KR102686311B1 - Pd-1/pd-l1을 표적으로 하는 저해제와 cox-2 저해제의 병용 - Google Patents

Pd-1/pd-l1을 표적으로 하는 저해제와 cox-2 저해제의 병용 Download PDF

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Abstract

PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제에 의한 새로운 치료 전략을 제공한다. COX-2 저해제를 포함하고, PD-1/PD-L1을 표적으로 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에 투여하는, 의약 조성물. COX-2 저해제를 포함하는, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제의 면역 활성화 효과 증강제.

Description

PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제의 병용
본 발명은, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제의 병용에 관한 것이다.
PD-1과 PD-L1의 상호작용은 종양 및 감염증이 면역 응답을 회피하는 주요한 분자 기구 중 하나이고, 이들 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 상호작용을 저해함으로써 항종양 효과 및 항병원체 효과가 얻어지는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1~5).
Bramer J, Reckamp K, et al: Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 373:1627-1639, 2015. Hamanishi J, Mandai M, Ikeda T, et al: Safety and Antitumor Activity of Anti-PD-1 Antibody, Nivolumab, in Patients With Platinum-Resistant Ovarian Cancer. J Clin Oncol, 33:4015-4022, 2015. Motzer RJ, Escudier B, McDermott DF, et al: Nivolumab versus Everolimus in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med, 373:1803-1813, 2015. Barber DL, Wherry EJ, Masopust D, et al: Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature, 439:682-687, 2006. Velu V, Titanji K, Zhu B, et al: Enhancing SIV-specific immunity in vivo by PD-1 blockade. Nature 458:206-210, 2009.
본 발명은 PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제에 의한 새로운 치료 전략을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 개(犬)의 종양 질환이나 소의 감염증에 있어서의 신규 제어법의 확립을 목표로 하고, COX-2 저해제에 의한 면역 활성화 효과와, 항-PD-L1 항체와의 병용에 의한 효과의 증강을 in vitro 시험에서 확인하였다. 본 발명은, 이 지견에 의해 완성된 것이다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) COX-2 저해제를 포함하고, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에 투여하는, 의약 조성물.
(2) PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제가 항체인 (1)에 기재된 의약 조성물.
(3) 항체가, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항체인 (1) 또는 (2)에 기재된 의약 조성물.
(4) COX-2 저해제가, 멜록시캄(meloxicam), 피록시캄(piroxicam), 세레콕시브(celecoxib), 피로콕시브(firocoxib), 로베나콕시브(robenacoxib), 카르프로펜(carprofen), 에토돌락(etodolac)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
(5) 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
(6) PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와, COX-2 저해제가 별도로 투여되는 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
(7) PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와, COX-2 저해제를 포함하는 배합제인 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
(8) COX-2 저해제를 포함하는, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제의 면역 부활 효과 증강제.
(9) PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에, COX-2 저해제를 의약적으로 유효한 양으로 피험자 또는 피험동물에 투여하는 것을 포함하는, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료 방법.
(10) 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한, COX-2 저해제의 사용으로서, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에, COX-2 저해제가 투여되는 상기 사용.
(11) 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한, COX-2 저해제의 사용으로서, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에, COX-2 저해제가 투여되는 상기 사용.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제를 병용함으로써, 면역 활성화 효과가 증강된다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원, 특원 2017-140891 및 특원 2018-016074의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1: 개 종양 세포주 CMeC, LMeC, CMM-1, CMM-2(멜라노마 유래) 및 HM-POS(골육종 유래)로부터의 PGE2 생산. CMM-1 및 HM-POS에서 PGE2 생산량이 높은 경향이 있었다.
도 2: 개 종양 세포주 CMeC, LMeC, CMM-1, CMM-2(멜라노마 유래) 및 HM-POS(골육종 유래)에 있어서의 COX2 유전자 발현량. PGE2 생산량과 일치하여 CMM-1 및 HM-POS에서 COX2 유전자의 발현량이 높았다.
도 3: 개 말초혈 단핵구(PBMC)에 대한 PGE2의 영향. 개 PBMC를 슈퍼 항원 SEB 및 항-CD28 항체 존재 하에서 3일간 자극 배양하고, 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ 농도를 ELISA법에 의해 정량하였다. PGE2는 개 PBMC로부터의 IL-2 및 IFN-γ 생산을 억제하였다.
도 4: 개 종양 세포주에 대한 COX-2 저해제의 PGE2 생산 억제 효과. Meloxicam은 개 종양 세포주 CMM-1(멜라노마 유래) 및 HM-POS(골육종 유래)로부터 생산되는 PGE2 양을 저하시키는 경향이 있었다.
도 5: 개 PBMC에 대한 COX-2 저해제의 PGE2 생산 억제 효과. Meloxicam은 슈퍼 항원 SEB 및 항-CD28 항체 존재 하에서 3일간 자극 배양한 개 PBMC로부터 생산되는 PGE2 양을 저하시켰다.
도 6: COX-2 저해제의 개 면역 담당 세포 활성화 효과. 개 PBMC를 슈퍼 항원 SEB 및 항-CD28 항체 존재 하에서 3일간 자극 배양하고, 상청 중의 IL-2 농도를 ELISA법에 의해 정량하였다. Meloxicam은 개 PBMC로부터의 IL-2 생산을 증가시켰다.
도 7: 항-PD-L1 항체 및 COX-2 저해제의 병용에 의한 개 면역 담당 세포 활성화 효과. 개 PBMC를 슈퍼 항원 SEB 및 항-CD28 항체 존재 하에서 3일간 자극 배양하고, 상청 중의 IL-2 농도를 ELISA법에 의해 정량하였다. 항-PD-L1 항체는 단독으로도 개 PBMC로부터의 IL-2 생산을 증가시켰지만, Meloxicam을 병용함으로써 새로운 IL-2 생산의 증가가 인지되었다.
도 8: 재조합 개 PD-1에 대한 재조합 개 PD-L1 결합의 저해. 개 PD-1-Ig에의 개 PD-L1-Ig의 결합을 ELISA 플레이트 상에서 검출하였다. 항체 비첨가시의 흡광도(O.D.)를 100%로 하고, 각 항체 농도에 있어서의 O.D.를 상대치로서 나타냈다. 개 PD-L1에 교차 반응을 나타낸 래트 항(抗)-우(牛) PD-L1 모노클로날 항체 4G12; Rat IgG2a (κ), 5A2; Rat IgG1 (κ), 및 6G7; Rat IgM (κ) 중에서, 4G12, 6G7 양 클론은 결합 저해능이 높았다.
도 9: pDC6 벡터와 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체의 모식도.
도 10: 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 및 c6G7의 발현과 정제. 비환원 조건에서 SDS-PAGE를 수행하고, CBB 염색에 의해 밴드를 가시화하였다. a: 단백질 A 정제만, b: ＋겔여과 크로마토그래피 정제.
도 11: 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 및 c6G7의 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성.
도 12: 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 고발현 세포의 수립.
도 13: 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 SDS-PAGE 상. 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12를 환원 조건 및 비환원 조건에서 전기영동하고, CBB 염색에 의해 가시화하였다. 환원 조건에서는 50 kDa 부근에 항체 중쇄, 25 kDa 부근에 항체 경쇄의 밴드가 보였다. 목적 이외의 밴드는 검출되지 않았다.
도 14: 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 개 PD-1/PD-L1 결합 및 CD80/PD-L1 결합 저해 활성. 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12는 개 PD-1-Ig 및 CD80-Ig에의 PD-L1-Ig 결합량을 저하시키고, 키메라 항체화에 의한 결합 저해 활성의 변화는 인지되지 않았다.
도 15: 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12에 의한 개 면역 담당 세포 활성화 효과. 개 PBMC를 3일간 자극 배양하고, 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ 농도를 ELISA법에 의해 정량하였다. 또, 자극 배양 2일째에 배양액 중에 핵산 아날로그 EdU를 첨가하고, 그 취입량을 플로우사이토메트리(flow cytometry)에 의해 정량하였다. 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12는 개 PBMC로부터의 IL-2 및 IFN-γ 생산을 증대시키고, CD4+ 및 CD8+ 림프구의 증식을 항진하였다.
도 16: 구강 내 멜라노마(A) 및 미분화 육종(B)에 있어서의 PD-L1의 발현.
도 17: 구강 내 멜라노마 이환견(罹患犬)을 대상으로 수행한 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 종양의 CT 화상 및 외관. (a, d) 치료 개시 전, (b, e) 치료 10주 시점, (c, f) 치료 34주 시점. 5회의 항체 투여(치료 개시 후 10주)로 현저한 항종양 효과가 인지되고, 34주 시점에서는 새로운 종양의 축소가 확인되었다.
도 18: 도 17에서 나타낸 구강 내 멜라노마 이환견에 있어서의 종양 장경의 추이. 베이스라인 장경에 비해서, 30% 이상의 축소를 부분 성공(PR)으로 하였다.
도 19: 미분화 육종 이환견을 대상으로 수행한 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 CT 화상. (a, c) 치료 개시 전, (b, d) 치료 3주 시점. 2회의 항체 투여로 현저한 종양의 축소가 인지되었다.
도 20: 구강 내 멜라노마 이환견(폐 전이 증례)을 대상으로 수행한 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 CT 화상. (a, d, g) 치료 개시 전, (b, e, h) 치료 6주 시점, (c, f, i) 치료 18주 시점. 9회의 항체 투여에 의해 복수의 폐 전이소가 소실하였다.
도 21: 구강 내 멜라노마 이환견의 폐 전이 발생 후의 생존율의 추이. 항체 투여군에서는, 대조군과 비교하여 생존 기간이 연장된 가능성이 있다.
도 22: 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 L쇄 가변 영역 및 H쇄 가변 영역에 있어서의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다.
도 23: PGE2에 의한 소의 T세포 응답에의 영향.
도 24: 소 PBMC에 있어서의 면역 관련 유전자의 발현에 대한 PGE2의 영향.
도 25: 소 PBMC에 있어서의 PD-L1의 발현에 대한 PGE2의 영향.
도 26: 소 PBMC에 있어서의 COX-2 저해제의 면역 활성화 효과.
도 27: 요네균 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석.
도 28: 요네균 감염 소에 있어서의 항원 자극에 의한 PD-L1 발현량의 변화.
도 29: 요네병 병변부에서의 PGE2, EP2 및 PD-L1의 발현 해석.
도 30: COX-2 저해제에 의한 요네균 특이적인 면역 응답의 활성화 효과.
도 31: 요네균 감염 소에 있어서의 래트 항-우 PD-L1 항체의 면역 활성화 효과.
도 32: COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 요네균 특이적인 면역 활성화 효과.
도 33: COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 요네균 특이적인 면역 활성화 효과.
도 34: BLV 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석.
도 35: BLV 감염 소에 있어서의 COX2 및 EP4 유전자의 발현 해석.
도 36: BLV 감염 소에 있어서의 항원 자극에 의한 PGE2 생산량의 변화.
도 37: BLV 감염 소 유래 PBMC 중의 BLV 프로바이러스에 대한 PGE2의 영향.
도 38: BLV 감염 소에 있어서의 항원 자극에 의한 PD-L1 발현량의 변화.
도 39: COX-2 저해제에 의한 BLV 특이적인 면역 응답의 활성화 효과.
도 40: BLV 감염 소에 있어서의 COX-2 저해제의 항바이러스 작용.
도 41: COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 BLV 특이적인 면역 활성화 효과.
도 42: COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 BLV 특이적인 면역 활성화 효과.
도 43: BLV 감염 소에 있어서의 COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 항바이러스 작용.
도 44: Mycoplasma bovis 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석.
도 45: Mycoplasma bovis 감염 소에 있어서의 혈장 PGE2 양과 면역 억제의 지표의 상관성.
도 46: Mycoplasma bovis 감염 소에 있어서의 COX2 및 EP4 유전자의 발현 해석.
도 47: Mycoplasma bovis 감염 소에 있어서의 COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과.
도 48: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 아미노산 서열. 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 L쇄 가변 영역 및 H쇄 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 나타내고, 추가로, 소 IgG1(CH2 도메인)에 변이를 가한 아미노산(아미노산 번호 및 변이: 250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→deletion, 347 A→S, 348 P→S)도 나타낸다.
도 49: pDC6 벡터와 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 모식도.
도 50: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 정제 순도의 확인.
도 51: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 결합 특이성.
도 52: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성(소 PD-L1 발현 세포와 가용성 소 PD-1의 결합 저해 시험의 결과).
도 53: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성(소 PD-1 발현 세포와 가용성 소 PD-L1의 결합 저해 시험의 결과).
도 54: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 BLV 항원에 대한 응답성(세포 증식).
도 55: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12의 BLV 항원에 대한 응답성(IFN-γ 생산량).
도 56: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12를 투여한 BLV 실험 감염 소에 있어서의 BLV 항원에 대한 T세포의 세포 증식 응답.
도 57: 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12를 투여한 BLV 실험 감염 소에 있어서의 BLV 프로바이러스 양의 변화.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, COX-2 저해제를 포함하고, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에 투여하는, 의약 조성물을 제공한다.
사이클로옥시게나제 2(COX-2)는, 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 포함하는 프로스타노이드를 생합성하는 과정에 관여하는 효소이다. 항상적으로 발현하는 COX-1과는 대조적으로, 염증 조직에서 사이토카인이나 증식 인자의 자극에 의해 그 발현이 유도된다. 다양한 종양 및 감염증에서 COX-2의 고발현이 보고되고, 종양 세포 및 감염 세포의 증식이나 병태(病態)의 형성에 관여하고 있다고 생각되고 있다. PGE2는 리셉터 EP2 및 EP4를 통해서 특히 세포 독성 T세포의 이펙터 기능을 억제하기 때문에, 면역 억제적인 종양 미소 환경을 구성하는 액성(液性) 인자로서 근래 주목받고 있다. 한편으로 COX-2 저해제는 PGE2 생산을 저하시키고, 면역 세포에 걸리는 억제를 저감하는 작용이 기대된다. 마우스 모델에서는, 세레콕시브 등의 COX-2 저해제와 PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제의 병용에서 항종양 효과 및 항바이러스 효과의 증진이 인지되고 있다.
COX-2 저해제는, COX-2를 선택적으로 저해하는 약이어도 되고, 멜록시캄, 피록시캄, 세레콕시브, 피로콕시브, 로베나콕시브, 카르프로펜, 에토돌락 등을 예시할 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다.
PD-1(Programmed cell death-1)은, 활성화한 T세포나 B세포에 발현하는 막단백질이고, 그 리간드인 PD-L1은, 단핵구나 수지상 세포 등의 항원 제시 세포, 암 등 다양한 세포에 발현한다. PD-1 및 PD-L1은, T세포의 활성화를 억제하는 억제 인자로서 일한다. 모종의 암 세포나 바이러스 감염 세포는, PD-1의 리간드를 발현하는 것에 의해, T세포의 활성화를 억제하고, 숙주의 면역 감시로부터 도피하고 있다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제로서는, PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 물질을 들 수 있고, 그러한 물질로서는, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 핵산(천연형 핵산, 인공 핵산을 포함), 저분자 유기 화합물, 무기 화합물, 세포 추출물, 동식물이나 토양 등으로부터의 추출물 등이 있을 수 있다. 물질은, 천연물이어도, 합성물이어도 된다. 바람직한 PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제는, 항체이며, 보다 바람직하게는, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 등의 항체이다. 항체는, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해 활성을 가지는 것이면 되고, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 인간화 항체, 인간형 항체 중 어느 것이어도 된다. 그러한 항체의 제조 방법은 공지이다. 항체는, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 모르모트, 개, 소 등, 어느 하나의 생물에서 유래하는 것이어도 된다. 또, 본 명세서에서, 항체란, Fab, F(ab)'2, ScFv, Diabody, VH, VL, Sc(Fv)2, Bispecific sc(Fv)2, Minibody, scFv-Fc monomer, scFv-Fc dimer 등의 저분자화된 것도 포함하는 개념이다.
항-PD-L1 항체로서는, (a) QSLLYSENQKDY(서열번호 37)의 아미노산 서열을 가지는 CDR1, WAT의 아미노산 서열을 가지는 CDR2 및 GQYLVYPFT(서열번호 38)의 아미노산 서열을 가지는 CDR3를 포함하는 L쇄 가변 영역과, 래트 이외의 동물의 항체의 L쇄 정상(定常) 영역을 가지는 L쇄와, (b) GYTFTSNF(서열번호 39)의 아미노산 서열을 가지는 CDR1, IYPEYGNT(서열번호 40)의 아미노산 서열을 가지는 CDR2 및 ASEEAVISLVY(서열번호 41)의 아미노산 서열을 가지는 CDR3를 포함하는 H쇄 가변 영역과 래트 이외의 동물의 항체의 H쇄 정상 영역을 가지는 H쇄를 포함하는, 항-PD-L1 항체를 예시할 수 있다.
래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 L쇄 가변 영역에 있어서의 CDR1~3은, 각각 QSLLYSENQKDY(서열번호 37)의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, WAT의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, GQYLVYPFT(서열번호 38)의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다(도 22 참조).
또, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 H쇄 가변 영역에 있어서의 CDR1~3은, 각각 GYTFTSNF(서열번호 39)의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, IYPEYGNT(서열번호 40)의 아미노산 서열로 이루어지는 영역 및 ASEEAVISLVY(서열번호 41)의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다(도 22 참조).
QSLLYSENQKDY(서열번호 37)의 아미노산 서열, WAT의 아미노산 서열 및 GQYLVYPFT(서열번호 38)의 아미노산 서열, 및, GYTFTSNF(서열번호 39)의 아미노산 서열, IYPEYGNT(서열번호 40)의 아미노산 서열 및 ASEEAVISLVY(서열번호 41)의 아미노산 서열에서는, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 된다.
상기의 항-PD-L1 항체에서, L쇄 가변 영역과 H쇄 가변 영역이 래트에서 유래하면 된다. 예를 들면, L쇄 가변 영역이 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역이고, H쇄 가변 영역이 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역이면 된다.
래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 H쇄 가변 영역의 아미노산 서열을, 각각, 서열번호 1 및 2에 나타내지만, 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에서는, 1 혹은 복수개(예를 들면, 5개 이하, 많아도 10개 정도)의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역 또는 H쇄 가변 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
래트 이외의 동물의 항체의 L쇄 정상 영역 및 H쇄 정상 영역은, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12와 교차 반응하는 PD-L1을 생산하는 동물 유래의 것이면 된다.
항체의 L쇄에는, Kappa쇄(카파쇄)와 Lambda쇄(람다쇄)가 있고, 상기의 항-PD-L1 항체에서, 래트 이외의 동물의 항체의 L쇄 정상 영역은, Kappa쇄 또는 Lambda쇄 중 어느 쇄의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지는 것이어도 되지만, 존재 비율은, 양(羊), 고양이, 개, 말, 소에서는 Lambda쇄의 쪽이 높고, 마우스, 래트, 인간, 돼지에서는 Kappa쇄의 쪽이 높다. 존재 비율이 높은 쇄 쪽이 바람직하다고 생각되므로, 양, 고양이, 개, 말, 소에서는 Lambda쇄의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하고, 마우스, 래트, 인간, 돼지에서는 Kappa쇄의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.
래트 이외의 동물의 항체의 H쇄 정상 영역은, 인간의 IgG4에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지면 된다. H쇄는, 정상 영역의 차이에 의해, γ쇄, μ쇄, α쇄, δ쇄, ε쇄로 나뉘어 지고, 이 차이에 의해 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE의 5 종류의 클래스(아이소타이프)의 면역 글로불린이 형성된다.
면역 글로불린 G(IgG)는 인간 면역 글로불린의 70-75%를 차지하고, 혈장 중에 가장 많은 단량체의 항체이다. 경쇄 2개와 중쇄 2개의 4개 쇄 구조를 가진다. 인간 IgG1, IgG2, IgG4는 분자량은 약 146,000이지만, 인간 IgG3는 Fab 영역과 Fc 영역을 연결하는 힌지부가 길고, 분자량도 170,000으로 크다. 인간 IgG1은 인간 IgG의 65% 정도, 인간 IgG2는 25% 정도, 인간 IgG3는 7% 정도, 인간 IgG4는 3% 정도를 차지한다. 혈관 내외에 평균적으로 분포한다. 인간 IgG1은, 이펙터 세포 표면의 Fc 리셉터나 보체 인자에 강한 친화성을 가지므로, 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC)을 유도하고, 또, 보체를 활성화하고 보체 의존성 세포 상해 활성(CDC)을 유도한다. 인간 IgG2와 인간 IgG4는, Fc 리셉터나 보체 인자에의 친화성이 낮기 때문에, ADCC 활성 및 CDC 활성이 낮다.
면역 글로불린 M(IgM)은 인간 면역 글로불린의 약 10%를 차지하는, 기본의 4개 쇄 구조가 5개 결합한 5량체의 항체이다. 분자량은 970,000. 통상 혈중에만 존재하고, 감염 미생물에 대해서 최초로 생산되어, 초기 면역을 담당하는 면역 글로불린이다.
면역 글로불린 A(IgA)는 인간 면역 글로불린의 10-15%를 차지한다. 분자량은 160,000. 분비형 IgA는 2개의 IgA가 결합한 2량체의 항체로 되어 있다. IgA1은 혈청, 콧물, 타액, 모유 중에 존재하고, 장액에는 IgA2가 많이 존재한다.
면역 글로불린 D(IgD)는 인간 면역 글로불린의 1% 이하의 단량체의 항체이다. B세포 표면에 존재하고, 항체 생산의 유도에 관여한다.
면역 글로불린 E(IgE)는 인간 면역 글로불린의 0.001% 이하와 극미량 밖에 존재하지 않는 단량체의 항체이다. 기생충에 대한 면역 반응에 관여하고 있다고 생각되지만, 기생충이 드문 선진국에서는, 특히 기관지 천식이나 알레르기에 크게 관여하고 있다.
개에서는, IgG의 H쇄로서, IgG-A(인간 IgG2에 상당), IgG-B(인간 IgG1에 상당), IgG-C(인간 IgG3에 상당), IgG-D(인간 IgG4에 상당)의 서열이 동정되어 있다. 상기의 항-PD-L1 항체에서는, ADCC 활성, CDC 활성을 모두 가지지 않는 IgG H쇄 정상 영역이 바람직하다(인간에서는 IgG4). 인간 IgG4에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역이 동정되어 있지 않은 경우에는, 인간 IgG1에 상당하는 면역 글로불린의 당해 영역에 변이를 가하는 것에 의해, ADCC 활성, CDC 활성을 모두 가지지 않게 된 것을 사용하면 된다.
소에서, 인간 IgG4에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역이 동정되어 있지 않기 때문에, 인간 IgG1에 상당하는 면역 글로불린의 당해 영역에 변이를 가하고, 이것을 사용할 수 있다. 그 일예로서, 소 항체의 H쇄 정상 영역(IgG1쇄, GenBank: X62916)의 CH2 도메인에 변이를 가한 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열(코돈을 최적화한 것)을, 서열번호 102 및 103에 나타낸다.
래트 이외의 동물이 개 또는 소이고, 개(犬) 항체 또는 소(牛) 항체의 L쇄 정상 영역이, Lambda쇄의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지며, 또한, 개 항체 또는 소 항체의 H쇄 정상 영역이, 인간의 IgG4에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지는 항-PD-L1 항체가 보다 바람직하다.
상기의 항-PD-L1 항체는, 래트-개 키메라 항체, 견화(犬化) 항체, 래트-소 키메라 항체, 우화(牛化) 항체를 포함하지만, 동물은, 개 또는 소로 한정되는 것은 아니고, 인간, 돼지, 원숭이, 마우스, 고양이, 말, 염소, 양, 물소, 토끼, 햄스터, 모르모트, 소 등을 예시할 수 있다.
예를 들면, 상기의 항-PD-L1 항체는, 개 항체의 L쇄 정상 영역이 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고, 개 항체의 H쇄 정상 영역이 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 항-PD-L1 항체, 혹은 소 항체의 L쇄 정상 영역이 서열번호 100의 아미노산 서열을 가지고, 소 항체의 H쇄 정상 영역이 서열번호 102의 아미노산 서열을 가지는 항-PD-L1 항체이면 된다.
서열번호 3, 4, 100 및 102의 아미노산 서열에서는, 1 혹은 복수개(예를 들면, 5개 이하, 많아도 10개 정도)의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, 항체의 L쇄 정상 영역 또는 H쇄 정상 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
상기의 항-PD-L1 항체는, L쇄 2개와 H쇄 2개의 4개 쇄 구조를 가지면 된다.
상기의 항-PD-L1 항체는, 이하와 같이 제조할 수 있다. 동정한 래트 항-우 PD-L1 항체의 가변 영역 서열과 래트 이외의 동물(예를 들면, 개 또는 소 등)의 항체(바람직하게는, 인간 IgG4 항체 또는 인간 IgG4 항체에 상당하는 항체)의 정상 영역 서열을 포함하는 인공 유전자를 합성하고, 그 인공 유전자를 벡터(예를 들면, 플라스미드)에 삽입 후, 숙주 세포(예를 들면, CHO 세포 등의 포유류 세포)에 도입하고, 당해 숙주 세포를 배양하는 것에 의해, 배양물로부터 항체를 채취한다.
본 발명자들이 동정한 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열을, 각각, 서열번호 1 및 5에 나타낸다. 추가로, 코돈 최적화 후의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 15 및 112에 나타낸다.
본 발명자들이 동정한 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열을, 각각, 서열번호 2 및 6에 나타낸다. 추가로, 코돈 최적화 후의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 16 및 113에 나타낸다.
개 항체의 L쇄 정상 영역(Lambda쇄, GenBank: E02824.1)의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열을, 각각, 서열번호 3 및 7에 나타낸다. 추가로, 코돈 최적화 후의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 17에 나타낸다.
개 항체의 H쇄 정상 영역(IgG-D쇄, GenBank: AF354267.1)의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열을, 각각, 서열번호 4 및 8에 나타낸다. 추가로, 코돈 최적화 후의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 18에 나타낸다.
또, 서열번호 9는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 개 항체의 L쇄 정상 영역(Lambda쇄, GenBank: E02824.1)으로 이루어지는 키메라 L쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 개 항체의 L쇄 정상 영역(Lambda쇄, GenBank: E02824.1)으로 이루어지는 키메라 L쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 서열번호 19에 나타낸다.
서열번호 10은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 개 항체의 H쇄 정상 영역(IgG-D쇄, GenBank: AF354267.1)으로 이루어지는 키메라 H쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 개 항체의 H쇄 정상 영역(IgG-D쇄, GenBank: AF354267.1)으로 이루어지는 키메라 H쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 서열번호 20에 나타낸다.
소 항체의 L쇄 정상 영역(Lambda쇄, GenBank: X62917)의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열을, 각각, 서열번호 100 및 101에 나타낸다. 추가로, 코돈 최적화 후의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 114에 나타낸다.
소 항체의 H쇄 정상 영역(IgG1쇄, GenBank: X62916을 개변(改變))의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을, 각각, 서열번호 102 및 103에 나타낸다.
또, 서열번호 115는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 소 항체의 L쇄 정상 영역(Lambda쇄, GenBank: X62917)으로 이루어지는 키메라 L쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 소 항체의 L쇄 정상 영역(Lambda쇄, GenBank: X62917)으로 이루어지는 키메라 L쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 서열번호 117에 나타낸다.
서열번호 116은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 소 항체의 H쇄 정상 영역(IgG1쇄, GenBank: X62916을 개변)으로 이루어지는 키메라 H쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 소 항체의 H쇄 정상 영역(IgG1쇄, GenBank: X62916을 개변)으로 이루어지는 키메라 H쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 서열번호 118에 나타낸다.
이 외에, 래트와 개, 소 이외의 동물의 L쇄 정상 영역 및 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열은, 공지의 데이터 베이스로부터 입수할 수 있고, 이들 서열을 이용할 수 있다.
개, 양, 돼지, 물소, 인간, 소의 L쇄 정상 영역 및 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오타이드 서열을 하기의 표에 정리하였다.
인간 IgG1의 정상 영역은 야생형에서는 ADCC 활성 및 CDC 활성을 가지지만, 특정의 부분에 아미노산 치환이나 결손을 가하는 것에 의해, 그러한 활성을 저하시킬 수 있는 것이 알려져 있다. 인간 이외의 동물에서, 인간 IgG4에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역이 동정되어 있지 않은 경우, 인간 IgG1에 상당하는 면역 글로불린의 당해 영역에 변이를 가하여, ADCC 활성 및 CDC 활성을 저하시킨 것을 사용할 수 있다.
서열번호 4, 3, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 12, 80, 82, 84~91, 100, 102 및 11의 아미노산 서열에서는, 1 혹은 복수개(예를 들면, 5개 이하, 많아도 10개 정도)의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 된다.
본 발명의 의약 조성물은, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료에 이용할 수 있다. 암 및/또는 감염증으로서는, 종양성 질환(예를 들면, 악성 흑색종, 폐암, 위암, 신장암, 유방암, 방광암, 식도암, 난소암 등), 백혈병, 요네병(Johne's disease), 아나플라스마병(Anaplasmosis), 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라스마(Mycoplasma) 감염증(예를 들면, 마이코플라스마성 유방염, 마이코플라스마성 폐렴 등), 결핵, 소형 피로플라즈마병(Theileria orientalis infection), 크립토스포리듐증(cryptosporidiosis), 콕시듐증(coccidiosis), 트리파노소마병(trypanosomiasis) 및 리슈마니아증(leishmaniasis) 등을 예시할 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은, COX-2 저해제를 포함하고, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에 투여된다.
본 발명의 의약 조성물에서, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와, COX-2 저해제를 병용 혹은 합제화할 수 있다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제를 병용하는 경우, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제는 별도로 투여되면 된다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제를 합제화하는 경우, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제를 포함하는 배합제로 하면 된다.
본 발명의 의약 조성물은, 전신 또는 국소적으로, 경구 또는 비경구로 피험자 또는 피험동물에 투여된다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제는, PBS 등의 완충액, 생리 식염수, 멸균수 등에 용해하고, 필요에 따라서 필터 등에서 여과 멸균한 후, 주사에 의해 피험동물(인간도 포함)에 투여하면 된다. 또, 이 용액에는, 첨가제(예를 들면, 착색제, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 용해 보조제, 안정화제, 보존제, 산화 방지제, 완충제, 등장화제, pH 조절제 등) 등을 첨가해도 된다. 투여 경로로서는, 정맥, 근육, 복강, 피하, 피내 투여 등이 가능하고, 또, 경비, 경구 투여해도 된다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제의 제제(製劑) 중에 있어서의 함량은, 제제의 종류에 따라 다르지만, 통상 1~100 중량%, 바람직하게는 50~100 중량%이다. 제제는, 단위 투여 제제로 제제화하면 된다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제(예를 들면, PD-L1 항체)의 투여량, 투여의 횟수 및 빈도는, 피험동물 또는 피험자의 증상, 연령, 체중, 투여 방법, 투여 형태 등에 따라 다르지만, 예를 들면, 통상, 성체 또는 성인 한 개체당 0.1~100 ㎎/㎏체중, 바람직하게는, 1~10 ㎎/㎏체중을, 적어도 1회, 원하는 효과가 얻어지는 빈도로 투여하면 된다.
COX-2 저해제는, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 포함하는 제제에 함유시켜도 되지만, 단독으로, 혹은 부형제 또는 담체와 혼합하여, 정제, 캡슐제, 산제(散劑), 과립제, 액제, 시럽, 에어로졸, 좌제, 주사제 등으로 제제화해도 된다. 부형제 또는 담체는, 당해 분야에서 상투적으로 사용되고, 의약적으로 허용되는 것이면 되고, 그 종류 및 조성은 적절히 변경된다. 예를 들면, 액상 담체로서는 물, 식물유 등이 이용된다. 고체 담체로서는, 유당, 백당, 포도당 등의 당류, 감자 전분, 옥수수 전분 등의 전분, 결정 셀룰로오스등의 셀룰로오스 유도체 등이 사용된다. 스테아린산 마그네슘 등의 활택제, 젤라틴, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스 등의 붕괴제 등을 첨가해도 된다. 그 외, 항산화제, 착색제, 교미제(矯味劑), 보존제 등을 첨가해도 된다.
COX-2 저해제는, 경구, 경비, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내 등의 다양한 경로에 의해서 투여할 수 있다.
COX-2 저해제의 제제 중에 있어서의 함량은, 제제의 종류에 따라 다르지만, 통상 1~100 중량%, 바람직하게는 50~100 중량%이다. 예를 들면, 액제의 경우에는 COX-2 저해제의 제제 중에 있어서의 함량은, 1~100 중량%가 바람직하다. 캡슐제, 정제, 과립제, 산제의 경우는, COX-2 저해제의 제제 중에 있어서의 함량은, 통상 약 10~100 중량%, 바람직하게는 50~100 중량%이며, 잔부는 담체이다. 제제는, 단위 투여 제제로 제제화하면 된다.
COX-2 저해제의 투여량, 투여의 횟수 및 빈도는, 피험동물 또는 피험자의 증상, 연령, 체중, 투여 방법, 투여 형태 등에 따라 다르지만, 예를 들면, 통상, 성체 또는 성인 일인당, 유효 성분의 양으로 환산하여, 0.05~20 ㎎/㎏체중 정도를 적어도 1회, 원하는 효과를 확인할 수 있는 빈도로 투여하면 된다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제의 비율(질량)은, 1:100~1000:1 정도가 적당하고, 바람직하게는 1:10~100:1이다.
본 발명은, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에, COX-2 저해제를 의약적으로 유효한 양으로 피험자 또는 피험동물에 투여하는 것을 포함하는, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
또, 본 발명은, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한, COX-2 저해제의 사용으로서, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에, COX-2 저해제가 투여되는 상기 사용을 제공한다.
추가로, 본 발명은, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한, COX-2 저해제의 사용으로서, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에, COX-2 저해제가 투여되는 상기 사용을 제공한다.
PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제를 COX-2 저해제와 병용함으로써, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제의 면역 부활 효과가 증강된다. 따라서, 본 발명은, COX-2 저해제를 포함하는, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제의 면역 부활 효과 증강제를 제공한다.
본 발명의 약제는, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와의 병용약 또는 배합제로서 이용할 수 있다. PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저해제와 COX-2 저해제의 병용 및 합제화에 대해서는, 상술하였다. 본 발명의 약제는, 의약으로서의 용도 외에, 실험 시약으로도 이용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
개에 있어서의 항-PD-L1 항체와 COX-2 저해제의 병용 효과의 검토
1. 서론
PD-1과 PD-L1의 상호작용은 종양이 면역 응답을 회피하는 주요한 분자 기구 중 하나이며, 이들의 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 상호작용을 저해함으로써 항종양 효과가 얻어지는 것이 보고되어 있다. 본 실시예에서는, 개의 종양 질환에 있어서의 신규 제어법의 확립을 목표로 하고, COX-2 저해제에 의한 면역 활성화 효과와, 항-PD-L1 항체와의 병용에 의한 효과의 증강을 in vitro 시험에서 확인하였다.
2. 재료 및 방법, 실험 결과
2.1. 개 종양 세포주로부터의 PGE2 생산
개의 멜라노마 유래 주화 세포 CMeC 및 LMeC(Ohashi E, Inoue K, Kagechika H, Hong SH, Nakagawa T, et al: Effect of natural and synthetic retinoids on the proliferation and differentiation of three canine melanoma cell lines. J Vet Med Sci 64: 169-172, 2002.), CMM-1 및 CMM-2(Ohashi E, Hong SH, Takahashi T, Nakagawa T, Mochizuki M, et al.: Effect of retinoids on growth inhibition of two canine melanoma cell lines. J Vet Med Sci 63: 83-86, 2001.)는, 2 머캅토 에탄올 2×10-5M, 10% 비동화(非動化; inactivated) 소 태아 혈청(Valley Biomedical 사), 항생 물질(스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 페니실린 100 U/㎖)(Invitrogen 사), 2 mM L-글루타민(Invitrogen 사)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Sigma 사)에서 37℃, 5% CO2 존재 하에서 배양하였다. 개 골육종 유래 주화 세포 HM-POS(Barroga EF, Kadosawa T, Okumura M, Fujinaga T: Establishment and characterization of the growth and pulmonary metastasis of a highly lung metastasizing cell line from canine osteosarcoma in nude mice. J Vet Med Sci 61: 361-367, 1999.)는, 10% 비동화 소 태아 혈청(Valley Biomedical 사), 항생 물질(스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 페니실린 100 U/㎖)(Invitrogen 사), 2 mM L-글루타민(Invitrogen 사)을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(D-MEM; Invitrogen 사)에서 37℃, 5% CO2 존재 하에서 배양하였다. 5×105/㎖로 조제한 세포를 24시간 배양한 후, 배양 상청 중의 PGE2 양을 Prostaglandin E2 Express EIA Kit(Cayman Chemical 사)를 이용하여 정량한 결과, CMM-1 및 HM-POS에서 PGE2의 생산이 높은 경향이 있었다(도 1).
2.2. 개 종양 세포주에 있어서의 COX2 유전자 발현
재료 및 방법 2.1에 기재된 방법에 따라서 배양한 개의 종양 유래 세포주로부터, TRI 시약(Molecular Research Center 사)을 이용하여 RNA를 추출하고, NanoDrop8000(Thermo Scientific 사)에 의해 농도를 계측하였다. 실험에 제공할 때까지 RNA 시료는 -80℃에 보존하였다.
상기 RNA 1 ㎍을 이용하여, DNase I 반응 버퍼, 1 U DNase I 증폭 등급(Invitrogen 사)을 가하고, 탈이온 증류수에 의해 10 ㎕로서, 실온에서 15분 DNase I 처리를 수행하였다. 다음에 25 nmol 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 혼화하고, 65℃에서 10분간 처리하였다. 여기에 200 pmol oligo-dT 프라이머를 첨가하고, 65℃에서 5분간 처리한 후, 역전사 반응액(PrimeScript Buffer; TaKaRa 사, 7.5 nmol dNTPs, 20 U RNase Plus RNase inhibitor; Promega 사, 100 U PrimeScript RTase; TaKaRa 사)을 가하고, 최종 용량 20 ㎕로서, 42℃에서 60분간 역전사 반응을 수행하여, 단쇄 cDNA를 합성하였다.
The National Center for Biotechnology Information(NCBI)에 등록되어 있는 개의 COX2의 염기서열(NM_001003354.1) 및 HPRT1의 염기서열(AY283372.1)로부터 프라이머(canine COX2 rt F 및 canine COX2 rt R, canine HPRT1 rt F 및 canine HPRT1 rt R)를 설계하고, Real-Time PCR법을 수행하였다. 종양 유래 세포주 cDNA 1 ㎕를 주형으로서, 10 pmol/㎕로 조제한 프라이머 canine COX2 rt F 및 canine COX2 rt R, 혹은 canine HPRT1 rt F 및 canine HPRT1 rt R을 각 0.3 ㎕, SYBR Premix DimerEraser(TaKaRa 사) 5㎕, DDW 3.4 ㎕를 포함하는 PCR 반응액 중에서 이하의 조건 하에서 Real-Time PCR(LightCycler480 System Ⅱ; Roche 사)을 수행하였다.
프라이머(canine COX2 rt F): AAGCTTCGATTGACCAGAGCAG(서열번호 108)
프라이머(canine COX2 rt R): TCACCATAAAGGGCCTCCAAC(서열번호 109)
프라이머(canine HPRT1 rt F): TGGCGTCGTGATTAGTGATGA(서열번호 110)
프라이머(canine HPRT1 rt R): CAGAGGGCTACGATGTGATGG(서열번호 111)
(PCR 반응 조건)
1. 사전 인큐베이션(Pre incubation) 95℃ 30초
2. 정량화(Quantification) 하기의 3 스텝을 50 사이클
I. 열변성 95℃ 5초간
Ⅱ. 어닐링 58℃ 30초간
Ⅲ. 신장 반응 72℃ 30초간
3. 멜팅 커브(Melting curve)
I. 95℃ 1초간
Ⅱ. 65℃ 15초간
Ⅲ. 95℃ 지속
4. 냉각 40℃
얻어진 COX2 mRNA 발현량을 내부 표준 유전자 HPRT1 mRNA 발현량으로 나눈 값을 COX2 유전자 발현량으로 한 결과, 배양 상청 중의 PGE2 생산량의 결과와 일치하여 CMM-1 및 HM-POS에서 COX2의 유전자 발현량이 높았다(도 2, Tukey의 다중 비교 검정, P<0.05).
2.3. 개 말초혈 단핵구로부터의 사이토카인 생산에 있어서의 PGE2의 영향
건강한 비글 및 잡종견에 의해 채혈한 헤파린 첨가 개 말초혈로부터, Percoll(GE Healthcare 사)을 이용하여 밀도구배 원심분리법에 의해 말초혈 단핵구(PBMC)를 분리하였다. 얻어진 PBMC는, 10% 비동화 소 태아 혈청(Valley Biomedical 사), 항생 물질(스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 페니실린 100 U/㎖)(Invitrogen 사), 2 mM L-글루타민(Invitrogen 사)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Sigma 사)에, Staphylococcal Enterotoxin B(SEB)(Sigma 사) 5 ㎍/㎖ 및 Anti-Canine CD28(eBioscience 사) 1 ㎍/㎖를 첨가하고, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 3일간 배양하였다. Prostaglandin E2(Cayman Chemical 사)를 최종 농도 2.5 μM에서 첨가한 경우의 배양 상청 중에의 인터류킨 2(IL-2) 및 인터페론 γ(IFN-γ) 생산량을 Canine IL-2 DuoSet ELISA(R&D systems 사) 및 Canine IFN-gamma DuoSet ELISA(R&D systems 사)를 이용하여 측정하였다. PGE2는 개 PBMC로부터의 IL-2 및 IFN-γ 생산량을 유의하게 저하시켰다(도 3, Wilcoxon의 부호순위합 검정, P<0.01 및 P<0.05).
2.4. COX-2 저해제의 PGE2 생산 억제 효과
개 종양 세포주 CMM-1 및 HM-POS를, 재료와 방법 2.1에 기재된 방법에 따라서 배양하고, Meloxicam(Sigma 사)을 최종 농도 5 μM이 되도록 첨가하였다. 각 종양 세포주로부터의 PGE2 생산량을 EIA법에 의해 정량한 결과, Meloxicam 첨가에 의해 PGE2 생산량이 저하하는 경향이 있었다(도 4). 또, 개 PBMC를 재료와 방법 2.3에 기재된 방법에 따라서 배양하고, Meloxicam(Sigma 사)을 최종 농도 5 μM이 되도록 첨가한 결과, PBMC로부터의 PGE2 생산량이 유의하게 저하하였다(도 5, Wilcoxon의 부호순위합 검정, P<0.05).
2.5. 개 말초혈 단핵구로부터의 사이토카인 생산에 있어서의 COX-2 저해제의 영향
개 PBMC를 재료와 방법 2.3에 기재된 방법에 따라서 배양하고, Meloxicam(Sigma 사)을 최종 농도 5 μM이 되도록 첨가하고, 배양 상청 중의 IL-2 농도를 ELISA법에 의해 정량하였다. Meloxicam 첨가에 의해 개 PBMC로부터의 IL-2 생산량이 유의하게 증가하였다(도 6, Wilcoxon의 부호순위합 검정, P<0.01).
2.6. 항-PD-L1 항체와 COX-2 저해제 병용에 의한 개 PBMC 활성화 효과의 증강
개 PBMC를 재료와 방법 2.3에 기재된 방법에 따라서 배양하고, 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12(Maekawa et al., 2017, data in submission, 후술의 참고예 1)를 최종 농도 20 ㎍/㎖, 및 Meloxicam(Sigma 사)을 최종 농도 5 μM이 되도록 첨가하고, 배양 상청 중의 IL-2 농도를 ELISA법에 의해 정량하였다. 항-PD-L1 항체 단독으로도 IL-2 생산량이 증가하였지만, Meloxicam을 병용함으로써 새로운 IL-2 생산량의 증대를 인지하였다(도 7, Steel-Dwass 검정, P<0.05).
[참고예 1]
래트-개 키메라 항-PD-L1 항체
1. 서론
면역 억제 수용체 Programmed death 1(PD-1)과 그 리간드인 Programmed death ligand 1(PD-L1)은 과잉의 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊게 관련하고 있는 인자로서 교토 대학, 혼조 다스쿠 등에 의해서 동정된 분자이다. 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 근래 밝혀지고 있다. 본 실시예에서는, 개 종양 질환에 대한 신규 치료법의 수립을 목적으로 개 PD-1 및 PD-L1의 결합을 저해가능한 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체(4G12)의 가변 영역 유전자와, 개 면역 글로불린(IgG4)의 정상 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell: CHO 세포)를 배양 증식시켜 얻은 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12를 제작하고, in vitro 및 in vivo의 효과를 확인하였다.
2. 재료 및 방법, 실험 결과
2.1 소 PD-L1 모노클로날 항체 생산 세포
소 PD-L1 유전자 서열을 동정하고(Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K.Vet Res. 2011 Sep 26;42:103.), 그 유전자 정보에 의해 재조합 소 PD-L1을 제작하였다. 동 재조합 단백질을 래트에게 면역(免疫)시켜 래트 항-우 PD-L1 항체를 얻었다(Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K.Immunology. 2014 Aug;142(4):551-61. 이 논문에 뒤에 개 키메라 항체의 가변 영역이 되는 클론 4G12가 게재되어 있다).
2.2 완전장(完全長) 개 PD-1 및 PD-L1 유전자의 동정
개 PD-1 및 PD-L1 cDNA 전장(全長)을 결정하기 위해서, 우선 The National Center for Biotechnology Information(NCBI)에 이미 등록되어 있는 개의 PD-1 및 PD-L1의 예상 염기서열(GenBank accession number; XM_543338 및 XM_541302)로부터 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내부를 증폭하도록 프라이머(cPD-1 inner F 및 R, cPD-L1 inner F 및 R)를 설계하여 PCR법을 수행하였다. 얻어진 증폭산물에 대하여, 상법에 따라 캐필러리 시퀀서에 의해 염기서열을 결정하였다. 추가로 완전장 PD-1 및 PD-L1 cDNA의 염기서열을 결정하기 위해서, 상기에서 결정한 개 PD-1 및 PD-L1 cDNA 서열을 기초로 프라이머(cPD-1 5' GSP 및 3' GSP, cPD-L1 5' GSP 및 3' GSP)를 설계하고, 각각 cDNA 말단의 신속한 증폭용 5' RACE 시스템 및 cDNA 말단의 신속한 증폭용 3' RACE 시스템(Invitrogen 사)을 이용하여 5' 및 3' RACE법을 수행하였다. 5' 및 3' RACE법에 의해 얻어진 목적으로 하는 유전자 단편은 상기의 방법에 따라서 염기서열을 결정하였다(Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10;9(6):e98415.).
프라이머(cPD-1 inner F): AGGATGGCTCCTAGACTCCC(서열번호 21)
프라이머(cPD-1 inner R): AGACGATGGTGGCATACTCG(서열번호 22)
프라이머(cPD-L1 inner F): ATGAGAATGTTTAGTGTCTT(서열번호 23)
프라이머(cPD-L1 inner R): TTATGTCTCTTCAAATTGTATATC(서열번호 24)
프라이머(cPD-1 5' GSP): GTTGATCTGTGTGTTG(서열번호 25)
프라이머(cPD-1 3' GSP): GGGACTTCCACATGAGCAT(서열번호 26)
프라이머(cPD-L1 5' GSP): TTTTAGACAGAAAGTGA(서열번호 27)
프라이머(cPD-L1 3' GSP): GACCAGCTCTTCTTGGGGAA(서열번호 28)
2.3　개 PD-1 및 PD-L1 발현 COS-7 세포의 구축
개 PD-1-EGFP 및 PD-L1-EGFP 발현 플라스미드를 제작하기 위해, 합성한 비글 PBMC 유래 cDNA를 주형으로, 5' 말단 측에 제한효소 XhoI 및 BamHI(PD-1), BglⅡ 및 EcoRI(PD-L1) 인식 부위를 부가하여 설계한 프라이머(cPD-1-EGFP F 및 R, cPD-L1-EGFP F 및 R)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 XhoI(Takara 사) 및 BamHI(Takara 사)(PD-1), BglⅡ(New England Biolabs 사) 및 EcoRI(Takara 사)(PD-L1)에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit(NIPPON Genetics 사)를 이용하여 정제하고, 동일한 제한효소 처리를 수행한 pEGFP-N2 벡터(Clontech 사)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen 사)를 이용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pEGFP-N2-cPD-1 혹은 pEGFP-N2-cPD-L1이라고 표기하였다.
프라이머(cPD-1-EGFP F): CCGCTCGAGATGGGGAGCCGGCGGGGGCC(서열번호 29)
프라이머(cPD-1-EGFP R): CGCGGATCCTGAGGGGCCACAGGCCGGGTC(서열번호 30)
프라이머(cPD-L1-EGFP F): GAAGATCTATGAGAATGTTTAGTGTC(서열번호 31)
프라이머(cPD-L1-EGFP R): GGAATTCTGTCTCTTCAAATTGTATATC(서열번호 32)
5×104/cm2의 COS-7 세포를 6웰 플레이트에 계대하고, 10% 비동화 소 태아 혈청, 0.01% L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2 존재 하에서 밤새 배양하였다. pEGFP-N2-cPD-1, pEGFP-N2-cPD-L1, 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 0.4 ㎍/cm2를 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen 사)을 이용하여, COS-7 세포에 각각 도입하고 48시간 배양하였다(cPD-1-EGFP 발현 세포 및 cPD-L1-EGFP 발현 세포). 제작한 발현 세포에 있어서의 개 PD-1 및 PD-L1의 발현을 확인하기 위해서, 도립형(倒立型) 공초점 레이저 현미경 LSM700(ZEISS 사)에 의해, Enhanced green fluorescent protein(EGFP)의 세포내 국재(局在)를 가시화하였다(Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10;9(6):e98415.).
2.4 재조합 개 PD-1, PD-L1 및 CD80의 구축
개 PD-1, PD-L1 및 CD80의 예상 아미노산 서열에 의해 추정된 세포외 영역을 증폭하도록 5' 말단 측에 NheI 혹은 EcoRV(PD-1 및 PD-L1)의 인식 서열을 부가한 프라이머(cPD-1-Ig F 및 R, cPD-L1-Ig F 및 R), 또는 5' 말단 측에 EcoRV 혹은 KpnI(CD80)의 인식 서열을 부가한 프라이머(cCD80-Ig F 및 R)를 설계하였다. 합성한 비글 PBMC 유래 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하고, PCR 산물을 NheI(Takara 사) 및 EcoRV(Takara 사), 또는 EcoRV(Takara 사) 및 KpnI(New England Biolabs 사)에 의해서 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit(NIPPON Genetics 사)를 이용하여 정제하고, 동일한 제한효소 처리를 수행한 pCXN2.1-Rabbit IgG Fc 벡터(Niwa et al., 1991; Zettlmeissl et al.,1990; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 교수 요코미조 다케히코 박사에 의해 분여(分與)된 것을 당 연구실에서 개변)를 이용하여, 클로닝을 수행하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen 사)에 의해서 정제하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 각각 pCXN2.1-cPD-1-Ig, pCXN2.1-cPD-L1-Ig 혹은 pCXN2.1-cCD80-Ig이라고 표기하였다.
프라이머(cPD-1-Ig F): CGCGGCTAGCATGGGGAGCCGGCGGGGGCC(서열번호 33)
프라이머(cPD-1-Ig R): CGCGGATATCCAGCCCCTGCAACTGGCCGC(서열번호 34)
프라이머(cPD-L1-Ig F): CGCGGCTAGCATGAGAATGTTTAGTGTCTT(서열번호 35)
프라이머(cPD-L1-Ig R): CGCGGATATCAGTCCTCTCACTTGCTGGAA(서열번호 36)
프라이머(cCD80-Ig F): CGCGGATATCATGGATTACACAGCGAAGTG(서열번호 104)
프라이머(cCD80-Ig R): CGGGGTACCCCAGAGCTGTTGCTGGTTAT(서열번호 105)
이들 발현 벡터를 Expi293F 세포(Life Technologies 사)에 트랜스펙션(transfection)하고, 재조합 Ig 융합 단백질을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 생산한 재조합 단백질은 상청으로부터 Ab Capcher Extra(단백질 A 변이체, ProteNova 사)를 이용하여 정제를 수행하고, PD-MidiTrap G-25(GE Healthcare 사)를 이용하여 버퍼를 인산 완충 생리식염수(PBS; pH 7.4)에 치환하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다(cPD-1-I, cPD-L1-Ig 및 cCD80-Ig). 단백질의 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific 사)에 의해 정량하고, 이후의 실험에 이용하였다.
2.5 개 PD-L1에 교차 반응을 나타내는 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체의 동정
개 PD-L1에 교차 반응을 나타내는 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체를 동정하기 위해, 2.1에서 제작한 항-우 PD-L1 항체를 이용하여 플로우사이토메트리(flow cytometry)를 수행하였다. 2×105-1×106개의 세포에 대해, 10 ㎍/㎖의 항-우 PD-L1 항체를 실온에서 30분간 반응시키고, 세정한 후에 Allophycocyanine 표지 항-래트 Ig 염소 항체(Beckman Coulter 사)를 이용하여 항-우 PD-L1 항체의 검출을 수행하였다. 해석에는 FACS Verse(Becton, Dickinson and Company 사)를 이용하였다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 아이소타이프 컨트롤(BD Biosciences 사), 래트 IgG1(κ) 아이소타이프 컨트롤(BD Biosciences 사), 래트 IgM(κ) 아이소타이프 컨트롤(BD Biosciences 사)을 사용하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 10% 비동화 염소 혈청이 첨가된 PBS를 사용하였다(Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10;9(6):e98415. 소 PD-L1 모노클로날 항체 3종: 4G12; Rat IgG2a(κ), 5A2; Rat IgG1(κ), 및 6G7; Rat IgM(κ)을 사용한 논문).
2.6 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 수립을 위한 가변 부위의 선정 시험
이하, 개 PD-L1에 교차 반응을 나타낸 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 10 클론 중에서 4G12; Rat IgG2a(κ), 5A2; Rat IgG1(κ), 및 6G7; Rat IgM(κ)을 선발하고, 이들 항체가 개 PD-1/PD-L1 결합을 저해하는지 검토하였다. 즉, 개 PD-1-Ig(2.4로 제작)을 평저 96웰 플레이트 상에 고층화하고, 1% BSA 및 0.05% Tween20을 포함하는 PBS에서 블로킹 조작을 수행하였다. Lightning-Link Biotin Conjugation Kit(Innova Biosciences 사)를 이용하여 비오틴화한 개 PD-L1-Ig(2.4로 제작)을, 각 농도(0, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖)의 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12, 5A2 및 6G7과 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 플레이트에 첨가하고, cPD-L1-Ig의 cPD-1-Ig에 대한 결합을 Neutravidin-HRP(Thermo Fisher Scientific 사) 및 TMB one component substrate(Bethyl Laboratories 사)를 이용한 발색 반응에 의해 정량하였다. 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 6G7은 양호한 개 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 나타냈지만, 5A2는 결합 저해 활성을 가지지 않았다.(도 8)
2.7 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 발현 벡터의 제작(도 9)
이하, 2.6의 선정 시험에 의해서 개 PD-1/PD-L1 결합에 대해 양호한 저해 활성을 나타낸(도 8) 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체: 4G12 및 6G7을 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체의 가변부로 하여, 2 종류의 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체를 수립하였다.
래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 및 6G7을 생산하는 하이브리도마에 의해 가변 영역(중쇄 및 경쇄) 유전자를 동정하였다. 추가로, 당해 래트 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 이미 알고 있는 개 항체의 중쇄 IgG4의 정상 영역 및 경쇄 람다쇄의 정상 영역과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, 코돈 최적화를 수행한 후(서열번호 9 및 10(아미노산 서열), 서열번호 19 및 20(코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열)), NotI 제한효소 인식 서열, KOZAK 서열, 키메라 항체 경쇄 서열, 폴리A 부가 시그널 서열(PABGH), 프로모터 서열(PCMV), SacI 제한효소 인식 서열, 인트론 서열(INRBG), KOZAK 서열, 키메라 항체 중쇄 서열, XbaI 제한효소 인식 서열을 상기의 순서대로 배치하도록 유전자 합성을 수행하였다. 합성한 유전자 쇄를, 발현용 벡터 pDC6(홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수에 의해 분여)의 클로닝 사이트(PCMV 하류, INRBG와 PABGH의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한효소 인식 서열)에 제한효소 인식 서열을 이용하여 상기의 순서대로 배치하도록 조립(組入)하고(도 9), 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 발현 벡터를 구축하였다. 이 발현 벡터를 Expi293F 세포(Life Technologies 사)에 트랜스펙션하여, 키메라 항체를 포함하는 배양 상청을 얻었다. 상청으로부터 Ab Capcher Extra(단백질 A 변이체, ProteNova 사)를 이용하여 정제를 수행하고, 추가로 겔여과 크로마토그래피에 의해 정제를 수행하였다. 10% 아크릴아미드 겔을 이용하여 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, Quick-CBB kit(와코준야쿠 공업 사)에 의해 염색을 수행한 후, 증류수 중에서 탈색을 수행하였다. 단백질 A 정제만에서는 협잡 단백질이 인지되었지만, 겔여과 크로마토그래피 정제를 함으로써 순도가 높은 정제 항체를 얻었다(도 10). 얻어진 정제 항체는 플로우사이토메트리를 이용하여 개 PD-L1 발현 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음). 당해 키메라 항체 2종의 개 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 2.6에 나타낸 방법에 의해 검토한 결과, 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12는 기원이 된 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 4G12와 동일한 결합 저해 활성을 나타냈지만, 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c6G7에서는 결합 저해능이 분명하게 감약하였다(도 11). 따라서 치료용 항체로서 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 4G12의 가변 영역 서열(서열번호 2 및 1(아미노산 서열), 서열번호 16 및 15(코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열))를 조립한 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12를 선정하였다. c4G12의 L쇄의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 서열번호 9 및 19에, H쇄의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 서열번호 10 및 20에 나타낸다.
2.8 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 발현
2.7에서 사용한 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 발현 pDC6 벡터를 디하이드로 엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포(CHO-DG44(dfhr-/-))에 트랜스펙션하고, 고발현 클론을 닷블롯법에 의해 선발하였다. 추가로 60 nM의 메토트렉세이트(Mtx)를 포함하는 배지에서 부하를 가하는 것에 의해 유전자 증폭 처리를 수행하였다. 유전자 증폭 종료 후의 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 안정 발현 세포(클론명: 4.3F1)를, Mtx를 포함하지 않는 Opti-CHO 배지에 옮기고, 14일간의 진탕 배양을 수행하였다(125 rpm, 37℃, 5% CO2). 트리판블루 염색에 의해 세포 생존율을 산출하였다(도 12). ELISA법에 의해 배양 상청 중의 키메라 항체 생산량을 정량하였다(도 12). 14일째의 배양 상청을 10,000g으로 10분간 원심하고, 세포를 제외한 후, 0.22 ㎛의 필터를 통해, 항체의 정제 스텝을 진행하였다.
나아가, 배지를 Dynamis 배지로 바꾸고, 적절한 Feed를 수행함으로써, 항체 생산량이 종래의 대략 2배로 향상하였다(데이터는 나타내지 않음).
2.9. 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 정제
상기의 방법에 의해 준비한 배양 상청은, Ab Capcher Extra(ProteNova 사)를 이용하여 정제하였다. 레진에의 결합은 오픈컬럼법을 이용하고, 평형화 버퍼 및 세정 버퍼로서 PBS pH 7.4를 사용하였다. 용출 버퍼에는 IgG 용출 버퍼(Thermo Scientific 사)를, 중화 버퍼에는 1M Tris를 사용하였다. 정제한 항체는 Amicon Ultra-15(50 kDa, Millipore 사)를 이용하여 한외 여과법에 의해 농축과, PBS에의 버퍼 치환을 수행하였다. 0.22 ㎛의 필터를 통하여, 각 실험에 사용하였다.
2.10. 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 정제의 확인(도 13)
정제한 항체의 순도를 확인하기 위해, SDS-PAGE 및 CBB 염색에 의해 항체 단백질의 검출을 수행하였다. SuperSep Ace 5-20%(Wako 사) 그래디언트 겔을 이용하고, 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12를 환원 조건 하 및 비환원 조건 하에서 전기영동하였다. Quick-CBB kit(와코준야쿠 공업 사)에 의해 염색을 수행한 후, 증류수 중에서 탈색을 수행하였다. 항체에 상당하는 분자량의 위치에 밴드가 보이며, 협잡 단백질의 밴드는 시인되지 않았다.
2.11. 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 cPD-L1-His에 대한 결합 친화성의 측정
개 PD-L1의 예상 아미노산 서열에 의해 추정된 세포외 영역을 증폭하도록 5' 말단측에 NheI 인식 서열을 부가한 프라이머(cPD-L1-His F)와, 5' 말단측에 EcoRV 인식 서열 및 6x His 태그 서열을 부가한 프라이머(cPD-L1-His R)를 설계하였다. 합성한 비글 PBMC 유래 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하고, PCR 산물을 NheI(Takara 사) 및 EcoRV(Takara 사)에 의해서 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit(NIPPON Genetics 사)를 이용하여 정제하고, 동일한 제한효소 처리를 수행한 pCXN2.1 벡터(Niwa et al., 1991; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 교수 요코미조 다케히코 박사에 의해 분여)를 이용하여, 클로닝을 수행하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen 사)에 의해서 정제하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pCXN2.1-cPD-L1-His라고 표기하였다.
프라이머(cPD-L1-His F): CGCGGCTAGCATGAGAATGTTTAGTGTCTT(서열번호 106)
프라이머(cPD-L1-His R): CGCGGATATCTTAATGGTGATGGTGATGGTGAGTCCTCTCACTTGCTGG(서열번호 107)
발현 벡터를 Expi293F 세포(Life Technologies 사)에 트랜스펙션하고, 재조합 단백질을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 생산한 재조합 단백질은 상청으로부터 TALON Metal Affinity Resin(Clontech 사)을 이용하여 정제를 수행하고, Amicon Ultra-4 Ultracel-3(Merck Millipore 사)를 이용하여 버퍼를 PBS에 치환하고, 실험에 제공할 때까지 4℃에서 보존하였다(cPD-L1-His). 단백질의 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific 사)에 의해 정량하고, 이후의 실험에 이용하였다.
생체 분자 상호작용 측정기(Biacore X100)를 이용하여, 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 cPD-L1-His에 대한 결합 친화성(Avidity)을 평가하였다. 즉, 항히스티딘 항체를 CM5 센서칩에 고정하고, cPD-L1-His를 캡쳐한 후에, 모노클로날 항체를 피분석물(analyte)로서 첨가함으로써 특이적 결합을 관찰하였다. 양 항체 모두 특이적 결합을 나타내고, Avidity는 거의 동등하였다(표 1). 또, 동일하게 cPD-L1-His에 대한 개 PD-1-Ig 및 CD80-Ig의 Avidity를 측정한 결과, 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12와 비교하여 분명하게 결합 친화성이 낮았다(표 1).
표 1. 각 항체 및 재조합 단백질의 개 PD-L1-His에 대한 결합 친화성
2.12. 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 개 PD-1/PD-L1 결합 및 CD80/PD-L1 결합 저해 활성(도 14)
개 PD-1-Ig, PD-L1-Ig 및 CD80-Ig(전술)을 이용하여, 항-PD-L1 항체에 의한 개 PD-1/PD-L1 결합 및 CD80/PD-L1 결합 저해 시험을 수행하였다. 개 PD-1-Ig 혹은 CD80-Ig을 평저 96웰 플레이트 상에 고층화하고, 2.6에서 수행한 순서에 따라 각 농도(0, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖)의 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 혹은 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12와 반응시킨 개 PD-L1-Ig의 결합량을 평가하였다. 키메라 항체화에 의한 결합 저해 활성의 변화는 인지되지 않았다.
2.13. 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 개 면역 담당 세포 활성화 효과(도 15)
개 PBMC를 슈퍼 항원인 Staphylococcal Enterotoxin B(SEB) 자극화로 3일간 배양하고, 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12의 첨가에 의한 사이토카인 생산량의 변화를 Duoset ELISA canine IL-2 or IFN-γ(R&D systems 사)를 이용하여 ELISA법에 의해 정량하였다. 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12는 개 PBMC로부터의 IL-2 및 IFN-γ 생산량을 증대시켰다. 또 동일하게 SEB 자극 2일째의 배양액 중에 핵산 아날로그인 EdU를 첨가하고 2시간 배양 후, 그 취입을 Click-iT Plus EdU flow cytometry assay kit(Life Technologies 사)를 이용하여 플로우사이토메트리에 의해 정량한 결과, 개 CD4+ 또는 CD8+ 림프구에 있어서의 EdU 취입이 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 첨가에 의해 항진하고, 세포 증식능의 상승이 인지되었다.
2.14. 개에의 접종 시험에 이용하는 종양 이환견의 선발
본 치료법은 종양에 PD-L1이 발현하고 있는 경우로부터 효과가 전망되므로, 면역 조직화학염색법에 의해 개 종양부에 있어서의 PD-L1 발현 해석을 수행하였다. 포름알데히드 고정하고, 파라핀 포매(包埋)한 종양 조직을 마이크로톰으로 4 ㎛ 두께로 박절하고, 실란 코팅 슬라이드 글라스(마츠나미 글라스 공업 사)에 첨부·건조시킨 후, 크실렌·알코올로 탈파라핀 처리를 수행하였다. 구연산 버퍼{구연산(와코준야쿠 공업 사) 0.37 g, 구연산 3 나트륨 2 수화물(키시다 화학 사) 2.4 g, 증류수 1000 ㎖}에 침지하면서 마이크로웨이브로 10분간 항원 부활화 처리를 수행하고, 니치레이 자동 면역 염색 장치에 의해 염색을 수행하였다. 전처리로서, 0.3% 과산화수소를 포함하는 메탄올 용액에 실온에서 15분간 침지한 후, PBS로 세정하고, 항-우 PD-L1 모노클로날 항체를 첨가하고 실온에서 30분 반응시켰다. PBS로 세정 후, 히스토파인 심플 스테인 MAX-PO(Rat)(니치레이 바이오사이언스 사)를 첨가하고 실온에서 30분간 반응시킨 후, 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocholride로 발색하고, 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다. 종양 세포가 PD-L1 양성인 구강 내 멜라노마 및 미분화 육종 이환견을 이하의 접종 시험(임상시험)에 이용하였다. 항-우 PD-L1 모노클로날 항체는, 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 생산 하이브리도마(Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 2014 Aug;142(4):551-61.)에 의해 수립하였다.
2.15. 개에의 접종 시험
임상시험에서 개에 접종하는 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12에 대해서는, 협잡물이나 중합체 단백질을 제거하는 목적으로, 2.8에서 나타낸 절차에 의해 얻은 배양 상청으로부터 MabSelect SuRe LX(GE Healthcare 사)를 이용한 친화 크로마토그래피 정제를 수행한 후, BioScale CHT20-I prepacked column(Bio-Rad 사)을 이용하여 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 정제를 수행하였다. 집합물(aggregate)을 포함하는 분획(fraction)은 추가로 HiScreen Q-Sepharose HP prepacked column(GE Healthcare 사)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피 정제를 수행하였다.
(1) 안전성 시험: 개(비글, 피임 암컷, 13세, 체중 대략 10 ㎏)에, 수립한 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12 2 ㎎/㎏을 2주간 간격으로 전 3회 점적 정맥주사하였다. 아나필락시 외, 임상상 문제가 되는 부작용은 관찰되지 않았다.
(2) 임상시험 1: PD-L1 양성인 구강 내 멜라노마(도 16A) 재발견(再發犬)(미니어쳐 닥스훈트, 수컷, 11세, 체중 대략 7.5 ㎏)에, 수립한 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12　2 ㎎/㎏ 혹은 5 ㎎/㎏을 2주간 간격으로 22회 점적 정맥주사하였다. 치료 개시 10주 시점에서 현저한 종양의 축소가 인지되고, 치료 개시 34주 시점에서는 새로운 축소가 확인되었다(도 17). 44주간의 관찰 기간 중, 림프절이나 폐에의 전이도 인지되지 않았다. 베이스라인 때와 비교하여, 30% 이상의 종양 장경의 감소를 PR(부분 성공)이라고 정의하면, 16-20주 시점 및 34주 이후에 PR의 기준을 충족시키고 있었다(도 18).
(3) 임상시험 2: 원발소(原發巢)가 PD-L1 양성이고(도 16B), 전신의 근육내에 복수의 전이소(轉移巢)가 있는 미분화 육종 이환견(웨스트 하이랜드 화이트테리어, 거세 수컷, 12세, 체중 대략 8 ㎏)에 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12　5 ㎎/㎏을 2주간 간격으로 2회 점적 정맥주사하였다. 치료 개시 3주 시점에서 분명한 종양의 퇴축이 인지되었다(도 19).
(4) 임상시험 3: 원발소를 외과 수술로 적출한 구강 내 멜라노마 이환견(비글, 피임 암컷, 11세, 체중 대략 10 ㎏)에 대해, 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12　2 ㎎/㎏ 혹은 5 ㎎/㎏을 2주간 간격으로 9회 점적 정맥주사하였다. 치료 개시 18주 시점에서 복수의 폐 전이소가 소실하였다(도 20).
(5) 임상시험 4: 폐 전이가 있는 구강 내 멜라노마 이환견 4마리에 래트-개 키메라 항-PD-L1 항체 c4G12　2 ㎎/㎏ 혹은 5 ㎎/㎏을 2주간 간격으로 점적 정맥주사하였다. 관찰 기간 중에 분명한 종양의 축소는 보이지 않았지만, 폐 전이가 확인되고나서의 생존 기간은 대조군(항체 비투여, 히스토리컬 컨트롤군: n=15)과 비교하여 긴 경향이 있었기 때문에(도 21), 항체 투여에 의해 생존 기간이 연장된 가능성이 있다.
2.16. 항-PD-L1 항체의 CDR 해석
NCBI IGBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 이용하여, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 상보성 결정 영역(CDR)을 결정하였다. 결과를 도 22에 나타낸다.
[실시예 2]
요네병 이환우(罹患牛)에 있어서의 항-우 PD-L1 항체와 COX-2 저해제의 병용 효과의 검토
1. 서론
PD-1과 PD-L1의 상호작용은 병원체가 면역 응답을 회피하는 주요한 분자 기구 중 하나이며, 이들의 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 상호작용을 저해함으로써 항병원체 효과가 얻어지는 것이 보고되어 있다. 본 실시예에서는, 요네병에 대한 신규 제어법의 확립을 목표로 하고, COX-2 저해제에 의한 면역 활성화 효과와, 항-우 PD-L1 항체와의 병용에 의한 효과의 증강을 in vitro 시험에서 확인하였다.
2. 재료 및 방법, 실험 결과
2.1. PGE2의 면역 억제 효과의 검토
소에 있어서의 PGE2의 면역 억제 효과를 검토하기 위해서, 항-CD3 모노클로날 항체 및 항-CD28 모노클로날 항체로 자극한 비감염 소 유래 PBMC의 PGE2 존재 하에서의 증식능 및 사이토카인 생산능, 사이토카인이나 전사 인자의 유전자 및 PD-L1의 발현량의 변화를 평가하였다.
(1) PGE2에 의한 세포 증식능의 변화
요네균 비감염 소(이하, 비감염 소) 유래 말초혈 단핵구(PBMC)를 96웰 플레이트(Corning 사)에 4×105개씩 파종하고, 10% 비동화 소 태아 혈청(Thermo Fisher Scientific 사), 항생 물질(스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 페니실린 100 U/㎖)(Thermo Fisher Scientific 사), 2 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific 사)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich 사)를 이용하여 37℃, 5% CO2 존재 하에서 3일간 배양하였다. PBMC는 Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester(CFSE, Invitrogen 사)에 의해서 표지하였다. 배지에는 2.5 nM로부터 2,500 nM까지 10배 단계 희석한 PGE2(Cayman Chemical 사) 혹은 음성 대조로서 인산 완충 생리식염수(PBS, pH 7.2, 와코준야쿠 공업 사)를 가하고, 합계 200 ㎕로 하였다. T세포에의 자극으로서 1 ㎍/㎖의 항-CD3 모노클로날 항체(MM1A; Washington State University Monoclonal Antibody Center) 및 1 ㎍/㎖의 항-CD28 모노클로날 항체(CC220; Bio-Rad 사)를 가하였다. 배양 후, PBMC를 회수하고 플로우사이토메트리법에 의해 해석을 수행하였다. 비특이적 반응을 막기 위해서 10% 비동화 염소 혈청(Thermo Fisher Scientific 사)이 첨가된 PBS를 각 웰에 100 ㎕ 가하고, 실온에서 15분 정치하였다. 세정 후, Alexa Fluor 647 표지 항-CD4 모노클로날 항체(CC30; Bio-Rad 사), peridinin-chlorophyII-protein complex/cyanin 5.5(PerCp/Cy 5.5) 표지 항-CD8 모노클로날 항체(CC63; Bio-Rad 사) 및 phycoerythrin/cyanin 7(PE/Cy7) 표지 항-IgM 모노클로날 항체(IL-A30; Bio-Rad 사)를 실온에서 20분 반응시켰다. 항-CD4 모노클로날 항체(CC30)는 Zenon Mouse IgG1 labeling Kits(Thermo Fisher Scientific 사)를 이용하여 Alexa Fluor 647을 표지하였다. 항-CD8 모노클로날 항체(CC63) 및 항-IgM 모노클로날 항체(IL-A30)는 Lightning-Link Conjugation Kit(Innova Biosciences 사)를 이용하여 PerCp/Cy5.5 및 PE/Cy7을 각각 표지하였다. 반응 후 2회 세정하고, FACS Verse(BD Biosciences 사) 및 FCS Express 4(De Novo Software 사)를 이용하여 해석하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)이 첨가된 PBS를 사용하였다.
(2) PGE2에 의한 사이토카인 생산량의 변화
비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, (1)과 동일하게 3일간 배양하였다(TNF-α 생산량의 해석은 PGE2 2,500 nM의 자극 배양만 실시). 3일 후, 배양 상청을 회수하고, IFN-γ의 생산량은 ELISA for Bovine IFN-γ(MABTECH 사), TNF-α의 생산량은 Bovine TNF alpha Do-It-Yourself ELISA(Kingfisher Biotech 사)를 이용하여 측정하였다. 측정에는 마이크로플레이트 리더 MTP-900(코로나 전기 사)을 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
(1), (2)의 실험 결과를 도 23에 나타낸다. PGE2를 25 nM, 250 nM 및 2,500 nM 첨가한 군에서, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포의 유의한 증식 억제가 확인되었다(도 23 a, b). IFN-γ 생산도 동일하게, PGE2를 25 nM, 250 nM 및 2,500 nM 첨가한 군에서 유의하게 억제되었다(도 23c). 추가로, PGE2를 2,500 nM 첨가한 군에서, TNF-α 생산도 유의하게 억제되었다(도 23d). 이상의 결과에 의해, 소에서도 PGE2가 면역 억제 효과를 가지는 것이 나타났다.
(3) PGE2에 의한 사이토카인 등의 mRNA 발현량의 변화
비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 1×106개씩 파종하고, 2,500 nM PGE2 혹은 DMSO 존재 하에서 3일간 배양하였다. 배양 후의 PBMC로부터 TRI 시약(Molecular Research Center 사)을 이용하여 전세포(全細胞) RNA를 추출하고, PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa 사) 및 Oligo-dT 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로서, SYBR Premix DimerEraser(TaKaRa사)와 각 유전자에 특이적인 프라이머 각 3 pmol을 포함하는 10 ㎕의 반응액으로 실시간 PCR (LightCycler480 System Ⅱ; Roche 사)을 수행하고, 각 유전자 발현량의 변화를 관찰하였다.
프라이머(boIL2 F): TTT TAC GTG CCC AAG GTT AA(서열번호 119)
프라이머(boIL2 R): CGT TTA CTG TTG CAT CAT CA(서열번호 120)
프라이머(boIL10 F): TGC TGG ATG ACT TTA AGG G(서열번호 121)
프라이머(boIL10 R): AGG GCA GAA AGC GAT GAC A(서열번호 122)
프라이머(boIFNγ F): ATA ACC AGG TCA TTC AAA GG(서열번호 123)
프라이머(boIFNγ R): ATT CTG ACT TCT CTT CCG CT(서열번호 124)
프라이머(boTNFα F): TAA CAA GCC AGT AGC CCA CG(서열번호 125)
프라이머(boTNFα R): GCA AGG GCT CTT GAT GGC AGA(서열번호 126)
프라이머(boTGFβ1 F): CTG CTG AGG CTC AAG TTA AAA GTG(서열번호 127)
프라이머(boTGFβ1 R): CAG CCG GTT GCT GAG GTA G(서열번호 128)
프라이머(boFoxp3 F): CAC AAC CTG AGC CTG CAC AA(서열번호 129)
프라이머(boFoxp3 R): TCT TGC GGA ACT CAA ACT CAT C(서열번호 130)
프라이머(boSTAT3 F): ATG GAA ACA ACC AGT CGG TGA(서열번호 131)
프라이머(boSTAT3 R): TTT CTG CAC ATA CTC CAT CGC T(서열번호 132)
프라이머(boACTB F): TCT TCC AGC CTT CCT TCC TG(서열번호 133)
프라이머(boACTB R): ACC GTG TTG GCG TAG AGG TC(서열번호 134)
프라이머(boGAPDH F): GGC GTG AAC CAC GAG AAG TAT AA(서열번호 135)
프라이머(boGAPDH R): CCC TCC ACG ATG CCA AAG T(서열번호 136)
실시간 PCR의 반응 조건은 이하와 같이 하였다.
열변성 95℃ 5초간(첫회만 30초간)
어닐링 60℃ 30초간
신장 반응 72℃ 30초간
열변성, 어닐링 및 신장 반응을 45 사이클 반복한 후, 융해 곡선 해석을 위해서 65℃에서 95℃까지 0.1℃/초로 상승시켰다. 증폭 산물의 융해 온도를 계측하고, 특이성의 확인을 수행하였다. 각 샘플에 대해 내부 표준으로서 ACTB 유전자 및 GAPDH 유전자 발현량을 정량하였다.
(3)의 실험 결과를 도 24에 나타낸다. PGE2의 첨가에 의해, PBMC에 있어서의 IFNγ, IL2 및 TNFα의 유전자 발현량이 유의하게 감소하였다. 한편으로, PGE2는 PBMC에 있어서의 IL10, STAT3, Foxp3 및 TGFβ1의 유전자 발현량을 유의하게 증가시켰다.
(4) PGE2에 의한 PD-L1 발현량의 변화
비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 1×106개씩 파종하고, (1)과 동일한 배양 조건에서 24시간 배양하였다. (3)과 동일하게, 배양 후의 PBMC로부터 전세포 RNA를 추출하여, cDNA를 합성하였다. 그리고, PDL1 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
프라이머(boPDL1 F): GGG GGT TTA CTG TTG CTT GA(서열번호 137)
프라이머(boPDL1 R): GCC ACT CAG GAC TTG GTG AT(서열번호 138)
또, 플로우사이토메트리법에 의해 배양 후의 PBMC에 있어서의 PD-L1 단백질의 발현을 해석하였다. 회수한 PBMC에 10% 비동화 염소 혈청(Thermo Fisher Scientific 사)이 첨가된 PBS를 각 웰에 100 ㎕ 가하고, 실온에서 15분 정치하였다. 세정 후, 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Rat IgG2a; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.) 혹은 래트 IgG2a 아이소타이프 컨트롤(BD Bioscience 사)을 첨가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 세정을 2회 수행한 후, allophycocyanin(APC) 표지 항-래트 Ig 항체(Southern Biotech 사)를 가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 2회 세정을 수행하고, FACS Verse (BD Biosciences 사) 및 FCS Express 4(De Novo Software 사)를 이용하여 해석하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)이 첨가된 PBS를 사용하였다.
(3)의 실험 결과를 도 25에 나타낸다. PGE2를 첨가하여 배양한 비감염 소 유래 PBMC에서는, PD-L1 mRNA(도 25a) 및 단백질(도 25b)의 발현이 유의하게 상승하였다. 이상의 결과에 의해, 소에서도 PGE2가 PD-L1 발현에 영향을 줄 가능성이 나타났다.
2.2. 소 PBMC에 있어서의 COX-2 저해제의 면역 활성화 효과의 검토
소에 있어서의 COX-2 저해제의 면역 활성화 효과를 검토하기 위해, 항-CD3 모노클로날 항체 및 항-CD28 모노클로날 항체 자극하의 PBMC 배양 시험에, COX-2 저해제(멜록시캄)를 첨가하고, 비감염 소 유래 PBMC의 증식능 및 사이토카인 생산능을 평가하였다.
비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, 1,000 nM의 멜록시캄(Signa-Aldrich 사) 혹은 음성 대조로서 DMSO 존재 하에서 3일간 배양하였다. T세포 자극으로서 1 ㎍/㎖의 항-CD3 모노클로날 항체(MM1A; Washington State University Monoclonal Antibody Center) 및 1 ㎍/㎖의 항-CD28 모노클로날 항체(CC220; Bio-Rad 사)를 가하였다. 3일 후, 전술의 2.1.(1) 및 (2)와 동일하게 하여 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 26에 나타낸다. 멜록시캄을 첨가한 군에서 CD8 양성 세포의 증식율이 유의하게 상승하고(도 26a), 또, IFN-γ 및 TNF-α의 생산량도 유의하게 증가하였다(도 26 b, c). 이상의 결과에 의해, 소에서도 COX-2 저해제가 면역 활성화 효과를 가지는 것이 나타났다.
2.3. 요네균 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석
소의 만성 감염증과 PGE2의 관련을 분명히 하기 위해, 요네균 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석을 수행하였다.
(1) 혈청 PGE2 양의 측정
우선, 자연 감염에 의해 요네병을 발증한 소의 혈청 및 비감염 소의 혈청 중에 포함되는 PGE2 양을 ELISA법에 따라 정량하였다. 자연 감염에 의한 요네병 발증 소의 혈청(농연기구, 동물위생연구부문, 모리 야스유키 박사에 의해 분여)에 포함되는 PGE2의 양을 Prostaglandin E2 Express ELISA Kit(Cayman Chemical 사)에 의해서 정량하였다. 측정에는 마이크로플레이트 리더 MTP-900(코로나 전기 사)을 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
(1)의 실험 결과를 도 27a에 나타낸다. 비감염 소와 비교하여, 요네병 발증 소에서는 혈청 중의 PGE2 양이 유의하게 증가하고 있었다.
(2) 요네 항원 자극에 의한 PGE2 생산량의 변화
요네 항원에 의해서 PGE2의 생산이 촉진되는 것을 확인하기 위해, 요네균 실험 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC를 요네 항원과 배양하고, 배양 상청 중의 PGE2 양을 ELISA법에 의해 정량하였다. 요네균 실험 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, 1 ㎍/㎖의 요네균 항원 존재 하에서 5일간 배양하였다. 요네균 항원으로서 Johnin Purified Protein Derivative(J-PPD)를 이용하였다. 또, 항원 자극에 의한 PGE2 생산이 COX-2 저해제에 의해서 억제되는 것을 확인하기 위해, 배지에 1 ㎍/㎖의 J-PPD 및 1,000 nM의 멜록시캄(Signa-Aldrich 사)을 가하였다. 5일 후, 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중에 포함되는 PGE2의 양을 Prostaglandin E2 Express ELISA Kit(Cayman Chemical 사)에 의해서 정량하였다.
(2)의 실험 결과를 도 27 b 및 c에 나타낸다. 요네균 실험 감염 소에서, 요네 항원을 가함으로써 PBMC로부터의 PGE2 생산이 유의하게 촉진되었다(도 27c). 한편으로, 비감염 소에서는 유의한 차이가 인지되지 않고(도 27b), J-PPD에 의한 요네균 실험 감염 소로부터의 PGE2 생산의 촉진은, 요네균에 대한 특이적인 응답인 것이 분명해졌다. 또, 그 조건 하에 COX-2 저해제를 첨가하여 배양하는 것에 의해서, PGE2의 생산이 유의하게 억제되었다(도 27c).
(3) 요네 항원 자극에 의한 COX2 발현량의 변화
요네균 실험 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 1×106개씩 파종하고, J-PPD 존재 하에서 24시간 배양하였다. 배양 후, PBMC를 회수하고, 전술한 방법으로 전세포 RNA를 추출하여, cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하고, COX2 특이적 프라이머를 이용하여 상술한 방법에 따라 실시간 PCR을 수행하였다.
프라이머(boCOX2 F): ACG TTT TCT CGT GAA GCC CT(서열번호 139)
프라이머(boCOX2 R): TCT ACC AGA AGG GCG GGA TA(서열번호 140)
(3)의 실험 결과를 도 27d에 나타낸다. 요네 항원 자극에 의해, 요네균 실험 감염 소에서 COX2 발현량이 유의하게 증가하였다. 이상의 결과에 의해, 요네균 감염 소에서, 요네 항원 자극에 의해서 COX-2의 발현이 상승하고, 그에 따라 PGE2의 생산이 촉진되는 것이 시사되었다.
2.4. 요네균 항원 자극에 의한 PD-L1 발현량의 변화
요네균 감염 소에서, 요네 항원 자극이 PD-L1 발현량에 주는 영향을 평가하였다. 요네균 실험 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 1×106개씩 파종하고, 요네 항원 존재 하에서 24시간 배양하였다. 배양 후의 PBMC를 회수하고, 플로우사이토메트리법에 의해 림프구, CD4 양성 T세포, CD8 양성 T세포, IgM 양성 세포 및 CD14 양성 세포 상의 PD-L1 발현을 해석하였다. 10% 비동화 염소 혈청(Thermo Fisher Scientific 사)이 첨가된 PBS를 각 웰에 100 ㎕ 가하고, 실온에서 15분 정치하였다. 세정 후, 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Rat IgG2a; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.) 혹은 래트 IgG2a 아이소타이프 컨트롤(BD Bioscience 사)을 첨가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 세정을 2회 수행한 후, 2차 항체를 가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 2차 항체로서, T세포 및 IgM 양성 세포 상의 PD-L1의 발현 해석에는 phycoerythrin(PE) 표지 항-CD3 모노클로날 항체(MM1A; Washington State University Monoclonal Antibody Center), fluorescein isothiocyanate(FITC) 표지 항-CD4 모노클로날 항체(CC8; Bio-Rad 사), PerCp/Cy 5.5 표지 항-CD8 모노클로날 항체(CC63; Bio-Rad 사), PE/Cy7 표지 항-IgM 모노클로날 항체(IL-A30; Bio-Rad 사) 및 APC 표지 항-래트 Ig 항체(Southern Biotech 사)를 이용하였다. 항-CD3 모노클로날 항체(MM1A)는 Zenon Mouse IgG1 labeling Kit를 이용하여 PE를 표지하였다. CD14 양성 세포 상의 PD-L1의 발현 해석에는 PerCp/Cy5.5 표지 항-CD14 모노클로날 항체(CAM36A; Washington State University Monoclonal Antibody Center) 및 APC 표지 항-래트 Ig 항체(Southern Biotech 사)를 이용하였다. 항-CD14 모노클로날 항체(CAM36A)는, Lightning-Link Conjugation Kit를 이용하여 PerCp/Cy5.5를 표지하였다. 반응 후, 2회 세정을 수행하고, FACS Verse(BD Biosciences 사) 및 FCS Express 4(De Novo Software 사)를 이용하여 해석하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)이 첨가된 PBS를 사용하였다.
실험 결과를 도 28에 나타낸다. 비감염 소와 비교하여, 요네균 실험 감염 소에서, 요네 항원을 가한 군에서 유의하게 PD-L1의 발현율이 증가하는 것이 나타났다(도 28a). 요네균 실험 감염 소의 CD4 양성 T세포, CD8 양성 T세포, IgM 양성 B세포 및 CD14 양성 세포에서도, 요네 항원 자극에 의해서 PD-L1의 발현율이 증가하였다(도 28 b-e).
2.5. 요네병 병변부에서의 PGE2, EP2 및 PD-L1의 발현 해석
다음에, 요네병의 병변부에 있어서의 PGE2 및 EP2의 발현 해석을 면역조직화학 염색법에 의해 수행하였다. 요네병의 야외 발증 소(#1, 설사나 중증의 수척 등 요네병의 임상 증상을 나타냄), 요네균 실험 감염 소(#65, 배균 및 설사 등의 임상 증상이 관찰됨; Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y and Ohashi K. Infect Immun, 84:77-89, 2016.) 및 비감염 컨트롤 소(C#6)의 회장(回腸) 조직 블록(농연기구, 동물위생연구부문, 모리 야스유키 박사에 의해 분여)을 이용하여, 면역조직화학 염색을 수행하였다. 4% 파라포름알데하이드{파라포름알데하이드 20g, PBS(pH 7.4) 500㎖}를 이용하여 고정하고, 파라핀 포매한 샘플을 마이크로톰으로 4 mm 두께로 박절하고, 실란 코팅 슬라이드 글라스(마츠나미 글라스 공업 사)에 첨부, 건조시킨 후, 크실렌알코올로 탈파라핀 처리를 수행하였다. 구연산 완충액{구연산 0.37g, 구연산 3 나트륨 2 수화물 2.4g, 증류수 1,000 ㎖}에 침지하면서 마이크로웨이브로 10분간 항원 부활화 처리를 수행하고, 니치레이 자동 면역 염색 장치에 의해 염색을 수행하였다. 전처리로서, 0.3% 과산화수소를 포함하는 메탄올 용액에서 실온에서 15분간 침지한 후, PBS로 세정하고, 항-PGE2 폴리클로날 항체(Abcam 사), 항-EP2 모노클로날 항체(EPR8030(B); Abcam 사) 혹은, 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체(6C11-3A11; Rat IgG2a; 일본 출원번호 2017-61389, Konnai S, Ohashi K, Murata S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Takagi S, Kagawa Y, Suzuki S, Nakajima C. PD-L1 검출용 항-PD-L1 항체.)를 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세정 후, 히스토파인 심플 스테인 MAX-PO(니치레이 바이오사이언스 사)를 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 3,3＇-diaminobenzidine tetrahydrocholride로 발색하고, 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.
실험 결과를 도 29에 나타낸다. Ziehl-Neelsen 염색에 의해서 요네균이 확인된 회장 병변부(야외 발증 소 #1 및 실험 감염 소 #65)에서, PGE2, EP2 및 PD-L1이 강하게 발현하고 있었다(도 29 a-d). 한편, 비감염 소(C#6)의 회장에서는, EP2의 발현은 확인되었지만, PGE2 및 PD-L1은 거의 발현하고 있지 않았다(도 29 a-d). 이들 결과에 의해, 요네병의 병변부에서 PGE2의 생산 및 PD-L1의 발현이 항진하고 있을 가능성이 나타났다.
2.6. COX-2 저해제에 의한 요네균 특이적 면역 응답의 활성화 효과의 검토
COX-2 저해제가 요네균 항원 특이적인 면역 응답에 대한 활성화 효과를 가지고 있는 것을 확인하기 위해서, 멜록시캄 및 요네 항원을 첨가하여 배양하고, 요네균 실험 감염 소 유래 PBMC의 증식능 및 사이토카인 생산능을 평가하였다. 요네균 실험 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, 1 ㎍/㎖의 J-PPD 및 1,000 nM의 멜록시캄(Signa-Aldrich 사) 존재 하에서 5일간 자극 배양하였다. 배양 후, 전술의 방법과 동일하게 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 30에 나타낸다. 요네균 실험 감염 소에서는, 멜록시캄의 첨가에 의해 CD8 양성 세포의 증식율(도 30a), IFN-γ의 생산량(도 30b) 및 TNF-α의 생산량(도 30c)의 유의한 증가가 관찰되었다. 이상의 결과에 의해, COX-2 저해제가 요네 항원 특이적인 T세포 응답에 대한 활성화 효과를 가지고 있는 것이 나타났다.
2.7. 요네균 감염 소에 있어서의 래트 항-우 PD-L1 항체의 면역 활성화 효과의 검토
래트 항-우 PD-L1 항체가, 요네균 감염 소에서도 면역 활성화 효과를 가지고 있는 것을 확인하기 위해서, 래트 항-우 PD-L1 항체 존재 하에서 PBMC 자극 배양 시험을 수행하고, 요네균 특이적인 T세포 응답을 평가하였다. 요네균 실험 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, 1 ㎍/㎖의 J-PPD 존재 하에서 5일간 자극 배양하였다. 자극 배양시에, 블록 항체로서 1 ㎍/㎖의 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.) 혹은 음성 대조 항체로서 동량의 래트 혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 가하였다. 배양 후, 전술의 방법과 동일하게 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 31에 나타낸다. 요네균 실험 감염 소에서는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 첨가에 의해 CD8 양성 세포의 증식율(도 30a), IFN-γ의 생산량(도 30b) 및 TNF-α의 생산량(도 30c)의 유의한 증가가 관찰되었다. 이상의 결과에 의해, PD-1/PD-L1 저해가 요네 항원 특이적인 T세포 응답에 대한 활성화 효과를 가지고 있는 것이 나타났다.
2.8. COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과의 검토
다음에, 요네균 실험 감염 소에서 COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과를 검토하였다. 요네균 실험 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, 요네 항원 혹은 음성 대조 항원 존재 하에서 5일간 배양하였다. 음성 대조 항원으로서 Mycobacterium bovis BCG주 유래 정제 단백(B-PPD)을 이용하였다. 배지에는 1,000 nM의 멜록시캄(Sigma-Aldrich 사) 및 1　㎍/㎖의 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.)를 가하고, 합계 200 ㎕로 하였다. 멜록시캄의 음성 대조로서 DMSO를, 음성 대조 항체로서 래트 혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 이용하였다. 배양 후, 전술의 방법과 동일하게 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 32에 나타낸다. 음성 대조군과 비교하여, 멜록시캄과 래트 항-우 PD-L1 항체를 가한 군에서 CD8 양성 세포의 증식율이 유의하게 증가하고 있었다(도 32a). 음성 대조 항원 자극을 가한 경우에서는 동일한 변화가 관찰되지 않았던 것으로부터, COX-2 저해제와 항-우 PD-L1 모노클로날 항체의 병용에 의해서, 요네 항원 특이적인 CD8 양성 세포 응답이 활성화되고 있을 가능성이 나타났다(도 32a). IFN-γ 생산량에 관해서는, 요네 항원 자극을 가한 경우, 음성 대조 항원 자극을 가한 경우 모두 유의한 변화는 확인되지 않았다(도 32b). 이상의 결과에 의해, 요네균 감염 소에서, COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의해서, 각각을 단제로 이용할 때보다도 큰 면역 활성화 효과를 나타낼 가능성이 나타났다.
2.9. COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과의 검토
마지막으로, 요네균 실험 감염 소에서 COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과를 검토하였다. 요네균 실험 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, 요네 항원 혹은 음성 대조 항원 존재 하에서 5일간 배양하였다. 음성 대조 항원으로서 Mycobacterium bovis BCG주 유래 정제 단백(B-PPD)을 이용하였다. 배지에는 1,000 nM의 멜록시캄 및 1　㎍/㎖의 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체(ch4G12; 일본 출원번호 2016-159089, Konnai S, Ohashi K, Murata S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Suzuki S, Nakajima C. 소를 위한 항-PD-L1 항체.)를 가하고, 합계 200 ㎕로 하였다. 멜록시캄의 음성 대조로서 DMSO를, 음성 대조 항체로서 소혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 이용하였다. 배양 후, 전술의 방법과 동일하게 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 33에 나타낸다. 요네균 감염 소에서 병용 효과를 평가한 결과, 래트 항-우 PD-L1 항체를 이용한 경우와 동일하게, COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 병용에 의해서, 요네 항원 특이적인 CD8 양성 세포 응답이 활성화되고 있을 가능성이 나타났다(도 33a). IFN-γ 생산량에 관해서는, 요네 항원 자극을 가한 경우, 음성 대조 항원 자극을 가한 경우 모두 유의한 변화는 확인되지 않았다(도 33b). 이상의 결과에 의해, 요네균 감염 소에서, COX-2 저해제와 PD-1/PD-L1 저해제의 병용에 의한 면역 활성화 효과가 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체를 이용한 경우에서도 나타났다.
[실시예 3]
소백혈병 바이러스 감염 소에 있어서의 항-우 PD-L1 항체와 COX-2 저해제의 병용 효과의 검토
1. 서론
PD-1과 PD-L1의 상호작용은 병원체가 면역 응답을 회피하는 주요한 분자 기구 중 하나이며, 이들의 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 상호작용을 저해함으로써 항병원체 효과가 얻어지는 것이 보고되어 있다. 본 실시예에서는, 소백혈병 바이러스(BLV) 감염증에 대한 신규 제어법의 확립을 목표로 하고, COX-2 저해제에 의한 면역 활성화 효과와, 항-우 PD-L1 항체와의 병용에 의한 효과의 증강을 in vitro 시험에서 확인하였다.
2. 재료 및 방법, 실험 결과
2.1. BLV 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석
소의 만성 바이러스 감염증인 BLV 감염증의 병태 진행에 있어서의 PGE2의 관련을 분명히 하기 위해, BLV 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석을 수행하였다.
(1) 혈장 PGE2 양의 측정 및 타지표와의 상관 해석
우선, BLV 감염 소의 혈장 중에 포함되는 PGE2 양을 Prostaglandin E2 Express ELISA Kit(Cayman Chemical 사)에 의해서 정량하였다. 측정에는 마이크로플레이트 리더 MTP-900(코로나 전기 사)을 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 추가로, 혈장 PGE2 양과 말초혈의 림프구 수 혹은 IgM 양성 세포에 있어서의 PD-L1의 발현율과의 상관을 조사하였다. BLV 감염 소로부터 분리한 PBMC에 대해 플로우사이토메트리 해석을 수행하고, IgM 양성 세포 상의 PD-L1 발현을 측정하였다. 우선, 항체의 비특이 반응을 저해하기 위해서 PBMC에 10% 비동화 염소 혈청(Thermo Fisher Scientific 사)이 첨가된 PBS를 각 웰에 100 ㎕ 가하고, 실온에서 15분 정치하였다. 세정 후, 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Rat IgG2a; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.) 혹은 래트 IgG2a 아이소타이프 컨트롤(BD Bioscience 사)을 첨가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 세정을 2회 수행한 후, PE/Cy7 표지 항-IgM 모노클로날 항체(IL-A30; Bio-Rad 사) 및 APC 표지 항-래트 Ig 항체(Southern Biotech 사)를 가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 항-IgM 모노클로날 항체(IL-A30)는, Lightning-Link Conjugation Kit를 이용하여 PE/Cy7을 표지하였다. 반응 후, 2회 세정을 수행하고, FACS Verse(BD Biosciences 사) 및 FCS Express 4(De Novo Software 사)를 이용하여 해석하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)이 첨가된 PBS를 사용하였다.
(1)의 실험 결과를 도 34에 나타낸다. BLV 감염증의 병태 진행(AL: aluekemic, 무증후; PL: persistent lymphocytosis, 림프구 증다증(增多症))에 수반하여, 혈장 중의 PGE2 양이 유의하게 증가하고 있었다(도 34a). BLV 감염증의 병태 진행의 지표인 말초혈 중의 림프구 수와 혈장 PGE2 양의 상관을 검토한 결과, 정의 상관이 인지되었다(도 34b). 또, PGE2 양과 IgM 양성 세포에 있어서의 PD-L1의 발현율의 상관을 검토한 결과, 정의 상관이 있는 것이 나타났다(도 34c). 이들 결과에 의해, BLV 감염증의 병태 진행이나, 그에 따르는 면역 억제에 PGE2가 관여하고 있는 것이 시사되었다.
(2) BLV 감염 소에 있어서의 COX2 및 EP4의 발현 해석
추가로 상세한 해석을 수행하기 위해서, 혈장 PGE2 양에 더하여, PGE2의 합성에 관여하는 COX2 유전자 및 면역 억제 시그널을 보내는 PGE2 수용체인 EP4의 유전자의 발현량을 실시간 PCR법에 의해 정량하였다. BLV 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC, CD4 양성 세포, CD8 양성 세포, CD14 양성 세포 및 CD21 양성 세포로부터, 실시예 2 2.1.(3)에서 전술한 방법으로 전세포 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, COX2(실시예 2 2.3.(3)에서 전술) 및 EP4 특이적 프라이머를 이용하여 실시예 2에서 기술한 방법에 따라 실시간 PCR을 수행하였다.
프라이머(boEP4 F): GTG ACC ATC GCC ACC TAC TT(서열번호 141)
프라이머(boEP4 R): CTC ATC GCA CSG ATG ATG CT(서열번호 142)
(2)의 실험 결과를 도 35에 나타낸다. 병태가 진행한 PL소에서 EP4의 유전자 발현량이 상승하고 있는 것이 확인되었다(도 35a). COX2 유전자 발현량에 관해서도 동일하게, PL소에서 상승하고 있는 것이 나타났다(도 35b). PGE2의 생산 세포를 검토하기 위해, CD4, CD8, CD21 및 CD14 양성 세포에 있어서의 COX2 유전자 발현량을 정량한 결과, PL소의 CD4, CD8 및 CD21 양성 세포에서, COX2 유전자 발현량이 증가하고 있는 것이 분명해졌다(도 35 c-e). CD14 양성 세포에 관해서는, PL소의 시료를 이용한 평가는 되어 있지 않지만, 비감염 소와 비교하여 AL소에서 COX2 유전자 발현량에 증가 경향이 인지되었다(도 35f). 이들 결과에 의해, BLV 감염증의 병태 진행에 수반하여, 다양한 세포군에서 COX-2의 발현이 상승하고 있는 것이 나타났다.
(3) BLV 항원 자극에 의한 PGE2 생산량의 변화
BLV 감염증에서는, 항원 자극에 의해서 COX2의 발현량이 증가한다고 보고되어 있다(Pyeon D, Diaz FJ, Splitter GA. J Virol. 74:5740-5745, 2000.). 이로부터, 항원 자극에 의해서 BLV 감염 소 유래 PBMC로부터의 PGE2 생산도 촉진될 것으로 예상된다. 이 가설을 검증하기 위해서, BLV 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC를 BLV 항원과 함께 배양하고, 배양 상청 중의 PGE2 양을 ELISA법에 의해 정량하였다. BLV 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, BLV 항원(최종 농도 2%) 존재 하에서 6일간 배양하였다. BLV 항원으로서, BLV 지속 감염 양(羊) 태아 신장 세포(FLK-BLV)의 배양 상청을 65℃에서 열처리한 것을 이용하였다. 또, 항원 자극에 의한 PGE2 생산이 COX-2 저해제에 의해서 억제되는 것을 확인하기 위해, 배지에 BLV 항원 및 1,000 nM의 멜록시캄(Signa-Aldrich 사)을 가한 조건도 준비하였다. 6일 후, 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중에 포함되는 PGE2 양을 Prostaglandin E2 Express ELISA Kit(Cayman Chemical 사)에 의해서 정량하였다.
(3)의 실험 결과를 도 36에 나타낸다. BLV 감염 소(AL: 도 36b, PL: 도 36c)에서, BLV 항원을 가함으로써 PBMC로부터의 PGE2 생산이 유의하게 촉진되는 것이 나타났다(도 36 b, c). 비감염 소에서 유의한 차이가 인지되지 않고(도 36a), BLV 항원에 의한 BLV 감염 소 유래 PBMC로부터의 PGE2 생산의 촉진은, BLV에 대한 특이적인 응답인 것이 분명해졌다. 또, 그 조건 하에 COX-2 저해제를 첨가하여 배양하는 것에 의해서, PGE2의 생산이 유의하게 억제되는 것이 확인되었다(도 36 b, c).
(4) PGE2가 BLV 프로바이러스 양에 주는 영향
다양한 만성 감염증에서, PGE2가 바이러스의 복제를 조장하고 있을 가능성이 나타나고 있다(Pyeon D, Diaz FJ, Splitter GA. J Virol. 74:5740-5745, 2000; Waris D, Siddiqui A. J Virol. 79:9725-9734, 2005.). 여기서, BLV 감염증에서 PGE2가 바이러스의 복제에 주는 영향을 평가하기 위해서, BLV 감염 소 유래 PBMC를 PGE2와 배양하고, BLV의 프로바이러스 양을 실시간 PCR법에 의해 정량하였다. BLV 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 1×106개씩 파종하고, 2,500 nM PGE2 혹은 DMSO 존재 하에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 회수한 PBMC로부터 Wizard DNA Purification kit(Promega 사)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 농도는, Nanodrop 8000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific 사)를 이용하여 측정한 흡광도(260 nm)를 기준으로서 정량하였다. PBMC 중의 BLV 프로바이러스 양을 측정하기 위해, Cycleave PCR Reaction Mix SP(TaKaRa 사) 및 소백혈병 바이러스 검출용 Probe/Primer/Positive control(TaKaRa 사)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 측정에는 LightCycler480 System Ⅱ(Roche Diagnosis 사)를 이용하였다.
(4)의 실험 결과를 도 37에 나타낸다. PGE2를 첨가한 군에서 프로바이러스 양이 유의하게 증가하는 것이 나타나고(도 37), PGE2가 BLV의 복제를 촉진시킬 가능성이 시사되었다.
2.2. BLV 항원 자극에 의한 PD-L1 발현량의 변화
BLV 감염 소에서, BLV 항원 자극이 PD-L1 발현량에 주는 영향을 평가하였다. BLV 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 1×106개씩 파종하고, BLV 항원(최종 농도 2%) 존재 하에서 24시간 배양하였다. 배양 후, PBMC를 회수하여, 실시예 2 2.4.에서 전술한 방법과 동일하게 플로우사이토메트리법에 의해 림프구, CD4 양성 T세포, CD8 양성 T세포, IgM 양성 세포 및 CD14 양성 세포 상의 PD-L1 발현을 해석하였다.
2.2의 실험 결과를 도 38에 나타낸다. BLV 감염 소의 PBMC에 BLV 항원 자극을 가하면, 림프구에서 PD-L1의 발현율이 유의하게 상승하는 것이 나타났다(도 38a). 추가로, 세포군(CD4 양성 T세포, CD8 양성 T세포, IgM 양성 세포 및 CD14 양성 세포)마다 PD-L1 발현량의 변화를 해석한 결과, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포에서 BLV 항원 자극에 의해서 PD-L1의 발현율이 증가하는 것이 분명해졌다(도 38 b-e).
2.3. COX-2 저해제에 의한 BLV 특이적 면역 응답의 활성화 효과의 검토
COX-2 저해제가 BLV 항원 특이적인 면역 응답에 대한 활성화 효과를 가지고 있는 것을 확인하기 위해서, 멜록시캄 및 BLV 항원의 존재 하에서 배양한 BLV 감염 소 유래 PBMC의 증식능 및 사이토카인 생산능을 평가하였다. BLV 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, BLV 항원(최종 농도 2%) 및 1,000 nM의 멜록시캄(Signa-Aldrich 사) 존재 하에서 6일간 자극 배양하였다. 배양 후, 실시예 2에서 전술한 방법과 같이 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 39에 나타낸다. BLV 실험 감염 소에서는, 멜록시캄의 첨가에 의해 CD4 양성 세포의 증식율(도 39a), CD8 양성 세포의 증식율(도 39b), IFN-γ의 생산량(도 39c) 및 TNF-α의 생산량(도 39d)의 유의한 증가가 관찰되었다. 이상의 결과에 의해, COX-2 저해제가 BLV 항원 특이적인 T세포 응답에 대한 활성화 효과를 가지고 있는 것이 나타났다.
2.3. BLV 감염 소에 있어서의 COX-2 저해제의 항바이러스 작용의 검토
COX-2 저해제의 생체내에 있어서의 항바이러스 효과를 검토하기 위해서, BLV 감염 소를 이용하여 임상 응용 시험을 수행하였다. 시험에는 홀스타인 종의 PL소 2마리(#1 및 #2)를 이용하였다. 시험 개시시의 체중과 연령은, #1이 736 ㎏, 8세 1개월령, #2가 749 ㎏, 3세 7개월령이었다. COX-2 저해제로서 메타캄 2% 주사액(이하, 메타캄; 공동설립 제약 사)을 0.5 ㎎/㎏로 피하에 접종하였다. 접종은 첫회에 가하고, #1는 첫회 접종 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56일 후에, #2는 첫회 접종 7, 14, 20, 27, 34, 41, 48, 55일 후에 수행하였다(도 40 a, b). 채혈은, #1에서 각 접종일 및 첫회 접종 후 1일째, 84일째에, #2에서 각 접종일, 각 접종의 다음날, 첫회 접종 후 3일째, 84일째에 수행하였다(도 40 a, b). 접종일의 채혈은 메타캄 접종 전에 수행하였다. 채취한 혈액을 이용하여, BLV 프로바이러스 양, 혈청 중의 PGE2 농도 및 IFN-γ 농도를 정량하였다. 프로바이러스 양은, 전술한 2.1.(4)와 동일한 방법으로 정량하였다. 혈청 중의 PGE2 농도 및 IFN-γ 농도는 각각 Prostaglandin E2 Express ELISA Kit(Cayman Chemical 사) 혹은 ELISA for Bovine IFN-γ(MABTECH 사)를 이용하여 측정하였다.
실험 결과를 도 40에 나타낸다. 메타캄의 투여에 의해서 #1 및 #2 모두, BLV의 프로바이러스 양이 유의하게 감소하였다(도 40 c, d). 또, 혈청 중의 PGE2 농도는 메타캄 투여의 다음날에 감소하고, 프로바이러스 양도 메타캄 투여의 다음날에 감소하고 있었다(도 40 c, d). 추가로, #2에서는 혈청 중의 IFN-γ 농도가 메타캄 투여의 다음날에 상승하였다(도 40e). 나아가, #1에서는 혈청 중의 IFN-γ 농도는 ELISA의 측정 한계 이하였다. 이상의 결과에 의해, COX-2 저해제가 BLV 감염 소의 생체내에서 항바이러스 효과를 가지고 있는 것이 제시되었다.
2.4. COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과의 검토
COX-2 저해제의 투여에 의해서 BLV 감염 소의 프로바이러스 양이 감소하였지만(도 40 c, d), 보다 강한 항바이러스 효과를 얻기 위해서, BLV 감염 소에서 COX-2 저해제와 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과를 검토하였다. BLV 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, BLV 항원 혹은 음성 대조 항원 존재 하에서 6일간 배양하였다. 음성 대조 항원으로서 BLV 비감염 양 태아 신장 세포(FLK)의 배양 상청을 65℃에서 열처리한 것을 이용하였다. 배지에는 1,000 nM의 멜록시캄(Sigma-Aldrich 사) 및 1 ㎍/㎖의 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.)를 가하고, 합계 200 ㎕로 하였다. 멜록시캄의 음성 대조로서 DMSO를, 음성 대조 항체로서 래트 혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 이용하였다. 배양 후, 전술의 방법과 동일하게 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 41에 나타낸다. BLV 항원으로 자극한 경우, 음성 대조군, 멜록시캄 단제군, 래트 항-우 PD-L1 항체 단제군과 비교하여, 멜록시캄과 래트 항-우 PD-L1 항체를 가한 군에서 CD4 양성 세포의 증식율(도 41a), CD8 양성 세포의 증식율(도 41b) 및 IFN-γ 생산량(도 41c)이 유의하게 증가하였다. 음성 대조 항원 자극을 가한 경우에서는 동일한 변화가 관찰되지 않았던 것으로부터, COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의해서, BLV 항원 특이적인 T세포 응답이 활성화되고 있는 것이 시사되었다(도 41 a-c). 이상의 결과에 의해, BLV 감염 소에서, COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의해서, 각각을 단제로 이용할 때 보다도 큰 면역 활성화 효과를 얻을 수 있을 가능성이 나타났다.
2.5. COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과의 검토
마지막으로, BLV 감염 소에서 COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과를 검토하였다. BLV 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트에 4×105개씩 파종하고, BLV 항원 혹은 음성 대조 항원 존재 하에서 6일간 배양하였다. 음성 대조 항원으로서 BLV 비감염 양 태아 신장 세포(FLK)의 배양 상청을 65℃에서 열처리한 것을 이용하였다. 배지에는 1,000 nM의 멜록시캄 및 1　㎍/㎖의 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체(ch4G12; 일본 출원번호 2016-159089, Konnai S, Ohashi K, Murata S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Suzuki S, Nakajima C. 소를 위한 항-PD-L1 항체.)를 가하고, 합계 200 ㎕로 하였다. 멜록시캄의 음성 대조로서 DMSO를, 음성 대조 항체로서 소혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 이용하였다. 배양 후, 전술의 방법과 동일하게 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 42에 나타낸다. BLV 감염 소에서, 래트 항-우 PD-L1 항체를 이용한 경우와 동일하게, COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 병용에 의해서, BLV 항원 특이적인 CD4 양성 세포 응답, CD8 양성 세포 응답 및 IFN-γ 생산이 활성화되었다(도 42 a-c). 이상의 결과에 의해, BLV 감염 소에서, COX-2 저해제와 PD-1/PD-L1 저해제의 병용에 의한 면역 활성화 효과가 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체를 이용한 경우에서도 나타났다.
2.6. COX-2 저해제와 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 병용에 의한 생체내에서의 항바이러스 효과의 검토
생체내에 있어서의 COX-2 저해제와 PD-1/PD-L1 저해제의 병용에 의한 항바이러스 효과를 검토하기 위해서, BLV 감염 소를 이용하여 임상 응용 시험을 수행하였다. 시험에는, BLV 프로바이러스 양이 많은 BLV 감염 소 2마리(#1719 및 #2702, 홀스타인 종)를 이용하였다. 시험 개시시의 체중과 연령은, #1719가 799 ㎏, 7세 4개월령, #2702가 799 ㎏, 4세 3개월령이었다. COX-2 저해제로서 메타캄 2% 주사액(이하, 메타캄; 공동설립 제약 사)을 0.5 ㎎/㎏로 피하에 접종하였다. 또, PD-1/PD-L1저해제로서 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체(ch4G12; WO2018/034225, Konnai S, Ohashi K, Murata S, Okagawa T, Nishimori A, Maekawa N, Suzuki S, Nakajima C. 소를 위한 항-PD-L1 항체.)를 1.0 ㎎/㎏으로 정맥내에 투여하였다. 메타캄 접종은 첫회에 가하고, 첫회 접종 7, 14일 후에 실시하였다. 채혈은, 항체 접종일 7일전(-7일째), 항체 접종일, 항체 접종 후 1일째, 3일째, 7일째, 항체 접종 후 14일째부터 58일째까지는 1주간에 1회로 수행하였다. 항체·메타캄 접종일(0일째) 및 메타캄 접종일(7일째, 14일째)의 채혈은 항체 및 메타캄 접종 전에 실시하였다. 채취한 혈액을 이용하여, BLV 프로바이러스 양을 정량하였다. 프로바이러스 양은, 전술한 2.1.(4)와 동일한 방법으로 정량하였다.
실험 결과를 도 43에 나타낸다. 항체 접종일(항체 접종 직전)의 BLV 프로바이러스 양은, #1719가 3,662 copies/50 ng DNA이고, #2702가 3,846 copies/50 ng DNA였다. 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체를 단독으로 투여하였다. #1719에서는, BLV 프로바이러스 양의 감소는 인지되지 않았지만(도 43a), 메타캄과 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체를 병용하였다. #2702에서는, 투여 후 3일째부터 49일째에 걸쳐 유의한 BLV 프로바이러스 양의 감소가 인지되었다(도 43b). 이상의 결과로부터, COX-2 저해제와 PD-1/PD-L1 저해제를 병용하는 것에 의해서, 생체 내에서의 항바이러스 효과가 증강되는 것이 나타났다. 이 병용 효과는, BLV 프로바이러스 양이 3,846 copies/50ng DNA 정도 또는 그 이하로 얻어지는 것이다. 다만 이 값은, 2.1.(4)에서 전술한 방법에 따라서 측정한 BLV 프로바이러스 양을 기준으로 하였다.
[실시예 4]
Mycoplasma bovis 감염 소에 있어서의 항-우 PD-L1 항체와 COX-2 저해제의 병용 효과의 검토
1. 서론
PD-1과 PD-L1의 상호작용은 병원체가 면역 응답을 회피하는 주요한 분자 기구 중 하나이며, 이들의 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 상호작용을 저해함으로써 항병원체 효과가 얻어지는 것이 보고되어 있다. 본 실시예에서는, Mycoplasma bovis에 기인하는 소의 마이코플라스마 감염증에 대한 신규 제어법의 확립을 목표로 하고, COX-2 저해제에 의한 면역 활성화 효과와, 항-우 PD-L1 항체와의 병용에 의한 효과의 증강을 in vitro 시험에서 확인하였다.
2. 재료 및 방법, 실험 결과
2.1. M. bovis 감염 소에 있어서의 혈청 PGE2 양의 해석
M. bovis에 기인하는 소의 마이코플라스마 감염증의 병태 진행에 있어서의 PGE2의 관련을 분명히 하기 위해, M. bovis 감염 소에 있어서의 PGE2의 동태 해석을 수행하였다. M. bovis 감염 소 및 M. bovis 비감염 소(이하, 비감염 소)의 혈청 중에 포함되는 PGE2 양을 Prostaglandin E2 Express ELISA Kit(Cayman Chemical 사)에 의해서 정량하였다. 측정에는 마이크로플레이트 리더 MTP-900(코로나 전기 사)을 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
실험 결과를 도 44에 나타낸다. M. bovis 감염 소에서, 비감염 소와 비교하여 혈청 PGE2 양이 유의하게 높았다(도 44a). 또, M. bovis 감염 소를 임상 증상마다 나누어 혈청 PGE2 양을 비교하면, M. bovis에 기인하는 유방염, 폐렴을 나타낸 개체에서 비감염 소와 비교하여 혈청 PGE2 양이 유의하게 높았다(도 44b). 이들 결과에 의해, 소의 마이코플라스마 감염증의 병태 진행에 PGE2가 관여하고 있을 가능성이 시사되었다.
2.2. M. bovis 감염 소에 있어서의 혈장 PGE2 양과 면역 응답의 지표의 상관 해석
다음에, M. bovis 감염 소의 혈장 PGE2 양과 M. bovis 특이적인 IFN-γ 응답 또는 CD14 양성 세포에 있어서의 PD-L1의 발현율과의 상관을 조사하였다. 우선, M. bovis 감염 소의 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 혈장 중에 포함되는 PGE2 양을 2.1에서 전술한 방법을 이용하여 측정하였다. 다음에, M. bovis 감염 소의 혈액으로부터 분리한 말초혈 단핵구(PBMC)를 10% 비동화 소 태아 혈청(Thermo Fisher Scientific 사), 항생 물질(스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 페니실린 100 U/㎖)(Thermo Fisher Scientific 사), 2 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific 사)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich 사)에 현탁하여, 4×105개씩 96웰 플레이트(Corning 사)에 파종한 후, 1.5 ㎍/㎖의 M. bovis 항원을 가하고 37℃, 5% CO2 존재 하에서 5일간 자극 배양하였다. M. bovis 항원으로서 M. bovis PG45주(ATCC 25523; 낙농학원대학 히구치 히데토시 교수에 의해 분여)를 열처리한 것을 이용하였다. 5일 후, 배양 상청을 회수하고, IFN-γ의 생산량은 ELISA for Bovine IFN-γ(MABTECH 사)를 이용하여 측정하였다. 측정에는 마이크로플레이트 리더 MTP-900(코로나 전기 사)을 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
또, M. bovis 감염 소 유래 PBMC에 대해 플로우사이토메트리 해석을 수행하고, CD14 양성 세포 상의 PD-L1 발현을 측정하였다. 우선, 항체의 비특이 반응을 저해하기 위해서 PBMC에 10% 비동화 염소 혈청(Thermo Fisher Scientific 사)이 첨가된 PBS를 각 웰에 100 ㎕ 가하고, 실온에서 15분 정치하였다. 세정 후, 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Rat IgG2a; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.) 혹은 래트 IgG2a 아이소타이프 컨트롤(BD Bioscience 사)을 첨가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 세정을 2회 수행한 후, PerCp/Cy5.5 표지 항-CD14 모노클로날 항체(CAM36A; Washington State University Monoclonal Antibody Center) 및 APC 표지 항-래트 Ig 항체(Southern Biotech 사)와 세포를 반응시켰다. 항-CD14 모노클로날 항체(CAM36A)는, Lightning-Link Conjugation Kit를 이용하여 PerCp/Cy5.5를 표지하였다. 반응 후, 2회 세정을 수행하고, FACS Verse(BD Biosciences 사) 및 FCS Express 4(De Novo Software 사)를 이용하여 해석하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)이 첨가된 PBS를 사용하였다.
실험 결과를 도 45에 나타낸다. M. bovis 감염 소에서, 혈장 중의 PGE2 양과 M. bovis 특이적인 IFN-γ 응답에 부의 상관이 인지되었다(도 45a). 또, PGE2 양과 CD14 양성 세포에 있어서의 PD-L1의 발현율에는, 정의 상관이 인지되었다(도 45b). 이들 결과에 의해, 소의 마이코플라스마 감염증에 수반하는 면역 억제에 PGE2가 관여하고 있는 것이 시사되었다.
2.3. M. bovis 감염 소에 있어서의 COX2 및 EP4의 발현 해석
추가로 상세한 해석을 수행하기 위해서, PGE2의 합성에 관여하는 COX2 유전자 및 면역 억제 시그널을 촉구하는 PGE2 수용체인 EP4의 유전자의 발현량을 실시간 PCR법에 의해 정량하였다. M. bovis 감염 소 및 비감염 소 유래 PBMC에 의해, 실시예 2 2.1.(3)에서 전술한 방법으로 전세포 RNA를 추출하여, cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, COX2(실시예 2 2.3.(3)에서 전술) 및 EP4 특이적 프라이머(실시예 3 2.1.(2)에서 전술)를 이용하여 실시예 2에서 기술한 방법에 따라 실시간 PCR을 수행하였다.
실험 결과를 도 46에 나타낸다. M. bovis 감염 소의 PBMC에서는 비감염 소와 비교하여, COX2 유전자 발현량에는 유의한 차이는 인지되지 않았지만(도 46a), EP4 유전자 발현량이 유의하게 상승하고 있었다(도 46b).
2.4. M. bovis 감염 소에 있어서의 COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과의 검토
마지막으로, M. bovis 감염 소에서 COX-2 저해제와 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의한 면역 활성화 효과를 검토하였다. M. bovis 감염 소 유래 PBMC를 96웰 플레이트(Corning 사)에 4×105개씩 파종하고, 항원 특이적 자극으로서 M. bovis 항원 1.5 ㎍/㎖, 혹은 T세포 자극으로서 항-CD3 모노클로날 항체(MM1A; Washington State University Monoclonal Antibody Center) 및 항-CD28 모노클로날 항체(CC220; Bio-Rad 사) 각 2 ㎍/㎖ 존재 하에서 5일간 배양하였다. 배지에는 10 μM의 멜록시캄(Sigma-Aldrich 사) 및 10 ㎍/㎖의 래트 항-우 PD-L1 항체(4G12; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.)를 가하였다. 멜록시캄의 음성 대조로서 DMSO를, 음성 대조 항체로서 래트 혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 이용하였다. 배양 후, 전술의 방법과 동일하게 세포 증식능과 사이토카인 생산량을 평가하였다.
실험 결과를 도 47에 나타낸다. M. bovis 항원으로 자극한 경우, 음성 대조군, 멜록시캄 단제군과 비교하여, 래트 항-우 PD-L1 항체 단제, 또는 멜록시캄과 래트 항-우 PD-L1 항체를 가한 군에서 IFN-γ 생산량이 증가하는 경향이 있었다(도 47). 또, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 자극한 경우, 음성 대조군, 멜록시캄 단제군과 비교하여, 래트 항-우 PD-L1 항체 단제를 가한 군에서 IFN-γ 생산량이 증가하는 경향이 있고, 멜록시캄과 래트 항-우 PD-L1 항체를 병용하면, 유의차는 인지되지 않았지만 IFN-γ 생산량이 추가로 증강되었다(도 47). 이 결과에 의해, M. bovis 감염 소에서, COX-2 저해제와 래트 항-우 PD-L1 항체의 병용에 의해서, 면역 활성화 효과가 보다 강하게 유도되는 것이 시사되었다.
[참고예 2]
래트-소 키메라 항-PD-L1 항체
1. 서론
면역 억제 수용체 Programmed death 1(PD-1)과 그 리간드인 Programmed death ligand 1(PD-L1)은 과잉의 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊게 관련하고 있는 인자로서 교토 대학, 혼조 다스쿠 등에 의해서 동정된 분자이다. 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 근래 밝혀지고 있다. 본 참고예에서는, 소의 감염증에 대한 신규 치료법의 수립을 목적으로 소 PD-1 및 PD-L1의 결합을 저해가능한 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체(4G12; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561.)의 가변 영역 유전자와, 소 면역 글로불린(IgG1, 다만, ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다. 도 48 참조. 아미노산 번호 및 변이: 250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→deletion, 347 A→S, 348 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug; 142(4):551-561.)의 정상 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell: CHO 세포)를 배양 증식시켜 얻은 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12를 제작하고, in vitro 및 in vivo의 효과를 확인하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. 소 PD-1 및 PD-L1 발현 세포의 구축
소 PD-1 유전자(GenBank accession number AB510901; Ikebuchi R, Konnai S, Sunden Y, Onuma M, Ohashi K. Microbiol. Immunol. 2010 May; 54(5):291-298.), 소 PD-L1 유전자(GenBank accession number AB510902; Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res. 2011 Sep. 26; 42:103.)에 대해서 cDNA 전장의 염기서열을 결정하고, 그 유전자 정보에 의해 소 PD-1 또는 PD-L1 막발현 세포를 제작하였다. 우선, 소 PD-1 또는 PD-L1 발현 플라스미드를 제작하기 위해, 합성한 소 PBMC 유래 cDNA를 주형으로서, 5' 말단 측에 제한효소 NotI 및 HindⅢ(소 PD-1), NheI 및 XhoI(소 PD-L1) 인식 부위를 부가한 프라이머(boPD-1-myc F 및 R, boPD-L1-EGFP F 및 R)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 NotI(Takara 사) 및 HindⅢ(Takara 사; 소 PD-1), NheI(Takara 사) 및 XhoI(Takara 사; 소 PD-L1)에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit(NIPPON Genetics 사)를 이용하여 정제하고, 동일한 제한효소 처리를 수행한 pCMV-Tag1 vector(Agilent Technologies 사; 소 PD-1) 또는 pEGFP-N2 vector(Clontech 사; 소 PD-L1)에 도입하여, 클로닝을 수행하였다. 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen 사) 이용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pCMV-Tag1-boPD-1이라고 표기한다.
프라이머(boPD-1-myc F): ATATGCGGCCGCATGGGGACCCCGCGGGCGCT(서열번호 143)
프라이머(boPD-1-myc R): GCGCAAGCTTTCAGAGGGGCCAGGAGCAGT(서열번호 144)
프라이머(boPD-L1-EGFP F): CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC(서열번호 145)
프라이머(boPD-L1-EGFP R): CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC(서열번호 146)
이하의 절차에 따라, 소 PD-1 막발현 세포를 제작하였다. 우선, 4×106개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍의 pCMV-Tag1-boPD-1을 Lipofectamine LTX(Invitrogen 사)를 이용하여 도입하였다. 48시간 후, G418(Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX supplement(Life technologies 사) 20 ㎖/l, 10% Pluronic F-68(Life technologies 사) 18 ㎖/l를 포함하는 CD DG44 배지(Life technologies 사)에 배지 교환하고, 셀렉션을 수행하였다. 얻어진 발현 세포를 래트 항-우 PD-1 항체 5D2와 실온에서 반응시키고, 세정 후, 항-래트 IgG 마이크로비즈 표지 항체(Miltenyi Biotec 사)와 실온에서 추가로 반응시켰다. Auto MACS(Miltenyi Biotec 사)를 이용하여 소 PD-1을 고발현하는 세포를 분리하고, 추가로 순도를 높이기 위해 동일한 절차로 재분리를 수행하였다. 제작한 발현 세포에 대해 한계 희석법에 의해 클로닝을 수행하고, 소 PD-1 고발현 CHO DG44 세포를 얻었다(소 PD-1 발현 세포).
이하의 절차에 따라, 소 PD-L1 막발현 세포를 제작하였다. 우선, 4×106개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍의 pEGFP-N2-boPD-L1 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2를 Lipofectamine LTX(Invitrogen 사)를 이용하여 도입하였다. 48시간 후, G418(Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX supplement(Life technologies 사) 20 ㎖/l, 10% Pluronic F-68(Life technologies 사) 18 ㎖/l를 포함하는 CD DG44 배지(Life technologies 사)에 배지 교환하고, 셀렉션을 수행함과 동시에 한계 희석법에 의해 클로닝을 수행하였다(소 PD-L1 발현 세포). 제작한 발현 세포에 있어서의 소 PD-L1의 발현을 확인하기 위해서, 도립형 공초점 레이저 현미경 LSM700(ZEISS 사)에 의해, EGFP의 세포내 국재를 가시화하였다.
2.2. 가용성 소 PD-1 및 PD-L1의 구축
이하의 절차에 따라, 소 PD-1-Ig 발현 플라스미드를 구축하였다. 소 PD-1(GenBank accession number AB510901)의 시그널 펩타이드 및 세포외 영역을 이미 알고 있는 소 IgG1(GenBank accession number X62916)의 정상 영역 Fc 부분과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, CHO 세포에 코돈의 최적화를 수행한 후, 제한효소(NotI) 인식 서열, KOZAK 서열, 소 PD-1 시그널 펩타이드 서열, 소 PD-1 유전자 세포외 영역 서열, 소 IgG1 Fc 영역 서열, 제한효소(XbaI) 인식 서열을 상기의 순서대로 배치하도록 유전자 합성을 수행하였다. 나아가, 소 IgG1은 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다(변이 삽입 개소: 185 E→P, 186 L→V, 187 P→A, 189 G→deletion, 281 A→S, 282 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug; 142(4):551-561. 이 논문의 도 2에 PD-1-Ig의 아미노산 서열, 변이 삽입 개소가 게재되어 있다). 합성한 유전자 쇄를 NotI(Takara 사) 및 XbaI(Takara 사)에 의해서 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit(NIPPON Genetics 사)를 이용하여 정제하고, 동일한 제한효소 처리를 수행한 발현용 벡터 pDN11(홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수에 의해 분여)의 클로닝 사이트(PCMV 하류, INRBG와 PABGH의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한효소 인식 서열)에 조립하고, 소 PD-1-Ig 발현 벡터를 구축하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen 사)에 의해서 정제하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pDN11-boPD-1-Ig이라고 표기한다.
이하의 절차에 따라, 소 PD-L1-Ig 발현 플라스미드를 구축하였다. 소 PD-L1(GenBank accession number AB510902)의 시그널 펩타이드 및 세포외 영역을 증폭하도록, 5' 말단 측에 제한효소 NheI 및 EcoRV 인식 부위를 부가한 프라이머(boPD-L1-Ig F 및 R)를 설계하였다. 합성한 소 PBMC 유래 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하고, PCR 산물을 NheI(Takara 사) 및 EcoRV(Takara 사)에 의해서 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit(NIPPON Genetics 사)를 이용하여 정제하고, 동일한 제한효소 처리를 수행한 pCXN2.1-Rabbit IgG1 Fc vector(Niwa et al., 1991; Zettlmeissl et al., 1990; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 교수 요코미조 다케히코 박사에 의해 분여된 것을 개변)에 도입하여, 클로닝을 수행하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen 사) 또는 FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit(NIPPON Genetics 사)에 의해서 정제하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pCXN2.1-boPD-L1-Ig이라고 표기한다.
프라이머(boPD-L1-Ig F): GCTAGCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC(서열번호 147)
프라이머(boPD-L1-Ig R): GATATCATTCCTCTTTTTTGCTGGAT(서열번호 148)
이하의 절차에 따라, 가용성 소 PD-1-Ig 발현 세포를 제작하였다. 4×106개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍의 pDN11-boPD-1-Ig을 Lipofectamine LTX(Invitrogen 사)를 이용하여 도입하였다. 48시간 후, G418(Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX supplement(Life technologies 사) 20 ㎖/l를 포함하는 OptiCHO AGT 배지(Life technologies 사)에 배지 교환하고, 3주간 배양하고 셀렉션을 수행하였다. 얻어진 세포주의 배양 상청 중의 Fc 융합 재조합 단백질의 농도는 항-우 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체(Rockland 사)를 이용한 ELISA법을 이용하여 측정하고, Fc 융합 재조합 단백질을 고발현하는 세포주의 선별을 수행하였다. 얻어진 고발현 세포주는 G418을 포함하지 않는 배지에 옮기고, 14일간 진탕 배양을 수행하고 배양 상청을 회수하였다. Fc 융합 재조합 단백질을 포함하는 배양 상청은, Centricon Plus-70(Millipore 사)을 이용하여 한외 여과한 후에, Ab-Capcher Extra(ProteNova 사)를 이용하여 Fc 융합 재조합 단백질을 정제하였다. 정제 후, PD-10 Desalting Column(GE Healthcare 사)에 의해 버퍼를 인산 완충 생리 식염수(PBS; pH 7.4)에 치환하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다(소 PD-1-Ig). 정제 후의 소 PD-1-Ig의 농도는 항-우 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체(Rockland 사)를 이용한 ELISA법에 의해 측정하였다. ELISA의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50(DS Pharma Biomedical 사)을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650 FA(코로나 전기 사)를 사용하였다.
이하의 절차에 따라, 가용성 소 PD-L1-Ig 발현 세포를 제작하였다. 7.5×107개의 Expi293F 세포(Life Technologies 사)에 30 ㎍의 pCXN2.1-boPD-L1-Ig을 Expifectamine(Life Technologies 사)을 이용하여 도입하고, 7일간 진탕 배양을 수행하고 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 Ab-Capcher Extra(ProteNova 사; 소 PD-L1-Ig)를 이용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 정제 후, PD MiniTrap G-25(GE Healthcare 사)에 의해 버퍼를 PBS(pH 7.4)에 치환하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다(소 PD-L1-Ig). 정제 후의 소 PD-L1-Ig의 농도는 Rabbit IgG ELISA Quantitation Set(Bethyl 사)를 이용하여 측정하였다. ELISA의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50(DS Pharma Biomedical 사)을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650 FA(코로나 전기 사)를 사용하였다.
2.3. 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 생산 세포의 제작
소 PD-L1-Ig(Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561. 이 논문에 기재한 방법으로 소 PD-L1-Ig을 제작하고, 면역에 사용하였다)을 래트의 발바닥(足蹠)에 면역시키고, 장골(腸骨) 림프절법을 이용하여 하이브리도마를 수립하고, 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 4G12주를 얻었다. 래트 항-우 PD-L1 모노클로날 항체의 수립법에 대해서는, 이하의 비특허 문헌에 그 상세가 기재되어 있다(Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res. 2013 Jul. 22; 44:59; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561).
2.4. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 발현 벡터의 제작
래트 항-우 PD-L1 항체 4G12를 항체 가변 영역으로서 소 IgG1 및 소 Igλ의 항체 정상 영역을 융합시킨, 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12를 수립하였다.
우선, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12를 생산하는 하이브리도마에 의해 가변 영역(중쇄 및 경쇄)의 유전자를 각각 동정하였다. 다음에, 당해 래트 항체 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 이미 알고 있는 소 IgG1(중쇄; GenBank Accession number X62916를 개변) 및 소 Igλ(경쇄; GenBank Accession number X62917)의 정상 영역과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, 코돈 최적화를 수행하였다(래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12: 서열번호 115 및 116(아미노산 서열), 서열번호 117 및 118(코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열)). 나아가, 소 IgG1에는 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다(도 48 참조. 아미노산 번호 및 변이: 250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→deletion, 347 A→S, 348 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug; 142(4):551-561.). 그리고, NotI 제한효소 인식 서열, KOZAK 서열, 키메라 항체 경쇄 서열, 폴리A 부가 시그널 서열(PABGH), 프로모터 서열(PCMV), SacI 제한효소 인식 서열, 인트론 서열(INRBG), KOZAK 서열, 키메라 항체 중쇄 서열, XbaI 제한효소 인식 서열을 상기의 순서로 배치하도록 유전자를 인공적으로 합성하였다. 합성한 유전자 쇄를 NotI(Takara 사) 및 XbaI(Takara 사)에 의해서 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit(NIPPON Genetics 사)를 이용하여 정제하고, 동일한 제한효소 처리를 수행한 발현 플라스미드 pDC6(홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수에 의해 분여)의 클로닝 사이트(PCMV 하류, INRBG와 PABGH의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한효소 인식 서열)에 도입하여, 클로닝을 수행하였다(도 49). 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen 사) 이용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30℃에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pDC6-boPD-L1ch4G12라고 표기한다.
2.5. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 발현
pDC6-boPD-L1ch4G12를, 디하이드로 엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포(CHO-DG44(dfhr -/-))에 도입하였다. 48시간 후, GlutaMAX supplement(Life technologies 사) 20 ㎖/l를 포함하는 OptiCHO AGT 배지(Life technologies 사)에 배지 교환하고, 3주간 배양하여 발현 세포의 셀렉션 및 한계 희석법에 따른 클로닝을 수행하였다. 다음에, 항-우 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체(Rockland 사)를 이용한 닷블롯법 및 ELISA법에 의해 배양 상청에 포함되는 키메라 항체의 농도를 측정하고, 고발현 클론을 선발하였다. 추가로, 선발한 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 고발현 클론에 대해서, 60 nM의 메토트렉세이트(Mtx)를 포함하는 배지에서 부하를 가하는 것에 의해 유전자 증폭 처리를 수행하였다. 이상과 같이 하여 수립한 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 안정 발현 세포를, Mtx를 포함하지 않는 Opti-CHO AGT 배지에 옮기고, 14일간의 진탕 배양을 수행하였다(125 rpm, 37℃, 5% CO2). 항-우 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체(Rockland 사)를 이용한 ELISA법을 이용하여, 배양 상청 중의 키메라 항체 생산량을 정량하였다. ELISA의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50(DS Pharma Biomedical 사)을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650 FA(코로나 전기 사)를 사용하였다. 14일째의 배양 상청을 10,000g으로 10분간 원심하고 세포를 제외한 후, 원심상청을 Steritop-GP 0.22 ㎛ 필터(Millipore 사)에 통하여 멸균하고, 정제에 제공할 때까지 4℃에서 보존하였다.
2.6. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 정제
상기의 방법에 의해 준비한 배양 상청으로부터, Ab Capcher Extra(ProteNova 사)를 이용하여 키메라 항체를 정제하였다. 레진에의 결합은 오픈컬럼법을 이용하고, 평형화 버퍼 및 세정 버퍼로서 PBS(pH 7.4)를 사용하였다. 용출 버퍼에는 IgG 용출 버퍼(Thermo Fisher Scientific 사)를, 중화 버퍼에는 1M Tris(pH 9.0)를 사용하였다. 정제한 항체는, PD-10 Desalting Column(GE Healthcare 사) 및 Amicon Ultra-15(50 kDa, Millipore 사)를 이용하여, PBS(pH 7.4)에의 버퍼 치환 및 농축을 수행하였다. 정제한 키메라 항체는, 0.22 ㎛ 주사기 필터(Millipore 사)를 통해 멸균하고, 실험에 제공할 때까지 4℃에서 보존하였다.
2.7. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 정제 순도의 확인
정제한 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 순도를 확인하기 위해, SDS-PAGE 및 CBB 염색에 의해 항체 단백질의 검출을 수행하였다. 10% 아크릴아미드 겔을 이용하여, 정제한 래트-소 키메라 항체를 환원 조건 하(2-머캅토 에탄올(Sigma-Aldrich 사)에 의해 환원) 및 비환원 조건 하에서 전기영동하였다. Quick-CBB kit(와코준야쿠 공업 사)에 의해 염색을 수행한 후, 증류수 중에서 탈색을 수행하였다. 결과를 도 50에 나타낸다. 환원 조건에서는 25 kDa 및 50 kDa, 비환원 조건에서는 150 kDa의 생각되는 위치에 밴드가 확인되었다.
2.8. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체의 결합 특이성
래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체가 소 PD-L1 발현 세포(전술)에 특이적으로 결합하는 것을 플로우사이토메트리법에 의해 확인하였다. 우선, 소 PD-L1 발현 세포에 대해서 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12를 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정 후, APC 표지 항-래트 Ig 염소 항체(SouthernBiotech 사) 또는 Alexa Fluor 647 표지 항-우 IgG(H+L) 염소 F(ab')2(Jackson ImmunoResearch 사)를 실온에서 30분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 아이소타이프 컨트롤(BD Biosciences 사) 또는 소 IgG1 항체(Bethyl 사)를 사용하였다. 세정 후, 세포 표면에 결합한 각 래트 항체 또는 래트-소 키메라 항체를 FACS Verse(BD Biosciences 사)에 의해 검출하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)을 가한 PBS를 사용하였다.
실험 결과를 도 51에 나타낸다. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12는, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12와 동일하게 소 PD-L1 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
2.9. 래트-소 키메라 항-PD-L1 항체의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성
(1) 소 PD-L1 발현 세포와 가용성 소 PD-1의 결합 저해 시험
소 PD-L1 발현 세포(전술) 및 소 PD-1-Ig(전술)을 이용하여, 항-우 PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 시험을 수행하였다. 우선, 2×105개의 소 PD-L1 발현 세포를 각 농도(0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖)의 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12와 실온에서 30분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서 래트 IgG2a(κ) 아이소타이프 컨트롤(BD Biosciences 사) 또는 소 IgG1 항체(Bethyl 사)를 사용하였다. 세정 후, Lightning-Link Type A Biotin Labeling Kit(Innova Biosciences 사)를 이용하여 비오틴 표지한 소 PD-1-Ig을 최종 농도 2 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 실온에서 추가로 30분간 반응시켰다. 추가로 세정 후, APC 표지 스트렙트아비딘(BioLegend 사)에 의해 세포 표면에 결합한 소 PD-1-Ig을 검출하였다. 해석에는 FACS Verse(BD Biosciences 사)를 이용하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)을 가한 PBS를 사용하였다. 항체 비첨가시의 소 PD-1-Ig 결합 세포의 비율을 100%로 하고, 각 항체 농도에 있어서의 소 PD-1-Ig 결합 세포의 비율을 상대치로서 나타냈다.
실험 결과를 도 52에 나타낸다. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12는, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12와 동일하게 소 PD-1/PD-L1의 결합을 농도 의존적으로 저해할 수 있는 것이 나타났다.
(2) 소 PD-1 발현 세포와 가용성 소 PD-L1의 결합 저해 시험
소 PD-1 발현 세포(전술) 및 소 PD-L1-Ig(전술)을 이용하여, 항-우 PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 시험을 수행하였다. 우선, 96웰 플레이트에 최종 농도(0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖)의 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12와, 최종 농도 1 ㎍/㎖의 소 PD-L1-Ig을 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 혼합액을 2×105개의 소 PD-1 발현 세포와 실온에서 30분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 아이소타이프 컨트롤(BD Biosciences 사) 또는 소 IgG1 항체(Bethyl 사)를 사용하였다. 세정 후, Alexa Fluor 647 표지 항토끼 IgG(H+L) 염소 F(ab')2(Life Technologies 사)를 실온에서 30분간 반응시키고, 세포 표면에 결합한 소 PD-L1-Ig을 검출하였다. 해석에는 FACS Verse(BD Biosciences 사)를 이용하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)을 가한 PBS를 사용하였다. 항체 비첨가시의 소 PD-L1-Ig 결합 세포의 비율을 100%로 하고, 각 항체 농도에 있어서의 소 PD-L1-Ig 결합 세포의 비율을 상대치로서 나타냈다.
실험 결과를 도 53에 나타낸다. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12는, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12와 동일하게 소 PD-1/PD-L1의 결합을 농도 의존적으로 저해할 수 있는 것이 나타났다.
2.10. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체를 이용한 생물 활성 시험
(1) 세포 증식에의 영향
래트-소 키메라 항-PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해가 림프구를 활성화하는 것을 확인하기 위해, 세포 증식을 지표로서 생물 활성 시험을 수행하였다. 정상소의 말초혈로부터 분리한 소 PBMC를 10×106개/㎖가 되도록 PBS에 현탁하고, Carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE)를 이용하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 10% 비동화 소 태아 혈청(Cell Culture Technologies 사), 항생 물질(스트렙토마이신 200 ㎍/㎖, 페니실린 200 U/㎖)(Life Technologies 사), 0.01% L-글루타민(Life Technologies 사)을 포함하는 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich 사)에서 2회 세정한 후, 항-우 CD3 마우스 항체(WSU Monoclonal Antibody Center 사)와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 세정 후, 항-마우스 IgG1 마이크로비즈(Miltenyi Biotec 사)와 4℃에서 15분간 반응시키고, autoMACS(등록상표) Pro(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD3 양성 T세포를 분리하였다. 분리한 CD3 양성 T세포에, 항-우 CD3 마우스 항체(WSU Monoclonal Antibody Center 사) 및 항-우 CD28 마우스 항체(Bio-Rad 사)를 첨가하고, 10 ㎍/㎖의 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12 존재 하 또는 비존재 하에서, 소 PD-L1 발현 세포와 공배양하였다(CD3 양성 T세포:소 PD-L1 발현 세포=10:1). 항체의 컨트롤에는, 혈청 유래 소 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 사용하고, PD-L1 발현 세포의 컨트롤에는, pEGFP-N2를 도입한 EGFP 발현 세포를 이용하였다. 6일 후, 세포를 회수하고, 항-우 CD4 마우스 항체 및 항-우 CD8 마우스 항체(Bio-Rad 사)와 실온에서 30분간 반응시켰다. 항체의 표지에는 Zenon Mouse IgG1 Labeling Kits(Life Technologies 사) 또는 Lightning-Link Kit(Innova Biosciences 사)를 이용하였다. 해석에는 FACS Verse(BD Biosciences 사)를 이용하였다. 배양 후의 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)을 가한 PBS를 사용하였다.
실험 결과를 도 54에 나타낸다. 소 PD-L1 발현 세포와의 공배양에 의해, CD4 양성 및 CD8 양성 T세포의 증식이 유의하게 억제되었다. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12는, CD4 양성 T세포에서, 이 억제를 저해하는 것이 나타났다.
(2) IFN-γ 생산량에의 영향
래트-소 키메라 항-PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해가 림프구를 활성화하는 것을 확인하기 위해, IFN-γ 생산량을 지표로서 생물 활성 시험을 수행하였다. BLV 감염 소의 말초혈로부터 분리한 소 PBMC를 4×106개/㎖가 되도록 10% 비동화 소 태아 혈청(Cell Culture Technologies 사), 항생 물질(스트렙토마이신 200 ㎍/㎖, 페니실린 200 U/㎖)(Life Technologies 사), 0.01% L-글루타민(Life Technologies 사)을 포함하는 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich 사)에 현탁하였다. PBMC에 10 ㎍/㎖의 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12, 2% BLV 감염 양 태아 신세포(FLK-BLV) 배양 상청을 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 6일간 배양하였다. 컨트롤 항체에는, 혈청 유래 래트 IgG(Sigma-Aldrich 사) 및 혈청 유래 소 IgG(Sigma-Aldrich 사)를 이용하였다. 6일 후, 배양 상청을 회수하고, Bovine IFN-γ ELISA Kit(BETYL 사)를 이용하여 IFN-γ 생산량을 정량하였다. ELISA의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50(DS Pharma Biomedical 사)을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650 FA(코로나 전기 사)를 사용하였다.
실험 결과를 도 55에 나타낸다. 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12는, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12와 동일하게 BLV 항원에 대한 소 PBMC의 IFN-γ 응답을 상승시키는 것이 나타났다(n=10).
2.11. 소에의 접종 시험
BLV 실험 감염 소(홀스타인 종, 수컷, 7개월령, 체중 267 ㎏)에, 수립한 래트-소 키메라 항-우 PD-L1 항체 ch4G12 약 260 ㎎(1 ㎎/㎏)을 점적 정맥주사하였다. 감염 소로부터 경시적으로 채혈을 수행하고, 밀도구배 원심법에 의해 PBMC를 분리하였다.
(1) BLV 항원에 대한 T세포의 세포 증식 응답
소 PBMC를 PBS에 현탁하고, CFSE를 이용하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 10% 비동화 소 태아 혈청(Cell Culture Technologies 사), 항생 물질(스트렙토마이신 200 ㎍/㎖, 페니실린 200 U/㎖)(Life Technologies 사), 0.01% L-글루타민(Life Technologies 사)을 포함하는 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich 사)에서 2회 세정한 후, 동배지에서 4×106개/㎖로 조정하였다. PBMC에 2% BLV 감염 양 태아 신세포(FLK-BLV) 배양 상청을 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 6일간 배양하였다. 컨트롤에는, 2% BLV 비감염 양 태아 신세포(FLK) 배양 상청을 이용하였다. 6일 후, PBMC를 회수하고, 항-우 CD4 마우스 항체, 항-우 CD8 마우스 항체 및 항-우 IgM 마우스 항체(Bio-Rad 사)와 4℃에서 20분간 반응시켰다. 항체의 표지에는 Zenon Mouse IgG1 Labeling Kits(Life Technologies 사) 또는 Lightning-Link Kit(Innova Biosciences 사)를 이용하였다. 해석에는 FACS Verse(BD Biosciences 사)를 이용하였다. 나아가, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich 사)을 가한 PBS를 사용하였다.
실험 결과를 도 56에 나타낸다. 항체 투여에 의해, CD4 양성 T세포의 BLV 특이적인 세포 증식 응답이 투여 전에 비해 증가하였다.
(2) BLV 프로바이러스 양의 변화
분리한 소 PBMC로부터 Wizard DNA Purification kit(Promega 사)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 농도는, Nanodrop 8000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific 사)를 이용하여 측정한 흡광도(260 nm)를 기준으로서 정량하였다. PBMC 중의 BLV 프로바이러스 양을 측정하기 위해, Cycleave PCR Reaction Mix SP(TaKaRa 사) 및 소백혈병 바이러스 검출용 Probe/Primer/Positive control(TaKaRa 사)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 측정에는 LightCycler480 System Ⅱ(Roche Diagnosis 사)를 이용하였다.
실험 결과를 도 57에 나타낸다. BLV 프로바이러스 양은, 시험 기간 종료까지 투여 전에 비해 유의하게 감소하였다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입한다.
산업상의 이용 가능성
본 발명의 의약 조성물은, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료에 이용할 수 있다.
<서열번호 1>
서열번호 1은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
MESQTHVLISLLLSVSGTYGDIAITQSPSSVAVSVGETVTLSCKSSQSLLYSENQKDYLGWYQQKPGQTPKPLIYWATNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLIISSVQAEDLADYYCGQYLVYPFTFGPGTKLELK
<서열번호 2>
서열번호 2는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
MGWSQIILFLVAAATCVHSQVQLQQSGAELVKPGSSVKISCKASGYTFTSNFMHWVKQQPGNGLEWIGWIYPEYGNTKYNQKFDGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEEAVISLVYWGQGTLVTVSS
<서열번호 3>
서열번호 3은, 개 항체의 L쇄 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
QPKASPSVTLFPPSSEELGANKATLVCLISDFYPSGVTVAWKASGSPVTQGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPDKWKSHSSFSCLVTHEGSTVEKKVAPAECS
<서열번호 4>
서열번호 4는, 개 항체의 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
ASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
<서열번호 5>
서열번호 5는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
ATGGAATCACAGACGCATGTCCTCATTTCCCTTCTGCTCTCGGTATCTGGTACCTATGGGGACATTGCGATAACCCAGTCTCCATCCTCTGTGGCTGTGTCAGTAGGAGAGACGGTCACTCTGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTTTTATACAGTGAAAACCAAAAGGACTATTTGGGCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGACTCCTAAACCCCTTATCTACTGGGCAACCAACCGGCACACTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGTAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTGATCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCTGATTATTACTGTGGGCAGTACCTTGTCTATCCGTTCACGTTTGGACCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA
서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열을 <서열번호 15>에 나타낸다.
ATGGAATCTCAAACTCATGTTTTGATTTCATTACTTCTGAGTGTTTCCGGAACCTACGGTGATATCGCTATCACTCAATCTCCCTCCTCTGTTGCTGTGTCTGTGGGCGAAACCGTTACCCTGTCCTGCAAGTCCAGTCAGTCTCTTCTCTACTCCGAGAATCAAAAGGACTACCTGGGCTGGTACCAACAGAAGCCCGGCCAGACCCCAAAGCCACTGATATACTGGGCAACCAACAGGCACACCGGAGTGCCCGACAGGTTCACAGGCAGTGGATCTGGCACCGACTTTACCTTGATCATTTCAAGCGTGCAGGCTGAAGATCTGGCCGACTACTACTGTGGTCAGTATCTGGTGTATCCTTTCACTTTCGGGCCAGGGACAAAATTGGAATTGAAG
서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열을 <서열번호 112>에 나타낸다.
ATGGAATCTCAAACTCATGTTTTGATTTCATTACTTCTGAGTGTTTCCGGAACCTACGGTGATATCGCTATCACTCAATCTCCCTCCTCTGTTGCTGTGTCTGTGGGCGAAACCGTTACCCTGTCCTGCAAGTCCAGTCAGTCTCTTCTCTACTCCGAGAATCAAAAGGACTACCTGGGCTGGTACCAACAGAAGCCCGGCCAGACCCCAAAGCCACTGATATACTGGGCAACCAACAGGCACACCGGAGTGCCCGACAGGTTCACAGGCAGTGGATCTGGCACCGACTTTACCTTGATCATTTCAAGCGTGCAGGCTGAAGATCTGGCCGACTACTACTGTGGTCAGTATCTGGTGTATCCTTTCACTTTCGGGCCAGGGACAAAACTCGAGCTCAAA
<서열번호 6>
서열번호 6은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
ATGGGATGGAGCCAGATCATCCTCTTTCTGGTGGCAGCAGCTACATGTGTTCACTCCCAGGTACAGCTGCAGCAATCTGGGGCTGAATTAGTGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAAATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGTAACTTTATGCACTGGGTAAAGCAGCAGCCTGGAAATGGCCTTGAGTGGATTGGGTGGATTTATCCTGAATATGGTAATACTAAGTACAATCAAAAGTTCGATGGGAAGGCAACACTCACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTATATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGGCAGTTATATCCCTTGTTTACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCTTCA
서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열을 <서열번호 16>에 나타낸다.
ATGGGTTGGTCTCAAATTATCTTGTTTTTGGTTGCTGCAGCCACTTGTGTTCATTCTCAGGTGCAGCTGCAACAAAGCGGCGCAGAACTGGTGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAAATATCTTGTAAGGCCAGCGGATATACTTTCACCTCCAATTTCATGCATTGGGTCAAACAGCAGCCCGGCAACGGACTCGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGAGTATGGCAACACAAAATATAACCAAAAATTTGATGGAAAGGCTACCCTGACTGCCGATAAGTCCTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGATAGCGCTGTCTACTTCTGTGCTTCCGAAGAGGCTGTCATATCCTTGGTCTATTGGGGCCAAGGAACTCTGGTGACCGTCTCATCT
서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열을 <서열번호 113>에 나타낸다.
ATGGGGTGGTCCCAGATTATATTGTTCCTCGTCGCCGCCGCCACTTGCGTACACAGCCAAGTGCAACTTCAACAAAGCGGTGCAGAACTGGTAAAGCCCGGTAGCTCTGTGAAAATATCCTGTAAAGCCAGTGGCTACACATTTACCAGCAACTTTATGCACTGGGTGAAGCAACAGCCCGGAAATGGCTTGGAGTGGATTGGCTGGATCTATCCCGAATATGGTAACACCAAGTATAATCAGAAGTTCGACGGTAAGGCCACCCTCACCGCCGATAAGTCATCCTCCACCGCCTATATGCAGCTCAGCAGCCTGACCAGCGAGGATTCCGCTGTGTACTTCTGTGCCAGCGAAGAGGCTGTGATCTCATTGGTGTATTGGGGACAGGGCACCCTCGTCACCGTGTCCAGC
<서열번호 7>
서열번호 7은, 개 항체의 L쇄 정상 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
CAGCCCAAGGCCTCCCCCTCGGTCACACTCTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCGGCGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTCATCAGCGACTTCTACCCCAGCGGCGTGACGGTGGCCTGGAAGGCAAGCGGCAGCCCCGTCACCCAGGGCGTGGAGACCACCAAGCCCTCCAAGCAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGACAAGTGGAAATCTCACAGCAGCTTCAGCTGCCTGGTCACGCACGAGGGGAGCACCGTGGAGAAGAAGGTGGCCCCCGCAGAGTGCTCTTAG
서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열을 <서열번호 17>에 나타낸다.
CAGCCCAAAGCCTCTCCCAGCGTCACCCTCTTCCCACCTTCCAGTGAGGAGCTGGGGGCAAACAAAGCCACTTTGGTGTGTCTCATCTCCGATTTTTACCCCTCCGGGGTCACAGTCGCATGGAAGGCCTCCGGATCCCCTGTGACACAGGGAGTGGAGACAACAAAACCTAGCAAGCAGAGTAACAATAAGTATGCCGCCTCAAGCTATCTCAGCCTTACTCCTGATAAGTGGAAGTCACATAGCAGTTTTAGTTGCCTCGTAACACATGAGGGTTCAACTGTGGAGAAAAAAGTAGCTCCAGCTGAGTGCTCATGA
<서열번호 8>
서열번호 8은, 개 항체의 H쇄 정상 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
GCCTCCACCACGGCCCCCTCGGTTTTCCCACTGGCCCCCAGCTGCGGGTCCACTTCCGGCTCCACGGTGGCCCTGGCCTGCCTGGTGTCAGGCTACTTCCCCGAGCCTGTAACTGTGTCCTGGAATTCCGGCTCCTTGACCAGCGGTGTGCACACCTTCCCGTCCGTCCTGCAGTCCTCAGGGCTCTACTCCCTCAGCAGCACGGTGACAGTGCCCTCCAGCAGGTGGCCCAGCGAGACCTTCACCTGCAACGTGGTCCACCCGGCCAGCAACACTAAAGTAGACAAGCCAGTGCCCAAAGAGTCCACCTGCAAGTGTATATCCCCATGCCCAGTCCCTGAATCACTGGGAGGGCCTTCGGTCTTCATCTTTCCCCCGAAACCCAAGGACATCCTCAGGATTACCCGAACACCCGAGATCACCTGTGTGGTGTTAGATCTGGGCCGTGAGGACCCTGAGGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGGATGGTAAGGAGGTGCACACAGCCAAGACGCAGCCTCGTGAGCAGCAGTTCAACAGCACCTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCCCCATTGAGCACCAGGACTGGCTCACCGGAAAGGAGTTCAAGTGCAGAGTCAACCACATAGGCCTCCCGTCCCCCATCGAGAGGACTATCTCCAAAGCCAGAGGGCAAGCCCATCAGCCCAGTGTGTATGTCCTGCCACCATCCCCAAAGGAGTTGTCATCCAGTGACACGGTCACCCTGACCTGCCTGATCAAAGACTTCTTCCCACCTGAGATTGATGTGGAGTGGCAGAGCAATGGACAGCCGGAGCCCGAGAGCAAGTACCACACGACTGCGCCCCAGCTGGACGAGGACGGGTCCTACTTCCTGTACAGCAAGCTCTCTGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGAGACACCTTCACATGTGCGGTGATGCATGAAGCTCTACAGAACCACTACACAGATCTATCCCTCTCCCATTCTCCGGGTAAATGA
서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열을 <서열번호 18>에 나타낸다.
GCTAGCACAACCGCTCCCTCCGTTTTTCCCCTCGCCCCATCCTGCGGGTCAACCAGCGGATCCACCGTCGCTCTGGCTTGTCTGGTGTCAGGATACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTTTCTTGGAATAGCGGCAGCCTTACTTCCGGCGTGCATACCTTCCCTAGCGTGCTTCAGTCCTCCGGTCTGTATTCCCTCAGCTCCACCGTAACTGTCCCAAGCTCAAGGTGGCCCTCTGAGACATTTACCTGCAATGTGGTCCATCCTGCTTCAAATACCAAAGTGGACAAGCCCGTCCCAAAAGAGTCTACCTGCAAATGTATCAGTCCTTGTCCCGTGCCCGAGTCTCTGGGCGGACCCTCAGTCTTTATCTTCCCACCCAAGCCAAAGGACATATTGCGCATTACACGGACACCCGAAATCACCTGTGTTGTGTTGGATCTCGGCCGGGAAGATCCTGAGGTGCAGATTAGTTGGTTTGTTGATGGCAAGGAGGTGCACACAGCAAAAACACAGCCCAGAGAACAGCAGTTCAACAGTACTTATAGAGTAGTGAGTGTGTTGCCTATAGAGCATCAGGACTGGCTGACAGGCAAAGAATTCAAATGTAGGGTTAACCACATTGGCCTCCCTAGTCCAATCGAGAGGACAATCTCTAAAGCCCGAGGCCAGGCTCATCAGCCTTCTGTGTACGTTCTGCCTCCTAGTCCTAAGGAACTGTCTTCTTCAGACACAGTAACACTCACTTGCCTGATTAAGGACTTTTTTCCTCCAGAGATTGATGTGGAATGGCAGTCTAACGGGCAGCCAGAGCCAGAATCTAAGTACCACACTACTGCACCACAGCTGGATGAGGATGGGTCTTACTTCCTGTACAGTAAGCTGAGTGTGGACAAGTCTCGATGGCAGCAGGGGGATACTTTTACTTGCGCAGTAATGCACGAAGCATTGCAGAACCACTACACTGACCTGTCACTTAGTCACTCACCAGGGAAGTAA
<서열번호 9>
서열번호 9는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 개 항체의 L쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 L쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
MESQTHVLISLLLSVSGTYGDIAITQSPSSVAVSVGETVTLSCKSSQSLLYSENQKDYLGWYQQKPGQTPKPLIYWATNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLIISSVQAEDLADYYCGQYLVYPFTFGPGTKLELKQPKASPSVTLFPPSSEELGANKATLVCLISDFYPSGVTVAWKASGSPVTQGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPDKWKSHSSFSCLVTHEGSTVEKKVAPAECS
<서열번호 10>
서열번호 10은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 개 항체의 H쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 H쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
MGWSQIILFLVAAATCVHSQVQLQQSGAELVKPGSSVKISCKASGYTFTSNFMHWVKQQPGNGLEWIGWIYPEYGNTKYNQKFDGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEEAVISLVYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
<서열번호 19>
서열번호 19는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 개 항체의 L쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 L쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열)을 나타낸다.
ATGGAATCTCAAACTCATGTTTTGATTTCATTACTTCTGAGTGTTTCCGGAACCTACGGTGATATCGCTATCACTCAATCTCCCTCCTCTGTTGCTGTGTCTGTGGGCGAAACCGTTACCCTGTCCTGCAAGTCCAGTCAGTCTCTTCTCTACTCCGAGAATCAAAAGGACTACCTGGGCTGGTACCAACAGAAGCCCGGCCAGACCCCAAAGCCACTGATATACTGGGCAACCAACAGGCACACCGGAGTGCCCGACAGGTTCACAGGCAGTGGATCTGGCACCGACTTTACCTTGATCATTTCAAGCGTGCAGGCTGAAGATCTGGCCGACTACTACTGTGGTCAGTATCTGGTGTATCCTTTCACTTTCGGGCCAGGGACAAAATTGGAATTGAAGCAGCCCAAAGCCTCTCCCAGCGTCACCCTCTTCCCACCTTCCAGTGAGGAGCTGGGGGCAAACAAAGCCACTTTGGTGTGTCTCATCTCCGATTTTTACCCCTCCGGGGTCACAGTCGCATGGAAGGCCTCCGGATCCCCTGTGACACAGGGAGTGGAGACAACAAAACCTAGCAAGCAGAGTAACAATAAGTATGCCGCCTCAAGCTATCTCAGCCTTACTCCTGATAAGTGGAAGTCACATAGCAGTTTTAGTTGCCTCGTAACACATGAGGGTTCAACTGTGGAGAAAAAAGTAGCTCCAGCTGAGTGCTCATGA
<서열번호 20>
서열번호 20은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 개 항체의 H쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 H쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열)을 나타낸다.
ATGGGTTGGTCTCAAATTATCTTGTTTTTGGTTGCTGCAGCCACTTGTGTTCATTCTCAGGTGCAGCTGCAACAAAGCGGCGCAGAACTGGTGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAAATATCTTGTAAGGCCAGCGGATATACTTTCACCTCCAATTTCATGCATTGGGTCAAACAGCAGCCCGGCAACGGACTCGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGAGTATGGCAACACAAAATATAACCAAAAATTTGATGGAAAGGCTACCCTGACTGCCGATAAGTCCTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGATAGCGCTGTCTACTTCTGTGCTTCCGAAGAGGCTGTCATATCCTTGGTCTATTGGGGCCAAGGAACTCTGGTGACCGTCTCATCTGCTAGCACAACCGCTCCCTCCGTTTTTCCCCTCGCCCCATCCTGCGGGTCAACCAGCGGATCCACCGTCGCTCTGGCTTGTCTGGTGTCAGGATACTTCCCCGAGCCTGTCACCGTTTCTTGGAATAGCGGCAGCCTTACTTCCGGCGTGCATACCTTCCCTAGCGTGCTTCAGTCCTCCGGTCTGTATTCCCTCAGCTCCACCGTAACTGTCCCAAGCTCAAGGTGGCCCTCTGAGACATTTACCTGCAATGTGGTCCATCCTGCTTCAAATACCAAAGTGGACAAGCCCGTCCCAAAAGAGTCTACCTGCAAATGTATCAGTCCTTGTCCCGTGCCCGAGTCTCTGGGCGGACCCTCAGTCTTTATCTTCCCACCCAAGCCAAAGGACATATTGCGCATTACACGGACACCCGAAATCACCTGTGTTGTGTTGGATCTCGGCCGGGAAGATCCTGAGGTGCAGATTAGTTGGTTTGTTGATGGCAAGGAGGTGCACACAGCAAAAACACAGCCCAGAGAACAGCAGTTCAACAGTACTTATAGAGTAGTGAGTGTGTTGCCTATAGAGCATCAGGACTGGCTGACAGGCAAAGAATTCAAATGTAGGGTTAACCACATTGGCCTCCCTAGTCCAATCGAGAGGACAATCTCTAAAGCCCGAGGCCAGGCTCATCAGCCTTCTGTGTACGTTCTGCCTCCTAGTCCTAAGGAACTGTCTTCTTCAGACACAGTAACACTCACTTGCCTGATTAAGGACTTTTTTCCTCCAGAGATTGATGTGGAATGGCAGTCTAACGGGCAGCCAGAGCCAGAATCTAAGTACCACACTACTGCACCACAGCTGGATGAGGATGGGTCTTACTTCCTGTACAGTAAGCTGAGTGTGGACAAGTCTCGATGGCAGCAGGGGGATACTTTTACTTGCGCAGTAATGCACGAAGCATTGCAGAACCACTACACTGACCTGTCACTTAGTCACTCACCAGGGAAGTAA
<서열번호 11>
서열번호 11은, 인간 항체의 L쇄 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
<서열번호 12>
서열번호 12는, 인간 항체(IgG4 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
<서열번호 13>
서열번호 13은, 인간 항체의 L쇄 정상 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
<서열번호 14>
서열번호 14는, 인간 항체(IgG4 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
TCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
<서열번호 21~36>
서열번호 21~36은, 순서대로, 프라이머 cPD-1 inner F, cPD-1 inner R, cPD-L1 inner F, cPD-L1 inner R, cPD-1 5' GSP, cPD-1 3' GSP, cPD-L1 5' GSP, cPD-L1 3' GSP, cPD-1-EGFP F, cPD-1-EGFP R, cPD-L1-EGFP F, cPD-L1-EGFP R, cPD-1-Ig, cPD-1-Ig R, cPD-L1-Ig F 및 cPD-L1-Ig R의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 37>
서열번호 37은, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 L쇄 가변 영역의 CDR1의 아미노산 서열(QSLLYSENQKDY)을 나타낸다.
<서열번호 38>
서열번호 38은, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 L쇄 가변 영역의 CDR3의 아미노산 서열(GQYLVYPFT)을 나타낸다.
<서열번호 39>
서열번호 39는, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 H쇄 가변 영역의 CDR1의 아미노산 서열(GYTFTSNF)을 나타낸다.
<서열번호 40>
서열번호 40은, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 H쇄 가변 영역의 CDR2의 아미노산 서열(IYPEYGNT)을 나타낸다.
<서열번호 41>
서열번호 41은, 래트 항-우 PD-L1 항체 4G12의 H쇄 가변 영역의 CDR3의 아미노산 서열(ASEEAVISLVY)을 나타낸다.
<서열번호 42>
서열번호 42는, 양 항체(IgG1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 43>
서열번호 43은, 양 항체(IgG1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 44>
서열번호 44는, 양 항체(IgG2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 45>
서열번호 45는, 양 항체(IgG2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 46>
서열번호 46은, 양 항체의 L쇄(Ig kappa(CK)) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 47>
서열번호 47은, 양 항체의 L쇄(Ig kappa(CK)) 정상 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 48>
서열번호 48은, 양 항체의 L쇄(Ig lambda(CL)) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 49>
서열번호 49는, 양 항체의 L쇄(Ig lambda(CL)) 정상 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 50>
서열번호 50은, 돼지 항체(IgG1a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 51>
서열번호 51은, 돼지 항체(IgG1a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 52>
서열번호 52는, 돼지 항체(IgG1b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 53>
서열번호 53은, 돼지 항체(IgG1b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 54>
서열번호 54는, 돼지 항체(IgG2a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 55>
서열번호 55는, 돼지 항체(IgG2a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 56>
서열번호 56은, 돼지 항체(IgG2b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 57>
서열번호 57은, 돼지 항체(IgG2b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 58>
서열번호 58은, 돼지 항체(IgG3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 59>
서열번호 59는, 돼지 항체(IgG3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 60>
서열번호 60은, 돼지 항체(IgG4a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 61>
서열번호 61은, 돼지 항체(IgG4a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 62>
서열번호 62는, 돼지 항체(IgG4b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 63>
서열번호 63은, 돼지 항체(IgG4b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 64>
서열번호 64는, 돼지 항체(IgG5a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 65>
서열번호 65는, 돼지 항체(IgG5a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 66>
서열번호 66은, 돼지 항체(IgG5b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 67>
서열번호 67은, 돼지 항체(IgG5b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 68>
서열번호 68은, 돼지 항체(IgG6a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 69>
서열번호 69는, 돼지 항체(IgG6a)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 70>
서열번호 70은, 돼지 항체(IgG6b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 71>
서열번호 71은, 돼지 항체(IgG6b)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 72>
서열번호 72는, 물소 항체(IgG1으로 추정된다)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 73>
서열번호 73은, 물소 항체(IgG1으로 추정된다)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 74>
서열번호 74는, 물소 항체(IgG2로 추정된다)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 75>
서열번호 75는, 물소 항체(IgG2로 추정된다)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 76>
서열번호 76은, 물소 항체(IgG3로 추정된다)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 77>
서열번호 77은, 물소 항체(IgG3로 추정된다)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 78>
서열번호 78은, 물소 항체의 L쇄(Ig lambda로 추정된다) 정상 영역(CL)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 79>
서열번호 79는, 물소 항체의 L쇄(Ig lambda로 추정된다) 정상 영역(CL)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 80>
서열번호 80은, 인간 항체(IgG4 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 81>
서열번호 81은, 인간 항체(IgG4 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 82>
서열번호 82는, 인간 항체(IgG4 variant 3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 83>
서열번호 83은, 인간 항체(IgG4 variant 3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 84>
서열번호 84는, 소 항체(IgG1 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 85>
서열번호 85는, 소 항체(IgG1 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 86>
서열번호 86은, 소 항체(IgG1 variant 3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 87>
서열번호 87은, 소 항체(IgG2 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 88>
서열번호 88은, 소 항체(IgG2 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 89>
서열번호 89는, 소 항체(IgG2 variant 3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 90>
서열번호 90은, 소 항체(IgG3 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 91>
서열번호 91은, 소 항체(IgG3 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열번호 92>
서열번호 92는, 소 항체(IgG1 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 93>
서열번호 93은, 소 항체(IgG1 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 94>
서열번호 94는, 소 항체(IgG1 variant 3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 95>
서열번호 95는, 소 항체(IgG2 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 96>
서열번호 96은, 소 항체(IgG2 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 97>
서열번호 97은, 소 항체(IgG2 variant 3)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 98>
서열번호 98은, 소 항체(IgG3 variant 1)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 99>
서열번호 99는, 소 항체(IgG3 variant 2)의 H쇄 정상 영역(CH1~CH3)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 100>
서열번호 100은, 소 항체의 L쇄 정상 영역(소 Ig lambda, GenBank: X62917)의 아미노산 서열을 나타낸다.
QPKSPPSVTLFPPSTEELNGNKATLVCLISDFYPGSVTVVWKADGSTITRNVETTRASKQSNSKYAASSYLSLTSSDWKSKGSYSCEVTHEGSTVTKTVKPSECS
<서열번호 101>
서열번호 101은, 소 항체의 L쇄 정상 영역(소 Ig lambda, GenBank: X62917)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
CAGCCCAAGTCCCCACCCTCGGTCACCCTGTTCCCGCCCTCCACGGAGGAGCTCAACGGCAACAAGGCCACCCTGGTGTGTCTCATCAGCGACTTCTACCCGGGTAGCGTGACCGTGGTCTGGAAGGCAGACGGCAGCACCATCACCCGCAACGTGGAGACCACCCGGGCCTCCAAACAGAGCAACAGCAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGAGCAGCGACTGGAAATCGAAAGGCAGTTACAGCTGCGAGGTCACGCACGAGGGGAGCACCGTGACGAAGACAGTGAAGCCCTCAGAGTGTTCTTAG
<서열번호 102>
서열번호 102는, 소 항체의 H쇄 정상 영역(소 IgG1, GenBank: X62916을 개변)의 아미노산 서열을 나타낸다. 변이 개소에 밑줄을 그었다. 아미노산 번호 및 변이: 113E→P, 114L→V, 115P→A, 116G→deletion, 209A→S, 210P→S
ASTTAPKVYPLSSCCGDKSSSTVTLGCLVSSYMPEPVTVTWNSGALKSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSMVTVPGSTSGQTFTCNVAHPASSTKVDKAVDPTCKPSPCDCCPPPPVAGPSVFIFPPKPKDTLTISGTPEVTCVVVDVGHDDPEVKFSWFVDDVEVNTATTKPREEQFNSTYRVVSALRIQHQDWTGGKEFKCKVHNEGLPSSIVRTISRTKGPAREPQVYVLAPPQEELSKSTVSLTCMVTSFYPDYIAVEWQRNGQPESEDKYGTTPPQLDADSSYFLYSKLRVDRNSWQEGDTYTCVVMHEALHNHYTQKSTSKSAGK
<서열번호 103>
서열번호 103은, 소 항체의 H쇄 정상 영역(소 IgG1, GenBank: X62916를 개변)의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 나타낸다.
GCTAGCACAACTGCTCCTAAGGTGTACCCCCTGAGCTCTTGCTGCGGCGACAAGTCTAGCAGCACCGTGACCCTCGGATGCCTCGTCAGCAGCTATATGCCTGAGCCAGTTACAGTGACATGGAATTCTGGTGCCCTTAAGTCCGGCGTCCATACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACAGTTTGTCCTCTATGGTGACAGTACCCGGTTCCACCTCCGGACAGACCTTTACCTGTAATGTGGCTCATCCCGCCTCCTCCACAAAGGTGGATAAGGCTGTTGACCCTACCTGTAAACCCAGTCCATGCGACTGCTGTCCCCCCCCTCCAGTTGCCGGACCCTCAGTCTTTATTTTCCCACCCAAACCCAAAGACACCCTGACAATCTCTGGAACACCAGAAGTCACCTGCGTCGTCGTGGATGTGGGCCACGACGATCCTGAGGTAAAATTCTCATGGTTCGTCGACGATGTGGAAGTGAATACAGCTACTACAAAACCTCGCGAAGAGCAGTTTAACTCTACCTATCGAGTGGTTTCTGCTTTGCGGATTCAGCATCAGGATTGGACAGGCGGCAAAGAGTTTAAATGTAAAGTCCATAACGAGGGACTTCCTTCTAGTATCGTGCGCACTATCAGTAGAACTAAAGGGCCTGCTCGGGAACCTCAGGTGTACGTCCTGGCACCTCCACAGGAAGAGCTGAGTAAGTCTACAGTTTCTCTGACTTGTATGGTAACATCTTTTTATCCAGATTACATCGCAGTTGAATGGCAGAGGAACGGGCAGCCAGAGAGTGAGGATAAGTACGGGACTACTCCACCACAGCTGGACGCAGACTCAAGTTACTTCCTGTACTCAAAGCTGAGGGTTGACAGAAACTCATGGCAGGAGGGGGACACTTACACTTGCGTAGTTATGCACGAGGCACTTCACAACCACTACACTCAGAAGAGTACTTCAAAGAGTGCAGGGAAGTAA
<서열번호 104~107>
서열번호 104~107은, 순서대로, 프라이머 cCD80-Ig F, cCD80-Ig R, cPD-L1-His F 및 cPD-L1-His R의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 108~111>
서열번호 108~111은, 순서대로, 프라이머 canine COX2 rt F, canine COX2 rt R, canine HPRT1 rt F 및 canine HPRT1 rt R의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<서열번호 114>
서열번호 114는, 소 항체의 L쇄 정상 영역(소 Ig lambda, GenBank: X62917)의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후)을 나타낸다.
CAGCCTAAGAGTCCTCCTTCTGTAACACTCTTTCCCCCCTCTACCGAGGAACTCAACGGCAATAAAGCTACCTTGGTTTGCCTTATTTCTGATTTCTACCCCGGGTCTGTGACCGTGGTGTGGAAAGCTGATGGGTCCACCATTACTCGGAATGTGGAAACCACCCGGGCTTCTAAGCAGTCCAACTCTAAATACGCAGCATCCTCCTATTTGAGTCTTACTAGTAGTGACTGGAAGTCAAAGGGTAGTTACAGTTGCGAAGTCACACATGAAGGTTCAACAGTGACAAAGACAGTCAAGCCCTCAGAGTGCTCATAG
<서열번호 115>
서열번호 115는, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 항체의 L쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 L쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
MESQTHVLISLLLSVSGTYGDIAITQSPSSVAVSVGETVTLSCKSSQSLLYSENQKDYLGWYQQKPGQTPKPLIYWATNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLIISSVQAEDLADYYCGQYLVYPFTFGPGTKLELKQPKSPPSVTLFPPSTEELNGNKATLVCLISDFYPGSVTVVWKADGSTITRNVETTRASKQSNSKYAASSYLSLTSSDWKSKGSYSCEVTHEGSTVTKTVKPSECS
<서열번호 116>
서열번호 116은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 소 항체의 H쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 H쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
MGWSQIILFLVAAATCVHSQVQLQQSGAELVKPGSSVKISCKASGYTFTSNFMHWVKQQPGNGLEWIGWIYPEYGNTKYNQKFDGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEEAVISLVYWGQGTLVTVSSASTTAPKVYPLSSCCGDKSSSTVTLGCLVSSYMPEPVTVTWNSGALKSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSMVTVPGSTSGQTFTCNVAHPASSTKVDKAVDPTCKPSPCDCCPPPPVAGPSVFIFPPKPKDTLTISGTPEVTCVVVDVGHDDPEVKFSWFVDDVEVNTATTKPREEQFNSTYRVVSALRIQHQDWTGGKEFKCKVHNEGLPSSIVRTISRTKGPAREPQVYVLAPPQEELSKSTVSLTCMVTSFYPDYIAVEWQRNGQPESEDKYGTTPPQLDADSSYFLYSKLRVDRNSWQEGDTYTCVVMHEALHNHYTQKSTSKSAGK
<서열번호 117>
서열번호 117은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 L쇄 가변 영역과 개 항체의 L쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 L쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열)을 나타낸다.
ATGGAATCTCAAACTCATGTTTTGATTTCATTACTTCTGAGTGTTTCCGGAACCTACGGTGATATCGCTATCACTCAATCTCCCTCCTCTGTTGCTGTGTCTGTGGGCGAAACCGTTACCCTGTCCTGCAAGTCCAGTCAGTCTCTTCTCTACTCCGAGAATCAAAAGGACTACCTGGGCTGGTACCAACAGAAGCCCGGCCAGACCCCAAAGCCACTGATATACTGGGCAACCAACAGGCACACCGGAGTGCCCGACAGGTTCACAGGCAGTGGATCTGGCACCGACTTTACCTTGATCATTTCAAGCGTGCAGGCTGAAGATCTGGCCGACTACTACTGTGGTCAGTATCTGGTGTATCCTTTCACTTTCGGGCCAGGGACAAAACTCGAGCTCAAACAGCCTAAGAGTCCTCCTTCTGTAACACTCTTTCCCCCCTCTACCGAGGAACTCAACGGCAATAAAGCTACCTTGGTTTGCCTTATTTCTGATTTCTACCCCGGGTCTGTGACCGTGGTGTGGAAAGCTGATGGGTCCACCATTACTCGGAATGTGGAAACCACCCGGGCTTCTAAGCAGTCCAACTCTAAATACGCAGCATCCTCCTATTTGAGTCTTACTAGTAGTGACTGGAAGTCAAAGGGTAGTTACAGTTGCGAAGTCACACATGAAGGTTCAACAGTGACAAAGACAGTCAAGCCCTCAGAGTGCTCATAG
<서열번호 118>
서열번호 118은, 래트 항-우 PD-L1 항체의 H쇄 가변 영역과 개 항체의 H쇄 정상 영역으로 이루어지는 키메라 H쇄의 뉴클레오타이드 서열(코돈 최적화 후 뉴클레오타이드 서열)을 나타낸다.
ATGGGGTGGTCCCAGATTATATTGTTCCTCGTCGCCGCCGCCACTTGCGTACACAGCCAAGTGCAACTTCAACAAAGCGGTGCAGAACTGGTAAAGCCCGGTAGCTCTGTGAAAATATCCTGTAAAGCCAGTGGCTACACATTTACCAGCAACTTTATGCACTGGGTGAAGCAACAGCCCGGAAATGGCTTGGAGTGGATTGGCTGGATCTATCCCGAATATGGTAACACCAAGTATAATCAGAAGTTCGACGGTAAGGCCACCCTCACCGCCGATAAGTCATCCTCCACCGCCTATATGCAGCTCAGCAGCCTGACCAGCGAGGATTCCGCTGTGTACTTCTGTGCCAGCGAAGAGGCTGTGATCTCATTGGTGTATTGGGGACAGGGCACCCTCGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACAACTGCTCCTAAGGTGTACCCCCTGAGCTCTTGCTGCGGCGACAAGTCTAGCAGCACCGTGACCCTCGGATGCCTCGTCAGCAGCTATATGCCTGAGCCAGTTACAGTGACATGGAATTCTGGTGCCCTTAAGTCCGGCGTCCATACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACAGTTTGTCCTCTATGGTGACAGTACCCGGTTCCACCTCCGGACAGACCTTTACCTGTAATGTGGCTCATCCCGCCTCCTCCACAAAGGTGGATAAGGCTGTTGACCCTACCTGTAAACCCAGTCCATGCGACTGCTGTCCCCCCCCTCCAGTTGCCGGACCCTCAGTCTTTATTTTCCCACCCAAACCCAAAGACACCCTGACAATCTCTGGAACACCAGAAGTCACCTGCGTCGTCGTGGATGTGGGCCACGACGATCCTGAGGTAAAATTCTCATGGTTCGTCGACGATGTGGAAGTGAATACAGCTACTACAAAACCTCGCGAAGAGCAGTTTAACTCTACCTATCGAGTGGTTTCTGCTTTGCGGATTCAGCATCAGGATTGGACAGGCGGCAAAGAGTTTAAATGTAAAGTCCATAACGAGGGACTTCCTTCTAGTATCGTGCGCACTATCAGTAGAACTAAAGGGCCTGCTCGGGAACCTCAGGTGTACGTCCTGGCACCTCCACAGGAAGAGCTGAGTAAGTCTACAGTTTCTCTGACTTGTATGGTAACATCTTTTTATCCAGATTACATCGCAGTTGAATGGCAGAGGAACGGGCAGCCAGAGAGTGAGGATAAGTACGGGACTACTCCACCACAGCTGGACGCAGACTCAAGTTACTTCCTGTACTCAAAGCTGAGGGTTGACAGAAACTCATGGCAGGAGGGGGACACTTACACTTGCGTAGTTATGCACGAGGCACTTCACAACCACTACACTCAGAAGAGTACTTCAAAGAGTGCAGGGAAGTAA
<서열번호 119~148>
서열번호 119~148은, 순서대로, 프라이머 boIL2 F, boIL2 R, boIL10 F, boIL10 R, boIFNγ F, boIFNγ R, boTNFα F, boTNFα R, boTGFβ1 F, boTGFβ1 R, boFoxp3 F, boFoxp3 R, boSTAT3 F, boSTAT3 R, boACTB F, boACTB R, boGAPDH F, boGAPDH R, boPDL1 F, boPDL1 R, boCOX2 F, boCOX2 R, boEP4 F, boEP4 R, boPD-1-myc F, boPD-1-myc R, boPD-L1-EGFP F, boPD-L1-EGFP R, boPD-L1-Ig F 및 boPD-L1-Ig R의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
<110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> COMBINATION USE OF INHIBITOR TARGETING PD-1/PD-L1 AND COX-2 INHIBITOR <130> 2019-FPA-9723 <150> JP2017-140891 <151> 2017-07-20 <150> JP2018-016074 <151> 2018-02-01 <160> 148 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 1 Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Gly Asp Ile Ala Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Asn Arg 65 70 75 80 His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gly Gln Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys 130 <210> 2 <211> 137 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Gly Trp Ser Gln Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Cys 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Asn Phe Met His Trp Val Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Asp Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Ser Glu Glu Ala Val Ile Ser Leu Val Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 3 <211> 105 <212> PRT <213> Canis lupus <400> 3 Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Ser Gly Ser Pro Val 35 40 45 Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 4 <211> 331 <212> PRT <213> Canis lupus <400> 4 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Thr Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val 100 105 110 Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125 Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val 130 135 140 Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 145 150 155 160 Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln 165 170 175 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln 180 185 190 Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly 195 200 205 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala 210 215 220 His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro 245 250 255 Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu 260 265 270 Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300 Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 5 <211> 399 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 atggaatcac agacgcatgt cctcatttcc cttctgctct cggtatctgg tacctatggg 60 gacattgcga taacccagtc tccatcctct gtggctgtgt cagtaggaga gacggtcact 120 ctgagctgca agtccagtca gagtctttta tacagtgaaa accaaaagga ctatttgggc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagactcct aaacccctta tctactgggc aaccaaccgg 240 cacactgggg tccctgatcg cttcacaggt agtggatccg ggacagactt cactctgatc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggct gattattact gtgggcagta ccttgtctat 360 ccgttcacgt ttggacctgg gaccaagctg gaactgaaa 399 <210> 6 <211> 411 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 6 atgggatgga gccagatcat cctctttctg gtggcagcag ctacatgtgt tcactcccag 60 gtacagctgc agcaatctgg ggctgaatta gtgaagcctg ggtcctcagt gaaaatttcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt aactttatgc actgggtaaa gcagcagcct 180 ggaaatggcc ttgagtggat tgggtggatt tatcctgaat atggtaatac taagtacaat 240 caaaagttcg atgggaaggc aacactcact gcagacaaat cctccagcac agcctatatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag tgaggaggca 360 gttatatccc ttgtttactg gggccaaggc actctggtca ctgtctcttc a 411 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Canis lupus <400> 7 cagcccaagg cctccccctc ggtcacactc ttcccgccct cctctgagga gctcggcgcc 60 aacaaggcca ccctggtgtg cctcatcagc gacttctacc ccagcggcgt gacggtggcc 120 tggaaggcaa gcggcagccc cgtcacccag ggcgtggaga ccaccaagcc ctccaagcag 180 agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgcctgacaa gtggaaatct 240 cacagcagct tcagctgcct ggtcacgcac gaggggagca ccgtggagaa gaaggtggcc 300 cccgcagagt gctcttag 318 <210> 8 <211> 996 <212> DNA <213> Canis lupus <400> 8 gcctccacca cggccccctc ggttttccca ctggccccca gctgcgggtc cacttccggc 60 tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacttcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120 tggaattccg gctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180 gggctctact ccctcagcag cacggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240 ttcacctgca acgtggtcca cccggccagc aacactaaag tagacaagcc agtgcccaaa 300 gagtccacct gcaagtgtat atccccatgc ccagtccctg aatcactggg agggccttcg 360 gtcttcatct ttcccccgaa acccaaggac atcctcagga ttacccgaac acccgagatc 420 acctgtgtgg tgttagatct gggccgtgag gaccctgagg tgcagatcag ctggttcgtg 480 gatggtaagg aggtgcacac agccaagacg cagcctcgtg agcagcagtt caacagcacc 540 taccgtgtgg tcagcgtcct ccccattgag caccaggact ggctcaccgg aaaggagttc 600 aagtgcagag tcaaccacat aggcctcccg tcccccatcg agaggactat ctccaaagcc 660 agagggcaag cccatcagcc cagtgtgtat gtcctgccac catccccaaa ggagttgtca 720 tccagtgaca cggtcaccct gacctgcctg atcaaagact tcttcccacc tgagattgat 780 gtggagtggc agagcaatgg acagccggag cccgagagca agtaccacac gactgcgccc 840 cagctggacg aggacgggtc ctacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900 tggcagcagg gagacacctt cacatgtgcg gtgatgcatg aagctctaca gaaccactac 960 acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaatga 996 <210> 9 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric L chain <400> 9 Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Gly Asp Ile Ala Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Asn Arg 65 70 75 80 His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gly Gln Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 165 170 175 Ser Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 180 185 190 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205 Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu 210 215 220 Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 10 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric H chain <400> 10 Met Gly Trp Ser Gln Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Cys 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Asn Phe Met His Trp Val Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Asp Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Ser Glu Glu Ala Val Ile Ser Leu Val Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val 145 150 155 160 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His 210 215 220 Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Glu Ser Thr 225 230 235 240 Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp 385 390 395 400 Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala 405 410 415 Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val 435 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Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu 100 105 110 Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 13 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgtta g 321 <210> 14 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 60 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 120 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 180 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 240 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 300 tatggtcccc catgcccatc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 360 ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 660 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 960 tccctgtctc tgggtaaatg a 981 <210> 15 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 15 atggaatctc aaactcatgt tttgatttca ttacttctga gtgtttccgg aacctacggt 60 gatatcgcta tcactcaatc tccctcctct gttgctgtgt ctgtgggcga aaccgttacc 120 ctgtcctgca agtccagtca gtctcttctc tactccgaga atcaaaagga ctacctgggc 180 tggtaccaac agaagcccgg ccagacccca aagccactga tatactgggc aaccaacagg 240 cacaccggag tgcccgacag gttcacaggc agtggatctg gcaccgactt taccttgatc 300 atttcaagcg tgcaggctga agatctggcc gactactact gtggtcagta tctggtgtat 360 cctttcactt tcgggccagg gacaaaattg gaattgaag 399 <210> 16 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 16 atgggttggt ctcaaattat cttgtttttg gttgctgcag ccacttgtgt tcattctcag 60 gtgcagctgc aacaaagcgg cgcagaactg gtgaaacctg gcagcagcgt gaaaatatct 120 tgtaaggcca gcggatatac tttcacctcc aatttcatgc attgggtcaa acagcagccc 180 ggcaacggac tcgagtggat cggctggatc taccccgagt atggcaacac aaaatataac 240 caaaaatttg atggaaaggc taccctgact gccgataagt cctccagcac cgcatacatg 300 caactctcct ccctgacctc cgaggatagc gctgtctact tctgtgcttc cgaagaggct 360 gtcatatcct tggtctattg gggccaagga actctggtga ccgtctcatc t 411 <210> 17 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 17 cagcccaaag cctctcccag cgtcaccctc ttcccacctt ccagtgagga gctgggggca 60 aacaaagcca ctttggtgtg tctcatctcc gatttttacc cctccggggt cacagtcgca 120 tggaaggcct ccggatcccc tgtgacacag ggagtggaga caacaaaacc tagcaagcag 180 agtaacaata agtatgccgc ctcaagctat ctcagcctta ctcctgataa gtggaagtca 240 catagcagtt ttagttgcct cgtaacacat gagggttcaa ctgtggagaa aaaagtagct 300 ccagctgagt gctcatga 318 <210> 18 <211> 996 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 18 gctagcacaa ccgctccctc cgtttttccc ctcgccccat cctgcgggtc aaccagcgga 60 tccaccgtcg ctctggcttg tctggtgtca ggatacttcc ccgagcctgt caccgtttct 120 tggaatagcg gcagccttac ttccggcgtg cataccttcc ctagcgtgct tcagtcctcc 180 ggtctgtatt ccctcagctc caccgtaact gtcccaagct caaggtggcc ctctgagaca 240 tttacctgca atgtggtcca tcctgcttca aataccaaag tggacaagcc cgtcccaaaa 300 gagtctacct gcaaatgtat cagtccttgt cccgtgcccg agtctctggg cggaccctca 360 gtctttatct tcccacccaa gccaaaggac atattgcgca ttacacggac acccgaaatc 420 acctgtgttg tgttggatct cggccgggaa gatcctgagg tgcagattag ttggtttgtt 480 gatggcaagg aggtgcacac agcaaaaaca cagcccagag aacagcagtt caacagtact 540 tatagagtag tgagtgtgtt gcctatagag catcaggact ggctgacagg caaagaattc 600 aaatgtaggg ttaaccacat tggcctccct agtccaatcg agaggacaat ctctaaagcc 660 cgaggccagg ctcatcagcc ttctgtgtac gttctgcctc ctagtcctaa ggaactgtct 720 tcttcagaca cagtaacact cacttgcctg attaaggact tttttcctcc agagattgat 780 gtggaatggc agtctaacgg gcagccagag ccagaatcta agtaccacac tactgcacca 840 cagctggatg aggatgggtc ttacttcctg tacagtaagc tgagtgtgga caagtctcga 900 tggcagcagg gggatacttt tacttgcgca gtaatgcacg aagcattgca gaaccactac 960 actgacctgt cacttagtca ctcaccaggg aagtaa 996 <210> 19 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 19 atggaatctc aaactcatgt tttgatttca ttacttctga gtgtttccgg aacctacggt 60 gatatcgcta tcactcaatc tccctcctct gttgctgtgt ctgtgggcga aaccgttacc 120 ctgtcctgca agtccagtca gtctcttctc tactccgaga atcaaaagga ctacctgggc 180 tggtaccaac agaagcccgg ccagacccca aagccactga tatactgggc aaccaacagg 240 cacaccggag tgcccgacag gttcacaggc agtggatctg gcaccgactt taccttgatc 300 atttcaagcg tgcaggctga agatctggcc gactactact gtggtcagta tctggtgtat 360 cctttcactt tcgggccagg gacaaaattg gaattgaagc agcccaaagc ctctcccagc 420 gtcaccctct tcccaccttc cagtgaggag ctgggggcaa acaaagccac tttggtgtgt 480 ctcatctccg atttttaccc ctccggggtc acagtcgcat ggaaggcctc cggatcccct 540 gtgacacagg gagtggagac aacaaaacct agcaagcaga gtaacaataa gtatgccgcc 600 tcaagctatc tcagccttac tcctgataag tggaagtcac atagcagttt tagttgcctc 660 gtaacacatg agggttcaac tgtggagaaa aaagtagctc cagctgagtg ctcatga 717 <210> 20 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 20 atgggttggt ctcaaattat cttgtttttg gttgctgcag ccacttgtgt tcattctcag 60 gtgcagctgc aacaaagcgg cgcagaactg gtgaaacctg gcagcagcgt gaaaatatct 120 tgtaaggcca gcggatatac 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ccgagccggt gaccgtgacc 120 tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc 180 gggctctact ctctcagcag catggtgacc gtgcccgcca gcagctcagg aacccagacc 240 ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgttggggtc 300 tccagtgact gctccaagcc taataaccag cattgcgtga gggaaccatc tgtcttcatc 360 ttcccaccga aacccaaaga caccctgatg atcacaggaa cgcccgaggt cacgtgtgtg 420 gtggtgaacg tgggccacga taaccccgag gtgcagttct cctggttcgt ggacgacgtg 480 gaggtgcaca cggccaggac gaagccgaga gaggagcagt tcaacagcac gtaccgcgtg 540 gtcagcgccc tgcccatcca gcaccaggac tggactggag gaaaggagtt caagtgcaag 600 gtcaacatca aaggcctctc ggcctccatc gtgaggatca tctccaggag caaagggccg 660 gcccgggagc cgcaggtgta tgtcctggac ccacccaagg aagagctcag caaaagcacg 720 gtcagcctca cctgcatggt catcggcttc tacccagaag atgtagacgt ggagtggcag 780 agagaccggc agactgagtc ggaggacaag taccgcacga ccccgcccca gctggacgcc 840 gaccgctcct acttcctgta cagcaagctc agggtggaca ggaacagctg gcagagagga 900 gacacctaca cgtgtgtggt gatgcacgag gccctgcaca atcactacat 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Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala 85 90 95 Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp 145 150 155 160 Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp 180 185 190 Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser 225 230 235 240 Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr 260 265 270 Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr 275 280 285 Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr 290 295 300 Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 305 310 315 320 Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys 325 <210> 103 <211> 987 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 103 gctagcacaa ctgctcctaa ggtgtacccc ctgagctctt gctgcggcga caagtctagc 60 agcaccgtga ccctcggatg cctcgtcagc agctatatgc ctgagccagt tacagtgaca 120 tggaattctg gtgcccttaa gtccggcgtc cataccttcc ctgctgtgct gcagtcctct 180 ggcctgtaca gtttgtcctc tatggtgaca gtacccggtt ccacctccgg acagaccttt 240 acctgtaatg tggctcatcc cgcctcctcc acaaaggtgg ataaggctgt tgaccctacc 300 tgtaaaccca gtccatgcga ctgctgtccc ccccctccag ttgccggacc ctcagtcttt 360 attttcccac ccaaacccaa agacaccctg acaatctctg gaacaccaga agtcacctgc 420 gtcgtcgtgg atgtgggcca cgacgatcct gaggtaaaat tctcatggtt cgtcgacgat 480 gtggaagtga atacagctac tacaaaacct cgcgaagagc agtttaactc tacctatcga 540 gtggtttctg ctttgcggat tcagcatcag gattggacag gcggcaaaga gtttaaatgt 600 aaagtccata acgagggact tccttctagt atcgtgcgca ctatcagtag aactaaaggg 660 cctgctcggg aacctcaggt gtacgtcctg gcacctccac aggaagagct gagtaagtct 720 acagtttctc tgacttgtat ggtaacatct ttttatccag attacatcgc agttgaatgg 780 cagaggaacg ggcagccaga gagtgaggat aagtacggga ctactccacc acagctggac 840 gcagactcaa gttacttcct gtactcaaag ctgagggttg acagaaactc atggcaggag 900 ggggacactt acacttgcgt agttatgcac gaggcacttc acaaccacta cactcagaag 960 agtacttcaa agagtgcagg gaagtaa 987 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 cgcggatatc atggattaca cagcgaagtg 30 <210> 105 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 cggggtaccc cagagctgtt gctggttat 29 <210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 cgcggctagc atgagaatgt ttagtgtctt 30 <210> 107 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 cgcggatatc ttaatggtga tggtgatggt gagtcctctc acttgctgg 49 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 aagcttcgat tgaccagagc ag 22 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 tcaccataaa gggcctccaa c 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 tggcgtcgtg attagtgatg a 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 cagagggcta cgatgtgatg g 21 <210> 112 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 112 atggaatctc aaactcatgt tttgatttca ttacttctga gtgtttccgg aacctacggt 60 gatatcgcta tcactcaatc tccctcctct gttgctgtgt ctgtgggcga aaccgttacc 120 ctgtcctgca agtccagtca gtctcttctc tactccgaga atcaaaagga ctacctgggc 180 tggtaccaac agaagcccgg ccagacccca aagccactga tatactgggc aaccaacagg 240 cacaccggag tgcccgacag gttcacaggc agtggatctg gcaccgactt taccttgatc 300 atttcaagcg tgcaggctga agatctggcc gactactact gtggtcagta tctggtgtat 360 cctttcactt tcgggccagg gacaaaactc gagctcaaa 399 <210> 113 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 113 atggggtggt cccagattat attgttcctc gtcgccgccg ccacttgcgt acacagccaa 60 gtgcaacttc aacaaagcgg tgcagaactg gtaaagcccg gtagctctgt gaaaatatcc 120 tgtaaagcca gtggctacac atttaccagc aactttatgc actgggtgaa gcaacagccc 180 ggaaatggct tggagtggat tggctggatc tatcccgaat atggtaacac caagtataat 240 cagaagttcg acggtaaggc caccctcacc gccgataagt catcctccac cgcctatatg 300 cagctcagca gcctgaccag cgaggattcc gctgtgtact tctgtgccag cgaagaggct 360 gtgatctcat tggtgtattg gggacagggc accctcgtca ccgtgtccag c 411 <210> 114 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 114 cagcctaaga gtcctccttc tgtaacactc tttcccccct ctaccgagga actcaacggc 60 aataaagcta ccttggtttg ccttatttct gatttctacc ccgggtctgt gaccgtggtg 120 tggaaagctg atgggtccac cattactcgg aatgtggaaa ccacccgggc ttctaagcag 180 tccaactcta aatacgcagc atcctcctat ttgagtctta ctagtagtga ctggaagtca 240 aagggtagtt acagttgcga agtcacacat gaaggttcaa cagtgacaaa gacagtcaag 300 ccctcagagt gctcatag 318 <210> 115 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric L chain <400> 115 Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Gly Asp Ile Ala Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Asn Arg 65 70 75 80 His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gly Gln Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys Gln Pro Lys Ser Pro Pro Ser Val Thr Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Thr Glu Glu Leu Asn Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Val Thr Val Val Trp Lys Ala 165 170 175 Asp Gly Ser Thr Ile Thr Arg Asn Val Glu Thr Thr Arg Ala Ser Lys 180 185 190 Gln Ser Asn Ser Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Ser 195 200 205 Ser Asp Trp Lys Ser Lys Gly Ser Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Glu 210 215 220 Gly Ser Thr Val Thr Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 116 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric H chain <400> 116 Met Gly Trp Ser Gln Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Cys 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Asn Phe Met His Trp Val Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Asp Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Ser Glu Glu Ala Val Ile Ser Leu Val Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val 195 200 205 Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro 225 230 235 240 Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu 275 280 285 Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys 325 330 335 Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ser Ser Ile Val Arg Thr Ile 340 345 350 Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala 355 360 365 Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met 370 375 380 Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu 405 410 415 Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg 420 425 430 Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 117 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 117 atggaatctc aaactcatgt tttgatttca ttacttctga gtgtttccgg aacctacggt 60 gatatcgcta tcactcaatc tccctcctct gttgctgtgt ctgtgggcga aaccgttacc 120 ctgtcctgca agtccagtca gtctcttctc tactccgaga atcaaaagga ctacctgggc 180 tggtaccaac agaagcccgg ccagacccca aagccactga tatactgggc aaccaacagg 240 cacaccggag tgcccgacag gttcacaggc agtggatctg gcaccgactt taccttgatc 300 atttcaagcg tgcaggctga agatctggcc gactactact gtggtcagta tctggtgtat 360 cctttcactt tcgggccagg gacaaaactc gagctcaaac agcctaagag tcctccttct 420 gtaacactct ttcccccctc taccgaggaa ctcaacggca ataaagctac cttggtttgc 480 cttatttctg atttctaccc cgggtctgtg accgtggtgt ggaaagctga tgggtccacc 540 attactcgga atgtggaaac cacccgggct tctaagcagt ccaactctaa atacgcagca 600 tcctcctatt tgagtcttac tagtagtgac tggaagtcaa agggtagtta cagttgcgaa 660 gtcacacatg aaggttcaac agtgacaaag acagtcaagc cctcagagtg ctcatag 717 <210> 118 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 118 atggggtggt cccagattat attgttcctc gtcgccgccg ccacttgcgt acacagccaa 60 gtgcaacttc aacaaagcgg tgcagaactg gtaaagcccg gtagctctgt gaaaatatcc 120 tgtaaagcca gtggctacac atttaccagc aactttatgc actgggtgaa gcaacagccc 180 ggaaatggct tggagtggat tggctggatc tatcccgaat atggtaacac caagtataat 240 cagaagttcg acggtaaggc caccctcacc gccgataagt catcctccac cgcctatatg 300 cagctcagca gcctgaccag cgaggattcc gctgtgtact tctgtgccag cgaagaggct 360 gtgatctcat tggtgtattg gggacagggc accctcgtca ccgtgtccag cgctagcaca 420 actgctccta aggtgtaccc cctgagctct tgctgcggcg acaagtctag cagcaccgtg 480 accctcggat gcctcgtcag cagctatatg cctgagccag ttacagtgac atggaattct 540 ggtgccctta agtccggcgt ccataccttc cctgctgtgc tgcagtcctc tggcctgtac 600 agtttgtcct ctatggtgac agtacccggt tccacctccg gacagacctt tacctgtaat 660 gtggctcatc ccgcctcctc cacaaaggtg gataaggctg ttgaccctac ctgtaaaccc 720 agtccatgcg actgctgtcc cccccctcca gttgccggac cctcagtctt tattttccca 780 cccaaaccca aagacaccct gacaatctct ggaacaccag aagtcacctg cgtcgtcgtg 840 gatgtgggcc acgacgatcc tgaggtaaaa ttctcatggt tcgtcgacga tgtggaagtg 900 aatacagcta ctacaaaacc tcgcgaagag cagtttaact ctacctatcg agtggtttct 960 gctttgcgga ttcagcatca ggattggaca ggcggcaaag agtttaaatg taaagtccat 1020 aacgagggac ttccttctag tatcgtgcgc actatcagta gaactaaagg gcctgctcgg 1080 gaacctcagg tgtacgtcct ggcacctcca caggaagagc tgagtaagtc tacagtttct 1140 ctgacttgta tggtaacatc tttttatcca gattacatcg cagttgaatg gcagaggaac 1200 gggcagccag agagtgagga taagtacggg actactccac cacagctgga cgcagactca 1260 agttacttcc tgtactcaaa gctgagggtt gacagaaact catggcagga gggggacact 1320 tacacttgcg tagttatgca cgaggcactt cacaaccact acactcagaa gagtacttca 1380 aagagtgcag ggaagtaa 1398 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 ttttacgtgc ccaaggttaa 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 cgtttactgt tgcatcatca 20 <210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 tgctggatga ctttaaggg 19 <210> 122 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 agggcagaaa gcgatgaca 19 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 ataaccaggt cattcaaagg 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 attctgactt ctcttccgct 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 taacaagcca gtagcccacg 20 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 gcaagggctc ttgatggcag a 21 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 ctgctgaggc tcaagttaaa agtg 24 <210> 128 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 cagccggttg ctgaggtag 19 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 cacaacctga gcctgcacaa 20 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 tcttgcggaa ctcaaactca tc 22 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 atggaaacaa ccagtcggtg a 21 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 tttctgcaca tactccatcg ct 22 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 tcttccagcc ttccttcctg 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 accgtgttgg cgtagaggtc 20 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 ggcgtgaacc acgagaagta taa 23 <210> 136 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 ccctccacga tgccaaagt 19 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 gggggtttac tgttgcttga 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 gccactcagg acttggtgat 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 acgttttctc gtgaagccct 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 140 tctaccagaa gggcgggata 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 141 gtgaccatcg ccacctactt 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 ctcatcgcac sgatgatgct 20 <210> 143 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 143 atatgcggcc gcatggggac cccgcgggcg ct 32 <210> 144 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 144 gcgcaagctt tcagaggggc caggagcagt 30 <210> 145 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 145 ctagctagca ccatgaggat atatagtgtc ttaac 35 <210> 146 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 146 caatctcgag ttacagacag aagatgactg c 31 <210> 147 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 147 gctagcatga ggatatatag tgtcttaac 29 <210> 148 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 148 gatatcattc ctcttttttg ctggat 26

Claims (11)

  1. 멜록시캄을 포함하고, 항-PD-L1 항체를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 하나의 시기에 투여하는, 세균, 진균 또는 바이러스에 의한 소의 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 감염증은 요네병(Johne's disease), 아나플라스마병(Anaplasmosis), 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라스마(Mycoplasma) 감염증, 결핵, 소형 피로플라즈마병(Theileria orientalis infection), 크립토스포리듐증(cryptosporidiosis), 콕시듐증(coccidiosis), 트리파노소마병(trypanosomiasis) 및 리슈마니아증(leishmaniasis)로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나인 것인 의약 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 감염증은 요네병, 소백혈병 바이러스 감염증 및 마이코플라즈마 감염증으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나인 것인 의약 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서,
    항-PD-L1 항체와 멜록시캄이 별도로 투여되는 의약 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    항-PD-L1 항체와 멜록시캄을 포함하는 배합제인 의약 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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