ES2708584T3 - Método para la generación automatizada de células T modificadas genéticamente - Google Patents

Método para la generación automatizada de células T modificadas genéticamente Download PDF

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Abstract

Un proceso automatizado para la generación de células T modificadas genéticamente, subconjuntos de células T y/o progenitores de células T que comprende las etapas: a) proporcionar una muestra de células que comprende células T, subconjuntos de células T y/o progenitores de células T b) preparación de la muestra celular por centrifugación c) separación magnética de las células T, subconjuntos de células T y/o progenitores de células T d) activación de las células T enriquecidas, subconjuntos de células T y/o progenitores de células T utilizando agentes moduladores e) modificación genética de las células T, subconjuntos de células T y/o progenitores de células T f) expansión de las células T modificadas genéticamente, subconjuntos de células T y/o progenitores de células T en una cámara de cultivo g) lavado de las células T cultivadas, los subconjuntos de células T y/o los progenitores de células T, caracterizado porque todas las etapas se realizan en un sistema de cultivo celular cerrado y estéril.

Description

DESCRIPCION
Metodo para la generacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente
Campo de la invencion
La invencion se refiere a la generacion automatizada de celulas T modificadas.
Antecedentes
La fabricacion clmica de celulas T modificadas geneticamente es actualmente un proceso complejo que generalmente comienza con la obtencion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) del paciente. Los protocolos actuales cuentan con una etapa de leucaferesis, que intercambian un proceso inicialmente mas engorroso (en lugar de un menor volumen de extraccion de sangre) por un aumento del rendimiento celular. Las PBMC a menudo se enriquecen en celulas T y se activan antes de la modificacion del gen con vectores virales o no virales. Las celulas T modificadas luego se expanden para alcanzar el numero de celulas requerido para el tratamiento, despues de lo cual las celulas finalmente se formulan y/o se crioconservan antes de la reinfusion. El producto celular debe estar sujeto a una serie de ensayos de control de calidad y debe cumplir con todos los criterios de liberacion y las pautas de Buenas Practicas de Manufactura (GMP). Hasta ahora, la transferencia de celulas adoptivas (ACT) que utilizan celulas T modificadas geneticamente se ha llevado a cabo principalmente por investigadores que han desarrollado su proceso de fabricacion para ensayos clmicos a pequena escala utilizando los dispositivos y la infraestructura disponibles. Tales terapias individualizadas son complejas:
el proceso de fabricacion de celulas es laborioso, ya que comprende muchas etapas (abiertas) de manejo (por ejemplo, procesamiento de celulas con gradiente de densidad, modificacion de genes, lavado, alimentacion, etc.) que requieren intervenciones de operadores expertos comprometidos que han recibido una capacitacion extensa. La tasa de fallas puede ser alta debido a la gran destreza y demanda de tiempo que se exige al personal de la sala limpia para elaborar estos productos complejos. Ademas, la infraestructura dedicada con salas limpias y todos los instrumentos requeridos deben estar en su lugar, ser calificados y funcionales para garantizar una contencion aseptica y esteril. Estos requisitos restringen dicha fabricacion clmica a un numero limitado de instituciones en todo el mundo. Esto, a su vez, limita el numero de procedimientos y, por lo tanto, el numero de pacientes que pueden atenderse en un momento dado. Tales modelos de distribucion comercial desfavorables impiden la inversion y, por lo tanto, el amplio desarrollo de estas terapias prometedoras para los pacientes que las necesitan (Kaiser AD, Cancer Gene Therapy (2015), 1-7).
El documento WO2009/072003A2 y Apel, M et al. (2013, Chemie Ingenieur Technik 85: 103-110) divulgan un sistema de procesamiento de muestras que integra tanto sistemas de separacion de muestras como tecnicas de procesamiento de muestras. El sistema de procesamiento/separacion combinado puede incluir un sistema cerrado que puede programarse para realizar automaticamente una variedad de etapas de procesamiento celular, incluidas las separaciones basadas en densidad, separacion por inmunoafinidad, separaciones magneticas que incluyen las inmunomagneticas, las etapas de lavado y una etapa de cultivo/estimulacion/activacion coherente de celulas. Los productos celulares procesados para terapias celulares comprenden, por ejemplo, celulas T colaboradoras, celulas T citotoxicas, celulas T activadas o celulas T reguladoras. Por lo tanto, en los documentos W02009/072003A2 y Apel, M et al. (2013, Chemie Ingenieur Technik 85: 103-110) las etapas de los metodos comprenden varias etapas mecanicas o ffsicas (tales como separacion magnetica, una etapa de separacion basada en densidad y una o mas etapas de lavado) pero solo una etapa "biologica" compleja y sensible, es decir, la etapa de cultivo/estimulacion/activacion celular de las celulas.
Robinet, E et al. (1998, Journal of Hematotherapy 7: 205-2015) divulga un sistema de cultivo cerrado para la transduccion y expansion ex vivo de linfocitos T humanos utilizando bolsas de tratamiento de celulas de Baxter, pero todas las etapas se realizaron manualmente.
El documento EP2594632A1 divulga un metodo para modificar celulas que comprende las etapas a) de introduccion de celulas en un dispositivo de modificacion celular, que comprende una camara de centrifugacion con al menos una superficie modificadora de celulas con un vector normal que tiene un angulo de 135 - 45° con respecto al eje rotacional de la camara de centrifugacion en la que, y que comprende al menos un puerto de entrada/salida, b) inmovilizacion de las celulas en las superficies modificadoras de la celula mediante la rotacion de la camara de centrifugacion de 2 a 2.000 g, c) mantener la rotacion de la rotacion de la camara de centrifugacion hasta que las celulas se modifican. Pero nuevamente, no se divulgan complejas etapas biologicas multiples en el documento EP2594632A1.
En Zhan, H et al. (2013, PlosOne 8: e77106), las celulas T se transdujeron en un sistema de bolsa cerrada despues de la activacion con perlas anti-CD3/CD28, y se enriquecieron con base en la expresion de CD34, pero todas las etapas se realizaron manualmente.
El documento W02005/108589A1 describe la transduccion en bolsas cerradas que se recubren previamente con RetroNectin® y se uso la lavadora de celulas CytoMateMR como un dispositivo automatizado de manejo de fluidos para recolectar las celulas justo antes de la transfeccion.
Tumaini, B et al. (2013, Cytotherapy 15: 1406-1415) divulga un sistema semicerrado no automatizado para la seleccion inicial, activacion, transduccion y expansion de celulas T con el uso de perlas anti-CD3/anti-CD28 y bolsas para producir celulas T transducidas anti-CD19 CAR autologas.
Wang, X et al. (2012, Journal of Immunotherapy 35: 689-701) divulgan un metodo de seleccion inmunomagnetica de sistema cerrado a escala clmica para aislar Tcm CD8+ de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). Este metodo utiliza el dispositivo CliniMACSMR para agotar primero las celulas CD14+, CD45RA+ y CD4+ de las pBMC, y luego seleccionar positivamente las celulas CD62L+.
Estas Tcm CD8+ son sensibles a la estimulacion con perlas anti-CD3/CD28, y pueden transducirse eficazmente con vectores lentivirales que codifican CAR. Los procesos de estimulacion, expansion y transduccion se realizan fuera del dispositivo de manera no automatizada.
Por lo tanto, existe la necesidad en la tecnica de un metodo para generar celulas T modificadas geneticamente para uso clmico que sea mas robusto e independiente de las habilidades de los operadores.
Sumario de la invencion
En general, es diffcil automatizar procesos biologicos, especialmente cuando deben combinarse multiples procesos para generar un producto complejo tal como celulas T modificadas geneticamente.
Por lo tanto, sorprendentemente, se encontro que la implementacion de un proceso automatizado de generacion de celulas T modificadas geneticamente en un dispositivo adecuado para el procesamiento de celulas en un entorno cerrado compatible con GMP (un sistema de cultivo de celulas cerrado y esteril) es robusta y conduce a cantidades iguales o incluso mayores de celulas T modificadas geneticamente adecuadas para aplicacion clmica en comparacion con los procesos no automatizados. La invencion divulga como obtener una mejor eficiencia de transduccion y una fabricacion robusta de numeros clmicamente relevantes de celulas T modificadas geneticamente gracias a menos manipulaciones inherentes a la automatizacion y al manejo mas "benevolo" de las celulas.
El procesamiento de celulas en un sistema cerrado compatible con GMP puede realizarse, por ejemplo, con CliniMACS Prodigy® y conjuntos de tubos asociados (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania). El CliniMACS Prodigy® ofrece una plataforma flexible para aplicaciones de procesamiento celular que permite la separacion magnetica de diferentes tipos de celulas, asf como protocolos de procesamiento celular. Los detalles del sistema de procesamiento de muestras tambien se divulgan en el documento WO2009/072003.
El metodo de la presente invencion comprende la preparacion celular automatizada, seleccion (separacion) de celulas T, subconjuntos de celulas T o progenitores de celulas T, activacion de dichas celulas, expansion de dichas celulas, transduccion de dichas celulas y formulacion (lavado) de dichas celulas, por ejemplo, para uso clmico posterior.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: Resultados de un enriquecimiento automatizado representativo de celulas T
Figura 2: Activacion automatizada de celulas T
Figura 3: Representacion esquematica de la arquitectura del software que permite la fabricacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente
FIG. 4A, B, C: Impacto de la agitacion del cultivo durante la fabricacion de celulas T modificadas geneticamente Figura 5: Relacion entre la densidad del cultivo celular y el efecto del tipo de agitacion aplicada al cultivo
Figura 6: Control en proceso de un procedimiento de fabricacion automatizado
Figura 7A, B: Eficacia de transduccion en condiciones manuales frente a condiciones automatizadas
Figura 8: Robustez de la fabricacion automatizada de celulas T
Figura 9A, B: Fabricacion automatizada utilizando condiciones de agitacion en el dfa 0
Figura 10: Composicion del cultivo celular durante la fabricacion automatizada
Descripcion detallada de la invencion
El estado actual de la tecnica para la fabricacion de celulas T modificadas geneticamente consiste en utilizar un gran numero de dispositivos para realizar pequenas etapas de la fabricacion de celulas T modificadas geneticamente. Muchas etapas requieren intervenciones manuales que aumentan los riesgos de error. En el presente documento, todas las etapas se realizan en un solo dispositivo, a modo de ejemplo, se utiliza CliniMACS Prodigy®, utilizando un conjunto de tubos esteriles y cerrados de un solo uso y un software programado. Sorprendentemente, el metodo de la invencion conduce a una mayor eficiencia de transduccion de las celulas T fabricadas y a una mayor expresion del transgen por las celulas T modificadas geneticamente en comparacion con el proceso manual (FIG. 8). Ademas, se puede generar una gran cantidad de celulas T altamente viables en menos de 2 semanas (FIG. 8 y 6). Estas ventajas relacionadas con el metodo de la invencion aqrn divulgada se basan en un entorno altamente mantenido (temperatura y gas) durante todo el proceso, ya que las celulas no necesitan ser retiradas de una incubadora para el muestreo, por ejemplo (lo que de otro modo llevana a una fuerte câ da de la temperature del cultivo) y gracias al delicado procesamiento y manejo de las celulas en el conjunto de tubos y la ausencia de pipeteo manual y/o uso de jeringas que crean fuerzas de corte que son diffciles de controlar en intensidad y para normalizar y son danosas para las celulas y al proceso.
En un aspecto, la presente invencion proporciona un proceso automatizado (metodo) para la generacion de celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T que comprenden las etapas: a) proporcionar una muestra de celulas que comprende celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T
b) preparacion de la muestra celular por centrifugacion
c) separacion magnetica de las celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T
d) activacion de las celulas T enriquecidas, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T utilizando agentes moduladores
e) modificacion genetica de las celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T
f) expansion de las celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T en una camara de cultivo
g) lavado de las celulas T cultivadas
caracterizadas porque todas las etapas se realizan en un sistema de cultivo celular cerrado y esteril.
Dicha separacion magnetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se puede realizar utilizando moleculas de union a antfgeno espedficas para un marcador de superficie celular en la superficie de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o progenitores de T celulas tales como marcadores
CD2, CD3, CD4, CD8 CD25, CD28, CD27, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD95, CD127, CD137, TCR alfa/beta, TCR gamma/delta, CCR7, PD-1 o Lag3.
Dichos agentes moduladores pueden seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpos agonistas, citoquinas, moleculas coestimuladoras recombinantes e inhibidores de farmacos pequenos. Preferentemente, dichos agentes moduladores son anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o fragmentos de los mismos acoplados a perlas o nanoestructuras. Mas preferentemente, los agentes moduladores son una nanomatriz, comprendiendo la nanomatriz a) una matriz de cadenas polimericas moviles, y b) unidas a dicha matriz de cadenas polimericas moviles anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o fragmentos de los mismos, en donde la nanomatriz es 1 a 500 nm de tamano. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o fragmentos de los mismos pueden estar unidos a matrices iguales o separadas de cadenas polimericas moviles. Si los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o fragmentos de los mismos se unen a matrices separadas de cadenas de polfmeros moviles, es posible el ajuste fino de las nanomatrices para la estimulacion de las celulas T. La nanomatriz puede ser biodegradable.
Ademas, filtracion esteril de dichas nanomatrices pequenas como se divulga, por ejemplo, en el documento WO2014/048920A1 es posible, lo cual es una caractenstica importante para la expansion in vitro de celulas T a largo plazo en condiciones que cumplen con los estandares rigurosos de GMP, es decir, en un sistema de cultivo de celulas cerrado y esteril.
Dicha modificacion genetica de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T puede realizarse por transduccion, transfeccion o electroporacion.
Preferiblemente, la transduccion se realiza con lentivirus, retrovirus gamma, alfa o adenovirus o con electroporacion o transfeccion por acidos nucleicos (ADN, ARNm, miARN, antagomires, ODN), protemas, nucleasas espedficas del sitio (nucleasas dedo de zinc, TALEN, CRISP/R), virus de ARN que se replican a sf mismos (por ejemplo, virus de la encefalopatfa equina) o vectores lentivirales con deficiencia de integracion.
Mas preferentemente, dicha modificacion genetica de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T puede realizarse transduciendo dichas celulas con vectores lentivirales.
Dicha expansion de las celulas T modificadas geneticamente, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se puede realizar agregando un medio celular adecuado para la expansion del cultivo celular tal como Medio TexMACS GMP (Miltenyi Biotec GmbH) a dicha camara de cultivo.
Dicha activacion, modificacion genetica y/o dicha expansion de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T pueden realizarse en condiciones de agitacion. Preferentemente, la agitacion se realiza durante la expansion de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T. Preferiblemente, la agitacion (rotacion) en la camara de cultivo se realiza de forma esporadica o periodica girando la camara de cultivo (camara de centrifugacion) cada 1-120 segundos, mas preferiblemente cada 15-60 segundos y lo mas preferiblemente cada 30 segundos, con fuerzas centnfugas entre mayores (>) 0 y maximo 70 x g (1 a 1.000 rpm en una camara con un radio de 6 cm) en una o dos direcciones, mas preferiblemente entre 0,2 y 17 x g (50 a 500 rpm en una camara con un radio de 6 cm) en una o dos direcciones, mas preferiblemente a 6 x g (300 rpm en una camara con un radio de 6 cm) en dos direcciones. Es importante destacar que las condiciones de agitacion se pueden adaptar durante el cultivo (generalmente incrementado al aumentar la densidad celular) para apoyar mejor la expansion de las celulas T.
Dicha activacion se puede realizar utilizando densidades de celulas entre 0,2e6 celulas/mL a 4e6 celulas/mL que se activaran y preferiblemente entre 0,5e6 celulas/mL a 2e6 celulas/mL y lo mas preferiblemente 1e6 celulas/mL. Alternativamente, dicha activacion se puede realizar utilizando altas densidades celulares entre 4e6 celulas/mL y 2e7 celulas/mL que se activaran y preferiblemente entre 4e6 celulas/mL a 1e7 celulas/mL.
Convencionalmente, las celulas T se activan y se expanden a baja densidad bajo una baja densidad de celulas T (es decir, <1e6 celulas T/mL o <2e6 celulas PBMC/mL). Normalmente, las altas densidades de celulas T (> 3e6 celulas T/mL o 5e6 celulas PBMC/mL) no se pueden activar correctamente. Por lo tanto, sorprendentemente, se pueden observar efectos sinergicos cuando se activan densidades altas de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T y luego se expanden bajo condiciones de agitacion (posiblemente antes o despues de la modificacion genetica de dichas celulas) dentro del proceso de la presente invencion. Esto conduce rapidamente a numeros celulares muy altos de celulas modificadas geneticamente (vease la Figura 9). Debido a este efecto sinergico inesperado de la combinacion de la activacion de numeros de celulas altos, por ejemplo, con una nanomatriz soluble como se menciono anteriormente y la condicion de agitacion durante la expansion, el proceso automatizado permite generar un alto numero de celulas T modificadas, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T para uso en terapia en un tiempo reducido en comparacion con los metodos conocidos en el arte (es decir, 8 dfas en lugar de 14-28).
Dichos celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T pueden modificarse geneticamente para expresar un receptor de antfgeno quimerico (CAR), un receptor de celulas T (TCR) o cualquier molecula accesoria en su superficie celular.
Para la formulacion final, las celulas T expandidas y modificadas geneticamente, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se lavan por centrifugacion y el reemplazo del medio de cultivo con un regulador apropiado para aplicaciones posteriores, como la infusion de la composicion de celulas generadas en un paciente.
Cuando sea necesario, las celulas T modificadas geneticamente, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T pueden separarse de las celulas T no modificadas, por ejemplo, utilizando nuevamente la tecnologfa de separacion magnetica integrada en el sistema de cultivo celular cerrado y esteril utilizado.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona una composicion sustancialmente pura de celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T obtenibles mediante el metodo de la presente invencion (vease la Figura 10).
En un aspecto adicional, la divulgacion proporciona una composicion farmaceutica de celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T obtenibles mediante el metodo de la presente invencion.
Como ejemplo, el CliniMACS Prodigy® y los conjuntos de tubos asociados (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) se utilizan en el presente documento como un sistema de procesamiento cerrado de muestras de celulas en el que se implemento un proceso automatizado. Este sistema se divulga en el documento W02009/072003 en detalle. Pero no pretende restringir el uso del metodo de la presente invencion al sistema CliniMACS Prodigy®.
El sistema CliniMACS Prodigy® esta disenado para automatizar y estandarizar los procesos completos de fabricacion de productos celulares. Combina la tecnologfa de separacion CliniMACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) con una amplia gama de posibilidades de procesamiento de celulas controladas por sensores. Las caractensticas destacadas del dispositivo son:
• Camara CentriCultMR desechable que permite el procesamiento y cultivo estandarizado de celulas
• Posibilidad de enriquecimiento y agotamiento de celulas, solo o en combinacion con los reactivos CliniMACS® (Miltenyi Biotec GmbH)
• Cultivo celular y posibilidades de expansion celular gracias a la temperatura y al intercambio controlado de gas CO2.
• Formulacion del producto final en medio y volumen predefinidos
• La posibilidad de programar el dispositivo utilizando Flexible Programming Suite (FPS) y un lenguaje de programacion compatible con GAMP5 para la personalizacion del procesamiento celular
• Conjuntos de tubos a medida para una variedad de aplicaciones.
La etapa de separacion de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T puede comprender uno, varios (dos o mas) o una combinacion de etapas de enriquecimiento positivo, es dedr, separacion de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T (marcacion magnetica directa). Las celulas T pueden seleccionarse para celulas T CD4+ y/o CD8+ usando moleculas de union a antigeno acopladas a partfculas tales como perlas magneticas espedficas para CD4 y CD8, respectivamente. Una subpoblacion de celulas T, tales como celulas T sin modificar y de memoria central, se pueden separar, por ejemplo, utilizando el marcador CD62L. La etapa de separacion de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T tambien puede comprender un enriquecimiento negativo (marcacion directa de celulas no T) de celulas T o del agotamiento de subconjuntos celulares que deben eliminarse de la preparacion. Por ejemplo, las celulas B pueden eliminarse del material del paciente con linfoma mediante el marcador CD19. Las celulas inhibidoras, tal como las celulas T reguladoras (alto CD25), los monocitos (CD14) tambien pueden eliminarse utilizando los marcadores CD25 y CD14, respectivamente.
La transduccion viral de las celulas T puede mejorarse mediante el uso de reactivos potenciadores de la transduccion, especialmente reactivos potenciadores de la transduccion seleccionados del grupo de reactivos policationicos (polibreno, sulfato de protamina, poli-L-lisina, peptidos con una carga positiva neta), poloxameros, moleculas de adhesion tales como fibronectina o fibronectina modificada (RetroNectina), o dominios de direccionamiento de protemas tales como anticuerpos, complejos de anticuerpos, partfculas magneticas.
Los potenciadores de transduccion pueden proporcionarse en solucion, revestidos en la camara de cultivo o revestidos en una sustancia portadora presente en suspension/solucion dentro de la camara de cultivo.
La camara de centrifugacion y la camara de cultivo pueden ser identicas. La camara de centrifugacion y la camara de cultivo se pueden usar en diversas condiciones: por ejemplo, para la separacion o transduccion, se puede aplicar una alta velocidad de rotacion (es decir, fuerzas g altas), mientras que, por ejemplo, las etapas de cultivo se pueden realizar con rotacion lenta o incluso en estado inactivo. En otra variante de la invencion, la camara cambia la direccion de rotacion de una manera oscilante que da como resultado una agitacion de la camara y el mantenimiento de las celulas en suspension. Por consiguiente, en el proceso de la invencion, las etapas de activacion, modificacion y/o cultivo de celulas T pueden realizarse bajo condiciones estables o de agitacion de la centrifugacion o la camara de cultivo.
La Figura 1 muestra los resultados de un enriquecimiento de celulas T automatizado representativo. Una leucaferesis de 8e9 celulas en total se conecta mediante soldadura esteril a un conjunto de tubos instalado en el CliniMACS Prodigy®. Las celulas se lavan y se marcan con el reactivo CliniMACS de CD4 y CD8. Las celulas T marcadas se afslan espedficamente del resto de las celulas mediante enriquecimiento magnetico. Las celulas antes y despues del enriquecimiento se marcan con anticuerpos unidos a fluorocromo contra CD3, CD14 y CD20 y se analizan mediante citometna de flujo. La grafica superior de puntos muestra la composicion de las celulas antes del enriquecimiento y la grafica inferior de puntos representa la pureza (94,7%) de las celulas T despues del enriquecimiento.
La Figura 2 muestra una activacion automatizada de celulas T. En el dfa 0, 1e8 celulas T enriquecidas se muestrearon automaticamente en la camara de un conjunto de tubos en el dispositivo CliniMACS Prodigy®. El mismo dfa, las celulas T se incuban con el reactivo de activacion del kit MACS GMP TransAct CD3/CD28 (Miltenyi Biotec GmbH) que conduce a la sobrerregulacion de los marcadores de activacion temprana CD25 y CD69. La Figura representa los resultados de un analisis citometrico de flujo representativo de seleccion de poblaciones en celulas T vivas antes de la activacion (parte superior) y 24 horas despues de proporcionar el reactivo de activacion (parte inferior) y muestra una sobrerregulacion fuerte de Cd 25 y CD69.
La Figura 3 muestra una representacion esquematica de la arquitectura del software que permite la fabricacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente: para realizar la fabricacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente, lo que significa que para poder automatizar un proceso biologico complicado es importante crear un software capaz de aceptar parametros como el numero de celulas, la velocidad de flujo, el volumen, la temperatura, el % de CO2, el movimiento del cultivo, el tiempo de incubacion, el intercambio de medios, etc. Para propositos de desarrollo, el programa debe ser flexible, sin embargo, para uso clmico, el numero de parametros de entrada debe reducirse y, en el proceso, deben anularse los cambios. Por lo tanto, se describe un programa en el que los parametros de cultivo, el tiempo y los dfas en que deben realizarse las acciones se configuran por primera vez en una denominada matriz de actividades. La matriz de actividades proporciona una grna para el programa que se ejecuta en segundo plano. El programa de fondo funciona como un bucle de cultivo (caja central) que controla las funciones basicas del cultivo donde los programas "satelite" tales como "Transduccion", "Lavado de reactivos", "Alimentacion" se pueden activar en un momento definido. Al finalizar los programas satelite se reanuda el ciclo de cultivo central. Los parametros del programa satelite y del ciclo de cultivo se definen en la matriz de actividad (parte de entrada no mostrada) al inicio del proceso de fabricacion. Aunque la creacion de un programa es importante para realizar procedimientos automatizados del proceso como se describe en este documento, la implementacion de un programa de este tipo puede ser realizada por un experto en la tecnica sin aportaciones inventivas. Sin embargo, la entrada de parametros y el desarrollo del programa (tal como los modos de agitacion, los tiempos y la frecuencia) deben implementarse espedficamente con el fin de obtener un proceso robusto y automatizado funcional (es decir, un proceso capaz de generar resultados confiables y reproducibles con material de entrada altamente variable, tal como celulas del paciente de diferentes indicaciones medicas).
La Figura 4 muestra el impacto de la agitacion del cultivo durante la fabricacion de celulas T modificadas geneticamente. Despues del enriquecimiento automatico de celulas positivas para CD62L en CliniMACS Prodigy®, se introdujeron 1e8 celulas T enriquecidas en la camara, activadas con el kit MACS GMP TransAct CD3/CD28 (Miltenyi Biotec GmbH), gen modificado con un vector lentiviral que codifica un receptor de antfgeno quimerico dirigido contra c D20. Los primeros 4-5 dfas se llevaron a cabo en condiciones de cultivo en estado estacionario. El cultivo se sometio luego a 3 tipos diferentes de modos de agitacion esporadica. A) tipo 1, cada 30 segundos (s), 100 rpm en una direccion durante 2 segundos, B) Tipo 1 desde el dfa 5 hasta el dfa 9. El d^a 9 se activa el tipo 2 (cada 30 segundos, 300 rpm en una direccion durante 2 segundos) o C) Tipo 1 desde el dfa 5 hasta el dfa 9. El dfa 9 se activa el Tipo 3 (cada 30 segundos, 300 rpm en dos direcciones durante 2 segundos). El eje X representa dfas de cultivo. El eje Y izquierdo muestra la expansion de celulas T (cuadrados), la densidad de las celulas (drculos, 1e6 celulas por mL) y el recuento total de celulas (triangulos, x 1e8 celulas). El eje Y derecho muestra la velocidad de agitacion del tipo indicado. Como se puede observar en C), la variacion de los parametros de las condiciones de agitacion conduce a un aumento de la produccion celular.
La Figura 5 muestra la relacion entre la densidad del cultivo celular y el efecto del tipo de agitacion aplicado al cultivo. Los resultados de varios experimentos realizados en condiciones similares a las descritas en la Figura 4, se puede observar que un tipo de agitacion mas robusto (por ejemplo, el tipo 3) producira mejores resultados cuando se somete a un cultivo con una densidad superior a 2e6 celulas/mL y preferiblemente superior a 4e6 celulas/mL. El eje X, representa dfas despues de que el cultivo se haya establecido en 250 mL, en todos los casos, 8 dfas despues del inicio del cultivo y la activacion inicial de las celulas T. El eje Y representa la densidad de celulas T (1e6 celulas/mL).
La Figura 6 muestra un control en proceso de un procedimiento de fabricacion automatizada. Para garantizar que las celulas T se cultiven en condiciones optimas, es importante poder muestrear el cultivo durante el proceso de fabricacion para monitorear los parametros cnticos. El proceso automatizado descrito en el presente documento permite al usuario tomar en cualquier momento una muestra del medio de cultivo en bolsas de muestreo dedicadas. Los parametros tales como la densidad celular, glucosa, pH, etc., pueden medirse a distancia. La Figura representa en el proceso los valores de monitoreo de un procedimiento tfpico realizada en CliniMACS Prodigy® utilizando el medio GMP TexMACS (Miltenyi Biotec GmbH). El eje X representa el tiempo en dfas. El eje Y izquierdo muestra los valores de glucosa (triangulo, en g/mL), valores de pH (pastilla sin relleno). El eje Y derecho representa la viabilidad (pastilla rellena, en %) y la velocidad de agitacion del experimento (lmea de puntos, en rpm).
La Figura 7 muestra la eficiencia de transduccion en condiciones manuales en comparacion con las automatizadas. En condiciones similares a las descritas en la Figura 4, 1e8 celulas T enriquecidas en T fueron estimuladas con el kit MACS GMP TransAct CD3/CD28 y transducidas con 1e8 unidades de transduccion del vector lentiviral codificante o un receptor de antfgeno quimerico anti-CD20 el dfa 1. En paralelo al proceso de fabricacion automatizado se llevo a cabo un proceso de fabricacion manual. 7 dfas despues de la transduccion, se analizo una muestra mediante citometna de flujo para determinar A) la frecuencia de las celulas T transducidas y B) la intensidad de fluorescencia media de la expresion de CAR. Como se puede ver, el porcentaje de celulas que expresan el transgen, asf como el nivel de expresion del transgen, es mayor en las celulas T transducidas durante el proceso de fabricacion automatizada.
La Figura 8 muestra la robustez de la fabricacion automatizada de celulas T. Todas las lmeas representan procesos de fabricacion automatizados independientes realizados con diferentes donantes. Los experimentos se realizan como se describe en la Figura 4. El eje X representa el tiempo en dfas y el eje Y el recuento de celulas absoluto determinado en los diferentes dfas. Como puede verse, el proceso de fabricacion automatizado es muy robusto y conduce a resultados muy comparables de procesos individuales.
La Figura 9 muestra la fabricacion automatizada utilizando condiciones de agitacion el dfa 0. Se aislaron celulas positivas para CD4/CD8 de aferesis y se cultivaron en diferentes configuraciones en la plataforma CliniMACS Prodigy®. Una mayor densidad de 4e8 celulas T enriquecidas se sembraron en 100 mL (A) o 200 mL (B) de volumen total en el dfa 0 y el cultivo se llevo a cabo inmediatamente en condiciones de agitacion de tipo 3. Las celulas en 100 mL se diluyeron el dfa 2 y se realizo un intercambio de medio todos los dfas a partir del dfa 4 hasta el final del cultivo. En el dfa 6, el cultivo iniciado con 200 mL (B) se detuvo, el cultivo que comenzo con 100 mL (A) se termino el dfa 8. Sorprendentemente, los resultados muestran que es posible activar y expandir las celulas T sin una fase de estado estable durante la activacion al inicio del cultivo. En tales condiciones dinamicas, es posible generar muy rapidamente un gran numero de celulas T (es decir, 2,8e9 celulas T en el dfa 8, en la Figura 9A, frente a 1,8e9 celulas en total en el dfa 8 en la Figura 4C).
La Figura 10 muestra una composicion del cultivo celular durante la fabricacion automatizada. Se conecto una capa leucocitaria de un donante sano al conjunto de tubos TS520 (Miltenyi Biotec GmbH) instalado en CliniMACS Prodigy®, los subconjuntos de celulas T sin modificar y de memoria central se enriquecieron utilizando el reactivo CliniMACS CD62L.
1e8 celulas enriquecidas con CD62L se colocaron en la camara de cultivo, se activaron, se transdujeron el dfa 1 con un vector lentiviral que codifica la protema verde fluorescente (GFP) y se expandieron utilizando el metodo descrito en esta invencion. La Figura representa la frecuencia de los subconjuntos de celulas indicados (desde la parte inferior de las barras hasta la parte superior: celulas T, celulas B, monocitos, celulas NK, celulas T NK y granulocitos). Como se puede ver despues de 11 dfas de cultivo y en la muestra de recoleccion final, el producto celular esta compuesto por mas del 95% de celulas T.
Realizaciones
En una realizacion de la invencion, una muestra de paciente, por ejemplo, que comprende celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T de interes se introducen en la camara de un sistema de cultivo cerrado y esteril tal como el CliniMACS Prodigy®. La muestra se centrifuga, preferentemente utilizando deteccion de fase de densidad optica, se eliminan los eritrocitos en exceso y la muestra de celulas se lava utilizando, por ejemplo, el regulador CliniMACS (Miltenyi Biotec GmbH) para evitar la agregacion celular, y esta etiquetado magneticamente con un reactivo de separacion de celulas magnetico como el reactivo CliniMACS CD4 y CD8 (Miltenyi Biotec GmbH). Despues del etiquetado, las celulas se lavan, se enriquecen magneticamente a traves de una columna integrada de seleccion de celulas magneticas y luego se devuelven a una camara de cultivo celular.
En la camara de cultivo celular, las celulas T pueden activarse en condiciones de cultivo estables o con agitacion con uno o una combinacion de reactivos capaces de inducir la proliferacion de celulas T, tales como anticuerpos agonistas (por ejemplo, anti-CD3 y anti-CD28), citoquinas (por ejemplo, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, lL-22, IL-23 , IL-35, TGF-b, IFN alfa, iFn gamma, TNFalfa) proternas recombinantes, moleculas coestimuladoras, lectinas, ionoforos, moleculas sinteticas, celulas presentadoras de antigenos (APC), APC artificiales o alimentadores. Estos reactivos de activacion pueden proporcionarse en solucion, revestidos en la camara de cultivo o revestidos en una sustancia portadora presente en suspension/solucion dentro de la camara de cultivo o en partfculas grandes.
Las celulas T pueden cultivarse en condiciones de cultivo constantes o con agitacion. Despues de un penodo de cultivo, el vector viral se agrega a la camara de cultivo y las celulas se transducen. Despues de un penodo de cultivo celular adicional, las celulas pueden ser transducidas nuevamente o lavadas extensamente y recolectadas (formuladas). Antes de la transferencia in vivo de los productos de celulas T modificados geneticamente, las celulas pueden lavarse, concentrarse y resuspenderse en un regulador que cumpla con los requisitos clrnicos para infusion in vivo. Todos las etapas mencionados anteriormente se realizan automaticamente.
En una realizacion de la invencion, las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se marcan uniendo perlas magneticas acopladas a anticuerpos a un marcador de superficie celular presente en la superficie de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T y enriquecimiento de las celulas marcadas por separacion magnetica (enriquecimiento positivo).
En otra realizacion de la invencion, las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se enriquecen mediante la union de perlas magneticas acopladas a anticuerpos a un marcador de superficie celular no presente en la superficie de las celulas T o subconjuntos celulares definidos y agotando las celulas marcadas mediante separacion magnetica (enriquecimiento negativo).
En una realizacion adicional de la invencion, ademas del primer enriquecimiento de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T, las celulas T modificadas geneticamente, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se enriquecen en una segunda etapa de enriquecimiento mediante etiquetado magnetico de las celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T y separacion magnetica antes o despues del cultivo para obtener una mayor frecuencia de las celulas T geneticamente modificadas, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T en la composicion celular finalmente lograda obtenida por el presente metodo. Por ejemplo, si la celula modificada geneticamente es una celula T que expresa una CAR o TCR, entonces la segunda etapa de separacion puede realizarse utilizando una molecula de union a antfgeno acoplada a una partfcula magnetica espedfica para la CAR o TCR expresada de forma recombinante en la superficie celular de la celula T modificada geneticamente.
En una realizacion preferida de la invencion, una muestra de celulas, por ejemplo, se proporciona sangre completa del paciente, que comprende celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T. Dicha muestra esta conectada a un sistema de cultivo celular cerrado y esteril, por ejemplo, la muestra se conecta a traves del juego de tubos al dispositivo CliniMACS Prodigy®. La muestra de celulas se prepara por centrifugacion en una camara de centrifugacion del dispositivo, lo que resulta en la separacion de eritrocitos y plaquetas de otras celulas, incluidas las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T. La separacion magnetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se realiza utilizando anticuerpos acoplados a partfculas magneticas espedficas para marcadores de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25 , CD28, CD27, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD95, CD127, CD137, TCR alfa/beta, TCR gamma/delta, CCR7, PD-1 o Lag3, conduciendo las celulas marcadas a traves de una unidad de iman con una columna de separacion del dispositivo que resulta en un enriquecimiento de dichas celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T. Despues de mover las celulas T separadas, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T a la camara de cultivo (que puede ser identica a la camara de centrifugacion) del dispositivo, dichas celulas se ajustan a una densidad dada de 0.5e6 celulas /mL hasta 2e6 celulas/mL activadas mediante el uso de agentes moduladores, por ejemplo, nanomatrices que consisten en cadenas polimericas moviles que tienen unidos anticuerpos anti-CD3 y ant-CD28 o fragmentos de los mismos y que tienen un tamano de entre 1 y 500 nm. Despues de dicha activacion de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T dichas celulas se modifican geneticamente en la camara de cultivo del dispositivo, por ejemplo, se transducen con un vector lentiviral que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica una CAR. Despues de la modificacion genetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T, dichas celulas se expanden en el cultivo bajo condiciones de agitacion. La agitacion se puede realizar mediante centrifugacion esporadica o periodica de la camara de cultivo (en este caso, la camara de cultivo es identica a la camara de centrifugacion) en condiciones que permiten que las celulas esten en suspension (y como se divulga en el presente documento). Finalmente, las celulas cultivadas se lavan por centrifugacion, lo que permite el reemplazo del medio de cultivo con un regulador apropiado para aplicaciones posteriores, como la infusion de la composicion celular generada a un paciente.
En una realizacion de la invencion, una mayor pureza de celulas T transducidas, por ejemplo, celulas T que expresan un transgen, tal como un CAR o TCR en su superficie celular, se obtienen al final del proceso de fabricacion gracias a una etapa de seleccion celular adicional que enriquece espedficamente las celulas T modificadas geneticamente, esto se realiza preferiblemente utilizando partfculas magneticas recubiertas con anticuerpos dirigidos contra la molecula de superficie codificada por el transgen. La etapa de enriquecimiento se lleva a cabo preferiblemente utilizando nuevamente la unidad de separacion magnetica del dispositivo de manera automatica y se realiza antes de la formulacion final.
Preferiblemente, se usa un agente de seleccion que puede eliminarse completamente de la superficie de las celulas seleccionadas despues de este segundo enriquecimiento y antes de la aplicacion a un paciente o uso posterior.
En otra realizacion de la invencion, es posible comenzar el proceso de fabricacion automatizada con densidades de celulas mas altas activando las celulas T en condiciones de suspension. Cuando se puede obtener un numero suficiente de celulas T objetivo, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T a partir del material de partida, es posible comenzar el proceso de fabricacion automatizada con una alta densidad de celulas de 4e6 a 1e7 celulas T directamente bajo condiciones de agitacion, por ejemplo, utilizando una centrifugacion esporadica o periodica de la camara de cultivo (en este caso, la camara de cultivo es identica a la camara de centrifugacion) en condiciones que permiten a las celulas estar en suspension para la activacion de las celulas al inicio del cultivo. Las celulas T pueden modificarse adicionalmente usando un vector lentiviral y expandirse bajo suspension. En esta realizacion de la invencion, preferentemente, las condiciones de agitacion se mantienen durante las etapas de activacion, modificacion genetica y etapas de expansion del proceso como se divulga en el presente documento para mantener el cultivo celular de alta densidad en suspension. La ventaja de esta alternativa es la posibilidad de obtener grandes cantidades de celulas en un penodo de tiempo mas corto (generalmente 1 semana frente a 10-14 dfas).
En una realizacion de la invencion, la etapa de modificacion genetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T puede realizarse usando vectores lentivirales. Los vectores lentivirales con el pseudotipo VSVG permiten una transduccion eficiente bajo un metodo de fabricacion automatizado. Sin embargo, el metodo es completamente adecuado para el uso de cualquier tipo de vector lentiviral (con, por ejemplo, el virus del sarampion (ML-LV), el virus de leucemia del mono gibon (GALV), el retrovirus endogeno felino (RD114), las envolturas pseudotipadas derivadas del retrovirus endogeno del babuino (BaEV)). Se pueden usar otros vectores virales, tales como vectores retrovirales gamma o alfa. Los reactivos potenciadores de la transduccion se pueden agregar cuando sea necesario utilizando la fabricacion automatizada descrita en esta invencion.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion.
Los terminos "sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas" y "sistema cerrado y esteril (cultivo de celulas)" se pueden usar indistintamente.
El termino "sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas", como se usa en este documento, se refiere a cualquier sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminacion de cultivos celulares mientras se realizan procesos de cultivo como la introduccion de material nuevo, por ejemplo, por transduccion, y realizando etapas de cultivo celular tales como proliferacion, diferenciacion, activacion y/o separacion de celulas. Dicho sistema permite operar en condiciones GMP o similares a GMP ("esteriles") que dan como resultado composiciones celulares que son clmicamente aplicables. A modo de ejemplo, el CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) se utiliza como un sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas. Este sistema se divulga en el documento WO2009/072003. Pero no pretende restringir el uso del metodo de la presente invencion al CliniMACS Prodigy®.
El proceso de la invencion se puede realizar en un sistema cerrado y esteril (un sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas), que comprende una camara de centrifugacion que comprende una placa base y una placa de cubierta conectadas por un cilindro, bombas, valvulas, una columna de separacion magnetica de celulas y un conjunto de tubos. Las muestras de sangre u otras fuentes que comprenden celulas T, subpoblaciones de celulas T y/o progenitores de celulas T pueden transferirse hacia y desde el conjunto de tubos mediante acoplamiento esteril o soldadura esteril. Un sistema adecuado se divulga en el documento WO2009/072003.
El sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas puede comprender una pluralidad de conjuntos de tubos (TS) en los que las celulas se transfieren entre TS mediante acoplamiento esteril o soldadura esteril.
Se pueden realizar diferentes modulos del proceso en TS cerrados funcionalmente diferentes con transferencia del producto (celulas) de un modulo generado en un conjunto de tubos a otro conjunto de tubos por medios esteriles. Por ejemplo, las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T pueden enriquecerse magneticamente en un primer conjunto de tubos (TS) TS100 de Miltenyi Biotec GmbH y la fraccion positiva que contiene celulas T enriquecidas se suelda del TS100 y se suelda a un segundo juego de tubos TS730 de Miltenyi Biotec GmbH para su posterior activacion, modificacion, cultivo y lavado.
Los terminos "metodo automatizado" o "proceso automatizado" como se usan en este documento se refieren a cualquier proceso que se automatice mediante el uso de dispositivos y/o ordenadores y software de ordenador. Los metodos (procesos) que se han automatizado requieren menos intervencion humana y menos tiempo humano. En algunos casos, el metodo de la presente invencion se automatiza si al menos una etapa del metodo presente se realiza sin ningun tipo de apoyo o intervencion humana. Preferentemente, el metodo de la presente invencion se automatiza si todas las etapas del metodo como se describe en el presente documento se realizan sin apoyo o intervencion humana que no sea la conexion de reactivos frescos al sistema. Preferentemente, el proceso automatizado se implementa en un sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas como CliniMACS Prodigy® como se describe en este documento.
El sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas puede comprender a) una unidad de procesamiento de muestras que comprende un puerto de entrada y un puerto de salida acoplado a un contenedor giratorio (o camara de centrifugacion) que tiene al menos una camara de muestras, en la que la unidad de procesamiento de muestras esta configurada para proporcionar una primera etapa de procesamiento a una muestra o rotar el recipiente para aplicar una fuerza centnfuga a una muestra depositada en la camara y separar al menos un primer componente y un segundo componente de la muestra depositada; y b) una unidad de separacion de muestras acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestras, comprendiendo la unidad de separacion de muestras un soporte de columna de separacion, una bomba y una pluralidad de valvulas configuradas para controlar al menos parcialmente el flujo de fluido a traves de un circuito de fluido y una columna de separacion colocada en el soporte, en el que la columna de separacion esta configurada para separar componentes etiquetados y no etiquetados de la muestra que fluye a traves de la columna.
Dicho contenedor giratorio tambien se puede utilizar como una camara de cultivo e incubacion de celulas con temperatura controlada (Unidad CentriCult = CCU). Esta camara se puede inundar con mezclas de gases definidas, proporcionadas por una unidad de mezcla de gases adjunta (por ejemplo, el uso de aire presurizado/N2/CO2 o N2/CO2/O2).
Todos los agentes pueden estar conectados al sistema cerrado antes del inicio del proceso. Esto incluye todos los reguladores, soluciones, medios de cultivo y suplementos, MicroBeads, utilizados para lavar, transferir, suspender, cultivar, recolectar celulas o clasificar celulas inmunomagneticas dentro del sistema cerrado. Alternativamente, dichos agentes pueden soldarse o conectarse por medios esteriles en cualquier momento durante el proceso.
La muestra de celulas que comprende celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T puede proporcionarse en bolsas de transferencia u otros recipientes adecuados que pueden conectarse al sistema cerrado por medios esteriles.
El termino "proporcionar una muestra de celulas que comprende celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T" significa la provision de una muestra de celulas, preferentemente de una muestra de celulas humanas de origen hematologico. Normalmente, la muestra de celulas puede estar compuesta de celulas hematologicas de un donante o un paciente. Dicho producto sangumeo puede estar en forma de sangre completa, capa leucocitaria, leucaferesis, PBMC o cualquier muestra clmica de productos sangumeos. Puede ser de origen fresco o congelado.
El termino "preparacion de la muestra de celulas mediante centrifugacion", como se usa en el presente documento, se refiere a la separacion de celulas de otros componentes (por ejemplo, componentes no celulares) de la muestra de celulas proporcionada por centrifugacion. La etapa centnfuga puede comprender uno, mas o todos los siguientes aspectos: separacion de gradiente, reduccion de eritrocitos, eliminacion de plaquetas y lavado de celulas.
El termino "lavado" significa el reemplazo del medio o regulador en el que se mantienen las celulas. La sustitucion del sobrenadante puede realizarse en parte (por ejemplo, se elimina el 50% del medio y se agrega el 50% del medio fresco), lo que a menudo se aplica con fines de dilucion o alimentacion, o por completo. Se pueden combinar varios etapas de lavado para obtener un reemplazo mas profundo del medio original en el que se mantienen las celulas. Una etapa de lavado a menudo involucra la sedimentacion de las celulas mediante fuerzas de centrifugacion y la eliminacion del sobrenadante. En el metodo de la presente invencion, las celulas se sedimentan por rotacion de la camara, por ejemplo, a 300 x g y el sobrenadante se elimina durante la rotacion de la camara. El medio se agrega durante la rotacion o en estado estable.
El termino "condiciones de agitacion", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier medio que permita mantener las celulas del cultivo celular en suspension. La agitacion se puede realizar por rotacion (o centrifugando esporadicamente) una camara de cultivo de un sistema de cultivo celular cerrado y esteril, y en donde dicha rotacion se realiza periodicamente como se describe en este documento. La agitacion tambien se puede realizar, por ejemplo, mediante el uso de un equipo de batido, un dispositivo propulsor o un flujo de lfquido (por ejemplo, canales) integrado en el sistema de cultivo celular cerrado y esteril utilizado que evita la sedimentacion de las celulas.
El termino "marcador", como se usa en el presente documento, se refiere a un antfgeno celular que se expresa espedficamente por un cierto tipo de celula. Preferentemente, el marcador es un marcador de superficie celular, de modo que se puede realizar el enriquecimiento, aislamiento y/o deteccion de celulas vivas. Los marcadores pueden ser marcadores de seleccion positiva tales como CD4, CD8 y/o CD62L o pueden ser marcadores de seleccion negativos (por ejemplo, agotamiento de celulas que expresan CD14, CD16, CD19, CD25, CD56).
El termino "expresion" como se usa en el presente documento se define como la transcripcion y/o traduccion de una secuencia de nucleotidos particular dirigida por su promotor en una celula.
El termino "partmula", como se usa en el presente documento, se refiere a una superficie de fase solida tal como partmulas coloidales, microesferas, nanopartmulas o perlas. Los metodos para la generacion de tales partmulas son bien conocidos en el campo de la tecnica. Las partmulas pueden ser partmulas magneticas. Las partmulas pueden estar en una solucion o suspension o pueden estar en un estado liofilizado antes de su uso en la presente invencion. La partmula liofilizada se reconstituye luego en un regulador conveniente antes de poner en contacto la muestra a procesar con respecto a la presente invencion.
El termino "nanoestructura", como se usa en el presente documento, se refiere a estructuras de tamano nanometrico que no estan dentro del alcance del termino "partmula", pero permiten la estimulacion policlonal de las celulas T cuando se acoplan a agentes moduladores tales como anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 o fragmentos de los mismos.
La nanomatriz como se describe en el documento WO2014/048920A1 o como se indica en el kit MACS GMP TransAct CD3/CD28 (Miltenyi Biotec GmbH, orden numero 170-076-140) es una nanoestructura espedfica. El termino "nanomatriz" como se usa en el presente documento se refiere a una nanomatriz que comprende
a) una matriz de cadenas polimericas moviles; y
b) unidos a dicha matriz de cadenas de polfmero moviles uno o mas agentes estimulantes que proporcionan senales de activacion a las celulas T; activando asf e induciendo la proliferacion de las celulas T, en donde la nanomatriz es de 1 a 500 nm, preferentemente de 10 a 200 nm, de tamano. Los agentes estimuladores pueden ser anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 o fragmentos de los mismos.
Estos polfmeros consisten en cadenas moviles (capaces de moverse), preferentemente altamente moviles (capaces de moverse), por lo que la matriz se caracteriza por la ausencia de una superficie solida como punto de union para los agentes estimulantes, tales como los anticuerpos, y que esta en fuerte contraste con las perlas o microesferas que se utilizan actualmente y que tienen regularmente una superficie ngida e inflexible.
La matriz consiste en un material inerte polimerico, preferiblemente biodegradable o biocompatible que no es toxico para las celulas. Preferentemente, la matriz esta compuesta por cadenas de polfmeros hidrofilos, que obtienen una movilidad maxima en solucion acuosa debido a la hidratacion de las cadenas. La matriz movil es el unico o al menos el componente principal de la nanomatriz, independientemente de los agentes que estan unidos a la misma.
La matriz movil puede ser de colageno, protemas purificadas, peptidos purificados, polisacaridos, glicosaminoglicanos o composiciones de matriz extracelular. Un polisacarido puede incluir, por ejemplo, eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar o alginato. Otros polfmeros pueden incluir poliesteres, polieteres, poliacrilatos, poliacrilamidas, poliaminas, polietileniminas, polfmeros policuaternarios, polifosfazenos, polivinilalcoholes, polivinilacetatos, polivinilpirrolidonas, copolfmeros de bloques o poliuretanos. Preferentemente, la matriz movil es un polfmero de dextrano.
Expameros (Stage Cell Therapeutics, Alemania) son otro ejemplo para una nanoestructura. En este documento, un oligomero de protema Strep-Tactin soluble se le anade un grupo funcional con un ligando primario activador tal como los fragmentos Fab anti-CD3 y CD28 para la estimulacion policlonal de celulas T. La cadena principal de Strep-Tactin permite la adicion de grupos funcionales reversible y modular mediante la asociacion de fragmentos Fab de baja afinidad.
El termino "molecula de union a antfgeno", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula que se une preferiblemente o es espedfica para la molecula objetivo deseada de la celula, es decir, el antfgeno. El termino "molecula de union a antfgeno" comprende, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El termino "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos policlonales o monoclonales, que pueden generarse por metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, por ejemplo, murino, rata, oveja, humano. Para fines terapeuticos, si se van a usar fragmentos de union a antfgeno no humanos, estos pueden humanizarse por cualquier metodo conocido en la tecnica. Los anticuerpos tambien pueden ser anticuerpos modificados (por ejemplo, oligomeros, anticuerpos reducidos, oxidados y marcados).
El termino "anticuerpo" comprende tanto moleculas intactas como fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', F(ab")2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Ademas, el termino "molecula de union a antfgeno" incluye cualquier molecula distinta de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen preferentemente a la molecula objetivo deseada de la celula. Las moleculas adecuadas incluyen, sin limitacion, oligonucleotidos conocidos como aptameros que se unen a moleculas objetivo deseadas, carbohidratos, lectinas o cualquier otra protema de union a antfgeno (por ejemplo, interaccion receptor-ligando). El enlace (acoplamiento) entre el anticuerpo y la partmula o nanoestructura puede ser covalente o no covalente. Un enlace covalente puede ser, por ejemplo, el enlace a grupos carboxilo en perlas de poliestireno, o a grupos NH2 o SH2 en perlas modificadas. El enlace no covalente es, por ejemplo, a traves de biotinaavidina o una partmula acoplada a fluoroforo unida a un anticuerpo anti-fluoroforo.
Los terminos "se une espedficamente a" o "espedfico para" con respecto a una molecula de union a antfgeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, se refiere a una molecula de union a antfgeno (en el caso de un anticuerpo o fragmento del mismo a un dominio de union a antfgeno) que reconoce y se une a un antfgeno espedfico en una muestra, por ejemplo, CD4, pero no reconoce o se une sustancialmente a otros antfgenos en dicha muestra. Un dominio de union a antfgeno de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une especfficamente a un antfgeno de una especie puede unirse tambien a ese antigeno de otra especie. Esta reactividad entre especies no es contraria a la definicion de "espedfico para" como se usa en este documento. Un dominio de union a antigeno de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une espedficamente a un antfgeno, por ejemplo, el antigeno CD4 tambien puede unirse sustancialmente a diferentes variantes de dicho antigeno (variantes alelicas, variantes de empalme, isoformas, etc.). Esta reactividad cruzada no es contraria a la definicion de ese dominio de union a antigeno como espedfico para el antigeno, por ejemplo, para CD4.
Una potente tecnologfa de clasificacion es la clasificacion magneticas de celulas. Los metodos para separar las celulas magneticamente estan disponibles comercialmente, por ejemplo, a traves de Invitrogen, Stem cell Technologies, en Cellpro, Seattle o Advanced Magnetics, Boston. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden acoplar directamente a partfculas de poliestireno magneticas tales como Dynal M 450 o partfculas magneticas similares y se pueden usar, por ejemplo, para la separacion celular. La tecnologfa Dynabeads no se basa en columnas, en su lugar, estas perlas magneticas con celulas unidas disfrutan de la cinetica de la fase lfquida en un tubo de muestra, y las celulas se afslan colocando el tubo en un bastidor magnetico. Sin embargo, en una realizacion preferida para enriquecer, clasificar y/o detectar celulas T, se usan subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T de anticuerpos monoclonales de una muestra de celulas junto con micropartfculas superparamagneticas coloidales que tienen un recubrimiento organico, por ejemplo, polisacaridos (tecnologfa de clasificacion celular activada magneticamente (MACS®) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania)). Estas partfculas (nanoperlas o MicroBeads) pueden conjugarse directamente con anticuerpos monoclonales o usarse en combinacion con anti-inmunoglobulina, avidina o MicroBeads espedficos contra el hapteno. La tecnologfa MACS® permite que las celulas se separen incubandolas con nanopartfculas magneticas recubiertas con anticuerpos dirigidos contra un antfgeno de superficie particular. Esto hace que las celulas que expresan este antfgeno se adhieran a las nanopartfculas magneticas.
Despues, la solucion celular se transfiere a una columna situada en un campo magnetico fuerte. En esta etapa, las celulas se unen a las nanopartfculas (que expresan el antfgeno) y permanecen en la columna, mientras que otras celulas (que no expresan el antfgeno) fluyen a traves de ella. Con este metodo, las celulas se pueden separar positiva o negativamente con respecto al antfgeno o antfgenos particulares. En caso de una seleccion positiva, las celulas que expresan el (los) antfgeno o antfgenos de interes, que se unieron a la columna magnetica, se lavan en un recipiente separado, despues de retirar la columna del campo magnetico. En caso de una seleccion negativa, el anticuerpo utilizado se dirige contra el antfgeno o antfgenos de superficie, que se sabe que estan presentes en las celulas que no son de interes. Despues de la aplicacion de la solucion de celulas/nanopartfculas magneticas en la columna, las celulas que expresan estos antfgenos se unen a la columna y se recoge la fraccion que atraviesa, ya que contiene las celulas de interes. Como estas celulas no estan marcadas por un anticuerpo acoplado a las nanopartfculas, estan "intactas". El procedimiento puede realizarse utilizando un etiquetado magnetico directo o un etiquetado magnetico indirecto. Para el etiquetado directo, el anticuerpo espedfico se acopla directamente a la partfcula magnetica. El etiquetado indirecto es una alternativa conveniente cuando el etiquetado magnetico directo no es posible o no se desea. Se puede usar un anticuerpo primario, un anticuerpo monoclonal o policlonal espedfico, una combinacion de anticuerpos primarios, dirigido contra cualquier marcador de superficie celular para esta estrategia de marcacion. El anticuerpo primario puede estar no conjugado, biotinilado o conjugado con fluoroforo. El etiquetado magnetico se logra luego con MicroBeads anti-inmunoglobulina, MicroBeads antibiotina o MicroBeads anti-fluoroforo. Los procesos descritos anteriormente tambien se pueden realizar en un sistema cerrado de procesamiento de muestras de celulas tal como CliniMACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) o CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania).
La expresion "composicion celular sustancialmente pura de celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T" como se usa en el presente documento se refiere a una composicion celular que comprende al menos el 70%, mas preferiblemente al menos el 90%, lo mas preferible al menos el 95% de las celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T en la composicion celular obtenida por el metodo de la presente invencion. La frecuencia de transduccion del producto celular depende del tipo de vector utilizado para llevar a cabo la modificacion del gen, asf como la naturaleza del transgen. Se puede obtener una mayor frecuencia de celulas T modificadas geneticamente mediante la inclusion de una etapa de seleccion adicional dirigido hacia, al menos una parte, del transgen.
"Receptor de antfgeno quimerico" o "CAR" se refiere a los receptores modificados por ingeniena genetica, que injertan una especificidad de antfgeno en las celulas, por ejemplo las celulas T. Los CAR de la invencion comprenden un dominio de union a antfgeno tambien conocido como region de direccionamiento de antfgeno, un dominio espaciador extracelular o region bisagra, un dominio transmembrana y al menos un dominio de senalizacion intracelular o al menos un dominio coestimulador y al menos un dominio de senalizacion intracelular.
El termino "celula modificada geneticamente" significa que contiene y/o expresa un gen foraneo o secuencia de acido nucleico que a su vez modifica el genotipo o fenotipo de la celula o su progenie. Especialmente, el termino se refiere al hecho de que las celulas pueden manipularse mediante metodos recombinantes bien conocidos en la tecnica para expresar peptidos o protemas en forma estable o transitoria, por ejemplo, CAR que no se expresan en estas celulas en estado natural. La modificacion genetica de las celulas puede incluir, pero no se restringe a, transfeccion, electroporacion, nucleofeccion, transduccion utilizando vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores retro o lentivirales no integradores, transposones, nucleasas de diseno que incluyen nucleasas de dedos de cinc, TALEN o CRISPR/Cas.
Las celulas T modificadas geneticamente, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T que se pueden obtener mediante los metodos descritos en el presente documento se pueden usar para etapas posteriores tales como investigacion, diagnostico, aplicaciones farmacologicas o clmicas conocidas por los expertos en la tecnica.
Las celulas T modificadas geneticamente, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T tambien se pueden usar como una composicion farmaceutica en la terapia, por ejemplo, terapia celular, o prevencion de enfermedades. La composicion farmaceutica se puede trasplantar en un animal o humano, preferentemente un paciente humano. La composicion farmaceutica se puede usar para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades en mairnferos, especialmente en seres humanos, incluyendo posiblemente la administracion de una cantidad farmaceuticamente eficaz de la composicion farmaceutica al marnffero. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de administracion estaran determinadas por factores tales como el estado del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis apropiadas pueden determinarse mediante ensayos clmicos.
El termino "cantidad terapeuticamente efectiva" significa una cantidad que proporciona un beneficio terapeutico para el paciente.
La composicion de celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T obtenidas por el metodo de la presente invencion se puede administrar ya sea solas o como una composicion farmaceutica en combinacion con diluyentes y/o con otros componentes tales como citoquinas o poblaciones celulares. En resumen, las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden comprender las celulas T modificadas geneticamente, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T de la presente descripcion como se describe en el presente documento, en combinacion con uno o mas vehfculos, diluyentes o excipientes farmaceutica o fisiologicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender reguladores tales como solucion salina regulada neutra, solucion salina regulada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; protemas; polipeptidos o aminoacidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutation; adyuvantes (por ejemplo, hidroxido de aluminio); y conservantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Fabricacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente utilizando varios conjuntos de tubos esteriles cerrados
Se conecta una bolsa de leucaferesis (100-200 mL) de un donante, mediante soldadura esteril al conjunto de tubos TS 100 (Miltenyi Biotec GmbH) instalado en el dispositivo CliniMACS Prodigy®. El regulador CliniMACS, asf como los reactivos CliniMACS CD4 y CD8 (Miltenyi Biotec GmbH) tambien estan conectados al mismo conjunto de tubos. Se lanza un programa de enriquecimiento. El conjunto de tubos se ceba automaticamente con regulador, luego el producto de leucaferesis se transfiere a la camara del conjunto de tubos donde se lava tres veces con regulador CliniMACS para eliminar el suero y las plaquetas. Tambien se realiza una reduccion de globulos rojos para eliminar el exceso de eritrocitos. Los reactivos CliniMACS CD4 y CD8 se transfieren a las celulas en la camara para la marcacion magnetica de las celulas positivas para CD4 y CD8. Despues de 30 minutos de incubacion a temperatura ambiente, las celulas marcadas magneticamente se transfieren automaticamente a una columna colocada en un campo magnetico. Las celulas marcadas se atrapan y las celulas no marcadas se eluyen en una bolsa de fraccion celular no objetivo. La columna con las celulas marcadas se enjuaga varias veces despues de lo cual las celulas marcadas se eluyen en la bolsa de la fraccion de celulas objetivo. Una bolsa de muestra integrada en el conjunto de tubos permite obtener una muestra de 1-2 mL que se analiza de forma remota para los recuentos de celulas y la pureza de las celulas mediante citometna de flujo (FIG. 12). Parte de las celulas enriquecidas se transfieren (a traves de una conexion de soldadura esteril) a otro conjunto de tubos (TS730) recien instalado en un dispositivo CliniMACS Prodigy®. El conjunto de tubos tambien esta conectado al medio MACS GMP TexMACS complementado con IL-2, el kit Ma Cs GMP TransAct CD3/CD28 (todos Miltenyi Biotec GmbH) y 1e8 celulas T enriquecidas. Se inicia el programa de activacion. Las celulas enriquecidas se lavan y se resuspenden en medio, el cultivo se fija a 37°C y con un suministro de gas CO2 al 5%. Tras equilibrar el cultivo, el reactivo de activacion se agrega automaticamente al cultivo. Veinticuatro horas mas tarde, se analiza una muestra para la sobrerregulacion de los marcadores de activacion CD25 y CD69 (FIG. 2). Una bolsa que contiene el vector viral esta soldada de forma esteril en el conjunto de tubos utilizando, por ejemplo, un soldador Terumo esteril, el usuario reconoce el mensaje en el software que solicita confirmacion de que el vector viral se ha conectado y el vector viral se transfiere a la camara que contiene el celulas T activadas. Despues de 5 dfas de cultivo, las celulas T se transfieren a una bolsa de 5 litros y se transfieren al Wave BioreactorMR (Life Technologies), otro dispositivo que permite la expansion de las celulas T. Las celulas se cultivan durante 7 dfas adicionales en suspension. La bolsa de celdas expandidas se conecta de nuevo a un conjunto de tubos nuevos en el CliniMACS Prodigy®. El CliniMACS Prodigy® permite la concentracion automatizada de las celulas desde 5 L hasta 100 mL y la nueva regulacion de las celulas en una solucion adecuada para infusion en humanos.
Ejemplo 2: Fabricacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente utilizando un unico conjunto de tubos esteriles cerrados
Se conecta una bolsa de capa leucocitaria de 100-200 mL de un donante, mediante soldadura esteril al conjunto de tubenas TS520 (Miltenyi Biotec GmBH) instalado en el dispositivo CliniMACS Prodigy®. El regulador CliniMACS, asf como el reactivo CliniMACS CD62L, el kit m Ac S GMP CD3/CD28 y el medio MACS GMP TexMACS que contiene 10 ng/mL de IL-7 e IL-15, tambien estan conectados al TS520 (todos Miltenyi Biotec GmbH). La matriz de actividad se llena luego con actividades (por ejemplo, transduccion, alimentacion, lavado, formula final) y sus parametros (por ejemplo, d^a, volumen, temperatura) del proceso de fabricacion automatizada. A continuacion se lanza el software programado (FIG. 3). Como en el ejemplo 1, se lava la leucoferesis. El etiquetado se realiza a 4-8°C (esto es importante para enriquecer las celulas positivas para CD62L ya que CD62L se elimina de la superficie de las celulas a temperatura ambiente). Las celulas etiquetadas se enriquecen y se eluyen en una nueva bolsa de aplicacion que forma parte del conjunto de tubos. El programa solicita que se tome una muestra (utilizando bolsas de muestreo incluidas en el conjunto de tubos). Una vez que se determina la densidad celular, esta informacion se indica en el programa, asf como el numero requerido de celulas que se transferiran nuevamente a la camara (por ejemplo, 1e8). El volumen requerido de celulas enriquecidas que contienen 1e8 celulas enriquecidas se transfiere automaticamente a la camara de cultivo. Luego se agrega el reactivo de activacion al cultivo. El dfa 1, la bolsa que contiene el vector Lentiviral en 10 mL se conecta al conjunto de tubos (esto se realiza de forma extemporanea debido a la corta vida media de los vectores virales). El vector viral, en este caso un vector lentiviral que codifica un CAR CD20 (que comprende los dominios de senalizacion 4-1BB y CD3zeta) se transfiere luego a las celulas T activadas. Las celulas T permanecen en cultivo a 37°C y en una atmosfera enriquecida con 5% de CO2 durante 2 dfas adicionales. El dfa 5, el medio de cultivo gastado se lava automaticamente y se reemplaza con medio fresco. El cultivo se fija ahora en agitacion tipo 1 (baja agitacion) para resuspender suavemente las celulas T utilizando una agitacion esporadica lenta de la camara. La mitad del medio de cultivo se cambia cada dos dfas para alimentar a las celulas con medio fresco. El dfa 9, la velocidad de agitacion aumenta a una agitacion de tipo 3 (resuspension mas vigorosa). En los dfas 11 a 13, el proceso de fabricacion llega a su fin, las celulas se lavan varias veces con una solucion adecuada para infusion humana (es decir, regulador de formulacion final) y se recogen en una bolsa para su posterior manejo clmico (FIG. 4 y 6). Ya sea por infusion directa o por crioconservacion. Las celulas T modificadas geneticamente fabricadas se analizaron para determinar su composicion celular (Figura 10), su porcentaje de celulas transducidas y el nivel de expresion de transgenes por celulas transducidas (Figura 7A y B, respectivamente).
Ejemplo 3: Fabricacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente a partir de cultivos de alta densidad activados en condiciones de agitacion
A partir de una leucoferesis de 100-200 mL, las celulas T CD4 y CD8 se enriquecen de manera similar al Ejemplo 2 utilizando el conjunto de tubos TS520 instalado en el CliniMACS Prodigy®. En este ejemplo, sin embargo, una alta densidad de 4e6 celulas T enriquecidas/mL se transfieren a la camara del conjunto de tubos esteriles cerrados. Las celulas T enriquecidas se sembraron en 100 mL (Figura 9A) el dfa 0 y la activacion se llevo a cabo inmediatamente en condiciones de agitacion de tipo 3 utilizando el kit Ma Cs GMP TransAct CD3/CD28 y 200 UI de IL-2 en medio MACS GMP TexMACS. Las celulas en 100 mL se diluyeron el dfa 2 y se realizo un intercambio de medio todos los dfas a partir del dfa 4 hasta el final del cultivo. El cultivo finalizo el dfa 8. Sorprendentemente, los resultados muestran que es posible activar y expandir las celulas T sin una fase de estado estable durante la activacion al comienzo del cultivo. En tales condiciones dinamicas, es posible generar muy rapidamente un gran numero de celulas T (es decir, 2,8e9 celulas T en el dfa 8 de la Figura 8A, frente a 1,8e9 celulas en total el dfa 8 en la Figura 4C).
Ejemplo 4: Fabricacion automatizada de celulas T modificadas geneticamente a partir de leucoferesis congelada
Se descongelo una bolsa de 100 mL de leucoferesis congelada de un donante y se transfirio a una bolsa de 3 L de diferenciacion de celulas MACS GMP (producto Miltenyi Biotec GmbH) y se diluyo con medio MACS GMP TexMACS en 2 litros. Las celulas descongeladas reposaron durante 48 horas a 37°C en CO2 al 5%, luego la bolsa de celulas se conecto a un conjunto de tubos esteriles cerrados instalado en CliniMACS Prodigy® para la concentracion celular automatizada. Luego se llevo a cabo un proceso de fabricacion similar al descrito en el Ejemplo 2 (utilizando celulas T enriquecidas con CD62L). El dfa 12, las celulas T modificadas geneticamente se formularon de forma definitiva en 100 mL de regulador CliniMACS y se transfirieron a la bolsa de recoleccion. La bolsa completa se conecto mediante soldadura esteril al conjunto de tubos esteriles cerrados TS100 instalado en un Prodigy CliniMACS®. Allf, las celulas T modificadas geneticamente se marcaron con microperlas anti-IgG1 para permitir el aislamiento de las celulas T modificadas geneticamente de las celulas T no modificadas. Todos las etapas desde las celulas descongeladas diluidas y en reposo hasta la fabricacion y el aislamiento de celulas T modificadas geneticamente se realizaron de manera automatizada utilizando varios conjuntos de tubos diferentes y varios tipos de programas diferentes.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso automatizado para la generacion de celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T que comprende las etapas:
a) proporcionar una muestra de celulas que comprende celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T
b) preparacion de la muestra celular por centrifugacion
c) separacion magnetica de las celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T
d) activacion de las celulas T enriquecidas, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T utilizando agentes moduladores
e) modificacion genetica de las celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T
f) expansion de las celulas T modificadas geneticamente, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T en una camara de cultivo
g) lavado de las celulas T cultivadas, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T, caracterizado porque todas las etapas se realizan en un sistema de cultivo celular cerrado y esteril.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dichos agentes moduladores se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos agomsticos, citoquinas, moleculas coestimuladoras recombinantes y pequenos inhibidores de farmacos.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dichos agentes moduladores son anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o fragmentos de los mismos acoplados a perlas o nanoestructuras.
4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas nanoestructuras son una nanomatriz, comprendiendo la nanomatriz a) una matriz de cadenas polimericas moviles, y b) unidas a dicha matriz de cadenas polimericas moviles anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o fragmentos de los mismos, en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm.
5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha modificacion genetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se realiza mediante la transduccion de dichas celulas con lentivirus, retrovirus gamma, retrovirus alfa o adenovirus o por electroporacion o por transfeccion de acidos nucleicos, protemas, nucleasas espedficas del sitio, virus de ARN autorreplicantes o vectores lentivirales con deficiencia de integracion.
6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha modificacion genetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se lleva a cabo mediante la transduccion de dichas celulas con vectores lentivirales.
7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha separacion magnetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se realiza usando moleculas de union a antfgeno espedficas para un marcador de superficie celular en la superficie de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T.
8. El proceso de la reivindicacion 7, en el que dichas moleculas de union a antfgeno espedficas para un marcador de superficie celular en la superficie de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T se seleccionan del grupo que consiste en los marcadores CD2, CD3, CD4, CD8 CD25, CD28, CD27, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD95, CD127, CD137, TCR alfa/beta, TCR gamma/delta, CCR7, PD-1 y Lag3.
9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha activacion, modificacion genetica y/o dicha expansion de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T se realizan en condiciones de agitacion.
10. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que dichas condiciones de agitacion se realizan mediante la rotacion de dicha camara de cultivo de dicho sistema de cultivo celular cerrado y esteril, y en el que dicha rotacion se realiza periodicamente con fuerzas centnfugas cada 1 a 120 segundos entre mas de 0 y maximo 70 x g en una o dos direcciones.
11. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, en el que dichas condiciones de agitacion se realizan durante la etapa de expansion f).
12. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha activacion se realiza utilizando densidades de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T de entre 0,5e6 celulas/mL de a 4e6 celulas/mL durante la activacion.
13. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha activacion se realiza utilizando altas densidades de celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T desde entre 4e6 celulas/mL a 1e7 celulas/mL durante la activacion.
14. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha modificacion genetica de las celulas T, los subconjuntos de celulas T y/o los progenitores de celulas T es la introduccion de una secuencia de polinucleotidos que codifica un receptor de antfgeno quimerico (CAR) o un receptor de celulas T (TCR).
15. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que dichas celulas T, subconjuntos de celulas T y/o progenitores de celulas T modificadas geneticamente expresan dicho CAR o TCR, y en el que dichas celulas que expresan dicho CAR o TCR estan separadas de las celulas que no expresan dicho CAR o t Cr en una etapa de separacion magnetica adicional antes de realizar la etapa g).
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