JP2002523041A - 第２の機能的ドメインを有するストレプトアビジン変異体 - Google Patents

第２の機能的ドメインを有するストレプトアビジン変異体

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Abstract

(57)【要約】 第２の機能的ドメインを含むストレプトアビジン分子が開示される。好ましい実施態様では、この第２のドメインは、ビオチン結合を妨害しない部位でストレプトアビジンアミノ酸配列中に組み込まれている細胞接着ペプチドである。好ましい実施態様では、この細胞接着ペプチドはＲＧＤである。このペプチドは、好ましくは、ストレプトアビジン分子の曝露されたループ、例えば、残基６３〜６９によって定義されるループの内部に配置される。変異ストレプトアビジン分子は、他の特徴（例えば、ビオチン結合部位のアミノ酸の改変によるビオチン結合の減少）を有し得る。開示されたストレプトアビジン分子についての好ましい用途は、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用を介して、第２の機能的ドメインを影響される細胞または分子と近接させるアダプターとしての用途、および血管デバイスもしくはプロテーゼのような基材のためのコーティングとしての用途である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （連邦政府支援の研究に関する声明） 連邦政府は、Ｄｒ．Ｐａｔｒｉｃｋ ＳｔａｙｔｏｎのＤＫ４９６５５の国立
衛生研究所（ＮＩＨ）補助金により、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】 （発明の背景） 本発明は、細胞接着ドメインのような第２の機能的ドメインを有するストレプ
トアビジン分子に関する。
【０００３】 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉによって産生されるタンパク質
であるストレプトアビジンは、水溶性ビタミンであるビオチンと非常に強固でか
つ特異的な非共有結合複合体を形成する。ストレプトアビジンは、リガンドとタ
ンパク質との間の非共有結合的相互作用の中で最も高いとされる親和性（解離定
数（Ｋａ）は１０13Ｍ-1〜１０15Ｍ-1の範囲内にあると見積もられる）でビオチ
ンと結合する四量体タンパク質である。この結合親和性は、通常の生理学的溶液
条件下で本質的に不可逆であるのに十分強く、そして広範の種々の臨床的および
工業的用途においてストレプトアビジンおよびビオチンの有用性のための基礎を
提供する。Ｇｒｅｅｎ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２９：８５−１４３（１
９７５）を参照のこと。
【０００４】 ビオチンに対しいて高親和性を共有するストレプトアビジンおよび相同タンパ
ク質のアビジンの両方とも、強いリガンド−タンパク質相互作用の模範として研
究されている。ストレプトアビジンおよびアビジンのＸ線結晶構造（両方ともそ
れらのアポおよびホロ形態である）が記載されている。両方の配列もまた、幾つ
かのストレプトアビジン融合タンパク質の構成を有すると報告されている（Ｓａ
ｎｏおよびＣａｎｔｏｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．１７６：５７１−５７７（１９９１）；米国特許第４，８３９，２９３号
）。
【０００５】 極度に高い結合親和性に加えて、ストレプトアビジンの有用性はまた、タンパ
ク質の独特の構造的特性から生じる。ストレプトアビジンは、４個の同一のサブ
ユニットの四量体であり、各サブユニットはビオチンに対する結合部位を寄与す
る。この四量体はほぼ二重の対称性を有しているため、この結合部位は２つ１組
になってその分子の対向面上に位置され、このタンパク質を効率的な分子アダプ
ターにする。ビオチンに対して高親和性を有するストレプトアビジンのこの構造
的特徴は、このタンパク質を多くの技術において重要な成分としている。
【０００６】 ストレプトアビジンは、大きな有意性のある４つの技術分野における重要な成
分である：１）生体分離／細胞ソーティング；２）画像化；３）ドラックデリバ
リー；および４）診断（ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．１８４：５−４５（１９９０））。分離分野において、このタンパク
質は、重要な細胞ソーティング用途において広範囲に使用されており、例えば、
これは骨髄移植前の造血幹細胞から汚染細胞を除去するために使用される。Ｂｅ
ｒｅｎｓｏｎら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｏｌ．Ｒｅｓ．３７７：４４９−４５
９（１９９２）。ストレプトアビジンは、癌診断において同様な広範な用途が見
出され、それは、種々の腫瘍特異性バイオマーカーの存在について試験するため
の研究および臨床的設定の両方において使用される。
【０００７】 ストレプトアビジンおよびビオチンの画像化およびドラッグデリバリー用途は
、画像化剤の同時標的化および送達または腫瘍細胞に対する治療のための能力か
ら生じる。画像化剤の標的化送達およびインビボ治療のためのストレプトアビジ
ンの使用において、特に重要な関心が現れている。ストレプトアビジンは、イン
ビトロおよびインビボの両方で、標的化細胞に薬物、毒素および画像化剤を送達
するために使用されている。例えば、Ｍｅｙｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．
１９：７１０−７１３（１９９１）を参照のこと。これらのシステムにおいて、
ストレプトアビジンは、標的化成分として作用する抗体と、ビオチン化治療学的
薬剤または画像化剤との間の分子アダプターの重大な役割を担う。幾つかのスト
ラテジーで、細胞は、抗体−ストレプトアビジン結合体であらかじめ標的化され
、これは、後のビオチン化薬剤の送達を伴う。他の用途において、ビオチン化抗
体は、細胞をあらかじめ標的化するために使用され、最初にこれは、後のストレ
プトアビジン−ビオチン化薬剤結合体の送達を伴う。ビオチン化抗体、続いてス
トレプトアビジン、および次いでビオチン化薬剤を使用して、３工程の送達もま
た可能である。
【０００８】 第２の機能的ドメインを含み、その結果、ビオチン結合が保持されるがストレ
プトアビジン分子がまた別の機能を有する、ストレプトアビジン分子を有するこ
とは有利である。例えば、分子が選択的に細胞に送達され得るように、細胞に結
合するストレプトアビジン分子を有することは有利である。選択的精製が実施さ
れ得るように特定の細胞型または特定のタンパク質に選択的に結合するストレプ
トアビジンを有することは有利である。
【０００９】 （発明の簡単な要旨） 第２の機能的ドメインを含むストレプトアビジン分子が開示される。好ましい
実施態様において、第２のドメインは、ビオチン結合を妨害しない部位でストレ
プトアビジンアミノ酸配列内に組み込まれた細胞接着ペプチドである。好ましい
実施態様において、細胞接着ペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン
酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）（ＲＧＤ）である。このペプチドは、好ましくは
残基６３〜６９によって規定されるループ内のようなストレプトアビジン分子の
露出したループ上に配置される。この変異体ストレプトアビジン分子が、ビオチ
ン結合部位におけるアミノ酸の改変により低下したビオチン結合のような他の特
徴を有し得る。開示されるストレプトアビジン分子の好ましい使用は、ストレプ
トアビジン／ビオチン相互作用を介して、第２の機能的ドメインを、影響される
べき細胞または分子近傍に、そして血管デバイスまたはプロテーゼのような基材
のためのコーティングとして接近させるためのアダプターとしての使用である。
【００１０】 （発明の詳細な説明） 開示される化合物は、第２の機能的ドメインを含むストレプトアビジンの改変
された形態である。ホモ四量体として作用するストレプトアビジンタンパク質は
、強力なビオチン結合タンパク質である。ビオチンを強固に結合するこの能力の
ために、ストレプトアビジンは、リンクとして作用するビオチン／ストレプトア
ビジン相互作用を用いて、広範な種々の診断、分離、および薬物標的化用途にお
けるアダプターとして使用される。これらの用途の多くはまた、エフェクター分
子を必要とする。アダプターとして、ストレプトアビジンは、しばしばモノクロ
ーナル抗体のような第２のタンパク質（エフェクター）を固定化するように機能
する。次いで、この第２のタンパク質は、抗体によって認識される細胞のような
標的を捕捉するように機能する。開示されるストレプトアビジン分子は、ストレ
プトアビジン分子自体に第２の機能を組み込むことによって、このような第２の
タンパク質をストレプトアビジンと関連付ける必要性を排除する。従って、開示
されるストレプトアビジン分子は、第２のタンパク質の活性を置換するエフェク
ター機能を有するように設計されている。
【００１１】 従って、ストレプトアビジンそれ自体がアダプタおよびエフェクターの両方と
して幾つかの用途に使用され得る。ストレプトアビジンがこれらの用途の多くを
単純化しそして改良するための機会を提供することは有利である。ストレプトア
ビジンは、ストレプトアビジン内に、好ましくは規定された表面位置に三次元の
スカフォールドを設けたストレプトアビジンに機能性ペプチド配列を設計するこ
とによって第２の機能的ドメインを含むように設計されている。
【００１２】 （Ａ．化合物および組成物） （１．ストレプトアビジン） 野生型ストレプトアビジンは周知であり、例えばＡｒｇａｒａｎａら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（４）：１８７１−１８８１（
１９８６）に記載されている。野生型ストレプトアビジンモノマーのアミノ酸配
列は、配列番号１に示される。成熟ストレプトアビジンタンパク質は、配列番号
１のアミノ酸２５で始まる。野生型ストレプトアビジンはまた、天然に存在する
ストレプトアビジンといわれ得る。例えば、ビオチンに対して低下した結合親和
性を有するストレプトアビジンの改変された形態はまた、開示された分子内で使
用され得る。このような改変されたストレプトアビジンの例は、ＷＯ９６／２４
６０６に記載される。低下した結合親和性を有するストレプトアビジン分子は、
有用である。なぜなら、例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンが、野生型
ストレプトアビジンの場合に必要とされるものより穏やかな条件を使用して分離
され得るためである。ストレプトアビジンの任意の形態は、本明細書中で記載さ
れるように第２の機能的ドメインを含むようにさらに改変され得、そして開示さ
れた改変されたストレプトアビジン分子の本明細書中で記載される任意の目的の
ために、またはストレプトアビジンの基本形態が使用される任意の目的のために
、使用され得る。ストレプトアビジンの結晶構造は、Ｗｅｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２４３：８５−８８（１９８９）に記載される。
【００１３】 本明細書中で使用されるように、他に示さない限り、ストレプトアビジン分子
はストレプトアビジンサブユニット（モノマー）および四量体ストレプトアビジ
ンタンパク質のような多量体ストレプトアビジンタンパク質の両方をいう。従っ
て、例えば、ビオチン結合ドメインおよび第２の機能的ドメインを含むストレプ
トアビジン分子についての言及は、ビオチン結合ドメインおよび第２の機能的ド
メインを有するストレプトアビジンモノマー、各サブユニットがビオチン結合ド
メインおよび第２の機能的ドメインを有するストレプトアビジン四量体、ならび
に１個、２個、または３個のサブユニットが第２の機能的ドメインを有する混合
ストレプトアビジン四量体（そして全てのサブユニットはビオチン結合ドメイン
を有する）を包含する。本明細書中で使用されるように、本明細書中で開示され
る第２の機能的ドメインを含む改変されたストレプトアビジン分子は、例えば、
変異体ストレプトアビジン、改変ストレプトアビジン、ストレプトアビジン誘導
体、およびストレプトアビジン変異体といわれ得る。文脈によって他のことが示
されない限り、本明細書中の用語「変異体」、「誘導体」、および「改変」は、
基本（開始）ストレプトアビジン分子内に第２の機能的ドメインを組み込むスト
レプトアビジンへの改変をいう。開始ストレプトアビジンは、それ自体、ストレ
プトアビジンの改変された形態、誘導体形態、または変異体形態であり得る。本
明細書中で使用されるように、野生型ストレプトアビジンは、天然に存在するス
トレプトアビジンの任意の形態をいう。
【００１４】 （２．第２の機能的ドメイン） 開示されるストレプトアビジン分子は、１つまたはそれ以上の第２の機能的ド
メインを含むように改変されているストレプトアビジン分子である。この第２の
機能的ドメインは、有用な機能を有する任意の分子であり得る。第２の機能的ド
メインがアミノ酸の配列であることが好ましい。しかし、ストレプトアビジンに
結合され得る任意の形態の分子は、第２の機能的ドメインとして使用され得る。
有用な第２の機能的ドメインとして、細胞接着配列、ホルモン、細胞表面レセプ
ターに対するリガンド、細胞情報伝達分子、サイトカイン、特異的結合分子、結
合インヒビター、酵素、特異的結合分子、および抗原が挙げられる。
【００１５】 好ましい第２の機能的ドメインは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接
着配列である。ＲＧＤは、フィブロネクチンおよび多くの他の細胞外マトリクス
およびｍａｔｒｉｃｅｌｌｕｌａｒタンパク質内に見出されるインテグリン媒介
細胞接着にとって重要である十分に特徴付けられたペプチド配列である。可溶性
ＲＧＤペプチドは、フィブロネクチンでコートした表面に対する細胞接着を阻害
し得、表面上に固定化される際にＲＧＤペプチドは細胞接着を媒介する。Ｐｉｅ
ｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、Ｍ．Ｄ．およびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ，（１９８４）
Ｎａｔｕｒｅ３０９：３０−３３；Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．およびＫｅｎｎｅｄ
ｙ，Ｄ．Ｗ．（１９８４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９９：２９−３６。天然の
ＲＧＤドメインを有さないタンパク質は、以前に、細胞接着特性を付与するＲＧ
Ｄ部位を組み込むように遺伝学的に設計されている。Ｍａｅｄａ，Ｔ．ら（１９
８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５１６５−１５１６８；Ｈａｓｈｉ
ｎｏ，Ｋ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：５４７−５５１；Ｂａ
ｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ９０：１０００３−１０００７；Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．ら（１９９５）
Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：３４１−３４６；Ｙａｍａｄａ，Ｔ．ら（
１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５６８７−５６９０；およびＳｍ
ｉｔｈ，Ｊ．Ｓ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３０４８６
−３０４９０． ２つのストレプトアビジン変異体が調製され、そしてＲＧＤ配列およびそれぞ
れＦＮ−ＳＡおよびＯＳＴＰ−ＳＡとして本明細書中で言及される、フィブリノ
ネクチンおよびオステオポンチンからの隣接残基を組み込むと特徴付けられた。
これらのＲＧＤストレプトアビジン変異体は、野生型ビオチン親和性を保持し、
さらにまたＲＧＤ依存様式で細胞接着を媒介する二官能性タンパク質である。こ
のＲＧＤ細胞接着配列は、組成物および方法を例示するために使用されるが、第
２の機能を提供する任意の数のペプチド配列が使用され得た。
【００１６】 第２の機能的ドメインは、特異的結合分子であり得る。従って、このような機
能的ドメインは、第２の特異性を有する開示されたストレプトアビジンを提供し
得る。特異的結合分子は、特定の分子または部位と特異的に相互作用する分子で
ある。抗体、レセプター／リガンド対のいすれかのメンバー、および特異的結合
親和性を有する他の分子は、開示されたストレプトアビジン分子の第２の機能的
ドメインとして有用な特異的結合分子の例である。
【００１７】 特定の分子または部分と特異的に相互作用する特異的結合分子は、分子または
部分に対して特異的であるといわれる。例えば、特異的結合分子が特定の抗原と
結合する抗体である場合、この特異的結合分子は、抗原に対して特異的であると
いわれる。特異的結合分子は、好ましくは、抗体、リガンド、結合タンパク質、
レセプタータンパク質、ハプテン、またはオリゴヌクレオチドである。
【００１８】 （３．分子の設計） 第２の機能的ドメインは、任意の適切な様式でストレプトアビジン分子に組み
込まれ得る。第２の機能的ドメインがストレプトアビジンのアミノ酸鎖内に組み
込まれることが好ましい。ペプチドまたはタンパク質である機能的ドメインの場
合、これは、例えば、好ましくはストレプトアビジンの露出したループにおいて
、第２の機能的ドメインのアミノ酸配列をストレプトアビジンのアミノ酸配列内
に挿入することによって行われ得る。第２の機能的ドメインの組み込みのための
ストレプトアビジンの好ましい露出したループは、対向するβ鎖間のストレプト
アビジン分子の残基６３〜６９のループである。このループは、各モノマーサブ
ユニットのビオチン結合部位の対向面上にある。
【００１９】 ペプチドまたはタンパク質でない機能的ドメインについて、この機能的ドメイ
ンは、ストレプトアビジンと結合され得る（ペプチドおよびタンパク質の機能的
ドメインはまた、ストレプトアビジンと結合され得る）。結合が使用される場合
、第２の機能的ドメインは、直接に結合され得、またはリンカーまたはスペーサ
ー分子を介して結合され得る。
【００２０】 ＲＧＤ配列は、フィブロネクチンのＩＩＩ型βターンのようなβターンループ
の頂端に通常見られる。Ｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６
７１−６７８。この逆平衡β鎖は、ＲＧＤループのための制約された枠組みを提
供する。ループ構造に比較し得る周期的なペプチドは、同じアミノ酸配列の直鎖
ペプチドについて向上した活性を証明する。Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．
Ｄ．ら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７２９４−１７２９８
。
【００２１】 従って、対向するβ鎖間のストレプトアビジン分子の露出したループは、ＲＧ
Ｄ変異の部位のために選択された（図１を参照のこと）。選択されたループ、残
基６３〜６９は、各モノマーサブユニットのビオチン結合部位の対向面上にあり
、従ってアミノ酸の変異または挿入によりビオチン結合の潜在的妨害を最小化す
る。このループはまた、ストレプトアビジンがビオチン化表面に結合する場合、
溶液に最大に露出される対称性に関連する表面上にある。ＲＧＤ配列をストレプ
トアビジンに導入するための最初の設計は、天然に存在するＡｓｐ６７残基の前
の、それぞれ残基Ａｌａ６５およびＴｈｒ６６の代わりにＡｒｇおよびＧｌｙに
置換した。もとの構築物に基づいて後に調製した２つの変異体は、フィブロネク
チンおよびオステオポンチンに見い出されるそれらを模倣するさらなる隣接残基
を含んだ。Ｇｌｙは残基６４と６５（残基番号は成熟した野生型ストレプトアビ
ジンに対応する）との間に挿入され、そしてＳｅｒおよびＶａｌまたはＰｒｏの
いずれか（それぞれ、フィブロネクチン、ＦＮ−ＳＡおよびオステオポンチン、
ＯＳＴＰ−ＳＡにに対応する）は、アミノ酸６７と６８（残基番号は成熟した野
生型ストレプトアビジンに対応する）との間に配置される。表１に示した配列お
よび配列番号１および配列番号３が得られた。表１に示されるアミノ酸配列は、
配列番号１のアミノ酸８８〜９３（野生型ストレプトアビジン）、配列番号２の
アミノ酸８８〜９５（フィブロネクチンストレプトアビジン）、および配列番号
３のアミノ酸８８〜９５（オステオポンチンストレプトアビジン）である。これ
らは、それぞれ、成熟した野生型ストレプトアビジンのアミノ酸６４〜６９、成
熟したフィブロネクチンストレプトアビジンのアミノ酸６４から７１、および成
熟したオステオポンチンストレプトアビジンのアミノ酸６４〜７１である。配列
番号１は、Ａｒｇａｒａｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １４（４）：１８７１−１８８１（１９８６）によって報告されるような野
生型ストレプトアビジンの配列である。
【００２２】
【表１】 さらなる隣接する残基は、ループの露出を増加し得、そして／または接着配列
をより好ましい配向に立体的に最適化し得る。ＲＧＤ配列を取り囲む隣接する残
基はまた、個々のインテグリンについての特異性と同様に、ペプチドの接着活性
を決定する際に役割を果たす。この概念は、一連の合成ペプチドを用いる証拠、
および特定の隣接残基の存在が最適な結合活性のために必要であることを示す阻
害研究によって支持されている。細胞スプレッド阻害の研究を通して、ＲＧＤ配
列の隣接アミノ酸配列における単一の変化が、細胞接着に対する有意な効果を有
し得ることもまた、実証された。Ｙａｍａｄａら（１９８４）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９９：２９−３６。
【００２３】 既知のインテグリンのほぼ半数がＲＧＤリガンド結合依存性を示し、そして特
定のインテグリンは、種々の細胞外タンパク質およびマトリックス細胞（ｍａｔ
ｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）タンパク質の間で異なる特定の隣接配列を必要とする。
Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｓｃｉ．１６：２４６−２５０。異なる隣接残基は、ＲＧＤドメインのコンホ
メーションを変化させ、従って、インテグリン特異性についての構造的基礎を提
供すると考えられている。以前の報告は、野生型ストレプトアビジンに固有のＲ
ＹＤ部位が細胞結合を支持し得ること、およびネイティブなタンパク質がインテ
グリンの関与について可溶性ＲＧＤペプチドと競合することを示唆した。Ａｌｏ
ｎ，Ｒ．ら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．１７０：１２３６−１２４１；Ａｌｏｎ，Ｒ．ら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．５８：２７１−２７９；Ａｌｏｎ，Ｒ．ら（１９９３）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：８９３−８９８。このような活性は、本明細書
中で報告された研究において使用された内皮細胞およびメラノーマ細胞を用いた
研究、または種々の細胞型を用いた他の研究においては観察されなかった。ＲＹ
Ｄ配列は、ストレプトアビジンの結晶構造において溶媒のアクセスし易さが限ら
れており、そしてストレプトアビジンとの特定のインテグリンの相互作用の強力
なメディエーターでないようである。
【００２４】 特定の隣接配列に加えて、ＲＧＤ配列は、周期的構造（例えば、天然に存在す
るタンパク質の可撓性ループ）に作られた場合に最も良好に機能する。このこと
は、とりわけ、逆平行鎖間に配置されたループについて真実である。この判断基
準に基づいて、ストレプトアビジン分子のコンピューターモデリングに基づく良
好な露出を有するようであるこのようなループは、例示されたストレプトアビジ
ン変異体について選択された。結果として、ＲＧＤストレプトアビジン変異体は
、野生型と区別できないビオチン親和性を保持した。
【００２５】 複数の異なる機能的ドメインがまた、ストレプトアビジン分子に組み込まれ得
る。例えば、種々のレセプター特異性を有する多数の異なるペプチド配列が、露
出したループまたは他の表面配置に組み込まれ得、これは、細胞分離および診断
的適用についてのさらなる機会を提供し得る。レセプター特異的ペプチド配列の
組込みは、ビオチン化された治療剤を利用する標的化薬物送達適用の前に、標的
化および捕捉剤の両方としての、開示されたストレプトアビジン分子の使用を可
能にする。
【００２６】 （４．ストレプトアビジン分子を用いる使用のための化合物） 開示されたストレプトアビジン分子を使用して、目的のいかなる化合物も標的
され得るか、送達され得るか、または固定化され得る。例えば、目的の化合物は
、核酸、タンパク質、ペプチド、有機化合物、無機化合物、ポリサッカリド、ま
たはこれらの任意の組合せであり得る。目的の化合物は、好ましくは、治療的ま
たは生物活性効果を有する。このような化合物の例には、抗生物質、抗ウイルス
剤、ワクチン、血管拡張剤、抗腫瘍薬剤、血管収縮薬、免疫調節化合物（ステロ
イド、抗ヒスタミン剤を含む）、およびサイトカイン（例えば、インターロイキ
ン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子およびインターフェロン（α、β、γ））
、オリゴヌクレオチドおよび核酸（遺伝子を含む）、核酸ワクチン、およびアン
チセンス、ヌクレアーゼ、気管支拡張薬、ホルモン（生殖ホルモン、カルシトニ
ン、インスリン、エリスロポエチン、成長ホルモン、および生物活性有機化合物
）が挙げられる。多くの他の治療的化合物および生理活性化合物が公知であり、
そして開示されたストレプトアビジン分子とともに使用され得る。
【００２７】 好ましくは、目的の化合物はビオチン化され、従ってストレプトアビジン分子
のビオチン結合ドメインと相互作用（結合）する。種々の分子をビオチン化する
ための多数の技術が公知であり、そしてビオチン化化合物を産生するために使用
され得る。あるいは、目的の化合物は、ストレプトアビジンの第２の機能的ドメ
インと相互作用（結合）し得る別の化合物または部分に結合され得る。このスト
レプトアビジン分子はまた、目的の化合物それ自体が第２の機能的ドメインと相
互作用し得るように設計され得る。
【００２８】 開示されたストレプトアビジン分子はまた、基材上に固定され得るかまたは基
材上に他の化合物を固定するために使用され得る。多数の支持基材が公知であり
、そして開示されたストレプトアビジン分子とともに使用され得る。これらには
、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポ
リエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチ
レン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカルボネート、テ
フロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリアンヒドライド、
ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、
コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質が挙げら
れる。開示されたストレプトアビジン分子を用いる使用のための基材は、薄いフ
ィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、編んだ繊維、成形加工し
たポリマー、粒子、および微粒子を含む任意の有用な形態を有し得る。固体状態
の基材についての好ましい形態は、マイクロタイターディッシュである。マイク
ロタイターディッシュの最も好ましい形態は、標準の９６ウェル型である。
【００２９】 （Ｂ．改変されたストレプトアビジン分子を作製するための方法） 第２の機能的ドメインを有する開示されたストレプトアビジンは、当業者に公
知である方法を使用して作製され得る。これらには、化学合成、存在するタンパ
ク質の改変、および組換えＤＮＡ方法論を使用してタンパク質の発現が含まれる
。
【００３０】 タンパク質は、標準的な化学的ペプチド合成技術を使用して合成され得る。ペ
プチドの固相合成（ここでは、配列のＣ末端アミノ酸が不溶性の支持体に結合さ
れ、その配列の残りのアミノ酸の配列の付加を続けて行う）が、本明細書中で記
載される循環的に順序を変えたリガンドおよび融合タンパク質の化学合成のため
に好ましい方法である。固相合成のための技術は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
；３−２８４頁、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２巻、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９６３）；ならび
にＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ，第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ
．（１９８４）によって記載される。
【００３１】 好ましい実施態様において、開示されたストレプトアビジンタンパク質は、組
換え方法論を使用して合成され得る。一般的に、これは、タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド配列を作製する工程、発現カセット中のポリヌクレオチドを
適切な発現プロモーターの制御下に配置する工程、宿主中でそのタンパク質を発
現させる工程、発現したそのタンパク質を単離する工程、および、必要とされる
場合、そのタンパク質を再生する工程を包含する。
【００３２】 タンパク質をコードするＤＮＡは、任意の適切な方法によって調製され得る。
規定された配列の核酸分子を産生するための多くの技術が公知であり、これらに
は、制限および連結、開始核酸の部位特異的変異誘発、ＰＣＲクローニング技術
、ならびに直接化学合成を含む。このような技術はまた、組み合わせられ得る。
開始ストレプトアビジン（例えば、野生型ストレプトアビジン）をコードする核
酸が、第２の機能的ドメインを含むストレプトアビジン分子をコードする核酸を
産生するために改変されることが好ましい。
【００３３】 部分長配列はクローニングされ得、そして適切な部分長配列は、適切な制限酵
素を使用して切断され得る。次いで、そのフラグメントが所望のＤＮＡ配列を産
生するために連結され得る。好ましい実施態様において、ポリペプチドをコード
するＤＮＡは、ＤＮＡ増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使
用して産生される。
【００３４】 開示されたストレプトアビジン分子をコードする核酸はまた、化学合成によっ
て、全体としてまたは部分的に作られ得る。化学合成は、一本鎖のオリゴヌクレ
オチドを産生する。これは、相補的配列を用いるハイブリダイゼーションによっ
て、または一本鎖を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼを用いるポリメラリ
ゼーションによって、二本鎖ＤＮＡに転換され得る。当業者は、現在のＤＮＡの
化学合成のための方法が約１００塩基の配列を調製することに限定されているが
、より長い配列が、より短い配列の連結によって得られ得ることを認識する。化
学合成の有用な方法には、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：
９０−９９（１９７９）のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１（１９７９）のホスホジエステル法；Ｂｅ
ａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２（１９８
１）のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号
の固体支持体法が挙げられる。
【００３５】 コードされたストレプトアビジン分子は、任意の適切な宿主細胞中で発現され
得る。この宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、および種々の高
等真核細胞（例えば、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株、およびＨｅＬａ細胞株）、
昆虫細胞、およびミエローマ細胞株が含まれる。好ましい実施態様において、タ
ンパク質は、プラスミドベクターまたはウイルスベクターによってコードされる
。組換えタンパク質遺伝子（すなわち、ストレプトアビジン分子をコードする核
酸）は、各々の宿主についての適切な発現制御配列に作動可能に連結される。Ｅ
．ｃｏｌｉにおける発現のために、プラスミドはプロモーター（例えば、Ｔ７プ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはλプロモーター）、リボソーム結合部
位、および好ましくはエンハンサー（例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０
、またはサイトメガロウイルス由来）、およびポリアデニル化配列を含むべきで
あり、そしてスプライシングドナー配列およびスプライシングアクセプター配列
を含み得る。
【００３６】 融合タンパク質をコードするプラスミドは、周知の方法（例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのための塩化カルシウム形質転換、および哺乳動物細胞のためのリン酸カルシ
ウム処理またはエレクトロポレーション）によって選択された宿主細胞に移入さ
れ得る。プラスミドによって形質転換された細胞は、プラスミドに含まれる遺伝
子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、およびｈｙｇ遺伝子）によって付与され
る抗生物質に対する耐性によって選択され得る。ウイルス細胞は、ベクター（例
えば、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）を用いて感染さ
れ得る。
【００３７】 一旦発現されると、組換えタンパク質は、当該分野の標準的な手順に従って精
製され得る。これらの手順は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、
カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む。薬学的使用には、少なく
とも約９０〜９５％の均一性である実質的に純粋な組成物が好ましく、９８〜９
９％以上の均一性が最も好ましい。特に、開示されたストレプトアビジン分子の
精製は、ビオチンもしくはリガンド、結合パートナー、または第２の機能的ドメ
インに特異的な結合分子のいずれかを含む親和性技術により補助され得る。一旦
（部分的または所望の均一性まで）精製されると、次にそのストレプトアビジン
分子は、所望されるように使用され得る。
【００３８】 当業者は、化学合成、生物学的発現、または精製の後に、ストレプトアビジン
分子がネイティブなタンパク質とは実質的に異なるコンホメーションを有し得る
ことを認識する。この場合、ストレプトアビジンを変性および還元させること、
次いで、ストレプトアビジンを好ましいコンホメーションに再フォールディング
させることが必要であり得る。タンパク質（ストレプトアビジンを含む）を還元
および変性させる方法ならびに再フォールディング誘導する方法は、当業者に周
知である。例えば、発現され、精製されたストレプトアビジンは、尿素またはグ
アニジウムクロライド中で変性され得、そしてゆっくりとした透析によって再生
され得る。
【００３９】 精製後、ストレプトアビジン分子は、適切に生物学的活性についてアッセイさ
れ得る。例えば、ストレプトアビジン分子は、ビオチン結合および／または第２
の機能的ドメインによって付与される第２の機能の存在についてアッセイされ得
る。この目的のために有用であるアッセイは、当業者に公知であり、そして一般
的に２つのカテゴリーに入る：特定の標的に対するストレプトアビジン分子の結
合アフィニティーを測定するもの、およびストレプトアビジン分子の生物学的活
性を測定するものである。
【００４０】 （Ｃ．改変されたストレプトアビジン分子を使用するための方法） 第２の活性を有する開示されたストレプトアビジン誘導体は、ストレプトアビ
ジンが使用され得る任意の目的のために使用され得る。これは、ビオチン／スト
レプトアビジン結合を含む任意の従来の手順を包含する。開示されたストレプト
アビジン誘導体は、ストレプトアビジンを有する第２の分子を会合させることが
所望される技術において特に有用である。多くのこのような使用は公知であり、
そして、開示されたストレプトアビジン誘導体を、別々のストレプトアビジン分
子および通常使用される第２の分子の代わりに置換することによって、すべてが
より効率的に作製され得る。
【００４１】 第２の機能的ドメインを有する開示されたストレプトアビジン分子は、ストレ
プトアビジン分子が結合し得るか、または会合され得る目的の任意の化合物、組
成物、構造、または対象を標的化、送達、固定化、または結合するための架橋ま
たはアダプターとして使用され得る。以下の実施例は、これらの使用を例証する
。細胞を標的化することについて、ビオチン結合ドメインおよび細胞接着配列（
第２の機能的ドメイン）を含むストレプトアビジン分子は、細胞と会合され得（
細胞接着配列を介して）、そしてビオチン化薬物（目的の化合物）は、薬物のビ
オチン部分とストレプトアビジン分子のビオチン結合ドメインとの結合を通して
、細胞に標的化されるかまたは細胞に送達され得る。固定化については、ビオチ
ン結合ドメインおよび特異的な結合分子（第２の機能的ドメイン）（例えば、細
胞表面レセプターについてのリガンド）を含むストレプトアビジン分子は、ビオ
チン結合ドメインを介して基材上に固定化され得る。次いで、特異的な結合分子
（例えば、細胞）に結合し得る化合物または組成物（目的の化合物）は、特異的
な結合分子へのその化合物の結合を通して基材上に固定化され得る。
【００４２】 診断的使用（すなわち、分析物の検出）のために、ビオチン結合ドメインおよ
び特異的結合分子（第２の機能的ドメイン）（例えば、分析物について特異的な
抗体）を含むストレプトアビジン分子は、ビオチン化された基材に（ビオチン結
合ドメインを介して）固定化され得る。そして、分析物（目的の化合物）は、ス
トレプトアビジン分子での特定の結合分子への分析物の結合を通して基材に固定
化され得る。アフィニティー分離について、ビオチン結合ドメインおよび特異的
結合分子（第２の機能的ドメイン）（例えば、目的の化合物について特異的な抗
体）を含むストレプトアビジン分子は、ビオチン結合ドメインを介して基材に固
定化され得る。次いで、目的の化合物は、特異的な結合分子への化合物の結合を
通して、基材上に捕捉され得る。基材の洗浄後、その化合物が溶出され得る。減
少した結合親和性を有するストレプトアビジン分子は、アフィニティー分離のた
めに有用である。なぜなら、ビオチンおよびストレプトアビジンは、野生型スト
レプトアビジンで必要とされるよりも穏やかな条件を使用して分離され得るから
である（このような改変されたストレプトアビジンの例は、ＷＯ ９６／２４６
０６に記載される）。このことは、基材に、基材およびストレプトアビジンに対
して最低限の損失を伴って、ストレプトアビジンを取り除くことを可能にする。
この様式において、基材およびストレプトアビジンの両方が再利用され得る。例
えば、基材には、異なる第２の機能的ドメインを有するストレプトアビジンの異
なる型がロードされ得る。
【００４３】 ビオチン化された化合物、構造、または対象と、第２の機能的ドメインと相互
作用し得る第２の化合物との間の架橋として機能する二機能性ストレプトアビジ
ンを用いる多くの他の組合せが可能である。上記または本明細書中の別の箇所の
例が例証するように、この架橋の多能性は、第２の化合物をなお別の化合物、構
造、または対象と結合させることによって増大させ得る。
【００４４】 開示されたストレプトアビジン誘導体のための好ましい用途は、基材（例えば
、組織培養ディッシュ、血管デバイス、およびプロテーゼ）のためのコーティン
グとしてである。次いで、第２の機能的なドメインは、例えば、細胞を免疫する
ため、細胞機能に影響を与えるため、そして／または細胞のためのスカフォール
ドとして機能するために使用され得る。開示されたストレプトアビジン誘導体が
、基材のためのコーティングとして使用されるか、または基材上に固定されるな
らば、第２の機能的ドメインが細胞を補充し得るか、細胞機能または活性を変化
または調節し得るか、あるいはコートされた基材に特異的な分子を固定化し得る
。
【００４５】 インテグリン媒介細胞接着は、細胞の挙動を制御する重要なシグナリング経路
に密接に関連し、そして開示されたストレプトアビジン誘導体はまた、特異的レ
セプター媒介関与および生物学を媒介するＲＧＤ配列または関連する配列の取り
込みを通して、細胞表現型を安定化するために使用され得る。
【００４６】 本発明はさらに、以下の非限定的な実施例によってさらに記載される。
【００４７】 （実施例） （実施例１：ＤＮＡの調製） 変異体型のストレプトアビジンを、以下のように生成した。オリゴヌクレオチ
ド（６０塩基長）を、最初にＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入し、そして凍結乾燥形態で輸送した。ＦＮ−ＳＡカ
セットを、以下の相補鎖をアニーリングすることによって得た：
【００４８】
【化１】 ＯＳＴＰ−ＳＡカセットを、以下の鎖を用いて構築した：
【００４９】
【化２】 以前に記載された、ｐＵＣ１８中のストレプトアビジン構築物（Ｃｈｉｌｋｏｔ
ｉ Ａ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２
：１７５４−１７５８）を、制限酵素ＸｂａＩおよびＢｓｐＥＩ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、アニーリングしたカセットについての
相補末端を作製した。これを、引き続きプラスミドＤＮＡに連結した。連結産物
を、Ｎｏｖａ−Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に移入した。６０
ｍｅｒフラグメントは、単一のヌクレオチド変異を含んだ。これは、適切に連結
された候補物をスクリーニングするために、ストレプトアビジン遺伝子由来のＸ
ｂａＩ部位を除去した。首尾よい連結を、蛍光色素ターミネーターサイクルＰＣ
Ｒ配列決定によって確認した。配列決定の確認に際して、変異したストレプトア
ビジン遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）消化を用いてｐＵＣ１８から抽出した。そのプラスミドは２つの
ＮｄｅＩ部位を含んでいたので、目的のフラグメントの長さを決定するための計
算を実行した。制限消化後、第２のアガロースゲルを、線状化したＤＮＡを分離
するために泳動し、そして注意深く正確なフラグメントを切り出した。次いで、
ストレプトアビジン遺伝子を含むＤＮＡを精製し、そして、引き続くサブクロー
ニングのために、あらかじめＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたｐ
ＥＴ２１ａプラスミドに連結した。そのプラスミドを、最終的に、大規模ストレ
プトアビジン発現のための調製物において、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ）コンピテント細胞に形質転換した。
【００５０】 （実施例２：ストレプトアビジンの調製） ストレプトアビジン遺伝子を有するｐＥＴ２１ａプラスミドを含むＢＬ２１（
ＤＥ３）細胞を、ＬＢブロスに接種するために使用し、そして一晩増殖させた。
次いで、その細胞を溶解してストレプトアビジン封入体を得た。そしてこの封入
体を、細胞のすべての細片が除去されるまで洗浄した。溶解および洗浄プロセス
の間、細胞および封入体を、適切な緩衝液中で超音波処理し、次いで封入体を収
集するために遠心分離した。その封入体を、６Ｍ グアニジン／ＨＣｌ中で、冷
却された低温室中で４℃にて一晩再溶解した。次に、溶解したタンパク質を再フ
ォールディング（これもまた４℃で一晩）し、次いでその溶液を遠心分離して、
凝集物および不純物を除去し、その後Ａｍｉｃｏｎ濾過システムを用いて、同様
の低温室条件下で濃縮した。濃縮後、タンパク質をイミノビオチンアフィニティ
ーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製し、ストレプトアビジン変異体を含む溶
出した容量を収集した。収集した容量を再び合わせて、ＴＥ生理食塩水、ｐＨ
７．０を用いてＡｍｉｃｏｎ濾過システムに戻し、そしてその溶液が中性ｐＨレ
ベル（約７．０）で平衡化されるまで濃縮する。希釈されたタンパク質サンプル
の吸光度の読みとりを行って、最終濃度を決定した。そしてアリコートを、短期
間の使用および頻繁な使用のために−２０℃で保存したが、一方長期保存を、タ
ンパク質のより高い安定性を確実にするために−８０℃で行った。
【００５１】 （実施例３：タンパク質分析） （Ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０〜２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）を、
タンパク質の構造およびおよその分子量を分析するために、変異体、野生型スト
レプトアビジン、およびＫａｌｅｉｄｏｓｃｐｅ分子量マーカーの煮沸したサン
プルおよび煮沸していないサンプルを用いて泳動した。煮沸していないサンプル
は、テトラマーストレプトアビジン構造を反映し、一方煮沸したサンプルは、モ
ノマーサブユニットに解離する。野生型ストレプトアビジンを、２つの変異体に
対するコントロールとして泳動して、ストレプトアビジンのモノマーおよびテト
ラマーの分子量を明確に可視化した。さらに、泳動緩衝液からＳＤＳを除外する
ことによって、ネイティブＰＡＧＥゲルを行った。なぜなら、その変異体は、Ｓ
ＤＳの存在下でわずかに不安定であるらしいからである。
【００５２】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、変異体タンパク質のモノマーサブユニットが、野生
型ストレプトアビジンモノマーの分子量と等しいことを示した。煮沸していない
野生型サンプルのテトラマーバンドは、ゲル上でおよそ６０，０００の分子量に
あることがはっきりと明白であった。しかし、それらの変異体の両方は、テトラ
マー構造の類似の弱い徴候を示した。その変異体テトラマーは、野生型と比較し
て、ゲル上でわずかにより高分子量側に泳動した。ネイティブ条件下において、
変異体タンパク質の煮沸していないサンプルは、ゲル上でわずかに高分子量側に
泳動したが、しかし、ＲＧＤ変異体は、ＳＤＳの非存在下においてテトラマー構
造を保持していた。
【００５３】 ＰＡＧＥゲル上の変異体のテトラマー構造の不安定性は、タンパク質サンプル
またはサンプルの沸騰に導入されるＳＤＳ泳動緩衝液によって引き起こされ得る
。ＲＧＤ変異体は、このような過激な変性条件に供されない。従って、このタン
パク質の不安定性の例証は、その意図された目的についての関連がない。
【００５４】 野生型と比較したＰＡＧＥゲル上のストレプトアビジン変異体のより遅い移動
は、変異したアルギニンが、電気泳動の間に陰極へのタンパク質の誘引をわずか
に排斥する、正の荷電をタンパク質に対して付加するのが当然であるという事実
と同様に、挿入された余分の残基から導入されたさらなる分子量に起因すると予
想されべきである。タンパク質のｐＩの増加を、使用されるＧＣＧプログラムに
よって計算して、野生型ストレプトアビジンおよびＲＧＤ変異体の示された分子
量を見積もった。
【００５５】 （Ｂ．質量分析法） 質量分析法を、電子スプレーイオン化質量分析法によって、２つのストレプト
アビジン変異体のサンプルで実行した。このタンパク質サンプルを、蒸留水に対
して一晩透析することによって調製した。次いで、質量分析計で分析を実行する
直前に、２５％メタノールおよび１％ギ酸中で３０分間煮沸した。
【００５６】 質量分析法は、計算された分子量の１〜２単位中のストレプトアビジン変異体
の両方について、正確な分子量測定を提供した。ＦＮ−ＳＡサンプルを、野生型
ストレプトアビジンをコントロールとして用いて固定した。野生型ピークは１３
，２６８で見られ、そしてＦＮ−ＳＡおよびＯＳＴＰ−ＳＡピークは、両方が１
３，５５４において見られた。２つの変異体間の単一の残基の違いである、バリ
ン（ＯＳＴＰ−ＳＡ）およびプロリン（ＦＮ−ＳＡ）は、２つの分子量単位のみ
によって分かれている。
【００５７】 （Ｃ．速度論的測定） 変異は、ビオチン結合ポケットから反対側のループに存在し、合理的な分子の
設計は、ｏｆｆ−ｒａｔｅを減少させる任意の効果またはストレプトアビジンの
解離定数を除去するべきである。これは、野生型のストレプトアビジンについて
以前に計算された値の標準偏差内にあるＲＧＤ変異体について実験的なｋoff値
によって実際に観察された。ｏｆｆ−ｒａｔｅ測定を、変異体のビオチン親和性
を定量的に特徴付けるために２５℃で実行し、そして野生型ストレプトアビジン
の結合親和性の結果を比較した。トリチウム化されたビオチンである、「ホット
」（なぜなら、放射性標識されているから）を、ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．０中で変
異体タンパク質のサンプルに添加し、そして１〜２時間平衡化した。。次いで、
ｏｆｆ−ｒａｔｅ反応を、ＰＢＳ中の５μＬの１５ｍＭ「コールド」ビオチン（
非放射性）の添加により開始した。トリチウム化ビオチンは、ストレプトアビジ
ン変異体から解離するので、アリコートを定めた時間に取り、そしてシンチレー
ション計数を実行して、トリチウム化ビオチンのβ放射を分析した。結合したト
リチウム化画分の自然対数を時間に対してプロットして、データの点の直線回帰
から計算されたｏｆｆ−ｒａｔｅ ｋoffを得た。
【００５８】 ｏｆｆ−ｒａｔｅ実験は、類似のビオチン親和性を保持する変異体と野生型ス
トレプトアビジンのものとしての解離速度の両方を示す。２５℃において、ＦＮ
−ＳＡについての３．２８×１０-6／秒およびＯＳＴＰ−ＳＡについての３．１
３×１０-6秒のｋoffと比較して、野生型についてのｋoffは３．３±０．１×１
０-6／秒である。
【００５９】 タンパク質の溶出がイムノビオチンカラムから明白であるという事実は、ＳＡ
における変異がその機能（すなわち、ビオチンに対するその強力な親和性）を変
化させないということの最初の表示であった。ｏｆｆ−ｒａｔｅ実験は、野生型
ストレプトアビジンと比較して、正常なビオチン親和性を保持する変異体を明瞭
に示し、そしてタンパク質の四次構造は安定であった。なぜなら、ストレプトア
ビジンは、テトラマー配置でビオチンに結合するのみであったからである。
【００６０】 （実施例４：細胞接着） 一連のタンパク質分析技術によってストレプトアビジン変異体が広範に特徴付
けられた後で、一連の細胞接着実験を行って、そのタンパク質が特異的なＲＧＤ
−インテグリンの関与を介する細胞結合を示したか否かを研究した。ラット大動
脈内皮細胞を、胎仔ウシ血清を有するＭＤＣＢ１３１培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
）中で培養し、そして細胞接着アッセイに使用した。野生型およびＲＧＤストレ
プトアビジン変異体を、種々の濃度で、９６ウェルポリスチレンプレート中で、
４℃で一晩インキュベートし、次いで、細胞のプレーティング（ｎ＝３）の前に
、ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡを用いて、１時間３７℃でブロックした。あるいは、
ビオチン化ＢＳＡを、９６ウェル中で、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ中
で１％ ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロックし、次いでストレプトアビジン
（野生型またはＲＧＤ）をウェル中で、３７℃で１時間、インキュベートした。
タンパク質溶液を吸引し、そしてウェルを滅菌ＰＢＳでリンスし、その後５０，
０００細胞を、３７℃で１時間、タンパク質コートしたウェルにプレーティング
した。培地を除去し、そしてウェルを、温ＰＢＳ（３７℃）で２回リンスした。
接着細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて５分間固定し、そして
４％ ＰＦＡ中の０．５％ トルイジンブルーで、室温でさらに５分間染色した
。その後、プレートを水道水の大きなボウルにウェルを浸すことによって、ウェ
ルを洗浄した。転倒させたプレートをペーパータオル上でブロットすることによ
ってそのプレートを乾燥させ、そして５９５ｎｍでプレートリーダーを用いてウ
ェルの吸光度を読みとる前に、ウェル中に残存している色素を１％ ＳＤＳで可
溶化した。その結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
【００６１】 最初の滴定接着アッセイは、吸着したタンパク質の量と接着細胞の比率との間
の両方のＲＧＳ変異体についての類似の線形相関を示した。吸光度の読みとりは
、ポリスチレンウェルに生理的吸着した両方の変異体について約０．３０で安定
し、そしてウェルに吸着した両方のタンパク質をビオチン−ＢＳＡでコートした
。両方の場合において、細胞接着の飽和を、約１００ｎＭ（５μｇ／ｍｌ）の濃
度で観察した。野生型の吸光度の読みとりは、１％ ＳＤＳ（読みとりのために
トルイジンを溶解するために使用した溶媒）のそれに匹敵した。
【００６２】 野生型ストレプトアビジンは、コントロールレベルより上の細胞接着を示さな
い。これはまた、固定液および細胞染色の導入前に、位相差顕微鏡を用いるウェ
ルの視覚的検査によって確認された（図３）。非常に多数の細胞がＲＧＤストレ
プトアビジン変異体を有するウェル中に接着したままであったが、一方、ウェル
中に残存する非常にわずかな細胞のみが野生型ストレプトアビジンでコートされ
た。
【００６３】 観察された細胞接着が直接的にＲＧＤ依存性であったか否かを確証するために
、阻害研究を、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号２のアミノ酸８９〜９４）、ＧＲＧＥＳ
Ｐ（配列番号８）、およびＧＲＡＤＳＰ（配列番号９）のペプチドを用いて行っ
た。この結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。ＲＧＥコントロールペプチドおよびＲ
ＡＤコントロールペプチドは、細胞接着に対して顕著な阻害効果を有さなかった
が、ＲＧＤペプチドは、用量依存的な様式で細胞接着を阻害した（図３Ａ）。１
００μＭのＲＧＤペプチドは細胞接着を阻害したが、一方同じ濃度の２つのコン
トロールペプチドは、かなりの程度の阻害活性を示さなかった。このデータは、
ストレプトアビジン変異体の細胞接着活性が、プレーティングが細胞接着を阻害
する前の、ＲＧＤペプチドを有するインテグリンレセプターのブロッキングとし
て、ＲＧＤ媒介性であることを確証する。
【００６４】 ＲＧＤ変異体と野生型との間の細胞接着アッセイにおける明白な対照は、その
変異体が首尾よくその意図された機能を実行したことを示す。野生型の低い吸光
度の値は、１％ ＳＤＳ単独と比較した場合のバックグラウンドの読みとりを反
映し、従って、実際的にＲＧＤ変異の非存在下では、ストレプトアビジンに対し
て結合し得なかったことを推定することは、確かなことである。これはまた、固
定液および染色液の導入前の接着アッセイの間にウェルを可視化することによっ
て確証され得る。多くの細胞がＲＧＤストレプトアビジンを有するウェルと接着
したままであったが、非常にわずかの細胞（もしあるとしても）が野生型でコー
トされたウェル中に残存した。
【００６５】 合成ヘキサペプチドＧＲＧＤＳＰ（配列番号２のアミノ酸８９〜９４）、ＧＲ
ＧＥＳＰ（配列番号８）、およびＧＲＡＤＳＰ（配列番号９）を、Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬより購入した。阻害アッセイを、タンパク質コートしたウェルにプレーテ
ィングする前に、細胞をペプチドと室温で１５分間インキュベートすること以外
は、細胞接着アッセイと同じプロトコールを用いて行った。
【００６６】 ストレプトアビジンコートしたポリスチレンディッシュ上でのメラノーマ細胞
接着アッセイを、０．１％ ＢＳＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを有するＤＭＥ
Ｍを培養培地として使用し、そして２×１０5細胞を各々のウェルに添加したこ
と以外は、内皮細胞接着アッセイについて上記のように記載したのと同様に行っ
た。高レベルのαvβ3インテグリンを発現するＭｏαv細胞を、Ｍ２１メラノー
マ細胞から誘導した。接着アッセイを、２４ウェル組織培養ポリスチレンディッ
シュで構築された自己アセンブルした単層上で行った。このディッシュを約４０
０Ａ金を用いて蒸着し、次いで２０％ ビオチン化アルキルチオール（ＢＡＴ）
および８０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の０．１ｍＭ エタノール性チ
オール溶液とともに、一晩インキュベートした。このウェルを１００％ エタノ
ールで３回リンスし、窒素を吹き付けて乾燥させ、次いでＰＢＳ中の０．０５ｍ
ｇ／ｍｌストレプトアビジン（野生型または変異型）とともに、左右に揺らしな
がら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、このタンパク質溶液を取り除
き、そして細胞を添加する前にＰＢＳで３回リンスした。抗体阻害アッセイを、
ＲＧＤ／ＲＧＥ阻害アッセイについてと実質的に同様に行った。ＬＭ６０９およ
びコントロールを、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．
（ＣＡ）から得、そして１：１０００希釈（１０μｇ／ｍｌ）で使用した。比較
できる細胞接着結果が、内皮細胞に加えて、ヒトメラノーマ細胞を用いて得られ
た。図４は、ＲＧＤ変異体が強力な細胞接着活性を示すこと、およびこの活性が
可溶性ＲＧＤペプチドによって阻害され得ることを示す。この細胞接着活性は、
抗αvβ3インテグリンモノクローナル抗体によって阻害され得るが、コントロー
ルの非特異的抗体によっては阻害されない（図５）。これらの結果は、ＲＧＤ配
列が細胞接着を媒介すること、およびこれらの配列がメラノーマ細胞に存在する
αvβ3インテグリンと特異的に相互作用することを実証する。
【００６７】 本明細書中で、および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ
」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の意味を指示しない限り、
複数形への言及を含むことが留意されなければならない。従って、例えば、「宿
主細胞（ａ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」との言及は、複数のこのような宿主細胞を
含み、「抗体（ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」との言及は、当業者に公知である
１つ以上の抗体およびその等価物に対する言及、などである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本明細書中に記載される変異体ストレプトアビジン分子の例の模式的
モデルおよびビオチン化表面上でのその配向である。黒色の側鎖はＲＧＤ残基を
表し、ビオチンはグレー色の球棒状の原子（ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋ ａ
ｔｏｍ）として表される。このモデルは、ＲＧＤが挿入されるループの正確な構
造を予測しようとするものではないが、単純にビオチンおよびＲＧＤ変異の空間
的関係を描写する。
【図２】 図２Ａおよび図２Ｂは、フィブロネクチン（ＦＮ−ＳＡ）のような隣接アミノ
酸を有するＲＧＤを組み込んだストレプトアビジンの濃度対５９５ｎｍの吸光度
（接着した細胞を表す）のグラフ、およびオステオポンチン（ＯＳＴＰ−ＳＡ）
のような隣接アミノ酸を有するＲＧＤを組み込んだストレプトアビジン濃度対５
９５ｎｍの吸光度のグラフである。ポリスチレン（図２Ａ）またはポリスチレン
上に吸着したビオチン−ＢＳＡ（図２Ｂ）のいずれかの上に、ＦＮ−ＳＡ（ひし
形）およびＯＳＴＰ−ＳＡ（丸）をコートし、野生型ストレプトアビジン（黒四
角）の接着と比較した。
【図３】 図３Ａは、ＦＮ−ＳＡ（黒ひし形）およびＯＳＴＰ−ＳＡ（白丸）に対する細
胞接着のコンペティターとして使用されるＲＧＤペプチドの濃度対５９５ｎｍの
吸光度（吸着した細胞を表す）のグラフである。図３Ｂは、ＦＮ−ＳＡ（黒棒）
またはＯＳＴＰ−ＳＡ（白棒）に対する細胞接着のインヒビターとしてＧＲＧＤ
ＳＰ（配列番号２のアミノ酸８９〜９４）、ＧＲＧＥＳＰ（配列番号８）および
ＧＲＡＤＳＰ（配列番号９）可溶ペプチドを使用する５９５ｎｍの吸光度（吸着
した細胞を表す）の棒グラフである。
【図４】 図４Ａおよび図４Ｂは、ＦＮ−ＳＡ（ひし形）、ＯＳＴＰ−ＳＡ（丸）および
野生型ストレプトアビジン（黒四角）でコートしたポリスチレンディッシュに対
するメラノーマ細胞の吸着を示す。図４Ａは、５９５ｎｍの吸光度（吸着した細
胞を表す）対ＦＮ−ＳＡおよびＯＳＴＰ−ＳＡの濃度のグラフである。図４Ｂは
、５９５ｎｍの吸光度（吸着した細胞を表す）対ＦＮ−ＳＡおよびＯＳＴＰ−Ｓ
Ａに対する細胞接着の競合剤として使用されるＲＧＤペプチドの濃度のグラフで
ある。図４Ｂの実験のストレプトアビジンコーティング濃度は、２００μＭにお
いて一定を維持した。エラーバーは、±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図５】 図５Ａおよび図５Ｂは、ビオチンおよびポリ（エチレングリコール）チオール
を含む混合自己アセンブル単分子層（ＳＡＭｓ）に対するメラノーマ細胞接着を
図示する。図５Ａは、ＦＮ−ＳＡ、ＯＳＴＰ−ＳＡ、および野生型ストレプトア
ビジンでコートしたＳＡＭを使用した５９５ｎｍの吸光度（接着した細胞を表す
）のグラフである。図５Ｂは、１０μｇ／ｍｌ抗−αvβ3インテグリン複合体（
ＬＭ６０９）またはアイソタイプ−適合した非免疫制御抗体の存在下で細胞懸濁
液の予備インキュベーション後の、ＦＮ−ＳＡ（黒棒）またはＯＳＴＰ−ＳＡ（
グレー棒）に対する５９５ｎｍの吸光度（吸着した細胞を表す）の棒グラフであ
る。これは、メラノーマ細胞接着のインテグリン特異性を実証する。エラーバー
は、±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｙ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ネルソン， クジェル イー． アメリカ合衆国 ワシントン 98103， シアトル， ノース 78ティーエイチ ス トリート 1340 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 CA06 CA07 DA02 EA04 GA11 HA01 HA17 4B064 AG01 CA10 CC24 DA01 DA13 4C076 AA95 EE41 FF31 FF68 GG22 4C081 AB13 AC06 BA13 BB06 CA01 CA15 DA02 EA06 4C084 AA02 AA06 AA07 BA31 BA41 BA42 CA59 NA03 NA12 NA13 ZC01 ZC78 4H045 AA10 AA20 AA40 BA40 CA11 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74 HA06

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ビオチン結合ドメインおよび第２の機能的ドメインを含む改
    変されたストレプトアビジン分子であって、ここで、該第２の機能的ドメインが
    該ストレプトアビジン分子に挿入されている、分子。
  2. 【請求項２】 前記第２の機能的ドメインが第２の機能を有するペプチドを
    含む、請求項１に記載のストレプトアビジン分子。
  3. 【請求項３】 前記第２の機能的ドメインが、残基６３と６９との間のスト
    レプトアビジン野生型配列に組み込まれている、請求項２に記載のストレプトア
    ビジン分子。
  4. 【請求項４】 前記第２の機能的ドメインが細胞接着ペプチドを含む、請求
    項２に記載のストレプトアビジン分子。
  5. 【請求項５】 ビオチン結合部位でのアミノ酸の改変によって変異ストレプ
    トアビジン分子がビオチン結合親和性を低下している、請求項１に記載のストレ
    プトアビジン分子。
  6. 【請求項６】 前記分子のビオチン結合親和性が、少なくとも野生型ストレ
    プトアビジン結合親和性の２５％である、請求項１に記載のストレプトアビジン
    分子。
  7. 【請求項７】 前記第２の機能的ドメインが、アミノ酸残基６３と６９との
    間の前記ストレプトアビジンアミノ酸配列に組み込まれた細胞接着ペプチドであ
    る、請求項１に記載のストレプトアビジン分子。
  8. 【請求項８】 前記細胞接着ペプチドが、アルギニン−グリシン−アスパラ
    ギン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）（ＲＧＤ）である、請求項７に記載のストレ
    プトアビジン分子。
  9. 【請求項９】 アルギニンが野生型ストレプトアビジンの残基６５の代わり
    に置換され、そしてグリシンが野生型ストレプトアビジンの残基６６の代わりに
    置換されている、請求項８に記載のストレプトアビジン分子。
  10. 【請求項１０】 隣接するアミノ酸をさらに含む、請求項８に記載のストレ
    プトアビジン分子。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のストレプトアビジン分子であって、こ
    こでアルギニンが野生型ストレプトアビジンの残基６５の代わりに置換され、第
    １のグリシンが野生型ストレプトアビジンの残基６６の代わりに置換され、第２
    のグリシンが野生型ストレプトアビジンの残基６４と残基６５の代わりに置換さ
    れたアルギニンとの間に挿入され、そしてセリン、およびプロリンまたはバリン
    のいずれかが野生型ストレプトアビジンの残基６７の後に挿入される、ストレプ
    トアビジン分子。
  12. 【請求項１２】 ストレプトアビジン分子がビオチン結合ドメインおよび第
    ２の機能的ドメインを含む、該ストレプトアビジン分子および基材を含有する、
    組成物。
  13. 【請求項１３】 前記ストレプトアビジン分子が前記基材に固定化されてい
    る、請求項１２に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 前記基材が血管デバイスまたはプロテーゼである、請求項
    １３に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 第２の機能的ドメインを有するストレプトアビジン分子の
    作製方法であって、該方法は、 組換えＤＮＡ方法論を使用して、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のスト
    レプトアビジン分子を産生する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 ２つの組成物を会合させる方法であって、該方法は、 （ｉ）ビオチンを含有する第１の組成物、 （ｉｉ）ビオチン結合ドメインおよび第２の機能的ドメインを含むストレプト
    アビジン分子、および （ｉｉｉ）第２の機能的ドメインによって結合され得る化合物を含有する第２
    の組成物、 を接触させる工程を包含し、 ここで該第１の組成物は、該ビオチン結合ドメインを介して該ストレプトアビ
    ジン分子と結合し、そして該第２の組成物は、該第２の機能的ドメインを介して
    該ストレプトアビジン分子と結合し、 ここで該第１の組成物、該ストレプトアビジン分子、および該第２の組成物は
    、同時にまたは任意の順序で連続的に接触され得る、 方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法であって、ここで前記第１の組成
    物は基材であり、前記第２の組成物は細胞であり、そして前記第２の機能的ドメ
    インは細胞接着ペプチドであり、 ここで該方法は、該細胞を該基材と会合させることによって、該基材上への該
    細胞の固定化を生じる、方法。
  18. 【請求項１８】 前記基材が血管デバイスまたはプロテーゼである、請求項
    １７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記細胞接着ペプチドが、アミノ酸残基６３〜６９の間の
    野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に組み込まれている、請求項１７に記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記細胞接着ペプチドが、アルギニン−グリシン−アスパ
    ラギン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）（ＲＧＤ）である、請求項１７に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 請求項１６に記載の方法であって、前記第２の組成物が分
    析物であり、そして前記第２の機能的ドメインが該分析物と特異的に結合するド
    メインであり、ここで、該方法は、該分析物を検出する工程をさらに包含する、
    方法。
  22. 【請求項２２】 前記第１の組成物、前記ストレプトアビジン分子、および
    前記第２の組成物を接触させる前に、 前記分析物を該分析物と特異的に結合する化合物と接触させる工程を包含し、
    ここで該分析物と特異的に結合する化合物は基材上に固定化され、それによって
    該分析物は基材に固定化される、工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】 前記第１の組成物が前記分析物と会合され、そして該分析
    物が該第１の組成物を検出することによって検出される、請求項２２に記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記第１の組
    成物が基材であり、前記第２の組成物が捕捉されるかまたは分離されるべき化合
    物であり、そして前記第２の機能的ドメインが化合物を特異的に結合するドメイ
    ンであって、 ここで、該方法は、該基材を該化合物と会合させることによって該化合物の親
    和性捕捉を生じる、方法。
  25. 【請求項２５】 前記捕捉された化合物を洗浄する工程、および 前記ストレプトアビジン分子から該化合物を溶出させる工程、 をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ストレプトアビジン分子が、ビオチン結合部位のアミ
    ノ酸の改変による減少したビオチン結合親和性を有するように改変される、請求
    項２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記第２の組
    成物が細胞であり、そして前記第２の機能的ドメインが該細胞に特異的に結合す
    るドメインであり、 ここで該細胞と前記ストレプトアビジン分子とが会合される、方法。
  28. 【請求項２８】 前記第１の組成物がビオチン化化合物であり、ここで該ビ
    オチン化化合物は前記細胞に標的化される、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記ビオチン化化合物が治療化合物である、請求項２８に
    記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記ビオチン化化合物が核酸、タンパク質、ペプチド、有
    機化合物、無機化合物、ポリサッカリド、または組み合わせである、請求項２８
    に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 請求項１６に記載の方法であって、前記第２の組成物が細
    胞であり、そして第２の機能的ドメインが細胞活性に影響を与え、ここで、該方
    法は、細胞活性において変化を生じる、方法。
  32. 【請求項３２】 前記第１の組成物が血管デバイスまたはプロテーゼである
    、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 基材にさらなるドメインを付加する方法であって、該方法
    は、 該基材、ならびにビオチン結合ドメインおよび第２の機能的ドメインを含むス
    トレプトアビジン分子を接触させる工程、 を包含する、方法。
  34. 【請求項３４】 前記基材が血管デバイスまたはプロテーゼである、請求項
    ３３に記載の方法。
JP2000566407A 1998-08-25 1999-08-25 第２の機能的ドメインを有するストレプトアビジン変異体 Withdrawn JP2002523041A (ja)

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