CN101780066A - 异硫氰酸酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了异硫氰酸酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途。本发明运用细胞生物学和分子生物学方法，证明异硫氰酸酯能有效抑制人肿瘤细胞生长侵袭转移。异硫氰酸酯有效抑制肿瘤细胞生长、侵袭，诱导凋亡，调控肿瘤转移相关基因，引起肿瘤细胞周期停滞，造成肿瘤细胞氧化损伤。因此，可以将异硫氰酸酯作为有效成分制备防治肿瘤侵袭转移药物以及制备防治肿瘤侵袭转移食品、保健品及化妆品。

Description

异硫氰酸酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途

技术领域

本发明属于医药应用领域，涉及异硫氰酸酯在制备防治肿瘤侵袭药物的用途。

背景技术

我国癌症的发病率与死亡率呈快速上升的趋势。癌症给患者本人及家庭造成极大痛苦，也占用了大量的社会资源和财富，癌症已经成为人类面临的日益严重的公共卫生问题。各国政府都投入了大量的人力物力，以期在癌症研究领域有所突破。

目前癌症的主要治疗方法是外科手术治疗、放疗、化疗和生物治疗等。外科手术治疗是最有效的治疗手段。然而绝大多数患者就诊时就已经是中晚期，或者是晚期，错过了手术治疗的机会。放射治疗为一种局部治疗，其疗效是有限的，同时亦有剂量限制性、毒性问题。化疗可应用于几乎全部癌症患者，因此抗肿瘤药物治疗成为中晚期癌症患者的主要治疗手段。

肿瘤侵袭转移是肿瘤的恶性标志和特征，也是肿瘤病人治疗失败和死亡的主要原因。如肺癌，约30％的患者在诊断时就已有远处转移，50％-60％的患者在治疗过程中发生远处转移，80％-90％的肺癌病人死于转移[1]。肺癌转移包括脑转移、骨转移、肝转移、肾及肾上腺转移，及较少见的皮肤、皮下组织、肌肉、腹腔内、心脏等部位的转移。肿瘤的转移是一个多步骤、多阶段、多因素和多基因调控的复杂过程[2]，因此控制肿瘤的侵袭和转移是改善肿瘤患者预后，提高患者生存率和生活质量的最重要的措施。然而目前尚无有效抑制肿瘤侵袭转移的药物。

鉴于目前抗肿瘤药物疗效不理想，且具毒副作用的特点，开发新型抗癌药物成为攻克癌症的难点。其中研究和开发天然抗肿瘤药物是目前抗肿瘤药物研发中的前沿和热点课题。

异硫氰酸酯是一种有机小分子，普遍存在于蔬菜中[3]。它是天然存在于十字花科蔬菜(如辣根、花椰菜、卷心菜等)中的硫代葡萄糖苷的降解产物。异硫氰酸酯之所以引起人们的兴趣，是因为它具有防癌作用，能抑制多种肿瘤的生成，如肺、胃、结肠、肝、食管、膀胱、乳腺等部位[4-7]。其作用机制是抑制致癌物的活化，如降低细胞色素P-450(cytochrome P-450)等活化酶的活性[8]；同时促进致癌物的排出，如提高谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferases)等的活性[9，10]。虽然对异硫氰酸酯的防癌作用进行了大量研究，但异硫氰酸酯对肿瘤侵袭、转移的作用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供异硫氰酸酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途。

本发明的技术方案概述如下：

异硫氰酸酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途。

所述异硫氰酸酯为异硫氰酸苄酯或异硫氰酸苯乙酯，异硫氰酸苄酯的分子式为C₆H₅CH₂NCS；结构式为：

异硫氰酸苯乙酯的分子式为C₆H₅CH₂CH₂NCS；结构式为：

所述肿瘤为肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌，前列腺癌，阴茎癌，黑色素瘤，脑瘤，口腔肿瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。

本发明运用细胞生物学和分子生物学方法，证明异硫氰酸酯能有效抑制人肿瘤细胞生长侵袭转移。异硫氰酸酯有效抑制肿瘤细胞生长，侵袭，诱导凋亡，调控肿瘤转移相关基因，引起肿瘤细胞周期停滞，造成肿瘤细胞氧化损伤。因此，可以将异硫氰酸酯作为有效成分制备防治肿瘤侵袭转移药物及防治肿瘤侵袭转移食品、保健品及化妆品。

附图说明

图1为异硫氰酸酯抑制高转移肺癌细胞L9981生长的剂量--生长曲线。图中异硫氰酸酯浓度范围为0-40μM，处理时间为48小时。

图2为异硫氰酸酯抑制低转移肺癌细胞NL9980生长的剂量--生长曲线。图中异硫氰酸酯浓度范围为0-40μM，处理时间为48小时。

图3为Boyden小室法检测细胞体外侵袭力的显微镜下细胞图片。BITC和PEITC浓度为10μM，作用时间为24小时。透膜细胞经龙胆紫染色(200倍视野)。其中图3-1为对照组，图3-2为BITC处理组，图3-3为PEITC处理组。

图4为Boyden小室法检测细胞体外侵袭力的数据统计图。BITC和PEITC浓度为10μM，作用时间为24小时。

图5为实时定量PCR法检测基因MMP-2的mRNA的表达水平。PEITC浓度10μM，作用时间24小时。

图6为实时定量PCR法检测基因β-catenin的mRNA的表达水平。PEITC浓度10μM，作用时间24小时。

图7为Western Blot法检测MMP-2的蛋白表达水平。BITC和PEITC浓度分别为10μM和20μM，作用时间24小时。

图8为Western Blot法检测Twist的蛋白表达水平。BITC和PEITC浓度分别为10μM和20μM，作用时间24小时。

图9为流式细胞术检测细胞凋亡。作用时间为24小时。细胞经propidium iodide(PI)和Annexin V--FITC双染色。9-1：对照；9-2：BITC(10μM)；9-3：BITC(20μM)；9-4：PEITC(10μM)；9-5：PEITC(20μM)。

图10为流式细胞术检测的凋亡细胞的比例。

图11为流式细胞术检测细胞周期。作用时间24小时。细胞经propidium iodide(PI)染色。11-1：对照；11-2：BITC(10μM)；11-3：PEITC(10μM).

图12为流式细胞术检测细胞内活性氧的水平。细胞经BITC或BITC+乙酰半胱氨酸(NAC)处理24小时。

图13为流式细胞术检测细胞内活性氧的水平。细胞经PEITC或PEITC+乙酰半胱氨酸(NAC)处理24小时。

图14为异硫氰酸酯对转录因子NFκB活性的调控。L9981细胞转染pNFκB-luc质粒。PEITC和BITC浓度分别为10μM和20μM，作用时间20小时。

图15为异硫氰酸酯对转录因子AP-1活性的调控。L9981细胞转染pAP-1-luc质粒。PEITC和BITC浓度分别为10μM和20μM，作用时间20小时。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

异硫氰酸苄酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途，异硫氰酸苄酯的分子式为C₆H₅CH₂NCS；结构式为：

所述肿瘤为肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌，前列腺癌，阴茎癌，黑色素瘤，脑瘤，口腔肿瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。

实施例2

异硫氰酸苯乙酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途，异硫氰酸苯乙酯的分子式为C₆H₅CH₂CH₂NCS；结构式为：

所述肿瘤为肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌，前列腺癌，阴茎癌，黑色素瘤，脑瘤，口腔肿瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。

异硫氰酸苄酯和异硫氰酸苯乙酯加入药学可接收的辅料按常规方法制成各种剂型，如各种规格的液体注射剂，粉针注射剂，注射用乳剂，片剂，丸剂，胶囊剂，膏剂，霜剂，贴剂，擦剂，粉剂，喷雾剂，植入剂，滴剂，栓剂，软膏剂，糖果剂等。

异硫氰酸苄酯和异硫氰酸苯乙酯的给药途径包括各种给药途径：口服给药，注射给药，植入给药，腔内给药，舌下给药，肛门给药，透皮给药，内外敷等。

实施例3

异硫氰酸酯抑制多种肿瘤细胞生长

通过MTT法，发现异硫氰酸苄酯和异硫氰酸苯乙酯能有效抑制肺癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞的生长。尤其通过比较对人高转移肺癌细胞L9981和低转移肺癌细胞NL9980生长的作用，发现其对高转移肺癌细胞L9981的抑制作用更强。异硫氰酸苄酯(BITC)作用于L9981细胞的50％抑制浓度(IC₅₀)为5.0μM，而作用于NL9980细胞的IC₅₀为8.8μM；异硫氰酸苯乙酯(PEITC)作用于L9981细胞的IC₅₀为9.7μM，而作用于NL9980细胞的IC₅₀为12.2μM。此结果显示其对高转移肺癌细胞具选择性抑制作用。剂量生长曲线见图1和图2，50％生长抑制浓度(IC₅₀)见表1。

表1.异硫氰酸酯抑制肿瘤细胞生长的50％生长抑制浓度(IC₅₀)

	IC50异硫氰酸苄酯(BITC)	IC50异硫氰酸苯乙酯(PEITC)
			高转移人肺癌细胞L9981	5.0μM	9.7μM
低转移人肺癌细胞NL9980	8.8μM	12.2μM
			人肺癌细胞A549	13.4μM	19.8μM
人乳腺癌细胞MCF-7	11.1μM	18.4μM
			人白血病细胞HL60	1.4μM	4.9μM

实施例4

异硫氰酸酯抑制肿瘤细胞的体外侵袭力

本发明运用Boyden小室法(Transwell Boyden chamber)检测了BITC和PEITC对L9981细胞侵袭力的影响。结果显示，BITC和PEITC浓度为10μM时，作用24小时，能有效抑制人高转移肺癌细胞L9981细胞的体外侵袭力(图3-1，3-2，3-3)，实验组的透膜细胞数分别仅为对照组的2.7％和7.3％(图4)，且平行实验显示此浓度作用24小时未引起细胞数减少。

实施例5

异硫氰酸酯对转移相关基因的调控

1.通过定量PCR的方法，检测了PEITC对人高转移肺癌细胞L9981细胞中转移相关基因MMP-2和β-catenin mRNA表达的影响，结果显示，PEITC浓度为10μM时，作用24小时即能降低促转移基因MMP-2的mRNA的表达(图5)；增强抗转移基因β-catenin的mRNA的表达水平(图6)。

2.通过Western Blot的方法，检测了PEITC对人高转移肺癌细胞L9981细胞中转移相关基因MMP-2和Twist的蛋白表达水平的影响，结果显示，PEITC浓度为10μM时，作用24小时即能降低促转移基因MMP-2(图7)和Twist(图8)蛋白的表达，抑制效果与剂量相关。

我们同时在mRNA和蛋白的水平证明异硫氰酸酯调控肿瘤转移相关基因的表达。

实施例6

异硫氰酸酯诱导细胞凋亡

通过Annexin-V标记法，运用流式细胞术，检测了异硫氰酸酯诱导细胞凋亡的作用。结果显示，BITC和PEITC作用24小时即可有效诱导L9981细胞凋亡，且诱导效果与剂量相关。图9-1：对照；图9-2：BITC(10μM)；图9-3：BITC(20μM)；图9-4：PEITC(10μM)；图9-5：PEITC(20μM)。图10显示凋亡细胞的比例。

实施例7

异硫氰酸酯诱导细胞周期停滞

运用流式细胞术，检测了异硫氰酸酯对细胞周期的影响。研究显示BITC和PEITC浓度为10μM时，作用24小时，可诱导细胞周期停滞，使细胞周期停滞在G₂/M期(图11)。图11-1：对照；图11-2：BITC(10μM)；图11-3：PEITC(10μM)。

实施例8

异硫氰酸酯提高细胞内活性氧的水平。

应用DCFH-DA荧光探针，运用流式细胞术，检测了细胞内活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的水平。研究发现，BITC和PEITC提高细胞内活性氧的水平，引发氧化损伤。抗氧化剂乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine，NAC)可有效保护细胞，降低异硫氰酸酯诱导的细胞内活性氧的水平。图12-1：对照；图12-2：BITC(10μM)；图12-3：PEITC (10μM)。

实施例9

异硫氰酸酯抑制转录因子的活性。

我们检测了异硫氰酸酯对转录因子NFκB和AP-1转录活性的影响。通过运用荧光素酶报告基因的方法，分别将质粒pNFκB-luc和pAP-1-luc转染到L9981细胞，检测了异硫氰酸酯对转录因子活性的影响。结果显示BITC和PEITC抑制转录因子NFκB(图14)和AP-1(图15)的活性，且抑制作用与剂量相关。

上述实验结果表明，BITC和PEITC可有效抑制具高转移潜能的肿瘤细胞的侵袭转移，并抑制多种肿瘤细胞的生长。BITC和PEITC是通过调控肿瘤转移相关基因的表达，诱导细胞凋亡，引起细胞周期停滞，引发氧化损伤，调控转录因子等途径抑制肿瘤细胞侵袭转移的。因BITC和PEITC具有此功能，故可作为有效成分制备具有抑制人肿瘤细胞生长侵袭的药品、食品、保健品及化妆品。

Claims (3)

1.异硫氰酸酯在制备防治肿瘤侵袭转移药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征是所述异硫氰酸酯为异硫氰酸苄酯或异硫氰酸苯乙酯，所述异硫氰酸苄酯的分子式为C₆H₅CH₂NCS；结构式为：

所述异硫氰酸苯乙酯的分子式为C₆H₅CH₂CH₂NCS；结构式为：

3.根据权利要求1所述的用途，其特征是所述肿瘤为肺癌，肝癌，食道癌，胃癌，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌，前列腺癌，阴茎癌，黑色素瘤，脑瘤，口腔肿瘤，耳癌，鼻咽癌和/或舌癌。

Images