CN101016548A

CN101016548A - 可溶性转化生长因子βⅡ型受体/γ－干扰素重组融合蛋白及其制备

Info

Publication number: CN101016548A
Application number: CN 200710066986
Authority: CN
Inventors: 张立煌; 姚航平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2007-01-30
Publication date: 2007-08-15

Abstract

本发明公开了一种可溶性转化生长因子βⅡ型受体/γ－干扰素重组融合蛋白。应用基因技术构建sTGFβRII/hIFN－γ融合基因的PCDNA3.1(+)真核表达载体，转染dhfr－CHO细胞，获得高效、稳定表达sTGFβRII/hIFN－γ融合蛋白的dhfr－CHO细胞株。其制备方法包括：构建sTGFβRII/hIFN－γ的PCDNA3.1(+)真核表达载体；聚合酶链反应(PCR)扩增IFN－γ；在哺乳动物dhfr缺陷型CHO细胞株DG44表达sTGFβRII/hIFN－γ融合蛋白；鉴定sTGFβRII/hIFN－γ融合蛋白的表达，以及纯化。综合sTGFβRII和IFN－γ在抗肝纤维化中潜在的协同作用及融合表达相对单独细胞因子对活性的增强作用，该重组融合蛋白可应用于制备抗肝纤维化药物。

Description

可溶性转化生长因子βⅡ型受体/γ-干扰素重组融合蛋白及其制备

技术领域

本发明属于医学生物工程技术领域，涉及基因工程药物及其制备，具体为一种用于抗肝纤维化的可溶性转化生长因子βII型受体/γ-干扰素重组融合蛋白及其制备。

背景技术

肝纤维化是各种原因慢性肝损伤的共同反应，以细胞外基质(Extra Cellular Matrix ECM)尤其胶原产生增加为特征，是一个可逆的病理过程；但在此过程中，肝功能最终将产生缺陷，若损伤持续存在则将导致肝硬化与肝衰竭，而肝硬化是不可逆性的反应，因此防止和逆转肝纤维化对于慢性肝病的治疗至关重要。肝纤维化是一个极其复杂的生理病理过程是各种慢性肝病的共同病理基础，目前认为，任何致病因子造成的肝脏损伤和炎症，在多种炎症因子的参与下，都可激活肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)、枯否细胞、窦内皮细胞等而启动肝纤维化，其中肝脏星形细胞是最关键的细胞，1876年，von Kupffer首先描述了这种细胞，它被激活后转化为肌成纤维细胞(MFB)，并伴随平滑肌动蛋白(d-SMA)的表达，向细胞外分泌胶原。而枯否细胞激活分泌TGF-α、TGF-β1、PDGF、Ito细胞刺激因子等细胞因子，进一步促进肝星状细胞的转化、增殖和合成细胞外基质。同时，受多种因素的影响，正常情况下，细胞外基质(ECM)合成和降解的动态平衡被破坏，细胞外基质大量增加，而降解相对减少，进一步发展则可引起肝小叶改建、假小叶和结节形成、而形成肝硬化。

TGFβ是最强的促HSC活化的细胞因子。TGFβ家族成员包括TGFβs、骨形成蛋白(bonemorphogenetic proteins BMPs)、抑制素(inhibition)和活化素(Activin)等40多个成员，是细胞生长和分化的调节者，参与调节许多生理功能，包括影响分化、增殖、凋亡与迁移，并在多种疾病的病理过程中发挥重要作用，是已知的最强的促纤维生成的细胞因子。哺乳动物有3种TGFβ表达，分别是TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3，其中TGFβ1与纤维化关系最密切。TGFβ1是多功能的细胞因子，自从它的细胞内信号转导下游中介分子Smad被发现以来，对TGFβ1作用机制研究迅速地发展。

在肝纤维化的形成过程中TGFβ/Smad信号转导对肝星状细胞(HSC)的分化，增殖及合成胶原方面有着其重要的作用。TGFβ/Smad信号转导分子机制包括三个阶段：(1)TGFβ与受体的结合及受体活化。TGFβ受体(TGFβR)家族为Ser/Thr激酶，包括三类，分别称为I、II、III型受体。其中TGFβRII是TGFβ在体内发挥生物学活性所必须的受体，能传导所有TGFβ同分异构体的信号。TGFβ与TGFβRII结合后，使TGFβR I和TGFβRII结合成为稳定的四聚体受体复合物，随后TGFβRII激酶磷酸化TGFβR I的近膜处富含甘氨酸与丝氨酸残基区域，启动TGFβ信号传导。(2)Smad蛋白的活化和信号传导。SMADs蛋白家族是首个被鉴定的TβR I激酶底物，它们在受体信号转导中起到关键作用。1995年Raftery等先后提出果蝇的dpp基因编码的MAD蛋白参与TGFβ超家族的信号转导，随后Svage等在新小杆线虫属胞浆内发现了与果蝇属中的MAD蛋白功能相似的sma蛋白，在脊椎动物体内也发现了类似的蛋白。为了统一标准把脊椎动物体内发现的sma和mad基因及其表达产物统称为SMAD。SMAD2，3直接和配体活化的TβR I相互作用后被磷酸化。R-SMADs磷酸化后，形成异源二聚体再和SMAD4相互作用，转位到核内调节基因转录。SMAD7可以和TβR I结合，阻碍R-SMAD磷酸化，也可以和E3泛素连接酶Smurf1和Smurf2相互作用，招募它们到TβR复合物，诱导活化TβR的降解。(3)Smad蛋白的核转位及对基因转录的调控。SMADs复合物一旦进入核内，就直接结合到DNA上调节基因的转录。

由于TGF-β/Smad信号传导系统在肝纤维化中的重要作用，通过拮抗这条信号转导通路来达到抗纤维化的作用是目前的研究热点。关于针对TGF-β/Smad信号传导系统的抗纤维化策略也很多，主要从以下两个水平来进行干预：

(1)TGFβ/TGFβR水平：目前常用的TGFβ受体拮抗剂有缺陷型TGFβRII、sTGFβRII和反意寡核苷酸。sTGFβRII能特异性结合TGFβ，但因缺乏丝氨酸/苏氨酸激酶区而不能传导信号，从而阻断TGFβ的生物作用，有抗肝纤维化的作用。虽然TGFβ及其受体在哺乳动物的组织细胞有广泛表达，但是Yu-an等在长期应用TGFβ拮抗剂(sTGFβRII)进行基因治疗的研究中并未发现副作用，这可能是因为TGFβ拮抗剂选择性中和与疾病相关的过度表达的TGFβ的作用，而对TGFβ的正常生理调节功能没有影响，因此sTGFβRII有临床长期应用的可能。Qi等发现通过腺病毒载体将TGFβIIR胞外区转染至肝脏，能改善Dimthlymitrosamine(DMN)诱导的大鼠肝纤维化，显著降低血清透明质酸和转氨酶活性，但是通过腺病毒转染至肝脏的基因表达十分短暂，且反复给予可能因为引起对载体的强免疫应答而使治疗无效。Jacob G等则发现sTGFβR II/IgG融合蛋白能显著抑制大鼠胆总管结扎引起的肝纤维化，减少I型胶原表达，抑制HSC活性，并有一定的预防作用；Yata Y等研究也表明sTGFβRII能明显抑制CCL4诱导的小鼠肝纤维化，作用呈剂量依赖关系；以上提示sTGFβRII是体内实验性慢性肝损伤、肝纤维形成的有效抑制剂，有抗肝纤维化作用。此外Yoshitaka I等发现转染sTGFβRII能减少肾炎大鼠肾小球ECM的累积、扩散；Qingiian W等的研究则表明sTGFβRII能显著改善实验动物的肺纤维化；国内汪玲等也报道，缺陷型TGFβRII质粒对大鼠肝纤维化有治疗作用。

(2)Smad信号传导调控水平：是目前研究的热点，Smad2、3、4是TGFβ/Smad信号传导的中间环节，理论上无论抑制他们的生成，磷酸化或核转为都能抑制肝纤维化。Smad7被认为是TGFβ/Smad信号传导最重要的负性调节因子之一。Dooley等应用转染了Smad7的eDNA的腺病毒载体注射肝纤维化大鼠，发现抑制了HSC的分化和增殖，抑制了Smad2、3的磷酸化和核转位，且肝内的胶原和d-SMA表达下降。IFN-γ无论在动物还是临床实验中都具有很好的抗纤维化作用。早期研究认为，IFN-γ的抗纤维化机制是通过JAK/STAT信号传导通路诱导Smad7产生。但Ghosh等发现用反义核酸技术封闭Smad7基因，对IFN-γ抑制TGFβ诱导I型胶原转录没有影响，提示IFN-γ不是通过诱导Smad7来发挥抗纤维化作用的；进一步实验显示IFN-γ诱导STAT1进入细胞核内与Smad3结合，抑制Smad3活性来拮抗Smad信号转导，同时发现一种共刺激因子P300/CBP可与Smad3和STAT1竞争结合，于是这两条信号通路在此整合，当P300/CBP大量表达时，IFN-γ就失去对TGFβ/Smad信号传导的抑制作用。

基于国内外对肝纤维化发生机制及治疗的研究，考虑到sTGFβRII和IFN-γ能在不同位点阻断TGFβ1/Smad信号转导通路、抑制HSC活化，联合应用两者将可能产生抗肝纤维化的协同效应，并因减少各自用量而降低副作用。且目前国内外尚无联合应用sTGFβRII和hIFN-γ治疗肝纤维化的有关报道。

发明内容

综合sTGFβRII和IFN-γ在抗肝纤维化中潜在的协同作用及融合表达相对单独细胞因子对活性的增强作用，本发明的目的是应用基因重组技术构建出sTGFβRII/hIFN-γ融合基因的PCDNA3.1(+)真核表达载体，转染dhfr-CHO细胞，以期获得高效、稳定表达sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的dhfr^-CHO细胞株。提供一种制备抗肝纤维化的药物及其制备方法。

本发明的可溶性转化生长因子βII型受体/γ-干扰素重组融合蛋白，其核苷酸序列和相应氨基酸序列如序列表SEQID NO.1所述。

可溶性转化生长因子βII型受体/γ-干扰素重组融合蛋白的制备方法为如下步骤：

(1)构建sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表达载体；

(2)聚合酶链反应(PCR)扩增IFN-γ；

(3)在哺乳动物dhfr缺陷型CHO细胞株DG44表达sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白：

(4)鉴定sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表达；

(5)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的纯化。

本发明的可溶性转化生长因子βII型受体/γ-干扰素重组融合蛋白应用于制备抗肝纤维化药物。

附图说明：

图1：pcDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒构建流程图。

图2：hIFN-γ、sTGFβRII的PCR产物电泳图

M：Gene Ruler_100bp DNA ladder；

1：hIFN-γPCR product；

2：sTGFβRII PCR product；

图3：TOPO-hIFN-γ重组质粒EcoR I酶切图

1：TOPO-hIFN-γ质粒用EcoR I酶切；2：Control未切

图4：TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒HindIII/XbaI酶切图1～3：TOPO-sTGFβRII/hIFN-γwith HindIII/XbaI double digestion

图5：PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒HindIII/XhoI酶切图

M：为DNA Marker，

1～2：PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γwith double digestion

3：PCDNA3.1(+)with double digestion

图6：MTX浓度梯度筛选中IFN-□表达量/10⁵cells

图7：有限稀释中hIFN-γ表达量/10⁵cells

图8：滚瓶培养上清液hIFN-γ表达量

图9：融合蛋白抗TGF-

1生物活性

A：untreated cell， C：TGFβ1(800pg/ml)

B：TGFβ1(800pg/ml)+TGFβRII Rabbit Polyclonal IgG

0.1～10ng/ml：serially diluted the sTGFβRII/hIFN-γprotein+TGFβ1(800pg/ml)

图10：融合蛋白对NK细胞活性的影响空白：untreated cells

0.1ng/ml～5ng/ml：serially diluted sTGFβRII/hIFN-γprotein

图11：融合蛋白抗病毒活性

D：VSV， B：VSV+rhIFN-γ(2ng/ml)， A：untreated cells

C：VSV+2ng/ml sTGFβRII/hIFN-γ+2ug/ml hIFN-γRabbit Polyclonal IgG

0.1ng/ml-10ng/ml：VSV+serially diluted sTGFβRII/hIFN-γprotein

图12：大鼠肝脏Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA荧光定量RT-PCR电泳图

图13：大鼠肝脏Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA荧光定量RT-PCR

图14：Col III、α-SMA、TGFβ1和TGFβRII的Western印迹实验

我们对所表达的蛋白作了生物学活性分析，结果表明获得的sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白具有sTGFβRII拮抗TGFβ1生物学活性的作用，和hIFN-γ刺激NK细胞杀伤活性及抗病毒活性。体外抗肝纤维化研究结果表明sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白能有效拮抗TGFβ1/Smad信号转导，抑制Smad2磷酸化。sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白也能有效抑制TGFβ1诱导的HSC活化，减少胶原等ECM的表达，具有潜在的抗肝纤维化作用。

具体实施方式

以下通过详细的技术流程表达本发明的技术方案：

1、可溶性TGFβII型受体(sTGFβRII)与人γ干扰素融合蛋白的表达、纯化

1.1 质粒、细胞株、菌株

l hIFN-γ质粒、TGFβIIR质粒，本所保存：

l PCDNA3.1(+)载体质粒，Invitrogen产品；

l PSV2-dhfr质粒，ATCC产品；

l Dhff缺陷型CHO细胞系DG44细胞株，本所保存；

l 貂肺上皮细胞Mv1Lu、肝星状细胞HSC、K562细胞，本所常规传代培养；

l DH5α感受态细胞、TOP 10F感受态细胞，Invitrogen产品；

l 疱疹性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)，上海第二军医大学免疫所惠赠。

1.2 PCR引物(表1)，参考Genebank设计，由上海生物工程有限公司(SANGON)合成

表1：PCR引物

Table1：List of Primers of PCR

primer		Sequence(5’-3’)	来源	size
primer		Sequence(5’-3’)	来源	size	hIFN-γsTGFβRII	senseantisensesenseantisense	TCTCTTGGCTGTTACTGCCAACCTCGAAACAGCATCTGACcccA/AGCTTTCTGCCATGGGTCGGGGGCTGccgG/GATCCAAGTCAGGATTGCTGGTGTTATATTC	SANGONSANGONSANGONSANGON	431483

1.3主要试剂

l 限制性内切酶(HindIII、BamH I、XhoI、XbaI)及RevertAid_M-MuLv First Strand；cDNASynthesis Kit， MBI Fermentas；

l QIAquick_DNA凝胶胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒，QIAGEN GmbH；

l TOPO T-A Cloning Kit、T4 DNA Ligase Kit，Invitrogen；

l UNIQ-10柱式小量质粒抽提试剂盒、UNIQ-5柱式大量质粒抽提试剂盒，SANGON；

l CD CHO Medium及DMEN/F12(1∶1)粉剂，Invitrogen；

l Methotrexate(MTX)，Invitrogen；

l 胎牛血清(Fetal Calf Serum，FCS)，Hyclone；

l human IFN-γELISA Kit，R&D Systems；

l 各类抗体：IFN-γ兔多克隆抗体、TGFβRII兔多克隆抗体，小鼠抗兔HRP，Santa Cruz；

2 构建方法

2.1 构建sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表达载体(见图1)：

图1：PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒构建流程图(Fig1：Construction ofPCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γplasmid)

2.1.1 聚合酶链反应(PCR)扩增IFN-γ：

参考Genebank E00692设计hIFN-γ的一对引物，Taq DNApolymerase进行聚合酶链反应(PCR)扩增，以hIFN-γ质粒为模板，：

模板(100ng) 3μl

LA Taq DNA聚合酶(5u/μl) 0.5μl

10×LA Taq Buffer 5μl

IFN-γsense(20pmol/μl) 1μl

IFN-γantisense(20pmol/μl) 1μl

2.5mM dNTP mix 4μl

H₂O 35μl

总体积 50μl

PCR反应条件：

95℃预变性 3min

72℃延伸 10min

PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将片段切下胶回收。

2.1.2 PCR扩增：

携带HindIII/BamH I限制性酶切位点的sTGFβRII 参考Genebank AH003678设计sTGFβRII的一对引物，在5’端、3’端分别引入HindIII识别位点、BamH I识别位点，用PyrobestDNA polymerase高保真扩增sTGFβRII，PCR反应体系及反应条件同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化，作HindIII/BamH I双酶切

sTGFβRII PCR产物 20μl

HindIII(10u/μl) 2μl

BamH I(10u/μl) 2μl

10×BufferY+/T 5μl

H₂O 21μl

总体积 50μl 混匀，37℃作用2h。

酶切产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将片段切下胶回收。

2.1.3 构建TOPO-hIFN-γ克隆载体：

将hIFN-γ基因片段用T-A克隆的方法插入TOPO T-A克隆载体

IFN-γPCR胶回收产物 3μl

TOPO T-AVetor 1μl

Salt Solution(6×) 1μl

加水至 6μl 混匀，室温作用10min

连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑取单个白色菌落若干，分别接种于3ml含Amp 100μg/ml的LB培养基中，抽提TOPO-hIFN-γ重组质粒DNA，作EcoR I单酶切鉴定

TOPO-hIFN-γ质粒 20μl

EcoR I(10u/μl) 2μl

10×BufferY+/T 5μl

H₂O 23μl

总体积 50μl 混匀，37℃作用2h。

酶切产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将阳性克隆进行核酸序列测定。

2.1.4 构建TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ克隆载体：

将测序正确的TOPO-hIFN-γ质粒用HindIII/BamH I双酶切

TOPO-hIFN-γ质粒 20μl

HindIII(10u/μl) 2μl

BamH I(10u/μl) 2μl

10×BufferY+/T 5μl

H₂O 21μl

总体积 50μl 混匀，37℃作用2h。

酶切产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将含hIFN-γ的载体片段切下胶回收。连接TOPO-hIFN-γ载体片段和sTGFβR II的HindIII/BamH I双酶切产物

sTGFβRII酶切片段 3μl

TOPO-hIFN-γ载体片段 5μl

5×Ligation Buffer 3μl

T4 DNA Ligase 1μl

H₂O 3μl

总体积 15μl 混匀，室温作用2h。

连接产物转化TOP 10F感受态细胞，操作同前。挑单个白色菌落扩增，抽提TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒DNA，作HindIII/XbaI双酶切鉴定

TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ质粒 20μl

HindIII(10u/μl) 2μl

XbaI(10u/μl) 2μl

10×BufferY+/T 5μl

H₂O 21μl

总体积 50μl 混匀，37℃作用2h。

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性质粒-20℃保存。

2.1.5 构建PCDNA3.1(+)-sTGFBRII/hIFN-γ真核表达载体：

用HindIII/XhoI双酶切PCDNA3.1(+)真核表达质粒和TOPO-sTGFβR II/hIFN-γ重组质粒

TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ质粒 20μl

HindIII(10u/μl) 2μl

XhoI(10u/μl) 2μl

10×BufferY+/T 5μl

H₂O 21μl

总体积 50μl

PCDNA3.1(+)质粒 20μl

HindIII(10u/μl) 2μl

XhoI(10u/μl) 2μl

10×BufferY+/T 5μl

H₂O 21μl

总体积 50μl

混匀，37℃作用2h。

酶切产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将目的片段切下胶回收。

将sTGFβRII/hIFN-γ片段克隆入PCDNA3.1(+)质粒

sTGFβRII/hIFN-γ酶切片段 3μl

PCDNA3.1(+)酶切载体片段 5μl

5×Ligation Buffer 3μl

T4 DNALigase 1μl

H₂O 3μl

总体积 15μl 混匀，室温作用2h。

连接产物转化DH5α感受态细胞，操作同前，铺含Amp 100μg/ml的1.5％琼脂LB培养基，挑单个菌落扩增，抽提PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒DNA，进行HindIII/XhoI鉴定，操作同前。并将酶切阳性的质粒进行核酸测序。

2.2 在哺乳动物dhfr缺陷型CHO细胞株DG44表达sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白：

2.2.1 DG44细胞的培养：

Dhfr缺陷型CHO细胞为营养缺陷型细胞，贴壁生长，培养于完全培养基，即含0.03mmol/L次黄嘌呤，0.003mmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷，0.1mmol/L脯氨酸，0.1mmol/L甘氨酸，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml，谷氨酰胺2mmol/L及10％胎牛血清的DMEM培养基中。转染细胞培养于缺乏次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷及甘氨酸的选择性培养基中。

2.2.2 PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒和PSV2-dhfr质粒共转染DG44细胞以及筛选、加压：

接种1×10⁶个DG44细胞于25cm2培养瓶中，以含次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)和脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)的DMEM完全培养液，5％CO2、37℃培养36h。取构建好的sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表达载体和PSV2-dhfr质粒(10∶1)按Lipofectamine^TM2000试剂盒说明书进行共转染。转染后六小时换液，48小时1∶10传代，采用不含H、T、Gly的选择培养基进行筛选，待克隆形成后再采用含800ug/ml的G418的选择培养基进行筛选，三天换液一次，持续两周。用间接ELISA方法选取融合蛋白表达量高的克隆进行5～1000nmolMTX梯度加压筛选。5nmol/mlMTX加压筛选10天，用间接ELISA方法选取融合蛋白表达量高的孔做有限稀释(每孔10个细胞)；用10nmol/mlMTX加压筛选20天，取最高表达孔再做有限稀释；用50nmol/mlMTX加压筛选20天，取最高表达孔再做有限稀释；用200nmol/mlMTX加压筛选20天，取最高表达孔再做有限稀释；500nmol/ml加压筛选20天，取最高表达孔再做有限稀释；1000nmol/ml加压筛选20天，取最高表达孔，扩大培养。

2.2.3 筛选稳定高效表达sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的DG44细胞株并无血清培养基滚瓶大量培养：

MTX加压筛选后的dhfr缺陷型CHOS细胞做有限稀释，96孔板，每孔一个细胞，挑选单个克隆的孔做上记号，十天换液，第15天双抗夹心法检测标记的孔，挑选六个较高的孔传至六孔板，等长满后再检测一次，取最高孔进行下一轮有限稀释，一共进行四轮。将筛选后的稳定高水平表达的克隆细胞株传至25cm²培养瓶，换用CD CHO Medium 37℃、5％CO₂培养过夜，以1×10e 5/瓶转入WHEATON-33滚瓶，加50ml培养基以2转/分钟速度37℃、5％CO²培养，至培养基变黄，传代。收集滚瓶培养上清。

2.3 鉴定sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表达：

2.3.1 ELISA检测取转染后48h的细胞培养上清液用双抗体夹心ELISA法检测hIFN-γ的表达、用直接ELISA法检测sTGFβRII的表达。

2.3.2 Western-blot检测

e 将50μl培养上清与等量2×SDS上样缓冲液(0.125mol/L Tris-HCl，20％Glycerol，4％SDS，0.2mol/L DTT，0.02％溴酚蓝)混合，煮沸10min。

SDS-PAGE：各孔中加入样品20μl，并加蛋白分子量Marker 5μl。110v稳流电泳，至溴酚蓝指示剂全部电泳至凝胶下缘，停止电泳。

l 蛋白电转移至PVDF膜：

将与凝胶大小相同的PVDF膜先后用甲醇和转膜缓冲液浸泡数分钟，滤纸、垫片用转膜缓冲液浸泡数分钟，PVDF贴于凝胶阳极面，两面再各覆盖一层滤纸，400mA稳压转110min。

l Western-blot检测：加兔抗sTβRII或小鼠抗IFNγ抗体4℃反应过夜，TBST漂洗4次每次10min，加入羊抗兔IgG-HRP(以TBST 1∶2000稀释)，室温反应1h。ECL显色，X线胶片曝光并显影。

2.4 sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的纯化将收集的滚瓶培养上清12000rpm离心30min，用Labscale TFF超滤装置纯化浓缩上清液，先后用100KD和10KD的膜包去除杂蛋白并浓缩上清液。超滤后上清用AKTA-100蛋白纯化仪进行纯化，先用HiTrap Desalting脱盐，脱盐后根据融合蛋白的等电点先后用阳离子交换层析和阴离子交换层析进行纯化，收集融合蛋白所在的峰。SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色后用凝胶扫描仪扫描检测样品纯度。收集的融合蛋白于Beckman DU640蛋白核酸分析系统进行定量，-80℃备用。融合蛋白于Savant真空低温干燥系统冻干后保存。

实验结果：

1.PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ的构建及鉴定

1.1 用所设计的引物扩增hIFN-γcDNA，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见预期大小(431bp)的特异性条带(见图2)。将其胶回收片段T-A克隆至TOPO克隆载体，所得TOPO-hIFN-γ质粒用EcoR I进行单酶切鉴定见到预期大小的4kb左右载体条带和430bp左右目的条带(见图3)。酶切阳性质粒测序(SANGON)，样本的所插入的hIFN-γ序列与标准序列(Genebank E00692)完全一致(见序列表1)。阳性质粒酶切产物胶回收以备进一步克隆。

1.2 sTGFβRII PCR产物经HindIII/BamH I双酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析(图3)，可见预期大小的(483bp)特异性条带；胶回收双酶切片段以备下一步克隆。

1.3 真核表达载体PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ的构建和鉴定将sTGFβRII与TOPO-hIFN-γ的HindIII/BamH I双酶切片段连接，获得sTGFβRII/hIFN-γ的融合基因，将其插入真核表达载体PCDNA3.1(+)的真核启动子CMV下游的HindIII/XhoI多克隆位点上，构建成真核表达质粒PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ。

1.3.1 TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ质粒鉴定HindIII/XbaI双酶切质粒产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见到1kb的左右的目的重组片段条带(sTGFβRII+hIFN-γ)和4kb左右的载体片段(3872bp)条带(见图4)，证实sTGFβRII/hIFN-γ融合基因重组在TOPO载体的HindIII和XbaI多克隆位点之间，成功构建了TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ质粒。

1.3.2 PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ质粒鉴定HindIII/XhoI双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图5)，可见1kb左右的目的片段和5.4kb左右的载体片段条带，证明sTGFβRII/hIFN-γ被插入到PCDNA3.1(+)载体的HindIII和XhoI位点之间；其核酸测序结果与预期序列完全一致(见序列表1)；此质粒进一步在分别含ampicillin和Neonycin的LB培养基中培养，均能良好生长，以上提示PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ构建准确无误。

2.sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的鉴定

PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ质粒转染dhfr-CHO细胞DG44 48h后所保留的细胞培养上清用双抗体夹心ELISA法检测hIFN-γ表达水平，A450值为2.27±0.18，空白对照A450值分别为0.07±0.01(p＜0.01)。用直接ELISA检测sTGFβRII，A450为1.78±0.51，空白对照A450分别为0.19±0.04(p＜0.01)。Western-blot显示，hIFN-γ和sTGFβRII在相同部位(约40kDa处)出现特异性条带，以上说明sTGFβRII/hIFN-γ融合基因已整合到细胞基因组，在DG44细胞培养上清中有sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表达。

3.获得稳定高效表达sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的DG44细胞株

3.1 转染PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重组质粒的DG44细胞在G418 800μg/ml加压筛选一周左右开始死亡，两周左右空白孔细胞全部死亡。将形成克隆的细胞经过有限稀释，挑选表达水平最高孔再用MTX5～1000nmol/ml加压筛选。随着MTX浓度升高，dhfr基因拷贝大量扩增，目的基因也随之大量扩增，sTGFβRII/hIFN-γ表达稳定上升，并达到峰值(图6)。当MTX浓度为500nM时，sTGFβRII/hIFN-γ表达量达到最大值，并随着浓度的增加sTGFβRII/hIFN-γ表达量不再上升，因此我们将500nM作为稳定筛选的MTX浓度。

3.2 加压筛选后的细胞再经有限稀释筛选出稳定高效的细胞株，总共进行了四轮有限稀释，第一轮有限稀释后，融合蛋白的表达水平大大增高，到第三轮稀释后表达水平基本稳定(图7)。筛选完毕后的细胞以1×10E5转入滚瓶培养。滚瓶培养期间用ELISA法跟踪检测上清中的hIFN-γ水平，显示表达水平稳定持续上升并达到峰值，最高表达量超过6ug/10⁵细胞/ml(图8)。获得稳定、高效表达sTGFβIIR/hIFN-γ融合蛋白的DG44细胞株。

4.TGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的纯化

将收集的滚瓶培养上清离心后，用Labscale TFF超滤装置纯化浓缩上清液，超滤后上清用AKTA-100蛋白纯化仪进行纯化，先用HiTrap Desalting脱盐，脱盐后根据融合蛋白的等电点先后用阳离子交换层析和阴离子交换层析进行纯化，收集融合蛋白所在的峰，检测蛋白纯度达80％以上。

为验证本发明sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白生物学活性以及实际使用效果，进行以下三部分试验：以下所有结果均以(

)表示，采用SPSS10软件进行双侧t检验分析。

一、sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白生物学活性的检测

1、sTGFβRII对TGFβ1的拮抗活性的检测：将Mv1Lu按1×10⁴接种于96孔板，待其贴壁后加入用hIFN-γ抗体(2μg/ml)预处理的不同浓度的融合蛋白和800pg/ml的人TGFβ1重组蛋白，37℃、5％CO₂培养72h，在培养结束前4h加MTT 50μl/孔(2mg/ml inPBS)，继续培养至72h，1000rpm离心10min，弃上清，加二甲基亚砜(DMSO)150μl/孔，振荡10min，于酶标仪570nm处读A值，检测Mv1Lu的生长状况。本实验连续检测3次，每次作3个复孔，设sTGFβRII活性封闭对照(加sTGFβRII抗体)、TGFβ1对照、空白对照。

2、hIFN-γ对NK细胞的刺激活性的检测：用不同浓缩度的融合蛋白预处理6h的正常人外周血淋巴细胞作为效应细胞，处于对数生长期的K562细胞作为靶细胞，采用LDH释放法(Cytotox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)检测NK细胞活性，操作按照说明书将淋巴细胞和K562细胞接种于96孔板(效、靶比为20∶1)。于37℃、5％CO₂培养4h后加底物液，室温避光30min后加终止液终止反应，于酶标仪490nm处测A值。本实验连续检测3次，每次作3个复孔，设空白对照。结果计算如下：

3、hIFN-γ的抗病毒活性的检测将处于对数生长期的WISH细胞按2×10⁴/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后加入以10％FCS DMEM系列稀释的sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白100μl/孔预处理孵育3h，加约500～1000TCID₅₀的VSV病毒25μl/孔，继续孵育至24h，用MTT法检测WISH细胞生长情况，设细胞对照孔、VSV病毒对照孔、rhIFN-γ对照孔、hIFN-γ活性封闭对照孔(加hIFN-γ抗体)。本实验重复3次，每次设3个复孔。

实验结果：

1 融合蛋白拮抗TGFβ1对Mv1Lu的生长抑制作用用不同浓缩度的sTGFβRII/hIFN-γ蛋白及一定量TGFβ1(800pg/ml)和Mv1Lu细胞共同哺育72h，经MTT法检测(图9)。10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml和0.1ng/ml的sTGFβRII/hIFN-γ蛋白各孔的A570值分别为1.633±0.09、1.603±0.07、1.203±0.07、0.61±0.04、0.44±0.04。各sTGFβRII/hIFN-γ蛋白孔和TGFβ1对照孔0.33±0.04比较有显著性差异(p＜0.01)；sTRII中和抗体孔和TGFβ1对照孔比较无显著差异(P＞0.1)。提示所表达的融合蛋白中的sTGFβRII能拮抗TGFβ1对Mv1Lu的生长抑制作用，说明本研究得到的融合蛋白具有拮抗TGFβ1生物学活性的作用。

2 融合蛋白刺激NK细胞杀伤活性 20∶1效靶比的淋巴细胞和K562细胞，在不同浓度的融合蛋白的作用下，用LDH释放法检测NK细胞活性(图10)。添加5ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0.5ng/ml融合蛋白的NK活性分别为(72.90±5.07)％、(68.67±9.38)％、(54.14±3.67)％、(35.92±3.81)％，与空白对照孔(18.05±6.09)％比较有显著性差异(p＜0.01)；添加0.1ng/ml融合蛋白的NK活性为(20.82±6.90)％，和空白孔比较无显著性差异(p＞0.1)。表明所表达的融合蛋白中的hIFN-γ能够刺激NK细胞的杀伤活性，得到的融合蛋白具有hIFN-γ生物学活性。

3 融合蛋白的抗病毒活性处于对数生长期的WISH细胞在不同稀释度融合蛋白及约500～1000TCID50的VSV病毒作用24h后，用MTT法检测hIFN-γ对WISH细胞的保护情况(图11)，加有10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml融合蛋白及rhIFN-γ对照的A570值分别为1.792±0.11、1.487±0.07、1.14±0.02、0.647±0.07、0.357±0.07、1.538±0.05，显著高于VSV病毒对照孔0.147±0.03(p＜0.01)，表明所表达的融合蛋白中的hIFN-γ具有抗病毒活性，得到的融合蛋白具有hIFN-γ生物学活性。

二、为验证可溶性TGFβII型受体(sTGFβRII)与人γ干扰素融合蛋白的体外抗肝纤维化作用，进行以下分子机制研究的试验：

1.主要试剂

l 重组TGFβ1标准品，R&D Systems；

l 各类抗体：IFN-γ兔多克隆抗体、TGFβRII兔多克隆抗体，CollagenI兔多克隆抗体、CollagenIII兔多克隆抗体、α-SMA小鼠单克隆抗体，Desmin小鼠单克隆抗体为Santa Cruz公司产品；Phospho-Samd2兔单克隆抗体，cell signaling technology公司产品；Smad2小鼠单克隆抗体、Smad7小鼠单克隆抗体为Abcam产品；羊抗小鼠FITC荧光二抗、羊抗兔FITC荧光二抗为Santa Cruz产品。

2.方法

2.1 sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白体外抗肝纤维化实验：

2.1.1 将HSC按1×10⁶接种于10cm的培养皿，待细胞贴壁，加不同浓度融合蛋白预处理2h后加入500pg/ml重组TGFβ1，37℃、5％CO₂培养72h。加200μl/dish的裂解液(10mmol/LTris-HCl pH＝7.4，150mmol/LNaCl，0.5％NP-40，0.1％SDS，0.5％胆酸钠，1mmol/L钒酸钠)，用机械法收集细胞，冰浴30min，10000rpm离心10min，取上清液加等量2×SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10min，按常规方法作CollagenI、CollagenIII、α-SMA的Western-blot分析。设空白对照、TGFβ1刺激对照、sTGFβRII对照和hIFN-γ对照。本实验重复3次，每次设2复孔。

2.1.2 将HSC按8×10³接种于24孔板，待细胞贴壁，加入10ng/ml浓度融合蛋白预处理2h后加入500pg/ml重组TGFβ1，37℃、5％CO₂培养72h。作空白对照、TGFβ1刺激对照。培养后细胞作CollagenI、CollagenIII、α-SMA、Desmin表达的间接免疫荧光细胞化学实验。

2.2 sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白体外抑制TGFβ1/SAMD信号通路实验将HSC按1×10⁶接种于10cm的培养皿，细胞长至80％满，加不同浓度融合蛋白预处理2h后加入500pg/ml重组TGFβ1，37℃、5％CO₂培养30min。加200μl/dish的裂解液(10mmol/LTris-HCl pH＝7.4，150mmol/LNaCl，0.5％NP-40，0.1％SDS，0.5％胆酸钠，1mmol/L钒酸钠)，用机械法收集细胞，冰浴30min，10000rpm离心10min，取上清液加等量2×SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10min，按常规方法作Westem-blot分析，检测SAMD2、磷酸化的SAMD2。作空白对照、TGFβ1刺激对照、sTGFβRII对照和hIFN-γ对照。本实验重复3次，每次设2复孔。SMAD7的检测方式同2.1.1。

实验结果：

1.HSC细胞在不同浓度的融合蛋白和一定量的TGFβ1(500pg/ml)共同作用72小时后，收集细胞做Western-blot比较各融合蛋白作用组、TGFβ1刺激、sTGFβRII和hIFN-γ对照及空白对照之间I型胶原、III型胶原、α-SMA。在本研究中Western-blot分析有显著差别。

2.HSC细胞在20ng/ml融合蛋白和一定量的TGFβ1(500pg/ml)共同作用72小时后，做间接免疫荧光细胞化学实验，比较融合蛋白作用组和TGFβ1刺激及空白对照之间I型胶原、III

型胶原、α-SMA。在本研究中间接免疫荧光细胞化学实验有显著差异。

3.HSC细胞在不同浓度的融合蛋白和一定量的TGFβ1(500pg/ml)共同作用30min后，收集细胞做Western-blot比较融合蛋白作用组、TGFβ1刺激组、sTGFβRII、hIFN-γ对照及空白对照之间SMAD2、Phospho-Smad2、Smad7。其中Phospho-Smad2有显著性差异。Smad2、Smad7个组之间无显著性差异。

三、为验证可溶性TGFβII型受体(sTGFβRII)与人γ干扰素融合蛋白的体内抗肝纤维化作用，进行以下动物试验：可溶性TGFβII型受体(sTGFβRII)与γ-干扰素融合蛋白抗大鼠肝纤维作用的试验。

按本发明的上述方法获得大鼠可溶性TGFβII型受体(sTGFβRII)与γ-干扰素融合的纯化蛋白并经体外活性鉴定，然后进行以下动物试验：

试验材料：

1.实验动物：雄性Sprague Dawley大鼠120只，6～7周龄，重135～150g，由中科院上海实验动物中心提供。

2.Recombinant Rat RIFN-γ：R&D公司产品。

3.四氯化碳(CCl₄)：上海凌峰化学试剂有限公司产品。

4.山茶油：浙江省江山市绿土源粮油食品有限公司产品。

5.即用型SABC免疫组化染色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品。

6.天狼猩红染料：由本所配制，常规保存。

7.PCR引物：根据Genebank登录的Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII和β-actin全部或部分cDNA序列设计引物，由上海生物工程技术公司合成。见表1，

表1PCR引物

Table 1 Sequences of PCR primers used in this study

TargetGenes	Primers	Primer Sequences	ProductSize(bp)
TargetGenes	Primers	Primer Sequences	ProductSize(bp)	α-SMA	P1P2	AGGGAGTAATGGTTGGAATGGGGGAGTACGGTACGCAGA	457

Col IIITGFβ1TGFβRIIβ-actin

P1P2P1P2P1P2P1P2

TGGTCCTCAGGGTGTAAAGGGTCCAGCATCACCTTTTGGTCACCATCCATGACATGAACCTCATGTTGGACAACTGCTCCCGTGTGGAGGAAGAACAACATCTCAAACTGCTCTGAGGTGCGCTGCGCTGGTCGTCGACAGTCACGCACGATTTCCCGCT

220404560619

试验过程：

1.肝纤维化模型的建立将CCl4用等体积的山茶油配成50％浓度的混合液，除正常组外，从第0天开始按0.3ml/100g体重背部皮下注射，每周一、四两次给药，持续8周，每周根据体重调整药量，以诱导慢性肝损伤和肝纤维化，六组均给予正常饮食。CCl₄皮下注射后第8周，处死六只大鼠取肝组织行组织病理学检查，治疗结束后两周处死所有大鼠，取肝脏，一部分用10％福尔马林固定，石蜡切片。另一部分-80℃冻存。

2.治疗将肝纤维化模型大鼠(n＝130)随机分为5组，每组26只，分入A、B、C、D、E组，另设正常对照一组Nor组(n＝10)。根据第一部分测定的RsTβRII-IFN-γ融合蛋白中RsTβRII及RIFN-γ的活性，融合蛋白的量采用每次每只大鼠0.136mg，RsTβRII的量采用每次每只大鼠0.048mg，并根据文献资料，IFN-γ采用每次每只大鼠7.5万IU。

□ A组(RsTβRII-IFN-γ重组融合蛋白治疗组)隔天注射一次，融和蛋白的量：每次每只大鼠肌肉注射0.136mg，共持续8周；

□ B组(IFN-γ治疗组)隔天注射一次，每次每只大鼠肌肉注射IFN-γ7.5万IU，共持续8周；

□ C组(可溶性受体蛋白RsTβRII治疗组)隔天注射一次，每次每只大鼠肌肉注射RsTβRII 0.048mg，共持续8周；

□ D组(IFN-γ+可溶性受体蛋白RsTβRII治疗组)隔天注射一次，每次每只大鼠肌肉注射RIFN-γ7.5万IU+RsTβRII 0.048mg，共持续8周；

□ E组(未处理的肝纤维化组)隔天注射生理盐水100μl/只；

□Nor(正常对照组，N组)：不作任何处理，自由饮食，共持续8周；

皮下注射方法：皮下注射给药部位是真皮和皮下结缔组织之间，常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，用1ml注射器吸取蛋白质溶液，75％酒精常规消毒大鼠注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。

结果观察

2.1HE染色观察大体病理变化，40×镜下观察肝纤维化程度。

2.2天狼猩红Siriured染色法观察I、III型胶原，100×镜下观察肝纤维化程度。

2.3免疫组织化学检测大鼠肝组织Col III、α-SMA、TGFβ1及TGFβRII的表达

2.4荧光定量RT-PCR检测大鼠肝组织Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII表达大鼠股动脉放血处死，取肝组织约1g，-80℃保存。

l 大鼠肝脏总RNA的提取

l cDNA第一链的合成以总RNA为模板合成cDNA第一链

l 荧光定量PCR(Light Cycler FastStart SYBR Green I Master，Roche)检测ColIII、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA表达水平每个Light Cycler PCR(15μl)反应体系为：1.5μl Light Cycler FastStart DNA Master Mix，1.8μlMgCl2(25mM)，0.4μl of each primer(10μM)，2μl经10倍稀释的cDNA，9.3μl H2O。PCR程序为95℃预变性10min；94℃变性10sec，65℃复性15sec，72℃延伸15sec，扩增50个循环；PCR产物95℃变性1min后迅速降温至55℃维持30sec，缓慢升温(0.1℃steps)至95℃，收集荧光信号，熔解曲线分析。结果以目的基因与相应的β-actin比值表示。反应结束后，取5μl PCR产物作琼脂糖凝胶(1.5％)电泳检测。

2.5 Western Blotting检测大鼠肝组织Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII蛋白表达

l 组织蛋白的提取，蛋白的定量

l SDS-PAGE和Western Blot

实验结果：

1.同步构建了大鼠sTβRII-IFN-γ融合蛋白表达载体。

2.体外细胞生物学实验：表达的RsTβRII-IFN-γ融合蛋白具有抵抗VSV对L929细胞的破坏作用及拮抗TGFβ对CCL-64细胞的增殖抑制作用，证明该融合蛋白同时具有sTβRII和IFN-γ的生物学活性：测定了RsTβRII-IFN-γ融合蛋白中RIFN-γ的活性单位，为：1mgRsTβRII-IFN-γ融合蛋白中RIFN-γ的效价为55万IU；测定了RsTβRII的比活性，得出RsTβRII-IFN-γ融合蛋白50％抑制率的用量是52.8ng/ml，单纯RsTβRII蛋白为18.6ng/ml，两者比值：2.84∶1。

3.动物实验：

(1)组织病理学肝纤维化模型大鼠分别给予肌肉注射重组融合蛋白RsTβRII-IFN-γ、RIFN-γ、可溶性受体蛋白RsTβRII、RIFN-γ+可溶性受体蛋白RsTβRII或生理盐水，隔天一次，持续8周。最后一次给药后2周处死全部大鼠，取部分肝组织，用10％福尔马林固定，石蜡切片，采用HE和天狼猩红纤维染色法观察肝纤维化程度。在HE和天狼猩红纤维染色的切片中均可见到E组和C组中央静脉扩张，大量纤维结缔组织(胶原)分割包绕肝小叶，形成假小叶，并可见大量结节。在天狼猩红纤维染色的片子中，胶原纤维在普通光镜下呈鲜红色，而A、B、D组纤维成分(胶原)较少，其中A组纤维成分(胶原)较B、D组更少，说明A组纤维化程度明显较其余各组轻。

(2)免疫组织化学检测大鼠肝组织Col III、α-SMA、TGFβ1及TGFβRII的表达

肝纤维化模型大鼠分别给予肌肉注射重组RsTβRII-IFN-γ融合蛋白、RIFN-γ、RsTβRII可溶性受体蛋白、RIFN-γ+RsTβRII可溶性受体蛋白或生理盐水，隔天一次，持续8周。最后一次给药后2周处死全部大鼠，取部分肝组织，用10％福尔马林固定，石蜡切片，采用免疫组织化学染色的方法观察Col III，α-SMA、TGFβ1及TGFβRII的表达。E组和C组这四个分子的表达均较高，A、B、D组表达较少，其中A组表达较B、D组更少，说明A组纤维化程度明显较其余各组轻。

(3)RT-PCR检测大鼠肝组织Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA表达大鼠肝脏组织提取总RNA，逆转录生成cDNA，分别用大鼠Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII引物PCR扩增，并与内参照β-actin比较，结果显示A、B、D组大鼠肝脏Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA表达水平较C组和E组低，其中A组最低，见图12。定量分析也表明了同样的结果，见图13。

(4)Western Blotting检测大鼠肝组织中Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII表达

提取大鼠肝组织蛋白，用western blotting检测Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII，ECL显色后与内参照β-actin比较，可见RsTβRII-IFN-γ融合蛋白治疗组(A组)这四个蛋白的表达量明显低于其余治疗组。见图14。

以上试验结果表明：

1.成功构建了PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ真核表达质粒。

2.获得高效、稳定表达具有生物学活性的sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的DG44细胞株。

3.建立了大规模无血清滚瓶培养体系及融合蛋白的大量表达及纯化。

4.体外细胞生物学实验：表达纯化的sTGFβRII/hIFN-γ重组融合蛋白分别具有sTGFRII和IFN-γ生物学活性，在体外能够显著抑制TGFβ诱导的肝星状细胞的活化，抑制细胞外基质的合成。

5.动物实验证实，sTGFβRII/hIFN-γ重组融合蛋白能显著减轻大鼠肝纤维化模型的肝纤维化程度，具有明显的抗肝纤维化作用。

研究结果

1.PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ进行酶切鉴定和测序分析结果与预期一致，说明成功构建了PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ真核表达质粒。

2.分析PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ转染DG44细胞后的蛋白表达。ELISA检测显示(OD值450nm)重组质粒的表达上清中hIFN-γ和sTGFβRII显著高于空白对照(p＜0.01)；Western-blot分析显示hIFN-γ和sTGFβRII在相同部位(约40kDa处)出现特异性条带；表明在DG44细胞培养上清中有sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表达。

3.转染的DG44经过多次有限稀释培养，上清中hIFN-γ维持在较高水平，表明获得高效、稳定表达的DG44细胞株。滚瓶培养最高达6ug/10⁵细胞/ml。用Labscale TFF超滤装置和AKTA-100纯化仪纯化的融合蛋白纯度达80％以上。

4.sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白生物学活性：将融合蛋白和TGFβ1与Mv1Lu共同孵育后，显著拮抗TGFβ1的增殖抑制作用；与正常人淋巴细胞共同孵育，融合蛋白能明显刺激NK细胞活性；和VSV病毒与WISH细胞一起孵育，能显著抑制VSV引起的WISH细胞病变。表明获得的融合蛋白具有sTGFβRII和hIFN-γ的生物学活性。

5.sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白体外抗肝纤维化分子机制：将融合蛋白和TGFβ1与HSC一起孵育，发现能显著抑制TGFβ1刺激诱导的SMAD2/3磷酸化，也能明显减少TGFβ1刺激诱导的HSC的ColI、ColIII、α-SMA、Desmin表达，表明该融合蛋白通过抑制TGFβ1/SAMD信号通路抑制HSC活化和胶原合成，有抗肝纤维化潜力。

6.动物实验：同步构建的大鼠sTβRII-IFN-γ融合蛋白治疗大鼠肝纤维化，能明显减少CCl₄诱导的大鼠HSC活化，减少α-SMA、TGFβ1、TβRII和Col III等ECM的表达，减轻肝纤维化程度，效果较单独使用RsTβRII蛋白、RIFN-γ或RsTβRII与RIFN-γ混合应用更明显。证明sTβRII/IFN-γ融合蛋白具有一定的抗肝纤维化作用。

序列表SEQID NO.1：sTGFβRII/hIFN-γ融合基因测序结果及相应氨基酸序列

1. ATG GGT CGG GGG CTG CTC AGG GGC CTG TGG

M G R G L L R G L W

31 CCG CTG CAC ATC GTC CTG TGG ACG CGT ATC

P L H I V L W T R I

61 GCC AGC ACG ATC CCA CCG CAC GTT CAG AAG

A S T I P P H V Q K

91 TCG GTT AAT AAC GAC ATG ATA GTC ACT GAC

S V N N D M I V T D

121 AAC AAC GGT GCA GTC AAG TTT CCA CTG TGT

N N G A V K F P Q L

151 TGT AAA TTI TGT GAT GTG AGA TIT TCC ACC

C K F C D V R F S T

181 TGT GAC AAC CAG AAA TCC TGC ATG AGC AAC

C D N Q K S C M S N

211 TGC AGC ATC ACC TCC ATC TGT GAG AAG CCA

C S I T S I C E K P

241 CAG GAA GTC TGT GTG GCT GTA TGG AGA AAG

Q E V C V A V W R K

271 AAT GAC GAG AAC ATA ACA CTA GAG ACA GTT

N D E N I T L E T V

301 TGC CAT GAC CCC AAG CTC CCC TAC CAT GAC

C H D P K L P Y H D

331 TTT ATT CTG GAA GAT GCT GCT TCT CCA AAG

F I L E D A A S P K

361 TGC ATG ATG AAG GAA AAA AAA AAG CCT GGT

C I M K E K K K P G

391 GAG ACT TTC TTC ATG TGT TCC TGT AGC TCT

E T F F M C S C S S

421 GAT GAG TGC AAT GAC AAC ATC ATC TTC TCA

D E C N D N I I F S

451 GAA GAA TAT AAC ACC AGC ATT CCT GAC TTG

E E Y N T S N P D L

481 GAT CCA CTA GTA ACG GCC GCC AGT GTG CTG

D P L V T A A S V L

511 GAA TTC GCC CTT TCT CTT GGC TGT TAC TGC

E F A L S L G C Y C

541 CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC

Q D P Y V K E A E N

571 CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA

L K K Y F N A G H S

601 GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA

D V A D N G T L F L

631 GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT

G I L K N W K E E S

661 GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC

D R K I M Q S Q I V

691 TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT

S F Y F K L F K N F

721 AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG

K D D Q S I Q K S V

751 GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG

E T I K E D M N V K

781 TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT

F F N S N K K K R D

811 GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA

D F E K L T N Y S V

841 ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA

T D L N V Q R K A I

871 CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG

H E L I Q V M A E L

901 TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA

S P A A K T G K R K

931 AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT AAG GGC

R S Q M L F R G K G

961 GAA TTC TGC AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG

E F C R Y P S H W R

991 CCG CTC GAG AGA GGG CCC GAA CAA AAA CTC

P L E R G P E Q K L

1021ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT AGC GCC GTC

I S E

1051GAC TAG

Claims

1、可溶性转化生长因子β II型受体/γ-干扰素重组融合蛋白，其特征在于其核苷酸序列和相应氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所述。

2、按权利要求1所述可溶性转化生长因子β II型受体/γ-干扰素重组融合蛋白的制备方法为如下步骤：

(1)构建sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表达载体；

(2)聚合酶链反应(PCR)扩增IFN-γ；

(4)鉴定sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表达；

(5)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的纯化。

3、按权利要求1所述可溶性转化生长因子β II型受体/γ-干扰素重组融合蛋白应用于制备抗肝纤维化药物。