JP2022162206A - 塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラム - Google Patents
塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラム Download PDFInfo
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Abstract
【課題】塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、前記塩基配列変換方法によって得られた塩基配列から作製されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、および塩基配列変換のためのプログラムを提供する。【解決手段】ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する入力部と、入力された塩基配列を変換する変換部と、を含み、変換部は、入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる塩基配列変換装置。【選択図】図４
Description
本出願における開示は、塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラムに関する。
タンパク質の構造や機能等を明らかにするために多くの研究が行われている。そして、タンパク質の研究には、タンパク質を得る必要があり、その過程で、組み換えＤＮＡによる生きた細胞でのタンパク質合成や細胞由来の因子を用いた無細胞タンパク質合成といった手法が開発されている。それら手法により生体組織や細胞から天然のタンパク質を抽出するよりも効率よくタンパク質を得ることができるが、さらにより多くのタンパク質を得ることが求められている。特許文献１および特許文献２には、塩基配列を最適化して、合成されるタンパク質量を増加させることが開示されている。
特許文献１には、コドン使用頻度、ＧＣ含有量、ＤＮＡモチーフ、反復配列、二次構造、逆反復を基準とした品質関数を用いてタンパク質の発現のためにヌクレオチド配列の最適化を行うことが開示されている。また、特許文献２には、コドン使用頻度、ｔＲＮＡ使用量、ＧＣ含有量、リボソーム結合配列、プロモーター、５’－ＵＴＲ、ＯＲＦおよび３’－ＵＴＲ配列を含むタンパク質発現に影響を与えるパラメータおよび因子を考慮して、粒子群最適化アルゴリズムを用い細菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞における遺伝子のタンパク質発現を高めるための遺伝子配列を改良し、最適化することが開示されている。
特許文献１および特許文献２に開示された塩基配列の最適化は、コドン使用頻度、ＧＣ含有量等の多くの情報に基づいて行われている。そこで、出願人は、鋭意研究を行ったところ、特許文献１および特許文献２に開示されたような多くの情報を用いずに、ポリペプチドをコードする塩基配列のコドンを変換させることで、ポリペプチドの合成量を増加させることを新たに見出した。
すなわち、本出願の開示の目的は、塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラムを提供することである。本出願の開示のその他の任意付加的な効果は、発明を実施するための形態において明らかにされる。
（１）ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する入力部と、
入力された塩基配列を変換する変換部と、
を含み、
変換部は、
入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
塩基配列変換装置。
（２）変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
上記（１）に記載の塩基配列変換装置。
（３）ポリペプチドをコードする塩基配列を変換する変換工程を含む塩基配列変換方法であって、
変換工程は、
変換前の塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
塩基配列変換方法。
（４）変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
上記（３）に記載の塩基配列変換方法。
（５）上記（１）および（２）に記載の塩基配列変換装置ならびに上記（３）および（４）に記載の塩基配列変換方法のいずれか一つによって得られた塩基配列から作製されたポリヌクレオチド。
（６）上記（１）および（２）に記載の塩基配列変換装置ならびに上記（３）および（４）に記載の塩基配列変換方法のいずれか一つによって得られた塩基配列からポリヌクレオチドを作製する方法。
（７）ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する処理と、
入力された塩基配列を変換する処理と、
をコンピュータに実行させるプログラムであって、
入力された塩基配列を変換する処理は、
入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
プログラム。
（８）変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
上記（７）に記載のプログラム。
入力された塩基配列を変換する変換部と、
を含み、
変換部は、
入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
塩基配列変換装置。
（２）変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
上記（１）に記載の塩基配列変換装置。
（３）ポリペプチドをコードする塩基配列を変換する変換工程を含む塩基配列変換方法であって、
変換工程は、
変換前の塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
塩基配列変換方法。
（４）変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
上記（３）に記載の塩基配列変換方法。
（５）上記（１）および（２）に記載の塩基配列変換装置ならびに上記（３）および（４）に記載の塩基配列変換方法のいずれか一つによって得られた塩基配列から作製されたポリヌクレオチド。
（６）上記（１）および（２）に記載の塩基配列変換装置ならびに上記（３）および（４）に記載の塩基配列変換方法のいずれか一つによって得られた塩基配列からポリヌクレオチドを作製する方法。
（７）ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する処理と、
入力された塩基配列を変換する処理と、
をコンピュータに実行させるプログラムであって、
入力された塩基配列を変換する処理は、
入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
プログラム。
（８）変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
上記（７）に記載のプログラム。
コドンを変換した塩基配列は、コドンを変換しない塩基配列よりも翻訳によるポリペプチドの合成量を増加させる。
以下、図面を参照しつつ、塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラムについて説明する。なお、本明細書において、同種の機能を有する部位には、同一または類似の符号が付されている。そして、同一または類似の符号の付された部位について、繰り返しとなる説明が省略される場合がある。
（塩基配列変換装置の実施形態）
図１～図４を参照して、実施形態に係る塩基配列変換装置１について説明する。図１は、塩基配列変換装置１の概略図である。図２は、変換されるコドンの５パターンを示す。図３は、コムギにおけるコドン使用頻度が付されたコドン表を示す。図４は、変換されるコドンの各パターンにおける変換例を示す。
図１～図４を参照して、実施形態に係る塩基配列変換装置１について説明する。図１は、塩基配列変換装置１の概略図である。図２は、変換されるコドンの５パターンを示す。図３は、コムギにおけるコドン使用頻度が付されたコドン表を示す。図４は、変換されるコドンの各パターンにおける変換例を示す。
実施形態に係る塩基配列変換装置１は、入力部２と、変換部３と、を少なくとも具備している。なお、図１に示す例では、任意付加的に記憶部４および表示部５を具備している。
実施形態に係る塩基配列変換装置１は、コンピュータにより構成してもよい。コンピュータは、制御部（ＣＰＵ）を具備している。そして、制御部が所定のプログラムを読み込むことにより、塩基配列変換装置１は変換部３を具備することとなる。
入力部２は、塩基配列変換装置１にポリペプチドをコードする塩基配列を入力できれば、特に制限はない。入力部２は、例えば、キーボード、マウスまたはタッチパネルが挙げられる。また、代替的に、ネットワーク（例えば、ＬＡＮやインターネット等）を介してポリペプチドをコードする塩基配列は入力部２に入力されてもよく、この場合、入力部２はネットワークインターフェースの形態で構成されてもよい。さらに代替的に、スキャナや記憶手段を用いて遺伝子配列を入力部２に入力してもよい。また、入力部２に入力される塩基配列は、ＤＮＡ配列でもよくＲＮＡ配列でもよい。なお、本明細書中において、ＤＮＡ配列におけるチミン（Ｔ）とＲＮＡ配列におけるウラシル（Ｕ）は、塩基配列情報として同等であるので、以下において塩基配列を表記した際、チミンはウラシルであってもよく、ウラシルはチミンであってもよい。
入力部２に入力されるポリペプチドをコードする塩基配列は、ポリペプチドをコードする配列を含んでいれば、特に制限はなく、ポリペプチドをコードしていない配列を含んでいてもよい。後述する変換部３でコドンを変換した塩基配列から翻訳されるポリペプチドは、コドンを変換する前と同じである。そのため、入力部２に入力されるポリペプチドをコードする塩基配列がどのようなポリペプチドをコードしているかは既知である。したがって、例えば、入力された塩基配列の５’側に任意の配列がある場合、ポリペプチドをコードする配列はわかっているため、塩基配列中のポリペプチドがコードされた場所からトリプレットをコドンとすればよい。なお、入力される塩基配列がポリペプチドをコードする配列のみである場合には、塩基配列の５’側の先頭からのトリプレットをコドンとすればよい。
変換部３は、入力されたポリペプチドをコードする塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、ポリペプチドをコードする塩基配列のコドンを変換する。
ポリペプチドであるタンパク質を合成する一般的な翻訳の開始過程は以下のように行われる。まずｍＲＮＡの５’末端のキャップ構造を転写開始因子が認識し、小分子リボソームと開始コドンに対応するメチオニン（Ｍｅｔ）を結合したｔＲＮＡがｍＲＮＡに結合する。次に、ｍＲＮＡに結合した小分子リボソームとｔＲＮＡは、メチオニンに対応するコドン（開始コドン）まで３'方向へ移動し、ｔＲＮＡのアンチコドンがｍＲＮＡ上の対応する開始コドンと結合する。そこに大分子リボソームが会合し、リボソームとｍＲＮＡとメチオニンを結合したｔＲＮＡの複合体を形成する。そして、メチオニンの次のコドンに対応するアンチコドンをもったｔＲＮＡがｍＲＮＡ上の対応するコドンと結合して伸長反応が進む。したがって、翻訳の開始過程において、キャップ構造を有するｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリペプチドをコードする配列の開始コドンを認識できる。
しかしながら、ポリペプチドの合成を無細胞系で行う場合には、キャップ構造を有していないｍＲＮＡが用いられる。無細胞系においてもタンパク質は合成されることから、小分子リボソームとメチオニンを結合したｔＲＮＡのｍＲＮＡへの結合は、キャップ構造によるものではない。そのため、タンパク質をコードするｍＲＮＡにメチオニンのコドンであるＡＴＧの配列が多数存在すると、小分子リボソームとメチオニンを結合したｔＲＮＡの結合場所によっては、本来の開始位置でない箇所から翻訳が始まってしまう可能性がある。また、翻訳は５’から３’方向へ行われるが、リボソームが結合するｍＲＮＡは一本鎖であるため、３’から５’方向へのＡＴＧ（５’から３’方向におけるＧＴＡ）となる配列に小分子リボソームとメチオニンを結合したｔＲＮＡが結合するおそれもある。したがって、５’から３’方向、３’から５’方向どちらの方向からみてもＡＴＧ配列を減少させることで、キャップ構造を有していないｍＲＮＡであっても間違った箇所への小分子リボソームとメチオニンを結合したｔＲＮＡの結合を抑制できると考えられる。
そこで、入力されたポリペプチドをコードする塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させるために、変換部３は、当該塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換する。なお、以下において、「５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡ」を「ＡＴＧおよび／またはＧＴＡ」と記載することもある。また、変換部３におけるコドンを変換した塩基配列は、上記したようにキャップ構造を有していないｍＲＮＡに対し有用であるが、キャップ構造を有したｍＲＮＡについても有用である。キャップ構造を有したｍＲＮＡとしても、ポリペプチドをコードする配列中の余計なＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させることができ、キャップ構造を有したｍＲＮＡについても翻訳間違いを抑制できる。
変換部３で変換されるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンは、５つのパターンがある。図２に変換される５つのパターンを示す。図２における枠は一つのコドンを表し、枠内の丸は任意のＡ、Ｔ、ＧまたはＣである。５つのパターンは、（１）連続した二つのコドンにおいて、ＡＴＧが二つのコドンを跨り、５’側のコドンがＡとＴを有し、３’側のコドンがＧを有したパターン、（２）連続した二つのコドンにおいて、ＡＴＧが二つのコドンを跨り、５’側のコドンがＡを有し、３’側のコドンがＴとＧを有するパターン、（３）連続した二つのコドンにおいて、ＧＴＡが二つのコドンを跨り、５’側のコドンがＧとＴを有し、３’側のコドンがＡを有するパターン、（４）連続した二つのコドンにおいて、ＧＴＡが二つのコドンを跨り、５’側のコドンがＧを有し、３’側のコドンがＴとＡを有するパターン、（５）コドンがＧＴＡであるパターン、が挙げられる。
なお、ポリペプチドをコードする塩基配列において、ＡＴＧがコドンとして存在したものは変換されない。ＡＴＧは、メチオニンをコードしているが、図３に示すコドン表にあるようにメチオニンはＡＴＧ以外のコドンで翻訳されない。そのため、ＡＴＧのコドンを変換してしまうと、メチオニン以外に変換することになり、入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えてしまう。したがって、ＡＴＧがコドンである場合は変換されない。よって、本明細書における「入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく」というのは、コドンとしてＡＴＧがある場合は変換しない。
変換されるコドンは、入力されたポリペプチドをコードする塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えなければ、コドンをどのように変換するかは特に制限はない。図３に示すコドン表にあるように、翻訳されるアミノ酸によっては、複数のコドンが存在する。そのようなコドンを変換する場合、例えば、選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンに変換してもよいし、それ以外の頻度のコドンに変換してもよい。また、上記したパターン（１）～（４）のようにＡＴＧおよび／またはＧＴＡが二つのコドンに跨った場合には、５’側または３’側のコドンのどちらか一方を変換してもよいし、両方を変換してもよい。例えば、コドン使用頻度を比較して、コドン使用頻度が高い方のコドンを変換してもよい。なお、コドン使用頻度は宿主によって異なり、ポリペプチドを合成する際に使用する細胞や細胞因子によって適宜入手すればよい。種々の宿主のコドン使用頻度表は、http://www.kazusa.or.jp/codon/より入手可能である。
具体的な例で、コドンの変換を以下で説明する。図４に、上記したパターン（１）～（５）それぞれにおいて、変換するコドンの例を示す。
パターン（１）は、ＧＡＴ－ＧＧＴおよびＣＡＴ－ＧＣＣの２つのコドンが連続して並んだ例を示す。ＧＡＴ－ＧＧＴの例は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とグリシン（Ｇｌｙ）のコドンが並んでいる。そして、ＧＡＴ－ＧＧＴの配列において、翻訳されるアミノ酸を変えることなく、塩基配列中にＡＴＧが現れないようにコドンを変換させる。図３に示すコドン表からアスパラギン酸のコドンは、ＧＡＴ、ＧＡＣである。また、グリシンのコドンは、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧである。そこで、アスパラギン酸のコドンをＧＡＴからＧＡＣに変換する。一方、グリシンのコドンはＧＧＴ以外に変換してもよいが、グリシンのコドンはすべて１番目の塩基がＧであるためＧＧＴから変換しなくてもよい。ＧＡＴをＧＡＣに変換することで、翻訳されるアミノ酸をアスパラギン酸とグリシンとしたままで、塩基配列はＡＴＧを含まないものとなる。
ＣＡＴ－ＧＣＣの例は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）とアラニン（Ａｌａ）のコドンが並んでいる。ヒスチジンのコドンは、ＣＡＴ、ＣＡＣである。また、アラニンのコドンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧである。したがって、上記のＧＡＴ－ＧＧＴと同様に、ＣＡＴ－ＧＣＣにおいて、ヒスチジンのＣＡＴをＣＡＣと変換することで、翻訳されるアミノ酸を変えることなく、塩基配列はＡＴＧを含まないものとなる。
パターン（２）は、ＣＣＡ－ＴＧＧおよびＣＡＡ－ＴＧＣの２つのコドンが連続して並んだ例を示す。ＣＣＡ－ＴＧＧの例は、プロリン（Ｐｒｏ）とトリプトファン（Ｔｒｐ）のコドンが並んでいる。プロリンのコドンは、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧである。また、トリプトファンのコドンは、ＴＧＧである。そうすると、トリプトファンのコドンは１つのみなので、変換することはできない。しかしながら、プロリンのコドンは４つあるため、塩基配列中にＡＴＧが現れないように、プロリンは、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧの３つのいずれかに変換することができ、どのコドンに変換してもよい。図３に示すコドン表に付された数値は、コムギにおけるコドン使用頻度である。例えば、変換するプロリンのコドンをコドン使用頻度が高いものとするのであれば、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧの中でコドン使用頻度が最も高いＣＣＧに変換する。なお、図３におけるコドン使用頻度の数値は、各アミノ酸の頻度合計を１となるように正規化したものである。
ＣＡＡ－ＴＧＣの例は、グルタミン（Ｇｌｎ）とシステイン（Ｃｙｓ）のコドンが並んでいる。図４に示すようにグルタミンのコドンＣＡＡをＣＡＧに変換する。
パターン（３）は、ＡＧＴ－ＡＡＡおよびＧＧＴ－ＡＴＴの２つのコドンが連続して並んだ例を示す。ＡＧＴ－ＡＡＡは、セリン（Ｓｅｒ）とリシン（Ｌｙｓ）のコドンが並んでいる。セリンのコドンは、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧの６つである。この場合、コドンの変換は、翻訳されるアミノ酸が変わらなければよいので、ＡＧＴのＴを変換するＡＧＣだけではなく、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧのいずれかに変換してもよい。したがって、図４に示すように５つのコドンの並びのいずれかに変換する。
ＧＧＴ－ＡＴＴはグリシン（Ｇｌｙ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）の例で、図４に示すように３つのコドンの並びのいずれかに変換する。
パターン（４）は、ＣＴＧ－ＴＡＴおよびＧＣＧ－ＴＡＣの２つのコドンが連続して並んだ例を示す。ＣＴＧ－ＴＡＴはロイシン（Ｌｅｕ）とチロシン（Ｔｙｒ）であり、図４に示すように４つのコドンの並びのいずれかに変換する。また、ＧＣＧ－ＴＡＣは、アラニン（Ａｌａ）とチロシン（Ｔｙｒ）であり、図４に示すように３つのコドンの並びのいずれかに変換する。
パターン（５）は、コドンがＧＴＡの場合である。ＧＴＡは、バリン（Ｖａｌ）のコドンである。バリンのコドンは４つあるため、図４に示すようにＧＴＡ以外の３つのコドンのいずれかに変換する。
変換部３で変換された塩基配列は、変換される前の塩基配列よりもポリペプチド合成量を増加させる。
実施形態に係る塩基配列変換装置１において、記憶部４および表示部５は任意付加的な構成要素である。記憶部４は、ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する処理および入力された塩基配列を変換する処理を行うプログラムを記憶する。また、記憶部４には、入力されたポリペプチドをコードする塩基配列、変換部３で変換された塩基配列等のデータを記憶してもよい。記憶部４としては、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＳＳＤ等のフラッシュメモリ、ＨＤＤ等が挙げられる。
表示部５は、入力部２で入力されたポリペプチドをコードする塩基配列、変換部３で変換された塩基配列を表示できれば、特に制限はない。表示部５としては、例えば、液晶ディスプレイ、ＣＲＴディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ、ＬＥＤディスプレイ等が挙げられる。
（塩基配列変換方法の実施形態）
塩基配列変換方法の実施形態について説明する。実施形態に係る塩基配列変換方法は、ポリペプチドをコードする塩基配列を変換する変換工程を含む。
塩基配列変換方法の実施形態について説明する。実施形態に係る塩基配列変換方法は、ポリペプチドをコードする塩基配列を変換する変換工程を含む。
ポリペプチドをコードする塩基配列を変換する変換工程は、変換前の塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる。塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンの変換は、上記した実施形態に係る塩基配列変換装置１の変換部３で行われるコドンの変換と同様である。
実施形態に係る塩基配列変換装置１および塩基配列変換方法は、以下の効果を奏する。
（１）翻訳されるポリペプチドを変えることなく、塩基配列中のＡＴＧまたは／およびＧＴＡを減らすようにコドンが変換された塩基配列は、コドンを変換する前の塩基配列より翻訳によって合成されるポリペプチドの量を増加できる。
（１）翻訳されるポリペプチドを変えることなく、塩基配列中のＡＴＧまたは／およびＧＴＡを減らすようにコドンが変換された塩基配列は、コドンを変換する前の塩基配列より翻訳によって合成されるポリペプチドの量を増加できる。
（ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを作製する方法の実施形態）
上記の実施形態に係る塩基配列変換装置１および／または塩基配列変換方法によって得られるコドンを変換した塩基配列を用いて、コドンを変換させたポリヌクレオチドを作製できる。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロアミダイト法等の公知の方法で作製できる。
上記の実施形態に係る塩基配列変換装置１および／または塩基配列変換方法によって得られるコドンを変換した塩基配列を用いて、コドンを変換させたポリヌクレオチドを作製できる。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロアミダイト法等の公知の方法で作製できる。
作製されたポリヌクレオチドを用いポリペプチドを合成できる。ポリペプチドは、組み換えＤＮＡによる生きた細胞でのポリペプチド合成や細胞由来の因子を用いた無細胞ポリペプチド合成といった公知の方法で合成できる。
（プログラムの実施形態）
上記の実施形態に係る塩基配列変換装置１は、コンピュータにより構成することができる。その際、コンピュータは既存のものをそのまま使用できる。すなわち、ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する処理と、入力された塩基配列を変換する処理と、をコンピュータに実行させるプログラムを提供することで、コンピュータを塩基配列変換装置１とすることができる。
上記の実施形態に係る塩基配列変換装置１は、コンピュータにより構成することができる。その際、コンピュータは既存のものをそのまま使用できる。すなわち、ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する処理と、入力された塩基配列を変換する処理と、をコンピュータに実行させるプログラムを提供することで、コンピュータを塩基配列変換装置１とすることができる。
以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
［緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコドン変換］
ＧＦＰをコードする塩基配列を用い、翻訳により合成されるＧＦＰを変えることなく、塩基配列中のＡＴＧおよびＧＴＡを減少させるようにコドンの変換を行った。
［緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコドン変換］
ＧＦＰをコードする塩基配列を用い、翻訳により合成されるＧＦＰを変えることなく、塩基配列中のＡＴＧおよびＧＴＡを減少させるようにコドンの変換を行った。
図５に結果を示す。図５Ａは、変換前のＧＦＰオリジナルの塩基配列を示す。図５Ａ中、上記した５パターンのいずれかに該当するＡＴＧまたはＧＴＡは、大きいフォントで示す。また、メチオニンに翻訳されるコドンとしてのＡＴＧは枠で囲っている。図５Ｂは、コドンの変換を行ったＧＦＰ（以下、「変換後ＧＦＰ」と記載することもある。）の塩基配列を示す。図５Ｂ中、下線を引かれているものが変換されたコドンである。
図５Ａに示すように、ＧＦＰオリジナルの塩基配列には、ＡＴＧは２３個あり、その内訳は、パターン（１）のＡＴＧが１５個、パターン（２）のＡＴＧが２個、メチオニンに翻訳されるコドンとしてのＡＴＧが６個であった。また、ＧＴＡは５個あり、その内訳は、パターン（３）のＧＴＡが２個であり、パターン（５）のＧＴＡが３個であった。
ＧＦＰをコードする塩基配列の変換は、パターン（１）～（３）の場合には５’側のコドンを変換した。また、変換できるコドンが複数の場合には、選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンに変換した。図５Ｂに示すように、変換後ＧＦＰの塩基配列には、メチオニンに翻訳されるコドンとしてのＡＴＧ６個以外のＡＴＧまたはＧＴＡは０個となった。
＜実施例２＞
［変換後ＧＦＰの塩基配列によるＤＮＡの作製およびＧＦＰ合成］
変換後ＧＦＰの塩基配列を用い、表１に示すＤＮＡ（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＧＦＰ）を作製した。Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＧＦＰは、受託合成サービス（ユーロフィンジェノミクス株式会社）により作製した。
［変換後ＧＦＰの塩基配列によるＤＮＡの作製およびＧＦＰ合成］
変換後ＧＦＰの塩基配列を用い、表１に示すＤＮＡ（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＧＦＰ）を作製した。Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＧＦＰは、受託合成サービス（ユーロフィンジェノミクス株式会社）により作製した。
作製したＯｐｔｉｍｉｚｅｄ ＧＦＰを用い無細胞系によるＧＦＰの合成を以下の手順で行った。
（１）ＰＣＲによる転写鋳型ＤＮＡの作製
転写鋳型ＤＮＡは、表１に示される１組のプライマー（フォワード側：ＦＷ－Ｅ０２－ＯｐｔＧＦＰ、リバース側：ＲＶ－ＯｐｔＧＦＰ）を設計し、転写鋳型ＤＮＡをＰＣＲにより作製した。ＰＣＲの反応溶液組成を表２に示す。また、反応サイクルを表３に示す。なお、プライマーは、受託合成サービス（ユーロフィンジェノミクス株式会社）により作製した。
転写鋳型ＤＮＡは、表１に示される１組のプライマー（フォワード側：ＦＷ－Ｅ０２－ＯｐｔＧＦＰ、リバース側：ＲＶ－ＯｐｔＧＦＰ）を設計し、転写鋳型ＤＮＡをＰＣＲにより作製した。ＰＣＲの反応溶液組成を表２に示す。また、反応サイクルを表３に示す。なお、プライマーは、受託合成サービス（ユーロフィンジェノミクス株式会社）により作製した。
使用した試薬および機械は以下のとおりである。
・ＰＣＲ酵素：東洋紡株式会社 ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ
・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ：ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製 Ｍａｓｔｅｃｙｃｌｅｒ Ｘ５０ｓ
・ＰＣＲ酵素：東洋紡株式会社 ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ
・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ：ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製 Ｍａｓｔｅｃｙｃｌｅｒ Ｘ５０ｓ
（２）転写反応
次に、作製した転写鋳型ＤＮＡを用いて、翻訳鋳型ｍＲＮＡを作製した。転写反応は、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０の表４に示す反応液を用い、先に作製したＰＣＲ反応溶液（転写鋳型ＤＮＡ含有）２．５μｌを用いて、３７℃で３時間行った。
次に、作製した転写鋳型ＤＮＡを用いて、翻訳鋳型ｍＲＮＡを作製した。転写反応は、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０の表４に示す反応液を用い、先に作製したＰＣＲ反応溶液（転写鋳型ＤＮＡ含有）２．５μｌを用いて、３７℃で３時間行った。
転写反応液２５μｌに対して１０μｌの４Ｍ酢酸アンモニウムを加えてよく混合し、さらに、１００μｌの１００％エタノールを加え転倒混和し、卓上遠心機で数秒間遠心分離した後、－２０℃で１０分静置した。その後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分、４°Ｃ）した。上清を除去後、卓上遠心機を用い数秒間遠心した。再度上清を除去し、沈殿が乾燥するまで静置した。その後、転写反応液２５μｌに対して４０μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（ＤＥＰＣ水）を加え、チップで沈殿をよく懸濁した。ＰＳＳ４０５０プロトコルに従い、１１０μｌ翻訳溶液中のｍＲＮＡ量を３５μｇとなるように核酸濃度測定を行い、８０μｌにフィルアップし、これを翻訳鋳型ｍＲＮＡ溶液とした。
（３）翻訳反応
次に、以下の組成の翻訳反応液を用いて、１６℃のインキュベーターにいれて１０時間反応させた。なお、表５に示す組成のうち、翻訳鋳型ｍＲＮＡを除いた組成液を調製し、その後、この組成液を室温に戻した後に、翻訳鋳型ｍＲＮＡを添加して、泡を立てないようにポンピングして、反応させた。Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ、および、ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘは、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０用いた。
次に、以下の組成の翻訳反応液を用いて、１６℃のインキュベーターにいれて１０時間反応させた。なお、表５に示す組成のうち、翻訳鋳型ｍＲＮＡを除いた組成液を調製し、その後、この組成液を室温に戻した後に、翻訳鋳型ｍＲＮＡを添加して、泡を立てないようにポンピングして、反応させた。Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ、および、ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘは、ＮＵＰｒｏｔｅｉｎ社製ＰＳＳ４０５０用いた。
反応後、反応液をエッペンドルフチューブに回収し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を行い、上清を翻訳完了後のＧＦＰ溶液とした。
＜比較例１＞
コドンを変換しないＧＦＰオリジナルの塩基配列に基づいてＧＦＰの合成を行った。合成手順は、表６に示すＮａｔｉｖｅ ＧＦＰ、ＦＷ－Ｅ０２－ＧＦＰおよびＲＶ－ＧＦＰを用いた以外は、実施例２と同様である。
コドンを変換しないＧＦＰオリジナルの塩基配列に基づいてＧＦＰの合成を行った。合成手順は、表６に示すＮａｔｉｖｅ ＧＦＰ、ＦＷ－Ｅ０２－ＧＦＰおよびＲＶ－ＧＦＰを用いた以外は、実施例２と同様である。
＜実施例３＞
［合成されたＧＦＰの蛍光測定］
実施例２および比較例１で合成されたＧＰＦの蛍光測定を行った。実施例２または比較例１で合成されたＧＦＰを含む溶液２２０μｌを試料とし、波長４７５ｎｍの励起光を照射して、ＧＦＰからの蛍光をプレートリーダで測定した。プレートリーダには、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダ（プロメガ社）を用いた。
［合成されたＧＦＰの蛍光測定］
実施例２および比較例１で合成されたＧＰＦの蛍光測定を行った。実施例２または比較例１で合成されたＧＦＰを含む溶液２２０μｌを試料とし、波長４７５ｎｍの励起光を照射して、ＧＦＰからの蛍光をプレートリーダで測定した。プレートリーダには、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）プレートリーダ（プロメガ社）を用いた。
結果を図６に示す。実施例２および比較例１で合成されたＧＦＰは、蛍光を発した。そして、実施例２は比較例１よりも蛍光量が大きかった。実施例２のＧＦＰと比較例１のＧＦＰは、同じポリペプチド配列である。したがって、実施例２の方が比較例１よりも蛍光量が大きいことから、実施例２で合成されたＧＦＰ量は比較例１で合成されたＧＦＰ量よりも多いということが示された。
以上の実施例より、翻訳されるポリペプチドを変えることなく、塩基配列中のＡＴＧまたは／およびＧＴＡを減らすようにコドンを変換することで、コドンを変換する前の塩基配列より翻訳によるポリペプチドの合成量を増加できることが示された。
本出願で開示する塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラムを用いるとポリペプチドの合成量を増加できる。したがって、タンパク質等のポリペプチドを扱う業者にとって有用である。
１…塩基配列変換装置、２…入力部、３…変換部、４…記憶部、５…表示部
Claims (8)
- ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する入力部と、
入力された塩基配列を変換する変換部と、
を含み、
変換部は、
入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
塩基配列変換装置。 - 変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
請求項１に記載の塩基配列変換装置。 - ポリペプチドをコードする塩基配列を変換する変換工程を含む塩基配列変換方法であって、
変換工程は、
変換前の塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
塩基配列変換方法。 - 変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
請求項３に記載の塩基配列変換方法。 - 請求項１および請求項２に記載の塩基配列変換装置ならびに請求項３および請求項４に記載の塩基配列変換方法のいずれか一つによって得られた塩基配列から作製されたポリヌクレオチド。
- 請求項１および請求項２に記載の塩基配列変換装置ならびに請求項３および請求項４に記載の塩基配列変換方法のいずれか一つによって得られた塩基配列からポリヌクレオチドを作製する方法。
- ポリペプチドをコードする塩基配列を入力する処理と、
入力された塩基配列を変換する処理と、
をコンピュータに実行させるプログラムであって、
入力された塩基配列を変換する処理は、
入力された塩基配列から翻訳されるポリペプチドを変えることなく、
塩基配列中の５’から３’方向におけるＡＴＧおよび／またはＧＴＡの中の、Ａ、ＴおよびＧいずれかの少なくとも一つを含むコドンを変換し、塩基配列中のＡＴＧおよび／またはＧＴＡを減少させる、
プログラム。 - 変換されたコドンは、変換する際に選択できるコドンの中でコドン使用頻度が最も高いコドンである、
請求項７に記載のプログラム。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021066901A JP2022162206A (ja) | 2021-04-12 | 2021-04-12 | 塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラム |
| PCT/JP2022/006052 WO2022219915A1 (ja) | 2021-04-12 | 2022-02-16 | 塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021066901A JP2022162206A (ja) | 2021-04-12 | 2021-04-12 | 塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022162206A true JP2022162206A (ja) | 2022-10-24 |
| JP2022162206A5 JP2022162206A5 (ja) | 2024-04-19 |
Family
ID=83639593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021066901A Pending JP2022162206A (ja) | 2021-04-12 | 2021-04-12 | 塩基配列変換装置、塩基配列変換方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを作製する方法、およびプログラム |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2022162206A (ja) |
| WO (1) | WO2022219915A1 (ja) |
Family Cites Families (4)
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2021
- 2021-04-12 JP JP2021066901A patent/JP2022162206A/ja active Pending
-
2022
- 2022-02-16 WO PCT/JP2022/006052 patent/WO2022219915A1/ja active Application Filing
Also Published As
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|---|---|
| WO2022219915A1 (ja) | 2022-10-20 |
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