CN117106716A - 培养细胞的方法及用于该方法的试剂盒和设备 - Google Patents
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Abstract
本文在某些方面提供了涉及孵育或培养(例如为了诱导刺激扩增(增殖)、活化、共刺激和/或存活)细胞组合物(例如淋巴细胞群)的方法。在某些方面中，提供了用于刺激细胞群以诸如扩增(增殖)、存活或保持、活化、共刺激或其他效果的方法和反应剂，包括使作用剂与细胞表面上的分子结合从而给细胞提供一个或多个信号。在某些情况下，所述反应剂为包含针对作用剂的多个结合位点的反应剂(如多聚化反应剂)，由此一个或多个作用剂通过与该反应剂的可逆结合而多聚化，例如由此产生刺激性反应剂(多聚的作用剂)，其具有多聚化于其上的刺激剂。在一些方面中，多聚的作用剂能用于对细胞群的扩增或增殖或其他刺激，随后此类刺激剂可通过可逆键的破坏被移除。还提供了其使用方法、组合物和设备。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月22日提交的发明名称为“培养细胞的方法及用于该方法的试剂盒和设备”的美国临时专利申请No.62/245,252以及2015年10月22日提交的发明名称为“培养细胞的方法以及用于所述方法的试剂盒和设备”的美国临时专利申请No.62/245,261的优先权，其内容各自通过引用全文纳入本文。
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技术领域
本文提供了(在某些方面)涉及孵育或培养(例如为了诱导刺激扩增(增殖)、活化、共刺激和/或存活)细胞组合物(例如淋巴细胞群)的方法。在某些方面中，本文提供了用于刺激细胞群以诸如扩增(增殖)、存活或保持、活化、共刺激或其他效果的方法和反应剂(reagent)，包括使作用剂(agent)与细胞表面上的分子结合从而给细胞提供一个或多个信号。在某些情况下，所述反应剂为包含针对作用剂的多个结合位点的反应剂(如多聚化反应剂)，由此一个或多个作用剂通过与该反应剂的可逆结合而多聚化，例如由此产生刺激性反应剂(多聚的作用剂，multimerized agent)，其具有多聚化于其上的刺激剂。在一些方面中，多聚的作用剂能用于对细胞群的扩增或增殖或其他刺激，随后此类刺激剂可通过可逆键的破坏被移除。还提供了其使用方法、组合物和设备。
背景技术
可获得体外刺激T细胞群的各种策略，包括体外扩增抗原特异性T细胞，以用于过继细胞免疫治疗或癌症治疗，在这些治疗中灌注此类T细胞已在荷肿瘤宿主中显示抗肿瘤反应性，或者用于病毒感染的治疗。需要用于例如研究、诊断和治疗目的的体外扩增细胞群的改进策略。提供满足此类需求的反应剂、方法、制品和试剂盒。
发明内容
本文提供了孵育细胞及其组合物的方法(例如为了培养此类细胞)，所述方法采用可逆性反应剂以在目标细胞中诱导或调节信号。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞。
在一些方面中，所述方法包括在作用剂(如受体结合剂，例如刺激剂))的存在下孵育包含T细胞的组合物。受体结合剂(如刺激剂)可以可逆结合于反应剂，该反应剂包含能够与该受体结合剂可逆结合的多个结合位点。在一些方面中，受体结合剂能够特异性结合于细胞(如T细胞)表面上的分子，例如以诱导或调节组合物中细胞(如T细胞)的信号的方式结合。在一些实施方式中，该方法包括特征，例如具体步骤、具体作用剂的选择和/或具体反应剂的选择，这些特征实现了对经由反应剂接受或调节的信号时长或强度或类型的控制或调整，和/或实现了对由该方法最终产生的产出组合物或细胞群的性质的控制或调整。在一些实施方式中，这些特征由于作用剂和反应剂的有益性能而成为可能，所述有益性能为例如：作用剂或反应剂各组分结合的可逆性，以及由此多聚的作用剂与细胞结合的可逆性。可利用反应剂的这些性能实现多种途径的控制。例如，在一些实施方式中，通过可逆结合，该方法包括对信号施加时间控制(temporal control)，控制细胞与多聚的作用剂的接触过程的持续时间，和/或由此诱导的信号转导的持续时间。
在一些实施方式中，方法涉及控制(如精确控制)此类作用剂与细胞结合的时长。例如，这可通过如下方式实现：在特定时间点主动逆转该结合，且在某些情况下同时还能在其他培养条件下(例如在生理温度下和/或包含各种营养物质下孵育)的额外时间段中保持细胞。因此，与仅涉及终止细胞所接受的所有或基本上所有信号的其他方法相反，本文提供的方法在某些方面中实现了特异性终止或中断通过特定反应剂递送的信号。
同样，在一些实施方式中，可逆性使得反应剂实质上模块化，在诱导可逆结合的条件下，允许其一个或多个组成部分的替换而无需工程化或新的反应剂，例如仅通过可逆结合和联合其他作用剂或反应剂。例如，通过能够使同一多聚化反应剂可逆结合各种刺激剂(不论同时或不同时)。所提供方法和组合物的使用者可根据所需的结果，调节所递送特定信号的性质，例如通过将一种或多种刺激剂替换为另一种或多种刺激剂，从而诱导更强或更弱或性质不同的信号。
在一些实施方式中，将时间控制和调节结合使用，例如通过在一种作用剂的存在下孵育细胞一定时间段，通过破坏诱导结合逆转，然后在另一种或多种不同作用剂或反应剂的存在下进行孵育。例如，在一个实施方式中，先用一种反应剂刺激T细胞以递送特定强度或性质的信号，在一定时间段后，破坏该信号，用性质或数量不同的信号(例如更强或更弱或激活不同的信号转导途径或已知对不同分化途径重要的信号)替代之。在一些实施方式中，该控制提供例如如下优点：允许用户最大化所需结果(例如扩增或保持)而避免不希望的结果(例如耗尽或无效能)。
在一些实施方式中，时间控制通过破坏反应剂或作用剂的可逆结合(例如通过加入底物)实现。例如，在一些实施方式中，在一定时间段中(如开始孵育后5天内)和/或在孵育总时长的一定百分比内(例如在时长的1/5、1/4、1/3或1/2内)，破坏受体结合剂和反应剂的可逆结合。因此，在一些情况中，该方法导致产生培养的T细胞。
在一些实施方式中，孵育在如下条件下进行：在该条件下，受体结合剂特异性结合于所述分子，由此诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的信号。
在某些实施方式中，对受体结合剂和反应剂结合的破坏在开始孵育后多于30分钟实现。例如，在一些方面中，受体结合剂和反应剂结合的破坏在孵育开始后的1小时至4天时实现，在孵育开始后的6小时至3天时实现，在孵育开始后的12小时至2天时实现，或在孵育开始后的1天至3天时实现。在一些情况中，受体结合剂和反应剂结合的破坏在孵育开始后的约1小时至约4天时实现，在孵育开始后的约6小时至约3天时实现，在孵育开始后的约12小时至约2天时实现，或在孵育开始后的约1天至约3天时实现。在一些方面中，该破坏在所述孵育开始后的大于或等于约1小时且在孵育开始后的1天、2天、3天或4天内发生。在一些实施方式中，受体结合剂的结合能够在T细胞中启动或启动了TCR/CD3复合物相关的信号。在一些方面中，受体结合剂特异性结合一些TCR/CD3复合物。在一些情况中，受体结合剂特异性结合CD3。
在一些实施方式中，分子(T细胞表面上的分子)是TCR/CD3复合物的组成部分或是CD3。在一些方面中，该分子是第一分子，且受体结合剂能进一步特异性结合一个或多个T细胞表面上的第二分子。在一些情况中，该第二分子能够诱导或促进、抑制(dampening)、或调节通过T细胞中所述第一分子递送的信号。
在一些方面中，受体结合剂包含结合伴侣C1。在一些方面中，反应剂包含的多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1。在一些情况中，两个或多个结合位点Z1各自能够结合于结合伴侣C1以在受体结合剂和反应剂之间形成可逆键。在一些实施方式中，对受体结合剂和反应剂之间结合的破坏包括：将含有能逆转受体结合剂和反应剂之间键的物质的组合物加入细胞。
在一些实施方式中，受体结合剂是第一受体结合剂，且在第二受体结合剂的存在下进一步进行孵育，该第二受体结合剂能够特异性结合于一个或多个T细胞表面上的第二分子。在一些实施方式中，第二受体结合剂与第二分子的结合增强、抑制或改变(modify)T细胞中通过第一分子递送的信号。
在一些实施方式中，反应剂包含能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点。在一些此类情况下，第二受体结合剂可逆地结合该反应剂。在一些方面中，能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点与能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点可相同或不同。
在一些方面中，第二受体结合剂包括结合伴侣C1或C2，其能够可逆结合两个或更多个结合位点Z1。在一些此类情况下，第一和第二受体结合剂通过两个或更多个结合位点Z1可逆结合于反应剂。在一些情况中，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且反应剂进一步包含多个结合位点Z2。多个结合位点Z2可具有结合于结合伴侣C2的能力，以形成第二受体结合剂和反应剂之间的可逆键。在一些方面中，C2和C1相同或基本相同、或者包含相同或基本相同的部分。在一些方面中，Z2和Z1相同或基本相同、或者包含相同或基本相同的部分。
在一些情况中，反应剂是第一反应剂，在至少一种第二反应剂的存在下进行孵育，该第二反应剂可逆结合第二受体结合剂。在一些实施方式中，孵育在第二受体结合剂特异性结合第二分子的条件下进行。在一些如此的方面中，第二受体结合剂与第二分子的结合诱导或调节信号，例如增强、抑制或改变在T细胞中通过第一分子递送的信号。
在一些实施方式中，所述破坏包括：将组合物加入细胞，该组合物含有能逆转第一受体结合剂和反应剂之间键和/或第二受体结合剂和反应剂之间键的物质。在一些实施方式中，所述破坏终止或减弱由第一受体结合剂诱导或调节的信号，且终止或减弱由第二受体结合剂诱导或调节的信号。
本文的一些实施方式中提供了用于培养T细胞的方法，其包括在第一受体结合剂的存在下孵育包含T细胞的组合物，所述第一受体结合剂能够特异性结合T细胞表面上表达的第一分子。在一些方面中，第一受体结合剂与第一分子的结合诱导或调节了T细胞中TCR/CD3复合物相关的信号。在一些此类实施方式中，组合物还在第二受体结合剂的存在下被进一步孵育，该第二受体结合剂可逆结合含有多个结合位点的反应剂。在一些方面中，第二受体结合剂能够特异性结合T细胞表面上的第二分子。在一些情况中，第二受体结合剂与第二分子的结合诱导或调节T细胞中的第二信号，以例如提高、抑制或改变通过第一分子递送的信号。在一些方面中，在开始孵育后5天内破坏第二受体结合剂和反应剂之间的可逆结合，由此产生培养的T细胞。
在一些实施方式中，第二信号增强、抑制或改变T细胞中通过第一分子递送的信号。
在本文所提供的任何方法的一些实施方式中，在第一受体结合剂特异性结合第一分子和/或第二受体结合剂特异性结合第二分子的条件下进行孵育，由此诱导或调节T细胞中的一种或多种信号。在一些实施方式中，所述破坏在开始所述孵育后大于30分钟时进行。在一些实施方式中，所述破坏在开始所述孵育后1小时-4天中进行，在开始所述孵育后6小时-3天中进行，在开始所述孵育后12小时-2天中进行，或在开始所述孵育后1天-3天中进行；或者，所述破坏在开始所述孵育后约1小时-约4天中进行，在开始所述孵育后约6小时-约3天中进行，在开始所述孵育后约12小时-约2天中进行，或在开始所述孵育后约1天-约3天中进行；或者，所述破坏在开始所述孵育后大于或等于约1小时时进行，在开始所述孵育后1天内、2天内、3天内或4天内进行。
在一些实施方式中，第二受体结合剂包含结合伴侣C1。在一些此类实施方式中，反应剂所包含的多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第二受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
在本文所提供的任何方法的一些实施方式中，第二信号是除TCR/CD3复合物相关信号以外的另一信号；第二信号能够增强或强化TCR/CD3复合物相关信号；或第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子或是TNF家族或TNF受体家族成员。在一些实施方式中，第二分子选自：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。在一些实施方式中，第二分子是CD28。
在一些实施方式中，第二分子是粘附分子或包含粘附分子，或是诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。在一些实施方式中，第二受体结合剂是特异性结合于选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。在一些实施方式中，第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。在一些实施方式中，第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述因子是核因子。在一些实施方式中，所述因子是视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
在一些实施方式中，所述破坏包括将组合物加入细胞，所述组合物包含能够逆转第二受体结合剂和反应剂之间的键的物质。在一些实施方式中，所述破坏终止或减弱由第二受体结合剂诱导或调节的信号。例如，在一些实施方式中，第二分子是CD28，该破坏在T细胞内终止或减弱CD28共刺激信号。
在一些方面中，孵育进一步在第三受体结合剂的存在下进行，该第三受体结合剂能特异性结合一个或多个T细胞表面上的第三分子。
在本文所提供的任何方法的一些实施方式中，第一受体结合剂特异性结合T细胞表面上表达的第一分子，其结合方式诱导或调节了T细胞中TCR/CD3复合物相关的信号；第二受体结合剂特异性结合第二分子，由此诱导或调节T细胞中的第二信号；且，第三受体结合剂特异性结合T细胞表面上的第三分子，该第三分子诱导或调节细胞中的其他信号。
在一些实施方式中，第一分子是CD3。
在一些实施方式中，第二信号增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号。在一些实施方式中，第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子，或是TNF家族或TNF受体家族成员。在一些实施方式中，第二分子选自：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。在一些实施方式中，第二分子是CD28。
在一些实施方式中，第三分子是细胞因子受体、趋化因子受体，或是粘附分子或包含粘附分子，或是诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。在一些实施方式中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。在一些实施方式中，第三受体结合剂是特异性结合于选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或，第三受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或，第三受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。在一些实施方式中，第三受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或，第三受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或，第三受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。在一些实施方式中，第三受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或，第三受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或，第三受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述因子是核因子。在一些实施方式中，所述因子是视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
在一些实施方式中，第三受体结合剂可逆结合第一反应剂或第二反应剂；或者，在可逆结合第三受体结合剂的其他反应剂的存在下进行孵育。
在本文所提供的任何方法的一些实施方式中，所述方法还包括，在所述破坏后进一步孵育包含T细胞的组合物。在一些实施方式中，孵育和进一步孵育在相同的容器中进行；和/或，进一步孵育在所述物质的存在下进行；和/或，所述方法在进一步孵育之前，不包括从细胞组合物中去除所述物质、受体结合剂、第二受体结合剂和/或反应剂。
在一些实施方式中，孵育和/或进一步孵育在37℃±2℃下进行，或在约37℃±2℃下进行；和/或，孵育和/或进一步孵育在能够将信号递送到T细胞的其他作用剂的存在下进行。在一些实施方式中，所述其他作用剂能够增强或诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖。在一些实施方式中，所述其他作用剂是选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。在一些实施方式中，进一步孵育的进行时间不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过8天或不超过6天。
本文提供了培养T细胞的方法，其包括：在特异性结合T细胞表面上CD28分子的受体结合剂的存在下，在影响细胞中通过CD28进行的信号转导的条件下，孵育包含T细胞的组合物；在开始所述孵育后的5天内，消除或减少受体结合剂和CD28分子的结合，从而终止或减弱细胞中的CD28信号转导，由此产生培养的T细胞。在一些实施方式中，所述消除或减弱在开始孵育后4天内、3天内、2天内或1天内进行。
在一些实施方式中，所述消除或减弱在开始孵育后4天内、3天内、2天内或1天内产生。在一些情况中，消除或减弱包括洗涤细胞，由此从组合物中去除或减少未特异性结合CD28的任何受体结合剂。在一些方面中，消除包括逆转受体结合剂和CD28分子间的结合相互作用，进一步包括洗涤细胞以去除或减少组合物中的受体结合剂。
在一些方面中，在孵育的至少部分期间和/或在孵育后，在特异性结合TCR/CD3复合物的分子的作用剂的存在下，孵育组合物中的T细胞，由此减弱或调节细胞中TCR/CD3复合物相关的信号。
本文在一些方面提供了一种培养T细胞的方法，其包括：在受体结合剂的存在下，孵育包含T细胞的组合物。在一些实施方式中，受体结合剂可逆结合包含能够可逆结合受体结合剂的多个结合位点的反应剂。在一些情况中，受体结合剂能够特异性结合目标细胞表面上除CD28、CD3或CD40以外的分子，其结合方式诱导或调节目标细胞中的信号和/或改变目标细胞的功能，由此产生培养的目标细胞。在一些实施方式中，所述分子不是CD137和/或所述受体结合剂不特异性结合CD137。
在一些方面中，孵育在一定条件下进行，在该条件下受体结合剂特异性结合于所述分子，由此诱导或调节T细胞中的信号。在一些实施方式中，所述信号不是TCR/CD3复合物相关信号。
在一些实施方式中，所述信号不是TCR/CD3复合物相关信号。
在一些实施方式中，受体结合剂包含结合伴侣C1。在一些此类实施方式中，反应剂的多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
在一些实施方式中，所述分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或，受体结合剂，特异性结合以下分子：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。
在一些实施方式中，受体结合剂是第二受体结合剂，所述分子是第二分子，在第一受体结合剂的存在下进行进一步孵育，所述第一受体结合剂能够特异性结合一个或多个T细胞表面上的第一分子，该第一分子可选地能够诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的第一信号。在一些实施方式中，第一受体结合剂可逆结合反应剂，所述反应剂包含针对第一受体结合剂和第二受体结合剂的多个结合位点；或者，第一受体结合剂可逆结合第二反应剂，所述第二反应剂包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点。
在一些实施方式中，第一受体结合剂能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号。在一些方面中，第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员。在一些情况中，第一受体结合剂特异性结合CD3。
在一些实施方式中，第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号。在一些情况中，第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强或强化TCR/CD3复合物相关的信号。
在本文的一些实施方式中，提供了一种培养T细胞的方法，所述方法包括在第一受体结合剂的存在下孵育包含T细胞的组合物，其中所述第一受体结合剂可逆结合反应剂，所述反应剂包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点。在一些情况中，第一受体结合剂能够特异性结合T细胞表面上的第一分子，以例如诱导或调节该组合物中T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。在一些实施方式中，所述方法包括在第二受体结合剂的存在下孵育包含T细胞的组合物，其中所述第二受体结合剂可以可逆结合进一步包含针对该第二受体结合剂的多个结合位点的反应剂，或可以可逆结合包含能够可逆结合该第二受体结合剂的多个结合位点的第二反应剂。在一些方面中，第二受体结合剂能够特异性结合T细胞表面上的第二分子，以例如诱导或调节该组合物中T细胞中的第二信号。在一些方面中，第二分子不同于CD28。在一些实施方式中，所述孵育在如下条件下进行：在所述条件下，信号和/或第二信号在组合物中的T细胞中被诱导或调节，由此产生培养的T细胞。
在一些实施方式中，第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员和/或第一受体结合剂特异性结合CD3。
在一些情况中，第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够诱导或调节除了TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号。在一些方面中，第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号。在一些实施方式中，第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强或强化TCR/CD3复合物相关的信号。
在一些实施方式中，所述分子(其可为第二分子)为：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137、(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在一些方面中，受体结合剂(其可为第二受体结合剂)特异性结合：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137、(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在一些实施方式中，所述分子(其可为第二分子)不是CD137，和/或所述受体结合剂(其可为第二受体结合剂)不特异性结合CD137。
在一些方面中，第一受体结合剂和第二受体结合剂可逆结合反应剂。在一些实施方式中，第一受体结合剂和第二受体结合剂各自独立地包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一和第二受体结合剂和反应剂之间的可逆键。在一些实施方式中，第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1和结合伴侣C2以形成第一和第二受体结合剂与反应剂之间的可逆键。在其他一些实施方式中，第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1以及两个或多个结合位点Z2，其中Z1各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一受体结合剂和反应剂之间的可逆键，Z2各自能够结合于结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。在一些实施方式中，受体结合剂是特异性结合于选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或，受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或，受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。在一些实施方式中，受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或，受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或，受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。在一些实施方式中，受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或，受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或，受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述因子是核因子。在一些实施方式中，所述因子是视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
在本文所提供任何方法的一些实施方式中，孵育在如下条件下进行：在所述条件下，受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节目标细胞中的信号和/或改变目标细胞中的功能。在一些实施方式中，受体结合剂包含结合伴侣C1，且多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂和反应剂之间的可逆键。在一些实施方式中，受体结合剂是额外的受体结合剂，所述分子是额外的分子，在第一受体结合剂的存在下进行进一步孵育，所述第一受体结合剂能够特异性结合一个或多个T细胞表面上的第一分子，该第一分子可选地能够诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的第一信号。
在一些实施方式中，第一受体结合剂可逆结合反应剂，所述反应剂包含针对该第一受体结合剂和额外受体结合剂的多个结合位点；或者，第一受体结合剂可逆结合第二反应剂，所述第二反应剂包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点。在一些实施方式中，第一受体结合剂能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关信号；和/或，第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或，第一受体结合剂特异性结合CD3。
在一些实施方式中，第一受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包含两个或多个结合位点Z2，它们各自能够结合于结合伴侣C2以形成第一受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
在一些实施方式中，在第二受体结合剂的存在下进行进一步孵育，所述第二受体结合剂能够可逆结合一个或多个T细胞表面上的第二分子，所述第二分子可选地能够诱导或调节组合物中的T细胞中的信号，从而增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
在一些实施方式中，第二信号是不同于TCR/CD3复合物相关信号的另一信号；第二信号能够增强或强化TCR/CD3复合物相关信号；或第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子或是TNF家族或TNF受体家族成员。在一些实施方式中，第二分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或，第二受体结合剂特异性结合CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在一些实施方式中，第二分子选自：CD28和CD137。在一些实施方式中，第二分子是CD28。
本文提供了培养目标细胞的方法，所述方法包括在受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物。受体接合作用剂可以可逆结合反应剂，该反应剂是包含能够与该受体结合剂可逆结合的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白。在一些情况中，受体结合剂能够特异性结合目标细胞表面上的分子，以例如诱导或调节该组合物中目标细胞中的信号。在一些方面中，突变链霉亲和素蛋白包含净负电荷或其等电点小于包含SEQ ID NO:4或6所示序列的突变链霉亲和素蛋白，由此产生培养的目标细胞。
在本文的一些方面中，提供了一种培养目标细胞的方法，所述方法包括在受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，其中所述受体结合剂可逆结合于反应剂，所述反应剂为包含能够可逆结合该受体结合剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白。在一些实施方式中，受体结合剂能够特异性结合目标细胞表面上的分子，其结合形式能够诱导或调节该组合物中目标细胞中的信号。在一些情况中，链霉亲和素类似物或突变蛋白对包含氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)的链霉亲和素结合肽的亲和力高于包含SEQ ID NO:1-6中任一所示氨基酸序列的链霉亲和素或突变蛋白，由此产生培养的目标细胞。
在一些实施方式中，孵育在如下条件下进行：在该条件下，受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节组合物中一个或多个目标细胞中的信号。
在一些情况中，反应剂的多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1。在一些情况中，受体接合剂包含结合伴侣C1，其能够可逆结合结合位点Z1，其中C1和Z1之间的可逆结合引起受体结合剂和反应剂之间的可逆结合。在一些实施方式中，链霉亲和素类似物或突变蛋白包含多个结合位点Z1，且多个受体结合剂可逆结合反应剂。
在一些实施方式中，目标细胞包括免疫细胞。例如，在一些实施方式中，目标细胞包括血细胞；目标细胞包括白细胞；目标细胞包括淋巴细胞；目标细胞包括B细胞；目标细胞包括B细胞群；目标细胞包括T细胞；目标细胞包括T细胞群；和/或目标细胞包括自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，目标细胞包含抗原特异性T细胞或其细胞群、辅助T细胞或其细胞群、细胞毒性T细胞或其细胞群、记忆T细胞或其细胞群、调节性T细胞或其细胞群、NK细胞或其细胞群、抗原特异性B细胞或其细胞群、记忆B细胞或其细胞群、调节性B细胞或其细胞群。在一些实施方式中，目标细胞是T细胞。
在一些实施方式中，所述分子递呈在T细胞表面上，且受体结合剂能够诱导或调节组合物中T细胞中的信号。在一些方面，受体结合剂能够引发T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号和/或受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员。在一些情况中，受体结合剂特异性结合CD3。在一些情况中，该分子是第一分子，且受体结合剂能够特异性结合该第一分子以及(在一些情况下)一个或多个目标细胞表面上的第二分子。在一些实施方式中，第二分子的结合能够增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
在一些实施方式中，该分子是第一分子，且受体结合剂能够特异性结合一个或多个目标细胞表面上的第二分子以及该第一分子，其中与第二分子的结合诱导或调节目标细胞中的信号。在一些实施方式中，第二分子的结合可选地能够增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
受体结合剂是第一受体结合剂，且在第二受体结合剂的存在下进行进一步孵育。第二受体结合剂可能够特异性结合一个或多个目标细胞表面上的第二分子。在一些情况中，第二受体结合剂与第二分子的结合诱导或调节T细胞中的第二信号，以例如提高、抑制或改良通过第一分子递送的信号。
在一些实施方式中，孵育在如下条件下进行：在该条件下，第二受体结合剂特异性结合第二分子，由此诱导或调节组合物中目标细胞中的信号，从而增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白或类似物包括能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点，由此该第二受体结合剂可逆结合该链霉亲和素突变蛋白或类似物。
在一些实施方式中，第二受体结合剂包括结合伴侣C1或C2，其能够可逆结合链霉亲和素类似物或突变蛋白中存在的两个或更多个结合位点Z2。
在一些情况中，额外的分子为：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在一些方面中，额外的分子为CD40或CD137。在一些情况中，第二受体结合剂特异性结合CD40或CD137。
在一些实施方式中，第二分子是粘附分子或包含粘附分子，或是诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。在一些实施方式中，第二受体结合剂是特异性结合于选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。在一些实施方式中，第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。在一些实施方式中，第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述因子是核因子。在一些实施方式中，所述因子是视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
第二受体结合剂包括多种不同的受体结合剂，其各自能够独立地结合组合物中T细胞表面上相同或不同的第二分子，从而共同诱导或调节细胞中的一个或多个信号。
在一些实施方式中，所述方法还包括破坏第一和/或第二受体结合剂和反应剂之间的可逆结合。在一些方面中，该破坏在开始孵育后14天内发生，在开始孵育后12天内发生，在开始孵育后10天内发生，在开始孵育后8天内发生，或在开始孵育后6天内发生。
在一些实施方式中，至少一部分孵育在能够将信号递送到T细胞的其他作用剂的存在下进行。在一些情况中，所述其他作用剂能够增强或诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖。在一些实施方式中，所述其他作用剂是细胞因子，例如IL-2、IL-15或IL-7。在一些情况中，所述其他作用剂不特异性结合CD28和/或诱导CD28信号转导。
在一些实施方式中，T细胞或目标细胞为来自对象的原代细胞。在一些情况中，T细胞或目标细胞直接分离自对象。在一些实施方式中，T细胞为未分级分离的T细胞、富含CD3+T细胞或为分离的CD3+T细胞、富含CD4+T细胞或为分离的CD4+T细胞、或者富含CD8+T细胞或为分离的CD8+T细胞。在一些实施方式中，在孵育前，T细胞不富含CD62L+细胞和/或不富含初始T细胞。在一些情况中，T细胞或目标细胞是人细胞。
在一些方面中，反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm。在一些情况中，反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
在一些实施方式中，在孵育期间，反应剂不是固体支持物、固定相、珠、微粒、磁性颗粒和/或基质，也不与固体支持物、固定相、珠、微粒、磁性颗粒和/或基质结合或联合；和/或，反应剂是柔性的，不含金属或磁性核心，完全或主要由有机多聚体组成，不为球形，基本上不为球形或形状不均一，和/或不坚硬。
在一些实施方式中，在孵育过程中，反应剂不结合支持物或固体支持物。在一些实施方式中，在孵育的至少部分过程中，反应剂结合于支持物，由此在孵育的至少部分过程中多个T细胞或目标细胞可逆固定在支持物上。在一些实施方式中，支持物为固定相或包含固定相；和/或支持物是固体支持物或包含固体支持物。
在一些实施方式中，受体结合剂(其可为第一受体结合剂)仅包含一个结合位点，例如B2。在一些方面中，受体结合剂(其可为第一受体结合剂)以单价方式特异性结合于该分子。在一些实施方式中，第二受体结合剂仅包含一个结合位点，例如B4。在一些情况中，第二受体结合剂以单价方式特异性结合于该分子。在一些实施方式中，结合位点(例如B2或B4)包含抗体结合位点(antibody combining site)。
在一些方面中，受体结合剂(其可为第一受体结合剂)和/或第二受体结合剂各自独立地为抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子(proteinaceous binding molecule)、包含Ig结构域的分子、细胞因子、趋化因子、适体、或MHC分子、或其结合片段。在一些此类方面中，受体结合剂(其可为第一受体结合剂)和/或第二受体结合剂包括抗体片段、Fab片段、二价抗体片段，例如F(ab’)2片段)或二价单链Fv(scFV)片段。在一些情况中，受体结合剂(其可为第一受体结合剂)和/或第二受体结合剂是单价抗体片段，例如Fab片段，Fv片段或scFV片段。在一些情况中，受体结合剂(其可为第一受体结合剂)和/或第二受体结合剂为具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子，例如适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体(glubody)、基于锚定蛋白主链的蛋白质、基于晶体主链的蛋白质、埃德连接蛋白(adnectin)或阿维多聚体(avimer)。
在一些实施方式中，受体结合剂(其可为第一受体结合剂)包括特异性结合CD3的作用剂。特异性结合CD3的作用剂可为抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD3结合分子。在一些实施方式中，第二受体结合剂包括特异性结合如下物质的作用剂：CD28、CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40和/或HVEM。所述作用剂特异性结合于CD28、CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40和/或HVEM，其可为：抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD28结合分子、抗CD90抗体、抗CD90抗体的二价抗体片段、抗CD90抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD90结合分子、抗CD95抗体、抗CD95抗体的二价抗体片段、抗CD95抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD95结合分子、抗CD154抗体、抗CD154抗体的二价抗体片段、抗CD154抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD154结合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD137结合分子、抗ICOS抗体、抗ICOS抗体的二价抗体片段、抗ICOS抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类ICOS结合分子、抗LAT抗体、抗LAT抗体的二价抗体片段、抗LAT抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类LAT结合分子、抗CD27抗体、抗CD27抗体的二价抗体片段、抗CD27抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD27结合分子、抗OX40抗体、抗OX40抗体的二价抗体片段、抗OX40抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类OX40结合分子、抗HVEM抗体、抗HVEM抗体的二价抗体片段、抗HVEM抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类HVEM结合分子、4-1BB配体、或其任何混合物。
在本文提供的任何方法的一些实施方式中，受体结合剂包含抗体片段；受体结合剂包含Fab片段；受体结合剂为选自下组的二价抗体片段：F(ab’)2片段和二价单链Fv(scFv)片段；受体结合剂为选自下组的单价抗体片段：Fab片段、Fv片段和scFv片段；和/或受体结合剂为选自下组的具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子：适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚定蛋白主链的蛋白质、基于晶体主链的蛋白质、埃德连接蛋白或阿维多聚体。
在本文提供的任何方法的一些实施方式中，反应剂为或包含：链霉亲和素，亲和素，可逆结合生物素、生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合链霉亲和素结合肽的亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的作用剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S-转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。
在一些实施方式中，反应剂为或包含：可逆结合生物素的链霉亲和素类似物或突变蛋白、或亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白、或亲和素类似物或突变蛋白；和/或，可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素类似物或突变蛋白、或亲和素类似物或突变蛋白。
在一些实施方式中，反应剂为：可逆结合生物素或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白、亲和素、链霉亲和素的寡聚物或多聚体；可逆结合链霉亲和素结合肽的亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的反应剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S-转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。在一些实施方式中，反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚物或聚合物。在一些方面中，寡聚物或多聚体中的个体分子通过多糖或二官能性接头交联。
在一些实施方式中，多个结合位点Z包括至少2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、72或更多个结合位点。
在一些方面中，链霉亲和素结合肽是Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)或Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
在一些实施方式中，反应剂包括链霉亲和素类似物或突变蛋白，其在对应于SEQID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。在一些实施方式中，链霉亲和素类似物或突变蛋白在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47。
在一些实施方式中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白具有SEQ ID NO：3-6中任一项所示的氨基酸序列。在一些方面中，链霉亲和素类似物或突变蛋白包括氨基酸序列与SEQ ID NO:3-6中任一项显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性，且包含对应于Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47的氨基酸序列。在一些实施方式中，链霉亲和素类似物或突变蛋白可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。在一些实施方式中，链霉亲和素类似物或突变蛋白结合如上所述任何序列的功能性片段，所述功能性片段可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。
在一些实施方式中，链霉亲和素类似物或突变蛋白在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素位置的第117、120和121位处还包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所示氨基酸取代选自：Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸取代为Glu117、Gly120或Tyr121。
在一些实施方式中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含SEQ ID NO：27或28所示的氨基酸序列。在一些方面中，链霉亲和素类似物或突变蛋白包含与SEQ ID NO:28显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列，且包含对应于Va144、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121的氨基酸序列。在一些实施方式中，链霉亲和素类似物或突变蛋白可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段、或链霉亲和素结合肽。在一些实施方式中，链霉亲和素类似物或突变蛋白可逆结合如上所述任何序列的功能性片段，所述功能性片段可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段、或链霉亲和素结合肽。
在一些方面中，结合伴侣C1和/或结合伴侣C2独立地包括链霉亲和素结合肽，例如Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:18)或Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
在一些实施方式中，所述破坏包括：将组合物加入细胞，该组合物含有能逆转受体结合剂(其可为第一受体结合剂)和/或第二受体结合剂与反应剂之间的键的物质。在一些实施方式中，所述物质是游离结合伴侣和/或为竞争剂。在一些实施方式中，所述物质在组合物中对T细胞或对目标细胞无害。在一些方面中，与在可比或相同条件下不含该物质分别孵育T细胞或目标细胞相比，加入该物质并未将存活T细胞或目标细胞的百分比降低到小于90％、80％、70％、60％或50％。在一些实施方式中，该破坏终止或减少T细胞或目标细胞中由受体结合剂或第二受体结合剂中一者或两者诱导或调节的信号。
在一些实施方式中，反应剂为或包含链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或亲和素类似物或突变蛋白、或其生物活性片段。在一些实施方式中，所述物质包含链霉亲和素结合肽、生物素或其生物活性片段、可选地D-生物素、或生物素类似物或生物活性片段。
在一些实施方式中，所述物质是链霉亲和素结合肽，例如：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)或Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。在一些实施方式中，所述物质为C1或其类似物，或者为C2或其类似物。
在一些实施方式中，结合位点Z1和结合伴侣C1之间可逆结合的解离常数(KD)和/或结合位点Z2和结合伴侣C2之间可逆结合的解离常数(KD)为10-2M～10-13M。
在一些实施方式中，在孵育前，细胞与特异性结合组合物中T细胞或目标细胞所含标志物的选择剂接触，从而产生或获得含有T细胞或目标细胞的组合物。在一些实施方式中，至少部分孵育在选择剂的存在下进行，所述选择剂特异性结合组合物中T细胞或目标细胞所含标志物，培养的T细胞富集了含有该标志物的T细胞或目标细胞。
在一些实施方式中，选择剂可逆结合反应剂，且反应剂还包含能够特异性结合该选择剂的多个结合位点。在一些方面中，选择剂可逆结合第二反应剂，该第二反应剂包含能够特异性结合该选择剂的多个结合位点。
在一些实施方式中，与没有信号的诱导或调节下的T细胞孵育相比，该信号的诱导或调节使得培养T细胞的扩增(繁殖)和/或活化增加。在一些实施方式中，所述增加是至少2倍、3倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍或更多。在一些实施方式中，与没有额外信号或第二信号的诱导或调节下的T细胞孵育相比，额外信号或第二信号的诱导或调节使得培养T细胞的扩增(繁殖)和/或活化增加。在一些实施方式中，所述增加是至少2倍、3倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍或更多。
在一些实施方式中，各自与孵育前组合物中的T细胞相比、与孵育后但未进行破坏或孵育后但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下的组合物中的T细胞相比，所述方法增加组合物中T细胞的扩增和/或增殖，改变组合物中T细胞的代谢谱，改变组合物中CD8+T细胞的亚组；和/或，增加组合物中长寿记忆T细胞。
在一些实施方式中，与孵育前、孵育后但未进行破坏或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下进行孵育后的组合物中的CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞相比，所述方法获得的培养T细胞中CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞的数量或百分比提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方式中，与孵育前、孵育后但未进行破坏或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下进行孵育后的组合物中的CD8+细胞比例或相对比例或标准化比例相比，所述方法获得的培养T细胞中CD8+T细胞的比例或相对比例或标准化比例提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方式中，与孵育前、孵育后但未进行破坏或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下进行孵育后的组合物中的相应细胞群体(CD62L+、长寿记忆T细胞或记忆干细胞(Tscm))的数量或百分比相比，所述方法获得组合物中的培养T细胞的CD62L+、可选的长寿记忆T细胞或记忆干细胞的数量或百分比提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一些实施方式中，培养T细胞包含多于35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％含CD62L表面阳性表型(CD62L+)的T细胞亚组，以占组合物中总T细胞或占组合物中总细胞的百分比计。
在一些实施方式中，T细胞亚组还包括如下表型：包括CD127+的表型；和/或CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+，以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的任何一种或多种。
在一些实施方式中，T细胞亚组包括低水平的TCR重排删除环(TREC)；和/或表达增殖标志物，该标志物可为Ki-67；和/或，在刺激剂的存在下具有增殖能力；和/或在刺激剂的存在下具有产生细胞因子(例如IFN-γ、TNF或IL-2)的能力。
在一些实施方式中，刺激剂是抗原、稳态细胞因子，例如IL-15和/或IL-17，或者是能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关信号的作用剂。
在一些实施方式中，T细胞亚组为长寿记忆T细胞，或包含长寿记忆T细胞。在一些实施方式中，T细胞亚组为T记忆干细胞(Tscm)，或包含T记忆干细胞。
在一些实施方式中，所述方法还包括将重组核酸分子导入细胞群的T细胞或目标细胞。在一些此类方面中，核酸分子可编码重组蛋白，由此细胞表达该重组蛋白。在一些实施方式中，重组受体是嵌合抗原受体或转基因T细胞受体(TCR)。在一些方面中，该方法离体或在体外进行。
在一些实施方式中，该方法还包括将培养的细胞给予患有疾病或具有症状的对象。
在本文的一些方面中，提供了一种组合物，其包含通过本文所提供的方法生产的多个培养T细胞或目标细胞，以及可选的药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方式中，加入所述物质后，细胞未在体外或离体于高于30℃的温度下孵育超过24小时、超过48小时、超过72小时或超过96小时。
本文还提供了一种制品，其包含：a)一种反应剂，其包含能够结合受体结合剂的多个结合位点；b)受体结合剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能够以诱导后调节T细胞中信号的方式特异性结合T细胞表面上的分子。在一些实施方式中，该分子不为CD28、CD3或CD40。
在一些实施方式中，结合该分子诱导或调节T细胞中除了TCR/CD3复合物相关信号以外的信号；和/或结合该分子增强或加强TCR/CD3复合物相关信号。在一些实施方式中，该分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。在一些实施方式中，该分子不是CD137。
在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合细胞因子受体、特异性结合趋化因子受体，或为粘附分子或包含粘附分子，或为诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。在一些实施方式中，受体结合剂是特异性结合于选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或，受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或者，受体结合剂是选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。在一些实施方式中，第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或，第二受体结合剂是选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。在一些实施方式中，受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或，受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或，受体结合剂是选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。在一些实施方式中，粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
在一些实施方式中，所述因子是核因子。在一些实施方式中，所述因子是视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
本文提供了培养目标细胞的方法，其包括在一种或多种受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，其中所述受体结合剂可逆结合反应剂，所述反应剂为包含能够结合作用剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白。在一些方面，链霉亲和素类似物或突变蛋白包含净负电荷、或所具有的等电点小于包含SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列的链霉亲和素突变蛋白、和/或对包含Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)氨基酸序列的链霉亲和素结合肽的亲和力高于包含如SEQ ID NO:1-6中任一所示氨基酸序列的链霉亲和素或突变蛋白。在一些实施方式中，所述作用剂可逆结合反应剂，且能特异性结合细胞表面上的分子。
在一些实施方式中，受体结合剂包括结合伴侣C1。在一些实施方式中，多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂或作用剂与反应剂之间的可逆键。
在一些实施方式中，所述作用剂是选择剂或受体结合剂。
在一些实施方式中，所述作用剂是特异性结合如下分子的受体结合剂：所述分子为或包含TCR/CD3复合物成员、CD3、共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子，或为TNF家族或TNF受体家族成员，或者所述分子为或包含粘附分子，或者为诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
在一些实施方式中，受体结合剂是第二受体结合剂，所述分子为第二分子，且所述反应剂还包含：c)能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点；和d)第一受体结合剂，其i)可逆结合该反应剂，且ii)能够特异性结合T细胞表面上的第一分子。
在一些实施方式中，该作用剂或第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员和/或第一受体结合剂特异性结合CD3。
在一些实施方式中，第一受体结合剂和第二受体结合剂各自独立地包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一和第二受体结合剂和反应剂之间的可逆键。在一些实施方式中，第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1和结合伴侣C2以形成第一和第二受体结合剂和反应剂之间的可逆键。在一些实施方式中，第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1以及两个或多个结合位点Z2，其中Z1各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一受体结合剂和反应剂之间的可逆键，Z2各自能够结合于结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
在一些实施方式中，反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm。在一些实施方式中，反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。在一些实施方式中，反应剂不结合支持物或固体支持物。在一些情况中，反应剂结合或固定于支持物。在一些情况中，支持物为固体支持物或为固定相。在一些方面中，支持物包括珠、颗粒、纳米颗粒或微球。
在一些实施方式中，作用剂单独选自抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子、包含Ig结构域的分子，及其结合片段。
在一些实施方式中，该作用剂、受体结合剂(其可为第二受体结合剂)和/或第一受体结合剂包含抗体片段。在一些方面中，该作用剂、受体结合剂(其可为第二受体结合剂)和/或第一受体结合剂)包含Fab片段。在一些情况中，作用剂，受体结合剂(其可为第二受体结合剂)和/或第一受体结合剂是二价抗体片段(例如F(ab’)2片段)或二价单链Fv(scFV)片段。在一些实施方式中，作用剂，受体结合剂(其可为第二受体结合剂)和/或第一受体结合剂是单价抗体片段，其选自Fab片段、Fv片段或scFV片段。
在一些实施方式中，作用剂或第一受体结合剂包括特异性结合CD3的作用剂。在一些实施方式中，特异性结合CD3的作用剂为抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD3结合分子。在一些实施方式中，作用剂或受体结合剂(其可为第二受体结合剂)包括特异性结合于CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40和/或HVEM的作用剂，例如：抗CD90抗体、抗CD90抗体的二价抗体片段、抗CD90抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD90结合分子、抗CD95抗体、抗CD95抗体的二价抗体片段、抗CD95抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD95结合分子、抗CD154抗体、抗CD154抗体的二价抗体片段、抗CD154抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD154结合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD137结合分子、抗ICOS抗体、抗ICOS抗体的二价抗体片段、抗ICOS抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类ICOS结合分子、抗LAT抗体、抗LAT抗体的二价抗体片段、抗LAT抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类LAT结合分子、抗CD27抗体、抗CD27抗体的二价抗体片段、抗CD27抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD27结合分子、抗OX40抗体、抗OX40抗体的二价抗体片段、抗OX40抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质性OX40结合分子、抗HVEM抗体、抗HVEM抗体的二价抗体片段、抗HVEM抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类HVEM结合分子、或其任何混合物。
在一些实施方式中，反应剂为或包含：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、和/或亲和素类似物或突变蛋白。在一些实施方式中，反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚物或聚合物。
本文的一些方面中提供了一种试剂盒，其包含本文所描述的反应剂以及可选的使用说明。在一些实施方式中，试剂盒包含能够逆转受体结合剂和反应剂之间键的物质。在一些实施方式中，试剂盒包含反应剂，该反应剂包含能够可逆结合受体结合剂的多个结合位点。在一些方面中，受体结合剂可逆结合反应剂，且能特异性结合目标细胞表面上表达的分子。在一些情况中，结合该分子诱导或调节目标细胞中的信号。在一些情况中，试剂盒包含能够逆转受体结合剂和反应剂之间键的物质。
在一些实施方式中，目标细胞是T细胞。在一些实施方式中，反应剂为或包含：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、和/或亲和素类似物或突变蛋白。在一些实施方式中，反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚物或聚合物。
在一些实施方式中，所述物质包含链霉亲和素结合肽、生物素或其生物活性片段、可选地D-生物素、或生物素类似物或生物活性片段。
在一些实施方式中，反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm。在一些实施方式中，反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。在一些实施方式中，反应剂不结合支持物或固体支持物。
在本文的一些方面中提供了一种组合物，其包含经基因工程化以表达重组受体的多个T细胞，该重组受体特异性结合目标抗原。在一些情况中，以占组合物中总T细胞或占组合物中总细胞的百分比计，大于35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞包括包含如下表型的T细胞亚组：CD3+、CD4+或CD8+和CD62L+，以及CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的一种或多种，以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的一种或多种。在一些实施方式中，在基因工程化之前或过程中，包含T细胞亚组的多个T细胞未在GSK-P抑制剂的存在下孵育；未在重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15的存在下孵育；或未富集CD62L+细胞。在一些实施方式中，组合物不含GSK-P抑制剂或重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15。
在一些实施方式中，T细胞亚组包含至少5×106、至少1×106或至少2×106个细胞。
在本文的一些方面中提供了一种组合物，其包含经基因工程化以表达重组受体的多个T细胞，该重组受体特异性结合目标抗原。在一些方面中，基因工程化T细胞源自转导含T细胞亚组的T细胞群，该T细胞亚组包含如下表面表型：CD3+、CD4+或CD8+和CD62L+，以及CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的一种或多种，以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的一种或多种。在一些实施方式中，与包含分离或富集自人对象(基于表型包含的一种或多种标志物的表面表达)的原代T细胞的细胞群相比，所述T细胞亚组以占细胞群中总T细胞更高的百分比存在或以占细胞群中总T细胞更多的数量存在。在一些实施方式中，与GSK-P抑制剂存在下孵育的T细胞群相比，所述T细胞亚组以占细胞群中总T细胞更高的百分比存在或以占细胞群中总T细胞更多的数量存在。在一些实施方式中，与重组稳态细胞因子(可选地IL-7或IL-15)存在下孵育的T细胞群相比，所述T细胞亚组以占细胞群中总T细胞更高的百分比存在或以占细胞群中总T细胞更多的数量存在。在一些实施方式中，与用抗CD3和抗CD8刺激但刺激或活化不大于1天、2天、3天、4天或5天和/或该刺激在生物素或生物素类似物存在下不被破坏的T细胞群相比，所述T细胞亚组以占细胞群中总T细胞更高的百分比存在或以占细胞群中总T细胞更多的数量存在。
在一些实施方式中，T细胞亚组以占细胞群中总T细胞等于或约大于35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的百分比存在。在一些实施方式中，T细胞亚组包含至少5×106个细胞、至少1×106个细胞、至少2×106个细胞或更多个细胞。
在一些实施方式中，组合物是药物组合物。
本文一些方面中提供了一种治疗方法，其包括给予患病或有症状的对象本文所述的组合物，即药物组合物。
在一些实施方式中，细胞包含重组受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或TCR。在一些方面中，重组受体(例如CAR或转基因TCR)特异性结合与疾病或症状有关的抗原。
在一些实施方式中，疾病或症状是癌症以及自身免疫性疾病或异常，或为感染性疾病。
附图说明
图1(A-E)提供了示例性实施方式的示意图。
图1A显示含有用于可逆结合于作用剂的多个结合位点的反应剂(或其代表性部分)的示意图。在此情况下，反应剂示为能够可逆结合两个作用剂，这两个作用剂各自能够特异性结合细胞上的分子。该反应剂具有多个结合位点(包括多个结合位点Z1)，它们各自能够可逆结合于作用剂。第一和第二作用剂(在有些情况下可相同)在示意图中显示为各自包含至少一个结合伴侣C1。结合伴侣C1可逆结合结合位点Z1。第一和第二作用剂各自还含有结合位点B2，B2能特异性结合细胞表面上的分子，在有些情况下，所述分子可在同一细胞上。在此，第一和第二作用剂示为特异性结合于同一细胞上的分子。
图1B显示含有能够可逆结合于第一和第二作用剂的多个结合位点的反应剂的示意图，其中第一和第二作用剂各自能够分别特异性结合第一和第二细胞上的分子。反应剂具有多个结合位点Z1，其各自能够可逆结合于作用剂。第一和第二作用剂(在有些情况下可相同)各自包含结合伴侣C1，其可逆结合于结合位点Z1。第一和第二作用剂各自含有结合位点B2，B2能特异性结合细胞表面上的分子，在有些情况下，所述分子可在同一细胞上或在不同细胞上。在此，第一作用剂结合第一细胞表面上的分子，第二作用剂结合第二细胞表面上的分子。
图1C显示能够可逆结合第一和第二作用剂的反应剂，所述作用剂各自能够分别特异性结合第一和第二细胞上的分子。反应剂含有多个结合位点Z1和Z2，其可相同或不同，它们各自能够可逆结合所述作用剂中的一种或两种。第一作用剂包含可逆结合Z1的结合伴侣C1；第二作用剂包含能可逆结合Z2的结合伴侣C2。在一些情况中，C1和C2不同。在一些情况中，C1和C2相同或基本上相同。第一作用剂包含结合位点B1，B1能特异性结合细胞表面上的分子，第二作用剂包含至少一个结合位点B3，B3能特异性结合细胞表面上的分子。在一些情况中，结合位点B1和B3结合两种不同细胞表面分子、或同一分子上的不同表位、或不同细胞表面上的相同或不同分子。在此，第一作用剂显示为通过B1结合第一细胞表面上的分子，第二作用剂通过B3结合第二细胞表面上的分子。
图1D显示能够可逆结合第一和第二作用剂(例如选择剂)的反应剂，所述作用剂各自能够特异性结合细胞上的分子。反应剂具有多个结合位点(包括Z1和Z2)，其可相同或不同，它们各自能够可逆结合于作用剂。第一作用剂包含能特异性结合于结合位点Z1的结合伴侣C1，第二作用剂包含能特异性结合于结合位点Z2的结合伴侣C2。在一些情况中，C1和C2不同。在一些情况中，C1和C2相同或基本上相同。第一作用剂包含能特异性结合细胞表面上分子的结合位点B1，第二作用剂包含能特异性结合细胞表面上分子的结合位点B3。在一些实施方式中，第一作用剂和第二作用剂可为选择剂。结合位点B1和B3能结合细胞表面上的相同或不同分子(例如受体)、同一分子上的相同或不同表位、或不同细胞表面上的相同或不同分子在此，第一作用剂结合细胞表面上的第一分子，第二作用剂结合同一细胞表面上的第二分子。
图1E显示可逆结合第一和第二作用剂的反应剂，所述作用剂各自能够特异性结合细胞上的分子。反应剂具有多个结合位点(包括Z1和Z2)，其可相同或不同，它们各自能够可逆结合于作用剂。第一作用剂包含能够可逆结合反应剂的Z1的结合伴侣C1，第二作用剂包含能够可逆结合Z2的结合伴侣C2。在一些情况中，C1和C2不同。在一些情况中，C1和C2相同或基本上相同。第一作用剂包含能特异性结合细胞表面上分子的至少一个结合位点B2，第二作用剂包含能特异性结合细胞表面上分子的至少一个结合位点B4。在一些实施方式中，第一作用剂和第二作用剂可为刺激剂。结合位点B2和B4能结合细胞表面上的相同或不同分子、分子上的相同或不同表位、或不同细胞表面上的相同或不同分子。在此，第一作用剂结合细胞表面上的第一分子，第二作用剂结合同一细胞表面上的第二分子。
图2(A-E)包括图2A～图2E，分别提供了图1A-1E中所示示例性实施方式的示意图，不同处在于所描绘的反应剂示为固定在支持物(例如固相)上。
图3提供了示例性实施方式的示意图，其中将寡聚反应剂用于使刺激剂多聚化，将所得复合物与细胞一起孵育以将信号递送给细胞，然后逆转结合。图A显示寡聚反应剂1，其示为未结合于任何支持物且为柔性。此处显示为Fab片段且能够特异性结合细胞表面上分子的刺激剂2结合反应剂。该作用剂包含能够可逆结合于反应剂上结合位点(例如结合位点Z)的结合伴侣(例如结合伴侣C)，使得作用剂多聚化。图B描绘了结合伴侣可逆结合反应剂上的结合位点。将细胞3加入系统中。图C描绘了多聚的作用剂(Fab片段)特异性结合细胞3上的分子4。在图C中，所绘作用剂是刺激性受体结合剂(例如第一受体结合剂和/或第二受体结合剂)，当作用剂结合细胞上的分子时，它们能诱导或调节细胞中的信号。如图D所示，将物质5(例如竞争性反应剂，如生物素)加入组合物，其可为对反应剂上的结合位点比所述作用剂上的结合伴侣具有更高结合亲和力的物质，由此破坏反应剂1和作用剂2之间的可逆结合。在一些情况中，所述作用剂(例如Fab片段)还能从其与细胞3上分子4的相互作用中解离。在一些情况中，这能破坏、减弱和/或终止细胞中的信号转导。
图4提供了可逆系统连接于支持物(例如固体支持物或表面，包括固相)的示例性实施方式的示意图。图A显示了包含反应剂1的支持物6。将能够特异性结合细胞表面上分子的作用剂2(例如Fab片段)加入该系统。作用剂2(例如Fab片段)包含能够可逆结合于反应剂上结合位点(例如结合位点Z)的结合伴侣(例如结合伴侣C)。图B描绘了结合伴侣可逆结合反应剂上的结合位点。将细胞3加入系统中。图C描绘了作用剂2(例如，Fab片段)结合细胞3表面上的分子4。在一些实施方式中，scFv包括受体结合剂或选择剂。在一些实施方式中，所述作用剂(例如Fab片段)可为受体结合剂或选择剂。在图C描绘了示例性一种或多种受体结合剂(例如第一受体结合剂和/或第二受体结合剂)，当作用剂(例如Fab片段)结合细胞上的分子时，它们能诱导或调节细胞中的信号。加入物质5(例如竞争性反应剂，如生物素)，其可为对反应剂上的结合位点比对所述作用剂(例如Fab片段)上的结合伴侣具有更高结合亲和力的物质，由此破坏反应剂和作用剂之间的可逆结合。图D描绘了作用剂2(例如Fab片段)和反应剂之间结合的破坏，由此使得反应剂从所述作用剂解离，从而从细胞解离。在一些情况中，所述作用剂(例如Fab片段)还能从其与细胞3上分子4的相互作用中解离。在一些情况中，这能破坏、减弱和/或终止细胞中的信号转导。
图5(A-C)显示在T细胞扩增中加入D-生物素然后用抗CD3/抗CD28 Fab刺激T细胞的时间效果(temporal effect)，所述抗CD3/抗CD28 Fab可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂。图5A是试验条件和时间线的示意图，其包括D-生物素的加入时间点和细胞培养过程中更换培养基的时间点。图5B显示在所示条件下刺激后CD3+、CD4+和CD8+细胞的总细胞计数(扩增程度)，所述条件包括加入D-生物素的不同时间点。为了对比，水平虚线表示在阳性对照(抗CD3/抗CD28珠)中扩增的CD3+、CD4+和CD8+细胞数。图5C显示对未刺激对照标准化时CD4+和CD8+细胞扩增倍数。
图6(A-F)显示用可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂的抗CD3/抗CD28Fab短时活化的CD3+ T细胞获得的特征，其中在开始刺激一天后加入D-生物素。图6A是试验条件和时间线的示意图，其包括D-生物素的加入时间点和细胞培养过程中更换培养基的时间点。图6B显示在所示条件下第7天时，培养物中的细胞计数(扩增程度)。水平虚线代表在抗-CD3/抗-CD28珠阳性对照中不加入D-生物素情况下扩增的细胞数。图6C显示图6B的培养物中CD4+和CD8+细胞的比例。水平虚线代表在阳性对照中不加入D-生物素情况下CD4+和CD8+细胞的级分。图6D显示基于未刺激对照中CD4+或CD8+细胞数标准化的CD4+或CD8+细胞数。水平虚线代表在抗-CD3/抗-CD28珠阳性对照中不加入D-生物素情况下扩增的CD4+或CD8+细胞数。图6E显示了在所示条件下第7天的培养物中CD4+和CD8+ T细胞群的CD62L和CD127表面表达流式细胞分析。图6F显示了在所示条件下第7天的培养物中CD4+和CD8+ T细胞群的Ki-67和T-bet表达流式细胞分析。ST-MM是抗CD3/抗CD28 Fab多聚化的链霉亲和素突变蛋白作用剂。
图7(A-C)显示用可逆结合于寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂的抗CD3/抗CD28Fab短时活化的CD8+T细胞获得的特征，其中在开始刺激一天后加入D-生物素，所用试验条件和时间线同图6A。图7A显示在所示条件下第7天时，培养物中的CD8+细胞计数(扩增程度)。水平虚线代表在抗-CD3/抗-CD28珠阳性对照中不加入D-生物素情况下扩增的细胞数。图7B显示在所示条件下第7天时，培养物中的CD62L和CD127表面表达的流式细胞分析。图7C显示在所示条件下第7天时，培养物中的Ki-67和T-bet表达的流式细胞分析。ST-MM是抗CD3/抗CD28 Fab多聚化的链霉亲和素突变蛋白作用剂。
图8(A-F)显示用可逆结合抗CD3 Fab和各种共刺激分子的寡聚链霉亲和素反应剂突变蛋白刺激的CD3+T细胞获得的特征。图8A显示在所示条件下第6天时，培养物中的细胞计数(扩增程度)。水平虚线代表在阳性对照(抗-CD3/抗-CD28珠)中扩增的细胞数。图8B显示在所示条件下第6天时培养物中的CD4+或CD8+细胞数，该细胞数基于未刺激对照标准化。如水平虚线所指，将阳性对照(抗CD3/抗CD28珠)中扩增的所得CD4+或CD8+细胞数设定为100％。图8C和8D显示在所示条件下第6天时，CD3+细胞培养物中CD62L+/CD4+(图8C)或CD62L+/CD8+(图8D)的标准化数量。如水平虚线所指，将阳性对照(抗CD3/抗CD28珠)中扩增的所得CD62L+/CD4+或CD62L+/CD8+细胞数设定为100％。图8E和图8F描绘了在所示条件下培养6天的示例性CD3+细胞内，CD4+(图8E)或CD8+(图8F)细胞中CD62L和CD69表面表达或CD45RO和CD45RA表面表达的流式细胞分析。
图9(A-D)显示用分别可逆结合抗CD3和抗CD28的寡聚链霉亲和素突变蛋白(ST-MM A)反应剂或寡聚链霉亲和素突变蛋白(/>XT；ST-MM B)反应剂刺激CD3+T细胞所得的特征。图9A显示在所示条件下第5天时，培养物中的细胞计数(扩增程度)。水平虚线代表在阳性对照(抗-CD3/抗-CD28珠)中扩增的细胞数。图6C显示图9A的培养物中CD4+和CD8+细胞的比例。水平虚线代表在阳性对照(抗-CD3/抗-CD28珠)中的CD4+和CD8+细胞级分。图9C显示基于未刺激对照中CD4+或CD8+细胞数标准化的CD4+或CD8+细胞数。水平虚线代表在抗-CD3/抗-CD28珠阳性对照中扩增的CD4+或CD8+细胞数。图9D显示在所示条件下第5天时，培养物中的CD62L和CD69表面表达的流式细胞分析。
图10(A-B)显示用分别可逆结合抗CD3和抗CD28的寡聚链霉亲和素突变蛋白(ST-MM A)反应剂或寡聚链霉亲和素突变蛋白(/>XT；ST-MM B)反应剂刺激CD8+T细胞所得的特征。图10A显示在所示条件下第6天时，培养物中的细胞计数(扩增程度)。水平虚线代表在阳性对照(抗-CD3/抗-CD28珠)中扩增的细胞数。图10B显示在所示条件下第6天时，培养物中的CD62L、CD69和CD8表面表达的流式细胞分析。
图11(A-C)显示了如下试验的结果：在该试验中，CD3+T应答细胞在体外用αCD3Fab和αCD28 Fab片段刺激后增殖，所述片段可逆固定于用链霉亲和素突变蛋白包被的珠。FIG.图11A为显示经刺激细胞尺寸分布(正向散射)的直方图，图11B描绘代表了增殖程度的直方图，该增殖程度按照如图11B顶部所示的每次细胞分裂的细胞数(0表示未分裂的细胞；5代表经过至少5次分裂的细胞)，图11C显示了刺激4天后的培养皿的图片。
图12(A-E)显示如下试验的结果：在该试验中，CD3+ T应答细胞在体外用可逆αCD3/αCD28 Fab片段刺激后增殖，所述片段可逆固定于用作可溶反应剂的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上。在图12所示的试验结果中，300,000个CD3+应答T细胞(T应答)以2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记，并用各种量的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白制备物刺激，在该突变蛋白上固定有αCD3 Fab片段和αCD28 Fab的组合，所述片段在重链上均携带作为链霉亲和素结合肽的Strep-标签。(“1×”对应于用0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab3官能化的3μg寡聚链霉亲和素突变蛋白；数字表示1×的倍数)。T应答细胞未被刺激，或者被作为阴性对照的空白寡聚链霉亲和素突变蛋白(无Fab)刺激。将补充有20U/ml白介素2(IL-2)的1ml细胞培养基中的T应答细胞与300,000个CD3阴性自体饲养细胞(用30Gy辐照)一起接种在48孔板中，一式两份。将细胞在37℃下孵育而不更换培养基，通过FACS分析法在5天后根据CFSE稀释液分析增殖(图12B)。图12A显示5天后培养物中的细胞尺寸分布。直方图显示活的CD3+细胞，而图12C显示培养后的细胞，所述细胞用1mM D-生物素处理后通过刺激性反应剂释放并被洗涤。用作为荧光标志物的藻红蛋白标记的链霉亲和素突变蛋白(ST-PE)复染分析单体Fab片段的解离和去除，显示了代表性直方图。图12D显示5天后的活细胞(台盼蓝阴性)绝对数量，采用纽氏计数室进行计数，针对相应刺激条件进行作图。图12D中示出中位细胞数；误差线表示标准误差(SD)。图12E显示了刺激5天后的培养皿的图片。
图13(A-B)显示经纯化的CD4+和CD8+T应答细胞(T应答)的扩增动力学，所述细胞在体外用可逆固定于作为可溶反应剂的两类可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白的αCD3/αCD28Fab片段或αCD3/αCD28/αCD8 Fab刺激。第一类寡聚链霉亲和素突变蛋白是在实施例3中获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白级分(也称为“常规”或“较小”寡聚链霉亲和素突变蛋白主链)，在图13(A-B)中以尖端向下的三角标记显示；用作可溶反应剂的第二类该寡聚链霉亲和素突变蛋白为通过可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白与生物素化人血清白蛋白(HSA)反应获得的寡聚物。该基于HSA的可溶反应剂在本文中也称为“较大”寡聚链霉亲和素突变蛋白主链。在图13(A-B)的试验中，扩增在不更换培养基的情况下进行。关于CD4+T应答细胞的结果示于图13A中，关于CD8+T应答细胞的结果示于图13B中。在本文的上下文中，应注意试验中使用的通过可逆结合第一作用剂以及可选的第二和第三作用剂官能化的可溶反应剂在图中被称为“多聚的作用剂”。
图14(A-B)显示经纯化的CD4+和CD8+T应答细胞(T应答)增殖的扩增动力学，所述细胞在体外用可逆固定于作为可溶反应剂的两类可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白的αCD3/αCD28 Fab片段刺激。第一类寡聚是在实施例3中获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白级分(也称为“常规寡聚链霉亲和素突变蛋白主链”)，在图14(A-B)中以尖端向上的三角标记显示；用作可溶反应剂的第二类该寡聚链霉亲和素突变蛋白为基于HSA的可溶反应剂，即上述的“较大主链”。在图14(A-B)的试验中，扩增在不更换培养基的情况下进行。关于CD4+T应答细胞的结果示于图14A中，关于CD8+T应答细胞的结果示于图14B中。
图15(A-B)显示获自图13和图14中关于纯化的CD4+和CD8+T应答细胞增殖的扩增动力学结果的组合数据，图15A描绘了关于CD4+T细胞的结果，图15B描绘了关于CD8+T细胞的结果。直线用于表示在第3天更换培养基的培养，虚线表示在第3天不更换培养基获得的扩增程度值。图15(A-B)中所示数据基于投入细胞数标准化。仅显示了用寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)刺激的T应答、用市售抗CD3/抗CD28珠(阳性对照)刺激的T应答以及未刺激的T细胞(阴性对照)的数据，而未提供关于具有“大主链”反应剂的数据。
图16(A-C)显示在体外用αCD3/αCD28 Fab片段多克隆刺激的CD3+中心记忆T细胞(TCM)(CD3+CD62L+CD45RA-TCM)的扩增动力学和表型，其中所述片段可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)上(如实施例3中所述)。图16(A-C)所示图表代表根据每个时间点收获的细胞数的增殖程度，图16A显示仅补充IL-2培养基中的增殖，图16B显示补充IL-2和IL-15的培养基中的增殖。图16C显示在这些可变细胞因子环境中培养14天后CD62L和CD127表面表达的流式细胞分析。
图17(A-B)显示在体外用αCD3/αCD28 Fab片段刺激的经纯化CD8+T应答细胞的扩增表型和产率，所述片段可逆固定于作为可溶反应剂作用的两类可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白。第一类寡聚链霉亲和素突变蛋白是寡聚链霉亲和素突变蛋白级分在实施例3中获得(常规主链)；用作可溶反应剂的第二类该寡聚链霉亲和素突变蛋白为如前所述的可溶寡聚物，在本文中称为“大”主链。在这些试验中，寡聚常规链霉亲和素突变蛋白级分(n≥3)也用作以单个Fab片段(图17A和17B中的第三柱)官能化或以αCD3 Fab和αCD28 Fab组合官能化的反应剂。除了用αCD3/αCD28 Fab片段组合刺激以外，还固定了额外的αCD8 Fab片段(市售获自IBA股份有限公司(德国哥廷根)以测试是否可能优先刺激特定的T细胞亚群。图17A显示了代表根据第6天收获的细胞数的增殖程度的柱状图，该增殖程度与阴性对照(未刺激的纯化CD8+T应答细胞)相比，并针对阳性对照(用市售抗CD3/抗CD28珠(珠上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的纯化CD8+T应答细胞)标准化。图17B显示细胞培养后T细胞表面分子CD45RO(其指示T细胞的增殖和活化)和CD8表面表达的流式细胞分析。用单向ANOVA比较各种刺激条件，未检测到显著差异(n.s.)。
图18(A-B)显示在体外用αCD3/αCD28 Fab片段刺激的经纯化CD8+T应答细胞的扩增表型和产率，所述片段可逆固定于作为可溶反应剂作用的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白，该可溶反应剂以单个Fab片段官能化或以Fab片段的组合官能化(如前所述)。在这些试验中，CD8+T应答细胞用可溶反应剂(实施例3的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白(1mg/ml))刺激，该可溶反应剂以不同量的αCD3 Fab和αCD28 Fab片段(可选与上述αCD8 Fab片段一起)官能化。术语“1×”对应于：1.5μg寡聚链霉亲和素突变蛋白，其以单独的0.5μgαCD3 Fab片段官能化，以及1.5μg寡聚链霉亲和素突变蛋白，其以单独的0.5μgαCD28 Fab官能化)，或者3μl寡聚链霉亲和素突变蛋白制备物，其加载有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab，或者4.5μl寡聚链霉亲和素突变蛋白制备物，其加载有0.5μg strep-标签的αCD3 Fab、0.5μgstrep-标签的αCD8 Fab和0.5μg strep-标签的αCD28 Fab。相应的，术语“2×”对应于：3.0μg寡聚链霉亲和素突变蛋白，其以单独的1μgαCD3 Fab片段官能化，以及3.0μg寡聚链霉亲和素突变蛋白，其以单独的1μgαCD28 Fab官能化，意味着用了两倍量的固定化αCD3 Fab片段。将未处理的T应答细胞作为阴性对照，将用市售抗CD3/抗CD8珠(在珠上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的纯化CD8+T应答细胞作为阳性对照。图18A显示其中柱代表增殖程度的图。该增殖程度根据与阴性对照相比并基于阳性对照标准化的第5天收集的细胞数。图18B显示细胞培养后CD8和CD45RO表面表达的FACS分析。
图19(A-B)显示在体外用αCD3/αCD28 Fab片段刺激的经纯化CD3+T应答细胞的扩增，所述片段可逆固定于作为可溶反应剂的实施例3的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白。在一个试验中，除了αCD3/αCD28 Fab片段，还将αCD8 Fab片段(市售获自IBA股份有限公司(德国哥廷根)，目录号6-800-203)固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上，以测试是否可能采用其上还可逆固定有αCD8 Fab片段的反应剂优先刺激大量CD3+培养物中的CD8+T细胞亚群。更具体而言，将500,000个纯化的CD3+应答T细胞(T应答)以3μl寡聚链霉亲和素突变蛋白制备物(1mg/ml)刺激，该突变蛋白加载有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab的组合。作为另选的方法，用0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab加载4.5μl寡聚链霉亲和素突变蛋白(如前所述)。将未处理的T应答细胞作为阴性对照，将用抗CD3/抗CD8珠(在珠上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的T应答作为阳性对照。图19A显示各条件下培养物中细胞计数(扩增程度)的图。图19B显示各刺激条件下CD4+和CD8+细胞的比例。
图20(A-B)显示Jurkat细胞中差示胞内钙移动，所述细胞用αCD3抗体OKT3标记或用以多聚化的OKT3Fab片段(本文中也称为Fab多聚体)标记。对于图20A中的试验，以钙敏感染料Indo-1-AM加载Jurkat细胞，如下引发钙释放：注入αCD3 mAb OKT3(黑色方形)或αCD3 OKT3 Fab多聚体(衍生自亲本细胞系OKT3)，进行或不进行在先的D-生物素破坏(分别为深灰色三角形和浅灰色圆形)，与注入PBS(白色倒三角形)进行比较。施加离子霉素作为阳性对照。胞内Ca2+浓度的时间分辨变化以流式细胞术基于FL6/FL7比例进行监测。对于图20B中的试验，Indo-1-AM标记的Jurkat细胞用如实施例11所述的不同αCD3刺激物活化(OKT3：上图；αCD3 Fab-多聚体：中图)，然后进行后续(t＝140s)的αCD3 Fab-多聚体信号转导的D-生物素介导破坏。将用D-生物素(下图)预解离的αCD3 Fab多聚体和离子霉素作为阴性或阳性对照。数据代表3次独立实验。/>
图21显示用抗CD3 OKT3 Fab多聚体可逆染色细胞的结果。将刚分离的PBMC用单克隆抗体(左侧点图，Fab多聚体的亲本克隆)或同源PE标记Fab多聚体染色，在用D-生物素处理之前(左起第二点图)或处理之后(中部点图)进行分析。然后在后续用新鲜PE标记的洗涤步骤之后检测剩余的Fab单体(右起第二点图)。将可逆染色细胞的二次Fab多聚体染色作为对照(右侧点图)。仅显示活(PI阴性)细胞。点图上的数字表示门控中的细胞百分比。
图22显示通过可逆结合抗CD28 Fab片段分离的细胞，所述片段用以藻红蛋白作为荧光标志物标记的多聚化。通过Fab多聚体磁性细胞选择从刚分离的PMBC中选择/分离CD28+细胞(如国际专利申请公开号No.WO2013/011011中所述)。在选择前，细胞用同源荧光aCD28多聚体(左侧点图)或用抗免疫球蛋白κ轻链的抗体(左起第二点图，α-IgκmAb)对照染色。选择后，用D-生物素处理细胞，然后洗涤以去除磁珠和Fab单体。然后，用αCD28 Fab-多聚体(右起第二点图)或用α-IgκmAb(右侧点图)对释放的CD28+细胞进行(复染)染色，以检测可能剩余的Fab单体。仅显示活(PI阴性)CD3+细胞。点图上的数字表示门控中的细胞百分比。
图23(A-B)显示在体外用αCD3/αCD28 Fab片段刺激的经纯化CD4+和CD8+ T应答细胞活化后的T细胞早期集落形成，所述片段可逆固定于实施例3中所述的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)。图23A描绘了关于CD4+ T细胞的结果，图23B描绘了关于CD8+ T细胞的结果。显示了用可溶多聚化反应剂(寡聚链霉亲和素突变蛋白)刺激的T应答、用市售抗CD3/抗CD28珠(阳性对照)刺激的T应答以及未刺激的T细胞(阴性对照)的数据。
图24(A-F)显示了在体外用两种肽刺激的纯化的CD3+CD62L+CD45RA-TCM应答细胞大量群体中的选择性抗原特异性(Ag-特异性)扩增动力学，所述两种肽为：MHC分子复合物(用作第一作用剂，其为细胞提供主要(primary)活化信号)和αCD28Fab片段(用作第二作用剂，其结合细胞表面上的辅助分子)，且显示了未刺激T细胞(阴性对照)。抗原特异性肽与MHC分子的复合物以及αCD28 Fab片段均可逆固定于同一可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)上(如实施例3中所述)。用于图24A中抗原特异性扩增的肽为：肽CRVLCCYVL(SEQ IDNO:38)，受限于HLA-C702 MHC分子的立即早期1蛋白的氨基酸309–317(描述于Ameres等，PLOS Pathogens，2013年5月，第9卷，第5期，e1003383)，其递呈巨细胞病毒(CMV)特异性的HLA-C7/IE-1表位。递呈肽的MHC I分子在其重链C末端携带链霉亲和素结合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:16)，其由德国哥廷根的IBA有限公司作为“”市售)。图24A显示Ag特异性细胞级分的示例性流式细胞分析，该级分细胞的扩增采用特异于该HLA-C7/IE-1表位的肽:MHC-I复合物作为第一作用剂为可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上的细胞提供主要活化信号。图24B-图24E中的图表显示根据每个时间点收获的特异性肽:MHC I多聚体阳性细胞数的进一步Ag特异性扩增动力学，其中比照图24A采用抗原特异性肽与MHC I分子的不同复合物作为第一作用剂为可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上的细胞提供主要活化信号。更具体而言，图24B显示Ag特异性细胞的扩增，该细胞采用特异于CMV的pp65表位(氨基酸341-350(QYDPVAALF)(SEQ IDNO:39)受限于HLA-A2402)的肽:MHC-1复合物扩增，图24C显示Ag特异性细胞的扩增，该细胞采用另一种特异于CMV的pp65表位(氨基酸265-274(RPHERNGFTV)(SEQ ID NO:40)受限于HLA-B702)的肽:MHC-1复合物扩增，图24D显示Ag特异性细胞的扩增，该细胞采用特异于腺病毒六邻体5表位(氨基酸114-124(CPYSGTAYNSL)(SEQ ID NO:41)受限于HLA-B702)的肽:MHC-1复合物增殖，图24E显示Ag特异性细胞的扩增，该细胞采用特异于CMV的HLA-B7/IE-1309-317表位(CRVLCCYVL(SEQ ID NO:38)；示例性FACS数据参见如上的图24A)的肽:MHC-1复合物增殖。所有携带/>-标签的肽:MHC-1分子均市售获自IBA有限公司。在该上下文中，携带“/>”作为其C末端的HLA-A*2402、HLA-B*0702和HLA-C*0702的氨基酸序列如所附序列表中SEQ ID NO:42、43和44所示，β2微球蛋白(其与α链一起形成，这意味着HLA编码的分子各自的MHC I分子)的氨基酸序列如所附序列表中SEQ ID NO:45所示。此外，图24F显示图24D的HLA-B7/六邻体5114-124刺激/扩增细胞下培养14天后CD62L和CD127表面表达的示例性流式细胞分析。
图25显示纯化的CD3+CD62L+CD45RA-TCM应答细胞的选择性Ag特异性扩增动力学，所述细胞在体外用如下物质刺激：a)抗原特异性肽MHC I复合物，和b)αCD28 Fab片段，其可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上作为第一和第二作用剂。出于该目的，对500,000个CD3+CD62L+CD45RA-应答TCM细胞(T应答)进行Ag特异性刺激，采用了3μl Streptactin多聚化反应剂制备物，其用0.5μg装配有链霉亲和素结合肽的肽:MHC I类复合物(特异性肽代表受限于HLA-B0702的六邻体5蛋白的氨基酸114-124(CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:41)，参见上文)以及0.5μgαCD28 Fab官能化。或选地，采用加载有0.5μg该肽:MHC I型复合物、0.5μgαCD8Fab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚化反应剂制备物。作为比较，采用加载有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab的3μl Streptactin多聚化反应剂制备物(1mg/ml)进行多克隆刺激。同样，作为上述的替代刺激条件，采用加载有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8Fab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚体制备物。将未处理(未刺激)的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠多克隆刺激的T应答细胞作为阳性对照。将1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15)中的T应答细胞接种于48孔板中。在37℃孵育细胞，每3天更换培养基，在7天和14天后进行细胞计数分析。图25中所示的照片代表以腺病毒HLA-B7/六邻体表位为示例的Ag特异性刺激第5天的集落形成程度。
图26(A-B)显示经转导的Jurket细胞的胞内信号转导级联活化，所述细胞经修饰以表达αCD19嵌合抗原受体(CAR)，并用作为可溶多聚化反应剂的实施例3的寡聚刺激。CAR的特异性源自于由单克隆抗体(mAb)抗原结合区组装的scFv区，该抗原结合区特异性结合目标/肿瘤相关抗原(例如CD19)并将其连接到T细胞特异性信号转导中(描述于Hudecek等，Clin Cancer Res，2013年6月15日；19(12):3153–3164)。在试验中，包含CD19 CAR天然配体的CD19胞外结构域(ECD)以及识别IgG4间隔子的多克隆αIgG F(ab)2片段(驴抗人F(ab)2市售获自Jackson免疫研究公司)都在该试验中作为第一作用剂为Jurkat细胞提供主要活化信号。可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白的可逆固定由融合于CD19ECD的C末端的链霉亲和素肽SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:16)提供，或由αIgG的生物素化(Fab)2片段提供(由于链霉亲和素突变蛋白“m2”与生物素的结合亲和力减弱，该结合可逆且能(例如)通过加入过量的游离生物素被撤换)。在图26A的对照试验中，用各种量的以αCD3 Fab和αCD28 Fab官能化的寡聚Streptactin(1mg/ml)制备物的混合物刺激300,000个CD3+Jurkat应答细胞(J应答)(“×1“对应于以0.5μg CD3 Fab和0.5μg CD28Fab–多克隆多聚的作用剂官能化的3μg多聚化Streptactin)。在图26B的试验中，将3μl寡聚Streptactin制备物以0.5μg(×1)或1μg(×2)CD19胞外结构域(ECD)官能化，或使3μl寡聚Streptactin制备物加载识别IgG4间隔子的0.5μg(×1)或1μg(×2)αIgG(两者均为CAR-特异性多聚化作用剂)。用抗CD3/抗CD28珠(珠上可逆固定αCD3和αCD28单克隆抗体)或PMA刺激J应答，将离子霉素刺激作为阳性对照。将200μl细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中的J应答细胞接种在1.5ml Eppendorf管中。在37℃孵育细胞，刺激0-20分钟后置于冰上并裂解。磷酸化ERK的检测指示活化MAPK信号转导，管家蛋白β-肌动蛋白的染色指示各条件和时间点下等量总蛋白质的加载。
图27显示用αCD3/αCD28 Fab刺激后加入D-生物素对CD3+T细胞中Ca2+流的影响，所述Fab可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂，该影响采用流式细胞术评估。在第60秒时，将多聚化的反应剂加入培养物(箭头“E”)，不对培养物进行破坏(左图)，或者通过在第200秒时加入D-生物素(箭头“B”)并在第400秒时加入离子霉素(箭头“I”)进行进一步处理。
图28A显示用可逆结合αCD3/αCD28 Fab(在第1天加或不加D-生物素)的多聚的作用剂刺激后或用对照抗CD3/CD28珠刺激后，在培养物中第0天、第3天和第7天所测得的CD3+T细胞活化所致的细胞计数(扩增程度)。以未刺激的细胞作为阴性对照。**:**：p≤0.05，双尾配对t检验。
图28B显示用可逆结合αCD3/αCD28 Fab(在第1天加或不加D-生物素)的多聚的作用剂刺激后或用对照抗CD3/CD28珠刺激后，在培养物中第0天、第3天和第7天所测得的CD3+T细胞活化所致的膜联蛋白V阳性细胞百分比(指示凋亡)。以未刺激的细胞作为阴性对照。**:**：p≤0.05，双尾配对t检验。
图29显示用可逆结合αCD3/αCD28 Fab(在第2天加或不加D-生物素)的多聚的作用剂刺激后或用对照抗CD3/CD28珠刺激后，在培养物中第3天和第7天通过测定CFSE稀释液所测得的CD3+T细胞活化所致的细胞周期进入和增殖。以未刺激的细胞作为阴性对照。
图30显示用可逆结合αCD3/αCD28 Fab(在第2天加或不加D-生物素)的多聚的作用剂刺激后或用对照抗CD3/CD28珠刺激后，在培养物中第24小时和第72小时通过WST-1试验所测得的CD4-或CD8-纯化T细胞的代谢活性。以未刺激的细胞作为阴性对照。
图31显示CD3+T细胞的扩增能力，所述细胞用可逆结合αCD3/αCD28 Fab的多聚的作用剂刺激，并进一步如下培养：(1)在分选分裂细胞后，且未进一步刺激(分选纯化的(sort-purified))下进一步培养，(2)分选分裂细胞并用多聚化作用剂再刺激(分选纯化、再刺激)后进一步培养，或(3)不进行分选或进一步再刺激(未分选)进一步培养。在所有条件下，在进一步培养之后的第一天加入D-生物素(虚线)。
具体实施方式
本文提供了刺激目标细胞(例如T细胞)组合物的方法，所述刺激为例如扩增、诱导目标细胞组合物存活或维持或分化。在一些实施方式中，所述方法涉及可逆反应剂系统，其能够结合目标表面上的分子(例如受体结合分子)，从而为细胞提供信号，在一些情况中，所述信号可为主要活化信号。在一些实施方式中，所述方法采用了反应剂，其可为其上结合有一个或多个作用剂(例如第一作用剂、第二作用剂等)的多聚化反应剂(multimerizationreagent)，所述作用剂为细胞提供信号，例如主要活化信号和/或辅助或共刺激信号。在一些实施方式中，主要活化信号可足以活化细胞以扩增/增殖。该第一作用剂能可逆结合或非可逆结合多聚化反应剂。多聚化反应剂还可具有结合于其上的第二作用剂，该第二作用剂刺激细胞表面上的辅助分子。第二作用剂结合于细胞表面上的辅助分子时，可由此刺激活化的细胞扩增。同样，该第二作用剂能可逆结合或非可逆结合多聚化反应剂。在一些方面中，还可采用一种或多种额外作用剂以调节或诱导细胞中的额外信号。在一些实施方式中，所提供的方法涉及通过控制破坏一个或多个可逆反应剂的时间来按时控制细胞刺激。
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本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。
I.采用可逆反应剂调节或刺激细胞的系统和方法的概述
在一些实施方式中，所述方法涉及将包含目标细胞的多个细胞与具有可逆结合的作用剂的一种或多种多聚化反应剂一起孵育(例如接触)。在一些实施方式中，多聚化反应剂可固定于固体支持物上或为可溶性，由此在至少一部分细胞孵育过程中，细胞接触该多聚化反应剂。在一个方面，本文所公开的方法是细胞群的系列扩增，其中淋巴细胞完整群体被刺激/扩增，然后通过在适合固相上的色谱法去除该扩增所必需的反应剂。在一些实施方式中，可选地用例如T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)转染扩增/被刺激的细胞(其为培养的细胞)，在一些方面中，可用结合导入的T细胞受体或嵌合抗原受体的不同刺激性分子对细胞进行二次刺激扩增。
在不含外源生长因子或少量外源生长因子的情况下体外扩增T细胞群的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利6,352,694B1和欧洲专利EP 0 700 430 B1)。一般而言，这些方法采用其上固定有各种大于1μM的结合剂(例如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)的固相表面。例如，抗CD3/抗CD28珠(Invitrogen公司)是市售可获得的用于T细胞扩增的反应剂，其为均匀的4.5μm超顺磁无菌无热源聚苯乙烯珠，珠上包被有针对人T细胞上CD3和CD28细胞表面分子的亲和纯化单克隆抗体混合物。然而，在一些情况中，此类磁珠(例如)难以整合到在临床试验或治疗目的所需的条件下扩增细胞的方法中，这是因为需确保将扩增的T细胞给予患者前，这些磁珠被完全去除。
在一些实施方式中，本文所提供的方法解决了这些问题。在一些方面中，所提供的反应剂是可逆的，从而刺激剂能从细胞组合物中移除。同时，在一些方面中，结合刺激剂的反应剂(例如多聚化反应剂)未固定在支持物上，例如未固定在固体支持物或表面上。因此，在一些方面中，反应剂(例如多聚化反应剂)是柔性的而非刚性。在一些实施方式中，反应剂能顺应或匹配细胞表面。在一些实施方式中，可将反应剂固定在支持物(例如固体支持物，包括固定相)上。在一些实施方式中，这些方法能与采用类似选择剂的选择方法一起使用，并同时或依序接触刺激剂，其中，所述选择方法能选择出一个或多个目标细胞。因此，在一些方面中，特定细胞或细胞亚组的刺激可通过在刺激的同时进行选择或分离发生偏移。
在一些实施方式中，所提供的方法涉及使细胞组合物与结合一个或多个受体结合剂(例如刺激剂)的反应剂(例如多聚化反应剂)一起孵育或培养(例如接触)(参见图3和图4)。在一些实施方式中，将细胞组合物与多聚化反应剂接触并通常使细胞群与该多聚化反应剂一起被孵育之后，细胞群通过第一作用剂形成复合物或通过第一作用剂结合多聚化作用剂。初始样品中所含缺乏特异性细胞表面分子的其他细胞群不与该多聚化反应剂结合。在此方面中，应注意细胞群通常在其表面具有多拷贝的该细胞表面分子，结合这些多拷贝通常为刺激或活化所需。
因此，多聚化作用剂通常提供多于一个结合位点(例如Z1)，在一些情况中，多个作用剂能可逆结合这些结合位点从而将第一作用剂、第二作用剂和/或其他作用剂以足够的密度递呈给细胞群。在此方面中，应注意到多聚化作用剂可具有多个结合位点(例如Z1)，例如链霉亲和素突变蛋白(且为同四聚体)在其天然状态下具有4个该结合位点(例如Z1)，且能进一步被寡聚化。在一些情况中，反应剂可仅具有一个结合位点(例如Z1)以可逆结合于结合伴侣(例如C1)。此类例子为多聚钙调蛋白。所述的钙调蛋白仅具有针对钙调结合肽的一个结合位点。然而，钙调蛋白能被生物素化，然后与链霉亲和素寡聚体(还可参见下文)反应，由此提供在“骨架”上存在高密度的多个钙调蛋白分子的多聚化反应剂，从而提供多聚钙调蛋白。
在一些实施方式中，孵育后或在需要中断刺激的其他适宜时间，可逆结合剂的结合伴侣C(例如C1)与多聚化反应剂的结合位点Z(例如Z1)之间的结合通过破坏相应的可逆键而被破坏。在一些情况中，破坏可通过在含有结合于多聚化反应剂的细胞群的孵育/反应混合物中加入竞争物实现。对于可逆结合剂的结合伴侣C(例如C1)与多聚化反应剂的结合位点Z(例如Z1)之间可逆键的竞争性破坏(其可理解为是竞争性洗脱)，可使细胞群/孵育混合物与能够破坏第一结合伴侣和结合位点Z(例如Z1)之间的键的游离第一结合伴侣C(例如C1)或所述第一结合伴侣C的类似物接触。在结合伴侣C(例如C1)为链霉亲和素结合肽(其结合链霉亲和素的生物素结合位点)的实例中，第一游离伴侣可为相应的游离链霉亲和素结合肽或竞争性结合的类似物。该类似物可为例如生物素或生物素衍生物，例如脱硫生物素。
在一些实施方式中，加入游离伴侣或其类似物使得结合伴侣C(例如C1)从多聚化反应剂上被替代下来，因此，由于结合伴侣包含于可逆结合剂中，实现了从多聚化反应剂替代该作用剂。所述作用剂的该替代进而导致第一作用剂从细胞表面分子解离，尤其是如果第一作用剂与细胞表面受体之间键的结合亲和力的解离常数(KD)为10-2M～10-13M，由此也可逆。在一些方面中，由于该解离，对细胞群的刺激也被终止了。
在一些实施方式中，抗体分子对它们抗原(包括例如细胞表面受体分子)的结合亲和力通常的KD亲和范围为约10-7M～约10-13M。因此，可将常规单克隆抗体用作作用剂(第一或第二受体结合剂(例如刺激剂)或选择剂)。在一些实施方式中，为了避免会导致较强结合的任何不为所需的亲和力作用，单克隆抗体也可以其单价抗体片段(例如Fab片段或单链Fv片段)的形式使用。
所提供的方法具有如下优点：细胞群刺激或扩增的时长能被精确控制，由此能够严密控制细胞群的功能状态。如本文所述，在刺激后5天内通过加入物质(例如竞争剂，如生物素或类似物)使细胞(例如T细胞)短期活化导致细胞增殖和被刺激，但改变了该细胞的一种或多种特征或特性，例如改变了CD4或CD8 T细胞百分比、CD8/CD4比例、表型标志物和/或分化状态。例如，本文所述的结果显示：采用所提供反应剂的实施方式按时控制信号的能力可使得较少分化的长寿T细胞群(例如长寿记忆T细胞)增加。在一些情况中，信号的时间控制(例如采用竞争性物质通过破坏多聚的作用剂结合)能用于相对于其他亚群，定制或调整特定亚群的扩增和/或维持。
在一些实施方式中，由于一种或多种可逆结合剂从细胞表面分子解离，所提供方法的优点还包括：在刺激过程结束时，经刺激细胞群不含刺激剂。并且，在一些实施方式中，用于该方法的所有其他反应剂，即作用剂(例如第一或第二作用剂，受体结合剂，例如刺激剂，或选择剂)以及结合伴侣C(例如C1)的竞争性反应剂或其类似物，可通过“移除盒(removal cartridge)”从经刺激的细胞群被轻易移除(参见例如国际专利申请公开号No.WO 2013/124474中所述)。在一些情况中，例如在多聚化反应剂固定于固体支持物(例如生物反应器表面或磁珠)上的情况下，其被取回(held back)。因此，使用移除盒来移除游离作用剂和竞争性反应剂可包括：将洗脱样品(例如破坏可逆结合后获得的样品)加载到第二色谱柱上。
在一些实施方式中，该色谱柱具有合适的固相，该固相既是亲和色谱基质，同时也能用作凝胶渗透基质。在一些方面中，该亲和色谱基质具有固定于其上的亲和反应剂。在一些实施方式中，亲和反应剂可为例如链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、亲和素、亲和素突变蛋白或其混合物。在一些实施方式中，作用剂(例如第一或第二作用剂、受体结合剂，如刺激剂，或选择剂)、结合伴侣C(C1)的竞争性反应剂结合于亲和反应剂，由此被固定在色谱基质上。由此，含有分离的扩增细胞群的洗脱样品中的作用剂(例如第一或第二作用剂、受体结合剂，如刺激剂，或选择剂)和竞争性反应剂被消耗。在一些实施方式中，培养的组合物不含任何反应剂质，在一些方面中，这在与诊断应用(例如，进一步FACSTM分选)联合使用或用于任何基于细胞的治疗性应用时具有优势。
在一些实施方式中，从组合物中去除反应剂和其他组分的能力还具有能够避免任何固体支持物(例如磁珠)的优点。在一些实施方式中，这意味着活化T细胞没有被此类磁珠污染的风险或被磁珠污染的风险最小。在一些实施方式中，这也意味着与其他方法相比，例如与采用Dyna珠而需采取额外措施来确保最终的扩增T细胞群不含磁珠相比，更易于建立符合GMP标准的工艺。此外，在一些实施方式中，采用可溶多聚化作用剂使其更易于从活化细胞群(T细胞、B细胞或还有天然杀伤细胞)移除，这是因为细胞能够通过离心简单沉淀，而含有该可溶多聚化作用剂的上清液则可弃去。或者，可在移除盒的凝胶渗透基质中从扩增细胞群移除可溶多聚化作用剂，例如可如上所述(例如国际专利申请公开号No.WO 2013/124474)。在一些实施方式中，由于不存在固相(例如磁珠)，本发明还提供了一种用于扩增细胞的自动化封闭系统，该系统可整合到已知细胞扩增系统中，所述已知细胞扩增系统为例如Xuri细胞扩增系统W25和WAVE生物反应器2/10系统，可市售购自GE Healthcare公司(英国白金汉郡小恰尔文(Little Chalfont,Buckinghamshire,United Kingdom))，或则细胞扩增系统，可市售购自TerumoBCT有限公司(雷克伍德，CO，USA)。
在一些方面中，本文所提供的方法可包括带有至少两个特异性细胞表面分子的细胞群。在一些实施方式中，第一细胞表面分子涉及细胞群的主要活化信号，而第二细胞表面分子是细胞表面上的辅助分子，其涉及为细胞提供刺激物。在一些实施方式中，细胞群与其中可逆结合第一作用剂和第二作用剂的多聚化反应剂接触，该第一作用剂为细胞提供主要活化信号，该第二作用剂诱导或调节额外的信号，例如刺激细胞表面上的辅助分子。细胞群可例如为：细胞表面分子为TCR/CD3复合物和细胞表面分子为辅助分子CD28的T细胞群。此外，如本文所述，还包括靶向其他辅助分子，例如如下分子中的一种或多种：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。在一些方面中，通过此类其他辅助分子进行的刺激可导致与通过CD28常规刺激相比，分化较少且(在一些情况下)长寿的T细胞群(例如长寿记忆T细胞)增加。在一些实施方式中，结合TCR/CD3复合物作为主要活化信号以及结合辅助分子(例如CD28或其他辅助分子)可为T细胞扩增/增殖所需。
在所描述的一些实施方式中，细胞群可或选地或者额外地在多聚化反应剂的存在下被刺激，该反应剂可逆结合靶向或结合细胞表面上分子的作用剂以提供调节细胞存活、增殖和/或一种或多种其他性质的额外信号。该被靶向的分子包括但不限于：细胞因子受体、趋化因子或粘附分子。在一些方面中，通过该额外分子的刺激可使被刺激或培养的细胞获得一种或多种改良的特性，例如提高的维持性、存活和/或较少耗竭表型或活性。
在一些实施方式中，本文所提供的方法还能进一步联合包括可逆结合相同反应剂(例如相同多聚化反应剂)的至少一种选择剂作为受体结合剂，例如第一或第二和/或额外受体结合剂(例如刺激剂)。在一些情况中，可以在T细胞亚群中增强或提高由孵育或培养(例如扩增(增殖)刺激、活化、共刺激和/或存活)所致的一种或多种特性，该T细胞亚群可在至少一种或多种选择剂的存在下在同时存在一种或多种刺激剂的孵育或培养中被可逆选择。例如，如本文实施例中所示，当T细胞与可逆结合抗CD8抗体多聚的作用剂以及抗CD3抗体刺激剂和抗CD28抗体刺激剂一起孵育时，T细胞组合物中的扩增程度在CD8+细胞中选择性增加。在一些实施方式中，与仅在一种或多种刺激剂的存在下而不存在选择剂的条件下孵育相比，在一种或多种刺激剂和特异性结合选择标志物的选择剂的存在下进行孵育，在培养的组合物中的选择标志物阳性T细胞亚群中由孵育或培养(例如扩增(增殖)刺激、活化、共刺激和/或存活)所致的一种或多种特性可提高至少1.5倍、至少2.0倍、至少3.0倍、至少4.0倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍、至少10.0倍、或更多倍。细胞(例如T细胞)特性的该偏移或选择性实现了对特定T细胞亚群或群体的终点特性的控制。在一些实施方式中，选择标志物可为如本文所述的任何选择标志物。在一些实施方式中，选择标志物选自：CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。
在一些实施方式中，多聚化反应剂包含至少一个结合位点Z(例如Z1)以可逆结合所述作用剂(例如第一作用剂)，该作用剂(例如第一作用剂)还包含至少一个结合伴侣C(例如C1)，其中结合伴侣C(例如C1)能够可逆结合多聚化反应剂的结合位点Z(例如Z1)。因此，作用剂(例如第一作用剂)在与多聚化作用剂接触或一起孵育时，能通过结合伴侣C(例如C1)和结合位点Z(例如Z1)之间形成的可逆键与多聚化反应剂可逆结合。此外，一种或多种其他作用剂(例如第二作用剂)可包括结合伴侣C(例如C2)，其中结合伴侣C2能够独立地可逆结合多聚化反应剂的结合位点Z(例如Z2)。因此，一种或多种额外作用剂(例如第二作用剂)在与多聚化作用剂接触或一起孵育时，通过结合伴侣C(例如C1)和结合位点Z(例如Z2)之间形成的可逆键与多聚化反应剂可逆结合。在一些情况中，C1和C2可相同或基本相同、和/或包含相同或基本相同的部分。在一些情况中，Z1和Z2可相同或基本相同、和/或包含相同或基本相同的部分。
在一些实施方式中，采用结合多聚化作用剂相同结合位点的结合伴侣C1和C2部分具有如下优点：可采用同样的竞争性反应剂(既针对第一结合伴侣C1，也针对第二结合伴侣C2)或其类似物破坏(在一些情况中，终止)目标细胞(例如T细胞)群的扩增，并从多聚化作用剂释放该目标细胞(如T细胞)群。
在一些情况中，为生产包含结合伴侣C的结合剂(例如第一、第二和/或额外作用剂，受体结合剂，如刺激剂，或选择剂)，可采用提供结合伴侣C(例如C1或C2)的相应表达载体重组生产该作用剂(例如抗体片段)，从而使得结合伴侣C(例如C1或C2)成为含该作用剂的融合蛋白位于N末端或C末端的一部分。在一些实施方式中，在作用剂为抗体或抗原结合片段的情况下，结合伴侣C(例如C1或C2)可位于轻链或重链的C末端。同时，克隆重组蛋白(例如抗体分子可变结构域)和重组生产相应蛋白质(例如抗体片段)的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如Skerra,A.(1994))。在一些实施方式中，可产生具有针对给定目标(例如所述CD3或CD28或其他辅助或刺激剂分子)的抗体样特性的人工结合分子的抗体分子，例如可通过熟知的发展性方法，例如噬菌体展示(例如在如下文献中综述：Kay,B.K.等(1996)Phage Display of Peptides and Proteins–A Laboratory Manual(“肽和蛋白质的噬菌体展示——实验室指南”)，第一版，学术出版社，纽约，NY；Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401–424，或Rodi,D.J.,和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87–93)、核糖体展示(在如下文献中综述：Amstutz,P.等，(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12,400-405)、或mRNA展示(如下文献中所报导：Wilson,D.S.等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,3750-3755)。
II.可逆反应剂系统及相关应用
在一些实施方式中，所述方法采用可逆系统，其中能够结合细胞表面上的分子(细胞表面分子)的至少一种作用剂(例如受体结合剂或选择剂)与反应剂可逆关联。在一些情况中，反应剂包含能够可逆结合于作用剂(例如受体结合剂或选择剂)的多个结合位点。一些情况中，反应剂是多聚化反应剂。在一些实施方式中，至少一种作用剂(例如受体结合剂或选择剂)包含能特异性结合于分子的表位或结构域的至少一个结合位点B，还包含特异性结合反应剂的至少一个结合位点Z的结合伴侣C。在一些情况中，结合伴侣C和至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是非共价相互作用。在一些实施方式中，结合伴侣C和至少一个结合位点Z之间的结合相互作用(例如非共价相互作用)是可逆的。
在一些实施方式中，可在能够结合至少一个结合位点Z的物质或包含能够结合至少一个结合位点Z的结合位点的物质(例如竞争性反应剂，也称为洗脱反应剂)的存在下介导可逆关联。通常，由于该物质(例如竞争性反应剂)对反应剂中所存在结合位点Z的结合亲和力高于更高和/或由于该物质的存在浓度高于结合伴侣C的浓度，该物质能用作竞争物，从而使得结合伴侣C从反应剂脱落和/或解离。在一些实施方式中，该物质(例如竞争性反应剂)对至少一个结合位点Z的亲和力高于作用剂(例如受体结合剂或选择剂)的结合伴侣C对所述至少一个结合位点Z的亲和力。因此，在一些情况中，反应剂的结合位点Z与作用剂(如受体结合剂或选择剂)的结合伴侣C之间的键可通过加入该物质(例如竞争性反应剂)被破坏，从而使得作用剂(例如受体结合剂或选择剂)和反应剂的关联可逆。
可用于该可逆洗脱的反应剂是本领域中已描述和已知的，参见例如：美国专利号No.5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；和国际公开PCT申请No.WO2013/124474和WO2014/076277。以下描述了能够形成可逆相互作用的反应剂和结合伴侣、以及能够逆转该结合的物质(例如竞争性反应剂)的非限制性例子。
A.反应剂
在一些实施方式中，反应剂包含一个或多个结合位点Z，所述Z能够可逆结合作用剂(例如受体结合剂或选择剂)所包含的结合伴侣C。在一些实施方式中，反应剂包含多个结合位点Z，它们各自能够特异性结合包含在作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中的结合伴侣C，从而使得反应剂能够可逆结合多个作用剂(例如受体结合剂或选择剂)，例如为多聚化反应剂。在一些实施方式中，反应剂是各自包含至少一个结合位点Z的个体分子(例如单体)或组成个体分子的复合物(例如四聚体)的寡聚体或多聚体。在一些实施方式中，反应剂包含至少两个结合位点Z，至少3个结合位点Z，至少4个结合位点Z，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72或更多个结合位点Z。结合位点可全部相同，或多个结合位点可包括一个或多个不同的结合位点(例如Z1、Z2、Z3等)。
在一些实施方式中，两种或多种作用剂(例如受体结合剂或选择剂)例如通过反应剂上存在的一个或多个结合位点于反应剂关联，例如可逆连接于反应剂。在一些情况中，这使得所述作用剂(例如受体结合剂或选择剂)彼此紧密排列，从而若具有细胞表面分子的目标细胞与具有能够结合该特定分子的一个或多个结合位点B的作用剂(例如受体结合剂或选择剂)接触，则发生亲和力作用。
在一些实施方式中，相同(即包含相同结合位点B)的两种或多种不同作用剂(例如受体结合剂或选择剂)能可逆结合该反应剂。在一些实施方式中，可以采用至少两种(类)作用剂(例如受体结合剂或选择剂)，在一些情况中，三种(类)或四种(类)不同的作用剂，例如两种或更多种不同的受体结合剂和/或选择剂。例如，在一些实施方式中，反应剂能可逆包含结合位点B1、B2、B3或B4等的第一作用剂(例如受体结合剂或选择剂)和包含其他结合位点(例如结合位点B1、B2、B3或B4中的另一种)的第二作用剂(例如受体结合剂或选择剂)。在一些情况中，第一作用剂和第二作用剂的结合位点可相同。例如，在一些方面中，至少两种作用剂(例如受体结合剂或选择剂)各自均能结合相同分子。在一些情况中，第一作用剂和第二作用剂的结合位点可不同。在一些方面中，至少两种作用剂(例如受体结合剂或选择剂)各自能结合不同的分子，例如第一分子、第二分子等。在一些情况中，不同分子(例如细胞表面分子)可存在于相同目标细胞上。在其他情况下，不同分子(例如细胞表面分子)可存在于同一细胞群中的不同目标细胞上。在一些情况中，第三、第四等作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可与相同作用剂反应剂关联，其各自含有其他不同的结合位点。
在一些实施方式中，两种或多种不同反应剂(例如受体结合剂或选择剂)包含相同的结合伴侣C。在一些实施方式中，两种或多种不同反应剂(例如受体结合剂或选择剂)包含不同的结合伴侣。在一些方面中，第一作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可具有能特异性结合反应剂上所存在结合位点Z1的结合伴侣C1，第二作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可具有能特异性结合反应剂上所存在结合位点Z1或结合位点Z2的结合伴侣C2。因此，在一些情况中，反应剂所包含的多个结合位点Z包括结合位点Z1和Z2，它们能够分别可逆结合于作用剂(例如受体结合剂或选择剂)所包含的结合伴侣C1和C2。在一些实施方式中，C1和C2相同，和/或Z1和Z2相同。在其他方面中，多个结合位点Z中的一个或多个可不同。在其他情况中，多个结合伴侣C中的一个或多个可不同。选择能与含有结合位点Z的反应剂相容的结合伴侣C的任何组合在本领域技术人员的能力范围内，只要各结合伴侣C能够与结合位点Z之一相互作用(例如特异性结合)。
在一些实施方式中，反应剂是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、亲和素、亲和素突变蛋白或类似物(例如中性亲和素)或其组合，其中该反应剂包含用于可逆关联结合伴侣C的一个或多个结合位点Z。在一些实施方式中，结合伴侣C可为生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽、或能够特异性结合链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、亲和素、亲和素突变蛋白或类似物的其他分子。在一些实施方式中，反应剂为或包含链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或亲和素类似物或突变蛋白，其可逆结合生物素、生物素类似物或其生物活性片段。在一些实施方式中，反应剂为或包含链霉亲和素突变蛋白或类似物、或亲和素突变蛋白或类似物，其可逆结合链霉亲和素结合肽。在一些实施方式中，所述物质(例如竞争性反应剂)可为生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽，其能够与结合伴侣C竞争结合一个或多个结合位点Z。在一些实施方式中，结合伴侣C和该物质(例如竞争性反应剂)是不同的，该物质(例如竞争性反应剂)对一个或多个结合位点Z的亲和力高于对结合伴侣的亲和力。
在一些实施方式中，链霉亲和素可为野生型链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物，例如链霉亲和素样多肽。类似地，在一些方面中，亲和素可包括野生型亲和素、或亲和素突变蛋白或类似物，例如中性亲和素，一种具有修饰的精氨酸的去糖基化生物素，其通常具有更中性的pi且可用作天然生物素的替代品。总体而言，生物素的去糖基化中性形式包括市售可获得的那些形式，例如“Extravidin”可获自Sigma Aldrich公司，或例如“NeutrAvidin”可获自Thermo Scientific公司或Invitrogen。
在一些实施方式中，反应剂为链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或类似物。在一些实施方式中，野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)的氨基酸序列如Argarana等，NucleicAcids Res.14(1986)1871-1882所公开(SEQ ID NO:1)。总体而言，链霉亲和素天然存在为四个相同亚基的四聚体，即其为同四聚体，其中各亚基包含针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的单个结合位点。示例性的链霉亲和素亚基是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，但该序列还可包含与其同源的来自其他链霉菌(Streptomyces)种系的序列。具体而言，链霉亲和素的各亚基对生物素可具有强结合亲和力，其平衡解离常数(KD)的数量级为约10-14M。在一些情况中，链霉亲和素可作为四个结合位点中仅一个有功能的单价四聚体存在(Howarth等，(2006)Nat.Methods,3:267-73；Zhang等，(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63))、作为四个结合位点中的两个有功能的二价四聚体存在(Fairhead等.(2013)J.Mol.Biol.,426:199-214)、或以单体或二聚体形式存在(Wu等，(2005)J.Biol.Chem.,280:23225-31；Lim等，(2010)Biochemistry,50:8682-91)。
在一些实施方式中，链霉亲和素可为任何形式，例如野生型或未修饰的链霉亲和素，例如来自链霉菌种系的链霉亲和素或其功能活性片段，其包含针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的结合位点的至少一个功能性亚基，例如通常包含SEQ ID NO:1所示的来自亲和素链霉菌(Streptomyces avidinii)的野生型链霉亲和素的至少一个功能性亚基或其功能活性片段。例如，在一些实施方式中，链霉亲和素可包含野生型链霉亲和素的片段，其在N-末端和/或C-末端截短。此类最小的链霉亲和素包括如下任何形式：N末端起始于SEQ ID NO:1的氨基酸位置10-16的区域中，C末端终止于SEQ ID NO:1的氨基酸位置133-142的区域中。在一些实施方式中，链霉亲和素功能活性片段包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述未修饰的链霉亲和素，例如SEQ ID NO:2所示的，还可包含位于对应于Ala13(按照SEQ ID NO:1所示编号)的位置处的N末端甲硫氨酸。本文提供的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白中的残基位置编号参照SEQ ID NO:1中残基的编号。
在一些方面中，链霉亲和素突变蛋白包括与未修饰或野生型链霉亲和素序列相比存在一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的多肽，但所述多肽包含至少一个功能性亚基，所述功能性亚基包含针对生物素、生物素衍生物或类似物或链霉亲和素结合肽的结合位点。在一些方面中，链霉亲和素样多肽和链霉亲和素突变蛋白可为本质上是野生型链霉亲和素免疫等价物的多肽，且尤其是能够以与野生型链霉亲和素相同或不同亲和力结合生物素、生物素衍生物或生物素类似物的多肽。在一些情况中，链霉亲和素样多肽或链霉亲和素突变蛋白可包含非野生型链霉亲和素的一部分的氨基酸，或它们可仅包含野生型链霉亲和素的一部分。在一些实施方式中，链霉亲和素样多肽是与野生型链霉亲和素不同的多肽，这是由于宿主不含将宿主产生的多肽转化为野生型链霉亲和素结构所需的酶。在一些实施方式中，链霉亲和素还可作为链霉亲和素四聚体和链霉亲和素二聚体存在，尤其是链霉亲和素同四聚体、链霉亲和素同二聚体、链霉亲和素异四聚体和链霉亲和素异二聚体。通常，各亚基一般具有针对生物素或生物素类似物或针对链霉亲和素结合肽的结合位点。链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的例子在例如WO 86/02077、DE 19641876 Al、US 6,022,951、WO98/40396或WO 96/24606中提及。
在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白可包含不是未修饰或野生型链霉亲和素的一部分的氨基酸，或可仅包含野生型或非修饰链霉亲和素的一部分。在一些实施方式中，与未修饰或野生型链霉亲和素亚基(例如SEQ ID NO:1所示的野生型链霉亲和素亚基或其功能活性片段，例如SEQ ID NO:2所示)相比，链霉亲和素突变蛋白包含可具有一个或多个氨基酸取代(替代)的至少一个亚基。在一些实施方式中，与野生型或未修饰链霉亲和素相比，链霉亲和素突变蛋白的至少一个亚基可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个不同氨基酸，和/或包含至少一个亚基，其所含氨基酸序列与SEQID NO:1或2所示氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，其中，此链霉亲和素突变蛋白具有结合生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的功能活性。在一些实施方式中，所述氨基酸替代(取代)是保守或非保守性突变。链霉亲和素突变蛋白的例子在本领域中已知，参见例如美国专利No.5,168,049；5,506,121；6,022,951；6,156,493；6,165,750；6,103,493；或6,368,813；或国际公开PCT申请No.WO2014/076277。
在一些实施方式中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白包括：含一个或多于一个功能性亚基的蛋白质，所述亚基包含针对生物素、生物素衍生物或类似物或链霉亲和素结合肽的一个或多个结合位点Z，例如含2个或更多个、三个或更多个、四个或更多个，在一些情况中，5、6、7、8、9、10、11、12或更多个功能性亚基的蛋白质。在一些实施方式中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白可包括：单体；二聚体，包括异二聚体或同二聚体；四聚体，包括同四聚体、异四聚体、单价四聚体或二价四聚体；或可包括其更高级别的多聚体或寡聚体。
在一些实施方式中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白对肽配体结合伴侣的结合亲和力小于1×10-4M、5×10-4M、1×10-5M、5x 10-5M、1×10-6M、5×10-6M或1×10-7M，但通常大于1×10-13M、1×10-12M或1×10-11M。例如，肽序列(Strep-标签)，如美国专利No.5,506,121中所公开的那些肽序列，可用作生物素模拟物，并对链霉亲和素具有结合亲和力，例如KD为约10-4M～10-5M。在一些情况中，结合亲和力可通过在链霉亲和素分子中进行突变得到进一步改善，参见例如美国专利No.6,103,493或国际公开PCT申请No.WO2014/076277。在一些实施方式中，结合亲和性可通过本领域已知的方法确定，例如下文所述的任一种。
在一些实施方式中，反应剂(例如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白)对肽配体结合伴侣具有结合亲和力，该肽配体结合伴侣可为存在于作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中的结合伴侣C。在一些实施方式中，肽序列包含具有SEQ ID NO:9所示通式的序列，例如包含SEQ ID NO:10所示序列。在一些实施方式中，肽序列具有SEQ ID NO:11所示的通式，例如如SEQ ID NO:12所示。在一个实例中，肽序列为Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称如SEQ ID NO:7所示)。在一个实例中，肽序列为Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称/>如SEQ ID NO:8所示)。在一些实施方式中，肽配体包含依次排列的至少两个链霉亲和素-结合模块，其中，所述两个模块之间的距离是至少0个且不大于50个氨基酸，其中，一个结合模块具有3～8个氨基酸且至少包含序列His-Pro-Xaa(SEQ IDNO:9)，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，例如如SEQ ID NO:11所示(参见例如国际公开的PCT申请公开号WO02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方式中，肽配体包含SEQ ID NO:13或14中任一所示的序列。在一些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO:15-19中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，反应剂为或包含链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1所示的野生型链霉亲和素或其生物活性部分相比，链霉亲和素突变蛋白包含一个或多个突变(例如氨基酸替代)。例如，链霉亲和素的生物活性部分包括N末端和/或C末端截短的链霉亲和素变体，其在一些情况中被称为最小链霉亲和素。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1的序列相比，N末端截短的最小链霉亲和素(可对其进行任何突变)在N末端起始于氨基酸位置10～16区域，在C末端终止于氨基酸位置133～142区域。在一些实施方式中，可使N末端截短的链霉亲和素(可对其进行任何突变)包含SEQ ID NO:2所示的序列。在一些实施方式中，最小链霉亲和素包含从位置Ala13～Ser139的氨基酸序列，且可选地具有替代Ala13的N末端甲硫氨酸残基。为了本文的目的，氨基酸位置的编号全部参考SEQ IDNO:1所示野生型链霉亲和素的编号(例如Argarana等，Nucleic Acids Res.14(1986),1871-1882，也可参见图3)。
在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白是美国专利No.6,103,493所述的突变体。在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44～53区域内包含至少一个突变，基于野生型链霉亲和素的氨基酸序列，例如如SEQ ID NO:1所示。在一些实施方式中，所述链霉亲和素突变蛋白在44、45、46和/或47中的一个或多个残基处包含突变。在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白在野生型链霉亲和素第44位处用疏水脂族氨基酸(例如Val、Ala、Ile或Leu)替代Glu，在第45位用任何氨基酸替代，在第46位用脂族氨基酸(例如疏水脂族氨基酸)替代，和/或在第47位用碱性氨基酸(例如Arg或Lys，如通常为Arg)替代Val。在一些实施方式中，在第46位为Ala和/或在第47位为Arg和/或在第44位为Val或Ile。在一些实施方式中，链霉亲和素突变体包含残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47，例如在包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示(也称为链霉亲和素突变蛋白1，SAM1)。在一些实施方式中，链霉亲和素突变体包含残基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，例如在包含如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示(也称为SAM2)。在一些情况中，此类链霉亲和素突变蛋白描述于例如美国专利6,103,493中，且可以的商品名市售获得。
在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白是描述于国际公开的PCT申请No.WO2014/076277的突变体。在一些实施方式中，参照SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44～53的区域中包含至少两个半胱氨酸残基。在一些实施方式中，所述半胱氨酸残基位于位置45和52处以产生连接这些氨基酸的二硫桥。在此类实施方式中，氨基酸44通常是甘氨酸或丙氨酸，且氨基酸46通常是丙氨酸或甘氨酸，且氨基酸47通常是精氨酸。在一些实施方式中，参照SEQ ID NO:1所示的氨基酸位置，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸残基115～121的区域中包含至少一个突变或氨基酸差异。在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置117、120和121处含有至少一个突变，和/或，氨基酸118和119缺失，且至少氨基酸位置121处有取代。
在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白在对应于117位的位置包含突变，该突变可为：大的疏水性残基(如Try、Tyr或Phe)或带电荷残基(如Glu、Asp或Arg)或疏水残基(如Asn或Gin)，或者，在一些情况中，疏水残基Leu、Met或Ala，或极性残基Thr、Ser或His。在一些实施方式中，117位的突变与如下突变组合：对应于120位的位置的突变，该突变可为小残基(如Ser或Ala或Gly)；对应于121位的位置的突变，该突变可为疏水性残基(例如大的疏水性残基，如Trp、Tyr或Phe)。在一些实施方式中，117位处的突变与以下突变组合：对应于SEQID NO:1所示野生型链霉亲和素或其生物活性片段第120位的位置处的突变，该突变可为疏水性残基(例如Leu、Ile、Met或Val，或通常Tyr或Phe；以及，对应于SEQ ID NO:1所示野生型链霉亲和素或其生物活性片段第121位的位置处的突变，该突变可为小残基(如Gly、Ala或Ser)或Gln或疏水性残基(如Leu、Val、Ile、Trp、Tyr、Phe或Met)。在一些实施方式中，此类突变蛋白还能包含残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或残基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白包含残基Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121。在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白包含SEQ ID NO:27或28所示的氨基酸序列，或显示出与SEQ ID NO:27或28所示氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列，其包含残基Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121，且显示结合生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽的功能活性。
在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白可包含任何组合形式的任何上述突变，且所得的链霉亲和素突变蛋白可显示对肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称如SEQ ID NO:7所示)的结合亲和力小于2.7×10-4M；和/或，对肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称/>如SEQ ID NO:8所示)的结合亲和力小于1.4×10-4M；和/或，对SEQ ID NO:7-19中任一项所示的任一肽配体的结合亲和力小于1×10-4M、5×10-4M、1×10-5M、5×10-5M、1×10-6M、5×10-6M或1×10-7M，但通常大于1×10-13M、1×10-12M或1×10-11M。
在一些实施方式中，链霉亲和素突变蛋白具有SEQ ID NO:3～6、27或28所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3～6、27或28任一所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，且对肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称如SEQ ID NO:7所示)的结合亲和力小于2.7×10- 4M；和/或，对肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称/>如SEQ IDNO:8所示)的结合亲和力小于1.4×10-4M；和/或，对SEQ ID NO:7-19中任一所示的任一肽配体的结合亲和力小于1×10-4M、5×10-4M、1×10-5M、5×10-5M、1×10-6M、5×10-6M或1×10-7M，但通常大于1×10-13M、1×10-12M或1×10-11M。
在一些实施方式中，链霉亲和素突变体还可结合至其它链霉亲和素配体，例如但不限于，生物素、亚氨基生物素、硫辛酸、脱硫生物素、二氨基生物素、HABA(羟基偶氮苯-苯甲酸)或/和二甲基-HABA。在以下实施方式中，链霉亲和素突变蛋白对其他链霉亲和素配体(例如生物素或脱硫生物素)的结合亲和力大于该链霉亲和素突变蛋白对生物素模拟肽配体(例如SEQ ID NO:7-19任一所示)的结合亲和力。因此，在一些实施方式中，生物素或生物素类似物或衍生物(例如脱硫生物素)在本文所提供的方法中可用作竞争性反应剂。例如，与生物素-链霉亲和素相互作用约10-13M的结合亲和力相比，命名为的链霉亲和素突变蛋白(例如包含SEQ ID NO:4所示序列)与命名为/>的肽配体(例如，如SEQ ID NO:8所示)的相互作用的特征在于KD为约10-6M的结合亲和力。在一些情况中，能以KD为10-10～10-13M或约10-10～10-13M的高亲和力结合/>的生物素能与竞争结合位点。
在一些情况中，反应剂包含可能够结合过渡金属离子的至少两个螯合基团K。在一些实施方式中，反应剂可能够结合寡聚组氨酸亲和标签、谷胱甘肽-S-转移酶、钙调蛋白或其类似物、钙调蛋白结合肽(CBP)、FLAG-肽、HA-标签、麦芽糖结合肽(MBP)、HSV表位、myc表位、和/或生物素化载体蛋白。
在一些实施方式中，反应剂是寡聚体或多聚体。在一些实施方式中，寡聚体或多聚体可通过如下方式产生：直接或间接连接天然存在状态的蛋白质个体分子、或者直接或间接连接形成个体分子的单体或亚基复合物(例如，直接或间接连接天然存在状态的蛋白质的二聚体、三聚体、四聚体等)。例如，链霉亲和素或亲和素的四聚化同二聚体或异二聚体可指相应寡聚体或多聚体的最小构建区块或个体分子。在一些实施方式中，寡聚体或多聚体可包含至少2个蛋白质个体分子连接(例如，为2聚体)，或可为蛋白质个体分子(例如单体、四聚体)的至少3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚体、17聚体、18聚体、19聚体、20聚体、25聚体、30聚体、35聚体、40聚体、45聚体或50聚体。
寡聚体可采用本领域已知的任何方法产生，例如描述于公开的美国专利申请公开号US2004/0082012中的任何方法。在一些实施方式中，寡聚体或多聚体包含两个或更多个个体分子，它们可以是交联的，例如通过多糖或二官能接头交联。
在一些实施方式中，通过在多糖的存在下交联个体分子或形成个体分子的亚基复合物来获得寡聚体或多聚体。在一些实施方式中，可通过在多糖(例如葡聚糖)中引入羧基残基来制备寡聚体或多聚体。在一些方面中，反应剂的个体分子(例如单体或四聚体)可通过内部赖氨酸残基的伯胺基团偶联，和/或通过游离N末端偶联到葡聚糖骨架中的羧基，所采用的是本领域常规的碳二亚胺化学法。在一些实施方式中，偶联反应进行的摩尔比为约60摩尔反应剂个体分子(例如单体或四聚体)/摩尔葡聚糖。
在一些实施方式中，反应剂是一个或多个链霉亲和素、或亲和素、或链霉亲和素的任何类似物或突变蛋白、或亲和素的任何类似物或突变蛋白(例如中性亲和素)的寡聚体或多聚体。在一些实施方式中，结合位点Z是亲和素或链霉亲和素的天然生物素结合位点，其在个体分子中可具有多至4个结合位点(例如包含4个结合位点Z的四聚体)，从而同四聚体可包含多至4个相同的结合位点(即Z1)，而异四聚体可包含4个可能不同的结合位点，例如包含Z1和Z2。在一些实施方式中，寡聚体由相同的链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、亲和素或亲和素突变蛋白的多个个体分子(例如多个同四聚体)形成或产生，在该情况下，寡聚体的各结合位点Z(例如Z1)相同。例如，在一些情况下，寡聚体可包含多个结合位点Z1，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50或更多个结合位点Z1。在一些实施方式中，寡聚体由作为链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、亲和素或亲和素突变蛋白异四聚体的多个个体分子形成或产生，和/或由结合位点Z不同(例如Z1和Z2)的链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、亲和素或亲和素突变蛋白的两个或多个不同个体分子形成或产生，在该情况下，多个不同结合位点Z(例如Z1和Z2)可存在于寡聚体之中。例如，在一些情况下，寡聚体可包含多个结合位点Z1和多个结合位点Z，两者的组合可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50或更多个组合的结合位点Z1和Z2。
在一些情况下，寡聚体或多聚体可分别通过多糖交联。在一些实施方式中，链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物、或亲和素类似物(例如中性亲和素)的寡聚体或多聚体可通过将羧基残基引入多糖(例如葡聚糖)制备，其第一步基本如Noguchi,A等，BioconjugateChemistry(1992)3,132-137中所述。在一些此类方面中，然后可使链霉亲和素或亲和素或其类似物通过内部赖氨酸残基的伯氨基团连接，和/或通过游离N末端连接到葡聚糖骨架中的羧基，在该第二步中所采用的是常规的碳二亚胺化学法。在一些情况下，还可通过用作接头的二官能分子(例如戊二醛)的交联或通过本领域所描述的其他方法获得链霉亲和素或亲和素或其任何类似物的交联寡聚体或多聚体。
在一些实施方式中，通过采用二官能接头或其他化学接头(例如戊二醛)或其他本领域已知的方法交联个体分子或组成个体分子的单体复合物来获得寡聚体或多聚体。在一些方面中，可通过采用用作接头的二官能分子(例如戊二醛)或通过本领域所描述的其他方法交联个体链霉亲和素或亲和素分子来获得链霉亲和素、或亲和素、或链霉亲和素或亲和素的任何突变蛋白或类似物的交联寡聚体或多聚体。例如，可以如下产生链霉亲和素突变蛋白的寡聚体：将巯基引入链霉亲和素突变蛋白(这可例如通过使链霉亲和素突变蛋白与2-亚氨氢氯化硫醇(Traut试剂)反应来实现)，以及活化(例如在独立的反应中)链霉亲和素突变蛋白中可用的氨基基团。在一些实施方式中，氨基基团的该活化可通过使链霉亲和素突变蛋白与市售可获得的异二官能交联剂(例如磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)或琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH))反应来实现。在一些此类实施方式中，将如此获得的两批反应产物混合在一起，通常会导致一批修饰的链霉亲和素突变蛋白中所含的巯基与另一批修饰的链霉亲和素突变蛋白的活化(例如通过马来酰亚胺功能化)氨基酸反应。在一些情况下，通过该反应形成链霉亲和素突变蛋白的多聚体/寡聚体。这些寡聚体可具有适当数量的个体分子，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50个或更多个个体分子，寡聚化程度可根据反应条件而不同。
在一些实施方式中，寡聚或多聚反应剂可通过尺寸排阻色谱分离，且任何所需级分可用作反应剂。例如，在一些实施方式中，在2-亚氨氢氯化硫醇和异二官能交联剂(例如磺基SMCC)的存在下使修饰的链霉亲和素突变蛋白反应后，可通过尺寸排阻色谱分离寡聚反应剂或多聚反应剂，且任何所需级分可用于反应剂。在一些实施方式中，寡聚物不具有(且不必具有)单一分子量，但它们可具有统计学重量分布，例如高斯分布。在一些情况下，具有多于三个链霉亲和素或突变蛋白四聚体(例如同四聚体或异四聚体)的任何寡聚体可用作可溶反应剂，例如通常为3～50个四聚体(例如同四聚体或异四聚体)、10～40个四聚体(例如同四聚体或异四聚体)、或25～35个四聚体(例如同四聚体或异四聚体)。该寡聚体可具有(例如)3～25个链霉亲和素突变蛋白四聚体(例如同四聚体或异四聚体)。在一些方面中，链霉亲和素突变蛋白的分子量约为50kDa，可溶寡聚体的分子量可为约150kDa～约2000kDa、约150kDa～约1500kDa、约150kDa～约1250kDa、约150kDa～1000kDa、约150kDa～约500kDa or约150kDa～约300kDa、约300kDa～约2000kDa、约300kDa～约1500kDa、约300kDa～约1250kDa、约300kDa～1000kDa、约300kDa～约500kDa、约500kDa～约2000kDa、约500kDa～约1500kDa、约500kDa～约1250kDa、约500kDa～1000kDa、约1000kDa～约2000kDa、约1000kDa～约1500kDa、约1000kDa～约1250kDa、约1250kDa～约2000kDa或约1500kDa～约2000kDa。通常，由于各链霉亲和素分子/突变蛋白具有四个生物素结合位点，该反应剂可提供12～160个结合位点Z，例如12～100个结合位点Z。
B.反应剂的形式
1.支持物
在一些实施方式中，反应剂包含在支持物上，所述支持物为例如固体支持物或表面(例如珠)或固定相(色谱基质)。在一些此类实施方式中，反应剂可逆固定在支持物上。在一些情况下，反应剂通过共价键固定于支持物。在一些情况下，反应剂通过非共价键可逆固定于支持物。
在一些实施方式中，支持物是固体支持物。可将任何固体支持物(表面)用于可逆固定反应剂。其上可固定反应剂的示例性固体支持物包括磁珠、多聚珠、细胞培养板、微量滴定板、膜或中空纤维。在一些方面中，将中空纤维用作细胞扩增洗脱(可购自TerumoBCT有限公司(雷克武德，CO，USA)中的生物反应器。在一些实施方式中，反应剂共价连接于固体支持物。在其他实施方式中，也可采用非共价相互作用进行固定，例如固定在塑料基板上。在一些实施方式中，反应剂可为例如可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素或亲和素突变蛋白。此类链霉亲和素突变蛋白可共价连接任何表面，例如用于色谱纯化的树脂(珠)，它们以该形式市售获自IBA有限公司(哥廷根)，例如作为/>琼脂糖、/> 高容量/>或其他易于市售获得的示例性例子是固定化的金属亲和色谱(IMAC)，例如可用于寡聚组氨酸标签(his-标签)蛋白的可逆固定/>树脂(Westburg公司，荷兰雷斯登)，例如用于可逆固定包含作为结合伴侣C的寡聚组氨酸标签(例如五或六组氨酸标签)的作用剂(例如受体结合剂或选择剂)。其他例子包括购自GE生命科学(GELife Sciences)的钙调蛋白琼脂糖，其可与包含作为结合伴侣C的钙调蛋白结合肽的作用剂(例如受体结合剂或选择剂)或与偶联了谷胱甘肽的琼脂糖一起使用。在一些此类情况中，结合伴侣C是谷胱甘肽-S-转移酶。
在一些实施方式中，支持物包含固定相。因此，在一些实施方式中，反应剂包含于固定相(也称为色谱基质)上。在一些此类实施方式中，反应剂可逆固定在固定相上。在一些情况下，反应剂通过共价键可逆固定于固定相。在一些方面中，反应剂通过非共价键可逆固定于固定相。
可将任何材料用作色谱基质。通常，适合的色谱材料本质上无害，即例如当在所需条件下用于装填的色谱柱中时，对细胞活力无不利影响。在一些实施方式中，固定相保持在预定的定位(例如预定位置)，而样品的定位可改变。因此，在一些实施方式中，固定相是色谱系统的一部分，流动相流过该部分(通过流经或以批量模式)，且液相中所含的组分(溶解或分散的)在该部分中在相间发生分布。
在一些实施方式中，色谱基质具有固相或半固相形式，而含有待分离/分隔目标细胞的样品则是液相。色谱基质可为微粒材料(具有任何适宜的尺寸和形状)或整体色谱材料，包括纸基质或膜。因此，在一些方面中，色谱法既可以是柱色谱法，也可以是平面色谱法。在一些实施方式中，除了标准色谱柱，还可将允许双向流的柱(例如柱，可购自PhyNexus有限公司，圣何塞(San Jose,CA,U.S.A)或移液器尖头用于基于柱/基于流通模式(flow through mode)的方法中。因此，在一些情况中，可用于本文方法中的色谱柱还包括移液器尖头或允许双向流的柱。在一些情况下，例如采用微粒基质材料时，该微粒基质材料的平均粒径可为例如约5μm～约200μm，或约5μm～约400μm，或约5μm～约600μm。在一些方面中，色谱基质可为或可包括例如聚合树脂或金属氧化物或类金属氧化物。在一些方面中，例如采用平面色谱时，基质材料可为任何适于平面色谱的材料，例如常规纤维素基或有机聚合物基膜(例如纸膜、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF))或二氧化硅包被的玻璃板。在一个实施方式中，色谱基质/固定相是非磁性材料或不可磁化的材料。
在一些实施方式中，适于本文方法的非磁性或不可磁化色谱固定相包括衍生化二氧化硅或交联凝胶。在一些方面中，交联凝胶可基于天然聚合物，例如基于自然界存在的聚合物类。例如，可作为色谱固定相基础的天然聚合物为多糖。在一些情况下，多糖各自通常是交联的。多糖基质的例子包括但不限于：琼脂糖凝胶(例如，SuperflowTM琼脂糖或材料，例如以不同珠和孔径可市售获得的SuperflowTM/>)或交联葡聚糖凝胶。另一示例性的例子是微粒交联琼脂糖基质，其共价结合有葡聚糖，可作为市售购自GE Healthcare公司(以不同尺寸和不同孔径)。此类色谱材料的另一示例性实例是/>其也可以不同珠和孔径获自GE Healthcare公司。
在一些实施方式中，交联凝胶可基于合成的聚合物，例如基于自然界中不存在的聚合物类。在一些方面中，色谱固定相所基于的此类合成的聚合物具有极性单体单元，由此其本身具有极性。因此，在一些情况中，该极性聚合物是亲水性的。在一些方面中，亲水性分子(也称疏油性)包含能与水分子形成偶极-偶极相互作用的部分。通常，疏水性分子(也称亲脂性)具有由水分离的趋势。
适合的合成聚合物的示例性例子是：聚丙烯酰胺类、苯乙烯-二乙烯基苯凝胶和丙烯酸酯和二醇的共聚物或丙烯酰胺与二醇的共聚物。示例性的例子是聚甲基丙烯酸凝胶，作为市售可获得。另一例子是乙二醇和甲基丙烯酸酯的共聚物，作为市售可获得。在一些实施方式中，色谱固定相还可包含天然和合成聚合物组分，例如多糖和琼脂糖的复合基质或复合物或共聚物(例如聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物)，或多糖和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的复合基质或复合物或共聚物。葡聚糖与N,N'-亚甲基双丙烯酰胺共聚物的示例性例子是如上所述的/>系列材料。在一些实施方式中，衍生的二氧化硅可包括偶联于合成或天然聚合物的二氧化硅颗粒。此类实施方式的例子包括但不限于：多糖接枝的二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝的二氧化硅、聚环氧乙烷接枝的二氧化硅、聚(2-羟乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的二氧化硅。
在一些实施方式中，色谱基质是凝胶过滤基质，例如当如本文所述用于移除盒中时。通常，凝胶过滤可以其设计经历的特征来表征。因此，凝胶过滤基质在一些方面中，很大程度上基于细胞或其他生物实体的尺寸实现对它们的分离。在一些此类方面中，相应色谱基质通常是如上所述的微粒状多孔材料。色谱基质可具有一定的排阻限度，其通常如上用分子量来限定完全被排除进入孔的分子。在一些实施方式中，可选择低于相应目标细胞重量的重量作为限定尺寸排阻限度的相应分子量。在该实施方式中，目标细胞被阻止进入尺寸排阻色谱基质的孔中。类似地，固定相可具有尺寸小于所选目标细胞的孔。在示例性实施方式中，色谱基质的平均孔径为0～约500nm。
在一些实施方式中，样品中存在的组分，例如作用剂(如受体结合剂或选择剂)或竞争性反应剂可具有小于孔的排阻限度的尺寸，从而能够进入色谱基质的孔中。在一些方面中，能够部分或全部进入孔容的此类组分中，进入孔容较少的较大分子被首先洗脱，而最小的分子通常最后被洗脱。在一些实施方式中，选择低于目标细胞最大宽度的色谱基质排阻限度。因此，在一些方面中，进入孔容的组分比目标细胞在色谱基质中/上保持更久。因此，在一些情况中，可在色谱柱的洗脱物中收集从样品中其他物质/组分中分离的目标细胞。因此，在一些方面中，组分，例如作用剂(例如受体结合剂或选择剂)或可用时的竞争性反应剂，可比目标细胞从凝胶过滤基质中在更晚的时间点洗脱出。在一些实施方式中，例如若凝胶渗透基质包含具有能结合作用剂(例如受体结合剂或选择剂)的结合位点Z的反应剂(例如共价结合于其上)和/或样品中存在竞争性反应剂，该效果可被进一步增加。在一些情况中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)和/或竞争性反应剂可通过反应剂的结合位点Z结合，从而固定在基质上。在一些方面中，该方法在移除盒中进行。
在一些实施方式中，用于本文方法中的色谱基质还可包括磁力可吸引物质，例如一种或多种磁力可吸引颗粒或铁磁流体。各磁力可吸引颗粒可包括具有能结合目标细胞的结合位点的反应剂。在一些情况中，磁力可吸引颗粒可包含抗磁性、铁磁性、顺磁性或超顺磁性材料。通常，超顺磁性材料以诱导磁场响应磁场而不会导致永久磁化。基于铁氧化物的磁性颗粒为例如市售可获得的：Dyn珠(Dynal Biotech公司)、磁性MicroBeads(MiltenyiBiotec公司)、磁性多孔玻璃珠(CPG有限公司)、以及获自各自其他来源，例如RocheApplied Science公司、BIOCLON公司、BioSource国际有限公司、micromod公司,AMBION公司、Merck公司、Bangs Laboratories公司、Polysciences公司或Novagen有限公司，仅列出其中一些公司。基于超顺磁Co和FeCo的磁性纳米颗粒以及铁磁性Co纳米晶体已有描述，例如Hutten,A等(J.Biotech.(2004),112,47-63)。在其他实施方式中，用于本文方法的色谱基质没有任何磁力可吸引物质。
在一些实施方式中，提供了包含至少一个第一固定相和第二固定相的组合件(arrangement)的设备，所述第一固定相和第二固定相为例如用于选择细胞的色谱柱(选择盒)和用于移除反应剂的第二色谱柱(移除盒)。该设备可包括串联流体连通的第一和第二固定相(色谱柱)的多个组合件。该设备可包括样品入口，该入口与第一和第二固定相的第一组合件的第一固定相流体连通。在一些实施方式中，该设备还可包括用于细胞的样品出口，该样品出口与用于色谱的第一和第二固定相的至少一个组合件中的最后一个的第二固定相流体连通。在一些方面中，该设备还可包括竞争性反应剂容器，其与第一和第二固体相的组合件的至少一个第一固体相流体连通。
2.可溶解
在一些实施方式中，反应剂不结合于固体支持物，即其以溶解形式存在或是溶解的。原则上，在反应剂固定在支持物(例如固体支持物或固定相)上的情况中，可使用相同的反应剂。例如，任何如上所述的示例性反应剂均可使用而无需将该反应剂固定或附着于支持物，例如不附着于固体支持物或固定相。在一些实施方式中，反应剂包含多个结合位点Z以通过与结合伴侣C的相互作用可逆结合于结合剂。在一些情况中，反应剂是个体分子的寡聚体或多聚体，或是形成个体分子的亚基的复合物的寡聚体或多聚体(例如二聚体蛋白、三聚体蛋白或四聚体蛋白的共聚体或多聚体)。在一些实施方式中，反应剂可为例如链霉亲和素突变蛋白寡聚体、钙调蛋白寡聚体、提供至少两个螯合基团K的化合物(寡聚体)，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属例子，由此使得反应剂能够结合寡组氨酸亲和标签、多聚谷胱甘肽-S-转移酶或生物素化载体蛋白。
在一些实施方式中，反应剂的特征是不含附着于该反应剂的固体支持物(表面)。例如，在一些实施方式中，反应剂不含或不附着于(直接或间接)颗粒、珠、纳米颗粒、微球或其他固体支持物。在一些实施方式中，反应剂是非刚性的、坚硬或硬性的，或不含或不附着于刚性、坚硬或硬性表面。在一些实施方式中，反应剂是柔性的或基本上柔性。在一些情况中，反应剂能够调节或匹配到细胞表面的形式。在一些实施方式中，反应剂的形状不是球形或基本球形，或不包含球形或基本球形的形状。
在一些实施方式中，基本全部，即多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的反应剂为有机材料、由有机材料组成或包含有机材料。例如，在一些实施方式中，多于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的反应剂为脂质、碳水化合物、蛋白质、肽或它们的混合物，由脂质、碳水化合物、蛋白质、肽或它们的混合物组成，或包含脂质、碳水化合物、蛋白质、肽或它们的混合物。在一些实施方式中，反应剂基本上缺少如下物质、基本不由如下物质组成或基本不含如下物质：无机材料、无机核心(例如金属，如铁)、合成或无机聚合物(例如苯乙烯聚合物，如聚苯乙烯)、乳胶、二氧化硅或磁性核心。例如，在一些实施方式中，反应剂的无机材料或组成反应剂一部分的无机材料的相对百分比少于20％、5％、10％、5％或更少。
在一些实施方式中，水性溶液中反应剂的总体积的大部分(即多于50％，例如多于60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)由反应剂所包含的个体蛋白分子组成，例如个体分子或形成个体分子的亚基的复合物(例如四聚体分子)的寡聚体或多聚体。在一些实施方式中，可溶反应剂的总密度小于1.2g/cm3、1.1g/cm3、1.0g/cm3或更小。
在一些实施方式中，可溶反应剂(例如不附着于支持物或固体支持物，如不附着于珠)具有相对小的尺寸，例如尺寸通常小于或约小于20nM，例如小于或约小于15nM，小于或约小于10nM，小于或约小于5nM或更小。
在一些实施方式中，可溶反应剂(例如不附着于支持物或固体支持物，如不附着于珠)是生物惰性的，即其对活细胞无毒性。在一些实施方式中，反应剂可生物降解，例如，其可通过酶活性降解或通过吞噬细胞清除。
在一些实施方式中，可使反应剂(例如链霉亲和素或突变蛋白，如四聚化链霉亲和素突变蛋白)与载体(例如有机载体)反应。在一些方面中，除了与多糖的反应以外，还可将生理学或药学上可接受的蛋白质，例如血清白蛋白(如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))用作载体蛋白。在此情况中，反应剂(例如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白，个体四聚体或寡聚体形式)可通过非共价相互作用与载体蛋白偶联。在一些此类实施方式中，生物素化BSA(可通过不同供应商市售获得，例如ThermoFisher Scientific公司、SigmaAldrich公司或Vectorlabs公司，仅列出一些公司名)可与反应剂(例如链霉亲和素突变蛋白)反应。在一些方面中，反应剂寡聚体(例如链霉亲和素寡聚体)中的一些可通过一个或多个结合位点Z非共价结合于生物素化载体蛋白，而将寡聚体的大部分结合位点Z留出用于结合于作用剂(例如受体结合剂或选择剂)以及本文所述的任何其他作用剂。因此，通过该途径，可制备具有多个结合位点Z的可溶反应剂。
在其他实施方式中，反应剂(例如链霉亲和素突变蛋白，个体四聚体或寡聚体形式)可共价偶联合成的载体，例如聚乙二醇(PEG)分子。例如，可将任何合适的PEG分子用于该目的，PEG分子和相应的反应剂可具有可溶性。通常，分子量最高达1000Da的PEG分子在水或可用于本文所述方法的培养基中可溶。在一些情况中，该基于PEG的反应剂可采用市售可获得的活化PEG分子(例如，PEG-NHS衍生物，可获自NOF North America公司，美国加利福尼亚州爱尔文；或活化的PEG衍生物，可获自Creative PEGWorks，美国北卡罗来纳州教堂山)与链霉亲和素突变蛋白的氨基基团制备。
C.作用剂
在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)具有用于结合细胞表面上的分子(例如细胞表面分子)的一个或结合位点B。因此，在一些情况中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)包含一个结合位点B或多个结合位点B，其中作用剂(例如受体结合剂或选择剂)与目标细胞表面上分子的特异性结合包括B和分子之间的相互作用。在一些实施方式中，作用剂仅包含单个结合位点，即为单价。在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)具有能够结合细胞表面分子的至少两个，例如多个结合位点B，包括3、4或5个结合位点B。在一些此类方面中，所述至少两个或多个结合位点B可相同。在一些实施方式中，一个或多个所述至少两个或多个结合位点B可不同(例如B1和B2)。
在一些实施方式中，一种或多种不同作用剂(例如一种或多种不同受体结合剂、选择剂或结合细胞上分子的其他作用剂)可逆结合反应剂。在一些实施方式中，至少2、3、4或更多种不同作用剂可逆结合相同的反应剂。在一些实施方式中，至少两种不同作用剂可逆结合相同的反应剂，由此各反应剂包含用于该作用剂和分子之间特异性结合的一个结合位点B或多个结合位点B。在一些实施方式中，所述至少两种或更多种作用剂包含相同的结合位点B，例如用于结合相同或基本相同的分子。在一些实施方式中，所述至少两种或更多种作用剂包含不同结合位点B，例如用于结合不同的分子。在一些实施方式中，第一作用剂(例如第一受体结合剂或第一选择剂)包含结合位点B1、B2、B3、B4等，第二作用剂(例如第二受体结合剂或第二选择剂)包含其他结合位点B1、B2、B3、B4等。在一些实施方式中，第一作用剂(例如第一选择剂)包含结合位点B1，第二作用剂(例如第二选择剂)包含结合位点B3。在一些实施方式中，第一作用剂(例如第一受体结合剂)包含结合位点B2，第二作用剂(例如第二受体结合剂)包含结合位点B4。在任何此类实施方式中，第一作用剂和第二作用剂可包含结合伴侣，C1或C2。在一些实施方式中，C1和C2可相同。在一些实施方式中，C1和C2不同。在一些实施方式中，第一作用剂和第二作用剂包含相同的结合伴侣C1。
在一些情况中，该作用剂(例如通过结合位点B)与反应剂的结合位点Z之间结合的解离常数(KD)的值可为约10-2M～约10-13M，或约10-3M～约10-12M，或约10-4M～约10-11M，或约10-5M～约10-10M。在一些实施方式中，结合剂和分子之间结合的解离常数(KD)为低亲和力，例如KD为约10-3～约10-7M。在一些实施方式中，结合剂和分子之间结合的解离常数(KD)为高亲和力，例如KD为约10-7～约1×10-10M。
在一些实施方式中，作用剂通过结合位点B与分子结合的解离发生得足够迅速，例如在反应剂和作用剂间的可逆键被破坏后，解离迅速得足以使得目标细胞仅被瞬时染色或与作用剂关联。在一些情况中，当用koff速率(也称为解离速率常数)表述作用剂(通过结合位点B)与分子的结合时，koff速率可为0.5×10-4秒-1或更大，约1×10-4秒-1或更大，约2×10-4秒-1或更大，约3×10-4秒-1或更大，约4×10-4秒-1或更大，约5×10-4秒-1或更大，约1×10-3秒-1或更大，约1.5×10-3秒-1或更大，约2×10-3秒-1或更大，约3×10-3秒-1或更大，约4×10-3秒-1,约5×10-3秒-1或更大，约1×10-2秒或更大，或约5×10-1秒-1或更大。本领域技术人员具有凭经验确定适于具体作用剂和细胞分子相互作用的koff速率范围的水平(参见例如美国申请公开号US2014/0295458)。例如，可使用具有较高koff速率(例如高于4.0×10-4秒-1)的作用剂，从而在破坏结合复合物后，可在一小时内去除或解离大部分该作用剂。在其他情况中，可使用具有较低koff速率(例如1.0×10-4秒-1)的作用剂，从而在破坏结合复合物后，可在约3个半小时内从细胞去除或解离大部分该作用剂。
在一些实施方式中，该键的KD以及作用剂(例如受体结合剂或选择剂)的结合位点B与细胞表面分子之间形成的键的KD、KA、koff和kon速率可通过任何合适的方法确定，例如通过荧光滴定、平衡透析或表面等离振子共振。
在一些方面中，细胞表面分子是作用剂(例如结合剂，如受体结合剂或选择剂)可针对的分子。在一些实施方式中，细胞表面分子是肽或蛋白质，例如受体，如膜受体蛋白。在一些实施方式中，受体为脂质、多糖或核酸。在一些实施方式中，细胞表面分子为蛋白质，其可为外周膜蛋白或整合膜蛋白。在一些实施方式中，细胞表面分子可具有一个或多个跨膜结构域。作为一些示例性例子，具有跨膜结构域的膜蛋白可为：G蛋白偶联受体，例如气味受体，视紫红质受体、视紫红质信息素受体，肽激素受体、味觉受体、GABA受体、鸦片受体，血清素受体，Ca2+受体，黑视素，神经递质受体，例如配体门控、电压门控或机械门控受体，包括乙酰胆碱、尼古丁、肾上腺素、去甲肾上腺素、儿茶酚胺、L-DOPA-、多巴胺和血清素(生物胺，内啡肽/脑啡肽)神经肽受体，受体激酶，例如丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶、孔蛋白/通道(例如氯通道、钾通道、钠通道)，OMP蛋白，ABC转运蛋白(ATP-结合盒转运蛋白)，例如氨基酸转运蛋白，Na-葡萄糖转运蛋白，Na/碘转运蛋白，例子转运蛋白，如光收获复合物(LightHarvesting Complex)，细胞色素氧化酶，ATP酶Na/K、H/K、Ca，细胞附着受体，例如金属蛋白酶，整合素或钙粘素。
在一些实施方式中，细胞表面分子可为限定所需细胞群或亚群的抗原，所述细胞群或亚群为例如血细胞群或亚群，如淋巴细胞(例如T细胞、T辅助细胞，如CD4+T辅助细胞，B细胞或天然杀伤细胞)、单核细胞或干细胞，例如CD34+外周干细胞或表达Nanog或Oct-4的干细胞。T细胞的例子包括如下细胞：例如CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节T细胞(Treg)。Treg的示例性例子为CD4 CD25 CD45RA Treg细胞，记忆T细胞的示例性例子是CD62LCD8+特异性中心记忆T细胞。细胞表面分子可为肿瘤细胞标志物。
如前所述，在一些实施方式中，作用剂(例如结合剂，如受体结合剂或选择剂)除了具有能结合细胞表面分子的结合位点B以外，还具有结合伴侣C。在一些方面中，该结合伴侣C能够结合反应剂的结合位点Z，其中，该反应剂具有针对结合伴侣C的一个或多个结合位点。在一些实施方式中，包含于作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中的结合伴侣C与一个或多个结合位点Z之间可形成非共价键，该共价键可为任何强度和亲和力，且可在实施该方法的条件下被破坏或逆转。作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可包括至少1个、至少2个、3个或更多个额外的结合伴侣C，反应剂可包括至少2个，例如3、4、5、6、7、8或更多个针对作用剂(例如受体结合剂或选择剂)所含结合伴侣C的结合位点Z。如美国专利7,776,562、美国专利8,298,782或国际专利申请公开号No.WO 2002/054065中所述，可选择结合伴侣和具有一个或多个相应结合位点Z的反应剂的任何组合，例如使得结合伴侣C和结合位点Z能够在复合物中可逆结合，以例如产生亲和效果。
作用剂(例如受体结合剂或选择剂)所包含的结合伴侣C可例如基于烃的(包括聚合的)，且包括氮-、磷-、硫-、碳-、卤素-或拟卤素基团。在一些方面中，其可为醇、有机酸、无机酸、胺、膦、硫醇、二硫化物、烷烃、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、核酸、脂质、糖、寡糖或多糖。作为进一步的例子，其还可为阳离子、阴离子、聚阳离子、聚阴离子、聚合阳离子、电解质、聚电解质、碳纳米管或碳纳米泡沫。通常，该结合伴侣C对反应剂结合位点的亲和力高于对其他物质的亲和力。相应结合伴侣C的例子包括但不限于冠醚、免疫球蛋白、其片段和具有抗体样功能的蛋白质性结合分子。
在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C包括生物素，反应剂包括可逆结合生物素的链霉亲和素类似物或亲和素类似物。在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C包括可逆结合链霉亲和素或亲和素的生物素类似物，反应剂包括可逆结合相应生物素类似物的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或亲和素类似物。在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C包括链霉亲和素或亲和素结合肽，反应剂包括可逆结合相应链霉亲和素或亲和素结合肽的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或亲和素类似物。
在一些实施方式中，反应剂是链霉亲和素，例如任何如上所述的链霉亲和素突变蛋白(例如，如SEQ ID NO:3-6所示)，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C可包括链霉亲和素结合肽。在一些实施方式中，肽序列包含具有SEQ ID NO:9所示通式的序列，例如包含SEQ ID NO:10所示序列。在一些实施方式中，肽序列具有SEQ ID NO:11所示的通式，例如如SEQ ID NO:12所示。在一个实例中，肽序列为Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称如SEQ ID NO:7所示)。在一个实例中，肽序列为Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称/>如SEQ ID NO:8所示)。在一些实施方式中，肽配体包含依次排列的至少两个链霉亲和素-结合模块，其中，所述两个模块之间的距离是至少0个且不大于50个氨基酸，其中，一个结合模块具有3～8个氨基酸且至少包含序列His-Pro-Xaa(SEQ ID NO:9)，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，例如如SEQ ID NO:11所示(参见例如国际公开的PCT申请公开号WO02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方式中，肽配体包含SEQ IDNO:13或14中任一所示的序列。在一些实施方式中，所述肽配体具有SEQ ID NO:15-19中任一项所示的氨基酸序列。在大部分情况中，所有这些链霉亲和素结合肽结合相同的结合位点，即链霉亲和素的生物素结合位点。如果将一个或多个链霉亲和素结合肽用作结合伴侣C(例如C1和C2)，则多聚化反应剂通常为链霉亲和素突变蛋白。
在一些实施方式中，链霉亲和素结合肽可被进一步修饰。在一些实施方式中，链霉亲和素结合肽可包括肽序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称 如SEQID NO:8所示)，该肽序列偶联于镍填充的trisNTA(也称为His-STREPPE或/>衔接体)。
在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)的结合伴侣C包括本领域技术人员已知作为亲和标签的部分。在该实施方式中，反应剂可包括已知结合该亲和标签的相应结合伴侣，例如抗体或抗体片段。作为已知亲和标签的一些示例性例子，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C可包括：二硝基苯酚或地高辛、寡聚组氨酸、多聚组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、甲壳素结合蛋白(CBP)或硫氧还蛋白、钙调蛋白结合肽(CBP)、FLAG-肽、HA-标签(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala)(SEQ ID NO:20)、VSV-G-标签(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys)(SEQ ID NO:21)、HSV-标签(序列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp)(SEQ ID NO:22)、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)(SEQ ID NO:22)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯疱疹病毒糖蛋白D的序列Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp(SEQ ID NO:24)的HSV表位、序列为Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(SEQ ID NO:25)的转录因子c-myc的“myc”表位、V5-标签(序列：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)(SEQ ID NO:26)、或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。在此类实施方式中，反应剂(可为抗体或抗体片段)的一个或多个结合位点Z和抗原之间形成的复合物能通过加入游离抗原(即游离肽(表位标签))或游离蛋白质(例如MBP或CBP)被竞争性破坏。在一些实施方式中，亲和标签还可为寡核苷酸标签。在一些情况中，该寡核苷酸标签可例如用于杂交反应剂中所连接或包含的具有互补序列的寡核苷酸。
适合的结合伴侣C的其他例子包括但不限于：凝集素、蛋白A、蛋白G、金属、金属离子、次氮基三乙酸衍生物(NTA)、RGD-基序、葡聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、氧化还原聚合物、糖蛋白、适体、染料、直链淀粉、麦芽糖、纤维素、甲壳素、谷胱甘肽、钙调蛋白、明胶、多粘菌素、肝素、NAD、NADP、赖氨酸、精氨酸、苄脒、多聚U、或寡聚-dT.凝集素(例如伴刀豆蛋白A)已知可结合多糖或糖基化蛋白。染料的示例性例子是三嗪染料染料，例如Cibacron蓝F3G-A(CB)或Red HE-3B，其特异性结合NADH依赖性酶类。通常，Green A结合Co A蛋白、人血清白蛋白以及脱氢酶。在一些情况中，染料7-氨基放线菌素D和4’,6-二脒基-2苯基吲哚结合DNA。通常，金属(例如Ni、Cd、Zn、Co或Cu)的阳离子常被用于结合亲和标签，例如包含寡聚组氨酸的序列，包括六组氨酸或His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys标签(MAT标签)(SEQ ID NO:35)和N-甲基丙烯酰基-(L)-半胱氨酸甲酯。
在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C与反应剂的一个或多个结合位点Z之间的结合在二价、三价或四价阳离子的存在下发生。就此而言，在一些实施方式中，反应剂包括二价、三价或四价阳离子，通常由合适的螯合剂容纳(例如复合)。在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C可包括含(例如复合)二价、三价或四价阳离子的部分。相应金属螯合剂的例子包括但不限于：乙二胺、乙二胺四乙酸盐(EDTA)、乙二醇四乙酸(ETGA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双(羧甲基)甘氨酸(也称次氮基三乙酸，NTA)、l,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)、2,3-二巯基-1-丙醇(二巯基丙醇)、卟吩和亚铁血红素。作为例子，EDTA形成包含大部分单价、二价、三价和四价金属离子(例如银(Ag+)、钙(Ca2+)、锰(Mn2+)、铜(Cu2 +)、铁(Fe2+)、钴(Co+)和锆(Zr4+))的复合物，而BAPTA特异于Ca2+。作为示例性的离子，用于本领域的标准方法是星形寡聚组氨酸标签与铜(Cu2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)或锌(Zn2+)离子之间的复合物，这些离子由螯合剂次氮基三乙酸(NTA)呈递。
在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C包括钙调蛋白结合肽，反应剂包括多聚化钙调蛋白，例如如美国专利5,985,65中所描述。在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C包括FLAG肽，反应剂包括结合FLAG肽的抗体，例如结合单克隆抗体4E11的FLAG肽，如美国专利4,851,341中所述。在一个实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C包括寡聚组氨酸标签，反应剂包括结合该寡聚组氨酸标签的抗体或过渡金属离子。在一些情况中，对所有这些结合复合物的破坏可通过金属离子螯合(例如钙螯合，如通过加入EDTA或EGTA)完成。在一些实施方式中，钙调蛋白、抗体(例如4E11)或螯合的金属离子或游离螯合剂可通过常规方法多聚化，例如在第一步中基本如Noguchi,A等，Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137所述，通过生物素化以及与链霉亲和素或亲和素或其寡聚物的络合，或通过在多糖(例如葡聚糖)中引入羧基残基，并在第二步中采用常规的碳二亚胺化学法，通过伯氨基团将钙调蛋白或抗体或螯合的金属离子或游离螯合剂连接于多糖(如葡聚糖)骨架中的羧基。在一些此类实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)中所包含的结合伴侣C与反应剂的一个或多个结合位点Z之间的结合通过金属离子螯合被破坏。金属螯合可例如通过加入EGTA或EDTA完成。
在一些实施方式中，特异性结合细胞表面分子的作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可例如包括抗体、其片段、或具有抗体样功能的蛋白质性结合分子。在一些实施方式中，作用剂的结合位点B是抗体结合位点，例如其为或包含抗体的一个或多个互补决定区(CDR)。(重组)抗体片段的例子包括但不限于：Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段，例如F(ab’)2F(ab’)2-片段、双抗体、三抗体(Iliades,P.等.,FEB S Lett(1997)409,437-441)、八抗体(Stone,E.等,Journal of Immunological Methods(2007)318,88-94)和其他结构域抗体(Holt,L.J.等，Trends Biotechnol.(2003),21,11,484-490)。在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可包括二价蛋白质性人工结合分子，例如二聚脂质运载蛋白突变蛋白(也称双运载蛋白“duocalin”)。
在一些实施方式中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可具有单个结合位点B，即其可为单价。单价作用剂(例如受体结合剂或选择剂)的例子包括但不限于：单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子或MHC分子。单价抗体片段的例子包括但不限于：Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)，包括二价单链Fv片段。
在一些实施方式中，作用剂为抗体或其抗原结合片段，例如Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段，如F(ab’)2片段。在一些实施方式中，作用剂为或衍生自已知结合感兴趣细胞分子的亲本抗体。各种抗细胞表面分子的抗体分子或其片段在本领域中是熟知的，此种任何均可用作本文所述方法中的作用剂。在一些实施方式中，作用剂为在其亲本或参考抗体的可变重链中具有一个或多个氨基酸替代的抗体或其片段，例如以产生具有如上所述的改变的亲和力或显示足够快速的解离速率的抗体。例如，已知示例性的此类突变为抗CD4抗体13B8.2的突变(参见例如美国专利No.7,482,000、美国专利申请公开No.US2014/0295458或国际专利申请公开No.WO2013/124474)，任何此类突变可在另一亲本或参考抗体中产生。
在一些方面中，作用剂(例如受体结合剂或选择剂)可为单价，例如包含单价抗体片段或单价人工结合分子(蛋白质性或其他)，例如基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白(也称“)，或为二价分子，例如两个结合位点均保留的抗体或片段(如F(ab’)2片段)。
具有抗体样功能的蛋白质性结合分子的例子包括基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白(参见例如WO 03/029462,Beste等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96,1898-1903)。通常，脂质运载蛋白，如胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein)、人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、人Apo脂质蛋白D或人泪液脂质运载蛋白，具有可被修饰的天然配体结合位点，从而使其结合所定目标。可用作特异性结合细胞表面分子的作用剂(例如受体结合剂或选择剂)的具有抗体样功能的蛋白质性结合分子的其他例子包括但不限于：所谓的糖体(参见例如国际专利申请公开No.WO 96/23879)、基于锚蛋白骨架的蛋白质(Mosavi,L.K.等，Protein Science(2004)13,6,1435-1448)或基于晶体骨架的蛋白质(例如国际专利申请公开No.WO 01/04144)、Skerra所描述的蛋白质(J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187)、阿迪连接素(AdNectins)、四连接素和阿维多聚体(avimers)。通常，包括由人受体结构域家族的外显子改组而成的多价阿维多聚体蛋白的阿维多聚体包含所谓的A-结构域，该结构域在数种细胞表面受体中作为多个结构域的串存在(Silverman,J.等,NatureBiotechnology(2005)23,1556-1561)。阿迪连接素(通常衍生自人纤连蛋白结构域)代表性地包含3个环，其可被工程化改造用于免疫球蛋白样结合靶标(Gill,D.S.&Damle,N.K.,Current Opinion in Biotechnology(2006)17,653-658)。四连接素(通常衍生自相应的人同三聚蛋白)同样代表性地在C型连接素结构域中包含环结构域，其可被工程化改造用于所需的结合。在某些情况中可用作蛋白质配体的类肽通常为寡聚(N-烷基)甘氨酸，其与肽的去边在于侧链与酰胺氮连接而非与碳原子连接。类肽通常耐受蛋白酶和其他修饰酶，且可比肽具有高得多的细胞穿透性(参见例如Kwon,Y.-U.和Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。
合适的蛋白质性结合分子的其他例子包括但不限于：EGF样结构域、环状(Kringle)结构域、I型纤连蛋白结构域、II型纤连蛋白结构域、III型纤连蛋白结构域、PAN结构域、Gla结构域、SRCR结构域、库尼茨(Kunitz)/牛胰脏胰蛋白酶抑制剂结构域、淀粉酶抑肽、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶草(P型)结构域、C型血管性血友病因子结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、I型甲状腺球蛋白重复、LDL受体A类结构域、寿司(Sushi)结构域、连接(Link)结构域、I型血小板反应蛋白结构域、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域(例如结构域抗体或骆驼重链抗体)、C型连接素结构域、MAM结构域、A型血管性血友病因子结构域、生长调节素B结构域、WAP型四二硫化物核心结构域、C型F5/8结构域、血液结合素结构域、SH2结构域、SH3结构域、层连蛋白型EGF样结构域、C2结构域、“κ体(Kappabodies)”(Ill等，Protein Eng(1997)10，949-57)、所谓“迷你体”(Martin等，EMBO J(1994)13，5303-5309)、双抗体(Holliger等，PNAS USA(1993)90，6444-6448)、所谓“Janusis”(Traunecker等，EMBO J(1991)10，3655-3659或Traunecker等，Int J Cancer(1992)增刊7，51-52)、纳米体、微体、粘合素(affilin)、亲和体、绳结蛋白(knottin)、泛素、锌指蛋白、自荧光蛋白或富亮氨酸重复蛋白。在一些实施方式中，具有抗体样功能的核酸分子可为适体。通常，适体折叠成确定的三维基序，并对给定目标结构具有高亲和力。
1.受体结合剂
在一些实施方式中，作用剂为受体结合剂。在一些实施方式中，受体结合剂结合于细胞表面上的分子(例如受体)，该作用剂与该分子之间的结合能够诱导或调节细胞中的信号。在一些情况中，细胞表面分子(例如受体)是信号转导分子。在一些此类情况中，受体结合剂能够特异性结合有一个或多个细胞表达的信号转导分子。在一些情况中，受体结合分子是刺激剂，其可为结合细胞表面分子(例如受体)时能够诱导细胞(例如T细胞)中信号的任何作用剂。
在一些实施方式中，信号可为免疫刺激性信号，在该情况中，受体结合剂或刺激剂能够诱导或调节涉及或刺激细胞(例如T细胞)免疫应答的信号，例如增加免疫细胞增殖或扩增、免疫细胞活化、免疫细胞分化、细胞因子分泌、细胞毒活性或免疫细胞的一种或多种其他功能性活性。在一些实施方式中，信号可为抑制性信号，在该情况中，受体结合剂或刺激剂能够诱导或调节细胞(例如T细胞)中涉及或抑制免疫应答的信号，例如抑制或减少免疫细胞增殖或扩增、免疫细胞活化、免疫细胞分化、细胞因子分泌、细胞毒活性或免疫细胞的一种或多种其他功能性活性。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)是受体激动剂、受体拮抗剂或混合的受体激动剂/拮抗剂。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)是第一受体结合剂(例如第一刺激剂)。在一些方面中，第一受体结合剂(例如第一刺激剂)结合细胞表面上的第一分子(例如受体分子)。因此，在一些情况中，第一受体结合剂(例如第一刺激剂)诱导或调节信号。在一些方面中，通过第一受体结合剂(例如第一刺激剂)的信号诱导或调节影响细胞活化、刺激和/或扩增(增殖)。因此，在一些情况中，第一受体结合剂(例如第一刺激剂)为细胞提供主要活化，从而活化细胞。在一些实施方式中，第一受体结合剂(例如第一刺激剂)提供T细胞活化信号1(例如通过T细胞受体(TCR)参与(engagement)的信号)。
在一些实施方式中，根据所提供方法孵育或培养细胞在一种或多种作用剂的存在下进行或实施。在一些实施方式中，细胞的孵育或培养在第一受体结合剂(例如如上所述)和一种或多种第二受体结合剂(例如第二刺激剂)的存在下进行。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)是第二受体结合剂(例如第二刺激剂)。在一些情况中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)结合细胞表面上的分子(例如细胞表面分子，如受体分子)。在一些实施方式中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)诱导或调节信号(例如第二或额外信号)。在一些实施方式中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)能够增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
在一些方面中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)可增强或加强由第一受体结合剂(例如第一刺激剂)诱导的信号。在一些实施方式中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)结合辅助分子和/或能刺激或诱导细胞中的辅助或第二和/或额外信号。在一些方面中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)结合共刺激分子和/或提供共刺激信号。在一些实施方式中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)提供T细胞活化信号2(例如共刺激信号)。在一些实施方式中，第二受体结合剂(例如第二刺激剂)提供T细胞活化信号3(例如细胞因子信号、辅助信号、存活信号和/或环境信号)。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂，其可为第二受体结合剂(例如第二刺激剂))结合(例如特异性结合)于分子(例如第二分子)，所述分子可为共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子、粘附分子、TNF家族或TNF受体家族成员和/或Wnt受体或共受体，例如卷曲蛋白(Fz)家族受体。
在一些实施方式中，根据所提供方法孵育或培养细胞在3种或更多种作用剂(例如3种或更多种结合剂)的存在下进行或实施。在一些实施方式中，细胞的孵育或培养在调节一种或多种额外信号的一种或多种额外受体结合剂(例如第三受体结合剂)的存在下进行。例如，在一些实施方式中，根据所提供方法孵育或培养细胞在至少3种不同受体结合剂的存在下进行或实施，例如第一受体结合剂(如第一刺激剂)，其提供主要T细胞活化信号，例如信号1(例如通过T细胞受体(TCR)参与的信号)；第二受体结合剂(如第二刺激剂)，其提供信号2(例如共刺激信号或辅助信号)；额外(例如第三)受体结合剂(例如额外刺激剂)，其提供信号3(例如细胞因子信号、存活信号和/或环境信号)。可选择任何组合的任何数量的受体结合剂(例如刺激剂)用于本文所述的任何方法。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外(如第三)受体结合剂，如刺激剂)可为特异性结合受体(例如细胞表面上表达的受体)的结合剂。在一些情况中，受体结合剂(如刺激剂)是抗体或其抗原结合片段。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)可选自下组：抗受体抗体、抗受体抗体的二价抗体片段、抗受体抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。在一些情况中，具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子可为适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、阿迪连接素或阿维多聚体。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)是抗体或其抗原结合片段，例如Fab片段。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外(如第三)受体结合剂，如刺激剂)可为结合(例如特异性结合)受体的配体。在一些实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂)是内源性配体、同源配体、合成配体和/或其部分、变体或修饰形式。例如，在一些实施方式中，受体结合剂是结合细胞因子受体的细胞因子。在一些实施方式中，受体结合剂是结合趋化因子受体的趋化因子。在一些实施方式中，受体结合剂是细胞因子或趋化因子的部分或胞外结构域、或者是结合细胞表面粘附分子的粘附分子的部分或胞外结构域。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为本身是细胞表面或跨膜蛋白的内源性配体和/或同源配体的胞外结构域或其部分。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外(如第三)受体结合剂，如刺激剂)结合细胞表面上的分子，所述细胞可为淋巴细胞，包括但不限于B细胞、T细胞或自然杀伤细胞。细胞的示例性例子是带有CD40或CD137的B细胞(两种细胞群可在仅结合提供活化信号的第一作用剂(例如4-1BB配体)时增殖)；αCD40抗体分子或αCD137抗体分子(参见例如Zhang等，2010,J Immunol,184:787-795))。可用于B细胞扩增的作用剂(第一或第二)的其他示例性例子为：结合IgG、CD19、CD28或CD14的作用剂，例如αCD19、αIgG、αCD28或αCD14抗体分子或其抗原结合片段。还预期用于B细胞扩增的第一或第二作用剂可包括针对toll样受体或白介素(例如IL-21)的配体(参见例如Dienz O等，2009.J.Exp.Med.206:69)。应注意B细胞的脂多糖依赖性活化也包括在本发明中，这是因为脂多糖也可用作第一作用剂，且能配置本文所用的结合伴侣C1。
适合的细胞群的其他示例性例子包括：通过第一作用剂与TCR/CD3结合以及第二作用剂与T细胞上的辅助分子(例如CD28)结合活化后扩增的T细胞群。在该情况中，第一作用剂刺激T细胞中TCR/CD3复合物相关信号，第二作用剂通过结合作为辅助分子的CD28提供第二刺激。可用于T细胞扩增的作用剂还可包括白介素，例如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21(参见例如Cornish等，2006,Blood.108(2):600-8，Bazdar和Sieg,2007,Journal ofVirology,2007,81(22):12670-12674，Battalia等，2013,Immunology,139(1):109-120)。可用于T细胞扩增的作用剂的其他示例性例子是结合CD8、CD45或CD90的作用剂，例如αCD8、αCD45或αCD90抗体。T细胞群的示例性例子包括：抗体特异性T细胞、T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(记忆T细胞的示例性例子是CD62L+CD8+特异性中心记忆T细胞)或调节性T细胞(Treg的示例性例子为CD4+CD25+CD45RA+Treg细胞)。
适合的细胞群的其他示例性例子包括：天然杀伤细胞(NK细胞)，其可例如用结合CD16或CD56的作用剂(例如αCD16或αCD56抗体)扩增。该αCD16抗体的示例性例子是抗体3G8，其VH序列如SEQ ID NO:48所示，VL序列如SEQ ID NO:49所示(参见例如Hoshino等，Blood.1991Dec 15；78(12):3232-40.)。可用于NK细胞扩增的其他作用剂可为IL-15(参见例如Vitale等，2002.The Anatomical Record.266:87-92)。适合的细胞群的其他示例性例子包括单核细胞，其可例如采用结合CD14的作用剂(例如αCD14抗体分子)扩增。
在一些方面中，受体结合剂(例如刺激剂)特异性靶向目标细胞表面上表达的分子，其中所述分子为TCR或嵌合抗原受体。例如，目标细胞表面上表达的分子选自：T细胞或B细胞抗原受体复合物、CD3链、CD3ζ、T细胞受体或B细胞受体的抗原结合部分、或嵌合抗原受体。在一些情况中，受体结合剂靶向肽:MHC I类复合物。
在一些实施方式中，刺激剂结合带His标签的目标细胞表面上表达分子的胞外结构域。在一些情况中，刺激剂包含肽序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称如SEQ ID NO:8所示)，该肽序列偶联于镍填充的trisNTA(也称为His-STREPPE或/>衔接体)。在一些实施方式中，带有His标签的目标细胞表面上表达的分子是CD19。
在一些方面中，受体结合剂(例如刺激剂)特异性结合重组受体(例如CAR)的抗体部分。在一些情况中，重组受体的抗体部分包括免疫球蛋白恒定区的至少部分，如铰链区，例如，IgG4铰链区，和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方式中，恒定区或部分是人IgG的，例如IgG4或IgG1的。在一些情况中，反应剂加载有识别IgG4间隔子的αIgG。
在一些实施方式中，两种或多种受体结合剂可逆结合相同的反应剂(例如多聚化反应剂)，例如结合相同的寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂。在一些实施方式中，两种或多种受体结合剂(例如第一受体结合剂、第二受体结合剂和/或一种或多种额外(例如第三)受体结合剂)通过能可逆结合该两种或多种受体结合剂的多个结合位点可逆结合相同的反应剂(例如多聚化反应剂)。
在一些实施方式中，两种或多种受体结合剂可逆结合两种或多种不同的反应剂(例如多聚化反应剂)，例如两种或多种不同的寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂。在一些此类实施方式中，至少一种受体结合剂(例如第一受体结合剂)通过能可逆结合受体结合剂的多个结合位点可逆结合第一反应剂(例如第一多聚化反应剂)，至少一种或多种额外的受体结合剂(例如第二受体结合剂或第三受体结合剂)通过能可逆结合受体结合剂的多个结合位点可逆结合第二反应剂(例如第二多聚化反应剂)。
a.受体结合剂刺激T细胞活化
在一些实施方式中，第一受体结合剂(例如第一刺激剂)可刺激细胞(例如T细胞)中的TCR/CD3复合物相关信号(例如通过TCR参与的信号1)。在一些方面中，第一受体结合剂(例如第一刺激剂)可为特异性结合CD3的结合剂。在一些情况中，特异性结合于CD3的第一受体结合剂(例如第一刺激剂)可选自下组：抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD3结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。在一些情况中，具有抗体样结合特性的蛋白质性CD3结合分子可为适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、阿迪连接素或阿维多聚体。
在一些实施方式中，抗CD3 Fab片段可衍生自由淋巴瘤细胞系OKT3(CRL-8001TM；也可参见美国专利No.4,361,549)生产的CD3结合单克隆抗体。抗CD3抗体OKT3的重链可变区和轻链可变区描述于Arakawa等，J.Biochem.120,657-662(1996)，且分别包含SEQID NO:31和32所示的氨基酸序列。/>
b.受体结合剂刺激了共刺激和/或辅助信号
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二受体结合剂，如刺激剂)结合于分子，该分子为表达该分子的细胞(例如T细胞或B细胞)提供共刺激或辅助信号。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)结合于分子，该分子向表达该分子的细胞(例如T细胞)提供刺激或活化T细胞活化信号2(例如共刺激信号)。在一些实施方式中，受体结合剂向表达该分子的细胞(如T细胞)提供辅助信号。
在本文所提供的任何实施方式中，受体结合剂(例如第二受体结合剂，如刺激剂)可为特异性结合受体(例如细胞表面上表达的受体)的结合剂。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)是抗体或其抗原结合片段，例如结合于细胞表面分子的抗体或其抗原结合片段，所述细胞表面分子在结合所述作用剂时，刺激或激活T细胞活化信号2(例如共刺激信号)。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)可选自下组：抗受体抗体、抗受体抗体的二价抗体片段、抗受体抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。在一些情况中，具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子可为适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、阿迪连接素或阿维多聚体。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)是抗体或其抗原结合片段，例如Fab片段。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为结合(例如特异性结合)于受体(例如细胞表面分子)的配体，所述受体结合于该作用剂时刺激或活化T细胞活化信号2(如共刺激信号)。在一些实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂)是内源性配体、同源配体、合成配体和/或其部分、变体或修饰形式。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为内源性配体和/或同源配体的胞外结构域或其部分。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)能够结合如下中的任何一种或多种：CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BBL、CD30L和LIGHT。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为抗体、二价抗体(例如F(ab’)2片段或二价单链Fv片段)、单价抗体(例如Fab片段、Fv片段或单链Fv片段(scFv))，或者针对如下任何一种或多种的配体：CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BBL、CD30L和LIGHT，其中该受体结合剂(例如刺激剂)与该分子结合时，该作用剂能够诱导或调节细胞中的信号。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为针对如下任何一种或多种的配体：CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BBL、CD30L和LIGHT，其中该受体结合剂(例如刺激剂)与分子结合时，该作用剂能够诱导或调节细胞中的信号。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为内源性配体和/或同源配体的胞外结构域或其部分。例如，在一些实施方式中，受体结合剂为或包含B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICOS-L、PD-L1、OX40L、CD27、4-1BB(CD137)和/或CD30的胞外结构域或其部分。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)能够特异性结合目标细胞表面上除了CD28、CD3、CD137或CD40以外的分子。在一些情况中，受体结合剂(例如刺激剂)与目标细胞表面上除了CD28、CD3或CD40以外分子的结合诱导或调节目标细胞中的信号和/或改变目标细胞的功能，由此产生培养的目标细胞。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)能够结合TNF家族或TNF受体家族成员(例如TNF受体超家族成员)中的任何一个或多个，和/或结合Wnt受体或共受体(例如卷曲蛋白(Fz)家族受体)。
在一些实施方式中，细胞上的分子是TNF受体超家族的成员，例如肿瘤坏死因子受体1(CD120a)、肿瘤坏死因子受体2(CD120b)、淋巴毒素β受体(CD18)、OX40(CD134)、CD40(Bp50)、Fas受体(Apo-1，CD95)、诱饵受体3(TR6，M68)、CD27(S152，Tp55)、CD30(Ki-1)、4-1BB(CD137)、死亡受体4(TRAILR1，Apo-2，CD261)、死亡受体5(TRAILR2、CD262)、Decoy受体1(TRAILR3、LIT、TRID、CD263)、诱饵受体2(TRAILR4，TRUNDD，CD264)、RANK(CD265)、护骨素(OCIF，TR1)、TWEAK受体(Fn14，CD266)、TACI(IGAD2，CD267)、BAFF受体(CD268)、疱疹病毒进入介质(ATAR，TR2，CD270)、神经生长因子受体(p75NTR，CD271)、B细胞成熟抗原(TNFRSF13A，CD269)、糖皮质激素诱导的TNFR相关(AITR，CD357)、TROY(TAJ，TRADE)、死亡受体6(CD358)、死亡受体3(Apo-3，TRAMP，LARD，WS-1)或外异蛋白A2受体(XEDAR)。
在一些情况中，特异性结合TNF受体超家族蛋白的受体结合剂是抗体或其抗原结合片段(例如Fab片段)。在一些实施方式中，特异性结合TNF受体超家族蛋白的受体结合剂是结合(例如特异性结合)受体和/或其胞外结构域或其部分的配体。在一些实施方式中，配体为或包括TNFα、淋巴毒素β(TNF-C)、OX40L、CD154、FasL、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、BAFF、LIGHT、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、BAFF、GITR配体、TL1A或EDA-A2、或任何跨膜蛋白的胞外结构域或其部分。
在一些实施方式中，细胞上的所述分子是Wnt受体或共受体，受体(例如卷曲蛋白(Fz)家族受体)、脂蛋白受体相关蛋白(LRP-5/6)、受体酪氨酸激酶(RTK)以及受体相关孤儿受体2(ROR2)。在一些实施方式中，细胞上的所述分子是例如：卷曲蛋白-1(FZD1)、卷曲蛋白-2(FZD2)、卷曲蛋白-3(FZD3)、卷曲蛋白-4(FZD4)、卷曲蛋白-5(FZD5)、卷曲蛋白-6(FZD6)、卷曲蛋白-7(FZD7)、卷曲蛋白-8(FZD8)、卷曲蛋白-9(FZD9)或卷曲蛋白-10(FZD10)。
在一些情况中，特异性结合Wnt受体或共受体的受体结合剂是抗体或其抗原结合片段(例如Fab片段)。在一些实施方式中，特异性结合Wnt受体或共受体的受体结合剂可为结合(例如特异性结合)该受体的配体。在一些实施方式中，该配体为或包括例如：WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11和WNT16。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)能够结合CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM中的任何一者或多者。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为针对如下任何一种或多种的抗体、二价抗体(例如F(ab’)2片段或二价单链Fv片段)、单价抗体(例如Fab片段、Fv片段或单链Fv片段(scFv))，或者配体：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM，其中该受体结合剂(例如刺激剂)与该分子结合时，该作用剂能够诱导或调节细胞中的信号。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为针对如下任何一种或多种的配体：CD28、4-1BB(CD137)、CD40、CD40L、用于T细胞活化的接头(LAT)、CD27、OX40(CD134)和疱疹病毒进入介质(HVEM)，其中该受体结合剂(例如刺激剂)与分子结合时，该作用剂能够诱导或调节细胞中的信号。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为内源性配体和/或同源配体的胞外结构域或其部分。例如，在一些实施方式中，受体结合剂为或包含B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBL、CD40、CD40L、CD27L(CD70)和/或OX40L的胞外结构域或其部分。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为CD28，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD28。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为CD28，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD28。在一些方面中，特异性结合于CD28的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD28结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。具有抗体样结合特性的蛋白质性CD28结合分子可为适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、阿迪连接素和阿维多聚体。
在一些实施方式中，抗CD28 Fab片段可衍生自抗体CD28.3(作为合成单链Fv构建体保藏，GenBank登录号No.AF451974.1；还可参见Vanhove等，BLOOD,2003年7月15日，第102卷，第2期，第564-570页)，其重链和轻链分别包含SEQ ID NO:33和34。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞或B细胞)表面上的分子可为CD137，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD137。在一些方面中，特异性结合于CD137的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD137结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，抗CD137抗体可为LOB12、IgG2a或LOB12.3、IgG1(如Taraban等，Eur JImmunol.2002Dec；32(12):3617-27中所描述)。还可参见例如US6569997、US6303121、Mittler等，Immunol Res.2004；29(1-3):197-208。
在一些实施方式中，细胞(例如B细胞)表面上的分子可为CD40，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD40。在一些方面中，特异性结合于CD40的受体结合剂(其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗CD40抗体、抗CD40抗体的二价抗体片段、抗CD40抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD40结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，抗CD40抗体可为嵌合单克隆抗人CD40抗体替奈昔单抗和抗人CD40(Affymetrix公司，目录号no.14-0409-80)，或描述于例如US 2002/0142358、US 2007/0077242、WO 2001/083755、Zhang等，2010,J Immunol,184:787-795中的任何一种。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为CD40L(CD154)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD40L。在一些方面中，特异性结合于CD40L的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗CD40L抗体、抗CD40L抗体的二价抗体片段、抗CD40L抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD40L结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些方面中，抗CD40L抗体可为Hu5C8，如Blair等，JEM第191卷，第4期，651-660中所述。还可参见例如WO1999061065、US20010026932、US7547438、WO2001056603。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合ICOS。在一些方面中，特异性结合于ICOS的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗ICOS抗体、抗ICOS抗体的二价抗体片段、抗ICOS抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性ICOS结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。参见例如US20080279851和Deng等，HybridHybridomics.2004Jun；23(3):176-82。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为活化T细胞的接头(LAT)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合LAT。在一些方面中，特异性结合于LAT的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗LAT抗体、抗LAT抗体的二价抗体片段、抗LAT抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性LAT结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。参见，例如，Zhang等，Cell，1998年1月，9；92(1):83-92和Facchetti等，Am J Pathol.1999年4月；154(4):1037–1046。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为CD27，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD27。在一些方面中，特异性结合于CD27的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗CD27抗体、抗CD27抗体的二价抗体片段、抗CD27抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD27结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。参见例如WO2008051424、US 9023999、US 8481029、US 9169325、US9102737、US 2016/0185870和He等,J Immunol.2013年10月15日；191(8):4174-83。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为OX40(CD134)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合OX40。在一些方面中，特异性结合于OX40的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗OX40抗体、抗OX40抗体的二价抗体片段、抗OX40抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性OX40结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。参见例如US 2010/0196359、US 2015/0307617、WO 2015/153513、WO203038191和Melero等，Clin Cancer Res.2013年3月1日；19(5):1044-53。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为疱疹病毒进入介质(HVEM)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合HVEM。在一些方面中，特异性结合于HVEM的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗HVEM抗体、抗HVEM抗体的二价抗体片段、抗HVEM抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性HVEM结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。参见例如WO2006054961、WO2007001459、Park等，Cancer Immunol Immunother.2012年2月；61(2):203-14。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为CD90，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD90。在一些方面中，特异性结合于CD90的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗CD90抗体、抗CD90抗体的二价抗体片段、抗CD90抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD90结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。参见例如抗CD90抗体克隆5E10(Stemcell Technologies公司，目录号60045或BD Biosciences公司，目录号550402)以及抗CD90抗体G7(Biolegend公司，目录号105201)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)表面上的分子可为CD95，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合CD95。在一些方面中，特异性结合于CD95的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗CD95抗体、抗CD95抗体的二价抗体片段、抗CD95抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD95结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些方面中，抗CD95抗体可为单克隆小鼠抗人CD95 CH11(UpstateBiotechnology公司,普莱西德湖(Lake Placid),NY)，或可为抗CD95 mAb 7C11或抗-APO-1，例如WO 2015/197874、US 9309320、US 7935339和Paulsen等，Cell Death&Differentiation(“细胞死亡和分化”)18.4(2011):619-631中所描述的任何一种。
c.受体结合剂提供额外信号
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上与受体结合剂(可为第二或额外受体结合剂)结合的分子是在与作用剂结合时，刺激或活化细胞因子信号、趋化因子信号、细胞粘附信号、T细胞活化信号3或其他信号(例如环境信号)的细胞表面分子。在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上与受体结合剂(可为第二或额外受体结合剂)特异性结合的分子是细胞因子受体或趋化因子受体。在一些情况中，受体结合剂(例如额外的受体结合剂)为或包含粘附分子，是诱导细胞因子产生、趋化因子产生、粘附分子表达的因子，和/或涉及刺激和/或调节辅助信号和/或额外信号(例如环境信号)。
在本文所提供的任何实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)可为特异性结合受体(例如细胞表面上表达的受体)的结合剂。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)是抗体或其抗原结合片段，例如结合于细胞表面分子的抗体或其抗原结合片段，所述细胞表面分子在结合所述作用剂时，刺激或活化细胞因子信号、趋化因子信号、细胞粘附信号、T细胞活化信号3或额外信号(例如环境信号)。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)可选自下组：抗受体抗体、抗受体抗体的二价抗体片段、抗受体抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。在一些情况中，具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子可为适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、阿迪连接素或阿维多聚体。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)是抗体或其抗原结合片段，例如Fab片段。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为结合(例如特异性结合)于受体(例如细胞表面分子)的配体，所述受体结合于该作用剂时刺激或活化细胞因子信号、趋化因子信号、细胞粘附信号、T细胞活化信号3或额外信号(例如环境信号)。在一些实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂)是内源性配体、同源配体、合成配体和/或其部分、变体或修饰形式。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为内源性配体和/或同源配体的胞外结构域或其部分。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)为或包含特异性结合细胞因子受体的配体。在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)为或包含细胞因子受体的配体，例如细胞因子或其部分。
示例性的细胞因子受体包括但不限于：IL-2R、IL-7R、IL-21R、CD132(IL受体共同γ链)、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。示例性的配体(例如细胞因子)包括但不限于：IL-2、IL-7、IL-21、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、I型干扰素(例如IFNα和/或IFNβ)、IL-12、IL-17、IL-9和TNF、及其生物活性片段。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)为特异性结合细胞因子受体的抗体或其抗原结合片段。在一些情况中，特异性结合于细胞因子受体的受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)可选自下组：抗细胞因子受体抗体、抗细胞因子受体抗体的二价抗体片段、抗细胞因子受体抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性细胞因子受体结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如额外受体结合剂)为或包含特异性结合趋化因子受体的配体。在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)为或包含趋化因子受体的配体，例如趋化因子或其部分。
实例性的趋化因子受体包括但不限于：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。示例性的配体(例如趋化因子)包括但不限于：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，及其生物活性片段。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)为特异性结合趋化因子受体的抗体或其抗原结合片段。在一些情况中，特异性结合于趋化因子受体的受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)可选自下组：抗趋化因子受体抗体、抗趋化因子受体抗体的二价抗体片段、抗趋化因子受体抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性趋化因子受体结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。
在一些情况中，特异性结合粘附分子或诱导细胞因子的因子的受体结合剂是抗体或其抗原结合片段(例如Fab片段)。在一些实施方式中，特异性结合粘附分子或诱导细胞因子的因子的受体结合剂可为结合(例如特异性结合)该受体的配体。
在一些实施方式中，受体结合剂是粘附分子和/或受体的内源性配体、同源配体、合成配体和/或其部分、变体或修饰形式。在一些实施方式中，受体结合剂(例如刺激剂)可为本身是细胞表面或跨膜蛋白的内源性配体和/或同源配体的胞外结构域或其部分。
在一些情况中，细胞上的分子(例如粘附分子)是：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1；全长α和β链序列分别如SEQ ID NOS:71和72所示)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素；全长序列如SEQ ID NO:73所示)、CD29/CD49d(VLA-4；全长序列如SEQ ID NO:75所示)、CD106(VCAM-1；全长序列如SEQ ID NO:74所示)，或是其生物活性片段。在一些实施方式中，受体结合剂是结合(例如特异性结合)粘附分子的抗体或其抗原结合片段，所述粘附分子为例如CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)或其生物活性片段。在一些实施方式中，受体结合剂是结合(例如特异性结合)粘附分子的配体或其部分，所述粘附分子为例如CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)。此类受体结合剂包括如下作用剂：其为或包含粘附分子内源性配体和/或同源配体的胞外结构域(ECD)或其部分。在一些实施方式中，受体结合剂是粘附分子的胞外结构域或其部分，且能结合细胞表面上的一个或多个粘附分子。此类受体结合剂的示例包括：LFA-1β(ECD如SEQID NO:78所示)；L-selectin(ECD如SEQ ID NO:79所示)；VCAM-1(ECD如SEQ ID NO:80所示)；和VLA-4(ECD如SEQ ID NO:81所示)；LFA-1α(ECD如所示SEQ ID NO:77)的胞外结构域，或其任何部分。
在一些实施方式中，诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子为或包括核因子，例如维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)为或包含特异性结合细胞因子受体的配体。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-2R，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合IL-2R。在一些方面中，特异性结合于IL-2R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗IL-2R抗体、抗IL-2R抗体的二价抗体片段、抗IL-2R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-2R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任何一种：例如EP 2425250、US 2011/0053209、WO 2009/145831、US 2010/0055098和Volk等，ClinExp Immunol.1989年4月；76(1):121–125。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-7R(CD127)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合IL-7R。在一些方面中，特异性结合于IL-7R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗IL-7R抗体、抗IL-7R抗体的二价抗体片段、抗IL-7R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-7R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一，例如WO 2016/059512、WO 2015/189302、Lee等，Proc Natl Acad Sci U S A.2012年7月31日；109(31):12674-9、Chung等,Blood(2007)110(8):2803-2810。在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-21R(CD360)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合IL-21R。在一些方面中，特异性结合于IL-21R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗IL-21R抗体、抗IL-21R抗体的二价抗体片段、抗IL-21R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-21R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一，例如US 2006/0159655、US 2006/0039902、US 2003/0108549和Guo等，J Transl Med.2010；8:50。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL受体共同γ链(γc；或CD132)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合该共同γ链。共同γ链(γc；或CD132)也称为白介素-2受体亚基γ或IL-2RG，是白介素受体IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-9R、IL-15R和IL-21R受体复合物所共有的细胞因子受体亚基。在一些方面中，特异性结合于该共同γ链的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗γc或抗CD132抗体、抗γc或抗CD132抗体的二价抗体片段、抗γc或抗CD132抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性共同γ链结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一，例如抗γc或抗CD132抗体TUGh4(AB_2123585(BioLegend公司，目录号338607)或AB_2123584(BioLegend公司，目录号338608))、Itano等，1996.J.Exp.Med.178:389、Kondo等，1993.Science 262:1874、Hodge等，2012.Blood.120:3774、Matsubara等，2014.Sci Rep.4:5043以及Massoud等，2015.PNAS.112:11030-11035、Pérez-Simón,Blood 2015 125:424-426。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-1R(CD121)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合IL-1R。在一些方面中，特异性结合于IL-1R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗IL-1R抗体、抗IL-1R抗体的二价抗体片段、抗IL-1R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-1R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为例如人IL-1R1抗体(R&D Systems公司，目录号AF269)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-15R(CD215)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)特异性结合IL-15R。在一些方面中，特异性结合于IL-15R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为第二受体结合剂，如第二刺激剂)可选自下组：抗IL-15R抗体、抗IL-15R抗体的二价抗体片段、抗IL-15R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-15R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一，例如US 2004/0185048、US 6013480，或可为抗人IL-15R抗体eBioJM7A4(Affymetrix公司，目录号12-7159-41)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为干扰素γ受体(IFNγR；CD119)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合IFNγR。在一些方面中，特异性结合于IFNγR的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗IFNγR抗体、抗IFNγR抗体的二价抗体片段、抗IFNγR抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IFNγR结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一，例如抗人CD119(IFNγ受体1)抗体GIR 208(eBioscience公司，目录号13-1199-80)以及抗人IFNγ受体抗体ab25448(Abcam公司，目录号ab25448)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为肿瘤坏死因子α受体(TNFαR，例如包括TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合TNFαR。在一些方面中，特异性结合于TNFαR的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗TNFαR抗体、抗TNFαR抗体的二价抗体片段、抗TNFαR抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性TNFαR结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一种：WO 2012/087928、WO 2010/120374和抗人IFNγ受体抗体ab19139(Abcam公司，目录号ab19139)和ab74315(Abcam公司，目录号ab74315)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-4R，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合IL-4R。在一些方面中，特异性结合于IL-4R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗IL-4R抗体、抗IL-4R抗体的二价抗体片段、抗IL-4R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-4R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为WO2005047331中所述中的任一种。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-10R，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合IL-10R。在一些方面中，特异性结合于IL-10R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗IL-10R抗体、抗IL-10R抗体的二价抗体片段、抗IL-10R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-10R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一种：US 7553932、US 8071374、Castro等，J Exp Med.2000年11月20日；192(10):1529-34或抗IL-10R抗体9D7(ThermoFisher公司，目录号06-1067)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为I型干扰素受体(例如IFNα受体(IFNAR)，包括IFNAR1和IFNAR2，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合IFNAR。在一些方面中，特异性结合于IFNAR的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗IFNAR抗体、抗IFNAR抗体的二价抗体片段、抗IFNAR抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IFNAR结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一种，例如：US 2013/0254912、US7662381、US 8460668、Baccala等，J.Immunol.2012,189(12):5976-5984和抗IFNAR2抗体克隆MMHAR-2(PBL Sciences公司，目录号21385-1)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-12R，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合IL-12R。在一些方面中，特异性结合于IL-12R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗IL-12R抗体、抗IL-12R抗体的二价抗体片段、抗IL-12R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-12R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为EP0638644或US5853721中所述的任一种。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为IL-17R(CD217)，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合IL-17R。在一些方面中，特异性结合于IL-17R的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗IL-17R抗体、抗IL-17R抗体的二价抗体片段、抗IL-17R抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性IL-17R结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为如下所述中的任一种：WO2008054603、EP2487188、Papp等，J Invest Dermatol.2012年10月；132(10):2466-9、Moseley等，2003.Cytokine Growth Factor Rev.14:155、Rong等，2009.Cell.Res.19:208、Toy等，2006.J.Immunol.177:36、或抗人CD217抗体克隆W15177A(Biolegend公司)。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-2配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-2配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，或为与SEQID NO:50所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-7配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-7配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，或为与SEQID NO:51所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-21配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-21配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示，或为与SEQID NO:52所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-1配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-1配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:53和/或54(分别为IL-1α或IL-1β)所示，或为与SEQ ID NO:53和/或54(分别为IL-1α或IL-1β)所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-15配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-15配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示，或为与SEQID NO:55所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-9配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-9配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示，或为与SEQID NO:81所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IFNγ配体或其生物活性部分。在一些方面中，IFNγ配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示，或为与SEQID NO:56所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如TNFα配体或其生物活性部分。在一些方面中，TNFα配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示，或为与SEQID NO:57所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-4配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-4配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示，或为与SEQID NO:58所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-10配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-10配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示，或为与SEQID NO:59所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如I型干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNκ、IFNδ、IFNε、IFNτ、IFNω和IFNζ(也称为限制素limitin))或其生物活性部分。在一些方面中，I型干扰素为IFNα或IFNβ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:60或61(分别为IFN-α2或IFN-β1)所示，或为与SEQ ID NO:60或61所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-12配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-12配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:62和/或63(分别为IL-12α或IL-12β)所示，或为与SEQ ID NO:62和/或63(分别为IL-12α或IL-12β)所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如IL-17配体或其生物活性部分。在一些方面中，IL-17配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示，或为与SEQID NO:64所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂(例如第二或额外受体结合剂)为或包含特异性结合趋化因子受体的配体。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为CXCR3，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合CXCR3。在一些方面中，特异性结合于CXCR3的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗CXCR3抗体、抗CXCR3抗体的二价抗体片段、抗CXCR3抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CXCR3结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为WO2003024404中所述的任一种。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为CCR7，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合CCR7。在一些方面中，特异性结合于CCR7的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗CCR7抗体、抗CCR7抗体的二价抗体片段、抗CCR7抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CCR7结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为US6153441中所述的任一种。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为CXCR1，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合CXCR1。在一些方面中，特异性结合于CXCR1的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗CXCR1抗体、抗CXCR1抗体的二价抗体片段、抗CXCR1抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CXCR1结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为抗CXCR1抗体[42705.111](Abcam；ab10400)。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为CXCR4，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合CXCR4。在一些方面中，特异性结合于CXCR4的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗CXCR4抗体、抗CXCR4抗体的二价抗体片段、抗CXCR4抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CXCR4结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为WO2003024404中所述的任一种。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如CXCL9配体或其生物活性部分。在一些方面中，CXCL9配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示，或为与SEQID NO:65所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如CXCL10配体或其生物活性部分。在一些方面中，CXCL10配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示，或为与SEQ ID NO:66所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如CCL19配体或其生物活性部分。在一些方面中，CCL19配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示，或为与SEQID NO:67所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如CCL21配体或其生物活性部分。在一些方面中，CCL21配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示，或为与SEQID NO:68所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些实施方式中，受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可包括刺激性受体或能够诱导细胞中信号的其他受体的配体，例如CCL25配体或其生物活性部分。在一些方面中，CCL25配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示，或为与SEQID NO:69所示序列显示至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相同性的变体，或为其生物活性部分，其中所述变体或生物活性部分保持了结合受体的活性和/或调节对该受体的一个或多个信号的功能性活性。
在一些情况中，受体结合剂(例如额外的受体结合剂)为或包含粘附分子，或是诱导细胞因子产生、趋化因子产生、粘附分子表达的因子，和/或涉及刺激和/或调节辅助信号和/或额外信号。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为CD62L，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合CD62L。在一些方面中，特异性结合于CD62L的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗CD62L抗体、抗CD62L抗体的二价抗体片段、抗CD62L抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD62L结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种，例如抗体DREG56(例如ATCC HB300)；参见例如Stemberger等，2012PLoSOne.2012；7(4):e35798。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为RORγt，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合RORγt。在一些方面中，特异性结合于RORγt的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗RORγt抗体、抗RORγt抗体的二价抗体片段、抗RORγt抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性RORγt结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，在一些情况中，抗体或抗原结合片段可为CA2572334中所述的任一种。
在一些实施方式中，细胞(例如T细胞)上的分子可为RORα，且受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)特异性结合RORα。在一些方面中，特异性结合于RORα的受体结合剂，例如刺激剂(例如其可为额外受体结合剂，如额外刺激剂)可选自下组：抗RORα抗体、抗RORα抗体的二价抗体片段、抗RORα抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性RORα结合分子。抗体或抗原结合片段可衍生自本领域中已知的任何一种。例如，抗RORα抗体为RORα抗体H-65(Santa Cruz Biotechnology公司，目录号sc-28612)。
2.选择剂
在一些实施方式中，作用剂为选择剂。在一些实施方式中，选择剂结合细胞表面上的分子，例如细胞表面分子。在一些情况中，细胞表面分子是选择标志物。在一些此类情况中，选择剂能够特异性结合一个或多个细胞表达的选择标志物。在一些实施方式中，可逆结合反应剂的一种或多种选择剂可用于促进细胞的选择或分离。
在本文所提供的任何实施方式中，受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)可为特异性结合受体(例如细胞表面上表达的受体)的结合剂。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)可选自下组：抗受体抗体、抗受体抗体的二价抗体片段、抗受体抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子。二价抗体片段可为F(ab’)2片段、或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可选自下组：Fab片段、Fv片段以及单链Fv片段(scFv)。在一些情况中，具有抗体样结合特性的蛋白质性受体结合分子可为适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、阿迪连接素或阿维多聚体。在一些情况中，特异性结合于受体的受体结合剂(例如第一、第二和/或额外受体结合剂，如刺激剂)是抗体或其抗原结合片段，例如Fab片段。
在一些实施方式中，细胞表面分子(例如选择标志物)可为限定所需细胞群或亚群的抗原，所述细胞群或亚群为例如血细胞群或亚群，如淋巴细胞(例如T细胞、T辅助细胞，如CD4+T辅助细胞，B细胞或天然杀伤细胞)、单核细胞或干细胞，例如CD34+外周干细胞或表达Nanog或Oct-4的干细胞。在一些实施方式中，选择标志物可为T细胞或T细胞亚组表面上所表达的标志物，例如CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。T细胞的例子包括如下细胞：例如CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节T细胞(Treg)。Treg的示例性例子包括CD4 CD25 CD45RA Treg细胞，记忆T细胞的示例性例子包括CD62L CD8+特异性中心记忆T细胞。细胞表面分子(例如选择标志物)也可为肿瘤细胞标志物。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD4，且选择剂特异性结合CD4。在一些方面中，特异性结合CD4的选择剂可选自下组：抗CD4抗体、抗CD4抗体的二价抗体片段、抗CD4抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD4结合分子。在一些实施方式中，抗CD4抗体(例如二价抗体片段或单价抗体片段，如CD4 Fab片段)可衍生自抗体13B8.2或保持特异性结合CD4的13B8.2功能活性突变体。例如，抗体13B8.2或m13B8.2的示例性突变体描述于美国专利No.7,482,000、美国专利申请No.US2014/0295458或国际专利申请公开号No.WO2013/124474；以及Bes,C等，J Biol Chem 278,14265-14273(2003)。命名为“m13B8.2”的突变Fab片段带有CD4结合小鼠抗体13B8.2的可变区，并且其恒定区包含用于重链的γ型人恒定CH1区以及κ型人轻链恒定区(如美国专利7,482,000中所述)。在一些实施方式中，抗CD4抗体(例如抗体13B8.2的突变体)在可变轻链中包含氨基酸替代H91A，在可变轻链中包含氨基酸替代Y92A、在可变重链中包含氨基酸替代H35A和/或在可变重链中包含氨基酸替代R53A，以上各自均按照Kabat编号。在一些方面中，与13B8.2 Fab片段的可变区相比，在m13B8.2中，轻链第91位的His残基(SEQ ID NO:30的第93位)突变为Ala，重链第53位的Arg残基(SEQ ID NO:29的第55位)突变为Ala。在一些实施方式中，可逆结合抗CD4或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8000-206或6-8000-205或6-8002-100；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD8，且选择剂特异性结合CD8。在一些方面中，特异性结合CD8的选择剂可选自下组：抗CD8抗体、抗CD8抗体的二价抗体片段、抗CD8抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD8结合分子。在一些实施方式中，抗CD8抗体(例如二价抗体片段或单价抗体片段，如CD8 Fab片段)可衍生自抗体OKT8(例如ATCC CRL-8014)或其保持特异性结合CD8的功能活性突变体。在一些实施方式中，可逆结合抗CD8或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8003或6-8000-201；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD3，且选择剂特异性结合CD3。在一些方面中，特异性结合CD3的选择剂可选自下组：抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD3结合分子。在一些实施方式中，抗CD3抗体(例如二价抗体片段或单价抗体片段，如CD3 Fab片段)可衍生自抗体OKT3(例如ATCC CRL-8001；参见例如Stemberger等，PLoS One.2012；7(4):e35798)或其保持特异性结合CD3的功能活性突变体。在一些实施方式中，可逆结合抗CD3或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8000-201、6-8001-100；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD25，且选择剂特异性结合CD25。在一些方面中，特异性结合CD25的选择剂可选自下组：抗CD25抗体、抗CD25抗体的二价抗体片段、抗CD25抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD25结合分子。在一些实施方式中，抗CD25抗体(例如二价抗体片段或单价抗体片段，如CD25 Fab片段)可衍生自抗体FRT5(参见例如Stemberger等，2012.PLoS One.2012；7(4):e35798)或其保持特异性结合CD25的功能活性突变体。在一些实施方式中，可逆结合抗CD4或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8000-205或6-8000-207或6-8004-050；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD62L，且选择剂特异性结合CD62L。在一些方面中，特异性结合CD62L的选择剂可选自下组：抗CD62L抗体、抗CD62L抗体的二价抗体片段、抗CD62L抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD62L结合分子。在一些实施方式中，抗CD62L抗体(例如二价抗体片段或单价抗体片段，如CD62L Fab片段)可衍生自抗体DREG56(例如，ATCC HB300；参见例如Stemberger等，2012.PLoS One.2012；7(4):e35798)或其保持特异性结合CD62L的功能活性突变体。在一些实施方式中，可逆结合抗DREG56或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8000-204或6-8005-050；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD45RA，且选择剂特异性结合CD45RA。在一些方面中，特异性结合CD45RA的选择剂可选自下组：抗CD45RA抗体、抗CD45RA抗体的二价抗体片段、抗CD45RA抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD45RA结合分子。在一些实施方式中，抗CD45RA抗体(例如二价抗体片段或单价抗体片段，如CD45RA Fab片段)可衍生自抗体MEM56(例如，Millipore 05-1413；参见例如Stemberger等，2012.PLoSOne.2012；7(4):e35798)或其保持特异性结合CD45RA的功能活性突变体。在一些实施方式中，可逆结合抗CD45RA或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8000-208或6-8007-050；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD45RO，且选择剂特异性结合CD45RO。在一些方面中，特异性结合CD45RO的选择剂可选自下组：抗CD45RO抗体、抗CD45RO抗体的二价抗体片段、抗CD45RO抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD45RO结合分子。在一些实施方式中，可逆结合抗CD45RO或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8000-209或6-8012-020；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD154，且选择剂特异性结合CD154。在一些方面中，特异性结合CD154的选择剂可选自下组：抗CD154抗体、抗CD154抗体的二价抗体片段、抗CD154抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD154结合分子。在一些实施方式中，可逆结合抗CD154或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得的反应剂(例如目录号6-8000-202或6-5510-050；IBA有限公司，德国哥廷根)。
在一些实施方式中，选择标志物可为CD16，且选择剂特异性结合CD16。在一些方面中，特异性结合CD16的选择剂可选自下组：抗CD16抗体、抗CD62L抗体的二价抗体片段、抗CD16抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质性CD16结合分子。在一些实施方式中，可逆结合抗CD16或其片段的反应剂是市售可获得的或衍生自市售可获得反应剂。在一些方面中，CD16结合分子包含的重链和/或轻链序列分别如SEQ ID NO:36和/或37所示。
III.培养细胞的方法
本文提供了培养细胞的方法，其包括：在作用剂(例如第一、第二和/或额外的，受体结合剂(如刺激剂或选择剂)的存在下，孵育包含目标细胞(例如T细胞)的组合物，其中，所述作用剂能够结合组合物中目标细胞(例如T细胞)表面上的分子、且可逆结合包含能够可逆结合该作用剂的多个结合位点的反应剂。在一些实施方式中，孵育在使该作用剂结合(例如特异性结合)细胞上所述分子的条件下进行。在一些情况中，对于某些受体结合剂(例如刺激剂)，该结合可诱导或调节组合物中目标细胞(例如T细胞)中的信号，例如所描述的主要信号或辅助信号。在一些实施方式中，该作用剂与该分子的结合引起如下中的一种或多种：组合物中目标细胞的刺激、活化、扩增(增殖)和/或分化。
在一些实施方式中，所提供的方法能够用于选择性诱导细胞群(例如B细胞、T细胞或天然杀伤细胞)的离体扩增。在一些情况中，刺激可在没有外源性生长因子(例如淋巴因子)和辅助细胞的条件下进行。在一些实施方式中，无需抗原即可诱导这些细胞(例如B细胞或T细胞)的增殖，因此提供了一种扩增的细胞群(例如T细胞群)，其就抗原反应性而言是多克隆的。提供本文所公开的方法可用于所选T细胞(例如CD4+或CD8+T细胞)群在延长时间段上的持续增殖，以使这些细胞的数量相对于原始T细胞群获得多倍增长。通常，在如本文所述的淋巴细胞群(克隆)扩增情况下，所有子代可与所选用于扩增的细胞群具有相同的抗原特异性。
在一些实施方式中，所述方法涉及扩增抗原特异性T细胞群。在一些实施方式中，为了生产抗原特异性T细胞，使T细胞接触适于在T细胞中引发主要活化信号的抗原，即将该抗原递呈给T细胞从而在T细胞中通过TCR/CD3复合物引发信号。例如，可通过与MHC分子偶联的抗原递呈细胞将抗原递呈给T细胞。可将抗原递呈细胞(例如B细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞、或能将抗原递呈给T细胞的其他细胞)在抗原(例如可溶性抗原)的存在下与T细胞一起孵育，从而该抗原递呈细胞将该抗原递呈给该T细胞。或者，可将表达感兴趣抗原的细胞与T细胞一起孵育。例如，可将表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞与T细胞一起孵育以诱导肿瘤特异性应答。类似地，可将病原体(例如病毒)感染的细胞(其递呈该病原体的抗原)与T细胞一起孵育。在T细胞群的抗原特异性活化之后，可根据所提供的方法扩增细胞。例如，建立其抗原特异性之后，可根据本文所述方法通过与抗CD3抗体(用作第一作用剂)和抗CD28抗体(用作第二作用剂)一起培养使T细胞扩增。在另一实施方式中，第一作用剂可为MHC I:肽复合物，其结合抗原特异性T细胞群。在该实施方式中，可使用任何已知且能与相应MHC I分子复合的抗原特异性肽。或者，也可将引发细胞扩增的受体的天然配体用作第一作用剂。例如，CD19胞外结构域可用于引起经转导以表达嵌合CD19结合抗原受体(CAR)的细胞的胞内信号转导级联反应活化。以上的示例性方面在实施例中展示。
在一些实施方式中，提供了培养细胞群的体外方法，其包括使包含组合物的样品与多聚化反应剂接触，其中所述组合物包含多个细胞。多聚化反应剂之上可逆固定(结合于其上)作用剂(第一、第二和/或额外受体结合剂，例如刺激剂或选择剂)，其可用于细胞的选择、刺激、扩增和/或分化。在一些实施方式中，作用剂(例如第一作用剂)为细胞提供主要活化信号，其中多聚化反应剂包含用于可逆结合该第一作用剂的至少一个结合位点Z。第一作用剂包含至少一个结合伴侣C1，其中该结合伴侣C1能够可逆结合多聚化反应剂的结合位点Z1，其中第一作用剂通过在结合伴侣C1和结合位点Z1之间的可逆键结合多聚化反应剂。第一作用剂结合细胞表面上的受体分子，从而为细胞提供主要活化信号，由此活化该细胞。
在一些实施方式中，多聚化反应剂固定在支持物(例如固体表面)上。在一些实施方式中，多聚化反应剂不结合于支持物，例如不结合于固体表面或固定相。
例如，在一些实施方式中，提供了扩增细胞群的体外方法，其包括：使包含细胞群的样品与多聚化反应剂接触，其中，该多聚化反应剂未固定在固体支持物上(即为可溶性形式)且结合了作用剂(第一或第二受体结合剂，例如刺激剂或选择剂)，其可用于细胞的选择、刺激、扩增和/或分化。在一些实施方式中，为细胞提供主要活化信号的作用剂(例如第一作用剂)可逆结合多聚化反应剂。多聚化反应剂包含用于结合第一作用剂的至少一个结合位点(例如Z1)，其中第一作用剂包含至少一个结合伴侣(例如C1)，其中结合伴侣C1能够结合多聚化反应剂的结合位点Z1。在一些实施方式中，第一作用剂通过结合伴侣C1和结合位点Z1之间形成的键结合多聚化作用剂，且第一作用剂结合细胞表面上的受体分子，从而为该细胞提供主要活化信号，由此活化该细胞。在一些实施方式中，当使用可溶多聚化作用剂时，结合伴侣C(例如C1)与结合位点Z(例如Z1)之间的键无需为可逆键。
在一些实施方式中，所提供的方法还包括使用结合有一种或多种额外作用剂(例如第二作用剂或第三作用剂)的多聚化反应剂，例如靶向细胞上的辅助或共刺激分子或其他信号转导分子，以刺激一个或多个额外信号，例如共刺激或辅助信号。在一些情况中，多聚化作用剂固定在支持物(例如固体支持物或固定相)上。在一些实施方式中，多聚化作用剂未固定在支持物上，即为可溶性形式。
在一些实施方式中，所述一种或多种额外作用剂(例如第二作用剂)包含能够可逆结合于结合位点(例如Z1、Z2、Z3等)的结合伴侣C(例如C1、C2、C3等)。在一些实施方式中，所述一种或多种额外作用剂(例如第二作用剂)包含结合伴侣(例如C2)，其中结合伴侣(例如C2)能够可逆结合多聚化反应剂的结合位点(例如Z2)，其中第二作用剂通过结合伴侣C2和结合位点Z2之间形成的可逆键连接多聚化反应剂。在一些实施方式中，结合伴侣C1和结合位点Z1之间形成的键可为可逆键，结合伴侣C2和结合位点Z2之间形成的键可为可逆键。在一些实施方式中，结合位点Z1和结合伴侣C1之间可逆结合的解离常数(KD)和/或结合位点Z2和结合伴侣C2之间可逆结合的解离常数(KD)为10-2M～10-13M。在一些方面中，例如当多聚化反应剂未结合于支持物(例如不结合于固体支持物或固定相)时，结合伴侣C1和结合位点Z1之间形成的键可为不可逆键，和/或结合伴侣C2和结合位点Z2之间形成的键也可为不可逆键。
在一些情况中，所述一种或多种额外作用剂(例如第二作用剂)结合细胞表面上的辅助分子，从而刺激细胞活化。在该实施方式中，第一作用剂可刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号，且可为特异性结合CD3的结合剂。在该实施方式中，T细胞上的辅助分子可为CD28，结合该辅助分子的第二作用剂是特异性结合CD28的结合剂。或者，在一些实施方式中，发现也可采用靶向其他辅助分子，在一些情况下，其可例如改善培养细胞的一种或多种特征、性质或特点。在一些实施方式中，辅助分子可为如下分子中的一种或多种：CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM(例如，分别为抗CD90抗体、抗CD95抗体、抗CD137抗体、和抗CD154抗体、抗ICOS抗体、抗LAT抗体、抗CD27抗体、抗OX40抗体或抗HVEM抗体)。示例性作用剂，例如受体结合剂(如刺激剂)如下所述。
在一些实施方式中，所述一种或多种额外作用剂(例如第三作用剂)结合调节细胞存活、增殖和/或一种或多种其他性质的额外分子。该被靶向的分子包括但不限于：细胞因子受体、趋化因子或粘附分子。在一些方面中，通过该额外分子的刺激可使被刺激或培养的细胞获得一种或多种改良的特性，例如提高的维持性、存活和/或较少耗竭表型或活性。示例性作用剂，例如受体结合剂(如刺激剂)如下所述。
在一些实施方式中，所提供的方法可在细胞群的活力至少基本不受影响的任何温度下进行。在一些实施方式中，孵育或培养进行的条件包括至少基本无害、没有不利或至少基本不影响活力的任何条件，例如在该条件下，待以完全活力扩增的细胞群的百分比为至少70％，包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。在一些实施方式中，所提供的方法在约20℃或更高的温度下进行。根据待扩增细胞群，适合的温度范围可为例如从约20℃～约45℃,包括从约25℃～约40℃，或从约32℃～37℃。在一些实施方式中，根据本发明的方法在恒定温度值下进行，或在所选温度值±约5℃、±约4℃、±约3℃、±约2℃、±约1℃或±约0.5℃下进行。本领域技术人员能够考虑细胞的性质和扩增条件，凭经验确定合适的温度。人细胞通常在例如37℃的温度下扩增。
根据本文所公开的内容，还提供了多聚的作用剂、或包含可逆结合一个或多个受体结合剂的多聚化反应剂的组合物，其能在细胞群中刺激(例如扩增或调节)信号。能够在细胞群中刺激(例如扩增或调节)信号的该多聚的作用剂是多聚化反应剂，该多聚化反应剂未结合于支持物(例如为可溶性形式)、且包含用于可逆结合向细胞提供主要活化信号的第一作用剂的至少一个结合位点Z(例如Z1)，其中该多聚化反应剂具有与其可逆结合的向细胞提供主要活化信号的所述第一作用剂；其中，该第一作用剂包含至少一个结合伴侣C(例如C1)，其中该结合伴侣C1能够可逆结合多聚化反应剂的至少一个结合位点Z1，其中第一作用剂通过结合伴侣C1和结合位点Z1之间形成的可逆键结合多聚化反应剂。应注意到该多聚化作用剂可具有本文所述的任何第一作用剂。
在一些实施方式中，本文所提供的多聚的作用剂还可包含至少一个结合位点Z2以可逆结合刺激细胞表面上辅助分子的第二作用剂，其中多聚化反应剂具有与其可逆结合的刺激细胞表面上辅助分子的第二作用剂，其中第二作用剂包含结合伴侣(例如C2)，其中结合伴侣C2能够结合多聚化反应剂的至少一个结合位点Z2。在该实施方式中，第二结合剂通过结合伴侣C2和结合位点Z2之间形成的键结合多聚化反应剂。在一些实施方式中，第二作用剂可结合如下分子中的一种或多种：CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM(例如，分别为抗CD90抗体、抗CD95抗体、抗CD137抗体、和抗CD154抗体、抗ICOS抗体、抗LAT抗体、抗CD27抗体、抗OX40抗体或抗HVEM抗体)。
在一些实施方式中，本文所提供的多聚的作用剂还可包含至少一个结合位点(例如Z，其与Z1或Z2相同或不同)以可逆结合额外作用剂，该额外作用剂结合调节细胞存活、增殖和/或一种或多种其他性质的额外分子，其中多聚化反应剂具有与其可逆连接的刺激细胞表面上额外分子的额外作用剂，其中该额外作用剂包含结合伴侣(例如C，其与C1或C2相同或不同)，其中结合伴侣C能够结合多聚化反应剂的所述至少一个结合位点Z。
在一些实施方式中，在多聚的作用剂(例如抗CD3/抗CD28链霉亲和素突变蛋白或其寡聚体)的存在下培养包含目标细胞(例如T细胞)的组合物可在生物反应器中进行，所述生物反应器为例如中空纤维生物反应器(例如细胞扩增系统的中空纤维生物反应器)或塑料袋生物反应器(例如用于Xuri细胞扩增系统W25的/>获自GEHealthcare公司)。
在一些实施方式中，方法还包括使反应混合物(例如包含目标细胞，如T细胞，其通过例如第一作用剂和第二作用剂结合于多聚化反应剂)中的目标细胞(例如T细胞)接触：(i)竞争性反应剂，例如游离第一结合伴侣C(例如C1)，或其能够破坏第一结合伴侣(例如C1)和结合位点(例如Z1)之间键的类似物，和/或(例如若需要)(ii)第二竞争性反应剂，例如游离第二结合伴侣(例如C2)，或其能够破坏第二结合伴侣(例如C2)和结合位点(例如Z2)之间键的类似物。通过如此操作，第一作用剂的所述结合伴侣C1和所述结合位点Z1之间的可逆键、以及第二作用剂的所述结合伴侣C2和所述多聚化反应剂的结合位点Z2之间的可逆键被破坏，由此在洗脱液中释放通过第一作用剂和第二作用剂连接多聚化反应剂的T细胞，并停止对T细胞的刺激和/或扩增。
在一些实施方式中，竞争性反应剂(例如第一和/或第二竞争性反应剂)在起始孵育后5天内加入，例如在起始孵育后的4天、3天、2天或1天内加入。因此，通过控制停止刺激的时间，从多聚的作用剂洗脱的培养T细胞的一种或多种特定特征可被改变(如本文所述)。
在一些实施方式中，方法还包括在成分的可逆解离后，分离或去除一种或多种剩余的成分。在一些实施方式中，培养的目标细胞(例如T细胞)中的任何未结合或残留的生物素可被分离或去除。在一些实施方式中，多聚化反应剂从培养的目标细胞组合物中的细胞移除或分离。例如，在一些实施方式中，分离/去除可采用第二固定相进行。为了该目的，包含目标细胞(例如T细胞)和多聚化反应剂的混合物在施加到如前所述的第一固定相上之前或之后，暴露于适当第二固定相上的色谱。该第二固定相可为凝胶过滤基质和/或亲和色谱基质，其中该凝胶过滤和/或亲和色谱基质包含亲和反应剂。包含在色谱树脂上的亲和反应剂包括(特异性)结合多聚化反应剂的结合位点Z1和/或结合位点Z2(若存在)的结合伴侣D，从而将多聚化反应剂固定在固定相上。如果采用基于链霉亲和素的多聚化反应剂以及具有作为结合伴侣C1或C2的链霉亲和素结合肽的第一和第二作用剂，包含于该第二固定相的亲和反应剂中的结合伴侣D可为生物素。然后，将用作多聚化反应剂的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白可溶寡聚体结合于通常共价偶联于色谱基质的生物素，所述色谱基质为例如市售可获得的biotin-sepharoseTM。在一些此类实施方式中，培养的细胞(例如培养的T细胞)可从多聚化反应剂中回收分离。
A.细胞
在一些实施方式中，细胞群的样品可来自任何合适的来源，通常所有样品来自身体组织或体液，例如血液。在后者的情况中，样品可为例如外周血单核细胞(PBMC)群，其可通过标准分离方法(例如血细胞的Ficoll梯度)获得。待刺激或扩增的细胞群还可为纯化形式，可已采用可逆细胞染色/分离技术分离，如以下专利文献中所述：美国专利7,776,562、美国专利8,298,782、国际专利申请公开号WO02/054065或国际专利申请公开号WO2013/011011。或者，细胞群还可通过经负磁性免疫粘附细胞分选获得(如美国专利6,352,694B1或欧洲专利0 700 430B1中所述)。如果将本文所述的分离方法用于基础研究，则样品可为体外细胞培养试验的细胞。样品通常将被制备成流体形式，例如溶液或分散液。
包含目标细胞的组合物中所含的细胞一般是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方式中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，或是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其他示例性的细胞包括干细胞，如专能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。细胞一般是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。
在一些实施方式中，本文所提供的可逆结合剂(例如多聚的作用剂)能扩增淋巴细胞群或淋巴细胞群中所包含的亚群。待扩增的淋巴细胞群可为任何适合的群，例如B细胞群、T细胞群或天然杀伤细胞群。T细胞群可为抗原特异性T细胞群，T辅助细胞群、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞或天然杀伤T细胞群。因此，在此类多聚的作用剂的实施方式中，第一作用剂能够刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。多聚的作用剂递呈的第一作用剂可由此为特异性结合CD3的结合反应剂，而结合辅助分子的第二作用剂，例如可为特异性结合CD28、CD137、CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM的结合剂。
在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群、CD3+、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位、和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱，和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。方法包括现成的方法。在一些方面中，如对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，如干细胞，如诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，如本文所述，并且在冷冻保存前或后将其重导回同一患者。
在一些实施方式中，T细胞，例如CD3+、CD4+或CD8+细胞未对其他标志物进一步富集。在一些实施方式中，T细胞未进一步富集CD62L+细胞。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括：原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T(TSCM)、中心记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MAIT)细胞、天然产生的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞，和δ/γT细胞。
在一些实施方式中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。
细胞的制备
在一些实施方式中，细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。细胞可分离自样品，例如生物样品，如从对象获得或衍生自对象的样品。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有一定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗性介入的人，如需要过继细胞疗法的人，用于该疗法的细胞是经分离、加工和/或经工程改造的。
因此，在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自对象的组织、液体和其它样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、遗传工程改造(例如采用病毒载体的转导)、清洗和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。
在一些方面中，从中衍生或分离细胞的样品为血液或血液源性的样品，或者为或衍生自血浆分离置换法或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(例如，过继细胞治疗)的情况中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类或猪。
在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种反应剂的存在下经清洗、离心和/或孵育，例如，以移除不需要的组分，富集所需组分，裂解或移除对具体反应剂敏感的细胞。在一些实例中，细胞基于一种或多种性质，例如密度、粘附性质、尺寸、对具体组分的敏感性和/或抗性被分离。
在一些实例中，例如，通过血浆分离置换法或白细胞去除术，获得来自对象循环血液的细胞。在一些方面中，所述样品包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、血红细胞，和/或血小板，和，在一些方面中包含与血红细胞和血小板不同的细胞。
在一些实施方式中，从所述对象收集的血液细胞经清洗，例如，以移除血浆级分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在一些实施方式中，清洗溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过半自动化的“流通”离心法(例如，Cobe 2991细胞处理器，百特公司(BaXter))完成。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过切向流过滤(TFF)完成。在一些实施方式中，在清洗后，所述细胞在各自生物相容缓冲液中重悬，例如，无Ca++/Mg++PBS。在某些实施方式中，移除血液细胞样品组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方式中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解血红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心来从外周血制备血液白细胞。
在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子(例如表面标志物，如表面蛋白，胞内标志物或核酸)的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用基于此类标志物进行分离的任何已知方法。分离方法可包括本文所公开分离方法中的任何一种，包括采用可逆反应剂系统的方法，例如如本文所述，采用作用剂(如受体结合剂或选择剂)和反应剂的方法。
在一些实施方式中，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面中，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，和从未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离已结合所述抗体或结合伴侣的细胞。
此类分离步骤可基于正选择，其中已结合所述作用剂的细胞被保留用于进一步应用，和/或，负选择，其中未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞被保留。在一些实例中，两种级分均保留用于进一步应用。在一些方面中，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，从而分离最好基于与所需群不同的细胞表达的标志物进行。
所述分离不需导致具体细胞群或表达具体标志物的细胞的100％的富集或移除。例如，正选择或富集具体类型的细胞，如表达标志物的那些，指的是，增加所述细胞的数量或百分数，但不需要导致不表达所述标志物的细胞完全不存在。同样地，负选择、移除或消耗具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，减少所述细胞的数量或百分数，但不需要导致所有此类细胞的完全移除。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的级分进行另一分离步骤，例如后续的正或负选择。在一些实例中，单个分离步骤同时消耗表达多重标志物的细胞，例如通过将细胞与各自对负选择靶向的标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣一起孵育。同样地，可通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣一起孵育来对多个细胞类型进行同时正选择。
例如，在一些方面中，T细胞的特定亚群，例如一种或多种表面标志物阳性或高水平表达的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞，通过正或负选择技术分离。
例如，CD3+，CD28+T细胞可以采用CD3/CD28偶联的磁珠(例如，DYNA珠M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器)来正选择。
在一些实施方式中，分离通过如下方式进行：通过正选择富集具体细胞群，或通过负选择消耗具体细胞群。在一些实施方式中，正或负选择通过将细胞与特异性地结合一种或多种表面标志物的一种或多种抗体或其它结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种表面标志物分别在正选择或负选择的细胞上表达(标志物+)或以相对较高水平表达(标志物高)。
在一些实施方式中，T细胞通过对在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(例如CD14)进行负选择来从PBMC样品分离。在一些方面中，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过针对一种或多种原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标志物进行正或负选择，可将此类CD4+和CD8+群进一步分选成亚群。
在一些实施方式中，CD8+细胞针对原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞进行进一步富集或消耗，例如通过基于与对应亚群相关联的表面抗原进行正或负选择。在一些实施方式中，进行针对中心记忆T(TCM)细胞的富集，以增加功效，如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，在一些方面中，其在此类亚群中特别强势。参见Terakura等.(2012)Blood.1:72–82；Wang等(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方式中，将TCM-富集的CD8+T细胞与CD4+T细胞合并进一步增强了功效。
在实施方式中，记忆T细胞在CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚组中均存在。PBMC可以针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或消耗，例如采用抗CD8和抗CD62L抗体。
在一些实施方式中，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于对CD45RA和/或粒酶B表达或高度表达的细胞进行负选择。在一些方面中，针对TCM细胞富集的CD8+群的分离通过如下方式进行：消耗表达CD4、CD14、CD45RA的细胞，和针对表达CD62L的细胞进行富集或正选择。一方面，针对中心记忆T(TCM)细胞的富集通过如下方式进行：由基于CD4表达选择的细胞阴性级分起始，其基于CD14和CD45RA的表达进行负选择，和基于CD62L进行正选择。在一些方面中，此类选择同时进行，而在其它方面中，此类选择以某一顺序依次进行。在一些方面中，将用于制备CD8+细胞群或亚群的基于CD4表达的相同选择步骤，也用以产生CD4+细胞群或亚群，从而保留来自基于CD4分离的阳性和阴性级分，并任选地在一种或多种进一步正或负选择步骤之后，用于所述方法的后续步骤。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助CD4+T细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方式中，中心记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个实例中，为了通过负选择对CD4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物(cocktail)通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质，如磁珠或顺磁珠，以允许分离用于正和/或负选择的细胞。例如，在一些实施方式中，所述细胞和细胞群采用免疫磁性(或亲和力磁性)分离技术分开(separated)或分离(isolated)(综述参见《分子医学方法》(Methodsin Molecular Medicine)，第58卷：代谢研究方法(Metastasis Research Protocols)，第2卷：细胞体外和体内行为(Cell Behavior In Vitro and In Vivo)，第17-25页，S.A.Brooks和U.Schumacher编新泽西州托托华的胡玛纳出版社(Humana Press Inc.))。
在一些方面中，使待分离的样品或细胞组合物与小的可磁化或磁响应性材料(如磁响应性颗粒或微粒，例如顺磁珠(例如，Dynal珠或MACS珠))一起孵育。所述磁响应性材料(例如，颗粒)一般直接或间接连接结合伴侣(例如，抗体)，其特异性地结合分子，例如需要分离(例如，需要进行负或正选择)的一种或多种细胞或细胞群上存在的表面标志物。
在一些实施方式中，所述磁性颗粒或珠包括磁响应性材料，其结合特异性的结合部分，例如抗体或其它结合伴侣。有多种熟知的磁响应性材料用于磁性分离方法。合适的磁性颗粒包括描述于Molday，美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中的那些，其通过引用纳入本文。胶体定形的颗粒(Colloidal sized particles)，例如描述于Owen美国专利号4,795,698的那些，而Liberti等，美国专利号5,200,084是其它实例。
孵育一般在一定条件下进行，由此，所述抗体或结合伴侣或分子(如二抗或其它反应剂，其特异性地结合所述抗体或结合伴侣)连接所述磁性颗粒或珠，特异性地结合所述样品中的细胞上的细胞表面分子(如果存在)。
在一些方面中，将所述样品置于磁场中，并且，具有与其连接的磁性响应或可磁化颗粒的那些细胞将被磁体吸引，并与未标记的细胞分离。对于正选择而言，保留被磁体吸引的细胞；对于负选择而言，保留不被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面中，在相同选择步骤过程中进行正和负选择的组合，其中，保留阳性和阴性级分，并进一步处理或进行进一步分离步骤。
在某些实施方式中，磁响应性颗粒包被于一抗或其它结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方式中，磁性颗粒通过对一种或多种标志物具有特异性的一抗的覆层连接细胞。在某些实施方式中，所述细胞(而非珠)用一抗或结合伴侣标记，然后，添加细胞类型特异性的二抗或其它结合伴侣(例如，链霉亲和素)被覆的磁性颗粒。在某些实施方式中，链霉亲和素被覆的磁性颗粒与生物素化一抗或二抗联用。
在一些实施方式中，使所述磁响应性颗粒保持连接待后续孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面中，使所述颗粒保持连接用于给予患者的细胞。在一些实施方式中，从所述细胞移去可磁化的或磁响应性颗粒。用于从细胞移去可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括，例如，采用竞争性非标记的抗体、可磁化颗粒或连接至可切割接头的抗体等。在一些实施方式中，可磁化颗粒是生物可降解的。
在一些实施方式中，基于亲和性的选择通过磁性活化的细胞分选(MACS)(加利福尼亚奥本的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))进行。磁性活化的细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择其上连接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方式中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后，依次洗脱非目标和目标物质。即，使连接至磁化颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未连接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以使得它们可被洗脱和回收的某种方式释放。在某些实施方式中，所述非目标细胞带标记并从异质细胞群消耗。
在某些实施方式中，分离(isolation)或分开(separation)采用进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个步骤的系统、装置或设备来进行。在一些方面中，所述系统用以在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的各个步骤，例如，以使错误、用户处理和/或污染最小化。在一个实例中，所述系统是国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中描述的系统。
在一些实施方式中，所述系统或设备在整合或自含独立系统中，和/或以自动化的或可编程的形式，进行例如分离、处理、工程改造和配制步骤中的一个或多个步骤，例如，全部步骤。在一些方面中，所述系统或设备包括与所述系统或设备信息连通的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估所述处理、分离、工程改造和配制步骤的结果，和/或调节所述处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。
在一些方面中，使用CliniMACS系统(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotic))进行所述分离和/或其它步骤，例如，以供在封闭和无菌系统中进行临床级别水平的细胞的自动化分离。组件可包括整合的微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵，和各种夹管阀。在一些方面中，整合的计算机控制仪器的所有组件，并指示所述系统以标准化的顺序进行重复的步骤。在一些方面中，磁性分离单元包括可移动的永久磁体和用于选择柱的支持物(holder)。蠕动泵控制通过贯穿管组的流速，并且，与夹管阀一起，确保通过所述系统的缓冲液的受控流和细胞的连续悬液。
在一些方面中，CliniMACS系统使用以无菌、无热源溶液形式提供的抗体-偶联的可磁化颗粒。在一些实施方式中，在用磁性颗粒标记细胞之后，清洗细胞以移除过量的颗粒。然后，将细胞制备袋连接至管组，其进一步连接包含缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预组装的无菌管道组成，包括前置柱和分离柱，并且仅用于单次使用。在分离程序起始之后，系统自动化地将所述细胞样品施加至分离柱上。使带标记的细胞保留在柱中，而通过一系列清洗步骤移除未标记的细胞。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是未标记的，并且不被保留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是经标记的，并且被保留在柱中。在一些实施方式中，在移除磁场之后，从所述柱洗脱用于本文所述方法的细胞群，并将其收集在细胞收集袋中。
在某些实施方式中，分离和/或其它步骤采用CliniMACS Prodigy系统(美天旎生物技术公司)进行。在一些方面中，CliniMACS Prodigy系统装配有细胞处理单元，所述细胞处理单元允许自动化清洗和通过离心分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可包括内置照相机和图像识别软件，其通过辨别来源细胞产物的肉眼可见层来确定最优细胞分级分离终点。例如，外周血可被自动化地分离成红细胞、血液白细胞和血浆层。CliniMACSProdigy系统还可包括整合的细胞培育腔室，其完成细胞培养方案，例如，细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如，Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9):651–660,Terakura等.(2012)Blood.1:72–82,和Wang等.(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过流式细胞术收集和富集(或消耗)，其中针对多种细胞表面标志物被染色的细胞携载于流体流中。在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过制备规模(FACS)-分选法收集和富集(或消耗)。在某些实施方式中，本文所述的细胞群通过采用微电机系统(MEMS)芯片联合基于FACS的检测系统来收集和富集(或消耗)(参见例如，WO 2010/033140，Cho等(2010)Lab Chip 10，1567-1573；和Godin等(2008)JBiophoton.1(5):355–376。在这两种情况中，细胞可以用多种标志物标记，以允许以高纯度分离明确界定的T细胞亚组。
在一些实施方式中，抗体或结合伴侣用一种或多种可检测标志物标记，以促进用于正和/或负选择的分离。例如，分离可基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，将基于对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的抗体或其它结合伴侣的结合所进行的细胞分离携载于流体流中，例如通过荧光活化的细胞分选(FACS)(其包括制备规模(FACS)和/或微电机系统(MEMS)芯片)，如与流式细胞术检测系统联合。此类方法允许进行基于多种标志物的同时正和负选择。
在一些实施方式中，制备方法包括：冷冻步骤，例如，在分离、孵育和/或工程改造之前或之后，冻存所述细胞。在一些实施方式中，所述冷冻和后续融化步骤移除细胞群中的粒细胞，并且，在某种程度上，移除细胞群中的单核细胞。在一些实施方式中，例如，在清洗步骤以移除血浆和血小板之后，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面中，可采用各种已知冷冻溶液和参数中的任何一种。一个实例涉及采用包含20％ DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS或其它合适的细胞冷冻培养基。然后，用培养基1:1将其稀释，从而DMSO和HSA的终浓度分别是10％和4％。然后，以1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。
在一些实施方式中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、活化、和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成在群中诱导细胞增殖、繁殖、活化，和/或存活以模拟抗原接触，和/或以引发细胞用于遗传工程改造，如用于导入重组抗原受体的那些条件。
所述条件可包括如下一种或多种：具体培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、作用剂，例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和经设计以活化细胞的任何其它作用剂。
在一些实施方式中，刺激条件或作用剂包括一种或多种作用剂，例如，配体，其能够活化TCR复合物的胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述作用剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号转导级联。这样的作用剂可包括抗体，例如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如，抗-CD3、抗-CD28，例如，其结合至固体支持物，例如珠，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗-CD3和/或抗-CD28抗体。在一些实施方式中，刺激型作用剂包括1L-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL浓度的IL-2。
在一些方面中，孵育根据例如授予Riddell等的美国专利号6,040,177，Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9):651–660,Terakura等.(2012)Blood.1:72–82和/或Wang等.(2012)J Immunother.35(9):689-701中所述的那些技术进行。
在一些实施方式中，T细胞群通过如下方式扩增：在组合物中添加饲养细胞，如非分裂型外周血单核细胞(PBMC)，(例如，从而针对待扩增的初始群中的各T淋巴细胞，所得细胞群包含至少约5、10、20或40或更多PBMC饲养细胞)；并孵育所述培养物(例如，培养足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面中，所述非分裂型饲养细胞可包括γ-辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方式中，所述PBMC用约3000-3600拉德范围内的γ射线辐照以防止细胞分裂。在一些方面中，所述饲养细胞在添加T细胞群之前添加至培养基。
在一些实施方式中，刺激条件包括适于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。可选地，孵育还可包括添加非分裂型EBV-转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养层细胞。LCL可以用约6000-10000拉德范围内的γ射线辐照。在一些方面中，LCL饲养细胞以任何合适的量提供，例如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率是至少约10:1。
在实施方式中，通过用抗原刺激天然或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，抗原特异性T细胞系或克隆可针对巨细胞病毒抗原产生，通过从感染的对象分离T细胞并采用相同抗原体外刺激细胞来进行。
B.设备和制品
在一些实施方式中，还提供了设备或制品。在一些实施方式中，提供了生物反应器和用于色谱法的第一固定相的组合件。该生物反应器适用于扩增细胞，而该固定相则适用于细胞分离和去除反应剂。第一固定相是凝胶过滤基质和/或亲和色谱基质，其中该凝胶过滤基质和/或亲和色谱基质包含亲和反应剂(例如所描述的多聚化反应剂)，其中该反应剂包含特异性结合第一作用剂所包含的结合伴侣C(例如C1)的结合位点Z(例如Z1)，和/或亲和反应剂(例如所描述的多聚化反应剂)包含特异性结合第二作用剂所包含的结合伴侣C(例如C2)的结合位点Z(例如Z2)。在一些实施方式中，凝胶过滤基质和/或亲和色谱基质包含亲和反应剂(例如所描述的多聚化反应剂)，其中所包含的反应剂包含特异性结合额外作用剂所包含的结合伴侣C(例如与第一或第二作用剂中所包含的相同或不同)的结合位点Z(例如与第一或第二作用剂相同或不同)。该第一固定相由此适于在其上固定所述第一作用剂、第二作用剂和/或额外作用剂、结合伴侣C，例如第一结合伴侣C1和/或游离的第二结合伴侣C2。此外，生物反应器和固定相流体连接。该组合件可用在如上文所解释的系列扩增中，且可整合到已知的细胞扩增系统中，例如细胞扩增系统或Xuri细胞扩增系统W25。
在该组合件中，第一固定相包含在色谱柱中或为平面固定相。该组合件还可包含第二固定相，其与第一固定相流体连接。该第二固定相可为凝胶过滤基质和/或亲和色谱基质，其中该凝胶过滤和/或亲和色谱基质包含亲和反应剂。该亲和反应剂可包含结合(特异性结合)多聚化反应剂的结合位点Z1的结合伴侣D，由此适用于将多聚化反应剂固定在固定相上。
还提供了一种用于纯化(例如选择)和培养(例如刺激或扩增)细胞组合物的设备，该设备包含至少一个如上所定义的生物反应器和用于色谱法的第一固定相或第二固定相的组合件。
该设备还可包括串联流体连接的生物反应器和固定相的多个组合件。
该设备可包含与组合件的生物反应器流体连接的样品进口，该组合件为生物反应器和用于色谱法的固定相的组合件。该设备还可包含用于目标细胞纯化和扩增的样品出口，该样品出口与至少一个组合件中的最后一个组合件的固定相流体连接，所述组合件为生物反应器和用于色谱法的固定相的组合件
在一些实施方式中，该设备可设计为功能性封闭系统。
C.经培养细胞的示例性特征
在一些实施方式中，经培养的目标细胞(例如经培养的T细胞)，其可包括根据本文所提供方法产生或生产的经培养细胞，基于或相对于它们增殖能力、表面标志物表达、分化状态、活化状态和/或代谢谱，显示一种或多种特定的表型和/或功能特征。在一些实施方式中，与根据本文所提供方法孵育之前的组合物中的对应或相应细胞功能或表型相比，根据所提供的任何方法培养目标细胞(例如培养T细胞)可使得细胞与功能(例如提高或降低功能活性)或表型(例如一种或多种标志物的更高或更低表达)相关的参数发生变化。在一些实施方式中，经培养的T细胞显示与如下参数相关的变化：扩增和/或增殖能力、CD4+/CD8+T细胞分布或比例、表面标志物表达、功能活性或代谢谱。
在一些实施方式中，在经培养T细胞中测得的参数变化是与在参比T细胞组合物或制备物中测得的相同或类似参数相比，或是以其为参照。通常，参比T细胞组合物或制备物中的T细胞包含或衍生自与可逆结合剂(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)一起孵育前的相同或基本相同的T细胞组合物，除了未对这些细胞进行孵育或对这些细胞进行了不同的孵育。在一些实施方式中，采用基本上相同的方案或条件(例如孵育中刺激剂的类型、刺激剂的形式、基本上相同的起始细胞数量、洗涤、存在额外反应剂与否、时间、温度)对参比T细胞制备物进行孵育，除了在参比T细胞制备物该孵育的至少一方面，在一些情况中仅一方面不同于产生经培养T细胞的孵育。在一些实施方式中，参比T细胞制备物是如下的制备物：其孵育中不采用多聚化反应剂而采用其他形式(例如直接和/或非可逆结合或偶联于支持物(例如固体支持物)，如珠、颗粒、磁性颗粒或珠、纳米颗粒或微球)的受体结合剂(例如刺激剂)。
在一些实施方式中，参比T细胞组合物或制备物是如下的组合物：与可逆结合剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)之前的包含T细胞的组合物。
在一些实施方式中，经培养T细胞如下产生：与可逆结合剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)少于5天和/或该作用剂与细胞上一种或多种分子的连接被破坏(例如在竞争性反应剂如生物素或生物素类似物的存在下)，例如在开始与该作用剂一起孵育起的5天内进行破坏。例如，在一些方面中，经培养T细胞在如下步骤后产生或生产：如本文所述，与可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中，所述孵育在起始该孵育后的5天内终止和/或被破坏(例如在约4、3、2或1天内，或更短时间内)，和/或在起始该孵育后的5天内(例如在约4、3、2或1天内，或更短时间内)向孵育细胞加入从细胞解离可逆结合作用剂的竞争剂(如生物素)。在一些实施方式中，参比T细胞制备物在如下步骤后产生或生产：与相同或基本相同的可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，但其中，所述孵育进行5天以上，并不终止和/或破坏以减弱或终止细胞中的信号诱导或调节，和/或其中T细胞制备物的生产不加入从细胞解离反应剂的竞争剂(如生物素或生物素类似物)。
在一些实施方式中，经培养T细胞如下产生：与可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中，受体结合剂(例如刺激剂)是不结合CD28和/或诱导信号转导的受体结合剂，不是抗CD28抗体或其片段。例如，在一些实施方式中，经培养T细胞在如下步骤后产生或生产：与其中一种或多种刺激剂与链霉亲和素突变蛋白可逆结合的可逆结合作用剂一起孵育，其中至少一种刺激剂特异于CD3(例如抗CD3抗体或其片段)，且第二刺激剂可特异于CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM中的一种或多种(例如，分别为抗CD90抗体、抗CD95抗体、抗CD137抗体、和抗CD154抗体、抗ICOS抗体、抗LAT抗体、抗CD27抗体、抗OX40抗体或抗HVEM抗体，或其抗原结合片段)。在一些实施方式中，参比T细胞制备物是如下步骤后产生或生产的T细胞培养物：与可逆结合作用剂一起孵育(如多聚的作用剂，例如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，但其中，该作用剂包含特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂。例如，在一些实施方式中，参比T细胞制备物在如下步骤后产生或生产：将T细胞组合物与抗CD3/抗CD28抗CD3/抗CD28/>珠或其他抗CD3/抗CD28刺激剂一起孵育。在一些实施方式中，该其他抗CD3/抗CD28刺激剂是其中抗体反应剂结合于支持物(例如固体支持物，如珠、颗粒、磁性颗粒或珠、纳米颗粒或微球)的作用剂。在一些实施方式中，经培养T细胞通过与可溶性(即不结合于支持物(如固体支持物))的可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，例如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)制备。
例如，在一些实施方式中，提供了经培养的T细胞，例如根据本文所提供的任何方法制备，其中该经培养的T细胞在如下步骤后产生或生产：与如本文所述的可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中该经培养的T细胞的特征为：与参比T细胞组合物或制备物相比，具有增强的扩增和/或增殖能力。在一些实施方式中，该增强的扩增和/或增殖能力包括：与参比T细胞组合物或制备物中的相应CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的数量或百分比相比，经培养的T细胞中的CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的数量或百分比提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任何一者)。
在一些实施方式中，提供了经培养的T细胞，例如根据本文所提供的任何方法制备，其中该经培养的T细胞在如下步骤后产生或生产：与如本文所述的可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中该经培养的T细胞的特征为：与参比T细胞培养物相比，具有增强的CD3+T细胞扩增和/或增殖能力。在一些实施方式中，该增强的扩增和/或增殖能力包括：与参比T细胞组合物或制备物中的相应CD3+T细胞的数量或百分比相比，经培养的T细胞中的CD3+T细胞的数量或百分比提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，提供了经培养的T细胞，例如根据本文所提供的任何方法制备，其中该经培养的T细胞在如下步骤后产生或生产：与如本文所述的可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中该经培养的T细胞的特征为：与参比T细胞组合物或制备物相比，具有增强的CD4+T细胞扩增和/或增殖能力。在一些实施方式中，该增强的扩增和/或增殖能力包括：与参比T细胞组合物或制备物中的相应CD4+T细胞的数量或百分比相比，经培养的T细胞中的CD4+T细胞的数量或百分比提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，提供了经培养的T细胞，例如根据本文所提供的任何方法制备，其中该经培养的T细胞在如下步骤后产生或生产：与如本文所述的可逆结合剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中该经培养的T细胞的特征为：与参比T细胞组合物或制备物相比，具有增强的CD8+T细胞扩增和/或增殖能力。在一些实施方式中，该增强的扩增和/或增殖能力包括：与参比T细胞组合物或制备物中的相应CD8+T细胞的数量或百分比相比，经培养的T细胞中的CD8+T细胞的数量或百分比提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，提供了经培养的T细胞，例如根据本文所提供的任何方法制备，其中该经培养的T细胞在如下步骤后产生或生产：与如本文所述的可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中该经培养的T细胞的特征为：与参比T细胞组合物或制备物相比，具有改变的CD8+/CD4+T细胞分布或标准化T细胞分布，例如改变的CD8+/CD4+比例或标准化CD8+/CD4+T细胞比例。该CD8+/CD4+比例或标准化比例可提高或降低。在一些实施方式中，相对于参比组合物或制备物中的CD8+T细胞的数量或百分比或标准化数量或百分比、或与之相比，改变的CD8+/CD4+T细胞比例使得经培养T细胞中CD8+T细胞的数量或百分比或标准化数量或百分比提高。在一些实施方式中，与参比组合物或制备物中的CD8+T细胞的数量或百分比或CD8+T细胞标准化数量或百分比相比，经培养的T细胞中的CD8+T细胞的数量提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或制备物中的CD8+/CD4+T细胞比例或标准化CD8+/CD4+比例相比，CD8+/CD4+T细胞比例或标准化CD8+/CD4+比例提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。在一些实施方式中，经培养T细胞中或者组合物或制备物中的数量、百分比或比例基于孵育前包含T细胞的起始组合物中的数量、百分比或比例标准化。
在一些实施方式中，提供了经培养的T细胞，例如根据本文所提供的任何方法制备，其中该经培养的T细胞在如下步骤后产生或生产：与如本文所述的可逆结合作用剂一起孵育(例如多聚的作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)，其中该经培养的T细胞的特征为：与参比T细胞组合物或制备物相比，改变的表面标志物表达谱。在一些实施方式中，该改变的表面标志物表达谱归因于一种或多种T细胞亚组的数量或百分比的改变，所述T细胞亚组的一种或多种选自下组的表面标志物为阳性、阴性、高或低：CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69、CCR7、CD27、CD28、CD122、T-bet、IL-7Rα、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1、KLRG1。在一些实施方式中，与参比组合物或制备物中的T细胞亚组的数量或百分比相比，经培养的T细胞中该T细胞亚组的数量或百分比提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或制备物相比，经培养T细胞中的T细胞亚组(例如与参比组合物或制备物相比，经培养T细胞中增加的T细胞亚组)具有降低或减少的分化或活化状态。在一些实施方式中，T细胞亚组不是或不包含效应T细胞(TE)或效应记忆T细胞(TEM)表型。在一些实施方式中，T细胞亚组包含如下中一种或多种表面表型：CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+或KLRG1低/-。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或培养物中的T细胞亚组的数量或百分比相比，经培养的T细胞中该T细胞亚组提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，经培养T细胞中的T细胞亚组(例如与参比组合物或制备物相比，经培养T细胞中有所增加的T细胞亚组)为CD62L和/或IL-7Rα(CD127)阳性和/或阴性或t-bet低。在一些实施方式中，T细胞亚组为CD45RA阳性和/或阴性或CD45RA低。在一些实施方式中，T细胞亚组为CCR7、CD45RA、CD62L、CD27、CD28、IL-7Rα(CD127)、CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1中的一种或多种，和/或CD45RO阴性。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或培养物中的T细胞亚组的数量或百分比相比，经培养的T细胞中该T细胞亚组提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，经培养T细胞中的T细胞亚组(例如与参比组合物或制备物相比，经培养T细胞中有所增加的T细胞亚组)为CD62L阳性(CD62L+)细胞或包含CD62L阳性(CD62L+)细胞。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或培养物中的T细胞亚组的数量或百分比相比，经培养的T细胞中该T细胞亚组提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，经培养T细胞中的T细胞亚组(例如与参比组合物或制备物相比，经培养T细胞中有所增加的T细胞亚组)是或包含具有如下特征的细胞：CD62L+，且a)CD45RA低/+、CD45RO低/+、CCR7+和CD27+中的任何一种或多种，且b)t-bet低、IL-7Rα+(CD127+)、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的任何一种或多种。在一些实施方式中，T细胞亚组还可为CD3+、CD4+或CD8+。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或培养物中的T细胞亚组的数量或百分比相比，经培养的T细胞中该T细胞亚组提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，经培养T细胞中的T细胞亚组(例如CD62L+T细胞亚组)为或包括记忆T细胞或其具体亚组(例如长寿记忆T细胞)，或与记忆T细胞或其具体亚组(例如长寿记忆T细胞)具有相同的表型特征。在一些实施方式中，此类记忆T细胞是中心记忆T细胞(TCM)或T记忆干细胞(TSCM)细胞。在一些实施方式中，所述记忆T细胞是TSCM细胞。与其他记忆T细胞亚组相比或与原初T细胞相比，TSCM细胞可被描述为具有一种或多种表型差异或功能性特征，例如更少分化或更原初化(参见例如Ahlers和Belyakov(2010)Blood,115:1678)；Cieri等，(2015)Blood,125:2865；Flynn等，(2014)Clinical&Translational Immunology,3,e20；Gattinoni等，(2012)Nat.Med.,17:1290-1297；Gattinoni等，(2012)Nat.Reviews,12:671；Li等，(2013)PLOS ONE,8:e67401；以及公开的PCT申请No.WO2014/039044)。在一些情况中，TSCM细胞被认为是唯一一种能产生效应T细胞和所有三个记忆T细胞亚组(TSCM,TCM,and TEM)的记忆T细胞。在一些方面中，在所有记忆T细胞亚组中，TSCM细胞具有针对抗原或稳态刺激的最高增殖应答和存活，以及缺乏关联抗原的最少消耗。在一些实施方式中，在过继转移后，与其他记忆T细胞相比，分化较少的TSCM细胞可具有更大的扩增、长寿活力以及目标细胞破坏，由此与用TCM或TEM细胞可能需要的细胞相比，可能以更少的转移细胞介导更有效治疗。
在一些方面中，已报导的或已知的针对TSCM细胞的表型或功能性特征包括例如，这些细胞：a)为CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+、IL-7Rα+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+；b)为CD45RA+、CCR7+、CD62L+和CD95+；c)为CD45RA+、CD45RO+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+和IL-2Rβ+；d)为CD45RO-、CD45RA+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD127+和CD95+；e)为CD45RA+、CD44+/-、CD62L+、CD127+、IL-2Rβ+、CD28+、CD43-、KLRG1-、Peforin-和颗粒酶B-；f)表达高水平的CCR7、CD62L、CD27和CD28，中等水平的CD95和IL-2Rβ，低水平的CD45RA，且不表达CD45RO或KLRG-1；或g)表达高水平的CD62L，低水平的CD44和t-bet，且为Sca-1+；和/或具有中等IL-2产生的能力，低IFNγ产生能力、低细胞毒性以及高自我更新能力。
在一些实施方式中，经培养T细胞中的T细胞亚组(例如与参比组合物或制备物相比，经培养T细胞中有所增加的T细胞亚组)为或包含记忆T细胞，例如长寿记忆T细胞。在一些实施方式中，所述记忆T细胞是中心记忆(TCM)T细胞。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RA-、CD45RO低/+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+CD122+和/或KLGR1低。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或培养物中的T细胞亚组的数量或百分比相比，经培养的T细胞中该T细胞亚组提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，所述记忆T细胞是T中心记忆干(TSCM)细胞。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RA低/+、CD45RO低/+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+、CD122+和/或KLGR1-。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RA低/+、CD45RO低/+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+、CD122+和/或KLGR1-。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+、IL-7Rα+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和/或LFA-1+。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RA+、CCR7+、CD62L+和/或CD95+。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RA+、CD45RO+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+和/或IL-2Rβ+。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RO-、CD45RA+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD127+和/或CD95+。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：CD45RA+、CD44+/-、CD62L+、CD127+、IL-2Rβ+、CD28+、CD43-、KLRG1-、Peforin-和/或颗粒酶B-。在一些实施方式中，T细胞亚组表达高水平的CCR7、CD62L、CD27和/或CD28，中等水平的CD95和/或IL-2Rβ，低水平的CD45RA和/或不表达CD45RO和/或KLRG-1。在一些实施方式中，T细胞亚组表达高水平的CD62L，低水平的CD44和t-bet，和/或为Sca-1+。在一些实施方式中，T细胞亚组具有表型特征：中等IL-2生产的能力，低IFNγ生产能力，低细胞毒性，和/或高自我更新能力。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或培养物中的T细胞亚组的数量或百分比相比，经培养的T细胞中该T细胞亚组提高至少约2倍(例如提高至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一者)。
在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或制备物相比，经培养的T细胞中所存在的T细胞亚组(例如如前所描述的任何T细胞亚组)占总T细胞的百分比更大，或在经培养T细胞中占总T细胞的数量更大。在一些实施方式中，经培养T细胞中T细胞亚组的百分比(以占培养物中总T细胞或总细胞的百分比计)为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方式中，与从人对象中基于表型所包含的一种或多种标志物的表面表达直接分离或富集、但不经孵育或培养的T细胞组合物中T细胞中的相应细胞亚组百分比相比，经培养细胞中T细胞亚组(例如如前所描述的任何T细胞亚组)的百分比更大，例如大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或大更多。在一些实施方式中，与参比T细胞组合物或制备物(例如如上所述的任何参比T细胞组合物或制备物，如根据本文所提供任何方法与可逆结合作用剂一起孵育前(例如多聚化作用剂，如与可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白的刺激剂一起孵育)的T细胞组合物)中的T细胞亚组总数、相对数目或标准化数目相比，经培养细胞中T细胞亚组(例如如前所描述的任何T细胞亚组)的总数、相对数目或标准化数目更大，例如大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或大更多。在一些实施方式中，对应于T细胞培养物中所存在的T细胞亚组的T细胞数为至少或至少约1×106个细胞、2×106个细胞、3×106个细胞、4×106个细胞、5×106个细胞或更多。
+在一些实施方式中，T细胞亚组为CD62L+和/或IL-7Rα+(CD127+)，且经培养T细胞中CD62L+和/或IL-7Rα+(CD127+)亚组的百分比(以占培养物中总T细胞或总细胞的百分比计)为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方式中，T细胞亚组为CD45RA-、CD45RO低/+和/或KLRG1低，且经培养T细胞中CD45RA-、CD45RO低/+和/或KLRG1低亚组的百分比(以占培养物中总T细胞或总细胞的百分比计)为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方式中，T细胞亚组为CD45RA低/+、CD45RO低/+和/或KLRG1-，且经培养T细胞中CD45RA低/+、CD45RO低/+和/或KLRG1-亚组的百分比(以占培养物中总T细胞或总细胞的百分比计)为至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
在一些实施方式中，T细胞亚组为TCM细胞，或包含TCM细胞。在一些实施方式中，经培养T细胞中TCM细胞亚组的百分比占总T细胞百分比或占培养物中总细胞的至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
在一些实施方式中，T细胞亚组为TSCM细胞，或包含TSCM细胞。在一些实施方式中，经培养T细胞中TSCM细胞亚组的百分比占总T细胞百分比或占培养物中总细胞的至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
在一些实施方式中，T细胞亚组，例如CD62L+T细胞具有或显示：a)低水平的TCR重排删除环(TREC)；和/或b)表达增殖标志物(例如Ki-67)；和/或c)在刺激剂的存在下显示增殖能力；和/或d)在刺激剂的存在下显示产生选自IFN-γ、TNF和IL-2的细胞因子的能力；和/或e)在缺乏刺激剂时对损耗有耐性(refractory to attrition)；和/或f)能够产生TSCM、TCM、TEM和TEFF细胞；和/或g)具有低细胞毒性；和/或h)在用少于TCM或TEM细胞的细胞过继转移后，能产生相同或更大的应答。在一些实施方式中，刺激剂是抗原、稳态细胞因子(例如IL-15或IL-17)，或者是能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关信号的作用剂。在一些实施方式中，产生细胞因子的能力包括产生IFNγ的低能力和/或产生IL-2的中等能力。
在一些实施方式中，提供了经培养的T细胞(例如根据本文所提供的任何方法制备)，其中经培养的T细胞在如本文所提供的孵育后产生或生产，且其中经培养的T细胞的特征在于与参比T细胞组合物或制备物相比，具有改变的功能活性谱。在一些实施方式中，与参比组合物或制备物相比或与参比组合物或制备物中的T细胞亚组相比，培养物中的经培养的T细胞或特定的T细胞亚组显示改变的功能活性谱，例如功能活性改变(例如提高或降低)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。在一些实施方式中，功能活性选自以下中的一种或多种：a)低水平的TCR重排删除环(TREC)；和/或b)表达增殖标志物(例如Ki-67)；和/或c)在刺激剂的存在下的增殖能力；和/或d)在刺激剂的存在下产生选自IFN-γ、TNF和IL-2的细胞因子的能力；和/或e)在缺乏刺激剂时对损耗有耐性；和/或f)能够产生TSCM、TCM、TEM和TEFF细胞；和/或g)低细胞毒性。在一些实施方式中，刺激剂是抗原、稳态细胞因子(例如IL-15或IL-17)，或者是能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关信号的作用剂。在一些实施方式中，产生细胞因子的能力包括产生IFNγ的低能力和/或产生IL-2的中等能力。在一些实施方式中，在经培养的T细胞中的T细胞亚组包括记忆T细胞，例如长寿记忆T细胞。在一些实施方式中，记忆T细胞是TSCM细胞。
在一些实施方式中，与采用参比组合物或制备物或采用参比组合物或制备物中的T细胞亚组进行过继转移所获得的应答相比，用更少的培养物中所存在的经培养的T细胞或特定T细胞亚组进行细胞过继转移后，能产生相同或更大的应答。在一些实施方式中，该应答采用少至少约2倍(例如至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一)的细胞获得。在一些实施方式中，该应答提高或增大至少约2倍(例如至少约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中的任一)。
在一些实施方式中，与在GSK-P抑制剂存在下在T细胞制备物中孵育的相应细胞亚组相比，经培养细胞中该T细胞亚组的百分比(例如如上所述的任何T细胞亚组)更大，例如大至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或更大。在一些实施方式中，经培养T细胞的组合物不含GSK-P抑制剂。
在一些实施方式中，与在重组稳态细胞因子(可选地IL-7或IL-15)存在下孵育的相应细胞亚组相比，经培养细胞中该T细胞亚组的百分比(例如如上所述的任何T细胞亚组)更大，例如大至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或更大。在一些实施方式中，经培养T细胞的组合物不含重组(例如外源)IL-7细胞因子或重组(例如外源)IL-15细胞因子。
在一些实施方式中，经培养T细胞的组合物根据本文所提供的任何方法生产或产生，其中将物质，例如竞争剂加入T细胞以破坏(例如减少和/或终止)一种或多种刺激剂的信号转导。在一些实施方式中，经培养T细胞的组合物包含物质(例如竞争剂，如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)的存在。在一些实施方式中，与在孵育中未外源加入该物质的参比组合物或经培养T细胞中该物质的量相比，该物质(例如竞争剂，如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)的存在量大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或更大。在一些实施方式中，经培养T细胞的组合物中该物质(例如竞争剂，如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)的量为或约为10μM～100μM、100μM～1mM、100μM～500μM或10μM～100μM。
IV.经培养细胞、抗原受体和基因工程化改造细胞的基因工程化改造方法
在一些实施方式中，经培养细胞包含或经工程化改造而包含：工程化改造的受体，例如工程化改造抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)，或T细胞受体。还提供了此类细胞的群，包含此类细胞的组合物和/或富含此类细胞的组合物，例如其中某一类型的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)被富集或选择。组合物包括用于给药的药物组合物和制备物，如用于过继细胞治疗。还提供将所述细胞和组合物给予对象(例如患者)的治疗方法。
因此，在一些实施方式中，经培养的细胞包括通过基因工程改造导入的一种或多种核酸，并由此表达所述核酸的重组或经基因工程改造的产物。在一些实施方式中，基因转移通过如下方式进行：首先，刺激培养的细胞，例如，通过将其与刺激物合并，所述刺激物诱导响应，例如增殖、存活和/或活化，例如，通过细胞因子或活化标志物的表达来检测，然后转导该活化的细胞，并且在培养物中扩增至足以供于临床应用的数量。
在一些情况中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对对象具有毒性。因此，在一些情况中，工程改造的细胞包含使细胞对体内负选择易感的基因区段(例如在过继免疫治疗中给予后)。例如在一些方面中，培养细胞经工程改造，从而它们可因它们所给予的患者的体内状况中的变化而被消除。可负选择的表型可通过插入赋予对所给予物质(例如，化合物)敏感性的基因来产生。可负选择的基因包括：单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等，Cell II:2，1977)，其提供更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核苷转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核苷转移酶(APRT)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。在一些方面中，经培养细胞还经工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。
A.编码抗原受体(例如嵌合抗原受体)的核酸
还提供了用于产生遗传工程改造的细胞的方法、核酸、化合物和试剂盒。基因工程改造一般涉及将编码重组或工程改造部分的核酸导入含有经培养细胞的组合物中，例如，通过逆转录病毒转导、转染或转化进行。
在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，如从另一个生物体或细胞获得的样品，其例如在待工程改造中的细胞和/或这类细胞来源的生物体中通常未发现。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如核酸不是自然中发现的，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。
1.嵌合抗原受体(CAR)
细胞通常表达重组受体，如抗原受体，包括功能性非TCR抗原受体，例如，嵌合抗原受体(CAR)，和其它抗原结合受体如转基因T细胞受体(TCR)。受体还包括其他嵌合受体。
示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，包括例如，在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所述的那些，和/或Sadelain等，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等，Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等，Cancer,2012年3月18(2):160-75中所述的那些。在一些方面中，所述抗原受体包括美国专利号7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的实例包括任何上述出版物中公开的CAR，例如WO2014031687，US 8,339,645，US 7,446,179，US 2013/0149337，美国专利号7,446,190，美国专利号8,389,282，Kochenderfer等，2013,NatureReviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等，(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等，Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号:8,389,282。嵌合受体，例如CAR通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。
在一些实施方式中，受体靶向的抗原是多肽。在一些实施方式中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方式中，与正常或非目标细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞，例如，肿瘤或病原性细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方式中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程改造的细胞上表达。
在一些实施方式中，受体靶向的抗原包括：孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2，和MAGE A3、CE7、维尔姆斯瘤(WT-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A1(CCNA1)和/或生物素化的分子，和/或通过HIV、HCV、HBV或其它病原体表达的分子。
在一些实施方式中，CAR结合病原体特异性抗原。在一些实施方式中，所述CAR对病毒抗原(例如HIV，HCV，HBV等)，细菌抗原，和/或寄生性抗原具有特异性。
在一些实施方式中，重组受体(例如，CAR)的抗体部分还包括免疫球蛋白恒定区的至少部分，如铰链区，例如，IgG4铰链区，和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方式中，恒定区或部分是人IgG的，例如IgG4或IgG1的。在一些方面中，恒定区的部分作为抗原-识别组成部分(例如，scFv)和跨膜结构域之间的间隔物区域。相较于不存在该间隔物，该间隔物的长度可在抗原结合之后提供提高的细胞响应性。示例性间隔物，例如，铰链区，包括描述于国际专利申请公开号WO2014031687中的那些。在一些实例中，间隔物长度为或约为12个氨基酸或长度不超过12个氨基酸。示例性的间隔物包括具有如下长度的那些：至少约10～229个氨基酸、约10～200个氨基酸、约10～175个氨基酸、约10～150个氨基酸、约10～125个氨基酸、约10～100个氨基酸、约10～75个氨基酸、约10～50个氨基酸、约10～40个氨基酸、约10～30个氨基酸、约10～20个氨基酸或约10～15个氨基酸，并且包括上述所列范围的任何端点之间的整数。在一些实施方式中，间隔区具有约12个氨基酸或更短，约119个氨基酸或更短或约229个氨基酸或更短。示例性间隔物包括单独IgG4铰链，连接CH2和CH3结构域的IgG4铰链或连接CH3结构域的IgG4铰链。
该抗原识别结构域一般连接至一个或多个胞内信号转导组分，例如在CAR的情况中，模拟通过抗原受体复合物(例如TCR复合物)的活化的信号转导组分，和/或通过另一细胞表面受体的信号。因此，在一些实施方式中，抗原-结合组成部分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和胞内信号转导结构域连接。在一些实施方式中，跨膜结构域融合于胞外结构域。在一个实施方式中，使用天然与受体(例如CAR)中的结构域之一关联的跨膜结构域。在一些情况中，跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免这类结构域结合相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，在一些方面中，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CDS，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和/或CD154的那些(即至少包含它们的跨膜区域)。或者，在一些实施方式中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面中，合成跨膜结构域主要包括疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三聚体将出现在合成的跨膜结构域的各末端。在一些实施方式中，所述连接通过接头、间隔物和/或跨膜结构域发生。
胞内信号转导结构域包括模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体联合共刺激受体的信号，和/或仅通过共刺激受体的信号的那些。在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽接头(例如，长度为2～10个氨基酸的接头，例如包含甘氨酸和丝氨酸的接头(例如，甘氨酸-丝氨酸双联体))，并在CAR的胞质信号转导结构域和跨膜结构域之间形成连接。
所述受体(例如，CAR)，一般包括至少一种的一个或多个胞内信号转导组成部分。在一些实施方式中，受体包括TCR复合物的胞内组成部分，例如介导T-细胞活化和细胞毒性的TCR CD3链，例如，CD3ζ链。因此，在一些方面中，抗原-结合部分连接一个或多个细胞信号转导模块。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号转导结构域，和/或其它CD跨膜结构域。在一些实施方式中，所述受体，例如，CAR，还包括一种或多种其它分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的部分。例如，在一些方面中，CAR或其它嵌合受体包括CD3ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方式中，在CAR或其它嵌合受体连接时，受体的胞质结构域或胞内信号转导结构域活化免疫细胞(例如经工程改造以表达CAR的T细胞)的至少一种正常效应功能或应答。例如，在一些情况中，CAR诱导T细胞的功能，如溶细胞活性或辅助性T细胞活性，如细胞因子或其它因子的分泌。在一些实施方式中，采用抗原受体组成部分或共刺激分子的胞内信号转导结构域的截短部分来替代完整免疫刺激链，例如，若其转导效应物功能信号。在一些实施方式中，一个或多个胞内信号转导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面中，还包括天然情况下存在与这些受体一致作用以在抗原受体接合后启动信号转导的共受体。
在天然TCR的情况中，完全活化一般不仅需要通过TCR的信号转导，而且还需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，在CAR中还包括用于生成第二或共刺激信号的组成部分。在其他实施方式中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组成部分。在一些方面中，其他CAR在同一细胞中表达并且提供用于生成第二或共刺激信号的组成部分。
在一些方面中，T细胞活化被描述为通过两类胞质信号转导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性主要活化的那些(第一胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号转导序列)。在一些方面中，CAR包括此类信号转导组成部分之一或两者。
在一些方面中，CAR包括第一胞质信号转导序列，其调节TCR复合物的主要活化。以刺激方式作用的第一胞质信号转导序列可包含信号转导基序，已知其是基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。包含第一胞质信号转导序列的ITAM的实例包括源自如下的那些：TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CDS，CD22，CD79a，CD79b，和CD66d。在一些实施方式中，CAR中的一种或多种胞质信号转导分子包含胞质信号转导结构域，其部分或源自CD3ζ的序列。
在一些实施方式中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40、DAP10，和ICOS)的跨膜部分和/或信号转导结构域。在一些方面中，同一CAR同时包括活化和共刺激组成部分。
在一些实施方式中，活化结构域包括在一个CAR内，而共刺激组成部分由识别另一种抗原的另一CAR提供。在一些实施方式中，CAR包括活化或刺激性CAR、共刺激CAR，其均表达在同一细胞上(参见WO2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激性或活化CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方式中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，如识别除了与疾病或病症相关和/或对疾病或病症特异性以外抗原的CAR，由此通过疾病靶向CAR递送的活化信号通过抑制性CAR与其配体结合而减少或抑制，例如减少脱靶效应。
在某些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含CD28跨膜和信号转导结构域，其连接至CD3(例如，CD3-ζ)胞内结构域。在一些实施方式中，胞内信号转导结构域包括了嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域，其连接CD3ζ胞内结构域。
在一些实施方式中，CAR涵盖一个或多个，例如，两个或更多个，共刺激结构域和活化结构域，例如，胞质部分中的初始活化结构域。示例性的CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的胞内组成部分。
在一些实施方式中，CAR或其它抗原受体还包括标志物，例如细胞表面标志物，其可用于确定使细胞表达受体(例如细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR))的转导或工程改造。在一些方面中，标记物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如tEGFR)的全部或部分(例如截短形式)。在一些实施方式中，编码标志物的核酸可操作性地连接编码接头序列(例如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸。参见WO2014031687。
在一些实施方式中，标志物是分子，例如，细胞表面蛋白，其不在T细胞上或T细胞表面上天然可见，或其部分。
在一些实施方式中，所述分子是非自体分子，例如，非自体蛋白，即，不被待向其过继转移所述细胞的宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质。
在一些实施方式中，所述标志物无治疗性功能和/或除了用作基因工程改造的标志物(例如，用于选择成功地工程改造的细胞)之外没有其他作用。在其它实施方式中，标志物可以是治疗性分子或发挥一些所需效果的分子，如将在体内遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体之后的应答。
在一些情况中，CAR被称为第一、第二和/或第三代CAR。在一些方面中，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面中，第二代CAR是提供此信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(例如CD28或CD137)的胞内信号转导结构域的CAR；在一些方面中，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括包含抗体或抗体片段的胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括包含抗体或片段的胞外部分和胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，抗体或片段包括scFv，且胞内结构域包含ITAM。在一些方面中，胞内信号转导结构域包括CD3-ζ链的ζ链的信号转导结构域。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括跨膜结构域，其连接胞外结构域和胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面中，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。包括提供的受体和其他多肽(例如接头或肽)的多肽可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面中，所述多肽可包含对原始或天然序列进行的修饰，只要该蛋白质保留所需活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或PCR扩增所致的误差。
在一些实施方式中，由连续剂量的细胞表达的受体(例如，CAR)包含由第一剂量的细胞表达的受体(例如，CAR)的至少一种免疫反应性表位。在一些方面，由以连续剂量给予的细胞表达的受体(例如CAR)与例如由第一剂量表达的受体(例如CAR)相同，或者与由第一剂量给予的细胞表达的受体(例如CAR)基本相同。
由以各种剂量给予对象的细胞表达的重组受体(例如CAR)通常识别或特异性结合被治疗的疾病或病症或细胞中所表达的、与之相关的和/或特异性的分子。在特异性结合于分子(例如抗原)时，受体通常将免疫刺激性信号(例如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方式中，第一剂量中的细胞表达CAR，所述CAR特异性结合由疾病或病症的细胞或组织表达的抗原或与疾病或病症相关的抗原。
2.TCR
在一些实施方式中，基因工程化改造的抗原受体包括：重组T细胞受体(TCR)和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方式中，从患者鉴定、分离针对目标抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并导入细胞。在一些实施方式中，针对目标抗原的TCR克隆已在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统，或HLA)工程改造的转基因小鼠中产生。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等，(2009)Clin Cancer Res.15:169–180和Cohen等.(2005)J Immunol.175:5799–5808)。在一些实施方式中，使用噬菌体展示分离针对目标抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等，(2008)Nat Med.14:1390–1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349–354)。
在一些实施方式中，获得T细胞克隆后，将TCRα和β链分离并克隆入基因表达载体。在一些实施方式中，TCRα和β基因通过小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽(skip peptide)连接，从而两条链共表达。在一些实施方式中，TCR的基因转移(genetic transfer)通过逆转录病毒或慢病毒载体，或通过转座子完成(参见例如，Baum等，(2006)Molecular Therapy:The Journal of the American Society of Gene Therapy.18:1748–1757；和Hackett等，(2010)Molecular Therapy:The Journal of the American Society of GeneTherapy.18:674–683)。
3.多靶向
在一些实施方式中，细胞和方法包括多靶向策略，如在细胞上表达两种或更多种基因工程改造的受体，其各自识别相同或不同抗原，并且一般各自包含不同的胞内信号转导组成部分。这类多靶向策略描述于，例如，国际专利申请公开号WO 2014055668A1(描述活化和共刺激性CAR的组合，例如，靶向在脱靶(例如正常)细胞上独立存在但仅在待治疗的疾病或病症的细胞上一起存在的2种不同抗原)和Fedorov等，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)(描述表达活化和抑制性CAR的细胞，如其中活化CAR结合至在正常或非疾病细胞以及待治疗疾病或病症的细胞上均表达的抗原，并且抑制性CAR结合至仅在不希望治疗的细胞或正常细胞上表达的另一种抗原的那些策略)。
例如，在一些实施方式中，细胞包括表达第一基因工程改造的抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，其一般在特异性结合至由第一受体识别的抗原(例如第一抗原)之后，能够诱导针对该细胞的活化信号。在一些实施方式中，细胞还包括第二基因工程改造的抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如，嵌合共刺激受体，其一般在特异性结合至由第二受体识别的第二抗原之后，能够诱导针对免疫细胞的共刺激信号。在一些实施方式中，第一抗原和第二抗原是相同的。在一些实施方式中，第一抗原和第二抗原是不同的。
在一些实施方式中，第一和/或第二基因工程改造的抗原受体(例如，CAR或TCR)能够诱导针对细胞的活化信号。在一些实施方式中，受体包括包含ITAM或ITAM-样基序的胞内信号转导组成部分。在一些实施方式中，由第一受体诱导的活化包括细胞中的蛋白质表达改变或信号转导，其导致引发免疫应答，如ITAM磷酸化和/或引发ITAM-介导的信号转导级联，位于结合受体(例如，CD4或CD8等)附近分子的簇集和/或形成免疫学突触，一种或多种转录因子(如NF-κB和/或AP-1)的活化，和/或诱导因子(如细胞因子)的基因表达，增殖和/或存活。
在一些实施方式中，第一和/或第二受体包括共刺激受体(如CD28、CD137(4-1BB)、OX40、和/或ICOS)的胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，第一和第二受体包括不同的共刺激受体的胞内信号转导结构域。在一实施方式中，第一受体包含CD28共刺激信号转导区域，而第二受体包含4-1BB共刺激信号转导区域，或反之亦然。
在一些实施方式中，第一和/或第二受体包括包含ITAM或ITAM-样基序的胞内信号转导结构域以及共刺激受体的胞内信号转导结构域。
在一些实施方式中，第一受体包括包含ITAM或ITAM-样基序的胞内信号转导结构域，而所述第二受体包含共刺激受体的胞内信号转导结构域。与在相同细胞内诱导的活化信号结合的共刺激信号导致了免疫应答，如稳健且持续的免疫应答，如增加的基因表达、细胞因子和其他因子的分泌，和T细胞介导的效应功能，如细胞杀伤。
在一些实施方式中，仅连接第一受体或仅连接第二受体都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面中，如果仅连接一个受体，细胞变得耐受或对抗原无应答，或者被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或发挥效应物功能。然而，在一些这类实施方式中，当连接多个受体时，如在表达第一和第二抗原的细胞相遇之后，实现所需的应答，如全免疫活化或刺激，例如，由一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持续、和/或进行免疫效应功能(如细胞毒性杀伤目标细胞)所示。
在一些实施方式中，两种受体分别诱导针对细胞的活化和抑制信号，使得受体之一与其抗原的结合活化细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导阻抑或减弱该应答的信号。示例是活化CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。可使用这种策略，例如，其中活化CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，而抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些实施方式中，在如下情况中使用多靶向策略，瞬时(例如，在与基因工程改造相关的刺激下)或永久地在非疾病细胞上表达和/或工程改造的细胞本身上表达与特定疾病或病症相关的抗原。在这种情况中，通过要求连接2个分离并单独特异性的抗原受体，可改善特异性、选择性和/或功效。
在一些实施方式中，多种抗原(例如，第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织、或者疾病或病症上(如癌细胞上)表达。在一些方面中，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方式中，多种抗原中的一种或多种一般也在不希望用细胞治疗靶向的细胞(如正常或非疾病细胞或组织)和/或工程改造的细胞本身上表达。在这类实施方式中，通过需要连接多个受体来实现细胞应答，实现了特异性和/或功效。
B.用于基因工程改造的方法和载体
用于引入基因工程改造的组成部分(例如，抗原受体，例如，CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并可用于本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)，转导，转座子，和电穿孔的转移方法。
在一些实施方式中，采用重组感染性病毒颗粒(例如，源自猿病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移进入培养的细胞。在一些实施方式中，采用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Koste等，(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等，(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等，(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等，Trends Biotechnol.2011年11月；29(11):550–557)。
在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)，骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，鼠胚胎干细胞病毒(MESV)，鼠干细胞病毒(MSCV)，脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是兼嗜性的，这意味着它们能够感染数种物种(包括人类)的宿主细胞。在一个实施方式中，用待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多示例性的逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller，A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Scarpa等(1991)Virology 180:849-852；Burns等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于，例如，Wang等，(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等，(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等，(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等，(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方式中，通过电穿孔将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Chicaybam等，(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等.(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，通过转位将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Manuri等(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等，(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等，(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(Current Protocols inMolecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston，Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是描述于，例如，国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190的那些。
在一些实施方式中，可在扩增期间或之后，用T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)转染细胞(例如T细胞)。用于引入所需受体基因的该转染可用任何合适的逆转录病毒载体进行(例如)。然后，可从起始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)释放基因修饰的细胞群，随后用第二类刺激物(例如通过从头诱导的受体(de novo introduced receptor))刺激。该第二类刺激物可包括：肽/MHC分子形式的抗原性刺激物，遗传引入受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或任何直接结合新受体框架内的任何配体(如抗体)(例如同识别受体内的恒定区)。参见，例如，Cheadle等，“Chimeric antigen receptors for T-cell basedtherapy”(“用于基于T细胞的治疗的嵌合抗原受体”)2012；907:645-66或Barrett等，Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer(“癌症的嵌合抗原受体治疗”)AnnualReview of Medicine第65卷:333-347(2014).
用于引入的其他核酸(例如基因)包括：用于提高疗效的那些，例如通过促进被转移细胞的存活和/或功能；提供用于细胞的选择和/或评估的标志物(例如体内评估存活或定位)的基因；改善安全性(例如通过使得细胞对体内负选择敏感)的基因，如Lupton S.D.等，Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等，Human Gene Therapy3:319-338(1992)；还可参见Lupton等的公开PCT/US91/08442和PCT/US94/05601，其中描述了采用双官能可选择融合基因，其源自主要可正选择标志物与可负选择标志物的融合。参见例如Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。
在一些情况中，可采用无需细胞(例如T细胞)被活化的载体。在一些此类情况中，在活化前，可对细胞进行选择和/或转导。因此，对细胞的工程化改造可在如本文所述培养细胞之前或之后，在一些情况中，在培养的至少一部分的期间或同时。在一些实施方式中，待工程化改造的细胞是经培养的细胞，或在一些情况中，细胞可在进行如本文所述的培养前被转导。
V.给予的组合物、制剂和方法
还提供了包含工程化改造受体(例如工程化改造抗原受体)，如CAR或TCR的组合物，以及包含工程化改造细胞的组合物，其包括药物组合物和制剂。还提供了包含通过本文所提供任何方法生产的多个经培养T细胞或目标细胞以及可选的药学上可接受的赋形剂的组合物。还提供了使用这些组合物的方法以及这些组合物的用途，如在表达该抗原的疾病、病症和异常的治疗中的使用和用途，以及在检测、诊断和预防方法中的应用。
A.组合物/制剂
术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含对于待给予该制剂的对象具有不可接受的毒性的额外成分。
“药学上可接受的运载体”指药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对于对象无毒性。药学上可接受的运载体包括但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面中，运载体的选择部分由特定细胞和/或给药方法来确定。因此，存在多种合适的配方。例如，药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％～约2％(以组合物总重量计)。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol,A.编(1980)。在所用剂量和浓度下，药学上可接受的运载体通常是对受者无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面中，组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在一些方面中，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如，《雷明顿：药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，LWW公司(Lippincott Williams&Wilkins)；第21版(2005年5月1日)。
制剂或组合物还可包含多于一种活性成分，该活性成分可用于待用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选对所述细胞具有补充活性的那些，其中各自的活性彼此不产生负面影响。这类活性成分适合以有效用于所需目的的用量联合存在。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱等。在一些实施方式中，所述细胞或抗体以盐，例如，药学上可接受的盐，的形式给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸的那些，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，和有机酸，例如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸。
活性成分可包封在微囊剂中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在大乳液(macroemulsion)中。在某些实施方式中，所述药物组合物配制为包合复合物，例如环糊精包合复合物或配制为脂质体。脂质体可用以靶向宿主细胞(例如，T细胞或NK细胞)至具体组织。许多方法可用于制备脂质体，例如描述于，例如，Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中的那些。
在一些方面中，所述药物组合物采用时间-释放、延迟释放和持续释放递送系统，从而所述组合物的递送在待治疗的部位敏化之前发生，并且具有足够的时间造成该部位敏化。许多类型的释放递送系统是可得并已知的。此类系统能避免重复给予所述组合物，由此提高对象和医师的便利度。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效或预防有效量)的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象来监测治疗或预防性功效。对于经数天或更长时间的重复给药，可根据所述病症使治疗重复直至疾病症状得到所需阻遏。然而，其它剂量方案可能是有用的并可以确定。所需剂量可以通过单药丸给予所述组合物，通过多药丸给予所述组合物或通过连续输注给予组合物来递送。
可采用标准给药技术、制剂和/或装置给予细胞。提供了用于组合物储存和给予的制剂和装置，如注射器和瓶。所述细胞的给予可以是自体同源或异源的。例如，免疫抑制细胞或祖细胞可获自一个对象，并给予相同对象或不同的相容对象。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射、或胃肠外给药。当给予治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，其通常被配制成单位剂型的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。本文所用的术语“胃肠外”，包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞群通过静脉内，腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予对象。
在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如，等渗水性溶液、悬液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面中可缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物多少更便于给药，尤其是通过注射。在另一方面，粘性组合物可在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物。
可通过将所述细胞纳入溶剂中，如与合适的运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等来制备无菌可注射溶液。该组合物也可被冻干。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、色素等，取决于所需的给药和制备途径。在一些方面中，可查阅标准教科书来制备合适制备物。
可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质，如单硬脂酸铝和明胶延长可注射药物形式的吸收。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括：包含抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质是成型制品的形式，例如膜或微胶囊。
用于体内给药的制剂一般为无菌的。无菌可例如通过无菌滤膜过滤来容易地实现。
B.给药方法
提供给予所述细胞、群和组合物的方法，和所述细胞、群和组合物用于治疗或防止疾病、病症和紊乱，包括癌症的应用。在一些实施方式中，将所述细胞、群和组合物给予具有具体待治疗(例如，通过过继细胞治疗，例如过继T细胞治疗)的疾病或病症的对象或患者。在一些实施方式中，将通过本文提供的方法制备的细胞和组合物，例如在孵育和/或其它处理步骤之后工程改造的组合物和生产终末组合给予对象，如具有所述疾病或病症或有风险患上所述疾病或病症的对象。在一些方面中，所述方法由此治疗，例如，减轻所述疾病或病症的一种或多种症状，例如通过减小表达由工程改造的T细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷。
给予用于过继细胞疗法的细胞的方法是已知的，且可与本文所提供的方法和组合物联合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于，例如，Gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等.(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等.(2013)PLoSONE 8(4):e61338。
本文中所用的“对象”是哺乳动物，例如人或其它动物，并且通常是人。在一些实施方式中，被给予所述细胞、细胞群或组合物的对象(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类，例如人。在一些实施方式中，所述灵长类是猴子或猿。所述对象可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿，少年，青少年，成人，和老年对象。在一些实施方式中，所述对象是非灵长类哺乳动物，例如啮齿类。
本文中所用的术语“治疗”(及其语法变化形式例如“治疗的”和“治疗性”)指完全或部分减轻或减少疾病或病症或紊乱或与其相关的症状、不利作用或结果或表型。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，和减轻或改善预后。该术语不表示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果具有效果。
本文中所用的“延迟疾病的发展”表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、遏制和/或拖延所述疾病(例如癌症)的发展。该延迟可具有不同的时间长度，这取决于病史和/或待治疗的个体。本领域技术人员应明了，实际上，充分或显著的延迟就效果而言可涵盖预防(对于未发展所述疾病的个体而言)。例如，晚期癌症(例如转移的发展)可被延迟。
本文中所用的“预防”包括对于疾病在倾向于发展疾病但尚未被诊断患病的对象中的发生或复发提供预防。在一些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
本文中所用的“阻抑”功能或活性意指，在与其它情况下的相同(除感兴趣病症或参数)病症相比时或者相较于另一病症，功能或活性的减少。例如，与没有阻抑肿瘤生长的细胞存在情况下的肿瘤生长速率相比，阻抑肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
物质(例如，药物制剂、细胞或组合物)，在给予中的“有效量”是指在一定剂量/量下、且作用必要的时间长度时，有效获得所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
物质(例如，药物制剂或细胞)的“治疗有效量”是指在剂量上和必需时程上，有效获得所需治疗结果(例如疾病、病症或紊乱的治疗)和/或该治疗的药物动力学或药代动力学效果的量。治疗有效量可根据多种因素变化，例如，疾病状态、年龄、性别，和对象体重，以及给予的细胞群。在一些实施方式中，所提供的方法涉及给予有效量(例如，治疗有效量)的所述细胞和/或组合物。
“预防有效量”指在一定剂量和必要时程中有效于获得所需预防结果的量。通常而言(但非必须)，由于预防剂量在疾病的早期或之前用于对象，预防有效量将小于治疗有效量。
所治疗的疾病或病症可为其中抗原的表达与疾病状况或紊乱的病因相关和/或涉及疾病状况或紊乱的病因的任何疾病或病因，例如抗原表达造成、加剧或者涉及该疾病、病症或紊乱。示例性的疾病和病症可包括与细胞恶性化或转化的疾病或病症(例如肿瘤)、自身免疫性或炎性疾病、或传染性疾病，例如由细菌、病毒或其他病原体所致。示例性的抗原，包括与可被治疗的各自疾病和病症相关的抗原，如上文所描述。在具体实施方式中，嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合于与疾病或病症相关的抗原。
因此，所提供的方法和应用包括用于过继细胞疗法的方法和应用。在一些实施方式中，该方法包括向对象、组织或细胞，如具有疾病、病症或紊乱风险或疑似具有疾病、病症或紊乱的对象、组织或细胞给予细胞或含有该细胞的组合物。在一些实施方式中，将所述细胞、群和组合物给予具有具体待治疗(例如，通过过继细胞治疗，例如过继T细胞治疗)的疾病或病症的对象。在一些实施方式中，给予对象(如具有疾病或病症或者处于疾病或病症风险中的对象)细胞或组合物缓解疾病或病症的一种或多种症状。
在一些实施方式中，细胞治疗(例如，过继T细胞治疗)通过自体转移进行，其中所述细胞分离自和/或在其它情况中制备自接受所述细胞治疗的对象，或从源自该对象的样品分离和/或制备。因此，在一些方面中，所述细胞源自需要治疗和所述细胞的对象(例如，患者)，其在分离和加工之后给予同一对象。
在一些实施方式中，所述细胞治疗(例如，过继T细胞治疗)通过同种异体转移进行，其中所述细胞分离自和/或在其它情况中制备自与待接受或最终接受所述细胞治疗的对象(例如，第一对象)不同的对象。在此类实施方式中，然后将所述细胞给予相同物种的不同对象，例如，第二对象。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相同的。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相似的。在一些实施方式中，所述第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超类型。可提供任何合适的手段给予细胞。给药和给予可部分取决于该给予是短期还是长期的。不同给药方案包括但不限于在不同时间点单次或多次给予、大剂给予(bolus administration)和脉冲输注。
在某些实施方式中，所述细胞，或细胞亚型的个体群，以如下范围给予所述对象：约100万至约1000亿个细胞和/或每千克体重约100万至约1000亿个细胞，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞，约2500万个细胞，约5亿个细胞，约10亿个细胞，约50亿个细胞，约200亿个细胞，约300亿个细胞，约400亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，例如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞，约3000万个细胞，约4000万个细胞，约6000万个细胞，约7000万个细胞，约8000万个细胞，约9000万个细胞，约100亿个细胞，约250亿个细胞，约500亿个细胞，约750亿个细胞，约900亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，和在一些情况中，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞，约2.5亿个细胞，约3.5亿个细胞，约4.5亿个细胞，约6.5亿个细胞，约8亿个细胞，约9亿个细胞，约30亿个细胞，约300亿个细胞，约450亿个细胞)，或这些范围和/或每千克体重之间任何值。同样，剂量可取决于所述疾病或紊乱和/或患者和/或其它治疗的具体属性。在一些实施方式中，所述细胞作为联合治疗的部分给予，例如，与另一治疗性介入，例如抗体或经工程改造的细胞或受体或作用剂，例如细胞毒性或治疗剂，同时或依次地，以任何顺序给予。在一些实施方式中，细胞与一种或多种其它治疗剂共同给予，或与另一治疗介入联合，同时或以任何顺序依次进行。在一些情况中，所述细胞与另一治疗在足够接近的时间共同给予，从而所述细胞群增强一种或多种其它治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，所述细胞在一种或多种其它治疗剂之前给予。在一些实施方式中，所述细胞在一种或多种其它治疗剂之后给予。在一些实施方式中，一种或多种其他治疗剂包括细胞因子，如IL-2，例如，以增强持久性。在一些实施方式中，所述方法包括化疗剂的给予。
在给予细胞之后，在一些实施方式中，检测工程改造的细胞群的生物活性，例如，通过任何数量的已知方法进行。用以评估的参数包括：工程改造的或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性体内结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏目标细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，Kochenderfer等，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子，例如CD107a，IFNγ，IL-2和TNF的表达和/或分泌，来检测细胞的生物活性。在一些方面中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷或负载的减少，来检测。
在某些实施方式中，工程改造的细胞以任何数量的方式进一步修饰，从而增加其治疗或预防性功效。例如，通过细胞群表达的工程改造的CAR或TCR可通过接头直接或间接地偶连至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)偶联至靶向部分的实践是本领域已知的。参见例如，Wadwa等,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)，和美国专利5,087,616。
VI.定义
除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种或一个”或“一种(个)或多种(个)”。应理解本文中所述的方面和变化形式包括：“由(这些方面和变化形式)组成”和/或“基本由(这些方面和变化形式)组成”。
本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。这适用而无关范围的宽度。
本文使用的术语“约”是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。本文中述及“约”某值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的实施方式。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。
本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
本文所用术语“载体”指一种核酸分子，所述核酸分子能够传递其连接的另一核酸。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，以及纳入已经导入的宿主细胞基因组的载体。某些载体能够引导与其操作性连接的核酸的表达。所述载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒或慢病毒。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已导入外源核酸载体的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化株”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及其衍生的子代，不计传代次数。子代的核酸含量可不与亲本细胞完全相同，并可包含突变。本文包括功能或生物活性与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的突变子代。
当述及一种或多种具体细胞类型或细胞群时，本文中所用的“富集”指，所述细胞类型或群的数量或百分数的增加，例如，相比于组合物中的总细胞数量或所述组合物的体积，或相对于其它细胞类型，例如通过基于由所述群或细胞表达的标志物的正选择，或通过基于不存在于待消耗的细胞群或细胞上的标志物的负选择。该术语不需要从所述组合物完全移除其它细胞、细胞类型或群，并且不需要如此富集的细胞以100％或甚至接近100％地在所述富集的组合物中存在。
本文中所用的，细胞或细胞群针对具体标志物呈“阳性”指，所述细胞上或细胞中具体标志物(通常是表面标志物)的可检测的存在。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或显著高于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
本文中所用的，称细胞或细胞群针对具体标志物呈“阴性”指，所述细胞上或细胞中具有具体标志物(通常是表面标志物)的存在基本不可检测。当述及表面标志物时，该术语指，通过流式细胞术检测到存在表面表达，例如，通过用特异性地结合至所述标志物的抗体染色，并检测所述抗体，其中，所述染色可被流式细胞术以一定水平检测到，所述水平显著高于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标志物呈阳性的细胞的水平，和/或基本相似于已知对所述标志物呈阴性的细胞的水平。
本文所用术语“表达”是指基于核酸分子编码序列(例如基因)产生多肽的过程。该过程可包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。
如本文所用，对照是指基本与测试样品相同的样品，除了其未用测试参数处理，或者若其为血浆样品，其可来自未受感兴趣条件/病症影响的正常志愿者对照也可为内部对照。
VII.示例性实施方式
提供的实施方式包括：
1.一种用于培养T细胞的方法，所述方法包括：
(a)在受体结合剂的存在下孵育包含T细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的反应剂，和ii)能够以诱导或调节所述组合物中T细胞中信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的分子；和
b)在开始所述孵育后5天内，破坏所述受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合，由此产生培养的T细胞。
2.如实施方式1所述的方法，其中，孵育在一定条件下进行，在该条件下所述受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的信号。
3.如实施方式1或实施方式2所述的方法，其中，所述破坏在开始所述孵育后大于30分钟时发生。
4.如实施方式1-3中任一项所述的方法，其中：
所述破坏在开始所述孵育后1小时～4天时发生，在开始所述孵育后6小时～3天时发生，在开始所述孵育后12小时～2天时发生，在开始所述孵育后1天～3天时发生；或
所述破坏在开始所述孵育后约1小时～约4天时发生，在开始所述孵育后约6小时～约3天时发生，在开始所述孵育后约12小时～约2天时发生，在开始所述孵育后约1天～约3天时发生；或
所述破坏在所述孵育开始后的大于或等于约1小时且在所述孵育开始后的1天、2天、3天或4天内发生。
5.如实施方式1-4中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂能够在所述T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
所述受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
所述受体结合剂特异性结合CD3。
6.如实施方式1-5中任一项所述的方法，其中，所述分子是TCR/CD3复合物的组成部分或是CD3。
7.如实施方式1-6中任一项所述的方法，其中，所述分子是第一分子，且所述受体结合剂还能特异性结合一个或多个所述T细胞表面上的第二分子，其中第二分子可选地能够诱导或增强、抑制或改变通过T细胞中所述第一分子递送的信号。
8.如实施方式1-7中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂包含结合伴侣C1；且
多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂与反应剂之间的可逆键。
9.如实施方式1-8中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括使细胞接触包含物质的组合物，所述物质能够逆转所述受体结合剂和反应剂之间的键。
10.如实施方式1-9中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是第一受体结合剂，所述孵育进一步在第二受体结合剂的存在下进行，所述第二受体结合剂能够特异性结合一个或多个所述T细胞表面上的第二分子，所述第二分子可选地能够增强、抑制或改变通过T细胞中所述第一分子递送的信号。
11.如实施方式10所述的方法，其中，所述反应剂包含能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点，由此所述第二受体结合剂可逆结合所述反应剂。
12.如实施方式11所述的方法，其中，能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点与能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点可相同或不同。
13.如实施方式11或实施方式12所述的方法，其中：
第二受体结合剂包含结合伴侣C1或C2，其能够可逆结合所述两个或多个结合位点Z1，由此第一和第二受体结合位点通过所述两个或多个结合位点Z1可逆结合所述反应剂；和/或
第二受体结合剂包含结合伴侣C2，所述反应剂还包含多个结合位点Z2，其能够可逆结合结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键。
14.如实施方式13所述的方法，其中：
C2和C1相同或基本相同、或者包含相同或基本相同的部分；和/或
Z2和Z1相同或基本相同、或者包含相同或基本相同的部分。
15.如实施方式1-14中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是第一反应剂，且所述孵育在至少一种第二反应剂的存在下进行，该第二反应剂可逆结合第二受体结合剂。
16.如实施方式10-15中任一项所述的方法，其中，所述孵育在如下条件下进行：在该条件下，第二受体结合剂特异性结合第二分子，从而诱导或调节一种信号，所述信号增强、抑制或改变通过T细胞中所述第一分子递送的信号。
17.如实施方式7-16中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括：将组合物加入细胞，该组合物含有能逆转第一受体结合剂和反应剂之间的键和/或第二受体结合剂和反应剂之间的键的物质。
18.如实施方式7-17中任一项所述的方法，其中，所述破坏终止或减弱由第一受体结合剂诱导或调节的信号，且终止或减弱由第二受体结合剂诱导或调节的信号。
19.一种用于培养T细胞的方法，所述方法包括：
(a)在如下物质的存在下孵育包含T细胞的组合物：
i)第一受体结合剂，其能够以诱导或调节所述T细胞中TCR/CD3复合物相关信号的方式特异性结合所述T细胞表面上表达的第一分子；和
ii)第二受体结合剂，其(i)可逆结合包含能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点的反应剂，和(ii)能够以诱导或调节所述T细胞中第二信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的第二分子，以增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号；和
(b)在开始所述孵育后5天内，破坏第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合，由此产生培养的T细胞。
20.如实施方式19所述的方法，其中，在第一受体结合剂特异性结合第一分子和/或第二受体结合剂特异性结合第二分子的条件下进行孵育，由此诱导或调节T细胞中的一种或多种信号。
21.如实施方式19或实施方式20所述的方法，其中：
第二受体结合剂包含结合伴侣C1；且
多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第二受体结合剂与反应剂之间的可逆键。
22.如实施方式7-21中任一项所述的方法，其中：
所述第二信号是除了TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号；
所述第二信号能够增强或强化TCR/CD3复合物相关信号；或
所述第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子、或是TNF家族或TNF受体家族成员。
23.如实施方式7-22中任一项所述的方法，其中，所述第二分子选自：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。
24.如实施方式7-23中任一项所述的方法，其中，所述第二分子是CD28。
25.如实施方式7-24中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括：将组合物加入细胞，该组合物含有能逆转第二受体结合剂和反应剂之间的键的物质，该物质可为第二反应剂。
26.如实施方式7-25中任一项所述的方法，其中：
所述破坏终止或减弱由第二受体结合剂诱导或调节的信号；或
额外的分子为CD28，且所述破坏终止或减弱T细胞中CD28共刺激信号。
27.如实施方式1-26中任一项所述的方法，包括：在所述破坏后，进一步孵育包含所述T细胞的组合物。
28.如实施方式27所述的方法，其中：
所述孵育和进一步孵育在相同的容器中进行；和/或
所述进一步孵育在所述物质的存在下进行；和/或
所述方法不包括：在所述进一步孵育前，从细胞组合物中去除所述物质、受体结合剂、第二受体结合剂和/或反应剂。
29.如实施方式1-28中任一项所述的方法，其中：
所述孵育和/或进一步孵育在37℃±2℃或约37℃±2℃下进行；和/或
所述孵育和/或进一步孵育在能够将信号递送到T细胞的其他作用剂的存在下进行。
30.如实施方式29所述的方法，其中，所述其他作用剂能够增强或诱导T细胞、CD4+细胞和/或CD8+细胞的增殖。
31.如实施方式30所述的方法，其中，所述其他作用剂是选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。
32.如实施方式1-28中任一项所述的方法，其中，所述进一步孵育的进行时间不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过8天或不超过6天。
33.一种用于培养T细胞的方法，包括：
在特异性结合T细胞表面上CD28分子的受体结合剂的存在下，在使所述细胞中通过CD28的信号转导发生的条件下，孵育包含T细胞的组合物；和
在所述孵育开始后5天内，消除或减弱所述受体结合剂和CD28分子的结合，由此终止或减少所述细胞中的CD28信号转导，从而产生培养的T细胞。
34.如实施方式33所述的方法，其中，所述消除或减弱在开始孵育后4天内、3天内、2天内或1天内产生。
35.如实施方式33或实施方式34所述的方法，其中，所述消除或减弱包括：
洗涤所述细胞，由此从组合物中去除或减少未特异性结合CD28的任何受体结合剂。
逆转所述受体结合剂和CD28分子间的结合相互作用，可选地进一步包括洗涤所述细胞以去除或减少组合物中的受体结合剂。
36.如实施方式33-35中任一项所述的方法，其中，在孵育的至少部分期间和/或在孵育后，在特异性结合TCR/CD3复合物的分子的作用剂的存在下，孵育组合物中的T细胞，由此诱导或调节所述细胞中TCR/CD3复合物相关的信号。
37.一种培养T细胞的方法，包括：在受体结合剂的存在下孵育包含T细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的反应剂，和ii)能够以诱导或调节T细胞中信号的方式特异性结合T细胞表面上除CD28或CD3以外的分子，从而产生培养的T细胞。
38.如实施方式37所述的方法，其中，孵育在一定条件下进行，在该条件下所述受体结合剂特异性结合于所述分子，由此诱导或调节T细胞中的信号。
39.如实施方式37或实施方式38所述的方法，其中，所述信号不是TCR/CD3复合物相关的信号。
40.如实施方式37-39中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成所述受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
41.如实施方式37-40中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是第二受体结合剂，所述分子是第二分子，孵育在第一受体结合剂的存在下进一步进行，所述第一受体结合剂能够特异性结合一个或多个T细胞表面上的第一分子，该第一分子可选地能够诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的第一信号。
42.如实施方式41所述的方法，其中：
所述第一受体结合剂可逆结合所述反应剂，所述反应剂包含针对第一受体结合剂和第二受体结合剂的多个结合位点；或
第一受体结合剂可逆结合第二反应剂，所述第二反应剂包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点。
43.如实施方式41或实施方式42所述的方法，其中：
第一受体结合剂能够在所述T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
第一受体结合剂特异性结合CD3。
44.如实施方式41-43中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号；或
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强或强化TCR/CD3复合物相关的信号。
45.一种用于培养T细胞的方法，包括在如下物质的存在下孵育包含T细胞的组合物：
i)第一受体结合剂，其(i)可逆结合包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点的反应剂，和(ii)能够以诱导或调节所述组合物中T细胞中TCR/CD3复合物相关信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的第一分子；和
ii)第二受体结合剂，其(i)可逆结合进一步包含针对第二受体结合剂的多个结合位点的反应剂，或可逆结合包含能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点的第二反应剂，和(ii)能够以诱导或调节所述组合物中T细胞中第二信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的第二分子，所述第二分子是除CD28以外的其他分子，和
其中，所述孵育在如下条件下进行：所述条件使得所述信号和/或第二信号在组合物中的T细胞中被诱导或调节，由此产生培养的T细胞。
46.如实施方式44所述的方法，其中，第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员和/或第一受体结合剂特异性结合CD3。
47.如实施方式45或实施方式46所述的方法，其中：
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够诱导或调节除TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号。
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号；或
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强或强化TCR/CD3复合物相关的信号。
48.如实施方式37-47中任一项所述的方法，其中：
所述分子，可为第二分子，选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或
所述受体结合剂，其可为第二受体结合剂，特异性结合：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。
49.如实施方式37-48中任一项所述的方法，其中，所述分子，其可为第二分子，不是CD137，和/或所述受体结合剂，其可为第二受体结合剂，不特异性结合CD137。
50.如实施方式42-49中任一项所述的方法，其中：
第一受体结合剂和第二受体结合剂可逆结合所述反应剂；以及
如下之一：
i)第一受体结合剂和第二受体结合剂各自独立地包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
ii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1和结合伴侣C2以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
iii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1以及两个或多个结合位点Z2，其中Z1各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键，Z2各自能够结合于结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键。
51.一种用于培养目标细胞的方法，包括：在受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合反应剂，所述反应剂为包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白；ii)能够以诱导或调节所述组合物中目标细胞中信号的方式特异性结合目标细胞表面上的分子，其中，所述链霉亲和素突变蛋白包含净负电荷或其等电点小于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示链霉亲和素突变蛋白等电点，由此产生培养的目标细胞。
52.一种用于培养目标细胞的方法，包括：在受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合反应剂，所述反应剂为包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白；ii)能够以诱导或调节所述组合物中目标细胞中信号的方式特异性结合目标细胞表面上的分子，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白对包含氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)的链霉亲和素结合肽的亲和力高于包含SEQ ID NO:1-6中任一项所示氨基酸序列的链霉亲和素或突变蛋白，从而产生培养的目标细胞。
53.如实施方式51或实施方式52所述的方法，其中，所示孵育在一定条件下进行，在该条件下所述受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节组合物中一个或多个目标细胞中的信号。
54.如实施方式51-53中任一项所述的方法，其中：
所述多个结合位点包含两个或更多个结合位点Z1；和
所述结合受体作用剂包含结合伴侣C1，其能够可逆结合结合位点Z1，其中C1和Z1之间的可逆结合引起所述受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合。
55.如实施方式54中所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含多个结合位点Z1，其中多个受体结合剂可逆结合所述反应剂。
56.如实施方式51-56中任一项所述的方法，其中：
所述目标细胞包括血细胞；
所述目标细胞包括白细胞；
所述目标细胞包括淋巴细胞；
所述目标细胞包括B细胞；
所述目标细胞包括B细胞群；
所述目标细胞包括T细胞；
所述目标细胞包括T细胞群；和/或
所述目标细胞包括天然杀伤(NK)细胞。
57.如实施方式51-56中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞包括：抗原特异性T细胞或其细胞群、辅助T细胞或其细胞群，细胞毒性T细胞或其细胞群、记忆T细胞或其细胞群、调节性T细胞或其细胞群、NK细胞或其细胞群、抗原特异性B细胞或其细胞群、记忆B细胞或其细胞群、或调节性B细胞或其细胞群。
58.如实施方式51-57中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞是T细胞。
59.如实施方式51-58中任一项所述的方法，其中，所述分子递呈在T细胞表面上，且所述受体结合剂能够诱导或调节所述组合物中T细胞中的信号。
60.如实施方式51-59中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
所述受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
所述受体结合剂特异性结合CD3。
61.如实施方式51-60中任一项所述的方法，其中，所述分子是第一分子，且所述受体结合剂能够特异性结合一个或多个目标细胞表面上的第一分子和第二分子，其中与第二分子的结合可选能够增强、抑制或改变通过所述第一分子递送的信号。
62.如实施方式51-61中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是第一受体结合剂，所述孵育进一步在第二受体结合剂的存在下进行，所述第二受体结合剂能够特异性结合一个或多个所述目标细胞表面上的第二分子，与第二分子的结合可选地能够诱导或调节信号，所述信号增强、抑制或改变所述第一分子递送的信号
63.如实施方式62所述的方法，其中，孵育在如下条件下进行：在该条件下，第二受体结合剂特异性结合第二分子，由此诱导或调节组合物中目标细胞中的信号，从而增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
64.如实施方式62或实施例63所述的方法，其中，链霉亲和素突变蛋白或类似物包括能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点，由此所述第二受体结合剂可逆结合所述链霉亲和素突变蛋白或类似物。
65.如实施方式64所述的方法，其中，第二受体结合剂包括结合伴侣C1或C2，其能够可逆结合链霉亲和素类似物或突变蛋白中存在的所述两个或更多个结合位点Z2。
66.如实施方式61-65中任一项所述的方法，其中：
额外分子选自：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或
第二受体结合剂特异性结合CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。
67.如实施方式61-66中任一项所述的方法，其中：
所述额外分子选自CD40和CD137；和/或
第二受体结合剂特异性结合CD40或CD137。
68.如实施方式11-67中任一项所述的方法，其中，第二受体结合剂包括多种不同的受体结合剂，其各自能够独立地结合组合物中T细胞表面上相同或不同的第二分子，从而共同诱导或调节细胞中的一个或多个信号。
69.如实施方式37-68中任一项所述的方法，还包括破坏第一和/或第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合。
70.如实施方式69所述的方法，其中，所述破坏在开始孵育后14天内发生，在开始孵育后12天内发生，在开始孵育后10天内发生，在开始孵育后8天内发生，或在开始孵育后6天内发生。
71.如实施方式37-70中任一项所述的方法，其中，至少一部分孵育在能够将信号递送到T细胞的其他作用剂的存在下进行。
72.如实施方式71所述的方法，其中，所述其他作用剂能够增强或诱导T细胞、CD4+细胞和/或CD8+细胞的增殖。
73.如实施方式71或实施方式72所述的方法，其中，所述其他作用剂是选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。
74.如实施方式71-73中任一项所述的方法，其中，所述其他作用剂不特异性结合CD28和/或诱导CD28信号转导。
75.如实施方式1-74中任一项所述的方法，其中，所述T细胞或目标细胞是获自对象的原代细胞。
76.如实施方式1-75中任一项所述的方法，其中，所述T细胞或目标细胞是直接分离自对象。
77.如实施方式1-50和57-76中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是未分级的T细胞，富含CD3+T细胞或为分离的CD3+T细胞，富含CD4+T细胞或为分离的CD4+T细胞，或富含CD8+T细胞或为分离的CD8+T细胞。
78.如实施方式1-50和57-77中任一项所述的方法，其中，在孵育前，所述T细胞不富含CD62L+细胞和/或不富含初始T细胞。
79.如实施方式1-78中任一项所述的方法，其中，所述T细胞或目标细胞是人细胞。
80.如实施方式1-80中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm；或
所述反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
81.如实施方式1-80中任一项所述的方法，其中，在所述孵育过程中，所述反应剂不结合于支持物或固体支持物。
82.如实施方式1-80中任一项所述的方法，其中，在孵育的至少部分过程中，所述反应剂结合于支持物，由此在孵育的至少部分过程中多个T细胞或目标细胞可逆固定在支持物上。
83.如实施方式82所述的方法，其中，所述支持物是固体支持物或固定相。
84.如实施方式1-83中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，仅包含所述结合位点B2中的一个；和/或
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，以单价方式特异性结合于所述分子。
85.如实施方式1-84中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂仅包含所述结合位点B4中的一个；和/或
第二受体结合剂以单价方式特异性结合于所述分子。
86.如实施方式84或实施方式85所述的方法，其中，结合位点B2和/或B4包括抗原结合位点。
87.如实施方式1-86中任一项所述的方法，其中，受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂各自独立地选自：抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子、包含Ig结构域的分子、细胞因子、趋化因子、适体、和MHC分子、及其结合片段。
88.如实施方式1-87中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂包含抗体片段；
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂包含Fab片段；
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂是选自F(ab’)2片段和二价单链Fv(scFV)片段的二价抗体片段；
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂是选自Fab片段，Fv片段或scFV片段的单价抗体片段；和/或
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂为选自下组的具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子：适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体(glubody)、基于锚定蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、附着连接蛋白(adnectin)和阿维多聚体(avimer)。
89.如实施方式1-88中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂，其可为第一受体结合剂，包括特异性结合于CD30的作用剂，其可选地选自下组：抗CD30抗体、抗CD30抗体的二价抗体片段、抗CD30抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质类CD30结合分子；和/或
第二受体结合剂包括特异性结合于CD28、CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40和/或HVEM的作用剂，所述作用剂可选地选自下组：抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD28结合分子、抗CD90抗体、抗CD90抗体的二价抗体片段、抗CD90抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD90结合分子、抗CD95抗体、抗CD95抗体的二价抗体片段、抗CD95抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD95结合分子、抗CD154抗体、抗CD154抗体的二价抗体片段、抗CD154抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD154结合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD137结合分子、抗ICOS抗体、抗ICOS抗体的二价抗体片段、抗ICOS抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类ICOS结合分子、抗LAT抗体、抗LAT抗体的二价抗体片段、抗LAT抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类LAT结合分子、抗CD27抗体、抗CD27抗体的二价抗体片段、抗CD27抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD27结合分子、抗OX40抗体、抗OX40抗体的二价抗体片段、抗OX40抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类OX40结合分子、抗HVEM抗体、抗HVEM抗体的二价抗体片段、抗HVEM抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类HVEM结合分子、4-1BB配体、或其任何混合物。
90.如实施方式1-50和58-89中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是或含：可逆结合生物素、生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合链霉亲和素结合肽的亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的反应剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。
91.如实施方式1-94中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂为或包含：可逆结合生物素或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白；
所述反应剂为或包含：可逆结合生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白；和/或
所述反应剂为或包含：可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白。
92.如实施方式1-91中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是或含如下物质的寡聚体或多聚体：可逆结合生物素或其生物活性片段的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素或亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的反应剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。
93.如实施方式1-92中任一项所述的方法，其中，所述反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、亲和素或和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚物或聚合物。
94.如实施方式92或实施方式93所述的方法，其中，寡聚体或多聚体中的个体分子通过多糖或双官能接头交联。
95.如实施方式1-94中任一项所述的方法，其中，多个结合位点包括至少2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、72或更多个结合位点。
96.如实施方式90-95中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素结合肽选自下组：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
97.如实施方式1-96中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂包含链霉亲和素类似物或突变蛋白，其在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素中的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47；或
所述链霉亲和素类似物或突变蛋白在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素中的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47。
98.如实施方式1-51和68-97中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)SEQ ID NO:3-6、27和28中任一项所示的氨基酸序列；
b)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一序列显示至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列相同性、且包含对应于Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47的氨基酸序列、且可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽；或
c)a)或b)的功能性片段，其可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。
99.如实施方式97或实施方式98所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白还包含一处或多处氨基酸置换，所述置换的位置对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中链霉亲和素内第117、120和/或121位。
100.如实施方式99所述的方法，其中：
所述一处或多处氨基酸置换选自：Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
所述一处或多处氨基酸置换为选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一种或多种；或
所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
101.如实施方式51-100中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
SEQ ID NO:27或28所示的氨基酸序列；
b)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:28显示至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列相同性、且包含对应于Va144、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121的氨基酸序列、且可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽；或
c)a)或b)的功能性片段，其可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。
102.如实施方式1-101中任一项所述的方法，其中，所述结合伴侣C1和/或结合伴侣C2独立地包含选自下组的链霉亲和素结合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
103.如实施方式1-36和69-102中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括：将组合物加入细胞，该组合物含有能逆转受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂与反应剂之间的键的物质。
104.如实施方式103所述的方法，其中，所述物质是游离结合伴侣和/或为竞争剂。
105.如实施方式103或实施方式104所述的方法，其中，所述物质在组合物中对T细胞或对目标细胞无害，和/或与在可比或相同条件下不含该物质分别孵育T细胞或目标细胞相比，加入该物质不会令存活T细胞或目标细胞百分比降至低于90％、80％、70％、60％或50％。
106.如实施方式1-36和69-105中任一项所述的方法，其中，该破坏终止或减少T细胞或目标细胞中由受体结合剂或第二受体结合剂中一者或两者诱导或调节的信号。
107.如实施方式10-18、22-32和69-107中任一项所述的方法，其中，
所述反应剂为或包含：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或亲和素类似物或突变蛋白、或其生物活性片段；和
所述物质包含链霉亲和素结合肽、生物素或其生物活性片段、可选地D-生物素、或生物素类似物或生物活性片段。
108.如实施方式107所述的方法，其中：
所述物质是选自下组的链霉亲和素结合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)；和/或
所述物质为C1或其类似物，或者为C2或其类似物。
109.如实施方式1-108中任一项所述的方法，其中：
所述结合位点Z1和所述结合伴侣C1之间可逆结合的解离常数(KD)和/或所述结合位点Z2和所述结合伴侣C2之间可逆结合的解离常数(KD)为10-2M～10-13M。
110.如实施方式1-109中任一项所述的方法，其中：
在孵育前，使细胞与特异性结合组合物中T细胞或目标细胞所含标志物的选择剂接触，从而产生或获得含有T细胞或目标细胞的组合物；或
至少部分孵育进一步在选择剂的存在下进行，所述选择剂特异性结合组合物中T细胞或目标细胞所含的标志物，其中培养的T细胞富集了含有该标志物的T细胞或目标细胞。
111.如实施方式110所述的方法，其中：
所述选择剂可逆结合反应剂，且所述反应剂还包含能够特异性结合该选择剂的多个结合位点；或
选择剂可逆结合第二反应剂，该第二反应剂包含能够特异性结合该选择剂的多个结合位点。
112.如实施方式1-110中任一项所述的方法，其中，与没有信号的诱导或调节下的T细胞孵育相比，所述信号的诱导或调节使得培养T细胞的扩增(繁殖)和/或活化增加。
113.如实施方式112所述的方法，其中，所述增加为至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
114.如实施方式7-113中任一项所述的方法，其中，与没有额外或第二信号的诱导或调节下的T细胞孵育相比，所述额外或第二信号的诱导或调节使得培养T细胞的扩增(繁殖)和/或活化增加。
115.如实施方式114所述的方法，其中，所述增加为至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
116.如实施方式1-115中任一项所述的方法，其中，所述方法增加组合物中T细胞的扩增和/或增殖，改变组合物中T细胞的代谢谱，改变组合物中CD8+T细胞的亚组；和/或，增加组合物中长寿记忆T细胞百分数，以上各自与孵育前组合物中的T细胞相比，与孵育后但未进行破坏或孵育后但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂的存在下相比。
117.如实施方式1-116中任一项所述的方法，其中，所述方法获得培养的T细胞，其中：
分别与孵育前、孵育后但未进行破坏、或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下进行孵育后的组合物中的CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+细胞的数量或百分比相比，CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+细胞的数量或百分比提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
与孵育前、孵育后但未进行破坏、或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下进行孵育后的组合物中的CD8+细胞比例或相对比例或标准化比例相比，CD8+T细胞的比例或相对比例或标准化比例提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
与孵育前、孵育后但未进行破坏、或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下进行孵育后的组合物中的相应细胞群体(CD62L+、长寿记忆T细胞或记忆干细胞(Tscm))的数量或百分比相比，CD62L+、可选的长寿记忆T细胞或记忆干细胞Tscm的数量或百分比提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
118.如实施方式1-117中任一项所述的方法，其中，培养的T细胞包含多于35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％含CD62L表面阳性表型(CD62L+)的T细胞亚组，以占组合物中总T细胞或占组合物中总细胞的百分比计。
119.如实施方式118所述的方法，其中，所述T细胞亚组还包含如下表型：
a)CD127+；和/或
b)CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的任何一种或多种，以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的任何一种或多种。
120.如实施方式118或实施方式119所述的方法，其中，所述T细胞亚组：
a)包含低水平的TCR重排删除环(TREC)；和/或
b)表达增殖标志物，其可选地为Ki-67；和/或
c)在刺激剂的存在下显示增殖能力；和/或
d)在刺激剂的存在下显示产生选自IFN-γ、TNF和IL-2的细胞因子的能力。
121.如实施方式120所述的方法，其中，所述刺激剂是抗原、稳态细胞因子，可选地IL-15和/或IL-17，或者是能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关信号的作用剂。
122.如实施方式118-121中任一项所述的方法，其中，所述T细胞亚组为或含长寿记忆T细胞。
123.如实施方式118-122中任一项所述的方法，其中，所述T细胞亚组为或含记忆T干细胞(TSCM)。
124.如实施方式1-123中任一项所述的方法，还包括将重组核酸分子导入T细胞或目标细胞群，其中该核酸分子编码重组蛋白，由此细胞表达该重组蛋白。
125.如实施方式124所述的方法，其中，重组受体是嵌合抗原受体或转基因T细胞受体(TCR)。
126.如实施方式1-125中任一项所述的方法，其中，所述方法在体外或离体进行。
127.如实施方式1-126中任一项所述的方法，还包括将所述培养的细胞给予患有疾病或病症的对象。
128.一种组合物，其包含通过实施方式1-127中任一项所述的方法生产的多个培养的T细胞或目标细胞，以及可选的药学上可接受的赋形剂。
129.如实施方式128所述的方法，其中，加入所述物质后，细胞未在体外或离体于高于30℃的温度下孵育超过24小时、超过48小时、超过72小时或超过96小时。
130.一种制品，其包含：
a)反应剂，其包含能够结合受体结合剂的多个结合位点；
b)受体结合剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能够以诱导或调节T细胞中信号的形式特异性结合T细胞表面上的分子，其中，所述分子不是CD28或CD3。
131.如实施方式130中所述的制品，其中：
结合所述分子诱导或调节T细胞中除TCR/CD3复合物相关信号以外的信号；和/或
结合所述分子增强或强化TCR/CD3复合物相关信号。
132.如实施方式130或实施方式131所述的方法，其中，所述分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。
133.如实施方式130-132中任一项所述的制品，其中，所述分子不是CD137。
134.一种制品，其包含：
a)反应剂，其为包含能够结合作用剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含净负电荷、或显示的等电点小于包含SEQID NO:4或6所示氨基酸序列的链霉亲和素突变蛋白、和/或显示比包含SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列的链霉亲和素突变蛋白对包含氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)的链霉亲和素结合肽的更高的亲和力；和
b)作用剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能特异性结合细胞表面上的分子。
135.如实施方式130-134中任一项所述的制品，其中：
所述受体结合剂或作用剂包含结合伴侣C1；且
所述多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂或作用剂与所述反应剂之间的可逆键。
136.如实施方式130-133中任一项所述的制品，其中，所述受体结合剂是第二受体结合剂，且所述分子是第二分子，所述反应剂还包含：c)能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点，和d)第一受体结合剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能够特异性结合T细胞表面上的第一分子。
137.如实施方式134或实施方式136所述的制品，其中，所述作用剂或第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员和/或第一受体结合剂特异性结合CD3。
138.如实施方式136或实施方式137所述的制品，其中：
i)第一受体结合剂和第二受体结合剂各自独立地包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
ii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1和结合伴侣C2以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
iii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1以及两个或多个结合位点Z2，其中Z1各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键，Z2各自能够结合于结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键。
139.如实施方式130-139中任一项所述的制品，其中：
所述反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm；或
所述反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
140.如实施方式130-139中任一项所述的制品，其中，所述反应剂不结合于支持物或固体支持物。
141.如实施方式130-140中任一项所述的制品，其中，所述反应剂结合于或固定于支持物。
142.如实施方式141所述的制品，其中，所述支持物是固体支持物或固定相。
143.如实施方式141或实施方式142所述的制品，其中，所述支持物包括珠、颗粒、纳米颗粒或微球。
144.如实施方式130-143中任一项所述的制品，其中，所述作用剂，受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂各自独立地选自：抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子、包含Ig结构域的分子、及其结合片段。
145.如实施方式130-144中任一项所述的制品，其中：
所述作用剂，受体结合剂，其可为第二受体结合剂，和/或第一受体结合剂包含抗体片段；
所述作用剂，受体结合剂，其可为第二受体结合剂，和/或第一受体结合剂包含Fab片段；
所述作用剂，受体结合剂，其可为第二受体结合剂，和/或第一受体结合剂是选自F(ab’)2片段和二价单链Fv(scFV)片段的二价抗体片段；或
所述作用剂，受体结合剂，其可为第二受体结合剂，和/或第一受体结合剂是单价抗体片段，其选自Fab片段、Fv片段或scFV片段。
146.如实施方式130-145中任一项所述的制品，其中：
所述作用剂或第一受体结合剂包括特异性结合于CD30的作用剂，其可选地选自下组：抗CD30抗体、抗CD30抗体的二价抗体片段、抗CD30抗体的单价抗体片段、以及具有抗体样结合特性的蛋白质类CD30结合分子；和/或
所述作用剂或受体结合剂，其可为第二受体结合剂，包括特异性结合于CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM的作用剂，其可选地选自下组：抗CD90抗体、抗CD90抗体的二价抗体片段、抗CD90抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD90结合分子、抗CD95抗体、抗CD95抗体的二价抗体片段、抗CD95抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD95结合分子、抗CD154抗体、抗CD154抗体的二价抗体片段、抗CD154抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD154结合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD137结合分子、抗ICOS抗体、抗ICOS抗体的二价抗体片段、抗ICOS抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类ICOS结合分子、抗LAT抗体、抗LAT抗体的二价抗体片段、抗LAT抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类LAT结合分子、抗CD27抗体、抗CD27抗体的二价抗体片段、抗CD27抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类CD27结合分子、抗OX40抗体、抗OX40抗体的二价抗体片段、抗OX40抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类OX40结合分子、抗HVEM抗体、抗HVEM抗体的二价抗体片段、抗HVEM抗体的抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类HVEM结合分子、和其任何混合物。
147.如实施方式130-147中任一项所述的制品，其中：
所述反应剂为或包含：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、和/或亲和素类似物或突变蛋白；或
所述反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或/和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚体或多聚体。
148.一种试剂盒，其包含如实施方式130-147中任一项所述的制品和可选的使用说明。
149.如实施方式148所述的试剂盒，其还包含能够逆转所述受体结合剂和所述反应剂之间键的物质。
150.一种试剂盒，其包含：
a)可逆反应剂，其包括i)包含能够可逆结合受体结合剂的多个结合位点的反应剂；和ii)可逆结合所述反应剂且能特异性结合目标细胞表面上表达的分子的受体结合剂，以及可选地其中结合所述分子诱导或调节所述目标细胞中的信号；和
b)能够逆转所述受体结合剂和所述反应剂之间的键的物质。
151.如实施方式150中所述的试剂盒，其中，所述目标细胞是T细胞。
151.如实施方式150或实施方式151所述的试剂盒，其中：
所述反应剂为或包含链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白或和亲和素类似物或突变蛋白；或
所述反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或/和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚体或多聚体。
152.如实施方式149-151中任一项所述的试剂盒，其中，所述物质包含链霉亲和素结合肽、生物素或其生物活性片段、可选地D-生物素、或生物素类似物或生物活性片段。
153.如实施方式150-152中任一项所述的试剂盒，其中：
所述反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm；或
所述反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
154.如实施方式150-153中任一项所述的试剂盒，其中，所述反应剂不结合于支持物或固体支持物。
155.一种组合物，其包含多个T细胞，所述T细胞经基因工程化改造以表达特异性结合目标抗原的重组受体，其中：
以占组合物中总T细胞或占组合物中总细胞的百分比计，大于35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞包含具有如下表型的T细胞亚组：CD3+、CD4+或CD8+和CD62L+，以及CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的一种或多种，以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的一种或多种；以及以下一者或两者：
a)在基因工程化改造前或过程中，包含T细胞亚组的所述多个T细胞：
i)未在GSK-P抑制剂的存在下孵育；
ii)未在重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15的存在下孵育；
iii)未富集CD62L+细胞；或
b)所述组合物不含GSK-P抑制剂或重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15。
156.如实施方式155所述的组合物，其中，所述T细胞亚组包含至少5×106、至少1×106或至少2×106个细胞。
157.一种组合物，其包含多个T细胞，所述T细胞经基因工程化改造以表达特异性结合目标抗原的重组受体，其中：
所述基因工程化改造的T细胞衍生自对包含具有如下表面表型的T细胞亚组的T细胞群的转导：CD3+、CD4+或CD8+和CD62L+以及CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的一种或多种以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的一种或多种，其中，与如下的任何一者相比，所述T细胞亚组在细胞群中总T细胞中所占百分比更大或在细胞群中的总T细胞数更大：
a)包含分离或富集自人对象的原代T细胞的群，所述分离或富集基于包含所述表型的一种或多种标志物的表面表达；
b)在GSK-P抑制剂存在下孵育的T细胞群；
c)在重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15的存在下孵育的T细胞群；或
d)用抗CD3和抗CD8刺激的T细胞群，但其中所述刺激大于1天、2天、3天、4天或5天和/或所述刺激不在生物素或生物素类似物的存在下被破坏。
158.如实施方式156所述的组合物，其中：
所述T细胞亚组以占细胞群中总T细胞等于或约大于35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的百分比存在；或
所述T细胞亚组包含至少5×106个细胞、1×106个细胞、2×106个细胞或更多个细胞。
159.如实施方式155-158中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
160.一种治疗方法，其包括给予患有疾病或病症的对象实施方式128、实施方式129或实施方式154-158中任一项所述的组合物。
161.如实施方式160所述的治疗方法，其中，所述细胞包含重组受体、嵌合抗原受体或TCR，且所述重组受体、嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合与所述疾病或病症相关的抗原。
162.如实施方式160或实施方式161所述的治疗方法，其中，所述疾病或病症是癌症，和自身免疫性疾病或紊乱，或感染性疾病。
163.一种培养目标细胞的方法，包括：在受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的反应剂，且ii)能够以诱导或调节目标细胞中信号和/或改变目标细胞功能的方式特异性结合所述目标细胞表面上除CD28、CD3、CD137或CD40以外的分子，从而产生培养的目标细胞。
164.如实施方式163所述的方法，其中，所述受体结合剂特异性结合细胞因子受体、特异性结合趋化因子受体，为粘附分子或包含粘附分子，或为诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
165.如实施方式163或实施方式164所述的方法，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。
166.如实施方式163-165中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2、IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、TNF、IL-7、IL-21和IL-9，或为其生物活性片段。
167.如实施方式163-165中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
168.如实施方式163或实施方式164所述的方法，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。
169.如实施方式163或实施方式164或实施方式168所述的方法，其中：
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的趋化因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
170.如实施方式163、实施方式164、实施方式168或实施方式169所述的方法，其中：
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
171.如实施方式163或实施方式164所述的方法，其中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。
172.如实施方式171所述的方法，其中，所述粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
173.如实施方式163或实施方式164所述的方法，其中，所述因子是核因子。
174.如实施方式163、实施方式164或实施方式173所述的方法，其中，所述因子是维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
175.如实施方式163-174中任一项所述的方法，其中：
所述目标细胞包括血细胞；
所述目标细胞包括白细胞；
所述目标细胞包括淋巴细胞；
所述目标细胞包括B细胞；
所述目标细胞包括B细胞群；
所述目标细胞包括T细胞；
所述目标细胞包括T细胞群；和/或
所述目标细胞包括天然杀伤(NK)细胞。
176.如实施方式163-175中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞包括免疫细胞。
177.如实施方式163-176中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞包括：抗原特异性T细胞或其细胞群、辅助T细胞或其细胞群，细胞毒性T细胞或其细胞群、记忆T细胞或其细胞群、调节性T细胞或其细胞群、NK细胞或其细胞群、抗原特异性B细胞或其细胞群、记忆B细胞或其细胞群、或调节性B细胞或其细胞群。
178.如实施方式163-177中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞是T细胞。
179.如实施方式163-178中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞是获自对象的原代细胞。
180.如实施方式163-178中任一项所述的方法，其中，孵育在如下条件下进行：在所述条件下，受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节目标细胞中的信号和/或改变目标细胞中的功能。
181.如实施方式163-180中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成所述受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
182.如实施方式163-181中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是额外受体结合剂，所述分子是额外分子，所述孵育在第一受体结合剂的存在下进一步进行，所述第一受体结合剂能够特异性结合一个或多个T细胞表面上的第一分子，该第一分子可选地能够诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的第一信号。
183.如实施方式182所述的方法，其中：
所述第一受体结合剂可逆结合所述反应剂，所述反应剂包含针对第一受体结合剂和第二受体结合剂的多个结合位点；或
第一受体结合剂可逆结合第二反应剂，所述第二反应剂包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点。
184.如实施方式182或实施方式183所述的方法，其中：
第一受体结合剂能够在所述T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
第一受体结合剂特异性结合CD3。
185.如实施方式182-184中任一项所述的方法，其中，第一受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C2以形成所述受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
186.如实施方式182-185中任一项所述的方法，其中，在第二受体结合剂的存在下进行进一步孵育，所述第二受体结合剂能够可逆结合一个或多个T细胞表面上的第二分子，所述第二分子可选地能够诱导或调节组合物中目标细胞中的信号，从而增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
187.如实施方式186所述的方法，其中：
所述第二信号是除了TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号；
所述第二信号能够增强或加强TCR/CD3复合物相关信号；或
所述第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子、或是TNF家族或TNF受体家族成员。
188.如实施方式186或实施方式187中所述的方法，其中，所述第二分子选自CD28和CD137。
189.如实施方式186-188中任一项所述的方法，其中，所述第二分子是CD28。
190.如实施方式186-188中任一项所述的方法，其中，第二受体结合剂包含结合伴侣C3，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z3，它们各自能够结合于结合伴侣C3以形成第一受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
191.如实施方式163-190中任一项所述的方法，其中：
C1和C2、C1和C3、C2和C3、或者C1、C2和C3相同或基本相同，或包含相同或基本相同的部分；
Z1和Z2、Z1和Z3、Z2和Z3、或者Z1、Z2和Z3相同或基本相同，或包含相同或基本相同的部分。
192.如实施方式163-191中任一项所述的方法，其中，在至少部分孵育中，所述反应剂被固定化于或能够被固定化于支持物，由此所述受体结合剂(额外、第一和/或第二)被固定化或能够被固定化于所述支持物。
193.如实施方式192所述的方法，其中：
所述支持物为或包含固定相；和/或
所述支持物为或包含固体支持物。
194.如实施方式163-191中任一项所述的方法，其中：
在孵育过程中，所述反应剂不是且不结合于或接合于固体支持物、固定相、珠、微粒、磁性颗粒和/或基质；和/或
所述反应剂是柔性的，不含金属或磁性核心，完全或主要由有机多聚体组成，不为球形，基本上不为球形或形状不均一，和/或不坚硬；
所述反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm；或
所述反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
195.如实施方式163-194中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，包含结合位点B1；和/或
所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，仅包含所述结合位点B1中的一个；和/或
所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，以单价方式特异性结合于所述分子。
196.如实施方式163-195中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂包含结合位点B2；和/或
第一受体结合剂仅包含所述结合位点B2中的一个；和/或
第一受体结合剂以单价方式特异性结合于所述分子。
197.如实施方式163-196中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂包含结合位点B4；和/或
第二受体结合剂仅包含所述结合位点B4中的一个；和/或
第二受体结合剂以单价方式特异性结合于所述分子。
198.如实施方式195-197中任一项所述的方法，其中，所述结合位点B2和/或B4包括抗原结合位点。
199.如实施方式195-197中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂选自：细胞因子、趋化因子或粘附分分子。
200.如实施方式163-199中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂(额外、第一和/或第二)各自独立地选自：抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子、包含Ig结构域的分子、适体、和MHC分子、及其结合片段。
201.如实施方式163-200中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂(额外、第一和/或额外)包含抗体片段。
所述受体结合剂(额外、第一和/或额外)包含抗体片段；
所述受体结合剂(额外、第一和/或额外)为选自F(ab')2片段和二价单链Fv(scFV)片段的二价抗体片段；
所述受体结合剂(额外、第一和/或额外)为选自Fab片段、Fv片段或scFV片段的单价抗体片段；和/或
所述受体结合剂(额外、第一和/或第二)为选自下组的具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子：适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚定蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、附着连接蛋白和阿维多聚体。
202.如实施方式163-201中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是或含：可逆结合生物素、生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合链霉亲和素结合肽的亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的反应剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。
203.如实施方式163-202中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂为或包含：可逆结合生物素或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白。
所述反应剂为或包含：可逆结合生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白；和/或
所述反应剂为或包含：可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白。
204.如实施方式163-203中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是或含如下物质的寡聚体或多聚体：可逆结合生物素或其生物活性片段的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素或亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的反应剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。
205.如实施方式163-204中任一项所述的方法，其中，所述反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚体或多聚体。
206.如实施方式204或实施方式205所述的方法，其中，寡聚体或多聚体中的个体分子通过多糖或双官能接头交联。
207.如实施方式163-206中任一项所述的方法，其中，多个结合位点包括至少2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、72或更多个结合位点。
208.如实施方式202-207中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素结合肽选自下组：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
209.如实施方式163-208中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂包含链霉亲和素类似物或突变蛋白，其在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素中的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47；或
所述链霉亲和素类似物或突变蛋白在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素中的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47。
210.如实施方式163-209中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)SEQ ID NO:3-6、27和28中任一项所示的氨基酸序列；
b)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3-6、27或28中任一序列显示至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列相同性、且包含对应于Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47的氨基酸序列、且可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽；或
c)a)或b)的功能性片段，其可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。
211.如实施方式209或实施方式210所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白还包含一处或多处氨基酸置换，所述置换的位置对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中链霉亲和素内第117、120和/或121位。
212.如实施方式211所述的方法，其中：
所述一处或多处氨基酸置换选自：Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
所述一处或多处氨基酸置换为选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一种或多种；或
所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
213.如实施方式163-212中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
SEQ ID NO:27或28所示的氨基酸序列；
b)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:28显示至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列相同性、且包含对应于Va144、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121的氨基酸序列、且可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽；或
c)a)或b)的功能性片段，其可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。
214.如实施方式163-213中任一项所述的方法，其中，所述结合伴侣C1和/或结合伴侣C2独立地包含选自下组的链霉亲和素结合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
215.如实施方式163-214中任一项所述的方法，还包括破坏第一和/或第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合。
216.如实施方式215所述的方法，其中，所述破坏包括：将组合物加入细胞，该组合物含有能逆转受体结合剂，其可为第一受体结合剂，和/或第二受体结合剂与反应剂之间的键的物质。
217.如实施方式216所述的方法，其中，所述物质是游离结合伴侣和/或为竞争剂。
218.如实施方式216或实施方式217所述的方法，其中，所述物质在组合物中对T细胞或对目标细胞无害，和/或与在可比或相同条件下不含该物质分别孵育T细胞或目标细胞相比，加入该物质不会令存活T细胞或目标细胞百分比降至低于90％、80％、70％、60％或50％。
219.如实施方式215-218中任一项所述的方法，其中，该破坏终止或减少T细胞或目标细胞中由受体结合剂或第二受体结合剂中一者或两者诱导或调节的信号。
220.如实施方式215-219中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂为或包含：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或亲和素类似物或突变蛋白、或其生物活性片段；和
所述物质包含链霉亲和素结合肽、生物素或其生物活性片段、可选地D-生物素、或生物素类似物或生物活性片段。
221.如实施方式220所述的方法，其中：
所述物质是选自下组的链霉亲和素结合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)；和/或
所述物质是C1、C2或C3或其类似物。
222.如实施方式163-221中任一项所述的方法，其中：
与缺乏对所述信号的诱导或调节的组合物中目标细胞，可选T细胞相比，诱导或调节所述信号使得选自下组的活性改变：趋药性、粘附、细胞因子产生、增殖(扩增)、细胞毒活性、代谢活性；和/或
与孵育前组合物中目标细胞，可选T细胞的功能活性相比，改变的功能活性选自：趋药性、粘附、细胞因子产生、增殖(扩增)、细胞毒活性、代谢活性；和/或
与孵育前组合物中目标细胞，可选T细胞的功能活性相比，培养的目标细胞显示选自下组的活性改变：趋药性、粘附、细胞因子产生、增殖(扩增)、细胞毒活性、代谢活性。
223.如实施方式222所述的方法，其中，所述活性改变至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
224.如实施方式163-223中任一项所述的方法，还包括将重组核酸分子导入T细胞或目标细胞群，其中该核酸分子编码重组蛋白，由此细胞表达该重组蛋白。
225.如实施方式224所述的方法，其中，所述重组受体是嵌合抗原受体或转基因T细胞受体(TCR)。
226.如实施方式163-225中任一项所述的方法，其中，所述方法在体外或离体进行。
227.如实施方式163-226中任一项所述的方法，还包括将所述培养的细胞给予患有疾病或病症的对象。
228.一种组合物，其包含通过实施方式163-227中任一项所述的方法生产的多个培养的T细胞或目标细胞，以及可选的药学上可接受的赋形剂。
229.如实施方式228所述的方法，其中，加入所述物质后，细胞未在体外或离体于高于30℃的温度下孵育超过24小时、超过48小时、超过72小时或超过96小时。
230.一种制品，其包含：
a)反应剂，其包含能够结合受体结合剂的多个结合位点；
b)受体结合剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能够以诱导或调节T细胞中信号或改变细胞中功能活性的形式特异性结合目标细胞表面上的分子，其中，所述分子不是CD28、CD3、CD137或CD40。
231.如实施方式230所述的制品，其中，所述受体结合剂特异性结合细胞因子受体、特异性结合趋化因子受体，为粘附分子或包含粘附分子，或为诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
232.如实施方式230或实施方式231所述的制品，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。
233.如实施方式230-232中任一项所述的制品，其中：
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2、IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、TNF、IL-7、IL-21和IL-9，或为其生物活性片段
234.如实施方式230-232中任一项所述的制品，其中：
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
235.如实施方式68或实施方式69所述的制品，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。
236.如实施方式230、实施方式231或实施方式235所述的制品，其中：
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的趋化因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
237.如实施方式68、实施方式69、实施方式235或实施例236所述的制品，其中：
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
238.如实施方式230或实施方式231所述的制品，其中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。
239.如实施方式238所述的制品，其中，所述粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
240.如实施方式230或实施方式231所述的制品，其中，所述因子是核因子。
241.如实施方式230、实施方式231或实施方式240所述的制品，其中，所述因子是维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
242.如实施方式230-241中任一项所述的制品，其中：
所述受体结合剂或作用剂包含结合伴侣C1；且
所述多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂或作用剂与所述反应剂之间的可逆键。
243.如实施方式230-241中任一项所述的制品，其中，所述受体结合剂是额外受体结合剂，且所述分子是额外分子，所述反应剂还包含：c)能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点，和d)第一受体结合剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能够特异性结合T细胞表面上的第一分子。
244.如实施方式243所述的制剂，其中，第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员和/或第一受体结合剂特异性结合CD3。
245.如实施方式243或实施方式244所述的制品，其中，在第二受体结合剂的存在下进行进一步孵育，所述第二受体结合剂能够可逆结合一个或多个T细胞表面上的第二分子，所述第二分子可选地能够诱导或调节组合物中目标细胞中的信号，从而增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
246.如实施方式245中所述的制品，其中：
所述第二信号是除了TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号；
所述第二信号能够增强或加强TCR/CD3复合物相关信号；或
所述第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子、或是TNF家族或TNF受体家族成员。
247.如实施方式245或实施方式246中任一项所述的制品，其中，所述第二分子选自CD28或CD137。
248.如实施方式245-247中任一项所述的制品，其中，第二分子是CD28。
249.如实施方式230-248中任一项所述的制品，其中，在至少部分孵育中，所述反应剂被固定化于或能够被固定化于支持物，由此所述受体结合剂(额外、第一和/或第二)被固定化或能够被固定化于所述支持物。
250.如实施方式249中所述的制品，其中：
所述支持物为或包含固定相；和/或
所述支持物为或包含固体支持物。
251.如实施方式230-248中任一项所述的制品，其中：
在孵育过程中，所述反应剂不是且不结合于或接合于固体支持物、固定相、珠、微粒、磁性颗粒和/或基质；和/或
所述反应剂是柔性的，不含金属或磁性核心，完全或主要由有机多聚体组成，不为球形，基本上不为球形或形状不均一，和/或不坚硬；
所述反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm；或
所述反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
252.如实施方式230-251中任一项所述的制品，其中，所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，第一受体结合剂和/或第二受体结合剂各自独立地选自：抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子、包含Ig结构域的分子、及其结合片段。
253.如实施方式230-252中任一项所述的制品，其中：
所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，第一受体结合剂和/或第二受体结合剂包含抗体片段；
所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，第一受体结合剂和/或第二受体结合剂包含Fab片段；
所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，第一受体结合剂和/或第二受体结合剂是选自F(ab’)2片段和二价单链Fv(scFV)片段的二价抗体片段；或
所述受体结合剂，其可为额外受体结合剂，第一受体结合剂和/或第二受体结合剂是单价抗体片段，其选自Fab片段、Fv片段或scFV片段。
254.如实施方式230-253中任一项所述的制品，其中：
所述反应剂为或包含链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白或和亲和素类似物或突变蛋白；或
所述反应剂包括：链霉亲和素类似物或突变蛋白、或和亲和素类似物或突变蛋白、亲和素、链霉亲和素的寡聚体或多聚体。
255.一种试剂盒，其包含如实施方式230-254中任一项所述的制品和可选的使用说明。
256.如实施方式255所述的试剂盒，其还包含能够逆转所述受体结合剂和所述反应剂之间键的物质。
257.如实施方式256所述的试剂盒，其中，所述物质包含链霉亲和素结合肽、生物素或其生物活性片段、可选地D-生物素、或生物素类似物或生物活性片段。
VIII.实施例
下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1：包含可逆结合于寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂的多聚化抗CD3和抗CD28 Fab片段的可溶刺激性反应剂的产生
刺激剂(抗CD3和抗CD28 Fab片段)通过可逆结合多聚化反应剂而被多聚化，所述多聚化反应剂为寡聚链霉亲和素突变蛋白。反应剂包含针对存在于Fab片段上的肽标签的多个结合位点。寡聚链霉亲和素突变蛋白根据制造商的说明书(Thermo Scientific公司)，通过如下物质的聚合制备：命名为m1(链霉亲和素同四聚体，其包含如SEQ IDNO:6所示的氨基酸突变序列，参见例如，美国专利号6,103,493和Voss和Skerra(1997)Protein Eng.,1:975-982)与磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，产品编号#22122Thermo Scientific公司)和亚氨氢氯化硫醇(iminothiolan，产品编号#26101Thermo Scientific公司)。寡聚链霉亲和素突变蛋白分子由单体(未反应)和二聚链霉亲和素突变蛋白通过尺寸排阻色谱制备。
抗CD3和抗CD28 Fab片段通过融合于各Fab片段的链霉亲和素肽结合伴侣，可逆结合于该寡聚链霉亲和素突变蛋白。抗CD3 Fab片段衍生自由淋巴瘤细胞系OKT3(CRL-8001TM；也可参见美国专利No.4,361,549)生产的CD3结合单克隆抗体，且包含Arakawa等，J.Biochem.120,657-662(1996)中所描述的抗CD3抗体OKT3的重链可变区和轻链可变区。这些序列分别如SEQ ID NO:31和32所示。抗CD28 Fab片段衍生自抗体CD28.3(作为合成单链Fv构建体保藏，GenBank登录号No.AF451974.1；还可参见Vanhove等，BLOOD,2003年7月15日，第102卷，第2期，第564-570页)，且分别包含如SEQ ID NO:33和34所示的抗CD28抗体CD28.3的重链和轻链可变区。Fab片段各自在其重链的羧基末端融合于链霉亲和素肽结合序列，所述序列包含依序排列的两个链霉亲和素结合模块，所述模块具有氨基酸序列SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:16)。重组产生带有肽标签的Fab片段(参见国际专利申请公开号WO 2013/011011和WO 2013/124474)。
为了实现可逆结合，将带有肽标签的抗CD3和抗CD28 Fab片段与多聚化反应剂在约室温下混合，从而使它们通过Fab片段上的twin-strep标签相互作用与所述反应剂可逆结合，所述标签是能够可逆结合反应剂上结合位点的结合伴侣。具体地，在该研究中，在室温下，将约0.5μg抗CD3肽标签化Fab片段和约0.5μg抗CD28肽标签化Fab片段加到约3μg可溶寡聚在一些情况下，预混合该肽标签化Fab片段，然后将其固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架上，在一些情况下，这可使得不同Fab分子的分布更均一化。将所得可溶抗CD3/抗CD28多聚化作用剂用于刺激T细胞。在一些情况中，在刺激细胞前，将所得可溶抗CD3/抗CD28多聚化作用剂储存在冰上。
实施例2：通过用可逆作用剂孵育按时控制T细胞刺激后对T细胞扩增的评估
将T细胞与实施例1中所述的反应剂一起孵育，其中包含多聚化可逆结合剂(抗CD3/抗CD28 Fab片段)。在开始后不同时间点通过加入D-生物素破坏多聚化抗CD3/抗CD28Fab和细胞之间的相互作用。D-生物素与作用剂上的strep标签竞争结合链霉亲和素突变蛋白上的结合伴侣，从而破坏结合。
更详细而言，T细胞基于CD3、CD4或CD8的表面表达从刚获自Ficoll梯度的外周血单核细胞(PBMC)样品中选出。将约500,000个T细胞(CD3+、CD4+或CD8+)接种在48孔板中的1mL完全RPMI培养基(补充有50U/mL IL-2)中。在细胞培养开始当天(第0天)，通常在刺激前至少20分钟，加入如实施例1中所述的反应剂(包含可逆结合的抗CD3/抗CD28 Fab)。在另一细胞样品中加入抗CD3/抗CD28珠(其为抗CD3和抗CD28 mAB包被的磁珠，其中的结合不会被D-生物素的加入破坏，由此提供了对照以确认在采用多聚化作用剂的情况下，加入D-生物素所观察到的任何效果是由于特异性结合和破坏)。将未处理(未刺激)的细胞用作阴性对照。
将细胞在37℃孵育共8天。如图5A所示，可在各种时间点将D-生物素加入已与多聚化抗CD3/抗CD28刺激剂一起孵育的细胞组合物(终浓度为1mM)，以破坏多聚化刺激剂复合物与细胞的可逆结合，从而减少或减弱通过该多聚化抗CD3和抗CD28 Fab递送到细胞的信号转导。具体而言，将D-生物素以1mM的终浓度加到培养孔中(在开始孵育后1小时、1天、2天、3天、4天或5天时，或在收获时(第8天))，而不重悬细胞。然后，在室温下孵育细胞30分钟，随后在37℃继续孵育(适用时)直至第8天。在第3天和第5天更换培养基。重悬各测试孔以收获细胞，各自转移到微量离心管中，并分析细胞计数以评估细胞扩增和/或通过流式细胞术分析CD4或CD8的表面表达。结果见图5B和5C。数据表示三个独立的试验，包括各测试条件和对照的重复。
如图5B所示，将T细胞与多聚化抗CD3/抗CD28作用剂一起孵育，然后通过在各时间点加入D-生物素进行破坏使得T细胞数量增加，这与T细胞扩增和/或维持程度至少与孵育8天而不破坏结合相当以及在一些情况中有所改善是一致的。该结果显示在较早的时间点加入D-生物素将Fab与多聚化反应剂解离(例如通常对于CD8+细胞为1天内，对于CD3+细胞为4天内)使得在开始刺激后第8天收获时，与不破坏信号的刺激相比，CD3+和CD8+细胞总数更高。具体而言，当用可溶抗CD3/抗CD8多聚化反应剂刺激CD8+T细胞1天，然后加入D-生物素破坏相互作用和抑制刺激信号时，收获时的T细胞数比起在抗CD3/抗CD8反应剂存在下扩增T细胞而不破坏结合大了几乎3倍。对于CD4+细胞，收获时的细胞数通常与在抗CD3/抗CD8存在下刺激而不破坏结合所观察到的细胞数相当，尤其是在如下时间点时：用抗CD3/抗CD8多聚化反应剂刺激后第1天和第4天通过破坏多聚化复合物来对抗CD3/抗CD28信号转导复合物进行按时控制的时间点。
为了评估在各种条件下对CD4+和CD8+亚组的相对效果，通过流式细胞术测定了经刺激CD3+细胞群中CD4+或CD8+T细胞的比例。如图5C所示，当破坏在相对较早的时间点进行时(例如在开始刺激后1天内)，与收获时的CD4+细胞相比，以及与其他条件相比，将CD3+细胞培养物与抗CD3/CD28多聚化作用剂一起孵育得到了相对较高的CD8+细胞比例。
实施例3：通过用可逆作用剂孵育按时控制活化CD3+T细胞后对T细胞扩增和表型的评估
评估了采用实施例1和2中所述反应剂、通过D-生物素破坏对T细胞刺激的按时控制的影响。在该研究中，如实施例1和2中所述选择大量CD3+T细胞，用多聚化CD3/CD28作用剂或各自控制反应剂中的一种孵育。如图6A所示，将D-生物素加入某些样品，而不加入其他样品(如实施例2中所描述)，将细胞培养至开始刺激后第8天(在第3天更换培养基)。将未处理(未刺激)的细胞用作阴性对照。在37℃孵育细胞，第3天更换培养基。七天后，重悬各测试孔以收获细胞，各自转移到微量离心管中，并分析细胞计数以评估细胞维持和/或扩增，和/或通过流式细胞术分析各自标志物(例如CD、CD8、CD62L和CD127)的表面表达和/或Ki-67和T-bet的核表达。示例性结果见图6B-6F。数据表示三个独立的试验，包括各测试条件和对照的重复。
如图6B所示，结果显示：与相似条件下用相同反应剂培养而不对信号进行按时控制(即不加入D-生物素)的细胞相比，用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂刺激细胞并在开始后第1天通过破坏进行按时控制后收获的CD3+T细胞数更大。观察到如下结果：与在抗CD3/抗CD28珠或可溶反应剂存在下刺激而不破坏可逆结合的细胞相比，用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂开始孵育后1天通过加入D-生物素破坏进行按时控制的刺激后收获的CD3+T细胞数大了约3倍。此外，加入D-生物素对在用抗CD3/抗CD28珠刺激的培养物情况下收获时的细胞数没有实质性影响，这表明在可溶反应剂中加入D-生物素所观察到的效果是因其特异性结合和破坏该反应剂组分结合的能力所致。
用可溶反应剂培养并在第1天采用D-生物素破坏进行按时控制后，在收获时，与其他测试条件相比，在CD3+扩增群中观察到较高比例的CD8+细胞(图6C)。如图6D所示，基于未刺激对照中CD4+和CD8+T细胞的比例对CD3+T细胞群中CD4+和CD8+亚组进行标准化，结果显示在第1天用D-生物素破坏可溶反应剂结合时，与CD4+T细胞相比，CD8+T细胞的相对扩增(和/或存活)程度大于其他测试条件。结果证明了在混合细胞培养物(例如大量T细胞)中，信号的按时控制(例如通过采用竞争物质破坏多聚化作用剂结合)能用于相对于其他亚群，定制或调整特定亚群的扩增和/或维持(例如CD4+相对CD8+)。
该研究的结果还显示采用该可逆反应剂的CD3/CD28信号按时控制能力还能用于影响组合物中具有不同活性、分化和表型谱的各种细胞群收获时的相对表现(relativerepresentation)。例如，如图6E所示，与其中细胞培养相同时间段但不通过破坏进行按时控制的其他条件相比，用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂刺激CD3+T细胞8天并在第1天加入D-生物素得到最终组合物，其中更高百分比的CD4+细胞和更高百分比的CD8+细胞显示高的CD62L和CD127表面表达。类似地，如图6F所示，与其中信号未被破坏的条件相比，在用多聚化反应剂刺激并在第1天进行破坏后，收获时更高百分比的CD4+和CD8+细胞为标志物Ki-67阳性(比高染色群水平略低)(指示了扩增)，并显示T-bet染色低水平。这些结果与如下结论一致：采用提供反应剂的实施方式按时控制信号的能力可使得较少分化的长寿T细胞群(例如长寿记忆T细胞)增加。无意受限于理论，CD62L和CD127的较高表达通常在较少分化和/或相对长寿的T细胞群上观察到，如原初和长寿记忆群，如中心记忆(TCM)和较少分化记忆T细胞，如所谓的记忆T干细胞(TSCM)。相反，这些标志物通常在效应细胞或终末分化效应记忆T细胞上较低。Ki-67阳性指示细胞增殖，表明了增殖群中的至少一些细胞可代表长寿少分化记忆细胞，与原初T细胞相反。T-bet染色通常在活化时增加，而在少分化细胞中减少，且已报导在长寿中心记忆T细胞中较低，而在TSCM细胞中更低。因此，结果指示在该研究中，通过在第1天破坏多聚化反应剂的信号按时控制使得具有与长寿少分化记忆细胞上存在的类似的表型标志物谱的细胞的维持、扩增和/或出现增加(与不进行破坏的类似刺激相比)。因此，在采用可逆反应剂的按时控制刺激后，收获的细胞中有增长的百分比可显示长寿记忆细胞(包括记忆T干细胞，TSCM)的特征。
实施例4：通过用可逆作用剂孵育按时控制活化CD8+T细胞后对T细胞扩增和表型的评估
为了评估对基本不存在CD4+细胞的CD8+细胞的影响，进行了与实施例3中基本类似的研究，但与刺激大量CD3+细胞相反，在该研究中对培养细胞中CD8+细胞进行富集。示例性结果见图7A-7C。数据表示三个独立的试验，包括各测试条件和对照的重复。
如图7A所示，与CD3+大量培养物情况下相同，与相应条件下不加入D-生物素或不另外破坏信号相比，在第1天破坏信号后，细胞数指示增加的细胞存活和/或扩增。细胞数和相对扩增或维持的增加类似于从大量CD3+细胞所观察到的结果，且同时，在对照样品中加入D-生物素指示该效果的特异性归因于破坏了多聚化反应剂组分的结合。
如图7B和7C所示，即便缺乏大量CD4+细胞，在该研究中的按时控制条件使得收获时显示类似于长寿记忆和/或少分化细胞表型特性的T细胞表现增加。
实施例5：用功能化到目标CD3和各种共刺激分子的可溶多聚化反应剂刺激T细胞的T细胞刺激评估
进行了对用或选刺激剂及其组合孵育的细胞评估的其他研究，结果表明对于所提供的反应剂的一些实施方式，反应剂的模块化性质可用于设计或调节所得组合物以促进所需结果或表型。包含抗CD3 Fab和一种或多种其他Fab的各种多聚化作用剂如实施例1中所述产生，例外是：除了所描述的抗CD3和抗CD28 Fab以外，采用了能够递送、调整或扩大T细胞中信号的其他Fab(抗CD90、抗CD95、抗CD137和抗CD154)。对于不同的条件，所述Fab以各种双和三组合可逆结合反应剂。
基本如实施例1中所述用各种Fab功能化反应剂，在室温下混合Fab和寡聚反应剂。对于两种不同Fab(双Fab组合)的多聚化，将约3μg寡聚与约0.5μg各Fab混合；对于在同一反应剂上三种不同Fab的多聚化(三Fab组合)，将约4.5μg可溶寡聚与约0.5μg各用于产生三Fab多聚化作用剂的Fab(包含抗CD3 Fab、抗CD28Fab和一种其他Fab(靶向CD90、CD95、CD137或CD154)。将所得可溶多聚化反应剂直接用于刺激T细胞，并可选地，在刺激细胞前储存在冰上。
如实施例1中所述分离CD3+T细胞，将500,000个CD3+T细胞接种到48孔板中的1mL完全细胞培养基(补充有50U/mL IL-2)。用各种可溶Fab多聚化作用剂或用抗CD3/抗CD28珠(抗CD3和抗CD28 mAb包被的珠)刺激细胞。将未处理(未刺激)的细胞用作阴性对照。在37℃孵育细胞，在开始后第2天更换培养基。6天后，重悬各测试孔以收获细胞，各自转移到微量离心管中，并分析细胞计数以评估细胞扩增和/或通过流式细胞术分析CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CD69或CD62L的表面表达。示例性结果见图8A-8F。数据表示三个独立的试验，包括各测试条件和对照的重复。
如图8A所示，用各种Fab多聚化作用剂刺激CD3+T细胞使得收获时的细胞计数(指示了扩增和/或为此)至少与用抗CD3/抗CD28珠刺激相当，且在某些情况下，更高。与用包含抗CD28 Fab的反应剂刺激(例如用抗CD3/抗CD28珠或可溶抗CD3/抗CD28多聚化作用剂刺激)的细胞相比，用不含抗CD28 Fab的Fab多聚化作用剂刺激使得T细胞组合物的扩增培养物向更高CD8+细胞比例偏移。例如，如图8B所示，基于未刺激对照中CD4+和CD8+T细胞比例标准化CD3+T细胞群中CD4+和CD8+亚组，结果显示：对于用包含多聚化抗CD3 Fab和多聚化抗CD90、抗CD95、抗CD137或抗CD154 Fab之一刺激的培养物(而不是用包含多聚化抗CD3和抗CD28 Fab刺激的培养物，或用含其中一种多聚化Fab为抗CD28 Fab的三多聚化Fab刺激的培养物)，CD8+T细胞数量的相对增长大于CD4+T细胞的相对增长；而用包含多聚化抗CD3和抗CD28 Fab刺激，或用含其中一种多聚化Fab为抗CD28Fab的三多聚化Fab刺激并不能使得扩增T细胞组合物中CD8+细胞的比例更高。
如图8C和8D所示，与采用相似刺激条件且采用包含抗CD28 Fab的作用剂相比，在该研究的条件下，采用除了包含抗CD28 Fab以外的多聚化Fab组合显示获得相对较大的CD62L+细胞百分比。在CD4+(图8C)和CD8+(图8D)群中均观察到该效果(在收获时，标准化相应亚组后，在CD3+T细胞群中)。图8E(CD4+T细胞)和8F(CD8+T细胞)显示在各种条件下的CD62L、CD69、CD45RA和CD45RO表达。这些结果证明在本文所提供的实施方式中，反应剂的模块性质实现了通过调整反应剂以获得所需结果、细胞群和表型，包括通过适用不同刺激剂的组合(包括靶向各种第二或辅助信号转导分子的那些，包括除了CD28以外的那些(例如CD90、CD95、CD137或CD154))。在一些方面中，该调整可用于使培养物向产生所需表型偏移，例如促进具有较少分化表面表型的细胞(如长寿记忆T细胞)。
实施例6：可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂的链霉亲和素突变蛋白骨架对T细胞刺激的效果
将另一种链霉亲和素突变蛋白(其为包含SEQ ID NO:27所示氨基酸突变蛋白序列的链霉亲和素同四聚体，参见例如国际公开PCT申请号WO 2014/076277)用于产生可溶寡聚反应剂，所采用的方法与实施例1中所述基本相同。抗CD3和抗CD28Fab片段通过融合于各Fab片段的链霉亲和素肽结合伴侣，固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白(ST-MM B)。将用所得抗CD3/CD28 Fab多聚化反应剂(ST-MM B)对T细胞的刺激与用实施例1中所产生的抗CD3/CD28 Fab多聚化反应剂(ST-MM A)进行比较。
CD3+T细胞从获自Ficoll梯度的新鲜外周血单核细胞(PBMC)样品中选出。将约500,000个CD3+T细胞接种在48孔板中的1mL完全RPMI培养基(补充有50U/mL IL-2)中。细胞用如下之一的物质刺激：如实施例1所述产生的可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MMA)，可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM B)，或者抗CD3/抗CD28珠(抗CD3和抗CD28 mAb包被的珠；阳性对照)。将未处理(未刺激)的细胞用作阴性对照。在37℃孵育细胞，不更换培养基。5天后，重悬各测试孔以收获细胞，各自转移到微量离心管中，并分析细胞计数以评估细胞扩增和/或通过流式细胞术分析CD4、CD8、CD69或CD62L的表面表达。示例性结果见图9A-9D。数据表示三个独立的试验，包括各测试条件和对照的重复。
如图9A所示，结果显示：用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)或可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM B)刺激CD3+T细胞所得细胞扩增相当，其大于用抗CD3/抗CD28珠刺激所得。图9B中所示结果显示：与用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)刺激的细胞相比，用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM B)刺激使得经扩增培养的T细胞组合物中CD8+细胞的比例小幅提高。如图9C所示，基于未刺激对照中CD4+和CD8+T细胞的比例对CD3+T细胞群中CD4+和CD8+亚组进行标准化，结果显示：与用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)或抗CD3/抗CD28珠刺激相比，用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MMB)刺激使得CD8+T细胞的扩增显著大于CD4+T细胞的扩增。图9D中的结果也显示：与用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)或抗CD3/抗CD28珠刺激相比，用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)刺激细胞使得扩增培养的T细胞组合物向更高CD62L+细胞比例偏移。
为评估特异于CD8+细胞的反应剂ST-MM B的效果，进行了与如上所述类似的试验，除了刺激持续到第6天且包括更换培养基。具体而言，将约500,000个CD8+T细胞接种在48孔板中的1mL完全RPMI培养基(补充有50U/mL IL-2)中。细胞用如下之一的物质刺激：如实施例1所述产生的可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)，可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM B)，或者抗CD3/抗CD28珠(抗CD3和抗CD28 mAb包被的珠；阳性对照)。将未处理(未刺激)的细胞用作阴性对照。在37℃孵育细胞，第4天更换培养基。6天后，重悬各测试孔以收获细胞，各自转移到微量离心管中，并分析细胞计数以评估细胞扩增和/或通过流式细胞术分析CD8、CD69或CD62L的表面表达。结果见图10A和10B。数据表示三个独立的试验，包括各测试条件和对照的重复。
如图10A所示，结果显示：用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM B)刺激CD8+T细胞使得细胞计数比用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)或用抗CD3/抗CD28珠刺激CD8+T细胞所得的细胞计数提高大于2倍。图10B中的结果显示：用可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM B)扩增的T细胞与可溶抗CD3/抗CD28多聚化反应剂(ST-MM A)扩增的T细胞或用抗CD3/抗CD28珠扩增的T细胞相比较的细胞表面表型，包括CD62L+和CD69+T细胞组合物的表面表达程度)。
实施例7：用可逆固定于链霉亲和素突变蛋白包被的珠上的αCD3/αCD28 Fab片段对CD3+T应答细胞刺激/扩增/>
将300,000个CD3+CD62L应答T细胞(T应答，从非动员供体血浆分离置换法产物中通过系列磁性富集分离)用3μM CFSE标记，并用5μl的15μl珠(10mg磁性颗粒/ml，加载有35μg/>/mg珠)制备物，所述珠加载有如下之一：仅0.5μgαCD3 Fab片段，仅0.5μgαCD28 Fab片段，或0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab的混合物。
所用αCD3 Fab片段衍生自杂交瘤细胞系OKT3所产生的结合CD3的单克隆抗体。杂交瘤细胞系OKT3和OKT3抗体描述于美国专利4,361,549，该细胞系已以登录号CRL-8001TM保藏。所用αCD28Fab衍生自单克隆抗人CD28抗体CD28.3(Vanhove等，BLOOD,2003年7月15日，第102卷，第2期，第564-570页)。该抗体CD28.3的可变区核苷酸序列已以合成单链Fv构建体抗人CD28抗体scFv28.3的形式存于GenBank(GenBank登录号AF451974.1，如SEQID NO:33和34所示)。
两种Fab片段均在大肠杆菌(E.coli)中重组产生(如国际专利申请公开号WO2013/011011和WO 2013/124474中所述)，携带作为恒定区(CH1和Cκ)的IgG1共有序列。两种Fab片段的重链在羧基末端与依序排列的两个链霉亲和素结合模块(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK)(SEQ ID NO:16，市售作为“ ”获自IBA有限公司，德国哥廷根)融合。将αCD3Fab片段用作第一作用剂并以链霉亲和素结合肽用作结合伴侣C1，将αCD28Fab片段用作第二作用剂并以链霉亲和素结合肽用作结合伴侣C2。将(四聚化)链霉亲和素突变蛋白“/>”用作反应剂，其上可逆固定有两种Fab片段。
在扩增试验中，将用空白珠(无Fab)的T应答细胞用作阴性对照。将T应答细胞与300,000个CD3细胞自体饲养细胞(用30Gy辐照)一起接种到48孔板中的3ml补充有10U/ml白介素2(IL-2)的完全细胞培养基(RPMI(Gibco公司)，其补充有10％(v/v)胎牛血清、L-谷氨酰胺、b-巯基乙醇、HEPES、青霉素、链霉素和庆大霉素)中，一式三份。在37℃下孵育细胞，不更换培养基，并在4天和通过FACS分析法进行分析。在用100μM D-生物素孵育10分钟后进行FACS染色和分析。图11A中显示了各条件下的一个代表性曲线。曲线显示：用碘化丙啶染色来区分活/死细胞的活CD3+细胞。图11A是显示经刺激细胞尺寸分布的直方图(正向散射)。图11A显示：当在其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab的混合物的珠的存在下孵育并用可逆结合在包被有链霉亲和素突变蛋白的珠上的αCD3/αCD28 Fab片段体外刺激后，T应答细胞的特定细胞群被刺激并扩增(与未刺激“仅珠”对照相比，尺寸/数量均增加)。图11B显示增殖染料CDSE稀释液的直方图，其代表了根据细胞数/次细胞分裂的增殖程度(显示于图11B顶部，0代表未分裂细胞；5代表经过至少5次分裂的细胞)。由图11B可以看出，用其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab的珠刺激的T细胞群几乎都经历了三次细胞分裂，这与仅采用单一刺激物相比(在未分裂峰“0”中的少量细胞)代表了更均一的增殖模式。增殖绝对量的提高也体现在更强烈的培养基消耗，如指示剂的颜色变为黄色所示(表现为图11C中孔中更浅的液体)。
实施例8：用可逆固定于可溶Strep-tactin的αCD3/αCD28 Fab片段对CD3+T应答细胞的刺激及该细胞的扩增
在本实施例中，用可逆固定于可溶寡聚(用作可溶反应剂)的αCD3/αCD28 Fab片段体外刺激后，CD3+T应答细胞(通过磁分选从获自Ficoll梯度的新鲜PBMC样品中分离)扩增。寡聚链霉亲和素突变蛋白如下获得：根据生产商(Thermo Scientific公司)方案，使/>与磺基SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，产品编号#22122Thermo Scientific公司)和亚氨氢氯化硫醇(iminothiolan，产品编号#26101Thermo Scientific公司)聚合。将寡聚链霉亲和素突变蛋白与单体(未反应)和二聚链霉亲和素突变蛋白通过尺寸排阻色谱分离，将所得寡聚链霉亲和素突变蛋白级分(n≥3)用作可溶反应剂。
对于体外扩增，将300,000个CD3+应答T细胞(T应答)以2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，并用各种量的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白制剂刺激，在该突变蛋白上固定有如上所述的αCD3 OKT3 Fab片段和抗体28.3的αCD28 Fab片段的组合(所述片段在重链上均携带作为链霉亲和素结合肽的如上所述的 )。(“1×”对应于用0.5μgαCD3和0.5μgαCD28单体Fab片段官能化的3μg寡聚链霉亲和素突变蛋白；数字“0.5×”、“2×”和“5×”表示“1×”的相应n倍)。T应答细胞未被刺激，或者被作为阴性对照的空白寡聚链霉亲和素突变蛋白(无Fab)刺激。将T应答细胞与300,000个CD3阴性自体饲养细胞(用30Gy辐照)一起接种在48孔板中补充有20U/ml IL-2的1ml细胞培养基中，一式两份。将细胞在37℃下孵育而不更换培养基，5天后采用FACS分析法根据CFSE稀释分析增殖。图12A显示与阴性对照相比，培养物中5天后增殖细胞的尺寸分布加大。图12B显示用其上固定有αCD3 Fab和αCD28Fab片段混合物的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白(与图11(A-C)和实施例7中的固体链霉亲和素磁珠相比)孵育时，CD3+T应答细胞被适当刺激且强烈增殖。图12A和12B中的结果表明：在这些体外条件下，在表面CD28和TCR/CD3复合物与可逆固定在可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上的αCD3和αCD28Fab片段啮合后，大部分CD3+T细胞分裂(2～5次细胞分裂)。在体外扩增后，在D-生物素处理后，解离并去除可溶多聚化作用剂。通过藻红蛋白标记的/> )(ST-PE)复染的细胞对单体Fab片段的解离和去除进行流式细胞术分析。代表性的直方图(深灰直方图)与仅适当ST-PE的阴性对照(浅灰直方图)对比显示。由图12C可以看出，两种Fab片段已从扩增的细胞彻底解离且完全去除。图12D显示5天后活(台盼蓝阴性)细胞的绝对数量。采用Neubauer计数室计数，并针对各相应刺激条件制作曲线。图12D中示出中位细胞数；误差线表示标准误差(SD)。图12D显示：所有固定在可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂上的αCD3 Fab片段和αCD28Fab片段的混合物均对CD3+细胞的扩增都同样有效，并使得绝对细胞数提高约4倍。
实施例9：用可逆αCD3/αCD28 Fab-Streptamer多聚体体外刺激(不换培养基)的纯化CD4+和CD8+T应答细胞的增殖动力学
在本实施例中，考察了用可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白的αCD3/αCD28Fab片段体外刺激的纯化CD4+和CD8+T应答细胞(T应答)的增殖的扩增动力学。出于该目的，将两种不同尺寸的可溶寡聚突变蛋白用作可溶反应剂。第一类寡聚是实施例8中获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白级分(n≥3，在本文中也称为“常规寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架”，在图13(A-B)中以尖端向上的三角标记显示)。用作可溶反应剂的第二类该寡聚链霉亲和素突变蛋白是与生物素化人血清白蛋白反应的寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)(在文本中也称为“大寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架”)。
在本实施例中，将500,000个纯化的CD4+或CD8+应答T细胞(T应答)分别用如上所述两种不同的Streptamer多聚体刺激，即用实施例8的寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架(采用浓度为1mg寡聚链霉亲和素突变蛋白/ml的溶液)刺激或用大寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架刺激(0.1mg/ml)。在3μl两种不同骨架上均加载之前实施例中所用的0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab，其在Fab片段重链C末端携带了链霉亲和素结合肽SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:16)。此外，在4.5μl常规寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架上加载0.5μgαCD3 Fab片段，0.5μgαCD8Fab片段(IBA有限公司，哥廷根，其在Fab片段的C末端携带链霉亲和素结合肽SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:16))和0.5μgαCD28 Fab片段。将未处理(未刺激)的T应答细胞作为阴性对照，将用市售可获得的抗CD3/抗CD8珠(在珠上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的T应答作为阳性对照。将T应答细胞接种在48孔板中的补充有30U/ml IL-2的1ml细胞培养基中(RPMI 1640(Gibco公司)，补充有10％(v/v)胎牛血清，0.025％(w/v)L-谷氨酰胺，0.025％(w/v)L-精氨酸，0.1％(w/v)HEPES，0.001％(w/v)庆大霉素，0.002％(w/v)链霉素，0.002％(w/v)青霉素)，一式两份。在37℃孵育细胞，不更换培养基，在1天、3天和6天后进行细胞计数分析。在图13(A-B)的试验中，扩增在不更换培养基的情况下进行。关于CD4+T应答细胞的结果示于图13A中，关于CD8+T应答细胞的结果示于图13B中，图代表了根据每个时间点收获的CD4+T应答(图13A)和CD8+T应答细胞数的增殖程度。
由图13A可见，其上可逆固定有αCD3 Fab和αCD28 Fab片段的“较小”可溶反应剂提供了与抗CD3/抗CD28珠(其为迄今为止用于T细胞扩增的标准反应剂)相同的CD4+T细胞扩增量，而“较大”可溶多聚的作用剂与Dyna珠相比则甚至于可提供更佳扩增。该改进可能归因于可溶“较大”多聚化能够比“较小”多聚化作用剂同时结合更多T细胞，从而能够比“较小”多聚化作用剂刺激更多CD4+T细胞。
如图13B所证明，采用本文所公开的可溶多聚化作用剂，可在前3天内至少与用抗CD3/抗CD28珠一样有效地扩增CD8+T细胞。应注意到在该时间段中，采用不仅携带可逆固定于其上的αCD3 Fab和αCD28 Fab片段(作为第一和第二作用剂)还携带可逆固定于其上的αCD8 Fab片段的可溶反应剂的扩增试验在这些培养条件下显示最佳的扩增程度。这表明：能够通过采用特异于具体细胞亚群的刺激物(此处为αCD8 Fab片段)来提高或调节扩增的选择性，从而能够获得更大量的所需细胞(亚)群。
因此，综上所述，实施例9显示可溶多聚化作用剂在引发T细胞扩增方面的功能与为了该目的采用抗CD3/抗CD28珠的目前标准方法相当。然而，由于刺激可通过加入竞争剂(例如在基于链霉亲和素的第一和第二作用剂与反应剂之间的可逆相互作用的情况选择，为生物素)被控制(和终止，若需要)，本文所述的组合物和方法因可优化扩增条件(例如，可以在图13B所示的试验中在3天后停止刺激)而提供了超越抗CD3/抗CD28珠技术的显著优势。此外，由于可溶反应剂能轻易从反应中去除(例如通过在扩增反应后将反应剂固定于生物素化的柱上)，本文所公开的扩增方法可在封闭系统中进行或自动化，该封闭系统为例如用于治疗目的的细胞GMP生产所需，而无需进行珠(例如抗CD3/抗CD28珠)的去除。
实施例10：用可逆αCD3/αCD28 Fab-Streptamer多聚体体外刺激(更换培养基)的纯化CD4+和CD8+T应答细胞的增殖动力学
在本实施例中，考察了用可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段体外刺激的纯化CD4+和CD8+T应答细胞(T应答)的增殖的扩增动力学。出于该目的，将两种不同尺寸的可溶寡聚突变蛋白用作可溶反应剂。第一类寡聚/>是实施例8中获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白级分(n≥3，在本文中也称为“常规寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架”，在图14(A-B)中以尖端向下的三角标记显示)。用作可溶反应剂的第二类该寡聚链霉亲和素突变蛋白通过实施例8中所得的寡聚Strep-tactin(n≥3)与生物素化人血清白蛋白反应获得。该可溶寡聚反应剂在本文中也称为“大寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架”。
在本实施例中，将400,000个纯化的CD4+或CD8+应答T细胞(T应答)分别用如上所述两种不同的寡聚链霉亲和素突变蛋白刺激，即用实施例8的寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架(1.0mg/ml)刺激或用大寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架刺激(0.1mg/ml)。用如上所述的0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab片段组合加载3μl两种不同的骨架。此外，用如上所述的0.5μgαCD3，0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab片段加载4.5μl实施例8的寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架。将未处理(未刺激)的T应答细胞作为阴性对照，将用抗CD3/抗CD8珠(在珠上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中。在37℃孵育细胞，在第3天更换培养基，在1天、3天和6天后进行细胞计数分析。关于CD4+T应答细胞的结果示于图14A中，关于CD8+T应答细胞的结果示于图14B中，图代表了根据每个时间点收获的CD4+T应答(图14A)和CD8+T应答细胞数(图14B)的增殖程度。
由图14A可见，其上可逆固定有αCD3 Fab和αCD28 Fab片段的可溶反应剂(多聚化作用剂)提供了比抗CD3/抗CD28珠更佳的CD4+T细胞扩增。
如图14B所证明，采用多聚化作用剂，可在前6天内至少与用抗CD3/抗CD28珠一样有效地扩增CD8+T细胞。应注意到在该时间段中，采用携带αCD3 Fab和αCD28 Fab片段(作为第一和第二作用剂)的较大可溶反应剂的扩增试验在这些培养条件下显示最佳的扩增程度。这同样可能归因于可溶“较大”多聚化作用剂能够比“较小”多聚化作用剂同时结合更多T细胞，从而能够比“较小”多聚化作用剂刺激更多CD4+T细胞。
实施例11：更换或不更换培养基的纯化CD4+和CD8+T细胞的扩增动力学
在本实施例中，基于对“较小”多聚化作用剂的输入细胞数以及阳性和阴性对照，标准化获自实施例9和10的合并数据。在“较大”多聚化作用剂上未获得标准化的数据。如实施例9和10中所解释，用3μl多聚化作用剂的制备物(1mg/ml；其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab片段)刺激400,000～500,000个CD4+或CD8+应答T细胞(T应答)。将未处理(未刺激)的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中，一式两份。在37℃孵育细胞，第3天更换培养基(图15(A-B)中的直线)或不更换培养基(图15(A-B)中的虚线)，在1天、3天和6天后分析细胞计数。如图15A的标准化数据所证明，其上可逆固定有αCD3 Fab和αCD28 Fab片段的“较小”可溶反应剂获得了约2.5倍扩增的CD4+T细胞，而采用抗CD3/抗CD28珠的扩增获得了约1.8倍的扩增率。因此，采用多聚化作用剂甚至于提供了比抗CD3/抗CD28珠更为改善的CD4+T细胞扩增。同样，图15B证实了，采用多聚化作用剂在前3天内能至少与用抗CD3/抗CD28珠一样有效地扩增CD8+T细胞。
实施例12：多克隆活化/扩增的大量CD3+中心记忆T细胞(TCM)的扩增动力学和表型
在本实施例中，将500,000个CD3+CD62L+CD45RA应答TCM细胞(T应答)以3μl实施例8的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白制剂(1mg/ml)刺激，该突变蛋白加载有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab的组合。此外，将加载有0.5μgαCD3，0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl寡聚链霉亲和素突变蛋白制剂用作额外的刺激条件。将未处理(未刺激)的T应答细胞作为阴性对照，将用抗CD3/抗CD8珠(在珠上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基，培养基中仅补充有30U/ml IL-2，或补充有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15。在37℃孵育细胞，每3天更换培养基，在7天和14天后进行细胞计数分析。图代表根据每个时间点收获的细胞数的增殖程度，图16A为仅补充IL-2的培养基，图16B为补充IL-2和IL-15的培养基。从图16A和图16B中均可见：其上可逆结合αCD3 Fab片段和αCD28 Fab片段的可溶反应剂比抗CD3/抗CD28珠获得了更佳的细胞扩增。如图16C的可变细胞因子环境中培养14天后CD62L和CD127表面表达的流式细胞分析进一步所示，与采用抗CD3/抗CD28珠的扩增相比，采用多聚化作用剂的试验方法在本实施例所选的两种条件下均保持更高的CD127表达长寿记忆T细胞含量。这证明了本文所述的方法和采用本文组合物的方法的进一步优势。
实施例13：扩增CD8+T细胞的产率和表型——用于刺激的尺寸不同的可溶反应剂和αCD8-Fab的加入刺激
在本实施例中，考察了用可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白的αCD3/αCD28Fab片段体外刺激的纯化CD8+T应答细胞(T应答)的扩增。此外，还考察了将αCD8-Fab加入反应剂以提高CD8+T细胞扩增的效果。
出于该目的，将300,000个纯化CD8+应答T细胞(T应答)分别用两种不同的基于Streptactin的反应剂刺激，即实施例8的小多聚化作用剂(1mg/ml)或如上所述的较大多聚化作用剂(0.1mg/ml)。用如上所述的0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab片段组合加载3μl两种寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架以形成多聚化作用剂。此外，用如上所述的0.5μgαCD3，0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab片段加载4.5μl的较小寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架。并且，还采用了仅用0.5μgαCD3 Fab片段或仅用0.5μgαCD28 Fab片段功能化的3μl“较小”寡聚链霉亲和素突变蛋白骨架。将未刺激的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中。在37℃孵育细胞，3天后更换培养基，并在6天后进行分析。图17A描绘了根据第6天收集的细胞数的增殖程度，与阴性对照相比，并基于阳性对照标准化。图17A显示与采用抗CD3/抗CD28珠的扩增相比，采用多聚化作用剂的CD8+T细胞扩增获得更高的CD8+T细胞产率。细胞培养后的CD8表面表达和CD45RO表面表达FACS分析显示：采用多聚化作用剂或采用抗CD3/抗CD8珠扩增了相同表型的CD8+T细胞(采用单向ANOVA比较各种刺激条件，未检测到显著差异(n.s.))。与采用抗CD3/抗CD28珠相比的采用本文所公开方法扩增的CD8+细胞产率改善可能归因于可溶多聚化作用剂能比固定在抗CD3/抗CD28珠上的抗体更好地接近其细胞表面上的目标受体。当从起始样品扩增稀有细胞群时，该改善的产率可变得极具优势。
此外，比较采用其上共同固定有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab片段的反应剂所获得的扩增产率(图17B中左起第二柱)与采用仅用αCD3 Fab片段或仅用αCD28 Fab片段功能化的两种反应剂的产率(图17B中左起第三柱)，可发现两种试验具有相同的扩增效力。因此，这些试验显示采用其上共同固定有第一作用剂和第二作用剂的一种反应剂在功能上等同于同时采用分别仅加载有第一作用剂和仅加载有第二作用剂的两种独立的反应剂进行扩增。
实施例14：扩增的CD8+T细胞的产率和表型——具有固定于其上的不同比例αCD3-和αCD28 Fab片段的各单独可溶反应剂的效价
在本实施例中，考察了用以不同量可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段体外刺激的扩增的CD8+T应答细胞(T应答)的产率和表型。
出于该目的，将300,000个CD8+应答T细胞(T应答)用不同量的制备混合物刺激，其中制备混合物为：仅用αCD3 Fab和仅用αCD28 Fab功能化的“小”寡聚链霉亲和素突变蛋白(1mg/ml)(“1×”对应于仅用0.5μgαCD3 Fab片段功能化的1.5μg寡聚链霉亲和素突变蛋白以及仅用0.5μgαCD28 Fab片段功能化的1.5μg寡聚链霉亲和素突变蛋白)，或用0.5μgαCD3Fab和0.5μgαCD28 Fab加载的3μl寡聚链霉亲和素突变蛋白制备物，或用0.5μgαCD3、0.5μgstrep标记的αCD28和0.5μgαCD28 Fab加载的4.5μl寡聚链霉亲和素突变蛋白制备物。将未处理的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中。在37℃孵育细胞，不更换培养基，并在5天后进行分析。图18A描绘了根据第5天收集的细胞数的增殖程度，与阴性对照相比，并基于阳性对照标准化。图18A显示与采用抗CD3/抗CD8珠的扩增相比，采用各种多聚化作用剂的CD8+T细胞扩增获得了更高的CD8+T细胞产率(尤其是5×条件下累积总反应剂的量获得了最优化细胞扩增，尤其是通过开始细胞分裂的总细胞随时间/增长)。细胞培养后的CD8表面表达和CD45RO(图18B)表面表达FACS分析显示：采用多聚化作用剂或采用市售可获得的抗CD3/抗CD8珠扩增了相同表型的CD8+T细胞。
实施例15：加入αCD8-Fab刺激的扩增CD3+T细胞的亚组组合物和产率
试验显示在体外用αCD3/αCD28 Fab片段刺激的经纯化CD3+T应答细胞的扩增，所述片段可逆固定于作为可溶性反应剂的实施例8的可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白。在一个试验中，除了αCD3/αCD28 Fab片段以外，还将αCD8 Fab片段(市售获自IBA有限公司，德国哥廷根，目录号6-8000-203)固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白上，以测试是否能够用可逆αCD3/αCD28多聚化作用剂在体外优先刺激特定T细胞亚群。更具体而言，将500,000个纯化的CD3+应答T细胞(T应答)以3μl寡聚链霉亲和素突变蛋白制备物(1mg/ml)刺激，该突变蛋白加载有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab的组合。作为或选的方法，给4.5μl寡聚链霉亲和素突变蛋白加载0.5μgαCD3 Fab、0.5μg strep-标签的αCD8 Fab和0.5μg strep-标签的αCD28 Fab。将未处理的T应答细胞作为阴性对照，将用抗CD3/抗CD8珠(在珠上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的T应答作为阳性对照。由图19A可看出，可逆加载αCD3 Fab片段、αCD28 Fab片段以及αCD8 Fab片段的反应剂提供了最高的扩增CD3+T细胞数。约1×106个扩增细胞数量的产率比采用市售可获得的抗CD3/抗CD8珠的这些T细胞的扩增高出约30％。此外且更重要的是，如图19B所示，与采用抗CD3/抗CD8珠或仅携带αCD3 Fab片段和αCD28 Fab片段作为第一和第二作用剂(如本文所述)的两种扩增相比，采用携带αCD3 Fab片段、αCD28Fab片段和αCD8 Fab片段的该反应剂的CD8+T细胞量最高。因此，该试验还显示本文所述方法和组合物的优势：除了为所选细胞群提供主要活化信号的第一作用剂以及提供共刺激信号的可选第二作用剂以外，还可将特异于所需细胞群活化的其他作用剂固定在反应剂上。因此，通过如此实施，本文所述的方法和组合物提供了从样品(例如包含各种不同亚群的样品)中优先扩增或选择性富集任何所需细胞群或亚群的可能性。
实施例16：Jurkat细胞中差示胞内钙移动的分析
本实施例中考察了用αCD3抗体克隆OKT3或用OKT3的Fab片段(用 多聚化)标记的Jurkat细胞中诱导的差示胞内钙移动的实时低流式细胞分析。
出于该目的，用钙敏感染料Indo-1-AM加载Jurkat细胞，通过注入αCD3多克隆抗体OKT3(由杂交瘤细胞系OKT3产生，见上方，黑色方块)或由其链霉亲和素结合肽可逆结合于Strep-Tactin(与藻红蛋白荧光偶联)的可溶αCD3 Fab片段(衍生自亲本细胞系OKT3)引发钙释放。在完整多聚OKT3 Fab-Strep-Tactin复合物的情况中，钙释放的引发时间段与用亲本抗体克隆(深灰三角)相同。通过注入D-生物素处理的预解离Fab-Strep-Tactin复合物(浅灰圆圈)完全避免细胞活化，这与注入PBS阴性对照(白色反三角)相同。施加离子霉素作为钙离子流的阳性对照。胞内Ca2+浓度的时间分辨变化以流式细胞术基于FL6/FL7比例进行监测。由图20A可以看出，亲本抗体OKT3和多聚化OKT3单价Fab片段均能造成钙释放，这意味着多聚化OKT3单价Fab抗体基本上与亲本抗体功能相同。注意到，如果在加入Streptactin-OKT3 Fab片段前，将生物素加入其上固定有OKT Fab片段的Strep-tactin，则多聚化OKT3Fab片段不能引发钙释放。在该情况中，生物素破坏作为多聚化作用剂的Strep-tactin与OKT3 Fab片段之间形成的可逆键。由此，从多聚化作用剂置换下单价Fab片段，且在解离后该单价Fab片段不能通过结合Jurkat细胞的CD3引发钙释放。
在图20B所示的试验中，indo-1-AM标记的Jurkat细胞通过OKT3衍生的αCD3Fab-Strep-Tactin复合物被活化(如图20A所述)。分别将注入完整复合物(上图)或预解离复合物(下图)作为阳性和阴性对照。此外，用完整Fab-Strep Tactin复合物刺激细胞然后注入D-生物素(靠近t＝140秒的峰值活化)导致αCD3 Fab多聚体信号转导的骤然破坏。在预解离Fab复合物组中注入离子霉素作为阳性对照。数据代表3次独立实验。重要的是，图20B显示在样品中加入D-生物素迅速将Fab片段从Strep-tactin多聚化作用剂撤除，由此即便在持续钙刺激的条件下也有效终止了钙释放，且证明了解离的OKT3 Fab片段不再具有生物学活性。同样，将Streptactin-OKT3 Fab样品加到Jurkat细胞前，将生物素加入Strep-tactin-OKT3 Fab片段多聚体时，多聚化OKT3 Fab片段也不能引发钙释放。
实施例17：用αCD3 Fab多聚体对细胞的可逆染色
本实施例考察了用αCD3 Fab多聚体对细胞的可逆染色。将刚分离的PBMC用αCD3单克隆抗体克隆OKT3(左侧点图，Fab多聚体的亲本克隆)或同源藻红蛋白(PE)标记的OKT3Fab多聚体染色，在用D-生物素处理之前(左起第二点图)或处理之后(中部点图)进行分析。然后在后续用刚刚以PE标记的洗涤步骤之后检测剩余的Fab单体。将可逆染色细胞的二次Fab多聚体染色作为对照(右侧点图)。图21中仅显示在用碘化丙啶(PI)染色区分活/死细胞的染色中阴性的活CD3细胞。点图上的数字表示门控中的细胞百分比。该试验显示用以作为多聚化反应剂的Streptactin多聚化的抗CD3 Fab片段对CD3+PBMC进行的染色完全可通过加入D-生物素逆转，且单独的单价Fab片段不结合PBMC上递呈的CD3分子。
实施例18：用αCD28 Fab多聚体对细胞的可逆分离
本实施例显示通过用磁性颗粒(该磁性颗粒可获自IBA有限公司，德国哥廷根)多聚化的抗CD28 Fab片段的可逆结合进行的细胞分离。将上文实施例7中所述的衍生自抗体28.3的Fab片段用于该目的。通过Fab多聚物磁性细胞选择从刚分离的PMBC中选择/分离CD28+细胞(基本如国际专利申请公开号No.WO2013/011011中所述)。结果如图22所示。在选择前，细胞用同源荧光αCD28多聚体(左侧点图)或用抗免疫球蛋白κ轻链的抗体(左起第二点图，α-IgκmAb)作为对照染色。选择后，用D-生物素处理CD28+细胞，然后洗涤以去除磁珠和Fab单体。然后，用αCD28 Fab-多聚体(右起第二点图)或用α-IgκmAb(右侧点图)对释放的CD28+细胞进行(复染)染色，以检测可能剩余的Fab单体。仅显示活(PI阴性)CD3+细胞。点图上的数字表示门控中的细胞百分比。图22显示：可采用该多聚化抗CD28 Fab片段从PMBC分离CD28+细胞，且所有包含抗CD28 Fab单体的分离反应剂均可在选择后去除。
实施例19：用可逆αCD3/αCD28 Fab-Streptamer多聚体体外刺激的纯化CD4+和CD8+T应答细胞活化后的早期集落(cluster)形成
在本实施例中，将400,000个CD4+或CD8+应答T细胞(T应答)以3μl寡聚链霉亲和素多聚化反应剂的制备物(1mg/ml)刺激，该反应剂加载有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab的组合。将未处理(未刺激)的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中。在37℃孵育细胞，在1和2天后显微镜检分析。对CD4+T应答(图23A)和CD8+T应答(图23B)的刺激分别显示为针对抗CD3/抗CD28珠(中间行)和多聚化作用剂(下行)。照片代表了集落形成程度。为了更好地可见度，在图23A和23B中用可溶链霉亲和素突变蛋白寡聚体刺激的示例性集落用圆圈指示。Dyna珠刺激的集落通过深色刺激颗粒的累积轻易可见。如所示，采用可溶寡聚的多聚化反应剂的本发明扩增方法形成了CD4+和CD8+T细胞的早期集落。
实施例20：从大量CD3+中心记忆T细胞中选择性抗原特异性扩增出TCM应答细胞(动力学和表型)
在本实施例中，考察了选择性抗原特异性(Ag特异性)扩增出纯化CD3+CD62L+CD45RA-TCM应答细胞的动力学和表型。
更详细而言，在体外用肽:MHC分子复合物(用作第一作用剂，其为细胞提供主要活化信号)和αCD28 Fab片段(用作第二反应剂，其刺激细胞表面上的辅助分子)刺激CD3+CD62L+CD45RA-TCM应答细胞。抗原特异性肽与MHC分子的复合物以及αCD28 Fab片段均可逆固定于可溶寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)上(如实施例8中所述)。用于抗原特异性扩增的肽为：肽CRVLCCYVL(SEQ ID NO:38)，立即早期1蛋白的氨基酸309–317(描述于Ameres等，PLOS Pathogens，2013年5月，第9卷，第5期，e1003383)，其递呈特异于巨细胞病毒(CMV)的HLA-C7/IE-1表位。递呈肽的MHC I分子在其α链(重链)C末端携带链霉亲和素结合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:16)，其由德国哥廷根的IBA有限公司作为“”市售)。
出于该目的，采用3μl可溶寡聚链霉亲和素多聚化反应剂的制剂(用0.5μg配备有链霉亲和素结合肽的肽:MHC I类复合物和0.5μgαCD28 Fab如上所述功能化)，对500,000个CD3+CD62L+CD45RA-应答TCM细胞(T应答)进行Ag特异性刺激。或选地，采用加载有0.5μg该肽:MHC I型复合物、0.5μg CD8αFab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚化反应剂制备物。作为比较，采用加载有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab的3μl Streptactin多聚化反应剂制剂(1mg/ml)进行多克隆刺激。同样，作为上述的替代刺激条件，采用加载有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚化反应剂制剂。将未处理(未刺激)的T应答细胞作为阴性对照，将用抗CD3/抗CD8珠(其上可逆固定了αCD3和αCD28单克隆抗体的珠)刺激的T应答细胞多克隆作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15)中。在37℃孵育细胞，每3天更换培养基，在7天和14天后进行细胞计数分析。结果如图24(A-F)所示。对Ag特异性细胞级分(用其上固定有针对HLA-C7/IE-1表位(CMV)的肽:MHC-I复合物的可溶strept-tactin寡聚体刺激/扩增)的示例性流式细胞分析(图24A)显示这些抗原特异性T细胞被特异性扩增。图24B-24E所示的图(代表根据在图24A所示扩增试验分析中每个时间点收获的肽:MHC I多聚体阳性细胞数量的不同Ag特异性的扩增程度)显示：采用相应Ag特异性肽和MHC 1分子的多聚化反应剂提供最高数量的扩增细胞(从受限于HLA-A2402的识别CMV pp65表位(范围为从氨基酸341-350(QYDPVAALF，(SEQ ID NO:39))的Ag特异性细胞的细胞数提高20倍～识别CMV HLA-B7/IE-1309-317表位(CRVLCCYVL(SEQ ID NO:38))的Ag特异性细胞的数量增加98倍)，由此显示本发明的扩增方法完全可应用于Ag特异性细胞的扩增。最后，针对HLA-B7/六邻体5表位(对腺病毒)培养14天后CD62L和CD127表面表达的示例性流式细胞分析(示于图24F)进一步确证了：在多克隆和Ag特异性刺激条件下，采用本发明可溶多聚化反应剂的试验方法保持了更高的CD127表达长寿记忆T细胞含量。
实施例21：大量中心记忆T细胞的选择性Ag特异性扩增动力学和表型
本实施例考察了纯化的CD3+CD62L+CD45RA-TCM应答细胞中的选择性Ag特异性扩增动力学，所述细胞在体外用如下物质刺激：a)抗原特异性肽MHC I复合物，和b)αCD28 Fab片段，其可逆固定于可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白上作为第一和第二作用剂。
出于该目的，对500,000个CD3+CD62L+CD45RA-应答TCM细胞(T应答)进行Ag特异性刺激，采用了3μl Streptactin多聚化反应剂制剂，其用0.5μg装配有链霉亲和素结合肽的肽:MHC I类复合物(特异性肽代表受限于HLA-B07的腺病毒六邻体5蛋白的氨基酸114-124(CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:41))以及0.5μgαCD28 Fab官能化。或者，采用加载有0.5μg该肽:MHC I型复合物、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚化反应剂。作为比较，采用加载有0.5μgαCD3Fab和0.5μgαCD28 Fab的3μl Streptactin多聚化反应剂制剂(1mg/ml)进行多克隆刺激，。同样，作为上述的替代刺激条件，采用加载有0.5μgαCD3Fab、0.5μgαCD8Fab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚体制备物。将未处理(未刺激)的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠多克隆刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15)中。在37℃孵育细胞，每3天更换培养基，在7天和14天后进行细胞计数分析。图25中所示的照片代表以腺病毒HLA-B7/六邻体5表位为示例的Ag特异性刺激第5天的集落形成程度。由图25可见，该腺病毒抗原特异性细胞可从原始CD3+CD62L+CD45RA-TCM应答细胞群被特异性扩增。
实施例22：用Streptamer多聚体刺激CD19-CAR转导的Jurkat细胞后的胞内信号级联活化
在本实施例中，考察了经转导Jurket细胞胞内信号转导级联活化，所述细胞经修饰以表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(CAR)，即CD19，并用作为可溶多聚化反应剂的实施例8的寡聚刺激。
出于该目的，300,000个Jurkat应答细胞(J应答)用如下物质刺激：(A)各种量的Streptactin多聚化反应剂制备物的混合物(1mg/ml)，所述反应剂用αCD3 Fab和αCD28 Fab片段如本文所述地功能化(“×1”对应于3μg Streptactin多聚化反应剂，其用0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28 Fab功能化，这提供了“基于多克隆链霉亲和素的多聚化反应剂”)，或(B)3μlStreptactin多聚化反应剂制备物(1mg/ml)，所述反应剂用0.5μg(×1)或1μg(×2)的CD19胞外结构域(ECD)功能化(αCD19-CAR的天然配体–这提供了“基于CAR-特异性链霉亲和素的多聚化反应剂”)，或3μl Streptactin多聚化反应剂制备物，所述反应剂加载有0.5μg(×1)或1μg(×2)识别αCD19-CAR中IgG4间隔子的αIgG–这也提供了“基于CAR-特异性链霉亲和素突变蛋白的多聚化反应剂”。装备有六组氨酸标签的CD19的ECD获自Sino Biological/Lifetechnologies公司(SEQ ID NO:47)，并通过以1:1的分子比混合CD19的ECD和衔接分子His-STREPPER(IBA有限公司，德国，订购号2-0920-005)并在室温孵育15分钟，功能化以结合基于链霉亲和素的多聚化反应剂。His-STREPPER衔接分子包含结合六组氨酸标签和链霉亲和素结合肽的螯合部分，由此临时提供目标分子，此处为带有链霉亲和素结合肽的CD19 ECD，其能够可逆结合基于链霉亲和素突变蛋白的多聚化反应剂。用抗CD3/抗CD28珠(珠上可逆固定αCD3和αCD28单克隆抗体)或PMA刺激J应答，将离子霉素刺激作为阳性对照。将J应答细胞接种在1.5ml Eppendorf管中200μl细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中。在37℃孵育细胞，刺激0-20分钟后置于冰上并裂解。磷酸化ERK的检测指示活化MAPK信号转导，管家蛋白β-肌动蛋白的染色指示各条件和时间点下等量总蛋白质的加载。通过显示采用“多克隆Streptactin多聚化反应剂”的Jurkat细胞活性的图26A与显示采用两种“基于CAR特异性链霉亲和素的多聚化反应剂”的Jurkat细胞活性的图26B的比较可见：Jurkat细胞可通过CD19胞外结构域与CD19特异性嵌合抗原受体的结合被活化/扩增。由于T细胞基因下游加工几乎专一地在预选择细胞群上进行，通过经IgG4间隔结构域(这在具有不同特异性的各种CAR中是保守的)引入的CAR的交联的普遍活化扩展了在这些体外细胞加工情况下的可逆细胞刺激/扩展的适用性。
因此，该试验显示：原则上，通过结合向细胞群提供主要活化信号的作用剂(配体)，任何细胞群均可采用可逆固定于多聚化反应剂的第一作用剂被扩增(如本文所述)。
实施例23：从单个库中平行抗原特异性扩增出TCM应答细胞
在本实施例中，考察了从用多种可逆肽:MHC/αCH28 Fab-Streptamer多聚体体外刺激的单个T应答细胞库中平行抗原特异性(Ag特异性)扩增出TCM应答细胞的动力学。
将500,000个CD3+CD62L+CD45RA-应答TCM细胞(T应答)同时针对多种Ag特异性进行刺激，对于各特异性，采用3μl Streptactin多聚体(用携带链霉亲和素结合肽的0.5μg相应肽:MHC I类复合物和同样携带链霉亲和素结合肽的0.5μgαCD28 Fab功能化)。作为或选的方法，将4.5μl基于链霉亲和素的多聚化反应剂(如本文所述，用携带链霉亲和素结合肽的0.5μg肽:MHC I类复合物、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab功能化)用于各特异性。作为比较，采用可逆加载有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab组合的3μl基于Streptactin的多聚化反应剂制剂(1mg/ml)进行多克隆刺激。同样，作为上述的替代刺激条件，采用可逆加载有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的4.5μl基于链霉亲和素的多聚化反应剂制剂。将未处理(未刺激)的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠(αCD3-和αCD28-mAb包被的珠)多克隆刺激的T应答细胞作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15)中。在37℃孵育细胞，每3天更换培养基，在7天和14天后进行细胞计数分析。
实施例24：用以αCD3/αCD8/αCD28 Fab片段可逆功能化的基于链霉亲和素的多聚化反应剂体外刺激的CD3+T应答细胞中的CD8+T细胞的优先增殖
用如下物质刺激300,000个CD3+应答T细胞(T应答)：3μl链霉亲和素多聚化制备物或采用大链霉亲和素骨架的多聚化反应剂(0.1mg/ml)，其各自加载了0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab的组合，或4.5μl基于链霉亲和素的多聚化反应剂的制备物，其加载了0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab，或3μl基于Streptactin的多聚化反应剂的制备物混合物，其仅加载了0.5μgαCD3 Fab和仅加载了0.5μgαCD28 Fab(各Fab片段同样携带链霉亲和素结合肽)。将未处理(未刺激)的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠(αCD3-和αCD28-mAb包被的珠)刺激的T应答作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中。在37℃孵育细胞，3天后更换培养基，并在6天后进行分析。
实施例25：用以αCD3 Fab和αCD28 Fab片段可逆功能化的基于链霉亲和素的多聚化反应剂体外刺激的CD3+T应答细胞中的CD8+T细胞的优先增殖
用如下物质刺激300,000个CD3+应答T细胞(T应答)：各种量的基于链霉亲和素的多聚化反应剂制备物的混合物(1mg/ml)，其用单独的αCD3 Fab片段和单独的αCD28 Fab片段功能化(用0.5μg单独的αCD3 Fab片段功能化的1.5μg基于链霉亲和素的多聚化反应剂，和用0.5μg单独的αCD28 Fab功能化的1.5μg基于链霉亲和素的多聚化反应剂)，或各种量的基于链霉亲和素的多聚化反应剂制备物的混合物(1mg/ml)，其用αCD3 Fab片段和αCD28 Fab片段并采用或不采用αCD8 Fab片段功能化(各Fab片段同样携带链霉亲和素结合肽)(用0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab片段—不含αCD8 Fab片段功能化的基于链霉亲和素的多聚化反应剂，或加载有0.5μgαCD3 Fab片段，0.5μgαCD28 Fab片段和0.5μgαCD8 Fab片段的4.5μl链霉亲和素多聚化反应剂制备物)。将未处理(未刺激)的T应答细胞用作阴性对照，用抗CD3/抗CD28珠(αCD3-和αCD28-mAb包被的珠)刺激的T应答作为阳性对照。将T应答细胞接种于48孔板上1ml细胞培养基(补充有30U/ml IL-2)中。在37℃孵育细胞，3天后更换培养基，并在6天后进行分析。
实施例26：通过原代T细胞中胞内钙动员分析的生物素介导的刺激破坏
通过评估Ca2+流监测了经由可逆多聚化反应剂破坏细胞刺激(通过加入D-生物素破坏)对原代人T细胞刺激的影响。将钙敏感染料加载到来自健康供体外周血单核细胞(PBMC)的CD3纯化T细胞，用反应剂孵育，该反应剂包含可逆结合在寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂上的多聚化抗CD3/抗CD28 Fab片段，并通过流式细胞分析评估Ca2+流。在第60秒加入抗CD3/抗CD28多聚化作用剂，不对培养物进行干扰或在第200秒加入D-生物素对培养物进行处理。为了确认通过从多聚化反应剂解离Fab片段破坏信号后仍可能诱导T细胞钙流，在第400秒加入离子霉素。
如图27所示，如反应剂诱导Ca2+水平提高后胞内Ca2+水平降低所示，通过加入D-生物素发生的解离能够破坏通过抗CD3/抗CD28多聚化作用剂递送到细胞的信号。在D-生物素介导的信号转导破坏后加入离子霉素将胞内Ca2+水平恢复到加入D-生物素前所观察到的水平，表明：在反应剂解离和信号转导破坏后细胞保持应答和健康，且能够流出钙，并应答离子霉素以表现出与初始刺激后所观察到类似水平的胞内水平。
实施例27：通过用可逆作用剂孵育按时控制活化T细胞后对T细胞扩增的评估
在用抗CD3/抗CD28信号孵育并对其进行解离后，评估了分离自健康供体的PBMC T细胞的扩增。加入包含可逆结合于寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂的多聚化抗CD3/抗CD28Fab片段的反应剂后，将T细胞孵育7天。在培养的第1天，加入D-生物素解离多聚化作用剂，或不破坏细胞(在第1天不加入D-生物素)。作为对照，用抗CD3/抗CD28磁珠孵育细胞7天。在培养的第0、3或7天评估总细胞计数和膜联蛋白V阳性细胞级分。如图28A和28B所示，与其中细胞用多聚化作用剂完整孵育7天的培养物(不加入D-生物素)相比以及与其中细胞用对照抗CD3/抗CD28珠孵育的培养物相比，用抗CD3/抗CD28多聚化作用剂培养并在第1天解离(在第1天加入生物素)的CD3+T细胞显示扩增提高和凋亡减少(如膜联蛋白V染色减少所指示)。
在另一测试中，用CFSE染料标记分离的CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞，在刺激后评估增殖(如上所述)，除了在第2天加入生物素。就CFSE染料稀释程度通过流式细胞术测定增殖。如图29所示，与用多聚化作用剂刺激但不破坏信号(不加生物素)的细胞相比，用抗CD3/抗CD28多聚化反应剂刺激、并在第一天解离(加入生物素)的CD3+细胞显示出提高的增殖。
实施例28：通过用可逆作用剂孵育按时控制活化后对T细胞中代谢活性的评估
通过监测使稳定四唑盐WST-1裂解为可溶甲染料复合物的比色法评估作为细胞增殖指示的细胞代谢活性。由于该试剂的裂解通常依赖于活细胞中NAD(P)H的糖酵解生产，甲/>染料程度通常可与培养物中代谢活性细胞数直接关联。在本研究中，用可逆结合于寡聚链霉亲和素突变蛋白反应剂的抗CD3/抗CD28多聚化Fab片段或用对照抗CD3/抗CD28磁珠反应剂孵育CD4-或CD8-纯化T细胞(在第2天加或不加D-生物素)。在孵育细胞第1、第2或第3天后，用WST-1反应剂孵育细胞，通过测定450nm处的吸光度作为读出评估代谢活性水平。基于所测试培养物中细胞数标准化所得结果，并表示为WST-1/细胞数的比值。
如图30所示，结果表明：在本研究的整个孵育过程中，即便在第2天加入生物素解离反应剂并破坏信号转导的情况下，用抗CD3/抗CD28多聚化反应剂受控刺激T细胞使得指示代谢活性和细胞扩增的信号水平提高。
实施例29：经抗CD3/抗CD28多聚化作用剂破坏信号转导对再刺激的T细胞扩增能力的影响
在包含多聚化抗CD3/抗CD28 Fab片段(可逆结合于寡聚形式的链霉亲和素突变蛋白上)的可逆反应剂的存在下，培养用CFSE染料标记的CD3+细胞。在第1天在图31所示的一些样品中加入D-生物素。在所指示的一些条件下，在第3天分选细胞以选出CFSE低(未分裂)的细胞。分选的细胞在如下条件下培养：不含另加的刺激物(分选纯化的，参见图31)，或进一步与额外的抗CD3/抗CD28多聚化作用剂混合(分选纯化，再刺激，参见图31)。对未分选的细胞(在第3天未基于CFSE水平分选的细胞)也进行平行评估。监测细胞扩增(基于未刺激细胞标准化)直至第15天。
如图31所示，对于所测试的所有条件，在研究的整个过程中直至第15天，观察到用多聚化反应剂孵育的细胞持续扩增。即便在第1天破坏了由多聚化作用剂诱导的信号转导的样品中以及细胞经分选纯化且不进一步加入额外反应剂的样品中，在整个时间过程中持续增殖。该结果表明用寡聚刺激反应剂孵育，即便仅1天，也能在15天期间诱导常持续的T细胞扩增。即便在其中细胞已在第3天被分选纯化以分离未分裂细胞、且其中不重新加入该反应剂或其他刺激性反应剂进行进一步刺激的样品中也观察到该效果。该结果与如下结论是一致的：可逆寡聚刺激剂能够在破坏反应剂结合和/或纯化未分裂细胞后的数日内、在不加入额外反应剂进行诱导的条件下诱导持续的T细胞扩增，在用珠刺激细胞的条件下进行的本测试中未观察到该效果。
实施例30：通过用可逆作用剂孵育按时控制活化后对T细胞表面标记物的评估
在各种条件下对T细胞进行刺激后评估了各种T细胞标志物的表达，所述条件包括：各类逆转录病毒介导的转导，用可逆结合抗CD3/抗CD28的多聚化作用剂孵育，在第1天进行或不进行由加入D-生物素诱导的解离。用各种逆转录病毒载体颗粒转导获自健康供体源的外周血单核细胞(PBMC)的CD3纯化T细胞，所述载体颗粒各自编码不同的嵌合抗原受体、在培养物中扩增、冷冻并解冻。加入实施例1所述反应剂后孵育细胞7天，所述反应剂包含通过可逆结合寡聚链霉亲和素突变蛋白而多聚化的多聚化抗CD3/抗CD28 Fab片段。在培养的第1天，在一些样品中加入D-生物素从细胞解离多聚化作用剂，而不对其他细胞和反应剂进行破坏(在第1天不加入D-生物素)。在其他样品中，用抗CD3/抗CD28磁珠孵育细胞7天。在不同时间测试多种T细胞活化和/或其他表型标志物各自的表面和/或胞内表达阳性细胞的百分比。
例如，在第7天，通过流式细胞术如所述测试细胞中标志物Ki-67和T-bet的表达。如本文其他研究中所述，用可逆寡聚反应剂刺激后，当在第1天解离该反应剂以破坏信号转导，观察到细胞的ki67保持阳性，但T-bet表达减少。该结果表明：在各种条件下，通过解离反应剂进行按时控制能用于产生其中细胞具有少分化或干细胞样表型、更多长寿和/或中心记忆和/或中心记忆干(细胞)表型的产出组合物。
所评估的其他标志物包括CD25和CD69以及标志物CD45RA、CD45RO、CD27、CD127和CXCR3，通过流式细胞术在第3天和第7天对其进行评估。结果为如下观察结果：在培养期间的第1天破坏可逆刺激性反应剂的结合使得所得产出组合物中的T细胞百分比更大，该产出组合物具有通常在少分化和/或相对长寿和/或干细胞样T细胞群(例如中心记忆(TCM)和少分化记忆T细胞，如所谓的记忆T干细胞(TSCM))中所观察到的表型谱特征。这些研究还与如下观察结合一致：通过在较早时间点(4天内)加入D-生物素对采用寡聚反应剂的刺激进行按时控制获得了具有如下特性的细胞组合物：该细胞组合物中具有与少分化、长寿T细胞群(例如长寿记忆T细胞)中所存在的表型谱一致或类似的表型谱的细胞增加。
本发明并不意在将范围限制于具体公开的实施方式，这些实施方式仅为提供，例如，对于本发明不同方面的说明。本文所述的组合物和方法的各种修饰将在本文的说明和启示后变得显而易见。可实施这类变化而不偏离本公开的真正范围和精神，并且落入本发明的范围内。
序列
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Claims (256)
1.一种用于培养T细胞的方法，所述方法包括：
(a)在受体结合剂的存在下孵育包含T细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的反应剂，且ii)能够以诱导或调节所述组合物中T细胞中信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的分子；和
b)在开始所述孵育后5天内，破坏所述受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合，由此产生培养的T细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，孵育在一定条件下进行，在该条件下所述受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的信号。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述破坏在开始所述孵育后大于30分钟时发生。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中：
所述破坏在开始所述孵育后1小时～4天时进行，在开始所述孵育后6小时～3天时进行，在开始所述孵育后12小时～2天时进行，在开始所述孵育后1天～3天时进行；或
所述破坏在开始所述孵育后约1小时～约4天时进行，在开始所述孵育后约6小时～约3天时进行，在开始所述孵育后约12小时～约2天时进行，在开始所述孵育后约1天～约3天时进行；或
所述破坏在所述孵育开始后的大于或等于约1小时且在所述孵育开始后的1天、2天、3天或4天内进行。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂与所述分子的结合在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
所述受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
所述受体结合剂特异性结合CD3。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述分子是TCR/CD3复合物的组成部分或是CD3。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述分子是第一分子，且所述受体结合剂还能特异性结合一个或多个所述T细胞表面上的第二分子，其中第二分子可选地能够诱导或增强、抑制或改变通过T细胞中所述第一分子递送的信号。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂包含结合伴侣C1；且
多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂与反应剂之间的可逆键。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括使细胞接触包含物质的组合物，所述物质能够逆转所述受体结合剂和反应剂之间的键。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是第一受体结合剂，且在第二受体结合剂的存在下进一步进行孵育，该第二受体结合剂能够特异性结合于一个或多个T细胞表面上的第二分子。
11.如权利要求10所述的方法，其中，第二受体结合剂与第二分子的结合促进、抑制、或改变通过T细胞中第一分子递送的信号。
12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中，所述反应剂包含能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点，由此所述第二受体结合剂可逆结合所述反应剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中，能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点与能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点可相同或不同。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中：
第二受体结合剂包含结合伴侣C1或C2，其能够可逆结合所述两个或多个结合位点Z1，由此第一和第二受体结合位点通过所述两个或多个结合位点Z1可逆结合所述反应剂；和/或
第二受体结合剂包含结合伴侣C2，所述反应剂还包含多个结合位点Z2，其能够可逆结合结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键。
15.如权利要求14所述的方法，其中：
C1和C2相同或基本相同、或者包含相同或基本相同的部分；和/或
Z2和Z1相同或基本相同、或者包含相同或基本相同的部分。
16.如权利要求10或权利要求11中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是第一反应剂，且所述孵育在至少一种第二反应剂的存在下进行，该第二反应剂可逆结合第二受体结合剂。
17.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中，孵育在一定条件下进行，在该条件下第二受体结合剂特异性结合于第二分子，由此诱导或调节T细胞中的第二信号。
18.如权利要求10-17中任一项所述的方法，其中，第二信号增强、抑制或改变T细胞中通过第一分子递送的信号。
19.如权利要求10-18中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括：将组合物加入细胞，该组合物含有能逆转第一受体结合剂和反应剂之间的键和/或第二受体结合剂和反应剂之间的键的物质。
20.如权利要求10-19中任一项所述的方法，其中，所述破坏终止或减弱由第一受体结合剂诱导或调节的信号，且终止或减弱由第二受体结合剂诱导或调节的信号。
21.一种用于培养T细胞的方法，所述方法包括：
(a)在如下物质的存在下孵育包含T细胞的组合物：
i)第一受体结合剂，其以诱导或调节所述T细胞中TCR/CD3复合物相关信号的方式特异性结合所述T细胞表面上表达的第一分子；和
ii)第二受体结合剂，其中，所述第二受体结合剂i)可逆结合包含能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点的反应剂，且ii)能够以诱导或调节所述组合物中T细胞中第二信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的第二分子；和
(b)在开始所述孵育后5天内，破坏第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合，由此产生培养的T细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中，第二信号增强、抑制或改变T细胞中通过第一分子递送的信号。
23.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中，在第一受体结合剂特异性结合第一分子和/或第二受体结合剂特异性结合第二分子的条件下进行孵育，由此诱导或调节T细胞中的一种或多种信号。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中，所述破坏在开始所述孵育后大于30分钟时发生。
25.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中：
所述破坏在开始所述孵育后1小时～4天时进行，在开始所述孵育后6小时～3天时进行，在开始所述孵育后12小时～2天时进行，在开始所述孵育后1天～4天时进行；或
所述破坏在开始所述孵育后约1小时～约4天时进行，在开始所述孵育后约6小时～约3天时进行，在开始所述孵育后约12小时～约2天时进行，在开始所述孵育后约1天～约3天时进行；或
所述破坏在所述孵育开始后的大于或等于约1小时且在所述孵育开始后的1天、2天、3天或4天内进行。
26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂包含结合伴侣C1；且
多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第二受体结合剂与反应剂之间的可逆键。
27.如权利要求7-26中任一项所述的方法，其中：
所述第二信号是除了TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号；
所述第二信号能够增强或加强TCR/CD3复合物相关信号；或
所述第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子、或是TNF家族或TNF受体家族成员。
28.如权利要求7-27中任一项所述的方法，其中，所述第二分子选自：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。
29.如权利要求7-28中任一项所述的方法，其中，所述第二分子是CD28。
30.如权利要求7-29中任一项所述的方法，其中，第二分子是粘附分子或包含粘附分子，或是诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
31.如权利要求27或权利要求30所述的方法，其中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。
32.如权利要求27、30和31中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。
33.如权利要求27和30-32中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
34.如权利要求27或权利要求30所述的方法，其中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。
35.如权利要求27、30和34中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
36.如权利要求27、30、34和35中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
37.如权利要求27或权利要求30所述的方法，其中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。
38.如权利要求27、30和37中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂是特异性结合选自下组的趋化因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
39.如权利要求27、30、37和38中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
40.如权利要求27或权利要求30所述的方法，其中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。
41.如权利要求27、30和40中任一项所述的方法，其中，所述粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
42.如权利要求27或权利要求30所述的方法，其中，所述因子是核因子。
43.如权利要求27、30或权利要求42所述的方法，其中，所述因子是维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
44.如权利要求7-43中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括使细胞接触包含物质的组合物，所述物质能够逆转第二受体结合剂和反应剂之间的键。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述破坏终止或减弱由第二受体结合剂诱导或调节的信号。
46.如权利要求44或权利要求45所述的方法，其中，第二分子是CD28，该破坏在T细胞内终止或减弱CD28共刺激信号。
47.如权利要求7-46中任一项所述的方法，其中，所述孵育进一步在第三受体结合剂的存在下进行，该第三受体结合剂能特异性结合一个或多个T细胞表面上的第三分子。
48.如权利要求47所述的方法，其中：
第一受体结合剂以诱导或调节所述T细胞中TCR/CD3复合物相关信号的方式特异性结合所述T细胞表面上表达的第一分子；
第二受体结合剂特异性结合第二分子，从而诱导或调节T细胞中的第二信号；和
第三受体结合剂特异性结合T细胞表面上的第三分子，所述第三分子诱导或调节所述细胞中的其他信号。
49.如权利要求47或权利要求48所述的方法，其中，第一分子是CD3。
50.如权利要求47-49中任一项所述的方法，其中，第二信号增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号。
51.如权利要求47-50中任一项所述的方法，其中，第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子、或是TNF家族或TNF受体家族成员。
52.如权利要求47-51中任一项所述的方法，其中，第二分子选自：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。
53.如权利要求47-52中任一项所述的方法，其中，第二分子是CD28。
54.如权利要求47-53中任一项所述的方法，其中，第三分子是细胞因子受体、趋化因子受体，或是粘附分子或包含粘附分子，或是诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
55.如权利要求54所述的方法，其中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。
56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中：
第三受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或
第三受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。
57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中：
第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或
第三受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
58.如权利要求54所述的方法，其中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。
59.如权利要求54或权利要求58所述的方法，其中：
第三受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或
第三受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
60.如权利要求54、58和59中任一项所述的方法，其中：
第三受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或
第三受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
61.如权利要求54所述的方法，其中，第三受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。
62.如权利要求54或权利要求61所述的方法，其中：
第三受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或
第三受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
63.如权利要求54、61和62中任一项所述的方法，其中：
第三受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或
第三受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
64.如权利要求54所述的方法，其中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。
65.如权利要求54或权利要求64所述的方法，其中，所述粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
66.如权利要求54所述的方法，其中，所述因子是核因子。
67.如权利要求54或权利要求66所述的方法，其中，所述因子是维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
68.如权利要求47-67中任一项所述的方法，其中：
第三受体结合剂可能结合第一反应剂或第二反应剂；或
孵育在可逆结合第三受体结合剂的其他反应剂的存在下进行。
69.如权利要求1-68中任一项所述的方法，包括：在所述破坏后，进一步孵育包含所述T细胞的组合物。
70.如权利要求69所述的方法，其中：
所述孵育和进一步孵育在相同的容器中进行；和/或
所述进一步孵育在所述物质的存在下进行；和/或
所述方法不包括：在进一步孵育前，从细胞组合物中去除所述物质、受体结合剂、第二受体结合剂和/或反应剂。
71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其中：
所述孵育和/或进一步孵育在37℃±2℃或约37℃±2℃下进行；和/或
所述孵育和/或进一步孵育在能够将信号递送到T细胞的其他作用剂的存在下进行。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述其他作用剂能够增强或诱导T细胞、CD4+细胞和/或CD8+细胞的增殖。
73.如权利要求72所述的方法，其中，所述其他作用剂是选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。
74.如权利要求69-73中任一项所述的方法，其中，所述进一步孵育的进行时间不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过8天或不超过6天。
75.一种用于培养T细胞的方法，包括：
在特异性结合T细胞表面上CD28分子的受体结合剂的存在下，在使所述细胞中通过CD28的信号转导发生的条件下，孵育包含T细胞的组合物；和
在所述孵育开始后5天内，消除或减少所述受体结合剂和CD28分子的结合，由此终止或减少所述细胞中的CD28信号转导，从而产生培养的T细胞。
76.如权利要求75所述的方法，其中，所述消除或减弱在开始孵育后4天内、3天内、2天内或1天内产生。
77.如权利要求75或权利要求76所述的方法，其中，所述消除或减弱包括：
洗涤所述细胞，由此从组合物中去除或减少未特异性结合CD28的任何受体结合剂；或
逆转所述受体结合剂和CD28分子间的结合相互作用，可选地进一步包括洗涤所述细胞以去除或减少组合物中的受体结合剂。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其中，在孵育的至少部分期间和/或在孵育后，在特异性结合TCR/CD3复合物的分子的作用剂的存在下，孵育组合物中的T细胞，由此诱导或调节所述细胞中TCR/CD3复合物相关的信号。
79.一种培养目标细胞的方法，包括：在受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的反应剂，且ii)以诱导或调节目标细胞中信号和/或改变目标细胞功能的方式特异性结合所述目标细胞表面上除CD28、CD3、或CD40以外的分子，从而产生培养的目标细胞。
80.如权利要求79所述的方法，其中，所述分子不是CD137和/或所述受体结合剂不特异性结合CD137。
81.如权利要求79或权利要求80所述的方法，其中，孵育在一定条件下进行，在该条件下所述受体结合剂特异性结合于所述分子，由此诱导或调节目标细胞中的信号。
82.如权利要求79-81中任一项所述的方法，其中，所述信号不是TCR/CD3复合物相关的信号。
83.如权利要求79-82中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成所述受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
84.如权利要求79-83中任一项所述的方法，其中：
所述分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或
所述受体结合剂特异性结合CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。
85.如权利要求79-84中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是第二受体结合剂，所述分子是第二分子，孵育在第一受体结合剂的存在下进一步进行，所述第一受体结合剂能够特异性结合一个或多个T细胞表面上的第一分子，该第一分子可选地能够诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的第一信号。
86.如权利要求85所述的方法，其中：
所述第一受体结合剂可逆结合所述反应剂，所述反应剂包含针对第一受体结合剂和第二受体结合剂的多个结合位点；或
第一受体结合剂可逆结合第二反应剂，所述第二反应剂包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点。
87.如权利要求85或权利要求86所述的方法，其中：
第一受体结合剂能够在所述T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
第一受体结合剂特异性结合CD3。
88.如权利要求85-87中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号；或
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强或强化TCR/CD3复合物相关的信号。
89.一种用于培养T细胞的方法，包括在如下物质的存在下孵育包含T细胞的组合物：
i)第一受体结合剂，其中，所述第一受体结合剂i)可逆结合包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点的反应剂，且ii)能够以诱导或调节所述组合物中T细胞中TCR/CD3复合物相关信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的第一分子；和
ii)第二受体结合剂，其中，所述第二受体结合剂i)可逆结合(a)反应剂，所述反应剂进一步包含针对第二受体结合剂的多个结合位点，或(b)第二反应剂，其包含能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点，且ii)以诱导或调节所述组合物中T细胞中第二信号的方式特异性结合所述T细胞表面上的第二分子，以及
其中，所述孵育在如下条件下进行：所述条件使得所述信号和/或第二信号在组合物中的T细胞中被诱导或调节，由此产生培养的T细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其中，第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员和/或第一受体结合剂特异性结合CD3。
91.如权利要求89或权利要求90所述的方法，其中：
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够诱导或调节除TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号；和/或
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强、抑制或改变通过第一分子递送的信号；或
第二受体结合剂与第二分子的特异性结合能够增强或强化TCR/CD3复合物相关的信号。
92.如权利要求85-91中任一项所述的方法，其中：
所述第二分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或
第二受体结合剂特异性结合CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。
93.如权利要求85-92中任一项所述的方法，其中，所述第二分子不是CD137和/或第二受体结合剂不特异性结合CD137。
94.如权利要求85-93中任一项所述的方法，其中：
第一受体结合剂和第二受体结合剂可逆结合所述反应剂；以及
以下之一：
i)第一受体结合剂和第二受体结合剂各自独立地包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
ii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1和结合伴侣C2以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
iii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1以及两个或多个结合位点Z2，其中Z1各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键，Z2各自能够结合于结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键。
95.如权利要求79-83中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。
96.如权利要求79-83和95中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。
97.如权利要求79-83、95和96中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
98.如权利要求79-83中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。
99.如权利要求79-83和98中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
100.如权利要求79-83、98和99中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
101.如权利要求79-83中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。
102.如权利要求79-83和101中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
103.如权利要求79-83、101和102中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
104.如权利要求79-83中任一项所述的方法，其中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。
105.如权利要求79-83和104中任一项所述的方法，其中，所述粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
106.如权利要求79-83中任一项所述的方法，其中，所述因子是核因子。
107.如权利要求79-83和106中任一项所述的方法，其中，所述因子是维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
108.如权利要求79-83和95-107中任一项所述的方法，其中，孵育在如下条件下进行：在所述条件下，受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节目标细胞中的信号和/或改变目标细胞中的功能。
109.如权利要求79-83和95-108中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成所述受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
110.如权利要求79-83和95-109中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是额外受体结合剂，所述分子是额外分子，所述孵育在第一受体结合剂的存在下进一步进行，所述第一受体结合剂能够特异性结合一个或多个T细胞表面上的第一分子，该第一分子可选地能够诱导或调节组合物中一个或多个T细胞中的第一信号。
111.如权利要求110所述的方法，其中：
第一受体结合剂可逆结合所述反应剂，所述反应剂包含针对第一受体结合剂和第二受体结合剂的多个结合位点；或
第一受体结合剂可逆结合第二反应剂，所述第二反应剂包含能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点。
112.如权利要求110或权利要求111所述的方法，其中：
第一受体结合剂能够在所述T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
第一受体结合剂特异性结合CD3。
113.如权利要求110-112中任一项所述的方法，其中，第一受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C2以形成所述受体结合剂和反应剂之间的可逆键。
114.如权利要求110-113中任一项所述的方法，其中，在第二受体结合剂的存在下进行进一步孵育，所述第二受体结合剂能够可逆结合一个或多个T细胞表面上的第二分子，所述第二分子可选地能够诱导或调节组合物中目标细胞中的信号，从而增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
115.如权利要求114所述的方法，其中：
所述第二信号是除了TCR/CD3复合物相关信号以外的其他信号；
所述第二信号能够增强或加强TCR/CD3复合物相关信号；或
所述第二分子是共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子、或是TNF家族或TNF受体家族成员。
116.如权利要求114或权利要求115所述的方法，其中：
所述第二分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或
第二受体结合剂特异性结合CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。
117.如权利要求114-116中任一项所述的方法，其中，所述第二分子选自CD28和CD137。
118.如权利要求114-117中任一项所述的方法，其中，第二分子是CD28。
119.一种用于培养目标细胞的方法，包括：在一种或多种受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，其中，所述受体结合剂i)可逆结合反应剂，所述反应剂为包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白；且ii)以诱导或调节所述组合物中目标细胞中信号的方式特异性结合目标细胞表面上的分子，其中，所述链霉亲和素突变蛋白包含净负电荷或其等电点小于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示链霉亲和素突变蛋白等电点，由此产生培养的目标细胞。
120.一种用于培养目标细胞的方法，包括：在一种或多种受体结合剂的存在下孵育包含目标细胞的组合物，所述受体结合剂i)可逆结合反应剂，所述反应剂为包含能够可逆结合所述受体结合剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白；且ii)以诱导或调节所述组合物中目标细胞中信号的方式特异性结合目标细胞表面上的分子，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白对包含氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:8)的链霉亲和素结合肽的亲和力高于包含SEQ ID NO:1-6中任一项所示氨基酸序列的链霉亲和素或突变蛋白，从而产生培养的目标细胞。
121.如权利要求119或权利要求120所述的方法，其中，所述孵育在一定条件下进行，在该条件下所述受体结合剂特异性结合所述分子，由此诱导或调节组合物中一个或多个目标细胞中的信号。
122.如权利要求119-121中任一项所述的方法，其中：
所述多个结合位点包含两个或更多个结合位点Z1；和
所述结合受体剂包含结合伴侣C1，其能够可逆结合结合位点Z1，其中C1和Z1之间的可逆结合引起所述受体结合剂和所述反应剂之间的可逆结合。
123.如权利要求122所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含多个结合位点Z1，其中多个受体结合剂可逆结合所述反应剂。
124.如权利要求79-88和95-123中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞包括免疫细胞。
125.如权利要求79-88和95-124中任一项所述的方法，其中：
所述目标细胞包括血细胞；
所述目标细胞包括白细胞；
所述目标细胞包括淋巴细胞；
所述目标细胞包括B细胞；
所述目标细胞包括B细胞群；
所述目标细胞包括T细胞；
所述目标细胞包括T细胞群；和/或
所述目标细胞包括天然杀伤(NK)细胞。
126.如权利要求79-88和95-125中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞包括：抗原特异性T细胞或其细胞群、辅助T细胞或其细胞群，细胞毒性T细胞或其细胞群、记忆T细胞或其细胞群、调节性T细胞或其细胞群、NK细胞或其细胞群、抗原特异性B细胞或其细胞群、记忆B细胞或其细胞群、或调节性B细胞或其细胞群。
127.如权利要求79-88和95-126中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞是T细胞。
128.如权利要求79-88和95-127中任一项所述的方法，其中，所述分子递呈在T细胞表面上，且所述受体结合剂能够诱导或调节所述组合物中T细胞中的信号。
129.如权利要求79-88和95-128中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关的信号；和/或
所述受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员；和/或
所述受体结合剂特异性结合CD3。
130.如权利要求79-88和95-129中任一项所述的方法，其中，所述分子是第一分子，且受体结合剂能够特异性结合一个或多个目标细胞表面上的第一分子以及第二分子，其中与第二分子的结合诱导或调节目标细胞中的信号。
131.如权利要求130所述的方法，其中，第二分子的结合可选地能够增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
132.如权利要求79-88和95-129中任一项所述的方法，其中，所述受体结合剂是第一受体结合剂，所述孵育进一步在第二受体结合剂的存在下进行，所述第二受体结合剂能够特异性结合一个或多个所述目标细胞表面上的第二分子，与第二分子的结合可选地能够诱导或调节目标细胞中的信号。
133.如权利要求132所述的方法，其中，第二分子的结合可选地能够增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
134.如权利要求132或权利要求133所述的方法，其中，孵育在一定条件下进行，在该条件下第二受体结合剂特异性结合于第二分子，由此诱导或调节组合物中目标细胞中的信号。
135.如权利要求134所述的方法，其中，第二分子的结合增强、减弱或改变通过第一分子递送的信号。
136.如权利要求132-135中任一项所述的方法，其中，链霉亲和素突变蛋白或类似物包括能够可逆结合第二受体结合剂的多个结合位点，由此所述第二受体结合剂可逆结合所述链霉亲和素突变蛋白或类似物。
137.如权利要求136所述的方法，其中，第二受体结合剂包括结合伴侣C1或C2，其能够可逆结合链霉亲和素类似物或突变蛋白中存在的所述两个或更多个结合位点Z2。
138.如权利要求130-137中任一项所述的方法，其中：
第二分子选自：CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM；和/或
第二受体结合剂特异性结合CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。
139.如权利要求130-138中任一项所述的方法，其中，第二分子是CD28。
140.如权利要求130-138中任一项所述的方法，其中：
第二分子选自CD40和CD137；和/或
第二受体结合剂特异性结合CD40或CD137。
141.如权利要求130-137中任一项所述的方法，其中，第二分子是粘附分子或包含粘附分子，或是诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
142.如权利要求130-137和141中任一项所述的方法，其中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。
143.如权利要求130-137、141和142中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。
144.如权利要求130-137、141和142中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
145.如权利要求130-137和141中任一项所述的方法，其中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。
146.如权利要求130-137和145中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
147.如权利要求130-137、145和146中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
148.如权利要求130-137和141中任一项所述的方法，其中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。
149.如权利要求130-137和148中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
150.如权利要求130-137、145和146中任一项所述的方法，其中：
第二受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
151.如权利要求130-137和141中任一项所述的方法，其中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。
152.如权利要求130-137、141和151中任一项所述的方法，其中，所述粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
153.如权利要求130-137和141中任一项所述的方法，其中，所述因子是核因子。
154.如权利要求130-137、141和153中任一项所述的方法，其中，所述因子是维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
155.如权利要求10-78、85-94和116-154中任一项所述的方法，其中，第二受体结合剂包括多种不同的受体结合剂，其各自能够独立地结合组合物中T细胞表面上相同或不同的第二分子，从而共同诱导或调节细胞中的一个或多个信号。
156.如权利要求1-155中任一项所述的方法，还包括破坏第一和/或第二受体结合剂与所述反应剂之间的可逆结合。
157.如权利要求156所述的方法，其中，所述破坏在开始孵育后14天内进行，在开始孵育后12天内进行，在开始孵育后10天内进行，在开始孵育后8天内进行，或在开始孵育后6天内进行。
158.如权利要求1-157中任一项所述的方法，其中，至少一部分孵育在能够将信号递送到T细胞的其他作用剂的存在下进行。
159.如权利要求158所述的方法，其中，所述其他作用剂能够增强或诱导T细胞、CD4+细胞和/或CD8+细胞的增殖。
160.如权利要求158或权利要求159所述的方法，其中，所述其他作用剂是选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。
161.如权利要求158-160中任一项所述的方法，其中，所述其他作用剂不特异性结合CD28和/或诱导CD28信号转导。
162.如权利要求1-161中任一项所述的方法，其中，所述T细胞或目标细胞是获自对象的原代细胞。
163.如权利要求1-162中任一项所述的方法，其中，所述T细胞或目标细胞是直接分离自对象。
164.如权利要求1-93和127-163中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是未分级的T细胞，富含CD3+T细胞或为分离的CD3+T细胞，富含CD4+T细胞或为分离的CD4+T细胞，或富含CD8+T细胞或为分离的CD8+T细胞。
165.如权利要求1-93和127-164中任一项所述的方法，其中，在孵育前，所述T细胞不富含CD62L+细胞和/或不富含初始T细胞。
166.如权利要求1-165中任一项所述的方法，其中，所述T细胞或目标细胞是人细胞。
167.如权利要求1-166中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm；或
所述反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
168.如权利要求1-167中任一项所述的方法，其中：
在孵育过程中，所述反应剂不是或不结合于或接合于固体支持物、固定相、珠、微粒、磁性颗粒和/或基质；和/或
所述反应剂是柔性的，不含金属或磁性核心，完全或主要由有机多聚体组成，不为球形，基本上不为球形或形状不均一，和/或不坚硬。
169.如权利要求1-168中任一项所述的方法，其中，在所述孵育期间，所述反应剂不结合于支持物或固体支持物。
170.如权利要求1-168中任一项所述的方法，其中，在孵育的至少部分过程中，所述反应剂结合于支持物，由此在孵育的至少部分过程中多个T细胞或目标细胞可逆固定在支持物上。
171.如权利要求170所述的方法，其中：
所述支持物为或包含固定相；和/或
所述支持物为或包含固体支持物。
172.如权利要求1-171中任一项所述的方法，其中，各受体结合剂自独立地选自：抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子、包含Ig结构域的分子、细胞因子、趋化因子、适体、和MHC分子、及其结合片段。
173.如权利要求1-172中任一项所述的方法，其中：
所述受体结合剂包含抗体片段；
所述受体结合剂包含Fab片段；
所述受体结合剂为选自F(ab')2片段和二价单链Fv(scFV)片段的二价抗体片段；
所述受体结合剂为选自Fab片段、Fv片段或scFV片段的单价抗体片段；和/或
所述受体结合剂为选自下组的具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子：适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、糖体、基于锚定蛋白骨架的蛋白质、基于晶体骨架的蛋白质、附着连接蛋白和阿维多聚体。
174.如权利要求1-118和155-173中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是或含：可逆结合生物素、生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合链霉亲和素结合肽的亲和素或链霉亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的反应剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。
175.如权利要求1-118和155-174中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂为或包含：可逆结合生物素或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白。
所述反应剂为或包含：可逆结合生物素类似物或其生物活性片段的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白；和/或
所述反应剂为或包含：可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素类似物或突变蛋白或亲和素类似物或突变蛋白。
176.如权利要求1-118和155-175中任一项所述的方法，其中，所述反应剂是或含如下物质的寡聚体或多聚体：可逆结合生物素、或其生物活性片段的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白；可逆结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素或亲和素类似物或突变蛋白；包含至少两个螯合基团K的反应剂，其中所述至少两个螯合基团能够结合过渡金属离子；能够结合寡聚组氨酸亲和标签的物质；能够结合谷胱甘肽-S转移酶的物质；钙调蛋白或其类似物；能够结合钙调蛋白结合肽(CBP)的物质；能够结合FLAG肽的物质；能够结合HA标签的物质；能够结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的物质；能够结合HSV表位的物质；能够结合myc表位的物质；或能够结合生物素化载体蛋白的物质。
177.如权利要求1-118和155-176中任一项所述的方法，其中，所述反应剂包括：链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、或和亲和素类似物或突变蛋白的寡聚体或多聚体。
178.如权利要求1-177中任一项所述的方法，其中，所述反应剂包含链霉亲和素类似物或突变蛋白的寡聚体或多聚体。
179.如权利要求176、177和178中任一项所述的方法，其中，寡聚体或多聚体中的个体分子通过多糖或双官能接头交联。
180.如权利要求174-179中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素结合肽选自下组：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
181.如权利要求1-180中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂包含链霉亲和素类似物或突变蛋白，其在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素中的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47；或
所述链霉亲和素类似物或突变蛋白在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的链霉亲和素中的第44-47位的序列位置处包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47。
182.如权利要求1-118和155-181中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
a)SEQ ID NO:3-6、27和28中任一项所示的氨基酸序列；
b)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3-6、27和28中任一序列显示至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列相同性、且包含对应于Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47的氨基酸序列、且可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽；或
c)a)或b)的功能性片段，其可逆结合生物素或其生物活性形式、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。
183.如权利要求181或权利要求182所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白还包含一处或多处氨基酸置换，所述置换的位置对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中链霉亲和素内第117、120和/或121位。
184.如权利要求183所述的方法，其中：
所述一处或多处氨基酸置换选自：Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或
所述一处或多处氨基酸置换为选自Glu117、Gly120或Tyr121中的一种或多种；或
所述氨基酸置换选自Glu117、Gly120或Tyr121。
185.如权利要求119-184中任一项所述的方法，其中，所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含：
SEQ ID NO:27或28所示的氨基酸序列；
b)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:28显示至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列相同性、且包含对应于Va144、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120和Tyr121的氨基酸序列、且可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽；或
c)a)或b)的功能性片段，其可逆结合生物素或其生物活性片段、生物素类似物或突变蛋白或其生物活性片段或链霉亲和素结合肽。
186.如权利要求1-118和155-185中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂是或包含链霉亲和素类似物或突变蛋白；且
所述结合伴侣C1和/或结合伴侣C2独立地包含选自下组的链霉亲和素结合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)。
187.如权利要求1-78和156-186中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括使细胞接触包含物质的组合物，所述物质能够逆转所述受体结合剂和反应剂之间的键。
188.如权利要求187所述的方法，其中，所述物质是游离结合伴侣和/或为竞争剂。
189.如权利要求187或权利要求188所述的方法，其中，所述物质在组合物中对T细胞或对目标细胞无害，和/或与在可比或相同条件下不含该物质分别孵育T细胞或目标细胞相比，加入该物质不会令存活T细胞或目标细胞百分比降至低于90％、80％、70％、60％或50％。
190.如权利要求1-78和156-189中任一项所述的方法，其中，该破坏终止或减少T细胞或目标细胞中由受体结合剂或第二受体结合剂中一者或两者诱导或调节的信号。
191.如权利要求1-190中任一项所述的方法，其中：
所述反应剂是或包括链霉亲和素类似物或突变蛋白或其生物活性片段；且
所述物质包含链霉亲和素结合肽、生物素或其生物活性片段、可选地D-生物素、或生物素类似物或生物活性片段。
192.如权利要求191所述的方法，其中：
所述物质是选自下组的链霉亲和素结合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQID NO:8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:18)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:19)；和/或
所述物质为C1或其类似物，或者为C2或其类似物。
193.如权利要求1-192中任一项所述的方法，其中：
所述结合位点Z1和所述结合伴侣C1之间可逆结合的解离常数(KD)和/或所述结合位点Z2和所述结合伴侣C2之间可逆结合的解离常数(KD)为10-2M～10-13M。
194.如权利要求1-193中任一项所述的方法，其中：
在孵育前，使细胞与特异性结合组合物中T细胞或目标细胞所含标志物的选择剂接触，从而产生或获得含有T细胞或目标细胞的组合物；或
至少部分孵育在选择剂的存在下进一步进行，所述选择剂特异性结合组合物中T细胞或目标细胞所含的标志物，其中培养的T细胞富集了含有该标志物的T细胞或目标细胞。
195.如权利要求194所述的方法，其中：
所述选择剂可逆结合所述反应剂，且所述反应剂还包含能够特异性结合该选择剂的多个结合位点；或
所述选择剂可逆结合其他反应剂，且所述其他反应剂还包含能够特异性结合该选择剂的多个结合位点。
196.如权利要求1-195中任一项所述的方法，其中，与没有信号的诱导或调节下的T细胞孵育相比，所述信号的诱导或调节使得培养T细胞的扩增和/或活化增加。
197.如权利要求196所述的方法，其中，所述增加为至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
198.如权利要求7-197中任一项所述的方法，其中，与没有额外或第二信号的诱导或调节下的T细胞孵育相比，所述额外或第二信号的诱导或调节使得培养T细胞的扩增和/或活化增加。
199.如权利要求198所述的方法，其中，所述增加为至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
200.如权利要求1-199中任一项所述的方法，其中，所述方法增加组合物中T细胞的扩增和/或增殖，改变组合物中T细胞的代谢谱，改变组合物中CD8+T细胞的亚组；和/或，增加组合物中长寿记忆T细胞，以上各自与孵育前组合物中的T细胞相比，与孵育后但未进行破坏或孵育后但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的物质的存在下相比。
201.如权利要求1-200中任一项所述的方法，其中，所述方法获得培养的T细胞，其中：
分别与孵育前、孵育后但未进行破坏、或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的物质存在下进行孵育后的组合物中的CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+细胞的数量或百分比相比，CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+细胞的数量或百分比提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍；
与孵育前、孵育后但未进行破坏、或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的作用剂存在下进行孵育后的组合物中的CD8+细胞比例或相对比例或标准化比例相比，CD8+T细胞的比例或相对比例或标准化比例提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
与孵育前、孵育后但未进行破坏、或在类似但在特异性结合CD28和/或诱导或调节CD28信号转导的物质存在下进行孵育后的组合物中的相应细胞群体，CD62L+、长寿记忆T细胞或记忆干细胞(Tscm))的数量或百分比相比，CD62L+、可选的长寿记忆T细胞或记忆干细胞Tscm的数量或百分比提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
202.如权利要求1-201中任一项所述的方法，其中，培养的T细胞包含多于35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％含CD62L表面阳性表型(CD62L+)的T细胞亚组，以占组合物中总T细胞或占组合物中总细胞的百分比计。
203.如权利要求202所述的方法，其中，所述T细胞亚组还包含如下表型：
a)CD127+；和/或
b)CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的任何一种或多种，以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的任何一种或多种。
204.如权利要求202或权利要求203所述的方法，其中，所述T细胞亚组：
a)包含低水平的TCR重排删除环(TREC)；和/或
b)表达增殖标志物，其可选地为Ki-67；和/或
c)在刺激剂的存在下显示增殖能力；和/或
d)在刺激剂的存在下显示产生选自IFN-γ、TNF和IL-2的细胞因子的能力。
205.如权利要求204所述的方法，其中，所述刺激剂是抗原、稳态细胞因子，可选地IL-15和/或IL-17，或者是能够在T细胞中引发TCR/CD3复合物相关信号的物质。
206.如权利要求202-205中任一项所述的方法，其中，所述T细胞亚组为或含长寿记忆T细胞。
207.如权利要求202-206中任一项所述的方法，其中，所述T细胞亚组为或含记忆T干细胞(TSCM)。
208.如权利要求1-207中任一项所述的方法，还包括将重组核酸分子导入T细胞或目标细胞群，其中该核酸分子编码重组蛋白，由此细胞表达该重组蛋白。
209.如权利要求208所述的方法，其中，重组受体是嵌合抗原受体或转基因T细胞受体(TCR)。
210.如权利要求1-209中任一项所述的方法，其中，所述方法在体外或离体进行。
211.如权利要求1-210中任一项所述的方法，还包括将所述培养的细胞给予患有疾病或病症的对象。
212.一种组合物，其包含通过权利要求1-211中任一项所述的方法生产的多个培养的T细胞或目标细胞，以及可选的药学上可接受的赋形剂。
213.如权利要求212所述的方法，其中，加入所述物质后，细胞未在体外或离体于高于30℃的温度下孵育超过24小时、超过48小时、超过72小时或超过96小时。
214.一种制品，其包含：
a)反应剂，其包含能够结合受体结合剂的多个结合位点；
b)受体结合剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能够以诱导或调节T细胞中信号的形式特异性结合T细胞表面上的分子，其中，所述分子不是CD28、CD3或CD40。
215.如权利要求215中所述的制品，其中：
结合所述分子诱导或调节T细胞中除TCR/CD3复合物相关信号以外的信号；和/或
结合所述分子增强或强化TCR/CD3复合物相关信号。
216.如权利要求214或权利要求215所述的制品，其中，所述分子选自：CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40和HVEM。
217.如权利要求130-132中任一项所述的制品，其中，所述分子不是CD137。
218.如权利要求217所述的制品，其中，所述受体结合剂特异性结合细胞因子受体、特异性结合趋化因子受体，为粘附分子或包含粘附分子，或为诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
219.如权利要求214或218所述的制品，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2。
220.如权利要求214、218或219所述的制品，其中，
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1和TNFR2；和/或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17和TNF，或为其生物活性片段。
221.如权利要求214和218-220中任一项所述的制品，其中，
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：IL-12R、IFN-γR、IL-4R和IL-17R；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15和IL-17，或为其生物活性片段。
222.如权利要求214或权利要求218所述的制品，其中，第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)。
223.如权利要求214、218或222所述的制品，其中，
第二受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；和/或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
224.如权利要求214、218、222或223所述的制品，其中，
第二受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子受体：IL-7R、IL-21R和CD132(IL受体共同γ链)；或
第二受体结合剂为选自下组的配体：IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9和IL-15，或为其生物活性片段。
225.如权利要求214或权利要求218所述的制品，其中，所述受体结合剂特异性结合选自下组的趋化因子受体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4。
226.如权利要求214、218或225所述的制品，其中，
所述受体结合剂是特异性结合选自下组的细胞因子受体的配体：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
227.如权利要求214、218、225或226所述的制品，其中，
所述受体结合剂特异性结合选自下组的细胞因子：CXCR3、CCR7、CXCR1和CXCR4；或
所述受体结合剂为选自下组的配体：CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21和CCL25，或为其生物活性片段。
228.如权利要求214或权利要求218所述的制品，其中，所述粘附分子选自：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)和CD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)，或为其生物活性片段。
229.如权利要求214、218和228中任一项所述的制品，其中，所述粘附分子选自：LFA-1、L-选择素、VCAM-1和VLA-4，或为其生物活性片段。
230.如权利要求214或权利要求218所述的制品，其中，所述因子是核因子。
231.如权利要求214、218和230中任一项所述的制品，其中，所述因子是维甲酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)或RORα。
232.一种制品，其包含：
a)反应剂，其为包含能够结合作用剂的多个结合位点的链霉亲和素类似物或突变蛋白，其中所述链霉亲和素类似物或突变蛋白包含净负电荷、或显示的等电点小于包含SEQID NO:4或6所示氨基酸序列的链霉亲和素突变蛋白的等电点、和/或显示比包含SEQ IDNO:4或6任一所示氨基酸序列的链霉亲和素突变蛋白对包含氨基酸序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:8)的链霉亲和素结合肽的更高的亲和力；和
b)作用剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能特异性结合细胞表面上的分子。
233.如权利要求214-232中任一项所述的制品，其中：
所述受体结合剂或作用剂包含结合伴侣C1；且
所述多个结合位点包含两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成受体结合剂或作用剂与所述反应剂之间的可逆键。
234.如权利要求214-233中任一项所述的制品，其中，所述作用剂是选择剂或受体结合剂。
235.如权利要求234所述的制品，其中，所述作用剂是特异性结合如下分子的受体结合剂：所述分子为或包含TCR/CD3复合物成员、CD3、共刺激分子、辅助分子、细胞因子受体、趋化因子受体、免疫检查点分子，或为TNF家族或TNF受体家族成员，或者所述分子为或包含粘附分子，或者为诱导细胞因子产生、趋化因子产生和/或粘附分子表达的因子。
236.如权利要求214-235中任一项所述的制品，其中，所述受体结合剂是第二受体结合剂，且所述分子是第二分子，所述反应剂还包含：c)能够可逆结合第一受体结合剂的多个结合位点，和d)第一受体结合剂，其i)可逆结合所述反应剂，且ii)能够特异性结合T细胞表面上的第一分子。
237.如权利要求232或权利要求236所述的制品，其中，所述作用剂或第一受体结合剂特异性结合TCR/CD3复合物成员和/或第一受体结合剂特异性结合CD3。
238.如权利要求236或权利要求237所述的制品，其中：
i)第一受体结合剂和第二受体结合剂各自独立地包含结合伴侣C1，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
ii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1，它们各自能够结合于结合伴侣C1和结合伴侣C2以形成第一和第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键；或
iii)第一受体结合剂包含结合伴侣C1，第二受体结合剂包含结合伴侣C2，且多个结合位点包括两个或多个结合位点Z1以及两个或多个结合位点Z2，其中Z1各自能够结合于结合伴侣C1以形成第一受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键，Z2各自能够结合于结合伴侣C2以形成第二受体结合剂和所述反应剂之间的可逆键。
239.如权利要求214-238中任一项所述的制品，其中：
所述反应剂的大小为小于20nm、小于10nm、小于5nm或小于1nm；或
所述反应剂的密度小于1.2g/cm3或小于1.0g/cm3。
240.如权利要求214-239中任一项所述的制品，其中，所述反应剂不结合于支持物或固体支持物。
241.如权利要求214-240中任一项所述的制品，其中，所述反应剂不结合于或固定于支持物。
242.如权利要求241所述的制品，其中，所述支持物是固体支持物或固定相。
243.如权利要求241或权利要求242所述的制品，其中，所述支持物包括珠、颗粒、纳米颗粒或微球。
244.如权利要求214-243中任一项所述的制品，其中，所述作用剂单独选自抗体片段、单价抗体片段、具有抗体样结合特征的蛋白质类结合分子、包含Ig结构域的分子，及其结合片段。
245.如权利要求214-244中任一项所述的制品，其中，所述抗体片段是选自F(ab')2片段和二价单链Fv(scFV)片段的二价抗体片段，或是选自Fab片段、Fv片段和scFv片段的单价抗体片段。
246.如权利要求214-245中任一项所述的制品，其中：
所述反应剂为或包含链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白或和亲和素类似物或突变蛋白；或
所述反应剂包括：链霉亲和素类似物或突变蛋白、或和亲和素类似物或突变蛋白、亲和素、链霉亲和素的寡聚体或多聚体。
247.一种试剂盒，其包含如权利要求214-246中任一项所述的制品和可选的使用说明。
248.如权利要求247所述的试剂盒，其还包含能够逆转所述受体结合剂和所述反应剂之间键的物质。
249.一种组合物，其包含多个T细胞，所述T细胞经基因工程化改造以表达特异性结合目标抗原的重组受体，其中：
以占组合物中总T细胞或占组合物中总细胞的百分比计，大于35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞包括包含如下表型的T细胞亚组：CD3+、CD4+或CD8+和CD62L+，以及CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的一种或多种，以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的一种或多种；以及以下一者或两者：
a)在基因工程化改造前或过程中，所述多个T细胞包含T细胞亚组：
i)未在GSK-P抑制剂的存在下孵育；
ii)未在重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15的存在下孵育；
iii)未富集CD62L+细胞；或
b)所述组合物不含GSK-P抑制剂或重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15。
250.如权利要求251所述的组合物，其中，所述T细胞亚组包含至少5×106、至少1×106或至少2×106个细胞。
251.一种组合物，其包含多个T细胞，所述T细胞经基因工程化改造以表达特异性结合目标抗原的重组受体，其中：
所述基因工程化改造的T细胞衍生自对包含具有如下表面表型的T细胞亚组的T细胞群的转导：CD3+、CD4+或CD8+和CD62L+以及CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+中的一种或多种以及t-bet低、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+和LFA-1+中的一种或多种，其中，与如下的任何一者相比，所述T细胞亚组在细胞群中总T细胞中所占百分比更大或在细胞群中的总T细胞数更大：
a)包含分离或富集自人对象的原代T细胞的群，所述分离或富集基于包含所述表型的一种或多种标志物的表面表达；
b)在GSK-P抑制剂存在下孵育的T细胞群；
c)在重组稳态细胞因子，可选地IL-7或IL-15的存在下孵育的T细胞群；或
d)用抗CD3和抗CD8刺激的T细胞群，但其中所述刺激大于1天、2天、3天、4天或5天和/或所述刺激不在生物素或生物素类似物的存在下被破坏。
252.如权利要求251所述的组合物，其中：
所述T细胞亚组以占细胞群中总T细胞等于或约大于35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的百分比存在；或
所述T细胞亚组包含至少5×106个细胞、1×106个细胞、2×106个细胞或更多个细胞。
253.如权利要求249-252中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
254.一种治疗方法，其包括给予患有疾病或病症的对象权利要求212、213和249-253中任一项所述的组合物。
255.如权利要求254所述的治疗方法，其中，所述细胞包含重组受体、嵌合抗原受体或TCR，且所述重组受体、嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合与所述疾病或病症相关的抗原。
256.如权利要求254或权利要求255所述的治疗方法，其中，所述疾病或病症是癌症，和自身免疫性疾病或紊乱，或感染性疾病。
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