CN111492239A - 不同谱系、起源或分期的癌细胞的细胞-基质阻抗监测 - Google Patents

Abstract

一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述方法包括：提供具有多个腔室的细胞‑基质阻抗监测盒，每个腔室具有配置为测量细胞‑基质阻抗的电极阵列，其中不同的腔室预装载有不同的靶细胞，具体实施为不同谱系、起源或分期的癌细胞；向所述多个腔室添加效应细胞与靶细胞相互作用，其中效应细胞是免疫细胞；在添加效应细胞之前和之后监测所述多个腔室的细胞‑基质阻抗，并任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞对不同靶细胞的杀伤效果。

Description

不同谱系、起源或分期的癌细胞的细胞-基质阻抗监测

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月1日提交的美国临时专利申请No.62/539,955的优先权权益，将其通过提述完整并入本文。

技术领域

本发明涉及癌细胞的细胞-基质阻抗监测，更具体地，涉及用于评估抗癌治疗针对预装载在基于细胞-基质阻抗的盒上的癌细胞的效果的方法，还涉及细胞-基质阻抗监测盒，其可与细胞培养装置(如用于将效应细胞无菌传递至细胞-基质阻抗监测盒的生物反应器)偶联。

发明背景

癌症是一类涉及可能侵袭或扩散到身体的其他部位的异常细胞生长的疾病。癌症开始时，不产生任何症状。随着肿块的增长或溃疡形成而出现症状。癌症可通过局部扩散、淋巴扩散到局部淋巴结或从血液通过血液扩散到远处而从其原始部位扩散，这被称为转移。当它通过血液途径扩散时，通常会扩散到全身。癌症导致约14％的人类死亡。

有许多正在进行中的治疗癌症的技术手段。其中包括新的化学治疗剂的开发。化学疗法通常是指使用药剂或药物治疗癌症。最近的实验方法是过继性细胞转移(ACT)，它涉及将细胞转移到患者体内。在不同的变化形式中，细胞可以来自同一位患者或另一个体。

到目前为止，患者对任何特定的癌症治疗并非普遍有反应，预测哪种治疗将有效可能是困难的。因此，在癌症过程中，患者常常尝试不同的治疗。因此，仍然需要开发方法和系统，以改进针对癌细胞的有潜力的疗法的筛选。

发明概述

本发明提供了一种基于细胞的测定法，可以有效地测试建议的抗癌治疗对预装载在盒中的癌细胞的作用，还提供了细胞-基质阻抗监测盒，其可以与细胞培养装置无菌联接，以进行样品(如效应细胞或工程化效应细胞)的无菌传递。

在本发明的一个方面，提供了一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述方法包括：提供具有多个腔室的细胞-基质阻抗监测盒，每个腔室具有配置为测量细胞-基质阻抗的电极阵列，其中不同的腔室预装载有不同的靶细胞，具体实施方式为不同谱系、起源或分期的癌细胞；向所述多个腔室添加效应细胞以便与靶细胞相互作用，其中效应细胞是免疫细胞；在添加效应细胞之前和之后监测所述多个腔室的细胞-基质阻抗，并任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞对不同靶细胞的杀伤效果。

所述盒可以实施为多种形式。在优选实施方案中，所述盒可被实施为多室盒(比如多孔板)，其中，一个或多个腔室是可以通过移除盖子而通达的，便于直接加载到腔室中。在其他实施方案中，至少一个腔室的顶部被密封，并且所述盒具有通道系统，所述通道系统被配置为输送流体进出所述腔室。此外，通道系统可配置有端口，用于将流体输送到盒中和从盒中输出。通道系统可配置为将效应细胞、细胞培养基和/或试剂接收到腔室内。

在一些实施方案中，自动化机器人系统将细胞直接传输到盒的腔室中，但在其他实施方案中，所述盒与培养装置流体联接，细胞培养、维持或储存在所述培养装置中，用于通过所述通道系统传输。在进一步的实施方案中，细胞培养装置是细胞培养皿或瓶。在其他实施方案中，细胞培养装置是生物反应器。在更进一步的实施方案中，生物反应器是波动摇摆生物反应器。在更进一步的实施方案中，细胞培养装置是细胞袋生物反应器系统。细胞-基质阻抗监测盒可以通过传输管路、阀门和/或泵无菌联接或连接至各种生物反应器，以保持无菌性。

在一些实施方案中，所述盒利用至少一个腔室中的具有多个测量电极和单个参考电极的电极阵列来监测细胞-基质阻抗。在其他实施方案中，所述盒利用至少一个腔室中的仅具有单个测量电极和单个参考电极的电极阵列来监测细胞-基质阻抗。在其他实施方案中，所述盒可以利用至少一个腔室中的叉指电极阵列来监测细胞-基质阻抗。

在一些实施方案中，所述盒具有容纳来自相同组织起源的不同靶细胞的多个不同的腔室。在其他实施方案中，所述盒具有容纳来自不同组织起源的不同靶细胞的多个不同的腔室。优选地，不同的靶细胞由某个设施预装载的，该设施维持来自不同组织起源的癌细胞并将经过预装载的盒配送给消费者。这样的组织起源的非限制性实例包括乳腺组织、肺组织、结肠组织、间充质细胞或成纤维细胞(例如纤维肉瘤)、前列腺组织、肾脏组织、表皮组织、肝组织和卵巢组织。相同组织起源内的不同靶细胞可以是不同的细胞系、不同的原代细胞，或者可由于突变、基因型或癌症分期(例如0、I、IIa、IIb、III、IV期等)而不同。具有相同组织起源的不同靶细胞(例如，肺癌细胞)可由于不同的基因表达和/或不同的蛋白质表达而不同。不同的基因表达可以包括具有不同突变的基因、不同的过表达基因等。不同的蛋白质表达可以包括通过细胞表达不同的蛋白质生物标志物或不同的靶蛋白。

所述盒也可以与至少一个空的腔室一起配送，从而允许操作者装载另外的靶细胞用于另外的测试。在一些情况下，另外的靶细胞是获自多种生物样品如实体瘤、造血肿瘤、血液和胸腔积液的癌细胞。在一些实施方案中，另外的靶细胞是从血液采集的循环肿瘤细胞(CTC)。在其他实施方案中，另外的靶细胞是从组织活检中采集的肿瘤细胞。

效应细胞可以是先天免疫系统的任何适合的细胞。可以在所述方法中使用的效应细胞的非限制性实例包括自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞。当效应细胞是T细胞时，它们可以是辅助性T细胞(Th细胞)、细胞毒性T细胞和/或记忆T细胞。在一些实施方案中，效应细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，在更进一步的实施方案中，TIL可以分离自前述采集另外的靶癌细胞的同一患者的癌组织。

在一些实施方案中，将效应细胞工程改造以展示一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，这些CAR针对疑似存在于至少一种靶细胞类型(比如至少一个癌细胞谱系、起源或分期)上的一种或多种抗原。为此，所述方法评估工程化效应细胞针对一个或多个癌细胞谱系、起源或分期的效果。在一些实施方案中，效应细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，每个CAR展示一个或多个针对癌细胞抗原的单链片段可变(scFv)区。在更进一步的实施方案中，效应细胞展示针对存在于相同或不同癌细胞谱系、起源或分期的两种或更多种不同癌细胞抗原的多个scFV。

按照前述，在一些实施方案中，将效应细胞工程改造以增加外源性化合物(任选地白细胞介素2)的表达，以促进效应细胞的生长、增殖或持久性。

所述方法可以比较来自单个测试室的阻抗或基于阻抗的参数，以确定效果；然而，在其他实施方案中，将测试室的阻抗或基于阻抗的参数与对照室的阻抗或基于阻抗的参数或预定对照参数进行比较。按照前述，在一个实施方案中，所述方法可包括添加来自同一受试者的非工程化效应细胞(例如，非工程化效应细胞不展示嵌合抗原受体CAR))，以形成对照室；监测对照室的阻抗，并任选地根据对照室的阻抗得出基于阻抗的参数；并且随时间推移将对照室与具有工程化效应细胞的腔室(也称为“测试室”)之间的阻抗或基于阻抗的参数进行比较，以确定测试室中效应细胞针对特定的癌细胞谱系、起源或分期的杀伤效果的差异。对照室可以装载有其他类型的对照细胞，其用作监测和测定在测试室中工程化效应细胞对靶癌细胞的细胞溶解作用的对照。

在一些实施方案中，所述方法包括比较细胞-基质阻抗测量值，但在优选实施方案中，所述方法包括比较基于阻抗的参数，该参数从阻抗得出。通常，阻抗或基于阻抗的参数随时间的降低指示癌细胞的细胞溶解效果增强。

在一些实施方案中，基于阻抗的参数是单参数，比如细胞指数、细胞变化指数或归一化至添加效应细胞之前的时间点的归一化细胞指数。在一些实施方案中，基于阻抗的参数是基于阻抗的曲线，并且在进一步的实施方案中，通过随时间推移比较基于阻抗的曲线来确定效应细胞对靶细胞的杀伤效果。然而，在其他实施方案中，通过计算和比较靶细胞的细胞溶解百分比来确定效应细胞对靶细胞的杀伤效果。

在一些实施方案中，评估一种或多种化合物对一种或多种谱系或起源的癌细胞的细胞溶解作用。因此，在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：添加另外的化合物，所述另外的化合物疑似增强或降弱效应细胞对靶细胞的杀伤效果；并确定响应于添加所述化合物的效果差异。可以测试多种化合物，包括抗体或抗体片段、修饰的抗体或抗体片段或肽。在一些实施方案中，所述另外的化合物是检查点抑制剂。检查点抑制剂寻求通过阻断癌细胞上的正常蛋白质来突破癌症针对免疫系统攻击的一种主要防御手段。检查点抑制剂的实例包括靶向效应细胞表面上的PD1、CTLA-4、CD137、OX40、CD27、CD40L、TIM3或它们在靶细胞表面上对应的同源配体的抗体或抗体片段。

在其他实施方案中，所述另外的化合物是双特异性衔接物，双特异性衔接物定义为连接在一起的至少两个多肽，其中至少一个多肽结合效应细胞，另外的至少一个多肽结合靶细胞，由此将效应细胞连接至靶细胞。在一个另外的实施方案中，双特异性衔接物结合T细胞表面模块，比如CD3。

上述方面可以进一步适用于提供确定杀伤患者癌细胞的治疗的方法。具体而言，可以向患有某种组织起源的癌症的患者施用被认为针对一个或多个癌细胞群具有细胞溶解效果的效应细胞，所述癌症例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、纤维肉瘤、前列腺癌、肾癌、表皮癌、肝癌或卵巢癌。替代地，或另外地，可以进一步测试被认为针对一个或多个癌细胞谱系或起源具有细胞溶解效果的效应细胞对从患者样品采集的癌细胞的细胞溶解作用。

此外，还提供了一种体内杀伤癌细胞的方法，所述方法包括基本上如上所述确定杀伤患者癌细胞的治疗；扩大效应细胞群；以及向患者施用治疗有效量的效应细胞。

在本发明的相关方面，提供了一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述方法包括：提供具有多个腔室的细胞-基质阻抗监测盒，每个腔室具有被配置为监测细胞-基质阻抗的电极阵列，其中不同的腔室预装载有不同的靶细胞，具体地为不同谱系、起源或分期的癌细胞；向所述多个腔室添加效应细胞，其中效应细胞是免疫细胞；向至少一些腔室添加双特异性衔接物，其中所述双特异性衔接物是疑似将效应细胞桥接至至少一些靶细胞的分子；随时间推移监测所述多个腔室的细胞-基质阻抗，包括在添加双特异性衔接物的步骤之前和之后，并任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞响应于双特异性衔接物对不同靶细胞的杀伤效果。

所述盒可以实施为多种形式。在优选实施方案中，所述盒具有多个腔室，每个腔室预装载有靶细胞。所述盒可被实施为多室盒(比如多孔板)，其中，一个或多个腔室可通过移除盖子而通达。在其他实施方案中，至少一个腔室的顶部被密封，并且所述盒具有通道系统，所述通道系统被配置为将流体输送到腔室中和从腔室中输出。此外，通道系统可配置有端口，用于将流体(例如，液体或气体)输送到盒中和从盒中输出。通道系统可配置为将效应细胞、细胞培养基和/或试剂接收到腔室内。

在一些实施方案中，自动化机器人系统将细胞直接传输到盒的腔室中，但在其他实施方案中，所述盒与培养装置流体联接，所述培养装置储存用于通过所述通道系统传输的细胞。在进一步的实施方案中，细胞培养装置是细胞培养皿或瓶。在其他实施方案中，细胞培养装置是生物反应器。在更进一步的实施方案中，生物反应器是波动摇摆(wave-rocking)生物反应器。在更进一步的实施方案中，细胞培养装置是细胞袋(cell bag)生物反应器系统。细胞-基质阻抗监测盒可以通过传输管路、阀门和/或泵无菌联接或连接至各种生物反应器，以保持无菌性。

在一些实施方案中，所述盒利用至少一个腔室中的具有多个测量电极和单个参考电极的电极阵列来监测细胞-基质阻抗。在其他实施方案中，所述盒利用至少一个腔室中的仅具有单个测量电极和单个参考电极的电极阵列来监测细胞-基质阻抗。在任一情况下，在进一步的实施方案中，所述盒可以利用在至少一个腔室中的叉指电极阵列来监测细胞-基质阻抗。

在一些实施方案中，所述盒具有容纳来自相同组织起源的不同靶细胞的多个不同的腔室。在其他实施方案中，所述盒具有容纳来自不同组织起源的不同靶细胞的多个不同的腔室。优选地，不同的靶细胞通过某种设施预装载，所述设施维持来自不同组织起源的癌细胞并将预装载的盒配送给消费者。这样的组织起源的非限制性实例包括乳腺组织、肺组织、结肠组织、间充质细胞或成纤维细胞(例如纤维肉瘤)、前列腺组织、肾脏组织、表皮组织、肝组织和卵巢组织。相同组织起源内的不同靶细胞可以是不同的细胞系、不同的原代细胞，或者可由于突变、基因型或癌症分期(例如0、I、IIa、IIb、III、IV期等)而不同。具有相同组织起源的不同靶细胞(例如，肺癌细胞)可由于不同的基因表达和/或不同的蛋白质表达而不同。不同的基因表达可以包括具有不同突变的基因、不同的过表达基因等。不同的蛋白质表达可以包括通过细胞表达不同的蛋白质生物标志物或不同的靶蛋白。

所述盒也可以与至少一个空的腔室一起配送，从而允许操作者装载另外的靶细胞用于另外的测试。在一些情况下，另外的靶细胞是获自多种生物样品比如实体瘤、造血肿瘤、血液和胸腔积液的癌细胞。在一些实施方案中，另外的靶细胞是从血液采集的循环肿瘤细胞(CTC)。在其他实施方案中，另外的靶细胞是从组织活检中采集的肿瘤细胞。

效应细胞可以是先天免疫系统的任何适合的细胞。可以在所述方法中使用的效应细胞的非限制性实例包括自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞。当效应细胞是T细胞时，它们可以是辅助性T细胞(Th细胞)、细胞毒性T细胞和/或记忆T细胞。在一些实施方案中，效应细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，在更进一步的实施方案中，它们可以分离自采集了前述另外的靶癌细胞的同一患者的癌组织。

可以将效应细胞工程改造以展示一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR针对疑似存在于至少一个癌细胞谱系、起源或分期的一种或多种抗原。为此，所述方法评估工程化效应细胞针对一个或多个癌细胞谱系、起源或分期以及双特异性衔接物的效果。在一些实施方案中，效应细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，每个CAR展示一个或多个针对癌细胞抗原的单链片段可变(scFv)区。在更进一步的实施方案中，效应细胞展示针对存在于相同或不同癌细胞谱系、起源或分期的两种或更多种不同癌细胞抗原的多个scFV。

按照前述在一些实施方案中，将效应细胞进一步工程改造以增加外源性化合物(任选地白细胞介素2)的表达，以促进效应细胞的生长、增殖或持久性。

在一些实施方案中，双特异性衔接物包括连接在一起的两个多肽，其中每个多肽结合效应细胞或靶细胞，由此桥接效应细胞和靶细胞。在一些实施方案中，双特异性衔接物结合T细胞表面模块，任选地为分化簇3(CD3)。

在一些实施方案中，所述方法包括比较细胞-基质阻抗测量值，但在优选实施方案中，所述方法包括比较从阻抗得出的基于阻抗的参数。通常，阻抗或基于阻抗的参数随时间降低指示癌细胞的细胞溶解效果增强。

在一些实施方案中，基于阻抗的参数是单参数，比如细胞指数、细胞变化指数、或者对添加双特异性衔接物之前的时间点归一化的归一化细胞指数。在一些实施方案中，基于阻抗的参数是基于阻抗的曲线，并且在进一步的实施方案中，通过随时间推移比较基于阻抗的曲线来确定在存在双特异性衔接物的情况下效应细胞对靶细胞的杀伤效果。然而，在其他实施方案中，通过计算和比较靶细胞的细胞溶解百分比来确定效应细胞对靶细胞的杀伤效果。

上述方面可以进一步适用于提供确定杀伤患者癌细胞的治疗的方法。具体而言，可以向具有相似或相同谱系、起源或分期的癌细胞的癌症患者施用被认为针对一个或多个癌细胞谱系、起源或分期具有细胞溶解效果的双特异性衔接物，所述癌症比如乳腺癌、肺癌、结肠癌、纤维肉瘤、前列腺癌、肾癌、表皮癌、肝癌或卵巢癌。替代地，或另外地，可以测试被认为针对一个或多个癌细胞谱系、起源或分期具有细胞溶解效果的双特异性衔接物对从患者样品采集的癌细胞的效果。

为了推进上述目的，还提供了一种体内杀伤癌细胞的方法，所述方法包括基本上如上所述确定杀伤患者癌细胞的治疗；以及向患者施用治疗有效量的双特异性衔接物。

在相关方面，提供了一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述方法包括：提供流体联接于生物反应器的细胞-基质阻抗监测盒和泵，所述盒具有带有电极阵列的腔室，所述电极阵列被配置为测量细胞-基质阻抗；向腔室中添加靶细胞并在生物反应器中培养细胞；将来自细胞培养物的细胞泵入腔室中；在添加来自细胞培养物的细胞之前和之后监测腔室的细胞-基质阻抗，并任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及确定响应于将细胞泵入腔室中的细胞-基质阻抗或基于阻抗的参数的变化。

在另一个相关方面，提供了一种细胞-基质阻抗监测系统，其包括：具有多个腔室的细胞-基质阻抗监测盒，每个腔室具有被配置为测量细胞-基质阻抗的电极阵列；生物反应器，其被配置为培养细胞，所述生物反应器流体联接于所述盒；泵，其被配置为将培养细胞从生物反应器泵入所述盒的多个腔室中；和阻抗分析仪，其电联接至电极阵列，用于测量多个腔室内的细胞-基质阻抗。

附图简述

图1A-E描绘了具有叉指电极阵列的细胞-基质阻抗测量盒的配置。图1A描绘了具有16个电极阵列(或16个电极结构单元)102的基质101，所述电极阵列以2行×8列的配置布置在基质上。图1B是更高分辨率的图像，其描绘了具有两个电极结构106的盒的单个电极阵列，每个电极结构包括多个叉指电极元件105。图1C显示了叉指电极阵列的示意图，说明在整个阵列中要求近似均匀的电极电阻分布(通过具有相同的表面积)。图1D描绘了具有单个测量电极107和单个参考电极108的细胞-基质阻抗测量盒的配置。图1E显示了具有多个腔室210的盒200的实例，所述多个腔室与生物反应器220流体联接，所述生物反应器220容纳效应细胞并且通过传输管路230和外部泵240传输效应细胞。还显示了用于容纳试剂或介质的试剂储存器225，其连接至阀245以便传输到腔室210中。另外，显示了气体输入250和输出260，用于将CO2和/或氧气和/或其他气体分子(根据细胞培养的需要)传输到腔室210中。

图2显示了具有8行腔室的盒，所述腔室装载有靶细胞，所述靶细胞实施为不同组织起源的癌细胞，指定为乳腺癌(B1-8)、肺癌(L1-8)、结肠癌(C1-8)、纤维肉瘤(F1-8)、前列腺癌(P1-8)、肾癌(K1-8)、表皮癌(E1-8)、肝癌(V1-8)和卵巢癌(O1-8)；并且所述盒具有用于另外的细胞的三个空列(Y1-8)，所述另外的细胞可由操作者添加，以进行另外的测试。在每列之内，预装载相同起源的不同靶细胞，例如但不限于源自相同组织类型的不同细胞系、具有不同突变的不同细胞、具有不同基因型的不同细胞、具有不同基因表达和/或不同蛋白质表达的不同细胞，等等。不同的基因表达可以包括具有不同突变的基因、不同的过表达基因等。不同的蛋白质表达可以包括通过细胞表达不同的蛋白质生物标志物或不同的靶蛋白。

图3显示了可以使用细胞-基质阻抗技术监测的免疫介导的肿瘤细胞杀伤的不同方法。

图4显示了在细胞-基质阻抗监测系统上以不同初始细胞接种数接种的人非小细胞肺癌细胞(H460细胞)的增殖的实时监测。连续记录细胞增殖，每15分钟一次，持续超过125小时。对数标度细胞生长曲线显示指数细胞生长或静止期的细胞。

图5显示了用抗癌药紫杉醇处理的人非小细胞肺癌细胞(H460细胞)的时间依赖性细胞指数。不同腔室的培养H460细胞在其指数生长期用不同浓度的紫杉醇处理。在处理之后使用细胞-基质阻抗监测系统实时监测细胞对不同剂量紫杉醇的动态反应，每15分钟一次，持续50小时。对于在67nM和500nM之间的紫杉醇浓度，加入化合物之后，H460细胞在细胞指数方面最初表现出逐渐下降。然而，取决于化合物浓度，在添加化合物之后约15小时至20小时之间，细胞指数在某时达到最小值。在此时间点之后，细胞指数表现出细胞指数逐渐上升。直到在添加化合物之后约15小时的时间，33nM的化合物浓度的细胞指数表现出接近恒定的值。在添加化合物后15小时之后，细胞指数表现出细胞指数逐渐上升。

图6显示了用抗癌药AC101103处理的人非小细胞肺癌细胞(H460细胞)的时间依赖性细胞指数。不同腔室的培养H460细胞在其指数生长期用不同浓度的AC101103处理。在细胞-基质阻抗监测系统上实时监测细胞对不同剂量AC101103的动态反应，每30分钟一次，持续约20小时。图6中的时间依赖性细胞指数与图5中所示的显著不同。对于3.125μg/ml、6.25μg/ml和12.5μg/ml的化合物浓度，细胞指数分别在约5小时、约15小时和>20小时表现出接近恒定的值。对于3.125μg/ml和6.25μg/ml的化合物浓度，在添加化合物后约5小时和约15小时之后，细胞指数开始上升。对于25μg/ml的化合物浓度，在添加化合物之后，细胞指数有逐渐而缓慢的下降。对于50μg/ml的化合物浓度，在约10小时的时间段内，细胞指数保持接近恒定，并且此后，细胞指数平稳下降。

图7显示了用多柔比星处理的腺癌人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)的动态药物反应曲线。将10,000个A549细胞接种在16X盒的每个腔室中。在处理前，在本发明的细胞-基质阻抗监测系统上实时监测细胞附着和细胞生长。当细胞处于指数生长期时，将不同浓度的多柔比星添加至细胞。将相同体积的用于溶解药物的溶剂用作溶媒对照。实时记录对多柔比星的时间和药物剂量依赖性细胞反应。

图8显示了细胞-基质阻抗监测盒上的NIH 3T3细胞的细胞数与细胞指数的相关性。将指示细胞数的细胞接种到基本上如图1B所示的带有电子传感器阵列的微量滴定盒中。电子传感器阵列是用纤连蛋白预包被的。在接种之后两小时，使用细胞-基质阻抗监测确定细胞指数。

图9A-B显示了使用细胞-基质阻抗监测系统监测到的各种癌细胞(列于表1中)对多柔比星处理的反应。将指示的细胞系接种到带有电子传感器阵列的微量滴定盒上。在用多柔比星处理之前和之后，以15或30或60分钟的时间间隔连续监测细胞反应。

图10A-B显示了使用细胞-基质阻抗监测系统监测到的各种癌细胞(列于表1中)对奥罗莫星处理的反应。将指示的细胞系接种到带有电子传感器阵列的微量滴定盒上。在用奥罗莫星处理之前和之后，以15或30或60分钟的时间间隔连续监测细胞反应。

图11A-B显示了使用细胞-基质阻抗监测系统监测到的各种癌细胞(列于表1中)对紫杉醇处理的反应。将指示的细胞系接种到带有电子传感器阵列的微量滴定盒上。在用紫杉醇处理之前和之后，以15或30或60分钟的时间间隔连续监测细胞反应。

图12A显示了使用细胞-基质阻抗监测系统监测到的人结肠腺癌细胞(MV522细胞)对多柔比星处理的反应。将MV522细胞接种到带有电子传感器阵列的微量滴定盒上，并以指示的时间和浓度用DMSO或多柔比星处理。

图12B显示了多柔比星处理对人结肠腺癌细胞(MV522细胞)的细胞生物效应的表征。使用FACS处理细胞以进行细胞周期分析，或用CFDA和Cy3-Annexin V处理以评估细胞活力。另外，将细胞固定并用鬼笔环肽染色以检查细胞形态学。对于活力和形态学，将细胞可视化并使用配备有CCD相机的荧光显微镜照相。

图13A显示了使用细胞-基质阻抗监测系统监测到的腺癌人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)对奥罗莫星处理的反应。将A549细胞接种到带有图1B中所示的电子传感器阵列的微量滴定盒上，并以指示的时间和浓度用DMSO或奥罗莫星处理。

图13B显示了奥罗莫星处理对人结肠腺癌细胞(MV522细胞)的细胞生物效应的表征。使用FACS处理细胞以进行细胞周期分析，或用CFDA和Cy3-Annexin V处理以评估细胞活力。另外，将细胞固定并用鬼笔环肽染色以检查细胞形态学。对于活力和形态学，将细胞可视化并使用配备有CCD相机的荧光显微镜照相。

图14A显示了使用细胞-基质阻抗监测系统监测到的腺癌人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)对紫杉醇处理的反应。将A549细胞接种到带有电子传感器阵列的微量滴定盒上，并以指示的时间和浓度用DMSO或紫杉醇处理。

图14B显示了紫杉醇处理对腺癌人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)的细胞生物效应的表征。使用FACS处理细胞以进行细胞周期分析，或用CFDA和Cy3-Annexin V处理以评估细胞活力。另外，将细胞固定并用鬼笔环肽染色以检查细胞形态学。对于活力和形态学，将细胞可视化并使用配备有CCD相机的荧光显微镜照相。

图15A-D是描绘根据使用细胞-基质阻抗监测系统获得的细胞指数曲线以5小时间隔估计的每种化合物对癌细胞系的时间依赖性IC值的曲线图(15A：多柔比星；15B：紫杉醇；15C：奥罗莫星；15D：他莫昔芬)，上述癌细胞系是公认的乳腺癌、肺癌、结肠癌和纤维肉瘤、前列腺癌、表皮癌、肝癌和卵巢癌的谱系。

图16A显示了在用多柔比星、长春碱或奥罗莫星处理之前和之后的人结肠直肠腺癌细胞(HT29细胞)的细胞指数曲线。还显示了细胞指数随时间(标记为“对数增长，模型”)和用DMSO溶媒对照处理的细胞(标记为“对照，HT29”)的理论指数增长。

图16B显示了从图16A所示的细胞指数曲线得出的细胞变化指数(CCI)。还显示了用于不同反应的基于图16C所示的规则的“黑白阴影代码”。

图16C显示了用于表示CCI曲线的颜色编码方案。如果DT是细胞在使用的细胞培养基中经历指数增长的倍增时间，则具有相对于0.7/DT的不同值的CCI指示不同的细胞变化状态。如果CCI>>0.7/DT，则细胞指数的增长快于细胞的指数生长(或对数生长)的预期(CCI曲线中这样的区域表示为

长方形)。如果CCI约为0.7/DT，则细胞指数的增长速率以与细胞的指数生长的预期相同(CCI曲线中这样的区域表示为

长方形)。如果CCI大于零但略小于0.7/DT，则细胞指数增长速率慢于指数生长的预期(CCI曲线中这样的区域表示为

长方形)。如果CCI大约为零，则细胞指数显示出接近恒定的值(CCI曲线中这样的区域表示为

长方形)。如果CCI为负，则细胞指数正在随着时间的推移而降低，表明细胞失去了与电极表面的附着或改变了它们的形态(曲线中这样的区域显示为

长方形)。如果CCI为很大的负值，则细胞指数随时间推移迅速降低，表明细胞迅速失去与电极表面的附着，或细胞非常迅速地改变了它们的形态(CCI曲线中这样的区域表示为

长方形)。去除CCI值中的瞬时、快速噪声，从而在添加化合物之后，整个CCI曲线由一个、两个或三个黑色/白色阴影矩形表示。

图17显示了针对指示的化学治疗剂测试的每个细胞系的细胞反应谱。对于每个细胞系和化合物，根据在IC50浓度下其对应的RT-CES反应计算时间依赖性细胞变化指数(CCI)。(IC50是时间依赖性的，因此使用添加药物之后30小时的IC50浓度或与之最接近的浓度)。根据图16C中所述的规则将与特定细胞反应相关的特定CCI曲线编码，并按照具有相似作用机制的化合物的组分组展示。DOX：多柔比星；5-F：5-氟尿嘧啶；COL：秋水仙胺；TAXOL：紫杉醇；VIN：长春碱；OLOM：奥罗莫星；ROS：罗斯科维汀(roscovitine)；STAU：星形孢菌素；TAMO：他莫昔芬；RIFA：利福平；ACEA-1：ACEA测试化合物。

图18显示了以ACEA 96x E-PLATE盒每腔室2500和10,000个细胞的密度接种后，对纤维肉瘤细胞(H1080细胞)、肺癌细胞(H460细胞)、肝肉瘤癌细胞(HepG2)和小鼠成纤维细胞系NIH 3T3随时间推移的细胞增殖的监测。使用细胞-基质阻抗监测系统，每30分钟动态监测细胞的粘附、铺展和增殖。

图19显示了将细胞-基质阻抗(细胞指数)和接种用于利用MTT比较细胞指数的细胞数关联的一系列图。在图19-小图A中，将范围从100个细胞一直增加到10,000个细胞的渐增数目的NIH 3T3接种到细胞-基质阻抗监测盒中，并监测细胞10小时，在此时间点获得细胞指数。将细胞指数值针对相应的细胞数作图。在图19-小图B中，在实验结束时通过MTT测定法测定了图19-图A中描述的细胞，并将590nm处的光密度针对接种的细胞数作图。

图20A-B描绘了使用细胞-基质阻抗监测系统的药物与靶细胞相互作用的动态监测。在图20A中，将人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)以每腔室10,000个细胞的密度接种在细胞-基质监测盒中，连续监测细胞24小时，在24小时时间点以指示的终浓度加入紫杉醇。在图20B中，对用DMSO或12.5nM紫杉醇处理20小时的A549细胞进行膜联蛋白V染色。用荧光显微镜观察细胞，并用附接的数码相机捕获图像。

图21A-B描绘了使用细胞-基质阻抗监测系统的细胞周期停滞的动态监测。将人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)以每腔室10,000个细胞接种在细胞-基质监测盒中，使用RT-CES连续监测。用(图21A)DMSO或100μM奥罗莫星处理细胞。在图21B中，用DMSO或100μM奥罗莫星处理在组织培养皿上生长20小时的A549细胞。通过流式细胞术进行细胞周期分析。

图22描绘了使用细胞-基质阻抗监测系统的细胞毒性化合物对靶细胞的作用的动态监测。将人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)接种在细胞-基质监测盒中，并使用RT-CES系统连续监测。用指示终浓度的(图A)星形孢菌素、(图B)长春碱和(图C)5-氟尿嘧啶处理细胞。

图23描绘了将NIH 3T3细胞(靶细胞)以20,000个细胞/腔室的密度接种在ACEA的微量滴定板(16X E-Plate)上。在RT-CES上连续监测NIH 3T3细胞的粘附和增殖。使细胞增殖至对数生长期，然后用效应NK细胞以7.5:1的效:靶比处理。作为对照，用单独的培养基或缺乏杀伤能力的效应细胞处理靶细胞。

图24描绘了图23中描述的NIH 3T3靶细胞在测定结束时洗涤、固定在甲醇中，并且用Giemsa蓝色染料染色之后的情况。将细胞可视化并使用连接至CCD相机的光学显微镜照相。NK细胞(效应细胞)对靶细胞的细胞毒作用表现在板底部的空隙，在这些空隙处，由于与效应细胞的相互作用，靶细胞已经发生了细胞死亡。对照效应Yac细胞系没有空隙，故评估为对靶细胞没有作用。

图25A-B描绘了在RT-CES系统上的NK细胞介导的细胞溶解的动态监测。在图25A中，显示了NK细胞介导的NIH 3T3细胞(靶细胞)的细胞溶解的动态监测。将NIH 3T3细胞以5000个细胞/腔室接种在96孔E-PLATE的腔室(此处具体为孔)中，并实时监测细胞的附着、铺展和增殖。在细胞接种之后34小时，细胞指数(CI)值达到3，大约等于10,000个细胞/腔室。以一式三份向每个腔室添加150,000个mNK细胞(效应细胞)或用作阴性对照的YAC细胞(对照效应细胞)。然后动态监测mNK细胞介导的细胞溶解。在图25B中，显示了mNK细胞在不同比例的E/T(效应细胞数:靶细胞数)下的时间依赖性细胞溶解活性。计算给定时间点的细胞溶解活性，并将其表示为细胞溶解百分比或百分比细胞溶解{细胞溶解％＝(CI_{无效应细胞}–CI_效应细胞)/CI_{无效应细胞}X100}，其中CI_效应细胞和CI_{无效应细胞}分别是在感兴趣的时间点添加和不添加效应细胞的腔室的细胞指数。为了计算此处所示的细胞溶解百分比，CI使用归一化细胞指数值。一般而言，计算细胞溶解百分比或百分比细胞溶解可使用细胞指数值或归一化细胞指数值。

图26A-D描绘了mNK细胞(鼠自然杀伤细胞)和NK 92细胞的细胞溶解活性的无标记定量测量。在图26A中，显示了mNK细胞的细胞溶解活性的定量测量。将NIH 3T3细胞接种至96腔室E-PLATE。在RT-CES系统上实时监测细胞生长，直到CI值达到3，相当于10,000个细胞/腔室。以不同的细胞浓度将mNK细胞(效应细胞)添加至靶细胞，使一系列E/T比(效应细胞数与靶细胞数)如所指示。在RT-CES系统上动态监测处于不同E/T比的靶细胞的细胞溶解。使用归一化细胞指数，其中将从添加mNK细胞之后获得的细胞指数值相对于来自相同腔室的在添加mNK细胞之前不久的细胞指数值进行归一化。在图26B中，显示了不同E/T比的mNK细胞的时间依赖性细胞溶解活性。根据以下等式计算mNK细胞对NIH 3T3细胞的细胞溶解百分比或百分比细胞溶解：{细胞溶解百分比＝(NCI_{无效应细胞}-NCI_效应细胞)/NCI_{无效应细胞}X100}，其中NCI_效应细胞和NCI_{无效应细胞}是在感兴趣的时间点分别添加和不添加效应细胞的腔室的归一化细胞指数。指示了时间依赖性细胞溶解活性。在图26C中，显示了NK 92细胞的细胞溶解活性的定量测量。如所述接种靶细胞MCF7，并如上所述在RT-CES系统上监测细胞生长。然后以不同的浓度将NK 92细胞添加至每个腔室，使得一系列E/T比如所指示。在RT-CES系统上动态监测不同E/T比的NK 92细胞对MCF7细胞的细胞溶解活性。在图26D中，显示了不同E/T比的NK92细胞的时间依赖性细胞溶解活性。如图26B所述计算NK 92细胞对MCF7细胞的细胞溶解百分比，并标明。

图27A-B描绘了RT-CES系统上的NK细胞对多种细胞系的细胞溶解的无标记评估。在图27A中，提供了NK 92介导的7种不同癌细胞系的细胞溶解。每行标明的细胞溶解百分比是在添加NK 92细胞8小时之后(此时显示出最大的细胞溶解)基于各个腔室的细胞指数值计算得到的。图27B显示了mNK介导的9种不同细胞系的细胞溶解。每行标明的细胞溶解百分比是在添加NK 92细胞12小时之后(此时显示出最大的细胞溶解)基于各个腔室的细胞指数值计算得到的。

图28描绘了RT-CES系统用于测量效应细胞介导的靶细胞的细胞溶解的基本原理。在图A中，粘附的靶细胞与腔室底部的传感器微电极的相互作用导致阻抗信号的产生，该阻抗信号用一种任意单位表示，称作细胞指数(CI)。在图B中，悬浮的效应细胞的添加未被传感器检测到，因为这些细胞未粘附至腔室底部。在图C中，由于靶细胞的形态变化以及细胞溶解后靶细胞与腔室底部微电极之间的相互作用的丧失，效应细胞介导的靶细胞的细胞溶解被传感器检测到。

图29A-C描绘了NK-92介导的细胞毒性的RT-CES监测。在图29A中，将10,000个人肺泡基底上皮细胞(A549细胞)靶细胞接种在E-PLATES(Acea Biosciences,Inc.,CA)的腔室(孔)中。在指示的时间点(箭头)，以不同的E/T比添加NK-92细胞，并使用RT-CES系统每15分钟动态监测A549细胞的活力。图29B描绘了在添加NK-92细胞之后25小时使用MTT的RT-CES读出的比较。将图29A中描述的A549细胞洗涤，并使用MTT评估细胞活力。对于每个E/T比，将通过RT-CES获得的归一化CI值与使用MTT测定法获得的吸光度值一起作图。在图29C中，RT-CES读出和MTT测定法两者都使用如“材料和方法”部分中所述的公式计算在不同E/T比下的NK-92细胞的细胞溶解活性百分比。

图30描绘了使用RT-CES系统的小鼠NK细胞对靶细胞的细胞溶解的动态监测。将NIH 3T3细胞接种在E-PLATE的腔室中，并在指示的时间点(箭头)以不同的E/T比添加小鼠NK细胞、YAC细胞或单独的培养基。使用RT-CES系统连续监测NIH 3T3细胞的活力。

图31A-D展现了NK-92介导的靶细胞的细胞溶解的特异性。(图31A)：将A549细胞接种在E-PLATES的腔室中。在以16:1(E/T比)的密度接种NK细胞之后二十四小时，与不同浓度的MEK抑制剂PD 98059一起预温育30分钟，然后在指示的时间点添加至A549细胞(箭头)。使用RT-CES系统连续监测A549细胞的活力。(图31B)：如“材料和方法”部分中所述，在添加NK后的指示时间计算在MEK抑制剂存在下NK-92介导的细胞裂解活性的程度。(图31C)：PI3激酶抑制剂渥曼青霉素对NK-92介导的A549细胞的细胞溶解的影响。如(图31A)中所述用抑制剂处理细胞。(图31D)：在(图31C)中描述的实验结束时计算NK-92细胞的细胞溶解活性百分比。

图32A描绘了显示EpCAM/CD3 BiTE抗体(双特异性T细胞衔接物)的添加促进PC3前列腺癌细胞的PBMC依赖性裂解的图。将PC3细胞以10,000个细胞/腔室的密度接种在E板96中，并在24小时后用渐增量的EpCAM/CD3 BiTE和效/靶比为20的新鲜分离的PBMC进行处理。无BiTE的PBMC对PC3生长曲线的指数期没有影响(X)，而渐增量的BiTE杀伤了癌细胞并诱导了归一化CI参数降低。CI归一化到添加PBMC之前的最后一个记录数据点。

图32B显示PBMC滴定证明了阻抗读数的高灵敏度和细胞杀伤的特异性。将PC3细胞用1μg/ml EpCAM/CD3 BiTE和渐增量的效/靶比处理。该图显示了比率与杀伤动力学之间成比例，以及1:1比率的有效性。

图33A-D显示了在具有不同量的表面EpCAM蛋白的癌细胞系中EpCAM BiTE介导的细胞杀伤的动力学。图33A描绘了PC3、MCF7和HeLa癌细胞系中EpCAM表面表达的流式细胞仪分析。使用PE缀合的抗人CD326(EpCAM)抗体(深灰色区域)评价了三种不同癌细胞系中的EpCAM表面表达。中灰色阴影区域表示阴性同种型对照抗体的信号，浅灰色区域表示未染色细胞的自发荧光。在图33B中，以相同的密度接种具有不同EpCAM表面表达水平的三个癌细胞系，并用相同量的EpCAM/CD3 BiTE抗体和PBMC处理。免疫细胞介导的细胞杀伤所致的细胞指数下降与三个细胞系中EpCAM表达的量成比例。在图33C中，基线绘图将多个细胞系之间的CI变异归一化，并揭示了与抗原表达和效应细胞量有关的细胞杀伤效率。使用相应对照组(无PBMC)的基线扣除，将每个组中重复实验(1μg/ml EpCAM BiTE)的CI归一化。同一颜色的渐变指示不同量的PBMC:癌细胞比率。灰色粗水平线对应于用作基线的无PBMC对照。在图33D中，对于用1μg/ml EpCAM/CD3 BiTE抗体处理的三个不同癌细胞系，50％细胞杀伤的有效时间(ET50)作为效:靶比的函数。50％细胞杀伤的有效时间(ET50)作为用1μg/mlEpCAM/CD3 BiTE抗体处理的三个不同癌细胞系的效:靶比的函数。

图34A)将Daudi B淋巴母细胞以80,000个细胞/腔室的密度接种在4℃下用1μg/ml山羊抗人IgM(25μL)包被过夜的腔室上。第二天，以对应于效:靶比1.25:1；0.625:1；0.313:1；0.156:1；0.078:1和0.039:1的密度添加Tall-104 T淋巴母细胞。图34B-在添加TALL 104之后的时间点4和24之间(A)的斜率图。无Tall-104和最低的浓度具有正斜率，而所有其他浓度剂量的斜率是剂量依赖性负值。图34C-仅有Daudi和仅有Tall-104的图显示，Tall-104对IgM包被板的CI的影响可忽略不计。针对最大量的Tall-104(1.25:1)报告了Tall-104图(图34C)。

图35 E-PLATE 96的腔室用抗CD40抗体预包被(在PBS中4μg/mL；在室温下温育三小时)研究的结果。用PBS洗涤腔室之后，以80,000个细胞/腔室的密度添加Daudi B细胞。接种Daudi细胞之后19.9小时，以不同的量添加NK-92效应细胞。随后再监测阻抗70小时。箭头指示效应细胞添加的点。(A)零个NK-92细胞。(B)80,000个NK-92细胞。(C)160,000个NK-92细胞。

发明详述

作为介绍，本发明提供了确定建议的抗癌治疗剂的效果的方法，这些方法的手段是将建议的治疗剂添加至预装载有癌细胞的盒中，并使用细胞-基质阻抗监测来监测癌细胞的细胞溶解。所述方法适合于具体化为各种形式的治疗剂，如独立地对癌细胞、效应细胞、工程化免疫细胞、溶瘤病毒及其组合起作用的抗癌化合物。通过确定癌细胞的细胞溶解的效果，这些方法可进一步鉴定适用于癌症患者的治疗。另外，细胞-基质监测盒适合于与多种细胞培养装置比如生物反应器无菌联接，由此降低测定期间污染的可能性。

A.定义

为了清楚地公开，而不是限制，本发明的详细描述被分成以下小节。除非另外定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文中提及的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物都通过提述完整并入本文。如果本节中阐述的定义与通过提述并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中阐述的定义相反或以别的方式不一致，则本节中阐述的定义优先于通过提述并入本文的定义。

如本文中使用的，“一个(a)”或“一个(an)”表示“至少一个”或“一个或多个”。

如本文中使用的，“膜”是片材。

当将有活力的、未受损的癌细胞悬液添加至腔室时，如果相当大百分比的细胞在十二小时内粘附至腔室表面，则腔室表面“适合于细胞附着”。优选地，至少50％的细胞在十二小时内粘附至腔室表面。更优选地，适合于细胞附着的表面具有这样的表面性质，使得至少70％的细胞在平板接种(即，将细胞添加至腔室)后的十二小时内粘附至所述表面。更优选地，适合于细胞附着的表面的表面性质导致至少90％的细胞在平板接种后的十二小时内粘附至所述表面。最优选地，适合于细胞附着的表面的表面性质导致至少90％的细胞在平板接种后的八、六、四、两个小时内粘附至所述表面。为了使之具有细胞附着的期望表面特性，可能需要将表面进行化学处理(例如，用酸和/或用碱处理)和/或物理处理(例如，用等离子体处理)和/或生物化学处理(例如，用一种或多种促进细胞附着的分子或生物分子包被)。在本发明中，生物相容性表面(比如膜)优选适合于将要在使用所述生物相容性表面(如膜)的测定法中使用的类型的细胞的附着，并且最优选地，所述生物相容性表面允许至少90％的与该生物相容性表面接触的细胞在整个测定法过程中附着。

“电极”是具有高电导率的结构，即，其电导率远高于周围材料的电导率。

如本文中使用的，“电极结构”是指单个电极，特别是具有复杂结构(例如，螺旋电极结构)的一个电极，或电连接在一起的至少两个电极元件的集合。“电极结构”内的所有电极元件处于电连接状态。

如本文中使用的，“电极元件”是指电极结构的单个结构特征，例如，叉指电极结构的指状突起。

如本文中使用的，“电极阵列”或“电极结构单元”是两个或更多个电极结构，所述电极结构被构造成具有这样的尺寸和间距，使得它们在与信号源连接时可以作为一个单元起作用，在电极结构周围的空间区域中产生电场。本发明的优选电极结构单元可以测量由于细胞附着至电极表面所致的阻抗变化。电极结构单元的非限制性实例是叉指电极结构单元和同心电极结构单元。在一些实施方案中，“电极阵列”包括小的测量电极和大的参考电极，后者将阻抗测量值指向小的测量电极。

“电极总线”是电极中连接单独的电极元件或子结构的部分。电极总线提供从单独的电极元件或单独的电极子结构到另一个电连接的共同传导路径。在本发明的盒中，电极总线可以接触电极结构的每个电极元件，并提供通往引导至连接垫的电迹线的电连接路径。

“电极迹线”或“导电迹线”或“电迹线”是从电极或电极元件或电极结构朝向用于将电极或电极元件或电极结构连接至阻抗分析仪的盒或设备的一端或边界延伸的导电路径。盒的末端或边界可以对应于盒或设备上的连接垫。

“连接垫”是本发明的设备或盒上的区域，其与设备或盒上的至少一个电极结构内的至少一个电极或所有电极元件处于电连接，并且与外部电路(例如，阻抗测量电路或信号源)可操作连接。通过任何适当的导电手段(比如引线或电线)，在连接垫和阻抗测量电路或信号源之间的电连接可以是直接或间接的。这样的导电手段也可以穿过位于设备或盒的其他区域上的电极或导电路径。

“叉指”表示一个方向的突起与另一不同方向的突起互相交错，如同双手叉握时的手指一样(需要注意的是，叉指电极元件优选地彼此不接触)。

如本文中使用的，“接触电极元件的可能性高”表示，如果细胞随机地定位在本发明的盒或设备的传感器区域内，则根据在本发明的盒或设备之上或之中使用的细胞的平均直径、电极元件的尺寸、以及电极元件之间的间隙的尺寸计算，细胞(或颗粒)接触电极元件的可能性大于约50％、更优选大于约60％、还更优选大于约70％、甚至更优选大于约80％、大于约90％、或大于约95％。

如本文中使用的，“电极[或电极结构]具有基本上相同的表面积”表示，述及的多个电极的表面积彼此基本上没有差异，以致于任何一个述及的电极(或电极结构)上的细胞附着或生长所致的阻抗变化对阻抗的总体可检测变化的贡献程度，与述及的任何其他电极(或电极结构)上的细胞附着或生长所致的阻抗变化相同或相似。换言之，在各电极(或电极结构)具有基本上相同的表面积的情况下，在细胞附着于电极或在其上生长后，任何一个电极都可影响阻抗的总体变化。在大多数情况下，在具有“基本上相同的表面积”的最大电极和最小电极之间的表面积之比小于10。优选地，电极阵列的最大电极与最小电极之间的表面积之比小于5、4、3、2、1.5、1.2或1.1。更优选地，电极结构的至少两个电极具有几乎相同或相同的表面积。

如本文中使用的，“盒具有适合于细胞附着或生长的表面”表示，设备的电极和/或非电极区具有适当的物理、化学或生物性质，使得感兴趣的细胞可以在表面上有活力地附着，并且在细胞培养物在设备表面上生长的同时，新细胞可以继续附着。然而，盒或其表面并不一定包含细胞活力或生长必需的物质。这些必需的物质，例如营养素或生长因子，可以在培养基中提供。优选地，当将有活力的未受损上皮或内皮细胞的悬液添加至“适合于细胞附着的表面”时，至少50％的细胞在十二小时内粘附至所述表面。更优选地，适合于细胞附着的表面具有这样的表面性质，导致至少70％的细胞在平板接种(即，将细胞添加至构成所述盒的腔室)后的十二小时内粘附至所述表面。甚至更优选地，适合于细胞附着的表面的表面性质使得至少90％的细胞在平板接种后的十二小时内粘附至所述表面。最优选地，适合于细胞附着的表面的表面性质导致至少90％的细胞在平板接种后的八、六、四、两个小时内粘附至所述表面。

如本文中使用的，“在电极之间或之中可检测的阻抗变化”(“或在电极结构之间或之中可检测的阻抗变化”)表示当电极表面发生分子结合反应时，在所述电极(或电极结构)之间或之中的阻抗将发生可通过阻抗分析仪或阻抗测量电路检测到的显著变化。阻抗变化是指在设备的电极表面上发生分子结合反应时的阻抗值与电极表面上未发生分子反应时的阻抗值之间的差。或者，阻抗变化是指细胞附着于电极表面时与细胞未附着于电极表面时阻抗值的差，或附着于构成所述设备的表面的电极的细胞的数量、类型、活性、粘附性或形态改变时的阻抗值的差。在大多数情况下，阻抗变化大于0.1％即可检测到。优选地，可检测到的阻抗变化大于1％、2％、5％或8％。更优选地，可检测到的阻抗变化大于10％。电极之间或之中的阻抗通常为施加电场的测量频率的函数。“在所述电极之间或之中的阻抗的可检测变化”并不要求所有频率下的阻抗变化都可检测到。“在所述电极之间或之中的阻抗的可检测变化”仅要求任何单个频率(或多个频率)下的阻抗变化可检测到。另外，阻抗具有电阻和电抗两个分量(电抗可以分为两类：容抗和感抗)。“在所述电极之间或之中的阻抗的可检测变化”仅要求任何单个频率或多个频率的电阻和电抗的任一者具有可检测的变化。在本申请中，阻抗是电阻抗或电子阻抗。用于测量这样的阻抗的方法通过以下方式实现：(1)在所述电极之间或之中施加给定频率(或多个频率，或具有特定电压波形)的电压，监测所述频率(或多个频率，或具有特定波形)时通过所述电极的电流，将电压幅值除以电流幅值，得到阻抗值；(2)施加单个频率分量(或多个频率或具有特定电流波形)的电流通过所述电极，监测所述频率(或多个频率，或具有特定波形)时在所述电极之间或之中产生的电压，将电压幅值除以电流幅值，得到阻抗值；(3)其他可以测量或确定电阻抗的方法。需要注意的是，上述“将电压幅值除以电流幅值，得到阻抗值”的描述中，“除以”是用相同频率下的电流幅值和电压幅值来进行的。这样的电阻抗的测量是电子或电过程，并不涉及使用任何试剂。

如本文中使用的，“所述至少两个电极具有实质不同的表面积”表示，任何电极的表面积彼此不相似，以至于细胞在较大电极上的附着或生长所致的阻抗变化对总体可检测阻抗的贡献，与细胞在较小电极上的附着或生长所致的阻抗变化对总体可检测阻抗的贡献相比，程度上不相同也不相似。优选地，细胞在较大电极上的附着或生长引起的任何阻抗变化都显著小于细胞在较小电极上的附着或生长引起的阻抗变化。通常，最大电极与最小电极之间的表面积之比大于10。优选地，最大电极与最小电极之间的表面积之比大于20、30、40、50或100。

如本文中使用的，“在空间上根据多孔微板的腔室布置的多对电极或电极结构”表示，盒或设备的多对电极或电极结构在空间上布置为与多孔微孔板的腔室的空间配置匹配，以便在需要时可以将盒插入、连接或附接至多孔微孔板(例如，无底多孔微孔板)，使得多孔微孔板的多个腔室将包括多个电极或电极结构。

如本文中使用的，“按行-列配置布置”表示，就电连接而言，电极、电极阵列或开关电路的位置通过行位置号和列位置号两者来标识。

如本文中使用的，“每个腔室含有基本上相同的数量...的细胞”表示，腔室中细胞的最低数量是腔室中细胞的最高数量的至少50％。腔室中细胞的最低数量是腔室中细胞的最高数量的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％。更优选地，每个腔室含有相同数量的细胞。

如本文中使用的，“剂量-反应曲线”表示细胞反应与所建议的治疗化合物的剂量浓度的依赖性关系。可以通过许多不同的参数来量度细胞反应。例如，化合物被怀疑具有细胞毒性并引起细胞死亡。然后，可以通过在用测试化合物处理细胞之后的非活的(或活的)细胞的百分比来量度细胞反应。将非活的(或活的)细胞的这一百分比作为测试化合物的剂量浓度的函数进行作图，构建剂量反应曲线。在本申请中，非活的(或活的)细胞的百分比可以表述为测得的阻抗值、或从阻抗测量得的细胞指数或细胞变化指数。例如，对于给定的细胞类型并且在特定的细胞生理条件下(例如，特定的细胞培养基)，细胞指数可显示与腔室中的活细胞数呈线性相关或正相关，据此可以从阻抗测量值得出细胞指数。因此，在本申请中，可以将细胞指数作为测试化合物的剂量浓度的函数进行作图，以构建“剂量-反应曲线”。应当注意，通常，细胞指数不仅与腔室中活细胞的数目有关，而且与细胞形态和细胞附着有关。因此，将细胞指数相对于剂量浓度作图不仅可提供关于细胞数的信息，而且还可提供关于它们的生理状态(例如细胞形态和细胞粘附)的信息。此外，本申请的系统和盒提供的一个重要优点在于可以在单个实验中获得多个时间点的“剂量-反应曲线”，这是因为系统可以连续监测细胞，提供短到几分钟至长达几天或数周时间范围内许多时间点的阻抗测量。

“化合物”或“建议的治疗化合物”是在测定中研究其活性或对细胞的直接或间接作用的任何化合物。测试化合物可以是任何化合物，包括但不限于小分子、大分子、分子复合物、有机分子、无机分子、生物分子(比如但不限于，脂质、类固醇、碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、肽、蛋白质、核酸)，或这些物质的任何组合。测试化合物可以是合成化合物、天然存在的化合物、天然存在的化合物的衍生物等。测试化合物的结构可以是已知的或未知的。在本发明的一个应用中，化合物能够或疑似能够诱导细胞溶解。在本发明的另一个应用中，化合物能够或疑似刺激效应细胞。“化合物”可以包括两个连接在一起形成双特异性衔接物的多肽，其中一个多肽结合效应细胞(例如T细胞上的CD3)，另一个多肽结合靶细胞，由此将效应细胞与靶细胞连接。在又另一个应用中，化合物能够或疑似能够与细胞相互作用(例如，与细胞表面受体结合，或抑制某个细胞内信号转导途径，或激活细胞)。

“已知化合物”是其至少一种活性已知的化合物。在本发明中，已知化合物优选是其对细胞的一种或多种直接或间接作用已知的化合物。优选地，已知化合物的结构是已知的，但不一定是这种情况。优选地，已知化合物对细胞的作用机制是已知的，例如，已知化合物对细胞的作用可以是，对细胞活力、细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞形态、细胞周期、IgE介导的细胞激活或刺激、受体-配体结合、细胞数、细胞质量、细胞周期性变化等的作用，但不限于这些例子。

“阻抗值”是存在或不存在癌细胞时测量的腔室中电极的阻抗。阻抗通常是频率的函数，即，阻抗值取决于进行测量时的频率。对本申请来说，阻抗值是指在单个频率或多个频率下测量的阻抗。此外，阻抗具有两个分量：一个电阻分量和一个电抗分量。本申请中的阻抗值是指电阻分量、或电抗分量、或电阻分量和电抗分量两者。因此，当测量或监测“阻抗值”时，我们指的是测量或监测电阻、或电抗、或电阻和电抗两者。在本申请方法的许多实施方案中，阻抗值还指的是从原始测量阻抗数据得的参数值。例如，可以使用细胞指数、或归一化细胞指数、或Δ细胞指数代表阻抗值。

“细胞指数”或“CI”是从测量的阻抗值得的参数，可用于反映阻抗值的变化。有许多方法可以得出或算出细胞指数。

给定时间点的“归一化细胞指数”通过将该时间点的细胞指数除以参考时间点的细胞指数来计算。因此，在参考时间点，归一化细胞指数为1。

给定时间点的“Δ细胞指数”通过从给定时间点的细胞指数中减去标准时间点的细胞指数来计算。因此，Δ细胞指数是细胞指数从初始时间(标准时间点)到测量时间的绝对变化。

“细胞变化指数”或“CCI”是从细胞指数得出的参数，某个时间点的“CCI”等于细胞指数相对于时间的一阶导数除以该时间点的细胞指数。

如本文中使用的，“细胞溶解活性”是指效应细胞溶解或杀伤靶细胞的能力。对于效应细胞数与靶细胞数的给定比率及向靶细胞添加效应细胞之后的特定时间段，如果第一种类型的效应细胞比第二种类型的效应细胞杀伤更多的靶细胞，则第一种类型效应细胞具有更高的细胞溶解活性。可以确定许多参数并用于指示或量化效应细胞的细胞溶解活性。例如，可以使用在将效应细胞添加至腔室中的靶细胞之后的某个时间点的靶细胞的活力来指示效应细胞的细胞溶解活性。靶细胞的低活力指示许多靶细胞已被效应细胞杀伤，并且表明效应细胞具有高的细胞溶解活性。在另一个实例中，还可以使用在将效应细胞添加至靶细胞之后的某个时间点的靶细胞的细胞溶解百分比(或细胞溶解的百分比)来指示细胞溶解活性。低的细胞溶解百分比指示效应细胞杀伤了很少的靶细胞，并且表明效应细胞具有低的细胞溶解活性。

如本文中使用的，“靶细胞”是指可以被效应细胞溶解或杀伤的任何细胞。所述盒预装载有具体化为癌细胞的靶细胞。癌细胞的非限制性实例包括癌细胞系和分离自癌组织的细胞。在用于测量效应细胞的细胞溶解活性的测定法中，人们感兴趣的是效应细胞杀伤了多少个靶细胞或百分之多少的靶细胞。因此，可以在测定期间的任何时间点确定靶细胞的量或靶细胞的活力。

如本文中使用的，术语“谱系”或“癌细胞谱系”是指从中得到癌细胞的细胞系或基因型。术语“起源”或“癌细胞起源”是指从中产生癌细胞的组织。术语“分期”是指从中回收或得到细胞的癌症的分期。

如本文中使用的，“效应细胞”是指能够杀伤或溶解靶细胞的任何细胞，比如自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、T细胞、具有细胞溶解活性的细胞类型、CAR-T细胞和其他细胞等。

如本文中使用的，“活力”是指活的或者尚未经历细胞溶解的活细胞的数量或百分比。在用于测量效应细胞的细胞溶解活性的测定法中，可能需要确定在将效应细胞添加至靶细胞之后的一些时间点的靶细胞的活力，以便确定效应细胞杀伤或溶解了多少个靶细胞或百分之多少的靶细胞。在本发明方法的一个实施方案中，将靶细胞引入到包括电极阵列的腔室中，所述电极阵列用于测量细胞-基质阻抗以量化靶细胞数。在将效应细胞添加至腔室之前和之后，测量含有靶细胞的腔室的阻抗。在一种方法中，可以通过比较在添加效应细胞前后的腔室的阻抗来确定在添加效应细胞之后的某个时间点的靶细胞的活力。靶细胞的活力可以作为感兴趣的时间点的腔室的阻抗与即将添加效应细胞之前的腔室的阻抗之比来计算。此种计算的隐含假设是腔室的阻抗可与腔室中的活细胞数大致成比例。在此，从添加效应细胞的时间点到感兴趣的时间点的这一时间段，假设靶细胞很少或没有增殖。因此，在感兴趣的时间点的腔室的阻抗与即将添加效应细胞之前的腔室的阻抗之比反映了初始细胞(即将添加效应细胞前的活细胞)中在感兴趣的时间点仍存活者的百分比。在另一种方法中，可以通过比较在添加效应细胞前后的腔室的细胞指数来确定在添加效应细胞之后的某个时间点的靶细胞的活力。靶细胞的活力可以作为在感兴趣的时间点的腔室的细胞指数与即将添加效应细胞之前的腔室的细胞指数之比来计算。此种计算的隐含假设是腔室的细胞指数可与腔室中的活细胞数大致成比例。对于这样的靶细胞活力的计算，细胞指数可以是归一化细胞指数。在另一种方法中，添加效应细胞之后的某个时间点的测试室中的靶细胞活力可以通过比较感兴趣的时间点的腔室的阻抗(或细胞指数)与对照室的阻抗(或细胞指数)来加以确定，所述对照室中添加了相同数目的靶细胞而未添加效应细胞。添加效应细胞之后的某个时间点的靶细胞的活力可以计算为：在感兴趣的时间点的测试室的阻抗(或细胞指数)与相同时间点的对照室的阻抗(或细胞指数)之比。这样的测试室中靶细胞活力的计算的隐含假设是，如果效应细胞没有杀伤或溶解靶细胞，则测试室的阻抗或细胞指数将与对照室相同。对于这样的靶细胞活力的计算，细胞指数可以是归一化细胞指数。

如本文中使用的，“原代细胞”是指已经源自患者或动物的各种组织和器官的任何非永生化细胞。

如本文中使用的，“具有细胞溶解活性的细胞”是指能够将靶细胞杀伤或溶解的任何细胞。具有细胞溶解活性的细胞是效应细胞。

如本文中使用的，“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”是指效应细胞对靶细胞的杀伤(或靶细胞的细胞毒性)，其中靶细胞已经用抗体标记。

B.细胞-基质阻抗监测盒和系统

使用与阻抗分析仪可操作连接的细胞-基质阻抗监测盒进行细胞-基质阻抗监测。所述盒有一个或多个腔室。用于阻抗监测的每个腔室在其底部都有电极阵列，并被配置为用于接收细胞。当将癌细胞添加至腔室时，它们附着在电极上并充当绝缘体，从而增加腔室内的阻抗。随着细胞生长并继续覆盖电极，电流受到与覆盖电极的细胞的数目、细胞形态和附着性质有关的方式的阻碍。当癌细胞被破坏时，比如由于化合物(例如毒性化合物、双特异性衔接物)和/或免疫细胞(例如效应细胞、CAR-T细胞)的存在而被破坏时，细胞形态和/或附着的伴随变化使阻抗改变。可以将阻抗或根据阻抗计算的基于阻抗的参数(例如细胞指数、归一化细胞指数或细胞变化指数)随时间绘图，并用于预测化合物或免疫细胞针对癌细胞表型的效果。如此，可以使用细胞-基质阻抗技术评估有潜力的治疗剂，无论是化合物还是工程化免疫细胞。然后可以将表现出抗癌活性的有潜力的治疗剂指定为用于治疗癌症状况的治疗剂，并因此施用于患者。

电极阵列可以配备成不同的结构配置。在一些实施方案中，电极阵列可以遵照Gaiver和Keese开发的阵列，其中多个小的测量电极共享一个大的参考电极，并且其中阻抗测量涉及小的测量电极。当大量癌细胞添加至腔室或细胞生长至融合后，这些配置可能是适合的。在需要更高分辨率的场合(例如，当腔室中添加的细胞少于100个时)的配置中，电极阵列可以配置为基本上如图1A-C所示及本文所述的叉指电极阵列。

在图1D中显示了另一个高分辨率实施方案，包括单个小的测量电极和大得多的参考电极。通过提供相对较小的测量电极，整个阵列的阻抗测量几乎完全涉及单个测量电极。已经发现这种配置具有极高的灵敏度，可用于处理非常少的靶细胞，比如10个或更少的细胞、9个或更少的细胞、8个或更少的细胞、7个或更少的细胞、6个或更少的细胞、5个或更少的细胞、4个或更少的细胞、3个或更少的细胞、2个或更少的细胞、或单个靶细胞。当将具体化为循环肿瘤细胞(CTC)的靶细胞添加至盒的任选空腔室中时，这种配置可能是优选的，循环肿瘤细胞以很少的数目循环，因此往往以较小的量从生物样品中采集和纯化。

在其他实施方案中，电极阵列具有任适何合的形状，例如，矩形、圆形、矩形线上的圆形(“线上圆”)、在矩形线或正弦线上的正方形。它们也可以是曲线的形式，例如但不限于螺旋形或弧形。

在每种配置中，盒的基质具有适合癌细胞附着和铺展的表面；其中细胞在基质上附着或铺展会导致每个电极阵列内的电极结构之间或之中的阻抗的可检测变化。已经显示，细胞附着和细胞群在盒上的广泛铺展可导致阻抗升高，而细胞群从盒上解离和滚动(rolling)通常使阻抗降低。我们发现，使用不同的化学毒性化合物、不同的效应细胞和不同的癌细胞，所述盒不仅可再现地检测癌细胞死亡，而且能够鉴定随时间推移的细胞-基质阻抗的差异，这证实所述盒和系统也可以应用于鉴定或验证对特定肿瘤或癌细胞具有期望的抗肿瘤活性的化合物或效应细胞的方法，因此允许所述细胞-基质阻抗监测盒应用于个体化医学方法。

在结构上，两个或更多个电极结构的叉指电极阵列被构造成具有这样的尺寸和间距，使得它们在与信号源连接时可以作为一个单元起作用，在电极结构周围的空间区域中产生电场。如本文中使用的，“电极结构”是指单电极，特别是具有复杂结构的电极。例如，电极结构可以具有两个或更多个电连接在一起的电极元件。在进一步的实施方案中，电极阵列具有两个电极结构，每个电极结构具有多个电极元件或子结构。在优选实施方案中，所述盒的每个叉指电极阵列的电极结构具有基本上相同的表面积。在进一步的优选实施方案中，每个叉指电极阵列包括两个电极结构，并且每个电极结构具有多个电极元件。电极阵列的两个电极结构中的每一个分别连接至位于基质边缘的单独的连接垫。

因此，在一些实施方案中，对于每个电极阵列，两个电极结构中的一个电极结构连接至两个或更多个连接垫中的一个连接垫，两个电极结构中的另一个电极结构连接至两个或更多个连接垫中的另一个连接垫。优选地，每个阵列被单独寻址，意味着阵列的电迹线和连接垫被配置成使得阵列可以以一定的方式连接至阻抗分析仪，使得可以使用开关(如电子开关)在给定时间将测量电压施加到单个阵列上。

每个叉指电极阵列在整个阵列上具有近似均匀的电极电阻分布。关于“阵列上的均匀电阻分布”，表示当在阵列的电极结构上施加测量电压时，在阵列任何给定位置的电极电阻近似等于阵列上任何其他位置的电极电阻。优选地，在所述盒的阵列上的第一位置的电极电阻与在同一阵列上的第二位置的电极电阻相差不超过30％。更优选地，在所述盒的阵列上的第一位置的电极电阻与在同一阵列上的第二位置的电极电阻相差不超过15％。甚至更优选地，在所述盒的阵列上的第一位置与在同一阵列上的第二位置的电极电阻相差不超过5％。更优选地，在所述盒的阵列上的第一位置与在同一阵列上的第二位置的电极电阻相差不超过2％。

在优选的叉指阵列布置中，利用给定电极阵列中的电极元件、电极之间的间距、以及电极总线，使得所有细胞，无论它们降落并附着至电极表面上的何处，都对测量的电极阵列总阻抗变化有相似的贡献。因此，期望的是，在所述盒的任何给定阵列内，当将测量电压施加至该电极阵列时，任何两个位置具有相似的电场强度。在叉指阵列的任何给定位置，电场强度与阵列的第一电极结构上的最近点和阵列的第二电极结构上的最近点之间的电位差相关。因此，期望给定的叉指阵列的所有电极元件上和所有电极总线上具有相似的电位降。基于这个要求，最好在整个叉指阵列中具有近似均匀的电极电阻分布，其中在感兴趣位置上的电极电阻等于第一电极结构上最近点(即第一电极结构上最接近感兴趣位置的点)和连接到第一电极结构的第一连接垫之间的电极电阻与第二电极结构上最近点(即第二电极结构上最接近感兴趣位置的点)和连接到第二电极结构的第二连接垫之间的电极电阻之和。

例如，通过具有特定间距和尺寸(长度、宽度、厚度和几何形状)的电极结构和电极总线，可以实现整个叉指阵列中大致均匀的分布，使得在所述叉指阵列上的任何单个位置的电阻大致等于在所述叉指阵列上的任何其他单个位置的电阻。在大多数实施方案中，给定叉指阵列的电极元件(或电极结构)将具有均匀的间距，并且具有相似的厚度和宽度，给定叉指阵列的电极总线将具有相似的厚度和宽度，并且从给定阵列引导至连接垫的电极迹线将具有非常相似的厚度和宽度。因此，在这些优选实施方案中，叉指阵列被设计为使得电极元件或结构的长度和几何形状、电极迹线的长度和几何形状以及总线的长度和几何形状允许在整个阵列中近似均匀的电极电阻分布。

在细胞-基质阻抗测量盒的一些优选实施方案中，电极结构包括多个电极元件，每个电极元件直接与电极总线连接。第一电极结构的电极元件与第一电极总线连接，并且第二电极结构的电极元件与第二电极总线连接。在这些实施方案中，两条电极总线中的每一条经由电迹线与单独的连接垫连接。虽然迹线的电阻对叉指阵列上某个位置的电阻有影响，但是对于阵列上的任何两个位置而言，从第一总线到第一连接垫与从第二总线到第二连接垫的迹线连接是相同的。因此，在这些优选实施方案中，设计阵列的几何形状时，为了在整个阵列提供均匀的电阻，并不需要考虑迹线电阻。

在每个阵列配置的一些实施方案中，用于监测细胞-基质阻抗的盒具有共享连接垫的两个或更多个电极阵列。优选地，所述盒的至少一个电极阵列的电极结构之一与连接垫连接，该连接垫也与所述盒的至少另一个电极阵列的电极结构连接。优选地，对于盒中的至少两个阵列，该两个或更多个阵列中的每个阵列具有与连接垫连接的第一电极结构，所述连接垫与至少一个其他电极阵列的电极结构连接；并且该两个或更多个阵列中的每个阵列具有与连接垫连接的第二电极结构，所述连接垫不与所述盒的任何其他电极结构或阵列连接。因此，在盒的优选设计中，至少有两个电极阵列，每个电极阵列具有与共用连接垫连接的第一电极结构和与独立连接垫连接的第二电极结构。

在一些优选实施方案中，阵列的每个电极结构与电极总线连接，所述电极总线经由导电迹线与盒的两个或更多个连接垫之一连接。在优选实施方案中，两个电极结构中的每一个与单条总线连接，使得每个阵列与两条总线连接，每个电极结构连接一条总线。在这种布置中，两条总线中的每一条与基质的单独的连接垫连接。

连接总线与连接垫的导电迹线可由任何导电材料制造。迹线可以位于基质的表面，并且可任选地被绝缘层覆盖。或者，可以将迹线布置在基质的第二平面中。阻抗测量盒上的导电迹线的布置和设计的描述可以在美国专利7,470,533中找到，将关于基质上的导电迹线的制造和设计的全部公开内容通过提述并入本文。

可以使用接合到基质上的连接垫和连接的印刷电路板上的适当的电子连接手段(比如金属夹)，以将电子连接从盒上的连接垫引至外部电子电路(例如，阻抗分析仪)。细胞-基质阻抗盒的设计及其制造的描述可以在美国专利7,470,533中找到，将包括电极阵列的阻抗盒的设计、特征和制造的所有描述和公开内容通过提述并入本文。

优选地，非导电基质是平面的，并且是平坦的或近似平坦的。示例性基质可由许多材料组成，包括但不限于硅上的二氧化硅、绝缘体上硅(SOI)晶片、玻璃(例如石英玻璃、铅玻璃或硼硅酸玻璃)、蓝宝石、陶瓷、聚合物、玻璃纤维、塑料，例如聚酰亚胺(例如Kapton，DuPont提供的聚酰亚胺薄膜)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯和尿素树脂。优选地，基质和基质表面不会干扰要在基质表面上发生的分子结合反应。对于细胞-基质阻抗监测，在本发明的盒的使用期间任何可能暴露于癌细胞的非导电基质的表面优选是生物相容的。非生物相容性基质材料可通过用另一种材料(比如聚合物或生物分子涂层)进行涂覆来使其具备生物相容性。

可以对基质表面的全部或部分进行化学处理，包括但不限于，例如通过添加官能团或添加带电荷或疏水基团来修饰表面。

美国专利7,470,533中描述了适用于本发明的盒的用于阻抗测量的电极阵列的描述，将涉及电极阵列(或结构单元)、电极结构、电极材料、电极尺寸、以及在基质上的电极的制造方法的全部公开内容通过提述并入本文。

在一些优选的盒中，电极阵列被制造在基质上，其中阵列包括两个电极结构，每个电极结构包括多个线上圆形电极元件，其中一个结构的电极元件与相对电极结构的电极元件交替。本发明的本盒的阵列的叉指电极元件(或电极结构)具有近似相等的宽度。优选地，本发明的本盒的阵列的电极元件(或电极结构)的宽度大于30微米，更优选宽度为约50至约300微米，并且还更优选宽度为约90微米。

优选地，叉指阵列的各电极元件(或电极结构)是大致均匀地间隔开的。优选地，本发明的所述盒的阵列的各电极元件(或电极结构)之间的间隙宽度小于50微米，更优选约5至约30微米宽，更优选约20微米宽。

所述盒可以包括一个或多个流体不可渗透的容器，优选具体化为腔室，用以容纳流体。这样的容器可以可逆地或不可逆地附接至基质或其部分，或在基质或其部分中形成(例如，形成为微量滴定板中的腔室)。在另一个实例中，所述盒包括可逆或不可逆地附接至塑料外壳的微电极条，所述塑料外壳具有与位于微电极条上的电极结构单元相对应的开口。适合的流体容器材料包括塑料、玻璃或涂覆有塑料的材料，如陶瓷、玻璃、金属等。包括流体容器的盒的描述和公开内容可以在美国专利7,470,533中找到，将能够接合包括用于阻抗测量的电极的基质的流体容器和流体容器结构的所有公开内容通过提述并入本文，包括其尺寸、设计、组成和制造方法在内。

在优选实施方案中，盒的基质上的每个电极阵列与流体不可渗透的腔室相关联，所述腔室可以是任何适合的容器。优选地，盒被组装到具有不透流体密封的无底多孔塑料板或条上。所述盒被组装成使得电极阵列在腔室的底部。在一些实施方案中，用于细胞-基质阻抗测量的多室盒具有附着至基板但与阵列不相关联的“非阵列”腔室。这样的腔室可任选地用于实施基于非阻抗的测定，或用于显微观察细胞。

美国专利7,470,533以及美国专利7,192,752中描述了多室阻抗测量盒的设计和组装，将两者的多室(多孔)阻抗测量盒的公开内容通过提述并入本文，包括其设计、组成和制造在内。所述盒优选具有2至1,536个腔室，更优选4至384个腔室，甚至更优选16至96个腔室，其中全部或非全部腔室与电极阵列相关联。

在一些优选实施方案中，可以将商业组织培养板改装以适配所述盒。无底板也可以按优选尺寸定制。优选地，腔室的直径在腔室的底部(布置在基质上的端部)为约1毫米至约20毫米，更优选为约2毫米至约8毫米。腔室可以具有均匀的直径，或者可以朝向底部逐渐变细，使得容器在与基质接触的端部处的直径小于相对端的直径。

美国专利7,470,533以及美国专利7,192,752中描述的盒配置通常具有可移除的盖子，以允许通达每个腔室。为此，这样的盒系统可以通过从顶部移液来预装载靶细胞，但更常见由机器人通过顶部装载。之后添加效应细胞和/或双特异性衔接物，方式是移除盖子，并通过顶部添加细胞或双特异性衔接物。

在其他实施方案中，所述盒具有密封的顶部，其可以在预装载靶细胞之前或之后被密封。在这样的实施方案中，优选地提供通道系统，所述通道系统与所述盒的每个腔室连通，使得流体样品可以递送至每个腔室。在图1E中显示了一个实例，其中盒200被示出为具有可经由通道系统(虚线)通达的多个腔室210。还显示了用于传输氧气和/或CO2和/或其他气体分子通过腔室的气体输入250和输出260。

在一些实施方案中，通道系统包括同一个通道，所述通道被分成与每个腔室共享连通的子通道。如本文中使用的，术语“共享连通”表示，递送至盒中的样品被流体分开(fluidically divided)，输送到具有“共享连通”的一组腔室内的每个腔室中。当使用“共享连通”方法时，不需要(但有可能)将传入的样品等份输送给每个腔室。通过使用选择性地将流体传递到腔室中的单向阀，可以避免腔室自身之间的连通，以防止污染。为此，当将同一份样品同时或接近同时地添加至所有腔室时，共享连通可能是优选的。例如，本领域熟知的是，长时间维持培养中的细胞群需要有规律的培养基更换，因此，可以使用具有与每个腔室共享连通的入口的通道系统，用于所有腔室同时或接近同时地更换细胞培养基。类似地，这样的通道系统可以将气体诸如氧气和/或CO₂递送至每个成员腔室。如图1E所示，当将同一个群体的效应细胞(提供在生物反应器220中)，例如CAR-T细胞，递送至每个腔室210中时，例如为了针对预装载在这些腔室中的多个不同的靶细胞测试同一个群体的CAR-T细胞，也可以优选将同一份样品递送至所有腔室。因此，基于共享连通的通道系统更好地测试同一个群体的效应细胞和从相同组织起源获得的不同靶细胞(比如源自同一癌症的多种细胞系)。同样，它可以更好地测试同一个群体的效应细胞和从相同组织起源(例如乳房组织)获得的不同癌症分期的靶细胞。这样的配置还有助于测试同一个群体的效应细胞和来自不同起源(比如跨越不同癌症)的不同靶细胞。

在一些实施方案中，通道系统包括一个或多个通道，这些通道选择性地将样品递送到少于全部的腔室。这样的配置可以通过沿着盒外部的单独可区分(separate anddistinct)的端口而通达所述少于全部的腔室。在另一种方法中，可以通过盒内的内部流体密封阀系统选择性地进入所述少于全部的腔室，选择性递送可通过操纵该系统而实现。内部阀系统可包含一个或多个旋转阀、推阀、拉阀、夹管阀、电磁阀和/或其他阀，以选择性地将同一份样品递送到少于全部的腔室，例如选择性地递送到每一个腔室或单独一组腔室。在又另一种方法中，介电泳或其他物理机制可以作为阀来使用，以导引或阻止细胞(例如，效应细胞)传递到一个或多个腔室中。当测试不同的效应细胞与一组相同或不同的靶细胞，或者测试不同的双特异性衔接物与一组相同或不同的靶细胞时，选择性递送到少于全部的腔室可能是期望的。此外，对于提供评估靶细胞杀伤的阳性或阴性对照而言，通达单独的腔室可能是期望的。

在优选实施方案中，通道系统还包括每个腔室的出口通道，使得可以从每个腔室中除去流体(例如，液体和/或气体)。在一些实施方案中，各出口通道在下游合并，以便最终从所有腔室一起除去流体，但在其他实施方案中，各出口通道保持单独可区分，例如用于收集上清液以便测试是否存在来自单独的腔室的一种或多种分析物。

在一些实施方案中，用于更换培养基的入口通道用作用于从腔室收集上清液的出口通道，反之亦然。功能切换可允许仅在盒的一端制造一系列复杂的通道；然而，这样的实施方案对于临床用途可能是不太优选的。在其他实施方案中，如图1E所示，可以通过将试剂储存器225沿着传输管路230连接至阀245来更换培养基，以将介质泵送到腔室210中。

在优选实施方案中，本发明通过使操作人员与被培养的细胞(无论是靶细胞还是效应细胞)之间的接触最小化来维持无菌性。为此，所述盒可以通过手动方式装载(例如，移液)效应细胞(和/或双特异性衔接物)，但优选在没有显著暴露于操作者的情况下装载。在所述盒具有可移除的顶部的实施方案中，可以通过在清洁环境中使用机器人移除顶部来装载效应细胞和/或双特异性衔接物，以降低污染的可能性。在所述盒具有密封的顶部并使用通道系统引入样品的实施方案中，通道系统可以使用本发明所属领域已知的适合的泵和/或管路利用微流体流动来运输样品。

如图1E所示，在一些实施方案中，效应细胞在生物反应器220中培养，然后通过微流体流动运输至盒200。为此，可以给盒200提供适合的管路230、连接器、阀245和/或泵240，以建立流体连通和传输。因此，可以将盒200与任何适合的生物反应器220一起使用。

在一些实施方案中，将所述盒与波动摇摆生物反应器(例如，WAVE生物反应器，(GEHealthcare))联合使用。WAVE生物反应器是利用无创摇摆运动的一次性系统，可为细胞生长提供有效的混合和气体传输。这样的系统包括智能控制软件和传感器技术，其可以与本文中用于细胞-基质阻抗监测的控制系统联合。

当与WAVE生物反应器连接时，细胞-基质阻抗监测盒可以流体联接于与所述系统一起使用的相应细胞袋(Cellbag)(GE Healthcare)。所谓“流体(地)联接”的意思是，流体，诸如液体或气体，可以传递至所述盒，例如通过配置为用于传输液体或气体的管路、泵和阀从生物反应器而传递至所述盒。细胞袋(Cellbag)生物反应器是WAVE生物反应器系统的一个子集，其中提供了预消毒的一次性使用袋子，所述袋子包括进气口、出口过滤器、无针采样口、氧气探针插入口以及填充/收获口。细胞-基质阻抗监测盒可以使用适合的连接器、传输管路、微流体泵和微流体阀来加以改装，以适配所述收获口或采样口。可以通过本发明系统内的软件对任何外部泵和阀进行操作编程。在一些实施方案中，将细胞袋本身进一步用阻抗监测电极阵列加以改良，并将其联接至细胞-基质阻抗监测系统，以在将效应细胞递送至所述盒之前评估效应细胞的生长和活力。

所述盒本身优选地形成细胞-基质阻抗测量系统的一部分，所述系统还包括阻抗分析仪，所述阻抗分析仪以电子方式连接至细胞-基质阻抗测量盒；盒站(catridgestation)，其能够接合一个或多个盒，并具有能够选择多个腔室中的任何一个内的电极阵列并将其连接至阻抗分析仪的电子电路；和软件程序，其连接至所述盒站和阻抗分析仪，以控制盒站并根据阻抗分析仪进行数据采集和数据分析。

在细胞-基质阻抗测量系统中，阻抗分析仪接合一个或多个多室盒的连接垫，以便测量阻抗。在上述系统的一个实施方案中，阻抗分析仪能够测量在1Hz至1MHz的频率范围内、0.1欧姆与10⁵欧姆之间的阻抗。阻抗分析仪优选地能够测量阻抗的电阻和电抗(容抗和感抗)两个分量。在上述系统的优选实施方案中，阻抗分析仪能够测量在100Hz至100kHz的频率范围内的在0.1欧姆与10³欧姆之间的阻抗。

通过使用盒站的电路，进行从测量一个腔室中的阵列上的阻抗到测量另一个腔室中的阵列上的阻抗的记录的数字切换，可将细胞-基质测量系统用于有效且同时地执行多种测定法。这样的切换的分辨率在毫秒级内，因此几乎是同时的。

当所述盒连接至阻抗分析仪时，可以测量与细胞行为有关的阻抗值的差。例如，细胞-基质阻抗测量盒可用于测量细胞附着于电极阵列时和细胞未附着于电极阵列时的阻抗值的差，或者可以检测附着于构成所述设备的表面的电极的细胞的数量、类型、活性、粘附性或形态改变时的阻抗值的差。

细胞-基质阻抗监测盒优选地由具有用于定位一个或多个多室盒的一个或多个平台或一个或多个插槽的盒站来保持。一个或多个平台或一个或多个插槽可包括用于将所述盒电连接至盒站的插座、插头或其他盒。在细胞阻抗测量测定法期间，盒站优选可以定位在组织培养箱中。它可以与优选位于组织培养箱外部的阻抗分析仪和计算机电连接。

所述盒站具有可连接至阻抗监测盒和阻抗分析仪的电子电路，以及可接通和断开与系统中使用的多室盒的两个或更多个电极阵列中的每个电极阵列的连接的电子开关。盒站的开关受软件程序控制。所述软件程序指导盒站将盒的阵列连接至阻抗分析仪和监测来自一个或多个电极阵列的阻抗。在阻抗监测期间，阻抗分析仪可以监测一个频率或多于一个频率的阻抗。优选地，对于给定的测定法，在多于一个时间点进行阻抗监测，并且优选地，在至少三个时间点(包括在添加效应细胞之前和之后)监测阻抗。盒站可以将盒的阵列个别地连接至阻抗分析仪，以在测量时间点监测盒的一个、一些或全部阵列。盒站的开关允许在每个期望的监测时间点快速连续地监测选定的多个个体阵列。每个监测时间点实际上是测定中的一个狭窄的时间框(例如，从不到一秒到几分钟)，阻抗检测在该时间框内进行。在本发明的一些优选实施方案中，盒站软件是可编程的，以指令盒的任何包括阵列的腔室以给定的时间间隔监测阻抗。

阻抗监测系统的软件还可以存储和显示数据。数据可以显示在屏幕上和/或作为打印的数据显示。优选地，所述软件可以允许输入和显示实验参数，比如描述信息，包括细胞类型、化合物浓度、监测的时间间隔等。

优选地，所述软件还可以分析阻抗数据。在优选实施方案中，所述软件可以对多室盒的一个或多个腔室计算一个或多个时间点的细胞指数(CI)。在一些优选实施方案中，所述软件可以根据多室盒的一个或多个腔室的阻抗测量来计算细胞变化指数(CCI)。所述软件优选地可以生成关于时间的阻抗数据和阻抗值(例如但不限于CI或CCI)的绘图。所述软件还可以执行其他分析，例如从CI计算细胞数，基于阻抗数据生成剂量反应曲线，基于阻抗值计算IC值，以及基于阻抗值和阻抗值曲线计算细胞生长或行为的动力学参数。阻抗监测系统的软件还可以存储和显示数据分析，例如计算的阻抗值和从其得的动力学参数，数据可以显示在屏幕上和/或作为打印的数据显示。

C.作为比较参数的细胞指数和细胞变化指数

在一些实施方案中，可以绘制细胞-基质阻抗值并进行相互比较，以鉴定靶细胞群的变化。然而，基于在所测量的阻抗、细胞数(更准确地说，活细胞数或附着的细胞数)和细胞附着状态之间的依赖关系，有可能根据测得的阻抗频率谱得出所谓的“细胞数指数”或“细胞数”，其为在本发明的基于阻抗的测定法中进行定量和比较靶细胞行为提供了有用的指标。在优选实施方案中，根据阻抗得的基于阻抗的参数用于比较，以确定调节靶细胞群的效果。

细胞指数已在前面论述过。在本申请中，术语“细胞指数”还意在包括如美国专利7,470,583、美国专利7,192,752和美国专利7,470,533中的“细胞数指数”，将关于它们包含的细胞指数和细胞数指数的论述和公开内容各自通过提述并入本文。

本发明包括若干用于计算细胞指数的方法，所述细胞附着于细胞-基质阻抗盒的两个或更多个基本上相同的阵列上，其中在所述盒中监测细胞的阻抗变化。“基本上相同的电极阵列”或“基本上相同的阵列”的意思是，对于参考阵列而言，电极、电极结构和电极元件的尺寸和布置是相同的。因此，两个基本上相同的电极阵列将具有相同尺寸(长度、宽度、厚度)的电极结构，其中电极结构具有相同数量的电极元件，并且每个阵列中的电极结构和电极元件的布置相同。布置是指结构或元件之间的距离(间隙宽度)、它们相对于彼此的物理位置以及它们的几何形状(角度、曲率度、线上圆或构造如城的几何形状等)，包括可以连接至电极结构或电极元件的任何电极总线的相同特征。具有基本上相同的阵列的电极还包含相同的材料。为了计算走线电阻和细胞指数，基质可以具有任何数目的基本上相同的阵列。

阻抗(Z)具有两个分量，即电阻Rs和电抗Xs。在数学上，阻抗Z表示如下：

Z＝Rs+jXs, (1)

其中

描绘了对于(串联)电抗分量Xs，施加在它上面的电压与通过它的电流呈90度异相。对于(串联)电阻，施加在它上面的电压与通过它的电流同相。正如在电子和电气工程中熟知的，阻抗还可以用并联电阻Rp和并联电抗Xp表示如下：

Z＝Rp*(jXp)/(Rp+jXp), (2)

其中

但是，这些表述(串联电阻和串联电抗，或并联电阻和并联电抗)是等效的。根据另一种表述中的参数值，电气和电子工程领域的技术人员可以容易地得出一种表述形式。为了清楚和一致起见，本发明中的描述和讨论利用了串联电阻和串联电抗的表述。为了简单起见，串联电阻和串联电抗简单地称为电阻和电抗。

如美国专利7,470,533中描述的，其中与细胞-基质阻抗监测有关的公开内容通过提述并入本文，通过测量在任何适合的频率范围内的阻抗，可以完成细胞-基质阻抗监测，以便检测或测量阻抗变化。例如，可以在约1Hz至约100MHz的频率范围内测量阻抗。在另一个例子中，可以在约100Hz至约2MHz的频率范围内测量阻抗。阻抗通常是频率的函数，即，阻抗值随频率的变化而变化。可以在单个频率或多个频率下监测细胞-基质阻抗。如果在多个频率下进行阻抗测量，则获得频率依赖性阻抗谱，即，具有在每个测量频率下的阻抗值。如上所述，阻抗具有两个分量–电阻分量和电抗分量。电阻分量或电抗分量或这两者的变化都可以构成阻抗的变化。

如美国专利7,470,533中所述(其中测量电阻抗的方法的公开内容通过提述并入本文)，所述用于测量电(或电子)阻抗的方法通过以下方式实现：(1)在所述电极之间或之中施加给定频率(或多个频率，或具有特定电压波形)的电压，监测所述频率(或多个频率，或具有特定波形)时通过所述电极的电流，将电压幅值除以电流幅值，得到阻抗值；(2)施加单个频率分量(或多个频率或具有特定电流波形)的电流通过所述电极，监测所述频率(或多个频率，或具有特定波形)时在所述电极之间或之中产生的电压，将电压幅值除以电流幅值，得到阻抗值；(3)其他可以测量或确定电阻抗的方法。需要注意的是，上述“将电压幅值除以电流幅值，得到阻抗值”的描述中，“除以”是针对相同频率的电流幅值和电压幅值来进行的。正如电气和电子工程熟知的那样，在这样的计算(例如，上面提到的除法)中，电流幅值和电压幅值以复数表示，其中考虑了电流和电压的大小及电流和电压正弦波之间的相差。类似地，阻抗值也以复数形式表示，具有电阻和电抗分量这两者，如上式所示。

如在美国专利7,470,533中所述(其中与细胞指数或细胞数指数有关的公开内容通过提述并入本文)，所测得的细胞-基质阻抗可用于计算被称为细胞指数或细胞数指数的参数。基于细胞附着于电极结构时与没有细胞附着于电极结构的情况相比的电阻或电抗的变化，可以采用各种方法来计算这样的细胞数指数。电极结构上没有细胞附着但具有相同的细胞培养基的电极结构的阻抗(电阻和电抗)有时被称为基线阻抗。可以通过以下一种或多种方法获得基线阻抗：(1)测量具有无细胞培养基的电极结构的阻抗，其中无细胞培养基引入到包含所述电极结构的腔室中，其中所述培养基与用于监测细胞附着情况的阻抗测量时所用的培养基相同；(2)在将含细胞的培养基施加到包括腔室底部上的电极结构的腔室之后不久(例如10分钟)测量阻抗(在含细胞的培养基添加之后一段短时间内，细胞没有足够的时间附着于电极表面。这段短时间的长度可取决于电极表面上细胞的类型和/或表面处理或修饰)；(3)当腔室中的全部细胞被某种处理(例如高温处理)和/或试剂(例如洗涤剂)杀死时，测量电极结构的阻抗(使用这种方法的条件是，该处理和/或试剂不应影响电极上的培养基的介电性能)。

在一个实例中，可以通过以下方式计算细胞指数或细胞数指数：在每个测量频率下，通过将细胞存在和/或附着于电极时电极阵列的电阻除以基线电阻计算出电阻比，求出或确定频谱上的电阻比的最大值，并从电阻比的最大值减去1。

使用数学公式，细胞指数如下求出：

其中N是测量阻抗的频率点的数目。例如，如果用于测量的频率是10kHz、25kHz和50kHz，则N＝3，f₁＝10kHz，f₂＝25kHz，f₃＝50kHz。R_细胞(f_i)是在频率f_i下当细胞存在于电极上时电极阵列或电极结构的电阻(细胞基质电阻)，R_b(f_i)是在频率f_i下电极阵列或结构的基线电阻。

针对给定腔室获得的细胞指数反映：1)有多少细胞附着于这个腔室孔中的电极表面，2)细胞附着于腔室中的电极表面的程度。在这种情况下，零或接近零的“细胞指数或细胞数指数”指示没有细胞或非常少量的细胞存在于或附着于电极表面。换言之，如果电极上没有细胞，或者如果细胞未很好地附着于电极上，则R_细胞(f_i)与R_b(f_i)大约相同，从而导致细胞指数＝0。较高的“细胞数指数”值指示，对于相同类型的细胞和在相似生理条件下的细胞，较多的细胞附着于电极表面。换言之，在相同的生理条件下，电极上附着的细胞越多，所述值R_细胞(f_i)越大，导致细胞指数值越大。因此，细胞指数是对腔室中存在的细胞数的定量量度。较高的“细胞指数”值也可能指示，对于相同类型的细胞和相同数目的细胞，细胞在电极表面附着得更好(例如，细胞铺展得更开，或者细胞更强地粘附于电极表面)。

因此，对于腔室中存在的相同数目的细胞而言，细胞状态的变化将导致细胞指数的变化。例如，细胞粘附力或细胞铺展的增加导致大的细胞/电极接触面积，导致R_细胞(f)的增加和更大的细胞指数。另一方面，细胞死亡或毒性诱导细胞去附着、细胞聚集，导致较小的R_细胞(f)，从而导致较小的细胞指数。

在另一个实例中，可以通过以下方式计算细胞数指数：在每个测量频率下，通过将细胞存在和/或附着于电极时电极阵列的电抗除以基线电抗计算出电抗比，找到或确定频谱上的电抗比的最大值，并从电阻比的最大值减去1。

在这种情况下，零或接近零的“细胞数指数”指示没有细胞或非常少量的细胞存在于或附着于电极表面。较高的“细胞数指数”值则表明对于相同类型的细胞和在相似生理条件下的细胞，较多的细胞附着于电极表面。

在又另一个实例中，可以通过以下方式计算细胞指数：在每个测量频率下，从细胞存在或附着于电极时的电极阵列的电阻减去基线电阻，以确定细胞存在时的电阻相对于基线电阻的变化；然后求出或确定电阻变化的最大值。

在这种情况下，基于细胞存在时在测量频率范围内的电阻相对于基线电阻的最大变化，得出“细胞数指数”。这个细胞指数以欧姆为量纲。

在又另一个实例中，可以通过以下方式计算细胞指数：在每个测量频率下，计算阻抗的大小(等于

其中R_s和X_s分别是串联电阻和电抗)；从细胞存在或附着于电极时的电极阵列的阻抗的大小减去基线阻抗的大小，以确定细胞存在时的阻抗大小相对于基线阻抗的变化；然后求出或确定阻抗大小变化的最大值。

在这种情况下，基于细胞存在时在测量频率范围内的阻抗大小相对于基线阻抗的最大变化，得出“细胞数指数”。这个细胞指数以欧姆为量纲。

在又另一个实例中，可以通过以下方式计算该指数：在每个测量频率下，通过将细胞存在或附着于电极时的电极阵列的电阻除以基线电阻计算出电阻比；然后通过从电阻比中减去1计算出在每个测量频率下的电阻的相对变化；然后对所有相对变化值进行积分(即，将不同频率下的所有相对变化值求和)。

在这种情况下，“细胞数指数”是基于多个频率点而不是如上面的实例那样基于单个峰值频率得出的。同样，零或接近零的“细胞数指数”指示电极上无细胞存在。较高的“细胞数指数”值指示，对于相同类型的细胞和在相似生理条件下的细胞，较多的细胞附着于电极。

在又另一个实例中，可以通过以下方式计算细胞指数：在每个测量频率下，从细胞附着于电极时电极阵列的电阻减去基线电阻，以确定细胞存在时的电阻相对于基线阻抗的变化；(这里，频率f_i下的电阻的变化为ΔR(f_i)＝R_s-细胞(f_i)＝R_s-细胞(f_i)-R_s-基线(f_i)，R_s-细胞和R_s-基线分别是细胞存在于电极阵列时的串联电阻和基线串联电阻)；分析电阻变化的频率依赖性，以得出可以量化这种依赖性的某些参数。在一个实例中，这样的参数可以被计算为

在另一个实例中，这样的参数可以计算为

将所述参数用作细胞指数或细胞数指数。

在这种情况下，基于对电阻变化的频谱的分析，得出“细胞数指数”。取决于如何计算参数，细胞指数可以欧姆为量纲。

在又另一个实例中，可以通过以下方式计算细胞指数：在每个测量频率下，计算阻抗的大小(等于

R_s和X_s分别是串联电阻和电抗)；从细胞附着于电极时电极阵列的阻抗的大小减去基线阻抗的大小，以确定细胞存在时阻抗的大小相对于基线阻抗的变化；(这里，频率f_i下阻抗大小的变化由ΔZ(f_i)＝|Z_细胞(f_i)|-|Z_基线(f_i)给出，

R_s-细胞和X_s-细胞分别是细胞存在于电极阵列上时的串联电阻和电抗，|Z_细胞(f_i)|是细胞存在于电极阵列上时电极阵列的阻抗的大小，|Z_基线(f_i)|是电极阵列的基线阻抗的大小)；分析阻抗大小变化的频率依赖性，以得出可以量化这种依赖性的某些参数。在一个实例中，这样的参数可以被计算为

在另一个实例中，这样的参数可以计算为

将所述参数用作细胞指数或细胞数指数。

在这种情况下，基于对阻抗大小变化的频谱的分析，得出“细胞数指数”。取决于如何计算参数，细胞指数可以欧姆为量纲。

如美国专利7,470,533、PCT申请号PCT/US03/22557和美国专利7,192,752中所述，将细胞指数或细胞数指数及其计算的公开内容通过提述并入本文，根据测量的细胞-基质阻抗(电阻或电抗)来计算被称为细胞指数或细胞数指数的参数的不同方法有多种。细胞指数或细胞数指数是在细胞-基质阻抗测量下对腔室内细胞的定量量度。

值得指出的是，对于利用阻抗信息来监测电极上的细胞状况而言，得出这样的“细胞数指数”不是必须的。实际上，人们可以选择直接使用测量的阻抗(例如，在单个固定频率下；或在最大相对变化频率下，或在多个频率下)作为细胞状况的指标。如果将测量的阻抗值直接用于监测细胞状况，则可以使用电阻或电抗或使用电阻和电抗两者。

然而，导出“细胞指数”或“细胞数指数”并使用这样的指数来监测细胞状况可能具有优势。使用“细胞数指数”来监测细胞生长和/或附着和/或活力状况有几个优势。

首先，人们可以利用这样的细胞数指数来比较不同的电极几何形状的性能。

其次，对于给定的电极几何形状，有可能通过对添加至电极上的不同数目的细胞进行阻抗测量来构建“校准曲线”，以描绘细胞数与细胞数指数之间的关系(在这种实验中，确保接种的细胞与电极表面的附着良好是非常重要的)。利用这样的校准曲线，当进行新的阻抗测量时，那么有可能根据新测量的细胞数指数来估计细胞数。

第三，细胞数指数也可以用来比较不同的表面状况。对于相同的电极几何形状和相同数目的细胞，表面处理给出的细胞数指数越大，表明细胞与电极表面的附着越好和/或表面越适宜细胞附着。

如上所示，对于一些计算细胞指数或细胞数指数的方法，知晓电极结构上有无细胞存在时的电极结构的阻抗(电阻和/或电抗)是重要的。根据等式(1)，电极阵列(电极上有或无细胞存在)的阻抗由下式给出：

Z_电极阵列＝Z_总-Z_迹线-Z_开关 (4)

其中Z_开关是电子开关在其导通阶段的阻抗，Z_迹线是连接垫和电极总线之间的基质上的电连接迹线(或导电迹线)的阻抗，Z_总是在阻抗分析仪上测得的总阻抗。通过选择质量好的电子开关，有可能使所有电子开关具有一致的导通阻抗(主要是电阻)。例如，电子开关的导通电阻可以约为3欧姆(+/-10％)，而导通电抗可以忽略不计(例如，在感兴趣的频率范围内小于0.2欧姆)。因此，如果确定或计算出迹线阻抗，则可以使用公式(4)来计算有或无细胞存在时的电极阵列的阻抗。

在一些实施方案中，用于比较的参数是归一化细胞指数。给定时间点的“归一化细胞指数”通过将所述时间点的细胞指数除以参考时间点的细胞指数计算出。因此，参考时间点的归一化细胞指数为1。归一化细胞指数是对特定时间点的细胞指数归一化的细胞指数。在本申请的大多数情况下，归一化细胞指数是相对于刚好在化合物添加或处理之前的时间点进行归一化得出的。因此，在这样的时间点(刚好在化合物添加之前)的归一化细胞指数对于所有腔室总是为单位1。使用这样的归一化细胞指数的一种可能的益处是消除不同腔室中细胞数差异的影响。具有较多细胞的腔室在化合物处理后可能产生较大的阻抗响应。使用归一化细胞指数，有助于消除由不同细胞数引起的这种变异。

给定时间点的“Δ细胞指数”通过从给定时间点的细胞指数中减去标准时间点的细胞指数计算出。因此，Δ细胞指数是细胞指数从初始时间(标准时间点)到测量时间的绝对变化。

在一些实施方案中，“细胞变化指数”用作用于比较的参数。可以通过导出直接反映细胞状态变化的参数来分析时间依赖性的细胞响应(包括细胞溶解响应)。例如，可以通过以下方式分析时间依赖性细胞响应：计算测量的阻抗响应变化的斜率(相当于阻抗响应相对于时间的一阶导数，这里的阻抗响应可以是测量的阻抗数据或导出值，比如细胞指数、归一化细胞指数或Δ细胞指数)。在另一个实例中，可以分析时间依赖性细胞响应(包括细胞溶解响应)的相对于时间的较高阶导数。这样的高阶导数可以提供关于细胞如何响应于不同化合物以及化合物作用机制的附加信息。

作为示例，我们描述了如何能够基于RT-CES系统提供的关于腔室中细胞的生物状态的实时定量信息(即细胞指数，CI)导出被称为细胞变化指数的参数。这个新参数(细胞变化指数(CCI))可以有效地将时间依赖性细胞指数I与细胞状态相关联，这个新参数计算如下：

因此，CCI是细胞指数的归一化变化率。CCI值可用于定量描述细胞状态变化。对于在常规细胞培养条件下呈指数生长的细胞，通过本文描述的细胞-基质阻抗监测系统确定的细胞指数预期是腔室中细胞数的成比例的度量，因为细胞形态和细胞与电极表面的平均粘附程度在整个细胞群中不表现随时间推移的显著变化。因此，细胞指数(CI)遵循指数函数随时间增加，使得

其中DT是细胞倍增时间。对于这样的指数生长培养物，CCI(t)是恒定的，假定

因此，几种类型的CCI(t)可以分类为：

如果CCI约为0.7/DT，则细胞指数以与细胞的指数生长的预期相同的速率增长。

如果CCI>>0.7/DT，则细胞指数增长快于细胞的指数生长(或对数生长)的预期。这表明细胞的生长可能比正常的指数生长更快，或细胞可能表现出某种形态变化(例如，细胞铺开或更好地粘附于电极表面)，以至于产生大的阻抗信号，或上述两种影响都有，或者可能存在测定或培养条件下特有的其他细胞行为。

如果CCI大于零但略小于0.7/DT，则细胞指数以比指数生长的预期更慢的速率增长。这表明细胞生长速率相对于指数增长可能减慢，或者细胞生长可能会因添加至培养基的化合物或其他细胞培养参数而受到某种程度的抑制，或者某些细胞群正在相继死亡并从电极表面脱离，或者可能存在测定或培养条件下特有的其他细胞行为。

如果CCI大约为零，则细胞指数显示接近恒定的值。这可能表明细胞生长几乎被完全抑制。例如，所有细胞都在细胞周期的某些点停滞，并且没有进一步进展。或者，这可能表明在培养物中正在相继死亡的细胞的数量几乎与新分裂细胞的数量一样。或者，这可能表明细胞达到了细胞培养的静止期。或者，这可能表明细胞数高于细胞-基质阻抗监测系统的检测上限。还有可能发生在测定或培养条件下特有的其他细胞行为。

如果CCI为负，则细胞指数正在随着时间的推移而降低，表明细胞丧失了与电极表面的附着或改变了它们的形态。

如果CCI为很大的负值，则细胞指数随时间的推移迅速降低，表明细胞迅速丧失与电极表面的附着，或细胞非常迅速地改变它们的形态。

C.癌细胞的细胞-基质阻抗监测

将细胞-基质阻抗监测盒和系统应用于评估建议的抗癌治疗剂对癌细胞的作用的方法。这样的抗癌治疗剂可以具体化为化合物，比如双特异性衔接物，或基于细胞的治疗剂，比如工程化免疫细胞(例如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞))。无论如何，建议的抗癌治疗剂应在预装载有靶细胞(具体化为癌细胞)的细胞-基质阻抗监测盒上进行测试。通过提供预装载有细胞的盒，操作者可以在无需维持癌细胞培养的情况下测试抗癌治疗剂的效果，而维持癌细胞培养可能既费时又有技术挑战。此外，通过预装载一组不同谱系、起源或分期的不同癌细胞，并且通过改造盒使之适于与生物反应器一起用于培养效应细胞，所述方法可以提供对有潜力的治疗剂(比如，工程化免疫细胞，比如CAR-T细胞，双特异性衔接物)对不同癌细胞群的效果的有效初步筛选。

在一个示例性方法中，提供了一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述包括提供细胞-基质阻抗监测盒，所述盒包括具有配置为测量细胞-基质阻抗的电极阵列的腔室，其中所述腔室预装载有具体化为癌细胞的靶细胞；向所述腔室添加效应细胞与靶细胞相互作用，其中所述效应细胞是经工程改造以展示疑似结合靶细胞的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞；在添加效应细胞之前和之后监测所述腔室的细胞-基质阻抗，以及任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；并且通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞对靶细胞的杀伤效果。

在另一个示例性方法中，提供了一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述方法包括提供细胞-基质阻抗监测盒，所述盒包括预装载有靶细胞的腔室，其中所述靶细胞是癌细胞；向所述腔室添加效应细胞，其中所述效应细胞是免疫细胞；向所述腔室添加双特异性衔接物，其中所述双特异性衔接物是被配置为将效应细胞桥接至靶细胞的分子；监测随时间推移的所述腔室的细胞-基质阻抗，所述时间包括在添加双特异性衔接物的步骤之前和之后，并任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞响应于双特异性衔接物的杀伤效果。

本发明的各种方法有一种共同的手段：使用细胞-基质阻抗监测来评估癌细胞响应于添加一种或多种建议的治疗剂的细胞溶解、附着、增殖和形态学变化，不论所述治疗剂是化合物(例如双特异性衔接物(BiTe))、细胞(例如工程化CAR-T)还是处于病毒(溶瘤病毒)的形式。通过提供预装载有不同谱系、分期或起源的一种或多种癌细胞的盒，可以确定对具有不同特征的癌症的特异性或效果，并因此评估作为治疗患者的疗法的价值。

虽然操作者理论上可以自行培养癌细胞并装载到盒上，但实际上已经发现，对许多最终用户而言，维持多种不同的细胞培养物可能过于耗时，而且技术上难以胜任。为此，已经开发出这样的系统：其维持多种不同的癌细胞培养物，并提供预装在细胞-基质阻抗监测盒中的细胞培养物；所述盒以可立即组装到生物反应器上的形式配送给操作者或最终用户，用于测定癌细胞的细胞溶解，同时保持无菌性。此外，由于盒本身自带细胞-基质阻抗测量电极阵列，因此在收到后，操作者可以通过将盒接合在阻抗系统的盒托盘中并监测培养物的细胞-基质阻抗来评估细胞的活力或状态。此外，通过提供可单独寻址的电极阵列，所述基于阻抗的系统可以独立于其他腔室评估每个腔室内的细胞的活力和形态。

预装载的癌细胞可以是原代癌细胞，但在大多数实施方案中，癌细胞是来自相同或不同起源的癌细胞系。“起源”表示细胞源自相同的组织或相同的来源。不同起源的组织的非限制性实例包括乳腺组织、肺组织、结肠组织、间充质细胞或成纤维细胞(例如纤维肉瘤)、前列腺组织、肾脏组织、表皮组织、肝组织和卵巢组织。在一些实施方案中，提供了来自相同起源的不同靶细胞。在这样的实施方案中，盒中可以预装载属于不同的细胞系或分期，但为同一个起源(例如，乳腺癌的不同细胞系或不同分期)的靶细胞。

图2中显示了预装载板的实例，其中将不同起源的癌细胞布置在不同的列中，并且将同一个起源的不同癌细胞布置在在多个列内的每个孔中。如图2所示，可以预装载的癌细胞的非限制性实例包括从一种或多种癌症获得或衍生的细胞，所述癌症比如乳腺癌(B1-8)、肺癌(L1-8)、结肠癌(C1-8)、纤维肉瘤(F1-8)、前列腺癌(P1-8)、肾癌(K1-8)、表皮癌(E1-8)、肝癌(V1-8)和卵巢癌(O1-8)。同样，在以上的每一者中，垂直列代表来自同一个起源的不同靶细胞。例如，通常将癌症按照癌前状态、0期、1期、2期、3期或4期的顺序分期。为此，可以根据分期对衍生自相同癌症(比如乳腺癌)的细胞进行分组并且预装载。即，对乳腺癌特异的盒可具有预装载有从每个分期获得的癌细胞的腔室，所述分期比如癌前状态或0期(B1)、1期(B2)、2期(B3)、3期(B4)和4期(B5)。

在一些实施方案中，将预装载的癌细胞培养，然后在配送前几天内将其预装载到盒中；但是在优选实施方案中，将癌细胞预装在盒中，并在配送前培养至少一周，以确保反应性培养物的存在。从实验上已经发现，培养癌细胞可能需要数周才能建立反应性培养物；然而，这样的时间本身对于本发明而言不是限制性的。将靶细胞添加至腔室后，允许它们沉降在电极表面上。细胞群的细胞-基质阻抗监测可以在与电极表面接触时开始。随着培养物开始粘附在电极上并生长，细胞阻碍腔室内的电流，并且细胞-基质阻抗的测量值升高。因此，虽然可以目视监测细胞，例如通过显微镜，但优选以电子方式通过监测细胞-基质阻抗考虑细胞是否适合配送。一旦通过细胞-基质阻抗监测认为整个盒中的培养物是稳定和反应性的，就可以配送盒。

在收到盒后，在使用之前，用户让细胞重新安置在电极上。可以使用盒的细胞-基质测量特征来确定细胞的状态。

一旦测定开始，监测经历至少两个时间点的阻抗，但是经常监测经历许多时间点上的阻抗，以建立基线阻抗、阻抗曲线和/或基于阻抗的曲线。基线可供比较用于确定在添加建议的治疗剂之后是否发生细胞溶解。

当治疗剂具体化为工程化效应细胞(例如CAR-T细胞)时，可以将细胞-基质阻抗监测盒与容纳效应细胞的培养装置联接。例如，可以在生物反应器比如WAVE生物反应器系统(GE Healthcare)中培养CAR-T细胞。在这样的实施方案中，细胞-基质阻抗监测盒可以流体联接于生物反应器，使得效应细胞可以在不暴露于外部环境的条件下被递送至盒内的一个或多个腔室，由此维持无菌培养。这是通过使用转接器和/或联接器来实现的，所述转接器和/或联接器将传输管路的一端附接至生物反应器，另一端附接至所述盒。在两端之间有一个或多个阀门和/或泵，用于调节进入盒中的细胞流动。在另外的实施方案中，通过一个或多个阀或通过介电泳或通过其他用于控制流体流动的物理机制来调节盒内的每个腔室之间的流动。

当将治疗剂具体化为双特异性衔接物时，可以与上述用于CAR-T细胞传输的方法基本上相同的方式传输效应细胞。另外，容纳有实验性双特异性衔接物的储库通过连接至传输管路而流体联接于细胞-基质阻抗监测盒，并使用泵将其泵送到腔室中。

在一些实施方案中，直接随时间推移比较阻抗，以评估靶细胞群的变化。在其他实施方案中，根据阻抗计算基于阻抗的参数，比如细胞指数、细胞变化指数、归一化细胞指数或细胞数，并进行随时间推移的比较。上面详细描述了确定基于阻抗的参数的方法。此外，可以在不同治疗剂量上比较阻抗或基于阻抗的参数，以确定IC50以便在治疗剂之间进行比较。

在一些实施方案中，基于阻抗的参数是细胞数(活细胞数)，其可以根据细胞指数得出。当确定建议的针对癌细胞的抗癌治疗的效果时，确定活细胞的数目可能是有用的。在测定癌细胞杀伤时，人们通常感兴趣的是，响应于治疗剂杀伤了每个谱系、起源或分期的多少靶细胞或多少百分比的靶细胞，从而精确计量其对于多个谱系、起源或分期的特异性或效果。因此，可以在测定法期间的任何时间点使用细胞-基质阻抗监测系统确定靶细胞的数量或活力。因此，在一些实施方案中，所述方法包括在添加建议的治疗剂之前和添加建议的治疗剂之后使用细胞-基质阻抗监测来维持靶细胞计数，以确定活力百分比或靶细胞杀伤百分比。本文档提供了根据细胞指数计算细胞数的方法。

为了证明所述系统与具体化为癌细胞的靶细胞一起使用的适用性，图4证明了细胞-基质阻抗系统监测癌细胞增殖的能力。在本实验中，将H460细胞引入到细胞-基质阻抗监测系统的16室盒(16X E-Plate)的腔室中，其中不同的腔室接受不同的初始细胞接种量。将所述盒与位于组织培养箱中的系统的盒站接合，所述培养箱保持温度为37℃，气氛为5％CO₂。以15分钟的间隔监测细胞-基质阻抗，持续125个小时。系统计算出每个时间点的细胞指数，并将其显示为时间的函数，以给出针对每个细胞接种量的细胞生长(增殖)曲线。细胞生长曲线以对数标度绘制，显示指数生长期和静止期。

为了演示可以在癌细胞对抗癌化合物反应的过程中测量细胞-基质阻抗的剂量依赖性变化，图5显示了代表用不同浓度的抗癌药紫杉醇处理的H460细胞的时间依赖性细胞指数的曲线。在本实验中，将H460细胞引入到16X细胞-基质阻抗监测盒(16X E-Plate)的腔室中。将所述盒放置在位于培养箱中的盒站上，所述培养箱保持条件为37℃和5％CO₂。培养细胞并在其指数生长期用不同浓度的紫杉醇处理。通过在处理之后使用细胞-基质阻抗监测系统实时监测细胞-基质阻抗来监测细胞对不同剂量紫杉醇的动态反应，每15分钟一次，持续50小时。细胞-基质阻抗监测系统在每个监测的时间点计算细胞指数，并将细胞指数绘制为时间的函数。对于在67纳摩尔和500纳摩尔之间的紫杉醇浓度，加入化合物之后，H460细胞在细胞指数方面表现出逐渐下降。然而，取决于化合物浓度，在添加化合物之后约15小时至20小时之间，细胞指数在某时达到最小值。在此时间点之后，这些腔室的细胞指数逐渐上升。直到在添加化合物之后约15小时，33纳摩尔的化合物浓度的细胞指数表现出接近恒定的值。在添加化合物后15小时之后，细胞指数表现出逐渐上升。

图6显示了代表用抗癌药AC101103处理的H460细胞的时间依赖性细胞指数的曲线。将H460细胞引入到16X细胞-基质阻抗监测盒(16X E-Plate)的腔室中。将所述盒放置在位于培养箱中的盒站上，所述培养箱保持条件为37℃和5％CO₂。培养细胞并在其指数生长期用不同浓度的AC101103处理。通过在处理之后在细胞-基质监测系统上实时测量阻抗来监测细胞对不同剂量AC101103的动态反应，每30分钟一次，持续20小时。

值得注意的是，图6中的时间依赖性细胞指数与图5中所示的显著不同。对于3.125微克/mL、6.25微克/mL和12.5微克/mL的化合物浓度，细胞指数分别在约5小时、约15小时和>20小时表现出接近恒定的值。对于3.125微克/mL和6.25微克/mL的化合物浓度，在添加化合物后约5小时和约15小时之后，细胞指数开始上升。对于25微克/mL的化合物浓度，在添加化合物之后，细胞指数有逐渐而缓慢的下降。对于50微克/mL的化合物浓度，在约10小时的时间段内，细胞指数保持接近恒定，此后细胞指数平稳下降。

图7显示了用多柔比星处理的A549细胞的动态药物反应曲线。将10,000个A549细胞接种在16X盒(16X E-Plate)的每个腔室中。将所述盒放置在位于培养箱中的盒站上，所述培养箱保持条件为37℃和5％CO₂。在处理之前，通过以规律间隔监测阻抗，在细胞-基质阻抗系统上实时监测细胞附着和细胞生长。当细胞处于指数生长期时，将不同浓度的多柔比星添加至所述腔室。一些腔室中添加相同体积的用于溶解药物的溶剂作为对照。如本图所示，在细胞-基质阻抗监测系统上实时记录了对多柔比星的时间和药物剂量依赖性细胞反应(计算为细胞指数)。

尽管以上总结的实验演示了细胞-基质阻抗可直接用于监测响应于施用抗癌化合物的癌细胞群的变化，但是本发明还确定了响应于效应细胞存在的癌细胞杀伤效果。图3提供了可以添加至盒的腔室中以评估癌细胞杀伤的不同效应细胞的概览。

在将效应细胞添加至含有靶细胞的腔室中之前和之后，应该测量细胞-基质阻抗。由于效应细胞悬浮在腔室中，它们基本上不干扰腔室中的传感器电极。因此，响应于效应细胞添加的阻抗变化几乎完全是由于靶细胞群的变化所致。

效应细胞可以是任何能够杀伤或溶解靶细胞、或呈递或标记靶细胞(比如通过用抗体标记靶细胞的表面)以被另一效应细胞溶解细胞。作为非限制性实例，效应细胞可以是自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、T细胞、基因修饰的T细胞或NK细胞和具有细胞溶解活性的细胞类型。此外，T细胞可以选自下组：辅助性T细胞(Th细胞)、细胞毒性T细胞和记忆T细胞。

如此，所述方法提供了一种通过确定抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、双特异性抗体介导的细胞毒性、CAR-T介导的细胞毒性、补体介导的细胞毒性、补体依赖性效应细胞介导的细胞毒性和至少部分依赖于效应细胞的其他细胞毒性来确定效应细胞对靶细胞的细胞毒活性的方法。

在一些实施方案中，将效应细胞进一步工程改造以增加外源性化合物(例如但不限于白细胞结介素2)的表达，以促进效应细胞的生长、增殖或持久性。可以将效应细胞以与靶细胞预定的比例添加至一个或多个腔室或流体容器中。免疫学领域的技术人员将能够提供或确定效应细胞与靶细胞的适当比例。

本发明还提供了能够激活、失活或刺激效应细胞的化合物或因子的添加。这样的化合物可能因效应细胞不同而变化，但可以包括脂多糖(LPS)、抗体、辅助化合物、从化合物文库中获得或筛选的化合物等。因此，所述化合物或因子可以是生物学领域中用于刺激效应细胞的任何适合的化合物或因子。作为非限制性实例，化合物可以是单克隆抗体、多克隆抗体、肽、蛋白质、脂质、生物分子、核酸分子、裸DNA分子等。可以获得或提供用于本发明的多种抗体，例如但不限于IgG、IgM、IgE、IgA以及重链部分、轻链部分(包括κ和λ轻链)、Fc部分、Fab部分、Fab’2部分等。抗体可以是人源化的，也可以是跨物种的。

类似地，另外的细胞类型或细胞系可以配备效应细胞。这样的细胞包括但不限于辅助细胞。

在一些实施方案中，将检查点抑制剂添加至腔室以增强癌细胞杀伤效果。检查点抑制剂的目的是通过阻断癌细胞上的正常蛋白质而突破癌症针对免疫系统攻击的一种主要防御手段。检查点抑制剂的实例包括其靶向效应细胞表面上的PD1、CTLA-4、CD137、OX40、CD27、CD40L、TIM3，或它们在靶细胞表面上的相应同源配体的抗体或抗体片段，。

抗体依赖性细胞介导的毒性(ADCC)是一种细胞介导的免疫防御机制，其中免疫系统的效应细胞主动溶解靶细胞，所述靶细胞的膜表面抗原已被特异性抗体结合。在人类中，ADCC通常由IgG介导。经典的ADCC由自然杀伤(NK)细胞介导；但是巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导它。由于ADCC依赖于先前的抗体应答，因此它是适应性免疫应答的一部分。

IgG恒定区的一种特异性受体，称为FcγRIII，在NK细胞膜上表达，并介导NK细胞活化和随后的ADCC。ADCC是抗体的抗肿瘤活性的主要组成部分。人们认为某些肿瘤带有可被体液免疫系统识别的抗原。抗体与肿瘤细胞上的抗原的随后相互作用将标记肿瘤细胞，通过先天免疫组分例如NK细胞使肿瘤细胞死亡。

因此，提供了一种筛选抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括提供与阻抗分析仪可操作连接的细胞-基质阻抗监测盒，其中所述盒包括用于接收细胞的腔室和位于腔室底部的电极阵列；向腔室添加被表征为癌细胞的靶细胞；向腔室添加建议的能够与靶细胞相互作用的治疗剂；向腔室添加效应细胞；在添加效应细胞之前和之后监测腔室的细胞-基质阻抗，以及任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；并且通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞对靶细胞的杀伤效果。比较可以是将阻抗或基于阻抗的参数与同一个腔室或与正或负对照室进行比较的方式。在一些实施方案中，效应细胞与癌细胞来自同一受试者。在其他实施方案中，将不同的癌细胞预装载在不同的腔室中。不同癌细胞的非限制性实例包括不同谱系、起源或分期的癌细胞。

在一些实施方案中，建议的治疗剂是双特异性衔接物。这样，将添加建议的治疗剂的步骤可以进一步定性为：将双特异性衔接物添加至具有靶细胞的腔室以形成测试室，其中双特异性衔接物是具备将效应细胞桥接至靶细胞的配置的分子。双特异性衔接物是指连接在一起的两个多肽，其中一个多肽结合效应细胞或靶细胞，另一个肽结合其余的效应细胞或靶细胞，由此将效应细胞连接至靶细胞。双特异性衔接物可与巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞一起使用。然而，双特异性衔接物优选地是将T细胞结合至癌细胞的双特异性T细胞衔接物(BiTe)。

因此，一种评估癌细胞上的细胞溶解活性的方法可包括：提供细胞-基质阻抗监测盒，所述盒包括预装载有不同靶细胞的不同腔室，其中所述不同靶细胞是具有不同谱系、起源或分期的癌细胞；向至少一个腔室添加效应细胞以形成至少一个测试室，其中效应细胞是免疫细胞；向所述至少一个测试室中添加双特异性衔接物，其中所述双特异性衔接物是具有将效应细胞桥接至靶细胞的配置的分子；监测随时间推移的所述至少一个测试室的细胞-基质阻抗，所述时间包括在添加双特异性衔接物的步骤之前和之后，并任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞响应于双特异性衔接物的杀伤效果。

示例性靶细胞具有衍生自选自下组的一种或多种癌症起源的癌细胞谱系、细胞系或分期，该组的组成为：乳腺癌、肺癌、结肠癌、纤维肉瘤、前列腺癌、肾癌、表皮癌、肝癌和卵巢癌。

效应细胞可以是自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞或B细胞。当效应细胞是T细胞时，T细胞选自下组的一种或多种，该组的组成为：辅助性T细胞(Th细胞)、细胞毒性T细胞和记忆T细胞。

在优选实施方案中，双特异性衔接物结合T细胞表面模块(称为BiTe)，任选地为分化簇3(CD3)。BiTe是具有两个不同结构域的修饰的抗体形式。一个结构域识别在靶细胞(比如肿瘤细胞)中表达的特异性抗原，另一个结构域识别并结合T细胞受体复合物的CD3亚基。通过结合CD3亚基，修饰的抗体激活表达CD3的免疫细胞(比如细胞毒性T淋巴细胞)，并促进免疫细胞对靶细胞的破坏。

在一些实施方案中，基于阻抗的参数是细胞指数，或者是对添加双特异性衔接物之前的时间点归一化的归一化细胞指数。在一些实施方案中，基于阻抗的参数是基于阻抗的曲线，在进一步的实施方案中，通过随时间推移比较基于阻抗的曲线来确定效应细胞对靶细胞的杀伤效果。通常，降低的阻抗或基于阻抗的参数指示效果增强。在相关实施方案中，通过计算和比较靶细胞的细胞溶解百分比来确定效应细胞对靶细胞的杀伤效果。

在一些实施方案中，所述测定法还包括监测对照室的阻抗，无论是正的还是负的。例如，所述方法可包括将阴性对照化合物添加至谱系、起源或分期相同的预装载癌细胞，以形成未将效应细胞连接至靶细胞的对照室，监测对照室的阻抗并且任选地根据对照室的阻抗得出基于阻抗的参数；以及比较对照室和测试室之间随时间推移的阻抗或基于阻抗的参数，以确定添加双特异性衔接物是否增强了效应细胞对靶细胞的杀伤。

在一些实施方案中，将检查点抑制剂添加至腔室以增强癌细胞杀伤效果。检查点抑制剂的目的是通过阻断癌细胞上的正常蛋白质而突破癌症针对免疫系统攻击的主要防御之一。检查点抑制剂的实例包括靶向效应细胞表面上的PD1、CTLA-4、CD137、OX40、CD27、CD40L、TIM3或它们在靶细胞表面上的相应同源配体的抗体或抗体片段。

此外，本发明的优点包括有效测试过继性细胞转移治疗方法的能力。过继性细胞转移(ACT)是通常涉及将患者的自身免疫细胞工程改造以识别和攻击肿瘤及其他癌细胞的方法。虽然仍处于临床试验中，但许多患者的癌症已完全消失，并且若干患者长期保持无癌症。

最常见的ACT方法涉及嵌合抗原受体(CAR)T细胞。CAR-T细胞是经基因工程改造在其表面产生特殊的受体(嵌合抗原受体)的T细胞，这些嵌合抗原受体使得T细胞能够识别肿瘤细胞上的特异性抗原。然后在实验室中培养这些工程化细胞，将其输注到患者体内。然后，T细胞在患者体内增殖，并靶向展示特异性抗原的癌细胞。

因此，本发明提供了一种确定建议的过继性细胞转移(ACT)疗法对癌细胞的效果的方法，所述方法通过以下方式实现：监测响应于添加工程化免疫细胞(比如CAR-T细胞)的癌细胞的细胞-基质阻抗；并比较随时间推移测量的阻抗或基于阻抗的参数(例如细胞指数、归一化细胞指数、细胞变化指数、通过细胞指数计算的细胞数)，以评估癌细胞杀伤效果。一种示例性方法包括提供与阻抗分析仪可操作连接的细胞-基质阻抗监测盒，其中所述盒装载有靶细胞，其中靶细胞是癌细胞；向腔室添加效应细胞以形成测试室，其中效应细胞是免疫细胞，进一步地，其中效应细胞被工程改造以展示疑似与至少一些靶细胞结合的结合模块，比如为工程化CAR-T细胞；在添加效应细胞之前和之后监测测试室的细胞-基质阻抗，并且任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞的杀伤效果。在一些实施方案中，靶细胞是添加到不同孔中的不同谱系、起源或分期的不同癌细胞。在一些实施方案中，将效应细胞在生物反应器中培养，并通过传输管路借助于泵送细胞培养物递送至目标孔。

虽然主要就CAR-T细胞进行了描述，但所述方法也可以适用于自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞等效应细胞。

采集诸如T细胞的效应细胞的方法是本领域熟知的，并且通常包括使用一种或多种方法，例如密度离心、表面标志物检测或结合、流式细胞术分选及其他方法从血液样品中纯化。可以使用免疫学领域已知的方案进行细胞比如CAR-T细胞的基因工程改造。在更进一步的实施方案中，CAR展示与癌细胞结合的单链片段可变区(scFv)。在其他实施方案中，单个CAR展示结合相同或不同癌细胞谱系的表面上的不同模块(针对相同或不同的蛋白质)的多个scFv区。在进一步的实施方案中，使用免疫学领域已知的噬菌体展示技术获得scFv。相关地，在一些实施方案中，所述方法还包括将效应细胞工程改造为表达外源蛋白质的步骤，所述外源蛋白质形成CAR的一部分。

在一些实施方案中，将效应细胞工程改造为展示靶向在相同或不同癌细胞的表面上的多种蛋白质的多种不同的CAR。

在进一步的实施方案中，将效应细胞进一步工程改造以增加外源性化合物(任选地白细胞介素2)的表达，以促进效应细胞的生长、增殖或持久性。

所述方法可用于测定在嗜中性粒细胞或抗MHC抗体存在下的补体介导的细胞毒性。补体系统是体液和先天免疫的主要效应机制之一。通过与抗体的恒定结构域相互作用，补体蛋白与已被IgG和IgM抗体靶向的肿瘤细胞结合。通过补体途径的成分在靶细胞膜上形成孔，或通过募集吞噬吞噬肿瘤细胞的嗜中性粒细胞，或通过颗粒酶诱导其破坏，补体蛋白与肿瘤细胞表面抗体的相互作用将导致肿瘤细胞破坏。中性粒细胞含有识别补体系统成分的特异性受体。

因此，还提供了一种测定补体介导的细胞毒性的方法，所述方法包括提供与阻抗分析仪可操作连接的细胞-基质阻抗监测盒，其中所述盒包括装载有靶细胞的腔室，其中靶细胞是癌细胞；向腔室添加能够与癌细胞相互作用的补体和建议的治疗性抗体；在添加补体之前和之后监测腔室的阻抗并且任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞的杀伤效果。在一些实施方案中，靶细胞是预装载到不同腔室中的不同谱系、起源或分期的不同癌细胞。在一些实施方案中，将效应细胞在生物反应器中培养，并借助于泵送通过传输管路细胞培养物递送至目标孔。在一些实施方案中，将建议的治疗性抗体从试剂储存器泵送到腔室中。

溶瘤病毒是最近的另一类促进抗肿瘤应答的治疗剂。由于感染的癌细胞受到溶瘤作用的破坏，它们释放出新的感染病毒颗粒或病毒体，以帮助破坏剩余的肿瘤。溶瘤病毒不仅会导致肿瘤细胞的直接破坏，而且还会刺激宿主的抗肿瘤免疫应答。为此，提供了一种评估癌细胞上的细胞溶解活性的方法，所述方法包括提供与阻抗分析仪可操作连接的细胞-基质阻抗监测盒，其中所述盒包括装载有靶细胞的腔室，其中靶细胞是癌细胞；向一个或多个腔室添加溶瘤病毒以形成一个或多个测试室，其中所述病毒疑似识别并溶解癌细胞；在添加溶瘤病毒之前和之后监测一个或多个测试室的细胞-基质阻抗，并且任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及通过随时间推移比较阻抗或从阻抗得出的基于阻抗的参数，确定癌细胞裂解的效果。在一些实施方案中，靶细胞是预装载到不同腔室中的不同谱系、起源或分期的不同癌细胞。在一些实施方案中，将溶瘤病毒在生物反应器中培养，并通过传输管路借助于泵送病毒培养物递送至目标孔。

癌细胞可以源自一种或多种癌症，比如乳腺癌、肺癌、结肠癌、纤维肉瘤、前列腺癌、肾癌、表皮癌、肝癌和卵巢癌。

溶瘤病毒本身并不显著地与电极相互作用，因此阻抗对应于靶细胞的状态。为此，基于阻抗的参数可以是细胞指数，或者是对添加病毒之前的时间点归一化的归一化细胞指数。阻抗或基于阻抗的参数随时间降低指示溶瘤活性增强。相关地，基于阻抗的参数可以是基于阻抗的曲线。在其他实施方案中，通过计算和比较靶细胞的细胞溶解百分比来确定癌细胞溶解效果。

D.药物制剂和药剂

一旦使用细胞-基质阻抗监测技术确定了建议的治疗剂有效于杀伤癌细胞，就可以将其配制为最终用于治疗癌症患者的药剂或药物制剂。在一些实施方案中，癌症患者是从其采集所述癌细胞的同一患者。在其他实施方案中，癌症患者患有与所述癌细胞相同或分期相同的癌症。本发明所属领域的普通技术人员将认识到，制剂可取决于所述治疗剂在药物领域中已知的形式及其给药途径。

在建议的治疗剂是效应细胞，如CAR-T细胞的实施方案中，可以在无菌条件下将效应细胞扩增成更大的效应细胞群，将其悬浮在盐水溶液中并输注到血流中，或者通过外科手术应用于抗肿瘤治疗。

在其中建议的治疗剂是化合物例如双特异性结合剂的实施方案中，所述化合物可以与药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、甜味剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、着色剂、调味剂及其混合物组合，然后口服施用、局部应用或通过与药物领域相一致的其他途径提供，以便用于癌症治疗。

稀释剂可包括但不限于甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、微晶纤维素、硅化微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素和普鲁兰多糖。

助流剂可包括但不限于二氧化硅、胶体二氧化硅、硅酸钙、硅酸镁、三硅酸镁、滑石粉、淀粉及它们的混合物。

粘合剂可包括但不限于海藻酸钠、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、聚乙二醇、淀粉、预胶化淀粉、糖、海藻糖、葡萄糖、黄芪胶、山梨糖醇、阿拉伯胶、藻酸盐、角叉菜胶、黄原胶、刺槐豆胶和阿拉伯胶、蜡、聚丙烯酰胺及它们的混合物。

润滑剂可包括但不限于硬脂酯钙、单硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、氢化植物油、轻质矿物油、硬脂酸镁、矿物油、聚乙二醇、泊洛沙姆、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂富马酸钠、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸锌及它们的混合物。

崩解剂可包括但不限于羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、海藻酸、壳聚糖、甲基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、波拉克林钾(polacrilin potassium)、淀粉、预胶化淀粉、海藻酸钠及它们的混合物。

实施例

实施例1

使用细胞-基质阻抗监测分析癌细胞对抗癌药的反应

在这项研究中，我们使用了细胞-基质阻抗监测(RT-CES系统或xCELLigence RTCA系统，ACEA Biosciences,Inc,San Diego,CA)来动态监测癌细胞对机理已表征的化学治疗化合物的反应，并分析特定的细胞反应模式。测试了13个癌细胞系，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌、成纤维细胞癌和中枢神经系统癌(表1)。将每个癌细胞类型用11种化学治疗化合物处理，这些化合物被分类DNA损伤剂、蛋白激酶抑制剂、抗有丝分裂药、细胞周期特异性抑制剂、蛋白质合成抑制剂和类别未知的化合物(表2)。对所有测试的细胞系和化合物的动态和剂量依赖性细胞-化合物相互作用模式进行了表征和总结。在图9-11中分别呈现了三种药物多柔比星、奥罗莫星和紫杉醇抗一组12种不同的细胞系的概况。另外，我们通过监测细胞周期进程、细胞活力和细胞的形态学状态来表征这些化合物对细胞的生物效应，以试图将特异性细胞反应与细胞指数轨迹的形状相关联(图12-14)。此外，我们计算了每种化合物对各种细胞系的时间依赖性IC-50值(图15)，并开发了计算细胞变化指数的算法，以分析不同化学治疗剂对不同细胞系的动态细胞反应。注意，在本申请中，RT-CES系统是指细胞-基质阻抗监测系统。术语RT-CES(实时细胞电子传感)与Team RTCA(实时细胞分析)或xCELLigence RTCA可互换使用。RT-CES和RTCA系统均来自ACEA BiosciencesInc.(San Diego CA)。

使用上述定义，计算了不同细胞系对不同化学治疗剂的动态RT-CES(RTCA)反应的细胞变化指数。基于CCI的时间依赖性值，跨时间标度的每个CCI数值区以基于黑-白阴影的编码表示。例如，如果在添加化合物后，CCI值(对于在以IC50值的浓度的特定化合物处理下的特定细胞系)在某个时间段内接近零，然后变为正值，达到约0.7/DT的值(DT为倍增)；那么细胞对该化合物的反应表示为一个

长方形，后跟一个

长方形。这样的分析的实例显示在图16中。表示对不同化合物的细胞动态反应的基于黑-白阴影的总编码图如图17所示。

在对这项研究的总结中，我们注意到使用RT-CES系统(或xCELLigence RTCA)筛选化学治疗剂可产生独特的活性模式，取决于化合物本身、浓度、温育时间长度和细胞类型。每种药物的“签名”模式与特定的生物现象如对数生长、细胞周期静止、形态变化和细胞死亡相关。“细胞变化指数”是从RT-CES数据导出的一个很好的参数，用于数学描述细胞的变化。基于CCI值进行的细胞反应分析表明，作用机制相似的药物展示出相似的模式。因此，动态细胞-化合物相互作用模式的相似性可以指示作用机制、对抗模式以及可能的分子靶标的相似性。RT-CES系统可以容易地适用于抗癌化合物的高通量动态筛选和分析，本研究中提出的信息密集型手段可应用于分析现有的癌症化疗剂、筛选新的化合物和深入了解抗癌剂的作用机制。

表1.针对多种化合物测试的癌细胞系的列表.

表2.在分析对多种抗癌化合物的细胞动态反应的研究中使用的化合物的列表.

实施例2

细胞毒性分析

方法

细胞.本研究中使用的所有细胞都从ATCC获得，并维持在37℃、5％CO₂饱和的培养箱中。将H460、HepG2和HT1080细胞维持在含5％FBS和1％青霉素和链霉素的RPMI培养基中。将NIH 3T3细胞维持在含10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM培养基中。

细胞增殖测定法.对于每种细胞类型，将指示数量的细胞接种在96X微量滴定板(e-plate^TM)的每个腔室中，其中在盒的单独腔室中具有在100μL培养基中的内置电极结构。使用RT-CES系统(细胞-基质阻抗监测系统)，每30分钟连续监测细胞的附着、铺展和增殖。根据实验，监测细胞增殖48-72小时。电子读出的细胞传感器阻抗显示为称为细胞指数的参数。

药物处理和细胞毒性评估.对于每种细胞类型，基于它们各自的增殖模式选择最佳细胞浓度(图18)。将指示的细胞数以100μL终体积接种在ACEA的16X或96X E-Plate(用于监测细胞-基质阻抗的盒)的每个腔室中。使用RT-CES系统(细胞-基质阻抗监测系统)，每30分钟连续监测细胞的附着、铺展和增殖。接种后大约24小时，当细胞处于对数生长期时，用100μL溶于细胞培养基的指示化合物处理细胞。还用DMSO处理细胞，用作溶媒对照。取决于实验，培养基中的最终DMSO浓度在0.25％-0.5％的范围内。

MTT测定法.将渐增数量的NIH 3T3细胞接种在16X e-plate中，通过RT-CES监测，获得相应的细胞指数。立即吸出培养基，然后根据制造商的方案使用标准MTT测定法对细胞进行测定。

流式细胞术.将A549细胞以500,000个细胞/腔室的密度接种在60mm组织培养皿中。接种后大约24小时，将细胞用指示终浓度的奥罗莫星处理，16小时后，将细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤两次并固定在70％甲醇中，并在4℃下储存一直到染色步骤为止。将细胞用碘化丙啶染色，并通过FACS使用488nm波长进行分析。

实施例3

使用RT-CES实时监测癌细胞增殖

为了通过采用RT-CES系统监测细胞-基质阻抗来评估动态细胞增殖，将H460人肺癌细胞、H1080纤维肉瘤细胞、HepG2人肝肉瘤细胞和NIH 3T3小鼠成纤维细胞以一式三份在ACEA的96X e-plate^TM中每腔室接种2500个和10,000个细胞。使用RT-CES系统，在指示的时间内每30分钟连续监测细胞(图18)。如图18所示，每种细胞类型都有其自身的特征性动力学轨迹，这些动力学轨迹基于接种的细胞数、细胞的总体尺寸和形态以及细胞与传感器表面的相互作用程度。并且，粘附和铺展动力学，以及细胞进入对数生长期的时间，对于每个标识的细胞系而言是特征性的，因此提供了优良的内部对照，并且提供了在制造工艺的不同阶段标准化并验证储藏培养物(stock culture)的途径。

为了确证RT-CES装置的细胞指数与腔室中的细胞数相关，将渐增数量的NIH 3T3细胞接种在16X e-plate^TM中，并进行长达10个小时的监测，获得这段时间的细胞指数。图19A显示了接种的细胞数相对于获得的细胞指数的绘图，并且指明，对于这种特定的细胞类型，RT-CES系统可以检测到少至100个细胞，而且读出在两个数量级范围内都是线性的，一直到10000个细胞。另外，在图19A中描述的实验结束时，还通过MTT测定法测定了细胞。如图19B所示，即使在多达1000个细胞时，MTT测定法与背景值也没有明显不同，对于超过1000个的细胞数，MTT单位则与接种的细胞数以线性方式相关。但是，重要的是，虽然RT-CES系统能够进行动态和连续的测量，但出于比较的原因，图19中描述的实验仅在单点实施，因为MTT是单点测定法。

实施例4

使用RT-CES细胞-基质阻抗监测系统确定对癌细胞的有潜力的治疗性处理

为了使用RT-CES细胞-基质阻抗监测系统评估药效，确定了他莫昔芬对不同细胞系的IC-50值，并在添加他莫昔芬之后48小时与MTT测定法进行了比较。根据表3，使用RT-CES系统获得的他莫昔芬对不同细胞系的IC-50值与MTT测定法获得的值高度一致，表明RT-CES系统可用于评估各种药物针对不同粘附细胞系的效力。

为了观察药物与靶细胞相互作用的动力学，将A549非小细胞肺癌细胞接种在ACEA96X e-plate^TM中，并连续监测直到细胞达到对数生长期时为止，此时将不同浓度的紫杉醇以指示的终浓度添加到细胞。如图20A所示，最高浓度的紫杉醇最初诱导了细胞毒作用，通过膜联蛋白V染色判断，该作用主要是由于细胞死亡所致(图20B)。值得注意的是，细胞从药物的最初细胞毒作用中恢复并开始重新增殖。虽然这种现象是由于紫杉醇的代谢和失活还是由于紫杉醇耐药亚群的出现所致尚待确定，但是，本实验清楚地例示了该RT-CES系统提供的实时测量的巨大优势，实时测量使用户有机会观察和评估药物与靶细胞相互作用的整个历史，进一步提供除细胞活力或细胞毒性以外的信息。如果采用MTT等传统单点测定法，容易错过在图20A中观察到的现象。

使用RT-CES系统连续监测药物与靶细胞的相互作用的又另一个主要优点是用户可以获得感兴趣的药物的作用机制的深入了解。为了演示这一点，将A549细胞接种在ACEA96X微量滴定盒中，并通过RT-CES连续监测。将细胞用作为溶媒对照的DMSO处理，或者用100μM奥罗莫星处理；奥罗莫星是一种CDK抑制剂，根据细胞系的不同，它可在G→1S过渡期或G2→M过渡期诱导细胞周期停滞。如图21A所示，向呈指数生长的A549细胞添加奥罗莫星引起细胞的细胞指数记录轨迹趋于平稳并保持稳态，使人联想到细胞既不增殖也不死亡的细胞周期阻滞。用DMSO处理的对照细胞继续增殖直到达到汇合，此时它们受到接触抑制且细胞指数记录趋于平稳。为了证明RT-CES监测到的奥罗莫星对A549细胞的作用确实是由于细胞周期停滞所致，用相同浓度的DMSO和奥罗莫星处理在组织培养皿上生长的A549细胞，并进行流式细胞术分析。如图21B所示，流式细胞术分析表明用指示浓度的奥罗莫星处理A549细胞在G2→M过渡期——此时CDK如CDK2是有活性的——诱导了细胞周期停滞。总之，使用RT-CES系统动态监测药物与靶细胞的相互作用，可为用户提供了解药物作用机制及其与靶细胞相互作用方式的机会。

为了评估RT-CES系统的细胞毒性分析，检验了A549细胞与具有不同作用机制的细胞毒性剂的相互作用。图22显示了通过RT-CES^TM监测的用不同浓度的5-氟尿嘧啶、长春碱和星形孢菌素处理的A549细胞的特征轨迹。根据图22，通过动态监测标明的细胞毒性剂的相互作用，生成了特征性动力学模式，这些模式取决于细胞背景、药物浓度、暴露持续时间和药物作用机制。由于每种化合物具有其自身的特征模式，这些动力学轨迹有望用于靶标未知的化合物的动力学概貌与作用机制已知的化合物的动力学概貌进行比较，由此确定靶标未知的化合物作用机制。

与传统的终点测定法相比，使用RT-CES系统进行细胞增殖、活力和细胞毒性的无标记的、动态的监测具有非常明显和重要的优势。它可以建立内部质量控制，确保不同测定法之间的一致性和再现性。动态监测可以观察药物与靶细胞相互作用的整个过程，因此用户可以更好地了解药物相互作用的模式和机理。此外，药物与靶细胞相互作用的实际动力学轨迹非常重要，因为它可以提供有关药物与靶细胞相互作用机制的线索。最后，由于每种化合物或药物在其与靶细胞的相互作用方面都有自身的特征性概貌，因此RT-CES系统可以用作确定具有未知靶标的药物的作用机制的手段。

表3.使用RT-CES系统与MTT测定法的他莫昔芬处理不同癌细胞系的IC-50值的比较。将标明的细胞系接种在ACEA 16X盒中，通过RT-CES监测。大约24小时后，用渐增浓度的他莫昔芬处理细胞，然后通过RT-CES连续监测。约48小时后停止实验，通过使用MTT测定16X盒(16X E-Plates)中的细胞。从RT-CES系统得出的IC-50值是时间依赖性的。在表中，针对RT-CES系统测定和MTT测定，显示了在化合物处理之后约48小时的IC-50值。

表3

实施例5

使用RT-CES细胞-基质阻抗监测系统的NK介导的NIH 3T3靶细胞杀伤

将NIH 3T3细胞(靶细胞)以20,000个细胞/腔室的密度接种在ACEA的16X微量滴定板(16X E-Plate)的腔室中。使用RT-CES连续监测细胞，让其粘附并增殖过夜。18小时后，将细胞与效应NK细胞系以效靶比7.5:1温育。在接下来的24小时连续监测靶细胞反应。作为对照，以效靶比7.5:1向所述细胞添加杀伤能力不足的小鼠NK细胞系Yac，或者仅添加100μL培养基添加。如图23和24所示，小鼠NK细胞系介导了靶细胞杀伤，体现在指示细胞死亡的细胞指数随时间的下降。另一方面，对照Yac细胞系对靶细胞没有重大影响，单独添加培养基也一样。本实验表明，可以使用RT-CES细胞-基质阻抗监测系统实时监测效应细胞对靶细胞的杀伤。

实施例5

人和鼠NK细胞系的细胞溶解活性测试

使用RT-CES系统，使用9个不同的靶细胞系(包括本领域常用的癌细胞系)各自测试了人和鼠NK细胞系的细胞溶解活性。在RT-CES系统上进行NK细胞介导的细胞溶解的定量和动态测量，无需任何标记步骤和试剂。实验结果是一致的。而且，RT-CES系统提供了细胞溶解的实时全自动测量，从而为大规模筛选负责调节NK细胞介导的细胞溶解活性的化合物或基因提供了可能。

细胞.这些实验中使用的NK 92、NIH 3T3细胞系和所有癌细胞系均购自ATCC。小鼠NK细胞系(mNK)由路易斯维尔大学的Hui Shao博士提供。将所有细胞系维持在37℃、含5％CO₂的培养箱中。将NK 92和mNK系维持在Alpha MEM中，其中含有2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、0.2m肌醇、0.1mM 2-巯基乙醇、0.02mM叶酸、12.5％马血清、12.5％FBS和100-200U/mL重组IL-2。其他癌细胞系维持在含5％FBS和1％青霉素和链霉素(GIBCO)的RPMI培养基中。将NIH 3T3细胞维持在含10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM培养基中。

RT-CES系统.该系统包括三个组件：分析仪和E-Plate站、集成软件以及16室或96室E-PLATE(16X或96X E-Plate)。将E-Plate站或盒站置于培养箱内，并通过细电缆连接至培养箱外的分析仪。将含细胞的E-Plate置于培养箱内的E-Plate站上，并在集成软件的控制下通过分析仪自动采集实验数据。

细胞溶解分析.将靶细胞接种到16室或96室E-Plate的腔室内的100μl培养基中。使用RT-CES系统，根据实验动态监测细胞生长24-34小时，直到它们达到对数生长期并形成单层时为止。然后将不同浓度的效应细胞直接添加到含有靶细胞的单独腔室中。为了背景对照，将效应细胞添加至没有靶细胞的腔室。添加效应细胞后，将E-Plate返回E-Plate站，通过分析仪自动采集测量值，每15分钟一次，一直到20个小时。

通过显微术分析细胞形态.使用尼康(Nikon)正置显微镜检查NK细胞介导的细胞溶解对靶细胞的作用。添加效应细胞后，当细胞指数达到对照的50％时，将细胞在80％甲醇中固定5分钟，然后用吉姆萨(Giemsa)蓝染色。通过显微术检查细胞的形态，并使用附带的CCD相机照相。

实验数据分析.集成软件能够显示实验从细胞接种到细胞溶解结束的整个历程。可以实时显示时间和效靶比(E/T)依赖性曲线，从而为动态监测NK细胞活性提供了可能。电子读出的细胞-电极阻抗显示为一个无量纲参数，称为细胞指数。这里的细胞指数通过以下方式确定：对每个测量频率f，计算腔室中存在靶细胞时腔室的电阻(阻抗的一个分量)(R_细胞(f))相对于腔室中不存在细胞而只有细胞培养基时腔室的背景电阻(R_背景(f))的相对变化(相对变化(f)＝(R_细胞(f)-R_背景(f))/R_背景(f))，然后，求出所有测量频率的电阻的最大相对变化(细胞指数＝所有测量频率的max{相对变化(f)}。将电阻的最大相对变化用作细胞指数。为了定量确定特定时间点的溶解，将细胞指数数据从RT-CES软件输出到Microsoft Excel，通过将具有特定E/T比的腔室的细胞指数与未添加NK细胞的对照室的细胞指数进行比较，并使用下列等式计算，确定在给定时间在特定E/T比的细胞溶解百分比：细胞溶解百分比＝(1-CI_给定E/T比/CI_{没有NK细胞})x 100。在图25B、26B、26D、27A和27B的细胞溶解百分比的计算中采用归一化细胞指数值。

结果和讨论：动态监测NK细胞介导的细胞溶解.为了使用RT-CES系统评估NK细胞介导的细胞溶解活性，使用鼠NK细胞系(mNK细胞系)和靶细胞系NIH 3T3细胞。将NIH 3T3靶细胞以5000个细胞/腔室接种在96室E-Plate的腔室中，在RT-CES系统上连续监测细胞生长，每60分钟一次，直到34小时后细胞达到生长期时为止。然后将效应鼠NK细胞以不同的E/T比直接添加至腔室，并在RT-CES系统上动态监控NK细胞介导的细胞溶解。如图25a所示，在以E/T比15至1添加mNK细胞后，与培养基对照的细胞指数相比，观察到NIH 3T3细胞的细胞指数显著下降。此外，在使用YAC细胞(一种没有细胞溶解作用的T淋巴细胞系)的效应对照室中未观察到任何显著的细胞指数下降，表明由于添加mNK细胞所致的细胞指数下降是特异性的，并且最有可能是通过细胞溶解介导的。在mNK细胞存在的情况下也观察到NIH 3T3细胞的时间依赖性细胞溶解，但在YAC细胞存在的情况下观察不到(图25B)。为了进一步证实细胞溶解作用，在向靶细胞添加mNK细胞8小时后将靶细胞染色，此时细胞溶解大约50％，然后，在显微镜下检查(数据未显示)。与对照YAC细胞相比，在mNK细胞存在的情况下，靶细胞通过mNK的细胞溶解作用被有效清除。总之，RT-CES系统提供了迄今为止唯一的直接监测NK细胞介导的细胞溶解作用，而不需要标记靶细胞和使用任何化学报告子的测定形式。另外，可以在RT-CES系统上动态监测细胞溶解的整个历程，而这是难以通过任何基于标记物的终点测定形式来实施的。细胞溶解动力学分析表明，对于mNK细胞检测到缓慢的细胞溶解。在添加mNK细胞的2小时内检测到细胞溶解，有趣的是，在4小时后，仅检测到不到30％的细胞溶解活性。四小时的温育时间是基于放射性同位素终点测定法的标准温育时间。通过RT-CES系统获得的数据清楚地表明，细胞溶解活性可以达到70％，这在添加mNK细胞12小时后出现。在现有的基于标记物的终点测定法中，可能容易错过在测定法的标准温育时间之后出现的这种细胞溶解活性。由此可见，RT-CES系统不仅提供无标记检测，更重要的是，它通过动态监控细胞溶解的整个历程，为更准确地评估细胞溶解活性提供了可能。

实施例6

NK细胞介导的细胞裂解的定量测量

RT-CES系统的细胞指数读出与细胞数相关(Solly等人，2004)，并将其用于定量监测化合物比如抗癌药诱导的细胞毒性。为了测试是否可以在RT-CES系统中定量测定mNK细胞活性，我们监测了在不同效/靶比下的细胞溶解。将鼠和人NK细胞系(mNK和NK 92)两者用作效应细胞，将NIH 3T3系和MCF7系(人乳腺癌细胞)分别用作针对每种效应细胞的靶细胞。如上所述，首先将靶细胞以5,000个细胞/腔室接种到96室E-Plate上，然后在RT-CES系统上监测细胞生长。当靶细胞达到生长期时，将NK细胞以不同的浓度直接添加至腔室。然后在RT-CES系统上实时监测不同E/T比的NK细胞介导的细胞溶解。如图26A和26C所示，在mNK或NK 92细胞添加至其靶细胞后，与无效应细胞的对照相比，细胞指数下降。细胞指数值的下降依赖于E/T比。任一情况(图26A的NIH 3T3细胞，图26C的MCF7细胞)下，E/T比越高，得到的细胞指数值越低。这强烈表明RT-CES系统能够特异性地且定量地测量NK细胞介导的细胞溶解活性。而且，对细胞溶解的动态监测可进一步揭示有关NK细胞介导的杀伤的基础机制。例如，细胞溶解动力学分析表明，NK 92细胞是比mNK细胞效力强得多的效应细胞。在E/T比为4/1或更高时，在添加NK 92细胞之后4小时内可以实现大于90％的MCF7细胞溶解(图26D)，而mNK细胞则仅有大约30％(图26b)。NK细胞的不同细胞溶解动力学表明效应细胞与靶细胞之间相互作用的独特性质(比如NK受体和配体的表达)以及NK细胞介导的细胞溶解的基础机制。

在RT-CES系统上对NK细胞在各种靶细胞系中的细胞溶解活性的无标记评估.使用9个细胞系测试了mNK和NK 92的细胞溶解活性，这9个细胞系中包括8个不同的人癌细胞系和NIH 3T3细胞系。表4和表5总结了不同靶细胞系对mNK或NK 92介导的细胞溶解的敏感性。NK 92在癌细胞系上显示出广泛的细胞溶解活性。NK 92介导的细胞溶解快速发生，并在添加NK 92细胞后8小时之前达到最大杀伤活性。图27A中显示了7个癌细胞系对NK 92细胞的敏感性比较。在这7个癌靶细胞系中，4个靶细胞系实现90％以上的细胞溶解，包括H460、HepG2、MCF7和MDA-MB231。相比之下，mNK细胞介导的细胞溶解似乎比NK92更具选择性(图27B)。在9个靶细胞系中，用mNK细胞温育12小时后，4个靶细胞系，包括NIH 3T3、A549、Hela和MDA-MB231，显示出超过30％的细胞溶解，而在5个靶细胞系，包括OVCR4、HT1080、HepG2、H460和MCF7中未发现细胞溶解(0％)或细胞溶解弱(10％)。另外，由mNK介导的细胞溶解比NK 92慢得多，在添加mNK细胞12小时后达到最大值。

表4.mNK细胞介导的9个细胞系的细胞溶解

表5.NK 92细胞介导的7个细胞系的细胞溶解

实施例7

使用细胞-基质阻抗监测进行自然杀伤细胞介导的靶细胞的细胞溶解的动态无标记监测.

在这个实施例中，RT-CES细胞-基质阻抗监测系统提供了对自然杀伤(NK)细胞介导的细胞溶解活性的无标记评估。使用RT-CES系统动态和定量监测NK介导的9个不同靶细胞系的细胞溶解，包括实验室中通常用作癌症模型的癌细胞系。将RT-CES系统监测的细胞溶解与标准技术(比如MTT测量)比较，显示出良好的相关性和更好的敏感性。为了测试测定法的特异性，采用了抑制NK细胞脱颗粒和细胞溶解的药理学药剂，显示出选择性和剂量依赖性地抑制NK介导的靶细胞的细胞溶解。总之，RT-CES系统可提供对细胞溶解的实时全自动测量，从而为大规模筛选负责调节NK介导的细胞溶解活性的化合物或基因提供可能。

细胞.这些实验中使用的NK 92、NIH 3T3细胞系和所有癌细胞系均购自ATCC。小鼠NK细胞系(mNK)由路易斯维尔大学的Hui Shao博士提供。将所有细胞系维持在37℃、含5％CO₂的培养箱中。将NK 92和mNK系维持在Alpha MEM中，其中含有2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、0.2m肌醇、0.1mM 2-巯基乙醇、0.02mM叶酸、12.5％马血清、12.5％FBS和100-200U/mL重组IL-2。其他癌细胞系维持在含5％FBS和1％青霉素和链霉素(GIBCO)的RPMI培养基中。将NIH 3T3细胞维持在含10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM培养基中。

RT-CES系统.该系统包括三个组件：分析仪和E-plate站、集成软件以及16室或96室E-plate。将E-plate站置于培养箱内，并通过细电缆连接至培养箱外的分析仪。将含细胞的E-plate置于培养箱内的E-plate站上，并在集成软件的控制下通过分析仪自动采集实验数据。RT-CES技术的原理先前已有描述(Abassi et al.,2004；Solly et al.,2004；Xinget al.,2005)。

细胞溶解分析.将靶细胞接种到16室或96室E-plate的腔室内的100μL培养基中。使用RT-CES系统，根据实验动态监测细胞生长24-34小时，直到它们达到对数生长期并形成单层时为止。然后将不同浓度的效应细胞直接添加到含有靶细胞的单独腔室中。为了设置背景对照，将效应细胞添加至没有靶细胞的腔室。添加效应细胞后，将E-Plate放回E-plate站，通过分析仪自动采集测量值，每15分钟一次，一直到20个小时。

通过显微术分析细胞形态.使用尼康(Nikon)正置显微镜检查NK细胞介导的细胞溶解对靶细胞的作用。添加效应细胞后，当细胞指数达到对照的50％时，将细胞在80％甲醇中固定5分钟，然后用吉姆萨(Giemsa)蓝染色。通过显微术检查细胞的形态，并使用附带的CCD相机照相。

数据分析.集成软件能够显示实验从细胞接种到细胞溶解终止的整个历程。可以实时显示时间和效靶比(E/T)依赖性曲线，从而允许动态监测NK细胞活性。电子读出的细胞-电极阻抗显示为一个无量纲参数，称为细胞指数。这里的细胞指数通过以下方式确定：对每个测量频率f，计算腔室中存在靶细胞时腔室的电阻(阻抗的一个分量)(R_细胞(f))相对于腔室中不存在细胞而只有细胞培养基时腔室的背景电阻(R_背景(f))的相对变化(相对变化(f)＝(R_细胞(f)-R_背景(f))/R_背景(f))，然后，找出所有测量频率的电阻的最大相对变化(细胞指数＝所有测量频率的最大{相对变化(f)}。将电阻的最大相对变化用作细胞指数。为了定量确定特定时间点的溶解，将细胞指数数据从RT-CES软件输出到Microsoft Excel，通过将具有特定E/T比的腔室的细胞指数与未添加NK细胞的对照室的细胞指数进行比较，并使用下列等式计算，确定在给定时间在特定E/T比的细胞溶解百分比：细胞溶解百分比＝(1-CI_给定E/T比/CI_{没有NK细胞})x100。在图29C、31A、31B、31C和31D的细胞溶解百分比的计算中采用归一化细胞指数值。

使用MTT测定法和结晶紫染色确定细胞溶解。将在E-plate上生长的靶细胞与不同比例的效应细胞温育，并温育过夜。使用RT-CES系统动态监测细胞溶解。实验结束时，用PBS洗涤腔室以除去未结合的细胞，根据制造商的方案(Sigma)使用MTT试剂，或者将细胞用4％多聚甲醛固定，然后用溶于H₂O中0.1％结晶紫溶液染色20分钟，将附着在E-plate底部的活细胞定量。将细胞洗涤五次以除去非特异性染色剂，并且将染色的细胞在0.5％TX-100的存在下溶解过夜。使用酶标仪在590nm的波长下测量溶解的染色剂。

使用RT-CES系统动态监测NK介导的细胞溶解.为了评估效应细胞介导的对靶细胞的细胞毒活性，我们采用了NK-92细胞系。NK-92是源自非霍奇金淋巴瘤患者的人IL-2依赖性细胞系，可以容易地在培养基中维持和增殖，对不同靶细胞系具有非常强的细胞毒活性(Gong et al.,1994)。NK-92细胞系及其一些衍生物目前正在进行各种癌症治疗的I期临床试验(Tam et al.,2003)。为了评估NK-92介导的细胞毒性，将A549肺癌细胞以10000个细胞/腔室的密度接种在ACEA E-plate中，并使用RT-CES系统动态监测细胞生长和增殖。接种后二十四小时，以标明的效靶(E/T)比添加NK细胞(图29)，并动态监测A549细胞活力的程度。如图29A所示，将NK-92细胞添加至A549细胞导致A549细胞指数随时间推移的密度依赖性降低，表明NK-92细胞正在诱发对A549细胞的细胞毒作用。将NK-92添加至不含任何A549细胞的腔室相对于背景没有任何明显的变化(数据未显示)。而且，仅用培养基处理的A549细胞继续生长并增殖(图29A)。为了将RT-CES系统与标准测定法测量的细胞活力进行比较，在实验结束时，洗涤E-plate的腔室，除去NK细胞和任何死细胞，通过MTT测定法确定靶细胞活力的程度。图29B显示了在50小时实验终止时细胞指数读数与MTT的比较。总体而言，MTT读数与RT-CES的细胞阻抗测量的相关性非常好。除MTT外，还平行地进行了靶细胞的结晶紫染色，其结果验证了MTT的结果(数据未显示)。在不同E/T比下通过RT-CES系统和MTT两者测量的NK-92细胞对A549靶细胞的相对细胞溶解活性如图29C所示。根据图29C，在检测细胞溶解方面，RT-CES系统比MTT更灵敏，尤其是在较低的E/T比下。

除NK-92细胞外，还使用RT-CES系统评估了小鼠NK细胞系(mNK)的细胞毒活性(图30)。将NIH 3T3小鼠成纤维细胞细胞系接种在E-plate中，使其生长过夜。接种后二十四小时，将NK细胞以不同的E/T比添加至腔室，并连续监测NIH 3T3细胞的活力(图30)。作为对照，将仅YAC细胞或仅培养基添加至在E-plate腔室中生长的NIH 3T3细胞。mNK细胞诱导了细胞指数逐渐降低，而仅添加YAC细胞或培养基对NIH3T3细胞的细胞指数记录几乎没有影响(图30)。为了确证细胞指数逐步降低是与细胞溶解相关的，将E-plate底部的细胞洗涤、固定，并用Giemsa染料染色，使用与显微镜附接的CCD相机照相(数据未显示)。将YAC细胞添加至E-plate底部上生长的NIH 3T3细胞对靶细胞未产生可检测的影响，而添加mNK细胞导致腔室底部的传感器上产生没有靶细胞的较大间隙和区域，表明已经发生了细胞溶解。总之，RT-CES系统为以非侵入、无标记和动态的方式监测效应细胞介导的对粘附靶细胞的细胞毒活性提供了可能。

使用RT-CES系统动态监测NK介导的不同靶细胞的细胞溶解.使用9个细胞系测试了mNK和NK 92的细胞溶解活性，其中包括8个不同的人癌细胞系和NIH 3T3细胞系。表4和表5总结了不同靶细胞系对mNK或NK 92介导的细胞溶解的敏感性。NK 92在癌细胞系上显示出广泛的细胞溶解活性。NK 92介导的细胞溶解快速发生，并在添加NK 92细胞后8小时之前达到最大杀伤活性。在这7个癌靶细胞系中，4个靶细胞系实现90％以上的细胞溶解，包括H460、HepG2、MCF7和MDA-MB231。相比之下，mNK细胞介导的细胞溶解(表4)似乎比NK 92(表5)更具选择性。在这9个靶细胞系中，用mNK细胞温育12小时后，4个靶细胞系，包括NIH 3T3、A549、HeLa和MDA-MB231，显示出超过30％的细胞溶解，而在5个靶细胞系，包括OVCR4、HT1080、HepG2、H460和MCF7中未发现细胞溶解(0％)或为弱的细胞溶解(10％)。另外，由mNK介导的细胞溶解比NK 92慢得多，在添加mNK细胞12小时后达到最大值。

通过阻断导致细胞毒性的信号传导途径的药剂抑制NK介导的靶细胞的细胞溶解.靶细胞在细胞膜上的NK受体的相互作用导致信号转导机制的激活，这导致靶细胞的细胞溶解(Vivier et al.,2004)。调节穿孔素与含颗粒酶的分泌颗粒在NK/靶细胞突触连接处的融合的关键信号级联之一是磷脂酰-肌醇-3-激酶(PI3K)、Rac和丝裂原活化蛋白激酶1(Erk)通路(Djeu et al.,2002；Vivier et al.,2004)。为了确定信号通路在调节NK介导的细胞毒性中的特异性，我们设法利用PI3K和Erk通路的特异性抑制剂。将NK-92细胞与PI3K抑制剂渥曼青霉素及Erk通路抑制剂PD98059两者一起温育，或与DMSO温育作为对照，然后添加至A549靶细胞。如图31所示，正如通过RT-CES系统监测的，渥曼青霉素和PD98059两者都以剂量依赖性方式抑制NK-92介导的A549细胞的细胞溶解。作为另外的对照，还将A549靶细胞与单独的渥曼青霉素和PD 98059一起温育，结果对基线的影响极小。我们计算了在添加NK后不同时间点两种抑制剂对细胞溶解的抑制百分比。虽然Erk通路抑制剂在所有标明的时间点均导致对细胞溶解的一致抑制(图31B)，但是PI3K抑制剂介导的对细胞溶解的抑制明显取决于进行分析的时间点(图31D)。总之，这里示出的实验清楚地证实了RT-CES系统可用于监测NK介导的针对多种不同的细胞系的细胞毒活性。此外，通过RT-CES系统测量可知，通过使用该信号传导级联调节颗粒融合的抑制剂干扰NK介导的细胞毒性反应，显著减弱了细胞毒性反应。数据还表明，抑制程度主要取决于NK与靶细胞温育的时间长度，这些数据也为动态监测效应细胞介导的细胞毒性提供了良好的理论基础。

讨论.NK细胞在先天免疫应答中起着核心作用，并且在弥合先天免疫与适应性免疫之间的空白方面，NK细胞起着中介作用(Lanier,2005)。NK细胞具有专门的细胞器官或颗粒，用于容纳细胞溶解酶和蛋白质，这些酶和蛋白质在遇到病原感染的细胞或肿瘤时发挥其细胞溶解活性(Smyth et al.,2002；Smyth et al.,2005)。最近，已经在NK细胞的表面上鉴定出许多受体，它们根据靶细胞的身份以正或负的方式调节NK介导的细胞毒性(Lanier,2005)。

在本报告中，我们描述了一种无标记的实时测定法，用于监测NK介导的针对不同粘附靶细胞的细胞毒性。这种测定法基于监测在微量滴定板(E-plate)底部腔室中制造的电子细胞传感器阵列上生长的靶细胞的活力。细胞与传感器的相互作用产生阻抗响应，该阻抗响应指示细胞的一般健康状况。我们已经使用人和小鼠NK细胞证明了NK介导的细胞毒活性可以使用RT-CES系统来监测，该系统由监测系统和E-PLATES组成其包括用于检测靶细胞的微电极(Abassi et al.,2004；Solly et al.,2004；Xing et al.,2005)。将RT-CES系统上监测的NK介导的细胞毒性与靶细胞的MTT和结晶紫染色等标准测定法相关联，以评估效应细胞介导的细胞毒性(图29)。这两种测定法均已被用于监测效应细胞介导的靶细胞的细胞溶解(Wahlberg et al.,2001；Peng et al.,2004)。含有溶解蛋白和蛋白酶的颗粒的释放受到受体介导的信号转导级联的调节。具体地说，已显示PI3K和ERK通路除了细胞因子分泌外，在颗粒胞吐和细胞毒性中起主要作用(Djeu et al.,2002；Vivier et al.,2004)。使用RT-CES系统并确认早期数据，我们能够证明，通过小分子抑制剂干扰PI3K和Erk通路，可阻断NK-介导的靶细胞的细胞溶解(图31)。不同通路阻断剂对细胞溶解的抑制程度取决于NK细胞与靶细胞一起温育的持续时间(图31B和图31D)。如果使用标准的单点测定法(比如铬释放测定法(CRA))，将容易错过抑制剂对细胞溶解的时间依赖性效应。

实施例8

BiTe介导的靶细胞的细胞杀伤

免疫疗法正在成为癌症治疗中最有前途的方法之一，通过识别癌细胞表面表达的特异性标志物，能够通过细胞毒性T细胞介导特异性癌细胞杀伤。抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是实现临床试验的首批免疫治疗方法之一，涉及不同类型的免疫效应细胞的活性。在嵌合抗原T细胞受体(CAR-T)方法中，患者的T淋巴细胞经过工程改造，从而表达与肿瘤细胞抗原结合并激活T细胞的细胞毒活性的嵌合受体。相反，双特异性T细胞衔接物(BiTE)抗体是工程化二价蛋白，其通过同时结合肿瘤细胞标志物和T细胞特异性受体CD3促进肿瘤细胞与T淋巴细胞之间的相互作用。通过这种双重相互作用，BiTE抗体诱导了细胞溶解突触的形成，通过细胞毒性事件级联，包括穿孔素和颗粒酶的释放，损害细胞膜的完整性，从而导向了靶肿瘤细胞的特异性溶解。随后，半胱天冬酶的激活诱导DNA片段化、形态变化以及最终的靶细胞凋亡。

为了确定使用BiTE抗体是否能重新定向免疫细胞以识别和杀伤癌细胞，我们将一种特异性EpCAM/CD3 BiTE用在PC3前列腺癌细胞上。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种跨膜糖蛋白，其介导上皮细胞中不依赖Ca²⁺的细胞-细胞粘附，并参与细胞信号传导、迁移、增殖和分化。它还在许多癌瘤中过表达，这些过表达对增殖和抗凋亡信号有贡献。将靶PC3细胞以10,000个细胞/腔室的密度接种在E-Plate 96上，并使其生长24小时。新鲜分离PBMC，以20的效:靶比与EpCAM BiTE抗体一起添加在一式四份的样品中。将CI对添加PBMC之前的最后一个记录数据点归一化。仅添加PBMC未能影响癌细胞的生长，癌细胞数量的增加反映在连续五天中归一化CI参数的升高。当细胞达到汇合时，CI升高结束(图32A，迹线X)。相反，在EpCAM BiTE存在下，CI开始下降到0(在PC3添加之前测量的初始背景值)。CI下降的动力学与BiTE量成比例，其中仅在PBMC添加12小时后，最高浓度诱导了CI下降(图32A：菱形迹线)。最低测试浓度仍然能够诱导细胞杀伤，但是初始CI下降只有在添加效应细胞后28小时才可见。此外，这样的浓度似乎不能诱导完全的细胞杀伤，其中CI曲线在大约测定结束时达到平稳值1(图32A：三角形迹线)。总之，这些数据证明了xCELLigence平台检测与BiTE滴定相关的细胞杀伤动力学差异的能力。

我们还评价了xCELLigence平台检测由于效:靶比变化所致的杀伤动力学差异的能力。这是特别令人感兴趣的，因为尽管免疫细胞对CI的贡献可以忽略不计，但是仍然存在这样的可能性，即PBMC数量所致的CI线性的改变可能影响比较具有不同比例的样品的能力。此外，癌症患者通常需要多个化疗周期，并且免疫功能低下。因此，很有必要评价是否在BiTE的存在下，即使少量的免疫细胞也能被有效激活。在图32B记载的实验中，我们将EpCAM/CD3 BiTE保持在g/ml的恒定浓度，而改变效:靶比。每个浓度的效应细胞均可有效杀伤癌细胞，甚至等摩尔比例的PBMC和PC3仍然能够诱导癌细胞的有效杀伤，即使动力学更长且杀伤不完全(图32B，黑色正方形)。使用铬-51和流式细胞术等终点方法很难实现这样的灵敏度。没有PBMC的样品(图32B，黑色圆形)与没有BiTE的对照具有相似的概貌，表明单独的免疫细胞对CI测量几乎没有影响。

针对癌症免疫疗法开发的不同策略都依赖于免疫系统通过癌细胞表面上表达的抗原对癌细胞的特异性靶向。然而，由于几乎所有实体瘤都有异质性，靶抗原的表达水平的差异可能会影响细胞杀伤效率，对治疗结果具有巨大影响。我们利用了三种不同的癌细胞系来测试细胞杀伤的动力学是否会受到表面EpCAM表达量的影响。我们使用了NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)来测量PC3前列腺、MCF 7乳腺和HeLa宫颈人癌细胞系中的EpCAM表面水平(图33A)。MCF7表达的抗原水平最高，而PC3的表达只有其十分之一，只有非常小的一个亚群表现出与MCF7相同的强度。HeLa群体一半不表达EpCAM，而其余细胞确实表达EpCAM，但强度为MCF7的1/100倍，比PC3的1/10。可见，这三种细胞系代表了EpCAM抗原变异的一个连续谱。

在一个单独的实验中，我们用相同量的EpCAM BiTE抗体和PBMC:癌细胞比例处理这三种不同的细胞系(图33B)。在MCF7中，添加PBMC诱导细胞指数立即升高，然后下降，在不到90小时内达到0值，在PC3中，同样的抗体需要超过115小时来达到稳定水平，且该水平仍然高于0。与MCF7相比，初始CI升高也延迟了4个小时。在HeLa中，同一抗体仍然诱导初始CI升高，然后逐渐下降，但比其他两种癌细胞系慢。

为了更好地鉴定与EpCAM表达和PBMC添加量相关的动力学差异，我们使用了经过抗体处理但没有PBMC的对照室来建立基线，针对该基线，将每种不同量的效应细胞比作为相对变化作图。使用相应的对照组对每种细胞系进行这样的基线标准化，并且针对每个BiTE浓度将曲线合并在一张单图中(图33C)。该颜色编码图立即突出了实验条件之间的动力学差异。在所有细胞系中，当效应细胞数量减少时，曲线的负斜率降低(图33C：从深色到浅色)。甚至下降曲线与水平轴相交的时间也与较低的PBMC数量成比例地增加。这个点很好地近似标记了细胞杀伤正在影响大多数癌细胞的时间。比较不同的细胞系，可清楚地看到动力学差异，其中MCF7在PC3和HeLa之前几天开始CI下降。

对抗体浓度和效:靶比的依赖性同样反映在ET50参数中(图33D)，其中MCF7在所有细胞比率都显示较短的时间，而HeLa仅在最高的效应细胞比率下降低到50％的值。

总之，这些实验证明了基于阻抗的方法在复杂的实验设计中测量细胞毒活性的高灵敏度。能够获得在时间尺度上响应的全部动态为更好地表征试剂功效提供了可能，还有助于更好地了解与癌细胞类型和效应细胞数量相关的细胞杀伤动态。如果使用51Cr释放或流式细胞术之类的终点测定法，进行这样的详细分析是不可能的或费力的。相反，由于xCELLigence平台的设置简单且无需任何标记步骤，因此允许快速且容易地建立具有多个剂量和重复的高通量实验。此外，由于没有任何标记，还为对相同细胞进行二次分析提供了可能。

实施例9

使用细胞-基质阻抗监测进行B细胞杀伤测定

将Daudi B淋巴母细胞在37℃下用5mM Cell Trace Violet(ThermoFisherscience)标记20分钟，并以80,000个细胞/腔室的密度接种到在4℃过夜包被有1μg/ml山羊抗人IgM(25ul)的腔室上。第二天，以相应于效:靶比1.25:1；0.625:1；0.313:1；0.156:1；0.078:1和0.039:1的密度添加Tall-104 T淋巴母细胞(图34A)。各腔室之间的总体积保持恒定。在54小时期间每15分钟执行一次CI测量。

在添加Tall-104之前，在最后读取时将CI图归一化(图34A)。测量在添加Tall-104后的最初10小时之间的归一化曲线上的斜率。CI图显示与效应细胞比率成比例的良好的B细胞剂量反应杀伤。除两个浓度外，所有浓度都显示出CI的时间依赖性降低。0.078:1具有即时的细胞生长抑制作用，其中CI恒定。0.039:1与没有Tall-104样品相比减缓了CI的升高。在斜率图中可以看出相同的进展。没有Tall-104和最低的浓度具有正斜率，而所有其他浓度具有剂量依赖性负值(图34B)。仅有Daudi和仅有Tall-104的图显示，Tall-104对IgM包被板的CI的影响可忽略不计。针对最大量的Tall-104(1.25:1)报告了Tall-104图(图34C)。

在另一个实例中，将Daudi细胞以80,000个细胞/腔室的密度固定在通过用抗CD40抗体预包被腔室的E-PLATE 96中。在接种Daudi细胞之后19.9小时，以不同的量添加效应细胞(NK-92)。随后另外监测阻抗70小时。采集原始阻抗数据，取平均值，进行归一化，然后减去阴性对照迹线，即不添加效应细胞时的B细胞迹线。结果表明，确实可以通过抗体(在这种情况下是针对CD40的抗体)将B细胞束缚在腔室的底部，随后可以监测效应细胞介导的细胞毒性。

Claims (42)

1.一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述方法包括：

a)提供包括多个腔室的细胞-基质阻抗监测盒，每个腔室具有配置为测量细胞-基质阻抗的电极阵列，其中不同的腔室预装载有不同的靶细胞，具体实施为不同谱系、起源或分期的癌细胞；

b)向所述多个腔室添加效应细胞以与靶细胞相互作用，其中效应细胞是免疫细胞；

c)在添加效应细胞之前和之后监测所述多个腔室的细胞-基质阻抗，并任选地从该阻抗得出基于阻抗的参数；以及

d)通过随时间推移比较所述阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞对不同靶细胞的杀伤的有效性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同的靶细胞是由维持来自不同组织起源的癌细胞的设施预装载的，所述方法进一步包括接收配送的预装载有所述不同的靶细胞的盒。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述不同的组织起源包括选自下组的至少一种组织起源：乳腺组织、肺组织、结肠组织、间充质细胞或成纤维细胞(例如纤维肉瘤)、前列腺组织、肾组织、表皮组织、肝组织和卵巢组织。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述盒流体连接于泵，所述泵将细胞培养物或流体泵送到所述多个腔室中。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述盒流体连接于外部细胞培养装置，所述外部细胞培养装置配置为在添加至所述多个腔室之前培养所述效应细胞，所述细胞培养装置任选地具体实施为生物反应器。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞培养装置是生物反应器，并且所述生物反应器是波动摇摆生物反应器。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述盒包括通道系统，所述通道系统配置为将流体输入腔室和输出腔室，所述盒任选地具有密封的顶部。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述通道系统配置有用于将气体输送到盒中和从盒中输出的端口。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述通道系统配置为从流体连接于所述盒的外部细胞培养装置接收效应细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述效应细胞选自下组：自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述效应细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)展示单链片段可变(scFv)区，并且任选地展示多个scFV。

13.根据权利要求1所述的方法，其中效应细胞工程被改造以增加外源性化合物(任选地为白细胞介素2)的表达，以促进效应细胞的生长、增殖或持久性。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述基于阻抗的参数为细胞指数，或者为对添加效应细胞之前的时间点归一化的归一化细胞指数。

15.一种评估对癌细胞的细胞溶解活性的方法，所述方法包括：

a)提供包括多个腔室的细胞-基质阻抗监测盒，每个腔室具有配置为监测细胞-基质阻抗的电极阵列，其中不同的腔室预装载有不同的靶细胞，具体实施为不同谱系、起源或分期的癌细胞；

b)向所述多个腔室添加效应细胞，其中效应细胞是免疫细胞；

c)至少一些腔室添加双特异性衔接物，其中所述双特异性衔接物是疑似将效应细胞桥接于至少一些靶细胞的分子；

d)随时间推移监测所述多个腔室的细胞-基质阻抗，包括在添加双特异性衔接物的步骤之前和之后，并任选地从该阻抗得出基于阻抗的参数；以及

e)通过随时间推移比较所述阻抗或基于阻抗的参数，确定效应细胞响应于双特异性衔接物对不同靶细胞的杀伤的有效性。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述不同的靶细胞是通过维持来自不同组织起源的癌细胞的设施预装载的，所述方法进一步包括接收配送的预装载有所述不同的靶细胞的盒。

17.根据权利要求16的方法，其中所述不同的组织起源包括选自下组的至少一种组织起源：乳腺组织、肺组织、结肠组织、间充质细胞或成纤维细胞(例如纤维肉瘤)、前列腺组织、肾组织、表皮组织、肝组织和卵巢组织。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述盒流体地连接于泵，所述泵将细胞培养物、所述双特异性衔接物和/或流体泵送到所述多个腔室中。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述盒流体地连接于外部细胞培养装置，所述外部细胞培养装置配置为在添加至所述多个腔室之前培养所述效应细胞，所述细胞培养装置任选地具体实施为生物反应器。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞培养装置是生物反应器，并且所述生物反应器是波动摇摆生物反应器。

21.根据权利要求15所述的方法，其中所述盒包括通道系统，所述通道系统配置为将细胞培养物或流体输送到所述多个腔室中，所述盒任选地具有密封的顶部。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述通道系统配置有用于将气体输送到盒中和从盒中输出的端口。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述通道系统配置为从流体连接于所述盒的外部细胞培养装置接收效应细胞。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述通道系统配置为从流体连接于所述盒的试剂储存器接收双特异性衔接物。

25.根据权利要求15所述的方法，其中所述效应细胞选自下组：自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞。

26.根据权利要求25所述的方法，其中T细胞选自下组的一种或多种：辅助性T细胞(Th细胞)、细胞毒性T细胞和记忆T细胞。

27.根据权利要求15所述的方法，其中所述双特异性衔接物包括连接在一起的两个多肽，其中每个多肽结合效应细胞或至少一些靶细胞，由此桥接效应细胞和至少一些靶细胞。

28.根据权利要求15所述的方法，其中所述双特异性衔接物结合T细胞表面模块，任选地结合分化簇3(CD3)。

29.根据权利要求15所述的方法，其中所述基于阻抗的参数是细胞指数，或者是对添加双特异性衔接物之前的时间点归一化的归一化细胞指数。

30.根据权利要求15所述的方法，其中阻抗或基于阻抗的参数降低指示有效性增加。

31.一种评估癌细胞的细胞溶解的方法，所述方法包括：

a)提供流体联接于生物反应器和泵的细胞-基质阻抗监测盒，所述盒包括具有电极阵列的腔室，所述电极阵列配置为测量细胞-基质阻抗；

b)向腔室中添加靶细胞并在生物反应器中培养细胞；

c)将来自细胞培养物的细胞泵入腔室中；

d)在添加来自细胞培养物的细胞之前和之后监测腔室的细胞-基质阻抗，并任选地从阻抗得出基于阻抗的参数；以及

e)确定所述细胞-基质阻抗或基于阻抗的参数响应于细胞泵入腔室中的变化。

32.根据权利要求31所述的方法，其中靶细胞是癌细胞，并且细胞培养物中的细胞是效应细胞。

33.根据权利要求31所述的方法，其中生物反应器是波动摇摆生物反应器。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述盒包括通道系统，所述通道系统配置为将流体输入和输出腔室，所述盒任选地具有密封的顶部。

35.根据权利要求31所述的方法，其中所述通道系统配置有用于将气体输送到盒中和从盒中输出的端口。

36.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞培养物中的细胞选自下组：自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞和B细胞。

37.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞培养物中的细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)展示单链片段可变(scFv)区，任选地展示多个scFV。

39.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞培养物中的细胞被工程改造以增加外源性化合物(任选为白细胞介素2)的表达，以促进所述细胞培养物中的细胞的生长、增殖或持久性。

40.根据权利要求31的方法，其中所述基于阻抗的参数是细胞指数，或者是对添加效应细胞之前的时间点归一化的归一化细胞指数。

41.根据权利要求31的方法，进一步包括将双特异性衔接物添加至所述腔室。

42.一种细胞-基质阻抗监测系统，其包括：

a)细胞-基质阻抗监测盒，其包括多个腔室，每个腔室具有配置为测量细胞-基质阻抗的电极阵列；

b)生物反应器，其配置为用于培养细胞，所述生物反应器流体联接于所述盒；

c)泵，其配置为将培养细胞从所述生物反应器泵入所述盒的多个腔室中；和

d)阻抗分析仪，其电联接于所述电极阵列，用于测量所述多个腔室内的细胞-基质阻抗。

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