KR20230172544A - 면역기능적 담체, 사용 방법, 및 항종양 면역요법으로서의 조성물 물질 - Google Patents

면역기능적 담체, 사용 방법, 및 항종양 면역요법으로서의 조성물 물질 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 암 치료를 위한 조성물 물질 및 방법에 관한 것이다. 특히, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체, 화학요법 약물, 및 임의적인 구성요소 예컨대 마이크로RNA, 메신저 RNA, 플라스미드 DNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 시클릭 디뉴클레오티드를 포함하는 항종양 면역요법으로서의 조성물 물질. 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 치료하는 방법이 또한 이 개시내용의 범주 내에 있다.

Description

면역기능적 담체, 사용 방법, 및 항종양 면역요법으로서의 조성물 물질
관련 출원에 대한 상호-참조
본 특허 출원은 2021년 4월 20일에 출원된, 미국 가출원 일련 번호 63/177,150에 관한 것이고 이의 우선권 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 이 개시내용으로 포함된다.
정부 지원 조항
이 발명은 국립보건원에 의해 수여된 CA232419 및 CA258737 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
서열 목록의 진술
컴퓨터-판독가능한 형태 (CRF)의 서열 목록이 본 출원과 동시에 제출된다. 2 kb의 크기를 갖는, 69447-02_Seq_Listing_ST25_txt라는 제목의 파일은 2022년 3월 30일에 생성된다. 본 출원인은 컴퓨터-판독가능한 형태의 내용이 동일하고 컴퓨터 판독가능한 형태에 기록된 정보가 서면 서열 목록과 동일하다는 것을 진술한다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 암 치료를 위한 조성물 물질 및 방법에 관한 것이다. 특히, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체, 화학요법 약물, 및 마이크로RNA, siRNA, 또는 올리고뉴클레오티드, 핵산, 또는 시클릭 디뉴클레오티드의 임의적인 구성요소를 포함하는 항종양 면역요법으로서의 조성물 물질.
이 섹션은 본 개시내용의 보다 나은 이해를 용이하게 하는데 도움이 될 수 있는 측면을 소개한다. 따라서, 이들 진술은 이에 비추어 해석되어야 하고 선행 기술인지 아닌지에 대한 인정으로 이해되어서는 안 된다.
면역 체크포인트 차단 (ICB)1 및 키메라 항원 수용체 T 세포 요법2의 성공 이후로, 12종이 넘는 면역요법이 지난 몇 년 동안 승인되어 왔고, 수천종의 면역치료제가 현재 개발 파이프라인에 있다3. 그러나, 면역요법은 단지 확인된 종양 항원 및/또는 잘 접근가능한 종양을 갖는 암 환자 중 작은 일부에게만 이익이 된다4. 새로운 치료 전략이 도달하기 어려운, 미확인된 종양을 갖는 보다 넓은 환자 집단에서 면역치료제의 효능을 개선시키기 위해 필요하다.
면역-종양학 공동체에서 관심을 얻는 접근법은 위치를 찾을 수 있고 접근가능한 종양을 국부로 치료하고 항종양 면역을 계내 자극하여 원위 종양에 대해 전신 효과를 발휘하는 것이다5,6. 국부 면역요법의 근거는 적절히 치료된 종양 세포가 종양 항원의 데포로서 역할을 하고 순환 면역 세포를 통해 종양에 대한 전신 면역 반응을 유도한다는 것이다6. 치료제를 종양에 국한시킴으로써, 국부 면역요법은 전통적인 접근법의 유용성을 제한한, 전신 부작용, 예컨대 면역-관련된 유해 사례를 피할 수 있다7. 이 전제에 기반하여, 국부 면역요법 시험의 수는 지난 10년 동안 기하급수적으로 성장해왔으며, 40개 초과의 초기 단계 임상 시험이 진행 중이다8.
효과적인 국부 면역요법을 위해, 여러 이벤트가 일관되게 조정될 필요가 있으며, 이는 종양-연관 항원 (TAA)의 계내 생성, 항원-제시 세포 (APC)의 활성화, 종양 미세환경 (TME)으로의 면역 세포의 침윤, 및 면역활성 TME의 유지를 포함한다. 항종양 면역 반응의 복잡성은 별개의 작용 메커니즘을 갖는 작용제의 조합을 요구한다. 예를 들어, 화학요법 약물은 면역원성 세포 사멸 (ICD)을 유도하여 TAA를 생성하고 손상-연관 분자 패턴 (DAMP)을 방출하는데 사용되며9,10, 이는 사멸하는 세포를 APC 흡수에 취약하게 만든다9. 핵산 및 뉴클레오티드는 이들의 다양한 기능으로 인해 빈번히 이용된다: 작은 뉴클레오티드는 강력한 면역아주반트로서 역할을 할 수 있고11, siRNA는 면역 체크포인트를 차단하는데 사용될 수 있고12, 마이크로RNA는 염증 시토카인 생산을 조절할 수 있다13.
암 요법에서의 다수의 면역치료제의 국부 전달에 대해, 담체 선택은 적어도 3개의 측면에서 중요하다. 첫 번째로, 담체는 종양에서의 치료제의 약리학적 효과를 최대화시키고 이들의 전신 부작용을 예방하기 위해 면역요법을 국부로 유지하는데 도움이 될 수 있다14. 두 번째로, 담체는 다수의 작용제의 공동국부화를 보장할 수 있다15. 예를 들어, ICD를 유도하는 파클리탁셀 (PTX)9 및 면역 체크포인트를 표적화하는 siRNA는 상호보완적인 기능을 위해 조합될 수 있다. 적절히 설계된 담체는 물리화학적 특색을 거의 공유하지 않고 달리 공동국부화시키기 어려울, 2종의 약물을 공동-전달할 수 있다. 세 번째로, 면역아주반트 기능으로 조작된 담체는 항종양 면역을 촉발하는데 활성 역할을 할 수 있으며16,17, 이는 치료 약물의 면역자극 효과와 상승작용한다. 그럼에도 불구하고, 다중 약물의 면역활성 국부 담체를 개발하는 것은 수월하지 않고; 이 목표를 달성하기 위한 초기 노력은 전제제18 또는 구성요소 중 적어도 1종의 전구약물 형성19에 의존했었으며, 이는 개별 약물에 맞춰질 필요가 있다.
여기서, 본 발명자들은 면역 세포를 활성화시키고 소수성 면역원성 세포 사멸 유도인자 및 면역조절 핵산/뉴클레오티드를 공동-전달하는, 폴리에틸렌이민 유도체 (2E')를 개발한다. 2E'의 단일 국부 투여 또는 파클리탁셀 및 PD-L1 siRNA 또는 시클릭 디뉴클레오티드와의 그의 조합은 강한 항종양 면역을 유도하며, 이는 크게 확립된 종양의 즉각적인 퇴행, 무종양 생존, 및 상이한 모델에서의 재챌린지 및 전이에 대한 저항성을 초래한다. 이 연구는 항종양 면역의 효과적인 계내 유도가 원위 및 재발 질환으로부터의 전신 보호를 야기할 수 있다는 것을 지지하며, 여기서 2E'는 면역요법의 단순하고 다목적 담체로서 다중 역할을 한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특색, 및 이점은 하기 설명 및 도면과 함께 고려될 때 보다 명백해질 것이고, 여기서 동일한 참조 번호는, 가능한 경우, 도면에 공통인 동일한 특색을 지정하는데 사용되었고, 여기서:
도 1a-1n. 2E'의 특징화 및 면역자극 활성. 도 1a. LCA-PEI 접합체 (2E')의 구조. 도 1b. 물 중에 조립된 2E'의 TEM 영상. 축척 막대: 100 nm. 도 1c. BMDC, CT26 및 B16F10 세포에서의 2E'의 시험관내 세포독성. (대표적인 배치의 n=3 또는 6회 복제, 평균 ± 표준 편차, SD). 도 1d. 24 h 동안 PEI 및 2E' (7 μg/mL)와 함께 인큐베이션 후 JAWSII DC 상의 성숙 마커 발현. (대표적인 배치의 n=3회 복제, 평균 ± SD). 도 1e. 24 h 동안 2E' 및 PEI와 함께 인큐베이션 후 BMDC에 의한 TNF-α 및 IL-1β 분비 (대표적인 배치의 n=3 또는 4회 복제, 평균 ± SD). 도 1f. 분비된 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP)의 생산에 의해 표시된 2E' 및 PEI에 의한 TLR-5 리포터 세포 활성화 (대표적인 배치의 n=3 또는 4회 복제, 평균 ± SD). 도 1g. CT26 및 B16F10 세포 상의 2E' 및 PEI-유도된 CRT 노출 (대표적인 배치의 n=3회 복제, 평균 ± SD). 도 1h. 식균작용 검정의 스케줄. 도 1i. 7 μg/mL 2E' 없이 (-) 또는 함께 (+) BMDC에 의한 CT26 세포의 식균작용의 유세포 분석법. % CT26+ BMDC: CT26 세포를 흡수하는 BMDC의 분획; % 식균작용된 CT26: BMDC에 의해 흡수된 CT26 세포의 분획 (대표적인 배치의 n=4 또는 5회 복제, 평균 ± SD). 2개의 분획의 계산을 위함. 도 1j. 7 μg/mL 2E' 없이 (-) 또는 함께 (+) BMDC와 함께 인큐베이션된 CT26 세포의 대표적인 공초점 영상 (좌측) 및 CT26 세포 및 BMDC의 공동국부화를 나타내는, 계산된 피어슨 상관 계수 (우측). CT26 세포는 셀트래커(Celltracker) 그린 (녹색)으로, 및 BMDC 세포는 셀트래커 딥레드 (적색)로 염색되었다. 축척 막대: 50 μm. 화살 머리는 CT26 세포 및 BMDC의 공동국부화를 나타낸다. 5개의 영상이 2개의 복제 웰로부터 찍혔다. 도 1k. 상이한 중량비를 갖는 2E'/PTX의 TEM 영상. 축척 막대: 200 nm. 도 1l. 0.2% 트윈-80을 함유하는 수용액 중 2E'/PTX로부터의 PTX 방출 프로파일 (대표적인 배치의 n=3회 복제, 평균 ± SD). 도 1m. 상단: 2E' 대 siPD-L1의 다양한 중량비에서의 2E'/siPD-L1 복합체의 겔 전기영동. 모든 레인은 1 μg siRNA와 동등한 복합체를 함유한다. 하단: 4 h 동안 2.66 μg/mL siPD-L1과 동등한 용량에서의 2E'/Cy3-표지된 siPDL-1 (1.5:1, w/w)과 함께 인큐베이션 후 CT26 세포의 공초점 영상 (청색: 핵, 녹색: 리소솜, 적색: siPD-L1), 축척 막대: 10 μm. 도 1n. 상단: PD-L1 침묵 검정의 스케줄. 하단: 2E'/siNeg 또는 2E'/siPD-L1 (4 μg/mL 2E' 및 2.66 μg/mL siPD-L1)로의 치료 후 IFN-γ-활성화된 B16F10 및 CT26 세포에서의 PD-L1 발현의 웨스턴 블롯 (n = 3 독립적인 시험, 평균 ± SD). p-값은 통상적인 일원 ANOVA (d) 후 터키 다중 비교 검정에 의해, 이원 ANOVA (e, f, g) 또는 일원 ANOVA (n), 및 양측 독립표본 t-검정 (i, j, n) 후 시닥 다중 비교 검정에 의해 계산되었다.
도 2a-2g. 2E'/PTX/siPD-L1의 특징화. 도 2a. 2E'/PTX 대 siPD-L1의 다양한 중량비에서의 2E'/PTX/siPD-L1 복합체의 겔 전기영동. 모든 레인은 1 μg siPD-L1과 동등한 복합체를 함유한다. 도 2b. 2E'/PTX/siPD-L1의 TEM 영상. 축척 막대: 200 nm. 도 2c. CT26 세포, BMDC, 및 비장세포에 대한 2E', PTX, 2E'/PTX 및 2E'/PTX/siPD-L1의 세포독성. 대표적인 배치의 n = 4-6회 복제, 평균 ± SD. p-값은 이원 ANOVA 후 시닥 다중 비교 검정에 의해 계산되었다. CT26 종양에 대한 2E'/PTX/siPD-L1의 항종양 효과. 도 2d. Balb/c 마우스에서의 CT26 종양 접종, 치료 주사, 및 재챌린지의 스케줄. 도 2e. 종양내 (IT) 주사에 의한 1 mg 2E', 0.2 mg/mL PTX, 및 0.67 mg siRNA로 이루어진 2E', 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg 또는 2E'/PTX/siPD-L1로 치료된 종양의 개별 성장 곡선 (그룹당 n=8). 도 2f. 단일 종양내 주사 후 무종양 마우스에서의 제1 재챌린지된 종양의 개별 성장 곡선. 도 2g. 제1 종양 챌린지에 저항하는 무종양 마우스에서의 제2 재챌린지된 종양의 개별 성장 곡선. CR: 완전한 퇴행.
도 3a-3f. B16F10 종양의 성장 및 면역표현형에 대한 2E'/PTX/siPD-L1의 단일 종양내 주사의 효과. 도 3a. C57BL/6 마우스에서의 B16F10 종양 접종 및 치료 주사의 스케줄. 도 3b. 종양내 (IT) 주사에 의한 1 mg 2E', 0.2 mg PTX 및 0.67 mg siRNA로 이루어진 D5W (n=4), 2E' (n=5), 2E'/PTX (n=5), 2E'/PTX/siNeg (n=4) 또는 2E'/PTX/siPD-L1 (n=5)로 치료된 종양의 개별 성장 곡선 및 치료 후 체중 변화. 도 3c. 치료-후 7일차의 TME에서의 면역 세포 (CD11c+ DC, CD11c+CD40+, CD11c+CD86+ 성숙 DC, F4/80+ 대식세포, CD80+ M1-유사 대식세포, CD206+ M2-유사 대식세포, Ly6C+ 단핵구성 및 Ly6G+ 호중구성 MDSC 및 T 세포) 집단. 도 3d. TME에서의 종양 세포 (CD45- 세포), 림프구 (CD45+ 세포), 대식세포 (CD45+F4/80+) 및 MDSC (CD11b+Ly6C+ 또는 CD11b+Ly6G+) 상 PD-L1 발현. 도 3e. 5 μg/mL 흑색종-특이적 항원 Trp2 펩티드 (SVYDFFVWL, 서열식별번호(SEQ ID NO): 5)의 자극 없이 (-) 또는 함께 (+) D5W (n=3), 2E'/PTX/siNeg (n=4) 또는 2E'/PTX/siNeg (n=4)로 치료된 B16F10@C57BL/6 마우스의 비장세포로부터의 IFN-γ 분비. 각각의 쌍은 개별 마우스를 나타낸다. 도 3f. 비장 CD3+ 세포에서의 Trp2 (SVYDFFVWL, 서열식별번호: 5)-특이적 CD8+ T 세포의 빈도. 비장은 치료 후 7일차에 수집되었다 (e, f). p-값은 일원 ANOVA (c,d) 후 던넷 다중 비교 검정, 이원 ANOVA (e) 후 시닥 다중 비교 검정 및 일원 ANOVA (f) 후 터키 다중 비교 검정에 의해 계산되었다. 데이터: 평균 ± SD.
도 4a-4c. B16F10@CT57BL/6 종양 모델에서의 전신 항-종양 효과 (a) 및 면역 기억 (b/c)에 대한 2E'/PTX/siPD-L1의 단일 종양내 주사의 효과. 도 4a. C57BL/6 마우스에서의 양측 B16F10 종양 접종 및 치료 주사의 스케줄; D5W (n=6), 2E'/siPD-L1 + PTX NC (n=8), 2E'/PTX/siNeg (n=9) 또는 2E'/PTX/siPD-L1 (n=9)의 단일 치료 후 치료된 및 비치료된 종양의 치료-후 11일차의 종양 성장 곡선 및 종양 크기; 평균 ± SD. p-값은 일원 ANOVA 후 던넷 다중 비교 검정에 의해 계산되었다. 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 마우스의 일부를 작은 종양 크기에도 불구하고 종양 궤양화로 인해 안락사시켰다는 것을 유의한다. 도 4b. C57BL/6 마우스에서의 B16F10 종양 접종, 치료 주사, 및 재챌린지의 스케줄; D5W (n=4) 및 2E'/PTX/siPD-L1 (n=11)로 치료된 종양의 개별 성장 곡선; 생존 곡선 (p-값: 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의한 vs. D5W); 및 치료 후 체중 변화. CR: 완전한 퇴행. 도 4c. 연령-매치된 나이브 마우스에서의 종양의 개별 성장 곡선; 나이브 및 종양-재챌린지된 마우스의 생존 곡선 (p-값: 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의한 vs. 나이브). 치료는 1 mg 2E', 0.2 mg PTX 및 0.67 mg siPD-L1 (또는 siNeg)을 함유하였다.
도 5a-5c. 4T1 종양의 성장 및 전이에 대한 2E'/PTX/siPD-L1의 단일 투여의 효과. 도 5a. Balb/c 마우스에서의 4T1 종양 접종, 치료 주사, 및 재챌린지의 스케줄; D5W (n=5), 외과적 절제 (n=5), 2E'/PTX/siNeg (n=9), 또는 2E'/PTX/siPD-L1 (n=8)로의 치료 후 4T1 종양-보유 Balb/c 마우스의 생물발광 영상화. 복합체는 1 mg 2E', 0.2 mg PTX 및 0.67 mg siRNA로 이루어졌다. 적색 화살 머리는 폐 전이를 나타낸다. 황색 원의 신호는 이웃 마우스의 강한 신호의 반영이다. 도 5b. 상이한 치료에 반응하여 4T1 종양의 개별 성장 곡선; 치료-후 19일차의 종양의 크기 (평균 ± SD; 크루스칼-월리스 ANOVA 후 던 다중 비교 검정에 의한 p-값); 생존 곡선 (p-값: 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의한 vs. D5W); 및 치료 후 체중 변화. CR: 완전한 퇴행. 도 5c. 생 4T1 세포의 재챌린지 후 연령-매치된 나이브 마우스 및 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 무종양 마우스의 생물발광 영상화; (재)챌린지 후 무종양 마우스의 백분율 (p-값: 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의한 vs. 나이브); 생 4T1 세포로의 재챌린지 후 47일차의 폐의 대표적인 영상.
도 6a-6b. CT26 종양의 성장 및 항종양 면역의 발생에 대한 2E'/PTX/CDN의 단일 종양내 주사의 효과. 도 6a. Balb/c 마우스에서의 CT26 종양 접종, 치료 주사, 및 재챌린지의 스케줄; D5W (n=5), PTX NC+CDN (n=8), 2E'/PTX (n=7) 및 2E'/PTX/CDN (n=7)로 치료된 종양의 개별 성장 곡선; 생존 곡선 (p-값: 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의한 vs. D5W); 및 치료 후 체중 변화. 복합체는 1 mg 2E', 0.2 mg PTX 및 20 μg CDN으로 이루어졌다. CR: 완전한 퇴행. 도 6b. 좌측: 연령-매치된 나이브 마우스에서의 CT26 종양의 개별 성장 곡선; CT26 세포로의 (재)챌린지 후 무종양 마우스의 백분율 (p-값: 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의한 vs. 나이브). 우측: 생존 무종양 마우스 (연령-매치된 나이브 마우스: n=5, 2E'/PTX 치료됨: n=3, 2E'/PTX/CDN 치료됨: n=6)에 접종된 4T1 (관련이 없음) 종양의 성장 곡선, 평균 ± SD, n.s.: 유의하지 않음; 4T1 세포로의 챌린지 후 무종양 마우스의 백분율.
도 7a-7c는 2E' 또는 2E'/PTX의 단일 종양내 주사가 양측 종양을 갖는 CT26@Balb/c 모델에서 종양의 빠른 퇴행 및 항종양 면역 반응을 유도한다는 것을 제시한다. 도 7a. Balb/c 마우스에서의 CT26 종양 접종 및 치료 주사의 스케줄. 도 7b. D5W, 2E' (0.5 mg), 2E' (1 mg) 또는 2E'/PTX (1 mg:0.2 mg)로 치료된 종양의 개별 성장 곡선 및 치료-후 10일차의 치료된 종양의 크기 (그룹당 n=5). CR: 완전한 퇴행. 도 7c. 비치료된 원위 종양의 개별 성장 곡선 및 원발성 종양의 치료-후 10일차의 원위 종양의 크기 (그룹당 n=5). 평균 ± SD; p-값은 크루스칼-월리스 일원 ANOVA 후 던 다중 비교 검정에 의해 계산되었다.
도 8a-8c는 2E' 또는 2E'/PTX의 단일 종양내 주사가 지연된 제2 종양 챌린지를 갖는 CT26@Balb/c 모델에서 종양의 빠른 퇴행 및 항종양 면역 반응을 유도한다는 것을 제시한다. 도 8a. Balb/c 마우스에서의 CT26 종양 접종 및 치료 주사의 스케줄. 도 8b. D5W (n=4), 2E' (2.7 mg) (n=7) 또는 2E'/PTX (2.7 mg:0.4 mg) (n=7)로 치료된 종양의 개별 성장 곡선 및 치료-후 22일차의 치료된 종양의 크기. 평균 ± SD; p-값은 크루스칼-월리스 일원 ANOVA 후 던 다중 비교 검정에 의해 계산되었다. 도 8c. 비치료된 원위 종양의 개별 성장 곡선. CR: 완전한 퇴행.
도 9a-9c는 CT26 종양에 대한 2E'/PTX의 항종양 효과를 제시한다. 도 9a. Balb/c 마우스에서의 CT26 종양 접종, 치료 주사, 및 재챌린지의 스케줄. 도 9b. D5W, 2E' (1.4 mg), 또는 2E'/PTX (1.4 mg:0.2 mg)의 단일 IT 주사 후 종양의 개별 성장 곡선 및 치료된 마우스의 생존 곡선 (그룹당 n=5). p-값: 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의한 vs. D5W. 도 9c. 단일 치료 후 무종양 마우스에서의 재챌린지된 종양의 개별 성장 곡선 및 재-챌린지 후 무종양 마우스의 백분율. CR: 완전한 퇴행.
도 10a는 2E'/PTX의 단일 종양내 주사가 정위 4T1@Balb/c 모델에서 원발성 종양의 불완전한 외과적 제거 후 종양의 재발 및 폐 전이를 감소시킨다는 것을 제시한다. 치료된 마우스의 생존 곡선. 도 10b 및 10c는 2E'/PTX/siPD-L1의 단일 종양내 주사가 CT26 종양을 갖는 Balb/c 마우스의 TDLN에서 종양 퇴행 및 면역표현형 변화를 유도한다는 것을 제시한다. 도 10b. 1 mg 2E', 0.2 mg/mL PTX 및 0.67 mg siRNA로 이루어진 D5W (n=4), 2E' (n=4), 2E'/PTX (n=4), 2E'/PTX/siNeg (n=4) 또는 2E'/PTX/siPD-L1 (n=5)로 치료된 종양의 개별 성장 곡선. 도 10c. 치료-후 7일차의 TDLN에서의 T 세포 및 DC 세포 집단. 평균 ± SD; p-값은 일원 ANOVA 후 던넷 다중 비교 검정에 의해 계산되었다.
도 11은 소수성 약물의 다목적 담체로서의 2E'를 제시한다. 2E'는 다양한 소수성 화합물, 예컨대 ICD 유도인자 [카르필조밉 (CFZ, 선택적 프로테아솜 억제제) 및 캄프토테신 (CPT, DNA 토포이소머라제 억제제)]; 소수성 형광 염료: DiR (DiIC18(7); 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도트리카르보시아닌 아이오다이드); 니플룸산 (관절 및 근육 통증에 사용된 약물); 프로부콜 (항-고지혈증 약물)과 조립 시 구형 입자를 형성한다.
도 12a-12c는 핵산의 담체로서의 2E'를 제시한다. 도 12a. 2E'/PTX 대 pDNA의 다양한 중량비에서의 2E'/PTX/pDNA 복합체의 겔 전기영동. 도 12b. 2E'/PTX/pDNA (1:0.4:0.7)의 TEM 영상. 축척 막대: 200 nm. 도 12c. 2E' 대 mRNA의 다양한 중량비에서의 2E'/mRNA 복합체의 겔 전기영동. 모든 레인은 1 μg pDNA 또는 mRNA와 동등한 복합체를 함유한다.
도 13a-13c는 양측 종양을 갖는 B16F10@C57BL/6 마우스에서의 2E'/PTX/siPD-L1의 항종양 효과를 제시한다. 치료된 (도 13a) 및 비치료된 종양 (도 13b)의 개별 성장 곡선. 도 13c: 하기의 단일 치료 후 생존 곡선 및 체중 변화 (평균 ± SD): D5W (n=6); 2E'/siPD-L1 + PTX NC (n=8); 2E'/PTX/siNeg (n=9); 또는 2E'/PTX/siPD-L1 (n=9). 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 마우스의 일부를 작은 종양 크기에도 불구하고 종양 궤양화로 인해 안락사시켰다는 것을 유의한다.
본 개시내용의 개념은 본원에서 도면 및 설명에 상세하게 예시되고 기재되지만, 도면의 결과 및 이들의 설명은 예시적인 것으로 간주되어야 하고 특징상 제한적이지 않으며; 단지 예시적인 실시형태만이 제시되고 기재되고 본 개시내용의 취지 내에 있는 모든 변화 및 변형이 보호되는 것이 바람직하다는 것이 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은, 하기 용어 및 어구는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해된 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용에서 용어 "약"은 값 또는 범위에서의 변동성의 정도, 예를 들어, 명시된 값 또는 명시된 범위의 한계의 10% 이내, 5% 이내, 또는 1% 이내를 허용할 수 있다. 본 개시내용에서 용어 "실질적으로"는 값 또는 범위에서의 변동성의 정도, 예를 들어, 명시된 값 또는 명시된 범위의 한계의 90% 이내, 95% 이내, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 적어도 약 99.999%, 또는 그 초과를 허용할 수 있다.
이 문헌에서, 단수형 용어는 문맥상 달리 명백히 지시되지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 포함하는데 사용된다. 용어 "또는"은 달리 지시되지 않는 한 비배타적인 "또는"을 지칭하는데 사용된다. 또한, 달리 정의되지 않고, 본원에 이용된 어구 또는 용어가 단지 설명의 목적을 위한 것이고 제한의 것이 아님이 이해되어야 한다. 섹션 제목의 임의의 사용은 문헌의 해석을 돕도록 의도되고 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 추가로, 섹션 제목과 관련된 정보는 해당 특정한 섹션의 내부 또는 외부에서 발생할 수 있다. 더욱이, 이 문헌에서 언급된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 문헌은 개별적으로 참조로서 포함된 바와 같이, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 이 문헌과 참조로서 포함된 이들 문헌 사이의 일치하지 않는 용법의 경우, 포함된 참고문헌의 용법은 이 문헌의 것을 보완하는 것으로 간주되어야 하고; 양립할 수 없는 불일치이 경우, 이 문헌에서의 용법이 지배한다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 관련 기술분야에서 인식되고 임의의 대상 조성물 또는 그의 구성요소를 운반하거나 또는 수송하는데 수반된 제약상-허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 각각의 담체는 대상 조성물 및 그의 구성요소과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용되어야" 한다. 제약상 허용되는 담체로서 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 하기를 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 제약 제제에 이용된 다른 비-독성의 상용성 물질.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "투여하는" 경구 (po), 정맥내 (iv), 근육내 (im), 피하 (sc), 경피, 흡입, 협측, 안구, 설하, 질, 직장 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 환자에게 본원에 기재된 화합물 및 조성물을 도입하는 모든 수단을 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 종래의 비독성 제약상 허용되는 담체, 아주반트, 및 비히클을 함유하는 단위 투여 형태 및/또는 제제로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 예시적인 포맷은 정제, 캡슐, 엘릭시르, 시럽 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 예시적인 경로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막외, 요도내, 흉골내, 근육내 및 피하, 뿐만 아니라 비경구 투여의 임의의 다른 관련 기술분야에서 인식된 경로를 포함한다.
비경구 투여의 예시적인 수단은 바늘 (미세바늘을 포함함) 주사기, 무바늘 주사기 및 주입 기술, 뿐만 아니라 관련 기술분야에서 인식된 비경구 투여의 임의의 다른 수단을 포함한다. 비경구 제제는 전형적으로 부형제 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 약 3 내지 약 9 범위의 pH)를 함유할 수 있는 수용액이나, 일부 적용의 경우, 이들은 멸균 비-수용액 또는 적합한 비히클 예컨대 멸균, 발열원-무함유 물과 함께 사용될 건조된 형태로서 보다 적합하게 제제화될 수 있다. 멸균 조건 하에, 예를 들어, 동결건조에 의한 비경구 제제의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 제약 기술을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다. 화합물의 비경구 투여는 예시적으로 염수 용액의 형태로 또는 리포솜에 포함된 화합물로 수행된다. 화합물이 그 자체로 용해되기에 충분히 가용성이 아닌 경우에, 가용화제 예컨대 에탄올이 적용될 수 있다.
청구된 조합물의 각각의 화합물의 투여량은 하기를 포함하는 여러 인자에 의존한다: 투여 방법, 치료될 상태, 상태의 중증도, 상태가 치료되거나 또는 예방되는지 여부, 및 치료될 사람의 연령, 체중, 및 건강. 추가적으로, 특정한 환자에 대한 약물유전체학 (치료제의 약동학, 약력학 또는 효능 프로파일에 대한 유전자형의 효과) 정보가 사용된 투여량에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 기재된 방법에서, 공동-투여의 개별 구성요소, 또는 조합이 임의의 적합한 수단에 의해, 동시 발생으로, 동시에, 순차적으로, 개별적으로 또는 단일 제약 제제로 투여될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 공동-투여된 화합물 또는 조성물이 별개의 투여 형태로 투여되는 경우에, 각각의 화합물에 대한 1일당 투여된 투여량의 수는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 화합물 또는 조성물은 동일하거나 또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 화합물 또는 조성물은 동시 또는 교대 레지멘에 따라, 요법의 과정 동안 동일하거나 또는 상이한 시간에, 동시에 분할된 또는 단일 형태로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료 유효량" 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 포함하는, 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되고 있는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 활성 화합물 또는 제약 작용제의 해당 양을 지칭한다. 하나의 측면에서, 치료 유효량은 임의의 의학적 치료에 적용되는 합리적인 이익/위험 비로 질환 또는 질환의 증상을 치료하거나 또는 완화시킬 수 있는 것이다. 그러나, 본원에 기재된 화합물 및 조성물의 총 매일 사용량이 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 담당의에 의해 결정될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 임의의 특정한 환자에 대한 특정 치료-유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 이용된 특정 화합물의 활성; 이용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이: 이용된 특정 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도; 치료의 지속기간; 이용된 특정 화합물과 조합되어 또는 동시에 사용된 약물; 및 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 통상의 임상의에게 널리 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다.
투여 경로에 따라, 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg 범위에 속하는 용량을 포함하는 다양한 허용되는 투여량이 본원에서 고려된다. 투여량은 단일 또는 분할될 수 있고, q.d. (1일 1회), b.i.d. (1일 2회), t.i.d. (1일 3회), 또는 심지어 격일로, 1주 1회, 1개월 1회, 1분기 1회 등을 포함하는 다양한 프로토콜에 따라 투여될 수 있다. 이들 경우 각각에서 본원에 기재된 치료 유효량은 투여의 사례, 또는 대안적으로 투여 프로토콜에 의해 결정된 바와 같이, 총 매일, 매주, 매달 또는 분기별 용량에 상응한다는 것이 이해된다.
본원에 기재된 예시적인 투여량 및 투여 프로토콜에 더하여, 본원에 기재된 화합물 중 임의의 1종 또는 혼합물의 유효량이 공지된 기술의 사용에 의해 및/또는 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관측함으로써 담당 진단의 또는 의사에 의해 결정될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 유효량 또는 용량을 결정하는데 있어서, 다수의 인자가 담당 진단의 또는 의사에 의해 고려되며, 이는 인간을 포함하는 포유동물의 종, 그의 크기, 연령, 및 전반적인 건강, 수반된 특정 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 정도 또는 관여 또는 중증도, 개별 환자의 반응, 투여된 특정 화합물, 투여 방식, 투여된 제제의 생체이용률 특징, 선택된 용량 레지멘, 병용 의약의 사용, 및 다른 관련된 상황을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "환자" 또는 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물 예컨대 반려 동물 (개 및 고양이 등) 및 가축 동물을 포함한다. 가축 동물은 식량 생산을 위해 사육된 동물이다. 치료될 환자는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
본원에 개시된 바와 같은, 소형 간섭 RNA (siRNA)는 RNA 간섭에 수반된, 20-25개의 염기쌍을 갖는 이중-가닥 RNA 분자를 지칭하는 고유한 용어이다. 이들 다른 RNA에 대한 정의는 문헌 [Zhang, P. et al., J. Integr. Bioinform. 2019 Sep; 16(3): 20190027]에서 찾아볼 수 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 화학요법 약물 또는 소수성 분자를 포함하는 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물은 마이크로RNA, 메신저 RNA, 플라스미드 DNA, 소형 간섭 RNA (siRNA), 올리고뉴클레오티드, 또는 시클릭 디뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 siRNA는 PD-L1 siRNA이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 화학요법 약물 또는 소수성 분자는 파클리탁셀, 소라페닙, 이트라코나졸, 도세탁셀, 독소루비신, 보르테조밉, 카르필조밉, 캄프토테신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 시타라빈, 빈크리스틴, 이리노테칸, 암포테리신, 니플룸산, 프로부콜, 인도메타신, 젬시타빈, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 소수성 염료 또는 그의 염이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 소수성 염료는 DiR'; DiIC18(7) (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3' 테트라메틸인도트리카르보시아닌 아이오다이드), 시아닌7, 시아닌 5, 또는 그의 허용되는 염을 포함하는 소수성 형광 염료이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 폴리에틸렌이민 유도체는 리토콜산 (LCA), 콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 글리코케노데옥시콜산, 타우로케노데옥시콜산, 또는 그의 허용되는 염에 의해 변형된/접합된 폴리에틸렌이민이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 폴리에틸렌이민은 약 2,500 Da 내지 250,000 Da의 분자량 범위를 갖는다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물 물질은 종양내로 투여된다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물 물질은 전신으로 투여된다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조성물 물질을 1종 이상의 희석제, 부형제, 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 마이크로RNA, 메신저 RNA, 플라스미드 DNA, 소형 간섭 RNA (siRNA), 올리고뉴클레오티드, 또는 시클릭 디뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 siRNA는 PD-L1 siRNA이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 화학요법 약물은 소수성 화학요법 분자이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 소수성 화학요법 약물은 파클리탁셀, 소라페닙, 이트라코나졸, 도세탁셀, 독소루비신, 보르테조밉, 카르필조밉, 캄프토테신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 시타라빈, 빈크리스틴, 이리노테칸, 암포테리신, 니플룸산, 프로부콜, 인도메타신, 젬시타빈, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 폴리에틸렌이민 유도체는 리토콜산 (LCA), 콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 글리코케노데옥시콜산, 타우로케노데옥시콜산, 또는 그의 허용되는 염에 의해 변형된/접합된 폴리에틸렌이민이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 폴리에틸렌이민은 약 2,500 Da 내지 약 250,000 Da의 분자량 범위를 갖는다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물 물질은 종양내로 또는 전신으로 투여된다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 본원에 개시된 바와 같은 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물은 필라멘트 형태를 취할 수 있다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌이민 유도체 및 소수성 염료를 포함하는 진단 목적을 위한 조성물 물질에 관한 것이다.
일부 다른 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리에틸렌이민 유도체 및 소수성 염료를 포함하는 진단 목적을 위한 조성물 물질에 관한 것이며, 여기서 상기 소수성 염료는 DiR'; DiIC18(7) (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3' 테트라메틸인도트리카르보시아닌 아이오다이드), 시아닌7, 시아닌 5, 또는 그의 허용되는 염을 포함한다.
효과적인 국부 면역요법을 위해, 여러 이벤트가 일관되게 조정될 필요가 있으며, 이는 종양-연관 항원 (TAA)의 계내 생성, 항원-제시 세포 (APC)의 활성화, 종양 미세환경 (TME)으로의 면역 세포의 침윤, 및 면역활성 TME의 유지를 포함한다. 항종양 면역 반응의 복잡성은 별개의 작용 메커니즘을 갖는 작용제의 조합을 요구한다. 예를 들어, 화학요법 약물은 면역원성 세포 사멸 (ICD)을 유도하여 TAA를 생성하고 손상-연관 분자 패턴 (DAMP)을 방출하는데 사용되며9,10, 이는 사멸하는 세포를 APC 흡수에 취약하게 만든다9. 핵산 및 뉴클레오티드는 이들의 다양한 기능으로 인해 빈번히 이용된다: 작은 뉴클레오티드는 강력한 면역아주반트로서 역할을 할 수 있고11, siRNA는 면역 체크포인트를 차단하는데 사용될 수 있고12, 마이크로RNA는 염증 시토카인 생산을 조절할 수 있다13.
암 요법에서의 다수의 면역치료제의 국부 전달에 대해, 담체 선택은 적어도 3개의 측면에서 중요하다. 첫 번째로, 담체는 종양에서의 치료제의 약리학적 효과를 최대화시키고 이들의 전신 부작용을 예방하기 위해 면역요법을 국부로 유지하는데 도움이 될 수 있다14. 두 번째로, 담체는 다수의 작용제의 공동국부화를 보장할 수 있다15. 예를 들어, ICD를 유도하는 파클리탁셀 (PTX)9 및 면역 체크포인트를 표적화하는 siRNA는 상호보완적인 기능을 위해 조합될 수 있다. 적절히 설계된 담체는 물리화학적 특색을 거의 공유하지 않고 달리 공동국부화시키기 어려울, 2종의 약물을 공동-전달할 수 있다. 세 번째로, 면역아주반트 기능으로 조작된 담체는 항종양 면역을 촉발하는데 활성 역할을 할 수 있으며16,17, 이는 치료 약물의 면역자극 효과와 상승작용한다. 그럼에도 불구하고, 다중 약물의 면역활성 국부 담체를 개발하는 것은 수월하지 않고; 이 목표를 달성하기 위한 초기 노력은 전제제18 또는 구성요소 중 적어도 1종의 전구약물 형성19에 의존했었으며, 이는 개별 약물에 맞춰질 필요가 있다.
여기서, 본 발명자들은 중합체성 유전자 담체20 및 톨-유사 수용체 (TLR)-5 효능제인21 폴리에틸렌이민 (PEI)의 양극성 변형에 기반하여, 국부 적용을 위한 면역치료제의 새로운 담체를 개발하였다. 본 발명자들은 소수성 약물을 수용하고 면역아주반트 기능을 증진시키기 위해 APC에 대한 면역자극 효과를 갖는 소수성 담즙산인22 리토콜산 (LCA)을 PEI의 플랭크에 접합시켰다. 본 발명자들은 PEI-LCA 접합체 (2E')가 물 중에서 초분자 조립을 형성하고, 단순한 혼합에 의해 소수성 약물 및 핵산 둘 다를 로딩하고, APC를 자극하여 활성 성분의 활성을 보완한다는 것을 입증한다. PTX와 함께, 2E'의 단일 종양내 투여는 종양의 즉각적인 퇴행을 유도하고 CT26 종양 모델에서 항종양 면역을 생성한다. PD-L1을 표적화하는 siRNA (siPD-L1) 또는 시클릭 디뉴클레오티드 (CDN)의 추가적인 혼입은 추가로 면역자극 효과를 증진시키며, 이는 단일 투여 후 다수의 모델에서 크게 확립된 종양의 퇴행 및 무종양 생존을 야기한다. 항종양 면역의 국부 유도는 전신 항종양 면역 및 종양 재챌린지 및 전이로부터 생존 동물을 보호하는 면역 기억을 활성화시킨다. 이 면역활성 복합체의 강력한 항종양 활성은 합리적으로-설계된 약물 담체의 중요성을 입증하고 효과적인 국부 면역요법에 의해 도달하기 어려운 종양을 치료하는 것의 실현가능성을 지지한다.
결과
2E' (폴리에틸렌이민-리토콜산 접합체)는 수지상 세포 (DC)에 덜 독성이고, 암 세포에 선택적으로 독성이고, PEI보다 생체내 더 안전하다.
2E' (도 1a)는 카르보닐디이미다졸을 통해 2:1 몰비로 LCA를 PEI에 접합시킴으로써 합성되었다23. 수성 배지에서, 2E'는 2.6 μg/mL의 임계 조립 농도로 LCA 모이어티로 인해 나노입자 조립을 형성하였다 (도 1b). 2E'는 골수-유래된 DC (BMDC)보다 CT26 및 B16F10 세포에 더 독성이었다 (도 1c). 암 세포가 정상 세포보다 비교적 더 음이온성인 표면을 전시하는 경향이 있기 때문에24,25, 2E'의 선택적 독성은 전하 차이에 기반하는 암 세포에 대한 친화도에 의해 설명될 수 있다. 문헌은 암 세포에 대한 선택적 독성이 양이온성 중합체의 공유된 특색인 것을 지지하고 (26, 27); 실제로, 2E' 및 PEI 둘 다는 정상 비장세포보다 CT26 세포에 더 큰 독성을 나타냈다. 세포독성 프로파일에서의 유사성에도 불구하고, 2E' 및 PEI는 종양내 주사 시 주목할 만한 차이를 나타냈다. 2.74 mg/마우스에서 PEI를 받은 모든 마우스 (7/7)는 48 h에 사망한 반면에, 어떠한 것 (0/7)도 2E'-치료된 그룹 (2.74 mg/마우스에서의 2E')에서 사망하지 않았다. PEI는 전신으로 투여될 때 폐 손상과 연관된 충격을 초래하는 것으로 공지되어 있다26. 차등 생체내 독성이 이들의 전신 흡수의 정도로부터 생성되었는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 Cy7-표지된 PEI 및 2E'를 종양내로 CT26 종양에 투여하였고 전신 형광 영상화에 의해 이들의 잔류를 모니터링하였다. 2E'는 아마 나노입자 입체형태로 인해, PEI보다 더 천천히 주사 부위로부터 사라졌다 (도 1b). 비교적 느린 흡수는 종양내로-주사된 2E'의 생체내 독성을 약독화시켰을 수 있다.
2E'는 면역아주반트로서 역할을 하고 APC에 의한 암 세포 흡수를 증진시키고, PTX 및 siPD-L1을 운반하고, CT26@Balb/c 및 4T1@Balb/c 모델에서 항종양 반응을 유도한다.
PEI는 TLR-521 및 Nlrp3 염증소체17,27의 공지된 효능제이다. 2E'가 PEI의 면역자극 효과를 유지하였는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 2E'를 골수-유래된 골수 세포 및 JAWSII DC에 적용하였다. 2E'는 BMDC 및 JAWSII DC의 성숙을 유도하였고 (도 1d) BMDC 및 BMDM으로부터의 종양 괴사 인자-α (TNF-α) 및 인터류킨-1β (IL-1β), 염증소체 활성화의 지표의 생산을 촉진하였다28 (도 1e). TLR 리포터 세포주를 사용한 비색 검정은 2E'가 TLR-5 신호전달을 활성화시켰다는 것을 나타냈다 (도 1f). 2E'도 PEI도 내독소 오염의 잠재적인 인공물을 제외하고, 비교할 만한 농도에서 TLR-4 신호전달을 활성화시키지 않았다. 추가적으로, 2E'로 치료된 CT26 및 B16F10 세포는 ICD의 징후인29 세포 표면 칼레티쿨린 (CRT)을 노출시켰다 (도 1g). 모든 시험에서, 2E'는 PEI보다 더 큰 반응을 유도하였으며, 이는 LCA 펜던트의 면역자극 활성에 기인할 수 있다22. 본 발명자들은 LCA가 용량 의존적 방식으로 BMDC 성숙을 자극한다는 것을 확인하였고 LCA가 PEI와 조합될 때 PEI의 면역자극 효과를 증가시킨다는 것을 제시하였다. 그럼에도 불구하고, LCA 및 PEI의 부가적인 효과는 PEI와 2E' 사이의 차이가 PEI 및 LCA + PEI의 차이보다 더 컸기 때문에, 2E'의 개선된 면역자극 효과를 완전히 설명하지 않는다. 2E'의 우수한 활성은 또한 NP 입체형태의 형성에 기인될 수 있으며, 이는 수-불용성 LCA의 가용화 및 세포 흡수를 촉진한다. 2E'의 면역자극 활성에 기반하여, 본 발명자들은 2E'가 종양 항원 (예를 들어, ICD를 겪은 종양 세포30,31)을 흡수하는 APC의 능력을 증진시켰는지 여부를 시험하였다. 본 발명자들은 DC 또는 BMDM을, 2E'와 함께 또는 없이, 유형-I ICD 유도인자9,30,32인 PTX로 미리-치료된 CT26 또는 B16F10 세포와 공동-배양하였고 (도 1h), 유세포 분석에 의해 암 세포의 APC 흡수를 정량화하였다. 암 세포를 흡수하는 DC 또는 BMDM의 분획 및 DC 또는 BMDM에 의해 흡수된 암 세포는 실질적으로 2E'에 따라 증가하였다 (도 1i, 1j). 이들 결과는 2E'가 면역아주반트로서 역할을 하고 종양 항원의 APC 흡수를 증진시킴으로써 항종양 면역 반응의 초기 단계를 용이하게 한다는 것을 시사한다.
LCA 플랭크의 소수성 및 PEI 백본의 양성 전하로 인해, 2E'는 PTX를 캡슐화시키고 siPD-L1과 복합체를 형성하였다. PTX-캡슐화된 2E' (2E'/PTX) 입자는 구형이고 2E'와 유사하게, ~20 nm 직경인 것으로 측정되었다 (도 1k). 1:0.4 (2E':PTX)의 중량비에서, 2E'/PTX는 23.4 ± 6.3 wt% (총 사용된 PTX의 81.9%)의 평균 PTX 로딩을 갖고 72 h 동안 수용액 중에서 캡슐화된 PTX의 32%를 방출하였다 (도 1l). 보다 큰 2E' 함량을 갖는 2E'/PTX (1:0.2, w/w)는 보다 천천히 PTX를 방출하였으며 (72 h에 21%), 이는 소수성 LCA 클러스터가 PTX 방출을 제어하였다는 시사한다. 1 부분의 2E'는 0.67 부분만큼의 siPD-L1과 복합체를 형성하였으며, 이는 에티듐 브로마이드를 배제한 완전한 복합체를 형성한다 (도 1m). 2E'/siPD-L1은 리포펙타민(Lipofectamine)2000/siPD-L1 복합체 (L2k/siPD-L1)만큼 효율적으로 CT26 세포에 진입하고 인터페론-γ (IFN-γ)-자극된 B16F10 및 CT26 세포 상의 PD-L1 발현을 억제하였다 (도 1n).
본 발명자들은 국부로 투여된 2E' 또는 2E'/PTX가 항종양 효과를 갖고 전신 항종양 면역을 유도하였는지 여부를 시험하기 위해 일련의 생체내 연구를 수행하였다. 첫 번째로, 본 발명자들은 2E' 또는 2E'/PTX를 Balb/c 마우스에서의 양측 CT26 종양 중 하나에 투여하였고 치료된 및 비치료된 원위 종양에 대한 효과를 관측하였다 (압스코팔 효과) (도 7a). 2E' (마우스당 1 mg) 또는 2E'/PTX (마우스당 1 mg 2E' + 0.2 mg PTX)의 단일 종양내 주사는 치료된 종양의 유의한 약독화 또는 박멸을 유도하였으며, 각각의 그룹에서의 마우스의 60%는 치료된 종양의 완전한 퇴행 (CR)을 나타냈다 (도 7b). 비치료된 원위 종양의 경우, 2E' 또는 2E'/PTX 그룹은 5% 덱스트로스 (D5W) 비히클 그룹보다 명백히 더 느린 종양 성장을 나타냈으나, 차이는 무의미하였다 (도 7c). 두 번째로, 본 발명자들은 보다 긴 모니터링과 함께 보다 높은 용량 (마우스당 2.7 mg 2E' 또는 2.7 mg 2E' + 0.4 mg PTX)에서 2E' 및 2E'/PTX를 시험하였다 (도 8a). 이번에는, 본 발명자들은 항종양 면역을 발생시키기 전 과도한 성장을 피하기 위해 원발성 종양의 치료 후 6일차에 원위 종양을 접종하였다. 2E' 및 2E'/PTX 둘 다는 마우스의 57%에서 원발성 종양의 성장을 억제하였지만, D5W-치료된 그룹에서의 마우스는 종양 퇴행을 나타내지 않았다. 2E'와 2E'/PTX 사이에서, 후자는 명백히 느린 종양 성장을 나타냈으며, 이는 치료-후 22일차의 종양 크기에서 D5W 대조군과의 유의한 차이를 초래한다 (도 8b). 비치료된 원위 종양에서, 2E' 및 2E'/PTX 그룹은 각각 57% 및 71% 마우스에서 종양 성장을 나타내지 않았지만, 나이브 마우스의 86%는 종양을 성장시켰다 (도 8c).
그러나, 관측된 CR은 아마 2차 종양에 대한 억제 효과를 갖는 원발성 종양을 기재하는 현상인 수반되는 종양 저항성으로 인해, D5W 그룹에서의 모든 4마리의 마우스가 또한 종양 성장을 나타내지 않았기 때문에, 반드시 전신 항종양 면역을 나타내지 않는다33. 세 번째로, 본 발명자들은 2E'/PTX가 종양의 면역 기억을 확립하였는지 여부를 시험하였다 (도 9a). 단일 종양내 주사 후, 2E'/PTX (마우스당 1.4 mg 2E' + 0.2 mg PTX)는 동물의 60%에서, 및 2E'는 40%에서 치료된 종양의 CR을 유도하였다 (도 9b). CR로 생존하는 동물은 초기 치료 후 17일차에 대측 측면에 생 CT26 세포로 재챌린지되었다. 모든 나이브 마우스는 2주에 종양을 성장시켰으나, 2E'는 2마리의 무종양 마우스 중 1마리에서 및 2E'/PTX는 3마리 중 2마리에서 종양 성장을 예방하였다 (도 9c). 최종적으로, 2E'/PTX는 Balb/c 마우스에서의 정위 루시페라제-발현 4T1 (4T1-Luc) 유방 종양으로 시험되었다 (도 10). 종양은 외과적으로 제거되었고 덩어리가 잔류되었으며, 이는 D5W 또는 2E'/PTX (마우스당 0.2 mg 2E' + 0.2 mg PTX)로 국부로 치료되었다 (도 10a). D5W 그룹에서의 모든 5마리의 마우스는 17일차에 종양 재발 및 폐 전이를 나타냈으며, 이는 치료 후 25일에 생존 동물을 남기지 않았다 (도 10b, 10c). 대조적으로, 2E'/PTX 그룹에서의 5마리의 마우스 중 2마리는 원발성 부위 및 폐에서 종양 신호를 나타내지 않고 적어도 50일 (관측 기간) 동안 생존하였다. 이들 결과는 면역자극제로서의 2E'가 종양 성장을 억제하였고 항종양 면역을 활성화시킬 가능성이 있었으며, 추가적인 PTX가 효과를 증진시키는 것을 시사한다.
2E'는 PTX 및 siPD-L1을 동시에 운반한다.
본 발명자들은 면역 체크포인트 상호작용을 차단함으로써 항종양 면역을 추가로 증진시키기 위해 siPD-L1을 2E'/PTX에 첨가하였다. 2E'/PTX/siPD-L1 조합은 1:0.2:0.67의 중량비에서 완전한 복합체를 형성하였다 (도 2a). 2E'/PTX/siPD-L1의 제타 전위 (+28.9 ± 1.0 mV)는 2E'/PTX의 것 (+44.6 ± 0.3 mV)보다 더 낮았으며, 이는 siPD-L1의 첨가를 반영한다. 3원 복합체는 50 nm의 평균 직경을 갖는 구형 형상을 나타냈다 (도 2b). 2E'/PTX/siPD-L1은 2E'/PTX보다 더 크게 나타났으며 (도 1b), 이는 siPD-L1이 다수의 2E'/PTX'와 복합체를 형성하였다는 것을 시사한다. 동적 광 산란에 의해 측정된 2E'/PTX/siPD-L1 (1/0.2/0.67, w/w/w)의 z-평균 (264.4 nm)은 TEM 측정 (50 nm)보다 ~5배 더 컸으며, 이는 수성 배지에서 현탁된 복합체가 어느 정도의 응집을 겪는다는 것을 나타낸다. 2E'/PTX/siPD-L1 및 2E'/PTX는 2E' 또는 PTX 단독보다 CT26 세포에 더 독성이었으며 (도 2c), 이는 2E' 및 PTX의 상승작용적 효과 (모든 시험된 수준에서의 2E'/PTX 및 2E'/PTX/siPD-L1에 대한 < 1의 조합 지수 (CI))를 나타낸다. 그러나, 2E'/PTX/siPD-L1 뿐만 아니라 PTX 또는 2E'/PTX는 ≤ PTX 2 μg/mL (및 2E' 10 μg/mL)에서 BMDC 및 비장세포에 대한 유의한 세포독성을 나타내지 않았다 (도 2c). 이 결과는 2E'의 차등 세포 상호작용 및 세포독성 (도 1c) 및 PTX에 대한 면역 세포의 공지된 저항성과 일치한다34. 수성 배지에서의 siRNA-매개된 복합체화 및 약한 정도의 응집의 징후에도 불구하고, 2E'/PTX/siPD-L1은 암 세포에 진입하고, 암 세포의 70%를 사멸시키고, 생존 IFN-γ-자극된 CT26 및 B16F10 세포에서 PD-L1 발현을 억제하였다. 2E'/PTX/siPD-L1은 BMDC 및 BMDM으로부터의 TNF-α 및 IL-1β의 분비를 유도하였다. siPD-L1을 대조군 siRNA (siNeg)로 대체하는 것은 하나의 농도를 제외하고는 시토카인 분비에 대한 무시할 만한 효과를 가졌으며, 이는 siRNA 서열의 역할을 배제한다. 2E'/PTX/siPD-L1은 또한 CT26 및 B16F10 세포 상의 CRT의 노출을 유도하였다. 이들 결과는 2E'가 PTX 및 siPD-L1을 동시에 운반하여, 암 세포에 대한 선택적 독성을 제공하고, APC를 자극하고, PD-L1 발현을 침묵시키는, 각각의 구성요소의 활성을 유지할 수 있다는 것을 지지한다.
2E'/PTX/siPD-L1의 단일 종양내 주사는 종양 퇴행을 유도하고 CT26@Balb/c 모델에서 반복된 종양 챌린지로부터 동물을 보호한다.
본 발명자들은 2E'/PTX/siPD-L1의 단일 종양내 주사가 항종양 면역을 발생시키는데 도움이 되었는지 여부를 시험하였다. 첫 번째로, Balb/c 마우스에서의 CT26 종양은 2E', 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg, 또는 2E'/PTX/siPD-L1로 치료되었다 (도 2d). 이전 결과와 일치하여, 2E' 그룹은 마우스의 50%에서, 및 2E'/PTX는 75%에서 CR을 나타냈다. 2E'/PTX/siPD-L1은 또한 마우스의 75%에서 CR을 나타낸 반면에, 2E'/PTX/siNeg 그룹은 37% 무종양 마우스를 가졌다 (도 2e). 무종양 동물은 치료 후 30일차에 대측 측면에 105개의 생 CT26 세포로 재챌린지되었다. 2E'/PTX/siNeg 그룹에서 하나를 제외하고 모두 재챌린지에 저항하였으며, 이는 2E'의 단일 치료 및 PTX와의 모든 조합이 항종양 면역을 발생시키는데 도움이 되었다는 것을 나타낸다 (도 2f). 그러나, 2E'/PTX/siPD-L1로 치료된 무종양 마우스는 이들이 20x 더 많은 생 CT26 세포 (2 x 106개)로 2회 재챌린지되었을 때 가장 잘 수행하였다. 2E', 2E'/PTX, 및 2E'/PTX/siNeg 그룹에서의 동물의 적어도 일부는 제2 챌린지 후 10-15일에 기하급수적인 종양 성장을 나타냈으나, 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 마우스는 다른 것과 비교하여 종양을 성장시키지 않거나 (CR: 50%) 또는 성장을 약화시켰다 (도 2g). 이들 결과는 모든 시험된 복합체가 항종양 면역 기억을 발생시켰다는 것을 입증하고; 이들 중에서, 2E'/PTX/siPD-L1은 생 종양 세포의 다중 재챌린지를 받은 생존 마우스에서 종양 성장을 억제하기에 충분한, 가장 강한 보호 면역을 나타냈다. 2E'/PTX/siNeg는 원발성 종양 제어 및 재챌린지에 대한 저항성에서 2E'/PTX보다 명백히 열등하였다. 본 발명자들은 siNeg가 기능적 활성 없이, 면역자극 효과에 중요한35-37, 단지 2E'의 양성 전하를 약화시켰다는 것을 추측한다. 반복된 연구에서, 본 발명자들은 치료에 반응하여 DC 성숙 및 T 세포 확장을 관측하기에 최적 시간인38 치료 후 7일차에 종양 면역환경을 검사하였다. 치료를 받은 CT26 종양이 이 시점에 분석하기에 너무 작기 때문에, 본 발명자들은 종양-배출 림프절 (TDLN)을 분석하였다. 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg, 및 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 그룹은 D5W-치료된 대조군과 비교하여 CD8+ T 세포 및 성숙 DC에서의 명백한 증가 및 CD4+ T 세포에서의 감소를 나타냈다 (도 10b/10c). 이들 결과는 2E' (도 1) 및 PTX (도 10b/10c)의 면역자극 효과 뿐만 아니라 이전 연구에서 관찰된 항종양 면역 기억 (도 2f, 2g)과 일치한다.
2E'/PTX/siPD-L1의 단일 종양내 주사는 불량한 면역원성 B16F10 종양에서 면역활성 표현형을 유도하고 유지한다.
본 발명자들은 치료된 종양의 면역표현형을 검사하는데 불량한 면역원성 B16F10 흑색종 모델을 사용하였다. 치료는 종양이 ~150 mm3 (CT26 종양보다 적어도 3배 더 큼)로 성장하여 (도 3a) 분석에 충분한 크기를 제공할 때 제공되었다. 다시, 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 그룹이 가장 효과적이었다 (도 3b). D5W 그룹의 종양은 이미 치료-후 7일에 종점에 접근한 반면에, 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 그룹의 것은 이 시간 동안 거의 성장하거나 또는 수축하지 않았다. 치료된 마우스 중 어떠한 것도 체중에서의 유의한 변화 (도 3b) 또는 실질 기관에서의 병변을 나타내지 않았으며, 이는 7일에 국부로 투여된 복합체의 안전성을 시사한다.
치료 후 7일에 수집된 종양은 유세포 분석 (도 3) 및 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석되었다. 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg, 또는 2E'/PTX/siPD-L1로 치료된 종양은 D5W로 치료된 것과 비교하여, 명백히 더 성숙 DC 및 대식세포를 가졌으며 염증-유발 CD80+ M1-유사 표현형으로 편향되었다 (도 3c). 흥미롭게도, 2E'/PTX 및 2E'/PTX/siNeg는 D5W 그룹과 비교하여 종양에서의 골수-유래된 억제인자 세포 (MDSC)의 백분율을 증가시켰다. 그러나, 2E'/PTX/siPD-L1 치료된 그룹은 MDSC 분획에서의 증가를 나타내지 않았다. 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg, 및 2E'/PTX/siPD-L1은 종양으로의 CD8+ T 세포 침윤을 증가시켰다 (도 3c). CD4+ T 세포는 유사하게 이들 그룹에서 증가하였다. 그러나, 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 종양은 CD4+ T 세포에서의 조절 T 세포 (Treg)의 최소 분획을 가졌으며, 이는 D5W 대조군 그룹보다 유의하게 더 높은 CD8+/Treg 비를 나타낸다. 이들 결과는 면역억제 세포의 유입에 저항하는, 2E'/PTX/siPD-L1이 가장 면역활성 표현형을 유지하였다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 또한 종양 미세환경에서의 PD-L1 발현을 결정하였다 (도 3d). 2E'/PTX 또는 2E'/PTX/siNeg-치료된 종양은 D5W-치료된 종양보다 유의하게 더 높은 PD-L1 발현을 나타냈다. 대식세포 및 MDSC를 포함하는, 종양 세포 및 면역 세포 둘 다는 증가된 PD-L1 발현의 경향을 나타냈으며, 이는 2E'/PTX-매개된 면역자극에 대한 음성 피드백을 시사한다. PD-L1 발현이 면역억제 MDSC로의 미성숙 골수 세포의 전환을 유도하고39 Treg의 분화 및 기능을 증진시킨다는40 것이 보고된다. 2E'/PTX 및 2E'/PTX/siNeg-치료된 종양에서의 증가된 PD-L1 발현은 MDSC 및 Treg의 증가된 집단과 일치한다 (도 3c). 대조적으로, 2E'/PTX/siPD-L1은 PD-L1의 과다발현을 예방하였다 (도 3d). 그러므로, 비교적 낮은 수준의 MDSC 및 Treg를 유지하는 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 그룹의 능력은 siPD-L1의 침묵 효과에 기인될 수 있다. PD-L1 발현 프로파일 및 면역 세포 집단은 총체적으로 2E'/PTX/siPD-L1이 면역자극 TME를 유도할 뿐만 아니라 (2E' 및 PTX에 기반함) 하나를 유지하였다는 (siPD-L1에 기반함) 것을 나타낸다. RNA 시퀀싱은 종양 성장 및 면역표현형 결정 결과와 일치하는 경향을 나타냈다 (도 3). 2E'/PTX/siNeg 및 2E'/PTX/siPD-L1 치료는 D5W 대조군과 비교하여, 종양-지지 시토카인, 예컨대 IL-6, LIF, IL-10, TNF, IL-1a의 발현을 억제하였다. RNA 시퀀싱은 또한 2E'/PTX/siNeg-치료된 종양에서 그러나 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 것에서는 아닌, PD-L1 코딩 유전자인 상승된 수준의 Cd274를 지지하였다.
2E'/PTX/siPD-L1의 단일 종양내 주사는 B16F10 종양에서 전신 항종양 면역 및 면역 기억을 프라이밍한다.
국부 항종양 면역의 활성화가 전신 항종양 면역으로 번역되었는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 치료 후 7일에 B16F10 종양-보유 마우스의 비장세포를 수집하였고 이들을 B16F10 흑색종-연관 항원인41 Trp2 펩티드로 자극하여, IFN-γ 생산을 측정하였다 (도 3e). 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 마우스의 비장세포는 D5W- 또는 2E'/PTX/siNeg-치료된 그룹보다 더 많은 IFN-γ를 생산하였으며, 이는 전신 항종양 면역의 활성화를 나타낸다. 이 활성화가 CD8+ T 세포를 수반하였는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 MHCI-Trp2 펩티드 사량체 복합체에 결합하는 CD8+ T 세포를 정량화하였다. 2E'/PTX/siPD-L1은 D5W 또는 2E'/PTX/siNeg와 비교하여 Trp2+ CD8+ T 세포의 유의한 증가를 유도하였으며 (도 3f), 이는 종양-특이적 T 세포 반응을 지지한다.
전신 항종양 면역의 증거에 기반하여, 본 발명자들은 2E'/PTX/siPD-L1이 D5W 및 2E'/PTX/siNeg와 비교하여, C57BL/6 마우스의 양측 B16F10 종양에서 비치료된 원위 종양에 대한 압스코팔 효과를 가질 것인지 여부를 시험하였다 (도 4a, 도 13). 전신으로 흡수된 PTX가 역할을 할 가능성을 배제하기 위해, 2E'/siPD-L1 및 PTX의 혼합물이 또한 비교되었다 (낮은 물 용해도로 인해, PTX는 나노결정으로서 혼합물에 포함되었으며42,43, 이는 B16F10 모델에서 상업 PTX 제제 (아브락산(Abraxane))보다 우수하였음43). 종양 항원-특이적 T 세포의 전신 활성화와 일치하여 (도 3e, 3f), 2E'/PTX/siPD-L1은 치료된 및 비치료된 원위 종양 둘 다에서 2E'/PTX/siNeg 및 2E'/siPD-L1 + PTX 혼합물보다 더 잘 종양 성장을 지연시켰으며, 치료-후 11일차에 양 측면에서 가장 작은 종양 크기를 생성하였다 (마지막 시점 모든 그룹은 생존하였음). 2E'/PTX/siPD-L1 및 2E'/siPD-L1 + PTX 혼합물의 비교는 비치료된 원위 종양이 PTX가 2E' (2E'/PTX/siPD-L1)에 캡슐화되었을 때 더 잘 억제된다는 것을 시사한다: 즉, 원위 종양에 대한 효과는 전신으로 흡수된 PTX의 기능보다, PTX의 잔류가 유익한, 국부 이벤트의 결과일 것이다.
본 발명자들은 이어서 2E'/PTX/siPD-L1 치료가 B16F10 종양에서 항종양 면역 기억을 생성할 것인지 여부를 질문하였다 (도 4b, 4c). 본 발명자들은 B16F10-보유 마우스를 D5W 및 2E'/PTX/siPD-L1로 치료하고 재현가능한 초기 종양 성장 패턴을 확인하였다 (도 3). D5W 그룹에서의 모든 마우스는 치료 후 8일에 종점에 도달하였다. 그러나, 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 동물은 치료로부터 31일의 중앙값 생존 시간을 나타냈으며, 마우스의 27%에서 CR을 유도하였다. 생존 무종양 마우스는 치료 후 54일차에 대측 측면에 105개의 생 B16F10 세포로 재챌린지되었다. 모든 연령-매치된 나이브 마우스는 14일에 종양을 발생시키고 접종 후 33일에 종점에 도달하였다. 2E'/PTX/siPD-L1 치료된 그룹에서의 3마리의 무종양 마우스 중에서, 1마리는 성장하는 종양 없이 재챌린지 후 16일차에 미지의 이유로 사망하였고; 다른 것은 재챌린지 후 18일차에 종양을 나타냈으며, 48일에 종점까지 성장하였고; 세 번째 것은 재챌린지 후 105일 (관측 기간)에 종양을 발생시키지 않았다. 재챌린지된 종양의 성장이 지연되거나 또는 없는 것은 2E'/PTX/siPD-L1로의 국부 치료가 B16F10 종양의 면역 기억을 확립한다는 것을 시사한다.
2E'/PTX/siPD-L1의 종양내 주사는 4T1 종양의 성장 및 전이를 억제한다.
2E'/PTX/siPD-L1의 광범위한 유용성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 자발적으로 림프절, 혈액, 폐, 간, 뇌 및 뼈를 포함하는 다수의 원위 부위로 전이하지만 원발성 종양은 인간 유방 종양이 그러한 바와 같이 존재하는46, 또 다른 불량한 면역원성 종양 모델인44,45 정위 4T1-Luc 종양에서 이를 3개의 대조군 그룹 (D5W, 2E'/PTX/siNeg, 및 임상 시나리오를 모방하는 완전한 외과적 절제)과 비교하여 시험하였다 (도 5). D5W 그룹에서, 종양은 기하급수적으로 성장하였고, 모든 동물은 널리 퍼진 전이와 함께 19일에 생리학적 종점에 도달하였다. 수술 그룹에, 80%는 수술로부터 13일에 수술 부위에서의 종양 재발을 나타냈고, 모두 폐 전이를 17일에 나타내고 25일에 종점에 도달하였다. 대조적으로, 비록 2E'/PTX/siNeg 및 2E'/PTX/siPD-L1-치료된 그룹은 치료 후 (1일에) 발광 신호의 즉각적인 손실 및 (2일에) 종양의 수축을 나타냈지만, 이들 중 대부분은 나중에 재성장하였다. 폐 전이의 발생은 또한 이들 치료에 의해 감소되었으며, 2E'/PTX/siNeg 그룹에서의 55% 및 2E'/PTX/siPD-L1 그룹에서의 88%는 치료 후 17일까지 폐에서 발광 신호를 나타내지 않았다. 중앙값 생존 시간은 30일 (2E'/PTX/siNeg) 및 35일 (2E'/PTX/siPD-L1)이었다. 2E'/PTX/siNeg-치료된 그룹은 CR을 나타내지 않은 반면에, 2E'/PTX/siPD-L1 그룹은 25% CR을 가졌다. 2E'/PTX/siPD-L1 그룹에서의 2마리의 무종양 마우스는 대측 측면에 4T1-Luc 세포로 재챌린지되었다. 재챌린지로부터 47일 (관측 기간)에 종양을 성장시키지 않은 반면에, 모든 연령-매치된 나이브 마우스는 11일에 성장시켰다 (도 5c). 이들 결과는 2E'/PTX/siPD-L1의 단일 치료가 원발성 종양 및 전이 둘 다의 관리에서 임상 벤치마크 치료인 외과적 제거를 능가하였다는 것을 입증하며, 이는 생존 동물에서 항종양 면역 기억을 확립한다.
STING 효능제인 시클릭 디뉴클레오티드 (CDN)와 조합된 2E'/PTX는 확립된 종양을 제거하고 CT26@Balb/c 모델에서 항종양 면역을 발생시킨다.
다른 약물을 운반하기 위한 2E'의 적용가능성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 siPD-L1을 인터페론 유전자 (STING) 경로의 자극인자의 효능제인47 CDN (2'3'-c-디-AMP의 비스포스포로티오에이트 유사체)으로 대체하고, 3개의 대조군 그룹 (D5W, PTX 나노결정 + CDN 혼합물, 2E'/PTX)과 함께, CT26 모델에서 이를 시험하였다 (도 6). PTX + CDN 혼합물은 D5W 대조군과 비교하여 종양 성장을 지연시켰으며, 이는 24 내지 35일의 중앙값 생존 시간을 연장하고 13% CR을 달성하였다. 2E'/PTX는 45일의 중앙값 생존 시간 및 43%의 CR 비율로 PTX + CDN 혼합물보다 더 효과적이었다. 2E'/PTX/CDN은 가장 우수한 항종양 효과를 나타냈다: 치료된 마우스의 86%가 단일 치료 후 무종양 생존하였다. 생 CT26 세포로 재챌린지될 때, 무종양 마우스 중 어떠한 것도 66일 (관측 기간) 동안 재챌린지된 종양을 성장시키지 않았지만, 모든 연령-매치된 나이브 마우스는 11일에 성장시켰고 34일에 사망하였다. 이들 결과는 2E'/PTX/CDN의 단일 종양내 치료가 확립된 종양을 박멸하고 종양의 침윤으로부터 치유된 동물을 보호한, 강한 항종양 면역 반응을 유도하였다는 것을 나타낸다. 2E'/PTX 또는 2E'/PTX/CDN 치료를 갖는 생존 동물은 관련이 없는 동계 4T1 종양을 거부하지 않았으며 (도 6b), 이는 항종양 면역이 종양-특이적이었다는 것을 나타낸다.
논의
면역요법은 암 요법에서 극적인 결과를 나타냈으나, 현재 반응 속도의 최대 한계는 개선된 접근법에 대한 필요를 나타낸다. 여기서 본 발명자들은 면역활성 나노입자, PTX 및 siPD-L1 또는 CDN을 운반하는 2E'가 단일 국부 투여 시 확립된 종양의 즉각적인 퇴행을 유도하고 항종양 면역의 활성화를 증진시켰으며, 이는 생존 동물의 전신, 장기간 보호를 야기한다는 것을 제시한다. 각각의 구성요소는 항종양 면역을 활성화시키는데 별개의 역할을 하였으며, 2E'는 면역아주반트 효과로 인해 종양에 대한 선천적 면역을 자극하고 (도 1d-1j) PTX 및 2E'는 ICD (즉, 종양 항원의 계내 생성)를 유도하고 (도 2c), 이는 이어서 종양에 대한 T-세포 면역을 활성화시킨다. siPD-L1은 달리 면역 체크포인트 상호작용 및 MDSC 및 Treg 모집에 관여할 PD-L1의 종양 발현을 예방함으로써 후기 단계에 기여하였다 (도 3c-f). CDN은 선천적 면역 반응을 활성화시키는데 2E' 및 PTX를 활용하였다48. 이들 3원 복합체는 유사한 종양 모델에서 최근에 보고된 국부 면역치료제보다 우수하거나 또는 이와 비교할 만하였다19,49. 예를 들어, 2E'/PTX/siPD-L1 (도 4, 5)은 단일 종양내 투여 후 치료로부터 중앙값 생존 시간 (B16F10 모델에서 31d vs. 21d49 및 4T1 모델에서 35d vs. 24d49) 및 % CR (B16F10 모델에서 27% vs. 0%49 및 4T1 모델에서 25% vs. 0%49)에서 STING 효능제를 운반하는 미세제조된 폴리락트-코-글리콜산 입자와 유리하게 비교된다49. 2E'/PTX/siPD-L1 (도 2 및 5) 및 2E'/PTX/CDN (도 6)은 또한 STING 효능제를 운반하는 캄프토테신 전구약물-기반 히드로겔과 비교할 만하며, 이는 광범위한 적용가능성의 추가적인 이점과 함께, 단일 종양내 주사 후 확립된 CT26 종양의 퇴행을 유도하고 4T1 종양의 성장 및 전이를 지연시켰다19. 게다가, 2E'/PTX/CDN은 문헌에서의 용량 (4 x 10 μg49, 1 x 40 μg49, 또는 3 x 20 μg50)의 1/2 또는 1/3인 20 μg CDN을 함유하였으나 단일 투여 후 86% CR 및 종양-특이적 면역을 달성하였다.
2E'는 이를 암의 국부 면역요법에 고유하게 적합하게 만드는 여러 뛰어난 특색을 갖는다. 첫 번째로, 담체는 그 자체로 면역활성이고, 모 중합체 PEI17,21 뿐만 아니라 접합된 LCA22의 고유한 특성에 기인한다. 양극성 PEI 유도체의 자기-조립에 의한 나노입자 형성 (도 1b)은 또한 중합체와 APC의 상호작용을 증진시켰을 수 있다. 두 번째로, 2E'는 면역 세포 (BMDC 및 비장세포)와 비교하여 암 세포에 대한 선택적 독성을 가지며, 이는 병에 걸린 암 세포에서의 ICD 표현형 (CRT 노출)을 초래한다 (도 1g). 암 세포는 에너지 생산을 위한 특이한 해당 경로를 겪어, 이로써 큰 양의 락트산을 분비하며, 이는 원형질막을 정상 세포보다 더 음으로 하전되게 만든다24. 밀집한 음성 전하는 2E'와의 상호작용을 용이하게 하였을 수 있으며, 이는 BMDC에 비해 CT26 및 B16F10 세포에 대한 2E'의 선택적 독성을 설명한다. 암 세포에 대한 면역활성 및 독성에 기반하여, 2E' 단독은 치료된 종양을 약독화시키거나 또는 억제하였다. 그러나, PTX, siPD-L1, 또는 CDN의 혼입은 추가로 항종양 효과를 증가시키고 강한 항종양 면역 기억을 확립하는데 도움이 되었다 (도 2-6). 그러므로, 2E'의 제3 특색은 상호보완적인 기능을 야기하나 담체 없이 공동-전달하기 어려운, 소수성 항암 약물 및 음으로 하전된 핵산 또는 뉴클레오티드 둘 다와의 그의 상용성이다. 2E', PTX, 및 siPDL-1의 조합은 2E' 및 PTX의 상승작용적 효과 (도 2c) 및 siPD-L1의 세포내 전달을 포함하는 유리한 결과를 생성한다. 본 발명자들은 2E'가 면역활성제의 다양한 조합의 전달에 적합할 것임을 구상한다. 2E'는 각각 소수성 LCA 코어 및 양이온성 PEI 백본을 통해 PTX 및 siPD-L1을 운반하고; 그러므로, PTX를 다른 소수성 ICD 유도인자로 (도 11) 및 siPD-L1을 상이한 siRNA, 뉴클레오티드 예컨대 CDN로 (도 6), 또는 다른 핵산으로 (도 12) 대체하는 것이 가능하다. 2E'의 모듈성 및 핵산 치료제의 다목적 기능은 담체 또는 약물의 재설계를 필요로 하지 않으면서 종양의 유형에 따라 포괄적인 조합을 개발하는 것을 허용할 것이다. 2E'의 이들 특색은 이 연구를 단순한 약물 담체로서 유사한 PEI-LCA 접합체를 사용하거나51 또는 PTX 및 siPD-L1을 상이한 담체 중에 조합한18 다른 것과 구별한다.
요약하면, 본 발명자들은 소수성 약물 및 핵산/뉴클레오티드의 면역자극 담체인 2E'를 개발하였다. 2E' 및 PTX 및 siPD-L1 또는 CDN과의 그의 조합은 단일 국부 투여에 의해 강력한 항종양 면역을 유도하였으며, 이는 다중 종양 모델에서의 크게 확립된 종양의 즉각적인 퇴행 및 무종양 생존을 초래한다. 치료된 동물은 TME 및 종양-특이적 T 세포 반응에서 면역활성 표현형을 나타내고 전이 또는 재챌린지에 저항하였으며, 이는 전신 항종양 면역 및 면역 기억의 유도를 나타낸다. 이 연구는 항종양 면역의 효과적인 계내 유도가 원위 및 재발 질환으로부터의 전신 보호를 야기할 수 있다는 것을 지지하고; 2E'는 항종양 면역에 수반된 다수의 이벤트를 다루는 화학요법 약물 및 핵산의 조합을 수용함으로써 국부 면역요법을 위한 단순하고 다목적 플랫폼을 제공한다.
물질 및 방법
물질
선형 폴리에틸렌이민 염기 형태 (PEI 염기 형태, MW: 2.5 kDa) 및 폴리에틸렌이민 히드로클로라이드 (PEI 염 형태, 2.5 kDa PEI 염기 형태와 동등한 MW 4 kDa)를 폴리사이언시스, 인크.(Polysciences, Inc.) (펜실베니아주 워링턴)로부터 구매하였다. 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI), 리토콜산 (LCA, ≥97%), 및 EtBr (10 mg/mL)을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스)로부터 구매하였다. D-루시페린 포타슘 염을 골드 바이오테크놀로지(Gold Biotechnology) (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구매하였다. 마우스 pdcd1lg1 mRNA에 특이적인 siRNA, 센스, 5'-CCCACAUAAAAAACAGUUGTT-3', 서열식별번호: 1; 안티센스, 5'- CAACUGUUUUUUAUGUGGGTT-3', 서열식별번호: 2; 음성 siRNA (센스, 5'-UGAAGUUGCACUUGAAGUCdTdT-3', 서열식별번호: 3; 안티센스, 5'-GACUUCAAGUGCAACUUCAdTdT-3', 서열식별번호: 4) 및 Cy5-표지된 음성 siRNA를 IDT (미국 아이오와주 코랄빌)로부터 구매하였다. iTAg 사량체/APC- H-2 Kb TRP2 (SVYDFFVWL)를 MBL 인터내셔널 코포레이션(MBL International Corporation) (매사추세츠주 우번)으로부터 구매하였다. 시클릭 디뉴클레오티드 (CDN)-2'3'-c-디-AM(PS)2 (Rp,Rp)를 인보트로젠(InvotroGen) (캘리포니아주 샌디에이고)으로부터 구매하였다. 반딧불이 루시페라제-발현 플라스미드 DNA (pLuc)를 이전에 보고된 바와 같이 DH5-α 적격 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에서 복제하였다52. 클린캡(CleanCap)® EGFP mRNA (mRNA)를 트리링크 바이오테크놀로지스(TriLink BioTechnologies) (캘리포니아주 샌디에이고)로부터 구매하였다.
2E' 합성 및 특징화
2E'는 이전 보고에 기재된 바와 같이 합성되었다23. 간단하게, 8.7 mg (50 μmol)의 CDI 및 15.8 mg의 LCA (40 μmol)를 교반 하에 2.7 mL의 클로로포름 중에 용해시켰다. 1 h 후, 혼합물을 60 ℃에서 50 mg의 PEI 염기 (2.5 kDa) (20 μmol)를 함유하는 10 mL 클로로포름 용액에 천천히 첨가하고 24 h 동안 교반 하에 반응시켰다. LCA-PEI 접합체 (2E')를 95% 에탄올에 이어, 산성화된 탈이온 (DI) 물에 대해 투석에 의해 정제하였다 (분자량 컷-오프 (MWCO): 1000 Da). 2E' 또는 PEI의 형광 표지화를 위해, 20 mg의 2E' 또는 PEI를 술포-cy5-NHS (1 mg)를 함유하는 무수 에탄올 (0.5 mL) 중에 분산시켰다. 반응 용액을 암실에서 24 h 동안 교반하고 1 kDa의 분자량 컷 오프로 투석 백을 사용하여 DI 물에 대해 투석하였다. 2E' 및 PEI 염기를 DMSO 중에 용해시키고 BBFO 프로브가 구비된 브루커(Bruker) DRX500-2 NMR 분광계에 의해 분석하였다.
2E'의 임계 조립 농도 (CAC)의 측정
2E'를 DI 물 중에 2 mg/mL로 용해시키고 단계적으로 DI 물에 의해 1.5x10-5 mg/mL로 희석하였다. 0.5 mL의 각각의 용액에, 아세톤 중 5 μL의 나일 래드 용액 (2 mg/mL)을 첨가하여 552 nm에서의 여기에 의해 636 nm에서의 방출 스펙트럼을 기록하였다.
2E'의 세포 상호작용
암컷 Balb/c 마우스로부터 수득된 CT26 세포 및 비장세포를 눈크(Nunc)™ 유리 바닥 접시 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 3 x105개의 밀도로 시딩하고 1 h 동안 인큐베이션하였다. 세포를 헹구고, 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 5 μg/mL 밀 배아 응집소-알렉사 플루오르(Alexa Fluor)™ 647 접합체로 10분 동안 염색시키고, 니콘(Nikon) A1R 공초점 현미경에 의해 영상화하였다.
2E'/PTX 및 2E'/PTX/siPD-L1의 제조 및 특징화
2E' 및 PTX의 2원 복합체 (2E'/PTX)를 제조하기 위해, 2E' 및 PTX를 둥근-바닥 플라스크에서 클로로포름/에탄올 혼합물 (3:1, v/v) 중 상이한 중량비에서 혼합하고, 회전 증발에 의해 건조시켜 플라스크의 벽에 박막을 형성하고, 배쓰 초음파처리에 의해 5분 동안 DI 물 중에 수화시켰다. 2E'/siPDL-1 2원 복합체를 30분 동안 실온에서 중량비를 변경하면서 뉴클레아제-무함유 물 중에 2E' 및 siPD-L1의 공동-인큐베이션에 의해 제조하였다. 2E', PTX, 및 siPD-L1의 3원 복합체 (2E'/PTX/siPD-L1)를 2E'/PTX를 siRNA와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 제조하였다. 3원 복합체의 형성은 1.1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인되었다. 모든 복합체의 크기 및 제타 전위는 말번(Malvern) 제타사이저 나노 ZS90 (영국 우스터셔)에 의해 결정되었다. 이들의 형태학은 1% 우라닐 아세테이트로의 음성 염색 후 FEI 테크나이(Tecnai) T20 투과 전자 현미경 (오리건주 힐스버러)에 의해 검사되었다.
2E'/PTX로부터의 PTX의 시험관내 방출
200 μg의 PTX와 동등한 1 밀리리터의 2E'/PTX (2.5:1, w/w) 또는 2E'/PTX (5:1, w/w)를 투석 카세트 (MWCO: 10 kDa)에 놓고, 15 mL의 0.2% 트윈 80 수용액에 배치하고, 25 ℃에서 일정한 교반 하에 인큐베이션하였다. 시간 간격에서, 전체 방출 배지를 신선한 배지로 대체하였다. 각각의 시점에서 샘플링된 배지에서의 PTX의 양은 아센티스(Ascentis) C18 칼럼 (25 cm x 4.6 mm, 입자 크기 5 mm)이 구비된 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템 (캘리포니아주 팔로 알토)에 의해 분석되었다. 이동상은 물 및 아세토니트릴 (50:50)로 구성되고 1 mL/분으로 전개되었다. PTX는 UV 검출기에 의해 227 nm의 파장에서 검출되었다.
종양 세포에서의 CRT 발현
2x105개의 CT26 또는 B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 밤새 시딩하였다. 세포 배양 배지를 다양한 농도에서 2E', PEI, PTX, 2E'/PTX 또는 2E'/PTX/siPD-L1을 함유하는 배지로 대체하였다. 6 h 또는 24 h 후, 세포를 수집하고, 염색 완충제 중에 재현탁시키고, 항-마우스 CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 비-특이적 결합을 차단하고, 알렉사 플루오르 488-접합된 항-CRT 모노클로날 항체 (ab196158, 압캠(Abcam))로 염색시켰다. 세포를 BD 아큐리(Accuri) C6 유세포 분석기를 사용한 분석 전 0.5 μg/mL 프로포듐 아이오다이드와 함께 1분 동안 인큐베이션하였다. CRT 노출을 시각화하기 위해, 2x105개의 CT26 또는 B16F10 세포를 공초점 접시에 시딩하고, 상이한 치료와 함께 24 h 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 상기와 동일한 방식으로 염색시키고, 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 고정된 세포의 공초점 영상을 2 μg/mL 훽스트(Hoechst) 33342로의 간단한 염색 후 니콘 A1R 공초점 현미경 (니콘 아메리카 인크.(Nikon America Inc.), 뉴욕주 멜빌)으로 찍었다.
BMDC 및 BMDM 분화
골수-유래된 수지상 세포 (BMDC) 및 골수-유래된 대식세포 (BMDM)는 마우스 골수 세포로부터 분화되었다. 골수를 암컷 Balb/c 또는 수컷 C57BL/6 마우스 (7주령)의 대퇴골로부터 수집하고, 여러 회 피펫팅하고, 100 및 40 μm 세포 스트레이너를 통해 통과시켜 단일-세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 500 rcf에서 8분 동안 원심분리에 의해 수집하고, ACK 용해 완충제로 처리하고, 헹구고, 100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10 mM β-메르캅토에탄올, 20 ng/mL 뮤린 GM-CSF 및 20% 소 태아 혈청으로 보충된 알파 최소 필수 배지 (MEM-알파, 리보뉴클레오시드, 데옥시리보뉴클레오시드, 4 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트) 중에 배양하였다. 7일 후, 부유하거나 또는 느슨한 부착성 세포는 원심분리에 의해 수집되고 APC 항-마우스 CD11c 항체 표지화에 의해 BMDC로서 확인되었다. 부착성 세포는 FITC 항-마우스 F4/80 항체 표지화에 의해 BMDM으로서 확인되었다.
BMDC 및 BMDM 자극
BMDC 또는 JAWSII DC (ATCC)를 비-조직 배양 처리된 6-웰 플레이트에 웰당 2 x 105개로 플레이팅하고 3 μg/mL 또는 7 μg/mL의 2E' 또는 PEI와 함께 인큐베이션하였다. 24 h 인큐베이션 후, 세포를 수집하고, 염색 완충제 중에 재현탁시키고, Fc-차단 항체와 함께 15분 동안 4 ℃에서 인큐베이션하고, 20분 동안 4 ℃에서 항-마우스 CD11c, CD86, CD40, 및 MHC-II 항체로 표지화하고, BD 아큐리 C6 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 치료된 BMDC 및 BMDM으로부터의 시토카인 생산을 측정하기 위해, 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 15,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하고 2E, PEI, 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg 또는 2E'/PTX/siPD-L1로 치료하였다. 24 h 후, 배지는 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 IL-1β 및 TNF-α에 대해 분석되었다.
TLR-4 및 TLR-5 활성화 검정
2E' 또는 PEI에 의한 TLR-4 활성화는 THP1-X블루(Blue)™-MD2-CD14 세포, TLR-4 리포터 세포 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼즈배드)로 평가되었다. TLR-5 활성화는 HEK-블루™ mTLR5 세포, TLR-5 리포터 세포 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼즈배드)로 시험되었다. TLR-4 리포터 세포를 96 웰 플레이트에 RPMI 배지에서 웰당 100,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. TLR-5 리포터 세포를 96 웰 플레이트에 HEK-블루™ 검출 배지에서 웰당 25,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 2E', PEI, LCA 또는 지질다당류 (LPS)를 다양한 농도에서 세포에 첨가하고 24 h 동안 37 ℃에서 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 상청액을 분비된 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP) 검정을 위해 수집하였다. SEAP의 흡광도는 620 nm에서 측정되었다.
시험관내 식균작용
CT26 또는 B16F10 암 세포를 셀 트래커 그린 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼즈배드)으로 1 h 동안 염색시키고 5 μg/mL PTX로 24 h 동안 치료하였다. PTX-치료된 암 세포를 수집하고, 계수하고 (2 x105개), 7 μg/mL의 2E'와 함께 또는 없이 또 다른 24 h 동안 셀-트래커 딥 레드 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼즈배드)-염색된 BMDC, JAWSII DC 또는 BMDM (2 x105개)과 함께 공동-배양하였다. 공동-배양된 세포를 수집하고, 염색 완충제 중에 재현탁시키고, BD 아큐리 C6 유세포 분석기 또는 BD LSR포르테사(LSRFortessa) 유세포 분석기 (미국 캘리포니아주 산 호세)에 의해 분석하였다. PTX-치료된 암 세포를 흡수하는 DC (암 세포+ DC 또는 대식세포)는 셀-트래커 딥 레드-염색된 BMDC, JAWSII DC 또는 BMDM에서의 이중-양성 세포의 백분율로서 및 식균된 암 세포는 셀 트래커 그린-염색된 암 세포에서의 이중-양성 세포의 백분율로서 정량화되었다. 시험관내 암 세포 식균작용을 시각화하기 위해, PTX-치료된 암 세포 (2 x105개)를 7 μg/mL의 2E'와 함께 또는 없이 24 h 동안 셀-트래커 딥 레드-염색된 BMDC 또는 BMDM (2 x105개)과 함께 공동-배양하고 니콘 A1R 공초점 현미경으로 영상화하였다.
세포독성
CT26 세포, B16F10 세포, BMDC, 또는 비장세포를 96 웰 플레이트에 웰당 8,000개의 세포 (CT26, B16F10) 또는 웰당 15,000개의 세포 (BMBC, 비장세포)의 밀도로 시딩하였다. 24 h 인큐베이션 후, 세포 배양 배지를 상이한 농도로 2E, PEI, 2E'/PTX 또는 2E'/PTX/siPD-L1치료를 함유하는 신선한 완전 배지로 대체하였다. 또 다른 24 h 동안 인큐베이션 후, 세포 세포독성은 MTT 검정 (CT26, B16F10) 또는 프로피듐 아이오다이드 (PI) 염색 (BMDC, 비장세포)에 의해 측정되었다. MTT 검정을 위해, 치료를 100 μL의 신선한 완전 배지 및 15 μL의 5 mg/mL MTT 용액으로 대체하였다. 4 h 인큐베이션 후, 100 μL의 정지/가용화 용액을 세포에 첨가하고 밤새 인큐베이션하였다. 용해된 포르마잔의 흡광도는 560 nm에서 스펙트라맥스(SpectraMax) M3 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)에 의해 판독되었다. PI 염색을 위해, 치료를 제거하고 세포를 PBS로 헹구고, 수집하고, 100 μL의 세포 염색 완충제 중에 재현탁시켰다. 5 마이크로리터 (40 ng)의 PI 염색 용액을 BD 아큐리 C6 유세포 분석기에 의한 분석 직전에 각각의 샘플에 첨가하였다. 조합 지수 (CI)는 컴퓨신(Compusyn) (컴보신, 인크.(Combosyn, Inc.), 뉴저지주 파라머스)에 의해 결정되었다. CI < 1, CI = 1, 및 CI > 1의 값은 각각 상승작용, 상가작용, 및 길항작용을 나타낸다53.
겔 지연 검정
2E'/siPD-L1, 2E'/PTX/siPD-L1 또는 2E'/PTX/pDNA 복합체의 형성은 아가로스 겔 지연 검정에 의해 시험되었다. 복합체를 2E' 또는 2E'/PTX 대 siPD-L1 또는 pDNA의 중량비를 변경하면서 제조하였다. 복합체를 1 μg siRNA 또는 pDNA와 동등한 양으로 0.5 μg/mL 에티듐 브로마이드를 함유하는 1.1% 아가로스 겔에 로딩하고 60 V에서 1 h 동안 1x TAE 완충제 중에 전개시켰다. siRNA 또는 pDNA 밴드는 302 nm에서 애저(Azure) C300 (미국 캘리포니아주 더블린)을 사용하여 검출되었다.
PD-L1 침묵
CT26 및 B16F10 세포를 2 mL의 배양 배지와 함께 6-웰 플레이트에 플레이트당 105개의 세포의 밀도로 플레이팅하고 24 h 동안 인큐베이션하였다. PD-L1 발현을 IFN-γ에 의해 유도하였다. PD-L1 발현을 위한 최적 인큐베이션 시간을 결정하기 위해, 세포를 IFN-γ 첨가 후 0, 12, 24, 36 및 48 h에 수집하고, 염색 완충제 중에 재현탁시키고, Fc-차단 항체와 함께 인큐베이션하고, 항-마우스 PD-L1 항체로 염색시키고, 유세포 분석에 의해 분석하였다.
siPD-L1 복합체의 침묵 효과를 평가하기 위해, 세포를 PD-L1 발현을 위한 최적 조건에서 (B16F10 세포는 25 ng/mL의 IFN-γ와 함께 4 h 동안 및 CT 26 세포는 100 ng/mL의 IFN-γ와 함께 12 h 동안) 인큐베이션하고 혈청-함유 배지에서 2.66 μg/mL siRNA와 동등한 PBS, 2E'/siPD-L1, 2E'/siNeg (PD-L1 침묵과 관련이 없는 siRNA), 2E'/PTX/siPD-L1 또는 2E'/PTX/siNeg로 12 h 동안 치료하였다. 그리고 이어서, 치료를 신선한 배지로 대체하고 36 h 동안 추가로 인큐베이션하고, PD-L1 발현은 웨스턴 블롯에 의해 결정되었다. 세포를 세포 용해 완충제 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 용해시켰고, 용해물을 12,000 g에서 20분 동안 4 ℃에서 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 상청액 중 총 단백질 함량은 BCA 검정에 의해 정량화되었고, 10 mg의 단백질에 상응하는 샘플을 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 겔-로딩 완충제와 혼합하고 95 ℃에서 5분 동안 가열하였다. 샘플을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고 (웰당 100 μg 단백질) 폴리비닐리덴 플루오라이드 막 상으로 옮겼다. 막을 실온에서 5% 탈지 분유를 함유하는 TBST 완충제 (pH 7.4, 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 및 0.05% 트윈 20) 중에서 차단하였다. 1 h 후, 막을 판매 회사의 권고에 따라 항-마우스 PD-L1 및 GAPDH 항체와 함께 24 h 동안 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 막을 3회 세척하고 2차 항-IgG-HRP 항체와 함께 1 h 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 2차 항체와 함께 인큐베이션 후, 막을 3회 세척하였고, 단백질 밴드는 애저 C300 (캘리포니아주 더블린)에 의해 검출되었다.
세포 흡수
siPD-L1 복합체의 세포 흡수를 검사하기 위해, 2E'/siPD-L1, 리포펙타민/siPD-L1 및 2E'/PTX/siPD-L1을 Cy3-표지된 siPD-L1로 제조하였다. CT26 세포를 눈크™ 유리 바닥 접시 (써모 사이언티픽)에 2 x105개의 밀도로 시딩하고 24 h 동안 인큐베이션하였다. 혈청-함유된 배지에서 66 μg/mL siRNA와 동등한, 2E'/siPD-L1, Lipo/siPD-L1 또는 2E'/PTX/siPD-L1을 세포와 함께 4 h 또는 6 h 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 200 nM 리소트래커(LysoTracker) 그린 및 2 μg/mL 훽스트 33342로 염색시키고, 니콘 A1R 공초점 현미경에 의해 영상화하였다.
동물 구매 및 관리
모든 동물 절차는 실험 동물 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드라인에 따라, 퍼듀(Purdue) 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다. 암컷 Balb/c 마우스 (5-6주령) 및 수컷 C57BL/6 (5-6주령)을 엔비고(Envigo) (미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터 구매하고 절차 전 1주 동안 적응시켰다.
2E'-Cy7 및 PEI-Cy7의 종양 잔류
종양내로-주사된 2E'-Cy7 및 PEI-Cy7의 잔류는 CT26 모델에서 평가되었다. CT26 종양 세포 (5 x 105개)를 Balb/c 마우스의 우측 뒷다리의 상부 플랭크에 피하로 접종하였다. 종양이 평균적으로 100 mm3로 성장하였을 때, 마우스를 40 μL의 75 μg/mL 2E'-Cy7 또는 PEI-Cy7로 종양내로 주사하였다. 2E'-Cy7 및 PEI-Cy7의 형광 강도는 스펙트럴 에이미(Spectral Ami) 광학 영상화 시스템 (스펙트럴 인스트루먼츠(Spectral Instruments), 애리조나주 투싼)에 의해 모니터링되었다.
양측 CT26 종양을 갖는 Balb/c 마우스에서의 항종양 효과
2E'/PTX/siPD-L1의 항종양 효과는 플랭크에 양측 CT26 종양을 보유하는 Balb/c 마우스에서 평가되었다. 종양은 피하 접종에 의해 동시에 양 플랭크에서 확립되었다. 1x106개의 CT26 세포를 우측 뒷다리의 플랭크에, 및 3x105개의 CT26 세포를 동일한 마우스의 좌측 플랭크에 접종하였다. 우측 측면 상의 종양이 평균적으로 30-50 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 무작위로 종양내 주사에 의해 우측 측면 상의 종양에 5% 덱스트로스 (D5W), 2E', 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg 또는 2E'/PTX/siPD-L1을 받는 상이한 그룹으로 할당하였다. 좌측 측면 상의 치료된 종양 및 비-치료된 종양의 크기는 디지털 캘리퍼로 격일로 측정되었고, 종양 부피는 (너비2 x 길이)/2로서 계산되었다.
CT26 종양을 갖는 Balb/c 마우스에서의 항종양 효과 및 생 세포의 지연된 재챌린지(들)
CT26 종양 세포 (5 x 105개)를 Balb/c 마우스의 우측 뒷다리의 상부 플랭크에 피하로 접종하였다. 종양 크기가 평균적으로 30-50 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 D5W, 2E', 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg 또는 2E'/PTX/siPD-L1의 종양내 주사로 치료하였다. 종양 성장은 상기 기재된 바와 같이 모니터링되었다. 항종양 면역이 확립되었는지 여부를 시험하기 위해, 치료로부터 30일까지 완전한 종양 완화로 생존하는 마우스를 대측 플랭크에 1x 105개의 생 CT26 세포로 재챌린지하였다. 제1 재챌린지에 저항성인 마우스를 치료로부터 60일에 2 x 106개의 생 CT26 세포로 다시 챌린지하였다. 2회의 별개의 실험에서, 생존 Balb/c 마우스를 치료 후 6 또는 17일에 1회 재챌린지하였다.
2E'/PTX/CDN은 CT26 종양을 갖는 Balb/c 마우스에서 시험되었다. 종양이 평균적으로 50-100 mm3로 성장하였을 때, D5W, 파클리탁셀 나노결정 및 유리 CDN 혼합물, 및 2E'/PTX, 또는 2E'/PTX/CDN을 종양내 주사에 의해 투여하였고, 종양 성장은 80일 동안 모니터링되었다. 무종양 마우스를 치료 후 82일 또는 140일에 대측 플랭크에 1 x 105개의 생 CT26 세포 또는 4T1 세포로 재챌린지하였다.
C57BL/6 마우스의 B16F10 종양에서의 항종양 효과
B16F10 종양 세포 (1 x 106개)를 C57BL/6 마우스의 우측 뒷다리의 상부 플랭크에 피하로 접종하였다. 종양 크기가 ~150 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 D5W, 2E', 2E'/PTX, 2E'/PTX/siNeg 또는 2E'/PTX/siPD-L1의 종양내 주사로 치료하였다. 종양 성장은 크기를 측정함으로써 모니터링되었다. 무종양 마우스를 대측 플랭크에 1x 105개의 생 B16F10 세포로 재챌린지하였다.
양측 B16F10 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에서의 항종양 효과
1 x 106개 및 1 x 105개의 B16F10 종양 세포를 각각 우측 및 좌측 뒷다리의 상부 플랭크에 피하로 접종하였다. 우측 측면 상의 종양이 65-100 mm3로 성장하였을 때, 이를 D5W (n=6), 2E'/siPD-L1+ PTX NC (n=8), 2E'/PTX/siNeg (n=9) 및 2E'/PTX/siPD-L1 (n=9)의 단일 종양내 주사로 치료하였다. 치료된 및 비치료된 종양의 성장은 크기를 측정함으로써 모니터링되었다.
Balb/c 마우스의 4T1 정위 종양에서의 항종양 효과
4T1-Luc 세포주는 퍼듀 대학교의 마이클 웬트(Michael Wendt) 교수로부터의 기증이었다. 4T1-Luc 2.5 x 104개를 암컷 Balb/c 마우스의 유방 지방 패드에 접종하였다. 종양 크기가 ~50 mm3에 도달하였을 때, D5W, 2E'/PTX/siNeg, 또는 2E'/PTX/siPD-L1을 종양내 주사에 의해 투여하거나, 또는 종양을 부분적인 또는 완전한 외과적 절제에 의해 제거하였다. 종양 성장은 크기를 측정함으로써 모니터링되었다. 또한, 전신 영상화가 종양 성장 대신에 루시페라제 발현을 결정하기 위해 스펙트럴 에이미 광학 영상화 시스템 (스펙트럴 인스트루먼츠, 애리조나주 투싼)에 의해 수행되었다. 무종양 마우스를 대측 유선에 2.5×103개의 생 4T1-Luc 세포로 재챌린지하였다.
비장세포의 단리
비장세포를 단리하기 위해 비장을 건강한 또는 종양-보유 마우스로부터 수집하였다. 수집된 비장을 조각으로 커팅하고 순차적으로 70 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 단일-세포 현탁액을 수득하였다. 세포 현탁액을 1 mL 암모늄-클로라이드-포타슘 (ACK) 용해 완충제와 함께 3분 동안 인큐베이션하여 적혈구를 제거하였다.
종양-특이적 면역
비장세포의 단일 세포 현탁액을 좀비 염료로 염색시키고, 항-마우스 CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 비-특이적 결합을 차단하고, 이어서 형광색소-접합된 항체: iTAg 사량체/APC- H-2 Kb TRP2 (SVYDFFVWL, 서열식별번호: 5), FITC 항-마우스 CD8 항체 (KT15), 및 PE 항-마우스 CD3 항체 (17A2)로 표지화하였고, 표지된 세포는 BD LSR포르테사 유세포 분석기에 의해 분석되었다.
B16F10 종양-보유 마우스로부터 수집된 비장세포를 반응을 결정하기 위해 MHC-I-제한 펩티드 항원 Trp2180-188 (SVYDFFVWL, 서열식별번호: 5)로 챌린지하였다. 비장세포를 100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10 mM β-메르캅토에탄올, 20 ng/ml 뮤린 GM-CSF, 및 20% 소 태아 혈청으로 보충된 MEM-알파 배지 중에 현탁시키고 웰당 1 x 106개의 세포로 96 웰 플레이트에 시딩하고 1-5 μg/mL의 Trp2 펩티드로 자극하였다. 48 h 인큐베이션 후, 세포를 500 rcf에서 8분 동안 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 각각의 상청액에서의 IFN-γ 농도는 ELISA (바이오레전드(Biolegend), 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에 의해 측정되고 동일한 마우스로부터 수집된 비-챌린지된 세포의 것과 비교되었다.
종양 및 림프구 기관의 면역표현형 결정
종양을 치료 후 7일차에 B16F10 종양을 갖는 C57BL/6 마우스로부터 수집하고, 2 h 동안 37 ℃에서 2 mg/mL 콜라게나제 유형 IV, 0.2 mg/mL DNase I, 및 0.2 mg/mL 히알루로니다제로 치료하고, 주사기 플런저의 고무 단부로 갈았다. 세포 현탁액을 순차적으로 70 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고 500 xg에서 8분 동안 원심분리하였다. 적혈구를 ACK 용해 완충제로 제거하였다. 단일 세포 현탁액을 좀비 염료로 염색시키고 항-마우스 CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 비-특이적 결합을 차단하고 이어서 형광색소-접합된 항체로 표지화하였다: FITC 항-마우스 CD3 항체 (17A2), PE 항-마우스 CD4 항체 (RM4-5), APC 항-마우스 CD8a 항체 (53-6.7), FITC 항-마우스 CD11c 항체 (N418), APC 항-마우스 CD86 항체 (GL-1), APC 항-마우스 CD40 항체 (3/23), APC 항-마우스 MHC-II 항체 (M5/114.15.2), 또는 FITC 항-마우스 F4/80 항체 (BM8). 표지된 세포는 BD 아큐리 C6 유세포 분석기 또는 BD LSR포르테사 유세포 분석기에 의해 분석되었다.
RNA 시퀀싱 검정
라이브러리의 생성 및 시퀀싱: C57BL/6 마우스에서의 B16F10 종양이 ~150 mm3로 성장하였을 때, 마우스는 D5W, 2E'/PTX/siNeg 또는 2E'/PTX/siPD-L1의 종양내 주사를 받았다 (0일차). 종양을 0일차에 비치료된 동물로부터 또는 7일차에 치료된 동물로부터 수집하고 단일 세포 현탁액으로 소화시켰다. 세포 펠릿을 2 mL의 TRK 용해 완충제 중에 용해시키고 모든 샘플이 수집될 때까지 냉동 보관하였다. 각각의 TRK 용해물 700 μL를 RNeasy 추출 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하는 RNA 단리로 이동시켰다. RNA 농도는 나노드롭에 의해 결정되었다. 1 마이크로그램의 RNA가 제조업체 설명서에 따라 유니버셜 플러스(Universal Plus) mRNA-Seq 키트 (테칸(Tecan))로 라이브러리를 생성하는데 사용되었다. 단일 일루미나(Illumina) NovaSeq 6000 S4 300 사이클, v1.5 화학, 레인을 라이브러리의 풀과 클러스터링하여 쌍형성된-단부 2x150개의 염기 판독물을 생산하였다.
판독물의 어댑터 및 품질 트리밍: 프로그램 fastp v.0.12.5가 품질 점수에 기반하여 판독물을 추가로 트리밍하고 어댑터 서열을 제거하는데 사용되었다54. 최소 품질 점수는 30으로 설정되었고, 50개 염기보다 짧거나 또는 트리밍 후 쌍형성되지 않은 판독물은 폐기되었다. STAR v. 2.5.4b가 --twopassMode Basic를 사용하고, BAM 정렬 파일에서의 태그 HI를 0에서 시작하도록 변형시키고, 비정규 스플라이스 접합부를 제거하여 Ensembl 무스 무스쿨러스(Mus musculus) 게놈 데이터베이스 버전 GRCm38.p6에 대해 판독물을 정렬하는데 사용되었다55. 가닥 모드 상 Subread v.2.0.2 소프트웨어 모듈 featureCounts가 Ensembl 무스 무스쿨러스 게놈 주석을 사용하여 유전자 계수 매트릭스로 유전자에 대한 판독물 맵핑을 표로 만드는데 사용되었다56.
통계적 분석: Bioconductor 패키지 edgeR v.3.24.3이 준-가능도 음성 이항 일반화된 로그-선형 모델을 계수 데이터에 피팅한 후, genewise 통계적 검정하여 차등 발현된 유전자를 확인하는데 사용되었다57,58. 벤야미니-호흐베르크 위발견률 보정이 다중 검정에 대한 p-값을 보정하는데 사용된다59. Bioconductor 패키지 BiomaRt v. 2.38.060 및 ClusterProfiler v 3.10.161이 유전자의 주석 및 경로 수행 및 차등 발현된 유전자에 대한 유전자 온톨로지 농축 분석에 사용되었다 (결과는 조정된 p-값<0.05인 경우에 유의한 것으로 간주되었음).
조직학
B16F10 종양을 갖는 C57BL/6 마우스로부터의 기관 (심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양)을 치료 후 7일차에 수집하고, 10% 중성 완충 포르말린 중에 고정시키고 4 μm의 두께로 절개하였다. 심장, 간, 비장, 폐 및 신장 절편을 H&E로 염색시키고, 종양 절편을 래트 항-마우스 CD8a 모노클로날 항체 (이바이오사이언시스(eBioscience), 클론 4SM15)에 이어 염소 항-래트 2차 항체 (벡터 랩스(Vector Labs), MP-5444)로 또는 토끼 항-마우스 PD-L1 항체 (노부스 바이오로지칼스(Novus biologicals), 클론 2096A)에 이어 말 항-토끼 2차 항체 (벡터 랩스, MP-5401)로 염색시켰다. 슬라이드를 트윈® 20을 포함한 트리스 완충 염수 중에서 2회 헹구고, 벡터 임팩트(immPACT) 레드 (벡터 랩스, SK-5105)를 20분 동안 적용시키고 헤마톡실린 대비염색, 탈수 및 커버슬립을 위해 라이카(Leica) 자동염색기 XL로 옮겼다. 영상을 라이카 Versa8 전체-슬라이드 스캐너를 사용하여 찍었다.
통계적 분석
모든 통계적 분석은 GraphPad Prism 9 (캘리포니아주 라 졸라)로 수행되었다. 모든 데이터는 다양한 그룹 중에서 수단의 통계적 차이를 결정하기 위해 일원 또는 이원 ANOVA 검정에 이어 권장된 다중 비교 검정으로 분석되었다. p < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 수많은 변형이 상기 기재된 특정 시행에 대해 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 시행은 기재된 특정한 제한으로 제한되어서는 안 된다. 다른 시행이 가능할 수 있다.
본 발명은 도면 및 상기 설명에 상세하게 예시되고 기재되었지만, 이는 예시적인 것으로 간주되어야 하고 특징상 제한적이지 않고, 단지 특정 실시형태만이 제시되고 기재되었고 본 발명의 취지 내에 있는 모든 변화 및 변형이 보호되는 것이 바람직하다는 것이 이해된다. 본 방법 및 조성물의 범주가 하기 청구범위에 의해 정의되는 것이 의도된다. 그러나, 이 개시내용이 그의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 구체적으로 설명되고 예시되는 것과 달리 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 본원에 기재된 실시형태에 대한 다양한 대안이 하기 청구범위에 정의된 바와 같은 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 청구범위를 실시하는데 이용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
Figure pct00001
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Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> Purdue Research Foundation Purdue Research Foundation <120> IMMUNOFUNCTIONAL CARRIER, METHODS OF USES, AND COMPOSITION MATTERS AS AN ANTITUMOR IMMUNOTHERAPY <130> 69447-02 <150> US 63/177,150 <151> 2021-04-20 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA specific for pdcd1lg1 mRNA, sense <400> 1 cccacauaaa aaacaguugt t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA specific for mouse pdcd1lg1 mRNA, antisense <400> 2 caacuguuuu uuaugugggt t 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> negative siRNA, sense <400> 3 ugaaguugca cuugaagucd tdt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> negative siRNA, antisense <400> 4 gacuucaagu gcaacuucad tdt 23 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> peptide antigen Trp2 (180-188) <400> 5 Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5

Claims (21)

  1. 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 화학요법 약물 또는 소수성 분자를 포함하는 항종양 면역요법 또는 진단 도구로서의 조성물 물질.
  2. 제1항에 있어서, 마이크로RNA, 메신저 RNA, 플라스미드 DNA, 소형 간섭 RNA (siRNA), 올리고뉴클레오티드, 또는 시클릭 디뉴클레오티드를 추가로 포함하는 조성물 물질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 siRNA가 PD-L1 siRNA인 조성물 물질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학요법 약물 또는 소수성 분자가 파클리탁셀, 소라페닙, 이트라코나졸, 도세탁셀, 독소루비신, 보르테조밉, 카르필조밉, 캄프토테신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 시타라빈, 빈크리스틴, 이리노테칸, 암포테리신, 니플룸산, 프로부콜, 인도메타신, 젬시타빈, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 소수성 염료 또는 그의 염인 조성물 물질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 소수성 염료가 DiR'; DiIC18(7) (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3' 테트라메틸인도트리카르보시아닌 아이오다이드), 시아닌7, 시아닌 5, 또는 그의 허용되는 염을 포함하는 소수성 형광 염료인 조성물 물질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민 유도체가 리토콜산 (LCA), 콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 글리코케노데옥시콜산, 타우로케노데옥시콜산, 또는 그의 허용되는 염에 의해 변형된/접합된 폴리에틸렌이민인 조성물 물질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 약 2,500 Da 내지 약 250,000 Da의 분자량 범위를 갖는 것인 조성물 물질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 물질이 종양내로 투여되는 것인 항종양 면역요법으로서의 조성물 물질.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 물질이 전신으로 투여되는 것인 항종양 면역요법으로서의 조성물 물질.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물 물질을 1종 이상의 희석제, 부형제, 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물.
  11. 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 면역아주반트로서의 폴리에틸렌이민 유도체 및 항종양 작용제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 상기 암으로부터의 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 마이크로RNA, 메신저 RNA, 플라스미드 DNA, 소형 간섭 RNA (siRNA), 올리고뉴클레오티드, 또는 시클릭 디뉴클레오티드를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 siRNA가 PD-L1 siRNA인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 화학요법 약물이 소수성 화학요법 분자인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 소수성 화학요법 약물이 파클리탁셀, 소라페닙, 이트라코나졸, 도세탁셀, 독소루비신, 보르테조밉, 카르필조밉, 캄프토테신, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 시타라빈, 빈크리스틴, 이리노테칸, 암포테리신, 니플룸산, 프로부콜, 인도메타신, 젬시타빈, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민 유도체가 리토콜산 (LCA), 콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 글리코케노데옥시콜산, 타우로케노데옥시콜산, 또는 그의 허용되는 염에 의해 변형된/접합된 폴리에틸렌이민인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 약 2,500 Da 내지 약 250,000 Da의 분자량 범위를 갖는 것인 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 물질이 종양내로 투여되는 것인 항종양 면역요법으로서의 방법.
  19. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 물질이 전신으로 투여되는 것인 항종양 면역요법으로서의 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 필라멘트 형태로 존재하는 것인 조성물 물질.
  21. 폴리에틸렌이민 유도체 및 소수성 염료를 포함하는 진단 목적을 위한 조성물 물질.
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