Ala, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, Ser, Gln 또는 Asn을 나타낸다. 특정 실시형태에 대해, aa15는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln, Asn, Ala, Val, Leu, Gly 또는 Phe 훨씬 더 바람직하게는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다.
상기 서열의 특정 실시형태에서, (Xaa)n ("루프 4")는 서열번호 41 내지 75로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 서열의 특정 실시형태에서, (Xaa)n("루프 4")는 서열번호 41 내지 75로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 서열번호 76 내지 84로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성, 훨씬 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 서열번호 76 내지 84로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 서열번호 85 내지 92 중 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 336에 대응하는 암호 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일하고, 훨씬 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 암호 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 가진다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 다음에 65℃에서 0.2X SSC에서의 세척의 엄격한 조건 하에 서열번호 85 내지 92 중 어느 하나와 혼성화하는 암호 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 PD-L1 결합 아피머는 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙, 아벨루맙 및/또는 두발루맙에 의해 PD-L1 결합과 경쟁하는 방식으로 PD-L1에 결합한다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 Ile-54, Tyr-56, Glu-58, Glu-60, Asp-61, Lys-62, Asn-63, Gln 66, Val-68, Val-76, Val-111, Arg-113, Met-115, Ile-116, Ser-117, Gly-120, Ala-121, Asp-122, Tyr-123 및 Arg-125로부터 선택된 PD-L1의 적어도 10개의 잔기를 수반하는 계면을 포함하는 PD-L1을 갖는 결정 구조를 형성한다.
특정 실시형태에서, PD-L1에 대한 PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드 결합은 (a) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 T-세포 증식을 증가시키고; (b) MLR 분석에서 인터페론-γ 생산에서 증가시키고; 그리고/또는 (c) MLR 분석에서 인터류킨-2(IL-2) 분비를 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합제-약물 접합체는 PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드 또는 다른 표적 결합 모이어티에 추가로, 예시를 위해, 분비 신호 서열, 펩타이드 링커 서열, 친화도 태그, 막관통 도메인, 세포 표면 체류 서열(retention sequence), 번역 후 변형에 대한 기질 인식 서열, 단백질-단백질 상호작용을 통해 응집하는 단백질의 다량체 구조를 생성하는 다량체화 도메인, 반감기 연장 폴리펩타이드 모이어티, 조직 국소화 및 항체의 항원 결합 부위를 변경시키기 위한 폴리펩타이드 서열, 및 다른 표적 및 상이한 표적에 대한 하나 이상의 추가적인 아피머 폴리펩타이드 서열 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 아미노산 서열을 포함할 수 있는 융합 단백질이다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은, 예컨대 Fc 도메인 또는 이의 일부, 알부민 단백질 또는 이의 일부, 알부민-결합 폴리펩타이드 모이어티, 트랜스페린 또는 이의 일부, 트랜스페린-결합 폴리펩타이드 모이어티, 피브로넥틴 또는 이의 일부, 또는 피브로넥틴-결합 폴리펩타이드 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 반감기 연장 폴리펩타이드 모이어티를 포함한다.
융합 단백질이 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 경우에, 특정 실시형태에서, 이는 FcN 결합을 보유하는 Fc 도메인이다.
융합 단백질이 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 경우에, 특정 실시형태에서 Fc 도메인 또는 이의 일부는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 또는 이의 하위부류(아이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2이다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 108 또는 서열번호 109의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성, 훨씬 더 바람직하게는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 서열을 가진다.
융합 단백질이 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 경우에, 특정 실시형태에서 Fc 도메인 또는 이의 일부는 C1q 결합, 보체 의존적 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; B 세포 수용체의 하향 조절, 또는 이들의 조합의 하향조절로부터 선택된 효과기 기능을 보유한다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질이 반감기 연장 폴리펩타이드 모이어티를 포함하는 경우에, 모이어티는 단백질에 이것이 존재하지 않을 때에 비해 단백질의 혈청 반감기를 적어도 5배만큼, 더 바람직하게는 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 500배 또는 심지어 1000배만큼 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 완충제, 염 등을 더 포함하는 인간 환자에서의 치료 용도에 적합한 약제학적 제제로서 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상은 (i) 결합제-약물 접합체 또는 본 명세서에 기재된 PD-L1 저해제/선천성 면역 자극제 조합물, 및 (ii) 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 완충제, 염 등을 포함하는, 인간 환자에서 치료 용도에 적합한 약제학적 제제에 관한 것이다.
본 발명의 약물-접합체의 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 면역-DASH 저해제이다. 특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 200nM 미만의 DPP8 및 DPP9 저해를 위해 인간 대식세포에서 시험관내 세포내 IC50을 가진다. 특정 실시형태에서, DPP8 및/또는 DPP9 저해에 대한(바람직하게는 DPP8과 DPP9 둘 다에 대한) 시험관내 무세포 IC50은 100nM 미만, 10nM, 1.0nM, 0.1nM, 0.01nM 또는 심지어 0.001nM이다. 특정 실시형태에서, DPP8 및/또는 DPP9 저해(바람직하게는 DPP8과 DPP 둘 다에 대한) EnPlex IC50은 100nM 미만, 10nM, 1.0nM, 0.1nM, 0.01nM, 0.001nM(1 피코몰) 또는 심지어 0.0001nM(100 펨토몰)이다. 특정 실시형태에서, DPP8 및/또는 DPP9 저해(바람직하게는 DPP8과 DPP 둘 다에 대한) Ki는 100nM 미만, 10nM, 1.0nM, 0.1nM, 0.01nM, 0.001nM(1 피코몰) 또는 심지어 0.0001nM(100 펨토몰)이다.
특정 실시형태에서, 대상 면역-DASH 저해제는 또한 유효 항종양제인 약물 농도 범위 내에서 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 저해한다. 예를 들어, 면역-DASH 저해제는 100nM 미만, 10nM, 1.0nM, 0.1nM, 0.01nM, 0.001nM(1 피코몰) 또는 심지어 0.0001nM(100 펨토몰)의 FAP 저해를 위한 Ki를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 대상 면역-DASH 저해제는 인간 대식세포의 파이롭토시스의 유도를 위해 IC50보다 적어도 2배 더 높은, 더 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 심지어 적어도 100배 더 높은 IC50으로 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)를 저해하고 - 즉, 면역-DASH는 FAP 저해보다 파이롭토시스의 강한 유도자이다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 느린 결합 저해 역학을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 DPP4와의 상호작용에 대한 koff 속도가 1x10-4/초 미만, 더 바람직하게는 5×10-5/초 미만, 3×10-5/초 또는 심지어 1×10-5/초 미만이다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 종양-연관 대식세포 수의 감소를 야기하는 데 충분한 양으로 결합제-약물 접합체로서 환자에게 투여된다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 종양에서 단핵구 골수-유래 억제 세포를 감소시키는 데 충분한 양으로 결합제-약물 접합체로서 환자에게 투여된다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 종양에서 과립구 골수-유래 억제 세포의 T-세포 억제 활성을 감소시키는 데 충분한 양으로 결합제-약물 접합체로서 환자에게 투여된다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 치료적 유효량에서 완전한 종양 억제를 생성하는 양으로 결합제-약물 접합체로서 환자에게 투여되고, 치료적 유효량은 결합제-약물 접합체의 최대 허용 용량보다 더 적다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 결합제-약물 접합체를 단독으로 또는 PGE2 저해제, 예컨대 cPLA-2 저해제와 조합하여 환자에게 투여된다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 결합제-약물 접합체를 단독으로 또는 DPP4 저해제, 예컨대 시타글립틴, 빌다글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴 및 알로글립틴과 조합하여 환자에게 투여된다.
도 1A, 도 1B 및 도 1C: AVA04-182 Fc 융합 단백질의 구조 및 특성규명
도 2: 비아코어(Biacore)에 의해 평가한 마우스 PD-L1에 대한 AVA04-182 Fc의 결합 역학
도 3: ELISA에 의한 AVA04-182 Fc의 마우스 PD-L1/마우스 PD-1과의 경쟁
도 4: ELISA에 의한 AVA04-182 Fc의 마우스 혼합 림프구 반응
도 5A 및 도 5B: AVA04-251 Fc 융합 단백질의 구조 및 특성규명
도 6: 비아코어(Biacore)에 의해 평가한 인간 PD-L1에 대한 AVA04-251 Fc의 결합 역학.
도 7: NFAT 유전자 리포터 분석(프로메가(Promega))에 의해 평가되는 AVA04-251 Fc에 의한 PD-1/PD-L1 상호작용의 저해
도 8A, 도 8B 및 도 8C: AVA04-251 BH cys 직렬식(in-line) 융합 단백질의 구조 및 특성규명.
도 9: 화합물 6323의 화학적 구조.
도 10: 화합물 6323의 합성 반응식.
도 11: 화합물 6325의 화학적 구조.
도 12: 화합물 6325의 합성 반응식.
도 13: 말레이미드 화학을 이용하는 AVA04-251 BH cys-6323의 합성 반응식.
도 14: NHS 화학을 이용하는 AVA04-183 Fc-6325의 합성 반응식.
도 15: 공통 유전자 뮤린 방광암(MB49) 모델에서 종양 성장에 대한 병용 치료(AVA04-182 Fc + VbP)의 효과.
도 16: 공통 유전자 뮤린 방광암(MB49) 모델에서 종양 시험감염 후 종양 성장에 대한 효과.
도 17: 결장직장암의 인간화된 공통 유전자 모델(MC38 HuPD-L1)에서 종양 성장에 대한 병용 치료(AVA04-251 Fc + VbP)의 효과.
도 18: 결장직장암의 인간화된 공통 유전자 모델(MC38 HuPD-L1)에서 종양 성장에 대한 병용 치료(AVA04-251 Fc + VbP)의 효과.
도 19: 결장직장암(MC38 HuPD-L1)의 인간화된 공통 유전자 모델에서 종양 시험감염 후 종양 성장에 대한 효과.
도 20: 말레이미드 화학을 이용하는 IR Dye 800CW에 대한 접합 전에 그리고 후에 인간 PD-L1에 대한 AVA04-251 BH cys 결합의 비교.
도 21: NHS 화학을 이용하는 IR Dye 800CW에 대한 접합 전에 그리고 후에 인간 PD-L1에 대한 AVA04-251 Fc 결합의 비교.
도 22: A375 마우스 이종이식 모델에서 AVA04-251 Fc-800의 생체분포.
도 23: A375 마우스 이종이식 모델에서 AVA04-251 Fc-800의 종양 침투.
도 24: 아피머-링커-VbP 프로-드러그의 시험관내 rhFAPα 절단.
도 25: 아피머-링커-VbP 프로-드러그의 시험관내 rhFAPα 절단 역학.
도 26: 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서의 급성 독성 연구에서 VbP에 비교되는 링커-VbP 프로-드러그의 평가.
도 27: J774 마우스 대식세포 세포주에서 시험관내 아피머-링커-VbP 프로-드러그 유도 파이롭토시스.
도 28: BALB/c 마우스에서 생체내 Cys-변형된 링커-VbP 프로-드러그 유도된 G-CSF 자극.
도 29: Expi293 세포에서 일시적으로 발현되고, 단백질 A 정제 후 정제 수율이 대략 160㎎/ℓ인 이필리무맙(바이오시밀러(biosimilar))/AVA04-141.
도 30: Expi293 세포에서 일시적으로 발현되는 베바시주맙(바이오시밀러)/AVA04-251은 97% 초과의 수율로 정제될 수 있고, 비아코어는 이중 특이성 항체-아피머 융합이 작제물이 가요성 링커[(G4S)3]를 포함하든 강성의 링커[A(EAAAK)3]를 포함하든 표적 둘 다에 맞물릴 수 있다는 것을 입증한다.
도 31: Fc 융합(2가 PD-L1 결합제 형식 및 이중특이성, 2가 PD-L1 결합제 및 표적×결합제 형식을 나타냄), 다양한 형식의 직렬 항체 융합, 수용체 트랩 도메인과 항-PD-L1 아피머의 BiTE 형식 및 직렬 융합을 포함하는, 본 발명의 항-PD-L1-약물 접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 항-PD-L1 아피머 형식화의 예시적인 예. 각각의 이들 형식은 하나 이상의 약물-접합체에 의해 유도될 수 있다.
도 32: 아피머는 Fc 상의 다양한 부위에서 형식화될 수 있고, 따라서 IgG-아피머 융합으로 번역되어야 한다. 400 내지 800㎎/l 범위에서의 전형적인(최적화되지 않은) 발현 수율. 순도를 평가하기 위해 사용한 분석적 SEC-HPLC.
도 33: FAPα 기질 인식 서열, 심지어 밀접해 있는 효소, 예컨대 FAPα 및 PREP의 절단 선택성을 도시한 도면. FAPa만이 유리 약물 모이어티를 절단하고 방출할 수 있다.
도 34: DAR을 증가시키고 각각의 약물 모이어티의 효소 방출을 유지하도록 설계된 FAPα 절단성 링커를 도시한 도면. 이 링커 설계에 의해, 25, 50 또는 심지어 100개 초과의 DAR을 실현 가능하다.
도 35A 및 도 35B: FAPα는 대부분의 고형 종양의 종양 미세환경에서 선택적으로 과발현된다는 것을 도시한 도면. FAPα는 mRNA 분석(도 35A), 조직화학(도 35A) 및 효소 활성의 검출(도 35B)에 의해 입증되는 바와 같이 정상 상피 조직에 대한 악성 인간 상피 조직에서 상향 조절된다.
도 36: FAPα-활성화 링커는 FAPα에 의해 단지 선택적으로 활성화된다는 것을 도시한 도면.
도 37A 및 도 37B: 유리 약물 모이어티 Val-보로Pro는 시험관내 AML 세포주에서 파이롭토시스를 유도한다는 것을 도시한 도면. 인간 PDX 모델은 생체내 MV4-11 AML 세포(인간 급성 단핵구 백혈병 모델)에 대해 Val-보로Pro 그 자체의 효능을 보여준다. 백만개의 MV4-11 세포를 10주령의 암컷 NOD-SCID Il2rg-/- 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. Val-보로Pro를 복강내로 1일 1회 20㎎/마우스로 투여하였고 - 순환 스케줄은 5일 약물 후에, 2일을 쉰다.
도 38: 유래된 인간 PD-L1에 결합된 항-PD-L1 아피머 ACA04-261의 결정-유래 구조로부터, 도 16은 두 단백질 간의 접촉 계면에 수반된 아미노산 잔기 목록을 제공한 도면.
I. 개요
본 발명의 일 양상은 하기를 포함하는 결합제-약물 접합체에 관한 것이다:
(i) 질환 상태의 조직에서 표적 세포 상의 세포 표면 특징에 결합하는 세포 결합 모이어티로서, 세포 표면 특징은 결합제-약물 접합체에 의해 결합될 때 느린 내재화를 겪는, 세포 결합 모이어티;
(ii) 표적 세포에 근접한 방관자 세포 상에서 약학적 효과를 갖는 약물 모이어티로서, 결합제-약물 접합체로부터 방출된 유리 약물 모이어티에 비해 결합제-약물 접합체의 부분일 때, 적어도 2배만큼 약화된 약학적 효과에 대한 EC50을 갖는, 약물 모이어티; 및
(iii) 폴리펩타이드 결합제 모이어티를 약물 모이어티에 공유적으로 연결시키는 링커 모이어티로서, 링커 모이어티는 질환 조직에서 세포외에 존재하는 효소에 의해 절단 가능한 기질 인식 서열을 포함하되, 효소의 존재 하에, 링커 모이어티는 절단되고 유리 약물 모이어티로부터 방출될 수 있는, 링커 모이어티.
II. 정의　
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구를 이하에 정의한다.　
a. 아피머
용어 "스테핀(Stefin) 폴리펩타이드"는 시스타틴 슈퍼패밀리에서의 단백질의 하위 그룹을 지칭하며, 이 패밀리는 다중 시스타틴-유사 서열을 함유하는 단백질을 포함한다.
시스타틴 패밀리의 스테핀 하위 그룹은 상대적으로 작은(대략 100개의 아미노산) 단일 도메인 단백질이다. 이들은 공지된 번역 후 변형을 받지 않으며, 이황화 결합이 없는데, 이는 이들이 다양한 세포외- 및 세포내 환경에서 동일하게 폴딩될 수 있다는 것을 시사한다. 스테핀 A 그 자체는 98개 아미노산의 단량체, 단일쇄, 단일 도메인 단백질이다. 스테핀 A의 구조가 풀어져서, 아피머 스캐폴드로의 스테핀 A의 합리적 돌연변이를 용이하게 한다. 시스타틴의 공지된 생물학적 활성만이 카텝신 활성의 저해이며, 이는 본 발명자가 본 발명의 조작된 단백질의 잔여 생물학적 활성에 대한 철저한 시험을 하는 것을 가능하게 한다.
용어 "아피머"(또는 "아피머 스캐폴드" 또는 "아피머 폴리펩타이드")는 스테핀 폴리펩타이드의 재조합적으로 조작된 변이체인 작고, 고도로 안정한 단백질을 지칭한다. 아피머 단백질은 단클론성 항체와 유사한 방식으로, 높은 친화도 및 특이성을 갖는 목적하는 표적 단백질에 결합하도록 모두 무작위화될 수 있는 N-말단의 서열 및 2개의 펩타이드 루프를 나타낸다. 스테핀 단백질 스캐폴드에 의한 2개 펩타이드의 안정화는 펩타이드를 취하여서, 유리 펩타이드의 라이브러리에 비해 결합 친화도 및 특이성을 증가시킬 수 있는 가능한 입체구조를 제한한다. 이들 조작된 비-항체 결합 단백질은 상이한 적용분야에서 단클론성 항체의 분자 인식 특징을 모방하도록 설계된다. 스테핀 폴리펩타이드 서열의 다른 부분에 대한 변형이 수행될 수 있으며, 이러한 변형은 이들 친화도 시약의 특성을 개선시키고, 예컨대 안정성을 증가시켜서, 이들을 다양한 온도 및 pH 등에 걸쳐 강하게 만든다. 바람직하게는 아피머는 스테핀 A로부터 유래된 서열을 포함하여, 스테핀 A 야생형 서열, 예컨대 인간 스테핀 A과 실질적인 동일성을 공유한다. 변형은 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 스캐폴드 서열로 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 특히, 아피머 스캐폴드는 인간 스테핀 A에 대응하는 서열에 대해 적어도 25%, 35%, 45%, 55% 또는 60% 동일하고, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 94%, 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 예를 들어, 서열 변형은 목적하는 표적(예컨대 PD-L1)에 결합하는 스캐폴드의 능력에 부정적으로 영향을 미치지 않으며, 예를 들어, 생물학적 기능을 회복하거나 생성하지 않는 경우, 예컨대 야생형 스테핀 A에 의해 소유되지만 본 명세서에 기재된 돌연변이 변화가 없는 것이다.
"결합제-약물 접합체"는 아피머 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 환자에 전달하도록 의도된 치료적 활성 단백질을 나타내기 위한 임의의 다른 변형(예를 들어, 접합, 번역 후 변형 등)을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"예정 사멸(Programmed death)-리간드 1"은 "PD-L1", "분화 클러스터 274", "CD274", "B7 상동체 1" 또는 "B7-H1"로도 알려져 있으며, 인간의 경우에 CD274 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. 인간 PD-L1은 상이한 환경 하에 면역계를 억제함에 있어서 주된 역할을 하는 40kDa의 1형 막관통 단백질이다. 대표적인 인간 PD-L1 서열은 UniProtKB 일차 수탁 번호 Q9NZQ7로 제공되며, 이의 다른 인간 동형 단백질을 포함한다. PD-L1은 이의 수용체인 PD-1에 결합하며, 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수종 세포 상에서 활성화 또는 저해를 조절하는 것으로 발견된다. PD-L1은 또한 공자극 분자 CD80(B7-1)에 대해 인식 가능한 친화도를 가진다. T 세포 상에서 PD-L1과 이의 수용체인 PD-1("세포 예정사 단백질 1" 또는 "CD279")과의 맞물림은 IL-2 생산 및 T 세포 증식의 TCR-매개 활성화를 저해하는 신호를 전달한다. 이와 관련하여, PD-L1은 관문으로 고려되며, 종양에서 이의 상향조절된 발현은 T-세포 매개된 항종양 반응의 저해에 기여한다. PD-L1은 다양한 포유류 종으로부터의 일반적으로 PD-L1에 대해 사용될 것이지만, PD-L1에 대한 임의의 언급이 인간 PD-L1을 포함하고, 바람직하게는, 특히 인간 PD-L1에 관한 것임이 본 출원 전체적으로 이해될 것이다.
"PD-L1 결합제-약물 접합체"는 적어도 10-6M의 해리 상수(Kd)로 PD-L1, 특히 인간 PD-L1에 결합하는 적어도 하나의 아피머 폴리펩타이드를 갖는 결합제-약물 접합체를 지칭한다.
b. 폴리펩타이드
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 가로막힐 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 정의 내에, 예를 들어, 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산을 포함)의 하나 이상의 유사체뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드가 포함된다.
용어 "아미노산 잔기" 및 "아미노산"은 상호 호환적으로 사용되며, 폴리펩타이드와 관련하여, 폴리펩타이드의 하나 이상의 펩타이드 결합에 참여하는 아미노산을 의미한다. 일반적으로, 아미노산을 표기하기 위해 본 명세서에서 사용되는 약어는 IUPAC-IUB 생화학명명 위원회(Commission on Biochemical Nomenclature)의 권고에 기반한다(문헌[Biochemistry (1972) 11:1726-1732] 참조). 예를 들어, Met, Ile, Leu, Ala 및 Gly은 각각 메티오닌, 아이소류신, 류신, 알라닌 및 글리신의 "잔기"를 나타낸다. 잔기는 카복실기의 OH 부분 및 .알파.-아미노기의 H 부분을 제거함으로써 대응하는 .알파.-아미노산으로부터 유래된 라디칼을 의미한다. 용어 "아미노산 측쇄"는 문헌[K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, 페이지 2 및 33]에 의해 정의하는 바와 같이 --CH(NH2)COOH 부분을 제외하는 아미노산의 해당 부분이다.
대부분의 경우에, 본 발명의 출원에서 사용되는 아미노산은 단백질에서 발견되는 천연 유래 아미노산, 또는 아미노기 및 카복실기를 함유하는 이러한 아미노산의 천연 유래 동화작용 또는 이화작용 산물이다. 특히 적합한 아미노산 측쇄는 다음의 아미노산으로부터 선택된 측쇄를 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 라이신, 알기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판, 및 펩타이딜글리칸 박테리아 세포벽의 구성성분으로서 확인된 해당 아미노산 및 아미노산 유사체.
"염기성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Arg, Lys 및 His을 포함한다. "산성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Glu 및 Asp을 포함한다. "중성 극성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Ser, Thr, Asn, Gln, Cys 및 Tyr을 포함한다. "중성 비극성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro, Trp 및 Phe을 포함한다. "비극성 지방족 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Gly, Ala, Val, Ile 및 Leu을 포함한다. "소수성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp을 포함한다. "작은 소수성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Ala 및 Val을 포함한다. "방향족 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기는 Tyr, Trp 및 Phe을 포함한다.
용어 아미노산 잔기는 본 명세서에 지칭된 임의의 특정 아미노산의 유사체, 유도체 및 동류(congener)를 추가로 포함하며, 예를 들어, 대상 아피머는 (특히 화학적 합성에 의해 생성된다면), 예를 들어, 사이아노알라닌, 카나바닌, 드젠콜산, 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 다이하이드록시-페닐알라닌, 5-하이드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 다이아미니오피멜산, 오르니틴 또는 다이아미노뷰티르산과 같은 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 적합한 측쇄를 갖는 다른 천연 유래 아미노사 대사물질 또는 전구체는 당업자에 의해 인식될 것이며, 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 아미노산의 구조가 입체이성질체 형태의 아미노산을 인정할 때 이러한 아미노산의 (D) 및 (L) 입체이성질체가 포함된다. 본 명세서의 아미노산 및 아미노산 잔기의 입체배치는 적절한 기호(D), (L) 또는 (DL)로 표기되며, 더 나아가 입체배치가 표기되지 않을 때, 아미노산 또는 잔기는 입체배치 (D), (L) 또는 (DL)을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 화합물의 구조는 비대칭 탄소 원자를 포함한다는 것을 주목할 것이다. 따라서 이러한 비대칭으로부터 생기는 이성질체는 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 이러한 이성질체는 고전적 분리 기법에 의해 그리고 입체 구조적으로 제어된 합성에 의해 실질적으로 순수한 형태로 얻어질 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 분명하게 반대로 언급되지 않는 한, 명명된 아미노산은 (D) 또는 (L) 입체이성질체를 둘 다 포함하는 것으로 해석될 것이다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고 최대 대응도에 대해 비교하고 정렬할 때(필요하다면 갭을 도입), 동일하거나, 또는 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 구체화된 백분율을 갖는, 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 백분율은 서열 비교 소프트웨어를 이용하거나 또는 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이들은 BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package) 및 이들의 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 두 핵산 또는 폴리펩타이드는 실질적으로 동일한데, 이는 이들이 서열 비교 알고리즘을 이용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정하는 경우, 최대 대응도에 대해 비교되고 정렬될 때, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 실시형태에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가진다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개의 잔기, 적어도 약 20개의 잔기, 적어도 약 40 내지 60개의 잔기, 적어도 약 60 내지 80개의 잔기 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 아미노산 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시형태에서, 동일성은 60 내지 80개보다 더 긴 잔기, 예컨대 적어도 약 80 내지 100개의 잔기에 걸쳐 존재하며, 일부 실시형태에서, 서열은, 예컨대 표적 단백질 또는 항체의 암호 영역에 비해 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개의 염기, 적어도 약 20개의 염기, 적어도 약 40 내지 60개의 염기, 적어도 약 60 내지 80개의 염기 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 뉴클레오타이드 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시형태에서, 동일성은 60 내지 80개보다 더 긴 염기, 예컨대 적어도 약 80 내지 1000개 또는 그 이상의 염기에 걸쳐 존재하며, 일부 실시형태에서, 서열은, 예컨대 관심 대상의 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 비해 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 알기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 일반적으로 정의되었다. 예를 들어, 타이로신의 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 및/또는 항체의 서열에서 보존적 치환은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 가용성 단백질 또는 항체의 표적 결합 부위에 대한 결합을 없애지 않는다. 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
"단리된" 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 천연에서 발현되지 않는 형태인 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 이들이 천연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리펩타이드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수(즉, 오염물질이 없음), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩타이드"는 적어도 2개의 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 혼성 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "링커" 또는 "링커 영역"은 제1 폴리펩타이드(예를 들어, 아피머의 복제물)와 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 다른 아피머, Fc 도메인, 리간드 결합 도메인 등) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 링커는 폴리펩타이드의 발현, 분비 또는 생체활성에 유해하게 영향을 미쳐서는 안 된다. 바람직하게는, 링커는 항원성이 아니며, 면역 반응을 유발하지 않는다.
"아피머-항체 융합체"는 항체의 아피머 폴리펩타이드 부분 및 가변 영역을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 아피머-항체 융합체는, 예를 들어, VH 및/또는 VL 쇄 중 하나 이상의 C-말단 또는 N-말단에 현수된 하나 이상의 아피머 폴리펩타이드 서열을 갖는 전장 항체를 포함하며, 즉, 조립된 항체 중 적어도 하나의 쇄는 아피머 폴리펩타이드와의 융합 단백질이다. 아피머-항체 융합체는 또한 하나 이상의 아피머 폴리펩타이드 서열이 항체 단편의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 갖는 융합 단백질의 부분으로서 제공되는 실시형태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 통해, 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 또는 임의의 앞서 언급한 것의 조합을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭하되, 항원-결합 부위는 보통 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어는 무손상 다클론성 항체, 무손상 단클론성 항체, 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 또는 Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 형식화된 해당 단편을 제공한 단일쇄 Fv(scFv) 항체, 다중특이성 항체, 이중특이성 항체, 단일특이성 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질(Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 형식화됨), 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다.
항체가 임의의 5가지의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이의 하위부류(아이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 가질 수 있지만, 이들의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기반하여 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 지칭된다.
항체의 "가변 영역"이라는 용어는 항체 경쇄의 가변 영역, 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 프레임워크 영역(FR) 및 "초가변 영역"으로도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)으로 이루어진다. 각각의 쇄에서 CDR은 프레임워크 영역에 의해 근접하여 함께 보유되고, 다른 쇄로부터의 CDR은 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지의 기법이 있다: (1) 교차종 서열 가변성에 기반한 접근(즉, 문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.]), 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학 연구에 기반한 접근(Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). 추가로, 이들 두 접근의 조합은 CDR을 결정하기 위해 당업계에서 때때로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간화된 항체"는 최소 비-인간 서열을 함유하는 특정 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린 또는 이들의 단편인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체는 CDR의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 비인간 종으로부터의 항체에서 대응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 개선시키고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역에서 그리고/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린에 대응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR을 함유하는 가변 도메인을 포함할 수 있는 반면, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역이다. 일부 실시형태에서, 가변 도메인은 인간 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가변 도메인은 인간 면역글로불린 공통 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역 또는 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 보통 키메라 항체와 별개로 고려된다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정소"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 특정 항체, 특정 아피머 또는 다른 특정 결합 도메인에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 일부를 지칭한다. 항원이 폴리펩타이드일 때, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 인접 아미노산과 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프(또한 선형 에피토프로서 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성 시 보유되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프(입체구조적 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조에서 적어도 3, 더 보통으로는, 적어도 5, 6, 7, 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"은 측정 가능한 및 재생 가능한 상호작용, 예컨대 표적과 아피머, 항체 또는, 생물학적 분자를 포함하는 분자의 이질적 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정하는 다른 결합 상대 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 표적에 특이적으로 결합하는 아피머는 더 큰 친화도, (다량체가 형식화되는 경우) 결합활성으로, 더 용이하게는, 그리고/또는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 지속기간으로 이 표적에 결합하는 아피머이다.
c. 관문 저해제, 공자극 작용제 및 화학치료제
"관문 분자"는 조직 및/또는 면역 세포에 의해 발현되고 관문 분자의 발현 수준에 의존하는 방식으로 면역 반응의 효능을 감소시키는 단백질을 지칭한다. 이들 단백질이 차단될 때, 면역계 상의 "브레이크"는 해제되며, 예를 들어, T 세포는 암 세포를 더 효과적으로 사멸시킬 수 있다. T 세포 또는 암 세포 상에서 발견되는 관문 단백질의 예는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT를 포함한다.
"관문 저해제"는 관문 분자로부터의 면역억제성 신호전달을 반전시키는 약물 독립체를 지칭한다.
"공자극 분자"는 공자극 리간드에 특이적으로 결합하여 공자극, 예컨대 이하로 제한되는 것은 아니지만, 증식을 매개하는 면역 세포, 예컨대 T 세포 동족 결합 상대를 지칭한다. 공자극 분자는 효과적인 면역 반응을 용이하게 하는 항원 수용체 또는 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공자극 분자는 MHCI 분자, BTLA 수용체 및 Toll 리간드, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 공자극 분자의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244,2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83 리간드.
"공자극 작용제"는 공자극 분자, 예컨대 공자극 리간드가 면역자극 신호를 전달하거나 생성하거나 또 다르게는 면역 반응의 효능 또는 효력을 증가시키는 공자극 분자를 활성화하는(작용화하는) 약물 독립체를 지칭한다.
"화학치료제"는 암 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(CYTOXAN); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민, 및 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스포르아마이드 및 트라이메틸올로멜라민을 포함하는, 메틸아멜라민 ; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타신온); 델타-9-테트라하이드로칸나빈올(드로나빈올, MARINOL); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신을 포함); 브리오스타틴; 페메트렉세드; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; TLK-286; CDP323, 경구 알파-4 인테그린 저해제; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 나이트로소유레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마1I 및 칼리케아마이신 오메가I1(예를 들어, 문헌[Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 에스페라마이신;뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네다인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(아드리아마이신, 몰폴리노-독소루비신, 사이아노몰폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사(DOXIL) 및 데옥시독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈(GEMZAR), 테가푸르(UFTORAL), 카페시타빈(XELODA), 에포틸론, 및 5-플루오로유라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라에메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플유리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 및 이마티닙(2-페닐아미노피리미딘 유도체)뿐만 아니라 다른 c-Kit 저해제; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐유라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK 다당류 복합체(JHS 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오리건주 유진에 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 유레탄; 빈데신(엘디신(ELDISINE), 필데신(FILDESIN)); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(아브락산(ABRAXANE)), 및 도세탁셀(탁소텔(TAXOTERE)); 클로람부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴(벨반(VELBAN)); 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 상기 중 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체;뿐만 아니라 상기 중 둘 이상의 조합물, 예컨대 CHOP, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 병용 요법에 대한 약어, 및 FOLFOX, 5-FU 및 류코보빈과 병용되는 옥살리플라틴에 의한 치료 요법에 대한 약어(ELOXATIN)를 포함한다.
또한 암 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나, 감소시키거나, 차단하거나 저해하도록 작용하고, 종종 전체 또는 전신 치료의 형태인, 항-호르몬제가 본 정의에 포함된다. 이들은 호르몬 그 자체일 수 있다. 예는, 예를 들어, 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX) 타목시펜을 포함), 랄록시펜(에비스타(EVISTA)), 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤(FARESTON)); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제(ERDs); 에스트로겐 수용체 길항제, 예컨대 풀베스트란트(파슬로덱스(FASLODEX)); 난소를 억제하거나 정지시키는 작용을 하는 제제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 작용제, 예컨대 류프롤라이드 아세테이트(루프론(LUPRON) 및 엘리가드(ELIGARD)), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 항-안드로겐, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드 및 비칼루타마이드; 및 방향화효소를 저해하고, 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 방향화효소 저해제, 예컨대, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티마이드, 메게스트롤 아세테이트(MEGASE), 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)), 포메스타니, 파드로졸, 보로졸 (리비솔(RIVISOR)), 레트로졸(페마라(FEMARA)) 및 아나스트로졸(아리미덱스(ARIMIDEX))를 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)를 포함한다. 이 밖에도, 화학치료제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트(예를 들어, 보네포스(BONEFOS) 또는 오스탁(OSTAC)), 에티드로네이트(디드로칼(DIDROCAL)), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(조메타(ZOMETA)), 알렌드로네이트(포사맥스(FOSAMAX)), 파미드로네이트(아레디아(AREDIA)), 틸루드로네이트(스켈리드(SKELID)), 또는 리세드로네이트(악토넬(ACTONEL));뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-다이옥살란 뉴클레오사이드 사이토신 유사체); 안티-센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상적 세포 증식에 관여되는 신호전달 경로에서 유전자 발현을 저해하는 것, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체(EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN) 백신, 및 백시드(VAXID) 백신; 토포아이소머라제 1 저해제(예를 들어, 루토테칸(LURTOTECAN)); 항-에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트; Kit 저해제, 예컨대 이마티닙 또는 EXEL-0862(타이로신 키나제 저해제); EGFR 저해제, 예컨대 에를로티닙 또는 세툭시맙; 항-VEGF 저해제, 예컨대 베바시주맙; 아리노테칸; rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)); 라파티닙 및 라파티닙 다이토실레이트(GW572016으로도 알려진 ErbB-2 및 EGFR 이중 타이로신 키나제 소분자 저해제); 17AAG(열 충격 단백질(Hsp) 90 독물질인 겔다나마이신 유도체), 및 상기 중 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "사이토카인"은 일반적으로 다른 세포 상에서 세포내 매개자로서 작용하거나 단백질을 생산하는 세포 상에서 자가분비 효과를 갖는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 지칭한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인; 인터류킨("IL"), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, IL-18 내지 IL-29(예컨대 IL-23), IL-31, 예를 들어, 프로류킨(PROLEUKIN) rIL-2를 포함하는; 종양-괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β, TGF-β1-3; 및 백혈병 저해 인자("LIF"), 신경 영양 인자("CNTF"), CNTF-유사 사이토카인("CLC"), 카디오트로핀("CT"), 및 kit 리간드("KL")를 비롯한, 다른 폴리펩타이드 인자를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "케모카인"은 백혈구의 주화성 및 활성화를 선택적으로 유도하는 능력을 갖는 가용성 인자(예를 들어, 사이토카인)를 지칭한다. 이들은 또한 혈관형성, 염증, 상처 치유 및 종양형성 과정을 촉발시킨다. 케모카인의 예는 IL-8, 뮤린 케라틴 생성 세포 화학유인물질(keratinocyte chemoattractant: KC)의 인간 상동체를 포함한다.
d. 치료
본 명세서에서 사용되는 용어 "기능장애"는 또한 항원 인식에 불응성 또는 비반응성, 구체적으로는 항원 인식을 하류의 T-세포 효과기 기능, 예컨대 증식, 사이토카인 생산(예를 들어, IL-2) 및/또는 표적 세포 사멸로 번역하는 것의 손상된 능력을 포함한다.
용어 "아네르기(anergy)"는 T-세포 수용체를 통해 전달된 불완전한 또는 불충분한 신호(예를 들어, ras-활성화의 부재 하에 세포내 Ca+2의 증가)로부터 초래된 항원 자극에 대해 비반응성인 상태를 지칭한다. T 세포 아네르기는 공자극의 부재 하에 항원에 의한 자극 시 생성되어, 공자극과 관련할 때조차 항원에 의한 후속적 활성화에 세포가 불응성이 되도록 초래할 수 있다. 비반응성 상태는 종종 인터류킨-2의 존재 하에 무시된다. 아네르기 T-세포는 클론 확장을 겪지 않고/았거나 효과기 기능을 획득하지 않는다.
용어 "고갈(exhaustion)"은 많은 만성 감염 및 암 동안 일어나는 지속된 TCR 신호전달로부터 생기는 T 세포 기능장애의 상태로서 T 세포 고갈을 지칭한다. 이는 불완전한 또는 결핍된 신호전달을 통하는 것이 아니라 지속된 신호전달로부터 일어난다는 점에서 아네르기와 구별된다. 이는 불량한 효과기 기능, 저해 수용체의 지속된 발현 및 기능성 효과기 또는 기억 T 세포와 별개의 전사 상태에 의해 정해진다. 고갈은 감염 및 종양의 최적의 제어를 막는다.
"T-세포 기능을 향상시키는 것"은 T-세포가 지속된 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도하거나, 야기하거나 또는 자극하거나, 또는 고갈된 또는 비활성 T-세포를 새롭게 하거나 또는 재활성화시키는 것을 의미한다. T-세포 기능을 향상시키는 것의 예는: 간섭 전 이러한 수준에 비해 CD8+ T-세포로부터의 γ-인터페론의 증가된 분비, 증가된 증식, 증가된 항원 반응성(예를 들어, 바이러스, 병원균 또는 종양 클리어런스)을 포함한다. 일 실시형태에서, 향상 수준은 적어도 50%, 대안적으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%이다. 이 향상을 측정하는 방식은 당업자에게 공지되어 있다.
"T 세포 기능장애"는 항원성 자극에 대해 감소된 반응성을 특징으로 하는 T-세포 반응의 장애 또는 병태이다. 특정 실시형태에서, T-세포 기능장애는 부적절한 증가된 수준의 PD-1과 특이적으로 연관된 장애이다. T-세포 기능장애는 또한 T-세포 항종양 작용(들)의 억제를 일으키는 종양에서 부적절한 증가된 수준의 PD-L1과 연관될 수 있다. 다른 실시형태에서, T-세포 기능장애는 T-세포가 아네르기이거나 또는 사이토카인을 분비하거나, 증식하거나, 세포용해 활성을 실행하는 능력이 감소된 것이다. 구체적 양상에서, 감소된 반응성은 면역원을 발현시키는 병원균 또는 종양의 비효과적인 제어를 초래한다. T-세포 기능장애를 특징으로 하는 T 세포 기능장애의 예는 미해결의 급성 감염, 만성 감염 및 종양 면역을 포함한다.
"종양 면역"은 종양이 면역 인식 및 클리어런스를 회피하는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료적 개념으로서, 종양 면역은 이러한 회피가 약화될 때 "치료되고", 종양은 면역계에 의해 인식되고 공격된다. 종양 인식의 예는 종양 결합, 종양 수축 및 종양 클리어런스를 포함한다.
"지속된 반응"은 치료 중단 후 종양 성장을 감소시킴에 있어서 지속된 효과를 지칭한다. 예를 들어, 종양 크기는 투여기의 시작 시 크기에 비해 동일하거나 더 작게 남아있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 지속된 반응은 치료 지속기간, 적어도 1.5x, 2.0x, 2.5x, 또는 3.0x 길이의 치료 지속기간과 적어도 동일한 지속기간을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리적 병태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는, 암종, 아세포종, 육종 및 혈액학적 암, 예컨대 림프종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "종양" 및 "신생물"은 과도한 세포 성장 또는 증식, 전암성 병변을 포함하는 양성(비암성) 또는 악성(암성) 중 하나로부터 초래되는 조직의 임의의 덩어리를 지칭한다.　 종양 성장은 일반적으로 비제어이고, 진행성이며, 정상 세포의 증식을 유도하거나 저해하지 않는다. 종양은 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 교세포, 식도, 나팔관, 담낭, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 요도, 요관, 요도, 자궁, 질 기관 또는 조직 또는 대응하는 세포로부터 선택된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 세포, 조직 또는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 종양은 암, 예컨대 육종, 암종, 형질세포종 또는 (악성 혈장 세포)를 포함한다. 본 발명의 종양은 백혈병(예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프아구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수구 백혈병, 급성 골수성 - 단핵구 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성다혈구증), 림프종(호지킨병, 비-호지킨병), 원발성 마크로글로불린혈증 질환, 중쇄병, 및 고형 종양, 예컨대 육종 암(예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 내피 육종, 림프관육종, 혈관육종, 림프내피 육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 암종, 기관지원성 암종, 수질 암종, 신세포 암종, 간세포암종, 나일관(Nile duct) 암종, 융모막 암종, 정조세포 종양, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체부종양, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 신경초종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종), 식도암, 담낭, 신장암, 다발성 골수종을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, "종양"은 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신세포암, 백혈병, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 및 신경교종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전이"는 새로운 위치에서 유사한 암성 병변의 발생과 함께 암이 기원 부위로부터 신체의 다른 영역으로 확산되거나 전달되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이하는" 세포는 이웃하는 세포와의 흡착 접촉을 상실하고 질환의 원발성 부위로부터 혈류 또는 림프를 통해 이동하여 이웃하는 신체 구조를 침윤하는 것이다.
용어 "암 세포" 및 "종양 세포"는 대량의 암 세포 집단, 및 종양 형성성 줄기 세포(암 줄기 세포)를 포함하는, 비-종양 형성성 세포를 둘 다 포함하는 암 또는 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 세포의 총 집단을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"는 해당 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별하기 위해 새롭게 하거나 분화하는 능력을 결여하는 해당 세포만을 지칭할 때 "비-종양 형성성"이라는 용어에 의해 변형될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기 위한 양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "완전한 반응" 또는 "CR"은 모드 표적 병변의 사라짐을 지칭하며; "부분적 반응" 또는 "PR"은 기준이 되는 가장 긴 직경의 합(SLD: sum of the longest diameter)을 참고할 때 표적 병변의 SLD의 적어도 30% 감소를 지칭하고; "안정한 질환" 또는 "SD"는 치료가 시작된 이후로 가장 작은 SLD를 기준으로 할 때, PR의 자격이 있는 표적 병변의 충분한 수축도 아니고, PD의 자격이 있는 충분한 자격도 아닌 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, "무진행 생존"(progression free survival: PFS)은 치료 중인 질환(예를 들어, 암)이 악화되지 않는 동안 치료 동안 및 치료 후의 시간 길이를 지칭한다. 무진행 생존은 환자가 완전한 반응 또는 부분적 반응을 경험한 시간의 양뿐만 아니라 환자가 안정한 질환을 경험한 시간의 양을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "전반적 반응률"(ORR)은 완전한 반응(CR)률과 부분적 반응(PR)률의 합계를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, "전반적 생존"은 시간의 특정 지속기간 후에 생존할 가능성이 있는 그룹 내 개체의 백분율을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 개체가 세포의 개입에 의해 야기되는 임상 질환의 진행 또는 치료를 변형시키는 노력을 하는 것을 지칭하며, 임상 병리의 예방적 개입 과정일 수 있다. 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 치료, 증상의 경감, 임의의 질환의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행률을 늦춤, 질환 관해의 개선 또는 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "대상체"는 특정 치료의 수용자가 될 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유류)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체에 대해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작용제" 및 "길항제"는 표적 또는 표적 경로의 생물학적 활성을 간접적으로 또는 직접적으로, 실질적으로, 유도하거나, 활성화시키거나, 촉진시키거나, 증가시키거나 또는 향상시킬 수 있는 제제를 지칭한다. 용어 "작용제"는 본 명세서에서 관심 대상의 단백질 또는 다른 표적의 활성을 부분적으로 또는 완전히 유도하거나, 활성화시키거나, 촉진시키거나, 증가시키거나 또는 향상시키는 임의의 제제를 유도하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "길항제" 및 "길항적"은 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접적으로 또는 간접적으로, 부분적으로 또는 완전히 차단시키거나, 저해하거나, 감소시키거나 또는 중화시킬 수 있는 제제를 지칭하거나 설명한다. 용어 "길항제"는 본 명세서에서 관심 대상의 단백질 또는 다른 표적의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 저해하거나, 감소시키거나 또는 중화시키는 임의의 제제를 포함하기 위해 사용된다.　
본 명세서에서 사용되는 용어 "조절" 및 "조절한다"는 생물학적 활성에서의 변화 또는 변경을 지칭한다. 조절은 활성의 자극 또는 활성의 저해를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가 또는 활성의 감소, 결합 특징의 변화, 또는 관심 대상의 단백질, 경로, 시스템 또는 다른 생물학적 표적의 활성화 연관된 생물학적, 기증적, 또는 면역학적 특성에서의 임의의 다른 변화일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 선천성 면역계와 적응 면역계 둘 다로부터의 반응을 포함한다. 이는 세포-매개 및/또는 체액성 면역 반응을 둘 다 포함한다. 이는 T-세포와 B-세포 반응뿐만 아니라 면역계의 다른 세포, 예컨대 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포 등으로부터의 반응을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 승인 가능하거나, 또는 미국 약전 또는 인간을 비롯한 동물에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 물질을 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 아쥬반트" 또는 "허용 가능한 약제학적 담체"는 본 개시내용의 적어도 하나의 제제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고, 약학적 활성을 파괴하지 않으며 치료적 효과를 전달하는 데 충분한 용량으로 투여될 때 비독성인 부형제, 담체 또는 아쥬반트를 지칭한다. 일반적으로, 당업자 및 미국 FDA는 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 아쥬반트가 임의의 제형의 비활성 성분이 되는 것으로 간주한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "치료적 효과"는 대상체, 예컨대 포유류에서 질환 또는 장애를 "치료"하는 데 유효한 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체의 양을 지칭한다. 암 또는 종양의 경우에, 치료적 유효량의 PD-L1 결합 결합제-약물 접합체는 치료적 효과를 가지며, 이렇게 해서 면역 반응을 촉진하거나, 항-종양 반응을 촉진하거나, 면역 세포의 세포용해 활성을 증가시키거나, 면역 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 증가시키거나, 종양 세포 수를 감소시키거나; 종양 형성성, 종양 형성성 빈도 또는 종양 형성성 능력을 감소시키거나; 암 줄기 세포 수 또는 빈도를 감소시키거나; 종양 크기를 감소시키거나; 암 세포 집단을 감소시키거나; 예를 들어, 연조직 및 뼈 내로의 암의 확산을 포함하는 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 저해하거나 중단시키거나; 종양 또는 암 세포 전이를 저해하거나 중단시키거나; 종양 또는 암 세포 성장을 저해하거나 중단시키거나; 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 일정한 정도로 완화시키거나; 이환율 및 사망률을 감소시키거나; 삶의 질을 개선시키거나; 또는 이러한 효과의 조합일 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위해" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한"은 (1) 진단된 병리적 병태 또는 장애 증상을 치유하고/하거나, 늦추고/늦추거나, 줄이고/줄이거나 중단시키는 치료적 측정 및 (2) 표적화된 병적 병태 또는 장애의 발생을 방지하거나 또는 늦추는 예방적 또는 방지적 측정을 둘 다 지칭한다. 따라서 치료가 필요한 대상은 이미 장애가 있는 대상; 장애를 갖는 경향이 있는 대상; 및 장애가 예방되어야 하는 대상을 포함한다. 암 또는 종양의 경우에, 대상체는 환자가 다음 중 하나 이상을 나타낸다면 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료된다": 증가된 면역 반응, 증가된 항-종양 반응, 면역 세포의 증가된 세포용해 활성, 면역 세포에 의한 종양 세포의 증가된 사멸, 암 세포의 수 또는 완전한 부재 하의 감소; 종양 크기의 감소; 연조직 및 뼈 내로 암 세포의 확산을 포함하는 말초 기관 내로의 암 세포 침윤의 저해 또는 부재; 종양 또는 암 세포 전이의 저해 또는 부재; 암 성장의 저해 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 경감; 감소된 이환율 및 사망률; 삶의 질의 개선; 종양 형성성의 감소; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소; 또는 효과들의 일부 조합.
e. 기타
용어 "알킬"은 직쇄 알킬기, 분지쇄 알킬기, 사이클로알킬(지환식) 기, 알킬 치환된 사이클로알킬기, 및 사이클로알킬 치환된 알킬기를 포함하는 포화된 지방족기의 라디칼을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 이의 골격에 대해 30개 이하의 탄소 원자(예를 들어, 직쇄에 대해 C1-C30, 분지쇄에 대해 C3-C30), 예를 들어, 20개 이하를 가진다. 마찬가지로, 특정 사이클로알킬은 이들의 고리 구조에 3 내지 10개의 탄소 원자, 예를 들어, 고리 구조에 5, 6 또는 7개의 탄소를 가진다. 본 명세서 및 청구범위 전체적으로 "알킬"(또는 "저급 알킬")은 "비치환된 알킬"과 "치환된 알킬"을 둘 다 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아르알킬"은 아릴기(예를 들어, 방향족 또는 헤테로방향족기)로 치환된 알킬기를 지칭한다.
용어 "알켄일" 및 "알킨일"은 상기 기재한 알킬과 길이 및 가능한 치환이 유사하지만, 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 각각 함유하는 불포화 지방족 기를 지칭한다.
탄소 수가 달리 구체화되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 "저급 알킬"은 상기 정의한 바와 같지만, 골격 구조에 1 내지 10개의 탄소, 예를 들어, 1 내지 4개 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는, 알킬기를 의미한다. 마찬가지로, "저급 알켄일" 및 "저급 알킨일"은 유사한 쇄 길이를 가진다. 일부 실시형태에서, 알킬기는 저급 알킬이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 알킬로서 표기되는 치환체는 저급 알킬이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "아릴"은 0 내지 4개의 헤테로원자, 예를 들어, 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트라이아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등을 포함할 수 있는 5-, 6- 및 7-원 단일-고리 방향족기를 포함한다. 고리 구조에 헤테로원자를 갖는 해당 아릴기는 또한 "아릴 헤테로사이클" 또는 "헤테로방향족"으로서 지칭될 수 있다. 방향족 고리는 하나 이상의 고리 위치에서 상기 기재한 바와 같은 이러한 치환체, 예를 들어, 할로겐, 아자이드, 알킬, 아르알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 하이드록실, 아미노, 나이트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스피오네이트, 포스피네이트, 카보닐, 카복실, 실릴, 에터, 알킬티오, 설폰일, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스터, 헤테로사이클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다. 용어 "아릴"은 또한 2 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리(고리는 "축합된 고리"임)에 공통되는 2개 이상의 환식 고리를 갖는 다환식 고리계를 포함하되, 고리 중 적어도 하나는 방향족이고, 예를 들어, 다른 환식 고리는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다.
용어 "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클릴 기"는 3- 내지 10-원 고리 구조, 예를 들어, 3- 내지 7-원 고리를 지칭하며, 이의 고리 구조는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로사이클은 또한 폴리사이클일 수 있다. 헤테로사이클기는, 예를 들어, 티오펜, 티안트렌, 퓨란, 피란, 아이소벤조퓨란, 크로멘, 잔텐, 페녹산티인, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 아이소티아졸, 아이소옥사졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 아이소인돌, 인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 아이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카바졸, 카볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 피리미딘, 페난트롤린, 페나진, 페나르사진, 페노티아진, 푸라잔, 페녹사진, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 몰폴린, 락톤, 락탐, 예컨대 아제티딘온 및 피롤리딘온, 설탐, 설톤 등을 포함한다. 헤테로사이클릴 고리는 하나 이상의 위치에서 상기 기재한 바와 같은 치환체로, 예를 들어, 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 하이드록실, 아미노, 나이트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카보닐, 카복실, 실릴, 에터, 알킬티오, 설폰일, 케톤, 알데하이드, 에스터, 헤테로사이클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 1가 방향족 단환식 고리계를 지칭하되, 적어도 하나의 고리계는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자이다. 용어 5-원 헤테로아릴은 헤테로아릴을 지칭하되, 고리 원자의 수는 5이다. 5-원 헤테로아릴기의 예는 피롤릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 옥사다이아졸릴, 티아다이아졸릴, 퓨라잔일, 이미다졸린일 및 트라이아졸릴을 포함한다.
용어 "헤테로사이클로알킬"은 단환식 또는 이환식 1가 포화 또는 비-방향족 불포화 고리계를 지칭하되, 1 내지 4개의 고리 원자는 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자이다. 용어 "3 내지 10-원 헤테로사이클로알킬"은 헤테로사이클로알킬을 지칭하되, 고리 원자의 수는 3 내지 10이다. 3 내지 10-원 헤테로사이클로알킬의 예는 3 내지 6-원 헤테로사이클로알킬을 포함한다. 이환식 고리계는 축합, 브리지 및 스피로환식 고리계를 포함한다. 헤테로사이클로알킬기의 더 구체적인 예는 아제판일, 아제티딘일, 아지리딘일, 이미다졸리딘일, 몰폴린일, 옥사졸리딘일, 옥사졸리딘일, 피페라진일, 피페리딘일, 피라졸리딘일, 피롤리딘일, 퀴뉴클리딘일 및 티오몰폴린일을 포함한다.
용어 "폴리사이클릴" 또는 "다환식 기"는 2 이상의 탄소가 두 인접한 고리에 공통되고, 예를 들어, 고리는 "축합된 고리"인, 2 이상의 고리(예를 들어, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴 및/또는 헤테로사이클릴)를 지칭한다. 비인접 원자를 통해 결합된 고리는 "브리지된" 고리로 지칭된다. 폴리사이클의 각각의 고리는 상기 기재한 바와 같은 이러한 치환체, 예를 들어, 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 하이드록실, 아미노, 나이트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카보닐, 카복실, 실릴, 에터, 알킬티오, 설폰일, 케톤, 알데하이드, 에스터, 헤테로사이클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "카보사이클"은 고리의 각각의 원자가 탄소인 방향족 또는 비-방향족 고리를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 원소의 원자를 의미한다. 예시적인 헤테로원자는 질소, 산소, 황 및 인이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "나이트로"는 -NO2를 의미하며; 용어 "할로겐"은 -F, -Cl, -Br 또는 -I를 나타내며; 용어 "설프하이드릴"은 -SH를 의미하고; 용어 "하이드록실"은 -OH를 의미하며; 용어 "설폰일"은 -SO2-를 의미한다.
"할로겐" 또는 "할로"는 단독으로 또는 다른 치환체의 부분으로서 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘, 또는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.
"치환" 또는 "로 치환된"은 이러한 치환이 치환된 원자 및 치환체의 허용된 원자가에 따르며, 치환은 안정한 화합물을 초래하며, 예를 들어, 전환, 예컨대 재배열, 고리화, 제거 등을 자발적으로 겪지 않는다는 함축적인 조건을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환체를 포함하도록 상정된다. 광범위한 양상에서, 허용 가능한 치환체는 유기 화합물의 비환식 및 환식, 분지형 및 비분지형, 탄소환식 및 헤테로사이클릴, 방향족 및 비방향족 치환체를 포함한다. 예시적인 치환체는, 예를 들어, 본 명세서에서 상기 기재한 것을 포함한다. 허용 가능한 치환체는 하나 이상이고, 적절한 유기 화합물에 대해 동일 또는 상이할 수 있다. 치환체는, 예를 들어, 할로겐, 하이드록실, 카보닐(예컨대 카복실, 에스터, 폼일, 또는 케톤), 티오카보닐(예컨대 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포메이트), 알콕시, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 사이아노, 나이트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설폰일, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 당업자는 탄화수소 쇄 상에서 치환된 모이어티는 적절하다면 그 자체가 치환될 수 있다는 것이 이해할 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환체는 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트를 포함), 설폰일 (설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트를 포함), 및 실릴기뿐만 아니라 에터, 알킬티오, 카보닐(케톤, 알데하이드, 카복실레이트 및 에스터를 포함), -CF3, -CN 등의 치환 및 비치환 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 치환된 알킬은 이하에 기재된다. 사이클로알킬은 추가로 알킬, 알켄일, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카보닐-치환된 알킬, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로원자, 예컨대 질소는 수소 치환체 및/또는 헤테로원자의 원자가를 충족시키는 본 명세서에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용되는 치환체를 가질 수 있다. 본 발명은 유기 화합물의 허용되는 치환체에 의한 임의의 방식으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "아미노산 잔기" 및 "펩타이드 잔기"는 이의 카복실기의 --OH 없이 아미노산 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 일반적으로, 아미노산 및 보호기를 표기하기 위해 본 명세서에서 사용되는 약어는 IUPAC-IUB 생화학명명 위원회(Commission on Biochemical Nomenclature)의 권고에 기반한다(문헌[Biochemistry (1972) 11:1726-1732] 참조). 예를 들어, Met, Ile, Leu, Ala 및 Gly은 각각 메티오닌, 아이소류신, 류신, 알라닌 및 글리신의 "잔기"를 나타낸다. 잔기는 카복실기의 OH 부분 및 □-아미노기의 H 부분을 제거함으로써 대응하는 □-아미노산으로부터 유래된 라디칼을 의미한다. 용어 "아미노산 측쇄"는 문헌[K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, 페이지 2 및 33]에 의해 정의하는 바와 같이 --CH(NH2)COOH 부분을 제외하는 아미노산의 해당 부분이다.
대부분의 경우에, 본 발명의 출원에서 사용되는 아미노산은 단백질에서 발견되는 천연 유래 아미노산, 또는 아미노기 및 카복실기를 함유하는 이러한 아미노산의 천연 유래 동화작용 또는 이화작용 산물이다. 특히 적합한 아미노산 측쇄는 다음의 아미노산으로부터 선택된 측쇄를 포함한다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 라이신, 알기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판, 및 펩타이딜글리칸 박테리아 세포벽의 구성성분으로서 확인된 해당 아미노산 및 아미노산 유사체.
용어 아미노산 잔기는 본 명세서에 지칭된 임의의 특정 아미노산의 유사체, 유도체 및 동류를 추가로 포함하며, 예를 들어, 대상 화합물, 예를 들어, 사이아노알라닌, 카나바닌, 드젠콜산, 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 다이하이드록시-페닐알라닌, 5-하이드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 다이아미니오피멜산, 오르니틴 또는 다이아미노뷰티르산과 같은 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 적합한 측쇄를 갖는 다른 천연 유래 아미노사 대사물질 또는 전구체는 당업자에 의해 인식될 것이며, 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 아미노산의 구조가 입체이성질체 형태의 아미노산을 인정할 때 이러한 아미노산의 (D) 및 (L) 입체이성질체가 포함된다. 본 명세서의 아미노산 및 아미노산 잔기의 입체배치는 적절한 기호(D), (L) 또는 (DL)로 표기되며, 더 나아가 입체배치가 표기되지 않을 때, 아미노산 또는 잔기는 입체배치 (D), (L) 또는 (DL)을 가질 수 있다. 본 발명의 일후 화합물의 구조는 비대칭 탄소 원자를 포함한다는 것을 주목할 것이다. 따라서 이러한 비대칭으로부터 생기는 이성질체는 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 이러한 이성질체는 고전적 분리 기법에 의해 그리고 입체 구조적으로 제어된 합성에 의해 실질적으로 순수한 형태로 얻어질 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 분명하게 반대로 언급되지 않는 한, 명명된 아미노산은 (D) 또는 (L) 입체이성질체를 둘 다 포함하는 것으로 해석될 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 특정 화합물은 특히 기하학적 또는 입체이성질체적 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 범주 내에 속하는 시스- 및 트랜스-이성질체, R- 및 S-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 이들의 라세미 혼합물, 및 이들의 다른 혼합물을 포함하는 모든 이러한 화합물을 상정한다. 추가적인 비대칭 탄소 원자는 치환체, 예컨대 알킬기에 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체뿐만 아니라 이들의 혼합물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
예를 들어, 본 발명의 화합물의 특정 거울상이성질체가 요망된다면, 비대칭 합성에 의해 또는 카이랄 보조제에 의한 유도체화에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 얻어진 부분입체이성질체 혼합물은 분리되고, 보조기는 순수한 목적하는 거울상이성질체를 제공하도록 절단된다. 대안적으로, 분자가 염기성 작용기, 예컨대 아미노, 또는 산성 작용기를 함유하는 경우에, 예컨대 카복실, 부분입체이성질체염은 적절한 광학적으로 활성인 산 또는 염기에 의해 형성된 다음, 당업계에 잘 공지된 분별 결정 또는 크로마토그래피 수단에 의해 이렇게 형성된 부분입체이성질체가 분해되고, 후속적으로 순수한 거울상이성질체가 회수된다.
용어 "IC50"은 반응(또는 결합)이 절반으로 감소되고, 전체 세포, 동물 또는 시험관내 무세포(정제된 효소) 시스템에서 측정될 수 있는 저해제의 농도를 지칭한다.　 무세포 효소의 저해는 또한 일부 형식 동역학 측정에 의하 Ki 값으로서 보고될 수 있다.
용어 "ICIC50" 또는 "IIC50"은 세포 침투성이 인자가 되도록 전체 세포와 관련한 DPP8 및 DPP9의 측정이다(세포 침투성인 DPP8 및 DPP9, 정제된 효소는 IC50를 측정하기 위한 세포 침투성 요건을 상실함).
용어 "DPP8"은 단백질 다이펩티딜 펩티다제 8을 지칭한다.
용어 "DPP9"는 단백질 다이펩티딜 펩티다제 9를 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 화학적 원소는 문헌[Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87] 표지 내부의 CAS 버전 주기율표에 따라 확인된다. 또한 본 발명의 목적을 위해, 용어 "탄화수소"는 적어도 하나의 수소 및 하나의 탄소 원자를 갖는 모든 침투성 화합물을 포함하는 것으로 상정된다. 광범위 양상에서, 침투성 탄화수소는 치환 또는 비치환될 수 있는 비환식 및 환식, 분지형 및 비분지형, 탄소환식 및 헤테로사이클릴, 방향족 및 비방향족 유기 화합물을 포함한다.
다이펩타이드(또는 다이펩타이드 유사체)의 경우에 용어 "P1 위치" 및 "P2 위치"는 각각 카복시 및 아미노 말단의 잔기를 지칭한다. 대상 I-DASH 저해제의 경우에, P1 위치는 보론산이 카복시 말단을 대체하는 아미노산(또는 아미노산 유사체)이다.
실시형태가 본 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 기재되는 경우에, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"에 관해 기재된 다른 유사한 실시형태가 또한 제공된다는 것이 이해된다. 또한 실시형태가 본 명세서에서 "본질적으로 이루어진"이라는 용어와 함께 기재되는 경우에, "이루어진"에 관해 기재된 다른 유사한 실시형태가 또한 제공된다는 것이 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "약" 또는 "대략"의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 값 또는 파라미터에 관한 실시형태를 포함한다(기재한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 설명은 "X"의 설명을 포함한다.　
어구에서 사용되는 용어 "및/또는", 예컨대 본 명세서에서 "A 및/또는 B"는 A와 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 어구에서 사용되는 용어 "및/또는", 예컨대 "A, B 및/또는 C"는 각각의 다음의 실시형태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B (단독); 및 C(단독).
III. 예시적인 실시형태
본 발명의 일 양상은 (i) 종양 내 세포 상에서 상향조절되거나 달리 선택적으로 나타나는 세포 표면 특징, 예컨대 단백질에 결합하는 세포 결합 모이어티, 예컨대 항체, 항체 단편, 비-항체 스캐폴드 또는 다른 폴리펩타이드 독립체), 및 (ii) 이에 현수된, 하기 식으로 나타내는 하나 이상의 약물-접합체를 포함하는, 결합제-약물 접합체를 제공한다:
Figure pct00009
식 중,
L1은 스페이서 또는 결합을 나타내며;
SRS는 종양의 세포외 공간에서 발현되는 세포외 프로테아제에 대한 기질 인식 서열을 나타내고;
L2는 자기 희생 링커 또는 결합을 나타내며;
DM은 약물 모이어티를 나타내고;
m은 1 내지 6의 정수를 나타내며, 바람직하게는 1, 2 또는 3이고; 그리고
n은 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 100, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
결합제-약물 접합체는, 표적 세포 상의 표면 특징과 결합할 때, 내재화 반감기가 적어도 6시간, 더 바람직하게는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 36, 48, 60, 75 또는 심지어 100시간이다.
a. 기질 인식 서열
특정 실시형태에서, 기질 인식 서열은 결합 모이어티가 향하는 세포가 조직에서 발현되는 효소에 의해 절단된 모이어티(전형적으로 펩타이드 또는 펩타이딜 모이어티)이다. "표적화된 세포 근처에서 선택적으로 절단 가능한 절단 부위"는 질환 조직으로부터 떨어진 유리 약물 모이어티의 방출을 감소시키기 위해 표적 세포 근처에 선택적으로 남아있는 제제에 의해서만 절단될 수 있는 부위의 의미를 포함한다. 바람직하게는, 기질 인식 서열을 절단하는 효소는 표적 세포 근처 외부의 효소 농도보다 적어도 5배 또는 10배 더 높은 농도, 더 바람직하게는 적어도 100 또는 500 또는 1000배 더 높은 농도에서 표적 세포 근처에 존재한다. 가장 바람직하게는, 기질 인식 서열을 절단하는 효소는 표적 세포 근처에서만 발견된다. 예를 들어, 표적 세포가 특정 종양 세포(예를 들어, 유방 종양 세포)일 때, 기질 인식 서열은 특정 종양(예를 들어, 유방 종양)에 선택적으로 존재하지만, 특정 종양(예를 들어, 유방 종양) 근처의 외부에는 존재하지 않는 효소에 의해 절단되는 것일 수 있다.
'세포 근처에서'는, 세포 표면 상에서 또는 해당 조직 내 간질액에서, 또는 둘 다에서, 또는 세포를 바로 둘러싸는 환경, 예를 들어, 혈액, 림프 및 기타 체액에서의 의미를 포함한다.
기질 인식 서열은 표적 세포 근처에서 선택적으로 절단되고, 따라서 유리 약물 모이어티는 원치않는(건강한) 세포에 대해서보다 표적 세포 근처의 세포/조직에 대해 우선적으로 약학적 활성을 발휘하기 위해 표적 세포 근처에서 접합체로부터 우선적으로 방출한다. 따라서, 유리 약물 모이어티가 건강한 세포/조직 근처에서 방출되는 정도보다 적어도 5배 또는 10배 이상, 더 바람직하게는 적어도 100 또는 500 또는 1000배 이상인 표적 세포 근처에서 약물 모이어티가 유리 약물 모이어티로서 방출되도록 기질 인식 서열은 선택적으로 절단되는 것이 바람직하다.
주어진 표적 세포에 대해, 당업자는 당업계에 확립된 방법을 이용하여 표적 세포 근처에서 선택적으로 절단 가능한 적절한 기질 인식 서열을 확립할 것이다. 예를 들어, 펩타이드 라이브러리를 참고하고 절단 후 단편화 프로파일의 MS 분석을 연구함으로써 펩타이드를 절단하는 프로테아제가 평가될 수 있다. 또한, 프로테아제 절단 모티프 및 펩타이드 절단 데이터의 공개된 문헌은 이하에 추가로 기재하는 바와 같이 조사될 수 있다.
일반적으로, 기질 인식 서열은 프로테아제 절단 부위이다. 따라서, 표적 세포가 종양 세포일 때, 기질 인식 서열은 종양 세포 근처에 있는 프로테아제에 의해 선택적으로 절단 가능할 수 있다. 다시 말해서, 기질 인식 서열은 종양 연관 프로테아제에 의해 절단 가능한 것일 수 있다. 종양 발생 동안에, 종양은 프로테아제를 비정상적으로 발현시키는데, 이것이 국소 조직을 침윤하게 하고 종국적으로 전이시킨다는 것은 잘 알려져 있다.
프로테아제는 막 결합된 형태(MMP14-17 및 MMP24-25)와 분비된 형태(MMP1-13 및 MMP18-23 및 MMP26-28)를 둘 다 포함하는 메탈로프로테이나제(MMP1-28)일 수 있다. 프로테아제는 A 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM) 및 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 A 디스인테그린 또는 메탈로프로테이나제(ADAMTS) 패밀리의 프로테아제에 속할 수 있다. 다른 예는 CD10(CALLA) 및 전립선 특이적 항원(PSA)을 포함한다. 특정 바람직한 실시형태에서, 프로테아제는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP□)이다. 프로테아제는 막 결합될 수도 있고 되지 않을 수도 있다는 것이 인식된다.
프로테아제 절단 부위는 과학 문헌에 잘 공지되어 있으며, 주어진 기질 인식 서열이 당업계에 공지된 확립된 기법을 이용하여 약물-접합체 모이어티에 포함되는 기반으로서 용이하게 작용할 수 있다.
발현, 세포 수송의 변화에 의해 세포외 농도가 표적 조직에서 상향조절/증가되는 프로테아제를 나타내는 정도로 또는, 질환 상태에 의해 야기되는 세포 용해에 의해 세포외로 될 수 있는 세포내 효소의 경우에, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 프로테아제 중 하나 또는 선택된 하위 그룹에 의해 선택적으로 절단 가능하도록 설계된 기질 인식 서열이 이용될 수 있다(삽입어구에 제공된 MEROPS 펩티다제 데이터베이스 번호; 문헌[Rawlings N. D., Morton F. R., Kok, C. Y., Kong, J. & Barrett A. J. (2008) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 36 Database issue, D320-325]): 펩신 A(MER000885), 가스트리신(MER000894), 메맙신-2(MER005870), 레닌(MER000917), 카텝신 D(MER000911), 카텝신 E(MER000944), 메맙신-1(MER005534), 납신 A(MER004981), 머네임(Mername)-AA034 펩티다제(MER014038), 펩신 A4(MER037290), 펩신 A5(호모 사피엔스)(MER037291), hCG1733572(호모 사피엔스)-형 추정적 펩티다제(MER107386), 납신 B 유사유전자(MER004982), CYMP g.p.(호모 사피엔스)(MER002929), 슈퍼패밀리 A1A 비지정(unassigned) 펩티다제(MER181559), 마우스 유방 종양 바이러스 레트로펩신(MER048030), 토끼 내인성 레트로바이러스엔도펩티다제(MER043650), S71-관련 인간 내인성 레트로펩신(MER001812), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047117), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047133), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047160), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047206), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047253), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047260), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047291), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047418), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047440), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047479), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047559), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER047583), RTVL-H-형 추정적 펩티다제(MER015446), 인간 내인성 레트로바이러스레트로펩신 상동체 1(MER015479), 인간 내인성 레트로바이러스레트로펩신 상동체 2(MER015481), 내인성 레트로바이러스레트로펩신 유사유전자 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DJ-1 추정적 펩티다제(MER003390). 머네임-AA100 추정적 펩티다제(MER014802). 머네임-AA101 비-펩티다제 상동체(MER014803). KIAA0361 단백질(호모 사피엔스-형)(MER042827). FLJ34283 단백질(호모 사피엔스)(MER044553). 비-펩티다제 상동체 염색체 21 오픈 리딩 프레임 33(호모 사피엔스)(MER160094). 패밀리 C56 비-펩티다제 상동체(MER177016), 패밀리 C56 비-펩티다제 상동체(MER176613). 패밀리 C56 비-펩티다제 상동체(MER176918). EGF-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(MER037230). CD97 항원 (인간형)(MER037286). EGF-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 3(MER037288). EGF-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1(MER037278). EGF-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 4(MER037294). 카데린 EGF LAG 세븐-패스 G-형 수용체 2 전구체(호모 사피엔스)(MER045397), Gpr64(무스 무스쿨러스)-형 단백질(MER123205). GPR56(호모 사피엔스)-형 단백질(MER122057). 라트로필린 2(MER122199). 라트로필린-1(MER126380). 라트로필린 3(MER124612). 프로토카데린 플라밍고 2(MER124239). ETL 단백질(MER126267). G 단백질-결합 수용체 112(MER126114). 7 막관통 나선 수용체(MER125448). Gpr114 단백질(MER159320). GPR126 혈관 유도성 G 단백질-결합 수용체(MER140015). GPR125(호모 사피엔스)-형 단백질(MER159279). GPR116(호모 사피엔스)-형 G-단백질 결합 수용체(MER159280). GPR128(호모 사피엔스)-형 G-단백질 결합 수용체(MER162015). 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일부 실시형태에서, 기질 인식 서열은 길이가 최대 15개의 아미노산인 펩타이드 모이어티이다. 기질 인식 서열은 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 조직 내 세포 결합 모이어티의 표적으로 공동 국소화되고, 결합제-약물 접합체가 프로테아제에 노출될 때 프로테아제는 약물-접합체 모이어티에서 기질 인식 서열을 절단한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 세포 표면 특징을 유의하게 발현시키지 않는 조직에서 활성이 아니거나 유의하게 덜 활성이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 건강한, 예를 들어, 비-질환 조직에서 활성이 아니거나 유의하게 덜 활성이다.
특정 실시형태에서, 기질 인식 서열은 다음으로부터 선택된 프로테아제에 의해 절단된다:
Figure pct00010
ADAMS 또는 ADAMTS, 예를 들어, ADAM8, ADAM9, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS4 또는 ADAMTS5.
Figure pct00011
아스파르테이트 프로테아제, 예를 들어, BACE 또는 Renin.
Figure pct00012
아스파르트산 카텝신(세포외 공간에서 세포 용해에 의해 상향조절되거나 방출되는 정도로), 예를 들어, 카텝신 D 또는 카텝신 E.
Figure pct00013
카스파제(세포외 공간에서 세포 용해에 의해 상향조절되거나 방출되는 정도로), 예를 들어, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10 또는 카스파제 14.
Figure pct00014
시스테인 카텝신, 예를 들어, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 K, 카텝신 L, 카텝신 S, 카텝신 V/L2, 카텝신 X/Z/P.
Figure pct00015
시스테인 프로테이나제, 예를 들어, 크루지파인, 레구마인 또는 오투바인(Otubain)-2.
Figure pct00016
KLK, 예를 들어, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13 또는 KLK14.
Figure pct00017
메탈로 프로테이나제, 예를 들어, 메프린(Meprin), 네프릴라이신(Neprilysin), PSMA 또는 BMP-1,
Figure pct00018
MMP, 예를 들어, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP19, MMP20, MMP23, MMP24, MMP26, MMP27.
Figure pct00019
세린 프로테아제, 예를 들어, 활성화 단백질 C, 카텝신 A, 카텝신 G, 키마제, 응고 인자 프로테아제(예를 들어, FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa), 엘라스타제, 그랜자임 B, 구아니디노벤조아타제, HtrA1, 인간 호중구 엘라스타제, 락토페린, 마랍신, NS3/4A, PACE4, 플라스민, PSA, tPA, 트롬빈, 트립타제 또는 uPA.
Figure pct00020
II형 막관통 세린 프로테아제(TTSP), 예를 들어, DESC1, DPP-4, FAP, 헵신, 마트립타제-2, MT-SP1/마트립타제, TMPRSS2, TMPRSS3, TMPRSS4.
예를 들어, 결합제-약물 접합체를 포함할 수 있는 적합한 기질 인식 서열, 즉, SRS는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 모이어티이다: TGRGPSWV, SARGPSRW, TARGPSFK, LSGRSDNH, GGWHTGRN, HTGRSGAL, PLTGRSGG, AARGPAIH, RGPAFNPM, SSRGPAYL, RGPATPIM, RGPA, GGQPSGMWGW, FPRPLGITGL, VHMPLGFLGP, SPLTGRSG, SAGFSLPA, LAPLGLQRR, SGGPLGVR, PLGL, GPRSFGL 및 GPRSFG.
일부 실시형태에서, 기질 인식 서열은 MMP, 예컨대 ISSGLLSS, QNQALRMA, AQNLLGMV, STFPFGMF, PVGYTSSL, DWLYWPGI, MIAPVAYR, RPSPMWAY, WATPRPMR, FRLLDWQW, LKAAPRWA, GPSHLVLT, LPGGLSPW, MGLFSEAG, SPLPLRVP, RMHLRSLG, LAAPLGLL, AVGLLAPP, LLAPSHRA, PAGLWLDP 및 ISSGLSS로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대한 기질이다.
일부 실시형태에서, 기질 인식 서열은 MMP, 예컨대 ISSGLSS, QNQALRMA, AQNLLGMV, STFPFGMF, PVGYTSSL, DWLYWPGI, ISSGLLSS, LKAAPRWA, GPSHLVLT, LPGGLSPW, MGLFSEAG, SPLPLRVP, RMHLRSLG, LAAPLGLL, AVGLLAPP, LLAPSHRA 및 PAGLWLDP로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대한 기질이다.
일부 실시형태에서, 기질 인식 서열은 트롬빈, 예컨대 GPRSFGL 또는 GPRSFG에 대한 기질이다.
대상 결합제-약물 접합체의 특정 실시형태에서, 기질 인식 서열은 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP□)에 의해 절단되며, 하기 식으로 나타낸다:
Figure pct00021
식 중,
R2는 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 H이며;
R3은 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 또는 아이소프로필, 및 더 바람직하게는 메틸이고;
R4는 존재하지 않거나 또는 (C1-C6) 알킬, -OH, -NH2, 또는 할로겐을 나타내며;
X는 O 또는 S를 나타내고; 그리고
-NH-는 L2가 자기 희생 링커라면 L2의 부분이거나 또는 L2가 결합이라면 DM의 부분인 아민을 나타낸다.
특정 실시형태에서, R2는 H이며, R3은 메틸이고, R4는 존재하지 않으며, X는 O이다.
b. 자기 희생기
본 발명의 결합제-약물 접합체는 약물 모이어티 및 절단성 기질 인식 서열 모이어티에 공유 결합된 헤테로사이클릴 자기-희생 모이어티를 사용할 수 있다. 자기-희생 모이어티는 정상적으로 안정한 분자 내로 2개의 이격된 화학적 모이어티를 함께 공유적으로 연결하고, 효소적 절단에 의해 분자로부터 상기 화학적 모이어티 중 하나를 방출할 수 있고; 상기 효소적 절단 후에, 상기 이격된 화학적 모이어티의 나머지를 방출하도록 2작용성 화학기의 나머지로부터 자발적으로 절단할 수 있는 2작용성 화학기로서 정의될 수 있다. 본 발명에 따르면, 자기-희생 모이어티는 이의 말단 중 하나에서 이의 말단 중 하나에서 직접적으로 또는 스페이서 단위를 통해 간접적으로, 아마이드 결합에 의해 리간드에 공유적으로 연결되고, 이의 다른 하나의 말단에서 약물로부터 남아있는 화학적 반응 부위(작용기)에 대해 공유적으로 연결된다. 자기-희생 모이어티에 의한 약물 모이어티의 유도체화는 약학적으로 덜 활성인(예를 들어, 덜 독성인) 또는 약물이 절단될 때까지 전혀 활성이 아닌 약물을 제공할 수 있다.
결합제-약물 접합체는 일반적으로 순환에서 안정하거나, 적어도 기질 인식 서열과 자기-희생 모이어티 간의 아마이드 결합을 절단할 수 있는 효소가 존재하지 않는 경우이어야 한다. 그러나, 적합한 효소에 대한 결합제-약물 접합체의 노출 시, 아마이드 결합은 절단되어, 자기-희생 모이어티를 약물에 공유적으로 연결하는 결합의 절단을 초래하는 자발적 자기-희생 반응을 개시함으로써, 이의 비유도체화된 또는 약학적으로 활성인 형태로 유리 약물 모이어티의 방출을 달성한다.
본 발명의 접합체에서 자기-희생 모이어티는 하나 이상의 헤테로원자를 혼입하고, 이에 의해 개선된 용해도를 제공하고, 절단율을 개선시키며, 접합체의 응집 경향을 감소시킨다. 헤테로사이클릴 자기-희생 링커의 이들 개선은 비-헤테로사이클릴 이상으로 본 발명을 작제하며, PAB-형 링커는 놀라운 그리고 예상치 못한 생물학적 특성, 예컨대 증가된 효능, 감소된 독성 및 더 바람직한 약물동태학을 초래할 수 있다.
특정 실시형태에서, L2는 벤질옥시카보닐기이다.
특정 실시형태에서, L2는 하기 식이되,
Figure pct00022
R1은 수소, 비치환 또는 치환된 C1-3　알킬, 또는 비치환 또는 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, R1은 수소이다. 특정 예에서, R1은 메틸이다.
특정 실시형태에서, L2는 하기 식들로부터 선택된다.
Figure pct00023
특정 실시형태에서, 자기-희생 모이어티 L2는 하기 식들로부터 선택된다
Figure pct00024
식 중,
U는 O, S 또는 NR6이고;
Q는 CR4　또는 N이며;
V1, V2　및 V3은 독립적으로 CR4　또는 N이고, 단, 화학식 II 및 III에 대해 Q, V1　및 V2　중 적어도 하나는 N이며;
T는 상기 약물 모이어티에 남아있는 NH, NR6, O 또는 S이고;
R1, R2, R3　및 R4는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, OH, -N(R5)2, -N(R5)3　+, C1-C8　알킬할라이드, 카복실레이트, 설페이트, 설파메이트, 설포네이트, -SO2R5, -S(O)R5, -SR5, -SO2N(R5)2, -C(O)R5, -CO2R5, -C(O)N(R5)2, -CN, -N3, -NO2, C1-C8　알콕시, C1-C8　할로치환된 알킬, 폴리에틸렌옥시, 포스포네이트, 포스페이트, C1-C8　알킬, C1-C8　치환된 알킬, C2-C8　알켄일, C2-C8　치환된 알켄일, C2-C8　알킨일, C2-C8　치환된 알킨일, C6-C20　아릴, C6-C20　치환된 아릴, C1-C20　헤테로사이클, 및 C1-C20　치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나; 또는 함께 취해질 때, R2　및 R3은 3 내지 7개의 탄소 원자의 카보닐(=O), 또는 스피로 탄소환식 고리를 형성하며; 그리고
R5　및 R6은 독립적으로 H, C1-C8　알킬, C1-C8치환된 알킬, C2-C8　알켄일, C2-C8　치환된 알켄일, C2-C8알킨일, C2-C8　치환된 알킨일, C6-C20　아릴, C6-C20　치환된 아릴, C1-C20　헤테로사이클, 및 C1-C20　치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
여기서 C1-C8　치환된 알킬, C2-C8　치환된 알켄일, C2-C8치환된 알킨일, C6-C20　치환된 아릴, 및 C2-C20 치환된 헤테로사이클은 F, Cl, Br, I, OH, -N(R5)2, -N(R5)3 +, C1-C8　알킬할라이드, 카복실레이트, 설페이트, 설파메이트, 설포네이트, C1-C8　알킬설포네이트, C1-C8　알킬아미노, 4-다이알킬아미노피리디늄, C1-C8　알킬하이드록실, C1-C8　알킬티올, -SO2R5, -S(=O)R5, -SR5, -SO2N(R5)2, -C(=O)R5, -CO2R5, -C(=O)N(R5)2, -CN, -N3, -NO2, C1-C8　알콕시, C1-C8　트라이플루오로알킬, C1-C8　알킬, C3-C12　카보사이클, C6-C20　아릴, C2-C20　헤테로사이클, 폴리에틸렌옥시, 포스포네이트, 및 포스페이트로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환된다.
T가 NH일 때, 이는 (자기-희생 모이어티에 대한 결합 전에) 약물 모이어티로부터 남아있는 1차 아민(-NH2)으로부터 유도되며, T가 N일 때, (자기-희생 모이어티에 대한 결합 전에) 약물 모이어티로부터의 2차 아민(-NH-)으로부터 유도된다는 것이 이해될 것이다. 유사하게, T가 O 또는 S일 때, 이는 자기-희생 모이어티에 대한 결합 전에 약물 모이어티로부터 남아있는 하이드록실(-OH) 또는 설프하이드릴(-SH)기로부터 각각 유도된다.
특정 실시형태에서, 자기-희생 링커 L2는 -NH-(CH2)4-C(=O)- 또는 -NH-(CH2)3-C(=O)-이다.
특정 실시형태에서, 자기-희생 링커 L2는 p-아미노벤질옥시카보닐(PABC)이다.
특정 실시형태에서, 자기-희생 링커 L2는 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린이다.
본 발명에서 사용하기에 용이하게 적합한 다른 예시적인 자기-희생 링커는, 예를 들어, 미국 특허 제7754681호, WO2012074693A1, 미국 특허 제9089614호, 유럽 특허 제1732607A2호, WO2015038426A1(이들 모두는 참조에 의해 원용됨), 문헌[Walther et al. "Prodrugs in medicinal chemistry and enzyme prodrug therapies" Adv Drug Deliv Rev. 2017 Sep 1;118:65-77, 및 Tranoy-Opalinski et al. "Design of self-immolative linkers for tumour-activated prodrug therapy", Anticancer Agents Med Chem. 2008 Aug;8(6):618-37]에 교시되며; 이들 각각의 교시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
c. 약물 모이어티
다양한 약물 독립체가 대상 결합제 약물 접합체의 약물 모이어티, 즉, DM으로서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 선천성 면역 경로 반응의 면역 활성제 및/또는 유도체로서 작용하는 약물을 포함하는 면역조절제이다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 IFN-α의 생산을 유도한다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 전염증 사이토카인의 생산을 유도한다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 IL-1β의 생산을 유도한다. 특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 IL-18의 생산을 유도한다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 NK, γδT 및 CD8+ T 세포를 유도하는 효과기 세포의 확장 및 생존을 촉진시킨다.
특정 실시형태에서, 유리 약물 모이어티는 대식세포 파이롭토시스를 유도한다.
(i) 예시적인 면역-DASH 저해제
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 면역-DASH 저해제는 하기 일반식으로 나타낸다;
Figure pct00025
식 중,
A는 N 및 Cα 탄소를 포함하는 4 내지 8원 헤테로사이클을 나타내고;
Z는 C 또는 N이며;
W는 -CN, -CH=NR5,
Figure pct00026
를 나타내고;
R'1은 C-말단 연결된 아미노산 잔기 또는 아미노산 유사체, 또는 C-말단 연결된 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 나타내며, 이의 아민 말단은 L1와 공유결합을 형성하거나, 또는 L1이 결합이라면, 기질 인식 서열을 갖고;
R'2는 존재하지 않거나 또는 고리 A에 대해 하나 이상의 치환을 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐(예컨대 카복실, 에스터, 포메이트, 또는 케톤), 티오카보닐(예컨대 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포메이트), 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7일 수 있으며;
X가 N이라면, R'3은 수소를 나타내며, X가 C라면, R'3은 수소 또는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐 (예컨대 카복실, 에스터, 포메이트, 또는 케톤), 티오카보닐 (예컨대 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포메이트), 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7을 나타내고;
R4는　수소, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-저급 알킬, -(CH2)n-O-알켄일, -(CH2)n-O-알킨일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-저급 알킬, -(CH2)n-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-저급 알킨일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3, -C(O)C(O)NH2, 또는 -C(O)C(O)OR8을 나타내며;
R5는 H, 알킬, 알켄일, 알킨일, -C(X1)(X2)X3, -(CH2)m-R7, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-알킬, -(CH2)n-O-알켄일, -(CH2)n-O-알킨일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-알킬, -(CH2)n-S-알켄일, -(CH2)n-S-알킨일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7, -C(O)C(O)NH2, 또는 -C(O)C(O)OR'7을 나타내고;
R6은 수소, 할로겐, 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R7을 나타내며,
R7은, 각각의 경우에 대해, 치환 또는 비치환된 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클을 나타내고;
R'7은, 각각의 경우에 대해, 수소, 또는 치환 또는 비치환된 알킬, 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클을 나타내며; 그리고
Y1 및 Y2는 독립적으로 또는 함께 OH, 또는 환식 유도체를 포함하는 하이드록실기로 가수분해될 수 있는 기일 수 있거나, 여기서 Y1 및 Y2는 고리 구조에서 5 내지 8개의 원자를 갖는 고리를 통해 연결되고(예컨대 피나콜 등),
R50은 O 또는 S를 나타내고; 그리고
R51은 N3, SH2, NH2, NO2 또는 O-R'7을 나타내며;
R52는 수소, 저급 알킬, 아민, OR'7, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 나타내거나, 또는 R51 및 R52는 이들의 부착된 인 원자와 함께 고리 구조에서 5 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클릴 고리를 완성하고,
X1은 할로겐을 나타내며;
X2 및 X3은 각각 수소 또는 할로겐을 나타내고,
m은 0이거나 또는 1 내지 8 범위의 정수이며; 그리고
n은 1 내지 8 범위의 정수이다.
바람직한 실시형태에서, 고리 A는, 예를 들어, 하기 식으로 나타내는 5, 6 또는 7원 고리이며,
Figure pct00027
더 바람직하게는 5 또는 6원 고리이다(즉, n은 1 또는 2이지만, n은 또한 3 또는 4일 수도 있다). 고리는 선택적으로, 추가로 치환될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, W는
Figure pct00028
를 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, R'1은 하기 식이다:
Figure pct00029
R36은 작은 소수성기, 예를 들어, 저급 알킬 또는 할로겐이며, R38은 수소이거나, 또는 R36 및 R37은 함께, 상기 A에 대해 정의한 바와 같이, N 및 Cα 탄소를 포함하는 4 내지 7원 헤테로사이클을 형성한다.
바람직한 실시형태에서, R'2는 존재하지 않거나, 또는 작은 소수성 기, 예컨대 저급 알킬 또는 할로겐을 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, R'3은 수소, 또는 작은 소수성 기, 예컨대 저급 알킬 또는 할로겐이다.
바람직한 실시형태에서, R'5는 수소, 또는 할로겐화된 저급 알킬이다.
바람직한 실시형태에서, X1은 플루오린이며, X2 및 X3은, 할로겐이라면, 플루오린이다.
또한 보론산 에스터 및 할라이드를 포함하는 임의의 앞서 언급한 화합물, 및 아세탈, 헤미아세탈, 케탈, 및 헤미케탈 및 환식 다이펩타이드 유사체를 포함하는 카보닐 균등물로 가수분해에 의해 전환될 수 있는 임의의 화합물이 균등물로서 여겨진다.
특정 바람직한 실시형태에서, 대상 방법은 면역-DASH 저해제로서, 아미노산의 보론산 유사체를 이용한다. 예를 들어, 본 발명은 대상 방법에서 보로-프로일 유도체의 사용을 상정한다. 본 발명의 예시적인 보론산 유도 저해제는 하기 일반식으로 나타낸다:
Figure pct00030
식 중,
R'1은 C-말단 연결된 아미노산 잔기 또는 아미노산 유사체, 또는 C-말단 연결된 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 나타내며, 이의 아민 말단은 L1와 공유결합을 형성하거나, 또는 L1이 결합이라면, 기질 인식 서열을 갖고; 그리고
R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 나타내거나, 또는 R11 및 R12는 이들이 부착된 O-B-O 원자와 함께 고리 구조에서 5 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클릴 고리르 완성한다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 P1 특이성 위치에서 프로일 기 또는 이의 유사체, 및 P2 특이성 위치에서 비극성(및 바람직하게는 소수성) 아미노산, 예를 들어, 비극성 아미노산, 예컨대 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 또는 메티오닌, 또는 이들의 유사체를 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드모방체이다. 다른 실시형태에서, P2 위치는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대 알기닌, 라이신, 아스파르트산 또는 글루탐산이다. 예를 들어, 면역-DASH 저해제는 Ala-Pro 또는 Val-Pro 다이펩타이드 서열 또는 이의 균등물을 포함할 수 있고, 하기 일반식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00031
바람직한 실시형태에서, 고리 A는, 예를 들어, 하기 식으로 나타내는 5, 6 또는 7원 고리이며,
Figure pct00032
특정 바람직한 실시형태에서, R32는 작은 소수성 기, 예를 들어, 저급 알킬 또는 할로겐이다.
특정 바람직한 실시형태에서, R32는 - 저급 알킬-구아니딘, -저급-알킬-아민, 저급-알킬-C(O)OH, 예컨대 -(CH2)m-NH-C(=N)(NH2), -(CH2)m-NH2 또는 -(CH2)m-COOH이며, m은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 3이다.
바람직한 실시형태에서, R'2는 존재하지 않거나, 또는 작은 소수성 기, 예컨대 저급 알킬 또는 할로겐을 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, R'3은 수소, 또는 작은 소수성 기, 예컨대 저급 알킬 또는 할로겐이다.
본 발명의 다른 양상은 화학식 III으로 나타내는 면역-DASH 저해제, 또는 이의 약제학적 염에 관한 것이다:
Figure pct00033
식 중,
고리 Z는 N 및 Cα 탄소를 포함하는 4 내지 10원 헤테로사이클을 나타내고;
W는 -CN, -CH=NR4, 표적의 활성 부위 잔기와 반응하는 작용기, 또는
Figure pct00034
를 나타내며;
7X는 O 또는 S이고;
X2는　H, 할로겐, 또는 저급 알킬이며;
Y1 및 Y2는 독립적으로 OH이거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 기를 나타내거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 5 내지 8원 고리를 형성하며;
R1은, 독립적으로 각각의 경우에 대해, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐, 티오카보닐, 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, -CF3, -(CH2)m-R3, -(CH2)mOH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R3, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일 또는 -(CH2)n-S-(CH2)m-R3을 나타내고;
R2는, 각각의 경우에 대해, 수소, 저급 알킬, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -C(=O)-알킬, -C(=O)-알켄일, -C(=O)-알킨일, 또는 -C(=O)-(CH2)m-R3을 나타내며;
R3은, 각각의 경우에 대해, 수소, 또는 치환된 또는 비치환된 저급 알킬, 저급 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클을 나타내고;　
R4는　수소, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-저급 알킬, -(CH2)n-O-알켄일, -(CH2)n-O-알킨일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-저급 알킬, -(CH2)n-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-저급 알킨일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3, -C(O)C(O)NH2, 또는 -C(O)C(O)OR8을 나타내며;
R5는 O 또는 S를 나타내고; 그리고
R6은　N3, SH, NH2, NO2　또는 OR8을 나타내며;
R7은 수소, 저급 알킬, 아민, OR8, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 나타내거나, 또는 R5 및 R6은 이들의 부착된 인 원자와 함께 고리 구조에서 5 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클릴 고리를 완성하고,
R8은, 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클릴을 나타내며;
R10은 존재하지 않거나 또는 이들이 현수된 고리 Z에 대한 1 내지 3개의 치환을 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐(예컨대 카복실, 에스터, 포메이트, 또는 케톤), 티오카보닐(예컨대 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포메이트), 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 아이소사이아노, 티오사이아네이토, 아이소티오사이아네이토, 사이아네이토, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, 저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일; -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R3, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3일 수 있으며;
n은 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고
m은 0, 1, 2 또는 3이다.
본 발명의 다른 양상은 화학식 IV로 나타내는 면역-DASH 저해제, 또는 이의 약제학적 염에 관한 것이다:
Figure pct00035
식 중,
고리 A는 N을 포함하는 3 내지 10원 고리를 나타내며;
고리 Z는 N 및 Cα 탄소를 포함하는 4 내지 10원 헤테로사이클을 나타내고;
W는 -CN, -CH=NR4, 표적의 활성 부위 잔기와 반응하는 작용기, 또는
Figure pct00036
를 나타내며;
X는 O 또는 S이고;
X1은 할로겐을 나타내며;
Y1 및 Y2는 독립적으로 OH이거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 기를 나타내거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 5 내지 8원 고리를 형성하며;
R1은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐, 티오카보닐, 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, -CF3, -(CH2)m-R3, -(CH2)mOH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R3, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일 또는 -(CH2)n-S-(CH2)m-R3을 나타내고;
R2는, 각각의 경우에 대해, 수소, 저급 알킬, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -C(=O)-알킬, -C(=O)-알켄일, -C(=O)-알킨일, 또는 -C(=O)-(CH2)m-R3을 나타내며;
R3은, 각각의 경우에 대해, 수소, 또는 치환된 또는 비치환된 저급 알킬, 저급 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클을 나타내고;　
R4는　수소, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-저급 알킬, -(CH2)n-O-알켄일, -(CH2)n-O-알킨일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-저급 알킬, -(CH2)n-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-저급 알킨일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3, -C(O)C(O)NH2, 또는 -C(O)C(O)OR8을 나타내며;
R5는 O 또는 S를 나타내고; 그리고
R6은　N3, SH, NH2, NO2　또는 OR8을 나타내며;
R7은 수소, 저급 알킬, 아민, OR8, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 나타내거나, 또는 R5 및 R6은 이들의 부착된 인 원자와 함께 고리 구조에서 5 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클릴 고리를 완성하고,
R8은, 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클릴을 나타내며;
R9 및 R10은 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 이들이 현수된 고리 A에 대한 또는 고리 Z에 대한 1 내지 3개의 치환을 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐(예컨대 카복실, 에스터, 포메이트, 또는 케톤), 티오카보닐(예컨대 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포메이트), 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 아이소사이아노, 티오사이아네이토, 아이소티오사이아네이토, 사이아네이토, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R3, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3일 수 있으며;
n은 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고
m은 0, 1, 2 또는 3이다.
특정 바람직한 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 DASH 효소 DPP8 및 DPP9(및 선택적으로 또한 DPP-4 및/또는 FAP)의 보론산 저해제이다.
특정 바람직한 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 DASH 효소 DPP8 및 DPP9(및 선택적으로 또한 DPP-4 및/또는 FAP)의 다이펩타이드 보론산 저해제이다. 특정 바람직한 실시형태에서, 면역-DASH 저해제인 다이펩타이드 보론산은 P1 위치에서 프롤린 또는 프롤린 유사체를 가진다. 대상 면역-DASH 저해제는 면역-매개 메커니즘에 의해 종양 억제를 매개할 수 있다. 대상 면역-DASH 저해제는 대식세포 파이롭토시스를 유도하고, 직접적으로 또는 간접적으로 이러한 활성을 면역원성 조절로서 갖고, 종양 세포를 항원-특이적 CTL 사멸에 대해 민감화하고, 면역-세포 서브세트 및 기능을 변경시키고, 수지상 세포 수송의 조절을 통해 T 세포 프라이밍을 가속화하고, 일반적 T-세포 매개 항종양 활성을 유발한다.
특정 실시형태에서, 면역-DASH 저해제 및 PD-1 저해제의 대상 조합은 하나 이상의 다른 화학치료제, 면역-종양학 제제 또는 방사선을 수반하는 요법의 부분으로서 투여될 수 있다. 이는 또한 종양 백신, 입양 세포 요법, 유전자 요법, 종양세포 붕괴성 바이러스 요법 등을 포함하는 요법의 부분으로서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 방법의 면역-DASH 저해제는 하기 화학식 I, 또는 이의 약제학적 염으로 나타낸다:
Figure pct00037
식 중,
고리 A는 3 내지 10원 고리 구조를 나타내며;
고리 Z는 N 및 Cα 탄소를 포함하는 4 내지 10원 헤테로사이클을 나타내고;
W는 -CN, -CH=NR4, 표적의 활성 부위 잔기와 반응하는 작용기, 또는
Figure pct00038
를 나타내며;
X는 O 또는 S이고;
X1은 할로겐을 나타내며;
Y1 및 Y2는 독립적으로 OH이거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 기를 나타내거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 5 내지 8원 고리를 형성하며;
R1은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐, 티오카보닐, 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, -CF3, -(CH2)m-R3, -(CH2)mOH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R3, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일 또는 -(CH2)n-S-(CH2)m-R3을 나타내고;
R2는, 각각의 경우에 대해, 수소, 저급 알킬, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -C(=O)-알킬, -C(=O)-알켄일, -C(=O)-알킨일, 또는 -C(=O)-(CH2)m-R3을 나타내며;
R3은, 각각의 경우에 대해, 수소, 또는 치환된 또는 비치환된 저급 알킬, 저급 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클을 나타내고;　
R4는　수소, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-저급 알킬, -(CH2)n-O-알켄일, -(CH2)n-O-알킨일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-저급 알킬, -(CH2)n-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-저급 알킨일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3, -C(O)C(O)NH2, 또는 -C(O)C(O)OR8을 나타내며;
R5는 O 또는 S를 나타내고; 그리고
R6은　N3, SH, NH2, NO2　또는 OR8을 나타내며;
R7은 수소, 저급 알킬, 아민, OR8, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 나타내거나, 또는 R5 및 R6은 이들의 부착된 인 원자와 함께 고리 구조에서 5 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클릴 고리를 완성하고,
R8은, 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클릴을 나타내며;
R9 및 R10은 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 이들이 현수된 고리 A에 대한 또는 고리 Z에 대한 1, 2 또는 3개의 치환을 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐 (예컨대 카복실, 에스터, 포메이트, 또는 케톤), 티오카보닐 (예컨대 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포메이트), 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 아이소사이아노, 티오사이아네이토, 아이소티오사이아네이토, 사이아네이토, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, 저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일;-(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R3, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3일 수 있으며;
n은 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고
m은 0, 1, 2 또는 3이다.
특정 실시형태에서, 화학식 I의 면역-DASH 저해제는 화학식 Ia에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00039
식 중, X, W, Z, R1, R2, R9 및 R10은 화학식 I에 대해 상기 정의한 바와 같고, p는 1, 2 또는 3이다.
Ia의 특정 바람직한 실시형태에서: R1은 저급 알킬이고; R9는 존재하지 않거나, 또는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
특정 실시형태에서, 화학식 I의 면역-DASH 저해제는 화학식 Ib에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00040
식 중, X, W, R1, R2, R9 및 R10은 화학식 I에 대해 상기 정의한 바와 같고, p는 1, 2 또는 3이다.
Ib의 특정 바람직한 실시형태에서: R1은 저급 알킬이고; R9는 존재하지 않거나, 또는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
특정 실시형태에서, 화학식 I의 면역-DASH 저해제는 화학식 Ic에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00041
식 중, X, W, R1, R2, R9 및 R10은 화학식 I에 대해 상기 정의한 바와 같고, p는 1, 2 또는 3이다.
Ic의 특정 바람직한 실시형태에서: R1은 저급 알킬이고; R9는 존재하지 않거나, 또는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
일부 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 하기로 나타낸다:
Figure pct00042
본 발명의 다른 양상은 화학식 IV로 나타내는 면역-DASH 저해제, 또는 이의 약제학적 염에 관한 것이다:
Figure pct00043
식 중,
고리 A는, R1a의 각각의 경우에 따라, 7 내지 12원 다환식 고리 구조를 나타내며;
고리 Z는 N 및 Cα 탄소를 포함하는 4 내지 10원 헤테로사이클을 나타내고;
W는 -CN, -CH=NR4, 표적의 활성 부위 잔기와 반응하는 작용기, 또는
Figure pct00044
를 나타내며;
X는 O 또는 S이고;
X1은 할로겐을 나타내며;
Y는 C 또는 N이고;
Y1 및 Y2는 독립적으로 OH이거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 기를 나타내거나, 또는 이들이 부착된 붕소 원자와 함께 보론산으로 가수 분해 가능한 5 내지 8원 고리를 형성하며;
R1a는 저급 알킬, -(CH2)m-, -(CH2)m-O-(CH2)m-;-(CH2)m-N-(CH2)m-; 또는 -(CH2)m-S-(CH2)m-이고;
R2는, 각각의 경우에 대해, 수소, 저급 알킬, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -C(=O)-알킬, -C(=O)-알켄일, -C(=O)-알킨일, 또는 -C(=O)-(CH2)m-R3을 나타내며;
R3은, 각각의 경우에 대해, 수소, 또는 치환된 또는 비치환된 저급 알킬, 저급 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클을 나타내고;　
R4는 수소, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, -(CH2)m-R3, -(CH2)n-OH, -(CH2)n-O-저급 알킬, -(CH2)n-O-알켄일, -(CH2)n-O-알킨일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R7, -(CH2)n-SH, -(CH2)n-S-저급 알킬, -(CH2)n-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-저급 알킨일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3, -C(O)C(O)NH2, 또는 -C(O)C(O)OR8을 나타내며;
R5는 O 또는 S를 나타내고;
R6은　N3, SH, NH2, NO2　또는 OR8을 나타내며;
R7은 수소, 저급 알킬, 아민, OR8, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 나타내거나, 또는 R5 및 R6은 이들의 부착된 인 원자와 함께 고리 구조에서 5 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클릴 고리를 완성하고,
R8은, 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 알켄일, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 헤테로사이클릴을 나타내며;
R9 및 R10은 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 이들이 현수된 고리 A에 대한 또는 고리 Z에 대한 1, 2 또는 3개의 치환을 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 할로겐, 저급 알킬, 저급 알켄일, 저급 알킨일, 카보닐 (예컨대 카복실, 에스터, 포메이트, 또는 케톤), 티오카보닐 (예컨대 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포메이트), 아미노, 아실아미노, 아미도, 사이아노, 아이소사이아노, 티오사이아네이토, 아이소티오사이아네이토, 사이아네이토, 나이트로, 아지도, 설페이트, 설포네이트, 설폰아미도, 저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일; -(CH2)m-R7, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-저급 알킬, -(CH2)m-O-저급 알켄일, -(CH2)n-O-(CH2)m-R3, -(CH2)m-SH, -(CH2)m-S-저급 알킬, -(CH2)m-S-저급 알켄일, -(CH2)n-S-(CH2)m-R3일 수 있으며;
n은 0, 1, 2 또는 3이고;
m은 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고
p는 1, 2 또는 3이다.
특정 실시형태에서, 화학식 II의 면역-DASH 저해제는 화학식 IIa에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00045
식 중, X, W, Z, R2, R9 및 R10은 화학식 II에 대해 상기 정의한 바와 같다.
IIa의 특정 바람직한 실시형태에서: R9는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
특정 실시형태에서, 화학식 II의 면역-DASH 저해제는 화학식 IIb에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00046
식 중, X, W, R2, R9 및 R10은 화학식 II에 대해 상기 정의한 바와 같다.
IIb의 특정 바람직한 실시형태에서: R9는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
특정 실시형태에서, 화학식 II의 면역-DASH 저해제는 화학식 IIc에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00047
식 중, X, W, R2, R9 및 R10은 화학식 II에 대해 상기 정의한 바와 같다.
IIc의 특정 바람직한 실시형태에서: R9는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
특정 실시형태에서, 화학식 II의 면역-DASH 저해제는 화학식 IId에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00048
식 중, X, W, R2, R9 및 R10은 화학식 II에 대해 상기 정의한 바와 같다.
IId의 특정 바람직한 실시형태에서: R9는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
특정 실시형태에서, 화학식 II의 면역-DASH 저해제는 화학식 IIe에 나타내거나, 또는 이의 약제학적 염이다:
Figure pct00049
식 중, X, W, Z, R2, R9 및 R10은 화학식 II에 대해 상기 정의한 바와 같다.
IIe의 특정 바람직한 실시형태에서: R9는 독립적으로 각각의 경우에 대해, 저급 알킬, -OH, -NH2, -N3, -저급 알킬-C(O)OH, -O-저급 알킬, -O-저급 알킬-C(O)OH, -구아니딘일이며; X는 O이고; 각각의 R2는 수소이며, R10은 존재하지 않거나, 또는 -OH, -NH2, -CN 또는 -N3의 단일 치환을 나타내고; Z는 피롤리딘 또는 피페리딘 고리(더 바람직하게는 피롤리딘 고리)이며; 그리고 W는 -B(OH)2 또는 -CN(더 바람직하게는 -B(OH)2)이다.
일부 실시형태에서, 면역-DASH 저해제는 다음 중 하나이다:
Figure pct00050
(ii) 예시적인 STING 작용제
STING 작용제의 비제한적 예는 하기 일반식 중 하나로 나타내는 작용제를 포함한다:
Figure pct00051
식 중,
X1 및 X2는 독립적으로, O 또는 S이고, 바람직하게는 동일하다(O,O 또는 S,S);
X3 및 X4는 독립적으로, 퓨린, 예컨대 구아닌 또는 구아닌 유사체, 또는 피리미딘이고, 물결선은 L1에 대한 공유 부착 부위를 나타내거나, 또는 L1은 기질 인식 서열에 대한 결합이고;
R1 및 R2는 독립적으로, H, 하이드록실, 할로겐(바람직하게는 F 또는 Cl) 또는 1 내지 18개 탄소로부터의 그리고 0 내지 3 헤테로원자로부터의 선택적으로 치환된 직쇄 알킬, 1 내지 9개 탄소의 선택적으로 치환된 알켄일, 1 내지 9개 탄소로부터의 선택적으로 치환된 알킨일, 또는 선택적으로 치환된 아릴이되, 치환체(들)는 존재한다면, C1-6 알킬 직쇄 또는 분지쇄, 벤질, 할로겐, 트라이할로메틸, C1-6 알콕시, -NO2, -NH2, -OH, =O, -COOR' 또는 -OR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있되, R1 및 R2는 둘 다 H가 아니고,
R'는 H 또는 저급 알킬, -CH2OH, 또는 -CONH2이다.
특정 실시형태에서, STING 작용제는 하기 화학식 중 하나로 나타낸다:
Figure pct00052
상기 STING 작용제 구조에서, X3 및 X4는 각각 독립적으로, 예를 들어, 9-퓨린, 9-아데닌, 9-구아닌, 9-하이포잔틴, 9-잔틴, 9-요산, 또는 9-아이소구아닌일 수 있으며, 단, X3 또는 X4 중 하나는 L2가 자기 희생 링커라면 L2와 결합을 공유하는 작용기, 또는 L2가 (해당) 결합이라면, DM과 결합을 공유하는 작용기를 포함한다.
X3 및 X4는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시형태에서, STING 작용제는 대부분 Rp,Rp 또는 Rp,Sp 입체이성질체의 형태로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, STING 작용제는 대부분 Rp,Rp 입체이성질체의 형태로 제공될 수 있다.
예시적인 STING 작용제는 하기를 포함한다:
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
특정 실시형태에서, STING 작용제는 다음의 구조식 중 하나로 나타낸다:
Figure pct00058
본 결합제 접합체에서 약물 모이어티로서 사용될 수 있는 또 다른 STING 작용제는 하기이다:
Figure pct00059
본 발명의 접합체에서 약물 모이어티로서 사용하는 데 용이하게 적합할 수 있는 또 다른 예시적인 STING 작용제는, 단지 예시를 위해, 국제 특허 출원 공개 WO2017123669A1, 및 WO2015077354A1, 및 미국 특허 공개 제20150056224A1호(이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 교시된다.
또한, 특히 자기-희생 링커의 사용에 의해, STING 작용제는, 예컨대 유리 하이드록실기를 통해, 상기 나타낸 바와 같은 아민 이외의 작용기를 통해 링커에 결합될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
(iii) 예시적인 TLR 작용제
"Toll-유사 수용체(TLR) 작용제"의 예는 TLR1/2 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제(예를 들어, PolyI:C), TLR4 작용제(예를 들어, S-형 지질다당류, 파클리탁셀, 지질 A, 및 모노포스포릴 지질 A), TLR5 작용제(예를 들어, 플라젤린), TLR6/2 작용제(예를 들어, MALP-2), TLR7 작용제, TLR7/8 작용제(예를 들어, 가르디퀴모드, 이미퀴모드, 록소리빈 및 레시퀴모드(R848)), TLR7/9 작용제(예를 들어, 하이드록시클로로퀸 설페이트), TLR8 작용제(예를 들어, 모톨리모드(VTX-2337)), TLR9 작용제(예를 들어, CpG-ODN), 및 TLR11 작용제(예를 들어, 프로필린)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 결합제 접합체에서 약물 모이어티로서 사용될 수 있는 예시적인 TRL 작용제는 S-27609, CL307, UC-IV150, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드, 모톨리모드, VTS-1463GS-9620, GSK2245035, TMX-101, TMX-201, TMX-202, 이사토리빈, AZD8848, MEDI9197, 3M-051, 3M-852, 3M-052, 3M-854A, S-34240, KU34B, 또는 CL663, 또는 적절하다면, 관련된 결합을 위해 적절한 작용기를 갖는 이들의 유사체를 포함하고, 기질 인식 서열로부터 또는 자기 희생 링커에 대한 결합에 의해 방출된다.
TRL, 특히 TRL7 작용제, TRL8 작용제 및 TRL7/8 작용제의 예시적인 작용제는 하기를 포함한다:
Figure pct00060
Figure pct00061
특정 실시형태에서, 약물 모이어티는 하기 일반식으로 나타내는 TRL7/8 작용제이다:
Figure pct00062
식 중,
X는 CH2, O, S 또는 N, 바람직하게는 CH2, O 또는 N, 더 바람직하게는 CH2 또는 O이고;
n은 0(N으로부터 O까지의 직접 결합), 또는 1 내지 5, 바람직하게는 1 또는 2의 정수이고;
z는 1 내지 5의 정수이며;
m은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 16의 정수이고;
p는 0(고리로부터 X까지의 직접 결합), 또는 1 내지 5, 바람직하게는 1 또는 2의 정수이며; 그리고
q는 1 내지 5, 바람직하게는 1 또는 2의 정수이다.
예를 들어, TRL 작용제는 TRL7/8 작용제, 예컨대 하기 중 하나이다:
Figure pct00063
공개 번호 WO2008135791, WO2016141092는 또한 TLR7을 통해 작용하는 면역-조절 특성을 갖는 이미다조퀴놀린 화합물의 부류를 기재한다.
본 발명의 결합제 접합체의 약물 모이어티로서 사용하기에 용이하게 적합한 다른 예시적인 TRL 작용제는, 예를 들어, 문헌[Yoo et al. "Structure-activity relationships in Toll-like receptor 7 agonistic 1H-imidazo[4,5-c]pyridines" Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 6526-6545; Fletcher et al. "Masked oral prodrugs of Toll-like receptor 7 agonists: a new approach for the treatment of infectious disease", 2006 Current opinion in investigational drugs (London, England). 7. 702-708; 및 Pryde et al. "The discovery of a novel prototype small molecule TLR7 agonist for the treatment of hepatitis C virus infection" Med. Chem. Commun., 2011, 2, 185-189]에 개시되어 있다.
또한, 특히 자기-희생 링커의 사용에 의해, TRL 작용제는, 예컨대 유리 하이드록실기를 통해, 상기 나타낸 바와 같은 아민 이외의 작용기를 통해 링커에 결합될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
(iv) 예시적인 RIG-1 작용제
앞서 언급한 실시형태 중 어느 하나의 접합체로서, 상기 면역-자극 작용제는 RIG-I 작용제이되, RIG-I 작용제는 KIN700, KIN1148, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400, KIN2000 또는 SB-9200이다.
(v) 예시적인 안트라사이클린
특정 실시형태에서, 약물 모이어티는 종양 세포의 면역원성 세포사를 유도할 수 있는 안트라사이클린 또는 이의 유도체, 바람직하게는 독소루비신 또는 다른 유사체이다.
안트라사이클린 및 이의 유사체는 구체적으로는, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 피라루비신, 발루비신, 아클라루비신, 미톡산트론, 악티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 및 미토마이신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 안트라사이클린 모이어티는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00064
식 중,
Rc는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)하이드록시알킬, 또는 (C1-C6)알칸오일옥시(C1-C6)알킬, 특히 메틸, 하이드록시메틸, 다이에톡시아세톡시메틸, 또는 뷰티릴옥시메틸을 나타내고;
Rd는 수소, 하이드록실, 또는 (C1-C6)알콕시, 특히 메톡시를 나타내며;
Re　및 Rf　중 하나는 수소 원소를 나타내고; 다른 하나는 수소 원자 또는 하이드록시 또는 테트라하이드로피란-2-일옥시(OTHP) 기를 나타낸다.
(vi) 예시적인 프로테아좀 저해제
특정 실시형태에서, 약물 모이어티는 프로테아좀 저해제이다. 예시적인 프로테아좀 저해제는 하기 식을 포함한다:
Figure pct00065
Figure pct00066
d. 세포 결합 모이어티
특정 실시형태에서, 질환 조직은 종양이다. 특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 세포 결합 모이어티는 종양 세포 상의 세포 표면 단백질에 결합하도록 선택된다. 다른 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 세포 결합 모이어티는 대식세포, 단핵구 유래 억제 세포(MDSC), 수지상 세포, 섬유아세포, T-세포, NK 세포, 비만 세포, 과립구, 호산구 및 B-세포 상의 세포 표면 단백질이 결합하도록 선택된다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체가 표적 세포 상의 표면 특징과 결합할 때, 결합제-약물 접합체의 세포 결합 모이어티는 적어도 6시간, 더 바람직하게는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 36, 48, 60, 75 또는 심지어 100시간의 내재화 반감기를 갖도록 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포 표면 단백질에 결합하는 결합제-약물 접합체의 세포 결합 모이어티는 건강한 상태의 조직으로부터의 정상 세포에 대해 질환 조직에서 표적 세포에 의해 선택적으로 발현되거나 상향조절된다. 예를 들어, 단백질은 조직으로부터의 정상 세포보다 2배 더 높은 수준, 훨씬 더 바람직하게는 조직으로부터의 정상 세포보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 심지어 1000-배 더 높은 수준에서 표적 세포의 표면 상에서 검출 가능하다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 세포 결합 모이어티는 다른 조직으로부터의 세포, 특히 중요한 기관으로부터의 세포에 비해 질환 조직 내 표적 세포에 의해 선택적으로 발현되거나 상향조절되는 세포 표면 단백질에 결합하도록 선택된다. 예를 들어, 단백질은 다른 조직으로부터의 세포보다 2배 더 높은 수준, 훨씬 더 바람직하게는 다른 조직으로부터의 세포보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 또는 심지어 1000-배 더 높은 수준에서 표적 세포의 표면 상에서 검출 가능하다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 세포 결합 모이어티는 관문 단백질에 결합하도록 선택되고, 바람직하게는 세포 결합 모이어티는 해당 관문점의 길항제이다. 관문 단백질의 예는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, BTLA, KIR, TIM-3, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, GAL9, CD160, VISTA, BTNL2, TIGIT, PVR, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A2 및 CSF-1R, 더 바람직하게는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, VISTA, HVEM, TIGIT, PVR, PD-L1 및 CD160으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 세포 결합 모이어티는 공자극 수용체에 결합하도록 선택되고, 세포 결합 모이어티는 수용체의 공자극 작용제이다. 예는 4-1BB, 4-1BB-L, OX40, OX40-L, GITR, CD28, CD40, CD40-L, ICOS, ICOS-L, LIGHT, 및 CD27, 더 바람직하게는 4-1BB, OX40, GITR, CD40 및 ICOS로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 수용체 또는 리간드인 표면 특징을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 결합 모이어티는 항체, 예컨대 인간화된 항체, 인간 항체, 또는 키메라 항체이거나, 또는 세포 표면 특징, 예컨대 Fab, F(ab)2, F(ab'), F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv, 이황화 연결된 Fv, dAb 또는 sdAb(또는 나노바디), CDR, scFv, (scFv)2, 다이-scFv, 바이-scFv, tascFv(탠덤 scFv), AVIBODY(예를 들어, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디), T-세포 관여자(BiTE), scFv-Fc, Fcab, mAb2, 소형 모듈 면역약제(SMIP), Genmab/유니바디 또는 듀오바디, V-NAR 도메인, IgNAR, 미니바디, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, 인트라바디 또는 다중특이성 항체에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포 결합 모이어티는, 예컨대 애피바디, 아피머, 아필린, 안티칼린, 아트리머, 아비머, DARPin, FN3 스캐폴드(예를 들어, 어드넥틴 및 센티린), 파이노머, 쿠니츠 도메인, 나노피틴, 프로넥틴, 오바디, 트라이바디, 아비머, 이환식 펩티드 및 Cys-노트로부터 선택된, 비-항체 스캐폴드이다.
(i) PD-L1 결합 아피머
특정 실시형태에서, 세포 결합 모이어티는 PD-L1에 결합하는 아피머이다. 아피머는 스테핀 A에 기반한 스캐폴드이며, 이는 스테핀 A, 바람직하게는 포유류 스테핀 A, 더 바람직하게는 인간 스테핀 A로부터 유래된 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 본 출원의 일 양상은 아미노산 서열을 갖는 야생형 스테핀 A 단백질로부터의 용매 접근성 루프 중 하나 이상이 PD-L1에, 바람직하게는 선택적으로, 바람직하게는 10-6M 이하의 Kd로 결합하는 능력을 갖는 아피머를 제공하는 아피머를 포함하는, PD-L1에 결합하는 아피머(또는 "항-PD-L1 아피머"로서 지칭됨)를 제공한다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머는 골격 서열을 갖고, 루프 2[(Xaa)n으로 표기] 및 루프 4[(Xaa)m으로 표기] 중 하나 또는 둘 다는 대안의 루프 서열 (Xaa)n 및 (Xaa)m으로 대체되는 야생형 인간 스테핀 A 단백질로부터 유래되며, 하기 일반식 (i)을 가진다:
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
식 중,
FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(서열번호 1)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열이고;
FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(서열번호 2)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드이며;
FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(서열번호 3)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
Xaa는 각각의 경우에 대해 개개로 아미노산 잔기이고, n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이다.
특정 실시형태에서, FR1은 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, FR1은 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있고; 특정 실시형태에서, FR2는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, FR2는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있고; 특정 실시형태에서, FR3은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, FR3은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 FR1, FR2 및/또는 FR3에 대응하는 아피머 서열 영역의 일부에서, 더 바람직하게는 아피머 내 아미노산 잔기로의 치환으로 제공될 것이며, 이의 측쇄는 용매 접근 가능하며, 아피머의 다른 부분과의 수소 결합에 관여하지 않는다. 일반적으로, 시스테인은 루프 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 내로 도입되지 않을 것이다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머는 하기 식으로 나타내는 아미노산 서열을 가진다(서열번호 4):
Figure pct00067
식 중,
Xaa는 개개로 각각의 경우에 대해, 아미노산 잔기이고; n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이며; Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, 또는 Glu, 더 바람직하게는 Gly, Ala, Arg 또는 Lys, 훨씬 더 바람직하게는 Gly 또는 Arg이고; Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 더 바람직하게는 Gly 또는 Ser이며; Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr, 더 바람직하게는 Arg, Lys, Asn 또는 Gln, 훨씬 더 바람직하게는 Lys 또는 Asn이고; Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 더 바람직하게는 Gly 또는 Ser이며; Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro, 더 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Pro, 훨씬 더 바람직하게는 Leu 또는 Pro이고; Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu, 더 바람직하게는 Ala, Val, Asp 또는 Glu, 훨씬 더 바람직하게는 Ala 또는 Glu이며; 그리고 Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys, 더 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Arg, 훨씬 더 바람직하게는 Leu 또는 Arg이다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 바람직하게는 루프 서열 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 이외의 아피머 서열의 일부에서 제공될 것이다. 따라서, 서열번호 4는 해당 서열의 변하는 위치에서 아미노산 잔기 대신에 1 내지 5개의 시스테인을 포함할 것이다.
예를 들어, 항-PD-L1 아피머는 하기 식으로 나타내는 아미노산 서열을 가질 수 있다(서열번호 5):
Figure pct00068
Xaa는 각각의 경우에 대해 개개로 아미노산 잔기이고; n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이다.
특정 실시형태에서, n은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9이다.
특정 실시형태에서, m은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9이다.
특정 실시형태에서, Xaa는, 독립적으로 각각의 경우에 대해, 원핵 또는 진핵 세포에서 재조합 발현에 의해 폴리펩타이드에 첨가될 수 있는 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 20가지의 천연 유래 아미노산 중 하나이다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 바람직하게는 루프 서열 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 이외의 아피머 서열의 일부에서 제공될 것이다. 따라서, 서열번호 5는 해당 서열의 변하는 위치에서 아미노산 잔기 대신에 1 내지 5개의 시스테인을 포함할 것이다.
상기 서열 및 화학식의 특정 실시형태에서, (Xaa)n은 하기 식 (II)에 나타낸 아미노산 서열이다
-aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6- (II)
식 중,
aa1은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Lys, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Lys 또는 Arg을 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 더 바람직하게는 작은 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu을 나타내며;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, 훨씬 더 바람직하게는 His 또는 Tyr, Trp 또는 His을 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 a 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 더 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu을 갖는 아미노산 잔기를 나타내며;
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 작은 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄; 더 바람직하게는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고; 그리고
aa6은 방향족 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Asp 또는 Glu; 더 바람직하게는 Trp 또는 Asp; 훨씬 더 바람직하게는 Trp을 나타낸다.
상기 서열 및 화학식의 특정 실시형태에서, (Xaa)n은 하기 식 (III)에 나타낸 아미노산 서열이다
-aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp- (III)
식 중,
aa1은 염기성 측쇄 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 바람직하게는 Lys, Arg, His, Ser, Thr, Asn 또는 Gln, 더 바람직하게는 Lys, Arg, His, Asn 또는 Gln, 훨씬 더 바람직하게는 Lys 또는 Asn을 나타내고;
aa2는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄, 더 바람직하게는 작은 지방족 측쇄, 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Ala, Gln, Asp 또는 Glu을 나타내며;
aa3은 방향족 또는 염기성 측쇄, 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg 또는 His, 더 바람직하게는 Phe, Tyr, Trp 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Tyr, Trp 또는 His을 갖는 아미노산 잔기를 나타내고;
aa4는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 바람직하게는 a 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄; 더 바람직하게는 Ala, Pro, Ile, Gln, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Gln, Lys, Arg, His, Asp 또는 Glu을 갖는 아미노산 잔기를 나타내며; 그리고
aa5는 중성 극성 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 또는 작은 지방족 또는 방향족 측쇄; 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 측쇄; 더 바람직하게는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg 또는 His, 훨씬 더 바람직하게는 Ser, Asn, Gln, Asp, Glu 또는 Arg을 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다.
상기 서열 및 화학식의 특정 실시형태에서, (Xaa)n은 서열번호 6 내지 40으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 6 내지 40으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, (Xaa)n은 서열번호 6 내지 40으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
Figure pct00069
Figure pct00070
상기 서열 및 화학식의 특정 실시형태에서, (Xaa)m은 하기 식 (IV)에 나타낸 아미노산 서열이다
-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15- (IV)
식 중,
aa7은 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기; 바람직하게는 Gly, Ala, Val, Pro, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu, 훨씬 더 바람직하게는 Gly, Ala, Trp, Gln, Ser, Asp 또는 Glu를 나타내며;
aa8은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Asp, Glu, Lys, Arg, His, Gln, Ser, Thr, Asn, Ala, Val, Pro, Gly, Tyr 또는 Phe, 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, Lys, Arg, His 또는 Gln을 나타내고;
aa9는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Gln, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Arg, Lys, Gly, Leu, Pro 또는 Tyr, 훨씬 더 바람직하게는 Gln, Thr 또는 Asp를 나타내며;
aa10은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Gln, Asn, Ala, Leu, Tyr, Trp, Pro 또는 Gly, 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, His, Gln, Asn, Leu, Trp 또는 Gly을 나타내고;
aa11은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 염기성 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Arg, Lys, His, Val, Ile, Tyr 또는 Gly 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Lys 또는 His을 나타내며;
aa12는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Thr, Gln, Asn, Lys, Arg, Val, Leu, Ile, Trp, Tyr, Phe 또는 Gly 훨씬 더 바람직하게는 Asp, Glu, Ser, Tyr, Trp, Arg 또는 Lys을 나타내고;
aa13은 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄 또는 비극성 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄, 더 바람직하게는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Pro, Asp, Glu, His, Arg, Trp, Tyr 또는 Phe 훨씬 더 바람직하게는 Ser, Thr, Gln, Asn, Val, Ile, Leu, Gly, Asp 또는 Glu을 나타내며;
aa14는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 Ala, Ile, Trp, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, His, Ser, Thr, Gln 또는 Asn 훨씬 더 바람직하게는 Ala, Pro, Asp, Glu, Arg, Lys, Ser, Gln 또는 Asn을 나타내고; 그리고
aa15는 아미노산 잔기, 바람직하게는 중성 극성 또는 중성 비극성 측쇄 또는 하전된 (산성 또는 염기성) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln, Asn, Ala, Val, Leu, Gly 또는 Phe 훨씬 더 바람직하게는 His, Arg, Lys, Asp, Ser, Thr, Gln 또는 Asn을 나타낸다.
상기 서열 및 화학식의 특정 실시형태에서, (Xaa)m은 서열번호 41 내지 75로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 41 내지 75로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, (Xaa)m은 서열번호 41 내지 75로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
Figure pct00071
Figure pct00072
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머는 서열번호 76 내지 84로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 76 내지 84로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머는 서열번호 76 내지 84로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 바람직하게는 루프 서열 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 이외의 아피머 서열의 일부에서 제공될 것이다. 따라서, 항-PD-L1 아피머는, 바람직하게는 루프 2 또는 루프 4 서열에 있지 않지만, 해당 서열의 다양한 위치에서 아미노산 잔기 대신에 적어도 1 내지 5개의 시스테인의 포함에 의해 서열번호 76 내지 84로 변하는 서열을 가질 것이다.
Figure pct00073
Figure pct00074
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머는 엄격한 조건(예컨대 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)의 존재 하 다음에 65℃에서 0.2X SSC에서의 세척) 하에 서열번호 85 내지 92 중 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 336에 대응하는 암호 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 서열번호 85 내지 92 중 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 336과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 98% 동일한 암호 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열, 또는 서열번호 85 내지 92 중 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 336에 혼성화하는 암호 서열을 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 가진다.
적어도 하나의 약물-접합체 모이어티가 아피머 서열에 도입된 시스테인의 티올 측쇄를 통해 아피머 서열에 현수되는 해당 실시형태에 대해, 시스테인은 바람직하게는 루프 서열 (Xaa)n 또는 (Xaa)m 이외의 아피머 서열의 일부에서 제공될 것이다. 따라서, 항-PD-L1 아피머는, 바람직하게는 루프 2 또는 루프 4 서열에 있지 않지만, 해당 서열의 다양한 위치에서 아미노산 잔기 대신에 적어도 1 내지 5개의 시스테인의 포함에 의해 서열번호 85 내지 92에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 변하는 서열을 가질 것이다.
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
더 나아가, 약간의 변형은 또한 - 상기 기재한 루프 2 및 루프 4 삽입물을 이후에 - 본 명세서에 개시된 스테핀 A 또는 스테핀 A 유래 서열에 대한 작은 결실 또는 첨가, 예컨대 스테핀 A 또는 스테핀 A 유래 아피머 폴리펩타이드에 대해 최대 10개의 아미노산의 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 약 1μM 이하, 약 100nM 이하, 약 40nM 이하, 약 20nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하, 또는 약 0.1nM 이하의 해리 상수(KD)로 단량체로서 인간 PD-L1에 결합한다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드 부분은, 예컨대 비아코어에 의해 측정할 때, 약 10-3 s-1(즉, 1/초의 단위) 또는 더 느린; 약 10-4 s-1 또는 더 느린 또는 심지어 약 10-5 s-1 또는 더 느린 오프 속도 상수(Koff)로 단량체로서 인간 PD-L1에 결합한다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드 부분은, 예컨대 비아코어에 의해 측정할 때, 적어도 약 103 M-1s-1 또는 더 빠른; 적어도 약 104 M-1s-1 또는 더 빠른; 적어도 약 105 M-1s-1 또는 더 빠른; 또는 심지어 적어도 약 106 M-1s-1 또는 더 빠른 결합 상수(Kon)로 단량체로서 인간 PD-L1에 결합한다.
특정 실시형태에서, PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드 부분은 1μM 이하, 약 100nM 이하, 약 40nM 이하, 약 20nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하, 또는 약 0.1nM 이하의 인간 PD-1로 경쟁적 결합 분석에서의 IC50으로 단량체로서 인간 PD-L1에 결합한다.
융합 단백질 - 일반
일부 실시형태에서, 아피머 폴리펩타이드는 아피머 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 조절하는 추가적인 삽입, 치환 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실은 변형된 아피머의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실은 아피머 폴리펩타이드에 대한 친화도를 조절하고, 예를 들어, PD-1에 대한 결합 및 저해에 대해, 순환 반감기를 조절하거나, 치료적 반감기를 조절하거나, 아피머 폴리펩타이드의 안정성을 조절하거나, 프로테아제에 의한 절단을 조절하거나, 용량을 조절하거나, 방출 또는 생체 이용 가능성을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나, 탈아미드화를 감소시키거나, 저장 수명을 개선시키거나, 또는 투여 경로를 개선시키거나 변경시킨다. 유사하게, 아피머 폴리펩타이드는 프로테아제 절단 서열, 반응기, 항체-결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음) 또는 다른 친화도 기반 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음) 또는 폴리펩타이드의 검출, 정제 또는 다른 속성을 개선시키는 연결된 분자(바이오틴을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 이들 추가적인 서열은 융합 단백질의 형태에서 아피머 폴리펩타이드의 하나의 말단 및/또는 다른 말단에 첨가된다. 따라서, 본 발명의 특정 양상에서, 결합제-약물 접합체는 적어도 하나의 아피머 폴리펩타이드 서열 및 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드 서열(본 명세서에서 "융합 도메인")을 갖는 융합 단백질이다. 융합 도메인은 목적하는 특성, 예컨대 -단지 예로서- 세포 표면 상의(즉, 암호화된 아피머에 대해) 세포 또는 체류로부터의 분비를 부여하도록, 번역 후 변형을 위한 기질 또는 다른 인식 서열로서 작용하도록, 단백질-단백질 상호작용을 통한 다량체 구조 응집을 생성하기 위해, 혈청 반감기를 변경시키도록(종종 연장시키도록), 또는 조직 국소화 또는 조직 배제 및 다른 ADME 특성을 변경시키도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 융합 도메인은, 예컨대 친화도 크로마토그래피에 의한, 융합 단백질의 단리 및/또는 정제에 특히 유용하다. 발현 또는 정제를 용이하게 하는 이러한 융합 도메인의 잘 알려진 예는, 단지 예로서, 친화도 태그, 예컨대 폴리히스티딘(즉, His6 태그), Strep II 태그, 스트렙타비딘-결합 펩타이드(SBP) 태그, 카모듈린-결합 펩타이드(CBP), 글루타틴 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스-결합 단백질(MBP), S-태그, HA 태그, c-Myc 태그, 티오레독신, 단백질 A 및 단백질 G를 포함한다.
아피머가 재조합적으로 만들어지는 경우에 분비되도록, 일반적으로 소포체의 내강에 대한 단백질의 수송 및 궁극적으로 분비되도록(또는 막관통 도메인 또는 다른 세포 표면 체류 신호의 경우에 세포 표면 상에 보유됨) 지시하는 신호 서열을 함유할 것이다. 신호 서열(또한 신호 펩타이드 또는 리더 서열로서 지칭됨)은 발생기 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된다. 이들은 폴리펩타이드를 소포체에 대해 표적화하며, 단백질은 분비를 통해 이들의 목적지, 예를 들어, 소기관의 내부 공간으로, 내부 막으로, 세포 외부 막으로, 또는 세포 외부로 구별된다. 대부분의 신호 서열은 단백질이 소포체에 수송된 후에 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 폴리펩타이드로부터의 신호 서열의 절단은 보통 아미노산 서열 내 특정 부위에서 일어나며, 신호 서열 내의 아미노산 잔기에 의존한다.
일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 길이가 약 5 내지 약 40개의 아미노산(예컨대 길이가 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 또는 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35, 또는 약 35 내지 약 40개의 아미노산)이다.
일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 인간 단백질로부터의 천연 신호 펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 신호 펩타이드는 비-천연 신호 펩타이드이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 비-천연 신호 펩타이드는 대응하는 천연 분비된 인간 단백질로부터의 돌연변이체 천연 신호 펩타이드이고, 하나 이상의(예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상) 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 비-IgSF 단백질 패밀리로부터의 신호 펩타이드 또는 이의 돌연변이체, 예컨대 면역글로불린으로부터의 신호 펩타이드(예컨대 IgG 중쇄 또는 IgG-카파 경쇄), 사이토카인(예컨대 인터류킨-2(IL-2), 또는 CD33), 혈청 알부민 단백질(예를 들어, HSA 또는 알부민), 인간 아주로시딘 프리단백질(preprotein) 신호 서열, 루시퍼라제, 트립시노겐(예를 들어, 키모트립시노겐 또는 트립시노겐) 또는 세포로부터 단백질을 효율적으로 분비할 수 있는 다른 신호 펩타이드이다. 예시적인 신호 펩타이드는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
Figure pct00078
대상 융합 단백질은 또한 이종성 단백질 서열 또는 도메인을 분리시키는 - 즉, 세포 결합 모이어티를 분리시키는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 결합제 약물 접합제에 하나 초과가 포함된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "링커"는 제1 폴리펩타이드(예를 들어, 아피머)와 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 제2 아피머, Fc 영역, 수용체 트랩(trap), 알부민 등) 사이에 삽입된 링커 아미노산 서열을 지칭한다. 연구자에 의해 설계된 경험적 링커는 일반적으로 이들의 구조에 따라 3가지 범주로 분류된다: 가요성 링커, 강성 링커, 및 생체내 절단성 링커. 기능성 도메인을 함께 연결하거나(가요성 및 강성의 링커에서와 같이) 또는 생체내 유리 기능성 도메인을 방출함에 있어서(생체내 절단 가능한 링커에서와 같이) 기본적 역할 이외에, 링커는 융합 단백질의 생산을 위한 다수의 다른 이점, 예컨대 생물학적 활성의 개선, 발현 수율의 증가, 및 목적하는 약물동태학 프로파일의 달성을 제공할 수 있다. 링커는 융합 단백질의 발현, 분비 또는 생체활성에 유해하게 영향을 미쳐서는 안 된다. 링커는 항원성이 아니어야 하며, 면역 반응을 유발하지 않아야 한다.
적합한 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 글리신과 세린 잔기의 혼합물을 포함하고, 종종 입체 장애가 있는 아미노산을 포함한다. 유용한 링커에 혼입될 수 있는 다른 아미노산은 트레오닌 및 알라닌 잔기를 포함한다. 링커는 길이가, 예를 들어, 1 내지 50개의 아미노산 길이, 1 내지 22개의 아미노산 길이, 1 내지 10개의 아미노산 길이, 1 내지 5개의 아미노산 길이, 또는 1 내지 3개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 효소 절단 부위를 포함할 수 있고, 따라서 제2 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드로부터 분리될 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 링커는 가요성을 특징으로 할 수 있다. 가요성 링커는 보통 결합된 도메인이 움직임 또는 상호작용의 특정 정도를 필요로 할 때 적용된다. 이들은 일반적으로 작은, 비극성(예를 들어, Gly) 또는 극성(예를 들어, Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성된다. 예를 들어, 문헌[Argos P. (1990) "An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion" J Mol Biol. 211:943-958]. 이들 아미노산의 작은 크기는 연결하는 기능성 도메인의 가요성을 제공하고, 이동을 가능하게 한다. Ser 또는 Thr의 혼입은 물 분자와의 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있고, 따라서 링커와 단백질 모이어티 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 감소시킨다. 가장 통상적으로 사용되는 가요성 링커는 Gly 및 Ser 잔기의 신장부("GS" 링커)로 주로 이루어진 서열을 가진다. 가장 널리 사용되는 가요성 링커의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n의 서열을 가진다. 복제수 "n"을 조절함으로써, 이 GS 링커의 길이는 기능성 도메인의 적절한 분리를 달성하도록, 또는 필요한 도메인간 상호작용을 유지하도록 최적화될 수 있다. GS 링커 이외에, 재조합 융합 단백질에 대해 다수의 다른 가요성 링커가 설계되었다. 이들 가요성 링커로서 작은 또는 극성 아미노산, 예컨대 Gly 및 Ser이 또한 풍부하지만, 가요성을 유지하기 위한 추가적인 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala뿐만 아니라 용해도를 개선시키기 위한 극성 아미노산, 예컨대 Lys 및 Glu을 함유할 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 링커는 강성을 특징으로 할 수 있다. 가요성 링커는 기능성 도메인을 수동적으로 연결하고 움직임의 특정 정도를 허용하는 이점을 갖지만, 이들 링커의 강성 결여는 특정 융합 단백질 실시형태에서, 예컨대 발현 수율 또는 생물학적 활성에서의 제한일 수 있다. 이들 예에서 가요성 링커의 무효성은 단백질 도메인의 비효율적인 분리 또는 서로에 의한 이들의 간섭의 불충분한 감소에 기인하였다. 이들 상황 하에서, 강성 링커는 도메인 간의 고정된 거리를 유지하기 위해 그리고 이들의 독립적 기능을 유지하기 위해 성공적으로 적용되었다.
다수의 천연 링커는 α-나선 구조를 나타내었다. α-나선 구조는 세그먼트 내 수소 결합 및 밀접하게 패킹된 골격에 의해 강성이고 안정하다. 따라서, 뻣뻣한 α-나선 링커는 단백질 도메인 사이의 강성 스페이서로서 작용할 수 있다. 문헌[George et al. (2002) "An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding"Protein Eng. 15(11):871-9]. 일반적으로, 강성의 링커는 α-나선 구조를 채택함으로써 또는 다중 Pro 잔기를 함유함으로써 상대적으로 뻣뻣한 구조를 나타낸다. 다수의 상황 하에서, 이들은 가요성 링커보다 더 효율적으로 기능성 도메인을 분리시킨다. 링커 길이는 도메인 간의 최적 거리를 달성하기 위해 복제 수를 변화시킴으로써 용이하게 조절될 수 있다. 결과로서, 강성의 링커는 도메인의 공간적 분리가 융합 단백질의 안정성 또는 생활성을 보존하는데 중요한 경우에 선택된다. 이와 관련하여, (EAAAK)n 서열을 갖는 알파 나선-형성 링커는 다수의 재조합 융합 단백질의 작제에 적용되었다. 강성 링커의 다른 유형은 has a Pro-풍부 서열, (XP)n을 가지며, X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 Ala, Lys, 또는 Glu을 표시한다.
단지 예로서, 예시적인 링커는 하기를 포함한다:
Figure pct00079
대상 융합 단백질에서 사용될 수 있는 다른 링커는 SerGly, GGSG, GSGS, GGGS, S(GGS)n(여기서 n은 1 내지 7임), GRA, 폴리(Gly), 폴리(Ala), GGGSGGG, ESGGGGVT, LESGGGGVT, GRAQVT, WRAQVT 및 ARGRAQVT를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이하에 기재한 Fc 융합의 힌지 영역은 또한 링커로 고려될 수 있다.
아피머 폴리펩타이드 서열 그 자체로 또는 융합 단백질의 부분으로서 제공된 측접 폴리펩타이드 모이어티로 이루어질 수 있는 또 다른 변형은 효소에 의해 번역 후 변형에 대한 부위인 하나 이상의 서열이다. 이들은 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 글리코지질-결합 변형 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
PK 및 ADME 특성의 조작
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 투여 경로, 예컨대 비경구 치료 투약에 최적인 반감기 및/또는 PK 프로파일을 갖지 않을 수도 있다. 용어 "반감기"는 물질, 예컨대 본 발명의 결합제-약물 접합체가 이의 약학적 또는 생리학적 활성 또는 농도의 절반을 상실하는 시간의 양을 지칭한다. 생물학적 반감기는 신체의 특정 기관 또는 조직의 물질, 또는 흡수 및 농도의 제거, 배설, 분해(예를 들어, 효소)에 의해 영향받을 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 반감기는 물질의 혈액 혈장 농도가 이의 정상 상태 수준("혈장 반감기")에 도달하는 시간을 결정함으로써 평가될 수 있다. 이런 단점을 처리하기 위해, 결합제-약물 접합체의 부분으로서 반감기 연장 모이어티의 혼입을 포함하는 다른 단백질 치료제의 경우에 사용되는 반감기의 연장을 위한 다양한 일반적 전략이 있다.
용어 "반감기 연장 모이어티"는 비교기, 예컨대 변형된 아피머 폴리펩타이드의 비접합 형태에 비해, 아피머 폴리펩타이드의 생체내 단백질 분해 또는 다른 활성-감소 변형을 방지하거나 이동시키고/시키거나, 반감기를 증가시키고/시키거나, 흡수율 증가, 독성 감소, 용해도 개선, 단백질 응집 감소, 변형된 아피머 폴리펩타이드의 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성 증가, 제조능력 증가 및/또는 변형된 아피머 폴리펩타이드의 면역원성 감소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 약물동태학 또는 생물학적 특성을 개선시키거나 변경시키는 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 형성하도록 아피머 폴리펩타이드에, 선택적으로 비자연적으로 암호화된 아미노산을 통해 직접적으로 또는 링커를 통해, 공유적으로 연결된("접합된" 또는 "융합된") 약제학적으로 허용 가능한 모이어티, 도메인 또는 분자를 지칭한다. 용어 "반감기 연장 모이어티"는 비-단백질성, 반감기 연장 모이어티, 예컨대 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 별개의 PEG, 하이드록시에틸 전분(HES), 지질, 분지형 또는 비분지형 아실기, 분지형 또는 비분지형 C8-C30 아실기, 분지형 또는 비분지형 알킬기 및 분지형 또는 비분지형 C8-C30 알킬기; 및 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 혈청 알부민, 트랜스페린, 어드넥틴(예를 들어, 알부민-결합 또는 약물동태학 연장(PKE) 어드넥틴), Fc 도메인, 및 비구조화된 폴리펩타이드, 예컨대 XTEN 및 PAS 폴리펩타이드(예를 들어, 아미노산 Pro, Ala, 및/또는 Ser으로 구성된 입체구조적으로 장애가 있는 폴리펩타이드 서열), 및 임의의 앞서 언급한 것의 단편을 포함한다. 아피머의 결정 구조 및 이의 표적, 예컨대 도면에 나타내는 PD-1과의 항-PD-L1 아피머 복합체와의 상호작용의 결정 구조의 시험은 특정 아미노산 잔기가 완전히 또는 부분적으로 용매에 접근 가능한 측쇄를 가진다는 것을 나타낼 수 있다.
특정 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 포유류 혈류에서 순환하는 얻어진 결합제-약물 접합체의 반감기를 모이어티에 접합되지 않는 단백질의 반감기에 비해(예컨대 아피머 폴리펩타이드 단독에 비해) 연장시킨다. 일부 실시형태에서, 반감기는 약 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배 또는 6.0배 초과만큼 연장된다. 일부 실시형태에서, 반감기는 반감기 연장 모이어티가 없는 단백질에 비해 생체내 투여 후에 6시간 초과, 12시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 72시간 초과, 96시간 초과 또는 1주 초과만큼 연장된다.
추가 예시를 위한 수단으로서, 본 발명의 결합제-약물 접합체의 생성에서 사용될 수 있는 반감기 연장 모이어티는 하기를 포함한다:
Figure pct00080
자연적으로 긴 반감기 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 약학적 아피머 서열의 융합체(예를 들어, Fc 융합체, 트랜스페린 [Tf] 융합체 또는 알부민 융합체. 예를 들어, 문헌[Beck et al. (2011) "Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1-2; Czajkowsky et al. (2012) "Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015-28; Huang et al. (2009) "Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology" Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692-9; Keefe et al. (2013) "Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; p. 345-56; Weimer et al. (2013) "Recombinant albumin fusion proteins. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 297-323; Walker et al. (2013) "Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325-43] 참조.
Figure pct00081
삽입물 폴리펩타이드, 예를 들어, XTEN(재조합 PEG 또는 "rPEG''로도 알려짐), 호모아미노산 중합체(HAP; HAPylation), 프롤린-알라닌-세린 중합체(PAS; PASylation), 또는 엘라스틴-유사 펩타이드(ELP; ELPylation)에 대한 약학적 아피머 서열의 유전적 융합체. 예를 들어, 문헌[Schellenberger et al. (2009) "recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009; 27:1186-90; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-lifee. Protein Eng Des Sel. 2007; 20:273-84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489-501. Floss et al. (2012) "Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37-45. Floss et al. "ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372-98] 참조.
Figure pct00082
반복부 화학적 모이어티에 대한 약학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질의, 예를 들어, PEG(PEGylation) 또는 히알루론산에 대한 화학적 접합에 의한 유체역학적 반경 증가. 예를 들어, 문헌[Caliceti et al. (2003) "Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates" Adv Drug Delivery Rev. 55:1261-77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113-28; Kontermann (2009) "Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies" BioDrugs. 23:93-109; Kang et al. (2009) "Emerging PEGylated drugs"Expert Opin Emerg Drugs. 14:363-80; 및 "Mero et al. (2013) "Conjugation of hyaluronan to proteins" Carb Polymers. 92:2163-70] 참조.
Figure pct00083
폴리시알릴화에 의한 약학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질의 융합; 또는, 대안적으로, (b) 음으로 하전된, 고도로 시알릴화된 펩타이드(예를 들어, 생물학적 약물 후보에 대한 천연 단백질, 예컨대 인간 CG b-서브유닛의 반감기를 연장시키는 것으로 알려진 카복시-말단의 펩타이드[CTP; 융모성 생식선 자극 호르몬(CG) b-쇄])의 융합의 음전하를 유의하게 증가시킴. 예를 들어, 문헌[Gregoriadis et al. (2005) "Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids" Int J Pharm. 2005; 300:125-30; Duijkers et al. "Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females" (2002) Hum Reprod. 17:1987-93; 및 Fares et al. "Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit" (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304-8. 35; 및 Fares "Half-life extension through O-glycosylation] 참조.
Figure pct00084
생활성 단백질에 대한 펩타이드 또는 단백질-결합 도메인의 부착을 통한, 정상적으로 긴 반감기 단백질, 예컨대 HSA, 인간 IgG, 트랜스페린 또는 피브로넥틴에 대한 비 공유적 결합. 예를 들어, 문헌[Andersen et al. (2011) "Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal 알부민 binding domain" J Biol Chem. 286:5234-41; O'Connor-Semmes et al. (2014) "GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans―PK/PD and safety" Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704-12. Sockolosky et al. (2014) "Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice" PLoS One. 2014;9:e102566] 참조.
오래가는 혈청 단백질에 대한 고전적 유전자 융합은 PEG 또는 지질에 대한 화학적 접합과 별개인 대안의 반감기 연장 방법을 제공한다. 2가지 주요 단백질이 전통적으로 융합 상대로서 사용되었다: 항체 Fc 도메인 및 인간 혈청 알부민(HSA). Fc 융합은 항체의 Fc 부분에 대한 펩타이드, 단백질 또는 수용체 엑소도메인의 융합을 수반한다. Fc와 알부민 융합은 둘 다 펩타이드 약물의 크기를 증가시킴으로써 뿐만 아니라 신체의 자연적 재순환 메커니즘(신생아 Fc 수용체, FcRn)의 이점을 취함으로써 연장된 반감기를 달성한다. FcRn에 대한 이들 단백질의 pH-의존적 결합은 엔도솜에서 융합 단백질의 분해를 방지한다. 이들 단백질에 기반한 융합은 전형적인 페길화 또는 지질화된 펩타이드보다 훨씬 더 긴 3 내지 16일 범위로 반감기를 가질 수 있다. 항체 Fc 도메인에 대한 융합은 펩타이드 또는 단백질 약물의 용해도 및 안정성을 개선시킬 수 있다. 펩타이드 Fc 융합의 예는 현재 후기 임상 시험에서의 GLP-1 수용체 작용제인 둘라글루타이드이다. 지방 아실화된 펩타이드에 의해 이용되는 동일한 단백질인 인간 혈청 알부민은 다른 인기있는 융합 상대이다. 알비글루타이드는 이 플랫폼에 기반한 GLP-1 수용체 작용제이다. Fc와 알부민 간의 주된 차이는 융합 상대의 선택에 따라서 이량체 또는 단량체로서 융합된 펩타이드의 제시를 야기하는 HSA의 단량체 구조에 대한 Fc의 이량체 특성이다. 종양 세포 상에서 아피머 표적, 예컨대 PD-L1이 함께 충분하 가깝게 이격되거나 이량체 그 자체라면, 아피머-Fc 융합의 이량체 특성은 결합활성을 생성할 수 있다. 이는 바람직할 수 있고 또는 표적에 의존하지 않는다.
Fc 융합
일부 실시형태에서, 아피머 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 도메인("Fc 도메인"), 또는 이의 단편 또는 변이체, 예컨대 기능성 Fc 영역과의 융합 단백질의 부분일 수 있다. 이와 관련하여, Fc 융합("Fc-융합"), 예컨대 아피머-Fc 융합 단백질로서 생성된 결합제-약물 접합체는 펩타이드 골격을 통해 (직접적으로 또는 간접적으로) 면역글로불린의 Fc 영역에 공유적으로 연결되는 하나 이상의 아피머 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. Fc-융합은, 예를 들어, 항체의 Fc 영역(이는 효과기 기능 및 약물동태학을 용이하게 함) 및 동일한 폴리펩타이드의 부분으로서 아피머 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 Fc 영역은 또한 하나 이상의 아피머에 간접적으로 연결될 수 있다. 다양한 링커가 당업계에 공지되어 있으며, 선택적으로 아피머 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 Fc를 연결하여 Fc-융합을 생성하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, Fc-융합은 Fc-융합 동형이량체를 형성하도록, 또는 비-동일 Fc 도메인을 이용하여, Fc-융합 이형이량체를 형성하도록 이량체화될 수 있다.
아피머 융합 단백질로서 대상 결합제-약물 접합체를 생성하는 데 사용하기 위한 인간 항체의 Fc 영역을 선택하기 위한 몇 가지 이유가 있다. 원칙적 근거는 항체에 비교하여 유사한 약물동태학 프로파일을 입증하기에, 그리고 Fc 영역에 의해 부여되는 특성의 이점을 취하기에 충분히 큰 안정한 단백질을 생산하는 것이며; 이는 내포작용 후 세포 표면에 대한 융합 단백질의 FcRn-매개 재순환을 수반하는 샐비지 신생아 FcRn 수용체를 포함하여, 리소좀 분해를 피하고, 다시 혈류 내로의 방출을 초래하여, 연장된 혈청 반감기에 기여한다. 다른 분명한 이점은 결합제-약물 접합체의 생산 동안 하류의 가공을 단순화시키고 결합제-약물 접합체의 고도로 순수한 제조의 생성을 허용할 수 있는 단백질 A에 대한 Fc 도메인의 결합이다.
일반적으로, Fc 도메인은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외하는 항체의 불변 영역을 포함할 것이다. 따라서, Fc 도메인은 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대해 N-말단인 가요성 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM에 대해 Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG에 대해, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. Fc 도메인의 경계는 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 이의 카복실-말단에 대해 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정해지되, 넘버링은 카바트에 제시된 바와 같은 EU 색인에 따른다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991)). Fc는 단리에서 이런 영역, 또는 전체 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질과 관련하여 이런 영역을 지칭할 수 있다. 다수의 상이한 Fc 위치에서 다형성이 관찰되며, 또한 본 명세서에 사용되는 바와 같은 Fc 도메인으로서 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 Fc, "기능성 Fc 영역"은 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 Fc 도메인 또는 이의 단편을 지칭한다. 기능성 Fc 영역은 FcRn에 결합하지만, 효과기 기능을 갖지는 않는다. FcRn에 결합하는 Fc 영역 또는 이의 단편의 능력은 당업계에 공지된 표준 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 이러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위한 당업계에 공지된 다양한 분석을 이용하여 평가될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1 하위부류로부터 유래되지만, 그러나 다른 하위부류(예를 들어, IgG2, IgG3 및 IgG4)가 또한 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00085
일부 실시형태에서, 융합 단백질에서 사용되는 Fc 영역은 Fc 분자의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 1 내지 16(즉, DKTHTCPPCPAPELLG)에 걸쳐있는 코어 힌지 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 아피머-함유 융합 단백질은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 힌지 영역 내의 위치 6 내지 9에서의 시스테인 잔기에 부분적으로 기인하여 다량체 구조(예를 들어, 이량체)를 채택할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 코어 힌지 서열에 측접하는 CH1 및 CH2 영역으로부터 유래된 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 힌지 서열은 GSTHTCPPCPAPELLG 또는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 서열은 바람직한 약물동태학, 생물물리학적 및/또는 생물학적 특성을 부여하는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 힌지 서열은 하기를 포함한다:
Figure pct00086
일 실시형태에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 18번 위치에서 잔기 P는 Fc 효과기 기능을 없애기 위해 S로 대체될 수 있고; 이 대체는 서열 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS, EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS, 및 DKTHTCPPCPAPELLGGSS를 갖는 힌지에서 예시된다. 다른 실시형태에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 1 내지 2번 위치에서 잔기 DK는 잠재적 클립 부위를 제거하기 위해 GS로 대체될 수 있고; 이 대체는 서열 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS에서 예시된다. 다른 실시형태에서, 인간 IgG1(즉, 도메인 CH1-CH3)의 중쇄 불변 영역의 103 위치에서 C는 경쇄의 부재 하에 부적절한 시스테인 결합 형성을 방지하기 위해 S로 대체될 수 있고; 이 대체는 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS, EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS, 및 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS에 의해 예시된다.
일부 실시형태에서, Fc는 포유류 Fc, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된 Fc 도메인을 포함하는 인간 Fc이다. Fc 영역은 천연 Fc 영역과 그리고/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 천연 Fc 영역과 그리고/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 서열번호 93으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 94 내지 106에 의해 제공된 예로부터의 Fc 서열을 포함한다. Fc 도메인의 C-말단 라이신은 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 선택적 성분이라는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, C-말단의 라이신이 없는 것을 제외하고, Fc 도메인은 서열번호 93 내지 106으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, C-말단의 라이이이 없는 것을 제외하고 Fc 도메인은 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Fc와 PD-L1 결합 아피머의 예시적인 Fc 융합은 실시예 및 도면에 제공되며, 이는 아피머 서열이 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 위치될 수 있고, 직접적으로 부착될 수 있거나, 또는 융합 단백질이 Fc 도메인과 아피머 폴리펩타이드 서열 사이에 개재되어 있는 다른 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다는 것을 입증한다. 예시되는 실시예에서, 비구조화된(가요성) 링커인 (Gly4Ser)n은 PD-L1 결합 아피머 "251"(서열번호 84) 및 인간 IgG1의 Fc 도메인(서열번호 93)과 함께 사용되며, 힌지 영역은 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG이다. 작제물은 둘 다 단백질의 성숙 형태로부터 절단된 CD33 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA를 포함하였다.
Figure pct00090
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 상에 결합된 분비된 Ig(FcR)가, 항원-보유 표적 세포에 이들 세포독성 효과기 세포가 특이적으로 결합하게 하고 후속적으로 세포독소에 의해 표적 세포를 사멸시키는 것을 가능하게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 융합 단백질은 얻어진 결합제-약물 접합체가 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효과기 기능성을 갖지 않는(또는 이것이 감소된) Fc 도메인 서열을 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 IgG2 또는 IgG4 아이소타입 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역의 자연적으로 기능이 억제된 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 유럽 특허 제0307434호에 기재되어 있다. 하나의 예는 235 및 237번 위치(EU 색인 넘버링)에서 알라닌 잔기의 치환을 포함한다.
다른 실시형태에서, 융합 단백질은 얻어진 결합제-약물 접합체는 일부 또는 모든 Fc 기능성을 보유하는 Fc 도메인 서열을 포함하고, 예를 들어, 예를 들어, 융합 단백질이 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터의 Fc 도메인을 포함한다면, ADCC와 CDC 활성 중 하나 또는 둘 다 가능할 것이다. 효과기 기능의 수준은, 예를 들어, CH2 도메인에서의 돌연변이에 의해 공지된 기법에 따라 달라질 수 있되, 예를 들어, IgG1 CH2 도메인은 239 및 332 및 330으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 예를 들어, 항체가 향상된 효과기 기능을 갖도록 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택되고/되거나, 예를 들어, Fc 영역의 푸코실화가 감소되도록 본 발명의 항원-결합 단백질의 글리코실화 프로파일을 변경시킨다.
알부민 융합
다른 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 적어도 하나의 아피머 서열에 추가로, 알부민 서열 또는 알부민 단편을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 아피머를 포함하는 폴리펩타이드 서열 내로의 혼입 이외에 화학적 결합을 통해 알부민 서열 또는 알부민 단편에 접합된다. 일부 실시형태에서, 알부민, 알부민 변이체, 또는 알부민 단편은 인간 혈청 알부민(HSA), 인간 혈청 알부민 변이체, 또는 인간 혈청 알부민 단편이다. HSA와 비슷한 알부민 혈청 단백질은, 예를 들어, 사이노몰거스 원숭이, 소, 개, 토끼 및 래트에서 발견된다. 비-인간 종 중에서, 소 혈청 알부민(BSA)은 HSA와 가장 구조적으로 유사하다. 예를 들어, 문헌[Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24] 참조. 본 개시내용은 cyno 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민으로부터 유래된 알부민 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 비-인간 종으로부터의 알부민의 용도를 상정한다.
혈청 반감기가 약 20일인 585개의 아미노산 폴리펩타이드의 성숙 HSA(대략 67kDa)는 수많은 내인성 및 외인성 리간드의 콜로이드성 삼투 혈압, 혈액 pH, 및 수송 및 분포의 유지를 주로 초래한다. 단백질은 3개의 구조적으로 상동성인 도메인(도메인 I, II 및 III)을 가지며, 알파-나선 입체구조에서 거의 완전하고, 17개의 이황화물 브리지에 의해 고도로 안정화된다. 특정 바람직한 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 하나 이상의 아피머 폴리펩타이드 서열 및 성숙 인간 혈청 알부민에 대한 서열(서열번호 111) 또는 융합 단백질에서 목적하는 정도로 성숙 알부민의 PK 및/또는 생체분포를 유지하는 변이체 또는 이의 단편을 포함하는, 알부민 융합 단백질일 수 있다.
Figure pct00091
알부민 서열은 상기 기재한 바와 같은 링커 서열의 사용에 의해 결합제-약물 접합체에서 아피머 폴리펩타이드 또는 다른 측접 서열로부터 시작될 수 있다.
달리 표시되지 않는다면, 본 명세서에서 "알부민" 또는 "성숙 알부민"에 대한 언급은 HSA를 지칭하는 것을 의미한다. 그러나, 전장 HSA는 18개 아미노산의 신호 펩타이드(MKWVTFISLLFLFSSAYS) 다음에 6개 아미노산의 프로-도메인(RGVFRR)을 가지며; 이 24개의 아미노산 잔기 펩타이드는 프리-프로 도메인으로서 지칭될 수 있다는 것을 주목한다. 아피머-HSA 융합 단백질은 재조합 단백질 암호화 서열에서 HSA 프리-프로-도메인을 이용하여 발현되고 분비될 수 있다. 대안적으로, 아피머-HSA 융합은 상기 기재한 것과 같은 다른 분비 신호 서열의 포함을 통해 발현되고 분비될 수 있다.
대안의 실시형태에서, 아피머 폴리펩타이드를 갖는 융합 단백질의 부분으로서 제공되기 보다는, 혈청 알부민 폴리펩타이드는 골격 아마이드 결합 이외의 결합을 통해, 예컨대 각각의 알부민 폴리펩타이드 상의 아미노산 측쇄와 아피머-함유 폴리펩타이드 사이의 화학적 접합을 통한 가교를 통해, 아피머-함유 폴리펩타이드에 공유결합될 수 있다.
알부민 결합 도메인
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 아피머 폴리펩타이드 서열을 갖는 융합 단백질(또한 폴리펩타이드의 경우)의 부분으로서 또는 인접한 폴리펩타이드 쇄의 부분 이외의 부위를 통해 화학적으로 접합된, 혈청-결합 모이어티를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 혈청-결합 폴리펩타이드는 알부민 결합 모이어티이다. 알부민은 다중 소수성 결합 포켓을 함유하며, 다양한 상이한 리간드, 예컨대 지방산 및 스테로이드뿐만 아니라 상이한 약물의 수송체로서 자연적으로 작용한다. 더 나아가, 알부민의 표면은 음으로 하전되어 고도로 소수성이 되게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알부민 결합 모이어티"는 알부민에 결합할 수 있는 임의의 화학기를 지칭하며, 즉, 알부민 결합 친화도를 가진다. 알부민은 내인성 리간드, 예컨대 지방산에 결합하지만; 그러나, 이는 또한 외인성 리간드, 예컨대 와파린, 페니실린 및 다이아제팜과 상호작용한다. 알부민에 대한 이들 약물의 결합은 가역적이기 때문에, 알부민-약물 복합체는 약물 생체분포 및 생체 이용 가능성을 향상시킬 수 있는 약물 저장소로서 작용한다. 내인성 알부민-결합 리간드를 모방하는 성분, 예컨대 지방산의 혼입은 알부민 결합을 강력하게 하며 약물 효능을 증가시키기 위해 사용되었다.
특정 실시형태에서, 단백질 반감기를 증가시키는 대상 결합제-약물 접합체의 생성에 적용될 수 있는 화학적 변형 방법은 펩타이드 측쇄에 대한 지방산의 공유 결합을 수반하는 지질화이다. 본래 인슐린의 반감기를 연장시키기 위한 방법으로서 만들어지고 개발된, 지질화는 페길화와 동일한 반감기 연장의 기본적 메커니즘을 공유하며, 즉, 신장 여과를 감소시키기 위해 유체역학 반경(hydrodynamic radius)을 증가시킨다. 그러나, 지질 모이어티는 그 자체가 상대적으로 작으며, 효과는 순환 알부민에 대한 지질 모이어티의 비공유 결합을 통해 간접적으로 매개된다. 지질화의 하나의 결과는, 펩타이드의 수용성을 감소시키지만, 펩타이드와 지방산 간의 링커 조작이, 예를 들어, 링커 내에서 글루타메이트 또는 미니 PEG의 사용에 의해 이를 조절할 수 있다는 것이다. 지질 모이어티의 링커 조작 및 변형은 알부민과 독립적으로 생체분포를 늦춤으로써 증가된 반감기에 기여할 수 있는 자기-응집에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14] 참조.
특정 결합제-약물 접합체의 생성에서 사용하기 위한 알부민 결합 모이어티의 다른 예는 알부민-결합 (PKE2) 어드넥틴(WO2011140086 "Serum Albumin Binding Molecules", WO2015143199 "Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains" 및 WO2017053617 "Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains"), 스트렙토코커스 균주(Streptococcus strain) G148의 단백질 G의 알부민 결합 도메인 3(ABD3), 및 알부민 결합 도메인 항체 GSK2374697("AlbudAb") 또는 ATN-103(오조랄리주맙(Ozoralizumab))의 알부민 결합 나노바디 부분을 포함한다.
페길화, XTEN, PAS 및 다른 중합체
매우 다양한 거대분자 중합체 및 기타 분자는 본 개시내용의 폴리펩타이드를 함유하는 아피머에 연결되어, 얻어진 결합제-약물 접합체의 생물학적 특성을 조절하기 위해 그리고/또는 결합제-약물 접합체에 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 이들 거대분자 중합체는, 자연적으로 암호화된 아미노산을 통해, 비-자연적으로 암호화된 아미노산, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 기능성 치환체, 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 첨가된 임의의 치환체 또는 작용기를 통해, 폴리펩타이드를 함유하는 아피머에 연결될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100Da 내지 약 100,000Da 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 범위일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100Da 내지 약 100,000Da일 수 있으며, 100,000Da, 95,000Da, 90,000Da, 85,000Da, 80,000Da, 75,000Da, 70,000Da, 65,000Da, 60,000Da, 55,000Da, 50,000Da, 45,000Da, 40,000Da, 35,000Da, 30,000Da, 25,000Da, 20,000Da, 15,000Da, 10,000Da, 9,000Da, 8,000Da, 7,000Da, 6,000Da, 5,000Da, 4,000Da, 3,000Da, 2,000Da, 1,000Da, 900Da, 800Da, 700Da, 600Da, 500Da, 400Da, 300Da, 200Da, 및 100Da을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 중합체의 분자량은 약 100Da 내지 약 50,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체의 분자량은 약 100Da 내지 약 40,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000Da 내지 약 40,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000Da 내지 약 40,000Da이다. 일부 실시형태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000Da 내지 약 40,000Da이다.
이 목적을 위해, 가요성 및 친수성 아미노산 쇄(500 내지 600개의 아미노산)에 융합된 페길화, 폴리시알릴화, 헵실화, 글리코실화, 또는 재조합 PEG 유사체를 포함하는 다양한 방법이 개발되었다(문헌[Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283; Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246] 참조).
중합체의 예는 폴리알킬 에터 및 이의 알콕시-캡핑된 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 이의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜, 후자는 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로도 알려짐); 별개의 PEG(dPEG); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에터; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리하이드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아마이드, 폴리알킬 아크릴아마이드, 및 폴리하이드록시알킬 아크릴아마이드(예를 들어, 폴리하이드록시프로필메타크릴아마이드 및 이의 유도체); 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체; 친수성 펩타이드 서열; 덱스트란 및 덱스트란 유도체를 포함하는 다당류 및 이들의 유도체, 예를 들어, 카복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 이의 유도체, 예를 들어, 키토산, 석신일 키토산, 카복시메틸키틴, 카복시메틸키토산; 하이알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아마이드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대: 스타이렌 말레산 무수물 공중합체, 다이비닐에틸 에터 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알코올; 이의 공중합체; 이의 삼합체; 이들의 혼합물; 및 앞서 언급한 것의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
선택된 중합체는 수용성일 수 있고, 따라서 이것이 부착된 결합제-약물 접합체가 수성 환경, 예컨대 생리적 환경에서 침전되지 않는다. 수용성 중합체는 선형, 포크 또는 분지형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 구조적 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 다른 수용성 중합체가 또한 사용될 수 있다. 예로서, PEG는 본 개시내용의 특정 실시형태를 기재하기 위해 사용된다. 결합제-약물 접합체의 치료적 용도를 위해, 중합체는 약제학적으로 허용 가능할 수 있다.
용어 "PEG"는 PEG의 말단에서 크기 또는 변형과 관련 없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하기 위해 광범위하게 사용되고, 하기 식에 의해 폴리펩타이드를 함유하는 아피머에 연결되는 것으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00092
여기서 n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 C1-4 알킬, 보호기 또는 말단의 작용기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 말단의 변형이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 폴리펩타이드에서 사용되는 PEG는 하이드록시 또는 메톡시를 갖는 하나의 말단 상에서 종결되며, 즉, X는 H 또는 CH3("메톡시 PEG")이다.
상기 식에 말단의 "-"으로 나타내는 PEG의 다른 말단은, 자연적으로 생기는 또는 비-자연적으로 암호화된 아미노산을 통해 폴리펩타이드를 함유하는 아피머에 부착될 수 있다는 것이 언급된다. 예를 들어, 부착은 폴리펩타이드의 아민기(라이신 또는 N-말단의 엡실론 아민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)에 대한 아마이드, 카바메이트 또는 유레아 결합을 통할 수 있다. 대안적으로, 중합체는 티올기(시스테인의 티올기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)에 대한 말레이미드 결합에 의해 연결되며 - 이 경우에, 아피머 폴리펩타이드 서열에 대한 부착은 특히 시스테인에 대한 아피머 서열 내 잔기를 변경시키는 것을 필요로 한다.
아피머-함유 폴리펩타이드에 연결된 수용성 중합체의 수(즉, 페길화 또는 글리코실화 정도)는 변경된(증가 또는 감소를 포함하지만 이들로 제한되지 않음) 약학, 약물동태학 또는 약력학적 특징, 예컨대 얻어진 결합제-약물 접합체에서의 생체내 반감기를 제공하도록 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 얻어진 결합제-약물 접합체의 반감기는 비변형 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 적어도 약 100-배 이상으로 증가된다.
얻어진 결합제-약물 접합체의 PK 또는 다른 생물학적 특성을 변형시키는 데 유용한 중합체 시스템의 다른 변형은, 특히 아피머 폴리펩타이드 서열과의 융합 단백질의 부분으로서 PEG의 기능성 유사체인 비구조화된, 친수성 아미노산 중합체의 사용이다. 폴리펩타이드 플랫폼의 고유한 생체 분해성은 PEG에 대한 잠재적으로 더 우수한 대안으로서 매력이 있다. 다른 이점은 PEG의 다분산성과 대조적으로 재조합 분자의 정확한 분자 구조이다. HSA 및 Fc 펩타이드 융합과 달리, 융합 상대의 3차원 폴딩이 유지될 필요가 있으며, 비구조화된 상대에 대한 재조합 융합은 많은 경우에, 보다 고온 또는 혹독한 조건, 예컨대 HPLC 정제 처리될 수 있다.
더 진보된 이 부류의 폴리펩타이드 중 하나는 XTEN(아뮤닉스(Amunix))으로 지칭되고, 864개의 아미노산 길이이며, 6개의 아미노산(A, E, G, P, S 및 T)으로 구성된다. 문헌[Schellenberger et al. "A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner" 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90] 참조. 중합체의 생분해성 특성에 의해 가능하다면, 이는 전형적으로 사용되는 40KDa PEG보다 훨씬 더 크며, 부수적으로 더 큰 반감기 연장을 부여한다. 아피머 함유 폴리펩타이드에 대한 XTEN의 융합은 최종 결합제-약물 접합체의 반감기 연장을 비변형 폴리펩타이드보다 60 내지 130배만큼 초래하여야 한다.
유사한 개념 사항에 기반한 제2 중합체는 PAS(XL-Protein GmbH)이다. 문헌[Schlapschy et al. "PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins" 2013 Protein Eng Des Sel. 26(8):489-501]. 무작위 코일 중합체는 단지 3개의 작은 비하전 아미노산, 프롤린, 알라닌 및 세린의 훨씬 더 제한된 세트로 구성된다. Fc, HAS 및 XTEN에 의해, PAS 변형은 발현될 때 일렬(inline) 융합 단백질을 생성하도록 아피머 폴리펩타이드 서열로 유전자 암호화될 수 있다.
다중 특이성 융합 단백질
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는, 예를 들어, 제1 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 다중-특이성 폴리펩타이드이다. 추가적인 결합 도메인은, 예시하기 위해, 제2 아피머 폴리펩타이드 서열(제1 아피머 폴리펩타이드 서열과 동일 또는 상이할 수 있음), 항체 또는 이의 단편 또는 다른 항원 결합 폴리펩타이드, 수용체의 리간드 결합 부분(예컨대 수용체 트랩 폴리펩타이드), 수용체-결합 리간드(예컨대 사이토카인, 성장 인자 등), 조작된 T-세포 수용체, 효소 또는 이의 촉매적 단편, 또는 일부를 부여하는 다른 폴리펩타이드 서열 중에서 선택되는 폴리펩타이드 서열일 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 또한 PD-L1에 관한 하나 이상의 추가적인 아피머 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 추가적인 항-PD-L1 아피머는 다중-특이적 아피머 융합 단백질을 생성하기 위해 제1 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드와 동일 또는 상이할 수 있다(또는 이들의 혼합). 결합제-약물 접합체가 동일한 PD-L1 단백질 상의 2개 부위(2파라토프) 또는 2개 초과의 부위(다중 파라토프)에 동시에 결합할 수 있도록, 결합제-약물 접합체는 PD-L1 상에서 동일 또는 중복 부위에 결합할 수 있거나, 또는 두 상이한 부위에 결합할 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 항체로부터의 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 얻어진 결합제-약물 접합체는 항-PD-L1 아피머와 항원 결합 부위를 둘 다 포함하는 단일쇄 일 수 있거나(예컨대 scFV의 경우에), 또는 예컨대 항-PD-L1 항체의 서열이 또한 융합된 중쇄 및/또는 경쇄와 조립된 항체에서 다중 단백질 복합체일 수 있다. 본 형식의 예시적인 아피머/항체 융합은 각각의 CTLA-4 및 PD-L1에 대해 2가인 도 11A에 나타낸 이필리무맙-AVA04-141 이중 특이성 항체이다. 다른 것은 VEGF-A 및 PD-L1 각각에 대해 2가인, 도 13A에 나타내는 베바시주맙-AVA04-251 이중 특이성 항체이다.
예시된 이필리무맙-AVA04-141 이중특이성 항체의 경우에, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 항-CTLA-4 항체 중쇄의 C-말단 단부에서 직렬 융합체로서 제공되며, 여기서 중쇄(제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA, 및 Gly4-Ser 반복부 링커를 포함)는 아피머 융합 서열을 가진다:
Figure pct00093
그리고 경쇄(제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA를 포함)는 천연 이필리무맙 항체의 서열을 가진다:
Figure pct00094
마찬가지로, 예시된 베바시주맙-AVA04-251 이중특이성 항체의 경우에, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 항-VEGF-A 항체 중쇄의 C-말단 단부에서 직렬 융합체로서 제공되며, 여기서 중쇄(제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA, 및 가요성 Gly4-Ser 반복부 링커를 포함)는 아피머 융합 서열을 가진다:
Figure pct00095
그리고 경쇄(제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA를 포함)는 천연 베바시주맙 항체의 서열을 가진다:
Figure pct00096
본 발명의 아피머를 형식화함에 있어서 가요성을 추가로 설명하기 위해, 베바시주맙-AVA04-251 이중특이성 항체의 형태가 또한 생성되었는데, 이때 경쇄는 상기와 동일하지만, 중쇄는 항체 중쇄와 항-PD-L1 아피머 사이에 강성의 링커를 포함하며, 중쇄(제거될 수 있는 분비 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA 및 강성의 A(EAAAK)3 링커를 포함함)는 아피머 융합 서열을 가진다:
Figure pct00097
당업자에 의해 명확하게 인식되고 도 17에 도시되는 바와 같이, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드 서열은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단 중 하나, 또는 이들의 조합/순열에 첨가될 수 있다. 게다가, 다량체 아피머와 관련하여 도 9에 나타낸 바와 같이, 하나 초과의 아피머 서열은 임의의 주어진 항체 쇄에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전장 면역글로불린을 포함하는 다중-특이성 결합제-약물 접합체에 대해, 항체에 대한 아피머 폴리펩타이드 서열의 융합은 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능을 보존할 것이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 이의 Fc 부분을 통해 Fc 수용체-양성 세포의 Fc 수용체에 결합할 것이다. 일부 추가 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 Fc 수용체-양성 세포에 대한 결합에 의해 Fc 수용체-양성 세포를 활성화시킴으로써, 사이토카인 및/또는 공자극 항원의 발현을 개시하거나 증가시킬 수 있다. 더 나아가, 결합제-약물 접합체는 T 세포의 생리학적 활성화에 필요한 적어도 제2의 활성화 신호를 공자극 항원 및/또는 사이토카인을 통해 T 세포에 전달할 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역계로부터의 효과기 세포, 예컨대 면역 세포, 간세포 및 내피세포의 표면 상에 존재하는 Fc 수용체를 발현시키는 다른 세포에 대한 Fc 부분의 결합으로부터 초래된다면, 결합제-약물 접합체는 세포-매개 면역 방어 메커니즘인 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 기능을 가질 수 있고, 이에 의해 면역계의 효과기 세포는 표적 세포를 적극적으로 용해시키는데, 이의 막-표면 항원은 항체에 의해 결합되며, 따라서 ADCC를 통해 종양 세포사를 촉발한다. 일부 추가 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 ADCC 기능을 입증할 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, Fc-매개 세포독성과 별개로, Fc 부분은 신체 내 이의 안정성 및 지속성에 중요한 결합제-약물 접합체의 혈청 수준을 유지하는 데 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피세포 상의 그리고 식세포 상의 Fc 수용체에 결합할 때, 결합제-약물 접합체는 내재화고 혈류로 다시 재순환되어, 신체 내에서 이의 반감기를 향상시킬 수 있다.
추가적인 아피머 폴리펩타이드의 예시적인 표적은 단지 예시를 위해, 다른 면역 관문 단백질, 및 면역 공자극 수용체(특히 추가적인 아피머(들)가 공자극 수용체를 작용화할 수 있는 겨우), 수용체, 사이토카인, 성장 인자, 또는 종양-연관 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
결합제-약물 접합체가 아피머/항체 융합 단백질인 경우에, 면역글로불린 부분은, 예를 들어, 면역글로불린이 CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, VEGF, VEGF 수용체, EGFR 또는 Her2/neu에 대한 단클론성 항체인 것일 수 있다. 이러한 면역글로불린의 몇몇 예시적 예는 다음 중 어느 것에 포함된 항체를 포함한다: 트라스투주맙, 파니투무맙, 세툭시맙, 오비누투주맙, 리툭시맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, 토시투모맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 브렌툭시맙 및 겜투주맙.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 PD-1, PD-L2, CTLA-4, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 또는 TIGIT를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 예컨대 T-세포 상에서 발현되는 면역 관문 분자를 저해하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 결합제-약물 접합체의 부분이다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 CD28, ICOS, CD137, OX40, GITR, CD27, CD30, HVEM, DNAM-1 또는 CD28H를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 예컨대 T-세포 상에서 발현되는 면역 공자극 분자를 작용화하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 결합제-약물 접합체의 부분이다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 면역 공자극 분자의 하나 이상의 리간드 작용제, 예컨대 CD28, ICOS, CD137, OX40, GITR, CD27, CD30, HVEM, DNAM-1 또는 CD28H에 대한 작용제 리간드를 포함하는 결합제-약물 접합체의 부분이다.
저해 면역 관문점 중 하나 또는 몇몇을 차단하고/하거나 면역 공자극 경로 중 하나 이상을 활성화시키는 결합 도메인과 항-PD-L1 아피머의 PD-L1 저해 활성을 조합함으로써, 다중-특이성 결합제-약물 접합체는 달리 고갈된 항-종양 T 세포를 구조하고, 항-종양 면역을 향상시킴으로써, 암 환자에서의 긍정적 반응을 얻을 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 조화롭게 발현되는 면역-관문 단백질의 결합제-약물 접합체에 의한 이중 차단은 부가적 또는 상승적 항-종양 활성을 생성할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 PGE2, TGF-βVEGF, CCL2, IDO, CSF1, IL-10, IL-13, IL-23, 아데노신 또는 STAT3 활성체의 길항제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 가용성 면역 억제 분자를 저해하는 하나 이상의 결합 도메인, 예컨대 가용성 면역 억제 분자(예컨대 수용체 트랩)에 결합하는 결합 도메인 또는 대응하는 동족 수용체에 결합하고 수용체의 리간드 활성화를 방지하는 결합 도메인을 포함하는 결합제-약물 접합체의 부분이다. 특정 예에서, 결합제-약물 접합체는 VEGF 수용체 트랩 도메인, 예컨대 애플리버셉트의 VEGF 결합 수용체 도메인을 포함한다. 다른 예에서, 결합제-약물 접합체는 TGF-β 수용체 트랩 도메인, 예컨대 MSB0011359C의 TGF-β 결합 수용체 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 종양 미세환경에서 상향조절된 단백질, 즉, 예컨대 종양 내 종양 세포, 또는 대식세포, 섬유아세포, T-세포 또는 종양에 침윤하는 다른 면역 세포 상에서 상향조절되는, 종양 연관 항원에 결합하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 결합제-약물 접합체의 부분이다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드는 CEACAM-1, CEACAM-5, BTLA, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR, B7-H3, B7-H4, CD40, CD4OL, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, Ga렉틴-9, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, LIGHT, MHC 클래스 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX4OL, PVR, SIRP□, TCR, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, VEGF, VEGF 수용체, EGFR, Her2/neu, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E 또는 TSLP로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 결합하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 결합제-약물 접합체의 부분이다.
(ii) 기타 PD-L1 결합제
일부 실시형태에서, 세포 결합 모이어티는 PD-1과 B7-1 둘 다에 대한 PD-L1의 결합을 저해하는 PD-L1 결합 길항제이다. 일부 실시형태에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-Ll 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-PDL1 항체는, 예컨대 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 실시형태에서, 항-PD-Ll 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, PD-L1 결합 길항제는 YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 및 MEDI4736으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포 결합 모이어티는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
Figure pct00098
또는
Figure pct00099
및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
Figure pct00100
을 포함하는 항-PD-L1 항체 또는 이의 단편이다.
다른 인간 및 인간화된 항체 및 이의 단편은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 본 발명에서 사용하는 데 용이하게 적합할 수 있다.
IV. 사용 방법 및 약제학적 조성물
본 발명의 결합제-약물 접합체는, 치료적 치료 방법, 예컨대 암에 대한 면역요법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 용도에서 유용하다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체는 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상, 종양 성장의 저해, 종양 용적의 감소, 종양 억제의 유도, 종양 세포 세포자멸사 증가 및/또는 종양의 종양 형성성 감소에 유용하다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 제제는 또한 병원균, 예컨대 바이러스에 대한 면역요법에 유용하다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체는 바이러스 감염 저해, 바이러스 감염 감소, 바이러스-감염 세포의 세포자멸사 증가 및/또는 바이러스-감염 세포의 사멸 증가에 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다.
본 발명은 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체에서 면역 반응을 활성화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체에서 면역 반응을 촉진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 세포-매개 면역을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 Th1-형 반응을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 T-세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 CD4+ T-세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 CD8+ T-세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 CTL 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 NK 세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 T 세포 활성을 증가시키고 NK 세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 CU 활성을 증가시키고 NK 세포 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 Treg 세포의 억제 활성을 저해 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 MDSC의 억제 활성을 저해 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 기억 T-세포의 백분율 수를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 장기간 면역 기억 기능을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키는 것은 장기간 기억을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 실질적인 부작용 및/또는 면역-기반 독성의 증거를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 증거를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 항원성 자극의 결과이다. 일부 실시형태에서, 항원성 자극은 종양 세포이다. 일부 실시형태에서, 항원성 자극은 암이다. 일부 실시형태에서, 항원성 자극은 병원균이다. 일부 실시형태에서, 항원성 자극은 바이러스-감염 세포이다.
결합제-약물 접합체가 면역 반응을 활성화 또는 저해하는지의 여부를 결정하기 위한 생체내 및 시험관내 분석은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 결합제-약물 접합체는 인간 PD-L1에 결합한다.
일부 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 결합제-약물 접합체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아피머 폴리펩타이드를 포함하는 아피머-함유 항체 또는 수용체 트랩 융합 폴리펩타이드이다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시형태에서, 종양에 대한 지속적 또는 장기간의 면역 반응을 활성화 또는 향상시키는 방법은 치료적 유효량의 인간 PD-L1에 결합하는 결합제-약물 접합체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양에 대한 지속적 면역 반응을 활성화 또는 향상시키는 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 결합제-약물 접합체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아피머 폴리펩타이드를 포함하는 아피머-함유 항체 또는 수용체 트랩 융합 폴리펩타이드이다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시형태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 저해하는 방법은 치료적 유효량의 인간 PD-L1에 결합하는 결합제-약물 접합체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 저해하는 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 결합제-약물 접합체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아피머 폴리펩타이드를 포함하는 아피머-함유 항체 또는 수용체 트랩 융합 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 종양은 항-PD-L1 아피머 폴리펩타이드와 함께 결합제-약물 접합체에 제공된 추가적인 결합 독립체에 의해 표적화된 종양 항원을 발현시키거나 과발현시키고, 즉, 결합제-약물 접합체는 이중특이성 또는 다중특이성 제제이다.
특정 실시형태에서, 종양 성장을 저해하는 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 종양을 갖거나, 또는 대상체는 제거된 종양을 가졌다.
일부 실시형태에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 실시형태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 신경내분비계 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양이다. 특정 실시형태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시형태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시형태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시형태에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정 실시형태에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 실시형태에서, 종양은 방광 종양이다.　
추가로 예시하기 위해, 대상 결합제-약물 접합체는 암, 예컨대 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행세포암, 방광암, 윌름암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 뼈암, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암), 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활액육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포 암종, 흑색종, 신장의 간상 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 뇌수막종, 뇌하수체 선종, 전정 신경초종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락얼기 유두종, 진성다혈구증, 혈소판증가증, 특발성 골수섬유증, 연조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 유암종 또는 간암, 유방암 또는 위암을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 암은, 예를 들어, 상기 기재한 여러가지의 전이성 암이다.
특정 실시형태에서, 암은 혈액학적 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 호지킨 림프종, 다발성 골수종, T-세포 급성 림프아구 백혈병(T-ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 비-호지킨 림프종, 광범위 B-세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 및 피부 T-세포 림프종(CTCL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 면역요법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 면역-종양학에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 종양 성장을 저해함에 있어서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 환자)에서 종양 성장을 저해함에 있어서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 암을 치료함에 있어서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 환자)에서 암을 치료함에 있어서의 용도를 발견한다.
제형은 본 발명의 정제된 결합제-약물 접합체를 약제학적으로 허용 가능한 비히클(예를 들어, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 당업자는 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 안정제가 제형 또는 약제학적 조성물의 비활성 성분이 되는 것으로 간주한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체는 동결건조되고/되거나 동결건조 형태로 저장된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 포함하는 제형은 동결건조된다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 비히클은 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제, 예컨대 옥타데실다이메틸벤질 염화암모늄, 염화헥사메토늄, 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄, 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들어, 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알기닌, 또는 라이신; 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체, 예컨대 Zn-단백질 복합체; 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료 중 하나를 위한 다수의 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 상피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국소; 네뷸라이저에 의하는 것을 비롯한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 폐, 기관내 및 비강내; 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내(예를 들어, 주사 또는 주입), 또는 두개내(예를 들어, 척추강내 또는 뇌실내)를 포함하는 비경구일 수 있다.
치료적 제형은 단위 투약 형태일 수 있다. 이러한 제형은 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 수성 또는 비수성 매질 중의 용액 또는 현탁액, 또는 좌약을 포함한다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주요한 활성 성분은 약제학적 담체와 혼합된다. 통상적인 정제화 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 솔비톨, 탈크, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산2칼슘 또는 검 및 희석제(예를 들어, 물)을 포함한다. 이들은 본 발명의 화합물, 또는 이의 비-독성의 약제학적으로 허용 가능한 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 사전제형화 조성물을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 고체 사전제형화 조성물은 상기 기재한 유형의 단위 투약 형태로 나누어진다. 제형 또는 조성물의 정제, 알약 등은 투약 형태를 제공하도록 코팅되거나 또는 달리 조제되어 연장된 작용의 이점을 얻는다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 외부 성분에 의해 내부 조성물을 포함할 수 있다. 더 나아가, 두 성분은 붕괴에 저항하는 작용을 하고 내부 성분이 위를 무손상으로 통과하거나 방출이 지연되게 하는 장용층에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장용층 또는 코팅에 대해 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체 산 및 셸락, 세틸 알코올 및 아세트산셀룰로스로서 이러한 물질과 중합체산의 혼합물을 포함한다.
본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체는 또한 마이크로캡슐에 포집될 수 있다. 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에 기재된 바와 같이, 이러한 마이크로캡슐, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메트아실레이트) 마이크로캡슐은 각각 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐에서 또는 마크로에멀션에서 제조된다.
특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 리포좀과 복합체화된 본 발명의 결합제-약물 접합체를 포함한다. 리포좀을 생성하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 정해진 기공 크기의 필터를 통해 압출될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 포함하는 지속-방출 제제가 생성될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 결합제-약물 접합체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함하며, 기질은 성형 물품(예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)의 형태이다. 지속-방출 기질의 예는 폴리에스터, 하이드로겔, 예컨대 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알코올), 폴리락타이드, L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)TM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 아이소뷰티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 투여하는 것에 추가로, 상기 방법 또는 치료는 적어도 1종의 추가적인 면역 반응 자극제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 면역 반응 자극제는 집락 자극 인자(예를 들어, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 줄기 세포 인자(SCF)), 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), 관문 저해제, 면역억제 작용(예를 들어, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체), toll-유사 수용체(예를 들어, TLR4, TLR7, TLR9), 또는 B7 패밀리의 구성원(예를 들어, CD80, CD86)을 차단하는 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적인 면역 반응 자극제는 결합제-약물 접합체의 투여 전에, 투여와 동시에 그리고/또는 투여에 후속적으로 투여될 수 있다. 결합제-약물 접합체 및 면역 반응 자극제(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는 1, 2, 3종 이상의 면역 반응 자극제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체를 투여하는 것에 추가로, 상기 방법 또는 치료는 적어도 1종의 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적인 치료제는 결합제-약물 접합체의 투여 전에, 투여와 동시에 그리고/또는 투여에 후속적으로 투여될 수 있다. 결합제-약물 접합체 및 추가적인 치료제(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 추가적인 치료제는 1, 2, 3종 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
2종 이상의 치료제와의 병용 요법은 종종 상이한 작용 메커니즘에 의해 작용하는 제제를 사용하지만, 이것이 필요하지는 않다. 상이한 작용 메커니즘을 갖는 제제를 이용하는 병용 요법은 상가적 또는 상승적 효과를 초래할 수 있다. 병용요법은 단일요법에서 사용되는 것보다 각각의 제제의 더 낮은 용량을 허용할 수 있고, 이에 의해 결합제-약물 접합체의 독성 부작용을 감소시키고/시키거나 치료 지표를 증가시킬 수 있다. 병용요법은 내성 암 세포가 발생될 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 병용요법은 면역 반응에 영향을 미치는(예를 들어, 반응을 향상시키거나 또는 활성화시키는) 치료제 및 종양/암 세포에 영향을 미치는(예를 들어, 저해하거나 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체와 적어도 1종의 추가적인 치료제의 조합물은 상가적 또는 상승적 결과를 초래한다. 일부 실시형태에서, 병용요법은 결합제-약물 접합체의 치료 지표 증가를 초래한다. 일부 실시형태에서, 병용요법은 추가적인 치료제(들)의 치료 지표 증가를 초래한다. 일부 실시형태에서, 병용요법은 결합제-약물 접합체의 독성 및/또는 부작용 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 병용요법은 추가적인 치료제(들)의 독성 및/또는 부작용 감소를 초래한다.
유용한 부류의 치료제는, 예를 들어, 항-튜불린제, 아우리스타틴, DNA 소홈 결합제, DNA 복제 저해제, 알킬화제(예를 들어, 백금 복합체, 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 삼핵 백금 복합체 및 카보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항-엽산, 항-대사물질, 화학요법 감작제, 듀오카마이신, 에토포사이드, 플루오린화된 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 나이트로소유레아, 플라틴올, 퓨린 항대사물질, 퓨로마이신, 방사선 감작제, 스테로이드, 탁산, 토포아이소머라제 저해제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항대사물질, 대사길항물질, 항유사분열제, 토포아이소머라제 저해제, 또는 혈관형성 저해제이다.
본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체와 병용하여 투여될 수 있는 치료제는 화학치료제를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 방법 또는 치료는 화학치료제와 병용하여 또는 화학치료제의 칵테일과 병용하여 본 발명의 결합제-약물 접합체의 투여를 수반한다. 결합제-약물 접합체에 의한 치료는 화학요법 투여 전에, 화학요법 투여와 동시에 또는 화학요법 투여에 후속적으로 일어날 수 있다. 병용 투여는 단일 약제학적 제형에서 또는 별개의 제형을 이용하는 공동 투여, 또는 적절하지만 일반적으로 모든 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있는 시간 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학치료제에 대한 제조 및 투약 스케줄은 제조업자의 설명서에 따라 또는 당업자에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투약 스케줄은 또한 문헌[The Chemotherapy Source Book, 4.sup.th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa]에 기재되어 있다.
본 발명에서 유용한 화학치료제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(사이톡산(CYTOXAN)); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민, 및 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스파오르아마이드 및 트라이메틸올로멜라민을 비롯한 메틸아멜라민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 나이트로소유레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라에메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모푸르, 사이토신 아라비노사이드, 다이데옥시유리딘, 독시플유리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK; 라족산; 시조퓨란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드(Ara-C); 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)) 및 도세탁셀(탁소텔(TAXOTERE)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈(젤로다(XELODA)); 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 화학치료제는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 방향화효소 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤(FARESTON)); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 류프롤라이드 및 고세렐린; 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 시스플라틴이다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 카보플라틴이다.　
본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시형태에서, 화학치료제는 토포아이소머라제 저해제이다. 토포아이소머라제 저해제는 토포아이소머라제 효소(예를 들어, 토포아이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학치료제이다. 토포아이소머라제 저해제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포사이드, 토포테칸 HCl, 테니포사이드(VM-26), 및 이리노테칸뿐만 아니라 이들 중 어느 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 이리노테칸이다.　
특정 실시형태에서, 화학치료제는 항대사물질이다. 항대사물질은 정상 생화학적 반응에 필요한 대사물질과 유사하고, 또한 세포의 한 가지 이상의 정상 기능, 예컨대 세포 분화를 방해하도록 충분히 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항-대사물질은 겜시타빈, 플루오로유라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 나트륨, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 사이토신 아라비노사이드, 티오구아닌, 5-아자사이티딘, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 클라드리빈뿐만 아니라 이들 중 어느 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 겜시타빈이다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시형태에서, 화학치료제는 튜불린에 결합하는 제제를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 항유사분열제이다. 일부 실시형태에서, 제제는 탁산이다. 특정 실시형태에서, 제제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체이다. 특정 실시형태에서, 제제는 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소텔), 알부민-결합 파클리탁셀(냅-파클리탁셀; 아브락산), DHA-파클리탁셀 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정 대안의 실시형태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 또는 빈데신 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 저해제 또는 유사분열 키나제의 저해제, 예컨대 오로라(Aurora) A 또는 Plk1이다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 파클리탁셀이다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 냅-파클리탁셀이다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 제제, 예컨대 소분자이다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2(ErbB2), 및/또는 VEGF를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 종양-연관 항원에 대한 저해제로서 작용하는 소분자와 함께 본 발명의 결합제-약물 접합체의 병용 투여를 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 결합제-약물 접합체는 게피티닙(이레사(IRESSA)), 에를로티닙(타세바(TARCEVA)), 수니티닙(수텐트(SUTENT)), 라파타닙, 반데타닙(작티마(ZACTIMA)), AEE788, CI-1033, 세디라닙(레센틴(RECENTIN)), 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)) 및 파조파닙(GW786034B)으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 키나제 저해제와 병용하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 mTOR 저해제를 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 암 줄기 세포 경로를 저해하는 소분자이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 Notch 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 Wnt 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 BMP 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 Hippo 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 mTOR/AKR 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 RSPO/LGR 경로의 저해제이다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 생물학적 분자, 예컨대 항체를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2/ErbB2, 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 종양-연관 항원에 대한 본 발명의 결합제-약물 접합체의 병용 투여를 수반할 수 있다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 Notch 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 Wnt 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 암 줄기 세포 경로를 저해하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 Notch 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 Wnt 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 BMP 경로의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 .베타.-카테닌 신호전달에 결합하는 항체이다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 혈관형성 저해제인 항체(예를 들어, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)이다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료제는 베바시주맙(아바스틴(AVASTIN)), 라무시루맙, 트라스투주맙(허셉틴(HERCEPTIN)), 퍼투주맙(옴니타르그(OMNITARG)), 파니투무맙(벡티빅스(VECTIBIX)), 니모투주맙, 잘루투무맙 또는 세툭시맙(어비툭스(ERBITUX))이다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 면역 반응을 조절하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3 항체, 또는 항-TIGIT 항체이다.
더 나아가, 본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체에 의한 치료는 다른 생물학적 분자, 예컨대 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)과의 병용 치료를 포함할 수 있거나 또는 종양의 수술적 제거, 암 세포의 제거, 또는 치료하는 의사에 의해 필요한 것으로 여겨지는 임의의 다른 요법을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 면역 반응 자극제이다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴(EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 마이오스타틴(GDF-8), NGF, 뉴트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-□, TGF-□, TNF-□, VEGF, P1GF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자와 조합될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 면역 반응 자극제이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 2(IL-2), B7-1(CD80), B7-2(CD86), 4-1BB 리간드, 항-CD3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIGIT 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체 및 항-TIM-3 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.　
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는: PD-1 활성의 조절제, PD-L2 활성의 조절제, CTLA-4 활성의 조절제, CD28 활성의 조절제, CD80 활성의 조절제, CD86 활성의 조절제, 4-1BB 활성의 조절제, OX40 활성의 조절제, KIR 활성의 조절제, Tim-3 활성의 조절제, LAG3 활성의 조절제, CD27 활성의 조절제, CD40 활성의 조절제, GITR 활성의 조절제, TIGIT 활성의 조절제, CD20 활성의 조절제, CD96 활성의 조절제, IDO1 활성의 조절제, 사이토카인, 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리의 구성원, 및 면역자극 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는 PD-1 길항제, PD-L2 길항제, CTLA-4 길항제, CD80 길항제, CD86 길항제, KIR 길항제, Tim-3 길항제, LAG3 길항제, TIGIT 길항제, CD20 길항제, CD96 길항제, 및/또는 IDO1 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, PD-1 길항제는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, PD-1에 결합하는 항체는 키트루다(KEYTRUDA)(MK-3475), 피딜리주맙(CT-011), 니볼루맙(OPDIVO, BMS-936558, MDX-1106), MEDI0680(AMP-514), REGN2810, BGB-A317, PDR-001 또는 STI-A1110이다. 일부 실시형태에서, PD-1에 결합하는 항체, 예를 들어, APE2058, APE1922, APE1923, APE1924, APE 1950, 또는 APE1963, 또는 임의의 이들 항체의 CDR 영역을 함유하는 항체로서 확인되는 항체는 국제 특허 출원 공개 WO 2014/179664에 기재되어 있다. 다른 실시형태에서, PD-1 길항제는 PD-L2, 예를 들어, AMP-224를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시형태에서, PD-1 길항제는 펩타이드 저해제, 예를 들어, AUNP-12이다.
일부 실시형태에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, CTLA-4에 결합하는 항체는 이필리무맙(여보이(YERVOY)) 또는 트레멜리무맙(CP-675,206)이다. 일부 실시형태에서, CTLA-4 길항제는 CTLA-4 융합 단백질, 예를 들어, KAHR-102이다.
일부 실시형태에서, LAG3 길항제는 LAG3에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, LAG3에 결합하는 항체는 IMP701, IMP731, BMS-986016, LAG525, 및 GSK2831781이다. 일부 실시형태에서, LAG3 길항제는 가용성 LAG3 수용체, 예를 들어, IMP321을 포함한다.
일부 실시형태에서, KIR 길항제는 KIR에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, KIR에 결합하는 항체는 리릴루맙이다.　
일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는 CD28 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD27 작용제, CD80 작용제, CD86 작용제, CD40 작용제, 및 GITR 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, OX40 작용제는 OX40 리간드, 또는 이의 OX40-결합 부분을 포함한다. 예를 들어, OX40 작용제는 MEDI6383일 수 있다. 일부 실시형태에서, OX40 작용제는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, OX40에 결합하는 항체는 MEDI6469, MEDI0562, 또는 MOXR0916 (RG7888)이다. 일부 실시형태에서, OX40 작용제는 OX40 리간드를 발현시킬 수 있는 벡터(예를 들어, 발현 벡터 또는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스)이다. 일부 실시형태에서, OX40-발현 벡터는 델타-24-RGDOX 또는 DNX2401이다.　
일부 실시형태에서, 4-1BB(CD137) 작용제는 결합 분자, 예컨대 안티칼린이다. 일부 실시형태에서, 안티칼린은 PRS-343이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 작용제는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 4-1BB에 결합하는 항체는 PF-2566(PF-05082566) 또는 우렐루맙(BMS-663513)이다.
일부 실시형태에서, CD27 작용제는 CD27에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, CD27에 결합하는 항체는 발리루맙(CDX-1127)이다.
일부 실시형태에서, GITR 작용제는 GITR 리간드 또는 이의 GITR-결합 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, GITR 작용제는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, GITR에 결합하는 항체는 TRX518, MK-4166, 또는 INBRX-110이다.　
일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는 사이토카인, 예컨대 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리의 구성원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 반응 자극제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD80 항체, 항-CD86 항체, 항-4-1BB 항체, 항-OX40 항체, 항-KIR 항체, 항-Tim-3 항체, 항-LAG3 항체, 항-CD27 항체, 항-CD40 항체, 항-GITR 항체, 항-TIGIT 항체, 항-CD20 항체, 항-CD96 항체 또는 항-IDO1 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합제-약물 접합체는 단독으로 또는 방사선 요법과 함께 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 결합제-약물 접합체는 단독으로 또는 표적화 요법과 함께 사용될 수 있다. 표적화 요법의 예는: 호르몬 요법, 신호 전달 저해제(예를 들어, EGFR 저해제, 예컨대 세툭시맙(얼비툭스(Erbitux)) 및 에를로티닙(타세바(Tarceva))); HER2 저해제(예를 들어, 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin)) 및 퍼투주맙(퍼제타(Perjeta))); BCR-ABL 저해제(예컨대 이마티닙(글리벡(Gleevec)) 및 다사티닙(스프라이셀(Sprycel))); ALK 저해제(예컨대 크리조티닙(잴코리(Xalkori)) 및 세리티닙(자이카디아(Zykadia))); BRAF 저해제(예컨대 베무라페닙(젤보라프(Zelboraf)) 및 다브라페닙(타핀라(Tafinlar))), 유전자 발현 조절제, 세포자멸사 유도제(예를 들어, 보테조밉(벨케이드(Velcade)) 및 카르필조밉(키프롤리스(Kyprolis))), 혈관형성 저해제(예를 들어, 베바시주맙(아바스틴(Avastin)) 및 라무시루맙(사이람자(Cyramza)), 독소에 부착된 단클론성 항체(예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴(애드세트리스(Adcetris)) 및 아도-트라스투주맙 엠탄신(캐사일라(Kadcyla)))를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 결합제-약물 접합체는 항-암 치료제 또는 면역조절 약물, 예컨대 면역조절 수용체 저해제, 예를 들어, 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 Tim-3 경로 길항제와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 Vista 경로 길항제와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 BTLA 경로 길항제와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 LAG-3 경로 길항제와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 TIGIT 경로 길항제와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-PDL1 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 BMS-936559, MSB0010718C 또는 MPDL3280A)와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-CTLA4 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-CS1 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR2DL1/2/3 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-CD137 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-GITR 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-PD-L2 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT1 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT2 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT3 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT4 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT5 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT6 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT7 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ILT8 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-CD40 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-OX40 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR2DL1 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR2DL2/3 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR2DL4 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR2DL5A 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR2DL5B 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR3DL1 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR3DL2 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-KIR3DL3 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-NKG2A 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-NKG2C 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-ICOS 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-SIRP.알파. 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-CD47 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-4-1 BB 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-IL-10 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-TSLP 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 IL-10 또는 페길화된 IL-10와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-APRIL 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 항-CD27 항체와 결합된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 결합제-약물 접합체는 바람직하게는 약제학적 조성물의 부분으로서 STING 작용제와 결합된다. 환식-다이-뉴클레오타이드(CDNs) 환식-다이-AMP(리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 다른 박테리아) 및 이의 유사체 환식-다이-GMP 및 환식-GMP-AMP는 인터페론 유전자의 자극제(Stimulator of INterferon Gene: STING)로서 알려진 병원균 인식 수용체(PRR)에 결합하는 병원균 연관 분자 패턴(PAMP)에 의해 인식된다. STING는 TANK 결합 키나제(TBK1)-IRF3 및 NF-.카파.B 신호전달 축을 활성화하여, IFN-.베타. 및 선천성 면역을 강하게 활성화시키는 다른 유전자 산물의 유도를 초래하는 숙주 포유류의 세포질에서 어댑터 단백질이다. STING는 숙주 세포질 감시 경로의 성분인데, 이는 STING 작용제와 함께 세포내 병원균에 의한 감염을 감지하고 이에 반응하여 본 발명의 IFN-β 생산을 유도하여, 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포뿐만 아니라 병원균-특이적 항체 둘 다로 이루어진 적응 보호 병원균-특이적 면역 반응의 발생을 야기한다는 것이 현재 인식되고 있다. 미국 특허 제7,709,458호 및 제7,592,326호; 국제 특허 출원 공개 WO2007/054279, WO2014/093936, WO2014/179335, WO2014/189805, WO2015/185565, WO2016/096174, WO2016/145102, WO2017/027645, WO2017/027646, 및 WO2017/075477(이들 모두는 참조에 의해 원용됨); 및 문헌[Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18:5631-4, 2008].
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 결합제-약물 접합체는 하나 이상의 사전결정된 항원에 대한 면역 반응을 자극하도록 의도된 하나 이상의 백신과 함께 투여된다. 항원(들)은 개체에 직접적으로 투여될 수 있거나, 예를 들어, 자가 또는 동종이형일 수 있는 종양 세포 백신(예를 들어, GVAX), 수지상 세포 백신, DNA 백신, RNA 백신, 바이러스-기반 백신, 박테리아 또는 효소 백신(예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 또는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)) 등으로부터 개체 내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Guo et al., Adv. Cancer Res. 2013; 119: 421-475; Obeid et al., Semin Oncol. 2015 August; 42(4): 549-561] 참조. 본 발명에서의 용도를 발견할 수 있는 표적 항원의 예는 다음의 표 4에 열거한다. 표적 항원은 또한 표에 열거된 항원의 면역학적으로 활성인 부분을 포함하는 단편 또는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 이 목록은 제한을 의미하지는 않는다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 결합제-약물 접합체는 카소피탄트(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 네투피탄트(MGI-헬신(MGI-Helsinn)) 및 기타 NK-1 수용체 길항제, 파로노세트린(MGI 파마(MGI Pharma)에 의해 알록시(Aloxi)로서 시판됨), 아프레피탄트(머크 앤 코(Merck and Co.)에 의해 에멘드(Emend)로서 시판됨; 뉴저지주 라웨이에 소재), 다이펜하이드라민(화이자(Pfizer)에 의해 베나드릴(Benadryl)로서 시판됨; 뉴욕주 뉴욕에 소재), 하이드록시진(화이자에 의하 아타락스(Atarax)로서 시판됨; 뉴욕주 뉴욕에 소재), 메토클로프라마이드(AH 로빈스 코(AH Robins Co,)에 의해 레글란(Reglan)으로서 시판됨; 버지니아주 리치몬드에 소재), 로라제팜(와이어스에 의해 아비탄(Ativan)으로서 시판됨; 뉴욕주 메디슨에 소재), 알프라졸람(화이자에 의해 자낙스(Xanax)로서 시판됨; 뉴욕주 뉴욕에 소재), 할로페리돌(오쏘-맥네일(Ortho-McNeil)에 의해 할돌(Haldol)로서 시판됨; 뉴저지주 라리탄에 소재), 드로페리돌(이납신(Inapsine)), 드로나빈올(솔베이 파마슈티칼스 인코포레이티드(Solvay Pharmaceuticals, Inc.)에 의해 시판되는 마리놀(Marinol); 조지아주 마리에타에 소재), 덱사메타손(머크 앤 코(Merck and Co.)에 의해 데카드론(Decadron)으로서 시판됨; 뉴저지주 라웨이에 소재), 메틸프레드니솔론(화이자에 의해 메드롤(Medrol)로서 시판됨; 뉴욕주 뉴욕에 소재), 프로클로르페라진(글락소스미스클라인(Glaxosmithkline)에 의한 콤파진(Compazine); 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크에 소재), 그라니세트론(호프만-라 로슈 인코포레이티드(Hoffmann-La Roche Inc.)에 의해 키트릴(Kytril)로서 시판됨; 뉴저지주 누틀리에 소재), 온단세트론(글락소스미스클라인에 의해 조프란(Zofran)으로서 시판됨; 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크에 소재), 돌라세트론(사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)에 의해 안제메트(Anzemet)로서 시판됨; 뉴욕주 뉴욕에 소재), 트로피세트론(노바티스(Novartis)에 의해 노보반(Navoban)으로서 시판됨; 뉴저지주 이스트 하노버에 소재)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 제토제와 함께 투여된다.
암 치료의 다른 부작용은 적혈구 및 백혈구 결핍증을 포함한다. 따라서, 본 발명의 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 이러한 결핍증을 치료하거나 예방하는 제제, 예컨대, 필그라스팀, PEG-필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파 또는 다르베포이에틴 알파와 함께 투여된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 결합제-약물 접합체는 항암 방사선 요법과 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, 방사선 요법은 외부 빔 요법(external beam therapy: EBT): 종양 위치에 고-에너지 X선 빔을 전달하는 방법이다. 빔은 환자 밖에서(예를 들어, 선형 가속기에 의해) 생성되고, 종양 부위에서 표적화된다. 이들 X-선은 암 세포를 파괴할 수 있으며, 조심스러운 치료 계획이 주변의 정상 조직은 남아있게 한다. 방사성원은 환자 신체 내부에 위치되지 않는다. 본 발명의 실시형태에서, 방사선 요법은 양성자 빔 요법: X-선 대신 양성자에 의해 질환 조직에 쏟아 붓는 입체조형요법(conformal therapy) 유형이다. 본 발명의 실시형태에서, 방사선 요법은 입체조형 외부 빔 방사선 요법: 개체 신체 구조에 방사선 요법을 맞추기 위한 진보된 기술을 사용하는 절차이다. 본 발명의 실시형태에서, 방사선 요법은 근접치료(brachytherapy): 보통 환부에 여분의 용량--또는 부스트--의 방사선을 제공하기 위해 사용되는 신체 내에서 방사성 물질의 일시적 배치이다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시형태에서, 치료는 항-바이러스 요법과 병용하여 본 발명의 결합제-약물 접합체 투여를 수반한다. 결합제-약물 접합체에 의한 치료는 항바이러스요법 투여 전에, 항바이러스요법 투여와 동시에 또는 항바이러스요법 투여에 후속적으로 일어날 수 있다. 병용요법에서 사용되는 항-바이러스 약물은 대상체를 감염시킨 바이러스에 의존할 것이다.
병용 투여는 단일 약제학적 제형에서 또는 별개의 제형을 이용하는 공동 투여, 또는 적절하지만 일반적으로 모든 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있는 시간 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 결합제-약물 접합체와 적어도 1종의 추가적인 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 이전에 제2 치료제에 의한 치료를 받은 환자에게 투여될 수 있다. 특정 다른 실시형태에서, 결합제-약물 접합체 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 동시에 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체에게 결합제-약물 접합체가 제공되는 한편, 제2 치료제(예를 들어, 화학요법)에 의한 치료 과정을 겪을 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 제2 치료제에 의한 치료 1년 이내에 투여될 것이다. 특정 대안의 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 제2 치료제에 의한 임의의 치료의 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 특정 다른 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 제2 치료제에 의한 임의의 치료의 4, 3, 2 또는 1주 이내에 투여될 것이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 제2 치료제에 의한 임의의 치료의 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 것이다. 2종(이상)의 제제 또는 치료는 약 몇 시간 또는 몇 분 이내에(즉, 실질적으로 동시에) 대상체에게 투여될 수 있다는 것이 추가로 인식될 것이다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 결합제-약물 접합체의 적절한 투약량은 모두 치료하는 의사의 재량으로, 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 질환의 반응, 결합제-약물 접합체가 치료적 또는 예방적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 이력 등에 따른다. 결합제-약물 접합체는 1회 또는 며칠 내지 몇달 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유가 달성되거나 또는 질환 상태의 감소가 달성될 때까지(예를 들어, 종양 크기의 감소) 투여될 수 있다. 환자 신체 내 약물 축적 측정으로부터 최적의 투약 스케줄이 계산될 수 있고, 개개 제제의 상대적 효능에 따라 다를 것이다. 투여하는 의사는 최적의 투약량, 투약 방법 및 반복 속도를 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 투약량은 0.01㎍ 내지 100㎎/㎏의 체중, 0.1㎍ 내지 100㎎/㎏의 체중, 1㎍ 내지 100㎎/㎏의 체중, 1㎎ 내지 100㎎/㎏의 체중 1㎎ 내지 80㎎/㎏의 체중, 10㎎ 내지 100㎎/㎏의 체중, 10㎎ 내지 75㎎/㎏의 체중, 또는 10㎎ 내지 50㎎/㎏의 체중이다. 특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 0.1㎎ 내지 약 20㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 0.1㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 0.25㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 0.5㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 1㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 1.5㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 2㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 2.5㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 5㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 7.5㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 10㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 12.5㎎/㎏의 체중이다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체의 투약량은 약 15㎎/㎏의 체중이다. 특정 실시형태에서, 투약량은 1일에, 1주에, 1개월에 또는 1년에 1회 이상 제공될 수 있다. 특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 1주마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회 또는 4주마다 1회로 제공된다.　
일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 초기의 보다 높은 "부하" 용량, 다음에 1회 이상의 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 빈도는 또한 변할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투약 요법은 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회 또는 1개월에 1회로 초기 용량, 다음에 추가적인 용량(또는 "유지" 용량)의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 투약 요법은 초기 부하 용량 다음에, 예를 들어, 초기 용량의 1/2의 매주의 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 투약 요법은 초기 부하 용량 다음에, 예를 들어, 격주로 초기 용량의 1/2의 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투약 요법은 3주 동안 3회의 초기 용량, 다음에, 예를 들어, 격주로 동일한 양의 유지 용량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제의 투여는 부작용 및/또는 독성을 야기할 수 있다. 일부 경우에, 부작용 및/또는 독성은 치료적 유효 용량에서 특정 제제의 투여를 불가능하게 할 만큼 심하다. 일부 경우에, 약물 요법은 중단되어야 하고, 다른 제제가 시도될 수 있다. 그러나, 동일한 치료적 분류의 다수의 제제는 종종 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내는데, 환자는 요법을 중단하여야 하거나, 또는 가능하다면, 치료제와 연관된 불쾌한 부작용으로 고통 받는다는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 투약 스케줄은 투여 또는 "주기"의 구체적 횟수로 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 3, 4, 5, 6, 7, 8회 이상의 주기 동안 투여된다. 예를 들어, 결합제-약물 접합체는 6주기 동안 2주마다 투여되고, 결합제-약물 접합체는 6주기 동안 3주마다 투여되며, 결합제-약물 접합체는 4주기 동안 2주마다 투여되고, 결합제-약물 접합체는 4주기 동안 3주마다 등으로 투여된다. 투약 스케줄은 당업자에 의해 결정되고, 후속적으로 변형될 수 있다.
따라서, 본 발명은 결합제-약물 접합체, 화학치료제 등의 투여와 연과된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는 1종 이상의 제제를 투여하기 위한 간헐적 투약 전략을 이용하는 것을 포함하는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 제제를 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 치료적 유효 용량의 화학치료제와 병용하여 치료적 유효 용량의 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 제제 중 하나 또는 둘 다는 간헐적 투약 전략에 따라 투여된다. 일부 실시형태에서, 간헐적 투약 전략은 초기 용량의 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계, 및 2주마다 약 1회로 후속적 용량의 결합제-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 간헐적 투약 전략은 초기 용량의 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계, 및 3주마다 약 1회로 후속적 용량의 결합제-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 간헐적 투약 전략은 초기 용량의 결합제-약물 접합체를 대상체에게 투여하는 단계, 및 4주마다 약 1회로 후속적 용량의 결합제-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 간헐적 투약 전략을 이용하여 투여되고, 화학치료제는 매주 투여된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 대상체는 바이러스 감염을 앓고 있다. 일 실시형태에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 간염 바이러스(A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인 바르 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 소아마비바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 또는 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로 감염된다.
실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 대상체는 박테리아 감염을 앓고 있다. 일 실시형태에서, 박테리아 감염은 클라미디아(Chlamydia), 리케차 박테리아(rickettsial bacteria), 마이코박테리아(mycobacteria), 스타필로콕시(staphylococci), 스트렙토콕시(streptococci), 뉴모노콕시(pneumonococci), 메닌고콕시(meningococci) 및 고노콕시(gonococci), 클렙시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(Legionella), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 살모넬라(Salmonella), 바실리(bacilli), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 클로스트리듐 테탄(Clostridium tetan), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 바실러스 안트리시스(Bacillus anthricis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 마이코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테륨 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis) 및 보리엘라(Borriella)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테륨에 의한 감염이다.
실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 대상체는 진균 감염을 앓고 있다. 일 실시형태에서, 진균 감염은 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼질러스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 니가(niger) 등), 털곰팡이 속(Genus Mucorales)(무코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 스켄키(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이데스 브라실렌시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라즈마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 진균에 의한 감염이다.
실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 결합제-약물 접합체를 이용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 대상체는 기생충 감염을 앓고 있다. 일 실시형태에서, 기생충 감염은 이질아메바, 대장섬모충, 파울러 자유 아메바, 가시아메바, 지아디아 포낭, 와포자충속, 폐포자충, 삼일열말라리아, 바베스열원충증, 트립파노소마 브루세이, 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 쥐모양선충(Nippostrongylus brasiliensis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충에 의한 감염이다.
a. PGE2 저해제
특정 실시형태에서, 결합제-약물 접합체는 PGE2 생산을 저해하는 제제와 병용하여 투여된다. PGE2 합성 공정은 세포막으로부터 아라키돈산을 이동시키는 포스포리파제 A2(PLA2) 패밀리 구성원, 아라키돈산을 프로스타글란딘 H2(PGH2), 및 PGE2의 최종 제형화에 필요한 프로스타글란딘 E 신타제(PGES)로 전환시키는 사이클로옥시게나제(구성적으로 활성인 COX1 및 유도성 COX2)를 수반한다. PGE2 합성 및 얻어진 염증 과정의 속도는 대부분의 생리적 조건에서 추가적인 인자, 예컨대 AA의 국소 이용 가능성에 의해 영향받을 수 있지만, PGE2 합성 속도는 COX2의 국소 발현 및 활성에 의해 제어된다.
다른 실시형태에서, 대상 결합제-약물 접합체는 PGE2 분해를 촉진시키는 제제와 병용하여 투여된다. PGE2 분해 속도는 15-하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소(15-PGDH)에 의해 제어되는데, 이는 PGE2 합성 속도에 추가로, 또한 PGE2 붕괴 속도가 대상 결합제-약물 접합체 조합에서의 치료적 개입을 위한 표적을 구성한다는 것을 시사한다.
또 다른 실시형태에서, 대상 결합제-약물 접합체는 PGE2 반응성을 감소시키는 제제와 병용하여 투여된다. 4가지 상이한 PGE2 수용체는 EP1, EP2, EP3 및 EP4이다. 2가지 Gs -결합 수용체, 즉, EP2 및 EP4를 통한 신호전달은, 아데닐레이트 사이클라제-촉발된 cAMP/PKA/CREB 경로에 의해 매개되어, PGE2의 항-염증 및 억제 활성의 우세한 양상을 매개한다. EP2는 대체로 cAMP-의존적 방식으로 신호전달되는 것으로 여겨지지만, EP4는 또한 PI3K-의존적 ERK1/2 경로를 활성화시킨다. 그러나, EP2와 EP4는 둘 다 GSK3/β-카테닌 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다. EP2의 발현 및 PGE2에 대해 얻어진 반응성은 특발성 폐 섬유증을 갖는 환자에서 관찰되는 바와 같은 초메틸화에 의해 억제될 수 있다. 이런 관찰들은 PGE2 생산 및 이의 분해의 조절에 추가로, 개개 PGE2 수용체의 발현 수준에서 PGE2 반응성 조절이 또한 인간 질환의 병리에 기여하고, 이들의 요법에서 이용될 수 있는 가능성을 상승시킨다. 근거에서, EP2, EP3 또는 EP4 신호전달에 우선적으로 영향을 미치는 합성 저해제의 사용은 상이한 양상의 PGE2 활성의 차별적 억제를 가능하게 한다.
PGE2 반응성을 감소시키는 제제는 또한 프로스타글란딘(PG) 신호전달 저해제를 포함한다. 중요한 면역억제 효과와 함께 수많은 수용체를 통한 프로스타글란딘 신호는 아데닐레이트 사이클라제의 활성화에 의해 매개되어, 세포내 환식 (c)AMP, PKA의 상승 및 PKA/CREB 경로의 하류 활성화가 얻어진다.
PG 반응성에 의한 다른 간섭 수준은 PG 수용체에 대한 이들의 결합에 의한 간섭을 포함한다. PGE2의 경우에, 2가지 중요한 cAMP-활성화 수용체는 다수의 특이적 저해제가 존재하는 EP2 및 EP4이다.
프로스타글란딘 또는 다른 인자에 의해 유도되는 cAMP 수준의 증가는 포스포다이에스터라제(PDE; 세포내 cAMP 수준을 감소시키는, 현재 공지되어 있는 6가지 유형, PDE1 내지 PDE5 및 PDE10)에 의해 방지될 수 있다. PDE는 모두 세포내 cAMP 수준을 증가시키는 잔틴(카페인, 아미노필린, IBMX, 펜톡시필린, 테오브로민, 테오필린 또는 파라잔틴)으로서 이러한 물질, 및 빈포세틴, 실로스타졸, 이나미논, 실로스타졸, 메셈브린, 롤리프람, 이부딜라스트, 드로타베린, 피클라밀라스트, 실다페닐, 타달라필, 버데나필 또는 파파베린을 포함하는 더 선택적인 합성 및 천연 인자를 포함하는 포스포다이에스터라제 저해제에 의해 제어될 수 있다.
더 나아가, PGE2 신호전달에 의한(또는 베타-아드레날린 작용제의 다른 cAMP-상승 인자, 예컨대 히스타민의 신호전달에 의한) 간섭은 cAMP의 하류 신호, 예컨대 PKA 또는 CREB의 저해에 의해 달성될 수 있다.
(a) 사이클로옥시게나제 저해제
특정 바람직한 실시형태에서, 대상 결합제-약물 접합체는 1종 이상의 프로스타글란딘(PG) 합성 저해제와 병용하여 투여된다. 일반적으로 PG의 합성 또는 특정 유형의 PG의 합성을 저해하는 인자. PG 합성 저해제는 PG 합성 경로에서 2가지 중요한 효소인 COX-1 및 COX-2의 비선택적 저해제, 및 COX-2에 대해 더 특이적이며 덜 독성인 것으로 여겨지는 COX-2의 선택적 저해제를 포함한다. 비-선택적 PG 저해제의 예는 아스피린, 인도메타신 또는 이부프로펜(애드빌(Advil), 모트린(Motrin))을 포함한다. COX-2-선택적 저해제의 예는 셀레콕시브(셀레브렉스(Celebrex)) 및 로페콕시브(비옥스(Vioxx))를 포함한다. COX-1-특이적 저해제의 예는 설린닥(클리노릴(Clinoril))이다. 프로스타글란딘 합성을 억제하는 다른 약물은 스테로이드(예: 하이드로코티손, 코티솔, 프레드니손 또는 덱사메타손) 및 항-염증, 해열제 및 진통 약물로서 통상적으로 사용되는 아세트아미노펜(타이레놀(Tylenol), 파나돌(Panadol))을 포함한다. 가장 통상적으로 사용되는 선택적 COX2 저해제의 예는 셀레콕시브, 알레콕시브, 발데콕시브 및 로페콕시브를 포함한다.
가장 통상적으로 사용되는 비-선택적 COX 1 및 COX2 저해제의 예는 아세틸살리실산(아스피린) 및 기타 살리실레이트, 아세트아미노펜(타이레놀), 이부프로펜(애드빌, 모트린, 누프린(Nuprin), 루펜(Rufen)), 나프록센(나프로신(Naprosyn), 알레브(Aleve)), 날부메톤(렐라펜(Relafen)) 또는 디클로페낙(카타플람(Cataflam))을 포함한다.
본 발명의 성분은 Cox-2 저해제이다. 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용될 수 있는 용어 "사이클로옥시게나제-2 저해제" 또는 "Cox-2 저해제"는 Cox-1 효소의 저해 정도와 상관없이 Cox-2 효소를 저해하고, 해당 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 화합물을 포괄한다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 화합물이 Cox-1 효소와 동일하거나, 더 크거나 또는 더 적은 정도로 Cox-2 효소를 저해하는지의 여부와 상관없이, 화합물은 Cox-2 저해제로 간주된다.
본 발명의 일 실시형태에서, Cox-2 저해제 화합물은 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 Cox-2 저해제로서 작용할 수 있는 바람직한 물질은 비-스테로이드성 항-염증 약물 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 순수한(-) 또는 (+) 광학 이성질체 형태를 포함한다.
본 발명에서 유용한 NSAID 화합물의 예는 아세메타신, 아세틸 살리실산, 알클로페낙, 알미노프로펜, 아자프로파존, 베노릴레이트, 베녹사프로펜, 부클록신산, 카프로펜, 콜린 마그네슘 트라이살리실레이트, 클리다낙, 클로피낙, 답손, 디클로페낙, 디플루니살, 드록시캄, 에토돌락, 페노프로펜, 펜부펜, 펜클로페낙, 펜티아작, 플록타페닌, 플루페니살, 플루르비프로펜, (r)-플루르비프로펜, (s)-플루르비프로펜, 퓨로페낙, 페프라존, 플루페남산, 플루프로펜, 이부페낙, 이부프로펜, 인도메타신, 인도프로펜, 아이소옥세팍, 아이소옥시캄, 케토프로펜, 케토롤락, 미로프로펜, 피록시캄, 멜록시캄, 메페나믹, 메페남산, 메클로페남산, 메클로펜, 나부메톤, 나프록센, 니플룸산, 옥사프로진, 옥시피낙, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 포도필로톡신 유도체, 프로글루메타신, 피프로펜, 피르프로펜, 프라프로펜, 살리실산, 살리실레이트, 수독시캄, 수프로펜, 설린닥, 테녹시캄, 티아프로펜산, 티오피낙, 티옥사프로펜, 톨페남산, 톨메틴, 지도메타신, 조메피락 및 2-플루오로-a-메틸[1,1'-바이페닐]-4-아세트산, 4-(나이트로옥시)뷰틸 에스터를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, Cox-2 저해제는 Cox-2 선택적 저해제이다. 용어 "Cox-2 선택적 저해제"는 Cox-1 효소 이상으로 Cox-2 효소를 선택적으로 저해하는 화합물을 포괄하고, 또한 약제학적으로 허용 가능한 염 및 해당 화합물의 프로드러그를 포함한다. 특정 실시형태에서, PGE2 길항제는 인도메타신이 아니다.
실제, Cox-2 저해제의 선택성은 시험이 수행되는 조건 및 시험 중인 저해제에 따라 다르다. 그러나, 본 명세서의 목적을 위해, Cox-2 저해제의 선택성은 Cox-1의 저해에 대한 시험관내 또는 생체내 IC50값을 Cox-2의 저해에 대한 IC50 값으로 나눈 비(Cox-1 IC50/Cox-2 IC50)로서 측정될 수 있다. Cox-2 선택적 저해제는 Cox-1 IC50　대 Cox-2 IC50의 비가 1 초과인　임의의 저해제이다. 바람직한 실시형태에서, 이 비는 2 초과, 더 바람직하게는 5 초과, 또한 더 바람직하게는 10 초과, 훨씬 더 바람직하게는 50 초과, 훨씬 더 바람직하게는 100 초과이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "IC50"은 사이클로옥시게나제 활성의 50% 저해를 생성하는 데 필요한 화합물 농도를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 Cox-2 선택적 저해제는 Cox-2 IC50이 약 1μM 미만, 더 바람직하게는 약 0.5μM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.2μM 미만이다.
바람직한 Cox-2 선택적 저해제는 Cox-1 IC50이 약 1μM, 더 바람직하게는 20μM 초과이다. 이러한 바람직한 선택성은 통상적인 NSAID-유도 부작용의 발생률을 감소시키는 능력을 나타낼 수 있다.
또한 Cox-2-선택적 저해제의 프로드러그로서 작용하는 화합물이 본 발명의 범주 내에 포함된다. Cox-2 선택적 저해제에 관해 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로드러그"는 대상체 신체 내에서 대사 또는 단순한 화학적 과정에 의해 활성 Cox-2 선택적 저해제로 전환될 수 있는 화학적 화합물을 지칭한다. Cox-2 선택적 저해제에 대한 프로드러그의 일례는 삼환식 Cox-2 선택적 저해제 발데콕시브의 치료적으로 유효한 프로드러그임 파레콕시브이다. 바람직한 Cox-2 선택적 저해제 프로드러그의 예는 파레콕시브나트륨이다. Cox-2 저해제의 프로드러그 부류는 미국 특허 제5,932,598호에 기재되어 있다(참조에 의해 원용됨).
본 발명의 Cox-2 선택적 저해제는, 예를 들어, Cox-2 선택적 저해제 멜록시캄(CAS 등록 번호 71125-38-7), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드러그일 수 있다.
Figure pct00101
본 발명의 다른 실시형태에서, Cox-2 선택적 저해제는 Cox-2 선택적 저해제 RS 57067, 6-[[5-(4-클로로벤조일)-1,4-다이메틸-1H-피롤-2-일]메틸]-3(2H)-피리다진온(CAS 등록 번호 179382-91-3), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 프로드러그일 수 있다.
Figure pct00102
다른 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00103
6-나이트로-2-트라이플루오로메틸-2H-1-벤조피란-3-카복실산
Figure pct00104
6-클로로-8-메틸-2-트라이플루오로메틸-2H-1-벤조피란-3-카복실산
Figure pct00105
((S)-6-클로로-7-(1,1-다이메틸에틸)-2-(트라이플루오로메틸-2H-1-벤조피란-3-카복실산
Figure pct00106
2-트라이플루오로메틸-2H-나프토[2,3-b]피란-3-카복실산
Figure pct00107
6-클로로-7-(4-나이트로페녹시)-2-(트라이플루오로메틸)-2H-1-벤조피란-3-카복실산
Figure pct00108
((S)-6,8-다이클로로-2-(트라이플루오로메틸)-2H-1-벤조피란-3-카복실산
Figure pct00109
6-클로로-2-(트라이플루오로메틸)-4-페닐-2H-1-벤조피란-3-카복실산
Figure pct00110
6-(4-하이드록시벤조일)-2-(트라이플루오로메틸)-2H-1-벤조피란-3-카복실산
Figure pct00111
2-(트라이플루오로메틸)-6-[(트라이플루오로-메틸)티오]-2H-1-벤조티오피란-3-카복실산
Figure pct00112
6,8-다이클로로-2-트라이플루오로메틸-2H-1-벤조티오피란-3-카복실산
Figure pct00113
6-(1,1-다이메틸에틸)-2-(트라이플루오로메틸)-2H-1-벤조티오피란-3-카복실산
Figure pct00114
6,7-다이플루오로-1,2-다이하이드로-2-(트라이플루오로메틸)-3- 퀴놀린카복실산
Figure pct00115
6-클로로-1,2-다이하이드로-1-메틸-2-(트라이플루오로메틸)-3-퀴놀린카복실산
Figure pct00116
6-클로로-2-(트라이플루오로메틸)-1,2-다이하이드로[1,8]나프티리딘-3-카복실산
Figure pct00117
((S)-6-클로로-1,2-다이하이드로-2-(트라이플루오로메틸)-3- 퀴놀린카복실산
Figure pct00118
(2S)-6,8-다이메틸-2-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-3-카복실산
Figure pct00119
(2S)-8-에틸-6-(트라이플루오로메톡시)-2-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-3-카복실산
Figure pct00120
(2S)-6-클로로-5,7-다이메틸-2-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-3-카복실산
바람직한 실시형태에서, 크로멘 Cox-2 저해제는 (S)-6-클로로-7-(1,1-다이메틸에틸)-2-(트라이플루오로메틸)-2H-1-벤조피란-3-카복실산, (2S)-6,8-다이메틸-2-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-3-카복실산, (2S)-6-클로로-8-메틸-2-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-3-카복실산, (2S)-8-에틸-6-(트라이플루오로메톡시)-2-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-3-카복실산, (S)-6,8-다이클로로-2-(트라이플루오로메틸)-2H-1-벤조피란-3-카복실산, (2S)-6-클로로-5,7-다이메틸-2-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-3-카복실산, 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, Cox-2 저해제는 하기 일반식으로 나타내는 삼환식 Cox-2 선택적 저해제 부류 또는 이들의 프로드러그로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00121
식 중:
Z1은 부분적으로 불포화 또는 불포화된 헤테로사이클릴 및 부분적으로 불포화 또는 불포화된 탄소환식 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R24는 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 및 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되되, R24는 치환 가능한 위치에서 알킬, 할로알킬, 사이아노, 카복실, 알콕시카보닐, 하이드록실, 하이드록시알킬, 할로알콕시, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 나이트로, 알콕시알킬, 알킬설핀일, 할로, 알콕시 및 알킬티오로부터 선택된 하나 이상의 라디칼로 선택적으로 치환되고;
R25는 메틸 또는 아미노로 이루어진 군으로부터 선택되며; 그리고
R26은 H, 할로, 알킬, 알켄일, 알킨일, 옥소, 사이아노, 카복실, 사이아노알킬, 헤테로사이클릴옥시, 알킬옥시, 알킬티오, 알킬카보닐, 사이클로알킬, 아릴, 할로알킬, 헤테로사이클릴, 사이클로알켄일, 아르알킬, 헤테로사이클릴알킬, 아실, 알킬티오알킬, 하이드록시알킬, 알콕시카보닐, 아릴카보닐, 아르알킬카보닐, 아르알켄일, 알콕시알킬, 아릴티오알킬, 아릴옥시알킬, 아르알킬티오알킬, 아르알콕시알킬, 알콕시아르알콕시알킬, 알콕시카보닐알킬, 아미노카보닐, 아미노카보닐알킬, 알킬아미노카보닐, N-아릴아미노카보닐, N-알킬-N-아릴아미노카보닐, 알킬아미노카보닐알킬, 카복시알킬, 알킬아미노, N-아릴아미노, N-아르알킬아미노, N-알킬-N-아르알킬아미노, N-알킬-N-아릴아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, N-아릴아미노알킬, N-아르알킬아미노알킬, N-알킬-N-아르알킬아미노알킬, N-알킬-N-아릴아미노알킬, 아릴옥시, 아르알콕시, 아릴티오, 아르알킬티오, 알킬설핀일, 알킬설폰일, 아미노설폰일, 알킬아미노설폰일, N-아릴아미노설폰일, 아릴설폰일, N-알킬-N-아릴아미노설폰일로부터 선택된 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 나타내는 Cox-2 선택적 저해제는 셀레콕시브(B-21), 발데콕시브(B-22), 데라콕시브(B-23), 로페콕시브(B-24), 에토리콕시브(MK-663; B-25), JTE-522(B-26) 또는 이들의 프로드러그를 포함하는 화합물의 군으로부터 선택된다.
상기 논의한 Cox-2 선택적 저해제의 선택된 예에 관한 추가적인 정보는 다음과 같이 찾을 수 있다: 셀레콕시브(CAS RN 169590-42-5, C-2779, SC-58653, 및 미국 특허 제5,466,823호(참조에 의해 원용됨)); 데라콕시브(CAS RN 169590-41-4); 로페콕시브(CAS RN 162011-90-7); 화합물 B-24(미국 특허 제5,840,924호); 화합물 B-26(WO 00/25779(참조에 의해 원용됨)); 및 에토리콕시브(CAS RN 202409-33-4, MK-663, SC-86218, 및 WO 98/03484(참조에 의해 원용됨)).
Figure pct00122
Figure pct00123
본 발명의 더 바람직한 실시형태에서, Cox-2 선택적 저해제는 셀레콕시브, 로페콕시브 및 에토리콕시브로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, B-27에서 나타내는 구조를 갖고, 치료적 유효량의 삼환식 Cox-2 선택적 저해제 발데콕시브의 프로드러그, B-22(미국 특허 제5,633,272호 참조(참조에 의해 원용됨))인, 파레콕시브(미국 특허 제5,932,598호(참조에 의해 원용됨))는 본 발명의 유리하게는 Cox-2 저해제로서 사용될 수 있다.
Figure pct00124
파레콕시브의 바람직한 형태는 파레콕시브 나트륨이다.
본 발명에서 유용한 다른 삼환식 Cox-2 선택적 저해제는 국제 특허 출원 공개 WO 00/24719에서 이미 기재한, 이하에 나타내는 화학식 B-28을 갖는 화합물 ABT-963이다.
Figure pct00125
(a) 사이토졸 포스포리파제 A2(cPLA2) 저해제
특정 실시형태에서, PGE2 저해제는 사이토졸 포스포리파제 A2(cPLA2)의 저해제, 예컨대, 단지 예시를 위해, 아라키돈일 트라이플루오로메틸 케톤,
Figure pct00126
Figure pct00127
바레스플라딥 메틸이다.
VI. 특정 실시예
Figure pct00128
Figure pct00129
실시예 1: 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 PD-L1 결합 아피머의 선택
본 발명의 펩타이드, 예를 들어, PD-L1 결합 성분은 2개의 무작위 루프를 갖지만, 일반적으로 동일한 길이의 9개의 아미노산에 배타적이지 않은 아피머 라이브러리로부터의 선택에 의해 확인할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PD-L1 결합 펩타이드는 스테핀 A의 서열에 기반하여 일정한 아피머 프레임워크 골격에서 나타나는 길이로 무작위 루프 서열인 9개의 아미노산을 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 선택에 의해 확인하였다. 이러한 선택 절차는 일반적으로 알려져 있다. 이러한 절차에 따르면, 파지의 현탁액은 표적 항원과 함께 인큐베이션시킨다(스트렙타비딘 비드 상에서 포획된 바이오틴일화된 항원 또는 플레이트 상에서 포획된 비바이오틴일화된 항원). 이어서, 비결합 파지를 세척하고, 후속적으로, 결합된 파지는 항원을 낮은 pH로 인큐베이션시킨 후에, 높은 pH로 인큐베이션시킴으로서 용리시킨다. 이어서, 이콜라이를 방출된, pH 중성 파지로 감염시키고, 제1 라운드 파지의 제제를 얻는다. 주기를, 예를 들어, 2회 또는 3회 반복적으로 수행하고, 표적화 파지를 농축시키기 위해, 엄격한 조건을 이후의 선택 라운드에서, 예를 들어, 세척 단계의 수를 증가시키고, 항원 농도를 감소시키고 나서, 차단된 스트렙타비딘 비드로 사전선택하거나, 차단 시약으로 웰 코팅함으로써, 증가시킬 수 있다.
연속적 라운드의 파지 증폭에 의한 선택 후에, 가용성 아피머 ELISA에 의해 PD-L1 결합 클론을 확인하였다. 간략하게, 아피머를 파지미드 벡터로부터 과발현시키고, 박테리아 세포를 용해시키고 나서, 용해물을 ELISA에서 사용하여, 아피머 상의 His6 태그에 접합된 항체를 갖는 플레이트 상에 고정된 PD-L1에 대한 아피머 결합을 검출하였다.
예시를 위해, 아피머 라이브러리로부터의 PD-L1 결합 파지의 선택을 이하에 기재하는 바와 같이 수행하고, 대략 1×1011개의 파지를 이용하여 대략 6×1010의 다양성 크기의 라이브러리로부터 첨가하였다.
M280 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 비드(써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 상에서 포획한 바이오틴일화된 항원. 간략하게, 아피머를 파지미드 벡터로부터 과발현시키고, 박테리아 세포를 용해시키고 나서, 용해물을 ELISA에서 사용하여, 선택을 위해 사용한 아피머 상의 His6 태그에 접합된 항체를 갖는 플레이트 상에 고정된 PD-L1에 대한 아피머 결합을 검출하였다. 알앤디(R & D)에 의힌 Fc-절단 형식으로 항원을 공급하였고, EZ 링크 설포-NHS-LC 바이오틴 키트(피어스(Pierce))를 이용하여 내부에서 바이오틴일화시켰다.
비드 상의 항원에 대한 파지의 첨가 전에, 파지와 비드는 둘 다 2% Marvel-PBS로 차단시켰고, 각각 1시간 동안 비-특이적 결합 상호작용을 감소시켰다. 이어서, 파지를 실온에서 1시간 동안 항원에 결합시킨 후에, PBS-0.1% Tween 20으로 5회 세척한 다음에 PBS로 2회 세척함으로써 비결합 또는 약하게 결합된 파지를 제거하고, 100mM 트라이에틸아민을 이용하여 파지를 용리시키고, 용리물을 제거하고 나서, 트리스 완충제로 중화시키고, 이어서, 0.1M HCl로 2회 용리시키고, 또한 트리스 완충제로 중화시켰다. 용리물을 풀링하고 채취된 파지를 집락 형성 단위(CFU)로서 적정한 후에, 이콜라이 TG1 세포에서 증폭시키고, 헬퍼 파지 M13KO7을 이용하여 구조하고 정제한 후에 적장하고, 다음 라운드의 패닝을 위한 유입물로서 사용하였다. 제2 및 제3 라운드의 패닝을 위해, 세척 엄격성은 PBS-Tween에 의한 더 많은 주기의 세척을 이용하고, 항원을 감소시킴으로써 증가되었다. 차단된 비드에 의한 유입물 파지의 사전선택에 의해 라운드 2 및 3에서 탈선택 단계를 또한 도입하여 비드 결합제를 제거하고, 비드를 각각의 라운드에서 뉴트라비딘과 스트렙타비딘 간에 교환하여 스트렙타비딘 결합제를 감소시켰다.
제2 및 제3 라운드 분획으로부터 파지의 적정 후에, 잘-단리된 플라크를 선별하고, 가용성 아피머를 발현시키고 나서, 조질의 추출물 ELISA에 의한 항원 결합에 대해 특성규명하였다. 간략하게, 아피머를 IPTG 유도에 의한 파지미드 벡터, 시약 B-PER II(써모 사이언티픽)을 이용하여 용리시킨 박테리아 세포 및 ELISA에서 사용한 원심분리로 정제된 용해물로부터 과발현시켜, 아피머 상의 His6 태그에 대한 HRP 접합 항체(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 갖는 플레이트 상에 고정된 PD-L1에 대한 아피머 결합을 검출하고, 1-단계 울트라 TMB-ELISA 기질(써모 사이언티픽)을 이용하여 ELISA를 진행하였다. 항원 코팅이 없는 음성 대조군 플레이트 상에서 상기 배경에 대한 결합을 나타내는 클론은 비특이적 결합제로서 거부하였다. 특이적 결합을 나타내는 클론을 서열분석하여 루프 서열을 확인하였다.
실시예 2: 인간암 세포주 발현 PD-L1에 대한 항-PD-L1 아피머의 결합 친화도
유세포 분석을 이용하여 AVA04 아피머의 친화도를 결정하였다.
조직 배양물로부터 탈착한 페니실린(100U/㎖, 하이클론(Hyclone)) 및 스트렙토마이신(100㎍/㎖, 하이클론)과 함께 10%의 FBS(깁코(Gibco))를 함유하는 RPMI-2640(시그마(Sigma))에서 성장시킨 PL-L1을 발현시키는 H441 세포를 DPBS를 이용하여 세척하였다. 300rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 세포를 PBS에서 재현탁시켰고, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 웰당 50000개의 세포를 처치하였다. 세포를 PBS로 세척하였다. 아피머 및 대조군을 2회 중복하여 염색 완충제(알앤디)에서 희석시키고, 대략 60분 동안 4±1℃에서 염색을 위해 세포 상에 첨가하였다. 세포를 세척하고 나서, 2차 항-시스타틴 A(알앤디)를 염색 완충제(알앤디)에서 1:15로 희석시키고, 대략 40분 동안 4±1℃에서 염색을 위해 세포 상에 첨가하였다. 세포를 세척하고 나서, 검출 항체 A488 항-염소(바이오레전드(Biolegend))를 염색 완충제(알앤디)에서 1:100로 희석시키고, 대략 30분 동안 4±1℃에서 염색을 위해 세포 상에 첨가하였다. 최종적으로, 세포를 세척하고, 생세포 및 사멸 세포를 10분 동안 4±1℃에서 염색 완충제에서 희석시킨 L/D 염색 좀비 아쿠아(Zombie Aqua)(바이오레전드)를 이용하여 염색하였다. 세포를 세척하고 나서, 고정 완충제(알앤디)를 각각의 웰에 10분 동안 4±1℃에서 첨가하고, 이어서, EDTA(론자(Lonza))에 의한 PBS를 첨가한 후에 유세포 분석기(구아바(Guava) 12 HT, 밀리포어(Millipore)) 상의 플레이트에서 판독하였다. 사멸 세포를 제외하고, 형광 그린 채널(488㎚/525/30)을 획득하였다. 인사이트(Incyte)를 이용하여 결과를 분석하고, 그래프패드를 이용하여 데이터를 플롯팅하였다.
MDA-MB-231에 대한 세포 결합 분석
Figure pct00130
세포 제조:
Detach MDA-MB-231 세포(ATCC)를 탈착시키고, 이어서, 이들을 0.25×10e6개의 세포/㎖, 80㎖로 희석시켰다.
200㎕의 세포 현탁액(50000개의 세포)을 모든 웰, 4개 플레이트에 피펫팅하였다.
300g, 5분 동안 원심분리시키고, 상청액을 버렸다.
세포를 200㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 300g, 5분 동안 원심분리시키고, 상청액을 버렸다.
Figure pct00131
아피머 및 대조군 희석 및 염색
표에 따라 아피머 및 항체 희석물을 제조한다(아테졸리주맙, 3.5nM로부터의 인비보겐(Invivogen) 및 500nM로부터의 아피머)
별개의 희석 플레이트에 대해:
웰 A1, B1, A2 및 B2 상의 60㎕ 염색 완충제
행 A 및 B 웰 4 내지 12에 대해 60㎕ 염색 완충제
행 C 내지 H 웰 2 내지 12에 대해 60㎕ 염색 완충제
1. 웰 A3 및 B3에 대해 3.5nM로부터 100㎕ 아테졸리주맙(인비보겐(InVivogen))
웰 A3 및 B3으로부터 A4 및 B4등에, A12 및 B12까지 30㎕를 전달한다.
2. 상기 표에 따라 대응하는 칼럼 1에 100㎕의 아피머 희석물을 피펫팅한다.
웰 1 내지 2, 2 내지 3 등으로부터 12까지 20㎕를 전달한다
세포가 있는 분석 플레이트 상에서 대응하는 웰에 희석 플레이트로부터의 50㎕를 피펫팅하고, 잘 혼합한다.
60분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다.
Figure pct00132
세척: 150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
1회 더 반복한다.
Figure pct00133
항 시스타틴으로 염색한다:
50㎕/웰의 염색 완충제를 웰 A1 내지 A12, 및 B2 내지 B12에 피펫팅한다
염색 완충제에서 항-시스타틴 항체의 22000㎕ 1:15 희석물을 제조한다: 1467㎕ Ab + 20533ul 염색 완충제. 50㎕/웰을 B1 및 행 C 내지 H 웰에 피펫팅한다. 40분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다.
Figure pct00134
세척하고, 150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
1회 더 반복한다
Figure pct00135
2차 Ag로 염색한다:
AF488 항-인간 IgG(바이오레전드)의 5000 ㎕의 1:100 희석물을 제조한다: 50㎕ 항-인간 IgG + 4950㎕ 염색 완충제
50㎕/웰로 행 A 및 B 웰 2 내지 12에 피펫팅한다
염색 완충제에서 항-염소 AF488(바이오레전드) 항체의 25000㎕의 1:500 희석물을 제조한다: 50㎕ Ab + 24950㎕ 염색 완충제.
50㎕/웰을 B1 및 행 C 내지 H 웰에 피펫팅한다.
30분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
Figure pct00136
생존 및 사멸 염색:
염색 완충제에서 L/D 염색 좀비 아쿠아(바이오레전드)의 25000㎕의 1:500 희석물을 제조한다: 50㎕ L/D 염색 + 24950㎕ 염색 완충제.
50㎕를 분석 플레이트 상의 모든 웰에 피펫팅하였다.
10분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
1회 더 반복한다
Figure pct00137
고정화 단계:
100㎕/웰의 고정 완충제를 첨가한다
10분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
100㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
세포를 100㎕ 염색 완충제 내로 현탁시키고, +5℃에서 저장한다.
H441에 대한 세포 결합 분석
Figure pct00138
세포 제조:
H441 세포를 탈착시키고, 이어서, 이들을 0.25×10e6개의 세포/㎖, 85㎖로 희석시켰다.
200㎕의 세포 현탁액(50000개의 세포)을 모든 웰, 4개 플레이트에 피펫팅하였다.
300g, 5분 동안 원심분리시키고, 상청액을 버렸다.
Figure pct00139
세척:
EDTA를 이용하여 세포를 200㎕의 PBS에 재현탁시켰다.
300g, 5분 동안 원심분리시키고, 상청액을 버렸다.
Figure pct00140
아피머 및 대조군 희석 및 염색
세포가 있는 분석 플레이트 상에서 대응하는 웰에 대응하는 희석 플레이트로부터의 50㎕를 피펫팅하고, 잘 혼합한다.
120분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
Figure pct00141
세척:
EDTA를 이용하여 150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
1회 더 반복한다
Figure pct00142
항 시스타틴에 의한 염색:
50㎕/웰 염색 완충제를 행 A 웰에 피펫팅한다
염색 완충제에서 항-시스타틴 항체(50ug/㎖ 저장액)의 18000㎕ 1:15 희석물을 제조한다: 1200㎕ Ab + 16800㎕ 염색 완충제.
50㎕/웰로 B 내지 H 웰에 피펫팅한다.
냉동고에 저장액은 없었지만, 랩구루(LabGuru)는 다회 나타났다. 대신에, I는 이 분석에서 BAF1407을 사용하여야 했다.
40분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
세척:
EDTA를 이용하여 150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
1회 더 반복한다.
Figure pct00143
2차 Ag로 염색한다:
AF488 항-인간 IgG의 3000 ㎕의 1:100 희석물을 제조한다: 30㎕ 항-인간 IgG + 2970㎕ 염색 완충제
50㎕/웰로 행 A 웰 2 내지 12에 피펫팅한다
염색 완충제에서 항-염소 AF488(바이오레전드) 항체의 18000㎕의 1:500 희석물을 제조한다: 36㎕ Ab + 18㎖ 염색 완충제.
50㎕/웰로 B 내지 H 웰에 피펫팅한다.
50㎕ 염색 완충제를 모든 플레이트의 A1에 피펫팅한다
30분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
EDTA를 이용하여 150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
Figure pct00144
생존 및 사멸 염색:
염색 완충제에서 L/D 염색 좀비 아쿠아(바이오레전드)의 22㎖의 1:500 희석물을 제조한다: 44㎕ L/D 염색 + 22㎖ 염색 완충제.
50㎕를 분석 플레이트 상의 모든 웰에 피펫팅하였다.
10분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
EDTA를 이용하여 150㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
1회 더 반복한다
Figure pct00145
고정화 단계:
100㎕/웰로 고정 완충제를 첨가한다
10분 동안 +5℃에서 인큐베이션시켰다
EDTA를 이용하여 100㎕/웰의 PBS를 첨가하고, 300g, 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버린다.
세포를 100㎕ 염색 완충제 내로 현탁시키고, +5℃에서 저장한다.
실시예 3: 아피머 Fc 및 일렬 융합 생산 및 특성규명
제조업자의 프로토콜에 따라 엑시펙타민　시약(써모)를 이용하여 아피머 Fc 융합 작제물(AVA04-251 Fc 및 AVA04-182 Fc; 상기 표 참조, 각각 개략적 표현 도 5A 및 1A)에 의해 현탁액 HEK 세포(Expi293F 세포주; 써모(Thermo)) 일시적 형질감염을 수행하였다. 20,000g에서 1시간 동안 원심분리하고 0.45 ㎛에서 여과함으로써 형질감염 후 칠(7)일에 상청액을 채취하였다. AKTA 엑스프레스(AKTA Xpress)(GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상의 mabSelect　Sure　HiTrap　칼럼을 이용하여 단백질을 친화도 정제하였다. 다섯(5)개 칼럼 용적(CV)의 증류수로 수지를 세척하고, 오(5)　CV 1x PBS로 평형상태로 만들었다. 이어서, 5㎖/분의 유속으로 상청액을 통과시킨 후에 십(10)　CV 1x PBS로 세척하였다. 결합된 단백질을 오(5) CV 0.1M 글리신 pH　2.8에서 용리시킨 후에 센트리퓨어(Centripure)　탈염 칼럼(엠프바이오테크 게엠베하(empBiotech　GmbH))를 이용하여 1x PBS 내로 완충제 교환하였다. 하이로드(HiLoad)　26/600　슈퍼덱스(Superdex_　200pg 칼럼(GE 헬스케어)를 이용하는 분취 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 제2 단계 정제를 수행하고 나서, AKTA 익스프레스(GE 헬스케어) 상에서 2.6㎖/분의 유속으로 1x PBS에서 실행하였다. MAbPac　SEC-1(써모) 또는 Yarra-3000 칼럼(페노메넥스)를 이용하여 분석적 SEC를 수행하고, 얼티메이트(Ultimate) 3000 HPLC(써모) 상에서 0.8㎖/분으로 1x PBS에서 실행하였다. AVA04-182 Fc (서열번호 118) 및 AVA04-251 Fc (서열번호 117) 최종 단백질 배취는 95% 초과의 순도를 나타내었다(각각 도 1C 및 도 4A).　나노드롭(Nanodrop)(써모) A280 판독을 이용하여 단백질 수율을 추정하고, 생성물을 200V에서 노벡스(Novex)™ 20X 볼트(Bolt)™ MES SDS 실행 완충제(Thermo) 중의 SDS-PAGE　볼트 비스 트리스 플러스 4 내지 12% 겔(써모) 상에서 실행하였고, 샘플은 환원 완충제에서 가열하였다. 겔 상의 단백질 밴드를 퀵 쿠마씨(Quick Commassie)(제너론(Generon))로 염색하였다.　페이지룰러(PageRuler)　사전염색　단백질 분자량 마커(써모)를 겔 상에서 실행하여 융합 단백질의 분자량을 추정하였다(도 1B 및 5B).
아피머 일렬 융합 단백질 AVA04-251 BH cys (서열번호 119, 개략적 표현 도 8A)을 이콜라이로부터 생성하고, 친화도, 이온-교환 및 크기-배제 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 발현 플라스미드 pD861(Atum)을 제조업자의 프로토콜을 이용하여 BL21 이콜라이 세포(밀리포어) 내로 형질전환시켰다. 50㎍/㎖ 카나마이신(어플라이켐(AppliChem))을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 총 형질감염 세포 혼합물을 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, 형질감염된 이콜라이의 론(lawn)을 1x 엄청난 브로스 배지(멜포드(Melford))와 50㎎/㎖ 카나마이신의 멸균 플라스크에 옮기고, 250rpm에서 진탕시키면서 30℃에서인큐베이션시켰다. 일단 세포가 ~0.8 내지 1.0의 OD600에 도달되면 10mM 람노스(알파 에이사르(Alfa　Aesar))를 이용하여 발현을 유도하고, 배양물을 37℃에서 추가 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 펠릿을 원심분리 및 용해시킴으로써 세포를 채취하였다. 니켈 아가로스 친화도 수지(슈퍼(Super)-NiNTA500; 제네론)를 이용하여 His 태그된 단백질의 배취 결합 친화도 정제를 이용하여 아피머 정제를 수행하였다. 비결합 단백질을 오(5) CV NPI20로부터 제거한 후에, 오(5) CV의 NPI400 완충제 및 환원제(50mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 0.4 M 이미다졸, 10mM TCEP)를 이용하여 결합 단백질을 용리시켰다. 용리된 단백질을 후속적으로 20mM MES pH 6에서 CM FF 이온-교환 칼럼(GE 헬스케어)에 기반한 양이온 교환 정제 단계 실행과 함께, 0.1% 트리톤 X-114(시그마) 세척 단계 및 1 M NaCl 구배에 의한 용리를 이용하여 완충제 교환하였다. 1x PBS에서　HiLoad　26/600　슈퍼덱스　75pg 칼럼(GE 헬스케어) 실행을 이용하는 분취 SEC에 기반하여 제3 정제를 수행하였다. AVA04-251 BH cys을 50mM MES pH 6.0, 150mM NaCl, 10mM TCEP를 함유하는 최종 환원 완충제에서 제형화하였다. 1x PBS 이동상에서 0.7㎖/분으로 얼티메이트(Ultimate) 3000 HPLC(써모) 상의 아클리암(Accliam) SEC-300 칼럼(써모) 실행을 이용하여 분석적 SEC를 수행하였다. SEC HPLC 및 SDS-PAGE 분석은 환원될 때 최종 단백질이 99% 초과로 순수하다는 것을 나타낸다(각각 도 8B 및 도 8C).
실시예 4: 아피머 Fc 융합 단백질에 대한 항-PD-L1 결합의 역학 분석
아민 결합 시약(GE 헬스케어)을 이용하여 10mM 아세트산나트륨 pH 4.0에서 인간 또는 마우스 PD-L1 Fc(알앤디 시스템즈)로 고정된 시리즈 S 센서 CM5 칩 및 실행 완충제 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 이용하여 비아코어 T200 역학 분석을 수행하였다. 아피머　Fc 융합의 단일 주기 역학 농도 적정을 30㎕/분의 유속으로 실행하였다. PD-L1 Fc　고정된 표면을 20 내지 30초 동안 3 내지 5mM NaOH로 재생시켰다(GE 헬스케어). 데이터 블랭크를 차감하고 1:1 랑그뮈어(Langmuir) 결합 모델(비아코어 평가 소프트웨어; GE 헬스케어)에 적합화시켜 겉보기 KD 값을 계산하였다. 다중-주기 역학을 이용하여　AVA04-182 Fc 융합 단백질은 36.1 pM의 KD를 갖는 것으로 나타났고(도 2) AVA04-251 Fc는 단일-주기 역학에 의해 측정된 23.4 pM의 KD를 가졌다(도 6).
실시예 5: 항-PD-L1 아피머의 특성규명을 위한 경쟁적 Elisa 　아피머 Fc 융합의 경쟁적 저해는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 평가하여 항-마우스 PD-L1 항체, 10F9.G2에 비교하였다(도 3). 인간 또는 마우스 PD-1 Fc(알앤디 시스템즈)를 플레이트 상에서 0.5㎍/㎖로 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 세척기를 이용하여 150㎕의 세척 완충제(PBS, 0.1% 트윈 20)로 2회 세척하였고, 90분 동안 실온(25 ± 1℃)에서 PBS에서 5% 카세인(시그마)로 포화시켰다. 앞서 기재한 바와 같이 플레이트를 세척하였다. 이어서, 아피머 및 대조군(PD-1 Fc; 블랭크)를 2회 중복하여 희석시키고, 1㎍/㎖의 마우스 PD-L1 Fc(알앤디 시스템즈) 또는 30ng/㎖의 인간 PD-L1(알앤디 시스템즈)와 함께 30분 동안 사전 인큐베이션시키고, 이어서, 90분 동안 실온(25 ± 1℃)에서 플레이트에 부하하였다. 앞서 기재한 바와 같이 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 바이오틴일화된 다클론성 항체 항-인간 PD-L1(알앤디 시스템즈)를 희석 완충제에서 희석시키고, 90분 동안 실온(25 ± 1℃)에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 앞서 기재한 바와 같이 3회 세척하고, 스트렙타비딘 HRP를 30분 동안 실온(25 ± 1℃)에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 기질(TMB, 피어스 써모-사이언티픽)을 10분 동안 플레이트 상에 첨가하였다. 산성 용액을 이용하여 반응을 중단시키고, 플레이트를 450 내지 630㎚에서 판독하였다. 보간된 비-선형 4모수 적합 표준 곡선을 이용하여 IC50을 계산하였다.
실시예 6: AVA04-182 Fc의 마우스 혼합 림프구 반응 분석
AVA04-182 Fc가 T 세포 반응을 조절하는 능력을 평가하기 위해 마우스 혼합 림프구 반응(MLR) 분석을 수행하였다. 이 MLR 분석에서, BMDC(골수 수지상 세포)를 한(1) 마리의 C57BL/6 마우스의 골수로부터 생성하고, GM-CSF의 존재 하에 칠(7)일 동안 배양시켰다. 이어서, 세포를 음성 선택을 이용하여 Balb/c 마우스의 비장으로부터 단리시킨 동종이형 CD4+ T 세포와 함께 공동 배양시켰다. MLR 분석을 시험 생성물(AVA04-182 Fc, SQTgly Fc[서열번호 120; PD-L1 표적화가 없는 아피머 Fc 융합], 아벨루맙 및 이의 아이소타입 대조군, HuIgG1) 및 대조군(항-마우스 PD-L1 클론 10F9.G2 및 이의 아이소타입 대조군, 래트 IgG2b)의 존재 또는 부재 하에 수행하였다. 시험 생성물을 3가지 농도(700, 70 및 7nM)에서 평가하고, 대조군을 한 가지 농도(70nM)에서 평가하였다. 3일의 배양 후에, 세포 상청액을 채취하고 나서, ELISA를 이용하여 인터페론 γ(IFNγ) 및 인터류킨-2(IL-2)의 분비를 평가하였다. 항-마우스 PD-L1 및 아벨루맙은 이들의 아이소타입 대조군에 비해 IL-2(데이터 미제시) 및 IFNγ 분비의 증가를 유도하였다(도 4). 유사하게, AVA04-182 Fc 처리는 SQTGly Fc에 비해 모든 시험 농도에서 IL-2(데이터 미제시) 및 IFNγ 분비의 증가를 야기하였다(도 4).
실시예 7: PD-1/PD-L1 세포-기반 차단 분석에서 항-PD-L1 아피머 AVA04-251 Fc의 활성
PD-1/PD-L1 세포-기반 분석(프로메가)을 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 간략하게, 인간 PD-1 및 NFAT 반응 요소(NFAT-RE)에 의해 유도되는 루시퍼라제 리포터를 발현시키는 Jurkat T 세포를 인간 PD-L1 및 항원-독립적 방식으로 동족 TCR을 활성화하도록 설계된 조작된 세포 표면 단백질을 발현시키는 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포와 함께 공동배양시켰다. 공동 배양시켰을 때, PD-1/PD-L1 상호작용은 TCR 신호전달 및 NFAT-RE-매개 발광을 저해한다. 항-PD-L1 아피머, AVA04-251 Fc의 첨가는 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하며, 저해 신호를 방출하고, TCR 활성화 및 NFAT-RE-매개 발광을 야기한다(도 7). 생체발광 신호를 검출하고, 클라리오스타 플레이트 판독기(Clariostar plate reader)(BMG 랩테크(BMG LabTech)) 상에서 바이오-글로(Bio-Glo)™ 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가) 및 신호 판독을 이용하여 정량화하였다.
실시예 8: 6323에 대한 합성 프로토콜(MAL-PEG 8 -Ser-D-Ala-Pro-Val-보로Pro)
말레이미드 6323(말레이미드[MAL]-활성화 PEG8 링커-Val-보로Pro[VbP] 프로-드러그)에 대한 화학 구조 및 합성을 각각 도 9 및 도 10에 제시한다.
화합물 3의 합성
HATU(0.8g, 2.1m㏖), DIEA(0.8 ㎖, 4.6m㏖) 및 H-Val-보로Pro-pn.HCl(화합물 2, 845㎎, 2.2m㏖)을 빙수욕 냉각 하에 무수 DMF(8㎖)에서 N-Boc-D-Ala-Pro-OH(화합물 1, 572㎎, 2m㏖) 용액에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 에틸아세테이트(100㎖)로 용해시키고, 0.1 N KHSO4(3×20㎖), 5% NaHCO3(3×20㎖), 염수(20㎖)로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 증발시켜 N-Boc-D-Ala-L-Pro-L-Val-L-보로Pro-pn을 제공하고, 이어서, 빙수 냉각 하에 다이옥산(20㎖) 중의 4N HCl 용액에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 다이클로로메탄(3×30㎖)과 함께 진공 하에 공증발시켜 완전히 건조시켰다. 이렇게 해서 화합물 3을 백색 분말(1.0g, 2개 단계에 걸쳐 92%)로서 얻었다.
화합물 4의 합성
상기 기재한 것과 동일한 방법을 이용하여 N-Fmoc-Ser-(OtBu)-OH을 화합물 3과 결합시킴으로써 N-Fmoc-Ser(OtBu)-D-Ala-L-Pro-L-Val-L-보로Pro-pn을 제조하였다. 이어서, Fmoc를 DMF 중의 20%의 피페리딘에 의해 제거하였다. 얻어진 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔사를 완전히 건조될 때까지 다이클로로메탄(3×30㎖)과 함께 진공 하에 공증발시켜 조질의 화합물 4를 제공하였고, 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
화합물 6323의 합성
0.2m㏖ 규모로 상기 기재한 것과 동일한 방법을 이용하여 MAL-dPEG8-산을 조질의 화합물 4와 결합시킴으로써 MAL-dPEG8-Ser(OtBu)-D-Ala-L-Pro-L-Val-L-보로Pro-pn을 제조하였다. 이어서, OtBu를 DCM 중의 50%의 TFA에 의해 제거하였다. 얻어진 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔기를 완전히 건조될 때까지 진공 하에 다이클로로메탄(3×10㎖)과 함께 공증발시켜 조질의 MAL-dPEG8-Ser-D-Ala-L-Pro-L-Val-L-보로Pro-pn을 제공하고, 이를 추가로 헥산-아세토나이트릴-물 중의 PhB(OH)2와 반응시킴으로써 탈보호시켜 피난다이올기를 제거하였다. 수층을 분리시키고, 이어서, (0.1% TFA과 함께) 수 중 20% 내지 25%의 아세토나이트릴로 반-분취 HPLC에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 양호한 무색 결정으로서 화합물 6323(40㎎, 최종 3개 단계에 대해 19%)을 얻었다.
실시예 9: 6325(NHS-PEG 8 -Ser-D-Ala-Pro-Val-보로Pro)에 대한 합성 프로토콜
6325(NHS-활성화 PEG8 링커-VbP 프로-드러그)에 대한 화학적 구조 및 합성을 각각 도 11 및 도 12에 제시한다.
화합물 2의 합성
DSC(71㎎, 0.275m㏖) 및 DIEA(0.1 ㎖, 0.58m㏖)를 빙수욕 냉각 하에 무수 DMF (1.5㎖) 중의 화합물 1(51㎎, 0.25m㏖) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 이어서, pH 7.8 인산염 완충제(5㎖)에서 빙욕 냉각 하에 NH2-dPEG®8-산(110㎎, 0.25m㏖)의 다른 용액에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시키고, 이어서, (0.1% TFA와 함께) 수 중 2% 내지 98% 아세토나이트릴로 용리하는 반-분취 HPLC에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 수집하였고, 동결건조시켜 화합물 2(120㎎, 2개 단계에 걸쳐 77%)를 제공하였다.
화합물 4의 합성
HATU(30㎎, 0.08m㏖), DIEA(28㎕, 0.16m㏖) 및 화합물 3(53㎎, 0.08m㏖; 화합물 6323의 합성으로부터; 실시예 8)을 빙욕 냉각 하에 무수 DMF(1.5㎖)에서 화합물 2(50㎎, 0.08m㏖)의 용액에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시키고, 이어서, (0.1% TFA와 함께) 수 중 20% 내지 98% 아세토나이트릴로 용리하는 반-분취 HPLC에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 수집하였고, 동결건조시켜 화합물 4(80㎎, 79%)를 제공하였다.
화합물 5의 합성
TFA(1.0㎖)를 빙욕 냉각 하에 DCM(0.5㎖) 중의 화합물 4(80㎎, 0.063m㏖) 용액에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 다이클로로메탄(3×10㎖)과 함께 진공 하에 공증발시켜 완전히 건조시키고, 이어서, 물-아세토나이트릴-헥산의 혼합물(2:1:2, 3.0㎖)에 용해시켰다. PhB(OH)2(8㎎, 0.065m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시키고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 (0.1% TFA과 함께) 수 중 20% 내지 98%의 아세토나이트릴로 반-분취 HPLC에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 수집하였고, 동결건조시켜 화합물 5(57㎎, 88%)를 제공하였다.
화합물 6325의 합성
DSC(15.5㎎, 0.06m㏖) 및 TEA(30㎕, 0.21m㏖)를 빙수욕 냉각 하에 무수 DMF(1.5㎖) 중의 화합물 5(57㎎, 0.056m㏖) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키고, 이어서, (0.1% TFA와 함께) 수 중 5% 내지 98% 아세토나이트릴로 용리하는 반-분취 HPLC에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 수집하였고, 동결건조시켜 백색 분말로서 화합물 6325(24㎎, 53%)를 제공하였다.
실시예 10: 말레이미드 화학을 이용하는 AVA04-251 BH cys에 대한 화합물 6323의 접합
AVA04-251 BH cys-6323 프로-드러그에 대한 합성 반응식에 대한 합성 반응식을 도 13에 제시한다.
화합물 6323(MAL-PEG8-Ser-DAla-Pro-VbP; 실시예 8)을 100mM의 농도로 DMSO에 용해시켰다. 1㎎/㎖ AVA04-251 BH cys의 1㎖ 샘플을 1ℓ의 50mM MES, 150mM NaCl, 1mM TCEP, pH 6에 대해 밤새 투석시켰다. 화합물 6323을 각각 100:1의 몰 비로 AVA04-251 BH cys에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새(17시간) 인큐베이션시켰다. 비접합 화합물 6323을 1㎖ HisTrap FF 칼럼(GE 헬스케어)로 제거하였다. 접합된 AVA04-251 BH cys-6323 프로-드러그를 1M 이미다졸을 이용하여 HisTrap 칼럼으로부터 용리시키고, PBS 1x(2×1ℓ)에 대해 투석하여 이미다졸을 제거하고 완충제 교환하였다. 얻어진 용액의 농도를 AVA04-251 BH cys(39151 M-1 ㎝-1; ExPASy ProtParam)의 서열로부터 계산한 흡광 계수를 이용하여 280㎚에서의 흡광도로부터 결정하였다.
후속적으로, 말레이미드 화학을 이용하는 IRDye 800CW에 대한 AVA04-251 BH cys의 접합은 이의 결합 능력을 변형시키지 않는다는 것을 ELISA에 결합함으로써 나타내었다(도 20).　
간략하게, 인간 PD-L1 Fc(알앤디 시스템즈)　키메라 단백질을 탄산염 완충제에서 0.5㎍/㎖로 96 웰 플레이트 상에 코팅시켰다. PBS 중의 5% 카세인에 의한 포화 후에,　플레이트를　세척하고, 접합 아피머 또는 비접합 대조군의 희석물을 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 바이오틴일화된　다클론성 항-시스타틴 A　항체(알앤디 시스템즈)를 첨가하고 나서, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고 나서, 스트렙타비딘-HRP를 이용하여 결합된 아피머를 검출하였다.　마지막 세척 후에, TMB를 첨가하고 나서, 플레이트를 450nM에서 판독하였다.　접합된 아피머(AVA04-251 BH cys-800)는 모 분자(AVA04-251 BH cys; 도 20)와 비교할 때 유사한 EC50을 나타내었다.
실시예 11: NHS 화학을 이용하는 AVA04-182 Fc에 대한 화합물 6325의 접합
AVA04-182 Fc-6325 프로-드러그에 대한 합성 반응식에 대한 합성 반응식을 도 14에 제시한다.
화합물 6325(NHS-PEG8-Ser-DAla-Pro-VbP; 실시예 9)를 100mM의 농도로 DMSO에 용해시켰다. AVA04-182 Fc를 PBS를 이용하여 1㎎/㎖로 희석시켰다. 1/10 용적의 1 M 인산칼륨, pH 9의 첨가에 의해 pH를 증가시켰다. 화합물 6325를 각각 4:1의 몰 비로 AVA04-182 Fc에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새(17시간) 인큐베이션시켰다. 비접합 화합물 6325를 제거하고, 5㎖ 제바 스핀 탈염 칼럼(Zeba Spin Desalting column)(써모 사이언티픽, 7000 MWCO)에 반응 혼합물을 통과시키고 1 L의 PBS에 투석시킴으로써 완충제 교환하였다. 얻어진 용액의 농도를 AVA04-182 Fc (92430 M-1 ㎝-1; ExPASy ProtParam)의 서열로부터 계산한 흡광 계수를 이용하여 280㎚에서의 흡광도로부터 결정하였다.
실시예 12: MB49 공통 유전자 뮤린 방광암 모델에서 VbP와의 조합에서 AVA04-182 Fc를 이용한 치료 후의 종양 성장 저해
마우스(n=10/그룹, C57BL/6)를 제0일에 동물당 1x106개의 MB49 세포로 우측 옆구리에 피하로 접종하였다. AVA04-182 Fc 및 SQTgly Fc 대조군(PD-L1 표적화가 없는 아피머 Fc 융합)을 IP 경로를 통해 10일에 걸쳐 3회 10 및 20㎎/㎏으로 시험하였다. 평균 종양 용적이 60㎣에 도달되었을 때, VbP(20㎎; 터프츠 유니버시티(Tufts University))를 무작위화 후에 시작해서 4주 동안 1주에 5일을 경구로 제공하였다.
치료를 개시하고 이십일(21)일 후에, 종양 성장을 분석하였다. VbP에 의한 그룹 대조군(SQTgly Fc)은 SQTgly Fc 단독에 비해 유의한 종양 성장 저해(p<0.001, 던넷 검정(Dunnett's test))를 나타낸다(도 15).
단일요법 간에 유의한 차이가 보이지 않았지만(AVA04-182 Fc 또는 VbP), AVA04-182 Fc + VbP에 의한 치료 후에 상가적 효과가 관찰되었는데, 이는 SQTgly Fc + VbP 병용 그룹에 비해 그룹으로부터의 일부 마우스에서 종양 퇴행(p<0.01, 던넷 검정)을 야기하였다.
면역 반응에 대한 효과를 평가하기 위해, 완전한 퇴행을 나타내는 마우스에서 MB49 세포로 접종한 후 60일 후에 재시험감염을 수행하였다. 마우스 중 어느 것도 기억 반응을 촉발시킬 수 있는 특정 T 세포 활성화의 충분한 향상을 확인하는 새로운 종양이 발생되지 않았다. 예상한 바와 같이, MB49 세포의 동일한 배양물로 접종한 미경험(naive) 마우스는 종양이 발생되었다(도 16).
실시예 13: 결장직장암의 C57BL/6 마우스 공통 유전자 모델에서 인간화된 PD-L1 MC38에서 VbP와 병용한 AVA04-251 Fc에 의한 치료 후 종양 성장 저해
마우스(n=8/그룹, C57BL/6)에 인간화된 PD-L1 MC38 종양 세포주를 우측 옆구리 영역에 피하로 접종하였다(이때 마우스 PD-L1 세포외 도메인은 동등한 인간 도메인으로 대체함; 크라운바이오 인코포레이티드(CrownBio Inc)). 일단 종양이 80㎣ 이상이 되면, AVA04-251 Fc 및 연관된 대조군(SQTgly Fc)을 IP 경로를 통해 주사하였다. 치료는 10㎎/㎏의 용량으로 3주 동안 1주 2회 투여하였다(AVA04-251 Fc 및 이의 대조군, SQTgly Fc). VbP(터프츠 대학교)를 경구로 0.02㎎/마우스로 1주에 5회(2일은 쉼) 투여하였다. 전반적으로, 치료 둘 다에 대해 종양 성장 저해가 나타났다(도 17). AVA04-251 Fc로 치료한 모든 마우스는 대조군에 비해 종양 크기가 감소되었다. VbP에 의한 치료 후, 마우스 중 어느 것도 단일요법에 비해 제13일에 종양 성장의 회피를 나타내지 않았다.
종양 접종 후 칠십(70)일에, 면역계에 기억 반응이 발생되고, 후속적 종양 성장을 방지하는지의 여부를 평가하기 위해 AVA04-251 Fc 및 VbP로 치료한 세(3)마리의 마우스에 huMC38 세포주로 2회 접종하였다(대조군에 동시에 접종함). 도 19에 나타낸 바와 같이, 제2 접종 후 십(10)일에, 처리군에서의 종양은 80㎣보다 더 작은 반면, 대조군에서, 종양은 750㎣ 초과에 도달되었다.
실시예 14: A375 마우스 이종이식 모델에서 AVA04-251 Fc-800의 생체분포.
형광 영상화를 이용하여 시간 경과 후 IR 염료-접합된 아피머의 생체분포에 기반하여 마우스 이종이식 모델에서 인간 PD-L1을 발현시키는 종양에 대한 항-PD-L1 아피머의 표적화를 평가하였다. 단백질 상의 접근 가능한 아미노기를 변형시키기 위해 NHS 화학을 이용하여 AVA04-251 Fc를 IRDye800CW (LI-COR)에 접합시켰다. AVA04-251 Fc(PBS 중의 1㎎/㎖)를 암실 조건 하에, 실온에서 (~23℃) 4:1 염료:단백질 2시간 동안의 화학량론으로 IRDye 800CW(수 중의 4㎎/㎖)와 함께 인큐베이션시켰다. 제조업자의 설명서에 따라 5㎖ 제바 스핀 탈염 칼럼(Zeba Spin Desalting Column)(MWCO 7000; 피어스)을 이용하여 염료-접합된 아피머(AVA04-251 Fc-800)로부터 유리 염료를 분리시켰다. 하기 식에 따라 280 및 780㎚에서의 흡광도에 기반하여 염료:단백질 비를 계산하였다:
염료:단백질 비 = (A780/□염료)/(A280-(0.03×A780))/ε단백질
0.03이 280㎚에서 IRDye 800CW의 흡광도에 대한 보정 인자인 경우, ε염료 및 ε단백질은 각각 염료에 대한 몰 흡광계수(270,000 M-1 ㎝-1임) 및 단백질에 대한 몰 흡광계수(AVA04-251 Fc에 대한 115000 M-1 ㎝-1)이다.
인간 PD-L1에 대한 염료-접합된 AVA04-251 Fc-800의 결합은 PD-L1 결합 ELISA를 이용하여 비-접합 아피머와 비교하였다(실시예 10에 기재함). 데이터는 염료 접합이 비슷한 EC50 값에 기반하여 PD-L1 표적에 대한 AVA04-251 Fc의 친화도에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다(도 21). 더 나아가, 염료-접합은 SEC HPLC(1x PBS에서 0.8㎖/분으로 Yarra 3000 칼럼 실행)에 기반하여 더 높은 응집 수준에 영향을 미치지 않는 것을 나타내었다.
동물의 옆구리에 A375 세포(100㎕ 멸균 PBS에서 5×106개의 세포[ATCC])의 피하 주사 후 암컷 무흉선 누드 마우스(찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories))에서 A375 마우스 이종이식 모델을 확립하였다. 종양을 주당 삼(3)회 모니터링하였고, 캘리퍼를 이용하여 발생된 종양을 측정하였다. 세(3)마리 마우스의 꼬리 정맥 내로 AVA04-251 Fc-800(0.1 또는 0.5n㏖)의 정맥내 투여 전에 종양을 500 내지 1000㎣로 성장시켰다. 주사 직 후(시간 0) 및 투약 후 1, 2, 4, 8 및 26시간에 제노겐(Xenogen) IVIS 200 바이오포토닉 이미저(Biophotonic Imager)를 이용하여 형광 영상을 기록하였다. 26시간 시점에 종양에 대한 항-PD-L1 아피머의 표적화를 나타내는 AVA04-251 Fc-800(0.5n㏖)을 투여한 대표적인 동물로부터의 시간-과정 영상(M4-1)은 도 22에 제시한다. 화살표는 신장, 간 및 종양의 대략의 위치를 나타낸다.
AVA04-251 Fc-800(동물 M4-2; 0.1㎚ol)의 투여 후 종양의 절개 후에 염료-접합된 아피머의 종양 침투가 입증되었다. 투약 후 26시간에 마우스를 안락사시키고, 종양을 제거하고 나서, 절반을 절개하였다. 절개된 종양을 앞서 기재한 바와 같이 영상화하였다(도 23).
실시예 15: 아피머-링커-VbP 프로-드러그의 시험관내 rhFAPα 절단
재조합 인간 섬유아세포 활성화 단백질 알파(rhFAPα)에 의한 아피머-링커-VbP 프로-드러그의 절단 후 생물학적으로 활성인 VbP의 방출 역학은 LC-MS/MS에 의해 시간-과정에 걸쳐 방출된 VbP의 정량화에 기반하여 연구하였다.
상이한 수의 에틸렌 글리콜 서브 유닛에 기반한 다양한 길이의 합성된 MAL- 및 NHS-활성화 FAPα 절단 가능한 링커-VbP 프로-드러그의 예를 실시예 8 및 9에 제시한다. MAL-활성화 링커-VbP 프로-드러그(예컨대 6323 [PEG8], 6324 [PEG16] 및 6327[PEG24])를 후속적으로 AVA04-251 BH cys을 포함하는 아피머에서 단일 Cys 잔기에 접합시켰다. 유사하게, AVA04-182 Fc를 포함하는 아피머의 유리기에 NHS-활성화 링커-VbP 프로-드러그(예컨대 6325 [PEG8], 6326 [PEG16] 및 6328[PEG24])를 접합시켜??. 대표적인 아피머 접합 방법을 실시예 10 및 11에 제시한다.
아피머-링커-VbP 프로-드러그 샘플(PBS 중의 5μM)을 rhFAPα(12nM 최종 농도; 알앤디 시스템)와 함께 15분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. TCA(5% 최종 농도)의 첨가에 의해 반응을 중단시키고, 얻어진 침전된 단백질을 원심분리(10분 동안 6,000 g)에 의해 제거하였다. TCA의 첨가에 의해 대조군 샘플을 제조한 후에 rhFAPα를 첨가하였다. VbP를 특이적으로 검출하도록 설계된 다중 반응 모니터링을 이용하는 LC-MS/MS(애질런트(Agilent) 1200 HPLC와 함께 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 4000Qtrap 질량분석기)를 수행하였다. 간략하게, 3분에 걸쳐 95:5 물:5% 메탄올(0.1% 폼산, 5mM 암모늄 산)로부터 5:95 물:메탄올(0.1% 폼산, 5mM 암모늄 산)의 선형 구배로 조박스 이클립스 플러스(Zorbax Eclipse Plus) C18 칼럼(4.6×50㎜, 1.8 ㎛)을 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 모 이온은 215.3 Da에 있고, 딸 이온은 126.1 Da에 있다. 내부 표준은 pH 2에서의 수 중 d8-Val-보로Pro이었다(모 이온 223.3Da, 딸 이온 126.1 Da).
각각 PEG8- 및 PEG24-링커-VbP 프로-드러그를 혼입하는 AVA04-251 BH cys-6323 및 AVA04-182 Fc-6328로부터의 VbP의 방출을 나타내는 대표적인 LC-MS/MS 크로마토그램을 도 24에 제공한다. 데이터는 다양한 PEG 길이의 링커-VbP 프로-드러그를 혼입하고 MAL-과 NHS-접합 화학 둘 다에 기반한 아피머-링커-VbP 프로-드러그로부터의 VbP의 rhFAPα 촉매된 방출을 확인한다.
후속적으로, 아피머-링커-VbP 프로-드러그 샘플(PBS 중의 5.5μM)을 rhFAPα(12nM 최종 농도; 알앤디 시스템)와 함께 37℃에서 인큐베이션시켰다. rhFAPα의 첨가 직후(시간 0) 및 후속적으로, 2, 5 및 10분 인큐베이션 후 분취액을 회수하였다. TCA(5% 최종 농도)의 첨가에 의해 반응을 중단시키고, 얻어진 침전된 단백질을 원심분리(10분 동안 6,000g)에 의해 제거하였다. 0.1 내지 1000ng/㎖ VbP(0.47 내지 4700nM; 터프츠 유니버시티) 범위에 걸쳐 제조한 표준 곡선에 대해 보간한 피크 면적에 기반하여, 앞서 기재한 바와 같이 LC-MS/MS에 의해 방출된 VbP를 정량화하였다.
6325(PEG8-링커-VbP 프로-드러그), 6326(PEG16-링커-VbP 프로-드러그) 및 6328(PEG24-링커-VbP 프로-드러그)에 접합된 AVA04-182 Fc로부터의 VbP의 FAPα 촉매된 방출 시간-과정을 도 25에 제시한다. 데이터는 아피머-링커-VbP 프로-드러그로부터의 VbP의 방출률과 PEG 링커 길이 간의 의존도를 나타내는데, 이는 목적하는 치료적 프로파일에 따라서 VbP 방출 역학을 변형시키는 능력을 시사한다.
실시예 16: 스프래그 돌리 래트에서의 급성 독성 연구에서 VbP에 비교되는 링커-VbP 프로-드러그의 평가
VbP의 10배 최대 허용 용량(MTD)와 동등한 용량으로 피하로 투여한 대표적인 링커-VbP 프로-드러그의 비교적 생체내 안전성은 스프래그 돌리(SD) 래트에서 확립되었고, 즉, SD 래트의 적어도 20%를 사멸시키는 VbP 용량의 10배였다.
투여 전에, MAL 모이어티를 비활성화시키기 위해 MAL-활성화 6323(PEG8-링커-VbP 프로-드러그)을 L-시스테인에 접합시켰다. L-시스테인(5㎎; 시그마)을 1㎖의 MAL-활성화 6323(50mM MES에서 4.8mM, 150mM NaCl, pH 6)에 용해시켜 10:1 L-시스테인:6323의 대략의 화학량론을 달성하였다. 얻어진 용액을 실온에서 2 내지 3시간 동안 인큐베이션시키고, 이후에 LC-MS 분석에 의해 반응이 완료에 도달되었다는 것을 확인하였다. 얻어진 Cys-변형된 6323은 10분에 걸쳐 2:98 아세토나이트릴:물(0.1% TFA) 구배로 슈펠코 디스커버리(Supelco Discovery) C18을 이용하는 분취 RP-HPLC에 의해 정제하였고, 후속적으로 동결건조시켰다.
여섯(6)마리의 수컷 SD 래트(찰스 리버)에 멸균 PBS에서 1.47㎎/㎏ Cys-변형된 6323(0.25㎎ VbP/㎏와 동등)을 피하로 주사하였다. 동물을 투약 후 1, 2, 4, 6, 8 및 24시간에 징후에 대해 관찰하였고, 안전성 종말점은 24시간 생존비였다; 24시간에 살아있는 동물의 수/처리된 총 횟수. 도 26은 멸균 PBS에서 0.010, 0.025 및 0.050㎎ VbP/㎏으로 피하로 투여한 Cys-변형된 6323(1.47㎎/㎏; 0.25㎎ VbP/㎏과 등가) 및 VbP(터프츠 유니버시티)에 대한 비슷한 안전성 데이터를 제시한다. 본 연구에서, VbP에 대한 MTD는 0.025㎎ VbP/㎏이 되는 것으로 간주하였다. 24시간에, 6마리의 동물 중 5마리는 생존하는 VbP MTD의 10배와 동등한 용량에서 Cys-변형된 6323을 투여하였고, VbP에 비해 VbP 프로-드러그에 대해 안전한 허용 범위를 나타내었다.
실시예 17: J774 마우스 대식세포 세포주에서 시험관내 아피머-링커-VbP 프로-드러그 유도 파이롭토시스.
아피머-링커-VbP 프로-드러그는 FAPα에 의해 절단되어 VbP를 방출하도록 설계한다. VbP는 NLRP1 및 CARD8 인플라마좀에서 카스파제-1의 활성화에 의한 대식세포 내 파이롭토시스를 유도하지만(1-3), VbP가 프로-드러그 접합체 내로 혼입될 때, 발린의 아미노기는 FAPα-절단성 링커와의 펩타이드 결합에 관여하기 때문에, 파이롭토시스 유도를 막는다. 대식세포 내 파이롭토시스를 유도하는 아피머-링커-VbP 프로-드러그의 능력이 FAPα 절단에 엄격하게 의존한다는 것을 입증하기 위해 rhFAPα의 존재 및 부재 하에 파이롭토시스에서의 시험관내 분석에서 AVA04-182 Fc의 프로-드러그 접합체를 시험하였다.
J774A.1 세포(마우스 단핵구 대식세포; ATCC)를 75㎠ 조직 배양 플라스크 내 DMEM-10%-FBS에서 성장시키고, PBS에서 스크레이핑에 의해 채취하고 나서, DMEM-1%-FBS에서 재현탁시키고, 5×103개의 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트(VWR)에 플레이팅하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에 넣었다. 24시간 동안 인큐베이션 후에, VbP, 비접합 AVA04-182 Fc, 링커-VbP 프로-드러그(6325, 6326 및 6328) 및 아피머-링커-VbP 프로-드러그(AVA04-182 Fc-6325, -6326 및 -6328)의 연속 10배 희석물을 25nM의 최종 농도에서 rhFAPα(알앤디 시스템즈)가 첨가된 웰 및 첨가되지 않은 웰에 첨가하였다. 각각의 반응 혼합물을 3회 중복해서 시험하고, 추가 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 제조업자의 설명서에 따라 사이토톡스 96 비-방사성 세포독성 분석(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)(프로메가)를 이용하여 배양물 상청액에 방출된 락트산염 탈수소효소(LDH; 파이롭토시스의 마커[4])를 측정하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax)®M2e 마이크로플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))에서 흡광도(A490) 측정에 의해 LDH 농도를 결정하였다. 세포 없이 DMEM-1%-FBS를 함유하는 웰에서 배경 방출을 차감하고, 얻어진 값을 사이토톡스(CytoTox) 96 용해 시약에 의해 방출된 LDH의 백분율로서 표현함으로써 LDH 방출 백분율을 계산하였다.
1μM의 농도에서, 모두 3가지의 아피머-링커-VbP 프로-드러그는 rhFAPα의 존재 하에 유의한 LDH 방출을 나타내었지만(밝은 막대; 도 27), 이의 부재 하에서는 나타내지 않았다(진한 막대; 도 27). 이는 또한 링커-VbP 프로-드러그에 대해 관찰되었다. 예상한 바와 같이(5), rhFAPα가 존재하는지의 여부와 상관없이 VbP는 유의한 LDH 방출을 생성하였다. 비접합 아피머는 LDH 방출을 생성하지 않았다. 이들 결과는 아피머-링커-VbP 프로-드러그가 FAPα-의존적 방식으로 VbP를 방출하지만, FAPα의 부재 하에 생물학적으로 비활성으로 남아있다는 것을 나타낸다.
실시예 18: BALB/c 마우스에서 생체내 Cys-변형된 링커-VbP 프로-드러그 유도된 G-CSF 자극.
대식세포에서, VbP는 프로-카스파제-1의 효소적으로 활성인 카스파제-1로의 가공을 초래하는 NLRP1 인플라마솜 내로의 카스파제-1의 보충을 유도하고, 이어서, 프로-IL-1β를 후속적으로 분비되는 성숙 및 생물학적 활성 형태로 가공하는 것으로 나타났다(3, 6). 자가분비와 근거리분비 방식 둘 다에서 작용하는 경우, 성숙 IL-1β는 전사 수준에서 다양한 사이토카인의 발현을 유도할 수 있다(7). 마우스에서, VbP의 투여는 사이토카인의 증가된 발현과 연관되며, G-CSF의 증가된 혈청 농도는 이 효과를 위한 강한 마커가 되는 것으로 나타났다(8, 9). 생체내 VbP의 생물학적 활성을 위한 마커로서 G-CSF의 유효성은 casp-1 -/- 및 Nlrp1b -/- 넉아웃 마우스에서 혈청 G-CSF 반응의 완전한 상실에 의해 뒷받침된다(1, 5). Cys-변형된 6323 프로-드러그에서, VbP는 발린의 아미노기를 수반하는 펩타이드 결합에 의해 FAPα-절단성 링커에 부착되고, 그 결과 FAPα 절단에 의해 방출될 때까지 VbP는 생물학적으로 비활성이다. 정상 마우스의 조직 및 혈액에 존재하는 FAPα 효소 활성의 유의한 수준은(10) 프로-드러그가 바이오마커로서 G-CSF의 혈청 농도를 이용하여 내인성 FAPα에 의해 생체내에서 활성화되는 이들의 능력에 대해 시험되는 것을 가능하게 한다.
Cys-변형된 6323 프로-드러그를 실시예 16에 기재한 바와 같이 생성하였다. 7 내지 8주령의 수컷 BALB/c 마우스(찰스 리버 래버러토리즈)에 치료당 5마리 마우스의 그룹에서 비히클 (PBS), 1.28 또는 0.64㎎/마우스 Cys-변형된 6323을 피하로 주사하였다. 투약 후 여섯(6) 시간에, 심장 천자에 의해 혈액을 수집하고, 제조업자의 설명서에 따라 마우스 G-CSF 퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 G-CSF의 혈청 농도를 측정하였다.
시험한 용량, 즉, 1.28과 0.64㎎/마우스 둘 다에서, Cys-변형된 6323(각각 회색 및 속이 빈 막대; 도 28)은 비히클 처리 마우스(진한 막대; 도 28)에 비해 G-CSF의 혈청 농도에서 유의한 증가를 유도하였다. 결과는 6323에서 FAPα-절단성 링커가 생물학적으로 활성인 VbP를 방출하기 위해 생체내에서 내인성 FAPα에 의해 절단될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 19: 예시적인 합성 계획
본 발명의 결합제-약물 접합체에 혼입될 수 있는 면역-DASH 저해제의 합성은 결합 시약, 예컨대 HATU 등을 이용하는 결합 반응, 다음에 필요하다면, 예를 들어 시약, 예컨대 필요하다면 BCl3 또는 HCl-PhB(OH)2 방법을 이용하는 탈보호를 수반할 수 있다. 표적 화합물 중 일부는 디스커버리(Discovery) C18 569226-U RP-HPLC 칼럼을 갖는 베리안(Varian) 반-분취 시스템을 이용하는 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 이동상은 전형적으로 물(0.1% TFA)을 아세토나이트릴(0.08% TFA)과 구배 농도에서 혼합함으로써 제조되었다. 화합물 코드, 구조 및 특징을 표 1에 나타낸다.
반응식 1. 일반적 합성 반응
Figure pct00146
Gly(1-아다만틸)-보로Pro(ARI-5544 또는 3102A-2C)의 예시적 합성 절차
반응식 2. ARI-5544에 대한 합성 반응 a
Figure pct00147
a 시약 및 조건: i. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA, DMF, 0℃ 내지 r.t., 93%; ii. 다이옥산 중의 4N HCl(g), 0℃ 내지 r.t.; iii. PhB(OH)2, MTBE-H2O, 2개 단계에 걸쳐 67%.
Gly(1-아다만틸)-보로Pro (ARI-5544)의 합성. 다이옥산(5 ㎖, 20m㏖) 중의 4N HCl(g)의 용액을 드라이아이스/아세톤 냉각 하에 화합물 1(0.86g, 1.6m㏖)에 첨가하고, 이어서, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 이어서, 에틸 에터(3×15㎖)와 함께 공증발시켜 (+)-피난다이올 보호된 ARI-5544를 얻었고, 이를 사전 냉각시킨 0.08N HCl(10㎖)로 용해시켰다. 이어서, tert-뷰틸 메틸 에터(MTBE)(10㎖) 및 페닐보론산(0.22g, 1.7m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 수성상을 분리시켰다. MTBE 층을 0.08N HCl(5㎖)로 추출하고, 합한 물 추출물을 에터(3×10㎖)로 세척하였다. 수성상을 회전증발기 상에서 농축시키고(< 30℃), 조질의 생성물을 분취 HPLC(용리액: 용매 A, 수 중 0.1% TFA; 용매 B, 아세토나이트릴 중의 0.08% TFA)에 의해 정제하였다. 목적하는 분획을 수집하고, 대략 10㎖로 농축시키고 나서, 냉동 건조시켜 화합물 ARI-5544를 TFA 염으로서 제공하였다(0.45g, 2개 단계에 걸쳐 67%). 1H NMR (D2O): δ 1.60 - 1.75 (m, 14 H), 1.85 - 2.15 (m, 6H), 3.07(dd, J = 11.1, 6.9 Hz, 1H), 3.46 - 3.52(m, 1H), 3.76 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 3.91(s, 1H). C16H27BN2O3 m/z (상대적 강도)에 대한 MS (ESI+): 577.5 ([2×(M - H2O) + H]+, 76), 307.4 2([M + H]+, 100), 289.4([M - H2O + H]+, 24).
3102C 의 예시적 합성 절차
반응식 3. 3102C에 대한 합성 방법 a
Figure pct00148
a 시약 및 조건: i. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA, DMF, 0℃ 내지 r.t., 90%; ii. CH2Cl2 중의 BCl3, - 78℃ 내지 r.t., 55%.
3102C의 합성. 1의 제조에 대해 상기 기재한 것과 유사한 결합 반응을 이용하여 N-Boc-L-3-하이드록시-1-아다만틸-글리신으로부터 시작해서, 화합물 2를 제조하였다. 이 생성물(0.28g, 0.5m㏖)을 건조 다이클로로메탄(5.0㎖) 중에 용해시키고, -78℃로 냉각시키는 한편, BCl3(다이클로로메탄 중의 1M, 5.0㎖)을 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 교반하고, 실온에 되게 하고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 잔사는 에터(5㎖)와 물(5㎖) 사이에서 나누어졌다. 수층을 더 많은 에터(2×5㎖)로 2회 세척하고, 진공 하에 농축시키고 나서, 반분취 RP-HPLC에 의해 정제하여 3102C을 TFA 염으로서 제공하였다(0.13g, 55%).
5870의 합성. 합성 반응식: i. DAST; ii. LiOH; iii. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; iv. BCl3.
Figure pct00149
5871의 합성. 합성 반응식: i. MeI, K2CO3, DMF; ii.4 eq. DAST 및 고온; iii. LiOH; iv. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; v. HCl, 이어서, PhB(OH)2.
Figure pct00150
5873의 합성. 합성 반응식: i.L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; ii. BCl3
Figure pct00151
5874의 합성. 합성 반응식: i. 1eq. 저온에서 DAST; ii. LiOH; iii. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; iv. HCl, 이어서, PhB(OH)2.
Figure pct00152
Gly(3-하이드록실-5,7-다이메틸-아다만틸)-보로Pro의 합성. 합성 반응식: i. MeI, K2CO3; ii. TrisylN3, KHMDS; iii. H2/Pd-C, Boc2O; iv. KOH; v. KMnO4; vi. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; vii. HCl, 이어서, PhB(OH)2.
Figure pct00153
5879의 합성. 합성 반응식: i. DAST; ii. LiOH; iii. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; iv. BCl3.
Figure pct00154
5880의 합성. 합성 반응식: i. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; ii. BCl3.
Figure pct00155
6067의 합성. 합성 반응식: i. 산화; ii. DAST; iii. H2/Pd-C; iv. L-보로Pro-pn, HATU, DIEA; v. HCl; vi. PhB(OH)2.
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
실시예 20: 예시적인 면역-DASH-저해제
다음의 표는 3 내지 7열에서 DPP8, DPP9, DPP4, DPP2, FAP(섬유아세포 활성화 단백질) 및 PREP의 무세포 제제에 대해 결정한 바와 같은 저해 IC50을 제공한다. 이들 IC50 값(nM)을 이하의 실시예 4에 제시하는 프로토콜에 따라 결정하였다. 계산한 경우에, 표는 또한 이하의 실시예 3에 기재하는 프로토콜에 따라 전체 세포에서 DPP8 및 DPP9의 저해에 대한 세포내 IC50("IIC50")을 제공한다. 특정 예에서, 표는 또한 세포 배양물 내 대식세포의 파이롭토시스를 유도하는 것에 대한 IC50을 제공한다.
Figure pct00162
Figure pct00163
실시예 21: 293T 세포에서 DPP 활성에 대한 세포내 IC 50 을 결정하기 위한 프로토콜.
293T 세포는 저수준의 내인성 DPP8/9를 발현시키지만 DPP IV, DPP II 또는 FAP는 발현시키지 않기 때문에, 이는 다른 배경 DPP 활성으로부터의 간섭 없이 세포내 DPP8/9 저해의 평가를 가능하게 한다. (Danilova, O. et al. (2007) Bioorg. Med. Chem. Lett. 17, 507-510; Wang, X.M. et al. (2005) Hepatology 42, 935-945) 이 정보는 화합물의 세포 투과성 평가를 가능하게 한다.
물질
- 293T 세포(ATCC, 카탈로그 번호 CRL-11268)
- 페놀 레드(VWR, 카탈로그 번호 45000-410) 없이, 2mM L-글루타민(VWR, 카탈로그 번호 45000-676), 10mM HEPES(VWR, 카탈로그 번호 45000-690), 1mM 피루브산나트륨(VWR, 카탈로그 번호 45000-710), 4500㎎/ℓ 글루코스(VWR, 카탈로그 번호 45001-116), 1x 페니실린-스트렙토마이신(VWR, 카탈로그 번호 45000-652)을 보충한 RPMI 1640 세포 배양 배지
- 저해제 또는 프로드러그
- 4000x 기질 용액(DMSO 중의 100mM Ala-Pro-AFC (바헴(Bachem), 카탈로그 번호 I-1680))
- 96-웰 검정 투명-바닥 플레이트(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 카탈로그 번호 353948)
기기
- 플레이트 진탕기
- 몰레큘러 디바이시즈 스펙트라맥스(Molecular Devices SpectraMax)®M2e 마이크로플레이트 판독기
프로토콜
분석 셋업
75㎠ 또는 더 큰 플라스크로부터의 세포를 트립신 처리하고 교반시키고, PBS로 세척하고 나서, RPMI 1640에서 재현탁시켰다. 세포를 얻어진 현탁액에서 계수하고, 75㎕당 100,000개의 세포를 갖도록 용적을 조절하였다. 96-웰 검정 투명-바닥 플레이트에서 1열의 A 내지 C행에 100㎕의 RPMI 1640 단독을 첨가하였다. 2 내지 10열의 남아있는 웰에 75㎕의 세포 현탁액을 첨가하였다. 37℃에서 밤새 플레이트를 평형상태로 만들었다.
샘플 제조
1. 분석을 위한 화합물을 제조하기 위해, 이를 DMSO에 용해시키거나, 고리화가 의심된다면, 100mM의 최종 농도로 pH 2.0 물(0.01N HCl)에 용해시켰다. pH 2.0 저장액에 대해, 최소 4시간 및 최대 밤새 실온에서 인큐베이션시켰다. 이로부터 RPMI 1640에서 4mM 저장액을 제조하였다. 이 농도에서 저해제가 불용성이라면, 100mM의 저장액을 1:10 내지 10mM로 희석시켰다. 이 저장액을 이용하여, 상기 기재한 바와 같이 0.4mM 저장액을 제조하였다. 각각의 희석된 샘플의 pH는 세포 배양 배지의 pH가 되는 것을 확인하여야 한다(pH 7 내지 8).
2. 단계 3에서 제조한 화합물에 대한 희석 플레이트를 제조하였다. 이를 위하여, 96-웰 플레이트의 A행에 대해 앞서 제조한 4 또는 0.4mM 저장액을 첨가하였다. 이로부터, 이하에 나타내는 G행에 이르기까지 RPMI 1640 내로 1:10 연속 희석을 수행한다. H행은 RPMI 1640 세포 배양 배지 단독을 가져야 한다:
Figure pct00164
3. 희석 플레이트로부터의 25㎕의 화합물을 적절한 경우 2 내지 10열에서의 분석 플레이트에 대해 단계 4에서 제조하였다. 각각의 샘플은 3회 중복하여 시험하여야 한다. 플레이트를 간단하게 진탕시키고, 37C에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
4. 이 시간 동안에, 기질을 제조하여야 한다. 이를 위하여, 100mM의 저장액을 1:400으로 RPMI 1640 내로 250 M의 최종 작업 농도로 희석시켰다.
5. 37℃에서 인큐베이션을 완료한 후에, 각각의 웰에 대해 5 단계에서 제조한 10㎕의 기질을 첨가하였다. 플레이트를 간단하게 진탕시키고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 일단 완료되면, λex: 400, λem: 505에서 형광을 판독한다.
데이터 분석
1. 형광 값을 y 값으로서 프리즘에 직접적으로 입력한다. x값인 저해제 농도에 대해, 분석에서의 이들의 희석을 처리하기 위해 희석 플레이트 내 농도를 4로 나눌 것이다. x값은 프리즘 내로 이들의 입력 전에 log 값으로 전환시켜야 한다. 저해제가 없는 웰에 대한 농도(H행)는 -14(10 내지 14 M과 동일)로서 입력하여야 한다.
2. 일단 값을 입력하면, "분석하다" 하에서, "비선형 회귀(곡선 적합화)"를 선택한다. 후속적 프롬프트에서, "log(저해제) 대 반응"을 선택한다. 이것으로 IC50 값을 계산하고, 이를 "결과" 선택에서 발견할 수 있다.
실시예 22: 다이펩티딜 펩티다제 IV, 다이펩티딜 펩티다제 8, 다이펩티딜 펩티다제 9, 다이펩티딜 펩티다제 II, 섬유아세포 활성화 단백질 또는 프로필 올리고펩티다제에 대한 시험관내 저해 분석을 위한 프로토콜
이 분석을 사용하여 재조합 인간 다이펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 다이펩티딜 펩티다제 8(DPP8), 다이펩티딜 펩티다제 9(DPP9), 다이펩티딜 펩티다제 II, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 또는 프로일 올리고펩티다제(PREP)에 대한 다양한 저해제의 IC50을 결정하였다.
물질
효소
- 재조합 인간 DPPIV (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 1180-SE)
- 재조합 인간 DPP8 (엔조 라이프 사이언시즈(Enzo Life Sciences), 카탈로그 번호 BML-SE527)
- 재조합 인간 DPP9 (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 5419-SE)
- 재조합 인간 DPPII (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 3438-SE)
- 재조합 인간 FAP (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 3715-SE)
- 재조합 인간 PREP (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 4308-SE)
분석 완충제
- 25mM Tris, pH 8.0(DPPIV 및 DPP9)
- 50mM Tris, pH 7.5(DPP8)
- 25mM MES, pH 6.0(DPPII)
- 50mM Tris, 140mM NaCl, pH 7.5 (FAP)
- 25mM Tris, 0.25 M NaCl, pH 7.5 (PREP)
기질
- 4000x 기질 용액(DMSO 중의 100mM Gly-Pro-AMC (VWR, 카탈로그 번호 100042-646), DPPIV, DPP8 및 DPP9)
- 4000x 기질 용액 (DMSO 중의 100mM Lys-Pro-AMC (바헴, 카탈로그 번호 I-1745), DPPII)
- 100x 기질 용액 (DMSO 중의 2.5mM Z-Gly-Pro-AMC (VWR, 카탈로그 번호 I-1145.0050BA), FAP 및 PREP)
일반적 물질
- 화합물
- 96-웰 검정 투명-바닥 플레이트(코스타(Costar), 카탈로그 번호 3603)
기기
- 플레이트 진탕기
- 몰레큘러 디바이시즈 스펙트라맥스(Molecular Devices SpectraMax)®M2e 마이크로플레이트 판독기
프로토콜
1. 분석을 위한 화합물을 제조하기 위해, 이를 DMSO에 용해시키거나, 고리화가 의심된다면, 100mM의 최종 농도로 pH 2.0 물(0.01N HCl)에 용해시켰다. pH 2.0 저장액에 대해, 최소 4시간 및 최대 밤새 실온에서 인큐베이션시켰다. 이로부터, 50mM Tris 중의 pH 7.4에서 1mM 저장액을 제조하였다. 이 농도에서 저해제가 불용성이라면, 100mM의 저장액을 1:10 내지 10mM로 희석시켰다. 이 저장액을 이용하여, 상기 기재한 바와 같이 0.1mM 저장액을 제조하였다.
2. 시험할 화합물 저장액에 대한 희석 플레이트를 제조하였다. 96-웰 플레이트의 A행에 대해 앞서 제조한 0.1 및/또는 1mM 저장액을 첨가하였다. 이로부터, 이하에 나타내는 열을 따라 적절한 분석 완충제에 1:10 연속 희석을 수행한다:
3. DMSO 저장액을 적절한 분석 완충제에 희석시킴으로써 20x 기질 용액을 제조한다.
4. 효소를 이들의 적절한 분석 완충제에 희석시킨다. 희석 인자는 로트 의존적이며, 분석을 수행하기 전에 결정하여야 한다. 최종 효소 농도는 DPPIV, 8, 9, II, FAP 및 PREP에 대해 각각 0.1, 0.8, 0.4, 0.2, 1.2 및 0.6nM이어야 한다. 2 내지 10열에서 필요한 각각의 웰에 180㎕를 첨가하였다. 1열은 이하에 나타내는 바와 같이 제조하여야 한다:
5. 희석 플레이트로부터의 20㎕의 관심 대상의 화합물을 적절한 경우 2 내지 10열에서의 분석 플레이트에 대해 단계 2에서 제조하였다. 각각의 샘플은 3회 중복하여 시험하여야 한다. 이를 플레이트를 처음 2분 동안 진탕시키면서 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
6. 각각의 웰에 단계 3에서 제조한 10㎕의 20x 기질을 첨가하고, 이를 처음 2분 동안 플레이트를 진탕시키면서, 15분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
7. λex: 380, λem: 460에서 형광을 판독한다.
데이터 분석
1. A1, B1 및 C1 웰에서 블랭크에 대한 값을 평균내고, 남아있는 웰로부터 이를 차감한다. 얻어진 형광 값을 y 값으로서 프리즘에 입력한다. x값인 화합물 농도에 대해, 분석 플레이트에서의 이들의 희석을 처리하기 위해 희석 플레이트 내 농도를 10.5로 나눌 것이다. 이들은 프리즘 내로 이들의 입력 전에 log 값으로 전환시켜야 한다.
2. 일단 값을 입력하면, "분석하다" 하에서, "비선형 회귀(곡선 적합화)"를 선택한다. 후속적 프롬프트에서, "log(저해제) 대 반응"을 선택한다. 이것으로 IC50 값을 계산하고, 이를 "결과" 선택에서 발견할 수 있다.
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
참조에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개개 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타나는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE AVACTA LIFE SCIENCES, LIMITED <120> TUMOR MICROENVIRONMENT-ACTIVATED DRUG-BINDER CONJUGATES, AND USES RELATED THERETO <130> TUV-10825 <140> PCT/US2019/035374 <141> 2019-06-04 <150> 62/680,300 <151> 2018-06-04 <160> 225 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met 1 5 10 15 His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu 20 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Glu Asp Leu Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Gly Phe 20 <210> 4 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(69) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(69) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Gly, Ala, Val, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(91) <223> Arg, Lys, Asn, Gln, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Gly, Ala, Val, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Ala, Val, Ile, Leu, Gly or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(113) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(113) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(114) <223> Gly, Ala, Val, Asp or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> Ala, Val, Ile, Leu, Arg or Lys <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 4 Met Ile Pro Xaa Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly 65 70 75 80 Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Asp Xaa Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp 115 120 125 Asp Glu Leu Thr Gly Phe 130 <210> 5 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(69) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(69) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(113) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(113) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 5 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly 65 70 75 80 Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn Gly Pro Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Ala Asp Arg Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp 115 120 125 Asp Glu Leu Thr Gly Phe 130 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Lys Ala Trp Gly Pro Lys Gln Trp Trp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Lys Pro Tyr Gly Pro Arg Asp Trp Asp 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Lys Glu Tyr Gly Pro Glu Glu Trp Trp 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 His Ala Tyr Gly Pro Arg Asp Trp Asp 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Lys Asp His Gly Pro Ile Ala Trp Trp 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Asn Lys His Phe His Gln Arg Phe Trp 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Asn Lys His Phe Pro Ile His Phe Trp 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 His Glu Phe Gly Pro Ala Glu Trp Asp 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Asn Ala His Phe Pro Gln Ser Phe Trp 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Lys Glu His Gly Pro Asp Ser Trp Trp 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Asn Gln His Phe Pro His Ser Phe Trp 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Asn Ala His Phe Gly Pro Arg Phe Trp 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Lys Pro Tyr Gly Pro Arg Asp Trp Asp Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Glu Pro Gln Leu Asp Thr Ser Pro Ile Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 82 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala His Ala Tyr Gly Pro Arg 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Met Ile Pro Arg Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Gly Arg Gln Asp Trp Val Leu Ser Thr Asn Tyr Tyr Ile 50 55 60 Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr Met His Leu Lys Val Phe Asn 65 70 75 80 Gly Pro Trp Val Pro Phe Pro His Gln Gln Leu Ala Asp Arg Val Leu 85 90 95 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 85 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 atgatcccgc gtggcctgtc tgaagctaaa ccagcaactc cggaaattca agagatcgtc 60 gataaggtga aaccgcagct ggaagagaaa acgaacgaaa cctacggtaa gctggaagcg 120 gtccagtaca aaacccaagt gctagcaaaa gattggggtc catctaactg gtggtccacc 180 aactattaca ttaaggttcg tgccggtgac aataagtata tgcacctgaa agtgttcaac 240 ggcccggttg 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<400> 97 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 102 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 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sequence <400> 175 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 176 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: IgG heavy chain signal sequence <400> 176 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 177 <211> 26 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: IgG heavy chain signal sequence <400> 177 Met Asp Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser 20 25 <210> 178 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: IgG Kappa light signal sequence <400> 178 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys 20 <210> 179 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: IgG Kappa light signal sequence <400> 179 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 180 <211> 17 <212> PRT <213> Gaussia princeps <400> 180 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala <210> 181 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Met Ala Phe Leu Trp Leu Leu Ser Cys Trp Ala Leu Leu Gly Thr Thr 1 5 10 15 Phe Gly <210> 182 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu Val 1 5 10 <210> 183 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 <210> 184 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 185 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Prolactin signal sequence <400> 185 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser 20 25 30 <210> 186 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly 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sequence may encompass 1-6 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 191 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 192 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 192 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 193 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 193 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 194 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 194 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 195 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 195 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 196 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 196 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 197 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 1-6 "Glu Ala Ala Ala Lys" repeating units <400> 197 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 20 25 30 <210> 198 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 198 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 199 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 199 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205 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 205 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 206 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 206 Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 207 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr 1 5 <210> 208 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 208 Gly Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 209 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 209 Trp Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 210 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 210 Ala Arg Gly Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 211 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 212 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 212 Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 213 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 213 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly 20 <210> 214 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 214 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 20 <210> 215 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 215 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 20 <210> 216 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 216 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser 20 <210> 217 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 217 Glu Pro Lys Ser Ser Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser 20 <210> 218 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 218 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser <210> 219 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 219 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ser <210> 220 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Arg Gly 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 <210> 224 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 224 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 225 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 225 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (84)

  1. 결합제-약물 접합체로서, (i) 질환 상태의 조직에서 표적 세포 상의 세포 표면 특징에 결합하는 세포 결합 모이어티로서, 세포 표면 특징은 상기 결합제-약물 접합체에 의해 결합될 때 느린 내재화를 겪는, 상기 세포 결합 모이어티; (ii) 상기 표적 세포에 근접한 방관자 세포(bystander cell) 상에서 약학적 효과를 갖는 약물 모이어티로서, 약물 모이어티가 상기 결합제-약물 접합체의 부분일 때에는 상기 결합제-약물 접합체로부터 방출된 유리 약물 모이어티에 비해 적어도 10배만큼 약화된 약학적 효과에 대한 EC50을 갖는, 상기 약물 모이어티; 및 (iii) 폴리펩타이드 결합제 모이어티를 약물 모이어티에 공유적으로 연결시키는 링커 모이어티로서, 링커 모이어티가 상기 질환 조직에서 세포외에 존재하는 효소에 의해 절단 가능한 기질 인식 서열을 포함하되, 상기 효소의 존재 하에 상기 링커 모이어티는 절단되고 상기 유리 약물 모이어티로부터 방출될 수 있는, 상기 링커 모이어티를 포함하는, 결합제-약물 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 질환 조직은 종양인, 결합제-약물 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 세포는 종양 세포인, 결합제-약물 접합체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 세포는 대식세포, 단핵구 유래 억제 세포(MDSC), 수지상 세포, 섬유아세포, T-세포, NK 세포, 비만 세포, 과립구, 호산구, B-세포 또는 혈관 내피세포인, 결합제-약물 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제-약물 접합체는, 상기 표적 세포 상의 표면 특징과 결합할 때, 내재화 반감기가 적어도 6시간, 더 바람직하게는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 36, 48 또는 60시간인, 결합제-약물 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 표면 특징은 건강한 상태의 조직으로부터의 정상 세포에 비해 상기 질환 조직에서의 상기 표적 세포에 의해 선택적으로 발현되는 단백질인, 결합제-약물 접합체.
  7. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 표면 특징은 관문 단백질 또는 공자극 수용체인, 결합제-약물 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 표면 특징은 CTLA-4, PD-1, LAG-3, BTLA, KIR, TIM-3, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, GAL9, CD160, VISTA, BTNL2, TIGIT, PVR, BTN1A1, BTN2A2, BTN3A2 및 CSF-1R, 더 바람직하게는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, BTLA, VISTA, HVEM, TIGIT, PVR, PD-L1 및 CD160으로 이루어진 군으로부터 선택된 관문 단백질이고, 상기 결합제 모이어티는 관문 길항제인, 결합제-약물 접합체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 표면 특징은 4-1BB, 4-1BB-L, OX40, OX40-L, GITR, CD28, CD40, CD40-L, ICOS, ICOS-L, LIGHT, 및 CD27, 더 바람직하게는 4-1BB, OX40, GITR, CD40 및 ICOS로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 수용체 또는 리간드이고, 상기 결합제 모이어티는 공자극 작용제인, 결합제-약물 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 결합 모이어티는 항체, 이러한 인간화된 항체, 인간 항체, 또는 키메라 항체이거나, 또는 상기 세포 표면 특징, 예컨대 Fab, F(ab)2, F(ab'), F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv, 이황화 연결된 Fv, dAb 또는 sdAb(또는 나노바디), CDR, scFv, (scFv)2, 다이-scFv, 바이-scFv, tascFv(탠덤 scFv), 아비바디(AVIBODY)(예를 들어, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디), T-세포 관여자(BiTE), scFv-Fc, Fcab, mAb2, 소형 모듈 면역약제(SMIP), Genmab/유니바디 또는 듀오바디, V-NAR 도메인, IgNAR, 미니바디, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, 인트라바디 또는 다중특이성 항체에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는, 결합제-약물 접합체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제 모이어티는, 예컨대 애피바디(Affibody), 아피머(Affimer), 아필린(Affilin), 안티칼린(Anticalin), 아트리머(Atrimer), 아비머(Avimer), DARPin, FN3 스캐폴드(예를 들어, 어드넥틴(Adnectin) 및 센티린(Centyrin)), 파이노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인, 나노피틴(Nanofitin), 프로넥틴(Pronectin), 오바디(OBody), 트라이바디(tribody), 아비머, 이환식 펩타이드 및 Cys-노트(Cys-knot)로부터 선택된, 비-항체 스캐폴드인, 결합제-약물 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식 중 하나로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00168

    식 중,
    CBM은 각각의 경우에 대해 동일 또는 상이할 수 있는 세포 결합 모이어티를 나타내고;
    L1은 스페이서 또는 결합을 나타내며;
    SRS는 기질 인식 서열을 나타내고;
    L2는 자기 희생(self immolative) 링커 또는 결합을 나타내며;
    DM은 약물 모이어티를 나타내고;
    m은 1 내지 6의 정수를 나타내며; 그리고
    n은 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 100, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
  13. 제12항에 있어서, L1은 탄화수소(직쇄 또는 환식), 예컨대 6-말레이미도카프로일, 말레이미도프로판오일 및 말레이미도메틸 사이클로헥산-1-카복실레이트이거나, 또는 L1은 N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트, N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트, N-석신이미딜(4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트이거나, 또는 L1은 폴리에터, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)인, 결합제-약물 접합체.
  14. 제12항에 있어서, CBM은 티올을 포함하고, L1은 말레이미드 모이어티를 통해 티올기에 결합된 폴리(에틸렌 글리콜)이며, L1은 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00169

    식 중, p는 1 내지 100, 바람직하게는 6 내지 50, 더 바람직하게는 6 내지 12의 정수를 나타낸다.
  15. 제12항에 있어서, CBM은 티올을 포함하고, L1은 말레이미드 모이어티를 통해 상기 티올기에 결합된 탄화수소 모이어티이며, L1은 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00170

    p는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질 인식 서열은 프로테아제, 바람직하게는 세린 프로테아제, 금속 프로테아제 또는 시스테인 프로테아제에 의해 절단된, 결합제-약물 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 환자의 질환 상태의 조직에서 세포외에서 존재하는 상기 프로테아제는 상기 환자의 건강한 상태의 조직보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 심지어 100배 초과의 수준인, 결합제-약물 접합체.
  18. 제16항에 있어서, 환자의 질환 상태의 조직에서 세포외에서 존재하는 상기 프로테아제는 환자의 다른 조직보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 심지어 100배 초과의 수준인, 결합제-약물 접합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 막 결합된 매트릭스 메탈로프로테이나제(예컨대 MMP14-17 및 MMP24-25)로부터 선택된 매트릭스 메탈로프로테이나제, 분비된 매트릭스 메탈로프로테이나제(예컨대 MMP1-13 및 MMP18-23 및 MMP26-28), 바람직하게는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP4, MMP9, MMP11, MMP13, MMP14, MMP17 또는 MMP19, 더 바람직하게는 MMP2, MMP9 또는 MMP14인, 결합제-약물 접합체.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 A 디스인테그린(A Disintegrin) 및 메탈로프로테이나제(A Disintegrin and Metalloproteinase: ADAM), 또는 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 A 디스인테그린 또는 메탈로프로테이나제(A Disintegrin or Metalloproteinase with Thrombospondin Motif: ADAMTS)인, 결합제, 약물 접합체.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 레구메인, 매트립타제(MT-SP1), 호중구 엘라스타제, TMPRSS, 트롬빈, u-형 플라스미노겐 활성체(uPA, 유로키나제로도 지칭됨), PSMA 또는 CD10(CALLA)인, 결합제-약물 접합체.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 프롤린 후 절단 프로테아제, 예컨대 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)인, 결합제-약물 접합체.
  23. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 인식 서열은 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)에 의해 절단되고, 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00171

    식 중,
    R2는 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 H이며;
    R3은 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 또는 아이소프로필, 및 더 바람직하게는 메틸이고;
    R4는 존재하지 않거나 또는 (C1-C6) 알킬, -OH, -NH2, 또는 할로겐을 나타내며;
    X는 O 또는 S를 나타내고; 그리고
    -NH-는 L2가 자기 희생 링커라면 L2의 부분이거나 또는 L2가 결합이라면 DM의 부분인 아민을 나타낸다.
  24. 제12항 내지 제15항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, L2는 -NH-(CH2)4-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, p-아미노벤질옥시카보닐(PABC) 및 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린으로 이루어진 군으로부터 선택된 자기 희생 링커인, 결합제-약물 접합체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티의 상기 약학적 효과는 세포 침투성인 상기 유리 약물 모이어티에 의존하는 반면, 상기 결합제-약물 접합체의 부분일 때, 상기 약물 모이어티는 실질적으로 세포 불침투성인, 결합제-약물 접합체.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티의 상기 약학적 효과는 L1에 대한 공유 결합에 의해 실질적으로 약화되는, 결합제-약물 접합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 면역조절제인, 결합제-약물 접합체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 면역 활성제인, 결합제-약물 접합체.
  29. 제27항에 있어서, 상기 유리 약물 모이어티는 선천성 면역 경로를 유도하는, 결합제-약물 접합체.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 DPP8 및 DPP9의 효소 활성을 저해하고 대식세포 파이롭토시스(pyroptosis)를 유도하는 면역-DASH 저해제인, 결합제-약물 접합체.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 활성제는 STING 작용제인, 결합제-약물 접합체.
  32. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 활성제는 RIG-1 작용제인, 결합제-약물 접합체.
  33. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 활성제는 Toll-유사 수용체(TLR) 작용제, 예컨대 TLR1/2 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6/2 작용제, TLR7 작용제, TLR7/8 작용제, TLR7/9 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, 및 TLR11 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 TLR3 작용제, TLR7 작용제, TLR7/8 작용제, 및 TLR9 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합제-약물 접합체.
  34. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 암 연관 섬유아세포(cancer associated fibroblast: CAF)에 대해 세포독성인, 결합제-약물 접합체.
  35. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 M1 대식세포로 쪽으로 종양 연관 대식세포를 분극화하거나 또는 M2 대식세포 면역억제 활성을 저해하는, 결합제-약물 접합체.
  36. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 T-세포 프라이밍 및/또는 수지상 세포 수송을 가속화하는, 결합제-약물 접합체.
  37. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유리 약물 모이어티는, 예컨대, 면역억제 작용 또는 림프절 및/또는 종양 미세환경으로의 이동을 차단시킴으로써 Treg 세포를 저해하거나 고갈시키는, 결합제-약물 접합체.
  38. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제-약물 접합체의 치료 지수는 전신으로 제공될 때의 상기 유리 약물 모이어티에 대한 치료 지수보다 적어도 5배 더 크고, 더 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 75 또는 심지어 100배 더 큰, 결합제-약물 접합체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 5000 amu 미만, 바람직하게는 2500amu 미만의 분자량을 갖는 저분자량 저해제인, 방법.
  40. 종양에서 세포 상의 세포 표면 단백질에 결합하는 하나 이상의 아피머 서열을 포함하며, 이에 현수된 하나 이상의 약물-접합체 모이어티를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 결합제-약물 접합체로서, 약물-접합체 모이어티는 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00172

    식 중,
    L1은 스페이서 또는 결합을 나타내며;
    SRS는 종양의 세포외 공간에서 발현되는 세포외 프로테아제에 대한 기질 인식 서열을 나타내고;
    L2는 자기 희생 링커 또는 결합을 나타내며;
    DM은 약물 모이어티를 나타내고;
    m은 1 내지 6의 정수를 나타내며, 바람직하게는 1, 2 또는 3이고; 그리고
    n은 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 100, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
  41. 제40항에 있어서, 상기 아피머 서열은 PD-L1 결합 모이어티인, 결합제-약물 접합체.
  42. 제41항에 있어서, 상기 PD-L1 결합 모이어티는 PD-L1에 1×10-6M 이하의 Kd로 결합하고 PD-L1과 이것이 결합한 PD-1과의 상호작용을 저해하는 아피머 폴리펩타이드 서열인, 결합제-약물 접합체.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 식 (I)로 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 결합제-약물 접합체:
    FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
    식 중,
    FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(서열번호 1)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열이고;
    FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(서열번호 2)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열이며;
    FR3은 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(서열번호 3)로 나타내는 폴리펩타이드 서열 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
    Xaa는 각각의 경우에 대해 개별적으로 아미노산 잔기이며; 그리고
    n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이다.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 하기 일반식으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00173

    식 중,
    Xaa는 각각의 경우에 대해 개별적으로 아미노산 잔기이며;
    n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이고;
    Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp 또는 Glu이며;
    Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
    Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser 또는 Thr이며;
    Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
    Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이며;
    Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고; 그리고
    Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이다.
  45. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 하기 일반식으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00174

    식 중,
    Xaa는 각각의 경우에 대해 개별적으로 아미노산 잔기이며; 그리고
    n 및 m은 각각 독립적으로, 3 내지 20의 정수이다.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 결합 아피머 폴리펩타이드는 서열번호 76 내지 84로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 단백질.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인의 티올 측쇄를 통해 상기 아피머 서열에 현수된 적어도 하나의 약물-접합체 모이어티는 아피머 서열에, 바람직하게는 FR1, FR2 및/또는 FR3에 대응하는 상기 아피머 서열의 일부에 도입되는, 결합제-약물 접합체.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1에 대한 상기 아피머 결합은 (a) 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction: MLR) 분석에서 T-세포 증식을 증가시키고; (b) MLR 분석에서 인터페론-γ 생산을 증가시키고; 그리고/또는 (c) MLR 분석에서 인터류킨-2(IL-2) 분비를 증가시키는, 결합제-약물 접합체.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아피머는 Fc 도메인 또는 이의 일부, 알부민 단백질 또는 이의 일부, 알부민-결합 폴리펩타이드 모이어티, 트랜스페린 또는 이의 일부, 트랜스페린-결합 폴리펩타이드 모이어티, 피브로넥틴 또는 이의 일부, 또는 피브로넥틴-결합 폴리펩타이드 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된 반감기 연장 폴리펩타이드 모이어티를 포함하는 웅합 단백질의 일부인, 결합제-약물 접합체.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, L1은 탄화수소(직쇄 또는 환식), 예컨대 6-말레이미도카프로일, 말레이미도프로판오일 및 말레이미도메틸 사이클로헥산-1-카복실레이트이거나, 또는 L1은 N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트, N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트, N-석신이미딜(4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트이거나, 또는 L1은 폴리에터, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)인, 결합제-약물 접합체.
  51. 제50항에 있어서, 상기 아피머는 유리 티올을 갖는 시스테인을 포함하고, L1은 말레이미드 모이어티를 통해 상기 티올기에 결합된 폴리(에틸렌 글리콜)이며, L1은 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00175

    식 중, p는 1 내지 100, 바람직하게는 6 내지 50, 더 바람직하게는 6 내지 12의 정수를 나타낸다.
  52. 제50항에 있어서, 상기 아피머는 유리 티올을 갖는 시스테인을 포함하고, L1은 말레이미드 모이어티를 통해 상기 티올기에 결합된 탄화수소 모이어티이며, L1은 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00176

    p는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
  53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질 인식 서열은 세린 프로테아제, 금속 프로테아제 또는 시스테인 프로테아제에 의해 절단된, 결합제-약물 접합체.
  54. 제53항에 있어서, 환자의 종양 조직에서 세포외에 존재하는 상기 프로테아제는 상기 환자의 비-종양 조직보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 심지어 100배 초과의 수준인, 결합제-약물 접합체.
  55. 제53항에 있어서, 환자의 종양 조직에서 세포외에 존재하는 상기 프로테아제는 상기 환자의 다른 조직보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 심지어 100배 초과의 수준인, 결합제-약물 접합체.
  56. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 막 결합된 매트릭스 메탈로프로테이나제(예컨대 MMP14-17 및 MMP24-25), 분비된 매트릭스 메탈로프로테이나제(예컨대 MMP1-13 및 MMP18-23 및 MMP26-28)로부터 선택된 매트릭스 메탈로프로테이나제이며, 바람직하게는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP4, MMP9, MMP11, MMP13, MMP14, MMP17 또는 MMP19, 더 바람직하게는 MMP2, MMP9 또는 MMP14인, 결합제-약물 접합체.
  57. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 A 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM), 또는 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 A 디스인테그린 또는 메탈로프로테이나제(ADAMTS)인, 결합제, 약물 접합체.
  58. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 레구메인, 매트립타제(MT-SP1), 호중구 엘라스타제, TMPRSS, 트롬빈, u-형 플라스미노겐 활성체(uPA, 유로키나제로도 지칭됨), PSMA 또는 CD10(CALLA)인, 결합제-약물 접합체.
  59. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 프롤린 후 절단 프로테아제, 예컨대 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)인, 결합제-약물 접합체.
  60. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 인식 서열은 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)에 의해 절단되고, 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00177

    식 중,
    R2는 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 H이며;
    R3은 H 또는 (C1-C6) 알킬을 나타내고, 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 또는 아이소프로필, 및 더 바람직하게는 메틸이고;
    R4는 존재하지 않거나 또는 (C1-C6) 알킬, -OH, -NH2, 또는 할로겐을 나타내며;
    X는 O 또는 S를 나타내고; 그리고
    -NH-는, L2가 자기 희생 링커라면 L2의 부분이거나 또는 L2가 결합이라면 DM의 부분인 아민을 나타낸다.
  61. 제41항 내지 제55항 및 제60항 중 어느 한 항에 있어서, L2는 -NH-(CH2)4-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, p-아미노벤질옥시카보닐(PABC) 및 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린으로 이루어진 군으로부터 선택된 자기 희생 링커인, 결합제-약물 접합체.
  62. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티의 상기 약학적 효과는 세포 침투성인 상기 유리 약물 모이어티에 의존하는 반면, 상기 결합제-약물 접합체의 부분일 때, 상기 약물 모이어티는 실질적으로 세포 불침투성인, 결합제-약물 접합체.
  63. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티의 상기 약학적 효과는 L1에 대한 공유 결합에 의해 실질적으로 약화된, 결합제-약물 접합체.
  64. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 면역조절제인, 결합제-약물 접합체.
  65. 제64항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 면역 활성제인, 결합제-약물 접합체.
  66. 제64항에 있어서, 상기 유리 약물 모이어티는 선천성 면역 경로를 유도하는, 결합제-약물 접합체.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 DPP8 및 DPP9의 효소 활성을 저해하고 대식세포 파이롭토시스를 유도하는 면역-DASH 저해제인, 결합제-약물 접합체.
  68. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 STING 작용제인, 결합제-약물 접합체.
  69. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 RIG-1 작용제인, 결합제-약물 접합체.
  70. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 Toll-유사 수용체(TLR) 작용제, 예컨대 TLR1/2 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6/2 작용제, TLR7 작용제, TLR7/8 작용제, TLR7/9 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, 및 TLR11 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 TLR3 작용제, TLR7 작용제, TLR7/8 작용제, 및 TLR9 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합제-약물 접합체.
  71. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 암 연관 섬유아세포(cancer associated fibroblast: CAF)에 대해 세포독성인, 결합제-약물 접합체.
  72. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 M1 대식세포로 쪽으로 종양 연관 대식세포를 분극화하거나 또는 M2 대식세포 면역억제 활성을 저해하는, 결합제-약물 접합체.
  73. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 T-세포 프라이밍 및/또는 수지상 세포 수송을 가속화하는, 결합제-약물 접합체.
  74. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유리 약물 모이어티는, 예컨대, 면역억제 작용 또는 림프절 및/또는 종양 미세환경으로의 이동을 차단시킴으로써 Treg 세포를 저해하거나 고갈시키는, 결합제-약물 접합체.
  75. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제-약물 접합체의 치료 지수는 전신으로 제공될 때의 유리 약물 모이어티에 대한 치료 지수보다 적어도 5배 더 크고, 더 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 75 또는 심지어 100배 더 큰, 결합제-약물 접합체.
  76. 제41항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 5000 amu 미만, 바람직하게는 2500amu 미만의 분자량을 갖는 저분자량 저해제인, 결합제-약물 접합체.
  77. PD-L1 저해제/선천성 면역 자극제 조합물로서, 선천성 면역 반응의 무익한(sterile) 유도제(예컨대 면역-DASH 저해제, STING 작용제, TRL7/8 작용제 또는 RIG-1 작용제)인 PD-L1 결합 폴리펩타이드 및 이에 접합된 약물 모이어티를 포함하되, 상기 PD-L1 결합 폴리펩타이드는 환자의 다른 조직에 대해 종양 내 상기 PD-L1 저해제/선천성 자극제의 축적을 야기하고, 상기 약물 모이어티는 환자의 다른 조직에 대해 상기 종양 미세환경에서 상기 PD-L1 결합 폴리펩타이드로부터 선택적으로 방출되는, PD-L1 저해제/선천성 면역 자극제 조합물.
  78. 인간 환자에서의 치료적 용도에 적합한 약제학적 제제로서, (i) 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 결합제-약물 접합체 또는 제77항의 PD-L1 저해제/선천성 자극제 조합물, 및 (ii) 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 완충제, 염 등을 포함하는, 약제학적 제제.
  79. 암을 앓고 있는 환자에 대한 치료의 부분으로서의, 제78항의 약제학적 제제의 용도.
  80. 제79항에 있어서, 상기 치료는 상기 환자에게 PGE2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 약제학적 제제의 용도.
  81. AML 세포를 사멸시키는 결합제-약물 접합체로서, i) AML 세포 상에서 선택적으로 발현되는 세포 표면 특징(예컨대 CD33 또는 CD123)에 결합하는 세포 결합 모이어티로서, 세포 표면 특징은 상기 결합제-약물 접합체에 의해 결합될 때 AML 세포에 의해 내재화되는, 상기 세포 결합 모이어티; (ii) 접합체로부터 유리 면역-DASH 저해제로서 방출될 때 상기 AML 세포에 대해 독성인 면역-DASH 저해제 모이어티; 및 (iii) 상기 세포 결합 모이어티를 상기 I-DASH 저해제 모이어티에 공유적으로 연결시키는 링커 모이어티로서, 링커 모이어티가 상기 AML 세포에서 세포내에 존재하는 효소(예컨대 카텝신)에 의해 절단 가능한 기질 인식 서열을 포함하는, 상기 링커 모이어티를 포함하되, 상기 세포 표면 특징에 결합 시 AML 세포에 의한 상기 결합제-약물 접합체의 내재화는 상기 세포내 효소에 대한 상기 링커 모이어티의 노출 및 상기 링커 모이어티의 절단 및 상기 AML 세포에서 상기 유리 면역-DASHG 모이어티의 세포내 방출을 초래하는, 결합제-약물 접합체.
  82. 결합제-약물 접합체로서, AML 세포 결합 모이어티(예컨대 CD33 결합제 또는 CD123 결합제)를 포함하고, 이에 현수된 하나 이상의 약물-접합체 모이어티를 갖되, 약물-접합체 모이어티는 하기 식으로 나타내는, 결합제-약물 접합체:
    Figure pct00178

    식 중,
    L1은 스페이서 또는 결합을 나타내며;
    SRS는 상기 AML 세포에서 발현되는 세포내 프로테아제에 대한 기질 인식 서열을 나타내고;
    L2는 자기 희생 링커 또는 결합을 나타내며;
    DM은 면역-DASH 저해제 모이어티를 나타내고;
    m은 1 내지 6의 정수를 나타내며, 바람직하게는 1, 2 또는 3이고; 그리고
    n은 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 100, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
  83. AML에 대한 치료의 부분으로서 인간 환자에서의 치료적 용도에 적합한 약제학적 제제로서, (i) 제80항 또는 제18항 중 어느 한 항의 결합제-약물 접합체, 및 (ii) 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 완충제, 염 등을 포함하는, 약제학적 제제.
  84. AML을 앓고 있는 환자에 대한 치료의 부분으로서의, 제82항의 약제학적 제제의 용도.
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