TWI606061B - 用於治療乳癌的細胞穿透胜肽及其應用 - Google Patents

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高雄醫學大學
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Description

用於治療乳癌的細胞穿透胜肽及其應用
本發明關於一種胜肽，且特別關於一種細胞穿透胜肽，其可治療乳癌。而且，本發明更關於此種細胞穿透胜肽的相關應用。
乳癌為一種常見的惡性腫瘤，且高居全球女性十大癌症死因第四名。早期研究指出乳導管與小葉的突變為主要的影響因素。許多因子可能會誘發突變，如：遺傳、生活習性、病毒感染、菸草的使用、與環境。臨床上，目前主要採用外科手術、化學治療、合併治療等方式施予患者。有趣的是，標靶基因治療的進展使得新藥開發大幅邁進。標靶基因治療包括單株抗體（Her2/neu）與小胜肽的使用。小胜肽具備低毒性、低免疫原性與穩定細胞穿透性，因此對於治療發展而言提供一項令人期待的途徑。
本發明之一目的在於提出一種細胞穿透胜肽，其包括：一如SEQ ID NO：3或6所示的胺基酸序列。
於一較佳實施方式中，所提的細胞穿透胜肽為由如SEQ ID NO：3或6所示之胺基酸序列所組成的。
本發明之另一目的在於提出一種核酸分子，其包括：一用以編碼前述細胞穿透胜肽之胺基酸序列的核苷酸序列。
本發明之再一目的在於提出一種細胞，其包括：前述的細胞穿透胜肽。
於一較佳實施方式中，所提的細胞包括：前述的核酸分子。
於另一較佳實施方式中，所提的細胞為原核細胞或真核細胞。
本發明之又一目的在於提出一種前述細胞穿透胜肽或核酸分子用於製備治療乳癌之藥劑的用途。
於一較佳實施方式中，所提的藥劑為透過血管內、椎管內、肌肉內、皮下、腹膜內、口服、直腸、陰道、鼻部、或腫瘤之途逕投予至一有此治療需求的個體內。
於另一較佳實施方式中，所提的藥劑可抑制乳癌細胞的生長、增生、侵襲、遷移、及/或群落成形。
於又一較佳實施方式中，所提的藥劑可促進乳癌細胞的凋亡。
於再一較佳實施方式中，所提的藥劑可抑制β-catenin/TCF4/LEF-1下游基因的表現。
於更一較佳實施方式中，所提的下游基因為BMP4、BTRC、CDKN2A、CLDN1、CLTA4、EDA、EDN1、FGF4、FGF9、FGF18、FOXN1、FST、ID2、IL6、MET、MITF、MYC、MYOG、NANOG、RUNX2、PITX2、SALL4、SOX2、ITAM1、VCAN、VEGFA、或WISP1。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉具體實施例，作詳細說明於下：
材料與方法
《細胞培養與胜肽合成》
MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞購自美國菌種保存中心（American Type Culture Collection），並保存於含10％胎牛血清及5％青黴素-鏈黴素-兩性黴素的DMEM/F12培養液（Life Technologies，格蘭德艾蘭，紐約）中。全部細胞培養於37℃與5％二氧化碳下。下列胜肽委託科羅耐國際股份有限公司（台北，台灣）合成：TAT-NLS-BLBD-1：YGRKKRRQRRRRKRRKADIKSSLVNESEI（SEQ ID NO：1）；TAT-NLS-BLBD-2：YGRKKRRQRRRRKRRKDPQKEKIFAEISHPEEEGDL（SEQ ID NO：2）；TAT-NLS-BLBD-3：YGRKKRRQRRRRKRRKGGGDPELCATDEMIPFKDEG（SEQ ID NO：3）；TAT-NLS-BLBD-4：YGRKKRRQRRRRKRRKMPQLSGGGGG（SEQ ID NO：4）；TAT-NLS-BLBD-5：YGRKKRRQRRRRKRRKGGGDPELC（SEQ ID NO：5）；TAT-NLS-BLBD-6：YGRKKRRQRRRRKRRKATDEMIPF（SEQ ID NO：6）；TAT-NLS-BLBD-6m：YGRKKRRQRRRRKRRKGTDEAAAA（SEQ ID NO：7）；TAT-BLBD-6：YGRKKRRQRRRATDEMIPF（SEQ ID NO：8）；NLS-BLBD-6：RKRRKATDEMIPF（SEQ ID NO：9）。
《細胞生長》
細胞生長為利用2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四氮唑單鈉鹽（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt）與細胞計數套組-8（CCK-8，Sigma）來分析。MCF-7、MDA-MB-231與HEK293細胞種於96孔盤內，並與胜肽TAT-NLS-BLBD-1至6、1μM的雌二醇（17β-estradiol，E2）、1μM的鄰苯二甲酸丁酯苄酯（benzyl butyl phthalate，BBP）及1μM的他莫昔芬（tamoxifen，TAM）作用。再培養48小時後，以細胞計數套組-8分析細胞生長，並用波長450nm的光測量光學密度。生長率以未處理的細胞進行歸一化。
《免疫沉澱與西方點墨》
免疫沉澱與西方點墨如前所述操作（Mol Ther. 2015 Apr;23(4):656-66、Oncotarget. 2015 Jan 1;6(1):494-509）。以4℃PBS（phosphate buffered saline）收集MCF-7與MDA-MB-231細胞，並於冰上以RIPA裂解緩衝液（Millipore，貝德福德，麻薩諸塞州，美國）裂解細胞沉澱物30分鐘。以10,000g轉速離心10分鐘取得裂解後的上層液，並將上層液與G蛋白質（protein G）珠體（Roche，印第安納波利斯，印地安納州）與抗β-catenin抗體作用。然後，進行西方點墨。於西方點墨，細胞萃取蛋白質以SDS-PAGE（SDS-polyacrylamide gel）分離，並用乾式轉移裝置（Bio-Rad）轉漬至硝化纖維膜（nitrocellulose membrane，Millipore）。以5％牛奶緩衝液阻斷非特異結合後，將膜與初級抗體抗TAT（transactivator of transcription）抗體（Santa Cruz Biotechnology，聖塔克魯茲，加利福尼亞州，美國）、抗LEF-1（lymphoid enhancer factor-1）抗體（Epitomics，柏靈格姆，加利福尼亞州，美國）及抗β-catenin抗體（Epitomics，柏靈格姆，加利福尼亞州，美國）作用。這些蛋白質透過ECL（Amersham Pharmacia Biotech）而顯現，並以Bio-Rad化學發光（chemiluminescent）偵測系統偵測。
《免疫螢光、TUNEL染色及鄰位連接分析（proximity ligation assay，PLA）》
MCF-7與MDA-MB-231細胞培養於底部配有玻片的35mm盤內，並以胜肽NLS-BLBD-6、TAT-BLBD-6與TAT-NLS-BLBD-6處理24小時。接著，以4％聚甲醛（paraformaldehyde）固定細胞，再於室溫下以0.2％Triton X-100透化細胞20分鐘。於免疫螢光，玻片與初級抗體抗β-catenin抗體與抗TAT抗體作用6小時，接著與Alexa-488螢光次級抗體作用1小時。於室溫下用DAPI（Sigma，聖路易，密蘇里州）染色細胞核1分鐘。於TUNEL染色，細胞凋亡為參考操作者手冊透過Apo-BrdU-red DNA分裂分析套組（Bio Vision，山景城，加利福尼亞州，美國）來完成。於PLA，蛋白質-蛋白質作用分析為參照操作者手冊利用Duolink ®using PLA ®Technology（Olink Bioscience，烏普薩拉，瑞典）來分析。簡言之，玻片與初級抗體抗β-catenin抗體與抗TAT抗體作用，再與次級抗體Duolink PLA Rabbit MINUS and PLA Mouse PLUS鄰位探針作用。最後，以Duolink偵測試劑套組（Olink Bioscience）來完成鄰位連接。免疫螢光影像與TUNEL染色為顯微鏡（IX-71，Olympus，東京，日本）所拍攝的。
《細胞週期分析》
MCF-7與MDA-MB-231細胞種於6孔盤內24小時，接著將培養液替換成含100μmol/l之胜肽的乾淨培養液。作用24小時後，透過胰蛋白酶處理收集細胞，然後以70％的4℃乙醇固定。於室溫下的暗室內，以50ng/ml的碘化丙啶（propidium iodide）染色細胞內的DNA30分鐘，之後以流式細胞儀（BD Bioscience）測定sub-G1細胞的百分率。
《侵襲、遷移與群落成形分析》
使用具8mm尺寸之孔的通孔反應室（transwell chamber）於體外侵襲分析。MCF-7與MDA-MB-231細胞種於上層反應室，並與胜肽TAT-NLS-BLBD-6及TAT-NLS-BLBD-6m作用。接著，添加10％胎牛血清培養液至下層反應室孔內。24小時後，以4％聚甲醛溶液固定侵襲至下層反應室的細胞，並於37℃下以0.1％結晶紫（crystal violet）染色30分鐘。利用顯微鏡擷取3個任意視野影像，並計算侵襲的細胞個數。於遷移分析，MCF-7與MDA-MB-231細胞種於6孔盤內。24小時後，以10μl的定量吸管尖劃出一人為傷口，再讓傷口於37℃下與TAT-NLS-BLBD-6或TAT-NLS-BLBD-6m作用24小時。用顯微鏡擷取傷口癒合的影像，並以Image J（美國國家衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州，美國）算出傷口癒合的距離。於群落成形分析，MCF-7與MDA-MB-231細胞種於10cm培養盤內，盤內的培養液有TAT-NLS-BLBD-6或TAT-NLS-BLBD-6m。2周後，以4％聚甲醛溶液固定細胞，並於37℃下以0.1％結晶紫染色30分鐘。
《體內腫瘤生長分析》
所有動物實驗均經高雄醫學大學實驗動物照護與使用委員會同意，且遵照核准指南進行。4至5周大的母裸鼠取自於國家實驗動物中心（台北，台灣）。腫瘤異種移植模型為利用皮下注射1x10 7個MCF-7-YFP或MDA-MB-231-GFP細胞至老鼠的右側腹部。將具可見之腫瘤的老鼠以每組5隻隨意分成3組。每隔2天經腫瘤注射控制組胜肽、及0、1、10mg/kg的TAT-NLS-BLBD-6至這些老鼠內，共三十五天。利用體內影像系統（Berthold Technologies，巴特維爾德巴特，德國）分析螢光密度，而裸鼠的腫瘤體積（V）計算如下：V＝長度x（直徑） 2x0.5。於斑馬魚異種栽植，斑馬魚（Danio rerio）養殖於28℃下的氣體反應室，接著依先前所述注射具有TAT-NLS-BLBD-6或控制組胜肽的1x10 4個MCF-7-GFP或MDA-MB-231-GFP細胞至斑馬魚的胚胎內（請參考Nat Protoc. 2007;2(11):2918-23）。注射24與28小時後，使用落射螢光（epifluorescence）顯微鏡測量螢光密度。
《腫瘤的組織研究》
將腫瘤組織切片成5μm厚，並置於顯微鏡的玻片上。參考操作者手冊以Dako LSAB套組（Dako，卡平特里亞，加利福尼亞州）染色組織玻片。使用抗TAT抗體於免疫組織化學中，而細胞核為利用蘇木精與伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色。螢光影像為螢光顯微鏡（IX-71，Olympus，東京，日本）所拍攝的。
《人類寡核苷酸DNA微陣列》
以Trizol試劑（Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）自細胞萃取出總RNA。RNA濃度與純度以OD 260/OD 280值（＞1.8）及OD 260/OD 230值（＞1.6）確認，產量為用Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，聖塔克拉拉，加利福尼亞州，美國）取得。人類全部基因體OneArray ®v6（華聯生物科技，台灣）有32,679個DNA寡核苷酸探針，每個探針設計成正意方向的60-mer。於這些探針之中，31,741個探針對應於RefSeq v51與Ensembl v65資料庫中的標示基因。此外，另有938個控制組探針。基因陣列列表的詳細說明可自http://www.phalanx.com.tw/Products/HOA_Probe.php取得。
《微陣列分析》
利用OneArray ®胺基酸丙烯基aRNA增幅套組（華聯生物科技，台灣）與Cy5染劑（Amersham Pharmacia，皮斯卡特維，紐澤西州，美國）自1μg的總RNA製備出螢光aRNA標的。使用華聯雜交系統將螢光標的雜交至具有華聯雜交緩衝液的人類全部基因體OneArray ®。50℃下雜交16小時後，以3個不同清洗步驟去除非特異連接的標的（第1次清洗為42℃、5分鐘；第2次清洗為42℃、5分鐘及25℃、5分鐘；第3次清洗為浸潤20次）。以離心方式乾燥玻片，並以Agilent G2505C掃描裝置（Agilent Technologies，聖塔克拉拉，加利福尼亞州，美國）掃描。以GenePix 4.1軟體（Molecular Devices）分析各位點的Cy5螢光強度。將各位點的訊號強度載入至Rosetta Resolver System ®（Rosetta Biosoftware）處理。Rosetta Resolver System ®的誤差模式可排除資料中的系統誤差與隨機誤差。過濾掉標記小於0的位點。透過50％中位數比例縮放歸一化法歸一化超過標準的位點。技術上重複的資料透過Pearson相關係數計算來確認再現性（R值＞0.975）。歸化後的位點強度轉換成介於控制組與處理組之間的基因表現log 2比率，其中log 2比率≧1或log 2比率≦1且P值＜0.05的位點可用於後續分析。
《定量RT-PCR》
總RNA為透過Trizol試劑（Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）分離的，並依操作者手冊以Deoxy+Hispec反轉錄酶套組（益生，台北，台灣）反轉錄成cDNA。定量RT-PCR為利用SYBR Green Master套組（Applied Biosystems，斯德哥爾摩，瑞典）分析的，並於Applied Biosystems的LightCycler設備中定量。定量RT-PCR的資料以18S cDNA的量歸一化。
實驗結果
《TAT-NLS-BLBD-6抑制乳癌細胞生長》
首先，成功合成含β-catenin/LEF-1結合區域（BLBD）之胜肽（序列：除了TAT胜肽與NLS胜肽以外者）、TAT胜肽（序列為：YGRKKRRQRRR）與核定位訊號（nuclear localization signal，NLS）胜肽（序列為： RKRRK）的融合胜肽。各個BLBD胜肽取自於LEF-1的前76個胺基酸，可有效地與β-catenin作用。TAT胜肽為取自人類免疫缺陷病毒的細胞穿透胜肽，可短時間內有效地輸送蛋白質、DNA、RNA與奈米粒子至細胞質內。由於穩定的β-catenin可移位至細胞核內來影響TCF-4/LEF-1結合至Wnt標的基因，因此透過合成這些具BLBD胜肽的融合胜肽來分析它們於乳癌細胞核內對β-catenin所調控之訊息傳遞的影響。除了上述的胜肽（SEQ ID NOs：1至6）外，還化學合成一具突變BLBD-6胜肽的融合胜肽（SEQ ID NO：7），以確認所有融合胜肽抑制乳癌細胞生長的能力。為此，採用細胞生長分析。結果顯示合成胜肽TAT-NLS-BLBD-3與TAT-NLS-BLBD-6可抑制MCF-7與MDA-MB-231細胞的生長（圖1A）。TAT-NLS-BLBD-3與TAT-NLS-BLBD-6具有共同序列ATDEMIPF，此為BLBD的活性區域序列。因此，TAT-NLS-BLBD-6m乃針對此活性區域序列進行突變，其不影響乳癌細胞的生長（圖1A）。因此，BLBD的這段活性區域對於乳癌細胞的生長為有影響的。
接著，分析TAT-NLS-BLBD-6對乳癌細胞生長的影響是否為劑量依賴的或時間依賴的。如圖1B、C，確實屬劑量依賴的及時間依賴的。另分析TAT-NLS-BLBD-6結合不同藥物後對乳癌細胞的影響。可發現：TAT-NLS-BLBD-6會抑制E2與BBP的活性，但反而提高TAM對乳癌細胞的反應（圖1D）。再者，令人感到有趣的是，TAT-NLS-BLBD-6無法抑制人類正常乳腺上皮細胞H184B5F5/M10與人類胚腎細胞HEK293的生長（圖1E）。綜上，TAT-NLS-BLBD-6中的BLBD活性區域能抑制乳癌細胞的生長，但不影響正常細胞（如：H184B5F5/M10與HEK293細胞）的生長。
《TAT-NLS-BLBD-6於細胞核內特異地結合至β-catenin》
雖然TAT-NLS-BLBD-6可抑制乳癌細胞的生長，但於體外是否能進入細胞核內與β-catenin結合仍為未知。於是，分析TAT-NLS-BLBD-6於細胞內的分布。如免疫螢光染色所示，TAT-NLS-BLBD-6（100μmol/l）位於乳癌細胞核內（圖2A）。然後，以免疫沉澱與PLA分析胜肽-蛋白質的作用。結果顯示TAT-NLS-BLBD-6可於MCF-7與MDA-MB-231的細胞核內與β-catenin結合（圖2B、C）。
《TAT-NLS-BLBD-6誘發細胞凋亡，並抑制侵襲、遷移與群落成形》
進一步研究這些胜肽的其他生物特性。首先，以流式細胞儀與TUNEL分析控制組、TAT-NLS-BLBD-6與TAT-NLS-BLBD-6m的細胞凋亡。由流式細胞儀結果可知，相較於控制組與TAT-NLS-BLBD-6m，TAT-NLS-BLBD-6造成MCF-7細胞中的sub-G1時期區域（凋亡前的影響）自7.35％增加到37.41％，而MDA-MB-231細胞中的區域自18.34％增加至43.10％（圖3A）。TUNEL結果更顯示當與控制組及TAT-NLS-BLBD-6m比較，TAT-NLS-BLBD-6可於乳癌細胞內提升BrdU與DNA碎片的結合（圖3B）。另根據侵襲、遷移與群落成形分析的結果，相較於控制組與TAT-NLS-BLBD-6m，TAT-NLS-BLBD-6可抑制乳癌細胞的移動與增生（圖3C至E）。此外，還選用正常細胞H184B5F5/M10來觀察TAT-NLS-BLBD-6對其表型特徵（如：細胞週期、細胞凋亡、侵襲、遷移、與群落成形）的影響。結果顯示TAT-NLS-BLBD-6對這些表型特徵並無影響。依上，TAT-NLS-BLBD-6具有潛力用來調控乳癌細胞的生物功能。
《TAT-NLS-BLBD-6於異種移植與異種栽植模型中抑制腫瘤生長》
為了瞭解TAT-NLS-BLBD-6於體內的影響，建立裸鼠異種移植模型與斑馬魚異種栽植模型。於異種移植中，皮下注射1x10 7個MCF-7-YFP與MDA-MB-231-GFP細胞至裸鼠的右側腹部。於注射後的1周，經腫瘤注射控制組胜肽、TAT-NLS-BLBD-6m（1mg/kg）、與TAT-NLS-BLBD-6（1、10mg/kg），並於腫瘤注射後的第35天以體內影像系統分析螢光密度。與控制組胜肽比較後，TAT-NLS-BLBD-6抑制腫瘤生長但不影響體重（圖4A、B）。此外，腫瘤切片為YFP或GFP陽性，可證實腫瘤源自所注射的乳癌細胞。免疫化學染色顯示：與控制組胜肽比較下，TAT為高表現的並存在於注射有TAT-NLS-BLBD-6之腫瘤的細胞核內（圖4C）。
於異種栽植中，共同注射1x10 4個MCF-7-YFP與MDA-MB-231-GFP細胞、及TAT-NLS-BLBD-6m與TAT-NLS-BLBD-6（100μmol/l）至斑馬魚胚胎的卵黃囊內。於注射後0、24與48小時，以螢光顯微鏡擷取螢光密度（圖5A）。相較於TAT-NLS-BLBD-6m組，在24至48小時之間TAT-NLS-BLBD-6組的螢光密度逐漸減少（圖5B、C）。綜上，TAT-NLS-BLBD-6提供一有潛力之用於抑制乳癌細胞生長但不影響體重的治療策略。
《確認TAT-NLS-BLBD-6與β-catenin/TCF4/LEF-1複合體中的下游基因》
以上顯示TAT-NLS-BLBD-6可與β-catenin結合。為了確認其是否會影響β-catenin/TCF4/LEF-1的下游基因，取得TAT-NLS-BLBD-6與TAT-NLS-BLBD-6m處理過之乳癌細胞的RNA樣本人類全球基因表現譜（圖6A）。這些表現譜資料為利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）軟體分析。於結果中，共有27個基因於MCF-7與MDA-MB-231細胞中向下調控，且已確認為β-catenin/TCF4/LEF-1下游基因，這些基因為BMP4、BTRC、CDKN2A、CLDN1、CLTA4、EDA、EDN1、FGF4、FGF9、FGF18、FOXN1、FST、ID2、IL6、MET、MITF、MYC、MYOG、NANOG、RUNX2、PITX2、SALL4、SOX2、ITAM1、VCAN、VEGFA與WISP1。接著，利用定量RT-PCR確認乳癌細胞內的基因表現譜。於MCF-7（圖6B）與MDA-MB-231細胞（圖6C）中，這27個候選基因的表現於TAT-NLS-BLBD-6處理後較於TAT-NLS-BLBD-6m處理後相對的低。總括來說，TAT-NLS-BLBD-6可抑制β-catenin/TCF4/LEF-1的下游基因。
《TAT-NLS-BLBD-6之下游基因的訊息途徑》
為進一步瞭解這些TAT-NLS-BLBD-6所向下調控之基因的訊息途徑、及細胞與分子功能，IPA軟體確認出前二大途徑為乳癌細胞內的IL-9（p＝2.4E-02，11.8％）與HER-2訊息途徑（p＝3.76E-02，7.9％）。此外，IPA軟體所確認出的前五大功能為脂肪代謝（p＝3.45E-05至4.84E-02）、分子輸送（p＝3.45E-05至4.84E-02）、小分子生化（p＝3.45E-05至4.84E-02）、細胞發育（p＝1.35E-04至4.88E-02）、及細胞生長與增生（p＝1.35E-04至4.81E-02）。為進一步研究TAT-NLS-BLBD-6是否會調控HER-2訊息途徑，使用HER2陽性細胞ZR-75-30來分析TAT-NLS-BLBD-6處理此細胞後的生長能力與下游基因的表現。結果顯示TAT-NLS-BLBD-6可於ZR-75-30細胞中抑制細胞生長（圖6D）以及β-catenin/TCF4/LEF-1下游基因的表現（圖6E）。總之，IPA軟體的證據提出TAT-NLS-BLBD-6會於乳癌細胞中影響免疫反應、細胞發育、生長與增生。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
圖1A為一長條圖，說明不同胜肽處理後之MCF-7與MDA-MB-231細胞的生長。 圖1B為一長條圖，說明不同濃度TAT-NLS-BLBD-6處理不同時間後之MCF-7細胞的生長。 圖1C為一長條圖，說明不同濃度TAT-NLS-BLBD-6處理不同時間後之MDA-MB-231細胞的生長。 圖1D為一長條圖，說明不同物質處理48小時後之MCF-7與MDA-MB-231細胞的生長。 圖1E為一長條圖，說明不同濃度TAT-NLS-BLBD-6處理48小時後之人類正常乳腺上皮細胞H184B5F5/M10與人類胚腎細胞HEK293的生長。 圖2A為一免疫螢光染色照片圖，說明TAT-NLS-BLBD-6於MCF-7與MDA-MB-231細胞內的分布，其中箭頭指出其位於細胞核內。 圖2B為一免疫沉澱結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6於MCF-7細胞內與β-catenin結合。 圖2C為一鄰位連接分析結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6於MCF-7及MDA-MB-231細胞內與β-catenin結合，其中箭頭指出結合發生於細胞核內。 圖3A為一流式細胞儀結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6對MCF-7及MDA-MB-231細胞週期的影響。 圖3B為一TUNEL結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6對MCF-7及MDA-MB-231細胞凋亡的影響。 圖3C為一侵襲分析結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6對MCF-7及MDA-MB-231細胞移動的影響。 圖3D為一傷口閉合結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6對MCF-7及MDA-MB-231細胞移動的影響。 圖3E為一群落成形結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6對MCF-7及MDA-MB-231細胞增生的影響。 圖4A為一GFP影像照片圖，說明TAT-NLS-BLBD-6於異種移植模型中對腫瘤生長的影響。 圖4B為一曲線圖，說明TAT-NLS-BLBD-6於異種移植模型中對腫瘤體積與個體重量的影響。 圖4C為一免疫化學染色結果圖，說明TAT-NLS-BLBD-6於異種移植模型中位於腫瘤的細胞核內。 圖5A為一流程圖，說明斑馬魚異種栽植模型的建立。 圖5B為一螢光顯微鏡照片圖，說明TAT-NLS-BLBD-6於異種栽植模型中對細胞生長的影響。 圖5C為一長條圖，說明圖5B的螢光定量結果。 圖6A為一人類全球基因表現譜，其為分析TAT-NLS-BLBD-6與TAT-NLS-BLBD-6m處理過之乳癌細胞的RNA樣本而取得的。 圖6B為一長條圖，呈現TAT-NLS-BLBD-6於MCF-7細胞中所向下調控的基因。 圖6C為一長條圖，呈現TAT-NLS-BLBD-6於MDA-MB-231細胞中所向下調控的基因。 圖6D為一長條圖，說明TAT-NLS-BLBD-6對HER2陽性細胞ZR-75-30生長的影響。 圖6E為一長條圖，呈現TAT-NLS-BLBD-6於HER2陽性細胞ZR-75-30中所向下調控的基因。
＜110＞高雄醫學大學 ＜120＞用於治療乳癌的細胞穿透胜肽及其應用 ＜160＞9 ＜210＞1 ＜211＞29 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Ala Asp Ile Lys Ser Ser Leu Val Asn Glu Ser Glu Ile 20 25 ＜210＞2 ＜211＞36 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Asp Pro Gln Lys Glu Lys Ile Phe Ala Glu Ile Ser His Pro Glu Glu 20 25 30 Glu Gly Asp Leu 35 ＜210＞3 ＜211＞36 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asp Pro Glu Leu Cys Ala Thr Asp Glu Met Ile Pro Phe 20 25 30 Lys Asp Glu Gly 35 ＜210＞4 ＜211＞26 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Met Pro Gln Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 ＜210＞5 ＜211＞24 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asp Pro Glu Leu Cys 20 ＜210＞6 ＜211＞24 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞6 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Ala Thr Asp Glu Met Ile Pro Phe 20 ＜210＞7 ＜211＞24 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Gly Thr Asp Glu Ala Ala Ala Ala 20 ＜210＞8 ＜211＞19 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞8 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Thr Asp Glu Met 1 5 10 15 Ile Pro Phe ＜210＞9 ＜211＞13 ＜212＞PRT ＜213＞人工序列 ＜220＞ ＜223＞ ＜400＞9 Arg Lys Arg Arg Lys Ala Thr Asp Glu Met Ile Pro Phe 1 5 10

Claims (11)

  1. 一種細胞穿透胜肽，係由一如SEQ ID NO：3或6所示的胺基酸序列所組成的。
  2. 一種核酸分子，係包括：一核苷酸序列，係用以編碼一如請求項第1項所述之細胞穿透胜肽。
  3. 一種細胞，係包括：一如請求項第1項所述之細胞穿透胜肽。
  4. 如請求項第3項所述之細胞，更包括：一如請求項第3項所述之核酸分子。
  5. 如請求項第3項所述之細胞，係原核細胞或真核細胞。
  6. 一種如請求項第1項所述之細胞穿透胜肽用於製備治療乳癌之藥劑的用途。
  7. 如請求項第6項所述之用途，其中該藥劑係透過血管內、椎管內、肌肉內、皮下、腹膜內、口服、直腸、陰道、鼻部、或腫瘤之途逕投予至一有該治療需求的個體內。
  8. 如請求項第6項所述之用途，其中該藥劑用於抑制乳癌細胞的生長、增生、侵襲、遷移、及/或群落成形。
  9. 如請求項第6項所述之用途，其中該藥劑用於促進乳癌細胞的凋亡。
  10. 如請求項第6項所述之用途，其中該藥劑用於抑制β-catenin/TCF4/LEF-1下游基因的表現。
  11. 如請求項第10項所述之用途，其中該下游基因為BMP4、BTRC、 CDKN2A、CLDN1、CLTA4、EDA、EDN1、FGF4、FGF9、FGF18、FOXN1、FST、ID2、IL6、MET、MITF、MYC、MYOG、NANOG、RUNX2、PITX2、SALL4、SOX2、ITAM1、VCAN、VEGFA、或WISP1。
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