CN111557940A - Mth1抑制剂th588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。MM U266细胞株经MTH1抑制剂TH588处理后，48h即可以使U266细胞形态不规则、细胞变小、有细胞碎片产生，大量细胞呈现凋亡、死亡状态；经过TH588处理的细胞核明显变小，染色不均，细胞核形态呈放射状、花瓣状，具有凋亡的特征。MTH1抑制剂TH588对多发性骨髓瘤U266细胞株有明显的抑制增殖、诱导细胞凋亡的作用。

Description

MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

背景技术

多发性骨髓瘤(mμltiple myeloma，MM)是一种起源于B淋巴细胞异常增生，以血液和尿液中产生异常增多的单克隆免疫球蛋白为特征的恶性肿瘤。该病多发于中老年人。随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等新的靶向药物应用于临床治疗，MM患者的预后情况得到一定程度的改善，但MM仍是一种不可治愈的恶性血液病，面临着耐药等多种问题，更多疗效高、毒性低、价格低的药物以及新的靶点需要被研究。目前还没有将MTH1抑制剂TH588用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物的报道和记载。

发明内容

本发明的目的在于提供MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用，MTH1抑制剂TH588对多发性骨髓瘤U266细胞株有明显的抑制增殖、诱导细胞凋亡的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了MTH1抑制剂TH588在制备抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和/或诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物中的应用。

优选的，所述多发性骨髓瘤细胞包括多发性骨髓瘤U266细胞。

本发明提供了MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

优选的，所述药物的剂型包括注射剂或片剂。

本发明的有益效果：本发明提供了MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。显微镜下观察显示，MM U266细胞株经MTH1抑制剂TH588处理后，48h即可以使U266细胞形态不规则、细胞变小、有细胞碎片产生，大量细胞呈现凋亡、死亡状态；DAPI染色后荧光显微镜下可以看出，经过TH588处理的细胞核明显变小，染色不均，细胞核形态呈放射状、花瓣状，具有凋亡的特征。荧光素酶结果显示，应用TH588后，MTH1表达被抑制，MM细胞的荧光强度较对照组低，证明对TH588对MM细胞增殖有抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用也愈明显。流式细胞仪分析TH588应用48h后可以诱导U266细胞的凋亡，使其用药后存活细胞比例下降。综上来看，MTH1抑制剂TH588对多发性骨髓瘤U266细胞株有明显的抑制增殖、诱导细胞凋亡的作用。

附图说明

图1为标本的CD138阳性细胞和CD138阴性细胞中MTH1表达情况的比较结果；

图2为IL-6对MM细胞系MTH1表达水平影响的检测结果；

图3为U266细胞荧光显微镜镜检图；图3中的A为空白对照组U266细胞荧光显微镜镜检图，B为1μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图，C为2.5μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图，D为5μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图，E为10μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图；

图4为U266细胞DAPI染色结果；图4中的A为空白对照组U266细胞DAPI染色结果，B为2.5μM的TH588处理U266细胞48h后DAPI染色结果，C为5μM的TH588处理U266细胞48h后DAPI染色结果，D为10μM的TH588处理U266细胞48h后DAPI染色结果；

图5为TH588对MTH1表达水平的影响检测结果；

图6-A为空白对照组U266细胞凋亡情况；

图6-B为1μM的TH588对U266细胞凋亡情况；

图6-C为2.5μM的TH588对U266细胞凋亡情况；

图6-D为5μM的TH588对U266细胞凋亡情况；

图6-E为10μM的TH588对U266细胞凋亡情况；

图7-A为标本的CD138阳性细胞和CD138阴性细胞中NUDT2的表达情况；

图7-B为标本的CD138阳性细胞和CD138阴性细胞中NUDT5的表达情况；

图7-C为标本的CD138阳性细胞和CD138阴性细胞中NUDT21的表达情况。

具体实施方式

本发明提供了MTH1抑制剂TH588在制备抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和/或诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物中的应用；所述多发性骨髓瘤细胞包括多发性骨髓瘤U266细胞。

本发明提供了MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

本发明中，所述MTH1抑制剂TH588的结构式如式I所示；所述MTH1抑制剂TH588来源于常规市售，本发明具体实施过程中，购自于美国MedChemExpress(MCE)公司。

本发明中，所述药物优选的还包括药学可接受的辅料；本发明对所述辅料的类型没有特殊限制，采用本领域常规辅料即可。

本发明中，所述药物的剂型优选的包括注射剂或片剂。

本发明中，所述药物中MTH1抑制剂TH588的浓度优选为2.5～10μM，更优选为5μM。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、试剂与仪器

TH588购自美国MedChemExpress(MCE)公司，分装于-80℃，短时间内置于-20℃保存。

CD138分选磁珠购自德国Miltenyi Biotech。

淋巴细胞分离液(人)购自天津市灏洋生物。

Trizol Reagen购自Invitrogen公司。

反转录试剂盒、QPCR mix购自北京全式金生物。

荧光素酶底物购自美国Promega公司。

RPMI1640细胞培养基购自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serμM，FBS)HyClone公司生产。

磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自Gibco。

ANNEXIN V APC凋亡检测试剂盒购自美国eBioscience公司。

ABI 7500FAST QPCR仪购自美国ABI公司。

高速低温离心机购自美国Thermo公司。

2、细胞系及其培养

将军事医学研究院实验室构建的luciferase稳定表达的MM U266细胞系，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，2～3d换液1次，取对数生长期的细胞。

3、MM病人标本CD138⁺细胞分选以及RNA的提取

5例标本来自青岛大学附属医院血液科MM病人的诊断穿刺骨髓，肝素抗凝。取回的标本与淋巴细胞分离液按体积比为1：1比例于50ml离心管，800g离心，收集骨髓单个核细胞，用CD138标记磁珠进行CD138阳性细胞分选，分选出CD138^-及CD138⁺细胞，用流式细胞仪进行分选效率验证，将得到的CD138阴性及阳性细胞应用Trizol分别进行RNA提取，用分光光度计检测所得到的RNA浓度及纯度，得到合格的样本。RNA提取后RNA浓度如表1所示，均为合格样本。

表1 MM病人标本RNA质量分析结果

4、MTH1在原代多发性骨髓瘤CD138⁺细胞中的表达检测

将检测合格的RNA样本根据反转录试剂盒操作进行反转录，之后进行QPCR，以β-actin为内参，内参引物正向序列：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，如SEQ ID NO.1所示；内参引物反向序列：5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′，如SEQ ID NO.2所示；MTH1正向引物序列：5′-GCTCATGGACGTGCATGTCTT-3′，如SEQ ID NO.3所示；MTH1反向引物序列：5′-GTGGAAACCAGTAGCTGTCGT-3′，如SEQ ID NO.4所示。以2^-ΔCT值大小表示MTH1的相对表达量。检测结果参见表2。

表2 MTH1在原代多发性骨髓瘤CD138⁺和CD138^-细胞中的表达检测

标本	2<sup>-ΔCT</sup>(CD138<sup>-</sup>)	2<sup>-ΔCT</sup>(CD138<sup>+</sup>)
			#1	0.12	0.07
#2	0.03	0.08
			#3	0.14	0.14
#4	0.42	0.60
			#5	0.19	0.25

CD138是一种在分化的浆细胞上广泛表达的膜蛋白，已被认为是多发性骨髓瘤诊断的主要诊断标志。经流式细胞术和免疫组织化学(IHC)分析表明，CD138在绝大多数的多发性骨髓瘤病例中均有表达。在造血细胞内，CD138的表达仅限于正常的浆细胞，但是在多发性骨髓瘤细胞上，CD138的表达明显要高于正常浆细胞。本发明选择多发性骨髓瘤患者CD138细胞作为研究对象，使用多发性骨髓瘤患者CD138阴性细胞作为参照，有研究证明骨髓瘤患者CD138阴性细胞中MTH1表达与正常人CD138阴性细胞MTH1的表达相当，因此选择患者自己的CD138阴性细胞作为他们CD138阳性细胞的对照。参见(Zhou H,JianY,LengY,etal.Human MutT homologue 1mRNA overexpression correlates to poor response ofmultiple myeloma[J].Int J Hematol,201,105(3):318-325.)根据表2数据所示，有3例标本的CD138阳性细胞MTH1表达要高于CD138阴性细胞。本发明计算出相对应的2^-ΔΔCт值(是将CD138⁺的2^-ΔCт除以CD138^-的2^-ΔCт，而CD138^-的值除以自身，恒为1，表示倍数关系)用PRISM软件作图表示直观比较其差异。参见图1。由图1可以看出，MTH1在部分多发性骨髓瘤细胞中高表达，这表明MTH1表达与多发性骨髓瘤具有相关性。

5、IL-6对MM细胞系MTH1表达水平影响的检测

取对数生长期U266细胞5×10⁵个细胞/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔培养体系为总体积1ml的无血清培养基。分别加入终浓度为25ng/ml、100ng/ml的IL-6，并设立对照组，24h后收集细胞，提取RNA，反转录进行qPCR检测MTH1表达水平的变化。结果参见图2。

根据QPCR的结果分析，没有应用IL-6的MM细胞系U266的MTH1表达2^-ΔCT值为0.01775±0.0008，当IL-6浓度为25ng/ml时，值为0.04370±0.0016，

当IL-6浓度为100ng/ml时，值为0.02596±0.0008，与对照组相比，应用IL-6的细胞MTH1表达水平均不同程度提高，且P<0.01，有统计学意义。

IL-6是体内骨髓瘤细胞的主要生长因子，它能在促进恶性浆细胞存活发面发挥作用。由实验结果可知，IL-6可以诱导多发性骨髓瘤细胞系U266的MTH1表达水平增高，印证了MTH1与多发性骨髓瘤相关性，使下一步研究MTH1在骨髓瘤发生发展中的重要作用成为可能。

6、细胞形态观察及DAPI染色检测

取对数生长期U266细胞5×10⁵个细胞/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔总体积1ml。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μM的TH588，并设立对照组。48h后收集细胞，PBS洗涤2次。以1ml PBS重悬细胞，于显微镜下观察细胞形态，用终浓度为100ng/ml的DAPI染色3～5min，在激发波长为461nm的荧光显微镜下观察U266细胞的凋亡形态。结果如下：

分别用终浓度为1、2.5、5、10μM的TH588处理U266细胞48h后，置于显微镜下随机地选取多个视野来观察U266细胞形态，可观察到对照组细胞形状规则，圆形透亮，大小一致，边缘整齐，TH588处理后的细胞密度变小，大小明显变小，形状不规则，细胞膜明显皱缩，细胞之间可见细胞碎片(图3，图3中的A为空白对照组U266细胞荧光显微镜镜检图，B为1μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图，C为2.5μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图，D为5μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图，E为10μM的TH588处理U266细胞48h后荧光显微镜镜检图)。

分别用终浓度为2.5、5、10μM的TH588处理细胞48h后再用DAPI染色，在荧光显微镜下观察显示，对照组细胞核核型完整，形态规则，染色均匀，随着药物浓度增加，细胞核形态开始发生变化，可见部分细胞核呈现放射状、花瓣状形态，表示用TH588处理后凋亡细胞增多(图4，图4中的A为空白对照组U266细胞DAPI染色结果，B为2.5μM的TH588处理U266细胞48h后DAPI染色结果，C为5μM的TH588处理U266细胞48h后DAPI染色结果，D为10μM的TH588处理U266细胞48h后DAPI染色结果)。

7、细胞增殖的检测以及TH588对MTH1表达水平的影响

细胞增殖的取对数生长期U266细胞，以1×10⁴个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔100μl体系。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μM的TH588，并设立对照组，每组设4个复孔，置37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中孵育，实验结束前避光加入50μl/孔的荧光素底物luciferin，每孔吸取带底物的悬液100μl于不透光96孔板中，置酶标仪上检测荧光强度。取对数生长期U266细胞2×10⁵个细胞/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔总体积1ml。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μM的TH588，并设立对照组。48h后收集细胞，提取RNA进行反转录后，进行QPCR的检测，检测MTH1表达的变化。检测结果参见表3。

表3 TH588对MTH1表达水平的影响检测结果

TH588(μmol/L)	0d	2d	3d
				对照组	1.0±0.009	2.9±0.134	6.0±0.508
1.0	1.0±0.013	2.9±0.169	4.7±0.016*
				2.5	1.0±0.017	2.5±0.028*	3.6±0.006**
5.0	1.0±0.084	1.7±0.035***	2.6±0.1856**
				10	1.0±0.031	1.4±0.051****	1.9±0.086***

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P<0.001，****p<0.000，和对照组比较。

荧光素酶报告基因结果显示，TH588作用于U266细胞系48h、72h后，与对照组相比，实验组的MTH1表达水平降低(图5)，对照组2^-ΔCT值为0.007±0.0003，1μM组2^-ΔCT值为0.003±0.0002，5μM组2^-ΔCT值为0.004±0.0004，10μM组2^-ΔCT值为0.003±0.0004，P均<0.05。

实验组的荧光强度与对照组有差异，且有统计学意义，应用48h后，1μM的药物浓度没有起到明显抑制细胞增殖的作用，当药物浓度达到2.5μM，抑制增殖作用明显(P<0.05)，应用72h后，与对照组相比1μM的药物浓度即有抑制细胞增殖的作用(P<0.05)，随着药物浓度进一步升高，抑制作用愈明显(P<0.0001)。

8、细胞凋亡的检测

取对数生长期U266细胞2×10⁵个细胞/ml的终浓度接种于12孔培养板，每孔总体积1ml。分别加入终浓度为1、2.5、5、10μM的TH588，并设立对照组。48h后收集细胞，离心，1200rpm，5min，PBS洗2次，使用eBioscience Annexin VAPC凋亡试剂盒，1×bindingbuffer洗1次，使用100μl binding buffer重悬，标记Annexin V APC，室温避光孵育10min，1×binding buffer洗1次，500μl重悬，加5μl PI，10min后流式细胞仪检测。使用Flowjo分析存活细胞即Annexin V与PI双阴性细胞的比例。

结果如下：

使用流式细胞仪检测凋亡并使用Flowjo分析存活细胞即APC与PI双阴性细胞的比例。对照组双阴性细胞比例为均数为81.93％，药物浓度为1μM时，双阴性比例下降到74.60％，2.5μM时，双阴性比例下降到68.53％，5μM时，双阴性比例降到67.33％，10μM时，双阴性比例下降到65.80％，统计学分析后差异具有统计学差异。由此可以得出TH588应用能够诱导骨髓瘤细胞凋亡。结果参见表4和图6-A～图6-E，其中图6-A为空白对照组U266细胞凋亡情况；图6-B为1μM的TH588对U266细胞凋亡情况；图6-C为2.5μM的TH588对U266细胞凋亡情况；图6-D为5μM的TH588对U266细胞凋亡情况；图6-E为10μM的TH588对U266细胞凋亡情况。

表4 TH588对U266细胞凋亡的影响和统计分析结果

TH588(μmol/L)	双阴性细胞(％)
		对照组	81.93±0.35
1.0	74.60±1.04**
		2.5	68.53±0.98***
5.0	67.33±0.24****
		10.0	65.80±0.35****

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P<0.001，****p<0.000，和对照组比较。

9、Nudix其他成员在原代多发性骨髓瘤CD138⁺细胞中的表达检测

除了MTH1外，还选取了其他Nudix家族成员在多发性骨髓瘤CD138⁺细胞中的表达水平，本发明选取了NUDT2、NUDT5、NUDT21，检测它们在5例MM标本中CD138-细胞及CD138⁺细胞中的表达水平。计算出5例MM标本CD138^-的2^-ΔΔCт值为1，NUDT2的5例标本CD138⁺的2^-ΔΔCт的值分别为5.3、13.5、2.5、4.0、6.0，NUDT5的5例标本CD138⁺的2^-ΔΔCт的值分别为1.2、2.1、1.8、2.5、4.0，NUDT21的5例标本CD138⁺的2^-ΔΔCт的值分别为0.85、4.1、3.1、3.1、1.2。由此可得5例标本CD138⁺细胞表达NUDT2、NUDT5的水平均高于CD138^-，而NUDT21的表达有例标本在CD138⁺中高表达。(图7-A～图7-C，其中图7-A为标本的CD138阳性细胞和CD138阴性细胞中NUDT2的表达情况；图7-B为标本的CD138阳性细胞和CD138阴性细胞中NUDT5的表达情况；图7-C为标本的CD138阳性细胞和CD138阴性细胞中NUDT21的表达情况)。通过对其他NUDIX成员NUDT2、NUDT5、NUDT21在多发性骨髓瘤患者CD138阳性细胞中的表达情况检测，发现表达也较阴性细胞高(P<0.5)，这对之后对治疗多发性骨髓瘤提供了可能以及非常有前景的靶点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛大学附属医院

<120> MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctggcaccc agcacaat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggccggact cgtcatac 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctcatggac gtgcatgtct t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggaaacca gtagctgtcg t 21

Claims (4)

1.MTH1抑制剂TH588在制备抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和/或诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多发性骨髓瘤细胞包括多发性骨髓瘤U266细胞。

3.MTH1抑制剂TH588在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂或片剂。

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