CN111575232A - JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用 - Google Patents

JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了JQ1在抑制T淋巴细胞PD‑1和/或Tim‑3表达中的应用，属于生物医药领域。本发明首次提出BRD4抑制剂JQ1可以下调T细胞中免疫检查点PD‑1和/或Tim‑3的表达，并在Jurkat T细胞、健康人和血液肿瘤患者CD4+T细胞、CD8+T细胞中进行了验证。本发明对于肿瘤T细胞免疫治疗提供了一个新的思路和方法，具有很大的应用前景和经济价值。

Description

JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用。
背景技术
血液肿瘤亦称恶性血液病，主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤等，是严重威胁人类健康的恶性疾病。目前血液肿瘤常规的治疗手段是化疗与放疗，但因其对正常细胞伤害大，副作用多，并常出现耐药、易复发等不足，限制了治疗的效果。研究发现，血液肿瘤中T细胞常处于衰老、耗竭状态，严重影响了T细胞的杀伤功能。所以科学家提出了免疫治疗的方向，并且近些年来免疫治疗逐渐发展成为血液肿瘤治疗的重要手段。免疫治疗是一种通过激活体内免疫细胞，增强机体抗肿瘤免疫应答的治疗方式，其主要机制之一为克服肿瘤免疫逃逸。
T细胞耗竭是发生免疫逃逸的关键因素，而免疫检查点表达升高是T细胞耗竭的一个重要表型。免疫检查点是免疫细胞上的抑制性受体，其在正常免疫微环境中是人体免疫系统中的保护分子，起类似刹车的作用，能防止免疫细胞过度激活，减少免疫反应对周围组织的损伤，避免发生自身免疫疾病。然而在肿瘤微环境中其表达明显上调，当它与配体结合后，可激活其相应信号通路，抑制免疫细胞活化或诱导免疫细胞耗竭，阻止免疫细胞的抗肿瘤活性，促进了肿瘤细胞的生长与增殖。
PD-1/PD-L1通路是免疫检查点调节中关键的信号通路，PD-1/PD-L1通路的激活，能抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。但是临床研究发现，当使用PD-1抗体截断PD-1的通路时，能部分逆转T细胞的失能。目前PD-1抗体已在临床上获批使用，在多种实体瘤治疗中取得良好疗效，在急性髓系白血病和多发性骨髓瘤等多种血液肿瘤体外研究中也展现出很强的抗肿瘤能力。但是PD-1抗体因其自身特性，用药方式单一，只能通过静脉给药，另外，其自身带有的免疫原性可能会引起不必要的免疫应答。更关键的一点是PD-1抗体治疗费用昂贵，病人经济负担极重，据统计，PD-1抗体治疗中每个病人的花费为100,000-250,000美元。因此，找到能抑制PD-1信号通路的可口服小分子药物日趋迫切。
Tim-3与PD-1同为T细胞免疫抑制性受体，它被称为PD-1的“神仙伴侣”。在黑色素瘤患者T细胞中发现Tim-3与PD-1共表达，有研究发现在PD-1抗体治疗的小鼠体内发现，当肿瘤小鼠对PD-1治疗耐药时，T细胞Tim-3表达明显增高，这提示PD-1抗体治疗耐药与T细胞Tim-3的表达升高有关。近年来，多个实验进一步证实抑制Tim-3的表达可增强PD-1抗体的抗肿瘤作用。Tim-3抗体与PD-1抗体联合时，可明显克服PD-1治疗耐药。
BRD4抑制剂JQ1((S)-(+)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-F][1,2,4]三唑并[4,3-A][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酸叔丁酯，C23H25ClN4O2S)是2011年发现的分子药物，它是BRD4的特异性抑制剂。JQ1在直接抑制肿瘤细胞方面的研究较深入，它可通过抑制c-Myc基因的转录来抑制恶性肿瘤的发展。近几年，有研究发现JQ1在肿瘤免疫调节中同样有重要的作用，如有研究发现它能直接抑制肿瘤细胞中PD-L1的表达，并且还有研究者发现它能通过调节CD8+干细胞样T细胞和记忆T细胞的功能特性，增强T细胞的抗肿瘤活性。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用。所述的应用为非疾病治疗和诊断目的的用途。
JQ1在制备具有抑制T淋巴细胞中PD-1和/或Tim-3表达的功能的产品中的应用。
JQ1在制备具有逆转肿瘤T淋巴细胞耗竭表型的功能的产品中的应用。
所述的逆转是指肿瘤T淋巴细胞中PD-1阳性细胞、Tim-3阳性细胞和PD-1/Tim-3双阳性细胞中的至少一种细胞比率下降。
所述的肿瘤包括但不限于血液肿瘤。
所述的血液肿瘤包括但不限于白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
一种抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达的方法，是通过JQ1干预T淋巴细胞实现；具体操作为：在含有JQ1和T淋巴细胞激活剂的培养基中培养T淋巴细胞。所述的方法为非疾病治疗和诊断目的的研究方法。
所述的T淋巴细胞激活剂优选为植物血凝素(PHA)，或佛波脂(PMA)和离子霉素(Ionomycin)的混合物。
所述的植物血凝素的工作浓度优选为100～300μg/ml；更优选为150μg/ml。
所述的佛波脂的工作浓度优选为15～25ng/ml；更优选为20ng/ml。
所述的离子霉素的工作浓度优选为0.1～1μg/ml；更优选为0.5μg/ml。
所述的JQ1的工作浓度优选为0.1～5μM；更优选为0.5μM。
所述的T淋巴细胞的占比优选为0.1×106～0.5×106个/mL培养基；更优选为0.25×106个/mL培养基。
所述的培养的时间优选为24～72h；更优选为24h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明首次明确BRD4抑制剂JQ1下调T细胞中PD-1的表达，在Jurkat T细胞、健康人和血液肿瘤患者CD4+T细胞、CD8+T细胞中进行了验证；
2.本发明首次明确BRD4抑制剂JQ1下调T细胞中Tim-3的表达，在Jurkat T细胞和血液肿瘤患者CD4+T细胞、CD8+T细胞中进行了验证；
3.本发明对于血液肿瘤的T细胞免疫治疗疗法提供了一个新的思路和方法，具有很大的应用前景和经济价值。
附图说明
图1是在Jurkat T细胞中进行17种分子药物的筛选结果图；其中，A表示各分子药物对基础状态下的Jurkat T细胞PD-1表达的影响，B表示各分子药物对经PHA激活下JurkatT细胞PD-1表达的影响。
图2是在T细胞中研究JQ1与PD-1表达关系的实验结果图；其中，A～B表示不同JQ1浓度对Jurkat T细胞的PD-1表达的影响，C～D表示JQ1的干预时长对Jurkat T细胞的PD-1表达的影响，E表示JQ1对不同浓度的PHA诱导激活的Jurkat T细胞的PD-1表达的影响，F表示JQ1对PHA诱导激活的正常人CD8+T细胞中PD-1表达的影响，G表示JQ1对P/I诱导激活的正常人CD8+T细胞中PD-1表达的影响，H表示JQ1对P/I诱导激活的正常人CD4+T细胞中PD-1表达的影响。
图3是在Jurkat T细胞中研究JQ1对Tim-3表达影响的实验结果图：A为转录组测序结果图，B为流式细胞术检查Jurkat T细胞中Tim-3表达情况的结果图。
图4是在淋巴瘤、AML和CML患者T细胞中研究JQ1对PD-1和Tim-3表达的影响的实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下述实施例中涉及的实验材料：
Jurkat T细胞株：购自美国ATCC公司，并根据ATCC协议进行维护。
CD4+T细胞、CD8+T细胞：为广东省广州市暨南大学数名20-35岁健康供者提供的外周血分选出来的CD4+T细胞和CD8+T细胞(所用收集的样本均告知志愿者研究目的和签署知情同意书)；
CD3+T细胞：为通过暨南大学第一附属医院收集初发淋巴瘤、AML(急性髓细胞性白血病)、CML(慢性粒细胞白血病)和MM(多发性骨髓瘤)患者的骨髓标本分选出来的CD3+T细胞(所用收集的样本均告知患者研究目的和签署知情同意书，样本的收集是在病人入院后需要抽血或骨髓穿刺进行疾病诊治相关检查时完成)；
Jurkat T细胞培养基：含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基；
CD4+T细胞和CD8+T细胞培养基：含5％胎牛血清、10ng/ml白细胞介素-2(IL-2)和1×支原体抗生素(弗德生物，货号：FD3001)的RPMI1640培养基；
CD3+T细胞培养基：含5％胎牛血清、10ng/ml IL-2的RPMI1640培养基。
下述实施例中涉及的实验方法：
1.细胞培养
(1)Jurkat T细胞培养：将Jurkat T细胞接种于Jurkat T细胞培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，2-3天传代一次，得到处于对数生长期中的Jurkat T细胞待用。
(2)CD4+T细胞、CD8+T细胞培养：将分选完毕的CD4+T细胞、CD8+T细胞接种于CD4+T细胞和CD8+T细胞培养基中，按T细胞扩增试剂盒(Miltenyi)说明书对CD4+T细胞和CD8+T细胞扩增培养，2-3天换液一次，扩增激活6天后细胞可用，在3周内将细胞使用完毕。
(3)CD3+T细胞培养：将分选完毕的CD3+T细胞接种于CD3+T细胞培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中静置2小时后待用。
2.流式细胞术
(1)将孔板里的细胞悬液转移至15ml离心管中；
(2)4℃、1500rpm离心5min；
(3)去上清，加入1ml 1×PBS(pH＝7.4)，重悬细胞后转移至1.5ml离心管中；
(4)同等条件下离心；
(5)使用PBS-BSA(1％BSA)与流式抗体按说明书推荐配置抗体稀释液，每1个样本需要100μl抗体稀释液；
(6)待步骤(4)中的离心管离心完毕后，去上清，加入100μl步骤(5)中的抗体稀释液；
(7)4℃避光孵育30min；
(8)孵育完毕后在每个离心管中加入500μl 1×PBS，同等条件下离心；
(9)去上清，加入100～200μl 1×PBS重悬细胞后，使用流式仪检测所测分子表达情况。
3.RNA提取
(1)试剂准备：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75％乙醇(DEPC水配置)、无水乙醇、DEPC水；
(2)样品处理：收取1～5×106个细胞于1.5ml离心管中，用1×PBS洗一遍后，加入1ml Trizol，迅速吹打裂解，室温静置10min后待用或放于-20℃冰箱中储存；
(3)在每个样品中加入200μl氯仿，震荡混匀15秒，室温静置3min；
(4)4℃、13000rpm离心15min。离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层；
(5)使用200μl的枪头小心吸取上层无色水相(约吸取400μl)至新的干净无菌的1.5ml EP管中；
(6)加入500μl异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min或以上；
(7)4℃、13000rpm离心15min；
(8)弃上清，加入1ml 75％乙醇，上下颠倒将沉淀悬浮起来；
(9)4℃、7500rpm离心5min；
(10)重复步骤(8)-(9)1次；
(11)弃上清，加入1ml无水乙醇，上下颠倒将沉淀悬浮起来；
(12)4℃、7500rpm离心5min；
(13)弃上清，室温放置干燥，大约晾5～10min；
(14)加入适量DEPC水溶解RNA(20～50μl/管)，-80℃冰箱保存或待用。
4.荧光实时定量PCR检测(RT-PCR)
(1)将RNA按逆转录试剂盒说明书推荐步骤合成cDNA；
(2)RT-PCR总反应体积为20μl，包括10μl 2×SYBR Green Mix、1μl上游引物(10μmol/μl)、1μl下游引物(10μmol/μl)、1μl cDNA，DEPC水补足至20μl；
(3)荧光定量仪反应条件为：95℃预变性15min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行40次循环；溶解曲线起始温度为70℃，每5s升高0.5℃，至95℃结束。
(4)使用2-ΔΔCT法计算基因表达量差异。
表1实时荧光定量PCR检测相关基因的引物
Figure BDA0002493463920000051
Figure BDA0002493463920000061
5.原代T细胞分选
(1)物资准备：淋巴分离液(天津TBD,Cat：LTS1077)、分选buffer、15ml离心管、MACS(磁珠)分选器、分选柱子、吸管、40μM滤网、50ml离心管，外周血或骨髓样本；
(2)在15ml离心管中加入2倍血量体积的淋巴分离液；
(3)采血管中加入与血量相等体积的分选buffer，用吸管轻柔吹打混匀；
(4)将步骤(3)中稀释的血液转移至淋巴分离液上方；
(5)25℃，2500rpm，离心15min；
(6)新的15ml离心管中加入2ml分选buffer液；
(7)把离心完毕的离心管里第1与第3层间的白膜用吸管吸至上步骤的分选buffer液中；
(8)用分选buffer补全液体至10ml；
(9)4℃、1500rpm，离心7min；
(10)弃去上清液(50ml离心管中)，加入5ml新的buffer液，吹打混匀；
(11)取一支新的15ml离心管，在上方放置一个40μm的滤网，将上步骤的细胞悬液通过滤网过滤，转移至新的离心管中，取20μl出来细胞计数；
(12)同等条件下再次离心；
(13)弃上清，细胞计数后，每107个细胞中加入80μl buffer、20μl分选抗体(CD3、CD4、CD8抗体均购自MACS品牌，货号分别为130-050-101、130-045-101、130-045-201)；
(14)4℃孵育15min；
(15)加入5ml分选buffer终止孵育，同等条件下再次离心；
(16)安装分选柱，加入1～4ml分选buffer洗柱子；
(17)离心完毕后，弃上清，加入3ml(LS规格柱子)或500μl(MS规格柱子)分选buffer重悬细胞；
(18)洗完柱子后，安装分选柱，下方放一根新的15ml离心管(收集废液)，将细胞重悬液转移至柱子里进行分选(分选除的细胞已被黏附在磁铁上)；
(19)重悬液滴至上方圈子时，加入3ml(LS规格柱子)或500μl(MS规格柱子)分选buffer洗细胞×3次；
(20)将柱子转移至新的15ml离心管中，加入3ml(LS规格柱子)或500μl(MS规格柱子)分选buffer，用柱筒快速将液体打至离心管里；
(21)将细胞离心后转移至完全培养基里，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
实施例1
在Jurkat T细胞中筛选抑制PD-1表达的分子药物
1.药物准备
将以下表2中分子药物原液用1×PBS稀释成工作液浓度的1000倍浓度，作为药物的储存液，PHA(植物血凝素)则用1×PBS(pH＝7.4)稀释为150μg/ml的储存液浓度，空白对照组和DMSO组作为对照组。
表2分子药物
分子药物 产品描述 靶点 工作浓度(pM)
Forskolin 腺苷酸环化酶激活剂 腺苷酸环化酶 1.0
SP600125 JNK抑制剂 JNK1，JNK2，Aurora A，TrkA，JNK3 10.0
PD 98,059 MEK抑制剂 MEK1 10.0
GSK-LSD12HCl LSD1抑制剂 LSD1 0.5
AG-490 EGFR抑制剂 EGFR 20.0
IFN-Y 细胞因子 IFN-γ受体 20.0ng/ml
BAY 11-7082 NF-KB抑制剂 E2-conjugating酶，IKBa磷酸化 3.0
GSK126 EZH2甲基转移酶抑制剂 EZH2 1.0
LY294002 PI3Kα/δ/β抑制剂 P110α，p110δ，p110β，DNA-PK 10.0
Paclitacel 微管聚合物稳定剂 微管(人内皮细胞) 0.1
Etoposide DNA合成酶抑制剂 TopoII 0.1
JQ1 溴结构域抑制剂 BRD2，BRD3，BRD4，BRDT(BET) 0.1
Fludarabine STAT1激活抑制剂 STAT1 0.5
Oltipraz Nrf2激活剂 Nrf2 10.0
Selumetinib MEK抑制剂 MEK1.MEK2.MEK3 0.1
5’AZA DNA甲基转移酶活性抑制剂 DNMTs 1.0
ATRA 维甲酸受体(RAR)和维甲酸X受体(RXR)配体 RAR，RAX 1.0
2.准备7.6×106个处于对数生长期的Jurkat T细胞
3.使用分子药物干预Jurkat T细胞
(1)在15ml离心管中加入10ml完全培养基和40μl 150μg/ml PHA，得到PHA溶液；
(2)取18个1.5ml离心管，其中1个管中加入1.1ml完全培养基和4.4μl DMSO，得到DMSO溶液；其余17个管分别加入1.1ml完全培养基和4.4μl分子药物储存液，得到17种分子药物溶液。
(3)取2个干净无菌的24孔板，分别标上1、2号板；
(4)在1号板中前19个孔分别加入0.5ml完全培养基，在2号板中前19个孔分别加入0.5ml步骤(1)中的PHA溶液；
(5)在1、2号板中前19个孔依次加入0.5ml完全培养基、0.5ml步骤(2)中的DMSO溶液与0.5ml步骤(2)中的分子药物溶液；
(6)在1、2号孔中分别加入1ml含2×105个细胞的细胞悬液；
(7)吹打混匀后，放进37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。
4.24小时后收取细胞，使用流式细胞仪检测细胞PD-1的表达情况。
实验结果：检测结果如图1所示：图1A表示各分子药物对基础状态下的Jurkat T细胞PD-1表达的影响；图1B表示各分子药物对经PHA激活下Jurkat T细胞PD-1表达的影响。检测结果提示分子药物PD98，095与JQ1无论在Jurkat T细胞基础状态下或激活状态下均能抑制PD-1的表达。
实施例2
根据实施例1的研究结果，JQ1因其具有免疫调节的特性被作为重点检测对象。在Jurkat T中进一步验证JQ1与PD-1的关系，并在CD8+T细胞和CD4+T细胞中验证JQ1对PD-1表达的影响。
1.不同JQ1浓度对Jurkat T的PD-1表达的影响
(1)将JQ1的原液用DMSO分别稀释成0.01mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的储存液；
(2)将PHA用1×PBS(pH＝7.4)稀释成150μg/ml的储存液；
(3)在15ml离心管中加入8ml完全培养基和32μl 150μg/ml PHA(工作液浓度为0.5ng/ml)；
(4)取7个5ml离心管，其中1个管中加入2.1ml完全培养基和8.4μl DMSO，得到DMSO溶液；其余6个管分别加入2.1ml完全培养基和8.4μl步骤(1)中不同浓度的JQ1储存液(工作液分别为0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM)，吹打混匀，得到不同浓度的JQ1溶液。
(5)取2个干净无菌的12孔板，分别标注1、2号板；
(6)在1、2号板前7孔中分别依次加入1ml步骤(4)中的DMSO溶液和不同浓度的JQ1溶液；
(7)在1号板中前7孔分别加入2ml完全培养基，2号板前7孔分别加入1ml步骤(3)中的PHA溶液和1ml完全培养基；
(8)在1、2号板前7孔中分别加入1ml含1×106个细胞的细胞悬液；
(9)吹打混匀后，放进37℃、5％CO2培养箱中培养24小时；
(10)收取细胞进行流式检测和提取RNA进行RT-PCR检测。
2.JQ1的干预时长对Jurkat T的PD-1表达的影响
(1)根据上方实验的结果，确定将0.5μM作为JQ1后续实验浓度，准备好0.5mM浓度的JQ1；
(2)将PHA用1×PBS稀释成150μg/ml的储存液；
(3)在3支15ml离心管中各加入13ml完全培养基，再分别加入65μl 150μg/ml PHA(工作液浓度为150ng/ml)、DMSO和0.5mM JQ1(工作液浓度为0.5μM)，反复吹打混匀，分别得到PHA溶液、DMSO溶液和JQ1溶液；
(4)取出4个6孔板，分别标注1、2、3、4号板，在每号板的6个孔上分别标注0h、6h、12h、24h、48h、72h，代表干预时长；
(5)在1、3号板各孔中分别加入1ml步骤(3)中配置的DMSO溶液，2、4号板各孔中分别加入1ml步骤(3)中配置的JQ1溶液，在3、4号板中加入1ml步骤(3)中配置的PHA溶液；
(6)在1、2号板中加入3ml完全培养基，3、4号板中加入2ml完全培养基；
(7)在1-4号板各孔中加入1ml含1×106个细胞的细胞悬液；
(8)吹打混匀后，放进37℃、5％CO2培养箱中培养；
(9)按孔板中各孔标注的干预时长，到时间点后收取细胞进行流式检测和提取RNA进行RT-PCR检测。
3.JQ1对不同浓度PHA诱导激活的Jurkat T细胞PD-1表达的影响
(1)准备对数生长期的Jurkat T细胞；
(2)配置好0.5mM的JQ1储存液和以下浓度的PHA：50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、300μg/ml；
(3)在2支干净无菌的15ml离心管中各加入5.5ml完全培养基，再分别加入22μlDMSO与0.5mM JQ1(工作液为0.5μM)，吹打混匀，分别得到DMSO溶液和JQ1溶液；
(4)在4支干净无菌的5ml离心管中各加入2.1ml完全培养基，再分别加入8.4μl 50μg/ml(工作液为50ng/ml)、100μg/ml(工作液为100ng/ml)、150μg/ml(工作液为150ng/ml)、300μg/ml的PHA(工作液为300ng/ml)，吹打混匀，得到不同工作液浓度的PHA溶液；
(5)取1个干净无菌的12孔板，分别标上“1、2、3、4、5、6、7、8、9、10”号；
(6)在1、3、5、7、9孔中分别加入1ml步骤(3)中的DMSO溶液，在2、4、6、8、10孔中分别加入1ml步骤(3)中的JQ1溶液；
(7)在1、2孔中各加入1ml完全培养基，在3、4孔中各加入1ml步骤(4)中50μg/mlPHA溶液，在5、6孔中各加入1ml步骤(4)中100μg/ml PHA溶液，在7、8孔中各加入1ml步骤(4)中150μg/ml PHA溶液，在9、10孔中各加入1ml步骤(4)中300μg/ml PHA溶液；
(8)在各孔中再加入1ml完全培养基和1ml含1×106个细胞的细胞悬液；
(9)吹打混匀后，放进37℃、5％CO2培养箱中培养24小时；
(10)收取细胞进行流式细胞术检测PD-1表达情况。
4.JQ1对CD4、CD8细胞PD-1表达的影响
(1)准备处于对数生长期的CD4、CD8 T细胞；
(2)配置好0.5mM的JQ1储存液和150ng/ml PHA储存液；
(3)在3支5ml离心管中各加入2.1ml完全培养基，再分别加入12.6μl DMSO、JQ1储存液(工作液浓度为0.5μM)和PHA储存液(工作液浓度为150ng/ml)，吹打混匀，分别得到DMSO溶液、JQ1溶液和PHA溶液；
(4)取一块干净无菌的12孔板，第一行标以“CD8”用以干预CD8+T细胞，第3行标以“CD4”用以干预CD4+T细胞；
(5)在CD8、CD4行的第1、3孔中加入500μl步骤(3)中的DMSO溶液，第2、4孔中加入500μl步骤(3)中的JQ1溶液，第3、4孔中再各加入500μl步骤(3)中的PHA溶液；
(6)在CD8、CD4行的第1、2孔中加入1.5ml完全培养基，3、4孔中加入0.5ml完全培养基，补给每孔2ml完全培养基；
(7)在CD8、CD4行各孔中再加入1ml含1.5×106个CD8+T细胞或CD4+T细胞的细胞悬液；
(8)24小时收取细胞进行流式细胞仪检测细胞中PD-1表达情况。
实验结果：检测结果如图2所示：研究结果显示，Jurkat T细胞的PD-1表达随着JQ1的浓度升高而减少(图2A、2B)，并且随着JQ1干预时间的延长而下降(图2C、2D)；另外，当随着PHA浓度增加，Jurkat T细胞活化程度增加，PD-1表达明显上升时，0.5μM JQ1同样可以明显抑制Jurkat T细胞中PD-1的表达(图2E)。在正常人CD8+T细胞中，0.5μM JQ1抑制了PHA诱导的PD-1表达(图2F)；为探究JQ1对不同激活剂诱导的PD-1表达的影响，PHA置换为20ng/mlPMA、0.5μg/ml离子霉素(Ionomycin)，相同的干预条件后发现，JQ1同样抑制了PMA/Ionomycin(简称P/I)诱导的PD-1表达(图2G)。在正常人CD4+T细胞中也发现了相似的效果，JQ1抑制了CD4+T细胞中P/I诱导的PD-1表达(图2H)。
实施例3
使用转录组测序技术挖掘出JQ1同时抑制Jurkat T细胞PD-1和Tim-3的表达的机制，并通过流式细胞术进一步验证JQ1抑制了Tim-3的表达。
1.在Jurkat T细胞中进行JQ1干预并进行转录组测序。
(1)准备好处于对数生长期的Jurkat T细胞及0.5mM JQ1储存液、150μg/ml PHA储存液；
(2)在3支5ml离心管中各加入2.1ml完全培养基，分别加入8.4ml DMSO储存液、JQ1储存液(工作液浓度为0.5μM)及PHA储存液(工作液浓度为150ng/m)，分别得到DMSO溶液、JQ1溶液和PHA溶液；
(3)在一个干净无菌的6孔板前4孔中，分别标上1、2、3、4孔；
(4)第1、2孔各加入2ml完全培养基，第3、4孔中各加入1ml完全培养基和1ml步骤(2)中PHA溶液；
(5)第1、3孔中各加入1ml步骤(2)中DMSO溶液、第2、4孔中各加入1ml步骤(2)中的JQ1溶液；
(6)在各孔中再加入1ml含1×106个细胞的细胞悬液；
(7)吹打混匀后，放进37℃、5％CO2培养箱中培养24小时；
(8)收取细胞，提取RNA后进行RNA转录组测序。
2.通过流式细胞术进一步验证JQ1抑制了Jurkat T细胞中Tim-3的表达
(1)细胞操作同1中(1)-(7)步骤；
(2)收取细胞，使用流式细胞术检测Tim-3的表达情况。
实验结果：检测结果如图3所示：转录组测序结果显示JQ1除了抑制Jurkat T细胞中PDCD1的表达，还同时抑制了另一T细胞抑制性受体HAVCR2(Tim-3)的表达(图3A)，其与PD-1同为免疫检查点受体。在流式细胞术结果中，进一步验证了JQ1明显抑制了Jurkat T细胞中PHA诱导的Tim-3表达(图3B)。
实施例4
在血液肿瘤患者的标本中检验JQ1对CD3+T细胞PD-1表达的影响。
(1)收集血液肿瘤患者标本：通过暨南大学第一附属医院收集初发淋巴瘤、AML和CML患者的骨髓标本，淋巴瘤、AML及CML的诊断按常规诊断标准，所用收集的样本均告知患者研究目的和签署知情同意书，样本的收集是在病人入院后需要抽血或骨髓穿刺进行疾病诊治相关检查时完成；
(2)按原代T细胞分选法分选出骨髓标本中的CD3+T细胞，将其平均分成2孔，放于24孔板中静置培养2小时；
(3)在2个孔的细胞悬液中分别加入0.5μM JQ1及等体积的DMSO，吹打混匀后，于细胞培养箱中培养24小时；
(4)收集细胞，按常规流式细胞术染色法，荧光抗体标记CD3、CD4、CD8、PD-1、Tim-3分子；
(5)使用流式仪检测CD3细胞中CD4与CD8亚群中PD-1和Tim-3的表达情况。结果如图4所示。
实验结果：淋巴瘤患者的结果显示，在CD3+CD4+T细胞及CD3+CD8+T细胞中，JQ1组的PD-1+或Tim-3+的T细胞比率明显下降，PD-1+/Tim-3+的T细胞比率也明显下降，说明JQ1改善了淋巴瘤T细胞的耗竭表型。同样的，在AML、CML及MM的结果中也出现了类似的趋势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACTB F
<400> 1
ttgttacagg aagtcccttg cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ACTB R
<400> 2
atgctatcac ctcccctgtg tg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-1 F
<400> 3
cgtggcctat ccactcctca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-1 R
<400> 4
atcccttgtc ccagccactc 20

Claims (10)

1.JQ1在抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达中的应用，其特征在于：所述的应用为非疾病治疗和诊断目的的用途。
2.JQ1在制备具有抑制T淋巴细胞中PD-1和/或Tim-3表达的功能的产品中的应用。
3.JQ1在制备具有逆转肿瘤T淋巴细胞耗竭表型的功能的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的JQ1在制备具有逆转肿瘤T淋巴细胞耗竭表型的功能的产品中的应用，其特征在于：
所述的逆转是指肿瘤T淋巴细胞中PD-1阳性细胞、Tim-3阳性细胞和PD-1/Tim-3双阳性细胞中的至少一种细胞比率下降。
5.根据权利要求3所述的JQ1在制备具有逆转肿瘤T淋巴细胞耗竭表型的功能的产品中的应用，其特征在于：
所述的肿瘤包括但不限于血液肿瘤。
6.一种抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达的方法，其特征在于：在含有JQ1和T淋巴细胞激活剂的培养基中培养T淋巴细胞；所述的方法为非疾病治疗和诊断目的的研究方法。
7.根据权利要求6中所述的抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达的方法，其特征在于：
所述的T淋巴细胞激活剂为植物血凝素，或佛波脂和离子霉素的混合物。
8.根据权利要求7中所述的抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达的方法，其特征在于：
所述的JQ1的工作浓度为0.1～5μM；
所述的植物血凝素的工作浓度为100～300μg/ml；
所述的佛波脂的工作浓度为15～25ng/ml；
所述的离子霉素的工作浓度为0.1～1μg/ml。
9.根据权利要求7中所述的抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达的方法，其特征在于：
所述的JQ1的工作浓度为0 5μM；
所述的植物血凝素的工作浓度为150μg/ml；
所述的佛波脂的工作浓度为20ng/ml；
所述的离子霉素的工作浓度为0.5μg/ml。
10.根据权利要求6中所述的抑制T淋巴细胞PD-1和/或Tim-3表达的方法，其特征在于：
所述的T淋巴细胞的占比为0.1×106～0.5×106个/mL培养基；
所述的培养的条件为37℃、5％CO2培养箱培养24～72h。
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