CN108913689A - 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统 - Google Patents

靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统 Download PDF

Info

Publication number
CN108913689A
CN108913689A CN201810009392.6A CN201810009392A CN108913689A CN 108913689 A CN108913689 A CN 108913689A CN 201810009392 A CN201810009392 A CN 201810009392A CN 108913689 A CN108913689 A CN 108913689A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
artificial
gene
targeting
shrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810009392.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108913689B (zh
Inventor
汪海健
贺福初
姜燕
赵园园
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Original Assignee
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University filed Critical Fudan University
Priority to CN201810009392.6A priority Critical patent/CN108913689B/zh
Publication of CN108913689A publication Critical patent/CN108913689A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108913689B publication Critical patent/CN108913689B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种靶向肝星状细胞同时双敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统，其在肝星状细胞(HSC)特异性的GFAP启动子控制下能够抑制Pdgfrβ和TβrII基因的表达，且其高度的靶向性和灵敏性，在肝纤维化的治疗方面有很好的临床应用前景。

Description

靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载 体系统
技术领域
本发明涉及一种靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统，以及它们在治疗肝纤维化方面的应用，属于生物医药领域。
背景技术
肝脏纤维化是大多数慢性肝病的共同特征，以细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的过度累积为特点，肝纤维化进展为肝硬化是发生肝相关的严重疾病及死亡的主要原因。在纤维化的过程中，受伤的肝细胞释放促纤维化细胞因子并激活毗邻的静息肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)，HSCs是响应肝损伤和参与创伤修复的主要的肝间充质细胞类型。HSCs从静息的类似于脂肪细胞的状态分化转化为肌成纤维细胞与其显著的形态学和生物学改变相关，例如收缩、纤维增生加强、胶原过度沉积以及ECM累积。HSCs是所有肝病类型中抗纤维化治疗的主要细胞靶标，调控HSCs活化和增殖的主要的促纤维化信号通路主要有转化生长因子β1(TGF-β1)和血小板源性生长因子(PDGF)通路，都是很有潜力的肝纤维化治疗靶点。
TGF-β1是一个明确的促纤维化细胞因子，它能够促进HSCs的活化。TGF-β1通过在细胞膜上形成II型(TGFβR2或TβRII)和I型(TβRI)丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合物来激活HSCs，该复合物随后招募并磷酸化SMAD蛋白。然后活化的SMAD复合物转位进入胞核，调节下游参与HSCs分化转化及细胞凋亡、ECM合成与降解的目的基因的转录。在TGF-β1的控制下，TβRII被激活，I型受体反式磷酸化从而激活它的激酶，因此它是一个启动者，并且是典型TGF-β/SMAD信号通路的关键部分。
当HSCs被激活后，若干生长因子和细胞因子，诸如PDGF，调控活化HSC的增殖。作为激活HSCs的最有效的促有丝分裂细胞因子，PDGF-BB主要结合受体PDGFR-β，激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)以及磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/Akt/P70S6K信号来促进HSCs增殖。
综上，由于在肝脏纤维化中TGF-β1和PDGF通路功能的融合与相互调控，有一些科学家们针对促肝纤维化的细胞因子TGF-β1和PDGF通路中的多种组分，来研发肝纤维化基因靶向治疗的方法，例如，人源化抗体、复合抑制剂、负显性可溶性受体，以及尤其是RNA干扰等。
关于RNA干扰技术，最近一个重大进展就是人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA)的应用。这种方法的基本原理是使用设计好的特异定位靶基因的shRNA在pre-miRNA茎环中替换掉成熟miRNA的序列，它可以将人工合成的发夹结构插入到天然miRNA骨架中，使用相同的细胞miRNA生物学机制加工成有效的miRNA。
AmiRNA方案与基于siRNA或shRNA的传统的RNAi方法相比具有若干优点，它具有高度灵敏性、可控性和较少的脱靶效应。
本领域技术人员希望能够开发出一种AmiRNA方案，该方案可以应用于针对TGF-β1和PDGF通路的靶向肝星状细胞的基因治疗。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明一方面提供一种靶向肝星状细胞的人工miRNA，所述人工miRNA具有miRNA骨架的二级结构，且其包含两个shRNA干扰单位，其中一个shRNA干扰单位为靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位，另一个shRNA干扰单位为靶向TβrII基因的shRNA干扰单位，两个shRNA干扰单位之间通过链接序列连接，其中，所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示，并且，所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示；或者，所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ ID NO.6所示，并且，所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.7所示，反义链序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述人工miRNA是在pri-miR-30a骨架基础上进行改造获得的miRNA骨架结构，且两个shRNA干扰单位之间的链接序列的长度为80-100bp。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位靠近5’端，所述靶向TβrII基因的shRNA干扰单位靠近3’端；且所述人工miRNA的全长序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
本发明再一方面提供了一种靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统，所述载体系统是通过将上述的人工miRNA插入到一miRNA表达载体的多克隆位点中构建形成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述miRNA表达载体为慢病毒miRNA表达载体，且其启动子被替换成GFAP启动子。
在本发明的更一个优选实施方案中，所述GFAP启动子为人GFAP启动子。
本发明再一方面提供了一种靶向肝星状细胞的载体系统的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
步骤1a，人工合成如权利要求2所述的人工miRNA；
步骤1b，提供慢病毒miRNA表达载体：将慢病毒载体pLenti-CMV-microRNA-EGFP-T2A-Puro中的原始启动子替换成人GFAP启动子作为慢病毒miRNA表达载体；
步骤2，将所述步骤1a合成的人工miRNA插入到所述步骤1b提供的慢病毒miRNA表达载体内位于EGFP基因的内含子中的多克隆位点，且所述多克隆位点连接人工miRNA的酶切位点为NdeⅠ和BamHⅠ；
上述步骤1a与步骤1b，两个步骤不分先后。
本发明还一方面提供了上述人工miRNA在制备肝纤维化基因治疗药物方面的用途。
本发明还一方面提供了上述的载体系统在制备肝纤维化基因治疗药物方面的用途。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述的载体系统和药用载体。
关于本发明申请文件中术语的定义：
术语“人工miRNA”，是指人工设计合成的miRNA(artificial micro RNA)。人们根据自然的micro RNA对靶基因表达的干扰沉默作用，参考自然micro RNA的序列结构，人为地合成设计靶向致病基因的micro RNA，使其即能够在体内表达，又具有干扰靶基因的作用，这种人工miRNA具有靶向性和有效性，是未来临床药物设计的一个有前景的方向。
关于术语“miRNA骨架”的解释：成熟的miRNA的初级转录物称为pri-miRNA，pri-miRNA的长度从几百到几千个碱基不等，具有5’CAP结构及3’polyA，由polⅡ启动子转录。转录后的pri-miRNA形成二级结构，RNA酶复合体DGCR8/Drosha识别pri-miRNA二级结构中的发卡结构，并进行酶切，形成pre-miRNA。人的pre-miRNA约70bp，包含5’和3’的反向重复序列以及接连的loop序列。最后由Dicer酶切割pre-miRNA，形成成熟的miRNA，约22bp。本案中的miRNA骨架是基于pri-miRNA的序列设计合成，其中包含5’短的CAP结构及3’端的polyA以及连接两个pre-miRNA的链接序列，能形成稳定的二级结构，提供DGCR8/Drosha酶的结构识别。
术语“shRNA干扰单位”，是指短发卡RNA(short hairpin RNA)，其包括5’和3’的反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列连接，组成发夹结构，一般来说由polⅢ启动子启动转录，其能够被Dicer酶识别切割形成成熟的miRNA。
关于术语“链接序列”的解释，在本案中，链接序列连接两个shRNA干扰单位(pre-miRNA茎环结构)，链接序列要求与3’端序列形成部分配对，具有维持二级结构稳定性及隔离两个shRNA干扰单位的作用。
术语“Pdgfrβ基因”是指血小板衍生生长因子受体β(platelet derived growthfactor receptor beta)的基因。血小板衍生生长因子受体β是细胞因子Pdgf的受体，位于细胞膜上，主要功能传递Pdgf信号(Pdgf信号通路的作用是促进细胞的分裂和增值)。Pdgfrβ基因的序列参见网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001146268.1。
术语“TβrII基因”，是指转化生长因子β受体Ⅱ(transforming growth factor,beta receptor II)的基因。转化生长因子β受体Ⅱ是转化生长因子TGFβ在细胞膜上的受体，其通过磷酸化将外界信号传递到细胞内，激活TGFβ信号通路(TGFβ信号通路参与细胞增值、分裂和凋亡等多种功能的调控，是HSC活化的最主要的促进因素)。TβrII基因序列的网址参见：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_009371.3。
术语“pri-miR-30a骨架”，是指存在人类的自然micro RNA，其骨架序列常常用来作为人工miRNA的骨架，例如将miR-30a的有效干扰序列即反向重复序列换成靶基因的shRNA系列，使靶基因的shRNA能够像miR-30a一样，在宿主体内正常转录，并剪切成成熟的miRNA。
术语“GFAP启动子”，是指胶质细胞原纤维酸性蛋白基因启动子(glialfibrillary acidic protein promoter)，GFAP启动子在星状细胞特异表达，尤其在神经系统中的神经胶质细胞中表达丰富。在肝组织中，GFAP特异性的在肝形状细胞中表达，因此在靶向治疗肝纤维化的研究中，GFAP启动子常常被用作靶向肝星状细胞的特异的启动子。
本发明提供了一种靶向肝星状细胞同时双敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统，其在肝星状细胞(HSC)特异性的GFAP启动子控制下能够抑制Pdgfrβ和TβrII基因的表达，且其高度的靶向性和灵敏性，在肝纤维化的治疗方面有很好的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例1的人工miRNA的二级结构简要示意图；
图2为本发明的实施例3的载体系统构建过程的示意图；
图3为细胞增殖实验结果图(本发明实施例3构建的载体系统病毒颗粒感染JS1细胞获得的稳定细胞株的细胞增殖实验结果图)；
图4为western blot检测JS1细胞中蛋白表达(Pdgfrβ、TβrII、α-Sma和Col1a蛋白表达水平)的实验结果分析图；
图5为western blot检测大鼠原代HSC细胞中蛋白表达(Pdgfrβ、TβrII、α-Sma和Col1a蛋白表达水平)的实验结果分析图；
图6和图8为免疫荧光实验结果图(本发明实施例3构建的载体系统病毒颗粒感染CCl4诱导的肝纤维化小鼠，肝组织冷冻切片进行免疫荧光实验检测人工miRNA及Pdgfrβ和TβrII在肝组织的表达分布)；
图7和图9为免疫荧光实验结果图(对照病毒颗粒感染CCl4诱导的肝纤维化小鼠，肝组织冷冻切片进行免疫荧光实验检测人工miRNA及Pdgfrβ和TβrII在肝组织的表达分布)；
图10为血清谷丙转氨酶活性检测实验结果图(本发明实施例3构建的载体系统病毒颗粒感染CCl4诱导的肝纤维化小鼠，小鼠血清的谷丙转氨酶活性检测结果)
图11为MASSON染色结果图(本发明实施例3构建的载体系统病毒颗粒感染CCl4诱导的肝纤维化小鼠，小鼠肝组织石蜡切片的MASSON染色结果)
图12为α-Sma的免疫组化染色结果图(本发明实施例3构建的载体系统病毒颗粒感染CCl4诱导的肝纤维化小鼠，小鼠肝组织石蜡切片的α-Sma的免疫组化染色结果)。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。
关于本发明的靶向肝星状细胞的人工miRNA设计理念以及技术难题简述如下：
关于靶向基因的选择，发明人旨在能够开发一种针对TGF-β1和PDGF通路的miRNA方案以应用于的靶向肝星状细胞的基因治疗，然而存在一些技术难题，例如，HSC活化的调控，除TGF-β1和PDGF外，还有很多其他信号通路参与调控，另外TGF-β1和PDGF信号通路中也涉及很多其他基因。所以在靶向基因的选择上，发明人研究了与TGF-β1通路、PDGF通路、以及与肝纤维的活化过程和增殖过程的所有其他信号分子，筛选对于肝纤维化基因治疗更有针对性的靶基因；另一方面，虽然已有研究表明用特定基因的shRNAs取代人类miRNA骨架的反向重复序列，可以实现对特定基因的干扰，然而是否能够将靶向两个基因的shRNA串联构建形成miRNA骨架(稳定的二级结构)，构建形成的miRNA骨架是否能够在体内有效转录，是否能够同时干扰两个基因的表达，目前还没有报道。
基于以上问题，发明人希望可以筛选出两个对于肝纤维化基因治疗更有针对性的靶基因，并且尝试这两个靶基因的shRNAs序列可以分别构建shRNA干扰单位，尝试将两者串联，再镶嵌到pri-miRNA骨架中构建形成稳定的miRNA骨架的二级结构，实现同时敲低这两个靶基因的表达；为此，发明人做了大量的研究与探索，发现Pdgfrβ基因和TβrII基因可以成为一对绝佳的组合，发明人利用Sigma公司提供的shRNAs数据库设计了数个这两个靶基因对应的shRNA干扰单位，将两个干扰单位串联的同时，在pri-miRNA骨架基础上进行改造，构建形成串联了两个干扰单位的miRNA骨架(具有稳定的二级结构)，再一一验证其敲低效率，发现实现了靶向肝星状细胞的Pdgfrβ和TβrII基因的双敲低。
具体来说，本发明的发明人提供了一种靶向肝星状细胞的人工miRNA，其中，所述人工miRNA具有miRNA骨架的二级结构，且其包含两个shRNA干扰单位，
其中一个shRNA干扰单位为靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位，
另一个shRNA干扰单位为靶向TβrII基因的shRNA干扰单位，
两个shRNA干扰单位之间通过链接序列连接，
其中，所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示，并且，所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示；或者，
所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ ID NO.6所示，并且，所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.7所示，反义链序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述人工miRNA是在pri-miR-30a骨架基础上进行改造获得的miRNA骨架结构，且两个shRNA干扰单位之间的链接序列的长度为80-100bp。
关于基础骨架(原始骨架)的选择，以及如何在基础骨架上进行改造，使得两个干扰单位能够串联在骨架上，并最终形成稳定的骨架二级结构，这也是一个要解决的技术难题。发明人经过大量的尝试，当选择pri-miR-30a骨架作为基础骨架，并且两个shRNA干扰单位之间的链接序列的长度为80-100bp时，能够形成稳定的骨架二级结构。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位靠近5’端，所述靶向TβrII基因的shRNA干扰单位靠近3’端；且所述人工miRNA的全长序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
1、合成靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的人工miRNA
实施例1：
在本实施例中，发明人委托上海华津生物科技有限公司合成了实施例1的人工miRNA，以下简称amiR-PT1；
amiR-PT1全长如SEQ ID NO.9所示，共358bp，其在pri-miR-30a的骨架基础上进行改造，获得了串联了两个shRNA干扰单位的miRNA骨架，且具有稳定的二级结构；其中，靠近5’端的为靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位，靠近3’端的为靶向TβrII基因的shRNA干扰单位；靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示；靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ IDNO.4所示。
另外，amiR-PT1序列的5’端具有NdeⅠ的酶切位点，3’端具有BamH1的酶切位点。
实施例1的人工miRNA的二级结构简要示意图参见图1，其中，标注Sh-TβrII的方框表示靶向TβrII基因的shRNA形成的发夹结构，标注Sh-Pdgfrβ的方框表示靶向Pdgfrβ基因的shRNA形成的发夹结构。
实施例2：
在本实施例中，发明人委托上海华津生物科技有限公司合成了实施例2的人工miRNA，以下简称amiR-PT2；
amiR-PT2全长如SEQ ID NO.10所示，其中，其在pri-miR-30a的骨架基础上进行改造，获得了串联了两个shRNA干扰单位的miRNA骨架，且具有稳定的二级结构；其中，靠近5’端的为靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位，靠近3’端的为靶向TβrII基因的shRNA干扰单位；靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ ID NO.6所示，靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.7所示，反义链序列如SEQ ID NO.8所示。
另外，amiR-PT2序列的5’端具有NdeⅠ的酶切位点，3’端具有BamH1的酶切位点。
实施例2的人工miRNA的二级结构同实施例1的，具体不再赘述。
实施例3：构建靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统
下面以实施例1的人工miRNA为例，介绍载体系统的构建过程。
具体的构建过程示意图参见图2。
步骤1a，获取实施例1合成的人工miRNA(amiR-PT1)；
步骤1b，提供慢病毒miRNA表达载体：将慢病毒载体pLenti-CMV-microRNA-EGFP-T2A-Puro中的原始启动子替换成人GFAP启动子作为慢病毒miRNA表达载体；具体内容如下：
慢病毒载体pLenti-CMV-microRNA-EGFP-T2A-Puro，购自上海和元生物公司；
以人的基因组DNA为模板，扩增GFAP启动子序列，扩增长度为2261bp(以转录起始位点为0，序列包含-2216BP到+45BP)；PCR引物两端携带酶切位点(MluⅠ和PstⅠ)序列；将扩增GFAP启动子的PCR产物以及步骤1b提供的慢病毒载体经MluⅠ和PstⅠ酶切，连接后，再转化到感受态大肠杆菌TOP10，获取阳性克隆(阳性克隆的基因送入上海华津生物科技有限公司测序确认)；对获得的阳性克隆进行质粒抽提和纯化操作(采用MACHEREY-NAGEL公司的质粒抽试剂盒，货号是：740412.50，具体操作步骤参见产品说明书)，获得的纯化后的质粒为上述的GFAP启动的靶向HSC的慢病毒miRNA表达载体；
上述步骤1a与步骤1b，两个步骤不分先后；
步骤2，将所述步骤1a获得的人工miRNA插入到所述步骤1b提供的慢病毒miRNA表达载体内位于EGFP基因的内含子中的多克隆位点，且所述多克隆位点连接人工miRNA的酶切位点为NdeⅠ和BamHⅠ；
将步骤1a获得的人工miRNA经由NdeⅠ和BamHⅠ酶切，将步骤1b提供的慢病毒miRNA表达载体经由NdeⅠ和BamHⅠ酶切，再将两者的酶切产物连接，连接后再转化感受态大肠杆菌TOP10，获取阳性克隆(阳性克隆的基因送入上海华津生物科技有限公司测序确认)；
对获得的阳性克隆进行质粒抽提和纯化操作(采用MACHEREY-NAGEL公司的质粒抽试剂盒，货号是：740412.50，具体操作步骤参见产品说明书)，获得纯化后的重组质粒为本发明的GFAP启动的靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统(以下简称重组质粒pLenti-amiR-PT1)。
同样的，也可以采用人工miRNA(amiR-PT2)来构建重组质粒pLenti-amiR-PT2，具体方法同上，不再赘述。
关于本发明的靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统(重组质粒pLenti-amiR-PT1)的生产
将上述获得的重组质粒pLenti-amiR-PT1转染293T细胞，转染试剂为Lipo2000(购自invitrogen公司)，转染后48小时，收集上清，即为病毒原液，1000rpm离心去除杂质，再进行20000rpm的高速离心2h，沉淀即为病毒颗粒pLenti-amiR-PT1。
同样的，也可以采用同样的方法来生产重组质粒pLenti-amiR-PT2，具体不再赘述。
关于本发明的靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统感染细胞
1)大鼠原代肝星状细胞的分离和纯化
原位消化：雄性SD大鼠约300克，用3％戊巴比妥600μl麻醉，仰卧固定。75％酒精消毒皮毛，剪去外层皮毛，行十字型剖腹术暴露内脏。暴露门静脉，于近肝脏处穿细丝线和远肝处穿粗丝线，同时暴露下腔静脉，于近肝处穿粗丝线。18G留置针行门静脉穿刺，退出针芯，结扎两处丝线固定留置管。留置管与通过蠕动泵的管子连接，用不含Ca2+、Mg2+的D-hanks液灌注以冲洗肝脏血液，灌注的速度为60rmp/min。肝脏肿胀变大，颜色由深红变黄，停止灌注，沿远离肝脏部位(穿丝线的远肝处)剪开下腔静脉，放出血液和D-hanks液的混合液，如上反复灌注几次直到肝脏颜色变白。换预热到37℃的链酶蛋白酶灌注，待肝脏膨胀变硬后，扎紧下腔静脉处的丝线，让酶液在肝组织中停留并充分消化肝实质细胞，反复消化几次后，换Ⅳ型胶原酶灌注，消化肝脏胶原等结缔组织成分，方法同前。待肝脏软化后停止灌注。
细胞分散：快速摘下肝脏，撕除肝包膜及结缔组织，放入盛有胶原酶/链酶蛋白酶分散液的硅化三角烧瓶内，加入4μL DNA酶溶液。200r/min，37℃恒温振荡30min，通过机械用力及酶消化进一步分散肝脏组织细胞。
细胞纯化：将振荡分散后的细胞悬液通过200目细胞过滤筛，过滤入50mL聚丙烯离心管。每管加入0.5～1μL DNA酶溶液，4℃，50rcf离心3min，离心洗涤3～4次，保留。
另外，发明人还进行了小鼠原代肝星状细胞的分离和纯化，具体操作同上，具体不再赘述。
2)小鼠肝星状细胞系JS1，由复旦大学中山医院消化内科提供。
3)病毒感染细胞
选取培养生长状态良好的目的细胞(上述获得的大鼠肝星状细胞及小鼠的肝星状细胞系JS1)，将浓缩纯化后的病毒颗粒液体pLenti-amiR-PT1、pLenti-amiR-PT2以及对照病毒pLenti-amiR-NC(该对照病毒与上述的pLenti-amiR-PT1、pLenti-amiR-PT2的不同之处仅在于：将两个shRNA干扰单位都替换成对任何基因都没有干扰效果的商用shRNANC1(购自上海华津生物科技有限公司)，分别加入目的细胞。因为病毒载体上含有GFP绿色银光标记蛋白，因此在感染48h后，细胞在荧光显微镜下观察，发现大分部细胞发出绿色荧光，说明病毒颗粒已经成功感染细胞，再加新霉素筛选，构建JS1稳定细胞株。
经病毒颗粒pLenti-amiR-PT1感染后的细胞株命名为JS1-GFAP-PT1。经病毒颗粒pLenti-amiR-PT2感染后的细胞株命名为JS1-GFAP-PT2。经对照病毒pLenti-amiR-NC感染后的细胞株命名为JS1-GFAP-NC。
效果数据
1、细胞增殖实验
实验目的：证明本发明的miRNA具有抑制细胞增值的作用。
实验过程：下面分别从细胞水平验证上述实施例3构建的pLenti-amiR-PT1和pLenti-amiR-PT2对Pdgfrβ基因和TβrII基因的双敲低实验效果。
1)将感染后的稳定株JS1-GFAP-NC、JS1-GFAP-PT1和JS1-GFAP-PT2按照每孔2000～2500个细胞数接种到96孔板，每一种细胞分别接种6个重复孔，接种10个相同的96孔板。
2)在随后连续5天分别于相同时间点加入检测试剂100μL/孔，在无细胞孔内加相同体积的混合液作为空白对照。关于加入的处理试剂为CCK-8与10％胎牛血清培养基混合液(按照1:10的体积比配制，现配现用)。
3)加入处理试剂后，将96孔板放于37℃CO2培养箱继续孵育2小时后，用酶标仪检测450nm的吸光值，并以630nm的吸光值作为仪器和背景的对照。关于记录的结果，取10个复孔的平均值，并将5天的数值连成折线图，显示细胞增殖水平，结果参见图3。
从图3的体外细胞增值实验的结果可以看出，JS1-GFAP-PT1和JS1-GFAP-PT2稳定细胞株的细胞增值的速度明显低于对照细胞株JS1-GFAP-NC，这说明本发明的人工miRNA(amiR-PT1和amiR-PT2)能够抑制大鼠肝星状细胞(HSCs)的体外生长。
2、免疫印迹实验检测干扰靶基因和活化标志蛋白的表达
实验目的：为了证明本发明的人工miRNA对HSC活化具有抑制作用。
实验过程：实例3获得的靶向Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统的病毒颗粒：amiR-PT1，amiR-PT2和amiR-NC感染的小鼠的肝星状细胞JS1，并建立稳定细胞株，收集各组细胞，提取总蛋白，进行蛋白的PAGE电泳及免疫印迹实验，检测各组细胞中干扰基因Pdgfrβ和TβrII，以及HSC活化标志蛋白Col1a和α-Sma的蛋白表达。
实验结果参见图4，从图中可以看出，与感染amiR-NC的对照JS细胞比较，感染amiR-PT1或amiR-PT2的两种JS1细胞，Pdgfrβ、TβrII、α-Sma和Col1a蛋白水平的表达明显降低；
另外，本发明人还在原代提取的大鼠HSC细胞中，验证了人工miRNA对HSC活化的抑制作用。具体操作：amiR-PT1，amiR-PT2和amiR-NC感染大鼠原代HSC细胞细胞，72小时候，收集细胞进行蛋白检测，方法同上，具体不再赘述。结果见图5。
从图4和图5可以得出本发明的人工miRNA，成功的干扰了靶基因Pdgfrβ和TβrII表达，具有显著抑制HSCs的活化的作用。
3、免疫荧光实验检验本发明的人工miRNA，以及Pdgfrβ和TβrII在肝组织的定位
实验目的：证明本发明的人工miRNA在肝脏中能够靶向HSC细胞。
实验过程：实例3获得的靶向Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统的病毒颗粒：amiR-PT1，amiR-PT2和amiR-NC经尾静脉注射到CCl4诱导的肝纤维化的小鼠，注射量为病毒滴度2×107/只。每五天注射一次。CCl4诱导建立小鼠肝纤维化的模型的过程：每三天腹腔注射橄榄油稀释的CCl4(稀释比CCl4:橄榄油＝1:4)2.5ml/kg。处理一个月后，分离肝组织，制作冷冻组织切片，进行免疫荧光实，检验人工miRNA及Pdgfrβ和TβrII在肝组织的表达分布，绿色荧光示踪人工miRNA的表达，红色荧光示踪靶基因的表达。
实验结果参见图6-图9，从图中可以看出，HSC细胞中的人工miRNA(绿色荧光)主要集中在汇管区，图中的红色荧光(每幅大图中的第三行左边小图中)为Pdgfrβ蛋白和TβrII蛋白，图6和图8中的红色荧光相对于图7和图9(对照组)的较弱。可以看出，在肝组织内，本发明的人工miRNA靶向定位于HSC，并干扰Pdgfrβ和TβrII两个基因的表达。
4、血清转氨酶活性检测
实验目的：验证本发明的人工miRNA对肝损伤的保护作用。
实验过程：amiR-PT1和amiR-NC的病毒颗粒注射到肝纤维化的小鼠中及对照组小鼠(方法同上)。取小鼠的血液，分离纯化血清，检测血清中谷丙转氨酶的活性。
结果参见图10，从图10可以看出感染amiR-PT1病毒颗粒的小鼠的血清谷丙转氨酶的活性显著低于转染对照amiR-NC病毒颗粒的小鼠，这说明本发明的人工miRNA对CCl4引起的肝损伤具有保护作用。
5、Masson染色检测胶原分泌
实验目的：验证本发明的人工miRNA具有改善肝纤维化的作用。
实验过程：amiR-PT1，amiR-PT2和amiR-NC的病毒颗粒注射到肝纤维化的小鼠中及对照组小鼠(方法同上)取小鼠的肝组织，制作石蜡切片，进行Masson染色，检测不同组小鼠肝组织中沉积的胶原程度。
结果显示，感染了amiR-PT1、amiR-PT2病毒颗粒的小鼠肝组织，蓝色区域(胶原染色为蓝色)的面积明显低于感染了对照病毒颗粒(amiR-NC)的小鼠肝组织；经统计蓝色区域的光密度值，获得了图11的结果。
因此，可以看出，本发明的人工miRNA，具有降低肝纤维化胶原分泌的作用。
6：α-SMA免疫组化实验
实验目的：证明本发明的人工miRNA在体内具有抑制HSC活化的作用。
实验过程：上述的小鼠肝组织的石蜡切片，进行α-SMA免疫组化实验，检测各组小鼠中α-SMA的表达情况，并测定α-SMA阳性区域的吸光度(OD450)。
结果参见图12，感染了amiR-PT1、amiR-PT2病毒颗粒的小鼠肝组织，其α-SMA阳性区域的吸光度(OD450)明显低于感染了对照病毒颗粒(amiR-NC)的小鼠肝组织；因此，这说明本发明的人工miRNA，在体内具有抑制HSC活化的作用。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 1
guggacuccg auacuuacu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 2
aguaaguauc ggaguccac 19
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 3
ccagaucgug ugugagacuu u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 4
aaagucucac acacgaucug g 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 5
guacgguggu guguucauau c 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 6
gauaugaaca caccaccgua c 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 7
cucaggaaau gagauugauu u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 8
aaaucaaucu cauuuccuga g 21
<210> 9
<211> 370
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 9
cauauggucg acuagggaua acaggguaau uguuugaaug aggcuucagu acuuuacaga 60
aucguugugg acuccgauac uuacugugaa gccacagaug uaaguaagua ucggagucca 120
cgccugcaca ucuuggaaac agcugggauu acuucuucag guuaacccaa cagaaggcuc 180
gaaaagguau auugcuguug acagugagcg ccccagaucg ugugugagac uuugugaagc 240
cacagaugua aaagucucac acacgaucug gugccuacug ccucgucuag aaaggggcua 300
cuuuaggagc aauuaucuug uuuacuaaaa cugaauaccu ugcuaucucu uugauacauu 360
uuuuggaucc 370
<210> 10
<211> 374
<212> RNA
<213> 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统(targeting hepatic stellate cells Pdgfrβ and TβrII genes)
<400> 10
cauauggucg acuagggaua acaggguaau uguuugaaug aggcuucagu acuuuacaga 60
aucguuguac gguggugugu ucauaucgug aagccacaga uguagauaug aacacaccac 120
cguacgccug cacaucuugg aaacagcugg gauuacuucu ucagguuaac ccaacagaag 180
gcucgaaaag guauauugcu guugacagug agcgcccuca ggaaaugaga uugauuugug 240
aagccacaga uguaaaauca aucucauuuc cugagugccu acugccucgu cuagaaaggg 300
gcuacuuuag gagcaauuau cuuguuuacu aaaacugaau accuugcuau cucuuugaua 360
cauuuuuugg aucc 374

Claims (10)

1.一种靶向肝星状细胞的人工miRNA，其特征在于：所述人工miRNA具有miRNA骨架的二级结构，且其包含两个shRNA干扰单位，
其中一个shRNA干扰单位为靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位，
另一个shRNA干扰单位为靶向TβrII基因的shRNA干扰单位，
两个shRNA干扰单位之间通过链接序列连接，
其中，所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示，并且，所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示；或者，
所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.5所示，反义链序列如SEQ IDNO.6所示，并且，所述靶向TβrII基因的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO.7所示，反义链序列如SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的人工miRNA，其特征在于：所述人工miRNA是在pri-miR-30a骨架基础上进行改造获得的miRNA骨架结构，且两个shRNA干扰单位之间的链接序列的长度为80-100bp。
3.如权利要求2所述的人工miRNA，其特征在于：
所述靶向Pdgfrβ基因的shRNA干扰单位靠近5’端，所述靶向TβrII基因的shRNA干扰单位靠近3’端；且
所述人工miRNA的全长序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
4.一种靶向肝星状细胞的敲低Pdgfrβ和TβrII两个基因的载体系统，其特征在于：
所述载体系统是通过将如权利要求1至3中任意一项所述的人工miRNA插入到一miRNA表达载体的多克隆位点中构建形成。
5.如权利要求4所述的载体系统，其特征在于：
所述miRNA表达载体为慢病毒miRNA表达载体，且其启动子被替换成GFAP启动子。
6.如权利要求5所述的载体系统，其特征在于：
所述GFAP启动子为人GFAP启动子。
7.一种靶向肝星状细胞的载体系统的构建方法，其特征在于：该构建方法包括以下步骤：
步骤1a，人工合成如权利要求2所述的人工miRNA；
步骤1b，提供慢病毒miRNA表达载体：将慢病毒载体pLenti-CMV-microRNA-EGFP-T2A-Puro中的原始启动子替换成人GFAP启动子作为慢病毒miRNA表达载体；
步骤2，将所述步骤1a合成的人工miRNA插入到所述步骤1b提供的慢病毒miRNA表达载体内位于EGFP基因的内含子中的多克隆位点，且所述多克隆位点连接人工miRNA的酶切位点为NdeⅠ和BamHⅠ；
上述步骤1a与步骤1b，两个步骤不分先后。
8.如权利要求1至3中任意一项所述人工miRNA在制备肝纤维化基因治疗药物方面的用途。
9.如权利要求4至6中任意一项所述的载体系统在制备肝纤维化基因治疗药物方面的用途。
10.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物包含如权利要求4至6中任意一项所述的载体系统和药用载体。
CN201810009392.6A 2018-01-05 2018-01-05 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统 Expired - Fee Related CN108913689B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810009392.6A CN108913689B (zh) 2018-01-05 2018-01-05 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810009392.6A CN108913689B (zh) 2018-01-05 2018-01-05 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108913689A true CN108913689A (zh) 2018-11-30
CN108913689B CN108913689B (zh) 2021-09-07

Family

ID=64403598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810009392.6A Expired - Fee Related CN108913689B (zh) 2018-01-05 2018-01-05 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108913689B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101016548A (zh) * 2007-01-30 2007-08-15 浙江大学 可溶性转化生长因子βⅡ型受体/γ－干扰素重组融合蛋白及其制备
CN101955975A (zh) * 2009-07-14 2011-01-26 重庆医科大学 组织金属蛋白酶抑制因子siRNA表达载体的构建及肝硬化治疗应用
CN105688229A (zh) * 2016-03-21 2016-06-22 华东师范大学 靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101016548A (zh) * 2007-01-30 2007-08-15 浙江大学 可溶性转化生长因子βⅡ型受体/γ－干扰素重组融合蛋白及其制备
CN101955975A (zh) * 2009-07-14 2011-01-26 重庆医科大学 组织金属蛋白酶抑制因子siRNA表达载体的构建及肝硬化治疗应用
CN105688229A (zh) * 2016-03-21 2016-06-22 华东师范大学 靶向肝星状细胞的siRNA脂质纳米囊泡及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D YANG ET AL.: "Inhibition of hepatic fibrosis with artificial microRNA using ultrasound and cationic liposome-bearing microbubbles", 《GENE THERAPY》 *
NINGNING YANG ET AL.: "GFAP Promoter-Driven RNA Interference on TGF-β1 to Treat Liver Fibrosis", 《PHARM RES》 *
RAQUEL CALLONI ET AL.: "Scaffolds for Artificial miRNA Expression in Animal Cells", 《HUMAN GENE THERAPY METHODS》 *
施凤等: "促纤维化因子在肝纤维化发生中的作用研究进展", 《实用肝脏病杂志》 *
杨小瑜: "肝纤维化的发病机制研究进展", 《山东医药》 *
杨开明等: "细胞信号通路影响肝纤维化的研究进展", 《大理大学学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108913689B (zh) 2021-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060228800A1 (en) Novel Transgenic Methods Using intronic RNA
CN101970661B (zh) 使用内含子的核糖核酸生成人类类胚胎干细胞
Chi et al. Temperature effect on nervous necrosis virus infection in grouper cell line and in grouper larvae
CN104450620B (zh) 一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方法
CN103849601B (zh) 一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用
CN104694576B (zh) 一种沉默df‑1细胞系中ifnar1基因的方法
CN104845932A (zh) 淫羊藿苷的新用途
CN106480090A (zh) 一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体系统及其应用
CN112301002B (zh) 一种减毒型狂犬病毒的制备方法与应用
CN107913284B (zh) miRNA302-367簇的微小RNA在靶向抑制血管新生和肿瘤生长的应用
CN108913689A (zh) 靶向肝星状细胞敲低Pdgfrβ和TβrII基因的人工miRNA及其载体系统
CN105039268A (zh) 表达鸭坦布苏病毒e蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用
CN106947763B (zh) 可雾化吸入的抗流感病毒感染的siRNA及其应用
CN106497975A (zh) 基因重组干细胞制剂的制备方法及其在皮肤损伤修复、瘢痕抑制中的应用
CN111676222A (zh) 抑制Mettl3基因表达的shRNA及其重组腺相关病毒与应用
KR20060065712A (ko) 간엽계 줄기세포의 간세포로의 분화 방법 및 인공 인간간장 세포
CN102266569B (zh) miR-199a及其抑制剂的应用
CN109536452B (zh) 一株可视化鼻咽癌细胞及其应用
CN102978226A (zh) 微环dna基因载体组合物及其制备方法和应用
CN111235114A (zh) 一种ev71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用
CN104745635B (zh) 一种沉默df-1细胞系中oasl基因的方法
CN106459970A (zh) 微rna146‑a及其于诊断、治疗及预防小核醣核酸病毒感染的用途及微rna146‑a拮抗剂
CN104450622A (zh) 一种重组细胞系、其制备方法和应用
CN104762325B (zh) 一种沉默df‑1细胞系中ifnar2基因的方法
CN113769093B (zh) 古蛋白1在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210907