CN101962693B - 猴空泡病毒的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所用引物和TaqMan探针是根据猴空泡病毒Large T基因的保守区域设计的，用以定量检测猴淋巴细胞或相关生物制品中的猴空泡病毒核酸拷贝数。所述检测方法是上述引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。本发明能准确的检测出猴群SV40的感染情况及相关生物制品中SV40的残留状况，对控制实验猴群的质量具有重要意义，能够保证相关生物制品的质量，对于控制SV40传播和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于猴空泡病毒的诊断及生物制品的猴空泡病毒检定，应用前景广阔。

Description

猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，特别是涉及猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

猴空泡病毒(Simian Virus 40，SV40)属于乳多空病毒科(Papovaviruidae)，多瘤病毒属(Polyomavirus)，是一种DNA肿瘤病毒。由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA，而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。2种早期mRNA分别编码大T抗原的小t抗原(即肿瘤蛋白质或抗原)。晚期转录本按照其特定的沉降系数，分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码Vp1、Vp3和Vp2衣壳蛋白([1]动物病毒学(第二版)，殷震，刘景华主编，科学出版社，1997。[2]实验动物病毒性疾病，军事医学科学院实验动物中心主编，农业出版社，1992。)。

SV40最早是在未接种病毒的猴肾细胞培养物中分离得到的，它能够转化灵长类细胞，其虽然不会对灵长类动物致病，但在物种间的传播会引起致病性的改变。近年来，SV40与人类肿瘤的关系得到了大量的研究，表明SV40与癌症有密切关系，比如肾脏疾病和出血性膀胱炎，进行性多灶性白质脑病，原发性脑癌和骨癌，间皮瘤和非霍奇金淋巴瘤等。根据SV40感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型。SV40在感染了Vero和BSC-1猴肾细胞系之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。猴的细胞系属于受纳细胞(permissive cell)。而啮齿动物(如小鼠)的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，就会发生癌变。这种啮齿动物细胞为SV40的非受纳细胞(non-permissive cell)。人的细胞是SV40的半受纳细胞(semi-permissivecell)，因为同SV40接触的人体细胞中，有1％～2％会产生出感染性的病毒。基于这些特性，SV40是第一个被用作哺乳动物克隆载体的病毒。

因SV40在猴体内主要成隐性感染，已有文献报道在我国猴群中广泛存在SV40感染(实验动物病毒性疾病，军事医学科学院实验动物中心主编，农业出版社，1992。)，极有可能造成猴源性生物制品的污染，所以提高实验用猴和猴源性生物制品的病毒检测能力既能够保证疫苗等生物制品的安全，又可以避免或减少由于SV40感染引发肿瘤的情况。目前，国外临床已经有应用specific real time quantitative polymerasechain reaction(RQ-PCR)方法检测临床样本中多瘤病毒BKV，JCV以及SV40感染的检测，以及分析猴源性生物制品(如脊髓灰质炎减毒活疫苗)的SV40污染情况。PCR技术由于其快速、安全且具有较高敏感性和特异性等优点被广泛应用。作为相关疫苗的生产原料，对猴源性生物制品SV40污染的检测变得尤为重要。我国药典中对于SV40的检测提供了PCR的检测方法，但在实际工作中发现存在扩增效果不佳的情况，极有可能出现漏检。因此，研究人员进一步优化了引物等相关条件，对PCR方法进行了改进，对猴的组织器官、脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸进行了SV40核酸的检测，在检测中获得了不错的效果。同时建立了间接免疫荧光实验(IFA)检测猴血清中的SV40大T抗原抗体，但是IFA的结果判定存在主观因素，因此影响了特异性。然而随着分子生物学的不断发展，以及我国对生物制品安全要求的不断提高，要求有更高敏感性和特异性的检测方法应用于检测。

近年来，实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、突变和多态性研究、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。实时荧光定量PCR是一种高通量的荧光分析技术，是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，可推算出组织中病毒的含量。

综上所述，为了实现猴群的批量检测，分析猴群中猴空泡病毒的感染状况，提高检测的灵敏度，建立猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法，以及研制相应的检测试剂变得十分迫切，对于控制SV40传播和人民用药安全具有深远意义。

发明内容

本发明提供了用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据猴空泡病毒Large T基因的保守区域设计的，用以定量检测猴淋巴细胞或相关生物制品中的猴空泡病毒核酸拷贝数。

具体来讲，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQID NO：3的核苷酸序列。

所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为Eclipse。

本发明的第二个目的是提供一种灵敏度较高且可准确定量的猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法。

本发明所提供检测方法，是以本发明的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。

所述20ul实时荧光定量PCR反应体系可包括：上游引物1ul(10uM)，下游引物1ul(10uM)，TaqMan探针0.5ul(10uM)，样品DNA 1ul(1μg/mL)，无RNA酶水6.5ul，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10ul。

所述实时荧光定量PCR反应条件可为：先50℃ 2min；然后95℃ 10min；最后95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为：用含有目的片段的质粒作为标准品，将其10倍系列稀释成①：6×10^-1拷贝/μl；②：6×10^-2拷贝/μl；③：6×10^-3拷贝/μl；④：6×10^-4拷贝/μl；⑤：6×10^-5拷贝/μl。将质粒作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于猴空泡病毒检测的标准曲线。

所述标准曲线的20ul实时荧光定量PCR反应体系包括：上游引物1ul(10uM)，下游引物1ul(10uM)，TaqMan探针0.5ul(10uM)，质粒DNA 1ul(0.1mg/mL)，无RNA酶水6.5ul，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10ul。实时荧光定量PCR反应条件与上述相同。

本发明的第三个目的是提供一种用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明提供了一种猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测方法。该方法是以待检样品中的核酸为检测对象，准确度及精密度均较好。本发明具有以下优点：

1、建立了猴空泡病毒探针法荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对实验用猴的组织样品及相关生物制品进行批量检测。

2、本检测方法与猴空泡病毒的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、全病毒ELISA法、IFA法和普通PCR相比，灵敏度较高，比普通PCR高16000倍，特异性更强，与其它猴源性DNA病毒没有交叉反应，检测准确性得到了很大的提高，其操作程序化，并可进一步制成检测试剂盒。

3、本检测方法不仅能够评价猴群的猴空泡病毒感染状况，同时也为猴空泡病毒的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。

4、本检测方法也可用于检测猴源性生物制品如脊髓灰质炎疫苗、实验室常用猴源性细胞中猴空泡病毒的残留状况，从而评价相关生物制品的质量。

综上所述，本发明能准确的检测出猴群SV40的感染情况及相关生物制品中SV40的残留状况，对控制实验猴群的质量具有重要意义，能够保证相关生物制品的质量，对于控制SV40传播和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于猴空泡病毒的诊断及生物制品的猴空泡病毒检定，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为10倍系列稀释pCR2.1-SV40-LT质粒标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线

图2为猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测的标准曲线

图3为猴空泡病毒实时荧光定量PCR检测的特异性试验及检测应用结果

图4为猴空泡病毒实时荧光定量PCR检测的敏感性试验结果

具体实施方式

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物及TaqMan探针由TaKaRa公司合成，所有序列测定工作均由宝生物工程(大连)有限公司完成。

实施例1、用于对猴空泡病毒(SV40)进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针的设计

参照GenBank收录的乙脑病毒SA14基因组全序列(GeneBank：U14163)，将与猴空泡病毒基因组结构极为相似的JC病毒(JCV)、BK病毒(BKV)和猴嗜淋巴多型瘤病毒(LPV)分别进行序列比对，选择猴空泡病毒Large T抗原基因保守区域，采用ABI PrimerExpress 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成TaqMan探针及引物。探针的荧光标记选择FAM(5’端)作为报告发光基团，Eclipse(3’端)为淬灭基团。

序列如下：

实施例2、猴空泡病毒(SV40)的实时荧光定量PCR检测

一、标准曲线的建立

1、构建pCR2.1-SV40-LT重组质粒

1.1目的基因—猴空泡病毒Large T抗原基因的克隆

1.1.1病毒DNA的提取

以下操作必须严格按照要求在P2实验室负压生物安全柜内进行。

(1)无菌条件下取猴空泡病毒液400μL、猴空泡病毒动物组织样本100mg或脊髓灰质炎病毒疫苗糖丸置入1.5mL洁净离心管，加入500ul抽提缓冲液(50mM TrispH8.0，25mM EDTA，100mM NaCl，1％Triton X-100)和50ul(20mg/mL)蛋白酶K，56℃水浴过夜。

(2)500ul Tris饱和酚pH8.0充分混匀；12000rpm室温离心2min。

(3)取上清水相加等体积氯仿/异戊醇(49∶1)充分混匀；12000rpm室温离心2min。

(4)取上清水相加入0.1被体积7.5M乙酸铵，750ul异丙醇，轻柔混匀；12000rpm室温离心5min。

(5)加70％乙醇，12000rpm室温离心5min，弃上清，干燥；

(6)病毒液和疫苗糖丸提取的用30ul水溶解，组织样本提取的用400ul水溶解。

(7)用紫外分光光度仪测定所得SV40病毒液提取的DNA浓度(浓度为1μg/mL)，立即进行逆转录或置于-20℃保存。

1.1.2PCR扩增

PCR的反应体系为50μL，依次加入下列成分：5μL 10×EX Buffer(MgCl₂ Plus，TaKaRa Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司)、4μL dNTP Mixture(10mM)、1μL正向引物：5’-AACCAGGAAATTTGTCGGTC-3’(50pmol)、1μL逆向引物：

5’-AAAGCGGGTTGATAGCCTAC-3’(50pmol)、0.25μL EX Taq(5unit/μL，购自宝生物工程(大连)有限公司)、1μL DNA、37.75μL水。

PCR反应条件为：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共30个循环。

1.1.3琼脂糖凝胶电泳检测

配制1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)。取PCR扩增产物5μL，与1μL的6×载样缓冲液混匀，加到凝胶孔格中。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，电泳条件为110V恒压/30min，凝胶成像系统下拍摄记录电泳结果。结果得到了242bp的目的条带，用Agarose Gel DNA Purification Kit(琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司)回收并纯化。

1.2猴空泡病毒Large T抗原基因重组质粒的构建

将猴空泡病毒Large T抗原基因片段与pCR2.1载体(购自invitrogen公司)进行连接，连接反应体系：2×Rapid Ligation Buffer 5μL(宝生物工程(大连)有限公司试剂盒)，pCR2.1载体0.5μL(浓度50ng/μL)，目的基因4μL(45μg/mL)，T4 DNA Ligase 0.5μL(5U/μL)。然后将连接产物热转化至E.coli Competent CellJM109中，涂布LB平板，37℃过夜培养。将选定的含有阳性克隆的单菌落进行培养，提取质粒DNA，用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶进行酶切鉴定并测序。酶切结果获得了242bp的目的条带及3.9kb质粒条带，与预期结果相符。测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含目的基因的重组质粒，命名为pCR2.1-SV40-LT。紫外分光光度法测定OD260nm值用以测定质粒DNA浓度，计算拷贝数，结果拷贝数为6×10¹⁰拷贝/μL，-20℃保存。

2、标准品检测

将pCR2.1-SV40-LT质粒DNA作为模板进行猴空泡病毒探针法实时荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成①：6×10^-1拷贝/μl；②：6×10^-2拷贝/μl；③：6×10^-3拷贝/μl；④：6×10^-4拷贝/μl；⑤：6×10^-5拷贝/μl。每个稀释度重复平行试验3次。

标准品检测反应体系为20μl，依次加入下列成分：上游引物1ul(10uM)，下游引物1ul(10uM)，TaqMan探针0.5ul(10uM)，质粒DNA 1ul(0.1mg/mL)，无RNA酶水6.5ul，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10ul。

标准品检测反应条件为：先50℃ 2min；然后95℃ 10min；最后95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

标准品探针法实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示(A-E依次为质粒标准品拷贝数6×10^-1-6×10^-5copies/mL的荧光曲线；F阴性对照)。

3、标准曲线的绘制

根据所得C_T值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线(图2)，标准曲线的R平方值为0.998，实时荧光定量PCR反应的扩增效率为110.528％。标准曲线显示：本发明建立的猴空泡病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法有9个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。

二、猴空泡病毒探针法实时荧光定量PCR检测56份恒河猴相关组织及猴源性生物制品

将56份猴脾、肺、肾(购自北京生物制品研究所)和10批脊髓灰质炎疫苗(由中国药品生物制品检定所疫苗室提供)的总DNA作为检测对象进行猴空泡病毒探针法实时荧光定量PCR检测。每份样本重复平行试验3次。

临床样本检测体系为20μL，依次加入下列成分：上游引物1ul(10uM)，下游引物1ul(10uM)，TaqMan探针0.5ul(10uM)，样品DNA 1ul(1μg/mL)，无RNA酶水6.5ul，Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10ul。

检测反应条件为：先50℃ 2min；然后95℃ 10min；最后95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

结果如图3所示(A-E依次为质粒标准品6×10^-1-6×10^-5copies/mL的荧光曲线；F SV40阳性对照荧光曲线；G猴15肾荧光曲线；H  猴26肺荧光曲线；I猴34肺荧光曲线)，显示：以猴15号肾、26号肺和34号肺DNA为模板均出现了目的荧光扩增曲线，而用普通PCR方法检测没有检出(请对检测结果加以说明)。

试验一、猴空泡病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法的特异性

设定BV、HSV-1、Vero细胞对照及水空白对照，以猴15号肾、26号肺和34号肺DNA作为模板进行探针法实时荧光定量PCR检测，评价反应系统的特异性。反应体系及反应条件与实施例2相同。每份样本重复平行试验2次。

探针法实时荧光定量PCR检测特异性扩增曲线如图3所示(A-E依次为pCR2.1-SV40-LT质粒标准品6×10^-1-6×10^-5copies/mL的荧光曲线；F SV40阳性对照荧光曲线；G猴15肾FQ-PCR荧光曲线；H猴26肺荧光曲线；I猴34肺荧光曲线；J阴性对照(BV、HSV-1、Vero细胞和水空白))，结果显示：以猴15号肾、26号肺和34号肺DNA为模板出现了目的荧光扩增曲线，而以BV、HSV-1、Vero细胞和水空白为模板没有出现目的荧光扩增曲线。结果说明：本发明用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针的特异性良好，定量反应体系特异性良好。

试验二、猴空泡病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法的敏感性

将pCR2.1-SV40-LT质粒标准品10倍系列稀释成8.1×10^-1、8.1×10^-2、8.1×10^-3、8.1×10^-4、8.1×10^-5、8.1×10^-6、8.1×10^-7、8.1×10^-8、8.1×10^-9、8.1×10^-10共10个稀释度，以无菌水为阴性对照，将质粒作为模板进行探针法实时荧光定量PCR检测，评价本发明反应系统的敏感性。

探针法实时荧光定量PCR检测敏感性扩增曲线如图4所示(A-J为质粒标准品拷贝数8.1×10⁹-8.1×10⁰copies/mL荧光扩增曲线；K阴性对照)，结果显示：以质粒标准品8.1×10⁰copies/mL为模板出现目的荧光扩增曲线。结果说明：本发明用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针的敏感性良好，定量反应体系敏感性良好。

实施例3、猴空泡病毒探针法实时荧光定量PCR检测试剂盒

将用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物SV40-LT-F(10uM)100ul，SV40LT-R(10uM)100ul和TaqMan探针(10uM)50ul以及TaqMan Gene ExpressionMaster Mix 1mL、SV40 DNA(0.01mg/mL)5ul、灭菌双蒸水1mL共同包装，得到猴空泡病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

序列表

Claims (4)

1.用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是根据猴空泡病毒Large T基因的保守区域设计的，用以定量检测猴淋巴细胞或相关生物制品中的猴空泡病毒核酸拷贝数；所述引物的上游引物为序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，下游引物为序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针为序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。

3.根据权利要求2所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为Eclipse。

4.一种用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1所述用于对猴空泡病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。

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