JP2022541586A - 多層ｒｎａナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

本開示は、正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含む内部を含むナノ粒子であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層の間に配置されている、ナノ粒子を提供する。そのようなナノ粒子を作製する方法は、本明細書中でさらに提供される。さらに、ここで開示されるナノ粒子を含む、関連細胞、細胞の集団、医薬組成物が提供される。対象における腫瘍に対する免疫応答を増加させる方法、対象の腫瘍内微小環境、リンパ節、および／または細網内皮器官にＲＮＡ分子を送達する方法、ならびに疾患を有する対象を治療する方法が、さらに提供される。【選択図】なし

Description

助成金の開示
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成番号Ｋ０８ ＣＡ１９９２２４、および米国陸軍衛生司令部によって授与された助成番号Ｗ８１ＸＷＨ－１７－１－０５１０の下、米国政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／８７６４４０号、２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７５９８、２０１９年８月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８８４９８３、２０１９、および２０１９年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／９３３３２６の優先権の利益を主張し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書中で援用される。
放射線療法および化学療法の重篤かつ非特異的な有害作用のため、神経膠芽腫（ＧＢＭ）を有する患者の腫瘍細胞を選択的に殺すことができる標的療法が不可欠である（Ｓｔｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５；３５２（１０）：９８７－９６；Ｓｔｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００９；１０（５）：４５９－６６；Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１０；２８（３１）：４７２２－９）。腫瘍特異的免疫療法は、悪性脳腫瘍を絶妙な精度で、正常組織への付随的損傷なしに根絶するために利用され得る（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１１；２９（２０）：２７８７－９４；Ｒｉｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｕｐｄａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００７；２（３）：１３３－９；Ｐａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２；８（４）：５０９－１９）。免疫療法は、活性化Ｔ細胞の細胞毒性の可能性に依存し、腫瘍関連または特異性の抗原（ＴＡＡまたはＴＳＡ）を認識および拒絶するためにスカベンジする。ほとんどの薬剤とは異なり、活性化Ｔ細胞は、ＩＣＡＭ／ＶＣＡＭのインテグリン（すなわち、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－４）結合を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し得る（Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．２０１１；１３（３）：３２４－３３；Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００３；３（７）：５６９－８１；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１４；９（４）：ｅ９４２８１）。Ｔ細胞は、ＴＡＡ／ＴＳＡを提示する樹状細胞（ＤＣ）との共培養（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５１９（７５４３）：３６６－９）でまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による形質導入（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；３６８（１６）：１５０９－１８）で、エクスビボで活性化され得る。あるいは、Ｔ細胞はがんワクチンを使用して内因的に活性化され得る。しかしながら、原発性ＧＢＭを有する患者を対象としたランダム化第ＩＩＩ相試験では、腫瘍特異的ＥＧＦＲＶＩＩＩ表面抗原を標的とするペプチドワクチンは、対照ワクチンよりも生存効果の向上を媒介しなかった（Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１７；１８（１０）：１３７３－８５）。ＥＧＦＲＶＩＩＩワクチンが抗腫瘍効果を媒介しないことは、治療用がんワクチンの課題を浮き彫りにする。予防的がんワクチンは、悪性腫瘍を予防するために機能するが（すなわち、子宮頸がんを予防するためのＨＰＶワクチン）、免疫が豊富な患者に防御を与えるために、ワクチンは数ヶ月から数年にわたって数回の追加免疫を必要とする。さらに、治療用がんワクチンは、急速に発展している悪性腫瘍（すなわち、ＧＢＭ）に対してはるかに迅速に免疫応答を誘導する必要がある（Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１８；１９（１０））。さらに、ＧＢＭは、初期の免疫療法反応を妨げる可能性のある、重度の全身性または腫瘍内抑制に関連する高侵襲性で不均一な腫瘍である（Ｃｈｏｎｇｓａｔｈｉｄｋｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８；２４（９）：１４５９－６８；Ｌｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００６；１２（２４）：７３０６－１５）。
ＲＮＡワクチンには、従来のモダリティに比べていくつかの利点がある。ＲＮＡは、自然免疫系および獲得免疫系の両方に強力な影響を及ぼす。ＲＮＡは、受容体３、７、および８のトル様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとして機能し、強力なＴＬＲ依存性自然免疫を誘導する（２４）。ＲＮＡはまた、細胞内病原体認識受容体（すなわち、黒色腫分化抗原５（ＭＤＡ－５）およびレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ））を刺激し、ヘルパーＣＤ４および細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞応答の両方を最高点まで活性化させる（Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．２０００；７（２３）：２０２８－３５；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０００；１０６（９）：１０６５－９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９８；１７（２４）：３１２５－３５）。細胞膜および核膜の両方を通過する必要があるＤＮＡワクチンとは異なり、ＲＮＡは、宿主ゲノムに組み込むことができないため、細胞質へのアクセスのみを必要とし、安全性に大きな利点を有する（Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉ．２０１７；７（１０）。Ｅｐｕｂ ２０１７／１０／２７）。特定のＨＬＡハプロタイプ（すなわちＨＬＡ－Ａ２）のためにのみ開発された多くのペプチドワクチンとは異なり、ＲＮＡはＭＨＣクラス制限を迂回して、一般の人々に活用できる（Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉ．２０１７；７（１０）．Ｅｐｕｂ ２０１７／１０／２７）。ＲＮＡの欠点の１つは、安定性がないことにより、「裸の」ＲＮＡを患者に直接投与することが難しくなることである。がんワクチンは、ＲＮＡが翻訳され、処理され、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子に提示されなければならない抗原提示細胞（ＡＰＣ）に局在化する必要があるため、分解は、新しいｍＲＮＡ技術の開発に対する強力な障壁であり続ける。これらの制限を克服するために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＵＦＢＴＩＰ）内の研究者は、脳腫瘍の治療のためのＲＮＡ負荷樹状細胞（ＤＣ）ワクチンを開発した（ＮＣＴ０３３３４３０５、ＰＩ：Ｓａｙｏｕｒ）（Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１０；２８（３１）：４７２２－９；Ｆｅｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７；１３（７）：２１５８－６７；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１１）：３００３－１２．Ｅｐｕｂ ２０１１／０７／２０；Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４． ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１３－３２６８。ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４６５８１５４；Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１３；８（３）：ｅ５９０８２；Ｆｅｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００６；１２（１４ Ｐｔ １）：４２９４－３０５））。総腫瘍由来ｍＲＮＡ（パーソナライズされた腫瘍特異的トランスクリプトームを表すために自己調製された）は、ＤＣワクチン生産のための再生可能な抗原特異的資源を提供する少数の細胞（約５００の腫瘍細胞）から臨床規模に増幅できることが示されている。ＲＮＡをロードしたＤＣのエクスビボでの産生にはかなりの見込みがあるが、細胞治療の進歩には開発上の課題が伴い、このことが、全人口のためにワクチンを生成することを困難にしている。
細胞治療の課題を回避するために、ナノキャリアがＲＮＡ送達媒体として開発されたが、新規ナノ粒子（ＮＰ）設計の未知の生物学的反応性のために、ＮＰのヒト臨床試験への転換は遅れている。あるいは、単純な生分解性脂質－ＮＰが、カチオン性およびアニオン性のがんワクチン製剤として開発されてきた。カチオン性製剤は、脂質コア内のｍＲＮＡをシールドするために作製されてきたが、アニオン性製剤は、ｍＲＮＡを粒子表面につなぐために作製されてきた。しかしながら、カチオン性製剤は、低い免疫原性に悩まされており、アニオン性製剤は、活性化されたＴ細胞応答を妨げる可能性のある深刻な腫瘍内および全身性免疫抑制によって妨げられたままである。
したがって、当該技術分野では、前述の制限を克服する新しいＲＮＡ－ＮＰが必要とされている。
本開示は、正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含む内部を含むナノ粒子であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層の間に配置されている、ナノ粒子を提供する。例示的な実施形態では、本開示のナノ粒子は、交互の核酸層およびカチオン性脂質二重層を含む内部を含む。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも３つの核酸層を含み、その核酸層のそれぞれが、カチオン性脂質二重層の間に配置される。例示的な態様では、ナノ粒子は、少なくとも４つまたは５つ以上の核酸層を含み、その核酸層のそれぞれが、カチオン性脂質二重層の間に配置されている。様々な態様において、ナノ粒子の最外層は、カチオン性脂質二重層を含む。様々な例において、表面は、カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む。例示的な態様では、コアは、カチオン性脂質二重層を含む。様々な態様において、コアの最外領域は、カチオン性脂質二重層を含む。いくつかの例において、コアの最外領域は、ＤＯＴＡＰを含むカチオン性脂質二重層を含む。任意選択で、コアは、約０．５重量％未満の核酸を含む。例示的な態様では、コアは、（ｉ）治療薬もしくは（ｉｉ）診断薬（例えば、造影剤）、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む。適切な治療薬および診断薬は、本明細書に記載されている。例示的な態様では、治療薬は、核酸を含むかまたは核酸である。任意選択で、治療薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはｓｉＲＮＡである。様々な例では、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、交互の核酸層（カチオン性脂質二重層）に存在する同じ核酸ではない。例示的な例では、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、交互の核酸層（カチオン性脂質二重層）に存在するのと同じ核酸である。様々な態様において、コアは、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介して組織または細胞を画像化するのに有用な酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）を含む。任意選択で、ＩＯＮＰは、脂肪酸、例えばＣ８－Ｃ３０脂肪酸でコーティングされる。様々な態様において、脂肪酸はオレイン酸である。様々な態様において、コアは、複数のＩＯＮＰ（任意選択で、オレイン酸でコーティングされる）を含み、ここで、複数が、脂質、例えば、カチオン性脂質によって一緒に保持されている。任意選択で、複数のＩＯＮＰ（任意選択で、オレイン酸でコーティングされる）はＤＯＴＡＰによって一緒に保持される。ナノ粒子の直径は、様々な態様において、直径が約５０ｎｍ～約２５０ｎｍであり、任意選択で、直径が約７０ｎｍ～約２００ｎｍである。例示的な例では、ナノ粒子は、約＋４０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、任意選択で、約＋４５ｍＶ～約＋５５ｍＶのゼータ電位によって特徴付けられる。様々な場合のナノ粒子のゼータ電位は、約５０ｍＶである。いくつかの態様において、核酸分子は、約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５、約１対約１０、または約１対約７．５の核酸分子：カチオン性脂質比で存在する。様々な態様において、核酸分子は、ＲＮＡ分子であり、任意選択で、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。様々な態様において、ｍＲＮＡは、インビトロ転写されたｍＲＮＡであり、インビトロ転写テンプレートは、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである。様々な態様において、ナノ粒子は、ＲＮＡ分子の混合物を含み、ＲＮＡの混合物は、ヒトの腫瘍、任意選択で、ヒトの腫瘍は、悪性脳腫瘍、任意選択で、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍から単離されたＲＮＡである。
本開示はまた、正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含む内部を含み、各核酸層がカチオン性脂質二重層の間に配置されるナノ粒子を作製する方法であって、（Ａ）核酸分子およびリポソームを、約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５、約１対約１０、または約１対約７．５のＲＮＡ：リポソーム比で混合して、ＲＮＡ被覆リポソームを得ることであって、リポソームが、カチオン性脂質および有機溶媒を含む脂質混合物を、有機溶媒を真空下で蒸発させることにより乾燥させることを含む、リポソームを作製するプロセスで作製される、ＲＮＡ被覆リポソームを得ることと、（Ｂ）ＲＮＡ被覆リポソームを、余剰量のリポソームと混合することと、を含む、方法を提供する。例示的な態様では、脂質混合物は、カチオン性脂質および有機溶媒を、１ｍＬの有機溶媒当たり約４０ｍｇのカチオン性脂質～１ｍＬの有機溶媒当たり約６０ｍｇのカチオン性脂質の比率、任意選択で、有機溶媒１ｍＬ当たり約５０ｍｇのカチオン性脂質の比率で含む。様々な例において、リポソームを作製するプロセスは、脂質混合物を再水和溶液で再水和して再水和脂質混合物を形成し、次に再水和脂質混合物を攪拌、休止、およびサイジングすることをさらに含む。任意選択で、再水和脂質混合物のサイジングは、再水和脂質混合物を超音波処理、押し出しおよび／または濾過することを含む。
本明細書では、ここで開示されるナノ粒子を作製する方法によって作製されたナノ粒子がさらに提供される。本明細書では、本開示のナノ粒子を含む細胞がさらに提供される。任意選択で、細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞（ＤＣ）である。本開示はまた、細胞の集団を提供し、ここで、集団の少なくとも５０％は、本開示による細胞である。
本開示は、本開示による複数のナノ粒子、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。様々な態様において、組成物は、１ｍＬ当たり約１０１０ナノ粒子～１ｍＬ当たり約１０１５ナノ粒子、任意選択で、１ｍＬ当たり約１０１２ナノ粒子±１０％を含む。
対象において、腫瘍に対する免疫応答などの免疫応答を増加させる方法が、本開示により提供される。例示的な実施形態では、方法は、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む。例示的な態様では、核酸分子は、ｍＲＮＡである。任意選択で、組成物は、対象に全身投与される。例えば、組成物は、静脈内投与される。様々な態様において、医薬組成物は、対象の樹状細胞（ＤＣ）を活性化するのに有効な量で投与される。様々な例において、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答である。任意選択で、Ｔ細胞媒介性免疫応答は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による活性を含む。
本開示はまた、ＲＮＡ分子を、腫瘍内微小環境、リンパ節、および／または細網内皮器官に送達する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、ここで開示される医薬組成物を対象に投与することを含む。任意選択的に、細網内皮器官は、脾臓または肝臓である。
疾患を有する対象を治療する方法が、本明細書中でさらに提供される。例示的な実施形態では、方法は、ＲＮＡ分子を腫瘍内微小環境、リンパ節、および／または細網内皮器官に送達する本開示の方法によって、対象の細胞にＲＮＡ分子を送達することを含む。様々な態様において、ＲＮＡ分子は、エクスビボで細胞に送達され、細胞は、対象に投与される。例示的な実施形態では、本方法は、対象の疾患を治療するのに有効な量で、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む。様々な例において、対象は、がんまたは腫瘍、任意選択で、悪性脳腫瘍、任意選択で、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍を有する。
ここで開示される医薬組成物および方法の追加の実施形態および態様を、以下に提供する。
脂質二重層、リポソーム、および多層（ＭＬ）ＲＮＡ ＮＰ（囲み）につながる一般的なスキームの一連の図解である。 未複合体化ＮＰ（左）およびＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（右）のＣＥＭ画像のペアである。 カチオン性ＲＮＡリポプレックスにつながる一般的なスキームの図解である。 カチオン性ＲＮＡリポプレックスにつながる一般的なスキームの図解である。 ＣＥＭ画像である。図２Ｃは未複合体化ＮＰのＣＥＭ画像、図２ＤはＲＮＡ ＬＰＸのＣＥＭ画像、図２ＥはＭＬ ＲＮＡ ＮＰのＣＥＭ画像である。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、アニオン性ＬＰＸ、または未処置のマウスの脾臓に存在するＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣクラスＩＩ＋脾細胞の％ＣＤ８６＋のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、アニオン性ＬＰＸ、または未処置のマウスの脾臓に存在するＣＤ８＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、アニオン性ＬＰＸ、または未処置のマウスの脾臓に存在するＣＤ４＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌのグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、アニオン性ＬＰＸで処置されたマウス、または未処置のマウスの生存率のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、アニオン性ＬＰＸで処置したマウスで産生された、または未処置のマウスのＩＦＮ－αの量のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処置したマウスまたは未処置のマウスの肺の写真のペアである。 腫瘍特異的ＲＮＡをロードしたＭＬ ＲＮＡ ＮＰまたは非特異的ＲＮＡ（ＧＦＰ ＲＮＡ）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰまたは未処置のマウスに存在する％中央メモリーＴ細胞（ＣＤ３＋細胞のＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋）のグラフである。 腫瘍特異的ＲＮＡをロードしたＭＬ ＲＮＡ ＮＰまたは非特異的ＲＮＡ（ＧＦＰ ＲＮＡ）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処理したマウスまたは未処置のマウスの生存率のグラフである。 腫瘍特異的ＲＮＡをロードしたＭＬ ＲＮＡ ＮＰもしくは非特異的ＲＮＡ（ＧＦＰ ＲＮＡ）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処置したマウスまたは未処置のマウスの生存率のグラフである。このモデルは、図３Ｃのデータを取得するために使用されたモデルとは異なる。 グラフである。図４Ａは、ＭＬ ＲＮＡ ＮＰの投与後の時間の関数としてプロットされた、ＣＤ３＋細胞のＣＤ８またはＣＤ４４およびＣＤ８の発現％のグラフである。図４Ｂは、ＭＬ ＲＮＡ ＮＰの投与後の時間の関数としてプロットされた、ＣＤ１１ｃ＋細胞のＰＤＬ１、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８６、またはＣＤ８０の発現％のグラフである。図４Ｃは、ＭＬ ＲＮＡ ＮＰの投与後の時間の関数としてプロットされた、ＣＤ３＋細胞のＣＤ４４およびＣＤ８の発現％のグラフである。図４Ｄは、生存期間の中央値（点線）と比較したＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処置されたイヌの生存率のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰのＣＥＭ画像であり、いくつかの層を有する例を示している。 パーソナライズされた腫瘍ｍＲＮＡをロードしたＮＰの生成を描いたカートゥーンである。わずか１００～５００個の生検された脳腫瘍細胞から、全ＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡライブラリーが生成されて、このライブラリーから、大量のｍＲＮＡ（パーソナライズされた腫瘍特異的トランスクリプトームを表す）を増幅できる。次に、負に帯電した腫瘍ｍＲＮＡは、正に帯電した脂質ＮＰに封入される。ＮＰは静電相互作用を介してＲＮＡを封入し、細網内皮器官（すなわち、肝脾臓およびリンパ節）の樹状細胞（ＤＣ）による取り込みのために静脈内投与（ｉｖ）される。次に、ＣＤ４およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子にペプチドを提示するために、ＲＮＡをＤＣの細胞内機構によって翻訳および処理する。 長期生存者処置のタイムラインである。１回目および２回目の腫瘍接種が示されている。 マウスの３つの群のそれぞれについての２回目の腫瘍接種後の動物の生存率のグラフである。非特異的ＲＮＡ（対象の腫瘍に特異的ではないＲＮＡ）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰでの２回目の腫瘍接種の前に処置された２つの群、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｐｐ６５）および２回目の腫瘍接種前に腫瘍特異的ＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処置した１つの群あるいは２回目の腫瘍接種前に未処置の動物。対照群の生存率は「未処置」として示される。 投与時のマウスにおけるアニオン性ＬＰＸの局在を図示する一連の画像である。 ＤＯＴＡＰの脂質コーティングによって結合された酸化鉄ナノ粒子の画像である。 多層ＲＮＡ ＮＰが、ｍＲＮＡを多層ベシクルに巻き付けてペイロード送達を促進する複雑な構造を形成することを示す。棒グラフは、アニオン性ＲＮＡ－ＬＰＳ（左側の最初のバー）、ＲＮＡ－リポプレックス（２番目のバー）、ＲＮＡ－ＮＰ（低）（３番目のバー）、およびＲＮＡ－ＮＰ（高）（４番目のバー）の遺伝子発現（発光）を示す。 多層ＲＮＡ ＮＰが、ＤＣ活性化およびＩＦＮ－α放出の増加を媒介することを示す。ＲＮＡ／アニオン性リポプレックス（ＬＰＸ）またはＲＮＡ－ＮＰを静脈内投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに週１回（×３）（静脈内）投与し、活性化ＤＣの評価のために、１週間後に脾臓を採取した（左）。ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－α評価のための最初の処置の６時間後に、血清を採取した（右）。 抗原特異的Ｔ細胞の誘発において、多層ＲＮＡ－ＮＰが、ＬＰＸおよびペプチドベースのワクチンよりも優れていることを示す。完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）で製剤化されたＲＮＡ／アニオン性リポプレックス（ＬＰＸ）（左）またはペプチドベースワクチン（右）を、ＯＶＡ特異的ＲＮＡ－ＮＰと比較した。動物（Ｎ＝５～８／群）は、最後のワクチンの１週間後の四量体陽性（ＯＶＡ特異的）Ｔ細胞の評価の前に、１０７ＯＴ－Ｉを受けた。 ＲＮＡ－ＮＰがＣＭＶマトリックスタンパク質ｐｐ６５に対して記憶再刺激応答を誘導することを示す。毎週、ｐｐ６５ ＲＮＡ－ＮＰ（×３）をナイーブＣ５７／Ｂｌ／６マウスに投与し、１週間後に脾細胞を採取して、ｐｐ６５ペプチドプールが重複する培養およびＩＦＮ－γの評価を行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ）。 多層腫瘍特異的ｍＲＮＡ－ＮＰが、優れた有効性を媒介することを示す。異なるリポプレックス（ＬＰＸ）またはＲＮＡ－ＮＰに腫瘍特異的ｍＲＮＡをロードし、処置用肺がんモデル（Ｋ７Ｍ２）で比較した（ｎ＝８／群）。各ワクチンを、毎週静脈内投与した（×３）。＊＊ｐ＜０．０１、Ｇｅｈａｎ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定。 電荷修飾されたＲＮＡ－ＮＰが、例えば、肺または脾臓に指向され得ることを実証する。ＲＮＡ－ＮＰを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射した（ｎ＝３～４／群）。細網内皮器官（リンパ節、脾臓、および肝臓）を２４時間以内に採取し、リンパ節から活性化マーカーＣＤ８６（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）を発現するＣＤ１１ｃ細胞を評価した（図１５Ａ）、脾臓細胞（図１５Ｂ）、または肝細胞（図１５Ｃ）。データは、本開示の構築物が、単回投与のみで細網内皮器官に送達され得ることを確立する。 全長ＬＡＭＰコンジュゲートｐｐ６５が、より高い割合の抗原特異的Ｔ細胞を誘導するように見えることを示す。ｐｐ６５の完全長ＬＡＭＰコンジュゲートＲＮＡをナイーブマウス（ｎ＝５／群）に週１回（ｘ３）静脈内投与し、脾臓を採取して、ｐｐ６５ペプチドプールをオーバーラップさせて再刺激した（＊ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。グラフは、ＮＰ単独、ＲＮＡ－ＮＰ、またはＬＡＭＰ ＲＮＡ－ＮＰを投与された被験者のＩＦＮ産生を比較している。 ＮＰ単独を投与された対象におけるＯＶＡ特異的テトラマー＋ＣＤ８細胞の割合、およびＭＤＡＳノックアウト対象におけるＲＮＡ－ＮＰを図示するグラフである。図１７Ａ－Ｔ細胞単独。図１７Ｂ－Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡを使用した再刺激アッセイ後。 ＲＮＡ－ＮＰはＴＬＲ７から独立して有効性を媒介する。野生型ＴＬＲ７＋／＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝８／群）にＢ１６Ｆ１０由来の腫瘍を皮下移植し、腫瘍体積を、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンド上でＴＬＲ７－／－ノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝５～８／群）と比較した。動物の両方の群は、毎週（×３）ＲＮＡ－ＮＰで静脈内処置されたのに対し、ＫＯマウスは、ＮＰ単独を投与された（＊＊＊ｐ＜０．００１、双方向ＡＮＯＶＡ）。 ＲＮＡ－ＮＰは、ＴＬＲ７とは独立してＩＦＮＡＲ１依存性応答を媒介する。（図１９Ａ）Ｋ７Ｍ２（１．２５ｘ１０６細胞）を尾静脈注射によりＢａｌｂ／ｃ（ｎ＝７／群）マウスの肺に接種し、隔週のＩＦＮ－α遮断抗体（ＩＦＮＡＲ１ ｍＡｂｓ）有りまたは無しで、毎週のＲＮＡ－ＮＰ（×３）で静脈内処置した。＊＊＊ｐＷｉｌｄ型ＴＬＲ７＋／＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝８）にＢ１６Ｆ０黒色腫を移植し、生存転帰をＴＬＲ７－／－ノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝５／群）Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドで比較した。動物の両方の群は、ＲＮＡ－ＮＰで毎週（×３）静脈内処置されたのに対し、ＫＯマウスは、ＮＰのみを投与された（＊ｐ）。 ＲＮＡ－ＮＰは、記憶想起反応を媒介する。（図２０Ａ）Ｋ７Ｍ２肺腫瘍を接種したＢａｌｂ／ｃマウス（５～８／群）に、続いて、３週間のＲＮＡ－ＮＰを静脈内ワクチン接種し、腫瘍抗体に対するエクスビボ記憶想起反応の分析のために、３回目のワクチン接種の１週間後に脾臓を採取した。ＩＦＮ－γによる抗原（Ｋ７Ｍ２）対対照腫瘍（Ｂ１６Ｆ０）（＊ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。（図２０Ｂ）以前にＲＮＡ－ＮＰで処置された長期生存動物（ｎ＝７）を、Ｋ７Ｍ２腫瘍細胞（１．２５ｘ１０６細胞）の静脈内投与で再チャレンジし、Ｋ７Ｍ２腫瘍を接種された未処置のマウスの新しいコホート（ｎ＝８）と比較した（＊＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。
本開示は、カチオン性脂質および核酸を含むナノ粒子に関する。本明細書で使用される場合、用語「ナノ粒子」は、直径が約１０００ｎｍ未満である粒子を指す。本開示のナノ粒子は、リポソーム形成を誘導するように処理されたカチオン性脂質を含むので、様々な態様でここに開示されるナノ粒子は、リポソームを含む。リポソームは、人工的に調製されたベシクルであり、例示的な態様では、主に脂質二重層から構成される。様々な例におけるリポソームは、栄養素および医薬品の投与のための送達媒体として使用される。様々な態様において、本開示のリポソームは異なるサイズであり、組成物は、（ａ）直径数百ナノメートルであり得、狭い水性コンパートメントによって分離された一連の同心二重層を含み得る多層ベシクル（ＭＬＶ）、（ｂ）直径５０ｎｍ未満であり得る小さな単細胞ベシクル（ＳＵＶ）、および（ｃ）直径５０～５００ｎｍであり得る大きな単細胞ベシクル（ＬＵＶ）のうちの１つ以上を含み得る。様々な例におけるリポソームは、不健康な組織へのリポソームの付着を改善するために、またはエンドサイトーシス（これに限定されない）などの事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドを含むように設計される。例示的な態様では、リポソームは、製剤の送達を改善するために、低または高ｐＨを含む。様々な例において、リポソームは、封入された製剤およびリポソーム成分、脂質ベシクルが分散される媒体の性質、封入された物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、ベシクルの用途および／または送達中に関与する追加のプロセス、目的の用途のためのベシクルの最適化サイズ、多分散性および貯蔵寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム製品の大規模生産のバッチ間の再現性および可能性に応じて配合されるが、これらに限定されない。
例示的な実施形態では、ナノ粒子は、表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層、任意選択で、３つ以上の核酸層を含む内部を含む。例示的な例では、各核酸層は、脂質層、例えば、カチオン性脂質層の間に配置される。例示的な態様では、ナノ粒子は、核酸および脂質の交互の層を含む多層である。例示的な実施形態では、本開示のナノ粒子は、交互の核酸層およびカチオン性脂質二重層を含む内部を含む。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも３つの核酸層を含み、その核酸層のそれぞれは、カチオン性脂質二重層の間に配置される。例示的な態様では、ナノ粒子は、少なくとも４つまたは５つの核酸層を含み、その核酸層それぞれは、カチオン性脂質二重層の間に配置される。例示的な態様では、ナノ粒子は、少なくとも５つを超える（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）核酸層を含み、それぞれの核酸層は、カチオン性脂質二重層の間に配置される。本明細書で使用される場合、用語「カチオン性脂質二重層」は、カチオン性脂質またはそれらの混合物を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる脂質二重層を意味する。適切なカチオン性脂質は、本明細書に記載されている。本明細書で使用される場合、用語「核酸層」は、核酸、例えば、ＲＮＡを含む、それから本質的になる、またはそれからなる、ここで開示されるナノ粒子の層を意味する。
本開示のナノ粒子の独特の構造は、多層ナノ粒子が生物学的効果を発揮する方法に機構的な違いをもたらす。以前に記載されたＲＮＡベースのナノ粒子は、少なくとも部分的に、トル様受容体７（ＴＬＲ７）経路を介して、それらの効果を発揮する。驚くべきことに、本開示の多層ナノ粒子は、ＴＬＲ７とは無関係に有効性を媒介する。例えば、図１８および１９Ａ～１９Ｂを参照のこと。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＭＤＡ－５などの細胞内病原体認識受容体（ＰＲＲ）は、ＴＬＲよりも多層ナノ粒子の生物活性に関連しているようである。例えば、図１７を参照のこと。これにより、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰは、単一のＴＬＲ（つまり、エンドソーム内のＴＬＲ７）とは反対に、複数の細胞内ＰＲＲ（つまり、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５）を刺激して、Ｉ型インターフェロンのより多くの放出およびより強力な先天性免疫の誘導をもたらす可能性がある（図１１）。これにより、無関係な種のｍＲＮＡが抗腫瘍活性（図３Ｂ、３Ｃ、および７Ｂ）を誘発し、腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰが優れた有効性を示し、長期的な生存者の利益を得ることができる（図１４）。
様々な態様において、ここで開示されるナノ粒子は、正に帯電した表面を含む。いくつかの例では、正に帯電した表面は、脂質層、例えばカチオン性脂質層を含む。様々な態様において、ナノ粒子の最外層は、カチオン性脂質二重層を含む。任意選択で、カチオン性脂質二重層はＤＯＴＡＰを含む。様々な例において、表面は、カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む。いくつかの態様において、コアは、カチオン性脂質二重層を含む。様々な態様において、コアの最外領域は、カチオン性脂質二重層を含む。いくつかの例では、コアの最外領域は、ＤＯＴＡＰを含むカチオン性脂質二重層を含む。様々な例では、コアは核酸を欠く。任意選択で、コアは、約０．５重量％未満の核酸を含む。例示的な態様では、コアは、（ｉ）治療薬もしくは（ｉｉ）診断薬（例えば、造影剤）または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む。適切な治療薬および診断薬は、本明細書に記載されている。例示的な態様では、治療薬は、核酸を含むかまたは核酸である。任意選択で、治療薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはｓｉＲＮＡである。様々な例では、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、交互の核酸層（カチオン性脂質二重層）に存在するのと同じ核酸ではない。例示的な例では、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、交互の核酸層（カチオン性脂質二重層）に存在するのと同じ核酸である。様々な態様において、コアは、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介して組織または細胞を画像化するのに有用な酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）を含む。任意選択で、ＩＯＮＰは、脂肪酸、例えばＣ８－Ｃ３０脂肪酸でコーティングされる。様々な態様において、脂肪酸は、オレイン酸である。様々な態様において、コアは、複数のＩＯＮＰ（任意選択で、オレイン酸でコーティングされる）を含み、ここで、複数は、脂質、例えば、カチオン性脂質によって一緒に保持される。任意選択で、複数のＩＯＮＰ（任意選択で、オレイン酸でコーティングされる）は、ＤＯＴＡＰによって一緒に保持される。治療薬および診断薬を含むコアのさらなる説明を、以下に提供する。
例示的な態様では、ナノ粒子は、ナノメートル範囲内の直径を有し、したがって、特定の例では、本明細書では「ナノリポソーム」または「リポソーム」と呼ばれる。例示的な態様では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば、約５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍの直径を有する。例示的な態様では、リポソームは、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１１０ｎｍ±５ｎｍ、約１１５ｎｍ±５ｎｍ、約１２０ｎｍ±５ｎｍ、約１２５ｎｍ±５ｎｍ、約１３０ｎｍ±５ｎｍ、約１３５ｎｍ±５ｎｍ、約１４０ｎｍ±５ｎｍ、約１４５ｎｍ±５ｎｍ、約１５０ｎｍ±５ｎｍ、約１５５ｎｍ±５ｎｍ、約１６０ｎｍ±５ｎｍ、約１６５ｎｍ±５ｎｍ、約１７０ｎｍ±５ｎｍ、約１７５ｎｍ±５ｎｍ、約１８０ｎｍ±５ｎｍ、約１９０ｎｍ±５ｎｍ、約２００ｎｍ±５ｎｍ、約２１０ｎｍ±５ｎｍ、約２２０ｎｍ±５ｎｍ、約２３０ｎｍ±５ｎｍ、約２４０ｎｍ±５ｎｍ、約２５０ｎｍ±５ｎｍ、約２６０ｎｍ±５ｎｍ、約２７０ｎｍ±５ｎｍ、約２８０ｎｍ±５ｎｍ、約２９０ｎｍ±５ｎｍ、約３００ｎｍ±５ｎｍの直径を有する。例示的な態様では、ナノ粒子は、直径が約５０ｎｍ～約２５０ｎｍである。一部の態様では、ナノ粒子は、直径が約７０ｎｍ～約２００ｎｍである。
例示的な態様では、ナノ粒子は、直径、例えば、直径約５０ｎｍ～約５００ｎｍまたは約５０ｎｍ～約２５０ｎｍの範囲のナノ粒子の不均一な混合物を含む医薬組成物中に存在する。任意選択で、医薬組成物は、直径が約７０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲のナノ粒子の不均一な混合物を含む。
例示的な例では、ナノ粒子は、約＋４０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、例えば、約＋４０ｍＶ～約＋５５ｍＶ、約＋４０ｍＶ～約＋５０ｍＶ、約＋４０ｍＶ～約＋５０ｍＶ、約＋５０ｍＶ、約＋４０ｍＶ～約＋４５ｍＶ、約＋４５ｍＶ～約＋６０ｍＶ、約＋５０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、約＋５５ｍＶ～約＋６０ｍＶのゼータ電位によって特徴付けられる。例示的な態様では、ナノ粒子は、約＋４５ｍＶ～約＋５５ｍＶのゼータ電位を有する。様々な場合のナノ粒子のゼータ電位は、約＋５０ｍＶである。様々な態様では、ゼータ電位は、＋３０ｍＶまたは＋３５ｍＶを超えている。ゼータ電位は、本開示のナノ粒子と、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６（１）：ｅ１２５６５２７（２０１６）に記載されるナノ粒子とを区別する１つのパラメーターである。
例示的な実施形態では、ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、米国特許出願第２０１３／００９０３７２号（その内容は、参照によりその全体が本明細書中で援用される）に記載されているものなどの低分子量カチオン性脂質である。例示的な例におけるカチオン性脂質は、カチオン性脂肪酸、カチオン性グリセロリン脂質、カチオン性グリセロリン脂質、カチオン性スフィンゴ脂質、カチオン性ステロール脂質、カチオン性プレノール脂質、カチオン性糖脂質、またはカチオン性ポリケチドである。例示的な態様では、カチオン性脂質は、２つの脂肪アシル鎖を含み、その各鎖は、独立して飽和または不飽和である。いくつかの例では、カチオン性脂質は、ジグリセリドである。例えば、いくつかの例では、カチオン性脂質は、式Ｉまたは式ＩＩのカチオン性脂質であり得る。
Figure 2022541586000001
Figure 2022541586000002
ここで、ａ、ｂ、ｎ、およびｍのそれぞれは、独立して、２～１２（例えば、３～１０）の整数である。いくつかの態様において、カチオン性脂質は、式Ｉのカチオン性脂質であり、ここで、ａ、ｂ、ｎ、およびｍのそれぞれは、独立して、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される整数である。例示的な例では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）、またはその誘導体である。例示的な例では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、またはその誘導体である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソームから形成されたリポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）からのＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、およびＭＣ３（ＵＳ２０１０／０３２４１２０、参照によりその全体が本明細書中で援用される）を含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に適切であることが以前に記載および示された安定化プラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されたリポソームを含む。一部の態様におけるナノ粒子は、核酸分子に加えて、３～４個の脂質成分で構成されている。例示的な態様では、リポソームは、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．によって記載されるように、５５％のコレステロール、２０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ－Ｓ－ＤＳＧ、および１５％の１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含む。例示的な例では、リポソームは、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、および３０％のカチオン性脂質を含み、ここで、カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、またはＨｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．に記載の１，２－ジリノレニルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
いくつかの実施形態において、リポソームは、約２５．０％コレステロール～約４０．０％コレステロール、約３０．０％コレステロール～約４５．０％コレステロール、約３５．０％コレステロール～約５０．０％コレステロール、および／または約４８．５％コレステロール～約６０％コレステロールを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％および４３．５％からなる群から選択される百分率のコレステロールを含み得る。いくつかの実施形態において、リポソームは、約５．０％～約１０．０％のＤＳＰＣおよび／または約７．０％～約１５．０％のＤＳＰＣを含み得る。
いくつかの実施形態において、リポソームは、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）、中性ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）ベースのリポソームである。（例えば、卵巣がんのためのｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８－１７１３）、参照によりその全体が本明細書で援用される）およびヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）である。
様々な例において、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、さらに中性脂質、ステロール、および粒子凝集を低減できる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
様々な態様におけるリポソームは、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質およびアミノアルコール脂質を含む。いくつかの態様において、リポソームは、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質を含むが、これらに限定されない。アミノアルコールカチオン性脂質は、いくつかの態様において、米国特許出願公開第２０１３／０１５０６２５号（その全体は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている、および／または記載されている方法によって作製された脂質を含む。非限定的な例として、特定の態様におけるカチオン性脂質は、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，２Ｚ）－である。オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３／０１５０６２５の化合物１）、２－アミノ－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３／０１５０６２５の化合物２）、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－［（オクチルオキシ）メチル］プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３／０１５０６２５の化合物３）、および２－（ジメチルアミノ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３／０１５０６２５の化合物４）、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体である。
様々な実施形態において、リポソームは、（ｉ）２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される少なくとも１つの脂質、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択された中性脂質、（ｉｉｉ）ステロール、例えばコレステロール、および（ｉｖ）約２０～６０％のカチオン性脂質：５～２５％の中性脂質：２５～５５％のステロールのモル比のＰＥＧ－脂質、例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ｃＤＭＡ。０．５～１５％のＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態において、リポソームは、モル基準で約２５％～約７５％の、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を含み、例えば、モル基準で約３５～約６５％、約４５～約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％または約４０％含む。
いくつかの実施形態において、リポソームは、モル基準で約０．５％～約１５％の中性脂質を含み、例えば、モル基準で約３～約１２％、約５～約１０％または約１５％、約１０％、または約７．５％含む。中性脂質の例には、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、製剤は、ステロールのモル基準で約５％～約５０％（例えば、モル基準で約１５～約４５％、約２０～約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％、または約３１％を含む）。例示的なステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態において、製剤は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を、モル基準で約０．５％～約２０％（例えば、モル基準で約０．５～約１０％、約０．５～約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％、または約５％）含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００未満、例えば、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、または約５００ＤａのＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の例には、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（本明細書ではＰＥＧ－Ｃ１４またはＣ１４－ＰＥＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７、２７６－２８７（２００５）（その内容は、参照によりその全体が本明細書中で援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な態様では、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメミルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６、１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメイヒロクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコス－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニリコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコス－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコント－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコント－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコス－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルロクチル）オキシル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－｛［８－（２－オクリルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミンおよび（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミンもしくはその薬学的に許容される塩または立体異性体から選択され得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質－ポリカチオン複合体を含む。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、当該技術分野で公知の方法によって、および／または米国特許出願公開第２０１２／０１７８７０２号（参照することによりその全体が本明細書中で援用される）に記載される方法によって達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、例えば、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンなどであるがこれらに限定されないカチオン性ペプチドまたはポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、脂質－ポリカチオン複合体を含み得、これは、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などであるがこれらに限定されない非カチオン性脂質をさらに含み得る。
いくつかの態様において、核酸分子は、約１対約５～約１対約２０、任意選択で約１対約１５、約１対約１０、または約１対約７．５の核酸分子：カチオン性脂質比で存在する。本明細書で使用される場合、用語「核酸分子：カチオン性脂質比」は、質量比を意味し、ここで、核酸分子の質量は、カチオン性脂質の質量に対して相対的である。また、例示的な態様では、用語「核酸分子：カチオン性脂質比」は、本開示のＭＬ ＲＮＡ ＮＰを作製するプロセス中にカチオン性脂質を含むリポソームに添加される核酸分子、例えば、ＲＮＡの質量の比を意味する。例示的な態様では、ナノ粒子は、１５０μｇの脂質混合物当たり約１０μｇ未満または約１０μｇのＲＮＡ分子を含む。例示的な態様では、ナノ粒子は、約１０μｇのＲＮＡを約１５０μｇのリポソームとインキュベートすることによって作製される。別の態様では、ナノ粒子は、脂質混合物の質量当たりより多くのＲＮＡ分子を含む。例えば、ナノ粒子は、１５０μｇのリポソーム当たり１０μｇ超のＲＮＡ分子を含み得る。いくつかの例では、ナノ粒子は、１５０μｇのリポソームまたは脂質混合物当たり１５μｇ超のＲＮＡ分子を含む。
様々な態様において、核酸分子は、ＲＮＡ分子、例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。様々な態様において、ＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。様々な態様において、ＲＮＡは細胞から単離された全ＲＮＡである。例示的な態様では、ＲＮＡは、例えば、腫瘍細胞またはがん細胞などの罹患細胞から単離された全ＲＮＡである。全腫瘍ＲＮＡを取得する方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書中の実施例１に記載される。
例示的な例では、ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡである。様々な態様において、ｍＲＮＡは、インビトロ転写されたｍＲＮＡである。様々な例において、ｍＲＮＡ分子は、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成される。ＩＶＴを実施するための適切な技術が、当該技術分野で公知である。例示的な態様では、ＩＶＴキットが使用される。例示的な態様では、キットは、１つ以上のＩＶＴ反応試薬を含む。本明細書で使用される場合、用語「インビトロ転写（ＩＶＴ）反応試薬」は、ＩＶＴ反応で機能する任意の分子、化合物、因子、または塩を指す。例えば、キットは、外因性ＤＮＡテンプレートからタンパク質を合成するための真核生物または原核生物抽出物を伴う原核生物ファージＲＮＡポリメラーゼおよびプロモーター（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）を含み得る。例示的な態様では、ＲＮＡは、インビトロ転写されたｍＲＮＡであり、インビトロ転写テンプレートは、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである。様々な態様において、ナノ粒子は、ヒトの腫瘍、任意選択で、悪性脳腫瘍、任意選択で、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内因性橋神経膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍から単離されたＲＮＡであるＲＮＡの混合物を含む。様々な態様において、ＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールをコードする配列を含み、その結果、インビトロ転写されたＲＮＡ分子は、３’末端にポリ（Ａ）テールを含む。様々な態様において、ナノ粒子を作製する方法は、例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ分子をキャッピングするなどの追加の処理工程を含む。
例示的な態様におけるｍＲＮＡは、タンパク質をコードする。任意選択で、タンパク質は、腫瘍抗原、サイトカイン、または共刺激分子からなる群から選択される。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、タンパク質をコードする。タンパク質は、一部の態様では、腫瘍抗原、共刺激性分子、サイトカイン、増殖因子、リンホカイン、（例えば、腫瘍転移を阻害するのに有効なサイトカインおよび増殖因子、少なくとも１つの細胞集団に対して抗増殖効果を有することが示されているサイトカインまたは増殖因子を含む）からなる群から選択される。このようなサイトカイン、リンホカイン、増殖因子、または他の造血因子としては：Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍｅｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書における使用のための追加の増殖因子としては、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質－１、骨形態形成タンパク質－２、骨形態形成タンパク質－３、骨形態形成タンパク質－４、骨形態形成タンパク質－５、骨形態形成タンパク質－６、骨形態形成タンパク質－７、骨形態形成タンパク質－８、骨形態形成タンパク質－９、骨形態形成タンパク質－１０、骨形態形成タンパク質－１１、骨形態形成タンパク質－１２、骨形態形成タンパク質－１３、骨形態形成タンパク質－１４、骨形態形成タンパク質－１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体α、サイトカイン誘導性好中球走化因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引物質、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β１．２、トランスフォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子β３、トランスフォーミング増殖因子β５、潜在性トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体、ならびにキメラタンパク質およびその生物学的または免疫学的に活性な断片が挙げられる。例示的な態様では、腫瘍抗原は、ウイルスタンパク質に由来する抗原、点突然変異に由来する抗原、またはがん－生殖系列遺伝子によってコードされる抗原である。例示的な態様では、腫瘍抗原は、ｐｐ６５、ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ／ＮＹ－ＥＳＯ１、ＳＳＸ、チロシナーゼ、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ－１、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、ＷＴ１である。例示的な態様では、共刺激性分子は、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群から選択される。いくつかの態様において、タンパク質は、腫瘍細胞またはヒトによって発現されない。例示的な例では、タンパク質は腫瘍抗原またはがん抗原に関連していない。いくつかの態様において、タンパク質は、腫瘍またはがんに対して非特異的である。例えば、非特異的タンパク質は緑色、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはオボアルブミン（ＯＶＡ）であり得る。
様々な場合において、ＲＮＡ分子は、アンチセンス分子、任意選択で、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである。アンチセンス分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するものであり得る。当業者に既知であるように、ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡが配列特異的な様式で分解される、植物および動物における遺伝子調節の遍在的な機構である（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，４８５－４９０（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２，２２５－２３２（２００２），Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６－８１１（１９９８），Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０１，２５－３３（２０００））。天然ＲＮＡ分解プロセスは、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって開始され、これは、長鎖ｄｓＲＮＡ前駆体の２１～２５ヌクレオチド長の二本鎖断片への切断を促進し、低分子干渉ＲＮＡと称される（ｓｉＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡとしても知られる）（Ｚａｍｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１０１，２５－３３（２０００）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５、１８８－２００（２００１）；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０４、２９３－２９６（２０００）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３－３６６（２００１））。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識して切断する大きなタンパク質複合体に組み込まれる（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９－３２１（２００１）。哺乳動物細胞へのｄｓＲＮＡの導入は、効率的なＤｉｃｅｒ媒介性のｓｉＲＮＡ生成にはつながらず、したがって、ＲＮＡｉを誘導しないことが報告されている（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２５２，９５－１０５（２０００），Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４７９，７９－８２（２０００））。様々な哺乳動物細胞におけるトランスフェクトされたおよび内因性遺伝子の発現を阻害する合成２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖を導入することによって、細胞でのｓｉＲＮＡの成熟におけるＤｉｃｅｒの必要性を回避され得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４－４９８（２００１））。
これに関して、一部の態様におけるＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介し、一部の態様では、タンパク質の発現を阻害するのに特異的なｓｉＲＮＡ分子である。本明細書で使用される用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導または媒介され得る約１０～約５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）を指す。例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～約３０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）または約２０～約２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、２１～２３ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。ｓｉＲＮＡは、二本鎖または一本鎖、好ましくは二本鎖であり得る。
代替的な態様では、ＲＮＡ分子は、代替的に、タンパク質の発現を阻害するのに特異的な短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。本明細書で使用される用語「ｓｈＲＮＡ」は、一本鎖ＲＮＡが、部分的にパリンドローム塩基配列を含有し、その中で二本鎖構造（すなわち、ヘアピン構造）を形成する、約２０以上の塩基対の分子を指す。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造に折り畳まれたｓｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ類似体）であり得る。ｓｈＲＮＡは、典型的には、ヘアピンの約２１ヌクレオチドアンチセンスおよびセンス部分、約２～約６ヌクレオチド長の非ループ側の任意選択的なオーバーハング、および、例えば約３～１０ヌクレオチド長であり得るループ部分、を含む約４５～約６０ヌクレオチドを含む。ｓｈＲＮＡは、化学的に合成され得る。あるいは、ｓｈＲＮＡは、ＤＮＡ配列のセンス鎖とアンチセンス鎖を逆方向に連結し、ＤＮＡを鋳型として使用してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでＲＮＡを合成することによって、産生され得る。
いかなる理論または機構に拘束されることを望むものではないが、ｓｈＲＮＡが細胞に導入された後、ｓｈＲＮＡは、約２０塩基以上（例えば、代表的には、２１、２２、２３塩基）に分解され、ＲＮＡｉを引き起こし、阻害効果をもたらす。したがって、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘発するため、本開示の有効な構成要素として使用され得る。ｓｈＲＮＡは、好ましくは３’突出末端を有してもよい。二本鎖部分の長さは、特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド以上、より好ましくは２０ヌクレオチド以上である。ここで、３’－突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは、長さが少なくとも２ヌクレオチドのＤＮＡであり、さらに好ましくは、長さが２～４ヌクレオチドのＤＮＡである。
例示的な態様では、アンチセンス分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。本明細書で使用される場合、用語「マイクロＲＮＡ」は、翻訳抑制または標的分解を介して遺伝子発現をサイレンシングするためにｍＲＮＡ分子と塩基対を形成する小さな（例えば、１５～２２ヌクレオチド）非コードＲＮＡ分子を指す。マイクロＲＮＡおよびその治療上の可能性は、当該技術分野において報告されている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ＭｉｃｒｏＲＮＡ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，２０１１，Ｂａｄｅｒ ａｎｄ Ｌａｍｍｅｒｓ，“Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ” Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ５２－５５（Ｍａｒｃｈ ２０１１）を参照されたい。
特定の例では、ＲＮＡ分子は、アンチセンス分子であり、任意選択で、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであり、免疫チェックポイント経路のタンパク質を標的として、発現を減少させる。様々な態様では、免疫チェックポイント経路のタンパク質は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、または共刺激受容体：ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、またはＧＩＴＲである。免疫チェックポイント経路のタンパク質は、特定の例では、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、またはＴＩＭ３である。免疫チェックポイントシグナル伝達経路は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２（４）：２５２－２６４（２０１２）に概説されている。
例示的な実施形態では、本開示のＮＰは、ＲＮＡ分子の混合物を含む。例示的な態様では、ＲＮＡ分子の混合物は、ヒトからの細胞から単離されたＲＮＡであり、任意選択で、ヒトは腫瘍を有する。一部の態様では、ＲＮＡの混合物は、ヒトの腫瘍から単離されたＲＮＡである。例示的な態様では、ヒトは、がん、任意選択で、本明細書に記載の任意のがんを有する。任意選択で、ＲＮＡが単離される腫瘍は、神経膠腫（膠芽腫を含むが、これに限定されない）、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍（例えば、黒色腫または乳がん）からなる群から選択される。例示的な態様では、ＲＮＡが単離される腫瘍は、がんの腫瘍、例えば、本明細書中に記載のこれらのがんのいずれかである。
様々な態様において、核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）は、ＬＡＭＰタンパク質を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の態様では、ＬＡＭＰタンパク質は、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ３、ＬＡＭＰ４、またはＬＡＭＰ５タンパク質である。
コア
例示的な実施形態では、本開示のナノ粒子は、治療薬もしくは診断薬またはそれらの組み合わせのための送達ビヒクルとして機能する。様々な態様において、本開示のナノ粒子は、治療薬および診断薬の両方として機能する治療薬の送達ビヒクルとして機能する。例示的な実施形態では、本開示のナノ粒子は、治療薬もしくは診断薬またはそれらの組み合わせを含むコアを含む。例示的な例では、治療薬は、化学療法剤または免疫療法剤である。任意選択で、免疫療法剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１阻害剤である。様々な態様において、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである。様々な態様において、診断薬は、本明細書に記載されているもののうちのいずれか１つなどの造影剤である。任意選択で、造影剤は、酸化鉄ナノ粒子を含む。
化学療法剤
ここで開示される多層ＲＮＡ ＮＰに含めるのに適した化学療法剤は、当該技術分野で公知であり、米国特許第６，６３０，１２４号（参照により本明細書中で援用される）に記載されるように、白金配位化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生物質、抗有糸分裂アルカロイドおよびジフルオロヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、化学療法剤は、白金配位化合物である。用語「白金配位化合物」は、イオンの形態で白金を提供する任意の腫瘍細胞増殖阻害化合物を指す。いくつかの実施形態において、白金配位化合物は、シス－ジアンミンジアクア白金（ＩＩ）－イオン、クロロ（ジエチレントリアミン）－塩化白金（ＩＩ）、ジクロロ（エチレンジアミン）－白金（ＩＩ）、ジアンミン（１，１－シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）、スピロプラチン、イプロプラチン、ジアンミン（２－エチルマロナト）－白金（ＩＩ）、エチレンジアミンマロナト白金（ＩＩ）、アクア（１，２－ジアミノジクロヘキサン）－スルファト白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）、（４－カロキシフタラト）（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－（イソクエン酸）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）シス（ピルバト）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）オキサラト白金（ＩＩ）オルマプラチンまたはテトラプラチンである。
いくつかの実施形態において、シスプラチンは、本開示の組成物および方法において使用される白金配位化合物である。シスプラチンは、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＰＬＡＴＩＮＯＬ（商標）の名称で市販されており、水、滅菌生理食塩水、または他の適切なビヒクルで構成するための粉末として入手可能である。本開示の文脈での使用に適した他の白金配位化合物は既知であり、市販されているか、および／また公知の技術によって調製され得る。シスプラチン、すなわちｃｉｓ－ジクロロジアンミン白金ＩＩは、様々なヒト固形悪性腫瘍の治療における化学療法剤として長年にわたって成功裏に使用されてきた。より最近では、他のジアミノ－白金錯体もまた、様々なヒト固形悪性腫瘍の治療における化学療法剤としての有効性を示している。このようなジアミノ白金錯体には、スピロ白金およびカルボプラチンが含まれるが、これらに限定されない。シスプラチンおよび他のジアミノ－白金錯体は、ヒトの化学療法剤として広く使用されてきたが、腎臓の損傷などの毒性の問題を引き起こす可能性のある高用量レベルで送達する必要がありた。
いくつかの実施形態において、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼは、真核細胞のＤＮＡトポロジーを変化させることができる酵素である。トポイソメラーゼは、細胞機能と細胞増殖に重要である。一般に、真核細胞には、Ｉ型およびＩＩ型の２つのクラスのトポイソメラーゼがある。トポイソメラーゼＩは、分子量が約１００，０００の単量体酵素である。この酵素は、ＤＮＡに結合し、一過性の一本鎖切断を導入し、二重らせんをほどき（または巻き戻しを可能にし）、その後、ＤＮＡ鎖から解離する前に切断を再封する。様々なトポイソメラーゼ阻害剤が、卵巣がん、乳がん、食道がん、または非小細胞肺がんを患うヒトの治療において、臨床的有効性を示してきた。
いくつかの態様において、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシンまたはカンプトテシン類似体である。カンプトテシンは、中国固有のＣａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｃｕｍｉｎａｔａ樹木およびインド固有のＮｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ ｆｏｅｔｉｄａ樹木によって生成される、水不溶性の細胞毒性アルカロイドである。カンプトテシンは、多くの腫瘍細胞の増殖を抑制する。カンプトテシン類似体クラスの化合物は、典型的には、ＤＮＡトポイソメラーゼＩの特異的阻害剤である。カンプトテシン類似体クラスの化合物には、トポテカン、イリノテカンおよび９－アミノ－カンプトテシンが含まれるが、これらに限定されない。
追加の実施形態において、化学療法剤は、以下に特許請求または記載されている任意の腫瘍細胞増殖阻害カンプトテシン類似体であり：米国特許第５，００４，７５８号および欧州特許出願第８８３１１３６６．４号、ＥＰ０ ３２１ １２２として公開、米国特許第４，６０４，４６３号および欧州特許出願公開第ＥＰ０ １３７ １４５号、米国特許第４，４７３，６９２および欧州特許出願公開第ＥＰ０ ０７４ ２５６号；米国特許第４，５４５，８８０号および欧州特許出願公開番号ＥＰ０ ０７４ ２５６号、欧州特許出願公開番号ＥＰ０ ０８８ ６４２号；Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９、２３５８－２３６３（１９８６）；Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｋｙｏｔｏ，１９８５，Ｔｏｋｙｏ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ １，ｐ．２８－３０、特に、ＣＰＴ－１１と呼ばれる化合物である。ＣＰＴ－１１は、４－（ピペリジノ）－ピペリジン側鎖が１０－ヒドロキシ－７－エチルカンプトテシンのＣ－１０でカルバメート結合を介して結合したカンプトテシン類似体である。ＣＰＴ－１１は現在、ヒトでの臨床試験が行われており、イリノテカンとも呼ばれる。Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３、５５４（１９８０）；Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０，１７７４（１９８７）、米国特許第４，３４２，７７６号、１９９０年９月１３日に出願された米国特許出願第５８１，９１６号および欧州特許出願公開番号第ＥＰ４１８ ０９９号、米国特許出願第４，５１３，１３８号および欧州特許出願公開番号ＥＰ０ ０７４ ７７０号、米国特許第４，３９９，２７６号および欧州特許出願公開番号００５６６９２号（それぞれの開示全体は、参照により本明細書中で援用される）。カンプトテシン類似体クラスの上記に記載された化合物の全ては、市販されており、および／または上記に記載された参考文献に記載されているものを含む既知の技術によって調製され得る。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカン、イリノテカンおよび９－アミノカンプトテシンからなる群から選択され得る。
カンプトテシン類似体クラスの多数の化合物（その薬学的に許容される塩、水和物および溶媒和物を含む）の調製、ならびにカンプトテシン類似体クラスのそのような化合物および不活性で薬学的に許容される担体または希釈剤を含む経口および非経口医薬組成物の調製は、欧州特許出願公開第ＥＰ０ ３２１ １２２号として公開されている米国特許第５，００４，７５８号および欧州特許出願第８８３１１３６６．４号に広く記載されており、それらの教示は、参照により本明細書中で援用される。
さらに他の実施形態では、化学療法剤は、抗生物質化合物である。適切な抗生物質には、ドキソルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびストレプトゾシンが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、化学療法剤は、有糸分裂阻害剤アルカロイドである。一般に、有糸分裂防止アルカロイドは、Ｃａｎｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓから抽出することができ、抗がん化学療法剤として有効であることが示されている。多数の半合成誘導体が、化学的および薬理学的の両方で研究されてきた（Ｏ．Ｖａｎ Ｔｅｌｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，１６９９－１７１６（１９９２）を参照）。本発明の有糸分裂阻害アルカロイドには、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル（ＰＴＸ；タキソール（登録商標））およびビノレルビンが含まれるが、これらに限定されない。後者の２つの有糸分裂阻害アルカロイドは、それぞれＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ ＣｏｍｐａｎｙおよびＰｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている（米国特許第５，６２０，９８５号を参照）。本発明の例示的な態様では、有糸分裂阻害アルカロイドはビノレルビンである。
本発明の他の実施形態において、化学療法剤は、ジフルオロヌクレオシドである。２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、抗ウイルス活性を有するとして当該技術分野で公知である。このような化合物は、米国特許第４，５２６，９８８号および同第４，８０８，６１４号に開示および教示されている。欧州特許出願公開１８４，３６５号は、これらの同じジフルオロヌクレオシドが腫瘍溶解活性を有することを開示する。特定の態様では、本発明の組成物および方法で使用される２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、ゲムシタビン塩酸塩としても知られる２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジン塩酸塩である。ゲムシタビンは市販されているか、または米国特許第４，５２６，９８８号、同第４，８０８，６１４号および同第５，２２３，６０８号に開示および教示されているように多段階プロセスで合成することができ、その教示は参照により本明細書中で援用される。
例示的な態様では、化学療法剤はホルモン療法剤である。例示的な例では、ホルモン療法剤は、例えば、レトロゾール、タモキシフェン、バゼドキシフェン、エキセメスタン、リュープロリド、ゴセレリン、フルベストラント、アナストロゾール、またはトレミフェンである。例示的な態様では、ホルモン療法剤は、黄体形成ホルモン（ＬＨ）遮断薬、例えば、ゴサレリン、またはＬＨ放出ホルモン（ＲＨ）アゴニストである。例示的な態様では、ホルモン療法剤は、ＥＲ標的剤（例えば、フルベストラントもしくはタモキシフェン）、ラパマイシン、ラパマイシン類似体（例えば、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ゾタロリムス、および３２－デオキソラパマイシン）、抗ＨＥＲ２薬（例、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、Ｔ－ＤＭ１、もしくはネラチニブ）またはＰＩ３Ｋ阻害剤（例、タセリシブ、アルペリシブ、もしくはブパルリシブ）である。
免疫療法剤
本明細書で使用される場合、用語「免疫療法剤」は、疾患、例えば、がんと戦うために身体の自然な防御を高める任意の治療剤を指す。様々な態様において、免疫療法剤は、細胞または分子、例えば、核酸分子、タンパク質またはペプチドである。任意選択で、細胞は、核酸分子、タンパク質、またはペプチドを発現するように作製された操作された細胞である。免疫療法剤は、例えば、モノクローナル抗体、腫瘍溶解性ウイルス治療剤、Ｔ細胞治療剤、またはがんワクチンであり得る。モノクローナル抗体は、例えば、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテキソリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブであり得る。様々な例において、免疫療法剤は、ＣＡＲ Ｔ細胞治療剤、例えば、チサゲンレクロイセル、アクシカブタジーン、またはシロレウセルである。様々な態様において、免疫療法剤は、臓器横断的（ｔｕｍｏｒ－ａｇｎｏｓｔｉｃ）薬剤、例えば、ラクロトレクチニブである。様々な態様において、免疫療法剤は、サイトカイン、任意選択で、インターフェロンまたはインターロイキンである。様々な側面で、サイトカインはＩＦＮ－α（ロフェロン－Ａ［２ａ］、イントロンＡ［２ｂ］、アルフェロン［２ａ］）またはＩＬ－２（アルデスロイキン））である。
例示的な態様では、治療薬は、核酸を含むか、または核酸である。任意選択で、治療薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはｓｉＲＮＡである。様々な例で、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、交互の核酸層（カチオン性脂質二重層）に存在する同じ核酸ではない。例示的な例では、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、交互の核酸層（カチオン性脂質二重層）に存在するのと同じ核酸である。例示的な例では、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、免疫チェックポイント経路で機能するタンパク質を標的とする。例示的な例では、ＡＳＯまたはｓｉＲＮＡは、免疫チェックポイント経路で機能するタンパク質の発現を低下させる。様々な態様で、免疫チェックポイント経路で機能するタンパク質は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－のいずれかである。Ｈ４、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＧＩＴＲのうちの１つである。
造影剤
強力な抗腫瘍免疫を開始し、治療応答の初期のＭＲＩベースのイメージングバイオマーカーとして機能する多機能ＲＮＡ負荷磁性リポソームを設計し、エレクトロポレーションよりも効果的に樹状細胞（ＤＣ）を活性化して、治療モデルにおける腫瘍増殖の優れた阻害をもたらすことが示された。酸化鉄の含有で、ＤＣトランスフェクションが増強され、ＭＲＩでのＤＣ遊走の追跡が可能になった。リンパ節のＴ２＊加重ＭＲＩ低強度は、ＤＣトラフィッキングとの強い相関関係があることが示され、リンパ節のＴ２＊加重ＭＲＩ低強度は、抗腫瘍反応の早期予測因子になり得ることが示唆された。前臨床腫瘍モデルでは、ワクチン接種の２日後に特定されたＭＲＩ予測の「応答者」は、処置後２～５週間で有意により小さい腫瘍を有し、ＭＲＩ予測の「非応答者」よりも１００％長く生きた。したがって、これらの研究は、強力な抗腫瘍免疫応答を生成してＭＲＩによる個々の治療結果を予測するための単純かつ拡張可能なナノ粒子製剤を提供する。特定の理論に拘束されることなく、酸化鉄ナノ粒子を含む本開示の多層ＲＮＡ ＮＰを使用して、ＤＣを活性化し、腫瘍増殖を阻害し、ＤＣトランスフェクションを増強し、ＭＲＩによるＤＣ遊走の追跡を可能にされ得る。したがって、本開示はさらに、正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含む内部を含むナノ粒子であって、各核酸層が、カチオン性脂質二重層の間に配置され、コアが、造影剤（例えば、造影剤）などの診断剤、任意選択で、ガドリニウム、パーフルオロカーボンマイクロバブル、酸化鉄ナノ粒子、金コロイドまたは金ナノ粒子を含む（例えば、Ｍａｈａｎ ａｎｄ Ｄｏｉｒｏｎ，Ｊ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｖｏｌｕｍｅ ２０１８，記事ＩＤ ５８３７２７６を参照）、ナノ粒子を提供する。様々な態様において、コアは、放射性医薬品（例えば、炭素－１１、フッ素－１８、ガリウム－６７または－６８、インジウム－１１１、ヨウ素－１２３、－１２５、－１３１、クリプトン－８１ｍ、ルテチウム－１７７、窒素－１３、酸素－１５、リン－３２、セレン－７５、テクネチウム－９９ｍ、タリウム－２０１、キセノン－１３３、イットリウム－９０）を含む。様々な態様において、コアは、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介して組織または細胞を画像化するのに有用な酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）を含む。様々な側面で、ＩＯＮＰは、Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）、Ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標）、またはＳｉｎｅｒｅｍ（登録商標）である。任意選択で、ＩＯＮＰは、脂肪酸、例えばＣ８－Ｃ３０脂肪酸でコーティングされる。様々な態様において、脂肪酸は、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、パルミトレイン酸、シス－バクエン酸、またはオレイン酸である。様々な態様において、コアは、複数のＩＯＮＰ（任意選択で、各ＩＯＮＰがオレイン酸でコーティングされる）を含み、ここで、複数は、脂質、例えば、カチオン性脂質によって一緒に保持される。任意選択で、複数のＩＯＮＰ（任意選択で、オレイン酸でコーティングされる）はＤＯＴＡＰによって一緒に保持される。ＤＯＴＡＰコーティングによって一緒に保持されたそのようなＩＯＮＰを作る方法が、本明細書に記載される。
作製方法
本開示はまた、正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含む内部を含むナノ粒子を作製する方法であって、ここで、各核酸層がカチオン性脂質二重層の間に配置され、この方法は、（Ａ）核酸分子およびリポソームを、約１対約５～約１対約２５、約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５のＲＮＡ：リポソーム比で混合して、ＲＮＡ被覆リポソームを得ることであって、リポソームが、カチオン性脂質および有機溶媒を含む脂質混合物を、有機溶媒を真空下で蒸発させることにより乾燥させることを含む、リポソームを作製するプロセスで作製される、ＲＮＡ被覆リポソームを得ることと、（Ｂ）ＲＮＡ被覆リポソームを、余剰量のリポソームと混合することと、を含む、方法を提供する。
例示的な態様では、ここで開示される方法によって作製されたナノ粒子は、本明細書に記載されるここで開示されるナノ粒子の説明と一致する。例えば、ここで開示される方法によって作製されたナノ粒子は、約＋４０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、任意選択で、約＋４５ｍＶ～約＋５５ｍＶのゼータ電位を有する。任意選択で、ここで開示される方法によって作製されたナノ粒子のゼータ電位は、約＋５０ｍＶである。様々な態様において、本開示の方法によって作製されたナノ粒子のコアは、約０．５重量％未満の核酸を含み、かつ／またはコアは、カチオン性脂質二重層を含み、かつ／またはナノ粒子の最外層は、カチオン性脂質二重層を含むか、かつ／または、ナノ粒子の表面は、カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む。
例示的な態様では、脂質混合物は、カチオン性脂質および有機溶媒を、１ｍＬの有機溶媒当たり約４０ｍｇのカチオン性脂質～１ｍＬの有機溶媒当たり約６０ｍｇのカチオン性脂質の比率、任意選択で、有機溶媒１ｍＬ当たり約５０ｍｇのカチオン性脂質の比率で含む。様々な例において、リポソームを作製するプロセスは、脂質混合物を再水和溶液で再水和して再水和脂質混合物を形成し、次に再水和脂質混合物を攪拌、休止、およびサイジングすることをさらに含む。任意選択で、再水和脂質混合物のサイジングは、再水和脂質混合物を超音波処理、押し出し、および／または濾過することを含む。
正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含み、各核酸層がカチオン性脂質二重層の間に配置される内部を含むナノ粒子を作製する例示的な方法は、本明細帳、実施例１で説明される。実施例１に記載されている工程のいずれか１つ以上を、ここで開示される方法に含めることができる。例えば、いくつかの実施形態では、この方法は、リポソームと複合体を形成する前にＲＮＡを調製するために必要とされる１つ以上の工程を含む。例示的な態様では、この方法は、対象、例えば、ヒトに投与するためのナノ粒子を調製するための下流の工程を含む。例示的な例では、この方法は、静脈内注射用のＮＰを処方することを含む。この方法は、様々な態様において、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を添加することを含み、任意選択で、得られた組成物を容器、例えば、バイアル、注射器、バッグ、アンプルなどに包装することを含む。一部の態様での容器は、すぐに使用できる容器であり、任意選択で、使い捨て用である。
本明細書では、ここで開示されるナノ粒子の作製方法によって作製されたナノ粒子がさらに提供される。
細胞とその集団
本明細書では、本開示のナノ粒子を含む（例えば、このナノ粒子でトランスフェクトされた）細胞がさらに提供される。例示的な態様では、細胞は、本開示のナノ粒子を含有し得る任意の型の細胞である。一部の態様における細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、または藻類である。代替的な態様では、細胞は、原核細胞、例えば、細菌または原生動物である。例示的な態様では、細胞は、培養細胞である。代替的な態様では、細胞は、初代細胞、すなわち、生物（例えば、ヒト）から直接単離された、初代細胞である。細胞は、接着細胞または浮遊細胞、すなわち浮遊状態で増殖する細胞であってもよい。例示的な態様における細胞は、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、任意の細胞型であり得、任意の型の組織に由来し得、任意の発達段階であり得る。例示的な態様では、リポソームを含む細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、特定のＴ細胞による認識のために抗原をプロセシングし、提示することによって、細胞の免疫応答を媒介する免疫細胞を指す。例示的な態様では、ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、またはＢ細胞である。例示的な態様では、ＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）である。例示的な態様では、細胞が、対象、例えば、ヒトに投与される場合、細胞は、対象に対して自己由来である。例示的な例では、免疫細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。
また、本開示により、細胞の集団であって、集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、本開示のナノ粒子を含む（例えば、このナノ粒子でトランスフェクトされた）細胞である、細胞の集団が提供される。一部の態様における細胞の集団は、不均一な細胞集団であるか、あるいは、一部の態様では、実質的に均一な集団であり、この集団は、本開示のナノ粒子を含む細胞を主に含む。
医薬組成物
本明細書において、本開示のナノ粒子、本開示のナノ粒子を含む細胞、本開示の細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせ、および薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤を含む組成物が提供される。例示的な態様では、組成物は、本開示による複数のナノ粒子および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含み、ヒトへの投与を目的とする医薬組成物である。例示的な態様では、組成物は、無菌組成物である。例示的な例では、組成物は、本開示の複数のナノ粒子を含む。任意選択で、複数のうちの少なくとも５０％のナノ粒子は、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍの直径を有する。様々な態様において、組成物は、１ｍＬ当たり約１０１０ナノ粒子～１ｍＬ当たり約１０１５ナノ粒子、任意選択で、１ｍＬ当たり約１０１２ナノ粒子±１０％を含む。
例示的な態様では、本開示の組成物は、ナノ粒子、ナノ粒子を含む細胞、または細胞の集団以外の、追加の成分を含み得る。組成物は、様々な態様では、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴射剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固剤、抗菌保存剤、抗酸化剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、被膜形成剤、風味増強剤、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、顆粒化剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性媒体、有機基剤、パスティル基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、保存剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基剤、界面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、張化剤、毒性剤、増粘剤、吸水剤、水混和性共溶媒、水軟化剤、または湿潤剤、を含む、任意の薬学的に許容される成分を含む。例えば、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）（その全体が参照により援用される）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）（その全体が参照により援用される）を参照されたい。
本開示の組成物は、非経口および皮下を含む、任意の許容可能な経路による投与に好適であり得る。他の経路としては、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、節内および脾臓内が挙げられる。例示的な態様では、組成物がリポソーム（リポソームを含む細胞ではない）を含む場合、組成物は、全身（例えば、静脈内）投与に好適である。
組成物が対象への投与を意図した形態である場合、それは、意図した投与部位と等張であるようにされ得る。例えば、溶液が非経口投与を意図した形態である場合、それは血液と等張であり得る。組成物は、典型的には無菌である。特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜を介した濾過によって達成され得る。特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアル、またはプレフィルド注射器、に入れられる。特定の実施形態では、組成物は、調製済の形態、または投与前に再構成または希釈される形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで保存され得る。
使用
特定の理論に拘束されることなく、本明細書で初めて開示されるデータは、対象の腫瘍に対する免疫応答を誘導することを含む、免疫応答を増加させるための、ここで開示されるＲＮＡ ＮＰの使用を支持する。したがって、対象の腫瘍に対する免疫応答を増加させる方法が、本開示によって提供される。例示的な実施形態では、方法は、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む。例示的な態様では、核酸分子は、ｍＲＮＡである。任意選択で、組成物は、対象に全身投与される。例えば、組成物は、静脈内投与される。様々な態様において、医薬組成物は、対象の樹状細胞（ＤＣ）を活性化するのに有効な量で投与される。様々な例では、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答である。必要に応じて、Ｔ細胞媒介性免疫応答は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による活性を含む。例示的な態様では、免疫応答は、自然免疫応答である。
また、本明細書で初めて提供されるデータは、対象における樹状細胞（ＤＣ）活性化を増加させるためのここで開示されるＲＮＡ ＮＰの使用を支持する。したがって、対象においてＤＣを活性化するか、またはＤＣ活性化を増加させる方法がさらに提供される。例示的な実施形態では、この方法は、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む。例示的な態様では、核酸分子はｍＲＮＡである。任意選択で、組成物は、対象に全身投与される。例えば、組成物は、静脈内投与される。様々な態様において、医薬組成物は、対象の腫瘍に対する免疫応答を増加させるのに有効な量で投与される。様々な例で、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答である。任意選択で、Ｔ細胞媒介性免疫応答は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による活性を含む。例示的な態様では、免疫応答は自然免疫応答である。
本明細書で使用される場合、用語「増加する」およびそれから派生する語は、１００％または完全な増加ではない場合がある。むしろ、当業者が潜在的な利点または治療効果を有すると認識する様々な程度の増加がある。例示的な実施形態において、この方法により提供される増加は、少なくともまたは約１０％の増加（例えば、少なくともまたは約２０％の増加、少なくともまたは約３０％の増加、少なくともまたは約４０％の増加、少なくともまたは約５０％の増加、少なくともまたは約６０％の増加、少なくともまたは約７０％の増加、少なくともまたは約８０％の増加、少なくともまたは約９０％の増加、少なくともまたは約９５％の増加、少なくともまたは約９８％の増加）である。
本開示はまた、ＲＮＡ分子を腫瘍内微小環境、リンパ節、および／または細網内皮器官に送達する方法を提供する。例示的な実施形態では、この方法は、ここで開示される医薬組成物を対象に投与することを含む。必要に応じて、細網内皮器官は、脾臓または肝臓である。本明細書では、腫瘍、例えば、脳腫瘍の細胞にＲＮＡを送達する方法であって、本開示の組成物を静脈内投与することを含み、組成物は、ナノ粒子を含む、方法が提供される。また、本明細書では、腫瘍、任意選択で、脳腫瘍の微小環境中の細胞にＲＮＡを送達する方法も提供される。例示的な実施形態では、この方法は、本開示の組成物を全身（例えば、静脈内）投与することを含み、組成物は、ナノ粒子を含む。一部の態様では、ナノ粒子は、免疫チェックポイント経路のタンパク質、任意選択で、ＰＤ－Ｌ１を標的とするｓｉＲＮＡを含む。様々な態様では、微小環境中の細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、任意選択で、腫瘍関連マクロファージである。本開示はまた、脳腫瘍微小環境において抗原提示細胞を活性化する方法を提供する。例示的な実施形態では、この方法は、ここで開示された組成物を全身（例えば、静脈内）投与することを含み、組成物は、ＮＰを含む。
本開示は、ＲＮＡ分子を細胞に送達する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、細胞を本開示のＮＰとインキュベートすることを含む。例示的な例では、細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、任意選択で、樹状細胞（ＤＣ）である。様々な例で、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）は、対象か得られる。特定の態様では、ＲＮＡ分子は、対象、例えば、ヒトから得られた腫瘍細胞から単離される。特定の態様では、ＲＮＡ分子は、アンチセンス分子であり、目的のタンパク質を標的として発現を減少させる。例示的な態様では、ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子であり、免疫チェックポイント経路のタンパク質を標的とする。免疫チェックポイント経路の好適なタンパク質は、当該技術分野で既知であり、本明細書にも記載されている。様々な例では、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ－Ｌ１を標的とする。
一旦ＲＮＡが細胞に送達されると、送達がインビトロまたはエクスビボであれば、細胞は、疾患の治療のために対象に投与され得る。したがって、本開示は、疾患を有する対象を治療する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、ＲＮＡ分子を細胞に送達する上記の方法に従って、ＲＮＡ分子を対象の細胞に送達することを含む。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、エクスビボで細胞に送達され、細胞は、対象に投与される。あるいは、本方法は、リポソームを対象に直接投与することを含む。例示的な実施形態では、疾患を有する対象を治療する方法は、対象において疾患を治療するのに有効な量で、本開示の組成物を投与することを含む。例示的な態様では、疾患はがんであり、一部の態様では、がんは、血液脳関門を越えて位置し、および／または対象は脳に位置する腫瘍を有する。一部の態様では、腫瘍は、神経膠腫、低悪性度神経膠腫または高悪性度神経膠腫、具体的には、グレードＩＩＩの星状細胞腫または神経膠芽腫である。あるいは、腫瘍は、髄芽腫またはびまん性内在性橋神経膠腫であり得る。別の実施例では、腫瘍は、非ＣＮＳ腫瘍、例えば、乳がん、黒色腫、または肺がんからの転移性浸潤であり得る。例示的な態様では、組成物は、リポソームを含み、任意選択で、リポソームを含む組成物は、対象に静脈内投与される。代替的な態様では、組成物は、リポソームでトランスフェクトされた細胞を含む。任意選択で、組成物の細胞は、ＡＰＣであり、任意選択で、ＤＣである。例示的な態様では、リポソームを含む細胞を含む組成物は、対象に皮内投与され、任意選択で、組成物は、対象の鼠径部に皮内投与される。例示的な例では、ＤＣは、対象から得られた白血球（ＷＢＣ）から単離され、任意選択で、ＷＢＣは、白血球除去を介して得られる。一部の態様では、ＲＮＡ分子は腫瘍抗原をコードする。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、腫瘍細胞から単離され、例えば、腫瘍細胞は、対象の腫瘍の細胞である。したがって、疾患を有する対象を治療する方法が、本明細書中でさらに提供される。例示的な実施形態では、方法は、ＲＮＡ分子を、腫瘍内微小環境、リンパ節、および／または細網内皮器官に送達するここで開示される方法によって、対象の細胞にＲＮＡ分子を送達することを含む。様々な態様では、ＲＮＡ分子は、エクスビボで細胞に送達され、細胞は、対象に投与される。例示的な実施形態では、方法は、対象の疾患を治療するのに有効な量で、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む。様々な例において、対象は、がんまたは腫瘍、任意選択で、悪性脳腫瘍、任意選択で、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍を有する。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」、ならびにそれに関連する言葉は、必ずしも１００％または完全な治療を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有するものとして認識する様々な程度の治療がある。この点で、本開示のがんを治療する方法は、任意の量または任意のレベルの治療を提供され得る。さらに、本方法によって提供される治療は、治療される疾患の１つ以上の状態または症状または徴候の治療を含み得る。例えば、本開示の治療方法は、疾患の１つ以上の症状を抑制し得る。また、本開示の方法によって提供される治療は、疾患の進行を遅らせることを包含し得る。用語「治療する」はまた、疾患の予防的治療を包含する。したがって、本開示の方法によって提供される治療は、予防的に治療される疾患の発症または再発を遅延され得る。例示的な態様では、本方法は、疾患の発症を、１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、４年、またはそれ以上遅延させる。予防的治療は、治療される疾患のリスクを低減することを包含する。例示的な態様では、本方法は、疾患のリスクを、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上、低減する。
特定の態様において、疾患を治療する方法は、疾患またはその症状を阻害する方法と見なされ得る。本明細書で使用される場合、用語「阻害する」およびそれから派生する語は、１００％または完全な阻害ではない場合がある。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有するものとして認識する様々な程度の阻害がある。ここで開示される方法は、疾患またはその症状の発症または再発を、任意の量またはレベルまで阻害し得る。例示的な実施形態では、本開示の方法によって提供される阻害は、少なくともまたは約１０％の阻害（例えば、少なくともまたは約２０％の阻害、少なくともまたは約３０％の阻害、少なくともまたは約４０％の阻害、少なくともまたは約５０％の阻害、少なくともまたは約６０％の阻害、少なくともまたは約７０％の阻害、少なくともまたは約８０％の阻害、少なくともまたは約９０％の阻害、少なくともまたは約９５％の阻害、少なくともまたは約９８％の阻害）である。
前述の方法に関して、ＮＰまたはそれを含む組成物は、一部の態様で、対象に全身投与される。任意選択で、この方法は、非経口投与によるリポソームまたは組成物の投与を含む。様々な例では、リポソームまたは組成物は、対象に静脈内投与される。
様々な態様では、ＮＰまたは組成物は、例えば、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、週３回、週２回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、隔週、３週間毎、毎月、または隔月、を含む任意のレジメンに従って投与される。様々な態様では、リポソームまたは組成物は、週１回対象に投与される。
対象
対象は、マウスおよびハムスターなどの齧歯目の哺乳動物、ならびにウサギなどの兎形目の哺乳動物、ネコ科の動物（ネコ）およびイヌ科の動物（イヌ）を含む食肉目の哺乳動物、ウシ科の動物（ウシ）およびイノシシ科の動物（ブタ）を含む偶蹄目の哺乳動物、またはウマ科の動物（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物である。一部の態様では、哺乳動物は、霊長目、Ｃｅｂｏｉｄ目またはＳｉｍｏｉｄ目（サル）に属するか、または真猿亜目（ヒトおよび類人猿）に属する。代表的な態様では、哺乳動物は、ヒトである。一部の態様では、ヒトは、１８歳以上の成人である。一部の態様では、ヒトは、１７歳以下の子供である。例示的な態様では、対象は、ＤＭＧを有する。様々な例では、ＤＭＧは、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である。
がん
本明細書に開示される方法によって治療可能ながんは、任意のがん、例えば、リンパ系または血流を通じて身体の他の部分に広がる可能性のある異常かつ制御されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖または腫瘍であり得る。
一部の態様におけるがんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管がん、または肛門直腸がん、眼がん、肝内胆管がん、関節のがん、頚部がん、胆嚢がん、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、口腔のがん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、大網、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ））、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および膀胱がん、からなる群から選択されるものである。特定の態様では、がんは、頭頸部がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がんおよび食道がん、膵がん、胃腸がん、胃がん、乳がん、子宮内膜がんおよび大腸がん、肝細胞がん、膠芽腫、膀胱がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、または細気管支肺胞がんからなる群から選択される。
以下の実施例は、単に本発明を例示するためだけに提供され、その範囲を如何様にも限定するためではない。
実施例１
この実施例は、本開示のナノ粒子を作製する方法を説明する。
ＤＯＴＡＰリポソームの調製
１日目に、ドラフト内で次の手順を実行した。ロータベーパー浴に水を加えた。クロロホルム（２０ｍＬ）を滅菌ガラスメスシリンダーに注いだ。１ｇのＤＯＴＡＰを含むバイアルを開けた後、ガラスピペットを使用して、５ｍＬのクロロホルムをＤＯＴＡＰバイアルに加えた。次に、一定量のクロロホルムおよびＤＯＴＡＰを、１Ｌの蒸発フラスコに移した。２番目の体積５ｍＬのクロロホルムをＤＯＴＡＰバイアルに加えてバイアル中に残存するＤＯＴＡＰを溶解し、この量のクロロホルムをＤＯＴＡＰバイアルから蒸発フラスコに移すことによって、ＤＯＴＡＰバイアルを洗浄した。メスシリンダー内の全てのクロロホルムが使用されるまで、この洗浄工程をさらに２回繰り返した。次に、蒸発フラスコをＢｕｃｈｉロータベーパーに入れた。水浴の電源を入れて、２５℃に調整した。蒸発フラスコを、水浴に触れるまで下に動かした。ロータベーパーの回転速度を、２に調整した。真空システムの電源を入れて、４０ｍｂａｒに調整した。１０分後、真空システムの電源を切り、クロロホルムをコレクターフラスコから収集した。採取したクロロホルムの量を測定した。一旦コレクターフラスコの位置を変えると、真空を再びオンにし、クロロホルムが完全に蒸発するまで、蒸発フラスコの内容物を一晩乾燥させた。
２日目に、滅菌メスシリンダーを使用して、ＰＢＳ（２００ｍＬ）を、室温に維持された新しい滅菌５００ｍＬ ＰＢＳボトルに追加した。ＤＯＴＡＰを収集するために、２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを準備した。Ｂｕｃｈｉロータベーパー水浴を、５０℃に設定した。ＰＢＳ（５０ｍＬ）を、２５ｍＬの使い捨て血清ピペットを使用して、蒸発フラスコに加えた。蒸発フラスコをＢｕｃｈｉロータベーパーに配置し、フラスコの１／３が水浴に沈むまで、下に動かした。ロータベーパーの回転速度を２に設定し、１０分間回転させた後、回転を止めた。蒸発フラスコからのＤＯＴＡＰを含む５０ｍＬのＰＢＳを、２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルに移した。ＰＢＳボトル内のＰＢＳの全量が使用されるまで、この工程を（３回）繰り返した。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルの最終容量は、４００ｍＬであった。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルの脂質溶液を３０秒間ボルテックスした後、５０℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション中、ボトルを１０分ごとにボルテックスした。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、室温で一晩静置した。
３日目に、ＰＢＳ（２００ｍＬ）を、ＤＯＴＡＰおよびＰＢＳを含む２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルに加えた。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、超音波浴に入れた。超音波浴に水を入れ、２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、５分間超音波処理した。押出機を、ＰＢＳ（１００ｍＬ）で洗浄し、この洗浄工程を繰り返した。０．４５μｍ孔のフィルターを濾過ユニットに取り付け、新しい（３番目の）５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、押出機の出力チューブに配置した。生物学的安全キャビネットｘ中で、３番目のＰＢＳボトルの約７０％が満たされるまで、ＤＯＴＡＰ－ＰＢＳ混合物を押出機にロードした。次に、押出機の電源を入れ、全ての混合物が押出機を通過するまで、ＤＯＴＡＰ ＰＢＳ混合物を加えた。続いて、０．２２μｍ孔のフィルターを濾過ユニットに取り付け、新しい（３番目の）５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、押出機の出力チューブに配置した。以前にフィルタリングされたＤＯＴＡＰ－ＰＢＳ混合物をロードし、全体にわたって再度実行した。次に、ＰＢＳ中にＤＯＴＡＰ脂質ナノ粒子（ＮＰ）を含むサンプルを、４℃で保存した。
ＲＮＡの準備
ＮＰに組み込む前に、ＲＮＡを、いくつかの方法の１つで調製した。全腫瘍ＲＮＡを、腫瘍細胞から全ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む）を単離することによって調製しれた。全腫瘍ＲＮＡの逆転写によって生成されたｃＤＮＡテンプレートを使用してインビトロ転写反応を実行することにより、インビトロ転写されたｍＲＮＡを調製した。腫瘍抗原特異的および非特異的ＲＮＡは、社内で作製するか、または販売会社から購入した。
全腫瘍ＲＮＡ：腫瘍細胞からの全腫瘍由来ＲＮＡ（例えば、Ｂ１６Ｆ０、Ｂ１６Ｆ１０、およびＫＲ１５８－ｌｕｃ）は、市販のＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の説明書に基づいて単離した。
インビトロ転写されたｍＲＮＡ：簡単には、ＲＮＡは、製造業者の指示に従って市販のＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ｃＤＮＡライブラリーは、ＲＴ－ＰＣＲによって生成した。ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｔａｋａｒａ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するために、ＰＣＲによる逆転写酵素反応を、全腫瘍ＲＮＡに対して実行した。次に、得られたｃＤＮＡを、Ｔ７／ＳＭＡＲＴおよびＣＤＳ ＩＩＩプライマーを含むＴａｋａｒａ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘを使用して増幅し、増幅サイクルの総数を、ゲル電気泳動で決定した。製造業者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して、ｃＤＮＡの精製を行った。各ＲＮＡナノ粒子ワクチンで使用するのに十分なｍＲＮＡを単離するために、Ｔ７酵素ミックスを有するｍＭＥＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを使用して、ｃＤＮＡライブラリー上でインビトロ転写を一晩行った。転写の忠実度を確保するため、ハウスキーピング遺伝子を評価した。次に、得られたｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキットで精製して、最終的なｍＲＮＡ産物を得た。
腫瘍抗原特異的および非特異的ｍＲＮＡ：
腫瘍抗原特異的ＲＮＡ（例えば、ｐｐ６５、ＯＶＡをコードするＲＮＡ）および非特異的ＲＮＡ（例えば、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡ）をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、制限酵素（すなわち、ＳｐｅＩ）を用いて線型化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅキットで精製した。続いて、線形化されたＤＮＡを、ｍｍＲＮＡインビトロ転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して転写し、ＲＮＡ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してクリーンアップした。別の方法では、非特異的ＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入する。
多層ＲＮＡナノ粒子（ＮＰ）の調製
ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰをＲＮＡと複合体化して、正に帯電した表面および空のコアを備えた密にコイル状のリポソーム内に含まれるｍＲＮＡのいくつかの層を持つように設計された多層ＲＮＡ－ＮＰを作成した（図１Ａ）。簡単に説明すると、安全キャビネット中で、ＲＮＡを－８０℃から解凍してから氷上に置き、ＰＢＳおよびＤＯＴＡＰを含むサンプル（ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰなど）を室温に戻した。一旦成分を調製すると、滅菌チューブ内で、目的の量のＲＮＡをＰＢＳと混合した。ＲＮＡおよびＰＢＳの混合物を含む滅菌チューブに、適切な量のＤＯＴＡＰ脂質ＮＰを、物理的に混合せずに（例えば、チューブを逆さにせずに、ボルテックスせずに、攪拌せずに）添加した。ＲＮＡ、ＰＢＳ、およびＤＯＴＡＰの混合物を、約１５分間インキュベートして、多層ＲＮＡ－ＮＰを形成させた。１５分後、チューブを繰り返し反転させることにより、混合物を穏やかに混合した。次に、混合物を、全身（すなわち、静脈内）投与の準備ができていると見なした。
上記の調製に使用されるＲＮＡおよびＤＯＴＡＰ脂質ＮＰ（リポソーム）の量を、事前に決定または事前に選択する。いくつかの例では、約１μｇのＲＮＡ当たり約１５μｇのリポソームの比率が使用された。例えば、約５μｇのＲＮＡ当たり約７５μｇのリポソームが使用されるか、または約２５μｇのＲＮＡ当たり約３７５μｇのリポソームが使用される。他の例では、１μｇのＲＮＡ当たり約７．５μｇのリポソームが使用された。したがって、例示的な例では、使用される全てのμｇのＲＮＡに対して、約１μｇ～約２０μｇのリポソームが使用される。
実施例２
この例は、本開示のナノ粒子の特徴付けを説明する。
極低温電子顕微鏡（ＣＥＭ）
実施例１に記載のように調製された多層ＲＮＡ－ＮＰならびに実施例１の「ＲＮＡ調製」および「多層ＲＮＡナノ粒子（ＮＰ）の調製」の工程以外は実施例１の全ての工程に従って作製したＲＮＡを含まない対照ＮＰ（未複合体化ＮＰ）の構造を、ＣＥＭを使用して分析した。ＣＥＭは、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ １７（３）１３２６－１３３５（２０１６）に本質的に記載されているように実行した。簡単に説明すると、多層ＲＮＡ－ＮＰまたは対照ＮＰを含むサンプルを、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（およびクライオＴＥＭ用の自動プランジフリーザー、これは、温度、相対湿度、ブロッティング条件および凍結速度を制御することにより、氷晶の形成なしにサンプルを凍結する）中にロードして瞬間冷凍する前に、氷上に保持する。次に、サンプルを、Ｇａｔａｎ ＵｌｔｒａＳｃａｎ ４０００（４ｋ×４ｋ）ＣＣＤカメラを備えたＴｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｆ２０ ＴＷＩＮ ２００ｋＶ／ＦＥＧ透過型電子顕微鏡で画像化した。得られるＣＥＭ画像を、図１Ｂに示す。右のパネルは、多層ＲＮＡ－ＮＰのＣＥＭ画像であり、左のパネルは対照ＮＰ（未複合体化ＮＰ）のＣＥＭ画像である。図１Ｂに示すように、対照ＮＰは最大２層を含んでいたが、多層ＲＮＡ ＮＰは、複数の層を含んでいた。図５は、例示的な多層ＲＮＡ ＮＰの別のＣＥＭ画像を示す。ここでは、脂質層と交互になっているＲＮＡ層の複数の層が特に明白である。
ゼータ電位
多層ＲＮＡ ＮＰのゼータ電位は、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ １７（３）１３２６－１３３５ （２０１６）に本質的に記載されるように、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰｌｕｓ装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、位相分析光散乱（ＰＡＬＳ）によって測定した。簡単に説明すると、未複合体化ＮＰまたはＲＮＡ－ＮＰ（２００μＬ）をＰＢＳ（１．２ｍＬ）に再懸濁し、機器にロードした。サンプルを、サンプル毎に５回、各実行で２５サイクル、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉモデルを使用して実行した。
実施例１に記載されるように調製された多層ＲＮＡ ＮＰのゼータ電位を、約＋５０ｍＶで測定した。興味深いことに、多層ＲＮＡ ＮＰのこのゼータ電位は、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６（１）：ｅ１２５６５２７（２０１６）に記載されている、＋２７ｍＶ付近で測定されたものよりもはるかに高かった。特定の理論に縛られることなく、クロロホルムを蒸発させるための真空シール法を含む多層ＲＮＡ ＮＰの作製に使用するためにＤＯＴＡＰ脂質ＮＰを作成する方法（実施例１）は、ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰの少ない環境酸化をもたらし、これにより、より多量のＲＮＡがＤＯＴＡＰ ＮＰと複合体を形成したり、かつ／またはＤＯＴＡＰ脂質ＮＰへのＲＮＡの取り込みがより増加したりすることが可能になり得る。
ゲル電気泳動によるＲＮＡの取り込み：
ＭＬリポソームに取り込まれたＲＮＡの量を測定するために、ゲル電気泳動実験を行った。この実験に基づき、実施例１に記載された手順で使用されたＲＮＡの、全てではないにしても、ほぼ全てが、ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰに組み込まれたことが定性的に示された。ＲＮＡ取り込みの程度を特徴付ける追加の実験は、ＲＮＡ－ＮＰ密度を測定し、このパラメーターをリポプレックスのパラメーターと比較することによって実行される。
実施例３
本実施例は、全身投与時のＲＮＡ－ＮＰのインビボ局在部位およびそのＲＮＡ ＮＰが、ＤＣの末梢および腫瘍内活性化を媒介することを示す。
実施例１に本質的に記載されるように作製されたＤＯＴＡＰ脂質ＮＰを、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡと複合体化して、ＣｒｅをコードするＲＮＡ－ＮＰを作製する。これらの多層ＲＮＡ－ＮＰを、ｌｏｘＰが隣接するＳＴＯＰカセットを搭載したＡｉ１４トランスジェニックマウスに投与する。ＳＴＯＰカセットは、Ｃｒｅ－リコンビナーゼが発現するまで、ｔｄＴｏｍａｔｏの転写を防ぐ。ＲＮＡ－ＮＰを投与してから１週間後、トランスジェニックマウスのリンパ節、脾臓および肝臓を採取し、切片化し、ＤＡＰＩで染色する。ｔｄＴｏｍａｔｏの発現を、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１８に本質的に記載されている手順に従って、蛍光顕微鏡で分析する。Ｃｒｅ－ｍＲＮＡ－ＮＰは、肝臓、脾臓、リンパ節などのリンパ器官にインビボで局在すると予想される。
実施例１に本質的に記載されるように作製されたＤＯＴＡＰ脂質ＮＰを、非特異的ＲＮＡ（例えば、腫瘍抗原特異的ではなかったＲＮＡ、オボアルブミン（ＯＶＡ）ｍＲＮＡ）と複合体化させ、皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３～４／群）に静脈内注射する。リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄および腫瘍を２４時間以内に採取し、ＣＤ１１ｃ細胞により（＊ｐ＜０．０５ Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定）、樹状細胞（ＤＣ）活性化マーカーＣＤ８６の発現を分析する。ＯＶＡ ｍＲＮＡ－ＮＰは、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、および腫瘍への広範なインビボ局在を示し、その中のＤＣを活性化すると予想される（ＣＤ１１ｃ＋細胞上での活性化マーカーＣＤ８６の増加した発現によって示される）。活性化されたＤＣは抗原特異的Ｔ細胞応答を準備し、いくつかの腫瘍モデルで抗腫瘍効率（ＴＩＬの増加を伴う）につながるため、我々は、多層ＲＮＡ ＮＰの抗腫瘍効果を試験した。
実施例４
この実施例は、本開示のナノ粒子の、カチオン性ＲＮＡリポプレックスおよびアニオン性ＲＮＡリポプレックスとの比較を記載する。
カチオン性リポプレックス（ＬＰＸ）を、外表面上にある正味の正電荷によってシールドされた脂質コアのｍＲＮＡを使用して最初に開発した（図２Ａ）。アニオン性ＲＮＡリポプレックス（図２Ｂ）を、二層リポソームの表面に繋がれた過剰なＲＮＡを用いて開発した。ＲＮＡおよび脂質ＮＰを、電荷を均等化する比率で混合することによって、ＲＮＡ－ＬＰＸを作製した。ＲＮＡおよび脂質ＮＰを、負電荷を有する脂質ＮＰを過飽和させる比率で混合することによって、アニオン性ＲＮＡ－ＮＰを作成した。次に、ＲＮＡ－ＬＰＸおよびアニオン性ＲＮＡ ＬＰＸの様々な態様を、上記の実施例に記載した多層ＲＮＡ ＮＰと比較した。
クライオ電子顕微鏡法（ＣＥＭ）を使用して、ＲＮＡ ＬＰＸおよび実施例１に記載されているように調製された多層ＲＮＡ－ＮＰの構造を比較した。未複合体化ＮＰを、対照として使用した。ＣＥＭを、実施例２に本質的に記載されているように実施した。図２Ｃは、未複合体化ＮＰのＣＥＭ画像、図２Ｄは、ＲＮＡ ＬＰＸのＣＥＭ画像（リポソームのＲＮＡに対するその質量比は３．７５：１）、図２Ｅは、多層ＲＮＡ－ＮＰのＣＥＭ画像（リポソームのＲＮＡに対するその質量比は１５：１である）。これらのデータは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰによってより多くのＲＮＡが保持されることを支持する。追加のデータは、質量または電荷による等量のＲＮＡおよび脂質ＮＰ（すなわち、それぞれＲＮＡ－ＬＰＸおよびアニオン性ＲＮＡ－ＬＰＸ）単に混合しただけでは観察できない多層ＲＮＡ ＮＰｓの形成を支持するＲＮＡ－ＬＰＸに対して、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ複合体化で、濃度がより減少することを示す。このことは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰによってより多くのＲＮＡが「保持」されることを支持する。
また、アニオン性ＬＰＸがマウスへの投与時にどこに局在するかを決定するために、実験を行った。図８に示すように、アニオン性ＬＰＸは投与時に動物の脾臓に局在し、以前の研究と一致している（Ｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５３４：３９６－４０１（２０１６））。
ＲＮＡ ＬＰＸ、アニオン性リポプレックス（ＬＰＸ）、または多層ＲＮＡ－ＮＰをマウスに投与し、活性化ＤＣの評価のために１週間後に脾臓を採取した（＊ｐ＜０．０５対応のないｔ検定）。この実験で使用したＲＮＡは、Ｋ７Ｍ２腫瘍骨肉腫細胞株に由来する腫瘍由来のｍＲＮＡであった。図２Ｆに示すように、多層ＲＮＡ ＮＰで処置されたマウスは、最高レベルの活性化ＤＣを示した。
アニオン性腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、および多層腫瘍ｍＲＮＡをロードしたＮＰを、治療用肺がんモデル（Ｋ７Ｍ２）で比較した（ｎ＝５～８／群）。各ワクチンを、毎週静脈内投与した（×３）（＊＊ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）。ＣＤ８＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋を図２Ｇに示し、ＣＤ４＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋を図２Ｈに示す。また、図２Ｊは、多層（ＭＬ）ＲＮＡ－ＮＰが、生来の抗ウイルスサイトカインである実質的に増加したＩＦＮ－αを媒介することを示す。このことは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが、非抗原特異的ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰからでさえも有効性を促進するのに十分な、実質的により大きな自然免疫を可能にすることを示す。まとめると、これらの図は、アニオン性ＬＰＸおよびＲＮＡ ＬＰＸと比較して、多層腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰの優れた有効性を示す。
アニオン性腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、陽イオン性腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、および多層腫瘍ｍＲＮＡをロードしたＮＰを、治療用肺がんモデル（Ｋ７Ｍ２）で比較した（ｎ＝８／群）。各ワクチンを毎週静脈内投与した（×３）、＊ｐ＜０．０５、Ｇｅｈａｎ Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定。生存率を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線分析によって測定した。図２Ｉに示すように、多層腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰは、カチオン性ＲＮＡリポプレックスおよびアニオン性ＲＮＡリポプレックスと比較して、生存率を高めるための優れた有効性を媒介した。
ここで、生理学的に関連する腫瘍抗原を標的とする多層ＲＮＡ－ＮＰ製剤は、アニオン性ＬＰＸおよびＲＮＡ ＬＰＸと比較して、免疫原性が高く（図２Ｆ～２Ｈ、２Ｊ）、かつ、有意により有効である（図２Ｉ）ことが示されている。特定の理論に縛られることなく、ＲＮＡ－脂質比を変更し、ゼータ電位を上昇させることにより、緊密に巻かれたｍＲＮＡの多層リングで構成される新しいＲＮＡ－ＮＰデザインが開発された（図１Ｃ）が、この多層デザインは、粒子の免疫原性を高め、かつインビボ局在化を末梢および腫瘍微小環境（ＴＭＥ）へ広げるために、ｍＲＮＡのＮＰ取り込みの増加（正／負の電荷を交互に繰り返すことによって濃縮される）を促進すると考えられる。これらの多層ＲＮＡ－ＮＰの全身投与は、リンパ節、細網内皮器官（すなわち、脾臓および肝臓）およびＴＭＥに局在化し、その中のＤＣを活性化する（ＣＤ１１ｃ＋細胞での活性化マーカーＣＤ８６の発現増加に基づく）。これらの活性化されたＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞応答を準備し、いくつかの腫瘍モデルで抗腫瘍効果（ＴＩＬの増加を伴う）をもたらす。
実施例５
本実施例は、ＤＣを全身的に活性化し、抗原特異的免疫を誘導し、かつ抗腫瘍効果を引き出す多層ＲＮＡ－ＮＰの能力を示す。
多層ＲＮＡ ＮＰの効果を、２番目のモデルで試験した。ここでは、Ｋ７Ｍ２肺腫瘍を接種したＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たり８匹のマウス）に、多層ＲＮＡ－ＮＰを週に３回ワクチン接種した。マウスの対照群は未処置であった。腫瘍内メモリーＴ細胞の分析のために、３回目のワクチンの１週間後に肺を採取した（＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。図３Ａは、ＲＮＡ－ＮＰで処置された肺（左）および未処置の肺（右）の写真のペアを提供する。図３Ｂは、未処置のマウス、ＧＦＰ ＲＮＡで多層ＲＮＡ ＮＰを処置したマウス、および腫瘍特異的ＲＮＡで多層ＲＮＡ ＮＰを処置したマウスの採取した肺の％中央メモリーＴ細胞（ＣＤ３＋細胞のＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋）のグラフである。
また、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＢＡＬＢ／ｃ ＳＣＩＤ（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ）マウス（群当たり８匹のマウス）にＫ７Ｍ２肺腫瘍を接種し、ＧＦＰ ＲＮＡまたは腫瘍特異的ＲＮＡを含む多層ＲＮＡ－ＮＰを、週に３回静脈内ワクチン接種した。マウスの対照群は、未処置であった。％生存率を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線にプロットした（＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｇｅｈｅｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘ）。図３Ｃに示すように、腫瘍特異的ＲＮＡを含む多層ＲＮＡ ＮＰで処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率は、３つの群の中で最も高かった。興味深いことに、ＧＦＰ ＲＮＡを含む多層ＲＮＡ ＮＰで処置されたＢＡＬＢ／ｃ ＳＣＩＤ（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ）マウスの生存率は、腫瘍特異的ＲＮＡを含む多層ＲＮＡ ＮＰで処置されたマウスとほぼ同じであった（図３Ｄ）。
まとめると、図３Ａ～３Ｄのデータは、ＧＦＰ ＲＮＡまたは腫瘍特異的ＲＮＡを含むＲＮＡ－ＮＰによる単剤療法が、免疫担当動物およびＳＣＩＤマウスの転移性肺腫瘍に対する有意な抗腫瘍効果を媒介することを示す。転移性肺腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス（図３Ａ～３Ｄ）では、ＧＦＰ（対照）および腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰの両方が自然免疫と抗腫瘍活性を媒介する。ただし、腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰのみが、腫瘍内メモリーＴ細胞の増加および長期生存者の転帰を媒介する（図３Ａ～３Ｄ）。頭蓋内悪性腫瘍を有するマウスにおけるＲＮＡ－ＮＰの抗腫瘍活性もまた実証された（データは示されていない）。
これらのデータは、多層ＲＮＡ－ＮＰが全身的にＤＣを活性化し、抗原特異的免疫を誘導し、抗腫瘍効果を誘発することを示す。図３Ａ～３Ｄは、対照ＲＮＡ－ＮＰが、腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰほど堅牢ではないいくつかの有効性で先天性応答を誘発することを示す。未処置のマウスと比較して、未複合体化ＮＰの影響は観察されていないが、多層ＲＮＡ ＮＰに組み込まれた場合、非特異的（ＧＦＰ ＲＮＡ）および腫瘍特異的ＲＮＡの両方が自然免疫を媒介する。ただし、腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰのみが獲得免疫を誘発し、長期的な生存の利益をもたらする（図３Ａ～３Ｄ）。
実施例６
この例は、パーソナライズされた腫瘍ＲＮＡ－ＮＰが、トランスレーショナルイヌモデルにおいて活性であることを示す。
多層ＲＮＡ－ＮＰの安全性および活性を、悪性神経膠腫または骨肉腫と診断されたクライアント所有のイヌ（ペットのイヌ）で評価した。イヌの悪性神経膠腫または骨肉腫を、最初に、パーソナライズされた腫瘍ＲＮＡ－ＮＰワクチンの生成のために生検した。
パーソナライズされた多層ＲＮＡ ＮＰを生成するために、各患者の生検から全ＲＮＡ材料を抽出した。次に、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、次に、ｃＤＮＡライブラリーからｍＲＮＡを増幅した。次に、ｍＲＮＡをＤＯＴＡＰ脂質ＮＰと複合体化して、実施例１に本質的に記載されているように多層ＲＮＡ－ＮＰにした。ＣＤ１１ｃ＋細胞上のＰＤ－Ｌ１、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を評価するために、ベースラインで採血し、次に、ワクチン接種の２時間後および６時間後に採血した。ＰＤ－Ｌ１、ＭＨＣ－ＩＩ、ＰＤＬ１／ＣＤ８０、およびＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８６のＣＤ１１ｃ発現を、イヌの最初の観察期間中に経時的にプロットする。ＣＤ３＋細胞を、イヌの最初の観察期間中にＣＤ４およびＣＤ８の割合について経時的に分析し、これらのサブセットを、活性化マーカー（すなわち、ＣＤ４４）の発現について評価した。これらのデータから、多層ＲＮＡ－ＮＰは、１）末梢ＤＣの活性化を示すＣＤ１１ｃ＋末梢血細胞上のＣＤ８０およびＭＨＣＩＩの増加、ならびに２）活性化Ｔ細胞の増加を誘発することが示された。
興味深いことに、投与後数時間以内に、腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰは、末梢血単核細胞の辺縁化を誘発し、この辺縁化は治療後の数日および数週間で増加したが、このことは、ＲＮＡ－ＮＰは、退出前に免疫細胞集団のリンパ球ホーニングを媒介することを示唆する。
これらのデータは、パーソナライズされたｍＲＮＡ－ＮＰが、トランスレーショナルイヌ疾患モデルで安全かつアクティブであることを示す。
この方法で評価されたイヌの特定のデータを示す。３１ｋｇの雄のアイリッシュセッターを、多層ＲＮＡ－ＮＰを投与されることに飼い主の同意を得て、研究に登録した。腫瘍生検後、腫瘍ｍＲＮＡを首尾よく抽出および増幅した。免疫応答を、最初のワクチンに対してプロットした。データは、ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＤＣ）での経時的な活性化マーカーの増加を示す（図４Ａ）。データは、ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後の最初の数時間以内に活性化されるＣＤ８＋細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞）の増加を示す。これらのデータは、多層ＲＮＡ－ＮＰが、雄のアイリッシュセッターで免疫学的に活性であることを裏付ける。悪性神経膠腫と診断された雄のボクサーを、ＲＮＡ－ＮＰを投与されることに飼い主の同意を得て、研究に登録した。腫瘍生検後、腫瘍ｍＲＮＡを首尾よく抽出および増幅した。免疫応答を、最初のワクチンに対してプロットする（図４Ｂ）。データは、ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＤＣ）での経時的な活性化マーカーの増加を示す。図４Ｃに示すように、ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後の最初の数時間以内に、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞）の増加が観察された。これらのデータは、多層ＲＮＡ－ＮＰが雄のボクサー犬で免疫学的に活性であることを裏付けている。
毎週ＲＮＡ－ＮＰ（×３）を投与された後、悪性神経膠腫と診断されたイヌは、着実な経過をたどった。ワクチン接種後のＭＲＩは、増加した腫れおよび増強（いくつかの場合で）を伴う安定した腫瘍負荷を示したが、このことは、無症候性のイヌの免疫療法反応からの偽進行とより一致し得る。支持療法および腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰ（切除なしの腫瘍生検後）のみを受けている悪性神経膠腫と診断されたイヌの生存率を図４Ｄに示する。図４Ｄでは、生存期間の中央値（点線で示されている）は約６５日であり、これは対症療法のみを受けているイヌの脳腫瘍患者のメタアナリシスから報告された。以前の研究では、イヌの脳星状細胞腫は７７日の全生存期間の中央値を有すると報告されている。パーソナライズされた多層ＲＮＡ ＮＰは、２００日を超える生存を可能にした。
ワクチン接種の６時間後に初日に微熱が急増したことを除いて、パーソナライズされた腫瘍ＲＮＡ－ＮＰ（１×）は、安定した血球数、差、腎機能および肝機能検査で良好な耐容性を有した。これまでに、我々は、悪性脳腫瘍と診断された４匹のクライアント所有のイヌを治療してきた。これらのイヌは、悪性腫瘍に対して他の治療的介入（すなわち、手術、放射線または化学療法）を受けておらず、評価された全ての患者が、偽進行または安定したもしくはより小さな腫瘍を伴う免疫応答の発生を評価したことを強調することが重要である。ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後に、１匹のイヌを剖検した。この患者では、介入剤に関連すると考えられる毒性はなかった。
これらの結果は、他の抗腫瘍治療介入を受けていない被験者について、悪性脳腫瘍を有するクライアント所有のイヌにおける腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰの安全性および活性を示唆する。
実施例７
この実施例は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの静脈内送達後にＤＯＴＡＰリポソームに封入されたマウス神経膠腫ｍＲＮＡおよびｐｐ６５ ｍＲＮＡの毒性研究を示す。
この研究の目的は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内送達した場合の、ＤＯＴＡＰリポソームによって封入されたｐｐ６５ ｍＲＮＡの安全性を評価することであった。病理学調査に適用可能な実験手順を、表１に要約する。全ての中間期の動物を、３５±１日目に剖検のために提出した。剖検は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａの職員によって行われた。表２に列挙されている組織サンプルを収集し、特に記載がない限り、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、早期に死亡した動物の組織を、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した。
Figure 2022541586000003
Figure 2022541586000004
顕微鏡評価に必要な組織は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓにより、トリミングされ、定期的に処理され、パラフィンに包埋され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。光学顕微鏡による評価は、群１および４の全ての動物、および早期死亡動物からのプロトコルで指定された全ての組織について、理事会認定の獣医病理学者である寄稿者により実施された。
プロトコル毎に顕微鏡で評価されるはずだったがスライド上で入手できなかった（したがって評価されなかった）組織は、病理学レポートの「個別動物データ」に、「存在せず」として列挙されている。各処置群から検査された組織の数は解釈するのに十分であったため、これらの欠落した組織は、研究の病理学部分の結果または解釈に影響を与えなかった。
肉眼的病理学：試験品に関連する肉眼的所見は認められなかった。観察された肉眼的所見は、この系統およびマウスの年齢で一般的に観察される性質に付随するものと見なされ、かつ／または対照および処置動物で同様の発生率であったので、ＤＯＴＡＰリポソーム中の１：１比のｐｐ６５ ｍＲＮＡおよびＫＲ１５８ｍＲＮＡの投与とは無関係であると見なされた。
組織病理学：試験品に関連する顕微鏡所見は認められなかった。注射部位に炎症性細胞浸潤を有する動物が数匹いたが、この所見は注射部位に一般的であり、研究のこの時点では、曖昧であると考えられた。観察された顕微鏡所見は、この系統およびマウスの年齢で一般的に観察される性質に付随するものであると見なされ、かつ／または対照および処置動物で同様の発生率および重症度であったので、ＤＯＴＡＰリポソーム中の１：１比のｐｐ６５ ｍＲＮＡおよびＫＲ１５８ｍＲＮＡの投与とは無関係であると見なされた。
研究０、１４、および２８日目に、１．０ｍｇ／ｋｇＫＲ１５８およびｐｐ６５ ｍＲＮＡ＋１５．０ｍｇ／ｋｇ ＤＯＴＡＰリポソームをマウスの尾静脈に静脈内注射しても、３５日±１日目に、研究に関する肉眼的または顕微鏡的試験品関連の所見は得られなかったと結論付けられた。注射部位には少量の炎症性細胞浸潤があり、これは注射部位の一般的な所見である。この発見は曖昧であった。
実施例８
本実施例では、多層ＲＮＡ－ＮＰでトランスフェクトされたｐＤＣが抗原特異的Ｔ細胞プライミングに与える影響を決定することを目的とした研究について説明する。
ｐＤＣは、自然免疫およびＩ型ＩＦＮの周知の刺激因子であるが、それらはまた、腫瘍内獲得免疫に対する重大な影響も媒介する。それらは、１）腫瘍特異的Ｔ細胞のプライミングのための抗原を直接提示し得、２）他のＤＣサブタイプのケモカイン補充（ケモカインＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ１０を介して）を通じて適応応答を支援し得、３）ＩＬ－１２分泌を介してＴｈ１免疫を極性化し得、かつ／または４）ＤＣローディングおよびＴ細胞プライミングのために（サイトカイン、ＴＲＡＩＬもしくはグランザイムＢを介して）腫瘍抗原の放出を媒介し得る。これらのエフェクター機能にもかかわらず、ｐＤＣは、また、免疫調節分子（ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、およびＩＤＯ）の放出および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の促進により免疫を弱め得る。この研究の目的は、獲得免疫および抗原特異的Ｔ細胞プライミングに対するＲＮＡ－ＮＰトランスフェクトｐＤＣの影響を解明することである。ＲＮＡ－ＮＰ活性化ｐＤＣは、抗原特異的免疫の直接プライマーとして機能し、エフェクターＴ細胞応答の促進において古典的ＤＣ（ｃＤＣ）および／または骨髄由来ＤＣ（ｍＤＣ）を支援すると仮定される。これらの実験は、ＲＮＡ－ＮＰ媒介免疫に必要なｐＤＣの活性化状態および免疫療法効果の強化に採用され得る経時的な枯渇に、新たな光を当てることである。
統計解析
生存率が重要である実施例９．１の研究では、ログランク検定を使用して、処置群と対照群との間でＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を比較する。我々の腫瘍モデルの経験は、未処置の対照マウスの全生存期間の中央値は約３０日であり、生存期間は形状パラメーターｋ＝６のＷｅｉｂｕｌｌ分布に従うことを示す。例として、２つの担がん群（処置および未処置）にそれぞれ１０匹のマウスを使用し、０．０５の有意性で評価された片側ログランク検定を使用した生存曲線の比較は、未処置群と比較した処置群の８日間の生存期間の中央値の改善を検出するための少なくとも８０％の力がある。この効果量は、対立仮説効果量の下で形状パラメーターｋ＝６の１０００のＷｅｉｂｕｌｌ分布生存データセットをシミュレートすることによって決定され、ｐ＜０．０５で有意であったこれらのデータセットのログランク検定の割合を観察した。実施例９．２～９．４の研究では、異なる時間に観察された応答を、治療時間および観察時間に相互に排他的な群が分散された双方向ＡＮＯＶＡモデルを使用して分析する。時間の経過に伴う免疫応答パラメーターの変化を、一般化線形混合効果モデル（ＧＬＭＭ）を使用して評価する。少なくとも１回は完全に複製された実験の応答変数を、ＧＬＭＭを使用して分析する。実験的複製を、「バッチ」または「実験日」の変動性を説明するためのランダム効果としてモデル化する。処置群および対照群を、固定効果としてモデル化し、混合効果モデリングフレームワーク内にネストされたＡＮＯＶＡタイプの設計を使用して比較される。
実施例８．１
本実施例は、野生型およびｐＤＣ ＫＯマウスにおけるＲＮＡ－ＮＰの抗腫瘍効果を測定するために設計された実験を説明する。
ＫＲ１５８ｂ－ｌｕｃ、ＧＬ２６１－ｌｕｃ、およびマウスＨ３．３Ｋ２７Ｍ変異細胞株の腫瘍形成能が設定されている。ＫＲ１５８ｂ－ｌｕｃおよびＧＬ２６１－ｌｕｃは両方ともルシフェラーゼでトランスフェクトされるため、生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長を監視し得る。ＫＲ１５８ｂ－ＬＵＣおよびＨ３Ｋ２７Ｍ変異ラインの腫瘍原性用量は、１×１０４細胞である。ＧＬ２６１－ＬＵＣの腫瘍原性用量は、１×１０５個の細胞である。ＧＬ２６１およびＫＲ１５８を、Ｃ５７Ｂｌ／６の大脳皮質に注入する（前項の右側２ｍｍの部位で脳の深さ３ｍｍ）。Ｈ３Ｋ２７Ｍ神経膠腫細胞は正中線に注入される。腫瘍ｍＲＮＡを、親細胞株（すなわち、ルシフェラーゼを含まないＫＲ１５８ｂ）から抽出し、３７５μｇの我々のカスタム脂質－ＮＰ製剤（マウス１匹当たり）と複合体を形成した２５μｇの腫瘍特異的ｍＲＮＡの静脈内（ｉｖ）注射からなるワクチン製剤に使用する。これらを、ＮＰのみおよび非特異的（すなわち、ｐｐ６５ ｍＲＮＡ）ＲＮＡ－ＮＰを投与された１０匹のネガティブ対照マウスと同時に比較する。マウスを、腫瘍移植の５日後から７日間隔で３回ワクチン接種する。ＩＦＮ－αレベルを、連続した時点（５日、１２日、および１９日）で、野生型およびｐＤＣ ＫＯマウスの血清から評価する。治療反応を示すが疾患に屈する野生型マウスでは、腫瘍における免疫学的回避メカニズム（すなわち、チェックポイントリガンドの発現、ＩＤＯ、ＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーション）および腫瘍微小環境内（すなわち、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ、およびＴＡＭ）が調査される。
これらのモデルにおけるＲＮＡ－ＮＰの抗腫瘍活性を示す前臨床データに基づいて、抗腫瘍活性はｐＤＣ ＫＯマウスで無効になると予想される。
実施例８．２
本実施例は、ＲＮＡ－ＮＰによる活性化後のｐＤＣ表現型および機能を決定するために設計された実験を説明する。
ｐＤＣ表現型を評価するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを保有するＫＲ１５８ｂに、３７５μｇのＦＩＴＣ標識ＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ）および２５μｇのＴＴＲＮＡ（ＫＲ１５８ｂに由来し、静脈内送達）から構成されるＴＴＲＮＡ－ＮＰをワクチン接種する。ワクチン接種の２４時間後、脾臓、腫瘍排出リンパ節（ｔｄＬＮ）および腫瘍の収集のために、レシピエントマウスを安楽死させる（ＣＯ２で人道的に殺す）。臓器を単一細胞懸濁液に消化させ、３７℃で５分間インキュベートする前に、ＲＢＣ溶解（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）させる。Ｆｉｃｏｌｌ勾配を用いて、実質細胞からＷＢＣを分離する。界面の細胞を、収集し、洗浄し、分析する。ｐＤＣを、ＣＤ１１ｃ、Ｂ２２０、およびＧｒ－１（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色する。異なるｐＤＣサブセットを、ＣＣＲ９、ＳＣＡ１、およびＬｙ４９ｑの示差染色によって識別する。活性化状態を、共刺激分子（すなわち、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）ケモカイン（すなわち、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ１０）およびケモカイン受容体（すなわち、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７）の発現に基づいて評価する。検出二次抗体は、ＦＩＴＣ検出用にＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（登録商標）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と複合体化させたウサギＩｇＧである。エフェクター対調節機能を、エフェクター（すなわち、ＩＦＮ－Ｉ、ＩＬ－１２）対調節性サイトカイン（すなわち、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０）の細胞内染色によって決定する。分析は、マルチパラメーターフローサイトメトリー（ＬＳＲ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）によって実施されるであろう。
末梢および腫瘍内臓器におけるｐＤＣの実質的な増加を示す我々の予備データに基づいて、脾臓、ｔｄＬＮ、および頭蓋内腫瘍におけるＦＩＴＣ陽性ｐＤＣを特定することが期待される。
実施例８．３
本実施例は、ＲＮＡ－ＮＰトランスフェクトｐＤＣが抗原特異的Ｔ細胞の直接的または間接的な活性化を媒介するかどうかを決定するために設計された実験を説明する。
ｐＤＣは、自然免疫およびＩ型ＩＦＮの周知の刺激因子であるが、抗原特異的応答に対するそれらの累積的な影響はまだ明らかにされていない。それらはＭＨＣクラスＩＩを発現するので、ＡＰＣ能力を有するが、ｃＤＣの対応物と比較すると、それらは、抗原特異的免疫の弱い直接プライマーであると考えられている。本実験は、ＲＮＡ－ＮＰという観点から、抗原特異的免疫の直接プライマーまたは促進剤のいずれかとしてのｐＤＣのより良い理解を生み出すことを目的とする。抗原特異的Ｔ細胞に対するｐＤＣの効果を決定するために、ＫＲ１５８ｂ保有マウスに、脾臓、ｔｄＬＮおよび頭蓋内腫瘍（上記のとおり）由来のＦＩＴＣ標識ＮＰ（Ａｖａｎｔｉ）、およびＦＡＣＳｏｒｔ（ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩ）関連ＦＩＴＣ＋ｐＤＣに封入されたＴＴＲＮＡ（マウス神経膠腫株ＫＲ１５８ｂ由来）をワクチン接種する。次に、ＲＮＡ－ＮＰトランスフェクトｐＤＣを、磁気的に分離したナイーブＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞と共培養し、Ｔ細胞を、増殖、表現型（エフェクター対中央記憶）、機能および細胞傷害性について評価する。ｐＤＣからの間接的な影響を、ナイーブＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を有するＴＴＲＮＡをロードしたＤＣ（マウス骨髄からエクスビボで成熟）とのエクスビボ共培養によって評価する。エクスビボ共培養は、ＣＦＳＥ（Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識されたナイーブＴ細胞（４００，０００個のＴ細胞を含む４０，０００個のＲＮＡ－ＮＰトランスフェクトｐＤＣ）を含む９６ウェルプレートで７日間、３回行う。Ｔ細胞の増殖は、フローサイトメトリーによってＣＦＳＥ希釈を測定することによって決定される。エフェクターおよび中央記憶集団の表現型は、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの示差染色によって決定される。これらのＴ細胞は、ビーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるＴｈ１サイトカイン（すなわち、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γ）の検出のために上清を採取する前に、合計２サイクル再刺激される。刺激されたＴ細胞は、ＫＲ１５８ｂ（ＧＦＰで安定的にトランスフェクトされた）または対照腫瘍（Ｂ１６Ｆ１０－ＧＦＰ）の存在下でもインキュベートされ、細胞毒性を誘導する能力について評価される。生存腫瘍細胞の代用としての、各共培養におけるＧＦＰの量は、フローサイトメトリーによって定量的に測定される。
ＦＡＣＳｏｒｔされたＲＮＡ－ＮＰトランスフェクトｐＤＣのインビボ効果は、これらの細胞（２５０，０００細胞／マウス）を担がんマウス（毎週ｘ３）に養子移入し、ＩＦＮ－γレポーターマウス（ＧＲＥＡＴマウス、Ｂ６トランスジェニック、ＩＲＥＳ－ｅＹＦＰレポーターを有するＩＦＮ－γプロモーターを含む、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）でのＹＦＰ発現によって抗原特異的Ｔ細胞を評価するために、１週間後に脾臓、ｔｄＬＮ、および腫瘍を採取することによって決定する。別の実験では、１週間後にＹＦＰ発現によって抗原特異的Ｔ細胞を測定するために脾臓、ｔｄＬＮ、および頭蓋内腫瘍を採取する前に、ＩＦＮ－γレポーターマウスに、ｐＤＣ枯渇ｍＡｂ有りまたは無しでＴＴＲＮＡ－ＮＰをワクチン接種する。Ｔ細胞機能アッセイを、上記のように実施する。
これらのｐＤＣは、直接的および／または間接的な手段のいずれかを介して抗原特異的Ｔ細胞をプライミングするために必要であると予想される。
実施例８．４
本実施例は、ＲＮＡ－ＮＰで活性化されたｐＤＣが、ｃＤＣおよび／またはｍＤＣからの抗原特異的Ｔ細胞プライミングを促進するかどうかを決定するために設計された実験を説明する。
ｐＤＣからのＩＦＮ－Ｉ放出は、ｃＤＣおよびｍＤＣの活性化マーカーを増加させることが知られているが、ｃＤＣ／ｍＤＣからの直接Ｔ細胞プライミングにおけるｐＤＣの役割はあまり明確ではない。この実験は、活性化されたｐＤＣの存在下または非存在下で抗原特異的Ｔ細胞をプライミングするＲＮＡトランスフェクトｃＤＣおよびｍＤＣの能力を解明することを目的としている。他のＤＣサブセットに対するｐＤＣの効果を決定するために、Ｃ５７Ｂｌ／６およびｐＤＣノックアウト（ＫＯ）マウス（ＢＤＣＡ２－ＤＴＲ、Ｂ６トランスジェニックマウス、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）を有するＫＲ１５８ｂにワクチンを接種し、ｃＤＣおよびｍＤＣからのＴ細胞プライミングを評価する。ＦＩＴＣ＋ｃＤＣおよびｍＤＣ集団は、静脈内ＴＴＲＮＡ－ＮＰ（ＦＩＴＣ標識）から２４時間以内にＦＡＣＳｏｒｔを介して分類され、増殖、機能および細胞毒性アッセイに基づいて、ナイーブＴ細胞応答をインビトロでプライミングする能力について評価される。常駐および移動性ｃＤＣを、それぞれＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋ＭＨＣＩＩ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ＋細胞によって識別し、ｍＤＣを、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１４＋ＭＨＣＩＩ＋細胞によって識別する。サイトカイン、ケモカインおよび活性化マーカーを、実施例９．１に記載されているように分析する。これらのｃＤＣ ／ｍＤＣのインビボ効果を、実施例９．２に記載されるように、細胞移動実験において実施する。簡単に説明すると、ＴＴＲＮＡ－ＮＰワクチン接種Ｃ５７Ｂｌ／６マウスまたはｐＤＣ ＫＯマウスからのＦＡＣＳｏｒｔｅｄ ｃＤＣおよびｍＤＣを、１週間後にＩＦＮ－γレポーターマウスにおけるＹＦＰ発現による抗原特異的Ｔ細胞を評価するために脾臓、ｔｄＬＮ、および頭蓋内腫瘍を採取する前に、担がんマウス（週１回×３）に養子移入する（２５０，０００細胞／マウス）。増殖、機能および細胞毒性のアッセイを実施する。
ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰは、活性化表現型を増強し、ｃＤＣおよびｍＤＣからのＴ細胞の直接プライミングを促進するｐＤＣを活性化すると予想される。
ｃＤＣおよび／またはｍＤＣに対するｐＤＣからの間接的な影響がない場合、ＮＫ細胞に対するｐＤＣの影響は、それらの活性化状態、機能、および細胞毒性を含めて評価される。
実施例８．５
本実施例は、ｐＤＣが腫瘍内微小環境内で時間の経過と共にエフェクター／制御性Ｔ細胞にどのように影響するかを決定するために設計された実験を説明する。
腫瘍へのｐＤＣの動員は、通常、ＩＤＯ、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの増加、および免疫調節性サイトカインの分泌を特徴とする調節表現型に関連する。本実験では、ＲＮＡ－ＮＰ活性化ｐＤＣが、腫瘍微小環境でＴ細胞を経時的に活性化することによって明確に機能するかどうかを決定する。ｐＤＣの腫瘍内効果を決定するために、ＴＴＲＮＡ－ＮＰを、ｐＤＣ枯渇ｍＡｂ（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）の有無にかかわらず、ＩＦＮ－γレポーターマウスを有するＫＲ１５８ｂに投与する。活性化および制御性Ｔ細胞を、連続した時点（６時間、１日、７日、および２１日）で、腫瘍内微小環境で経時的に評価する。エフェクターＴ細胞を特徴付けし、Ｔｒｅｇを、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、およびＣＤ４の発現によって表現型決定する。非枯渇動物からのｐＤＣを、これらの部位からＦＡＣＳｏｒｔし、サイトカイン、ケモカイン、活性化マーカー（すなわち、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０）、細胞溶解マーカー（すなわち、ＴＲＡＩＬ、グランザイムｂ）、および調節マーカー（すなわち、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＤＯ）の発現について表現型決定する。腫瘍細胞による免疫表現型の変化も経時的に評価する（すなわち、ＭＨＣ－Ｉ、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰα）。
実施例９
本実施例では、ＲＮＡ－ＮＰで活性化されたＴ細胞の排出、輸送、および機能に対するＩ型インターフェロンの役割を評価することを目的とした研究について説明する。
統計分析 腫瘍を有するマウスを、介入治療を受ける前に無作為化する。群ごとに１０匹の動物を選択すると、関心のある効果を検出するのに十分な力が得られるはずである。例として、特定の時間に観察された７つの処置群を有するＡＮＯＶＡ設計内で、ＡＮＯＶＡフレームワーク内で実行された対比較は、０．０５の両側有意水準で８０％のパワーで１．２７ＳＤユニットに等しい効果サイズを検出し得る。いくつかの観察時間に実験群で観察された免疫パラメーター応答を、通常または負の二項応答誤差を有する一般化線形モデル（ＧＬＭ）を使用して分析する。応答を、相互に排他的な群が処理および観察時間に分散された双方向ＡＮＯＶＡ設計で編成する。少なくとも１回は完全に複製された実験の応答変数を、ＧＬＭＭを使用して分析する。実験的複製を、「バッチ」または「実験日」の変動を説明するためのランダム効果としてモデル化する。処置群および対照群を、固定効果としてモデル化し、混合効果モデリングフレームワーク内にネストされたＡＮＯＶＡタイプの設計を使用して比較する。
実施例９．１
本実施例は、ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後の抗原特異的Ｔ細胞のケモカイン受容体、Ｓ１Ｐ１、およびＶＬＡ－４／ＬＦＡ－１発現プロファイルを決定するために設計された実験を説明する。
リンパ器官からのＴ細胞の退出に必要なスフィンゴシン－１－リン酸受容体１（Ｓ１Ｐ１）に対するＩＦＮ－Ｉの効果、およびＢＢＢを通過するＴ細胞の移動に必要なインテグリン（すなわちＶＬＡ－４、ＬＦＡ－１）を評価する。ＩＦＮ－γレポーターマウスを有するＫＲ１５８ｂ、またはＩＦＮＡＲ１ブロッキングｍＡｂ（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）を投与されているＩＦＮ－γレポーターマウスに、ＴＴＲＮＡ－ＮＰを移植する。２５μｇのＴＴＲＮＡを有する３７５μｇのＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ）（ＫＲ１５８ｂから抽出して静脈内投与）で構成されるＲＮＡ－ＮＰは、週に１回（×３）投与され、移植の５日後に開始される。最後のワクチン接種から１週間後、レシピエントマウスを安楽死させ（ＣＯ２で人道的に殺す）、脾臓、ｔｄＬＮ、骨髄、および頭蓋内腫瘍を採取する。臓器を消化させ、脾臓、リンパ節、骨髄および腫瘍からの抗原特異的Ｔ細胞を、ＹＦＰ発現ならびにエフェクターおよび中央メモリーＴ細胞（すなわち、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４）の連続染色による示差染色によって識別する（７、１４日および２１日）。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞からのＴｈ１関連ケモカイン受容体（すなわち、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７およびＣＸＣＲ３）、Ｓ１Ｐ１発現、ＶＬＡ－４、およびＬＦＡ－１発現（エバイオサイエンス）を、マルチパラメーターフローサイトメトリーおよびＩＨＣによって評価する。
ＬＦＡ－１およびＣＣＲ２は、ＲＮＡ－ＮＰ投与後に活性化Ｔ細胞に発現すると予想される。ＩＦＮＡＲ１ ｍＡｂ後の活性化Ｔ細胞のケモカイン発現パターン、Ｓ１Ｐ１、インテグリンに変化がない場合、ＩＦＮＡＲ１ ｍＡｂ有りまたは無しで処置されたマウスのＦＡＣＳソートＴ細胞（ＹＦＰ＋細胞）でＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行い、免疫関連遺伝子の変化を評価する。
実施例９．２
本実施例は、ＲＮＡ－ＮＰ活性化Ｔ細胞のインビトロおよびインビボ遊走に対するＩＦＮ－Ｉの効果を決定するために設計された実験を説明する。
ＩＦＮＡＲ１遮断後に末梢臓器における抗原特異的Ｔ細胞が増加したが、抗腫瘍効果が欠如したことを示す我々のデータに基づき、ＲＮＡ－ＮＰ活性化Ｔ細胞遊走に対するＩＦＮ－Ｉの効果を決定する。ＫＲ１５８ｂを有するＩＦＮ－γレポーターマウス、またはＩＦＮＡＲ１、ＬＦＡ－１、またはＣＣＲ２ブロッキング抗体を投与されるＩＦＮ－γレポーターマウスに、静脈内ＴＴＲＮＡ－ＮＰを週に１回（×３）ワクチン接種する。ＢＢＢのインビボ横断を、連続した時点（ＲＮＡ－ＮＰ後５日、１０日、１５日、２０日）での頭蓋内腫瘍（脾臓、リンパ節、骨髄と比較して）中のＴ細胞の百分率および絶対数から評価する。
Ｔ細胞の遊走能もまた、インビトロ培養で分析する。ＫＲ１５８ｂ腫瘍を有するナイーブな、ＩＮＦＡＲ１、ＬＦＡ－１、またはＣＣＲ２ ＫＯ動物（Ｂ６ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ）に、静脈内ＴＴＲＮＡ－ＮＰをワクチン接種する。Ｔ細胞を、ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒを介して５０～１００％ＦＢＳ溶液にＦＡＣＳｏｒｔする。これらのＴ細胞を、トランスウェルアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で遊走能について評価する。簡単に説明すると、Ｔ細胞を、ＫＲ１５８ｂ－ＧＦＰ腫瘍細胞の層の間に透過膜を有する細胞培養インサートの上層に配置する。遊走を、レイヤー間を移動するセルの数によって評価する。Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＡ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によりＩＦＮ－γを決定する前に、腫瘍細胞（４×１０６／ｍＬ）（×４８時間）との共培養のために、ＩＬ－２（１マイクログラム／ｍＬ）有りまたは無しで、１ｍＬ当たり４×１０６の濃度で、Ｔ細胞を培地中でプレーティングする。生存腫瘍細胞の代用として、各共培養におけるＧＦＰの量を、フローサイトメトリー分析によって定量的に測定する。
ＢＢＢを通過する活性化Ｔ細胞の輸送には、Ｉ型ＩＦＮが必要であると予想される。抗原特異的Ｔ細胞を適切に定義できない場合、生理学的に関連するＧＢＭ抗原であるｐｐ６５（我々の腫瘍ｍＲＮＡコホートにスパイクされる）に対する応答を、脾臓、ｔｄＬＮおよび頭蓋内腫瘍中でのＣＤ８＋細胞のテトラマー染色によるｐｐ６５－ＨＬＡ－Ａ２制限エピトープＮＴＵＤＧＤＤＮＮＤＶの分析により、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスで、重複ペプチドプール再刺激アッセイによって追跡する。
実施例９．３
本実施例は、ＲＮＡ－ＮＰ後の抗原特異的Ｔ細胞機能に対するＩＦＮ－Ｉの寄与を説明する。
ＩＦＮ－Ｉは、Ｔｒｅｇを促進し、エフェクターおよびメモリーＣＤ８＋細胞を調節することが示されており、ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後の活性化Ｔ細胞応答の促進にも不可欠である。これらの明確な効果により、ＲＮＡ－ＮＰワクチン投与後の抗原特異的Ｔ細胞機能に対するＩＦＮ－Ｉの寄与が決定される。ＫＲ１５８ｂを有するＩＦＮ－γレポーターマウス、またはＩＦＮＡＲ１ ｍＡｂを投与されているＩＦＮ－γレポーターマウスに、週に１回（×３）静脈投与ＴＴＲＮＡ－ＮＰをワクチン接種する。抗原特異的Ｔ細胞を、ＹＦＰ＋細胞により評価する。脾臓、リンパ節、骨髄および腫瘍からのＹＦＰ＋Ｔ細胞を、それらの活性化状態（すなわち、ＣＤ１０７ａ、パーフォリン、グランザイム）、増殖（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識された養子移入細胞の蛍光希釈による）、分化（エフェクターおよび中央記憶サブセットへ、および細胞毒性について評価する。Ｔ細胞の細胞傷害性を、ＫＲ１５８ｂ（安定してＧＦＰでトランスフェクトされた）または対照腫瘍（Ｂ１６Ｆ１０）の存在下で決定する。Ｉ型ＩＦＮは、腫瘍微小環境内でＴ細胞の増殖および機能を増強することもまた期待される。
Ｉ型ＩＦＮの遮断後に抗原特異的Ｔ細胞の遊走能または機能に変化がない場合、Ｔ細胞枯渇の調節に対するＩ型ＩＦＮの効果を評価する。免疫チェックポイント（すなわち、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３）の発現に対するＩ型ＩＦＮならびに腫瘍細胞およびＡＰＣ（すなわち、ＰＤ－Ｌ１、ガレクチン－９）に対するそれらのリガンドの効果もまた評価する。
実施例１０
本実施例は、非抗原特異的多層（ＭＬ）ＲＮＡ ＮＰが、記憶を与え、腫瘍の再チャレンジをかわすのに十分な長さの抗原特異的免疫を媒介することを示す。
腫瘍接種により合計２回チャレンジされたが、ＧＦＰ ＲＮＡもしくはｐｐ６５ ＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（それぞれ腫瘍に非特異的である）、または腫瘍特異的ＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで毎週１回（×３）のみ処置された長期生存マウス（例えば、約１００日間生存したマウス）を用いて、実験を行った。処置は、最初の腫瘍接種の直後および２回目の腫瘍接種の約１００日前に行われた。対照マウス（未処置のマウス）はいずれも１００日まで生存しなかったため、同じタイプのマウスにＫ７Ｍ２腫瘍を接種することにより、新しい対照群のマウスを作成した。元の対照マウスと同様に、新しい対照群は、何の処置も受けなかった。長期生存者もまた、２回目の腫瘍接種後に処置を受けなかった。この実験のイベントのタイムラインを、図７Ａに示す。
注目すべきことに、３つの群全てのマウスは、２回目の腫瘍チャレンジを生き延びた長期生存者を含んでいた。図７Ｂ（２回目の接種後の期間のみを示す）に示すように、３つの群全てのマウスには、腫瘍移植後４０日まで生存する長期生存者が含まれていた（腫瘍接種の２回目の例）。興味深いことに、非特異的ＲＮＡ（ＧＦＰ ＲＮＡまたはｐｐ６５ ＲＮＡ）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで以前に治療された長期生存マウスの百分率は、腫瘍特異的ＲＮＡ（２回目の腫瘍チャレンジの前に処置）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで治療された群に匹敵する、２回目の腫瘍接種後４０日まで生存した。
これらのデータは、対象の腫瘍に非特異的なＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰが、腫瘍に特異的なＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰにより提供される治療的処置に匹敵する治療的処置を腫瘍に提供し、動物の生存率の増加した百分率につながることを裏付けている。
実施例１１
この例は、ＤＯＴＡＰでコーティングされた酸化鉄粒子を作製する例示的な方法を示す。
ＤＯＴＡＰコーティング酸化鉄粒子（ＩＯＮＰ）を、多層ＲＮＡ ＮＰに組み込むために合成した。簡単に説明すると、ＤＯＴＡＰのストック溶液（約２～約４ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＯＴＡＰをエタノール中に溶解することにより調製した。ＤＯＴＡＰストック溶液を、Ｑ Ｓｏｎｉｃａ（モデル：Ｑ５００）でプローブ超音波処理し、合計３０秒の超音波処理時間で３８％の振幅を使用した。最初に等量の超音波処理したＤＯＴＡＰストックを等量の水で溶解することにより、適切な量のＤＯＴＡＰをゆっくりと水相に段階的に除去した。得られた溶液をさらに水に溶解して、最終容量を１０ｍｌにする。以下、水およびＤＯＴＡＰを含むこの溶液を「ＤＯＴＡＰ水溶液」と呼ぶ。
ＩＯＮＰを熱分解によって合成し、オレイン酸でコーティングし、磁気的に分離して、遊離オレイン酸を除去した。ＩＯＮＰを、最終的にクロロホルムに懸濁した。
適切な濃度の１ｍｌのクロロホルム中ＩＯＮＰを、１０ｍｌのＤＯＴＡＰ水溶液に加えた。ＤＯＴＡＰ：酸化鉄粒子の予想比率は０．１：０．５であり、０．５ｍｇの酸化鉄粒子（ＩＯＮＰ）をコーティングするには０．１ｍｇのＤＯＴＡＰが必要であった。この溶液を、３８％の振幅、５９秒間のパルス、１０秒間のパルス、強度２０００Ｊ（Ｑ Ｓｏｎｉｃａモデル：Ｑ５００）でプローブ超音波処理した。溶液を、ドラフト内に一晩一定に攪拌しながら放置して、有機溶媒を蒸発させた。
この方法は、ＤＯＴＡＰの脂質コーティングによって結合された酸化鉄ナノ粒子を生成した。得られた粒子を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。図９は、ＤＯＴＡＰコーティングによって結合されたＩＯＮＰの画像である。
実施例１２
本実施例は、酸化鉄ナノ粒子をロードした多層ＲＮＡ ＮＰを作成する方法を示す。
実施例１１は、多層ＲＮＡ ＮＰのコアを提供するＤＯＴＡＰのコーティングによって一緒に保持されたオレイン酸でコーティングされたＩＯＮＰを生成する方法を説明する。鉄を含まない遊離のＤＯＴＡＰを使用して多層構造に封入する前に、ＩＯＮＰコアに、負の電荷で層形成する。簡単に説明すると、回転加熱のための水溶液への再懸濁、バス超音波処理、押し出しおよび特定の質量比１：１５の腫瘍ｍＲＮＡでの層状化（μｇ投与、ＲＮＡ対ＮＰ）の前に、回転真空蒸発を使用して、ＤＯＴＡＰ／クロロホルム混合物から有機溶媒を除去する。周囲環境からの酸化を防ぐために、多層電荷を、真空密封中で手順を実行することによって維持する。酸化鉄ナノ粒子がロードされた多層ＲＮＡ ＮＰを、上記のように、ゼータ電位およびＲＮＡ取り込みの観点からＣＥＭによって特徴付ける。複合体を、サイズおよび濃度のＮａｎｏｓｉｇｈｔ測定によって検証し、層を、クライオ電子顕微鏡（ＣＥＭ）によって視覚化する。インビトロでのトランスフェクションを、ＧＦＰ ｍＲＮＡ多層粒子を使用して実証し、インビボでの免疫原性を、ＯＶＡｍＲＮＡを使用して実行する。酸化鉄ナノ粒子をロードした多層ＲＮＡ ＮＰのトランスフェクション効率を決定する。酸化鉄をロードしたＧＦＰ ＲＮＡおよびロードしないＧＦＰ ＲＮＡを含む多層ＲＮＡ－ＮＰを使用して、樹状細胞をトランスフェクトし、ＧＦＰ陽性細胞を、フローサイトメトリーにより測定する。トランスフェクトされたＤＣの明視野画像および蛍光画像を撮影する。
実施例１３
本実施例は、酸化鉄ナノ粒子がロードされた多層ＲＮＡ ＮＰに対する磁場の影響を示す。
磁性リポソームがＲＮＡを細胞に送達する能力への１０１ｍＴの磁場の影響を試験する。ＧＦＰ ＲＮＡを含むＩＯＮＰロード多層ＲＮＡ ＮＰを、実施例１２に本質的に記載されるように作製する。ＩＯＮＰロード多層ＲＮＡ ＮＰを、磁場の存在下または不在下で、ＤＣ２．４樹状細胞と共に３０分間インキュベートする。１セットの細胞について、ＭａｇｎｅＦｅｃｔ－Ｎａｎｏ ＩＩ ２４ウェルマグネットアレイにより生成された磁場の不在下で、ＲＮＡロード磁性リポソームを、ＤＣ２．４樹状細胞と共に一晩インキュベートする。３０分後、粒子含有培地を除去し、新鮮な培地と交換する。遺伝子送達を、２４時間でのフローサイトメトリーにより、ＧＦＰの発現として評価する。磁場が存在しない場合と比較して、磁場が存在する場合の方が、ＧＦＰ＋ＤＣの数が多いと予想される。
本明細書において援用される、刊行物、特許出願および特許を含む、全ての参考文献は、各々の参考文献が参照により組み入れられるように個々にかつ具体的に示されかつその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参考として本明細書中で援用される。
本開示を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに同様の指示物は、本明細書に別の記述がなければ、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する」は、別途注記のない限り、開放型専門用語として解釈されるべきである（すなわち、「～を含むがこれらに限定されない」を意味する）。
本明細書において特に指定のない限り、本明細書中の値の範囲の記載は、その範囲および各端点に入る各々の別個の値を個々に指す略記方法として役立つことを意図したものであるにすぎず、各々の別個の値および各端点は、それが本明細書中に個々に記載されているかのように本明細書に組み入れられる。
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において特に指定のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行され得る。特に要求されない限り、本明細書中に提供されるあらゆる例、または例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、本開示をより上手く説明することを意図したものにすぎず、本開示の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書における言語は、本開示の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すと解釈されるべきではない。
本開示を実施するための発明者に知られている最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の説明を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に使用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本開示が実施されることを意図する。したがって、本開示は、適用法で許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての改変および同等物を含む。さらに、本明細書において特に指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組み合わせが本開示に包含される。

Claims (77)

  1. 正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含む内部を含むナノ粒子であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層の間に配置されている、ナノ粒子。
  2. 少なくとも３つの核酸層を含み、前記核酸層のそれぞれがカチオン性脂質二重層の間に配置されている、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. 少なくとも４つの核酸層を含み、前記核酸層のそれぞれがカチオン性脂質二重層の間に配置されている、請求項２に記載のナノ粒子。
  4. ５つ以上の核酸層を含み、前記核酸層のそれぞれがカチオン性脂質二重層の間に配置されている、請求項３に記載のナノ粒子。
  5. 前記ナノ粒子の最外層が、カチオン性脂質二重層を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  6. 前記表面が、前記カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  7. 前記コアが、カチオン性脂質二重層を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  8. 前記コアが、約０．５重量％未満の核酸を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  9. 前記ナノ粒子の直径が、直径約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、任意選択で、直径約７０ｎｍ～約２００ｎｍである、請求項１～８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  10. 約４０ｍＶ～約６０ｍＶ、任意選択で、約４５ｍＶ～約５５ｍＶのゼータ電位を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  11. 約５０ｍＶのゼータ電位を含む、請求項１０に記載のナノ粒子。
  12. 約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５または約１対約７．５の比率で、核酸分子およびカチオン性脂質を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  13. 前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡである、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  14. 前記核酸分子が、ＲＮＡ分子である、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  15. 前記ＲＮＡ分子が、ｍＲＮＡである、請求項１４に記載のナノ粒子。
  16. 前記ｍＲＮＡが、インビトロ転写されたｍＲＮＡであり、インビトロ転写テンプレートが、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである、請求項１５に記載のナノ粒子。
  17. 前記ｍＲＮＡが、タンパク質をコードする、請求項１５または１６に記載のナノ粒子。
  18. 前記タンパク質が、腫瘍抗原、サイトカイン、または共刺激分子からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記タンパク質が、腫瘍細胞またはヒトによって発現されない、１７に記載のナノ粒子。
  20. 前記ＲＮＡ分子が、アンチセンス分子、任意選択で、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１４に記載のナノ粒子。
  21. ＲＮＡ分子の混合物を含む、請求項１４に記載のナノ粒子。
  22. 前記ＲＮＡ分子の混合物が、ヒト由来の細胞から単離されたＲＮＡである、請求項２１に記載のナノ粒子。
  23. 前記ヒトが、腫瘍を有し、前記ＲＮＡの混合物が、前記ヒトの前記腫瘍から単離されたＲＮＡであり、任意選択で、前記腫瘍が、悪性脳腫瘍、任意選択で、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍である、請求項２２に記載のナノ粒子。
  24. リポソームが、前記核酸分子および前記カチオン性脂質を約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５のＲＮＡ：カチオン性脂質比で混合することによって調製される、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  25. 前記コアが、治療薬もしくは診断薬またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  26. 前記治療薬が、化学療法剤または免疫療法剤である、請求項２５に記載のナノ粒子。
  27. 前記免疫療法剤が、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１阻害剤である、請求項２６に記載のナノ粒子。
  28. 前記ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項２７に記載のナノ粒子。
  29. 前記診断薬が、造影剤である、請求項２５に記載のナノ粒子。
  30. 前記造影剤が、酸化鉄ナノ粒子を含む、請求項２９に記載のナノ粒子。
  31. 正に帯電した表面ならびに（ｉ）コアおよび（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層を含む内部を含み、各核酸層がカチオン性脂質二重層の間に配置されるナノ粒子を作製する方法であって、
    （Ａ）核酸分子およびリポソームを、約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５のＲＮＡ：リポソーム比で混合して、ＲＮＡ被覆リポソームを得ることであって、前記リポソームが、カチオン性脂質および有機溶媒を含む脂質混合物を、前記有機溶媒を真空下で蒸発させることにより乾燥させることを含む、リポソームを作製するプロセスで作製される、ＲＮＡ被覆リポソームを得ることと、
    （Ｂ）前記ＲＮＡ被覆リポソームを、余剰量のリポソームと混合することと、を含む、方法。
  32. 前記脂質混合物が、前記カチオン性脂質および前記有機溶媒を、１ｍＬの有機溶媒当たり約４０ｍｇのカチオン性脂質～１ｍＬの有機溶媒当たり約６０ｍｇのカチオン性脂質の比率、任意選択で、有機溶媒１ｍＬ当たり約５０ｍｇのカチオン性脂質の比率で含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記リポソームを作製するプロセスが、前記脂質混合物を再水和溶液で再水和して再水和脂質混合物を形成し、次に前記再水和脂質混合物を攪拌、休止、およびサイジングすることをさらに含む、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 前記再水和脂質混合物のサイジングが、前記再水和脂質混合物を超音波処理、押し出しおよび／または濾過することを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 実施例１の工程を含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ナノ粒子が、約４０ｍＶ～約６０ｍＶ、任意選択で、約４５ｍＶ～約５５ｍＶのゼータ電位を有する、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ナノ粒子の前記コアが、約０．５重量％未満の核酸を含み、かつ／または前記コアがカチオン性脂質二重層を含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ナノ粒子の前記最外層が、カチオン性脂質二重層を含み、かつ／または前記ナノ粒子の表面が、前記カチオン性脂質二重層の前記カチオン性脂質の複数の親水性部分を含む、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 請求項３１～３９のいずれか一項に記載の方法により作製された、ナノ粒子。
  40. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のまたは請求項３９に記載のナノ粒子を含む、細胞。
  41. 抗原提示細胞（ＡＰＣ）、任意選択で、樹状細胞（ＤＣ）である、請求項４０に記載の細胞。
  42. 細胞の集団であって、前記集団の少なくとも５０％が、請求項４０または４１に記載の細胞である、細胞の集団。
  43. 請求項１～２４または請求項３９のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
  44. 前記組成物が、１ｍＬ当たり約１０１０ナノ粒子～１ｍＬ当たり約１０１５ナノ粒子、任意選択で、１ｍＬ当たり約１０１２ナノ粒子±１０％を含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 請求項４３または４４に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の腫瘍に対する免疫応答を増加させる方法。
  46. 核酸分子がｍＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記組成物が、前記対象に全身投与される、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記組成物が、静脈内投与される、請求項４８に記載の方法。
  49. 前記医薬組成物が、前記対象において樹状細胞（ＤＣ）を活性化するのに有効な量で投与される、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記免疫応答が、Ｔ細胞媒介性免疫応答である、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記Ｔ細胞媒介性免疫応答が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による活性を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. ＲＮＡ分子を腫瘍内微小環境、リンパ節、および／または細網内皮器官に送達する方法であって、請求項４３または４４の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
  53. 前記細網内皮器官が、脾臓または肝臓である、請求項５２に記載の方法。
  54. 疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項５２または５３に記載の方法により、前記対象の細胞にＲＮＡ分子を送達することを含む、方法。
  55. ＲＮＡ分子が、エクスビボで前記細胞に送達され、前記細胞が、前記対象に投与される、請求項５４に記載の方法。
  56. 疾患を有する対象を治療する方法であって、前記対象の前記疾患を治療するのに有効な量で、請求項４３または４４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  57. 前記対象が、がんまたは腫瘍を有する、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記腫瘍が、悪性脳腫瘍であり、任意選択で、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍である、請求項５７に記載の方法。
  59. 請求項２５～３０のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、細胞。
  60. 抗原提示細胞（ＡＰＣ）、任意選択で、樹状細胞（ＤＣ）である、請求項５９に記載の細胞。
  61. 細胞の集団であって、前記集団の少なくとも５０％が、請求項５９または６０のいずれか一項に記載の細胞である、細胞の集団。
  62. 請求項２５～３０のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
  63. 前記組成物が、１ｍＬ当たり約１０１０ナノ粒子～１ｍＬ当たり約１０１５ナノ粒子、任意選択で１ｍＬ当たり約１０１２ナノ粒子±１０％を含む、請求項６２に記載の医薬組成物。
  64. 請求項６２または６３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象の腫瘍に対する免疫応答を増加させる方法。
  65. 前記核酸分子が、ｍＲＮＡである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記組成物が、前記対象に全身投与される、請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 前記組成物が、静脈内投与される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記医薬組成物が、前記対象の樹状細胞（ＤＣ）を活性化するのに有効な量で投与される、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記免疫応答が、Ｔ細胞媒介性免疫応答である、請求項６４～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記Ｔ細胞媒介性免疫応答が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）による活性を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. ＲＮＡ分子を、腫瘍内微小環境、リンパ節、および／または細網内皮器官に送達する方法であって、請求項４３または４４の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
  72. 前記細網内皮器官が、脾臓または肝臓である、請求項５２に記載の方法。
  73. 疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項５２または５３に記載の方法により、前記対象の細胞にＲＮＡ分子を送達することを含む、方法。
  74. ＲＮＡ分子が、エクスビボで前記細胞に送達され、前記細胞が、前記対象に投与される、請求項５４に記載の方法。
  75. 疾患を有する対象を治療する方法であって、前記対象の前記疾患を治療するのに有効な量で、請求項６２または６３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  76. 前記対象が、がんまたは腫瘍である、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記腫瘍が、悪性脳腫瘍であり、任意選択で、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、または中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍である、請求項７６に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20230346700A1 (en) * 2020-02-19 2023-11-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Multilamellar RNA Nanoparticles and Methods of Sensitizing Tumors to Treatment with Immune Checkpoint Inhibitors
CA3174187A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Multilamellar rna nanoparticle vaccine against sars-cov-2
WO2022236096A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. Car t cell therapy method

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130323165A1 (en) * 2010-03-08 2013-12-05 Northeastern University Magnetic Nanoplatforms for Theranostic and Multi-Modal Imaging Applications
CN103906527B (zh) * 2011-06-08 2020-07-10 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
ITRM20120480A1 (it) * 2012-10-09 2014-04-10 Uni Degli Studi Camerino Nanoparticelle lipidiche multicomponenti e procedimenti per la loro preparazione.
US20210077399A1 (en) * 2018-05-08 2021-03-18 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Magnetic liposomes and related treatment and imaging methods
WO2020037102A1 (en) * 2018-08-15 2020-02-20 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of sensitizing tumors to treatment with immune checkpoint inhibitors

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