CN117384867B - 一种经修饰的Cas3移位酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和遗传工程领域，公开了一种修饰的Tfu Cas3移位酶，包含该移位酶的构建体，以及采用该移位酶或构建体表征目标多核苷酸的方法及应用。本发明提供的经修饰的Tfu Cas3移位酶及其构建体均能够控制多核苷酸穿过生物纳米孔的移动，尤其当多核苷酸链长度增加时，依然可以稳定控制多核苷酸移动而不会从多核苷酸上发生脱落。本发明还提供了特异的Tfu Cas3移位酶突变体，通过共价连接提高了其控制多核苷酸穿过纳米孔移位的能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种经修饰的Cas3移位酶，特别是涉及一种能够控制目标多核苷酸穿过生物纳米孔移动的DNA移位酶，并且特别有助于对多核苷酸进行测序，属于基因工程和遗传工程领域。
背景技术
近些年发展起来的纳米孔测序技术是一种新型的单分子测序技术，其利用电场力驱动单链多核苷酸穿过嵌在绝缘磷脂膜上的纳米级生物孔道蛋白，由于不同的碱基大小，每个核苷酸分子在通过生物纳米孔时会产生特征性的阻碍电流，记录下的这些特征电流信号对应于目标核酸的序列。
在“链测序”方法中，单个多核苷酸链通过所述生物纳米孔从而实现核苷酸序列的鉴定。相比于其他测序技术，这种测序技术的优势在于成本低，无需PCR扩增，快速实时便捷，测序读长长（超过150kb），以及RNA及表观遗传修饰直接测序的能力。其被认为是测序领域的革命性技术，具有不可估量的应用价值。
但是，纳米孔测序技术也存在严重的限制。在电场作用下，单链多核苷酸穿过纳米孔的速度非常快以至于难以从系统噪音中分辨出单个核苷酸的电流阻碍信号。因此，为了实现对核苷酸的鉴定，链测序使用多核苷酸结合的分子马达来控制多核苷酸穿过所述生物纳米孔的移动。然而，分子马达和多核苷酸的结合并非一成不变，在其控制多核苷酸移动时，尤其是面对很长的核苷酸序列时，分子马达会出现从多核苷酸上发生脱落的问题。此外，在链测序这种单分子水平的测序技术中，分子马达存在许多出乎意料的单分子动态行为，比如某些马达蛋白由于活性差，会出现停滞的现象，从而引起孔道的阻塞，降低了测序的通量。其次，马达蛋白在多核苷酸上的移位会出现向前滑动、倒退以及步长不均一的情况，这些不规则的单分子行为导致马达蛋白无法完美地控制单链多核苷酸以棘轮的方式穿过纳米孔，从而降低碱基识别的准确度。因此，目前亟需一种能够稳定、高效地控制多核苷酸穿过生物纳米孔的技术。
发明内容
针对上述技术问题，本发明克服了现有技术中多核苷酸穿孔速度过快的问题，提供了一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其在链测序过程中对于控制多核苷酸穿孔运动是非常有用的。
Cas3是细菌用于抵抗外来入侵遗传因子的CRISPR-Cas获得性免疫系统的一个关键组分，它是一种嵌合酶，其N端为HD-核酸酶结构域，C端是ATP依赖的单链DNA移位酶结构域，移位酶结构域又分为四个亚结构域，分别是RecA1域（RecA式结构域）、RecA2域（RecA式结构域）、连接域、CTD域，相应的Tfu Cas3蛋白的结构信息可以从蛋白质数据库（PDB）中获得。
为了用于多核苷酸测序，本发明提供了一种修饰的Tfu Cas3移位酶，通过对其HD-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸进行突变，使其丧失核酸酶活性，成为一种单纯的单链DNA移位酶。
在本发明优选的实施方案中，所述HD-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸突变是D84A突变。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
为了用于多核苷酸测序，本发明提供了一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其是将TfuCas3移位酶中至少一个天然半胱氨酸残基突变为丙氨酸或者丝氨酸，所述Tfu Cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
Tfu Cas3移位酶本身存在的天然半胱氨酸残基位点为：36、75、208、293、295、584、89、690、838、853、873和939。
在本发明优选的实施方案中，优选的突变组合包括C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
为了用于多核苷酸测序，本发明提供了一种修饰的Tfu Cas3移位酶，至少两个半胱氨酸残基或者非天然氨基酸被引入Tfu Cas3移位酶的CTD域、RecA1域或RecA2域中，所述Tfu Cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
上述修饰不妨碍移位酶与多核苷酸的结合。这些修饰的半胱氨酸或者非天然氨基酸彼此连接通常可以降低多核苷酸从移位酶脱离的能力。通过引入这些修饰增加了移位酶控制多核苷酸穿孔运动的能力，尤其当多核苷酸链长度增加时，依然可以稳定控制多核苷酸移动而不会从多核苷酸上发生脱落。其中：
CTD域中的修饰位点有：E921-T926，P938-F944，M870-I881，L849-F856；
RecA1域中的修饰位点有：V592-Q604，R622-R628；
RecA2域中的修饰位点有：M373-L383，R331-A339。
因此，在本发明优选的实施方案中，突变位点包括E921-T926、P938-F944、M870-I881、L849-F856、V592-Q604、R622-R628、M373-L383和R331-A339。
在本发明进一步优选的实施方案中，优选的突变组合包括L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A。
在本发明更加优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
为了用于多核苷酸测序，本发明提供了一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其是用多核苷酸结合部分替换Tfu Cas3移位酶的HD-核酸酶活性域，所述Tfu Cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
本发明采用基因融合的方法来制备所述的Tfu Cas3移位酶，具体的可以是，将TfuCas3的N端HD-核酸酶域的氨基酸序列删除，然后将多核苷酸结合部分的氨基酸序列插入到Tfu Cas3移位酶域的氨基酸序列中，构建成融合基因。
在本发明优选的实施方案中，所述的多核苷酸结合部分包括一个或多个结构域。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述的结构域是从螺旋-发卡-螺旋（HhH）结构中选取的相应的结构域。
在本发明更加优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明优选的实施方案中，所述的移位酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
本发明另一方面提供了一种编码本发明的移位酶的核苷酸序列。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6和SEQ ID NO.8所示。
本发明另一方面提供了一种构建体，所述构建体包含本发明的移位酶，和用于结合多核苷酸的结合部分。
在本发明优选的实施方案中，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白会或双链结合蛋白。
本发明另一方面提供了本发明的移位酶或编码该移位酶的核苷酸序列或包含该移位酶的构建体在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔中的应用。
本发明另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含本发明的移位酶或编码该移位酶的核苷酸序列或包含该移位酶的构建体。
本发明另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的装置，其特征在于，所述装置包含本发明的移位酶或编码该移位酶的核苷酸序列或包含该移位酶的构建体。
本发明另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的方法，其包括以下步骤：
1、将目标多核苷酸与纳米孔，和本发明的移位酶或包含该移位酶的构建体接触，使得所述移位酶或构建体控制所述目标多核苷酸穿过所述纳米孔；和
2、获取目标多核苷酸中的核苷酸与所述纳米孔相互作用的一个或多个特征，以表征所述目标多核苷酸，所述构建体包含移位酶和用于结合多核苷酸的结合部分。
在本发明优选的实施方案中，所述一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
在本发明优选的实施方案中，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光测量进行。
在本发明优选的实施方案中，所述的目标多核苷酸为单链、双链、或至少一部分是双链的。
在本发明优选的实施方案中，所述的纳米孔为跨膜孔，所述的跨膜孔为生物孔、固态孔或生物与固态交杂的孔。
本发明另一方面提供了一种包含编码本发明的移位酶的核苷酸序列的载体。
本发明再一方面提供了一种包含编码本发明的移位酶的核苷酸序列或包含该核苷酸序列的载体的宿主细胞。
有益效果
本发明人已经证明了经修饰的Tfu Cas3移位酶能够控制多核苷酸穿过生物纳米孔的移动，尤其当在施加电势诸如电压时。所述的经修饰的移位酶能够使目标多核苷酸以可控和逐步的方式顺着或逆着由所施电压引起的电场进行移动。
本发明提供的特异的Tfu Cas3移位酶突变体，通过共价连接提高了其控制多核苷酸穿过纳米孔移位的能力，尤其当多核苷酸链长度增加时，本发明所述的移位酶突变体依然可以稳定控制多核苷酸移动而不会从多核苷酸上发生脱落。
本发明还提供了包含Tfu Cas3移位酶的构建体，所述构建体同样具有控制多核苷酸移动的能力。本发明的构建体降低了本发明的修饰的Tfu Cas3移位酶从被测序的多核苷酸上发生脱落的风险，尤其当多核苷酸链长度增加时，所述构建体依然可以稳定控制多核苷酸移动而不会从多核苷酸上发生脱落。
附图说明
图1是SDS-PAGE凝胶电泳纯化本发明的Tfu Cas3-D84A移位酶的结果图。
M：Marker；
1：Tfu Cas3-D84A移位酶的电泳结果图。
图2 是本发明中使用的DNA构建体Z的示意图。
A：50个T；
B：本发明使用的解旋酶；
C：4个iSpC18 spacer；
D：SEQ ID NO：10；
E：SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14；
F：SEQ ID NO：12；
G：3’端带有胆固醇标记的SEQ ID NO：13。
图3是显示Tfu Cas3-D84A移位酶控制DNA穿过纳米孔移位时的电流轨迹示意图。
X轴：时间（s）；
Y轴：电流（nA）。
图4是显示图3所示移位酶控制DNA过孔移动的区域放大图。
X轴：时间（s）；
Y轴：电流（nA）。
具体实施方式
为了更好的说明本方法的目的和优点，结合附图及具体实施例对本发明具体实施内容做进一步详细说明。
实施例1：Tfu Cas3-D84A移位酶的制备
根据野生型Tfu Cas3蛋白的氨基酸序列（Accession No.:Q47PJ0, Gene name:Tfu_1593），通过体外基因合成的方法获得其核酸序列，再以大肠杆菌为宿主进行相关密码子的优化，更换为大肠杆菌常用的密码子，获得优化的Cas3蛋白的核酸序列，其序列如SEQID NO. 9所示。将合成的核酸序列通过NdeⅠ和XhoⅠ两个限制性酶切位点连接插入到pET28表达载体中，经测序验证序列正确，最终获得Tfu Cas3-D84A移位酶的重组表达质粒。然后，通过重叠PCR的方法进行定点突变来获得Tfu Cas3-D84A突变体的核酸序列，其序列如SEQID NO. 2所示。
将重组质粒通过热激法转化到BL21（DE3）的大肠杆菌表达宿主中。在诱导表达过程中，首先用加有卡纳抗性的LB培养基在37℃过夜培养含有该表达质粒的宿主菌，然后按照1：100的比例在37℃进行放大培养，待其OD(600)值达到0.4-0.6时停止培养并放在4℃进行1小时的降温处理，随后加入终浓度0.5mM的异丙基硫代半乳糖（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）在16℃诱导表达12-16h。然后，4℃，15000rpm离心收集细菌，通过高压破碎仪在4℃对菌体进行高压破碎，随后4℃离心收集上清液，然后通过镍柱、肝素柱、Q柱以及分子筛等一步一步实现目的蛋白的分离纯化，最终获得大量的高纯度的目的蛋白，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
附图1显示了经纯化后的Tfu Cas3-D84A移位酶的SDS-PAGE凝胶电泳图。
实施例2：Tfu Cas3-D84A移位酶控制DNA构建体Z穿过纳米孔的能力
制备如附图2所示的DNA构建体Z，SEQ ID NO：10（区域D）其5’末端连接到SEQ IDNO：11（区域E），其3’末端连接到4个iSpC18间隔区（区域C），该间隔区连接到50个T的末端（区域A），该DNA构建体的SEQ ID NO：10区域与SEQ ID NO：12（区域F）杂交，而SEQ ID NO：12区域同时又与SEQ ID NO：13（区域G）杂交。
将制备的DNA构建体Z（终浓度0.1nM）和Tfu Cas3-D84A移位酶（终浓度10nM）在室温的缓冲液（10mM Hepes，pH 8.0，100mM KCl，10%甘油，5mM DTT）中预孵育30分钟。
在缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的CsgG纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品、ATP（终浓度2mM）和MgCl2（终浓度10mM）一起流入到单个纳米孔实验系统（总体积100μL），在+180mV的恒定电压下测量信号6h（包括潜在的2s的-180mV电压反转）。
如附图3所示，观察到Tfu Cas3-D84A移位酶控制DNA构建体Z穿过纳米孔时所进行的移动。Tfu Cas3-D84A移位酶控制的DNA移动时长为30秒，对应于接近1000bp的DNA构建体Z穿过CsgG纳米孔的移动。
附图4显示了Tfu Cas3-D84A移位酶控制的DNA移动的部分区域的放大图。
实施例3：Tfu Cas3-C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶的制备
根据野生型Tfu Cas3蛋白的氨基酸序列（Accession No.:Q47PJ0, Gene name:Tfu_1593），通过体外基因合成的方法获得其核酸序列，再以大肠杆菌为宿主进行相关密码子的优化，更换为大肠杆菌常用的密码子，获得优化的Cas3蛋白的核酸序列，其序列如SEQID NO. 9所示。将合成的核酸序列通过NdeⅠ和XhoⅠ两个限制性酶切位点连接插入到pET28表达载体中，经测序验证序列正确，最终获得Tfu Cas3-C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A的重组表达质粒。然后，通过重叠PCR的方法进行定点突变来获得Tfu Cas3-C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A突变体的核酸序列，其序列如SEQ ID NO.4所示。
将突变后的重组质粒通过热激法转化到BL21（DE3）的大肠杆菌表达宿主中。在诱导表达过程中，首先用加有卡纳抗性的LB培养基在37℃过夜培养含有该表达质粒的宿主菌，然后按照1：100的比例在37℃进行放大培养，待其OD(600)值达到0.4-0.6时停止培养并放在4℃进行1小时的降温处理，随后加入终浓度0.5mM的异丙基硫代半乳糖（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）在16℃诱导表达12-16h。然后，4℃，15000rpm离心收集细菌，通过高压破碎仪在4℃对菌体进行高压破碎，随后4℃离心收集上清液，然后通过镍柱、肝素柱、Q柱以及分子筛等一步一步实现目的蛋白的分离纯化，最终获得大量的高纯度的目的蛋白，其序列如SEQ ID NO. 3所示。
实施例4：Tfu Cas3-C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶控制DNA构建体Z穿过纳米孔的能力
制备如附图2所示的DNA构建体Z，SEQ ID NO：10（区域D）其5’末端连接到SEQ IDNO：11（区域E），其3’末端连接到4个iSpC18间隔区（区域C），该间隔区连接到50个T的末端（区域A），该DNA构建体的SEQ ID NO：10区域与SEQ ID NO：12（区域F）杂交，而SEQ ID NO：12区域同时又与SEQ ID NO：13（区域G）杂交。
将制备的DNA构建体Z（终浓度0.1nM）和Tfu Cas3-C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶（终浓度10nM）在室温的缓冲液（10mM Hepes，pH 8.0，100mMKCl，10%甘油，5mM DTT）中预孵育30分钟。
在缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的CsgG纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品、ATP（终浓度2mM）和MgCl2（终浓度10mM）一起流入到单个纳米孔实验系统（总体积100μL），在+180mV的恒定电压下测量信号6h（包括潜在的2s的-180mV电压反转）。
观察到Tfu Cas3-C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶控制DNA构建体Z穿过纳米孔时所进行的移动。Tfu Cas3-C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶控制的DNA移动时长为30秒，对应于接近1000bp的DNA构建体Z穿过CsgG纳米孔的移动。
实施例5：Tfu Cas3-L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶的制备
根据野生型Tfu Cas3蛋白的氨基酸序列（Accession No.:Q47PJ0, Gene name:Tfu_1593），通过体外基因合成的方法获得其核酸序列，再以大肠杆菌为宿主进行相关密码子的优化，更换为大肠杆菌常用的密码子，获得优化的Cas3蛋白的核酸序列，其序列如SEQID NO. 9所示。将合成的核酸序列通过NdeⅠ和XhoⅠ两个限制性酶切位点连接插入到pET28表达载体中，经测序验证序列正确，最终获得Tfu Cas3-L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A的重组表达质粒。然后，通过重叠PCR的方法进行定点突变来获得Tfu Cas3-L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A突变体的核酸序列，其序列如SEQ ID NO. 6所示。
将突变后的重组质粒通过热激法转化到BL21（DE3）的大肠杆菌表达宿主中。在诱导表达过程中，首先用加有卡纳抗性的LB培养基在37℃过夜培养含有该表达质粒的宿主菌，然后按照1：100的比例在37℃进行放大培养，待其OD(600)值达到0.4-0.6时停止培养并放在4℃进行1小时的降温处理，随后加入终浓度0.5mM的异丙基硫代半乳糖（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）在16℃诱导表达12-16h。然后，4℃，15000rpm离心收集细菌，通过高压破碎仪在4℃对菌体进行高压破碎，随后4℃离心收集上清液，然后通过镍柱、肝素柱、Q柱以及分子筛等一步一步实现目的蛋白的分离纯化，最终获得大量的高纯度的目的蛋白，其序列如SEQ ID NO. 5所示。
实施例6：Tfu Cas3-D84A移位酶和Tfu Cas3-L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶控制完整DNA构建体Y穿过纳米孔时移动能力的比较
制备如附图2所示的DNA构建体U，SEQ ID NO：10（区域D）其5’末端连接到4000bp碱基长度的SEQ ID NO：14（区域E），其3’末端连接到4个iSpC18间隔区（区域C），该间隔区连接到50个T的末端（区域A），该DNA构建体的SEQ ID NO：10区域与SEQ ID NO：12（区域F）杂交，而SEQ ID NO：12区域同时又与SEQ ID NO：13（区域G）杂交。
该构建体U与实施例2使用的构建体Z相似，不同在于区域E对应于SEQ ID NO：14。
将制备的DNA构建体U（终浓度0.1nM）分别与Tfu Cas3-D84A移位酶和Tfu Cas3-L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶（终浓度10nM）在室温的缓冲液（10mM Hepes，pH 8.0，100mM KCl，10%甘油，5mM DTT）中预孵育30分钟，添加终浓度810μM的TMAD在35℃催化处理30分钟，在缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的CsgG纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品、ATP（终浓度2mM）和MgCl2（终浓度10mM）一起流入到单个纳米孔实验系统（总体积100μL），在+180mV的恒定电压下测量信号6h（包括潜在的2s的-180mV电压反转）。
分别考察上述两种移位酶控制的DNA的移动。结果表明，在6个小时的运行时间里，对于区域E，每秒中Tfu Cas3-D84A移位酶控制的DNA移动的数目逐渐减少，而Tfu Cas3-L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶在每秒中控制DNA移动的数目在6个小时的运行时间内仅稍微减少。因此，Tfu Cas3-L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A移位酶显示了提高的控制DNA移动的能力，其在整个实验运行过程中保持了相当恒定的移动速度。
实施例7、Tfu Cas3-HhH5th移位酶的制备
根据野生型Tfu Cas3蛋白的氨基酸序列（Accession No.:Q47PJ0, Gene name:Tfu_1593），采用无缝克隆的方法，将编码野生型Tfu Cas3蛋白的核酸序列的N端HD-核酸酶结构域替换为如SEQ ID NO：15所示的螺旋-发卡-螺旋（HhH）结构中如SEQ ID NO：16所示的第五结构域，获得Tfu Cas3-HhH5th移位酶的融合表达质粒。
将该质粒通过热激法转化到BL21（DE3）的大肠杆菌表达宿主中。在诱导表达过程中，首先用加有卡纳抗性的LB培养基在37℃过夜培养含有该表达质粒的宿主菌，然后按照1：100的比例在37℃进行放大培养，待其OD(600)值达到0.4-0.6时停止培养并放在4℃进行1小时的降温处理，随后加入终浓度0.5mM的异丙基硫代半乳糖（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）在16℃诱导表达12-16h。然后，4℃，15000rpm离心收集细菌，通过高压破碎仪在4℃对菌体进行高压破碎，随后4℃离心收集上清液，然后通过镍柱、肝素柱、Q柱以及分子筛等一步一步实现目的蛋白的分离纯化，最终获得大量的高纯度的目的蛋白，其序列如SEQ ID NO. 7所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
实施例8：Tfu Cas3-HhH5th移位酶控制DNA构建体Z穿过纳米孔的能力
制备如附图2所示的DNA构建体Z，SEQ ID NO：10（区域D）其5’末端连接到SEQ IDNO：11（区域E），其3’末端连接到4个iSpC18间隔区（区域C），该间隔区连接到50个T的末端（区域A），该DNA构建体的SEQ ID NO：10区域与SEQ ID NO：12（区域F）杂交，而SEQ ID NO：12区域同时又与SEQ ID NO：13（区域G）杂交。
将制备的DNA构建体Z（终浓度0.1nM）和Tfu Cas3-HhH5th移位酶（终浓度10nM）在室温的缓冲液（10mM Hepes，pH 8.0，100mM KCl，10%甘油，5mM DTT）中预孵育30分钟。在缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的CsgG纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液（600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0）流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品、ATP（终浓度2mM）和MgCl2（终浓度10mM）一起流入到单个纳米孔实验系统（总体积100μL），在+180mV的恒定电压下测量信号6h（包括潜在的2s的-180mV电压反转）。
观察到Tfu Cas3-HhH5th移位酶能够控制DNA构建体Z穿过纳米孔时所进行的移动。
以上实施例仅仅是本发明的较佳实施例而已，本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (14)
1.一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2.编码权利要求1所述的移位酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
4.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含权利要求1所述的移位酶和用于结合多核苷酸的结合部分，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白或双链结合蛋白。
5.权利要求1所述的移位酶或权利要求2或3所述的核苷酸序列或权利要求4所述的构建体在控制目标多核苷酸穿过纳米孔中的应用。
6.一种控制目标多核苷酸穿过纳米孔的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的移位酶或权利要求2或3所述的核苷酸序列或权利要求4所述的构建体。
7.一种控制目标多核苷酸穿过纳米孔的装置，其特征在于，所述装置包含权利要求1所述的移位酶或权利要求2或3所述的核苷酸序列或权利要求4所述的构建体。
8.一种控制目标多核苷酸穿过纳米孔的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将目标多核苷酸与纳米孔，和权利要求1所述的移位酶或权利要求4所述的构建体接触，使得所述移位酶或构建体控制所述目标多核苷酸穿过所述纳米孔；和
（2）获取目标多核苷酸中的核苷酸与所述纳米孔相互作用的一个或多个特征，以表征所述目标多核苷酸，所述构建体包含移位酶和用于结合多核苷酸的结合部分，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白或双链结合蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光测量进行。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述的目标多核苷酸为单链、双链、或至少一部分是双链的。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述的纳米孔为跨膜孔，所述的跨膜孔为生物孔、固态孔或生物与固态交杂的孔。
13.一种包含权利要求2或3所述的核苷酸序列的载体。
14.一种包含权利要求2或3所述的核苷酸序列或包含权利要求13所述的载体的宿主细胞。
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| CN117384867A (zh) | 2024-01-12 |
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