KR102569068B1 - 항pd-l1 항체 - Google Patents
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Abstract
래트 이외의 동물에도 여러 차례 투여가 가능한 항PD-L1 항체를 제공한다. (a) QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항PD-L1 항체. 상기 항PD-L1 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물. 상기 항PD-L1 항체를 제조하는 방법도 제공한다.
Description
본 발명은, 항PD-L1 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 래트 항(伉)소 PD-L1 항체의 상보 사슬 결정 영역 (CDR) 을 포함하는 가변 영역과 래트 이외 동물의 항체의 불변 영역을 갖는 항PD-L1 항체에 관한 것이다.
면역 억제 수용체 Programmed death 1 (PD-1) 과 그 리간드인 Programmed death ligand 1 (PD-L1) 은 과잉인 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊게 관련하고 있는 인자로서 쿄토 대학, 혼죠 타스쿠씨들에 의해 동정 (同定) 된 분자이다 (비특허문헌 1:Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T The EMBO Journal. 1992 Nov ; 11 (11):3887-3895.). 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 최근 밝혀져, 인간 의료에서는, PD-1 의 기능을 저해하는 항체 의약이 개발되어, 실용화되고 있다 (오노 약품 공업 주식회사 「옵디보 (등록상표)」).
지금까지, 본 발명자들은, 동물 난치성 질병에 대한 PD-1 또는 PD-L1 을 표적으로 하는 면역 요법의 개발을 실시하고, 이 신규 면역 요법이 질병 횡단적 또한 동물 횡단적으로 응용이 가능한 것을 분명히 해 왔다 (비특허문헌 2:Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 2014 Aug ; 142 (4):551-61., 비특허문헌 3:Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10 ; 9 (6):e98415., 비특허문헌 4:Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2011 Jan ; 34 (1):55-63.).
그러나, 본 발명자들이 지금까지 제조한 항체는, 래트 항체이기 때문에, 래트 이외의 동물에는 여러 차례 투여할 수 없다.
Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T The EMBO Journal. 1992 Nov ; 11 (11):3887-3895.
Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 2014 Aug ; 142 (4):551-61.
Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10 ; 9 (6):e98415.
Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2011 Jan ; 34 (1):55-63.
본 발명은, 래트 이외의 동물에도 여러 차례 투여가 가능한 항PD-L1 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 개 PD-1 및 PD-L1 의 결합을 저해 가능한 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 (4G12) 의 가변 영역을 결정하고, 이 가변 영역 유전자와, 개 면역 글로블린 (인간 IgG4 에 상당하는 IgG-D) 의 불변 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell:CHO 세포) 를 배양 증식시킴으로써, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체를 제조하는 것에 성공하였다. 또한, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 (4G12) 의 가변 영역의 CDR 을 결정하였다.
또, 본 발명자들은, 소 PD-1 및 PD-L1 의 결합을 저해 가능한 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 (4G12) 의 가변 영역을 결정하고, 이 가변 영역 유전자와, 소 면역 글로블린 (소 IgG1, 단, ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (도 19 참조. 아미노산 번호 및 변이:250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→삭제, 347 A→S, 348 P→S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug ; 142 (4):551-561.).) 의 불변 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell:CHO 세포) 를 배양 증식시킴으로써, 래트-소 키메라 항PD-L1 항체를 제조하는 것에 성공하였다. 본 발명은, 이들 지견에 의해 완성된 것이다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) (a) QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항PD-L1 항체.
(2) L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하는 (1) 기재의 항체.
(3) L 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역이고, H 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역인 (2) 기재의 항체.
(4) L 사슬 가변 영역이 서열 번호 1 의 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 가변 영역이 서열 번호 2 의 아미노산 서열을 갖는, (3) 기재의 항체.
(5) 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬 또는 Kappa 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역이, 인간의 IgG4 에 상당하는 면역 글로블린의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(7) 래트 이외의 동물이 소이고, 소 항체의 H 사슬 불변 영역이, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(8) 래트 이외의 동물이 개이고, 개 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖고, 또한, 개 항체의 H 사슬 불변 영역이, 인간의 IgG4 에 상당하는 면역 글로블린의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 (6) 기재의 항체.
(9) 소 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖고, 또한, 소 항체의 H 사슬 불변 영역이, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인 (7) 기재의 항체.
(10) 개 항체의 L 사슬 불변 영역이 서열 번호 3 의 아미노산 서열을 갖고, 개 항체의 H 사슬 불변 영역이 서열 번호 4 의 아미노산 서열을 갖는 (8) 기재의 항체.
(11) 소 항체의 L 사슬 불변 영역이 서열 번호 100 의 아미노산 서열을 갖고, 소 항체의 H 사슬 불변 영역이 서열 번호 102 의 아미노산 서열을 갖는 (9) 기재의 항체.
(12) L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물.
(14) 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 (13) 기재의 의약 조성물.
(15) 암 및/또는 감염증이, 종양성 질환, 백혈병, 요네병, 아나플라즈마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라즈마 감염증 (예를 들어, 마이코플라즈마성 유방염, 마이코플라즈마성 폐렴 등), 결핵, 소형 피로플라즈마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증으로 이루어지는 군에서 선택되는 (14) 기재의 의약 조성물.
(16) (a') QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 와, (b') GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는, 인공 유전자 DNA.
(17) (16) 기재의 인공 유전자 DNA 를 포함하는 벡터.
(18) (17) 기재의 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
(19) (18) 기재의 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항PD-L1 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
(20) QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA.
(21) GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원, 일본 특허출원 2016-159088, 일본 특허출원 2016-159089, 일본 특허출원 2017-110723 및 일본 특허출원 2017-61454 의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명에 의해, 신규 항PD-L1 항체가 얻어졌다. 이 항체는, 래트 이외의 동물에도 이용 가능하다.
도 1 은, 재조합 개 PD-1 에 대한 재조합 개 PD-L1 결합의 저해. 개 PD-1-Ig 에 대한 개 PD-L1-Ig 의 결합을 ELISA 플레이트 상에서 검출하였다. 항체 비첨가시의 흡광도 (O.D.) 를 100 % 로 하고, 각 항체 농도에 있어서의 O.D. 를 상대값으로서 나타냈다. 개 PD-L1 에 교차 반응을 나타낸 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 ; Rat IgG2a (κ), 5A2 ; Rat IgG1 (κ), 및 6G7 ; Rat IgM (κ) 중, 4G12, 6G7 양 클론은 결합 저해능이 높았다.
도 2 는, pDC6 벡터와 래트-개 키메라 항PD-L1 항체의 모식도.
도 3 은, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 및 c6G7 의 발현과 정제. 비환원 조건으로 SDS-PAGE 를 실시하고, CBB 염색에 의해 밴드를 가시화하였다. a:프로테인 A 정제만, b:+겔 여과 크로마토그래피 정제.
도 4 는, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 및 c6G7 의 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성.
도 5 는, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 고발현 세포의 수립.
도 6 은, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 SDS-PAGE 이미지. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 를 환원 조건 및 비환원 조건으로 전기 영동하고, CBB 염색에 의해 가시화하였다. 환원 조건에서는 50 kDa 부근에 항체 중사슬, 25 kDa 부근에 항체 경사슬의 밴드가 보였다. 목적 이외의 밴드는 검출되지 않았다.
도 7 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 개 PD-1/PD-L1 결합 및 CD80/PD-L1 결합 저해 활성. 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 는 개 PD-1-Ig 및 CD80-Ig 에 대한 PD-L1-Ig 결합량을 저하시키고, 키메라 항체화에 의한 결합 저해 활성의 변화는 확인되지 않았다.
도 8 은, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 에 의한 개 면역 담당 세포 활성화 효과. 개 PBMC 를 3 일간 자극 배양하고, 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ 농도를 ELISA 법에 의해 정량하였다. 또, 자극 배양 2 일째에 배양액 중에 핵산 아날로그 EdU 를 첨가하고, 그 취입량을 플로우 사이토메트리에 의해 정량하였다. 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 는 개 PBMC 로부터의 IL-2 및 IFN-γ 산생을 증대시키고, CD4+ 및 CD8+ 림프구의 증식을 항진하였다.
도 9 는, 구강내 멜라노마 (A) 및 미분화 육종 (B) 에 있어서의 PD-L1 의 발현.
도 10 은, 구강내 멜라노마 이환 개를 대상으로 실시한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 종양의 CT 화상 및 외관. (a, d) 치료 개시 전, (b, e) 치료 10 주 시점, (c, f) 치료 34 주 시점. 5 회의 항체 투여 (치료 개시 후 10 주) 로 현저한 항종양 효과가 확인되고, 34 주 시점에서는 추가적인 종양의 축소가 확인되었다.
도 11 은, 도 10 에서 나타낸 구강내 멜라노마 이환 개에 있어서의 종양 장경의 추이. 베이스라인 장경에 비하여, 30 % 이상의 축소를 부분 성공 (PR) 으로 하였다.
도 12 는, 미분화 육종 이환 개를 대상으로 실시한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 CT 화상. (a, c) 치료 개시 전, (b, d) 치료 3 주 시점. 2 회의 항체 투여로 현저한 종양의 축소가 확인되었다.
도 13 은, 구강내 멜라노마 이환 개 (폐전이 증례) 를 대상으로 실시한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 CT 화상. (a, d, g) 치료 개시 전, (b, e, h) 치료 6 주 시점, (c, f, i) 치료 18 주 시점. 9 회의 항체 투여에 의해 복수의 폐 전이소가 소실되었다.
도 14 는, 구강내 멜라노마 이환 개의 폐전이 발생 후의 생존률의 추이. 항체 투여군에서는, 대조군과 비교하여 생존 기간이 연장된 가능성이 있다.
도 15 는, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 L 사슬 가변 영역 및 H 사슬 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다.
도 16 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 교차 반응성. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 양, 돼지의 PD-L1 에 결합하는 것이 확인되었다.
도 17 은, 물소의 백혈구에 대한 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 반응성. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 물소의 혈중 매크로파지 (CD14+CD11b+세포) 에 강하게 결합하였다. 또, 물소의 림프구 (CD14-CD11b-세포) 에 대하여, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는 약하게 결합하였다. 이 결합성의 차이는, 매크로파지와 림프구에 있어서의 PD-L1 의 발현량을 반영하고 있는 것으로생각된다.
도 18 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 에 의한 양 또는 돼지 PD-1/PD-L1 의 결합 저해 시험. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 양 및 돼지 PD-1/PD-L1 의 결합을 농도 의존적으로 저해할 수 있는 것이 나타났다.
도 19 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 아미노산 서열. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 L 사슬 가변 영역 및 H 사슬 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 나타내고, 또한, 소 IgG1 (CH2 도메인) 에 변이를 가한 아미노산 (아미노산 번호 및 변이:250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→삭제, 347 A→S, 348 P→S) 도 나타낸다.
도 20 은, pDC6 벡터와 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 모식도.
도 21 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 정제 순도의 확인.
도 22 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 결합 특이성.
도 23 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성 (소 PD-L1 발현 세포와 가용성 소 PD-1 의 결합 저해 시험의 결과).
도 24 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성 (소 PD-1 발현 세포와 가용성 소 PD-L1 의 결합 저해 시험의 결과).
도 25 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 소 림프구 응답에 대한 활성화 효과 (세포 증식).
도 26 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 BLV 항원에 대한 소 림프구 응답의 활성화 효과 (IFN-γ 산생량).
도 27 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 를 투여한 BLV 실험 감염 소에 있어서의 BLV 항원에 대한 T 세포의 세포 증식 응답.
도 28 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 를 투여한 BLV 실험 감염 소에 있어서의 BLV 프로바이러스량의 변화.
도 2 는, pDC6 벡터와 래트-개 키메라 항PD-L1 항체의 모식도.
도 3 은, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 및 c6G7 의 발현과 정제. 비환원 조건으로 SDS-PAGE 를 실시하고, CBB 염색에 의해 밴드를 가시화하였다. a:프로테인 A 정제만, b:+겔 여과 크로마토그래피 정제.
도 4 는, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 및 c6G7 의 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성.
도 5 는, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 고발현 세포의 수립.
도 6 은, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 SDS-PAGE 이미지. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 를 환원 조건 및 비환원 조건으로 전기 영동하고, CBB 염색에 의해 가시화하였다. 환원 조건에서는 50 kDa 부근에 항체 중사슬, 25 kDa 부근에 항체 경사슬의 밴드가 보였다. 목적 이외의 밴드는 검출되지 않았다.
도 7 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 개 PD-1/PD-L1 결합 및 CD80/PD-L1 결합 저해 활성. 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 는 개 PD-1-Ig 및 CD80-Ig 에 대한 PD-L1-Ig 결합량을 저하시키고, 키메라 항체화에 의한 결합 저해 활성의 변화는 확인되지 않았다.
도 8 은, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 에 의한 개 면역 담당 세포 활성화 효과. 개 PBMC 를 3 일간 자극 배양하고, 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ 농도를 ELISA 법에 의해 정량하였다. 또, 자극 배양 2 일째에 배양액 중에 핵산 아날로그 EdU 를 첨가하고, 그 취입량을 플로우 사이토메트리에 의해 정량하였다. 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 는 개 PBMC 로부터의 IL-2 및 IFN-γ 산생을 증대시키고, CD4+ 및 CD8+ 림프구의 증식을 항진하였다.
도 9 는, 구강내 멜라노마 (A) 및 미분화 육종 (B) 에 있어서의 PD-L1 의 발현.
도 10 은, 구강내 멜라노마 이환 개를 대상으로 실시한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 종양의 CT 화상 및 외관. (a, d) 치료 개시 전, (b, e) 치료 10 주 시점, (c, f) 치료 34 주 시점. 5 회의 항체 투여 (치료 개시 후 10 주) 로 현저한 항종양 효과가 확인되고, 34 주 시점에서는 추가적인 종양의 축소가 확인되었다.
도 11 은, 도 10 에서 나타낸 구강내 멜라노마 이환 개에 있어서의 종양 장경의 추이. 베이스라인 장경에 비하여, 30 % 이상의 축소를 부분 성공 (PR) 으로 하였다.
도 12 는, 미분화 육종 이환 개를 대상으로 실시한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 CT 화상. (a, c) 치료 개시 전, (b, d) 치료 3 주 시점. 2 회의 항체 투여로 현저한 종양의 축소가 확인되었다.
도 13 은, 구강내 멜라노마 이환 개 (폐전이 증례) 를 대상으로 실시한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 투여 치료 시험에 있어서의 CT 화상. (a, d, g) 치료 개시 전, (b, e, h) 치료 6 주 시점, (c, f, i) 치료 18 주 시점. 9 회의 항체 투여에 의해 복수의 폐 전이소가 소실되었다.
도 14 는, 구강내 멜라노마 이환 개의 폐전이 발생 후의 생존률의 추이. 항체 투여군에서는, 대조군과 비교하여 생존 기간이 연장된 가능성이 있다.
도 15 는, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 L 사슬 가변 영역 및 H 사슬 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다.
도 16 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 교차 반응성. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 양, 돼지의 PD-L1 에 결합하는 것이 확인되었다.
도 17 은, 물소의 백혈구에 대한 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 반응성. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 물소의 혈중 매크로파지 (CD14+CD11b+세포) 에 강하게 결합하였다. 또, 물소의 림프구 (CD14-CD11b-세포) 에 대하여, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는 약하게 결합하였다. 이 결합성의 차이는, 매크로파지와 림프구에 있어서의 PD-L1 의 발현량을 반영하고 있는 것으로생각된다.
도 18 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 에 의한 양 또는 돼지 PD-1/PD-L1 의 결합 저해 시험. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 양 및 돼지 PD-1/PD-L1 의 결합을 농도 의존적으로 저해할 수 있는 것이 나타났다.
도 19 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 아미노산 서열. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 L 사슬 가변 영역 및 H 사슬 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 나타내고, 또한, 소 IgG1 (CH2 도메인) 에 변이를 가한 아미노산 (아미노산 번호 및 변이:250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→삭제, 347 A→S, 348 P→S) 도 나타낸다.
도 20 은, pDC6 벡터와 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 모식도.
도 21 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 정제 순도의 확인.
도 22 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 결합 특이성.
도 23 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성 (소 PD-L1 발현 세포와 가용성 소 PD-1 의 결합 저해 시험의 결과).
도 24 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성 (소 PD-1 발현 세포와 가용성 소 PD-L1 의 결합 저해 시험의 결과).
도 25 는, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 소 림프구 응답에 대한 활성화 효과 (세포 증식).
도 26 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 의 BLV 항원에 대한 소 림프구 응답의 활성화 효과 (IFN-γ 산생량).
도 27 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 를 투여한 BLV 실험 감염 소에 있어서의 BLV 항원에 대한 T 세포의 세포 증식 응답.
도 28 은, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 를 투여한 BLV 실험 감염 소에 있어서의 BLV 프로바이러스량의 변화.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, (a) QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항PD-L1 항체를 제공한다.
래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 L 사슬 가변 영역에 있어서의 CDR1 ∼ 3 은, 각각, QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, WAT 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다 (도 15 참조).
또, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 H 사슬 가변 영역에 있어서의 CDR1 ∼ 3 은, GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다 (도 15 참조).
QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열, WAT 의 아미노산 서열 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열, 그리고, GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 된다.
본 명세서에 있어서, 항체란, 전체 길이 항체 외에, Fab, F(ab)'2, ScFv, Diabody, VH, VL, Sc(Fv)2, Bispecific sc(Fv)2, Minibody, ScFv-Fc monomer, ScFv-Fc dimer 등의 저분자화 된 것도 포함하는 개념이다.
본 발명의 항PD-L1 항체에 있어서, L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하면 된다. 예를 들어, L 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역이고, H 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역이면 된다.
래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열 및 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을, 각각, 서열 번호 1 및 2 에 나타내지만, 서열 번호 1 및 2 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들 변이가 도입되어도, PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역 또는 H 사슬 가변 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역 및 H 사슬 불변 영역은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 와 교차 반응하는 PD-L1 을 산생하는 동물 유래의 것이면 된다.
항체의 L 사슬에는, Kappa 사슬 (카파 사슬) 과 Lambda 사슬 (람다 사슬) 이 있으며, 본 발명의 항PD-L1 항체에 있어서, 래트 이외 동물의 항체의 L 사슬 불변 영역은, Kappa 사슬 또는 Lambda 사슬 중 어느 쪽 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이어도 되지만, 존재 비율은, 양, 고양이, 개, 말, 소에서는 Lambda 사슬 쪽이 높고, 마우스, 래트, 인간, 돼지에서는 Kappa 사슬 쪽이 높다. 존재 비율이 높은 사슬 쪽이 바람직한 것으로 생각되므로, 양, 고양이, 개, 말, 소에서는 Lambda 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, 마우스, 래트, 인간, 돼지에서는 Kappa 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
래트 이외 동물의 항체의 H 사슬 불변 영역은, 인간의 IgG4 에 상당하는 면역 글로블린의 불변 영역의 아미노산 서열을 가지면 된다. H 사슬은, 불변 영역의 차이에 의해, γ 사슬, μ 사슬, α 사슬, δ 사슬, ε 사슬로 나뉘어지고, 이 차이에 의해 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 의 5 종류의 클래스 (아이소타입) 의 면역 글로블린이 형성된다.
면역 글로블린 G (IgG) 는 인간 면역 글로블린의 70-75 % 를 차지하고, 혈장 중에 가장 많은 단량체의 항체이다. 경사슬 2 개와 중사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는다. 인간 IgG1, IgG2, IgG4 는 분자량은 약 146,000 이지만, 인간 IgG3 은 Fab 영역과 Fc 영역을 잇는 힌지부가 길고, 분자량도 170,000 으로 크다. 인간 IgG1 은 인간 IgG 의 65 % 정도, 인간 IgG2 는 25 % 정도, 인간 IgG3 은 7 % 정도, 인간 IgG4 는 3 % 정도를 차지한다. 혈관 내외에 평균적으로 분포한다. 인간 IgG1 은, 이펙터 세포 표면의 Fc 리셉터나 보체 인자에 강한 친화성을 가지므로, 항체 의존성 세포 상해 활성 (ADCC) 을 유도하고, 또, 보체를 활성화하여 보체 의존성 세포 상해 활성 (CDC) 을 유도한다. 인간 IgG2 와 인간 IgG4 는, Fc 리셉터나 보체 인자에 대한 친화성이 낮기 때문에, ADCC 활성 및 CDC 활성이 낮다.
면역 글로블린 M (IgM) 은 인간 면역 글로블린의 약 10 % 를 차지하는, 기본 4 개 사슬 구조가 5 개 결합한 5 량체의 항체이다. 분자량은 970,000. 통상적으로 혈중에만 존재하고, 감염 미생물에 대하여 최초로 산생되며, 초기 면역을 담당하는 면역 글로블린이다.
면역 글로블린 A (IgA) 는 인간 면역 글로블린의 10-15 % 를 차지한다. 분자량은 160,000. 분비형 IgA 는 2 개의 IgA 가 결합한 2 량체의 항체가 되어 있다. IgA1 은 혈청, 콧물, 타액, 모유 중에 존재하고, 장액에는 IgA2 가 많이 존재한다.
면역 글로블린 D (IgD) 는 인간 면역 글로블린의 1 % 이하의 단량체의 항체이다. B 세포 표면에 존재하고, 항체 산생의 유도에 관여한다.
면역 글로블린 E (IgE) 는 인간 면역 글로블린의 0.001 % 이하로 극미량 밖에 존재하지 않는 단량체의 항체이다. 기생충에 대한 면역 반응에 관여하고 있는 것으로 생각되지만, 기생충이 드문 선진국에 있어서는, 특히 기관지 천식이나 알레르기에 크게 관여하고 있다.
개에서는, IgG 의 H 사슬로서, IgG-A (인간 IgG2 에 상당), IgG-B (인간 IgG1 에 상당), IgG-C (인간 IgG3 에 상당), IgG-D (인간 IgG4 에 상당) 의 서열이 동정되어 있다. 본 발명의 항체에서는, ADCC 활성, CDC 활성을 함께 갖지 않는 IgG H 사슬 불변 영역이 바람직하다 (인간에서는 IgG4). 인간 IgG4 에 상당하는 면역 글로블린의 불변 영역이 동정되어 있지 않은 경우에는, 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로블린의 당해 영역에 변이를 가함으로써, ADCC 활성, CDC 활성을 함께 갖지 않게 된 것을 사용하면 된다.
소에서는, IgG 의 H 사슬로서, IgG1, IgG2, IgG3 의 서열이 동정되어 있다. 본 발명의 항체에서는, ADCC 활성, CDC 활성을 함께 갖지 않는 IgG H 사슬 불변 영역이 바람직하다 (인간에서는 IgG4). 인간 IgG1 의 불변 영역은 야생형에서는 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖지만, 특정한 부분에 아미노산 치환이나 결손을 가함으로써, 그들의 활성을 저하시키게 되는 것이 알려져 있다. 소에 있어서, 인간 IgG4 에 상당하는 면역 글로블린의 불변 영역이 동정되어 있지 않기 때문에, 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로블린의 당해 영역에 변이를 가하고, 이것을 사용할 수 있다. 그 일례로서, 소 항체의 H 사슬 불변 영역 (IgG1 사슬, GenBank:X62916) 의 CH2 도메인에 변이를 가한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열 (코돈을 최적화한 것) 을, 각각, 서열 번호 102 및 103 에 나타낸다.
래트 이외의 동물이 개인 경우, 개 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖고, 또한, 개 항체의 H 사슬 불변 영역이, 인간의 IgG4 에 상당하는 면역 글로블린의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는 항PD-L1 항체가 보다 바람직하다.
래트 이외의 동물이 소인 경우, 소 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖고, 또한, 소 항체의 H 사슬 불변 영역이, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인 항PD-L1 항체가 보다 바람직하다.
본 발명의 항PD-L1 항체는, 래트-개 키메라 항체, 개화 항체, 완전 개형 항체, 래트-소 키메라 항체, 소화 항체, 완전 소형 항체를 포함하지만, 동물은, 개와 소에 한정되는 것은 아니고, 인간, 돼지, 원숭이, 마우스, 고양이, 말, 염소, 양, 물소, 토끼, 햄스터, 모르모트 등등을 예시할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 항PD-L1 항체는, 개 항체의 L 사슬 불변 영역이 서열 번호 3 의 아미노산 서열을 갖고, 개 항체의 H 사슬 불변 영역이 서열 번호 4 의 아미노산 서열을 갖는 항PD-L1 항체여도 된다.
또, 예를 들어, 본 발명의 항PD-L1 항체는, 소 항체의 L 사슬 불변 영역이 서열 번호 100 의 아미노산 서열을 갖고, 소 항체의 H 사슬 불변 영역이 서열 번호 102 의 아미노산 서열을 갖는 항PD-L1 항체여도 된다.
서열 번호 3 및 4 그리고 서열 번호 100 및 102 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들 변이가 도입되어도, 항체의 L 사슬 불변 영역 또는 H 사슬 불변 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 항PD-L1 항체는, L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 가지면 된다.
본 발명의 항PD-L1 항체는, 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 동정한 래트 항소 PD-L1 항체의 가변 영역 서열과 래트 이외의 동물 (예를 들어, 개, 소 등) 의 항체 (바람직하게는, 인간 IgG4 항체, 인간 IgG4 항체에 상당하는 항체 또는 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로블린의 당해 영역에 변이를 가하고, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시킨 것) 의 불변 영역 서열을 포함하는 인공 유전자를 합성하고, 그 인공 유전자를 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 에 삽입 후, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 등의 포유류 세포) 에 도입하고, 그 숙주 세포를 배양함으로써, 배양물로부터 항체를 채취한다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 1 및 5 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 15 에 나타낸다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 2 및 6 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 16 에 나타낸다.
개 항체의 L 사슬 불변 영역 (Lambda 사슬, GenBank:E02824.1) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 3 및 7 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 17 에 나타낸다.
소 항체의 L 사슬 불변 영역 (Lambda 사슬, GenBank:X62917) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 100 및 101 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 104 에 나타낸다.
개 항체의 H 사슬 불변 영역 (IgG-D 사슬, GenBank:AF354267.1) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 4 및 8 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 18 에 나타낸다.
소 항체의 H 사슬 불변 영역 (IgG1 사슬, GenBank:X62916 을 개변) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을, 각각, 서열 번호 102 및 103 에 나타낸다.
또, 서열 번호 9 는, 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 개 항체의 L 사슬 불변 영역 (Lambda 사슬, GenBank:E02824.1) 으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 개 항체의 L 사슬 불변 영역 (Lambda 사슬, GenBank:E02824.1) 으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 19 에 나타낸다.
또, 서열 번호 105 는, 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 불변 영역 (Lambda 사슬, GenBank:X62917) 으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 불변 영역 (Lambda 사슬, GenBank:X62917) 으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 107 에 나타낸다.
서열 번호 10 은, 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 개 항체의 H 사슬 불변 영역 (IgG-D 사슬, GenBank:AF354267.1) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 개 항체의 H 사슬 불변 영역 (IgG-D 사슬, GenBank:AF354267.1) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 20 에 나타낸다.
서열 번호 106 은, 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 불변 영역 (IgG1 사슬, GenBank:X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 불변 영역 (IgG1 사슬, GenBank:X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 108 에 나타낸다.
이 외, 각종 동물의 L 사슬 불변 영역 및 H 사슬 불변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은, 공지된 데이터베이스로부터 입수할 수 있고, 이들의 서열을 이용할 수 있다.
개, 양, 돼지, 물소, 인간, 소의 L 사슬 불변(정상) 영역 및 H 사슬 불변(정상) 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 하기의 표에 정리하였다.
(표)
(돼지 계속)
서열 번호 4, 3, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 12, 80, 82, 84 ∼ 91, 100, 102 및 11 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들 변이가 도입되어도, Ig 중사슬 또는 경사슬의 불변 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
인간 IgG1 의 불변 영역은 야생형에서는 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖지만, 특정한 부분에 아미노산 치환이나 결손을 가함으로써, 그들의 활성을 저하시키게 되는 것이 알려져 있다. 인간 이외의 동물에 있어서, 인간 IgG4 에 상당하는 면역 글로블린의 불변 영역이 동정되어 있지 않은 경우, 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로블린의 당해 영역에 변이를 가하고, ADCC 활성 및 CDC 활성을 저하시킨 것을 사용할 수 있다.
본 발명은, (a') QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 와, (b') GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는, 인공 유전자 DNA 를 제공한다. 또, 본 발명은, QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA ((a') 의 DNA) 도 제공한다. 또한, 본 발명은, GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA ((b') 의 DNA) 도 제공한다.
(a) QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬, (b) GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬에 대해서는, 상기 서술하였다. (a') 의 DNA 는 (a) 의 L 사슬을 코드하는 DNA (유전자) 이고, (b') 의 DNA 는 (b) 의 H 사슬을 코드하는 DNA (유전자) 이고, (a') 의 DNA 와 (b') 의 DNA 를 포함하는 인공 유전자 DNA 는, 시판되는 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 인공 유전자 DNA 에는, 제한 효소 인식 부위, KOZAK 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열 등을 부가해도 된다.
또, 본 발명은 상기 인공 유전자 DNA 를 포함하는 벡터도 제공한다.
벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ 파지 등의 박테리오파지, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스 등의 동물 바이러스, 바큘로바이러스 등의 곤충병원 바이러스 등을 사용할 수 있다. 후술하는 실시예에서는, pDC6 (일본 특허 제5704753호, US Patent 9096878, EU Patent 2385115, Hong Kong (China) patent HK1163739, Australia Patent 2009331326) 을 사용하였다.
벡터에는, 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 인트론 서열, 선택 마커, SV40 복제 오리진 등을 부가해도 된다.
또한, 본 발명은, 상기 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포도 제공한다. 이 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항체를 채취함으로써, 항PD-L1 항체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항PD-L1 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법도 제공한다. 본 발명의 항체의 제조 방법에 있어서, L 사슬을 코드하는 DNA 와 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는 인공 유전자 DNA 를 짜넣은 벡터를 숙주 세포에 트랜스펙션 해도 되고, L 사슬을 코드하는 DNA 를 짜넣은 벡터와 H 사슬을 코드하는 DNA 를 짜넣은 벡터를 숙주 세포에 코트랜스펙션 해도 된다.
숙주 세포로는, 세균 세포 (예를 들어, 에쉐리히아속균, 바틸루스속균, 고초균 등), 진균 세포 (예를 들어, 효모, 아스페르길루스 등), 곤충 세포 (예를 들어, S2 세포, Sf 세포 등), 동물 세포 (예를 들어, CHO 세포, COS 세포, HeLa 세포, C127 세포, 3T3 세포, BHK 세포, HEK293 세포 등), 식물 세포 등을 예시할 수 있다. 이 중, 디하이드로 엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포 (CHO-DG44 (dhfr-/-)) 가 바람직하다.
재조합 벡터를 숙주에 도입하려면, Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 에 기재된 방법 (예를 들어, 인산 칼슘법, DEAE-덱스트란법, 트랜스펙션법, 마이크로 인젝션법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법, 형질 도입법, 스크레이프 로딩법, 쇼트건법 등) 또는 감염에 의해 실시할 수 있다.
형질 전환체를 배지에서 배양하고, 배양물로부터 본 발명의 항PD-L1 항체를 채취할 수 있다. 항체가 배지에 분비되는 경우에는, 배지를 회수하고, 그 배지로부터 항체를 분리하고, 정제하면 된다. 항체가 형질 전환된 세포내에 산생되는 경우에는, 그 세포를 용해하고, 그 용해물로부터 항체를 분리하고, 정제하면 된다.
배지로는, OptiCHO 배지, Dynamis 배지, CD CHO 배지, ActiCHO 배지, FortiCHO 배지, Ex-Cell CD CHO 배지, BalanCD CHO 배지, ProCHO 5 배지, Cellvento CHO-100 배지 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
배지의 pH 는 배양하는 세포에 따라 상이하지만, 일반적으로는 pH 6.8 ∼ 7.6, 많은 경우 pH 7.0 ∼ 7.4 가 적당하다.
배양하는 세포가 CHO 세포인 경우, CHO 세포의 배양은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 통상적으로, 기상의 CO2 농도가 0-40 %, 바람직하게는 2-10 % 의 분위기하, 30-39 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 정도에서, 배양하는 것이 가능하다.
적당한 배양 기간은, 통상적으로 1 일 ∼ 3 개월이고, 바람직하게는 1 일 ∼ 3 주간이다.
항체의 분리 및 정제는, 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 공지된 분리, 정제법으로는, 염석이나 용매 침전법 등의 용해도의 차를 이용하는 방법, 투석법, 한외 여과법, 겔 여과법, 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 등의 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동법 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등이 사용된다.
본 발명의 항PD-L1 항체는, 동물용 또는 인간용의 항체 의약으로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기의 항PD-L1 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 암 및/또는 감염증으로는, 종양성 질환 (예를 들어, 악성 흑색종, 폐암, 위암, 신장암, 유암, 방광암, 식도암, 난소암 등), 백혈병, 요네병, 아나플라즈마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라즈마 감염증 (예를 들어, 마이코플라즈마성 유방염, 마이코플라즈마성 폐렴 등), 결핵, 소형 피로플라즈마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항PD-L1 항체를 PBS 등의 완충액, 생리 식염수, 멸균수 등에 용해 하고, 필요에 따라 필터 등으로 여과 멸균한 후, 주사에 의해 피험 동물 (인간도 포함한다) 에게 투여하면 된다. 또, 이 용액에는, 첨가제 (예를 들어, 착색제, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 용해 보조제, 안정화제, 보존제, 산화 방지제, 완충제, 등장화제, pH 조절제 등) 등을 첨가해도 된다. 투여 경로로는, 정맥, 근육, 복강, 피하, 피내 투여 등이 가능하고, 또, 경비, 경구 투여해도 된다.
본 발명의 항PD-L1 항체의 투여량, 투여의 횟수 및 빈도는, 피험 동물의 증상, 연령, 체중, 투여 방법, 투여 형태 등에 따라 상이하지만, 예를 들어, 통상적으로, 성수 (成獸) 한마리당 0.1 ∼ 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는, 1 ∼ 10 ㎎/㎏ 체중을, 적어도 1 회, 원하는 효과가 얻어지는 빈도로 투여하면 된다.
본 발명의 의약 조성물은, 단독으로 사용해도 되지만, 외과 수술, 방사선 요법, 암 백신 등 다른 면역 요법이나 분자 표적 치료약과 조합하여 사용해도 된다. 이에 따라, 상승 효과를 기대할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 래트-개 키메라 항PD-L1 항체
1. 서론
면역 억제 수용체 Programmed death 1 (PD-1) 과 그 리간드인 Programmed death ligand 1 (PD-L1) 은 과잉인 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊게 관련하고 있는 인자로서 쿄토 대학, 혼죠 타스쿠씨들에 의해 동정된 분자이다. 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 최근 밝혀져 있다. 본 실시예에서는, 개 종양 질환에 대한 신규 치료법의 수립을 목적으로 개 PD-1 및 PD-L1 의 결합을 저해 가능한 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 (4G12) 의 가변 영역 유전자와, 개 면역 글로블린 (IgG4) 의 불변 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell:CHO 세포) 를 배양 증식시켜 얻은 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 를 제조하고, in vitro 및 in vivo 의 효과를 확인하였다.
2. 재료 및 방법
2.1 소 PD-L1 모노클로날 항체 산생 세포
소 PD-L1 유전자 서열을 동정하고 (Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet Res. 2011 Sep 26 ; 42:103.), 그 유전자 정보로부터 재조합 소 PD-L1 을 제조하였다. 동 (同) 재조합 단백질을 래트에게 면역하고 래트 항소 PD-L1 항체를 얻었다 (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 2014 Aug ; 142 (4):551-61. 이 논문에 후에 개 키메라 항체의 가변 영역이 되는 클론 4G12 가 게재되어 있다).
2.2 완전 길이 개 PD-1 및 PD-L1 유전자의 동정
개 PD-1 및 PD-L1 cDNA 전체 길이를 결정하기 위해서, 먼저 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) 에 이미 등록되어 있는 개의 PD-1 및 PD-L1 의 예상 염기 서열 (GenBank accession number ; XM_543338 및 XM_541302) 로부터 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내부를 증폭하도록 프라이머 (cPD-1 inner F 및 R, cPD-L1 inner F 및 R) 를 설계하고 PCR 법을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물에 대해서, 통상적인 방법에 따라서 캐필러리 시퀸서에 의해 염기 서열을 결정하였다. 또한 완전 길이 PD-1 및 PD-L1 cDNA 의 염기 서열을 결정하기 위해서, 상기에서 결정한 개 PD-1 및 PD-L1 cDNA 서열을 기초로 프라이머 (cPD-1 5′GSP 및 3′GSP, cPD-L1 5′GSP 및 3′GSP) 를 설계하고, 각각 5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 및 3′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Invitrogen 사) 를 사용하여 5′ 및 3′RACE 법을 실시하였다. 5′ 및 3′RACE 법에 의해 얻어진 목적으로 하는 유전자 단편은 상기의 방법에 따라서 염기 서열을 결정하였다 (Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10 ; 9 (6):e98415.).
프라이머 (cPD-1 inner F):AGGATGGCTCCTAGACTCCC (서열 번호 21)
프라이머 (cPD-1 inner R):AGACGATGGTGGCATACTCG (서열 번호 22)
프라이머 (cPD-L1 inner F):ATGAGAATGTTTAGTGTCTT (서열 번호 23)
프라이머 (cPD-L1 inner R):TTATGTCTCTTCAAATTGTATATC (서열 번호 24)
프라이머 (cPD-1 5′GSP):GTTGATCTGTGTGTTG (서열 번호 25)
프라이머 (cPD-1 3′GSP):CGGGACTTCCACATGAGCAT (서열 번호 26)
프라이머 (cPD-L1 5′GSP):TTTTAGACAGAAAGTGA (서열 번호 27)
프라이머 (cPD-L1 3′GSP):GACCAGCTCTTCTTGGGGAA (서열 번호 28)
2.3 개 PD-1 및 PD-L1 발현 COS-7 세포의 구축
개 PD-1-EGFP 및 PD-L1-EGFP 발현 플라스미드를 제조하기 위해서, 합성한 비글 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로, 5′말단측에 제한 효소 XhoI 및 BamHI (PD-1), BglII 및 EcoRI (PD-L1) 인식 부위를 부가하여 설계한 프라이머 (cPD-1-EGFP F 및 R, cPD-L1-EGFP F 및 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 XhoI (Takara 사) 및 BamHI (Takara 사) (PD-1), BglII (New England Biolabs 사) 및 EcoRI (Takara 사) (PD-L1) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pEGFP-N2 vector (Clontech 사) 를 사용하여 클로닝을 실시하였다. 얻어진 목적으로 하는 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pEGFP-N2-cPD-1 혹은 pEGFP-N2-cPD-L1 이라고 표기하였다.
프라이머 (cPD-1-EGFP F):CCGCTCGAGATGGGGAGCCGGCGGGGGCC (서열 번호 29)
프라이머 (cPD-1-EGFP R):CGCGGATCCTGAGGGGCCACAGGCCGGGTC (서열 번호 30)
프라이머 (cPD-L1-EGFP F):GAAGATCTATGAGAATGTTTAGTGTC (서열 번호 31)
프라이머 (cPD-L1-EGFP R):GGAATTCTGTCTCTTCAAATTGTATATC (서열 번호 32)
5 × 104/cm2 의 COS-7 세포를 6 구멍 플레이트에 계대하고, 10 % 비동화 소 태자 (胎仔) 혈청, 0.01 % L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37 ℃, 5 % CO2 존재하에서 하룻밤 배양하였다. pEGFP-N2-cPD-1, pEGFP-N2-cPD-L1, 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 0.4 ㎍/cm2 를 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen 사) 을 사용하여, COS-7 세포에 각각 도입하고 48 시간 배양하였다 (cPD-1-EGFP 발현 세포 및 cPD-L1-EGFP 발현 세포). 제조한 발현 세포에 있어서의 개 PD-1 및 PD-L1 의 발현을 확인하기 위해서, 도립형 (倒立型) 공초점 레이저 현미경 LSM700 (ZEISS 사) 에 의해, Enhanced green fluorescent protein (EGFP) 의 세포내 국재를 가시화하였다 (Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10 ; 9 (6):e98415.).
2.4 재조합 개 PD-1, PD-L1 및 CD80 의 구축
개 PD-1, PD-L1 및 CD80 의 예상 아미노산 서열로부터 추정된 세포외 영역을 증폭하도록 5′말단측에 NheI 혹은 EcoRV (PD-1 및 PD-L1) 의 인식 서열을 부가한 프라이머 (cPD-1-Ig F 및 R, cPD-L1-Ig F 및 R), 또는 5′말단측에 EcoRV 혹은 KpnI (CD80) 의 인식 서열을 부가한 프라이머 (cCD80-Ig F 및 R) 를 설계하였다. 합성한 비글 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, PCR 산물을 NheI (Takara 사) 및 EcoRV (Takara 사), 또는 EcoRV (Takara 사) 및 KpnI (New England Biolabs 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCXN2.1-Rabbit IgG Fc vector (Niwa et al., 1991 ; Zettlmeissl et al., 1990 ; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 교수 요코미조 다케히코 선생님으로부터 분여된 것을 당 연구실에서 개변) 를 사용하여, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 각각 pCXN2.1-cPD-1-Ig, pCXN2.1-cPD-L1-Ig 혹은 pCXN2.1-cCD80-Ig 라고 표기하였다.
프라이머 (cPD-1-Ig F):CGCGGCTAGCATGGGGAGCCGGCGGGGGCC (서열 번호 33)
프라이머 (cPD-1-Ig R):CGCGGATATCCAGCCCCTGCAACTGGCCGC (서열 번호 34)
프라이머 (cPD-L1-Ig F):CGCGGCTAGCATGAGAATGTTTAGTGTCTT (서열 번호 35)
프라이머 (cPD-L1-Ig R):CGCGGATATCAGTCCTCTCACTTGCTGGAA (서열 번호 36)
프라이머 (cCD80-Ig F):CGCGGATATCATGGATTACACAGCGAAGTG (서열 번호 129)
프라이머 (cCD80-Ig R):CGGGGTACCCCAGAGCTGTTGCTGGTTAT (서열 번호 130)
이들의 발현 벡터를 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 트랜스펙션 하고, 재조합 Ig 융합 단백질을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 산생한 재조합 단백질은 상청으로부터 Ab Capcher Extra (프로테인 A 변이체, ProteNova 사) 를 사용하여 정제를 실시하고, PD-MidiTrap G-25 (GE Healthcare사) 를 사용하여 버퍼를 인산 완충 생리 식염수 (PBS ; pH 7.4) 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다 (cPD-1-I, cPD-L1-Ig 및 cCD80-Ig). 단백질의 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific 사) 에 의해 정량하고, 이후의 실험에 사용하였다.
2.5 개 PD-L1 에 교차 반응을 나타내는 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체의 동정
개 PD-L1 에 교차 반응을 나타내는 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체를 동정 하기 위해서, 2.1 에서 제조한 항소 PD-L1 항체를 사용하여 플로우 사이토메트리를 실시하였다. 2 × 105-1 × 106 개의 세포에 대하여, 10 ㎍/㎖ 의 항소 PD-L1 항체를 실온에서 30 분간 반응시키고, 세정한 후에 Allophycocyanine 표지 항래트 Ig 염소 항체 (Beckman Coulter 사) 를 사용하여 항소 PD-L1 항체의 검출을 실시하였다. 해석에는 FACS Verse (Becton, Dickinson and Company 사) 를 사용하였다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사), 래트 IgG1 (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사), 래트 IgM (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 10 % 비동화 염소 혈청가 PBS 를 사용하였다 (Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10 ; 9 (6):e98415. 소 PD-L1 모노클로날 항체 3 종:4G12 ; Rat IgG2a (κ), 5A2 ; Rat IgG1 (κ), 및 6G7 ; Rat IgM (κ) 를 사용한 논문).
2.6 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 수립을 위한 가변 부위의 선정 시험
이하, 개 PD-L1 에 교차 반응을 나타낸 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 10 클론 중 4G12 ; Rat IgG2a (κ), 5A2 ; Rat IgG1 (κ), 및 6G7 ; Rat IgM (κ) 를 선발하고, 이들의 항체가 개 PD-1/PD-L1 결합을 저해하는지 검토하였다. 즉, 개 PD-1-Ig (2.4 에서 제조) 를 평저 (平底) 96 구멍 플레이트 상에 고층화 (固層化) 하고, 1 % BSA 및 0.05 % Tween20 을 포함하는 PBS 로 블로킹 조작을 실시하였다. Lightning-Link Biotin Conjugation Kit (Innova Biosciences 사) 를 사용하여 비오틴화한 개 PD-L1-Ig (2.4 에서 제조) 를, 각 농도 (0, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖) 의 래트 항소 PD-L1 항체 4G12, 5A2 및 6G7 과 37 ℃ 에서 30 분간 반응시킨 후, 플레이트에 첨가하고, cPD-L1-Ig 의 cPD-1-Ig 에 대한 결합을 Neutravidin-HRP (Thermo Fisher Scientific 사) 및 TMB one component substrate (Bethyl Laboratories 사) 를 사용한 발색 반응에 의해 정량하였다. 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 6G7 은 양호한 개 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 나타냈지만, 5A2 는 결합 저해 활성을 갖지 않았다. (도 1)
2.7 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 발현 벡터의 제조 (도 2)
이하, 2.6 의 선정 시험에 의해 개 PD-1/PD-L1 결합에 대하여 양호한 저해 활성을 나타낸 (도 1) 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체:4G12 및 6G7 을 래트-개 키메라 항PD-L1 항체의 가변부로 하고, 2 종류의 래트-개 키메라 항PD-L1 항체를 수립하였다.
래트 항소 PD-L1 항체 4G12 및 6G7 을 산생하는 하이브리도마로부터 가변 영역 (중사슬 및 경사슬) 유전자를 동정하였다. 또한, 당해 래트 항체 중사슬 및 경사슬 가변 영역 서열을 이미 알려진 개 항체의 중사슬 IgG4 의 불변 영역 및 경사슬 람다 사슬의 불변 영역과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, 코돈 최적화를 실시한 후 (서열 번호 9 및 10 (아미노산 서열), 서열 번호 19 및 20 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열)), NotI 제한 효소 인식 서열, KOZAK 서열, 키메라 항체 경사슬 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열 (PABGH), 프로모터 서열 (PCMV), SacI 제한 효소 인식 서열, 인트론 서열 (INRBG), KOZAK 서열, 키메라 항체 중사슬 서열, XbaI 제한 효소 인식 서열을 상기의 순서로 배치하도록 유전자 합성을 실시하였다. 합성한 유전자 사슬을, 발현용 벡터 pDC6 (홋카이도 대학 인수 (人獸) 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 제한 효소 인식 서열을 이용하여 상기의 순서로 배치하도록 짜넣고 (도 2), 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 발현 벡터를 구축하였다. 이 발현 벡터를 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 트랜스펙션 하고, 키메라 항체를 포함하는 배양 상청을 얻었다. 상청으로부터 Ab Capcher Extra (프로테인 A 변이체, ProteNova 사) 를 사용하여 정제를 실시하고, 또한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제를 실시하였다. 10 % 아크릴아미드 겔을 사용하여 비환원 조건 아래에서 SDS-PAGE 를 실시하고, Quick-CBB kit (와코 쥰야쿠 공업사) 에 의해 염색을 실시한 후, 증류수 중에서 탈색을 실시하였다. 프로테인 A 정제만으로는 협잡 (挾雜) 단백질이 확인되었지만, 겔 여과 크로마토그래피 정제를 함으로써 순도가 높은 정제 항체를 얻었다 (도 3). 얻어진 정제 항체는 플로우 사이토메트리를 사용하여 개 PD-L1 발현 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 그 키메라 항체 2 종의 개 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성을 2.6 에 나타낸 방법에 의해 검토한 결과, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 는 근원이 된 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 와 동일한 결합 저해 활성을 나타냈지만, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c6G7 에서는 결합 저해능이 분명히 감약하였다 (도 4). 따라서 치료용 항체로서 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 의 가변 영역 서열 (서열 번호 2 및 1 (아미노산 서열), 서열 번호 16 및 15 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열)) 를 짜넣은 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 를 선정하였다. c4G12 의 L 사슬의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 9 및 19 에, H 사슬의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 10 및 20 에 나타낸다.
2.8 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 발현
2.7 에서 사용한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 발현 pDC6 벡터를 디하이드로 엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포 (CHO-DG44 (dfhr-/-)) 에 트랜스펙션 하고, 고발현 클론을 도트 블롯법에 의해 선발하였다. 또한, 60 nM 의 메토트랙세이트 (Mtx) 를 포함하는 배지에서 부하를 가함으로써 유전자 증폭 처리를 실시하였다. 유전자 증폭 종료 후의 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 안정 발현 세포 (클론명:4.3F1) 를, Mtx 를 포함하지 않는 Opti-CHO 배지로 옮기고, 14 일간의 진탕 배양을 실시하였다 (125 rpm, 37 ℃, 5 % CO2). 트리판 블루 염색에 의해 세포 생존률을 산출하였다 (도 5). ELISA 법에 의해 배양 상청 중의 키메라 항체 산생량을 정량하였다 (도 5). 14 일째의 배양 상청을 10,000 g 으로 10 분간 원심하고, 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시키고, 항체의 정제 스텝으로 진행하였다.
또한, 배지를 Dynamis 배지로 바꾸고, 적절한 Feed 를 실시함으로써, 항체 산생량이 종래의 대략 2 배로 향상되었다 (데이터는 나타내지 않음).
2.9. 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 정제
상기의 방법에 의해 준비한 배양 상청은, Ab Capcher Extra (ProteNova 사) 를 사용하여 정제하였다. 레진에 대한 결합은 오픈 칼럼법을 이용하고, 평형화 버퍼 및 세정 버퍼로서 PBS pH 7.4 를 사용하였다. 용출 버퍼에는 IgG Elution Buffer (Thermo Scientific 사) 를, 중화 버퍼에는 1M Tris 를 사용하였다. 정제한 항체는 Amicon Ultra-15 (50 kDa, Millipore 사) 를 사용하여 한외 여과법에 의해 농축과, PBS 로의 버퍼 치환을 실시하였다. 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시키고, 각 실험에 사용하였다.
2.10. 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 정제의 확인 (도 6)
정제한 항체의 순도를 확인하기 위해서, SDS-PAGE 및 CBB 염색에 의해 항체 단백질의 검출을 실시하였다. SuperSep Ace 5-20 % (Wako 사) 그래디언트 겔을 사용하고, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 를 환원 조건 아래 및 비환원 조건 아래에서 전기 영동하였다. Quick-CBB kit (와코 쥰야쿠 공업사) 에 의해 염색을 실시한 후, 증류수 중에서 탈색을 실시하였다. 항체에 상당하는 분자량의 위치에 밴드가 보이고, 협잡 단백질의 밴드는 시인되지 않았다.
2.11. 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 cPD-L1-His 에 대한 결합 친화성의 측정
개 PD-L1 의 예상 아미노산 서열로부터 추정된 세포외 영역을 증폭하도록 5′말단측에 NheI 인식 서열을 부가한 프라이머 (cPD-L1-His F) 와, 5′말단측에 EcoRV 인식 서열 및 6xHis 태그 서열을 부가한 프라이머 (cPD-L1-His R) 를 설계하였다. 합성한 비글 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, PCR 산물을 NheI (Takara 사) 및 EcoRV (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCXN2.1 vector (Niwa et al., 1991 ; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 교수 요코미조 다케히코 선생님으로부터 분여) 를 사용하여, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pCXN2.1-cPD-L1-His 라고 표기하였다.
프라이머 (cPD-L1-His F):CGCGGCTAGCATGAGAATGTTTAGTGTCTT (서열 번호 131)
프라이머 (cPD-L1-His R):
CGCGGATATCTTAATGGTGATGGTGATGGTGAGTCCTCTCACTTGCTGG (서열 번호 132)
발현 벡터를 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 트랜스펙션 하고, 재조합 단백질을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 산생한 재조합 단백질은 상청으로부터 TALON Metal Affinity Resin (Clontech 사) 을 사용하여 정제를 실시하고, Amicon Ultra-4 Ultracel-3 (Merck Millipore 사) 을 사용하여 버퍼를 PBS 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다 (cPD-L1-His). 단백질의 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific 사) 에 의해 정량하고, 이후의 실험에 사용하였다.
생체 분자 상호 작용 측정기 (Biacore X100) 를 사용하여, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 4G12 및 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 cPD-L1-His 에 대한 결합 친화성 (Avidity) 을 평가하였다. 즉, 항히스티딘 항체를 CM5 센서 칩에 고정시키고, cPD-L1-His 를 캡처한 후에, 모노클로날 항체를 아날라이트로서 첨가함으로써 특이적 결합을 관찰하였다. 양 항체 모두 특이적 결합을 나타내고, Avidity 는 거의 동등하였다 (표 1). 또, 마찬가지로 cPD-L1-His 에 대한 개 PD-1-Ig 및 CD80-Ig 의 Avidity 를 측정한 바, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 와 비교하여 분명하게 결합 친화성이 낮았다 (표 1).
표 1. 각 항체 및 재조합 단백질의 개 PD-L1-His 에 대한 결합 친화성
2.12. 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 개 PD-1/PD-L1 결합 및 CD80/PD-L1 결합 저해 활성 (도 7)
개 PD-1-Ig, PD-L1-Ig 및 CD80-Ig (전술) 를 사용하여, 항PD-L1 항체에 의한 개 PD-1/PD-L1 결합 및 CD80/PD-L1 결합 저해 시험을 실시하였다. 개 PD-1-Ig 혹은 CD80-Ig 를 평저 96 구멍 플레이트 상에 고층화 하고, 2.6 에서 실시한 순서에 따라서 각 농도 (0, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖) 의 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 혹은 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 와 반응시킨 개 PD-L1-Ig 의 결합량을 평가하였다. 키메라 항체화에 의한 결합 저해 활성의 변화는 확인되지 않았다.
2.13. 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 개 면역 담당 세포 활성화 효과 (도 8)
개 PBMC 를 슈퍼 항원인 Staphylococcal Enterotoxin B (SEB) 자극화로 3 일간 배양하고, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 의 첨가에 의한 사이토카인 산생량의 변화를 Duoset ELISA canine IL-2 or IFN-γ (R & D systems 사) 를 사용하여 ELISA 법에 의해 정량하였다. 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 는 개 PBMC 로부터의 IL-2 및 IFN-γ 산생량을 증대시켰다. 또 마찬가지로, SEB 자극 2 일째의 배양액 중에 핵산 아날로그인 EdU 를 첨가하여 2 시간 배양 후, 그 취입을 Click-iT Plus EdU flow cytometry assay kit (Life Technologies 사) 를 사용하여 플로우 사이토메트리에 의해 정량한 바, 개 CD4+ 또는 CD8+ 림프구에 있어서의 EdU 취입이 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 첨가에 의해 항진하고, 세포 증식능의 상승이 확인되었다.
2.14. 개에 대한 접종 시험에 사용하는 종양 이환 개의 선발
본 치료법은 종양에 PD-L1 이 발현하고 있는 경우에 보다 효과가 전망되기 때문에, 면역 조직 화학 염색법에 의해 개 종양부에 있어서의 PD-L1 발현 해석을 실시하였다. 포름알데히드 고정하고, 파라핀 포매한 종양 조직을 마이크로 톰으로 4 ㎛ 두께로 얇게 자르고, 실란 코팅 슬라이드 글래스 (마츠나미 가라스 공업사) 에 첩부 (貼付)·건조시킨 후, 자일렌·알코올로 탈파라핀 처리를 실시하였다. 시트르산 버퍼 {시트르산 (와코 쥰야쿠 공업사) 0.37 g, 시트르산3나트륨 2 수화물 (키시다 화학사) 2.4 g, 증류수 1000 ㎖} 에 침지하면서 마이크로 웨이브로 10 분간 항원 부활화 처리를 실시하고, 니치레이 자동 면역 염색 장치에 의해 염색을 실시하였다. 전처리로서, 0.3 % 과산화수소를 포함하는 메탄올 용액에 실온에서 15 분간 침지한 후, PBS 로 세정하고, 항소 PD-L1 모노클로날 항체를 첨가하여 실온에서 30 분 반응시켰다. PBS 로 세정 후, 히스토파인 심플 스테인 MAX-PO (Rat) (니치레이 바이오사이언스사) 를 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 3,3'-다이아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocholride) 로 발색하고, 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다. 종양 세포가 PD-L1 양성이었던 구강내 멜라노마 및 미분화 육종 이환 개를 이하의 접종 시험 (임상 시험) 에 사용하였다. 항소 PD-L1 모노클로날 항체는, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 산생 하이브리도마 (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 2014 Aug ; 142 (4):551-61.) 로부터 수립하였다.
2.15. 개에 대한 접종 시험
임상 시험에 있어서 개에 접종하는 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 에 대해서는, 협잡물이나 중합체 단백질을 제거할 목적으로, 2.8 에서 나타낸 순서에 의해 얻은 배양 상청으로부터 MabSelect SuRe LX (GE Healthcare 사) 를 사용한 어피니티 크로마토그래피 정제를 실시한 후, BioScale CHT20-I prepacked column (Bio-Rad 사) 을 사용하여 하이드록시 어퍼타이트 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 아그리게이트를 포함하는 프랙션은 또한 HiScreen Q-Sepharose HP prepacked column (GE Healthcare 사) 을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피 정제를 실시하였다.
(1) 안전성 시험:개 (비글, 피임 암컷, 13 세, 체중 대략 10 ㎏) 에게 수립한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 2 ㎎/㎏ 을 2 주간 간격으로 전체 3 회 점적정주 (點滴靜注) 하였다. 아나필락시 외에, 임상상 문제가 되는 부작용은 관찰되지 않았다.
(2) 임상 시험 1:PD-L1 양성인 구강내 멜라노마 (도 9A) 재발 개 (미니어처 닥스훈트, 수컷, 11 세, 체중 대략 7.5 ㎏) 에게 수립한 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 2 ㎎/㎏ 혹은 5 ㎎/㎏ 을 2 주간 간격으로 22 회 점적정주하였다. 치료 개시 10 주 시점에서 현저한 종양의 축소가 확인되고, 치료 개시 34 주 시점에서는 추가적인 축소가 확인되었다 (도 10). 44 주간의 관찰 기간 중, 림프절이나 폐에 대한 전이도 확인되지 않았다. 베이스라인시와 비교하여, 30 % 이상의 종양 장경의 감소를 PR (부분 성공) 이라고 정의하면, 16-20 주 시점 및 34 주 이후에 PR 의 기준을 충족하고 있었다 (도 11).
(3) 임상 시험 2:원발소가 PD-L1 양성이고 (도 9B), 전신의 근육내에 복수의 전이소가 있는 미분화 육종 이환 개 (웨스트 하이랜드 화이트 테리어, 거세 수컷, 12 세, 체중 대략 8 ㎏) 에게 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 5 ㎎/㎏ 을 2 주간 간격으로 2 회 점적정주하였다. 치료 개시 3 주 시점에서 분명한 종양의 퇴축이 확인되었다 (도 12).
(4) 임상 시험 3:원발소를 외과 수술로 적출한 구강내 멜라노마 이환 개 (비글, 피임 암컷, 11세, 체중 대략 10 ㎏) 에 대해서, 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 2 ㎎/㎏ 혹은 5 ㎎/㎏ 을 2 주간 간격으로 9 회 점적정주하였다. 치료 개시 18 주 시점에서 복수의 폐 전이소가 소실되었다 (도 13).
(5) 임상 시험 4:폐전이가 있는 구강내 멜라노마 이환 개 4 마리에게 래트-개 키메라 항PD-L1 항체 c4G12 2 ㎎/㎏ 혹은 5 ㎎/㎏ 을 2 주간 간격으로 점적정주하였다. 관찰 기간 중에 분명한 종양의 축소는 보이지 않았지만, 폐전이가 확인되고 나서의 생존 기간은 대조군 (항체 비투여, 히스토리컬 컨트롤군:n = 15) 과 비교하여 긴 경향이 있었기 때문에 (도 14), 항체 투여에 의해 생존 기간이 연장된 가능성이 있다.
2.16. 항PD-L1 항체의 CDR 해석
NCBI IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 를 사용하여, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 결정하였다. 결과를 도 15 에 나타낸다.
[실시예 2] 항PD-L1 항체의 다른 동물종에 대한 응용
1.1. 양, 돼지 및 물소 PD-L1 유전자의 동정
양, 돼지 및 물소 PD-L1 cDNA 코딩 영역 (CDS) 전체 길이를 결정하기 위해서, 먼저 양, 돼지 및 소 PD-L1 유전자의 염기 서열 (GenBank accession number ; XM_004004362, NM_001025221 및 XM_613366) 로부터 유전자의 CDS 전체 길이를 증폭하는 프라이머 (ovPD-L1 CDS F 및 R, poPD-L1 CDS F 및 R, buPD-L1 CDS F1, R1, F2 및 R2) 를 설계하고 PCR 법을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물에 대해서, 통상적인 방법에 따라서 캐필러리 시퀸서에 의해 염기 서열을 결정하였다 (Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2011 Jan ; 34 (1):55-63. 물소 PD-L1 유전자를 동정한 논문).
프라이머 (ovPD-L1 CDS F):ATGAGGATATATAGTGTCTTAACAT (서열 번호 109)
프라이머 (ovPD-L1 CDS R):TTACGTCTCCTCAAAATGTG (서열 번호 110)
프라이머 (poPD-L1 CDS F):ATGAGGATATGTAGTATCTTTACAT (서열 번호 111)
프라이머 (poPD-L1 CDS R):TTACGTCTCCTCAAATTGTGT (서열 번호 112)
프라이머 (buPD-L1 CDS F1):ATGAGGATATATAGTGTCTT (서열 번호 113)
프라이머 (buPD-L1 CDS R1):GCCACTCAGGACTTGGTGAT (서열 번호 114)
프라이머 (buPD-L1 CDS F2):GGGGGTTTACTGTTGCTTGA (서열 번호 115)
프라이머 (buPD-L1 CDS R2):TTACGTCTCCTCAAATTGT (서열 번호 116)
1.2. 양 PD-1, 양 PD-L1, 돼지 PD-1 및 돼지 PD-L1 발현 COS-7 세포의 구축
양 PD-1, 양 PD-L1, 돼지 PD-1 및 돼지 PD-L1 발현 플라스미드를 제조하기 위해서, 합성한 양 또는 돼지 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로, 5′말단측에 제한 효소 BglII 및 SmaI (양 PD-1), HindIII 및 SmaI (돼지 PD-1), 또는 XhoI 및 SmaI (양 및 돼지 PD-L1) 인식 부위를 부가하여 설계한 프라이머 (ovPD-1-EGFP F 및 R, ovPD-L1-EGFP F 및 R, poPD-1-EGFP F 및 R, 또는 poPD-L1-EGFP F 및 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 BglII (Takara 사) 및 SmaI (Takara 사) (양 PD-1), HindIII (Takara 사) 및 SmaI (Takara 사) (돼지 PD-1), XhoI (Takara 사) 및 SmaI (Takara 사) (양 및 돼지 PD-L1) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pEGFP-N2 vector (Clontech 사) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pEGFP-N2-ovPD-1, pEGFP-N2-ovPD-L1, pEGFP-N2-poPD-1 혹은 pEGFP-N2-poPD-L1 로 표기하였다.
프라이머 (ovPD-1-EGFP F):GAAGATCTATGGGGACCCCGCGGGCGCCG (서열 번호 117)
프라이머 (ovPD-1-EGFP R):GACCCGGGGAGGGGCCAGGAGCAGTGTCC (서열 번호 118)
프라이머 (ovPD-L1-EGFP F):CCGCTCGAGATGAGGATATATAGTGTCT (서열 번호 119)
프라이머 (ovPD-L1-EGFP R):ATCCCGGGCGTCTCCTCAAAATGTGTAG (서열 번호 120)
프라이머 (poPD-1-EGFP F):ACTAAGCTTATGGGGACCCCGCGGG (서열 번호 121)
프라이머 (poPD-1-EGFP R):ACTCCCGGGGAGGGGCCAAGAGCAGT (서열 번호 122)
프라이머 (poPD-L1-EGFP F):CCGCTCGAGATGAGGATATGTAGTATCTT (서열 번호 123)
프라이머 (poPD-L1-EGFP R):ATCCCGGGCGTCTCCTCAAATTGTGTATC (서열 번호 124)
5 × 104/㎠ 의 COS-7 세포를 6 구멍 플레이트에 계대하고, 10 % 비동화 소 태자 혈청, 0.01 % L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37 ℃, 5 % CO2 존재하에서 하룻밤 배양하였다. pEGFP-N2-ovPD-1, pEGFP-N2-ovPD-L1, pEGFP-N2-poPD-1, pEGFP-N2-poPD-L1, 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 0.4 ㎍/㎠ 를 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen 사) 을 사용하여, COS-7 세포에 각각 도입하고, 48 시간 배양하였다 (ovPD-1-EGFP 발현 세포, ovPD-L1-EGFP 발현 세포, poPD-1-EGFP 발현 세포 및 poPD-L1-EGFP 발현 세포). 제조한 발현 세포에 있어서의 양 PD-1, 양 PD-L1, 돼지 PD-1 및 돼지 PD-L1 의 발현을 확인하기 위해서, 도립형 공초점 레이저 현미경 LSM700 (ZEISS 사) 혹은 올인원 형광 현미경 BZ-9000 (KEYENCE 사) 에 의해, EGFP 의 세포내 국재를 가시화하였다.
1.3. 재조합 양 PD-L1 및 돼지 PD-L1 의 구축
양 PD-L1 또는 돼지 PD-L1 의 예상 아미노산 서열로부터 추정된 세포외 영역을 증폭하도록 5′말단측에 NheI 혹은 EcoRV 의 인식 서열을 부가한 프라이머 (ovPD-L1-Ig F 및 R, 또는 poPD-L1-Ig F 및 R) 를 설계하였다. 합성한 양 또는 돼지 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, 그 PCR 산물을 NheI (Takara 사) 및 EcoRV (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCXN2.1-Rabbit IgG Fc vector (Niwa et al., 1991 ; Zettlmeissl et al., 1990 ; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 교수 요코미조 다케히코 선생님으로부터 분여된 것을 당연구실에서 개변) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit (NIPPON Genetics 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pCXN2.1-ovPD-L1-Ig 혹은 pCXN2.1-poPD-L1-Ig 라고 표기하였다.
프라이머 (ovPD-L1-Ig F):GACGCTAGCATGAGGATATATAGTGTCT (서열 번호 125)
프라이머 (ovPD-L1-Ig R):GCTCTGATATCCCTCGTTTTTGCTGGAT (서열 번호 126)
프라이머 (poPD-L1-Ig F):GACGCTAGCATGAGGATATGTAGTATCTT (서열 번호 127)
프라이머 (poPD-L1-Ig R):AGCTTGATATCCCTCTTTCTTGCTGGATC (서열 번호 128)
7.5 × 107 개의 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 30 ㎍ 의 pCXN2.1-ovPD-L1-Ig, 또는 pCXN2.1-poPD-L1-Ig 를 Expifectamin (Life technologies 사) 을 사용하여 도입하고, 6 일간 진탕 배양을 실시하여 배양 상청을 회수하였다. Fc 융합 재조합 단백질을 포함하는 배양 상청은, Ab-Capcher Extra (ProteNova 사) 를 사용하여 Fc 융합 재조 단백질을 정제하였다. 정제 후, PD-10 Desalting Column (GE Healthcare 사) 에 의해 버퍼를 PBS (pH 7.4) 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다 (ovine PD-L1-Ig). 정제 후 ovine PD-L1-Ig 및 porcine PD-L1-Ig 의 농도는 Rabbit IgG ELISA Quantitation Set (BETHYL 사) 를 사용하여 측정하였다. ELISA 의 각 세정 조작에는 Auto Palte Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하였다.
1.4. 양, 돼지 PD-L1 에 대한 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 반응성
양 및 돼지 PD-L1 에 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체가 교차 반응하는 것을 플로우 사이토메트리법에 의해 확인하였다. 양, 돼지 PD-L1-EGFP 발현 COS-7 세포를 10 % 비동화 염소 혈청가 PBS 를 사용하여 실온에서 15 분간 블로킹 하고, 10 ㎍/㎖ 의 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 를 실온에서 30 분간 반응시키고, 세정한 후에 Allophycocyanine 표지 항래트 Ig 염소 항체 (Beckman Coulter 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 % 소혈청 알부민가 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 16 에서 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 양, 돼지의 PD-L1 에 결합하는 것이 확인되었다.
1.5. 물소의 백혈구에 대한 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 반응성
물소 (Bubalus bubalis ; 아시아 물소) 의 말초혈을 ACK 버퍼로 용혈하고, 백혈구를 분리하였다. 10 % 비동화 염소 혈청가 PBS 를 사용하여 실온에서 15 분간 블로킹 하고, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12·Peridinin-chlorophyll-protein complex/cyanin 5.5 표지 항소 CD14 항체 (mouse IgG1, CAM36A, VMRD 사)·항소 CD11b 항체 (mouse IgG2b, CC126, AbD Serotec 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, Allophycocyanine 표지 항래트 Ig 염소 항체 (Beckman Coulter 사)·Fluorescein isothiocyanate 표지 항마우스 IgG2b 염소 항체 (Beckman Coulter 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 해석에는 FACS Calibur (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 10 % 비동화 염소 혈청가 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 17 에서 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 물소의 혈중 매크로파지 (CD14+CD11b+세포) 에 강하게 결합하였다. 또, 물소의 림프구 (CD14-CD11b-세포) 에 대하여, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는 약하게 결합하였다. 이 결합성의 차이는, 매크로파지와 림프구에 있어서의 PD-L1 의 발현량을 반영하고 있는 것으로 생각된다.
1.6. 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 에 의한 양 또는 돼지 PD-1/PD-L1 의 결합 저해 시험
양 PD-1-EGFP 발현 COS-7 세포 및 양 PD-L1-Ig 재조합 단백질, 또는 돼지 PD-1-EGFP 발현 COS-7 세포 및 돼지 PD-L1-Ig 재조합 단백질을 사용하여, 래트 항소 PD-L1 항체 (4G12) 에 의한 양 또는 돼지의 PD-1/PD-L1 결합 저해 시험을 실시하였다. 각 농도 (0, 1, 5, 10, 20, 50 ㎍/㎖) 의 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 를 미리 양 PD-L1-Ig (종농도 1 ㎍/㎖) 또는 돼지 PD-L1-Ig (종농도 5 ㎍/㎖) 와 37 ℃ 에서 30 분간 반응시키고, 그 후 2 × 105 개의 양 PD-1-EGFP 발현 COS-7 세포, 또는 돼지 PD-1-EGFP 발현 COS-7 세포에 각각 37 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, Alexa Fluor 647 표지 항토끼 IgG (H+L) 염소 F(ab')2 (Life Technologies 사) 에 의해 세포 표면에 결합한 양 PD-L1-Ig 또는 돼지 PD-L1-Ig 를 검출하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 항체 비첨가시의 PD-L1-Ig 결합 세포의 비율을 100 % 로 하고, 각 농도에 있어서의 PD-L1-Ig 결합 세포의 비율을 상대값으로서 나타냈다.
그 결과, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 는, 양 PD-1/PD-L1 및 돼지 PD-1/PD-L1 의 결합을 농도 의존적으로 저해할 수 있는 것이 나타났다 (도 18).
[실시예 3]
1. 서론
면역 억제 수용체 Programmed death 1 (PD-1) 과 그 리간드인 Programmed death ligand 1 (PD-L1) 은 과잉인 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊게 관련하고 있는 인자로서 쿄토 대학, 혼죠 타스쿠씨들에 의해 동정된 분자이다. 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 최근 밝혀져 있다. 본 실시예에서는, 소의 감염증에 대한 신규 치료법의 수립을 목적으로 소 PD-1 및 PD-L1 의 결합을 저해 가능한 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 (4G12) 의 가변 영역 유전자와, 소 면역 글로블린 (IgG1, 단, ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다. 도 19 참조. 아미노산 번호 및 변이:250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→삭제, 347 A→S, 348 P→S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug ; 142 (4):551-561.) 의 불변 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell:CHO 세포) 를 배양 증식시켜 얻은 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 를 제조하고, in vitro 및 in vivo 의 효과를 확인하였다.
2. 재료 및 방법
소 PD-1 및 PD-L1 발현 세포의 구축
소 PD-1 유전자 (GenBank accession number AB510901 ; Ikebuchi R, Konnai S, Sunden Y, Onuma M, Ohashi K. Microbiol. Immunol. 2010 May ; 54 (5):291-298.), 소 PD-L1 유전자 (GenBank accession number AB510902 ; Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res. 2011 Sep. 26 ; 42:103.) 에 대해서 cDNA 전체 길이의 염기 서열을 결정하고, 그 유전자 정보로부터 소 PD-1 또는 PD-L1 막 발현 세포를 제조하였다. 먼저, 소 PD-1 또는 PD-L1 발현 플라스미드를 제조하기 위해서, 합성한 소 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 하여, 5′말단측에 제한 효소 NotI 및 HindIII (소 PD-1), NheI 및 XhoI (소 PD-L1) 인식 부위를 부가한 프라이머 (boPD-1-myc F 및 R, boPD-L1-EGFP F 및 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 NotI (Takara 사) 및 HindIII (Takara 사 ; 소 PD-1), NheI (Takara 사) 및 XhoI (Takara 사 ; 소 PD-L1) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCMV-Tag1 vector (Agilent Technologies 사 ; 소 PD-1) 또는 pEGFP-N2 vector (Clontech 사 ; 소 PD-L1) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 얻어진 목적으로 하는 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pCMV-Tag1-boPD-1 이라고 표기한다.
프라이머 (boPD-1-myc F):ATATGCGGCCGCATGGGGACCCCGCGGGCGCT (서열 번호 133)
프라이머 (boPD-1-myc R):GCGCAAGCTTTCAGAGGGGCCAGGAGCAGT (서열 번호 134)
프라이머 (boPD-L1-EGFP F):CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC (서열 번호 135)
프라이머 (boPD-L1-EGFP R):CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC (서열 번호 136)
이하의 순서에 따라서, 소 PD-1 막 발현 세포를 제조하였다. 먼저, 4 × 106 개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍ 의 pCMV-Tag1-boPD-1 을 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 20 ㎖/ℓ, 10 % Pluronic F-68 (Life technologies 사) 18 ㎖/ℓ 를 포함하는 CD DG44 배지 (Life technologies 사) 로 배지 교환하고, 셀렉션을 실시하였다. 얻어진 발현 세포를 래트 항소 PD-1 항체 5D2 와 실온에서 반응시키고, 세정 후, 항래트 IgG 마이크로 비즈 표지 항체 (Miltenyi Biotec 사) 와 실온에서 추가로 반응시켰다. Auto MACS (Miltenyi Biotec 사) 를 사용하여 소 PD-1 을 고발현하는 세포를 분리하고, 또한 순도를 높이기 위해서 동일한 순서로 재분리를 실시하였다. 제조한 발현 세포에 대해서 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하고, 소 PD-1 고발현 CHO DG44 세포를 얻었다 (소 PD-1 발현 세포).
이하의 순서에 따라서, 소 PD-L1 막 발현 세포를 제조하였다. 먼저, 4 × 106 개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍ 의 pEGFP-N2-boPD-L1 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 를 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 20 ㎖/ℓ, 10 % Pluronic F-68 (Life technologies 사) 18 ㎖/ℓ 를 포함하는 CD DG44 배지 (Life technologies 사) 로 배지 교환하고, 셀렉션을 실시하는 것과 동시에 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하였다 (소 PD-L1 발현 세포). 제조한 발현 세포에 있어서의 소 PD-L1 의 발현을 확인하기 위해서, 도립형 공초점 레이저 현미경 LSM700 (ZEISS 사) 에 의해, EGFP 의 세포내 국재를 가시화하였다.
가용성 소 PD-1 및 PD-L1 의 구축
이하의 순서에 따라서, 소 PD-1-Ig 발현 플라스미드를 구축하였다. 소 PD-1 (GenBank accession number AB510901) 의 시그널 펩티드 및 세포외 영역을 이미 알려진 소 IgG1 (GenBank accession number X62916) 의 불변 영역 Fc 부분과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, CHO 세포에 코돈의 최적화를 실시한 후, 제한 효소 (NotI) 인식 서열, KOZAK 서열, 소 PD-1 시그널 펩티드 서열, 소 PD-1 유전자 세포외 영역 서열, 소 IgG1 Fc 영역 서열, 제한 효소 (XbaI) 인식 서열을 상기의 순서로 배치하도록 유전자 합성을 실시하였다. 또한, 소 IgG1 은 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (변이 삽입 지점:185 E→P, 186 L→V, 187 P→A, 189 G→삭제, 281 A→S, 282 P→S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug ; 142 (4):551-561. 이 논문의 Figure 2 에 PD-1-Ig 의 아미노산 서열, 변이 삽입 지점이 게재되어 있다). 합성한 유전자 사슬을 NotI (Takara 사) 및 XbaI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 발현용 벡터 pDN11 (홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 짜넣고, 소 PD-1-Ig 발현 벡터를 구축하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pDN11-boPD-1-Ig 라고 표기한다.
이하의 순서에 따라서, 소 PD-L1-Ig 발현 플라스미드를 구축하였다. 소 PD-L1 (GenBank accession number AB510902) 의 시그널 펩티드 및 세포외 영역을 증폭하도록, 5′말단측에 제한 효소 NheI 및 EcoRV 인식 부위를 부가한 프라이머 (boPD-L1-Ig F 및 R) 를 설계하였다. 합성한 소 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, PCR 산물을 NheI (Takara 사) 및 EcoRV (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCXN2.1-Rabbit IgG1 Fc vector (Niwa et al., 1991 ; Zettlmeissl et al., 1990 ; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 교수 요코미조 다케히코 교수로부터 분여된 것을 개변) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 또는 FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit (NIPPON Genetics 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pCXN2.1-boPD-L1-Ig 라고 표기한다.
프라이머 (boPD-L1-Ig F):GCTAGCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC (서열 번호 137)
프라이머 (boPD-L1-Ig R):GATATCATTCCTCTTTTTTGCTGGAT (서열 번호 138)
이하의 순서에 따라서, 가용성 소 PD-1-Ig 발현 세포를 제조하였다. 4 × 106 개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍ 의 pDN11-boPD-1-Ig 를 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 20 ㎖/ℓ 를 포함하는 OptiCHO AGT 배지 (Life technologies 사) 로 배지 교환하고, 3 주간 배양하여 셀렉션을 실시하였다. 얻어진 세포주의 배양 상청 중의 Fc 융합 재조합 단백질의 농도는 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 ELISA 법을 이용하여 측정하고, Fc 융합 재조합 단백질을 고발현하는 세포주의 선별을 실시하였다. 얻어진 고발현 세포주는 G418 를 포함하지 않는 배지로 옮기고, 14 일간 진탕 배양을 실시하여 배양 상청을 회수하였다. Fc 융합 재조합 단백질을 포함하는 배양 상청은, Centricon Plus-70 (Millipore 사) 을 사용하여 한외 여과한 후에, Ab-Capcher Extra (ProteNova 사) 를 사용하여 Fc 융합 재조합 단백질을 정제하였다. 정제 후, PD-10 Desalting Column (GE Healthcare 사) 에 의해 버퍼를 인산 완충 생리 식염수 (PBS ; pH 7.4) 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다 (소 PD-1-Ig). 정제 후의 소 PD-1-Ig 의 농도는 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 ELISA 법에 의해 측정하였다. ELISA 의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하였다.
이하의 순서에 따라서, 가용성 소 PD-L1-Ig 발현 세포를 제조하였다. 7.5 × 107 개의 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 30 ㎍ 의 pCXN2.1-boPD-L1-Ig 를 Expifectamine (Life Technologies 사) 을 사용하여 도입하고, 7 일간 진탕 배양을 실시하여 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 Ab-Capcher Extra (ProteNova 사 ; 소 PD-L1-Ig) 를 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 정제 후, PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare 사) 에 의해 버퍼를 PBS (pH 7.4) 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다 (소 PD-L1-Ig). 정제 후의 소 PD-L1-Ig 의 농도는 Rabbit IgG ELISA Quantitation Set (Bethyl 사) 를 사용하여 측정하였다. ELISA 의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하였다.
래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 산생 세포의 제조
소 PD-L1-Ig (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug. ; 142 (4):551-561. 이 논문에 기재한 방법으로 소 PD-L1-Ig 를 제조하고, 면역에 사용하였다) 를 래트의 족척 (足蹠) 에 면역하고, 장골 림프절법을 이용하여 하이브리도마를 수립하여, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 산생하이브리도마 4G12 주를 얻었다. 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체의 수립법에 대해서는, 이하의 비특허문헌에 그 상세한 내용이 기재되어 있다 (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res. 2013 Jul. 22 ; 44:59 ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug. ; 142 (4):551-561).
래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 발현 벡터의 제조
래트 항소 PD-L1 항체 4G12 를 항체 가변 영역으로 하여 소 IgG1 및 소 Igλ 의 항체 불변 영역을 융합시킨, 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 를 수립하였다.
먼저, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 를 산생하는 하이브리도마로부터 가변 영역 (중사슬 및 경사슬) 의 유전자를 각각 동정하였다. 다음으로, 당해 래트 항체 각각의 중사슬 및 경사슬 가변 영역 서열을 이미 알려진 소 IgG1 (중사슬 ; GenBank Accession number X62916 을 개변) 및 소 Igλ (경사슬 ; GenBank Accession number X62917) 의 불변 영역과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, 코돈 최적화를 실시하였다 (래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12:서열 번호 105 및 106 (아미노산 서열), 서열 번호 107 및 108 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열)). 또한, 소 IgG1 에는 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (도 19 참조. 아미노산 번호 및 변이:250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→삭제, 347 A→S, 348 P→S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug ; 142 (4):551-561.). 그리고, NotI 제한 효소 인식 서열, KOZAK 서열, 키메라 항체 경사슬 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열 (PABGH), 프로모터 서열 (PCMV), SacI 제한 효소 인식 서열, 인트론 서열 (INRBG), KOZAK 서열, 키메라 항체 중사슬 서열, XbaI 제한 효소 인식 서열을 상기의 순서로 배치하도록 유전자를 인공적으로 합성하였다. 합성한 유전자 사슬을 NotI (Takara 사) 및 XbaI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 발현 플라스미드 pDC6 (홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다 (도 20). 얻어진 목적으로 하는 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 ―30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pDC6-boPD-L1ch4G12 라고 표기한다.
래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체의 발현
pDC6-boPD-L1ch4G12 를, 디하이드로 엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포 (CHO-DG44 (dfhr-/-)) 에 도입하였다. 48 시간 후, GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 20 ㎖/ℓ 를 포함하는 OptiCHO AGT 배지 (Life technologies 사) 로 배지 교환하고, 3 주간 배양하여 발현 세포의 셀렉션 및 한계 희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 다음으로, 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 도트 블롯법 및 ELISA 법에 의해 배양 상청에 포함되는 키메라 항체의 농도를 측정하고, 고발현 클론을 선발하였다. 또한, 선발한 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 고발현 클론에 대하여, 60 nM 의 메토트랙세이트 (Mtx) 를 포함하는 배지에서 부하를 가함으로써 유전자 증폭 처리를 실시하였다. 이상과 같이 하여 수립한 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 안정 발현 세포를, Mtx 를 포함하지 않는 Opti-CHO AGT 배지로 옮기고, 14 일간의 진탕 배양을 실시하였다 (125 rpm, 37 ℃, 5 % CO2). 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 ELISA 법을 이용하여, 배양 상청 중의 키메라 항체 산생량을 정량하였다. ELISA 의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하였다. 14 일째의 배양 상청을 10,000 g 으로 10 분간 원심하여 세포를 제거한 후, 원심 상청을 Steritop-GP 0.22 ㎛ 필터 (Millipore 사) 에 통과시켜 멸균하고, 정제에 제공할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다.
래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체의 정제
상기의 방법에 의해 준비한 배양 상청으로부터, Ab Capcher Extra (ProteNova 사) 를 사용하여 각 키메라 항체를 정제하였다. 레진에 대한 결합은 오픈 칼럼법을 이용하고, 평형화 버퍼 및 세정 버퍼로서 PBS (pH 7.4) 를 사용하였다. 용출 버퍼에는 IgG Elution Buffer (Thermo Fisher Scientific 사) 를, 중화 버퍼에는 1 M Tris (pH 9.0) 를 사용하였다. 정제한 항체는, PD-10 Desalting Column (GE Healthcare 사) 및 Amicon Ultra-15 (50 kDa, Millipore 사) 를 사용하여, PBS (pH 7.4) 에 대한 버퍼 치환 및 농축을 실시하였다. 정제한 키메라 항체는, 0.22 ㎛ 시린지 필터 (Millipore 사) 를 통과시켜 멸균하고, 실험에 제공할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다.
래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체의 정제 순도의 확인 (도 21)
정제한 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체의 순도를 확인하기 위해서, SDS-PAGE 및 CBB 염색에 의해 항체 단백질의 검출을 실시하였다. 10 % 아크릴아미드 겔을 사용하여, 정제한 래트-소 키메라 항체를 환원 조건 아래 (2-메르캅토에탄올 (Sigma-Aldrich 사) 에 의해 환원) 및 비환원 조건 아래에서 전기 영동하였다. Quick-CBB kit (와코 쥰야쿠 공업사) 에 의해 염색을 실시한 후, 증류수 중에서 탈색을 실시하였다. 결과를 도 21 에 나타낸다. 환원 조건에서는 25 kDa 및 50 kDa, 비환원 조건에서는 150 kDa 의 상정되는 위치에 밴드가 확인되었다.
래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체의 결합 특이성 (도 22)
래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체가 소 PD-L1 발현 세포 (전술) 에 특이적으로 결합하는 것을 플로우 사이토메트리법에 의해 확인하였다. 먼저, 소 PD-L1 발현 세포에 대하여 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, APC 표지 항래트 Ig 염소 항체 (SouthernBiotech사) 또는 Alexa Fluor 647 표지 항소 IgG (H+L) 염소 F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 또는 소 IgG1 항체 (Bethyl 사) 를 사용하였다. 세정 후, 세포 표면에 결합한 각 래트 항체 또는 래트-소 키메라 항체를 FACS Verse (BD Biosciences 사) 에 의해 검출하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 % 소혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 22 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 는, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 와 마찬가지로 소 PD-L1 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
래트-소 키메라 항PD-L1 항체의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성
(1) 소 PD-L1 발현 세포와 가용성 소 PD-1 의 결합 저해 시험 (도 23)
소 PD-L1 발현 세포 (전술) 및 소 PD-1-Ig (전술) 를 사용하여, 항소 PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 시험을 실시하였다. 먼저, 2 × 105 개의 소 PD-L1 발현 세포를 각 농도 (0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖) 의 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 와 실온에서 30 분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 또는 소 IgG1 항체 (Bethyl 사) 를 사용하였다. 세정 후, Lightning-Link Type A Biotin Labeling Kit (Innova Biosciences 사) 를 사용하여 비오틴 표지한 소 PD-1-Ig 를 종농도 2 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 실온에서 추가로 30 분간 반응시켰다. 또한 세정 후, APC 표지 스트렙토아비딘 (BioLegend 사) 에 의해 세포 표면에 결합한 소 PD-1-Ig 를 검출하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 % 소혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다. 항체 비첨가시의 소 PD-1-Ig 결합 세포의 비율을 100 % 로 하고, 각 항체 농도에 있어서의 소 PD-1-Ig 결합 세포의 비율을 상대값으로서 나타냈다.
실험 결과를 도 23 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 는, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 와 마찬가지로 소 PD-1/PD-L1 의 결합을 농도 의존적으로 저해할 수 있는 것이 나타났다.
(2) 소 PD-1 발현 세포와 가용성 소 PD-L1 의 결합 저해 시험 (도 24)
소 PD-1 발현 세포 (전술) 및 소 PD-L1-Ig (전술) 를 사용하여, 항소 PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 시험을 실시하였다. 먼저, 96 구멍 플레이트에 종농도 (0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 ㎍/㎖) 의 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 와, 종농도 1 ㎍/㎖ 의 소 PD-L1-Ig 를 첨가하고, 실온에서 30 분간 반응시켰다. 이 혼합액을 2 × 105 개의 소 PD-1 발현 세포와 실온에서 30 분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a (κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 또는 소 IgG1 항체 (Bethyl 사) 를 사용하였다. 세정 후, Alexa Fluor 647 표지 항토끼 IgG (H+L) 염소 F(ab')2 (Life Technologies 사) 를 실온에서 30 분간 반응시키고, 세포 표면에 결합한 소 PD-L1-Ig 를 검출하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 % 소혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다. 항체 비첨가시의 소 PD-L1-Ig 결합 세포의 비율을 100 % 로 하고, 각 항체 농도에 있어서의 소 PD-L1-Ig 결합 세포의 비율을 상대값으로서 나타냈다.
실험 결과를 도 24 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 는, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 와 마찬가지로 소 PD-1/PD-L1 의 결합을 농도 의존적으로 저해할 수 있는 것이 나타났다.
래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체를 사용한 생물 활성 시험
(1) 세포 증식에 대한 영향 (도 25)
래트-소 키메라 항PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해가 림프구를 활성화하는 것을 확인하기 위해서, 세포 증식을 지표로 하여 생물 활성 시험을 실시하였다. 정상 소의 말초혈로부터 분리한 소 PBMC 를 10 × 106 개/㎖ 가 되도록 PBS 에 현탁하고, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 를 사용하여 실온에서 20 분간 반응시켰다. 10 % 비동화 소 태자 혈청 (Cell Culture Technologies 사), 항생 물질 (스트렙토마이신 200 ㎍/㎖, 페니실린 200 U/㎖) (Life Technologies 사), 0.01 % L-글루타민 (Life Technologies 사) 을 포함하는 RPMI 1640 배지 (Sigma-Aldrich 사) 로 2 회 세정한 후, 항소 CD3 마우스 항체 (WSU Monoclonal Antibody Center 사) 와 4 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, 항마우스 IgG1 마이크로 비즈 (Miltenyi Biotec 사) 와 4 ℃ 에서 15 분간 반응시키고, autoMACS (등록상표) Pro (Miltenyi Biotec) 를 사용하여 CD3 양성 T 세포를 분리하였다. 분리한 CD3 양성 T 세포에, 항소 CD3 마우스 항체 (WSU Monoclonal Antibody Center 사) 및 항소 CD28 마우스 항체 (Bio-Rad 사) 를 첨가하고, 10 ㎍/㎖ 의 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 존재하 또는 비존재하에서, 소 PD-L1 발현 세포와 공배양하였다 (CD3 양성 T 세포:소 PD-L1 발현 세포 = 10:1). 항체의 컨트롤에는, 혈청 유래 소 IgG (Sigma-Aldrich 사) 를 사용하고, PD-L1 발현 세포의 컨트롤에는, pEGFP-N2 를 도입한 EGFP 발현 세포를 사용하였다. 6 일 후, 세포를 회수하고, 항소 CD4 마우스 항체 및 항소 CD8 마우스 항체 (Bio-Rad 사) 와 실온에서 30 분간 반응시켰다. 항체의 표지에는 Zenon Mouse IgG1 Labeling Kits (Life Technologies 사) 또는 Lightning-Link Kit (Innova Biosciences 사) 를 사용하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 배양 후의 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 % 소혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 25 에 나타낸다. 소 PD-L1 발현 세포와의 공배양에 의해, CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포의 증식이 유의하게 억제되었다. 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 는, CD4 양성 T 세포에 있어서, 이 억제를 저해하는 것이 나타났다.
(2) IFN-γ 산생량에 대한 영향 (도 26)
래트-소 키메라 항PD-L1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해가 림프구를 활성화하는 것을 확인하기 위해서, IFN-γ 산생량을 지표로서 생물 활성 시험을 실시하였다. BLV 감염 소의 말초혈로부터 분리한 소 PBMC 를 4 × 106 개/㎖ 가 되도록 10 % 비동화 소 태자 혈청 (Cell Culture Technologies 사), 항생 물질 (스트렙토마이신 200 ㎍/㎖, 페니실린 200 U/㎖) (Life Technologies 사), 0.01 % L-글루타민 (Life Technologies 사) 을 포함하는 RPMI 1640 배지 (Sigma-Aldrich 사) 에 현탁하였다. PBMC 에 10 ㎍/㎖ 의 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 또는 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12, 2 % BLV 감염 양 태자 신세포 (FLK-BLV) 배양 상청을 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO2 조건하에서 6 일간 배양하였다. 컨트롤 항체에는, 혈청 유래 래트 IgG (Sigma-Aldrich 사) 및 혈청 유래 소 IgG (Sigma-Aldrich 사) 를 사용하였다. 6 일 후, 배양 상청을 회수하고, Bovine IFN-γ ELISA Kit (BETYL 사) 를 사용하여 IFN-γ 산생량을 정량하였다. ELISA 의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하였다.
실험 결과를 도 26 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 는, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 와 마찬가지로 BLV 항원에 대한 소 PBMC 의 IFN-γ 응답을 상승시키는 것이 나타났다 (n = 10).
래트 항소 PD-L1 항체의 CDR 해석
NCBI IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 를 사용하여, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 결정하였다. 결과를 도 19 에 나타낸다.
소에 대한 접종 시험
BLV 실험 감염 소 (홀스타인종, 수컷, 7 개월령, 체중 267 ㎏) 에게 수립한 래트-소 키메라 항소 PD-L1 항체 ch4G12 약 260 ㎎ (1 ㎎/㎏) 을 점적정주하였다. 감염 소로부터 시간 경과적으로 채혈을 실시하고, 밀도 구배 원심법에 의해 PBMC 를 분리하였다.
(1) BLV 항원에 대한 T 세포의 세포 증식 응답 (도 27)
소 PBMC 를 PBS 에 현탁하고, CFSE 를 사용하여 실온에서 20 분간 반응시켰다. 10 % 비동화 소 태자 혈청 (Cell Culture Technologies 사), 항생 물질 (스트렙토마이신 200 ㎍/㎖, 페니실린 200 U/㎖) (Life Technologies 사), 0.01 % L-글루타민 (Life Technologies 사) 을 포함하는 RPMI 1640 배지 (Sigma-Aldrich 사) 로 2 회 세정한 후, 동 배지로 4 × 106 개/㎖ 로 조정하였다. PBMC 에 2 % BLV 감염 양 태자 신세포 (FLK-BLV) 배양 상청을 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO2 조건 아래에서 6 일간 배양하였다. 컨트롤에는, 2 % BLV 비감염 양 태자 신세포 (FLK) 배양 상청을 사용하였다. 6 일 후, PBMC 를 회수하고, 항소 CD4 마우스 항체, 항소 CD8 마우스 항체 및 항소 IgM 마우스 항체 (Bio-Rad 사) 와 4 ℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 항체의 표지에는 Zenon Mouse IgG1 Labeling Kits (Life Technologies 사) 또는 Lightning-Link Kit (Innova Biosciences 사) 를 사용하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 % 소혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 27 에 나타낸다. 항체 투여에 의해, CD4 양성 T 세포의 BLV 특이적인 세포 증식 응답이 투여 전에 비해 증가하였다.
(2) BLV 프로바이러스량의 변화 (도 28)
분리한 소 PBMC 로부터 Wizard DNA Purification kit (Promega 사) 를 사용하여 DNA 를 추출하였다. 추출한 DNA 의 농도는, Nanodrop 8000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여 측정한 흡광도 (260 ㎚) 를 기준으로 하여 정량하였다. PBMC 중의 BLV 프로바이러스량을 측정하기 위해서, Cycleave PCR Reaction Mix SP (Takara 사) 및 소 백혈병 바이러스 검출용 Probe/Primer/Positive control (Takara 사) 을 사용하여 리얼타임 PCR 을 실시하였다. 측정에는 LightCycler480 System II (Roche Diagnosis 사) 를 사용하였다.
실험 결과를 도 28 에 나타낸다. BLV 프로바이러스량은, 시험 기간 종료까지 투여 전에 비해 유의하게 감소하였다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
본 발명의 항PD-L1 항체는, 동물의 암이나 감염증의 예방 및/또는 치료에 이용할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
<서열 번호 1>
서열 번호 1 은, 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 2>
서열 번호 2 는, 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 3>
서열 번호 3 은, 개 항체의 L 사슬 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 4>
서열 번호 4 는, 개 항체의 H 사슬 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 5>
서열 번호 5 는, 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 번호 5 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 <서열 번호 15> 에 나타낸다.
<서열 번호 6>
서열 번호 6 은, 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 번호 6 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 <서열 번호 16> 에 나타낸다.
<서열 번호 7>
서열 번호 7 은, 개 항체의 L 사슬 불변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 번호 7 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 <서열 번호 17> 에 나타낸다.
<서열 번호 8>
서열 번호 8 은, 개 항체의 H 사슬 불변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 번호 8 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 <서열 번호 18> 에 나타낸다.
<서열 번호 9>
서열 번호 9 는, 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 개 항체의 L 사슬 불변 영역으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 10>
서열 번호 10 은, 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 개 항체의 H 사슬 불변 영역으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 19>
래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 개 항체의 L 사슬 불변 영역으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열) 을 나타낸다.
<서열 번호 20>
서열 번호 20 은, 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 개 항체의 H 사슬 불변 영역으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열) 을 나타낸다.
<서열 번호 11>
서열 번호 11 은, 인간 항체의 L 사슬 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 12>
서열 번호 12 는, 인간 항체 (IgG4 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 13>
서열 번호 13 은, 인간 항체의 L 사슬 불변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 14>
서열 번호 14 는, 인간 항체 (IgG4 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 21 ∼ 36>
서열 번호 21 ∼ 36 은, 순서로, 프라이머 cPD-1 inner F, cPD-1 inner R, cPD-L1 inner F, cPD-L1 inner R, cPD-1 5′GSP, cPD-1 3′GSP, cPD-L1 5′GSP, cPD-L1 3′GSP, cPD-1-EGFP F, cPD-1-EGFP R, cPD-L1-EGFP F, cPD-L1-EGFP R, cPD-1-Ig, cPD-1-Ig R, cPD-L1-Ig F 및 cPD-L1-Ig R 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 37>
서열 번호 37 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 L 사슬 가변 영역의 CDR1 의 아미노산 서열 (QSLLYSENQKDY) 을 나타낸다.
<서열 번호 38>
서열 번호 38 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 L 사슬 가변 영역의 CDR3 의 아미노산 서열 (GQYLVYPFT) 을 나타낸다.
<서열 번호 39>
서열 번호 39 는, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 H 사슬 가변 영역의 CDR1 의 아미노산 서열 (GYTFTSNF) 을 나타낸다.
<서열 번호 40>
서열 번호 40 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 H 사슬 가변 영역의 CDR2 의 아미노산 서열 (IYPEYGNT) 을 나타낸다.
<서열 번호 41>
서열 번호 41 은, 래트 항소 PD-L1 항체 4G12 의 H 사슬 가변 영역의 CDR3 의 아미노산 서열 (ASEEAVISLVY) 을 나타낸다.
<서열 번호 42>
서열 번호 42 는, 양 항체 (IgG1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 43>
서열 번호 43 은, 양 항체 (IgG1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 44>
서열 번호 44 는, 양 항체 (IgG2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 45>
서열 번호 45 는, 양 항체 (IgG2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 46>
서열 번호 46 은, 양 항체의 L 사슬 (Ig kappa(CK)) 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 47>
서열 번호 47 은, 양 항체의 L 사슬 (Ig kappa(CK)) 불변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 48>
서열 번호 48 은, 양 항체의 L 사슬 (Ig lambda(CL)) 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 49>
서열 번호 49 는, 양 항체의 L 사슬 (Ig lambda(CL)) 불변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 50>
서열 번호 50 은, 돼지 항체 (IgG1a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 51>
서열 번호 51 은, 돼지 항체 (IgG1a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 52>
서열 번호 52 는, 돼지 항체 (IgG1b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 53>
서열 번호 53 은, 돼지 항체 (IgG1b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 54>
서열 번호 54 는, 돼지 항체 (IgG2a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 55>
서열 번호 55 는, 돼지 항체 (IgG2a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 56>
서열 번호 56 은, 돼지 항체 (IgG2b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 57>
서열 번호 57 은, 돼지 항체 (IgG2b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 58>
서열 번호 58 은, 돼지 항체 (IgG3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 59>
서열 번호 59 는, 돼지 항체 (IgG3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 60>
서열 번호 60 은, 돼지 항체 (IgG4a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 61>
서열 번호 61 은, 돼지 항체 (IgG4a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 62>
서열 번호 62 는, 돼지 항체 (IgG4b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 63>
서열 번호 63 은, 돼지 항체 (IgG4b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 64>
서열 번호 64 는, 돼지 항체 (IgG5a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 65>
서열 번호 65 는, 돼지 항체 (IgG5a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 66>
서열 번호 66 은, 돼지 항체 (IgG5b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 67>
서열 번호 67 은, 돼지 항체 (IgG5b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 68>
서열 번호 68 은, 돼지 항체 (IgG6a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 69>
서열 번호 69 는, 돼지 항체 (IgG6a) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 70>
서열 번호 70 은, 돼지 항체 (IgG6b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 71>
서열 번호 71 은, 돼지 항체 (IgG6b) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 72>
서열 번호 72 는, 물소 항체 (IgG1 로 추정된다) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 73>
서열 번호 73 은, 물소 항체 (IgG1 로 추정된다) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 74>
서열 번호 74 는, 물소 항체 (IgG2 로 추정된다) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 75>
서열 번호 75 는, 물소 항체 (IgG2 로 추정된다) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 76>
서열 번호 76 은, 물소 항체 (IgG3 으로 추정된다) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 77>
서열 번호 77 은, 물소 항체 (IgG3 으로 추정된다) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 78>
서열 번호 78 은, 물소 항체의 L 사슬 (Ig lambda 로 추정된다) 불변 영역 (CL) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 79>
서열 번호 79 는, 물소 항체의 L 사슬 (Ig lambda 로 추정된다) 불변 영역 (CL) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 80>
서열 번호 80 은, 인간 항체 (IgG4 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 81>
서열 번호 81 은, 인간 항체 (IgG4 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 82>
서열 번호 82 는, 인간 항체 (IgG4 variant 3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 83>
서열 번호 83 은, 인간 항체 (IgG4 variant 3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 84>
서열 번호 84 는, 소 항체 (IgG1 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 85>
서열 번호 85 는, 소 항체 (IgG1 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 86>
서열 번호 86 은, 소 항체 (IgG1 variant 3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 87>
서열 번호 87 은, 소 항체 (IgG2 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 88>
서열 번호 88 은, 소 항체 (IgG2 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 89>
서열 번호 89 는, 소 항체 (IgG2 variant 3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 90>
서열 번호 90 은, 소 항체 (IgG3 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 91>
서열 번호 91 은, 소 항체 (IgG3 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 92>
서열 번호 92 는, 소 항체 (IgG1 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 93>
서열 번호 93 은, 소 항체 (IgG1 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 94>
서열 번호 94 는, 소 항체 (IgG1 variant 3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 95>
서열 번호 95 는, 소 항체 (IgG2 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 96>
서열 번호 96 은, 소 항체 (IgG2 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 97>
서열 번호 97 은, 소 항체 (IgG2 variant 3) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 98>
서열 번호 98 은, 소 항체 (IgG3 variant 1) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 99>
서열 번호 99 는, 소 항체 (IgG3 variant 2) 의 H 사슬 불변 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 100>
서열 번호 100 은, 소 항체의 L 사슬 불변 영역 (소 Ig lambda, GenBank:X62917) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 101>
서열 번호 101 은, 소 항체의 L 사슬 불변 영역 (소 Ig lambda, GenBank:X62917) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 번호 101 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 <서열 번호 104> 에 나타낸다.
<서열 번호 102>
서열 번호 102 는, 소 항체의 H 사슬 불변 영역 (소 IgG1, GenBank:X62916 을 개변) 의 아미노산 서열을 나타낸다. 변이 지점에 밑줄을 그었다. 아미노산 번호 및 변이:113E→P, 114L→V, 115P→A, 116G→삭제, 209A→S, 210P→S
<서열 번호 103>
서열 번호 103 은, 소 항체의 H 사슬 불변 영역 (소 IgG1, GenBank:X62916 을 개변) 의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 나타낸다.
<서열 번호 105>
서열 번호 105 는, 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 불변 영역으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 106>
서열 번호 106 은, 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 불변 영역 (소 IgG1, GenBank:X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
<서열 번호 107>
래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 불변 영역으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열) 을 나타낸다.
<서열 번호 108>
래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 불변 영역 (소 IgG1, GenBank:X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열) 을 나타낸다.
<서열 번호 109 ∼ 132>
서열 번호 109 ∼ 132 는, 순서로, 프라이머 ovPD-L1 CDS F, ovPD-L1 CDS R, poPD-L1 CDS F, poPD-L1 CDS R, buPD-L1 CDS F1, buPD-L1 CDS R1, buPD-L1 CDS F2, buPD-L1 CDS R2, ovPD-1-EGFP F, ovPD-1-EGFP R, ovPD-L1-EGFP F, ovPD-L1-EGFP R, poPD-1-EGFP F, poPD-1-EGFP R, poPD-L1-EGFP F, poPD-L1-EGFP R, ovPD-L1-Ig F, ovPD-L1-Ig R, poPD-L1-Ig F, poPD-L1-Ig R, cCD80-Ig F, cCD80-Ig R, cPD-L1-His F 및 cPD-L1-His R 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
<서열 번호 133 ∼ 138>
서열 번호 133 ∼ 138 은, 순서로, 프라이머 boPD-1-myc F, boPD-1-myc R, boPD-L1-EGFP F, boPD-L1-EGFP R, boPD-L1-Ig F, boPD-L1-Ig R 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY
<120> Anti-PD-L1 antibodies
<130> FP-221PCT
<150> JP P2016-159088
<151> 2016-08-15
<150> JP P2016-159089
<151> 2016-08-15
<150> JP P2017-110723
<151> 2017-06-05
<150> JP P2017-61454
<151> 2017-03-27
<160> 138
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 1
Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu Ser Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Tyr Gly Asp Ile Ala Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ala
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Asn Arg
65 70 75 80
His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gly Gln Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Lys
130
<210> 2
<211> 137
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 2
Met Gly Trp Ser Gln Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Cys
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Asn Phe Met His Trp Val Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Asp Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Ser Glu Glu Ala Val Ile Ser Leu Val Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 3
<211> 105
<212> PRT
<213> Canis lupus
<400> 3
Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Ser Gly Ser Pro Val
35 40 45
Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 4
<211> 331
<212> PRT
<213> Canis lupus
<400> 4
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Thr Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val
100 105 110
Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
115 120 125
Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val
130 135 140
Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
145 150 155 160
Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln
165 170 175
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln
180 185 190
Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly
195 200 205
Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala
210 215 220
His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser
225 230 235 240
Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro
245 250 255
Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu
260 265 270
Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290 295 300
Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 5
<211> 399
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 5
atggaatcac agacgcatgt cctcatttcc cttctgctct cggtatctgg tacctatggg 60
gacattgcga taacccagtc tccatcctct gtggctgtgt cagtaggaga gacggtcact 120
ctgagctgca agtccagtca gagtctttta tacagtgaaa accaaaagga ctatttgggc 180
tggtaccagc agaaaccagg gcagactcct aaacccctta tctactgggc aaccaaccgg 240
cacactgggg tccctgatcg cttcacaggt agtggatccg ggacagactt cactctgatc 300
atcagcagtg tgcaggctga agacctggct gattattact gtgggcagta ccttgtctat 360
ccgttcacgt ttggacctgg gaccaagctg gaactgaaa 399
<210> 6
<211> 411
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 6
atgggatgga gccagatcat cctctttctg gtggcagcag ctacatgtgt tcactcccag 60
gtacagctgc agcaatctgg ggctgaatta gtgaagcctg ggtcctcagt gaaaatttcc 120
tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt aactttatgc actgggtaaa gcagcagcct 180
ggaaatggcc ttgagtggat tgggtggatt tatcctgaat atggtaatac taagtacaat 240
caaaagttcg atgggaaggc aacactcact gcagacaaat cctccagcac agcctatatg 300
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag tgaggaggca 360
gttatatccc ttgtttactg gggccaaggc actctggtca ctgtctcttc a 411
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> Canis lupus
<400> 7
cagcccaagg cctccccctc ggtcacactc ttcccgccct cctctgagga gctcggcgcc 60
aacaaggcca ccctggtgtg cctcatcagc gacttctacc ccagcggcgt gacggtggcc 120
tggaaggcaa gcggcagccc cgtcacccag ggcgtggaga ccaccaagcc ctccaagcag 180
agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgcctgacaa gtggaaatct 240
cacagcagct tcagctgcct ggtcacgcac gaggggagca ccgtggagaa gaaggtggcc 300
cccgcagagt gctcttag 318
<210> 8
<211> 996
<212> DNA
<213> Canis lupus
<400> 8
gcctccacca cggccccctc ggttttccca ctggccccca gctgcgggtc cacttccggc 60
tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacttcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120
tggaattccg gctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180
gggctctact ccctcagcag cacggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240
ttcacctgca acgtggtcca cccggccagc aacactaaag tagacaagcc agtgcccaaa 300
gagtccacct gcaagtgtat atccccatgc ccagtccctg aatcactggg agggccttcg 360
gtcttcatct ttcccccgaa acccaaggac atcctcagga ttacccgaac acccgagatc 420
acctgtgtgg tgttagatct gggccgtgag gaccctgagg tgcagatcag ctggttcgtg 480
gatggtaagg aggtgcacac agccaagacg cagcctcgtg agcagcagtt caacagcacc 540
taccgtgtgg tcagcgtcct ccccattgag caccaggact ggctcaccgg aaaggagttc 600
aagtgcagag tcaaccacat aggcctcccg tcccccatcg agaggactat ctccaaagcc 660
agagggcaag cccatcagcc cagtgtgtat gtcctgccac catccccaaa ggagttgtca 720
tccagtgaca cggtcaccct gacctgcctg atcaaagact tcttcccacc tgagattgat 780
gtggagtggc agagcaatgg acagccggag cccgagagca agtaccacac gactgcgccc 840
cagctggacg aggacgggtc ctacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900
tggcagcagg gagacacctt cacatgtgcg gtgatgcatg aagctctaca gaaccactac 960
acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaatga 996
<210> 9
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric L chain
<400> 9
Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu Ser Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Tyr Gly Asp Ile Ala Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ala
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Asn Arg
65 70 75 80
His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gly Gln Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Lys Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
145 150 155 160
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala
165 170 175
Ser Gly Ser Pro Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys
180 185 190
Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro
195 200 205
Asp Lys Trp Lys Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu
210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 10
<211> 468
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric H chain
<400> 10
Met Gly Trp Ser Gln Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Cys
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Asn Phe Met His Trp Val Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Asp Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Ser Glu Glu Ala Val Ile Ser Leu Val Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val
145 150 155 160
Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His
210 215 220
Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Glu Ser Thr
225 230 235 240
Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr
290 295 300
Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu
325 330 335
Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp
385 390 395 400
Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala
405 410 415
Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 11
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 12
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
100 105 110
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 13
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgtta g 321
<210> 14
<211> 981
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 60
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 120
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 180
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 240
acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 300
tatggtcccc catgcccatc atgcccagca cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc 360
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 540
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 660
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 840
ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 960
tccctgtctc tgggtaaatg a 981
<210> 15
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 15
atggaatctc aaactcatgt tttgatttca ttacttctga gtgtttccgg aacctacggt 60
gatatcgcta tcactcaatc tccctcctct gttgctgtgt ctgtgggcga aaccgttacc 120
ctgtcctgca agtccagtca gtctcttctc tactccgaga atcaaaagga ctacctgggc 180
tggtaccaac agaagcccgg ccagacccca aagccactga tatactgggc aaccaacagg 240
cacaccggag tgcccgacag gttcacaggc agtggatctg gcaccgactt taccttgatc 300
atttcaagcg tgcaggctga agatctggcc gactactact gtggtcagta tctggtgtat 360
cctttcactt tcgggccagg gacaaaattg gaattgaag 399
<210> 16
<211> 411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 16
atgggttggt ctcaaattat cttgtttttg gttgctgcag ccacttgtgt tcattctcag 60
gtgcagctgc aacaaagcgg cgcagaactg gtgaaacctg gcagcagcgt gaaaatatct 120
tgtaaggcca gcggatatac tttcacctcc aatttcatgc attgggtcaa acagcagccc 180
ggcaacggac tcgagtggat cggctggatc taccccgagt atggcaacac aaaatataac 240
caaaaatttg atggaaaggc taccctgact gccgataagt cctccagcac cgcatacatg 300
caactctcct ccctgacctc cgaggatagc gctgtctact tctgtgcttc cgaagaggct 360
gtcatatcct tggtctattg gggccaagga actctggtga ccgtctcatc t 411
<210> 17
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 17
cagcccaaag cctctcccag cgtcaccctc ttcccacctt ccagtgagga gctgggggca 60
aacaaagcca ctttggtgtg tctcatctcc gatttttacc cctccggggt cacagtcgca 120
tggaaggcct ccggatcccc tgtgacacag ggagtggaga caacaaaacc tagcaagcag 180
agtaacaata agtatgccgc ctcaagctat ctcagcctta ctcctgataa gtggaagtca 240
catagcagtt ttagttgcct cgtaacacat gagggttcaa ctgtggagaa aaaagtagct 300
ccagctgagt gctcatga 318
<210> 18
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 18
gctagcacaa ccgctccctc cgtttttccc ctcgccccat cctgcgggtc aaccagcgga 60
tccaccgtcg ctctggcttg tctggtgtca ggatacttcc ccgagcctgt caccgtttct 120
tggaatagcg gcagccttac ttccggcgtg cataccttcc ctagcgtgct tcagtcctcc 180
ggtctgtatt ccctcagctc caccgtaact gtcccaagct caaggtggcc ctctgagaca 240
tttacctgca atgtggtcca tcctgcttca aataccaaag tggacaagcc cgtcccaaaa 300
gagtctacct gcaaatgtat cagtccttgt cccgtgcccg agtctctggg cggaccctca 360
gtctttatct tcccacccaa gccaaaggac atattgcgca ttacacggac acccgaaatc 420
acctgtgttg tgttggatct cggccgggaa gatcctgagg tgcagattag ttggtttgtt 480
gatggcaagg aggtgcacac agcaaaaaca cagcccagag aacagcagtt caacagtact 540
tatagagtag tgagtgtgtt gcctatagag catcaggact ggctgacagg caaagaattc 600
aaatgtaggg ttaaccacat tggcctccct agtccaatcg agaggacaat ctctaaagcc 660
cgaggccagg ctcatcagcc ttctgtgtac gttctgcctc ctagtcctaa ggaactgtct 720
tcttcagaca cagtaacact cacttgcctg attaaggact tttttcctcc agagattgat 780
gtggaatggc agtctaacgg gcagccagag ccagaatcta agtaccacac tactgcacca 840
cagctggatg aggatgggtc ttacttcctg tacagtaagc tgagtgtgga caagtctcga 900
tggcagcagg gggatacttt tacttgcgca gtaatgcacg aagcattgca gaaccactac 960
actgacctgt cacttagtca ctcaccaggg aagtaa 996
<210> 19
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 19
atggaatctc aaactcatgt tttgatttca ttacttctga gtgtttccgg aacctacggt 60
gatatcgcta tcactcaatc tccctcctct gttgctgtgt ctgtgggcga aaccgttacc 120
ctgtcctgca agtccagtca gtctcttctc tactccgaga atcaaaagga ctacctgggc 180
tggtaccaac agaagcccgg ccagacccca aagccactga tatactgggc aaccaacagg 240
cacaccggag tgcccgacag gttcacaggc agtggatctg gcaccgactt taccttgatc 300
atttcaagcg tgcaggctga agatctggcc gactactact gtggtcagta tctggtgtat 360
cctttcactt tcgggccagg gacaaaattg gaattgaagc agcccaaagc ctctcccagc 420
gtcaccctct tcccaccttc cagtgaggag ctgggggcaa acaaagccac tttggtgtgt 480
ctcatctccg atttttaccc ctccggggtc acagtcgcat ggaaggcctc cggatcccct 540
gtgacacagg gagtggagac aacaaaacct agcaagcaga gtaacaataa gtatgccgcc 600
tcaagctatc tcagccttac tcctgataag tggaagtcac atagcagttt tagttgcctc 660
gtaacacatg agggttcaac tgtggagaaa aaagtagctc cagctgagtg ctcatga 717
<210> 20
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 20
atgggttggt ctcaaattat cttgtttttg gttgctgcag ccacttgtgt tcattctcag 60
gtgcagctgc aacaaagcgg cgcagaactg gtgaaacctg gcagcagcgt gaaaatatct 120
tgtaaggcca gcggatatac tttcacctcc aatttcatgc attgggtcaa acagcagccc 180
ggcaacggac tcgagtggat cggctggatc taccccgagt atggcaacac aaaatataac 240
caaaaatttg atggaaaggc taccctgact gccgataagt cctccagcac cgcatacatg 300
caactctcct ccctgacctc cgaggatagc gctgtctact tctgtgcttc cgaagaggct 360
gtcatatcct tggtctattg gggccaagga actctggtga ccgtctcatc tgctagcaca 420
accgctccct ccgtttttcc cctcgcccca tcctgcgggt caaccagcgg atccaccgtc 480
gctctggctt gtctggtgtc aggatacttc cccgagcctg tcaccgtttc ttggaatagc 540
ggcagcctta cttccggcgt gcataccttc cctagcgtgc ttcagtcctc cggtctgtat 600
tccctcagct ccaccgtaac tgtcccaagc tcaaggtggc cctctgagac atttacctgc 660
aatgtggtcc atcctgcttc aaataccaaa gtggacaagc ccgtcccaaa agagtctacc 720
tgcaaatgta tcagtccttg tcccgtgccc gagtctctgg gcggaccctc agtctttatc 780
ttcccaccca agccaaagga catattgcgc attacacgga cacccgaaat cacctgtgtt 840
gtgttggatc tcggccggga agatcctgag gtgcagatta gttggtttgt tgatggcaag 900
gaggtgcaca cagcaaaaac acagcccaga gaacagcagt tcaacagtac ttatagagta 960
gtgagtgtgt tgcctataga gcatcaggac tggctgacag gcaaagaatt caaatgtagg 1020
gttaaccaca ttggcctccc tagtccaatc gagaggacaa tctctaaagc ccgaggccag 1080
gctcatcagc cttctgtgta cgttctgcct cctagtccta aggaactgtc ttcttcagac 1140
acagtaacac tcacttgcct gattaaggac ttttttcctc cagagattga tgtggaatgg 1200
cagtctaacg ggcagccaga gccagaatct aagtaccaca ctactgcacc acagctggat 1260
gaggatgggt cttacttcct gtacagtaag ctgagtgtgg acaagtctcg atggcagcag 1320
ggggatactt ttacttgcgc agtaatgcac gaagcattgc agaaccacta cactgacctg 1380
tcacttagtc actcaccagg gaagtaa 1407
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
aggatggctc ctagactccc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
agacgatggt ggcatactcg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
atgagaatgt ttagtgtctt 20
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
ttatgtctct tcaaattgta tatc 24
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
gttgatctgt gtgttg 16
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
cgggacttcc acatgagcat 20
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
ttttagacag aaagtga 17
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
gaccagctct tcttggggaa 20
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
ccgctcgaga tggggagccg gcgggggcc 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
cgcggatcct gaggggccac aggccgggtc 30
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
gaagatctat gagaatgttt agtgtc 26
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
ggaattctgt ctcttcaaat tgtatatc 28
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
cgcggctagc atggggagcc ggcgggggcc 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
cgcggatatc cagcccctgc aactggccgc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 35
cgcggctagc atgagaatgt ttagtgtctt 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
cgcggatatc agtcctctca cttgctggaa 30
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 37
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Lys Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 38
Gly Gln Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 39
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn Phe
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 40
Ile Tyr Pro Glu Tyr Gly Asn Thr
1 5
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 41
Ala Ser Glu Glu Ala Val Ile Ser Leu Val Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 331
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 42
Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr
65 70 75 80
Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro
100 105 110
Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
145 150 155 160
Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
180 185 190
Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln
210 215 220
Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu
260 265 270
Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly
290 295 300
Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys
325 330
<210> 43
<211> 996
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 43
gcctcaacaa cacccccgaa agtctaccct ctgacttctt gctgcgggga cacgtccagc 60
tccatcgtga ccctgggctg cctggtctcc agctatatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120
tggaactctg gtgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggccatcct gcagtcctcc 180
gggctctact ctctcagcag cgtggtgacc gtgccggcca gcacctcagg agcccagacc 240
ttcatctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagcg tgttgagccc 300
ggatgcccgg acccatgcaa acattgccga tgcccacccc ctgagctccc cggaggaccg 360
tctgtcttca tcttcccacc gaaacccaag gacaccctta caatctctgg aacgcccgag 420
gtcacgtgtg tggtggtgga cgtgggccag gatgaccccg aggtgcagtt ctcctggttc 480
gtggacaacg tggaggtgcg cacggccagg acaaagccga gagaggagca gttcaacagc 540
accttccgcg tggtcagcgc cctgcccatc cagcaccaag actggactgg aggaaaggag 600
ttcaagtgca aggtccacaa cgaagccctc ccggccccca tcgtgaggac catctccagg 660
accaaagggc aggcccggga gccgcaggtg tacgtcctgg ccccacccca ggaagagctc 720
agcaaaagca cgctcagcgt cacctgcctg gtcaccggct tctacccaga ctacatcgcc 780
gtggagtggc agaaaaatgg gcagcctgag tcggaggaca agtacggcac gaccacatcc 840
cagctggacg ccgacggctc ctacttcctg tacagcaggc tcagggtgga caagaacagc 900
tggcaagaag gagacaccta cgcgtgtgtg gtgatgcacg aggctctgca caaccactac 960
acacagaagt cgatctctaa gcctccgggt aaatga 996
<210> 44
<211> 329
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 44
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser
20 25 30
Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Ala Lys Val
85 90 95
Asp Lys Arg Val Gly Ile Ser Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro
100 105 110
Pro Cys Val Ser Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Ser Leu Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Gly Gln Gly Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
145 150 155 160
Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His
180 185 190
Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Ala Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys
260 265 270
Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr
290 295 300
Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys
325
<210> 45
<211> 990
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 45
gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgacttctt gctgcgggga cacgtccagc 60
tccagctcca tcgtgaccct gggctgcctg gtctccagct atatgcccga gccggtgacc 120
gtgacctgga actctggtgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc catcctgcag 180
tcctccgggc tctactctct cagcagcgtg gtgaccgtgc cggccagcac ctcaggagcc 240
cagaccttca tctgcaacgt agcccacccg gccagcagcg ccaaggtgga caagcgtgtt 300
gggatctcca gtgactactc caagtgttct aaaccgcctt gcgtgagccg accgtctgtc 360
ttcatcttcc ccccgaaacc caaggacagc ctcatgatca caggaacgcc cgaggtcacg 420
tgtgtggtgg tggacgtggg ccagggtgac cccgaggtgc agttctcctg gttcgtggac 480
aacgtggagg tgcgcacggc caggacaaag ccgagagagg agcagttcaa cagcaccttc 540
cgcgtggtca gcgccctgcc catccagcac gaccactgga ctggaggaaa ggagttcaag 600
tgcaaggtcc acagcaaagg cctcccggcc cccatcgtga ggaccatctc cagggccaaa 660
gggcaggccc gggagccgca ggtgtacgtc ctggccccac cccaggaaga gctcagcaaa 720
agcacgctca gcgtcacctg cctggtcacc ggcttctacc cagactacat cgccgtggag 780
tggcagagag cgcggcagcc tgagtcggag gacaagtacg gcacgaccac atcccagctg 840
gacgccgacg gctcctactt cctgtacagc aggctcaggg tggacaagag cagctggcaa 900
agaggagaca cctacgcgtg tgtggtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacacag 960
aagtcgatct ctaagcctcc gggtaaatga 990
<210> 46
<211> 102
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 46
Pro Ser Val Phe Leu Phe Lys Pro Ser Glu Glu Gln Leu Arg Thr Gly
1 5 10 15
Thr Val Ser Val Val Cys Leu Val Asn Asp Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
20 25 30
Asn Val Lys Val Lys Val Asp Gly Val Thr Gln Asn Ser Asn Phe Gln
35 40 45
Asn Ser Phe Thr Asp Gln Asp Ser Lys Lys Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
50 55 60
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ser Ser Glu Tyr Gln Ser His Asn Ala Tyr
65 70 75 80
Ala Cys Glu Val Ser His Lys Ser Leu Pro Thr Ala Leu Val Lys Ser
85 90 95
Phe Asn Lys Asn Glu Cys
100
<210> 47
<211> 309
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 47
ccatccgtct tcctcttcaa accatctgag gaacagctga ggaccggaac tgtctctgtc 60
gtgtgcttgg tgaatgattt ctaccccaaa gatatcaatg tcaaggtgaa agtggatggg 120
gttacccaga acagcaactt ccagaacagc ttcacagacc aggacagcaa gaaaagcacc 180
tacagcctca gcagcaccct gacactgtcc agctcagagt accagagcca taacgcctat 240
gcgtgtgagg tcagccacaa gagcctgccc accgccctcg tcaagagctt caataagaat 300
gaatgttag 309
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 48
Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr
1 5 10 15
Glu Glu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr
35 40 45
Ile Asn Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys
65 70 75 80
Ser Lys Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Thr Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser
100 105
<210> 49
<211> 321
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 49
ggtcagccca agtccgcacc ctcggtcacc ctgttcccgc cttccacgga ggagctcagt 60
accaacaagg ccaccgtggt gtgtctcatc aacgacttct acccgggtag cgtgaacgtg 120
gtctggaagg cagatggcag caccatcaat cagaacgtga agaccaccca ggcctccaaa 180
cagagcaaca gcaagtacgc ggccagcagc tacctgaccc tgacgggcag cgagtggaag 240
tctaagagca gttacacctg cgaggtcacg cacgagggga gcaccgtgac gaagacagtg 300
aagccctcag agtgttctta g 321
<210> 50
<211> 328
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 50
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Met Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys
100 105 110
Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser
225 230 235 240
Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr
260 265 270
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe
290 295 300
Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
325
<210> 51
<211> 987
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 51
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcggcaggga cacgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccatgacc 120
tggaactcgg gcgccctgac cagtggcgtg cataccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag catggtgacc gtgccggcca gcagcctgtc cagcaagagc 240
tacacctgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacaagcg tgttggaaca 300
aagaccaaac caccatgtcc catatgccca ggctgtgaag tggccgggcc ctcggtcttc 360
atcttccctc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc agacccccga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtcagcaa ggagcacgcc gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc 480
gtagaggtgc acacggccga gacgagacca aaggaggagc agttcaacag cacctaccgt 540
gtggtcagcg tcctgcccat ccagcaccag gactggctga aggggaagga gttcaagtgc 600
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aaagtcaccg taacctgcct ggtcattggc ttctacccac ctgacatcca tgttgagtgg 780
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ggagaaacat ttgagtgtgc ggtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacccagaag 960
tccatctcca agactcaggg taaatga 987
<210> 52
<211> 328
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 52
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Val Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Gly Ile His Gln Pro Gln Thr Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys
100 105 110
Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser
225 230 235 240
Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Thr Tyr
260 265 270
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe
290 295 300
Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
325
<210> 53
<211> 987
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 53
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcggcaggga cgtgtctggc 60
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tccatctcca agactcaggg taaatga 987
<210> 54
<211> 328
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 54
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys
100 105 110
Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser
225 230 235 240
Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr
260 265 270
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe
290 295 300
Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys
325
<210> 55
<211> 987
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 55
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcagcaggga cacgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
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gggctctact ccctcagcag catggtgacc gtgccggcca gcagcctgtc cagcaagagc 240
tacacctgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacaagcg tgttggaaca 300
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gtggtggttg atgtgagcca ggagaacccg gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc 480
gtagaggtgc acacggccca gacgaggcca aaggaggagc agttcaacag cacctaccgc 540
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aaggtcaaca acaaagacct cccagccccc atcacaagga tcatctccaa ggccaaaggg 660
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tctatctcca agactccggg taaatga 987
<210> 56
<211> 328
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 56
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Leu Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys
100 105 110
Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser
225 230 235 240
Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr
260 265 270
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe
290 295 300
Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys
325
<210> 57
<211> 987
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 57
gcccccaaga cggccccatt ggtctaccct ctggccccct gcggcaggga cacgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
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tacacctgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacaagcg tgttggaaca 300
aagaccaaac caccatgtcc catatgccca gcctgtgaat cgccagggcc ctcggtcttc 360
atcttccctc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacacccca ggtcacgtgc 420
gtggtagttg atgtgagcca ggagaacccg gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc 480
gtagaggtgc acacggccca gacgaggcca aaggaggagc agttcaacag cacctaccgc 540
gtggtcagcg tcctgcccat ccagcaccag gactggctga acgggaagga gttcaagtgc 600
aaggtcaaca acaaagacct cccagccccc atcacaagga tcatctccaa ggccaaaggg 660
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aaagtcagca taacctgcct ggtcattggc ttctacccac ctgacatcga tgtcgagtgg 780
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ggaggcatat tccagtgtgc ggtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacccagaag 960
tctatctcca agactccggg taaatga 987
<210> 58
<211> 333
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 58
Ala Tyr Asn Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Val Ser Asp His Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Arg
35 40 45
Val Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Ile Val Ala Ala Ser Ser Leu Ser Thr Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Tyr His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Asp Ile Glu Pro Pro Thr Pro Ile Cys Pro Glu Ile Cys Ser
100 105 110
Cys Pro Ala Ala Glu Val Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr
130 135 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Glu Ala Glu Val Gln Phe Ser
145 150 155 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Leu Tyr Thr Ala Gln Thr Arg Pro Met
165 170 175
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile
180 185 190
Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn
195 200 205
Asn Lys Asp Leu Leu Ser Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Thr
210 215 220
Gly Pro Ser Arg Val Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ala Trp Glu
225 230 235 240
Glu Leu Ser Lys Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe
245 250 255
Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu
260 265 270
Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly
275 280 285
Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Val Arg Trp Gln
290 295 300
Arg Gly Asp Leu Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn
305 310 315 320
His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
325 330
<210> 59
<211> 1002
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 59
gcctacaaca cagctccatc ggtctaccct ctggccccct gtggcaggga cgtgtctgat 60
cataacgtgg ccttgggctg ccttgtctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gtgccctgtc cagagtcgtg cataccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag catggtgatc gtggcggcca gcagcctgtc caccctgagc 240
tacacgtgca acgtctacca cccggccacc aacaccaagg tggacaagcg tgttgacatc 300
gaacccccca cacccatctg tcccgaaatt tgctcatgcc cagctgcaga ggtcctggga 360
gcaccgtcgg tcttcctctt ccctccaaaa cccaaggaca tcctcatgat ctcccggaca 420
cccaaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggagg aggctgaagt ccagttctcc 480
tggtacgtgg acggcgtaca gttgtacacg gcccagacga ggccaatgga ggagcagttc 540
aacagcacct accgcgtggt cagcgtcctg cccatccagc accaggactg gctgaagggg 600
aaggagttca agtgcaaggt caacaacaaa gacctccttt cccccatcac gaggaccatc 660
tccaaggcta cagggccgag ccgggtgccg caggtgtaca ccctgccccc agcctgggaa 720
gagctgtcca agagcaaagt cagcataacc tgcctggtca ctggcttcta cccacctgac 780
atcgatgtcg agtggcagag caacggacaa caagagccag agggcaatta ccgcaccacc 840
ccgccccagc aggacgtgga tgggacctac ttcctgtaca gcaagctcgc ggtggacaag 900
gtcaggtggc agcgtggaga cctattccag tgtgcggtga tgcacgaggc tctgcacaac 960
cactacaccc agaagtccat ctccaagact cagggtaaat ga 1002
<210> 60
<211> 277
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 60
Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
1 5 10 15
Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser Tyr Thr Cys
20 25 30
Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly
35 40 45
Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro
50 55 60
Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
65 70 75 80
Ile Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
85 90 95
Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
100 105 110
His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
115 120 125
Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
130 135 140
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
145 150 155 160
Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val
165 170 175
Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Thr Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr
180 185 190
Leu Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu
195 200 205
Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr
210 215 220
Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
225 230 235 240
Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Gln Cys Ala
245 250 255
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Phe
260 265 270
Lys Thr Pro Gly Lys
275
<210> 61
<211> 834
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 61
accttcccat ccgtcctgca gccgtcaggg ctctactccc tcagcagcat ggtgaccgtg 60
ccggccagca gcctgtccag caagagctac acctgcaatg tcaaccaccc ggccaccacc 120
accaaggtgg acaagcgtgt tggaacaaag accaaaccac catgtcccat atgcccagcc 180
tgtgaagggc ccgggccctc ggccttcatc ttccctccaa aacccaagga caccctcatg 240
atctcccgga cccccaaggt cacgtgcgtg gtggtagatg tgagccagga gaacccggag 300
gtccagttct cctggtacgt ggacggcgta gaggtgcaca cggcccagac gaggccaaag 360
gaggagcagt tcaacagcac ctaccgcgtg gtcagcgtcc tgcccatcca gcaccaggac 420
tggctgaacg ggaaggagtt caagtgcaag gtcaacaaca aagacctccc agcccccatc 480
acaaggatca tctccaaggc caaagggcag acccgggagc cgcaggtgta caccctgccc 540
ccacccaccg aggagctgtc caggagcaaa gtcacgctaa cctgcctggt cactggcttc 600
tacccacctg acatcgatgt cgagtggcaa agaaacggac agccggagcc agagggcaat 660
taccgcacca ccccgcccca gcaggacgtg gacgggacct acttcctgta cagcaagctc 720
gcggtggaca aggccagctg gcagcgtgga gacacattcc agtgtgcggt gatgcacgag 780
gctctgcaca accactacac ccagaagtcc atcttcaaga ctccgggtaa atga 834
<210> 62
<211> 318
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 62
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Val Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Gly Ile His Gln Pro Gln Thr Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys
100 105 110
Glu Gly Pro Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Leu Ile Gln His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Thr Glu Glu Leu Ser Arg Ser
225 230 235 240
Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr
260 265 270
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe
290 295 300
Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315
<210> 63
<211> 955
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 63
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcggcaggga cgtgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcgccctgac cagtggcgtg cacaccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag catggtgacc gtgccggcca gcagcctgtc cagcaagagc 240
tacacctgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacaagcg tgttggaata 300
caccagccgc aaacatgtcc catatgccca gcctgtgaag ggcccgggcc ctcggccttc 360
atcttccctc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccccaa ggtcacgtgc 420
gtggtggttg atgtgagcca ggagaacccg gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc 480
gtagaggtgc acacggccca gacgaggcca aaggaggagc agttcaacag cacctaccgc 540
gtggtcagcg tcctgctcat ccagcaccag gactggctga acgggaagga gttcaagtgc 600
aaggtcaaca acaaagacct cccagccccc atcacaagga tcatctccaa ggccaaaggg 660
cagacccggg agccgcaggt gtacaccctg cccccaccca ccgaggagct gtccaggagc 720
aaagtcacgc taacctgcct ggtcactggc ttctacccac ctgacatcga tgtcgagtgg 780
caaagaaacg gacagccgga gccagagggc aattaccgca ccaccccgcc ccagcaggac 840
gtggacggga cctacttcct gtacagcaag ctcgcggtgg acaaggccag ctggcagcgt 900
ggagacacat tccagtgtgc ggtgatgcac gaggctctgc acaaccacta caccc 955
<210> 64
<211> 323
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 64
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala His Ser Leu Ser Ser Lys Arg
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Lys Thr Lys Val Asp Leu
85 90 95
Cys Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val Ala Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Met Ile
115 120 125
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu
130 135 140
His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Glu Glu Val His
145 150 155 160
Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
165 170 175
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp Leu Lys Gly Lys
180 185 190
Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Glu Asp Leu Pro Gly Pro Ile Thr
195 200 205
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Val Val Arg Ser Pro Glu Val Tyr
210 215 220
Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Lys Ser Ile Val Thr Leu
225 230 235 240
Thr Cys Leu Val Lys Ser Ile Phe Pro Phe Ile His Val Glu Trp Lys
245 250 255
Ile Asn Gly Lys Pro Glu Pro Glu Asn Ala Tyr Arg Thr Thr Pro Pro
260 265 270
Gln Glu Asp Glu Asp Arg Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val
275 280 285
Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu Cys Ala Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr
305 310 315 320
Gln Gly Lys
<210> 65
<211> 975
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<220>
<221> misc_feature
<222> (748)..(748)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 65
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcagcaggga cacgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggtctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcgccctgac cagtggcgtg cacaccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag catggtgacc gtgccggccc acagcttgtc cagcaagcgc 240
tatacgtgca atgtcaacca cccagccacc aaaaccaagg tggacctgtg tgttggacga 300
ccatgtccca tatgcccagg ctgtgaagtg gccgggccct cggtcttcat cttccctcca 360
aaacccaagg acatcctcat gatctcccgg acccccgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 420
gtcagcaagg agcacgccga ggtccagttc tcctggtacg tggacggcga agaggtgcac 480
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ctgcccatcc agcacgagga ctggctgaag gggaaggagt tcgagtgcaa ggtcaacaac 600
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tacttcctgt acagcaagct cgcggtggac aaggcaagat gggaccatgg agaaacattt 900
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actcagggta aatga 975
<210> 66
<211> 317
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 66
Ala Tyr Asn Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Val Ser Asp His Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Trp Gly Ala Gln Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Thr Val Thr Val Pro Ala His Ser Leu Ser Ser Lys Cys
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Leu
85 90 95
Cys Val Gly Lys Lys Thr Lys Pro Arg Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys
100 105 110
Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Ile Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Glu Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp
180 185 190
Leu Lys Gly Lys Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Glu Asp Leu Pro
195 200 205
Gly Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Val Val Arg Ser
210 215 220
Pro Glu Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Lys Ser
225 230 235 240
Ile Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Ser Phe Phe Pro Pro Phe Ile
245 250 255
His Val Glu Trp Lys Ile Asn Gly Lys Pro Glu Pro Glu Asn Ala Tyr
260 265 270
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Glu Asp Glu Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Phe Ser Val Glu Lys Phe Arg Trp His Ser Gly Gly Ile His
290 295 300
Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315
<210> 67
<211> 952
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 67
gcctacaaca cagctccatc ggtctaccct ctggccccct gtggcaggga cgtgtctgat 60
cataacgtgg ccttgggctg cctggtctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
tggaactggg gcgcccagac cagtggcgtg cacaccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag cacggtgacc gtgccggccc acagcttgtc cagcaagtgc 240
ttcacgtgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacctgtg tgttggaaaa 300
aagaccaagc ctcgatgtcc catatgccca ggctgtgaag tggccgggcc ctcggtcttc 360
atcttccctc caaaacccaa ggacatcctc atgatctccc ggacccccga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtcagcaa ggagcacgcc gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc 480
gaagaggtgc acacggccga gacgagacca aaggaggagc agttcaacag cacttaccgc 540
gtggtcagcg tcctgcccat ccagcacgag gactggctga aggggaagga gttcgagtgc 600
aaggtcaaca acgaagacct cccaggcccc atcacgagga ccatctccaa ggccaaaggg 660
gtggtacgga gcccggaggt gtacaccctg cccccacccg ccgaggagct gtccaagagc 720
atagtcacgc taacctgcct ggtcaaaagc ttcttcccgc ctttcatcca tgttgagtgg 780
aaaatcaacg gaaaaccaga gccagagaac gcataccgca ccaccccgcc ccaggaggac 840
gaggacggga cctacttcct gtacagcaag ttctcggtgg aaaagttcag gtggcacagt 900
ggaggcatcc actgtgcggt gatgcacgag gctctgcaca accactacac cc 952
<210> 68
<211> 314
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 68
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Leu
85 90 95
Cys Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
115 120 125
Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
130 135 140
Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
145 150 155 160
Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
165 170 175
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp Leu Lys Gly Lys
180 185 190
Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr
195 200 205
Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr
210 215 220
Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile
225 230 235 240
Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp
245 250 255
Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro
260 265 270
Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala
275 280 285
Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe Gln Cys Ala Val
290 295 300
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310
<210> 69
<211> 943
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 69
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcggcaggga cacgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccctgacc 120
tggaactcgg gcgccctgac cagtggcgtg cataccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag catggtgacc gtgccggcca gcagcctgtc cagcaagagc 240
tacacctgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacctgtg tgttggacga 300
ccatgtccca tatgcccagc ctgtgaaggg cccgggccct cggtcttcat cttccctcca 360
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acaccccagg tcacgtgcgt ggtggtagat 420
gtgagccagg aaaacccgga ggtccagttc tcctggtatg tggacggtgt agaggtgcac 480
acggcccaga cgaggccaaa ggaggcgcag ttcaacagca cctaccgtgt ggtcagcgtc 540
ctgcccatcc agcacgagga ctggctgaag gggaaggagt tcgagtgcaa ggtcaacaac 600
aaagacctcc cagcccccat cacaaggatc atctccaagg ccaaagggcc gagccgggag 660
ccgcaggtgt acaccctgtc cccatccgcc gaggagctgt ccaggagcaa agtcagcata 720
acctgcctgg tcactggctt ctacccacct gacatcgatg tcgagtggaa gagcaacgga 780
cagccggagc cagagggcaa ttaccgcacc accccgcccc agcaggacgt ggacgggacc 840
tacttcctgt acagcaagct cgcggtggac aaggccagct ggcagcgtgg agacccattc 900
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<210> 70
<211> 320
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 70
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Thr Val Thr Val Pro Ala Arg Ser Ser Ser Arg Lys Cys
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Leu
85 90 95
Cys Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Asn Gly
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
115 120 125
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
130 135 140
Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Glu Glu Val His
145 150 155 160
Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
165 170 175
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys
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Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr
195 200 205
Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr
210 215 220
Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile
225 230 235 240
Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp
245 250 255
Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Ser Thr Pro
260 265 270
Pro Gln Glu Asp Glu Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala
275 280 285
Val Asp Lys Ala Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ile His Cys Ala Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr
305 310 315 320
<210> 71
<211> 960
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 71
gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcggcaggga cacgtctggc 60
cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcgccctgac cagtggcgtg cacaccttcc catccgtcct gcagccgtca 180
gggctctact ccctcagcag cacggtgacc gtgccggcca ggagctcgtc cagaaagtgc 240
ttcacgtgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacctgtg tgttggacga 300
ccatgtccca tatgcccagc ctgtgaaggg aacgggccct cggtcttcat cttccctcca 360
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccccgagg tcacgtgcgt ggtggtagat 420
gtgagccagg aaaacccgga ggtccagttc tcctggtacg tggacggcga agaggtgcac 480
acggccgaga cgaggccaaa ggaggagcag ttcaacagca cctaccgtgt ggtcagcgtc 540
ctgcccatcc agcaccagga ctggctgaag ggaaaggagt tcgagtgcaa ggtcaacaac 600
aaagacctcc cagcccccat cacaaggatc atctccaagg ccaaagggcc gagccgggag 660
ccgcaggtgt acaccctgtc cccatccgcc gaggagctgt ccaggagcaa agtcagcata 720
acctgcctgg tcactggctt ctacccacct gacatcgatg tcgagtggaa gagcaacgga 780
cagccggagc cagagggcaa ttaccgctcc accccgcccc aggaggacga ggacgggacc 840
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tgtgcggtga tgcacgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagtccat ctccaagact 960
<210> 72
<211> 266
<212> PRT
<213> Bubalus bubalis
<400> 72
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Ala Pro Ala Ser Ala Thr Lys Ser Gln
20 25 30
Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp
35 40 45
Lys Ala Val Val Pro Pro Cys Arg Pro Lys Pro Cys Asp Cys Cys Pro
50 55 60
Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
65 70 75 80
Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
85 90 95
Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe
100 105 110
Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu
115 120 125
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
130 135 140
Asn Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln
165 170 175
Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Asp Glu Leu
180 185 190
Ser Lys Ser Thr Val Ser Ile Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro
195 200 205
Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asp Gly Gln Pro Glu Ser Glu
210 215 220
Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
225 230 235 240
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asn Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly
245 250 255
Gly Ala Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu
260 265
<210> 73
<211> 801
<212> DNA
<213> Bubalus bubalis
<400> 73
gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc gggctctact ctctcagcag 60
cacggtgacc gcgcccgcca gcgccacaaa aagccagacc ttcacctgca acgtagccca 120
cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgttgttccc ccatgcagac cgaaaccctg 180
tgattgctgc ccaccccctg agctccccgg aggaccctct gtcttcatct tcccaccaaa 240
acccaaggac accctcacaa tctctggaac tcctgaggtc acgtgtgtgg tggtggacgt 300
gggccacgat gaccccgagg tgaagttctc ctggttcgtg gacgatgtgg aggtaaacac 360
agccaggacg aagccaagag aggagcagtt caacagcacc taccgcgtgg tcagcgccct 420
gcccatccag cacaacgact ggactggagg aaaggagttc aagtgcaagg tctacaatga 480
aggcctccca gcccccatcg tgaggaccat ctccaggacc aaagggcagg cccgggagcc 540
gcaggtgtac gtcctggccc caccccagga cgagctcagc aaaagcacgg tcagcatcac 600
ttgcatggtc actggcttct acccagacta catcgccgta gagtggcaga aagatgggca 660
gcctgagtca gaggacaaat atggcacgac cccgccccag ctggacagcg atggctccta 720
cttcctgtac agcaggctca gggtgaacaa gaacagctgg caagaaggag gcgcctacac 780
gtgtgtagtg atgcatgagg c 801
<210> 74
<211> 309
<212> PRT
<213> Bulalus bubalis
<400> 74
Ala Ser Ile Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Arg Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Thr Val Thr Ala Pro Ala Ser Ala Thr Lys Ser Gln Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Thr
85 90 95
Ala Val Gly Phe Ser Ser Asp Cys Cys Lys Phe Pro Lys Pro Cys Val
100 105 110
Arg Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
115 120 125
Met Ile Thr Gly Asn Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly
130 135 140
Arg Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Gly Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Gly Arg Ser Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Tyr Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Asn Asp Trp Thr Gly
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val
225 230 235 240
Ser Val Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val
245 250 255
Glu Trp His Arg Asp Arg Gln Ala Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Lys Val Asn Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Gly Ala Tyr Thr Cys
290 295 300
Val Val Met His Glu
305
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<212> DNA
<213> Bubalus bubalis
<400> 75
gcctccatca cagccccgaa agtctaccct ctgacttctt gccgcgggga aacgtccagc 60
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tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctct 180
gggctctact ctctcagcag cacggtgacc gcgcccgcca gcgccacaaa aagccagacc 240
ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacacggc tgttgggttc 300
tccagtgact gctgcaagtt tcctaagcct tgtgtgaggg gaccatctgt cttcatcttc 360
ccgccgaaac ccaaagacac cctgatgatc acaggaaatc ccgaggtcac atgtgtggtg 420
gtggacgtgg gccgggataa ccccgaggtg cagttctcct ggttcgtggg tgatgtggag 480
gtgcacacgg gcaggtcgaa gccgagagag gagcagttca acagcaccta ccgcgtggtc 540
agcaccctgc ccatccagca caatgactgg actggaggaa aggagttcaa gtgcaaggtc 600
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cgggagccgc aggtgtacgt cctggcccca ccccaggaag agctcagcaa aagcacggtc 720
agcgtcactt gcatggtcac tggcttctac ccagactaca tcgccgtaga gtggcataga 780
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ggctcctact tcctgtacag caggctcaag gtgaacaaga acagctggca agaaggaggc 900
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<212> PRT
<213> Bubalus bubalis
<400> 76
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Asn
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Met Pro Thr Ser Thr Ala Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Thr
85 90 95
Ala Val Thr Ala Arg His Pro Val Pro Lys Thr Pro Glu Thr Pro Ile
100 105 110
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115 120 125
Cys Gln Cys Pro Lys Cys Pro Glu Pro Leu Gly Gly Leu Ser Val Phe
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro
145 150 155 160
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val
165 170 175
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Arg Met
180 185 190
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala
195 200 205
Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Arg Glu Lys Glu Phe Lys Cys
210 215 220
Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser
225 230 235 240
Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro
245 250 255
Pro Arg Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Ile
260 265 270
Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Glu Val Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr His Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp
290 295 300
Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asn Arg Ser
305 310 315 320
Ser Trp Gln Glu Gly Asp His Tyr Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu Arg Asn His Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 77
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<212> DNA
<213> Bubalus bubalis
<400> 77
gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctggcatcca gctgcgggga cacgtccagc 60
tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gtgccctgaa gaacggcgtg cacaccttcc cggccgtccg gcagtcctcc 180
gggctctact ctctcagcag catggtgacc atgcccacca gcaccgcagg aacccagacc 240
ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacacggc tgtcactgca 300
aggcatccgg tcccgaagac accagagaca cctatccatc ctgtaaaacc cccaacccag 360
gagcccagag atgaaaagac accctgccag tgtcccaaat gcccagaacc tctgggagga 420
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gaggtcacgt gtgtggtggt ggacgtgggc caggatgacc ccgaagtgca gttctcctgg 540
ttcgtggatg acgtggaggt gcacacagcc aggatgaagc caagagagga gcagttcaac 600
agcacctacc gcgtggtcag cgccctgccc atccagcacc aggactggct gcgggaaaag 660
gagttcaagt gcaaggtcaa caacaaaggc ctcccggccc ccatcgtgag gaccatctcc 720
aggaccaaag ggcaggcccg ggagccacag gtgtatgtcc tggccccacc ccgggaagag 780
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gacgtggagt ggcagagaaa tgggcagcct gagtcagagg acaagtacca cacgacccca 900
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<212> PRT
<213> Bubalus bubalis
<400> 78
Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu
1 5 10 15
Glu Leu Ser Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ser Met Thr Val Ala Arg Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile
35 40 45
Thr Arg Asn Val Glu Thr Thr Arg Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser
65 70 75 80
Lys Gly Ser Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr
85 90 95
Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser
100 105
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<211> 318
<212> DNA
<213> Bubalus buballis
<400> 79
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<210> 80
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 81
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 81
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gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360
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<210> 82
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 83
<211> 654
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 83
gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 60
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 300
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 360
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa atga 654
<210> 84
<211> 329
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 84
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala
85 90 95
Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro
100 105 110
Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp
145 150 155 160
Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp
180 185 190
Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys
225 230 235 240
Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys
260 265 270
Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr
290 295 300
Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys
325
<210> 85
<211> 329
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 85
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala
85 90 95
Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro
100 105 110
Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp
145 150 155 160
Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp
180 185 190
Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys
225 230 235 240
Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys
260 265 270
Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr
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Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys
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<210> 86
<211> 329
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 86
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
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Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Ala Val Asp Pro Arg Cys Lys Thr Thr Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro
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Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp
145 150 155 160
Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp
180 185 190
Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys
225 230 235 240
Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys
260 265 270
Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr
290 295 300
Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys
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<211> 326
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 87
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
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Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Ser Gly Gln Thr Phe
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala
85 90 95
Val Gly Val Ser Ile Asp Cys Ser Lys Cys His Asn Gln Pro Cys Val
100 105 110
Arg Glu Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
115 120 125
Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asn Val Gly
130 135 140
His Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Arg Ser Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Ser Ala Pro
195 200 205
Ile Val Arg Ile Ile Ser Arg Ser Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Val Leu Asp Pro Pro Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu
225 230 235 240
Ser Val Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ala Val
245 250 255
Glu Trp Gln Arg Asn Arg Gln Thr Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Gln Leu Asp Thr Asp Arg Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Ala Tyr Thr Cys
290 295 300
Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Met Gln Lys Ser Thr
305 310 315 320
Ser Lys Ser Ala Gly Lys
325
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<211> 326
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 88
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
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65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala
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Val Gly Val Ser Ser Asp Cys Ser Lys Pro Asn Asn Gln His Cys Val
100 105 110
Arg Glu Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
115 120 125
Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asn Val Gly
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His Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
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Val His Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
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Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly
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Ile Val Arg Ile Ile Ser Arg Ser Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln
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Val Tyr Val Leu Asp Pro Pro Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val
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Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala
85 90 95
Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
145 150 155 160
Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp
180 185 190
Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser
225 230 235 240
Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr
260 265 270
Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr
290 295 300
Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys
325
<210> 103
<211> 987
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 103
gctagcacaa ctgctcctaa ggtgtacccc ctgagctctt gctgcggcga caagtctagc 60
agcaccgtga ccctcggatg cctcgtcagc agctatatgc ctgagccagt tacagtgaca 120
tggaattctg gtgcccttaa gtccggcgtc cataccttcc ctgctgtgct gcagtcctct 180
ggcctgtaca gtttgtcctc tatggtgaca gtacccggtt ccacctccgg acagaccttt 240
acctgtaatg tggctcatcc cgcctcctcc acaaaggtgg ataaggctgt tgaccctacc 300
tgtaaaccca gtccatgcga ctgctgtccc ccccctccag ttgccggacc ctcagtcttt 360
attttcccac ccaaacccaa agacaccctg acaatctctg gaacaccaga agtcacctgc 420
gtcgtcgtgg atgtgggcca cgacgatcct gaggtaaaat tctcatggtt cgtcgacgat 480
gtggaagtga atacagctac tacaaaacct cgcgaagagc agtttaactc tacctatcga 540
gtggtttctg ctttgcggat tcagcatcag gattggacag gcggcaaaga gtttaaatgt 600
aaagtccata acgagggact tccttctagt atcgtgcgca ctatcagtag aactaaaggg 660
cctgctcggg aacctcaggt gtacgtcctg gcacctccac aggaagagct gagtaagtct 720
acagtttctc tgacttgtat ggtaacatct ttttatccag attacatcgc agttgaatgg 780
cagaggaacg ggcagccaga gagtgaggat aagtacggga ctactccacc acagctggac 840
gcagactcaa gttacttcct gtactcaaag ctgagggttg acagaaactc atggcaggag 900
ggggacactt acacttgcgt agttatgcac gaggcacttc acaaccacta cactcagaag 960
agtacttcaa agagtgcagg gaagtaa 987
<210> 104
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 104
cagcctaaga gtcctccttc tgtaacactc tttcccccct ctaccgagga actcaacggc 60
aataaagcta ccttggtttg ccttatttct gatttctacc ccgggtctgt gaccgtggtg 120
tggaaagctg atgggtccac cattactcgg aatgtggaaa ccacccgggc ttctaagcag 180
tccaactcta aatacgcagc atcctcctat ttgagtctta ctagtagtga ctggaagtca 240
aagggtagtt acagttgcga agtcacacat gaaggttcaa cagtgacaaa gacagtcaag 300
ccctcagagt gctcatag 318
<210> 105
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric L chain
<400> 105
Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Ile Ser Leu Leu Leu Ser Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Tyr Gly Asp Ile Ala Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ala
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Glu Asn Gln Lys Asp Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Asn Arg
65 70 75 80
His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gly Gln Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Lys Gln Pro Lys Ser Pro Pro Ser Val Thr Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Thr Glu Glu Leu Asn Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
145 150 155 160
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Val Thr Val Val Trp Lys Ala
165 170 175
Asp Gly Ser Thr Ile Thr Arg Asn Val Glu Thr Thr Arg Ala Ser Lys
180 185 190
Gln Ser Asn Ser Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Ser
195 200 205
Ser Asp Trp Lys Ser Lys Gly Ser Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Glu
210 215 220
Gly Ser Thr Val Thr Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 106
<211> 465
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric H chain
<400> 106
Met Gly Trp Ser Gln Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Cys
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Asn Phe Met His Trp Val Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Asp Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Ser Glu Glu Ala Val Ile Ser Leu Val Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys
130 135 140
Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val
145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val
195 200 205
Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro
225 230 235 240
Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys
325 330 335
Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ser Ser Ile Val Arg Thr Ile
340 345 350
Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala
355 360 365
Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met
370 375 380
Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu
405 410 415
Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg
420 425 430
Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 107
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 107
atggaatctc aaactcatgt tttgatttca ttacttctga gtgtttccgg aacctacggt 60
gatatcgcta tcactcaatc tccctcctct gttgctgtgt ctgtgggcga aaccgttacc 120
ctgtcctgca agtccagtca gtctcttctc tactccgaga atcaaaagga ctacctgggc 180
tggtaccaac agaagcccgg ccagacccca aagccactga tatactgggc aaccaacagg 240
cacaccggag tgcccgacag gttcacaggc agtggatctg gcaccgactt taccttgatc 300
atttcaagcg tgcaggctga agatctggcc gactactact gtggtcagta tctggtgtat 360
cctttcactt tcgggccagg gacaaaactc gagctcaaac agcctaagag tcctccttct 420
gtaacactct ttcccccctc taccgaggaa ctcaacggca ataaagctac cttggtttgc 480
cttatttctg atttctaccc cgggtctgtg accgtggtgt ggaaagctga tgggtccacc 540
attactcgga atgtggaaac cacccgggct tctaagcagt ccaactctaa atacgcagca 600
tcctcctatt tgagtcttac tagtagtgac tggaagtcaa agggtagtta cagttgcgaa 660
gtcacacatg aaggttcaac agtgacaaag acagtcaagc cctcagagtg ctcatag 717
<210> 108
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized sequence
<400> 108
atggggtggt cccagattat attgttcctc gtcgccgccg ccacttgcgt acacagccaa 60
gtgcaacttc aacaaagcgg tgcagaactg gtaaagcccg gtagctctgt gaaaatatcc 120
tgtaaagcca gtggctacac atttaccagc aactttatgc actgggtgaa gcaacagccc 180
ggaaatggct tggagtggat tggctggatc tatcccgaat atggtaacac caagtataat 240
cagaagttcg acggtaaggc caccctcacc gccgataagt catcctccac cgcctatatg 300
cagctcagca gcctgaccag cgaggattcc gctgtgtact tctgtgccag cgaagaggct 360
gtgatctcat tggtgtattg gggacagggc accctcgtca ccgtgtccag cgctagcaca 420
actgctccta aggtgtaccc cctgagctct tgctgcggcg acaagtctag cagcaccgtg 480
accctcggat gcctcgtcag cagctatatg cctgagccag ttacagtgac atggaattct 540
ggtgccctta agtccggcgt ccataccttc cctgctgtgc tgcagtcctc tggcctgtac 600
agtttgtcct ctatggtgac agtacccggt tccacctccg gacagacctt tacctgtaat 660
gtggctcatc ccgcctcctc cacaaaggtg gataaggctg ttgaccctac ctgtaaaccc 720
agtccatgcg actgctgtcc cccccctcca gttgccggac cctcagtctt tattttccca 780
cccaaaccca aagacaccct gacaatctct ggaacaccag aagtcacctg cgtcgtcgtg 840
gatgtgggcc acgacgatcc tgaggtaaaa ttctcatggt tcgtcgacga tgtggaagtg 900
aatacagcta ctacaaaacc tcgcgaagag cagtttaact ctacctatcg agtggtttct 960
gctttgcgga ttcagcatca ggattggaca ggcggcaaag agtttaaatg taaagtccat 1020
aacgagggac ttccttctag tatcgtgcgc actatcagta gaactaaagg gcctgctcgg 1080
gaacctcagg tgtacgtcct ggcacctcca caggaagagc tgagtaagtc tacagtttct 1140
ctgacttgta tggtaacatc tttttatcca gattacatcg cagttgaatg gcagaggaac 1200
gggcagccag agagtgagga taagtacggg actactccac cacagctgga cgcagactca 1260
agttacttcc tgtactcaaa gctgagggtt gacagaaact catggcagga gggggacact 1320
tacacttgcg tagttatgca cgaggcactt cacaaccact acactcagaa gagtacttca 1380
aagagtgcag ggaagtaa 1398
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 109
atgaggatat atagtgtctt aacat 25
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 110
ttacgtctcc tcaaaatgtg 20
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 111
atgaggatat gtagtatctt tacat 25
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 112
ttacgtctcc tcaaattgtg t 21
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 113
atgaggatat atagtgtctt 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 114
gccactcagg acttggtgat 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 115
gggggtttac tgttgcttga 20
<210> 116
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 116
ttacgtctcc tcaaattgt 19
<210> 117
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 117
gaagatctat ggggaccccg cgggcgccg 29
<210> 118
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 118
gacccgggga ggggccagga gcagtgtcc 29
<210> 119
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 119
ccgctcgaga tgaggatata tagtgtct 28
<210> 120
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 120
atcccgggcg tctcctcaaa atgtgtag 28
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 121
actaagctta tggggacccc gcggg 25
<210> 122
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 122
actcccgggg aggggccaag agcagt 26
<210> 123
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 123
ccgctcgaga tgaggatatg tagtatctt 29
<210> 124
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 124
atcccgggcg tctcctcaaa ttgtgtatc 29
<210> 125
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 125
gacgctagca tgaggatata tagtgtct 28
<210> 126
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 126
gctctgatat ccctcgtttt tgctggat 28
<210> 127
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 127
gacgctagca tgaggatatg tagtatctt 29
<210> 128
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 128
agcttgatat ccctctttct tgctggatc 29
<210> 129
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 129
cgcggatatc atggattaca cagcgaagtg 30
<210> 130
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 130
cggggtaccc cagagctgtt gctggttat 29
<210> 131
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 131
cgcggctagc atgagaatgt ttagtgtctt 30
<210> 132
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 132
cgcggatatc ttaatggtga tggtgatggt gagtcctctc acttgctgg 49
<210> 133
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 133
atatgcggcc gcatggggac cccgcgggcg ct 32
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 134
gcgcaagctt tcagaggggc caggagcagt 30
<210> 135
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 135
ctagctagca ccatgaggat atatagtgtc ttaac 35
<210> 136
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 136
caatctcgag ttacagacag aagatgactg c 31
<210> 137
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 137
gctagcatga ggatatatag tgtcttaac 29
<210> 138
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 138
gatatcattc ctcttttttg ctggat 26
Claims (23)
- (a) QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 포함하고, L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하고, 래트 이외의 동물이 소 또는 개인, 항PD-L1 항체.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
L 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역이고, H 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역인, 항PD-L1 항체. - 제 3 항에 있어서,
L 사슬 가변 영역이 서열 번호 1 의 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 가변 영역이 서열 번호 2 의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 1 항에 있어서,
래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬 또는 Kappa 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 1 항에 있어서,
래트 이외의 동물이 개이고, 개 항체의 H 사슬 불변 영역이, 개의 IgG-D 의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 1 항에 있어서,
래트 이외의 동물이 소이고, 소 항체의 H 사슬 불변 영역이, 서열 번호 102 의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 6 항에 있어서,
개 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 7 항에 있어서,
소 항체의 L 사슬 불변 영역이, Lambda 사슬의 불변 영역의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 8 항에 있어서,
개 항체의 L 사슬 불변 영역이 서열 번호 3 의 아미노산 서열을 갖고, 개 항체의 H 사슬 불변 영역이 서열 번호 4 의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 9 항에 있어서,
소 항체의 L 사슬 불변 영역이 서열 번호 100 의 아미노산 서열을 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 1 항에 있어서,
L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는, 항PD-L1 항체. - 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는 멜라노마, 미분화 육종 및 BLV(bovine leukemia virus) 감염증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 위한, 의약 조성물.
- 삭제
- 삭제
- (a') QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 와, (b') GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하고, L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하고, 래트 이외의 동물이 소 또는 개인, 인공 유전자 DNA.
- 제 16 항에 기재된 인공 유전자 DNA 를 포함하는 벡터.
- 제 17 항에 기재된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포주.
- 제 18 항에 기재된 숙주 세포주를 배양하고, 배양물로부터 항PD-L1 항체를 채취하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법.
- QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA와, GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA를 포함하는, 인비트로(in vitro) 에서 항PD-L1 항체의 제조를 위한 조성물로서, L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하고, 래트 이외의 동물이 소 또는 개인, 조성물.
- QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA를 짜넣은 벡터와, GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA를 짜넣은 벡터를 포함하는, 인비트로(in vitro) 에서 항PD-L1 항체의 제조를 위한 조성물로서, L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하고, 래트 이외의 동물이 소 또는 개인, 조성물.
- QSLLYSENQKDY (서열 번호 37) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, WAT 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 GQYLVYPFT (서열 번호 38) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 불변 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 를 짜넣은 벡터와, GYTFTSNF (서열 번호 39) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, IYPEYGNT (서열 번호 40) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 ASEEAVISLVY (서열 번호 41) 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 불변 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 를 짜넣은 벡터로 형질 전환된 숙주 세포주로서, L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하고, 래트 이외의 동물이 소 또는 개인, 숙주 세포주.
- 제 22 항의 숙주 세포주를 배양하고, 배양물로부터 항PD-L1 항체를 채취하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법.
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