JP2024517287A - Ｃａｒ ｔ細胞療法の方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングする方法を提供する。本方法は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む組成物を、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を対象に施す少なくとも１日前に、対象に投与することを含む。本開示はまた、対象において固形腫瘍を治療する方法を提供し、本方法は、表面抗原陰性固形腫瘍を含む対象に、ナノ粒子内の核酸が表面抗原をコードする、ナノ粒子を含む第１の組成物と、表面抗原を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を含む第２の組成物とを投与することを含む。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞による治療を増強するための多層ナノ粒子の使用に関する。

助成金の開示
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成番号Ｋ０８ ＣＡ１９９２２４及びＲ３７ ＣＡ２５１９７８の下で米国政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

関連出願の相互参照及び参照による組み込み
本出願は、２０２１年５月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８６，０５７号及び２０２２年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／３１３，０５７号に対する優先権を主張し、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年７月１７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／４２６０６号、２０２１年２月５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／１６９２５号、及び２０２１年２月１９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／１８８３１号も、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本開示の一部である配列表を明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「５６５２８＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは２０２２年５月６日に作成され、サイズは１，８８１バイトである。配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）Ｔ細胞は、がん細胞抗原などの特定の細胞表面抗原を認識する受容体を発現するように遺伝子操作されたＴリンパ球である。ＣＡＲ Ｔ療法の有望性は、血液由来のがん、例えば、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫に対して実現されている。しかしながら、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は依然として初期段階であり、基礎となる技術における多くの進歩にもかかわらず、広範な使用に対する重大な障害が残っている。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、固形腫瘍に対してまだ成功していない。ＣＡＲ Ｔ細胞が固形腫瘍に輸送される及びそれに浸潤する能力が低いことが重要な課題であり、腫瘍微小環境は主に免疫抑制性である。とりわけ、調節性Ｔ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、及び腫瘍関連マクロファージ（tumor-associated macrophage、ＴＡＭ）は、Ｔ細胞上の阻害性受容体（例えば、ＣＴＬＡ－４）に結合する細胞表面リガンド（例えば、ＣＤ８０／ＣＤ８６）を発現するとともに、Ｔ細胞におけるアポトーシスを抑制又は誘発する可溶性因子を分泌する。固体に対するＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性に対する別の大きな障壁は、表面抗原の不均一性又は固形腫瘍内の表面抗原の発現の欠如である。これらの課題は、固形腫瘍を有するがん患者の大部分にＣＡＲ Ｔ細胞療法を適用する際の進歩を妨げてきた。

加えて、コンディショニング療法は、概して、ＣＡＲ Ｔ細胞投与前に必要とされる。ＣＡＲ Ｔ細胞投与前のリンパ球枯渇（lymphodepletion、ＬＤ）コンディショニングは、調節性Ｔ細胞を排除することによって、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及び生存のための「好ましい」環境を創出すると考えられている。ＬＤコンディショニングは、多くの場合、シクロホスファミド、フルダラビン、ペントスタチン、若しくはベンダムスチンなどの化学療法剤の投与、又は放射線全身照射を伴う。ＬＤコンディショニングのサイクル、例えば、１～５日間にわたる化学療法の実施は、通常、ＣＡＲ Ｔ細胞の注入の２～１４日前に施されて、ＣＡＲ Ｔ細胞が増殖及び活性化するための「空間」を生み出す。Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって現在承認されている全てのＣＡＲ Ｔ細胞治療剤は、ＣＡＲ Ｔ細胞産物の注入前に化学療法に基づくリンパ球枯渇コンディショニング療法を必要とする。リンパ球枯渇コンディショニング療法は、患者によって忍容されるが、これは多くの場合、重大な副作用と関連付けられ、患者を感染症の重大なリスクにさらす。

例えば、有効性を改善し、ＣＡＲ Ｔ細胞療法から利益を得る患者集団を拡大し、望ましくない副作用を最小限に抑えるＣＡＲ Ｔ細胞治療レジメンが、依然として必要とされている。

本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングする方法を提供する。本方法は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を対象に投与することを含む。本組成物は、対象にＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す少なくとも１日前に対象に投与される。様々な態様では、本方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を対象に施すことを更に含む。任意選択で、第１の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を対象に施す２～１４日（例えば、７日など約５～約８日）前に投与される。また、本開示の様々な態様では、対象は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す前２１日以内にリンパ球枯渇療法を施されない。例示的な実施形態では、本ナノ粒子は、少なくとも３つの核酸層（例えば、少なくとも４つ又は少なくとも５つの核酸層）を含み、それらの各々は、カチオン性脂質二重層間に配置される。様々な態様では、ナノ粒子の最外層は、カチオン性脂質二重層を含む。様々な例において、表面は、カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む。例示的な態様では、コアは、カチオン性脂質二重層を含む。任意選択で、コアは、約０．５重量％未満の核酸を含む。ナノ粒子の直径は、様々な態様では、直径で約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、任意選択で、直径で約７０ｎｍ～約２００ｎｍである。例示的な例では、ナノ粒子は、約＋４０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、任意選択で、約＋４５ｍＶ～約＋５５ｍＶのゼータ電位によって特徴付けられる。ナノ粒子のゼータ電位は、様々な例において、約＋５０ｍＶである。いくつかの態様では、核酸分子は、約１対約５～約１対約２５、任意選択で約１対約１５、約１対約１０、又は約１対約７．５の核酸分子：カチオン性脂質比で存在する。様々な態様では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、任意選択で、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）である。様々な態様では、ｍＲＮＡは、インビトロ転写されたｍＲＮＡであり、インビトロ転写テンプレートは、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである。様々な態様では、本ナノ粒子は、ヒトの腫瘍から単離されたＲＮＡなどのＲＮＡの混合物を含む。様々な態様では、核酸は、ＣＡＲ Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原をコードしない。様々な態様では、対象は、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍、又は骨肉腫などの固形腫瘍に罹患している。

本開示は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を、ＣＡＲ Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングするために使用することを更に企図し、これにおいて、本組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を対象に施す少なくとも１日前に対象に投与される。ＣＡＲ Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングするための医薬の調製において本ナノ粒子を使用することも企図され、ＣＡＲ Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングすることに使用するための本明細書に記載されるナノ粒子組成物も企図される。

本開示は、対象において固形腫瘍を治療する方法も提供する。本方法は、表面抗原陰性固形腫瘍を含む対象に、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置され、核酸が、表面抗原をコードする、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を投与することを含む。表面抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を含む第２の組成物も対象に投与される。任意選択で、第１の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む第２の組成物の少なくとも１日前に投与される。また、本開示の様々な態様では、対象は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す前２１日以内にリンパ球枯渇療法を施されない。例示的な実施形態では、本ナノ粒子は、少なくとも３つの核酸層（例えば、少なくとも４つ又は少なくとも５つの核酸層）を含み、それらの各々は、カチオン性脂質二重層間に配置される。様々な態様では、ナノ粒子の最外層は、カチオン性脂質二重層を含む。様々な例において、表面は、カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む。例示的な態様では、コアは、カチオン性脂質二重層を含む。任意選択で、コアは、約０．５重量％未満の核酸を含む。ナノ粒子の直径は、様々な態様では、直径で約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、任意選択で、直径で約７０ｎｍ～約２００ｎｍである。例示的な例では、ナノ粒子は、約＋４０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、任意選択で、約＋４５ｍＶ～約＋５５ｍＶのゼータ電位によって特徴付けられる。ナノ粒子のゼータ電位は、様々な例において、約＋５０ｍＶである。いくつかの態様では、核酸分子は、約１対約５～約１対約２５、任意選択で約１対約１５、約１対約１０、又は約１対約７．５の核酸分子：カチオン性脂質比で存在する。様々な態様では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、任意選択で、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。様々な態様では、固形腫瘍は、肺、肝臓、骨、脾臓、又はリンパ節に存在する。例示的な固形腫瘍は、骨肉腫である。様々な態様では、表面抗原は、ＣＤ７０であり、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ７０に結合するＣＡＲを発現する。

本開示は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置され、核酸が表面抗原をコードする、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物、並びに表面抗原を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を含む第２の組成物を、対象において表面抗原陰性固形腫瘍を治療するために使用することも提供する。任意選択で、第１の組成物は、第２の組成物（ＣＡＲ Ｔ細胞を含む）の少なくとも１日前に投与される。ＣＡＲ Ｔ細胞療法を用いて表面抗原陰性固形腫瘍を治療するための医薬の調製における本ナノ粒子の使用も企図され、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を用いて表面抗原陰性固形腫瘍を治療することに使用するための本明細書に記載されるナノ粒子組成物も企図される。

ここで開示されるナノ粒子、医薬組成物、及び方法の追加の実施形態及び態様を、以下に提供する。

脂質二重層、リポソーム、及び多層（multilamellar、ＭＬ）ＲＮＡ ＮＰ（囲み）を導く一般的なスキームの一連の図解である。 未複合体化ＮＰ（左）及びＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（右）のＣＥＭ画像のペアである。 カチオン性ＲＮＡリポプレックスを導く一般的なスキームの図解である。 アニオン性ＲＮＡリポプレックスを導く一般的なスキームの図解である。 未複合体化ＮＰのＣＥＭ画像である。 ＲＮＡ ＬＰＸのＣＥＭ画像である。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰのＣＥＭ画像である。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、若しくはアニオン性ＬＰＸで処置したマウス、又は未処置のマウスの脾臓に存在するＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣクラスＩＩ＋脾細胞の％ＣＤ８６＋のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、若しくはアニオン性ＬＰＸで処置したマウス、又は未処置のマウスの脾臓に存在するＣＤ８＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、若しくはアニオン性ＬＰＸで処置したマウス、又は未処置のマウスの脾臓に存在するＣＤ４＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌのグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、若しくはアニオン性ＬＰＸで処置したマウス、又は未処置のマウスの生存％のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ）、ＲＮＡ ＬＰＸ、若しくはアニオン性ＬＰＸで処置した際のマウスで産生された、又は未処置のマウスのＩＦＮ－αの量のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰの投与後の時間の関数としてプロットされたＣＤ３＋細胞のＣＤ８又はＣＤ４４及びＣＤ８の発現％のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰの投与後の時間の関数としてプロットされたＣＤ１１ｃ＋細胞のＰＤＬ１、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８６、又はＣＤ８０の発現％のグラフである。 ＭＬ ＲＮＡ ＮＰの投与後の時間の関数としてプロットされたＣＤ３＋細胞のＣＤ４４及びＣＤ８の発現％のグラフである。 生存期間の中央値（点線）と比較したＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処置したイヌの生存％のグラフである。 イヌモデルにおけるＭＬ ＲＮＡ－ＮＰの投与後（ｘ軸）に誘発されたリンパ球のパーセンテージ（ｙ軸）を図解する。 イヌモデルにおけるＭＬ ＲＮＡ－ＮＰの投与後数時間のインターフェロン－α産生（ｐｇ／ｍＬ、ｙ軸）を図解する。 ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰの投与後数時間（ｘ軸）のＣｄ１１ｃ＋細胞上のＣＤ８０＋発現の増加（発現％、ｙ軸）を図解する。 イヌ対象へのＭＬ ＲＮＡ－ＮＰの投与後数時間（ｘ軸）のＣＤ８及びＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞の発現を図解する。 Ａは、長期生存対象処置のタイムラインである。１回目及び２回目の腫瘍接種が示されている。Ｂは、３群のマウスの各々についての２回目の腫瘍接種後の動物の生存率のグラフである。２つの群は、非特異的ＲＮＡ（対象における腫瘍に特異的ではないＲＮＡ；緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein、ＧＦＰ）又はｐｐ６５）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰにより２回目の腫瘍接種の前に処置し、１つの群は、腫瘍特異的ＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰにより２回目の腫瘍接種の前に処置したか、又は２回目の腫瘍接種の前の未処置の動物である。対照群の生存率は、「未処置」として記す。 腫瘍移植後の時間（日数）の関数としての、ＭＬ ＲＮＡ ＮＰにより単独（ＲＮＡ－ＮＰ）で又はＰＤＬ１モノクローナル抗体（ＲＮＡ－ＮＰ＋ＰＤＬ１ ｍＡｂ）と組み合わせて処置した群の生存しているマウスのパーセンテージのグラフである。対照群には、未処置マウス（未処置）、いずれのＲＮＡも含まないＭＬ ＮＰで処置したマウス（ＮＰ単独）、及びＰＤＬ１モノクローナル抗体のみで処置したマウス（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）が含まれていた。^＊ｐ＜０．０５、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘ。 腫瘍移植後様々な日数での、メラノーマの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図６Ａ）、肉腫モデルにおける生存率（図６Ｂ）、及び転移性肺モデルにおける生存率（図６Ｃ）を図解する折れ線グラフである。これらの図は、本開示のＭＬ ＲＮＡ－ＮＰがインビボで免疫学的にコールドの腫瘍に対する有効な抗腫瘍免疫応答を媒介することを示す。 腫瘍移植後様々な日数での、メラノーマの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図６Ａ）、肉腫モデルにおける生存率（図６Ｂ）、及び転移性肺モデルにおける生存率（図６Ｃ）を図解する折れ線グラフである。これらの図は、本開示のＭＬ ＲＮＡ－ＮＰがインビボで免疫学的にコールドの腫瘍に対する有効な抗腫瘍免疫応答を媒介することを示す。 腫瘍移植後様々な日数での、メラノーマの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図６Ａ）、肉腫モデルにおける生存率（図６Ｂ）、及び転移性肺モデルにおける生存率（図６Ｃ）を図解する折れ線グラフである。これらの図は、本開示のＭＬ ＲＮＡ－ＮＰがインビボで免疫学的にコールドの腫瘍に対する有効な抗腫瘍免疫応答を媒介することを示す。 本開示の非特異的ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが顕著な抗腫瘍有効性を媒介することを示す。図７Ａ：皮下Ｂ１６Ｆ０腫瘍を保有しているＣ５７Ｂｌ／６マウス（７～８匹／群）の腫瘍体積（ｍｍ^３）に、ルシフェラーゼＲＮＡ－ＮＰで週１回（×３）ワクチン接種するか、又はＰＤ－Ｌ１－ｍＡｂで週２回（×３）処置した。図７Ｂ：Ｋ７Ｍ２肺腫瘍を接種し、週３回のＧＦＰ ＲＮＡ－ＮＰ（×３）又は週２回のＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂでワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）の生存率プロット（生存％；ｙ軸）。図７Ｃ：非特異的ＲＮＡ－ＮＰ（ルシフェラーゼ）は、チェックポイント耐性マウス腫瘍モデル（Ｂ１６Ｆ０）におけるＩＣＩ（免疫チェックポイント阻害剤）に対する応答を感作させる。腫瘍体積（ｍｍ^３）をｙ軸に提供し、腫瘍移植後の日数をｘ軸に提供する。 本開示の非特異的ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが顕著な抗腫瘍有効性を媒介することを示す。図７Ａ：皮下Ｂ１６Ｆ０腫瘍を保有しているＣ５７Ｂｌ／６マウス（７～８匹／群）の腫瘍体積（ｍｍ^３）に、ルシフェラーゼＲＮＡ－ＮＰで週１回（×３）ワクチン接種するか、又はＰＤ－Ｌ１－ｍＡｂで週２回（×３）処置した。図７Ｂ：Ｋ７Ｍ２肺腫瘍を接種し、週３回のＧＦＰ ＲＮＡ－ＮＰ（×３）又は週２回のＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂでワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）の生存率プロット（生存％；ｙ軸）。図７Ｃ：非特異的ＲＮＡ－ＮＰ（ルシフェラーゼ）は、チェックポイント耐性マウス腫瘍モデル（Ｂ１６Ｆ０）におけるＩＣＩ（免疫チェックポイント阻害剤）に対する応答を感作させる。腫瘍体積（ｍｍ^３）をｙ軸に提供し、腫瘍移植後の日数をｘ軸に提供する。 本開示の非特異的ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが顕著な抗腫瘍有効性を媒介することを示す。図７Ａ：皮下Ｂ１６Ｆ０腫瘍を保有しているＣ５７Ｂｌ／６マウス（７～８匹／群）の腫瘍体積（ｍｍ^３）に、ルシフェラーゼＲＮＡ－ＮＰで週１回（×３）ワクチン接種するか、又はＰＤ－Ｌ１－ｍＡｂで週２回（×３）処置した。図７Ｂ：Ｋ７Ｍ２肺腫瘍を接種し、週３回のＧＦＰ ＲＮＡ－ＮＰ（×３）又は週２回のＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂでワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／群）の生存率プロット（生存％；ｙ軸）。図７Ｃ：非特異的ＲＮＡ－ＮＰ（ルシフェラーゼ）は、チェックポイント耐性マウス腫瘍モデル（Ｂ１６Ｆ０）におけるＩＣＩ（免疫チェックポイント阻害剤）に対する応答を感作させる。腫瘍体積（ｍｍ^３）をｙ軸に提供し、腫瘍移植後の日数をｘ軸に提供する。 ＲＮＡ－ＮＰは、ＣＡＲ Ｔ細胞に対する応答を感作させる。図８Ａは、腫瘍移植後の様々な日数（ｘ軸）での腫瘍サイズ（ｙ軸、腫瘍サイズの代用としての蛍光）を図解する折れ線グラフである。対象は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与の２４時間前に放射線照射（５Ｇｙ）を受けた。この研究は、移植前にＣＤ７０を発現するＫＲ１５８細胞（ＣＤ７０ＫＲ１５８）を利用した。このＲＮＡ－ＮＰ耐性腫瘍モデル（ＣＤ７０ＫＲ１５８）において、ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞（１×１０^７を投与）を、ＣＤ７０をコードする核酸を含むナノ粒子とともに投与すると、相当な相乗作用が観察された。ＲＮＡ－ＮＰ（ＣＤ７０をコードする）を、ＣＡＲ Ｔ細胞注入の２４時間後に開始して毎週投与した（ｐ＝０．０５）。図８Ｂは、ＲＮＡ－ＮＰ連携療法が有る場合と無い場合（ｘ軸）との末梢血中のＣＡＲ Ｔ細胞の数（ｙ軸）を図解する棒グラフである。ＲＮＡ－ＮＰの投与後６時間で、ＲＮＡ－ＮＰは、末梢血からのＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞動員を誘導した（^＊、ｐ＝０．０１７９）。 ＲＮＡ－ＮＰは、ＣＡＲ Ｔ細胞に対する応答を感作させる。図８Ａは、腫瘍移植後の様々な日数（ｘ軸）での腫瘍サイズ（ｙ軸、腫瘍サイズの代用としての蛍光）を図解する折れ線グラフである。対象は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与の２４時間前に放射線照射（５Ｇｙ）を受けた。この研究は、移植前にＣＤ７０を発現するＫＲ１５８細胞（ＣＤ７０ＫＲ１５８）を利用した。このＲＮＡ－ＮＰ耐性腫瘍モデル（ＣＤ７０ＫＲ１５８）において、ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞（１×１０^７を投与）を、ＣＤ７０をコードする核酸を含むナノ粒子とともに投与すると、相当な相乗作用が観察された。ＲＮＡ－ＮＰ（ＣＤ７０をコードする）を、ＣＡＲ Ｔ細胞注入の２４時間後に開始して毎週投与した（ｐ＝０．０５）。図８Ｂは、ＲＮＡ－ＮＰ連携療法が有る場合と無い場合（ｘ軸）との末梢血中のＣＡＲ Ｔ細胞の数（ｙ軸）を図解する棒グラフである。ＲＮＡ－ＮＰの投与後６時間で、ＲＮＡ－ＮＰは、末梢血からのＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞動員を誘導した（^＊、ｐ＝０．０１７９）。 ＲＮＡ－ＮＰは、末期悪性腫瘍を有するイヌにおいて、注入後わずか２時間で、ＩＦＮ－αサージ、末梢ＤＣの活性化、及びリンパ球の辺縁趨向を誘発する。図９Ａは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間、及び投与後６時間；ｘ軸）でのＩＦＮ－αレベル（ｐｇ／ｍＬ、ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。図９Ｂは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間；ｘ軸）での％ＣＤ８０＋樹状細胞（ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。図９Ｃは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間、投与後６時間、投与後１週間、投与後２週間、及び投与後６週間；ｘ軸）でのリンパ球の絶対数（Ｋ／μＬ；ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。 ＲＮＡ－ＮＰは、末期悪性腫瘍を有するイヌにおいて、注入後わずか２時間で、ＩＦＮ－αサージ、末梢ＤＣの活性化、及びリンパ球の辺縁趨向を誘発する。図９Ａは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間、及び投与後６時間；ｘ軸）でのＩＦＮ－αレベル（ｐｇ／ｍＬ、ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。図９Ｂは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間；ｘ軸）での％ＣＤ８０＋樹状細胞（ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。図９Ｃは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間、投与後６時間、投与後１週間、投与後２週間、及び投与後６週間；ｘ軸）でのリンパ球の絶対数（Ｋ／μＬ；ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。 ＲＮＡ－ＮＰは、末期悪性腫瘍を有するイヌにおいて、注入後わずか２時間で、ＩＦＮ－αサージ、末梢ＤＣの活性化、及びリンパ球の辺縁趨向を誘発する。図９Ａは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間、及び投与後６時間；ｘ軸）でのＩＦＮ－αレベル（ｐｇ／ｍＬ、ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。図９Ｂは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間；ｘ軸）での％ＣＤ８０＋樹状細胞（ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。図９Ｃは、様々な時点（ＲＮＡ－ＮＰの投与前、投与後２時間、投与後６時間、投与後１週間、投与後２週間、及び投与後６週間；ｘ軸）でのリンパ球の絶対数（Ｋ／μＬ；ｙ軸）を図解する折れ線グラフである。 インビトロ抗腫瘍特異的死滅である。図１０Ａは、Ｋ７Ｍ２ ＯＳＡマウス固形腫瘍モデルにおけるＣＤ７０＋腫瘍とＣＤ７０指向ＣＡＲ Ｔ細胞との同時培養後の抗腫瘍特異的ＩＦＮ－γ放出を示す（二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｒｋｅｙの多重比較）。Ｋ７Ｍ２細胞は、試験前にＣＤ７０を発現した。図１０Ｂは、ＣＡＲ Ｔ用量の増加と相関する抗腫瘍特異的死滅を示す。 インビトロ抗腫瘍特異的死滅である。図１０Ａは、Ｋ７Ｍ２ ＯＳＡマウス固形腫瘍モデルにおけるＣＤ７０＋腫瘍とＣＤ７０指向ＣＡＲ Ｔ細胞との同時培養後の抗腫瘍特異的ＩＦＮ－γ放出を示す（二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｒｋｅｙの多重比較）。Ｋ７Ｍ２細胞は、試験前にＣＤ７０を発現した。図１０Ｂは、ＣＡＲ Ｔ用量の増加と相関する抗腫瘍特異的死滅を示す。 表面抗原陰性腫瘍モデル（移植前にＣＤ７０を発現しなかったＫ７Ｍ２細胞）において、ＣＤ７０をコードする核酸を含むＲＮＡ－ＮＰの投与は、固形腫瘍をＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞に対して感作させた。ＲＮＡ－ＮＰ（ｉ．ｖ．）を、Ｋ７Ｍ２尾静脈接種後５日目、ＣＡＲ Ｔ投与後７日目、及びその後毎週（×３）投与した－（８／群；ｐ＝０．０３）。「ＷＴ－ＮＰ」は、ＣＤ７０陰性総腫瘍由来ｍＲＮＡを含む。未処置の対象及びＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した対象の生存は、３０日未満であった。ＷＴ－ＮＰ、ＣＤ７０をコードするＮＰ、及びＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせたＷＴ－ＮＰの投与により、生存が延長した。注目すべきことに、ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせてＣＤ７０をコードするＮＰを投与することで、提供された他の処置をはるかに超えて生存が有意に改善された。 ＣＤ７０をコードするＲＮＡを含む本開示のナノ粒子（５マイクログラム及び２５マイクログラム）の注射後３６時間でのＣＤ７０＋脾細胞の％（図１２Ａ）及びＣＤ７０＋肝細胞の％（図１２Ｂ）を示す折れ線グラフである。マウスにＲＮＡ－ＮＰを注射し、臓器（脾臓及び肝臓）を収集してＣＤ７０発現を特徴付けた。ＮＰの全身投与により、脾細胞及び肝臓における抗原発現が生じた。 ＣＤ７０をコードするＲＮＡを含む本開示のナノ粒子（５マイクログラム及び２５マイクログラム）の注射後３６時間でのＣＤ７０＋脾細胞の％（図１２Ａ）及びＣＤ７０＋肝細胞の％（図１２Ｂ）を示す折れ線グラフである。マウスにＲＮＡ－ＮＰを注射し、臓器（脾臓及び肝臓）を収集してＣＤ７０発現を特徴付けた。ＮＰの全身投与により、脾細胞及び肝臓における抗原発現が生じた。 形質導入研究及び腫瘍細胞のインビトロ死滅の結果を図解する。図１３Ａは、ＣＤ７０をコードするＮＰの適用後の樹状細胞（ＤＣ２．４）及び脳腫瘍細胞（ＫＲ１５８）におけるＣＤ７０の発現を示すプロットを含む。ＤＣ２．４及びＫＲ１５８細胞は、ＣＤ７０を天然に発現しない。ＤＣ２．４細胞の約７３％及びＫＲ１５８細胞の約９５％が、ＮＰへの曝露後にＣＤ７０を発現した。図１３Ｂは、非特異的ＲＮＡ（オボアルブミン（ovalbumin、ＯＶＡ）をコードするＲＮＡ）を含むＮＰ、ＣＤ７０をコードするＲＮＡを含むＮＰ、ＯＶＡＮＰとＣＤ７０標的化ＣＡＲ Ｔ細胞との組み合わせ、及びＣＤ７０ＮＰとＣＤ７０標的化ＣＡＲ Ｔ細胞との組み合わせが、腫瘍細胞生存性に与える効果を図解する折れ線グラフである。腫瘍細胞生存性（ｙ軸）の代用として発光を測定したこのインビトロアッセイにおいて、ＣＤ７０を天然に発現しないＫＲ１５８細胞を利用した。エフェクター細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）と標的細胞（腫瘍）との比をｘ軸に記す。ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ７０をコードするＮＰとの組み合わせは、生存腫瘍細胞の有意な低減を媒介した（すなわち、この組み合わせにより、他の処置よりも有意に多くの腫瘍細胞死が生じた）。 形質導入研究及び腫瘍細胞のインビトロ死滅の結果を図解する。図１３Ａは、ＣＤ７０をコードするＮＰの適用後の樹状細胞（ＤＣ２．４）及び脳腫瘍細胞（ＫＲ１５８）におけるＣＤ７０の発現を示すプロットを含む。ＤＣ２．４及びＫＲ１５８細胞は、ＣＤ７０を天然に発現しない。ＤＣ２．４細胞の約７３％及びＫＲ１５８細胞の約９５％が、ＮＰへの曝露後にＣＤ７０を発現した。図１３Ｂは、非特異的ＲＮＡ（オボアルブミン（ovalbumin、ＯＶＡ）をコードするＲＮＡ）を含むＮＰ、ＣＤ７０をコードするＲＮＡを含むＮＰ、ＯＶＡＮＰとＣＤ７０標的化ＣＡＲ Ｔ細胞との組み合わせ、及びＣＤ７０ＮＰとＣＤ７０標的化ＣＡＲ Ｔ細胞との組み合わせが、腫瘍細胞生存性に与える効果を図解する折れ線グラフである。腫瘍細胞生存性（ｙ軸）の代用として発光を測定したこのインビトロアッセイにおいて、ＣＤ７０を天然に発現しないＫＲ１５８細胞を利用した。エフェクター細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）と標的細胞（腫瘍）との比をｘ軸に記す。ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ７０をコードするＮＰとの組み合わせは、生存腫瘍細胞の有意な低減を媒介した（すなわち、この組み合わせにより、他の処置よりも有意に多くの腫瘍細胞死が生じた）。

本開示は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の有効性を改善し、かつ／又は療法に応答する患者集団を拡大するための材料及び方法を提供する。例えば、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングする方法を提供する。本方法は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子（nanoparticle、ＮＰ）を含む第１の組成物を対象に投与することを含む。本組成物は、対象にＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す少なくとも１日前に対象に投与される。以前は、最適なＴ細胞増殖及び活性化をインビボで達成するためには、リンパ球枯渇（ＬＤ）コンディショニングが必要であると一般的に考えられた。ＬＤコンディショニングは、対象のリンパ球集団を一掃する働きをする。そのような「負のコンディショニング」は、感染に対する感受性の増加、低血球数、悪心、嘔吐、倦怠感、及び脱毛などの望ましくない副作用と関連付けられる。驚くべきことに、本明細書に記載されるナノ粒子組成物の投与により、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受け入れるように身体が十分にプライミングされ、その結果、ＬＤコンディショニングが不要となることが確定した。この「正のコンディショニング」により、ＬＤ療法と関連付けられる望ましくない副作用が回避される。更に、本明細書に記載されるナノ粒子組成物の投与により、固形腫瘍へのＴ細胞輸送を促進し、別様には免疫抑制性である腫瘍微小環境における活性化を増強する免疫学的環境が創出される。本明細書に記載される観察は、ＣＡＲ Ｔ細胞治療のために対象を準備することにおけるパラダイムシフトを表す。

本開示はまた、対象における固形腫瘍を治療する方法を提供し、ここでは、固形腫瘍は、「表面抗原陰性」であり、腫瘍が本明細書に開示される治療の前にＣＡＲ Ｔ細胞療法に対して臨床的に応答性であるのに十分なレベルの表面腫瘍抗原を発現しないことを意味する。本方法は、表面抗原陰性固形腫瘍を含む対象に、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置され、核酸が、表面抗原をコードする、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を投与することを含む。本方法は、表面抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む第２の組成物を投与することを更に含む。ＣＡＲ Ｔ細胞によって標的とされる表面抗原をコードするｍＲＮＡを含む本明細書に記載されるナノ粒子の投与は、難治性固形腫瘍（すなわち、十分なレベルの表面抗原発現の欠如に起因してＣＡＲ Ｔ細胞療法に応答しない腫瘍）を、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に応答する腫瘍に変換できることが確定されている。本明細書に記載される材料及び方法は、新たな患者集団（難治性固形腫瘍を有する患者集団）のためのＣＡＲ Ｔ細胞療法の可能性を広げるとともに、「既製の」ＣＡＲ Ｔ細胞療法を使用できるようにする可能性がある。

本方法の様々な態様を以下に説明する。セクションの見出しの使用は、単に読みやすさのためだけである。本開示は全体として読まれるべきであり、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。

ナノ粒子
本方法のナノ粒子は、カチオン性脂質及び核酸を含む。本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、直径が約１０００ｎｍ未満である粒子を指す。本開示のナノ粒子は、リポソーム形成を誘導するように処理されたカチオン性脂質を含むので、様々な態様でここに開示されるナノ粒子は、リポソームを含む。リポソームは、人工的に調製されたベシクルであり、例示的な態様では、主に脂質二重層から構成される。様々な例におけるリポソームは、栄養素及び医薬品の投与のための送達媒体として使用される。様々な態様では、本開示のリポソームは、異なるサイズであり、組成物は、（ａ）直径数百ナノメートルであり得、狭い水性コンパートメントによって分離された一連の同心二重層を含み得る多層ベシクル（multilamellar vesicle、ＭＬＶ）、（ｂ）例えば、直径５０ｎｍ未満であり得る小さな単細胞ベシクル（small unicellular vesicle、ＳＵＶ）、及び（ｃ）例えば、５０～５００ｎｍの直径であり得る大きな単細胞ベシクル（large unilamellar vesicle、ＬＵＶ）のうちの１つ以上を含み得る。様々な例におけるリポソームは、不健康な組織へのリポソームの付着を改善するために、又はエンドサイトーシス（これに限定されない）などの事象を活性化するために、オプソニン又はリガンドを含むように設計される。例示的な態様では、リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低又は高ｐＨを含む。様々な例において、リポソームは、封入された製剤及びリポソーム成分、脂質ベシクルが分散される媒体の性質、封入された物質の有効濃度及びその潜在的な毒性、ベシクルの適用及び／又は送達中に関与する任意の追加のプロセス、目的の用途のためのベシクルの最適化サイズ、多分散性及び貯蔵寿命、並びに安全かつ効率的なリポソーム製品の大規模生産のバッチ間の再現性及び可能性などであるがこれらに限定されない、物理化学的特性に応じて製剤化される。

例示的な実施形態では、ナノ粒子は、表面、並びに（ｉ）コア及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層、任意選択で、３つ以上の核酸層を含む、内部を含む。例示的な例では、各核酸層は、脂質層、例えば、カチオン性脂質層の間に配置される。例示的な態様では、ナノ粒子は、核酸及び脂質の交互の層を含む多層である。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも３つの核酸層を含み、それらの各々は、カチオン性脂質二重層間に配置される。例示的な態様では、ナノ粒子は、少なくとも４つ又は５つの核酸層を含み、それらの各々は、カチオン性脂質二重層間に配置される。例示的な態様では、ナノ粒子は、少なくとも５つを超える（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の）核酸層を含み、それらの各々は、カチオン性脂質二重層間に配置される。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質二重層」という用語は、カチオン性脂質又はそれらの混合物を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる、脂質二重層を意味する。好適なカチオン性脂質は、本明細書に記載されている。本明細書で使用される場合、「核酸層」という用語は、核酸、例えば、ＲＮＡを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、ここで開示されるナノ粒子の層を意味する。

本開示のナノ粒子の固有の構造は、多層ナノ粒子（multilamellar nanoparticle、ＭＬ－ＮＰ）が生物学的効果を発揮する方法におけるメカニズムの違いをもたらす。以前に記載されたＲＮＡベースのナノ粒子は、少なくとも部分的に、トル様受容体７（toll-like receptor 7、ＴＬＲ７）経路を介して、それらの効果を発揮する。驚くべきことに、本開示の多層ナノ粒子は、ＴＬＲ７とは無関係に有効性を媒介する。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＭＤＡ－５などの細胞内病原体認識受容体（pathogen recognition receptor、ＰＲＲ）は、ＴＬＲよりも多層ナノ粒子の生物活性に関連していると思われる。これにより、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰは、単一のＴＬＲ（例えば、エンドソーム内のＴＬＲ７）とは反対に、複数の細胞内ＰＲＲ（例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５）を刺激して、Ｉ型インターフェロンの更なる放出及びより強力な自然免疫の誘導を達成することができる可能性がある。これにより、ＲＮＡ－ＮＰは、長期生存対象利益を伴う優れた有効性を示すことができる。

様々な態様では、ここで開示されるナノ粒子は、正に帯電した表面を含む。いくつかの例では、正に帯電した表面は、脂質層、例えば、カチオン性脂質層を含む。様々な態様では、ナノ粒子の最外層は、カチオン性脂質二重層を含む。任意選択で、カチオン性脂質二重層は、ＤＯＴＡＰを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。様々な例において、表面は、カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む。いくつかの態様では、コアは、カチオン性脂質二重層を含む。様々な例では、コアは、核酸を欠き、任意選択で、コアは、約０．５重量％未満の核酸を含む。

例示的な態様では、ナノ粒子は、ナノメートル範囲内の直径を有し、したがって、ある特定の例において、本明細書では「ナノリポソーム」又は「リポソーム」と称される。例示的な態様では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば、約５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍの直径を有する。例示的な態様では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１１０ｎｍ±５ｎｍ、約１１５ｎｍ±５ｎｍ、約１２０ｎｍ±５ｎｍ、約１２５ｎｍ±５ｎｍ、約１３０ｎｍ±５ｎｍ、約１３５ｎｍ±５ｎｍ、約１４０ｎｍ±５ｎｍ、約１４５ｎｍ±５ｎｍ、約１５０ｎｍ±５ｎｍ、約１５５ｎｍ±５ｎｍ、約１６０ｎｍ±５ｎｍ、約１６５ｎｍ±５ｎｍ、約１７０ｎｍ±５ｎｍ、約１７５ｎｍ±５ｎｍ、約１８０ｎｍ±５ｎｍ、約１９０ｎｍ±５ｎｍ、約２００ｎｍ±５ｎｍ、約２１０ｎｍ±５ｎｍ、約２２０ｎｍ±５ｎｍ、約２３０ｎｍ±５ｎｍ、約２４０ｎｍ±５ｎｍ、約２５０ｎｍ±５ｎｍ、約２６０ｎｍ±５ｎｍ、約２７０ｎｍ±５ｎｍ、約２８０ｎｍ±５ｎｍ、約２９０ｎｍ±５ｎｍ、又は約３００ｎｍ±５ｎｍの直径を有する。例示的な態様では、ナノ粒子は、直径で約５０ｎｍ～約２５０ｎｍである。いくつかの態様では、ナノ粒子は、直径で約７０ｎｍ～約２００ｎｍである。

例示的な態様では、ナノ粒子は、直径、例えば、直径約５０ｎｍ～約５００ｎｍ又は約５０ｎｍ～約２５０ｎｍの範囲のナノ粒子の不均一な混合物を含む医薬組成物中に存在する。任意選択で、医薬組成物は、直径で約７０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲のナノ粒子の不均一な混合物を含む。

例示的な例では、ナノ粒子は、約＋４０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、例えば、約＋４０ｍＶ～約＋５５ｍＶ、約＋４０ｍＶ～約＋５０ｍＶ、約＋４０ｍＶ～約＋５０ｍＶ、約＋４０ｍＶ～約＋４５ｍＶ、約＋４５ｍＶ～約＋６０ｍＶ、約＋５０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、約＋５５ｍＶ～約＋６０ｍＶのゼータ電位によって特徴付けられる。例示的な態様では、ナノ粒子は、約＋４５ｍＶ～約＋５５ｍＶのゼータ電位を有する。様々な例におけるナノ粒子のゼータ電位は、約５０ｍＶである。様々な態様では、ゼータ電位は、＋３０ｍＶ又は＋３５ｍＶを超える。ゼータ電位は、本開示のナノ粒子と、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６（１）：ｅ１２５６５２７（２０１６）に記載されるナノ粒子とを区別する、１つのパラメータである。

例示的な実施形態では、ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、米国特許出願公開第２０１３００９０３７２号（その内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されているものなどの低分子量カチオン性脂質である。例示的な例におけるカチオン性脂質は、カチオン性脂肪酸、カチオン性グリセロ脂質、カチオン性グリセロリン脂質、カチオン性スフィンゴ脂質、カチオン性ステロール脂質、カチオン性プレノール脂質、カチオン性糖脂質、又はカチオン性ポリケチドである。例示的な態様では、カチオン性脂質は、２つの脂肪アシル鎖を含み、その各鎖は、独立して飽和又は不飽和である。いくつかの例では、カチオン性脂質は、ジグリセリドである。例えば、いくつかの例では、カチオン性脂質は、式Ｉ又は式ＩＩのカチオン性脂質であり得、

式中、ａ、ｂ、ｎ、及びｍの各々は、独立して、２～１２（例えば、３～１０）の整数である。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、式Ｉのカチオン性脂質であり、式中、ａ、ｂ、ｎ、及びｍの各々は、独立して、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される整数である。例示的な例では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）、又はその誘導体である。例示的な例では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、又はその誘導体である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（1,2-dioleyloxy-N,N-dimethylaminopropane、ＤＯＤＭＡ）リポソームから形成されたリポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）からのＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（1,2-dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropane、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、及びＭＣ３（米国特許公開第２０１００３２４１２０号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、インビトロ及びインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが以前に記載及び示された安定化プラスミド脂質粒子（stabilized plasmid-lipid particle、ＳＰＬＰ）又は安定化核酸脂質粒子（stabilized nucleic acid lipid particle、ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されたリポソームを含む。いくつかの態様におけるナノ粒子は、核酸分子に加えて、３～４個の脂質成分から構成される。例示的な態様では、リポソームは、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００５；２２（３）：３６２－７２によって記載されているように、５５％のコレステロール、２０％のジステアロイルホスファチジルコリン（disteroylphosphatidyl choline、ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ－Ｓ－ＤＳＧ、及び１５％の１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含む。例示的な例では、リポソームは、Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５；１０７（２）：２７６－８７（２００５）によって記載されているように、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、及び３０％のカチオン性脂質を含み、カチオン性脂質は、１，２－ジステアルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（1,2-distearloxy-N,N-dimethylaminopropane、ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、又は１，２－ジリノレニルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（1,2-dilinolenyloxy-3-dimethylaminopropane、ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。

いくつかの実施形態では、リポソームは、約２５．０％のコレステロール～約４０．０％のコレステロール、約３０．０％のコレステロール～約４５．０％のコレステロール、約３５．０％のコレステロール～約５０．０％のコレステロール、及び／又は約４８．５％のコレステロール～約６０％のコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、リポソームは、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％、及び４３．５％からなる群から選択される百分率のコレステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、リポソームは、約５．０％～約１０．０％のＤＳＰＣ及び／又は約７．０％～約１５．０％のＤＳＰＣを含み得る。

いくつかの実施形態では、リポソームは、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）、中性ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣がんのためのｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８－１７１３）、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）、及びヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｓｒａｅｌ）である。

様々な例において、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（dilinoleyl-methyl-4-dimethylaminobutyrate、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、又はジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、更に中性脂質、ステロール、及び粒子凝集を低減することができる分子、例えば、ＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質を含む。

様々な態様におけるリポソームは、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質及びアミノアルコール脂質を含む。いくつかの態様では、リポソームは、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質を含むが、これらに限定されない。アミノアルコールカチオン性脂質は、いくつかの態様では、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号に記載されている脂質及び／又は記載されている方法によって作製された脂質を含む。非限定的な例として、ある特定の態様におけるカチオン性脂質は、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号における化合物１）、２－アミノ－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号における化合物２）、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－［（オクチルオキシ）メチル］プロパン－１－オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号における化合物３）、及び２－（ジメチルアミノ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号における化合物４）、又はその任意の薬学的に許容される塩若しくは立体異性体である。

様々な実施形態では、リポソームは、（ｉ）２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群より選択される少なくとも１つの脂質、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質、（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロール、並びに（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質、例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ又はＰＥＧ－ｃＤＭＡを、約２０～６０％のカチオン性脂質：５～２５％の中性脂質：２５～５５％のステロール：０．５～１５％のＰＥＧ－脂質のモル比で含む。

いくつかの実施形態では、リポソームは、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、モル基準で約２５％～約７５％のカチオン性脂質、例えば、モル基準で約３５～約６５％、約４５～約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％、又は約４０％を含む。

いくつかの実施形態では、リポソームは、モル基準で約０．５％～約１５％の中性脂質、例えば、モル基準で約３～約１２％、約５～約１０％、又は約１５％、約１０％、若しくは約７．５％を含む。中性脂質の例には、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭが含まれるが、これらに限定されない。様々な態様では、ナノ粒子は中性脂質を含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約５％～約５０％のステロール（例えば、モル基準で約１５～約４５％、約２０～約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％、又は約３１％を含む。例示的なステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％～約２０％のＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質（例えば、モル基準で約０．５～約１０％、約０．５～約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％、又は約５％）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００未満、例えば、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、又は約５００ＤａのＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の例には、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（本明細書ではＰＥＧ－Ｃ１４又はＣ１４－ＰＥＧとも称される）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７、２７６－２８７（２００５）で更に考察され、その内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な態様では、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメミルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６、１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメイヒロクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１ Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１ Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコス－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニリコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコス－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコント－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコント－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコス－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルロクチル）オキシル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－｛［８－（２－オクリルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミン、又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体から選択され得る。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質－ポリカチオン複合体を含む。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、当該技術分野で既知の方法、及び／又は米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号（参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される方法によって達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、ポリリジン、ポリオルニチン及び／又はポリアルギニンなどであるがこれらに限定されない、カチオン性ペプチド又はポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、脂質－ポリカチオン複合体を含み得、これは、コレステロール又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（dioleoyl phosphatidylethanolamine、ＤＯＰＥ）などであるがこれらに限定されない、非カチオン性脂質を更に含み得る。

様々な態様では、カチオン性リポソームは、任意選択で、非カチオン性脂質を含まない。中性分子は、いくつかの態様では、サイズが２００ｎｍを超えるＲＮＡ負荷リポソームをもたらす多層ナノ粒子のコイル化／凝縮を妨害し得る。ヘルパー分子なしで生成されるカチオン性リポソームは、約７０～２００ｎｍ（又はそれ未満）のサイズを含み得る。これらの構築物は、負に帯電した核酸を有するカチオン性脂質から本質的になり、粒子の酸化（周囲環境に曝露された場合）を防ぐ密封されたロータリー真空エバポレーターで製剤化され得る。この態様では、ヘルパー脂質が存在しないことにより、各ＮＰが粒子当たりにより多くの量の核酸を含む、密にパッケージ化された多層ＮＰへのｍＲＮＡコイル形成が最適化される。粒子当たりの核酸ペイロードの増加により、これらの多層ＲＮＡナノ粒子は、免疫系を調節するための有効性の重要な予測因子である、顕著に大きな自然免疫応答を駆動する。

いくつかの態様では、核酸分子は、約１対約５～約１対約２５の核酸分子：カチオン性脂質比で存在する。いくつかの態様では、核酸分子は、約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５、約１対約１０、又は約１対約７．５の核酸分子：カチオン性脂質比で存在する。本明細書で使用される場合、「核酸分子：カチオン性脂質比」という用語は、質量比を意味し、ここで、核酸分子の質量は、カチオン性脂質の質量に対して相対的である。また、例示的な態様では、「核酸分子：カチオン性脂質比」という用語は、本開示のＭＬ ＲＮＡ ＮＰを作製するプロセス中にカチオン性脂質を含むリポソームに添加される核酸分子、例えば、ＲＮＡの質量の比率を意味する。例示的な態様では、ナノ粒子は、１５０μｇの脂質混合物当たり約１０μｇ未満又は約１０μｇのＲＮＡ分子を含む。例示的な態様では、ナノ粒子は、約１０μｇのＲＮＡを約１５０μｇのリポソームとインキュベートすることによって作製される。別の態様では、ナノ粒子は、脂質混合物の質量当たりより多くのＲＮＡ分子を含む。例えば、ナノ粒子は、１５０μｇのリポソーム当たり１０μｇ超のＲＮＡ分子を含み得る。いくつかの例におけるナノ粒子は、１５０μｇのリポソーム又は脂質混合物当たり１５μｇ超のＲＮＡ分子を含む。

様々な態様では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、例えば、転移ＲＮＡ（transfer RNA、ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ribosomal RNA、ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。様々な態様では、ＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。様々な態様では、ＲＮＡは細胞から単離された全ＲＮＡである。例示的な態様では、ＲＮＡは、例えば、腫瘍細胞又はがん細胞などの罹患細胞から単離された全ＲＮＡである。全腫瘍ＲＮＡを取得する方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書中の実施例１に記載されている。

表面抗原陰性固形腫瘍を含む対象における固形腫瘍を治療するための方法の文脈において、第１の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞によって認識される表面抗原（本明細書では表面腫瘍抗原とも称される）をコードする核酸を含むナノ粒子を含む。ＣＡＲ Ｔ細胞療法のためのいくつかの好適ながん抗原標的が既知であり、例えば、米国特許第１０，６８８，１６６号（特に腫瘍抗原の開示に関して、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている。抗原は、例えば、クローディン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１６６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＦＲα、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７１、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＨＥＲ２、メソテリン、ＣＤ１３３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＩＬ－１３Ｒα、ＰＤ－Ｌ１、ＩＬ－１１ＲαＥｐｈＡ２、ＭＡＧＥ、ＭＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＴＥＭ１、ＦＡＰ、ＧＡＧＥ、ＭＵＣ１、又はＮＹ－ＥＳＯ－１であり得る。様々な態様では、表面抗原は、ＣＤ７０である（すなわち、第１の組成物のナノ粒子の核酸は、ＣＤ７０をコードし、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ７０発現腫瘍細胞を標的とする）。ヒトＣＤ７０の配列は、当該技術分野で既知である。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ３２９７０を参照されたい。

例示的な例では、ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡである。本開示の様々な態様では、細胞から単離された全ＲＮＡを含むナノ粒子が使用される。様々な態様では、ｍＲＮＡは、インビトロ転写されたｍＲＮＡである。様々な例において、ｍＲＮＡ分子は、インビトロ転写（in vitro transcription、ＩＶＴ）によって生成される。ＩＶＴを実施するための好適な技術が、当該技術分野で既知である。例示的な態様では、ＩＶＴキットが採用される。例示的な態様では、キットは、１つ以上のＩＶＴ反応試薬を含む。本明細書で使用される場合、「インビトロ転写（ＩＶＴ）反応試薬」という用語は、ＩＶＴ反応で機能する任意の分子、化合物、因子、又は塩を指す。例えば、キットは、外因性ＤＮＡテンプレートからタンパク質を合成するための真核生物又は原核生物抽出物を伴う原核生物ファージＲＮＡポリメラーゼ及びプロモーター（Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６）を含み得る。任意選択で、ＲＮＡは、インビトロ転写されたｍＲＮＡであり、インビトロ転写テンプレートは、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである。様々な態様では、ナノ粒子は、ヒトの腫瘍から単離されたＲＮＡであるＲＮＡの混合物を含む。任意選択で、腫瘍は、骨肉腫、又は膠芽腫、髄芽腫、びまん性橋膠腫、若しくは中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍などの悪性脳腫瘍である。様々な態様では、ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ分子が３’末端にポリ（Ａ）テールを含むように、ポリ（Ａ）テールをコードする配列を含む。様々な態様では、ナノ粒子を作製する方法は、例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ分子をキャッピングすることなどの追加の処理工程を含む。

例示的な態様におけるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、タンパク質をコードする。任意選択で、タンパク質は、腫瘍抗原、サイトカイン、又は共刺激分子からなる群から選択される。実際には、タンパク質は、いくつかの態様では、例えば、腫瘍転移を阻害するのに有効なサイトカイン及び増殖因子、並びに少なくとも１つの細胞集団に対して抗増殖効果を有することが示されているサイトカイン又は増殖因子を含む、腫瘍抗原、共刺激性分子、サイトカイン、増殖因子、造血因子、又はリンホカインからなる群から選択される。そのようなサイトカイン、リンホカイン、増殖因子、又は他の造血因子としては、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍｅｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、及びエリスロポエチンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における使用のための追加の増殖因子としては、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質－１、骨形態形成タンパク質－２、骨形態形成タンパク質－３、骨形態形成タンパク質－４、骨形態形成タンパク質－５、骨形態形成タンパク質－６、骨形態形成タンパク質－７、骨形態形成タンパク質－８、骨形態形成タンパク質－９、骨形態形成タンパク質－１０、骨形態形成タンパク質－１１、骨形態形成タンパク質－１２、骨形態形成タンパク質－１３、骨形態形成タンパク質－１４、骨形態形成タンパク質－１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体α、サイトカイン誘導性好中球走化因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引物質、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β１．２、トランスフォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子β３、トランスフォーミング増殖因子β５、潜在性トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体、並びにキメラタンパク質及びその生物学的又は免疫学的に活性な断片が挙げられる。例示的な態様では、腫瘍抗原は、ウイルスタンパク質に由来する抗原、点変異に由来する抗原、又はがん－生殖系列遺伝子によってコードされる抗原である。例示的な態様では、腫瘍抗原は、ｐｐ６５、ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ／ＮＹ－ＥＳＯ１、ＳＳＸ、チロシナーゼ、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ－１、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、若しくはＷＴ１、又は本明細書に記載される任意の他の腫瘍抗原である。例示的な態様では、共刺激分子は、ＣＤ８０及びＣＤ８６からなる群から選択される。

いくつかの態様では、本開示の方法は、腫瘍から単離されたｍＲＮＡではない（すなわち、腫瘍ｍＲＮＡではない）、又は腫瘍細胞によって、若しくはヒトによって発現されるタンパク質をコードする核酸ではない（すなわち、タンパク質は腫瘍抗原又はがん抗原に関連しない）核酸を含む、ナノ粒子の使用を含み得る。これに関して、様々な態様では、ナノ粒子は、対象に投与されるＣＡＲ Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原をコードする核酸を含まない。様々な態様では、ナノ粒子は、核酸の混合物を含み、わずかな割合のみが、対象に投与されるＣＡＲ Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原をコードする（例えば、核酸の１０％未満又は５％未満が、ＣＡＲ Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原をコードする）。いくつかの態様では、核酸は、腫瘍又はがんに対して非特異的であるタンパク質をコードする。例えば、非特異的タンパク質は緑色、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はオボアルブミン（ＯＶＡ）であり得る。驚くべきことに、ＣＡＲ Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原をコードする核酸は、本開示のＮＰ組成物を使用してプレコンディショニングを達成するために必要とされない。

表面抗原陰性腫瘍を有する対象における固形腫瘍を治療することを含む、本開示の態様では、第１の組成物（ナノ粒子を含む）は、ナノ粒子であって、表面抗原をコードする核酸を含むナノ粒子、及び対象に投与されるＣＡＲ Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原をコードする核酸を含まない他のナノ粒子の混合集団を含み得る。

様々な態様では、本開示は、ナノ粒子の使用を企図し、核酸層は、スローサイクリング細胞（slow-cycling cell、ＳＣＣ）によって発現される核酸分子の配列を含む。「スローサイクリング細胞」又は「ＳＣＣ」という用語は、低速で増殖する腫瘍又はがん細胞を指す。例示的な態様では、ＳＣＣは、少なくとも約５０時間の倍加時間を有する。ＳＣＣは、黒色腫、卵巣がん、膵臓腺がん、乳がん、神経膠芽腫、結腸がんを含む、多数のがん組織で確認されている。Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １３４（５）：１３３１－１３４３（２０１１）（特にＳＣＣの記載に関して参照により本明細書中に組み込まれる）で教示されているように、ＳＣＣは、腫瘍開始特性の増加を示し、幹細胞様である。増殖速度が遅いため、ＳＣＣは、標識保持細胞（label-retaining cell、ＬＲＣ）とも称される。例示的な例では、核酸分子は、単離されたＳＣＣから抽出されたＲＮＡであるか、又は単離されたＳＣＣから抽出されたＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子である。任意選択で、ＳＣＣは、腫瘍（例えば、膠芽腫）を有する対象から得られた混合腫瘍細胞集団から単離される。本明細書で使用される場合、「混合腫瘍細胞集団」という用語は、異なるサブタイプの腫瘍細胞を含み、スローサイクリング細胞及び少なくとも１つの他の腫瘍細胞型、例えば、ファーストサイクリング細胞（fast-cycling cell、ＦＣＣ）を含む、異種細胞集団を指す。スローサイクリング細胞（ＳＣＣ）によって発現される核酸分子の配列を含む、核酸層を含むＮＰは、特に図１２に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／１６９２５号（国際公開第２０２１／１５８９９６号）に更に記載されている。

任意選択で、本開示の様々な態様は、腫瘍によって発現される融合タンパク質をコードする核酸のエピトープに結合するか、又はそれをコードする、ＲＮＡ分子を含むナノ粒子の使用を伴い得る。例示的な態様では、エピトープは、融合タンパク質をコードする核酸の接合部を含む。様々な態様では、エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩに結合するアミノ酸配列をコードする。例として、様々な例における融合タンパク質は、Ｃ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡ融合タンパク質、又は本明細書若しくはＰａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３２（１１）：５９４－６０３ （２０１３）、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １９（１）：１７７（２０１８）、Ｗｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ １７，ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ２８（２０１８）、あるいはＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９，ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ １０７４ （２０１９）に記載される融合タンパク質である。参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／１６９２５号の図２５～２８を参照されたい。例示的な態様では、融合タンパク質は、Ｅｒｄｒ１、Ｍｉｄ１、Ｐｐｐ１ｒ１３ｂ、又はＣＫＢのうちの２つの少なくとも一部を含む融合タンパク質である。例示的な態様では、融合タンパク質は、Ｅｒｄｒ１の少なくとも一部及びＭｉｄ１の少なくとも一部（例えば、Ｅｒｄｒ１／Ｍｉｄ１若しくはＭｉｄ１／Ｅｒｄｒ１）、又はＰｐｐ１ｒ１３ｂの少なくとも一部及びＣＫＢの少なくとも一部（例えば、Ｐｐｐ１ｒ１３ｂ／ＣＫＢ若しくはＣＫＢ／Ｐｐｐ１ｒ１３ｂ）を含む、融合タンパク質である。様々な態様では、融合タンパク質は、脳腫瘍のネズミモデルによって発現される。例示的な態様では、融合タンパク質は、ＥＷＳＲ１、ＦＵＳＲ１、ＦＯＸＯ１、ＳＳ１８、ＦＬＩ１、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＦＥＶ、ＳＳＸ１のうちの２つの少なくとも一部を含む融合タンパク質である。例示的な態様では、融合タンパク質は、ＥＷＳＲ１、ＦＵＳＲ１、ＦＯＸＯ１、又はＳＳ１８の少なくとも一部、及びＦＬＩ１、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＦＥＶ、又はＳＳＸ１の少なくとも一部（例えば、ＥＷＳＲ１／ＦＬＩ１、ＦＬＩ１／ＥＷＳＲ１、ＥＷＳＲ１／ＥＲＧ、ＥＲＧ／ＥＷＳＲ１、ＥＷＳＲ１／ＥＴＶ１若しくはＥＴＶ１／ＥＷＳＲ１、ＥＷＳＲ１／ＥＴＶ４、ＥＴＶ４／ＥＷＳＲ１、ＥＷＳＲ１／ＦＥＶ、ＦＥＶ／ＥＷＳＲ１、ＦＵＳＲ１／ＦＥＶ、ＦＥＶ／ＦＵＳＲ１、ＦＵＳＲ１／ＥＲＧ、ＥＲＧ／ＦＵＳＲ１、ＦＯＸＯ１／ＰＡＸ３、ＰＡＸ３／ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ１／ＰＡＸ７、ＰＡＸ７／ＦＯＸＯ１、ＳＳ１８／ＳＳＸ１、又はＳＳＸ１／ＳＳ１８）を含む。例示的な態様では、融合タンパク質は、肉腫腫瘍によって発現される。様々な態様では、融合タンパク質は、ＹＡＰ１、ＦＡＭ１１８Ｂ、ＭＡＭＬＤ１、Ｃ１１ｏｒ９５、ＲＥＬＡ、ＥＰＮ、ＭＴＯＲ、ＣＡＳＺ１、ＴＰ５３、ＤＥＫ、ＦＸＲ２、ＢＲＡＦ、ＫＩＡＡ１５４９、又はＥＭＬ４のうちの２つの少なくとも一部を含む。例示的な態様では、融合タンパク質は、ＹＡＰ１、Ｃ１１ｏｒ９５、ＭＴＯＲ、ＴＰ５３、又はＢＲＡＦの少なくとも一部、及びＦＡＭ１１８Ｂ、ＭＡＭＬＤ１、ＲＥＬＡ、Ｃ１１ｏｒｆ９５、ＥＰＮ、ＣＡＳＺ１、ＤＥＫ、ＦＸＲ２、ＫＩＡＡ１５４９、又はＥＭＬ４の少なくとも一部（例えば、ＹＡＰ１／ＦＡＭ１１８Ｂ、ＦＡＭ１１８Ｂ／ＹＡＰ１、ＹＡＰ１／ＭＡＭＬＤ１、ＭＡＭＬＤ１／ＹＡＰ１、ＹＡＰ１／Ｃ１１ｏｒｆ９５、ｃ１１ｏｒｆ９５／ＹＡＰ１、Ｃ１１ｏｒｆ９５－ＲＥＬＡ、ｃ１１ｏｒｆ９５／ＲＥＬＡ、ＥＰＮ－ＹＡＰ１、ＥＰＮ－ＹＡＰ１、ＭＴＯＲ／ＭＴＯＲ、ＭＴＯＲ／ＣＡＳＺ１、ＣＡＳＺ１／ＭＴＯＲ、ＴＰ５３／ＴＰ５３、ＴＰ５３／ＤＥＫ、ＤＥＫ／ＴＰ５３、ＴＰ５３／ＦＸＲ２、ＦＸＲ２／ＴＰ５３、ＢＲＡＦ／ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＡＡ１５４９／ＢＲＡＦ、ＢＲＡＦ／ＥＭＬ４、又はＥＭＬ４／ＢＲＡＦ）を含む。例示的な態様では、融合タンパク質は、神経腫瘍によって発現される。融合タンパク質は、がんにおける体細胞変異のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）（ＣＯＳＭＩＣ）に関するｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ／ｆｕｓｉｏｎでのウェブサイト、又は腫瘍学及び血液学における 遺伝学及び細胞遺伝学のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）に関するａｔｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｓｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／Ｄｅｅｐ／Ｃａｎｃｅｒ＿ＣｙｔｏｇｅｎｏｍｉｃｓＩＤ２０１４５．ｈｔｍｌでのウェブサイトに記載されているものうちのいずれか１つであり得る。腫瘍によって発現される融合タンパク質をコードする核酸のエピトープに結合するか、又はそれをコードするＲＮＡ分子を含むナノ粒子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２１／１６９２５号に更に記載されている。

様々な例では、本開示の態様は、アンチセンス分子であるＲＮＡ分子、任意選択で、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、又はそれらの任意の組み合わせを含む、ナノ粒子の使用を伴い得る。アンチセンス分子は、ＲＮＡ干渉を媒介するもの（ＲＮＡｉ）であり得る。当業者に既知であるように、ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡが配列特異的様式で分解される、植物及び動物における遺伝子制御の遍在的機構である（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，４８５－４９０（２００１）、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１２，２２５－２３２（２００２）、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６－８１１（１９９８）、Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０１，２５－３３（２０００））。天然ＲＮＡ分解プロセスは、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって開始され、これは、長鎖ｄｓＲＮＡ前駆体の２１～２５ヌクレオチド長の二本鎖断片への切断を促進し、低分子干渉ＲＮＡと称される（ｓｉＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡとしても知られる）（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．，１０１，２５－３３（２０００）、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８－２００（２００１）、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３－２９６（２０００）、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３－３６６（２００１））。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識して切断する、大型タンパク質複合体に組み込まれる（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９－３２１（２００１））。哺乳動物細胞へのｄｓＲＮＡの導入は、ｓｉＲＮＡの効率的なＤｉｃｅｒ媒介性生成をもたらさず、したがって、ＲＮＡｉを誘導しないことが報告されている（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５２，９５－１０５（２０００）、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４７９，７９－８２（２０００））。様々な哺乳動物細胞におけるトランスフェクトされた遺伝子及び内因性遺伝子の発現を阻害する合成２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖を導入することによって、細胞内のｓｉＲＮＡの成熟におけるＤｉｃｅｒの必要性がバイパスされ得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４－４９８（２００１））。本開示の態様は、ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡ分子を含むナノ粒子の使用を伴い得、いくつかの態様では、ＲＮＡは、タンパク質の発現を阻害することに特異的なｓｉＲＮＡ分子である。本明細書で使用される場合の「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉを誘導又は媒介することが可能である約１０～約５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（又はＲＮＡ類似体）を指す。例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～約３０ヌクレオチド（若しくはヌクレオチド類似体）又は約２０～約２５ヌクレオチド（若しくはヌクレオチド類似体）、例えば、２１～２３ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含む。ｓｉＲＮＡは、二本鎖又は一本鎖、好ましくは二本鎖であり得る。

代替的な態様では、本開示は、タンパク質の発現を阻害することに特異的な短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子であるＲＮＡ分子を含む、ナノ粒子の使用を企図する。本明細書で使用される場合の「ｓｈＲＮＡ」という用語は、一本鎖ＲＮＡが、部分的にパリンドローム塩基配列を含み、その中で二本鎖構造（すなわち、ヘアピン構造）を形成する、約２０以上の塩基対の分子を指す。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造にフォールドされるｓｉＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ類似体）であり得る。ｓｈＲＮＡは、典型的には、約４５～約６０ヌクレオチドを含み、ヘアピンの約２１ヌクレオチドのアンチセンス及びセンス部分と、約２～約６ヌクレオチド長の非ループ側の任意選択的なオーバーハングと、例えば、約３～１０ヌクレオチド長であり得るループ部分と、を含む。

例示的な態様では、本開示は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるアンチセンス分子を含むナノ粒子の使用を企図する。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」という用語は、翻訳抑制又は標的分解を介して遺伝子発現をサイレンシングするためにｍＲＮＡ分子との塩基対を形成する小さな（例えば、１５～２２ヌクレオチド）非コードＲＮＡ分子を指す。マイクロＲＮＡ及びその治療可能性は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ＭｉｃｒｏＲＮＡ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，２０１１、Ｂａｄｅｒ ａｎｄ Ｌａｍｍｅｒｓ，”Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ”Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ５２－５５（Ｍａｒｃｈ ２０１１）を参照されたい。

ある特定の例では、ＲＮＡ分子は、アンチセンス分子、任意選択で、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡであり、これは、発現の低減のために免疫チェックポイント経路のタンパク質を標的とする。様々な態様では、免疫チェックポイント経路のタンパク質は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、又は共刺激受容体ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、若しくはＧＩＴＲである。ある特定の例における免疫チェックポイント経路のタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、又はＴＩＭ３である。免疫チェックポイントシグナル伝達経路は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－２６４（２０１２）に概説されている。

例示的な実施形態では、本開示のナノ粒子は、ＲＮＡ分子の混合物を含む。例示的な態様では、ＲＮＡ分子の混合物は、ヒト由来の細胞から単離されたＲＮＡであり、任意選択で、ヒトは、腫瘍を有する。いくつかの態様では、ＲＮＡの混合物は、ヒトの腫瘍から単離されたＲＮＡである。例示的な態様では、ヒトは、がん、任意選択で、本明細書に記載される任意のがんを有する。任意選択で、ＲＮＡが単離される腫瘍は、神経膠腫（限定されないが、膠芽腫を含む）、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、又は中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍（例えば、黒色腫若しくは乳がん）からなる群から選択される。任意選択で、ＲＮＡが単離される腫瘍は、骨肉腫である。例示的な態様では、ＲＮＡが単離される腫瘍は、がんの腫瘍、例えば、本明細書中に記載されるこれらのがんのうちのいずれかである。

様々な態様では、ナノ粒子は、ＬＡＭＰタンパク質を含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）を含む。ある特定の態様では、ＬＡＭＰタンパク質は、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ３、ＬＡＭＰ４、又はＬＡＭＰ５タンパク質である。

ＣＡＲ Ｔ細胞
本明細書に開示される組成物は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を用いた治療を受けている対象のための治療レジメンの一部である。一般に、本明細書に記載される方法は、特定のＣＡＲ Ｔ細胞産物に依存しない。様々な態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、第１の組成物のナノ粒子によってコードされる表面抗原に結合する。様々な態様では、本開示の方法は、免疫応答が所望される特定の標的細胞に依存しない。「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、腫瘍細胞などの標的細胞によって発現される抗原を認識し、それに結合するように操作されている人工免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞のために設計され、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体の一本鎖断片（single chain fragment、ｓｃＦｖ）又は他の抗体断片）のキメラである（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２６（８）：４９８－５０５（２０１５））。ＣＡＲは、非ＭＨＣ制限様式で、選択された標的に向けてＴ細胞特異性及び反応性を再指向する能力を有する。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プ処理と無関係である抗原を認識する能力を与え、したがって、腫瘍回避の主要な機構を回避する。更に、Ｔ細胞において発現されると、ＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量体化しない。

各々が異なる成分を含む、ＣＡＲの様々なフォーマットがある。「第１世代」ＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを通して、抗体由来ｓｃＦｖをＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに接合する。「第２世代」ＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するために、追加のドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、又はＩＣＯＳを組み込む。「第３世代」ＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ゼータ鎖と融合した２つの共刺激ドメインを含む。第３世代共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の組み合わせを含み得る。ＣＡＲは、いくつかの実施形態では、一般的に単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来するエクトドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３及び／又は共刺激分子に由来する１つ（第１世代）、２つ（第２世代）、又は３つ（第３世代）のシグナル伝達ドメインを有するエンドドメインを含む（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２５（２６）：４０１７－４０２３（２０１５）、Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．，２０（２）：１５１－１５５（２０１４））。

いくつかの態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍抗原を標的とする。腫瘍抗原は、例えば、がん細胞の細胞表面に関連する部分を含み、好ましくは、正常な（非がん性）組織では発現されない（又はまれにしか発現されない）。ＣＡＲ Ｔ細胞療法のためのいくつかの好適ながん抗原標的が既知であり、例えば、米国特許第１０，６８８，１６６号（特に腫瘍抗原の開示に関して、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、クローディン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、メソテリン、ＣＥＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＧＤ－２、又はＮＹ－ＥＳＯ－１（若しくは本明細書に記載される任意の他の抗原）を標的とし得る。がんの治療のためのＣＡＲ Ｔ細胞治療剤の例としては、例えば、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル）、ＴＥＣＡＲＴＵＳ（商標）（ブレクスカブタジェンアウトルーセル）、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）（チサゲンレクルユーセル）、及びＹＥＳＣＡＲＴＡ（商標）（アキシカブタゲンシロルユーセル）が挙げられる。非がん関連抗原の例としては、ウイルス抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus、ＨＣＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus、ＨＢＶ）抗原、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）抗原、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr virus、ＥＢＶ）抗原）、真菌抗原、寄生虫抗原、及び細菌抗原が挙げられる。

様々な態様では、修飾Ｔ細胞のＣＡＲは、分化抗原群７０（Cluster of Differentiation 70、ＣＤ７０）に結合する抗原結合ドメインを含む。ＣＤ７０は、ＣＤ２７に対する唯一のリガンドを表すＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ７０は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのグリコシル化膜貫通タンパク質である。ＣＤ７０－ＣＤ２７相互作用は、機能的リンパ球の発生中に共刺激を提供することにおいて重要な役割を果たす。ＣＤ７０発現の厳密な制御が、免疫細胞活性化のための最適なシグナル伝達に必要とされる。ＣＤ７０発現は、高度に活性化されたＴ／Ｂリンパ球及び成熟樹状細胞のわずかなサブセットに限定されるが、骨肉腫を含む明確に異なる固形腫瘍悪性腫瘍は、ＣＤ７０を構成的に過剰発現し得る。ＣＤ７０は、原発性腫瘍によって高度に発現されるだけでなく、再発性腫瘍においても高度に発現され、これは、原発性腫瘍及び再発性腫瘍のための一貫した治療標的を提示する。本開示の様々な態様では、ＣＡＲは、ＣＤ２７の細胞外部分（ＣＤ７０に対するリガンド）を含む抗原結合部分を含む。任意選択で、膜貫通ドメインは、４１ＢＢの細胞内部分である。ＣＤ７０標的化ＣＡＲの例示的な配列は、配列番号１によってコードされる：ＴＧＧＣＡＡＧ ＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣ ＴＧＧＴＧＧＣＴＧＴ ＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧ ＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣ ＧＧＡＣＴＧＡＧＣＧ ＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣ ＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣ ＴＧＣＣＣＣＧＡＧＡ ＧＡＣＡＣＴＡＣＴＧ ＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣ ＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴ ＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧ ＣＧＡＧＣＣＣＧＧＣ ＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧ ＴＧＡＡＡＧＡＣＴＧ ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＣ ＣＧＧＡＡＧＧＣＣＧ ＣＣＣＡＧＴＧＣＧＡ ＴＣＣＴＴＧＣＡＴＣ ＣＣＣＧＧＣＧＴＧＴ ＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣ ＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣ ＡＣＣＡＧＡＣＣＣＣ ＡＣＴＧＣＧＡＧＡＧ ＣＴＧＣＣＧＧＣＡＴ ＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧ ＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴ ＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣ ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧ ＣＣＡＡＣＧＣＣＧＡ ＧＴＧＣＧＣＣＴＧＣ ＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴ ＧＧＣＡＧＴＧＣＣＧ ＧＧＡＣＡＡＡＧＡＡ ＴＧＣＡＣＣＧＡＧＴ ＧＣＧＡＣＣＣＴＣＴ ＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣ ＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧ ＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧ ＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧ ＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣ ＣＴＣＡＧＣＣＣＡＣ ＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣ ＴＡＣＧＴＧＴＣＣＧ ＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡ ＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡ ＧＣＣＧＧＣＣＡＣＡ ＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴ ＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣ ＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣ ＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣ ＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣ ＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣ ＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧ ＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣ ＡＧＣＧＡＣＴＴＣＡ ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＴ ＧＧＴＧＡＴＣＴＴＣ ＡＧＣＧＧＣＡＴＧＴ ＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴ ＣＡＣＣＣＴＧＧＣＴ ＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴ ＴＣＣＴＧＣＡＣＡＡ ＧＣＧＧＧＧＣＡＧＡ ＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣ ＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴ ＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣ ＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣ ＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣ ＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡ ＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴ ＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧ ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ ＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡ ＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧ ＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡ ＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡ ＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣ ＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧ ＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡ ＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣ ＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣ ＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧ ＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣ ＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧ ＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧ ＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣ ＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧ ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣ ＣＣＡＧＡＧＧＣＧＧ ＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣ ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴ ＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡ ＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧ ＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣ ＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣ ＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧ ＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧ ＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧ ＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧ ＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧ ＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧ ＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡ ＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡ ＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣ ＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣ ＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣ ＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡ ＡＧＡ（配列番号１）。例示的なＣＤ７０標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、特にキメラ抗原受容体及びＣＡＲ Ｔ細胞の産生のその開示に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０５１０４７号に記載されている。

ＣＡＲ Ｔ療法は、その表面上で特定のＣＡＲを産生することができるように操作されている対象又は患者自身の免疫細胞を利用する、免疫療法であり得る。いくつかの状況では、Ｔ細胞は、身体から採血し、１つ以上の血液成分（血漿、血小板又は白血球など）を除去するプロセスである、アフェレーシスを介して対象又は患者の身体から収集される。次いで、身体から収集されたＴ細胞は、その表面上に特定のキメラ抗原受容体を産生するように遺伝子操作される。ＣＡＲ Ｔ細胞は、実験室内で成長させることによって増殖され、次いで、対象若しくは患者、又は別の対象若しくは患者に投与される。ＣＡＲ Ｔ細胞は、その表面上で標的抗原を発現するがん細胞を認識し、死滅させる。細胞は、療法のレシピエントとなる対象から単離され得るか、又は療法の最終的なレシピエントではないドナー対象から単離され得る。

使用
本開示は、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性を増強する、及び／又はＣＡＲ Ｔ細胞を使用する治療に対して腫瘍を感受性にするための方法を提供する。例えば、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングする方法であって、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を対象に施す少なくとも１日前に、対象に投与することを含む、方法を提供する。例示的な態様では、核酸分子は、ｍＲＮＡである。任意選択で、組成物は、対象に全身投与される。例えば、組成物は、静脈内投与される。様々な態様では、医薬組成物は、対象における樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）を活性化するのに有効な量で投与される。

第１のナノ粒子組成物は、本開示の様々な態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の少なくとも１日前に（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の１日以上前に）対象に投与される。本開示の例示的な態様では、第１の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の少なくとも１日前であるが約３０日以内に対象に投与される。例えば、第１の組成物は、任意選択で、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の約２～約２１日前に投与される（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の約２～約１４日前に投与される）。例えば、本方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す約７日前など、対象にＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す約５～約８日前に組成物を投与することを含み得る。様々な態様では、第１の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与の２時間～７２時間前に投与される。投与がＣＡＲ Ｔ細胞投与の少なくとも１日前である限り、組成物の複数回の投与が対象に与えられ得る。本開示の第１のナノ粒子組成物を用いたプレコンディショニングは、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞産物の受容のために身体をプライミングし、標的細胞への輸送を促進し、ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性及び活性化を増強する。いくつかの態様では、本方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与する工程を更に含む。

本開示は、対象における固形腫瘍を治療する方法であって、表面抗原陰性固形腫瘍を含む対象に、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置され、核酸が表面抗原をコードする、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を投与することと、表面抗原を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を含む第２の組成物を投与することと、を含む、方法を更に提供する。例示的な態様では、核酸分子は、ｍＲＮＡである。第１のナノ粒子組成物は、任意選択で、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む第２の組成物の投与の少なくとも１日前に（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の１日以上前に）対象に投与される。様々な態様では、第１の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の少なくとも１日前であるが約３０日以内に対象に投与される。例えば、第１の組成物は、任意選択で、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の約２～約２１日前に少なくとも１回投与される（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与の約２～約１４日前に投与される）。例えば、本方法は、対象にＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す約２～約５日前に第１の組成物を投与することを含み得る。第１の組成物の複数回投与は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与前に対象に与えられ得、第１の組成物の複数回投与は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与後に対象に与えられ得る。任意選択で、第１及び／又は第２の組成物は、対象に全身投与される。例えば、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、静脈内投与される。

本開示の様々な態様では、対象は、表面抗原陰性腫瘍を含む。これに関して、表面抗原陰性腫瘍は、本方法の前にＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する臨床的に関連する応答を達成するためには不十分なレベルの表面腫瘍抗原を発現する腫瘍である。「表面抗原陰性腫瘍」は、表面抗原が腫瘍に完全に存在しないことを必ずしも必要としないが、これは、本開示によって企図される。表面抗原陰性腫瘍は、様々な態様では、腫瘍の細胞の２０％未満（例えば、腫瘍生検によって測定される）が表面抗原を発現する（例えば、細胞の１８％未満、１５％未満、１３％未満、１０％未満、８％未満、５％未満、又は３％未満が表面抗原を発現する）、腫瘍である。したがって、様々な態様では、表面抗原陰性腫瘍は、本方法の前に、腫瘍中の細胞の１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満が表面抗原を発現するものである。腫瘍細胞上の表面腫瘍抗原の存在又は非存在を特徴付ける方法は、当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＲ検出法、次世代配列決定法、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、及び免疫染色を含む。

任意選択で、対象は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す前２１日以内にリンパ球枯渇療法を施されない。リンパ球枯渇療法は、当該技術分野で理解されており、例えば、シクロホスファミド、フルダラビン、ペントスタチン、若しくはベンダムスチンなどの化学療法薬の投与、又は放射線照射（例えば、放射線全身照射）を含む。任意選択で、対象は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の投与前の１８日以内、１４日以内、１０日以内、７日以内、又は３日以内にリンパ球枯渇療法を施されない。また、任意選択で、対象は、第１のナノ粒子組成物の投与前２１日以内にリンパ球枯渇療法を施されない。任意選択で、対象は、第１のナノ粒子組成物の投与前１８日以内、１４日以内、１０日以内、７日以内、又は３日以内にリンパ球枯渇療法を施されない。

様々な態様では、本方法は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む追加の（第２又は第３の）組成物を対象に投与することを更に含む。ナノ粒子、核酸などに関する上記の考察は、本明細書に開示される第１の組成物及び追加の組成物の両方に適用される。第１の組成物及び追加の組成物は、同じ組成物であり得るか、又は異なり得る。例えば、追加の組成物のナノ粒子は、第１の組成物のナノ粒子と比較して異なる核酸を含み得る。様々な態様では、追加の組成物のナノ粒子に組み込まれる核酸は、腫瘍ｍＲＮＡであり、例えば、ｍＲＮＡは、インビトロ転写されたｍＲＮＡであり、インビトロ転写テンプレートは、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである。様々な態様では、追加の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与の２時間～７２時間後に投与されるが、本開示は、他の投与のタイミングも企図する。

本開示はまた、ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた治療に対する固形腫瘍の感受性を増加させる方法も提供する。例示的な実施形態では、本方法は、本明細書に記載のナノ粒子、例えば、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の粗製物を対象に投与することを含む。任意選択で、核酸は、腫瘍表面抗原をコードする。任意選択で、第１の組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞を投与する少なくとも１日前に投与される。例示的な態様では、「感受性」は、「治療への応答性」を意味し、「感受性」及び「応答性」の概念は、薬物／化合物治療に応答する腫瘍又はがん細胞がその薬物に敏感であると言われるという点で、正の関係がある。「感受性」は、用量－効果曲線の横座標値の軸又はそれに平行な線との交点に関して定量的に測定又は記載され得、そのような点は、所与の程度の効果をもたらすためにのみ必要な用量に対応する。これと同様に、測定システムの「感受性」は、所与の程度の出力（効果）をもたらすのに必要な最小入力（最小用量）として定義されている。本開示の方法によって提供される感受性の増加は、対照と比較して、少なくとも又は約１％～約１０％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加）であり得る。本開示の方法によって提供される感受性の増加は、対照と比較して、少なくとも又は約１０％～約９５％超の増加（例えば、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加、少なくとも又は約９８％の増加、少なくとも又は約１００％の増加）であり得る。例示的な態様では、対照は、がん若しくは腫瘍、又はここで開示される薬学的組成物で治療されなかった対象若しくは対象の集団、あるいはプラセボで処置された対象若しくは対象の対象である。例示的な態様では、対照は、本明細書に開示される治療前の腫瘍である。

ＣＡＲ Ｔ療法に対する感受性の増加は、いくつかの方法のうちのいずれかで決定され得る。例えば、本明細書に記載される方法は、Ｔ細胞生存を増強し、Ｔ細胞寿命を促進し、かつ／又は複製能の喪失を制限するとともに、腫瘍を縮小し、かつ／又は腫瘍細胞死を媒介し得る。Ｔ細胞活性及び免疫応答を測定する方法が、当該技術分野で既知である。Ｔ細胞活性は、例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（７）：ｅ１１８６７（２０１０）に記載されているものなどの細胞傷害性アッセイによって測定され得る。他のＴ細胞活性アッセイは、Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（６）：８５９－８６４（２０００）に記載されている。免疫応答を測定する方法は、例えば、Ｍａｃａｔａｎｇａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７（９）：１４５２－１４５９（２０１０）、及びＣｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７（５）：１１２７－３５（２００１）に記載されている。

本明細書に記載される材料及び方法は、例えば、がん（例えば、固形腫瘍）などの疾患又は障害について対象を治療するために有用である。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語、並びにそれに関連する単語は、必ずしも１００％の若しくは完全な治療又は寛解を含意しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識する様々な程度の治療が存在する。この点で、疾患又は障害を治療する方法は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。更に、本方法によって提供される治療は、治療されている疾患の１つ以上の状態又は症状若しくは兆候の治療を含み得る。例えば、本開示の治療方法は、疾患の１つ以上の症状を阻害し得る。また、本開示の方法によって提供される治療は、疾患の進行を減速することを包含し得る。

「治療する」という用語はまた、疾患の予防的治療を包含する。したがって、ここで開示される方法によって提供される治療は、予防的に治療されている疾患の発症又は再発／ぶり返しを遅延させ得る。例示的な態様では、本方法は、疾患の発症を、１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、４年、又はそれ以上遅延させる。予防的治療は、治療される疾患のリスクを低減することを包含する。例示的な態様では、本方法は、疾患のリスクを、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又はそれ以上低減する。

ある特定の態様では、疾患を治療する方法は、疾患又はその症状を阻害する方法とみなされ得る。本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語及びそれから派生する単語は、１００％の又は完全な阻害又は解消ではない場合がある。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識する様々な程度の阻害が存在する。ここで開示される方法は、疾患又はその症状の発症又は再発を、任意の量又はレベルまで阻害し得る。例示的な実施形態では、本方法によって提供される阻害は、少なくとも又は約１０％の阻害（例えば、少なくとも又は約２０％の阻害、少なくとも又は約３０％の阻害、少なくとも又は約４０％の阻害、少なくとも又は約５０％の阻害、少なくとも又は約６０％の阻害、少なくとも又は約７０％の阻害、少なくとも又は約８０％の阻害、少なくとも又は約９０％の阻害、少なくとも又は約９５％の阻害、少なくとも又は約９８％の阻害）である。材料及び方法は、任意の量又はレベルで腫瘍の拡散又は増殖を阻害し得る。

がん（例えば、固形腫瘍）の治療は、いくつかの方法のうちのいずれかによって決定され得る。対象の健康状態における任意の改善が企図される（例えば、本明細書に記載される任意のパラメータの少なくとも若しくは約１０％の低減、少なくとも若しくは約２０％の低減、少なくとも若しくは約３０％の低減、少なくとも若しくは約４０％の低減、少なくとも若しくは約５０％の低減、少なくとも若しくは約６０％の低減、少なくとも若しくは約７０％の低減、少なくとも若しくは約８０％の低減、少なくとも若しくは約９０％の低減、又は少なくとも若しくは約９５％の低減）。例えば、治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指す：（１）新生細胞の数の削減、（２）新生細胞死の増加、（３）新生細胞生存の阻害、（５）腫瘍増殖若しくは新たな病変の出現の阻害（すなわち、ある程度減速すること、好ましくは停止させること）、（６）腫瘍サイズ若しくは腫瘍負荷の減少、（７）臨床的に検出可能な疾患の非存在、（８）がんマーカーのレベルの減少、（９）患者生存率の増加、及び／又は（１０）疾患若しくは状態に関連する１つ以上の症状（例えば、疼痛）のある程度の緩和。例えば、治療の有効性は、治療後の腫瘍質量及び／又は体積の変化を検出することによって決定され得る。腫瘍のサイズは、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、又は触診によって、並びに生検又は外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定又は病理学的検査によって測定される、初期サイズ及び寸法と比較され得る。応答は、例えば、腫瘍体積の変化率を使用して定量的に特徴付けられ得る（例えば、本開示の方法は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の腫瘍体積の低減をもたらす）。代替的に、腫瘍応答又はがん応答は、「病理学的完全応答」（pathological complete response、ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（clinical complete remission、ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（clinical partial remission、ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（clinical stable disease、ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（clinical progressive disease、ｃＰＤ）、又は他の定性的基準のような定性的様式で特徴付けられ得る。加えて、治療有効性はまた、他の免疫療法治療又は化学療法に対する応答性に関して特徴付けられ得る。様々な態様では、本開示の方法は、対象における治療を監視することを更に含む。

前述の方法に関して、ナノ粒子を含む組成物は、いくつかの態様では、対象に全身投与される。任意選択で、本方法は、非経口投与による本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの投与を含む。本明細書に記載の任意の薬剤の非経口剤形は、硬膜外、脳内、脳室内、皮膚上、動脈内、関節内、心臓内、海綿体内注射、皮内、病巣内、筋肉内、眼内、骨内注入、腹腔内、髄腔内、子宮内、膣内投与、静脈内、膀胱内、硝子体内、皮下、経皮、血管周囲投与、又は経粘膜を含むが、これらに限定されない様々な経路によって対象に投与され得る。脳への投与のために、薬学的組成物は、腫瘍内送達カテーテル、リザーバ（例えば、Ｏｍａｙａリザーバ）に取り付けられた脳室シャントカテーテル、注入ポンプを使用して腫瘍組織に導入され得るか、又は腫瘍切除腔に導入され得る（Ｇｌｉａｓｉｔｅ，Ｐｒｏｘｉｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなど）。脳内の腫瘍組織はまた、連続注入カテーテルを使用して対流を介して、又は脳脊髄液を通して、薬学的組成物を投与することによって接触され得る。様々な例では、本組成物は、対象に静脈内投与される。

投与される活性薬剤の量又は用量（すなわち、「有効量」）は、合理的な時間枠にわたって対象において、所望の生物学的効果、例えば、治療応答又は予防応答を達成するために十分であるべきである。例えば、組成物の１回以上の用量は、投与時から臨床的に許容される期間内に、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法のために対象をプライミングする、かつ／又はＣＡＲ Ｔ細胞療法に対して腫瘍を感作させる（かつ任意選択でがんを治療するために十分であるべきである。表面抗原をコードする核酸を含むナノ粒子を含む、第１の組成物が投与される場合において、第１の組成物の１回以上の用量は、腫瘍内の表面抗原の存在を増加させるために十分であるべきである。例えば、例示的な態様では、第１の組成物の１回以上の用量は、投瘍内の腫瘍細胞の２０％以上で表面抗原の発現を達成するために（例えば、投与時から臨床的に許容される期間内に、固形腫瘍内の腫瘍細胞の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％で表面抗原の発現を達成するために、対象に提供される。例として、かつ本開示を限定することを意図せずに、本開示の活性薬剤の用量は、約０．０００１～約１ｇ／治療されている対象の体重ｋｇ／日、約０．０００１～約０．００１ｇ／体重ｋｇ、又は約０．０１ｍｇ～約１ｇ／体重ｋｇであり得る。

様々な態様では、ナノ粒子組成物は、例えば、毎日（１日当たり１回、１日当たり２回、１日当たり３回、１日当たり４回、１日当たり５回、１日当たり６回）、週３回、週２回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、隔週などを含む、任意のレジメンに従って投与される。様々な態様では、本組成物は、対象に週１回投与される。第１の組成物及び追加のナノ粒子組成物の投与レジメンは、同じであり得るか、又は異なり得る。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞投与後に提供される追加のナノ粒子含有組成物の投与レジメンは、第１の組成物とは異なる間隔で、かつ第１の組成物よりも長い期間（すなわち、より長い全治療期間）にわたって起こり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物は、採用される特定のＣＡＲ Ｔ細胞及び治療されているがんの治療レジメンに従って投与され得る。

本開示の方法は、上記の工程を単独で、又は他の工程と組み合わせて含んでもよい。本方法は、上記の工程のうちのいずれか１つを繰り返すことを含んでもよく、かつ／又は上記のものとは別に追加の工程を含んでもよい。例えば、ここで開示される方法は、本開示のナノ粒子又は組成物を作製又は調製するための工程を更に含んでもよい。例えば、ここで開示される方法は、対象の腫瘍の試料を、任意選択で、生検を介して取得することを更に含む。本方法はまた、腫瘍の細胞から全ＲＮＡを単離すること、逆転写を介して全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成すること、及びｃＤＮＡからｍＲＮＡを増幅することを更に含んでもよい。任意選択で、ｍＲＮＡは、例えば、第２の組成物のナノ粒子に組み込まれる。ここで開示される方法はまた、いくつかの態様では、約１対約１０～約１対約２０（例えば、約１～約１９、約１～約１８、約１～約１７、約１～約１６、約１～約１５、約１～約１４、約１～約１３、約１～約１２、約１～約１１）のＲＮＡ：カチオン性脂質比でｍＲＮＡ及びカチオン性脂質を混合することを更に含む。例示的な例では、ここで開示される方法は、約１～約１５のＲＮＡ：カチオン性脂質比でｍＲＮＡ及びカチオン性脂質を混合することを更に含む。

対象
対象は、マウス及びハムスターなどの齧歯目の哺乳動物、並びにウサギなどの兎形目の哺乳動物、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科の動物（イヌ）を含む食肉目の哺乳動物、ウシ科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含む偶蹄目の哺乳動物、又はウマ科の動物（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、霊長目、Ｃｅｂｏｉｄ目又はＳｉｍｏｉｄ目（サル）に属するか、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）に属する。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様では、ヒトは、１８歳以上の成人である。いくつかの態様では、ヒトは、１７歳以下の子供である。

様々な態様では、対象は、表面抗原陰性固形腫瘍を含む。

がん
本明細書に開示される方法によって治療可能ながんは、任意のがん、例えば、任意選択でリンパ系又は血流を通して身体の他の部分に広がる可能性のある異常かつ制御されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖又は腫瘍であり得る。様々な態様では、対象は、固形腫瘍を有する。これに関して、本開示は、固形腫瘍の治療を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、本方法は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を対象に施す少なくとも１日前に、対象に投与することと、任意選択で、その後でＣＡＲ Ｔ細胞療法を施すことと、を含む。同様に任意選択で、本方法は、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む追加の（第２の）組成物を、ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した後に、投与することを更に含む。

いくつかの態様におけるがんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん（例えば、神経膠腫）、乳がん（例えば、三種陰性乳がん）、肛門のがん、肛門管のがん、肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頭部、頸部、胆嚢、又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、外陰のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、胃腸がん（例えば、消化管カルチノイド腫瘍）、ホジキンリンパ腫、子宮内膜がん又は肝細胞がん、下咽頭がん、腎がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、細気管支肺胞上皮がん）、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、骨肉腫、膵がん、腹膜のがん、大網のがん、腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がん（renal cell carcinoma、ＲＣＣ））、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、及び膀胱がんからなる群から選択されるものである。特定の態様では、がんは、頭頸部、卵巣、子宮頸部、膀胱、及び食道がん、膵がん、胃腸がん、胃、乳、子宮内膜、及び大腸がん、肝細胞がん、神経膠芽腫、膀胱及び肺がん（例えば、非小細胞肺がん（non-small cell lung cancer、ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞がん）からなる群から選択される。任意選択で、対象は、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、又は中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍などの悪性脳腫瘍に罹患している。任意選択で、対象は、再発性又は転移性骨肉腫などの骨肉腫に罹患している。

様々な態様では、対象は、難治性悪性腫瘍に罹患している。この点で、特定の療法又は宿主免疫応答を回避する腫瘍は、「難治性」（又は不応性）である。療法に対して「感受性」である腫瘍は、治療に対する有益な臨床応答を示す。宿主免疫応答に対して「感受性」である腫瘍は、宿主免疫系によって認識され、免疫エフェクター細胞による攻撃を受ける。

ＣＡＲ Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングすることに加え、本開示のＲＮＡ－ＬＰは、免疫学的に「コールド」な腫瘍、例えば、浸潤性Ｔ細胞を欠く、かつ／又は免疫系によって認識されない腫瘍を、免疫学的に「ホット」な腫瘍、すなわち、例えば、腫瘍微小環境における活性化された骨髄細胞及び／又はリンパ球浸潤及びインターフェロン産生を呈する腫瘍に移行させることができる。「コールド」な腫瘍の免疫学的治療は、適応免疫応答が存在しないことに少なくとも部分的に起因して、大きな課題を提示する。免疫学的に「コールド」な腫瘍を引き起こす傾向のあるがんには、神経膠芽腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、及び多くの乳がんが含まれるが、これらに限定されない。ただし、「コールド」な腫瘍は、これらの種類のがんに限定されるが、がんが対象において進行するにつれて、一部のがんは、免疫系の回避を可能にする耐性機序を発達させる。驚くべきことに、本開示のナノ粒子は、宿主免疫系によって認識されるように、腫瘍を「再プログラム」する。

例示的な態様では、対象は、免疫チェックポイント阻害剤（immune checkpoint inhibitor、ＩＣＩ）耐性の悪性腫瘍に罹患している。免疫応答（又はＩＣＩ）に対する腫瘍の感受性、又は別の言い方をすれば、腫瘍に対する免疫応答（又はＩＣＩ）の有効性は、当該技術分野で既知のものなどの様々な方法で決定することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つ以上の他の治療剤の投与を更に含む。いくつかの態様では、他の治療剤は、がんを治療又は予防することを目的とする。いくつかの実施形態では、他の治療剤は、化学療法剤である。一般的な化学療法剤としては、アドリアマイシン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、トランスプラチナム、５－フルオロウラシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。化学療法は、それがリンパ球枯渇療法である場合、様々な例において、上記のように、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の前の時間枠内に投与されない。

いくつかの実施形態では、他の治療剤は、がんの治療のための放射線療法において使用される薬剤であり、実際、いくつかの実施形態では、本方法は、放射線療法を含む治療レジメンの一部である。更に、本開示の方法は、神経膠腫（例えば、神経膠芽腫）などの腫瘍の外科的切除に関連して行われ得る。

例示的な態様では、本方法は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を対象に投与することを含む。「免疫チェックポイント阻害剤」又は「ＩＣＩ」は、免疫チェックポイント経路のタンパク質の機能を減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、又は妨害する任意の薬剤（例えば、化合物又は分子）である。免疫チェックポイント経路のタンパク質は、免疫応答を調節し、場合によっては、Ｔ細胞ががん細胞を攻撃するのを防止する。様々な態様では、免疫チェックポイント経路のタンパク質は、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、又は共刺激受容体ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、若しくはＧＩＴＲである。様々な態様では、ＩＣＩは、小分子、阻害核酸、又は阻害ポリペプチドである。様々な態様では、ＩＣＩは、免疫チェックポイント経路のタンパク質に結合してその機能を阻害する抗体、抗原結合抗体断片、又は抗体タンパク質産物である。抗体、抗原結合抗体断片、又は抗体タンパク質産物である好適なＩＣＩは、当該技術分野で既知であり、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ニボルマブ（ＰＤ－１；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ペンブロリズマブ（ＰＤ－１；Ｍｅｒｃｋ）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１；Ｍｅｒｃｋ）、及びデュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ８：１０６９－１０８６（２０１８））を含むが、これらに限定されない。ＩＣＩの他の例としては、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ３：Ｉｍｍｕｎｔｅｐ）；ＢＭＳ－９８６０１６（ＬＡＧ３；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＩＰＨ２１０１（ＫＩＲ；Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ピディリズマブ（ＰＤ－１；Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＰＤ－Ｌ１；Ｒｏｃｈｅ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＰＤ－Ｌ１；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＰＤ－Ｌ１；ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、ＡＵＮＰ１２（ＰＤ－１；Ａｕｒｉｇｅｎｅ）、ＭＧＡ２７１（Ｂ７－Ｈ３：ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及びＴＳＲ－０２２（ＴＩＭ３；Ｔｅｓａｒｏ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ナノ粒子の製造方法
正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸（例えば、ＲＮＡ）層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子は、（Ａ）核酸分子とリポソームとを、約１対約５～約１対約２５、例えば、約１対約５～約１対約２０、任意選択で、約１対約１５の核酸（例えば、ＲＮＡ）：リポソーム比で混合して、核酸（例えば、ＲＮＡ）で被覆されたリポソームを得ることを含む方法によって製造されてもよい。リポソームは、カチオン性脂質及び有機溶媒を含む脂質混合物を、有機溶媒を真空下で蒸発させることによって乾燥させることを含む、リポソームを作製するプロセスによって作製される。本方法は、（Ｂ）ＲＮＡで被覆されたリポソームを余剰量のリポソームと混合することを更に含む。例示的な態様では、ここで開示される方法によって作製されたナノ粒子は、本明細書に記載されるナノ粒子の記載と一致する。例えば、ここで開示される方法によって作製されたナノ粒子は、約＋４０ｍＶ～約＋６０ｍＶ、任意選択で、約＋４５ｍＶ～約＋５５ｍＶのゼータ電位を有する。任意選択で、ここで開示される方法によって作製されたナノ粒子のゼータ電位は、約＋５０ｍＶである。様々な態様では、ここで開示される作製されたナノ粒子のコアは、約０．５重量％未満の核酸を含み、かつ／又はコアは、カチオン性脂質二重層を含み、かつ／又はナノ粒子の最外層は、カチオン性脂質二重層を含み、かつ／又は、ナノ粒子の表面は、カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む。

例示的な態様では、脂質混合物は、カチオン性脂質及び有機溶媒を、１ｍＬの有機溶媒当たり約４０ｍｇのカチオン性脂質～１ｍＬの有機溶媒当たり約６０ｍｇのカチオン性脂質の比、任意選択で、１ｍＬの有機溶媒当たり約５０ｍｇのカチオン性脂質の比で含む。様々な例において、リポソームを作製するプロセスは、脂質混合物を再水和溶液で再水和して再水和された脂質混合物を形成し、次に再水和された脂質混合物を攪拌、静置、及びサイジングすることを更に含む。任意選択で、再水和された脂質混合物のサイジングは、再水和された脂質混合物を超音波処理、押し出し、及び／又は濾過することを含む。

ナノ粒子を作製する例示的な方法の説明は、本明細書において実施例１で提供される。実施例１に記載される工程のうちのいずれか１つ以上は、必要に応じて調整されてもよいことが理解される。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、リポソームと複合体化させる前に、ＲＮＡを調製するために必要とされる１つ以上の工程を含む。例示的な態様では、対象、例えば、ヒトに投与するためのナノ粒子を調製するために、下流の工程が含まれる。例示的な例では、本方法は、静脈内注射用のＮＰを配合することを含む。本方法は、様々な態様では、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を加えることを含み、任意選択で、得られた組成物を容器、例えば、バイアル、注射器、バッグ、アンプルなどに包装することを含む。いくつかの態様における容器は、すぐに使用できる容器であり、任意選択で、使い捨て用である。

医薬組成物
本開示のナノ粒子と、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む、組成物が本明細書に提供される。例示的な態様では、本組成物は、無菌組成物である。例示的な例では、本組成物は、本開示の複数のナノ粒子を含む。任意選択で、複数のうちの少なくとも５０％のナノ粒子は、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍの直径を有する。様々な態様では、本組成物は、１ｍＬ当たり約１０^１０ナノ粒子～１ｍＬ当たり約１０^１５ナノ粒子、任意選択で、１ｍＬ当たり約１０^１２ナノ粒子±１０％を含む。

例示的な態様では、本開示の組成物は、ナノ粒子、ナノ粒子を含む細胞、ナノ粒子を含む細胞の集団、又はＣＡＲ Ｔ細胞以外の、追加の成分を含んでもよい。本組成物は、様々な態様では、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴射剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固剤、抗菌保存剤、抗酸化剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、被膜形成剤、風味増強剤、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、顆粒化剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性媒体、有機基剤、パスティル基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、保存剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基剤、界面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、張化剤、毒性剤、増粘剤、吸水剤、水混和性共溶媒、水軟化剤、又は湿潤剤を含む、任意の薬学的に許容される成分を含む。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）、参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）を参照されたい。

本開示の組成物は、非経口及び皮下を含む、任意の許容される経路による投与に好適であり得る。他の経路としては、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、節内、及び脾臓内が挙げられる。例示的な態様では、本組成物は、全身（例えば、静脈内）投与に好適である。本組成物が対象への投与を意図した形態である場合、これは、意図した投与部位と等張であるようにすることができる。例えば、溶液が非経口投与を意図した形態である場合、これは血液と等張であり得る。本組成物は、典型的には無菌である。ある特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜を介した濾過によって達成されてもよい。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、概して、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内用溶液バッグ、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアル、若しくはプレフィルド注射器に入れられる。ある特定の実施形態では、本組成物は、すぐに使用できる形態、又は投与前に再構成若しくは希釈される形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで保存されてもよい。

以下の実施例は、単に本発明を例示するために提供され、その範囲を如何様にも限定するためではない。

実施例１
この実施例は、本開示のナノ粒子を作製する方法を説明する。

ＤＯＴＡＰリポソームの調製
１日目に、ドラフト内で次の工程を実行した。ロータベーパー浴に水を加えた。クロロホルム（２０ｍＬ）を滅菌ガラスメスシリンダーに注いだ。１ｇのＤＯＴＡＰを含むバイアルを開けた後、ガラスピペットを使用して、５ｍＬのクロロホルムをＤＯＴＡＰバイアルに加えた。次に、一定量のクロロホルム及びＤＯＴＡＰを、１Ｌの蒸発フラスコに移した。２番目の体積５ｍＬのクロロホルムをＤＯＴＡＰバイアルに加えて、バイアル中に残存するＤＯＴＡＰを溶解させ、次に、この量のクロロホルムをＤＯＴＡＰバイアルから蒸発フラスコに移すことによって、ＤＯＴＡＰバイアルを洗浄した。メスシリンダー内の全てのクロロホルムが使用されるまで、この洗浄工程を更に２回繰り返した。次に、蒸発フラスコをＢｕｃｈｉロータベーパーに入れた。水浴の電源を入れて、２５℃に調整した。蒸発フラスコを、水浴に触れるまで下に動かした。ロータベーパーの回転速度を、２に調整した。真空システムの電源を入れて、４０ｍｂａｒに調整した。１０分後、真空システムの電源を切り、クロロホルムをコレクターフラスコから収集した。収集したクロロホルムの量を測定した。コレクターフラスコの位置を変えたら、真空を再びオンにし、クロロホルムが完全に蒸発するまで、蒸発フラスコの内容物を一晩乾燥させた。

２日目に、滅菌メスシリンダーを使用して、ＰＢＳ（２００ｍＬ）を、室温に維持した新しい滅菌５００ｍＬ ＰＢＳボトルに加えた。ＤＯＴＡＰを収集するために、２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを準備した。Ｂｕｃｈｉロータベーパー水浴を、５０℃に設定した。ＰＢＳ（５０ｍＬ）を、２５ｍＬの使い捨て血清ピペットを使用して、蒸発フラスコに加えた。蒸発フラスコをＢｕｃｈｉロータベーパーに配置し、フラスコの１／３が水浴に沈むまで、下に動かした。ロータベーパーの回転速度を２に設定し、１０分間回転させた後、回転を止めた。蒸発フラスコからのＤＯＴＡＰを含む５０ｍＬのＰＢＳを、２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルに移した。ＰＢＳボトル内のＰＢＳの全量が使用されるまで、この工程を（３回）繰り返した。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルの最終容量は、４００ｍＬであった。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルの脂質溶液を３０秒間ボルテックスした後、５０℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの間、ボトルを１０分毎にボルテックスした。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを室温で一晩放置した。

３日目に、ＰＢＳ（２００ｍＬ）を、ＤＯＴＡＰ及びＰＢＳを含む２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルに加えた。２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、超音波浴に入れた。水を超音波浴に満たし、２番目の５００ｍＬ ＰＢＳボトルを５分間超音波処理した。押出機をＰＢＳ（１００ｍＬ）で洗浄し、この洗浄工程を繰り返した。０．４５μｍ孔のフィルターを濾過ユニットに取り付け、新しい（３番目の）５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、押出機の出力チューブ内に配置した。生物学的安全キャビネット中で、３番目のＰＢＳボトルの約７０％が満たされるまで、ＤＯＴＡＰ－ＰＢＳ混合物を押出機にロードした。次に、押出機の電源を入れ、全ての混合物が押出機を通過するまで、ＤＯＴＡＰ ＰＢＳ混合物を加えた。続いて、０．２２μｍ孔のフィルターを濾過ユニットに取り付け、新しい（３番目の）５００ｍＬ ＰＢＳボトルを、押出機の出力チューブに配置した。以前にフィルタリングされたＤＯＴＡＰ－ＰＢＳ混合物をロードし、全体にわたって再度実行した。次に、ＰＢＳ中にＤＯＴＡＰ脂質ナノ粒子（ＮＰ）を含む試料を、４℃で保存した。

ＲＮＡ調製
ＮＰに組み込む前に、ＲＮＡを、いくつかの方法のうちの１つで調製した。全腫瘍ＲＮＡを、腫瘍細胞から全ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む）を単離することによって調製した。全腫瘍ＲＮＡの逆転写によって生成されたｃＤＮＡテンプレートを使用してインビトロ転写反応を実行することにより、インビトロ転写されたｍＲＮＡを調製した。腫瘍抗原特異的及び非特異的ＲＮＡは、施設内で作製するか、又は供給業者から購入した。

全腫瘍ＲＮＡ：腫瘍細胞からの全腫瘍由来ＲＮＡ（例えば、Ｂ１６Ｆ０、Ｂ１６Ｆ１０、及びＫＲ１５８－ｌｕｃ）は、市販のＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示に基づいて単離した。

インビトロ転写されたｍＲＮＡ：簡単に説明すると、ＲＮＡは、製造業者の指示に従って市販のＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ｃＤＮＡライブラリーは、ＲＴ－ＰＣＲによって生成した。ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｔａｋａｒａ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを生成するために、ＰＣＲによる逆転写酵素反応を、全腫瘍ＲＮＡに対して実行した。次に、得られたｃＤＮＡを、Ｔ７／ＳＭＡＲＴ及びＣＤＳ ＩＩＩプライマーを含むＴａｋａｒａ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘを使用して増幅し、増幅サイクルの総数を、ゲル電気泳動で決定した。製造業者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して、ｃＤＮＡの精製を行った。各ＲＮＡナノ粒子ワクチンで使用するのに十分なｍＲＮＡを単離するために、Ｔ７酵素ミックスを有するｍＭＥＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを使用して、ｃＤＮＡライブラリー上でインビトロ転写を一晩行った。転写の忠実度を確保するため、ハウスキーピング遺伝子を評価した。次に、得られたｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキットで精製して、最終的なｍＲＮＡ産物を得た。

腫瘍抗原特異的及び非特異的ｍＲＮＡ：腫瘍抗原特異的ＲＮＡ（例えば、ｐｐ６５、ＯＶＡをコードするＲＮＡ）及び非特異的ＲＮＡ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡ）をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、制限酵素（すなわち、ＳｐｅＩ）を使用して線形化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅキットを用いて精製する。続いて、線形化されたＤＮＡを、ｍｍＲＮＡインビトロ転写キット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して転写し、ＲＮＡ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してクリーンアップした。代替的な方法では、非特異的ＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入される。

多層ＲＮＡナノ粒子（ＮＰ）の調製
ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰをＲＮＡと複合体化して、正に帯電した表面及び空のコアを備えた密にコイル状のリポソーム内に含まれるｍＲＮＡのいくつかの層を有するように設計された多層ＲＮＡ－ＮＰを作製した（図１Ａ）。簡単に説明すると、安全キャビネット中で、ＲＮＡを－８０℃から解凍し、次に、氷上に置き、ＰＢＳ及びＤＯＴＡＰを含む試料（例えば、ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰ）を室温に戻した。成分を調製したら、滅菌チューブ内で、所望の量のＲＮＡをＰＢＳと混合した。ＲＮＡ及びＰＢＳの混合物を含む滅菌チューブに、適切な量のＤＯＴＡＰ脂質ＮＰを、物理的に混合せずに（例えば、チューブを逆さにせずに、ボルテックスせずに、攪拌せずに）加えた。ＲＮＡ、ＰＢＳ、及びＤＯＴＡＰの混合物を、約１５分間インキュベートして、多層ＲＮＡ－ＮＰを形成させた。１５分後、チューブを繰り返し反転させることにより、混合物を穏やかに混合した。この時点で、混合物を、全身（すなわち、静脈内）投与の準備ができているとみなした。

上記の調製に使用されるＲＮＡ及びＤＯＴＡＰ脂質ＮＰ（リポソーム）の量は、事前に決定又は事前に選択される。いくつかの例では、約１μｇのＲＮＡ当たり約１５μｇのリポソームの比率が使用された。例えば、約５μｇのＲＮＡ当たり約７５μｇのリポソームが使用されるか、又は約２５μｇのＲＮＡ当たり約３７５μｇのリポソームが使用される。他の例では、１μｇのＲＮＡ当たり約７．５μｇのリポソームが使用された。したがって、例示的な例では、使用される全てのμｇのＲＮＡに対して、約１μｇ～約２０μｇのリポソームが使用される。

実施例２
この例は、本開示のナノ粒子の特徴付けを説明する。

極低温電子顕微鏡（Cryo-Electron Microscopy、ＣＥＭ）
ＣＥＭを使用して、実施例１に記載のように調製された多層ＲＮＡ－ＮＰ並びに「ＲＮＡ調製」及び「多層ＲＮＡナノ粒子（ＮＰ）の調製」の工程以外は実施例１の全ての工程に従って作製されたＲＮＡを含まない対照ＮＰ（未複合体化ＮＰ）の構造を分析した。ＣＥＭを、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ １７（３）１３２６－１３３５（２０１６）に本質的に記載されているように実行した。簡単に説明すると、多層ＲＮＡ－ＮＰ又は対照ＮＰを含む試料を、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（及びクライオＴＥＭ用の自動プランジフリーザー、これは、温度、相対湿度、ブロッティング条件及び凍結速度を制御することにより、氷晶の形成なしに試料を凍結する）中にロードして瞬間冷凍する前に、氷上に保持した。次に、試料を、Ｇａｔａｎ ＵｌｔｒａＳｃａｎ ４０００（４ｋ×４ｋ）ＣＣＤカメラを備えたＴｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｆ２０ ＴＷＩＮ ２００ｋＶ／ＦＥＧ透過型電子顕微鏡で画像化した。得られるＣＥＭ画像を、図１Ｂに示す。右のパネルは、多層ＲＮＡ－ＮＰのＣＥＭ画像であり、左のパネルは対照ＮＰ（未複合体化ＮＰ）のＣＥＭ画像である。図１Ｂに示すように、対照ＮＰは最大２層を含んでいたが、多層ＲＮＡ ＮＰは、複数の層を含んでいた。

ゼータ電位
多層ＲＮＡ ＮＰのゼータ電位を、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ １７（３）１３２６－１３３５（２０１６）に本質的に記載されるように、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰｌｕｓ装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、位相分析光散乱（ｐｈａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＰＡＬＳ）によって測定した。簡単に説明すると、未複合体化ＮＰ又はＲＮＡ－ＮＰ（２００μＬ）をＰＢＳ（１．２ｍＬ）に再懸濁し、機器にロードした。試料を、試料毎に５回、各実行で２５サイクル、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉモデルを使用して実行した。

実施例１に記載されるように調製された多層ＲＮＡ ＮＰのゼータ電位を、約＋５０ｍＶで測定した。興味深いことに、多層ＲＮＡ ＮＰのこのゼータ電位は、Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６（１）：ｅ１２５６５２７（２０１６）に記載されている、＋２７ｍＶ付近で測定されたものよりもはるかに高かった。特定の理論に縛られることなく、クロロホルムを蒸発させるための真空シール法を含む多層ＲＮＡ ＮＰの作製に使用するためにＤＯＴＡＰ脂質ＮＰを作製する方法（実施例１）は、ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰの少ない環境酸化をもたらし、これにより、より多量のＲＮＡがＤＯＴＡＰ ＮＰと複合体を形成し、かつ／又はＤＯＴＡＰ脂質ＮＰへのＲＮＡの取り込みがより増加することが可能になり得る。

ゲル電気泳動によるＲＮＡの取り込み：
ＭＬリポソームに組み込まれたＲＮＡの量を測定するために、ゲル電気泳動実験を行った。この実験に基づき、実施例１に記載された手順で使用されたＲＮＡの、全てではないにしても、ほぼ全てが、ＤＯＴＡＰ脂質ＮＰに組み込まれたことが定性的に示された。ＲＮＡ取り込みの程度を特徴付ける追加の実験は、ＲＮＡ－ＮＰ密度を測定し、このパラメータをリポプレックスのパラメータと比較することによって実行される。

実施例３
この実施例は、本開示のナノ粒子と、カチオン性ＲＮＡリポプレックス及びアニオン性ＲＮＡリポプレックスとの比較を記載する。

カチオン性リポプレックス（lipoplex、ＬＰＸ）を、外表面上にある正味の正電荷によってシールドされた脂質コアのｍＲＮＡを用いて最初に開発した（図２Ａ）。アニオン性ＲＮＡリポプレックス（図２Ｂ）を、二層リポソームの表面につながれた過剰なＲＮＡを用いて開発した。ＲＮＡ及び脂質ＮＰを、電荷を均等化する比率で混合することによって、ＲＮＡ－ＬＰＸを作製した。ＲＮＡ及び脂質ＮＰを、負電荷を有する脂質ＮＰを過飽和させる比率で混合することによって、アニオン性ＲＮＡ－ＮＰを作製した。次に、ＲＮＡ－ＬＰＸ及びアニオン性ＲＮＡ ＬＰＸの様々な態様を、上記の実施例に記載した多層ＲＮＡ ＮＰと比較した。

クライオ電子顕微鏡法（ＣＥＭ）を使用して、ＲＮＡ ＬＰＸ及び実施例１に記載されているように調製された多層ＲＮＡ－ＮＰの構造を比較した。未複合体化ＮＰを、対照として使用した。ＣＥＭを、実施例２に本質的に記載されているように実施した。図２Ｃは、未複合体化ＮＰのＣＥＭ画像、図２Ｄは、ＲＮＡ ＬＰＸのＣＥＭ画像（リポソームのＲＮＡに対するその質量比は３．７５：１）、図２Ｅは、多層ＲＮＡ－ＮＰのＣＥＭ画像（リポソームのＲＮＡに対するその質量比は１５：１である）。これらのデータは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰによってより多くのＲＮＡが保持されることを裏付ける。追加のデータは、ＲＮＡ ＬＰＸに対してより多くのＭＬ ＲＮＡ－ＮＰ複合体化を有する濃縮液滴が、質量又は電荷で等量のＲＮＡ及び脂質ＮＰ（すなわち、それぞれＲＮＡ－ＬＰＸ及びアニオン性ＲＮＡ－ＬＰＸ）を単純に混合することによっては観察されないＭＬ ＲＮＡ ＮＰの多層形成を裏付けることを示す。このことは、本明細書に記載のＭＬ ＲＮＡ－ＮＰによってより多くのＲＮＡが「保持」されることを裏付ける。

また、アニオン性ＬＰＸがマウスへの投与時にどこに局在するかを決定するために、実験を行った。アニオン性ＬＰＸは、投与時に動物の脾臓に局在した。

ＲＮＡ ＬＰＸ、アニオン性リポプレックス（ＬＰＸ）、又は多層ＲＮＡ－ＮＰをマウスに投与し、活性化ＤＣの評価のために１週間後に脾臓を採取した（^＊ｐ＜０．０５対応のないｔ検定）。この実験で使用したＲＮＡは、Ｋ７Ｍ２腫瘍骨肉腫細胞株に由来する腫瘍由来のｍＲＮＡであった。図２Ｆに示すように、多層ＲＮＡ ＮＰで処置されたマウスは、最高レベルの活性化ＤＣを示した。

アニオン性腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、及び多層腫瘍ｍＲＮＡをロードしたＮＰを、治療用肺がんモデル（Ｋ７Ｍ２）で比較した（ｎ＝５～８／群）。各ワクチンを、毎週静脈内投与した（ｘ３）（^＊＊ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）。ＣＤ８＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋を図２Ｇに示し、ＣＤ４＋脾細胞の％ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋を図２Ｈに示す。また、図２Ｊは、多層（ＭＬ）ＲＮＡ－ＮＰが、自然抗ウイルスサイトカインである実質的に増加したＩＦＮ－αを媒介することを示す。このことは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが、非抗原特異的ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰからでさえも有効性を促進するのに十分な、実質的により大きな自然免疫を可能にすることを示す。これらのデータはまた、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが、ＩＦＮ－αの最も重要な産生株である活性化された形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ｐＤＣ）の数を増加させることも間接的に裏付けている。まとめると、このデータは、アニオン性ＬＰＸ及びＲＮＡ ＬＰＸと比較して、多層腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰの優れた有効性を示している。

アニオン性腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、陽イオン性腫瘍ｍＲＮＡ－リポプレックス、及び多層腫瘍ｍＲＮＡをロードしたＮＰを、治療用肺がんモデル（Ｋ７Ｍ２）で比較した（ｎ＝８／群）。各ワクチンを毎週静脈内投与した（×３）、^＊ｐ＜０．０５、Ｇｅｈａｎ Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定。生存率を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線分析によって測定した。図２Ｉに示すように、多層腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰは、カチオン性ＲＮＡリポプレックス及びアニオン性ＲＮＡリポプレックスと比較して、生存率を高めるための優れた有効性を媒介した。

インビボでの自然免疫応答を活性化するための多層ＲＮＡ－ＮＰの能力をまた、神経膠腫腫瘍微小環境で調べた。

ＲＮＡ－ＮＰは腫瘍の血管周囲領域に局在し、活性化された骨髄細胞のためにＴＭＥを再プログラムする。Ｋ－ｌｕｃ保有動物（ｎ＝５／群）に、腫瘍ＲＮＡ－ＮＰ又はＮＰのみを接種した。ＲＮＡ－ｓｅｑ分析のために４８時間後に腫瘍を採取した。ＲＮＡ－ＮＰを投与された動物では、ＢＡＴＦ３、ＩＲＦ、及びＩＦＮ応答遺伝子についての遺伝子シグネチャーの顕著なアップレギュレーションが観察された。特に、本発明のＲＮＡ－ＮＰは、ＢＡＴＦ３（エフェクター樹状細胞表現型に関連する）、ＩＲＦ５及びＩＲＦ７（インターフェロン調節因子）、並びにＩＳＧ１５及びＩＦＩＴＭ３（インターフェロン応答遺伝子）の発現を顕著にアップレギュレートした。これらの遺伝子は、免疫療法の応答を感作させるために不可欠であることが示されている。そのため、ＲＮＡ－ＮＰは、エフェクター免疫応答に関連する神経膠腫腫瘍微小環境における重要な自然免疫遺伝子シグネチャーをアップレギュレートし、実際に腫瘍を「コールド」から「ホット」に変え、免疫チェックポイント阻害剤をＲＮＡ－ＮＰ処置前は効果がなかった場所で活性化できるようにする。

ここで、生理学的に関連する腫瘍抗原を標的とする多層ＲＮＡ－ＮＰ製剤は、アニオン性ＬＰＸ及びＲＮＡ ＬＰＸと比較して、免疫原性が高く（図２Ｆ～図２Ｈ、図２Ｊ）、有意により有効である（図２Ｉ）ことが示されている。特定の理論に縛られることなく、ＲＮＡ－脂質比を変更し、ゼータ電位を上昇させることにより、緊密に巻かれたｍＲＮＡの多層リングから構成される新しいＲＮＡ－ＮＰデザインが開発された（図１Ｃ）が、この多層デザインは、粒子の免疫原性を高め、インビボ局在化を末梢及び腫瘍微小環境（tumor microenvironment、ＴＭＥ）へ広げるために、ｍＲＮＡのＮＰ取り込みの増加（正／負の電荷を交互に繰り返すことによって濃縮される）を促進すると考えられる。これらの多層ＲＮＡ－ＮＰの全身投与は、リンパ節、細網内皮器官（すなわち、脾臓及び肝臓）並びにＴＭＥに局在化し、そこでＤＣを活性化する（ＣＤ１１ｃ＋細胞での活性化マーカーＣＤ８６の発現の増加に基づいて）。これらの活性化されたＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞応答をプライミングし、いくつかの腫瘍モデルで抗腫瘍効果（ＴＩＬの増加を伴う）をもたらす。

実施例４
この例は、パーソナライズされた腫瘍ＲＮＡ－ＮＰが、トランスレーショナルイヌモデルにおいて活性であることを示す。

多層ＲＮＡ－ＮＰの安全性及び活性を、悪性神経膠腫又は骨肉腫と診断されたクライアント所有のイヌ（ペットのイヌ）で評価した。イヌの悪性神経膠腫又は骨肉腫を、最初に、パーソナライズされた腫瘍ＲＮＡ－ＮＰワクチンの生成のために生検した。

パーソナライズされた多層ＲＮＡ ＮＰを生成するために、各患者の生検から全ＲＮＡ材料を抽出した。次に、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製し、次に、ｃＤＮＡライブラリーからｍＲＮＡを増幅した。次に、ｍＲＮＡをＤＯＴＡＰ脂質ＮＰと複合体化し、実施例１に実質的に記載されている多層ＲＮＡ－ＮＰにした。ＣＤ１１ｃ＋細胞上のＰＤ－Ｌ１、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の評価のために、血液を、ベースラインで、次に、ワクチン接種から２時間後及び６時間後に採取した。ＰＤ－Ｌ１、ＭＨＣ－ＩＩ、ＰＤＬ１／ＣＤ８０、及びＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８６のＣＤ１１ｃ発現を、イヌの最初の観察期間中に経時的にプロットする。ＣＤ３＋細胞を、イヌの最初の観察期間中にＣＤ４及びＣＤ８の割合について経時的に分析し、これらのサブセットを、活性化マーカー（すなわち、ＣＤ４４）の発現について評価した。これらのデータから、多層ＲＮＡ－ＮＰは、１）末梢ＤＣの活性化を示すＣＤ１１ｃ^＋末梢血細胞上のＣＤ８０及びＭＨＣＩＩの増加、並びに２）活性化Ｔ細胞の増加を誘発することが示された。

興味深いことに、投与後数時間以内に、腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰは、末梢血単核細胞の辺縁趨向を誘発し、この辺縁趨向は、治療後数日及び数週間で増加したが、このことは、ＲＮＡ－ＮＰが放出前に免疫細胞集団のリンパ球ホーニングを媒介することを示唆している。

これらのデータは、パーソナライズされたｍＲＮＡ－ＮＰが、トランスレーショナルイヌ疾患モデルで安全かつ活性であることを示す。

この方法で評価されたイヌの特定のデータを示す。３１ｋｇの雄のアイリッシュセッターを、多層ＲＮＡ－ＮＰを投与されることに飼い主の同意を得て、研究に登録した。腫瘍生検後、腫瘍ｍＲＮＡを首尾よく抽出及び増幅した。免疫応答を、最初のワクチンに応答してプロットした。データは、ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＤＣ）での経時的な活性化マーカーの増加を示す（図３Ａ）。データは、ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後の最初の数時間以内に活性化されるＣＤ８＋細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞）の増加を示す。これらのデータは、多層ＲＮＡ－ＮＰが、雄のアイリッシュセッターで免疫学的に活性であることを裏付ける。悪性神経膠腫と診断された雄のボクサーを、ＲＮＡ－ＮＰを投与されることに飼い主の同意を得て、研究に登録した。腫瘍生検後、腫瘍ｍＲＮＡを首尾よく抽出及び増幅した。免疫応答を、最初のワクチンに応答してプロットする（図３Ｂ）。データは、ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＤＣ）での経時的な活性化マーカーの増加を示す。図３Ｃに示すように、ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後の最初の数時間以内に、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞）の増加が観察された。これらのデータは、多層ＲＮＡ－ＮＰが雄のボクサー犬で免疫学的に活性であることを裏付けている。自然発生神経膠腫を有するイヌの治療からの追加の観察を、図３Ｅ～３Ｈに示す。図３Ｅは、ワクチン接種後の日に誘発されたリンパ球のパーセンテージを示し、これは、放出前の抗原教育のための辺縁趨向を示唆している。図３Ｆは、インターフェロンα産生の急増を示し、図３Ｇは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰの投与後数時間でのＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＣＤ８０発現の増加を示す。図３Ｈは、免疫学的により「活性な」環境への移行に注目した、ＣＤ８＋細胞及びＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞の発現を示す。このデータは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰを使用して、免疫療法に対してより応答する免疫環境に移行することを裏付けている。

毎週ＲＮＡ－ＮＰ（×３）を投与された後、悪性神経膠腫と診断されたイヌは、着実な経過をたどった。ワクチン接種後のＭＲＩは、増加した腫れ及び増強（いくつかの場合で）を伴う安定した腫瘍負荷を示したが、このことは、無症候性のイヌの免疫療法反応からの偽進行とより一致し得る。支持療法及び腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰ（切除なしの腫瘍生検後）のみを受けている悪性神経膠腫と診断されたイヌの生存率を図３Ｄに示す。図３Ｄでは、生存期間の中央値（点線で示されている）は約６５日であり、これは対症療法のみを受けているイヌの脳腫瘍患者のメタアナリシスから報告された。以前の研究では、イヌの脳星状細胞腫は７７日の全生存期間の中央値を有すると報告されている。パーソナライズされた多層ＲＮＡ ＮＰは、２００日を超える生存を可能にした。

初日のワクチン接種から６時間後に微熱が急増したことを除いて、パーソナライズされた腫瘍ＲＮＡ－ＮＰ（１×）は、安定した血球数、差違、腎機能及び肝機能検査で良好な耐容性を示した。今日までに、悪性脳腫瘍を有すると診断された４頭のイヌを治療した。これらのイヌは、悪性腫瘍に対して他の治療的介入を受けておらず（すなわち、手術、放射線又は化学療法なし）、評価された全ての患者が、偽進行又は安定した／より小さな腫瘍を伴う免疫応答を発生させたことを強調することが重要である。ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種後に、１匹のイヌを剖検した。この患者では、介入剤に関連すると考えられる毒性はなかった。

これらの結果は、他の抗腫瘍治療介入を受けていない対象について、悪性脳腫瘍を有するクライアント所有のイヌにおける腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰの安全性及び活性を示唆する。

実施例５
本実施例は、非抗原特異的多層（ＭＬ）ＲＮＡ ＮＰが、記憶を与え、腫瘍の再チャレンジをかわすのに十分な長さの抗原特異的免疫を媒介することを示す。

腫瘍接種により合計２回チャレンジされたが、ＧＦＰ ＲＮＡ若しくはｐｐ６５ ＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰ（各々腫瘍に非特異的である）、又は腫瘍特異的ＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで毎週１回（×３）のみ処置された長期生存マウス（例えば、約１００日間生存したマウス）を用いて、実験を行った。処置は、最初の腫瘍接種の直後及び２回目の腫瘍接種の約１００日前に行われた。対照マウス（未処置のマウス）はいずれも１００日まで生存しなかったため、同じタイプのマウスにＫ７Ｍ２腫瘍を接種することにより、新しい対照群のマウスを創出した。元の対照マウスと同様に、新しい対照群は、いずれの処置も受けなかった。長期生存者もまた、２回目の腫瘍接種後にいずれの処置も受けなかった。この実験のイベントのタイムラインを、図４Ａに示す。

注目すべきことに、３つの群全てのマウスは、２回目の腫瘍チャレンジを生き延びた長期生存者を含んでいた。図４Ｂ（２回目の接種後の期間のみを示す）に示すように、３つの群全てのマウスは、腫瘍移植後４０日まで生存する長期生存者を含んでいた（腫瘍接種の２回目の例）。興味深いことに、非特異的ＲＮＡ（ＧＦＰ ＲＮＡ又はｐｐ６５ ＲＮＡ）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで以前に処置された長期生存マウスのパーセンテージは、腫瘍特異的ＲＮＡ（２回目の腫瘍チャレンジの前に処置）を含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処置された群に匹敵する、２回目の腫瘍接種後４０日まで生存した。

これらのデータは、対象の腫瘍に非特異的なＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰが、腫瘍に特異的なＲＮＡを含むＭＬ ＲＮＡ ＮＰにより提供される治療的処置に匹敵する治療的処置を腫瘍に提供し、動物の生存率の増加したパーセンテージにつながることを裏付けている。

実施例６
この実施例は、ＭＬ ＲＮＡ ＮＰを免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与すると、腫瘍保有対象の生存率の大幅な増加につながることを示している。

ＩＣＩと組み合わせたＭＬ ＲＮＡ ＮＰの効果を試験するために、腫瘍保有Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ単独（ＲＮＡ ＮＰ）で、又は抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体（anti-PDL1 monoclonal antibody、ＰＤＬ１ ｍＡｂ）と組み合わせて、処置した。対照群には、未処置のマウス、いずれのＲＮＡもロードされていないナノ粒子（ＮＰのみ）、又はＰＤＬ１ ｍＡｂのみで処置されたマウスが含まれていた。腫瘍移植のために、マウス口腔扁平上皮がん（oral cavity squamous cell carcinoma、ＯＳＣＣ）細胞である約２００，０００ＭＯＣ－１細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの皮下に移植した。ナノ粒子を投与された群（ＭＬ ＲＮＡ ＮＰのみ、又はＰＤＬ１ ｍＡｂ若しくはＮＰのみと組み合わせた）については、腫瘍移植の２４時間以内にＮＰを静脈内注射し、次に、週１回更に２回注射した。ＩＣＩ（ＭＬ ＲＮＡ ＮＰ＋ＰＤＬ１ ｍＡｂ又はＰＤＬ１ ｍＡｂのみ）を投与されたマウスの群については、ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（４００μｇ）を腹腔内に注射し、続いて、ＮＰの３回目の投与まで週２回２００μｇを注射した。各群の生存マウスを、約１００日間の研究期間にわたってモニターし、各群の生存マウスのパーセンテージを、腫瘍移植後の時間の関数としてプロットした。結果を図５に示す。この図に示すように、ＩＣＩと組み合わせたＭＬ ＲＮＡ ＮＰで処置した生存マウスのパーセンテージは、いずれかの治療のみを受けたマウスよりもはるかに高かった。

実施例７
この実施例は、本開示のＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが、免疫学的に「コールド」な腫瘍、すなわち、ＩＣＩに応答しなかった腫瘍に対して抗腫瘍免疫応答を媒介することを示す。図６Ａ～６Ｃに示されるように、本開示のＭＬ ＲＮＡ－ＮＰを免疫チェックポイント阻害剤（ここでは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）とともに投与すると、ＲＮＡ－ＮＰ単独及びチェックポイント阻害剤単独の投与と比較して、黒色腫モデルにおいて腫瘍体積の減少がもたらされた。ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰの投与はまた、肉腫モデル及び転移性肺モデルでの対象の生存の増強をもたらした。このデータは、ＭＬ ＲＮＡ－ＮＰが免疫学的に「コールド」な腫瘍を再プログラムすることを確立するとともに、一連のがん及び腫瘍のタイプにわたってＭＬ ＲＮＡ－ＮＰの有効性を示している。

実施例８
本実施例は、ＣＡＲ Ｔ細胞プライミングに対する本開示のナノ粒子組成物の全身投与の影響を解明するための研究を説明する。

ＣＤ７０及びＧＤ２は、骨肉腫（osteosarcoma、ＯＳＡ）において発現される表面抗原である。ＣＤ７０－ＣＡＲ Ｔプラットフォームは、ＣＤ７０発現固形腫瘍に対して有望な抗腫瘍活性を示す。Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．，１０（１）：４０１６（２０１９）．インビトロ実験において、ＣＤ７０－ＫＲ１５８及びＣＤ７０－Ｋ７Ｍ２ ＯＳＡ腫瘍細胞に対する腫瘍特異的死滅が観察された。加えて、ＧＤ２発現ＯＳＡ細胞株（Ｋ７Ｍ２及びＭＯＳ－Ｊ）を標的とするＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞構築物を生成した。追跡実験において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、組織へのＣＡＲ Ｔ動員と良好に相関する表面標的（すなわち、ＣＤ７０）をコードするＲＮＡ－ＮＰと組み合わせた場合、確立された固形腫瘍の実質的な退縮を媒介することが示された（図８Ａ）。

ＣＡＲ特異的Ｔ細胞（移植の１週間後に投与）に対するＮＰ活性化ＡＰＣの効果を決定するために、Ｋ７Ｍ２保有マウス（肺ＯＳＡ転移をｉ．ｖ．接種）に、以前に説明されているように（Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６：ｅ１２５６５２７；ｄｏｉ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１６．１２５６５２７）、ＦＩＴＣで標識したＮＰにカプセル化した精製腫瘍ｍＲＮＡ（Ｋ７Ｍ２を発現するＣＤ７０に由来する）をワクチン接種した。２５μｇの腫瘍ｍＲＮＡ（Ｋ７Ｍ２由来）を伴う３７５μｇの本明細書に記載の脂質－ＮＰから構成されるＲＮＡ－ＮＰ（対ＮＰ単独又は対照ＲＮＡ－ＮＰ）を、ＣＡＲ Ｔ細胞投与の２４時間後から開始して毎週（×３）ｉｖ投与した。ＣＡＲ導入遺伝子発現を末梢血から評価した。最後のワクチンの１週間後、関連性のあるＦＩＴＣ＋ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６＋ＭＨＣ＋細胞）を、脾臓、腫瘍流入領域リンパ節（tumor draining lymph node、ｔＤＬＮ）及びＯＳＡ腫瘍から選別した（ＦＡＣＳｏｒｔ；ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩ）。次に、ＲＮＡ－ＮＰトランスフェクトＤＣを、ＣＡＲ Ｔ細胞とともに培養し、Ｔ細胞を、増殖、表現型（エフェクター対中央メモリー）、機能、及び細胞傷害性について評価した。Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによってＣＦＳＥ希釈を介して評価した。エフェクター／中央メモリー細胞の表現型を、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの示差染色によって決定した。これらのＴ細胞を、ビーズアレイ（ＢＤ）によるＴｈ１サイトカイン（すなわち、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γ）の検出のために上清を採取する前に、合計２サイクル再刺激した。抗原特異性を決定するために、Ｔ細胞を、Ｋ７Ｍ２（表面標的を発現する、ＧＦＰ又はルシフェラーゼでトランスフェクトしたもの）又は対照腫瘍（Ｂ１６Ｆ１０－ＧＦＰ、Ｋ７Ｍ２を発現する非表面標的）の存在下でインキュベートし、細胞傷害性死滅について評価した。生存腫瘍細胞の代用としての、各共培養におけるＧＦＰ又はルシフェラーゼの量を、フローサイトメトリー及び生物発光によって定量的に測定した。このタイプのアッセイの代表的な結果を、ＲＮＡ－ＮＰを使用した脾臓及び肝細胞の形質導入を示す図１３Ａ、並びに腫瘍細胞、ＲＮＡ－ＮＰ、及びＣＡＲ Ｔ細胞を使用した研究に対応する図１３Ｂに示す。

腫瘍へのＤＣの動員は、典型的には、ＩＤＯ、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの増加、及び免疫調節性サイトカインの分泌を特徴とする調節表現型と関連付けられる。ＤＣの腫瘍内効果を決定するために、腫瘍ｍＲＮＡ－ＮＰを伴う又は伴わないＣＡＲ Ｔ細胞（対ＮＰ単独又は対照ＲＮＡ－ＮＰ）を、Ｋ７Ｍ２保有ＩＦＮ－γレポーターマウスに、ＤＣ枯渇ｍＡｂ（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）を伴って又は伴わずに、週１回（×３）投与する。活性化及び制御性Ｔ細胞を、連続した時点（６時間、１日、７日、及び２１日）で、腫瘍内微小環境で経時的に調べる。以前に説明されているように（Ｓａｙｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ，１８（１０）：６１９５－２０６（２０１８））エフェクターＴ細胞を特徴付けてもよく、Ｔｒｅｇを、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、及びＣＤ４の発現によって表現型決定する。非枯渇動物由来のＤＣを、多重サイトカイン、ケモカイン（すなわち、ＩＬ－２、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－Ｉ／ＩＩ、ＭＩＰ－１－アルファ／ベータ）、活性化マーカー（すなわち、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０）、細胞溶解性マーカー（すなわち、ＴＲＡＩＬ、グランザイムｂ）、及び調節マーカー（すなわち、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＤＯ）の発現について、ＦＡＣＳｏｒｔ及び表現型決定する。腫瘍細胞による免疫表現型の変化も評価する（すなわち、ＭＨＣ－Ｉ、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰα）。

実施例９
本実施例は、ＯＳＡ腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＡＲ Ｔ細胞輸送及び持続性に対する機構的基盤を調べるための研究を説明する。

ＲＮＡ－ＮＰは、Ｔ細胞上のＬＦＡ－１及びＣＣＲ２を、インターフェロン－Ｉ依存性の様式でアップレギュレートする。これらの知見は、ＲＮＡワクチンを受けた大型動物における末梢血からのリンパ球及び単球の大量の動員と相関する。高悪性度ＯＳＡは、低悪性度ＯＳＡと比較して増加したレベルのＣＣＬ２を発現するので、このアプローチは、ＣＡＲ Ｔ細胞療法をＯＳＡ ＴＭＥへと駆動し、抗腫瘍活性及び持続性の増強をもたらし得る。

以降の研究は、ＲＮＡ－ＮＰワクチン接種前後のＣＡＲ Ｔ細胞のケモカイン受容体、Ｓ１Ｐ１、及びＶＬＡ－４／ＬＦＡ－１発現プロファイルを調べるために役立つ。この方法論により、リンパ器官からのＴ細胞放出に必要なスフィンゴシン－１－リン酸受容体１（sphingosine-1-phosphate receptor 1、Ｓ１Ｐ１）、及びＴＭＥへのＴ細胞通過に必要なインテグリン（すなわち、ＶＬＡ－４、ＬＦＡ－１）を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞輸送分子に対するＲＮＡ－ＮＰの効果の評価が可能になる。Ｋ７Ｍ２保有ＩＦＮ－γレポーターマウスに、ＣＡＲ Ｔ細胞単独又はＲＮＡ－ＮＰと組み合わせたＣＡＲ Ｔ細胞を投与する。最後のワクチン接種から１週間後、レシピエントマウスを人道的に安楽死させ（ＣＯ_２により）、脾臓、ｔｄＬＮ、骨髄、及び腫瘍を採取する。臓器を消化させ、脾臓、リンパ節、骨髄、及び腫瘍からのＣＡＲ Ｔ細胞を、標的抗原の表面発現によって、並びにエフェクター及び中央メモリーＴ細胞（すなわち、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４マーカー）についての示差染色によって、連続した時点（７、１４、及び２１日目）で識別する。ＣＤ４及びＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞からのＴｈ１関連ケモカイン受容体（すなわち、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、及びＣＸＣＲ３）、Ｓ１Ｐ１発現、ＶＬＡ－４、及びＬＦＡ－１発現（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、マルチパラメータフローサイトメトリー及びＩＨＣによって評価する。

以降の研究は、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ及びインビボ遊走、並びにＯＳＡ ＴＭＥにおける持続性に対するＲＮＡ－ＮＰの効果を調べるために役立つ。インビトロ：Ｋ７Ｍ２腫瘍保有ナイーブ、ＬＦＡ－１、ＣＣＬ２、又はＣＣＲ２ ＫＯ動物（Ｂ６トランスジェニック、Ｊａｃｋｓｏｎ）に、ＲＮＡ－ＮＰ有り又は無しでＣＡＲ Ｔ細胞（対ＮＰ単独又は対照ＲＮＡ－ＮＰ）を毎週（×３）投与する。最後のワクチンの１週間後、Ｔ細胞を、ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒを介してＦＡＣＳｏｒｔする。これらのＴ細胞を、トランスウェルアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）において遊走能について評価し得る。簡単に説明すると、Ｔ細胞を、Ｋ７Ｍ２－ＧＦＰ腫瘍細胞の層の間に透過膜を有する細胞培養インサートの上層に置く。遊走を、層間を移動するセルの数によって評価する。Ｔ細胞を、腫瘍細胞（４×１０^６／ｍＬ）（×４８時間）との共培養のために、ＩＬ－２（１マイクログラム／ｍＬ）有り又は無しで、１ｍＬ当たり４×１０^６の濃度で、Ｔ細胞培地にプレーティングした後、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ－γを決定する。生存腫瘍細胞の代用として、各共培養におけるＧＦＰの量を、フローサイトメトリー分析及び生物発光によって定量的に測定する。インビボ：Ｋ７Ｍ２保有ＩＦＮ－γレポーターマウス、又はＬＦＡ－１若しくはＣＣＬ２遮断ｍＡｂ（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）を受けているＩＦＮ－γレポーターマウスに、ＲＮＡ－ＮＰ有り又は無しでＣＡＲ Ｔ細胞（対ＮＰ単独又は対照ＲＮＡ－ＮＰ）を毎週（×３）投与する。ＴＭＥへのインビボ通過を、連続した時点（第１のワクチンから５日目、１０日目、１５日目、２０日目）でのＯＳＡ腫瘍（脾臓、リンパ節、骨髄と比較して）中のＣＡＲ Ｔ細胞のパーセンテージ及び絶対数から評価する。抗原特異的なＴ細胞の細胞傷害性アッセイを、上記のように実施する。

実施例１０
本実施例は、大型動物ＯＳＡモデルにおいて全身ワクチン接種を行った場合と行わなかった場合のＣＡＲ Ｔ細胞の免疫学的活性を調べるための研究を説明する。

ＯＳＡ（天然にＣＤ７０を発現した）を有する２頭のイヌをＲＮＡ－ＮＰで処置し、ＣＡＲで形質転換したイヌＴ細胞を生成した。注目すべきことに、１頭のＯＳＡ患者が生存し続ける。ＯＳＡを有するイヌにおいて、投与後数時間以内に、腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰは、末梢血単核細胞の辺縁趨向を誘発し、この辺縁趨向は、治療後数日及び数週間で増加した（図９Ａ～Ｃ）が、このことは、ＲＮＡ－ＮＰが放出前に免疫細胞集団のリンパ球ホーニングを媒介することを示唆している。ＲＮＡ－ＮＰはまた、１）２時間で急増した血清ＩＦＮ－α、２）ＣＤ１１ｃ＋末梢血細胞上のＣＤ８６、ＰＤ－Ｌ１、及びＭＨＣＩＩ（末梢ＤＣの活性化を示す）、並びに３）活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ、における増加も誘発した。

以降の研究は、ＯＳＡのイヌモデルにおけるＲＮＡ－ＮＰ及びＣＡＲ Ｔ細胞の併用療法を調べる。転移性ＯＳＡを有するイヌのための日常的な標準治療は、緩和（生検なし）を伴い、一様に致死的である。転移性ＯＳが疑われるイヌ（画像化に基づく）を登録する。次いで、イヌは、組織病理学による疾患の確認のためのスクリーニングＣＴガイド下生検、及びＧＤ２又はＣＤ７０発現についてのスクリーニングを受ける。患者が適格性を満たす場合、本発明者らは、ＧＤ２又はＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造し、これら（１×１０^７細胞／ｋｇ）を腫瘍特異的ＲＮＡ－ＮＰと併せて投与する。パーソナライズした腫瘍ｍＲＮＡの妥当性確認は、ゲル電気泳動、ナノドロップ分光光度法、及び生物分析によるＲＮＡの品質、濃度、及び完全性に基づいて決定される。生検及び末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）収集の２週間後に、ＣＡＲ Ｔ細胞単独又はＣＡＲ Ｔ細胞及びＲＮＡ－ＮＰ（１時間間隔）を、登録されたイヌに与える。イヌからの末梢検査所見及び血清サイトカイン（すなわち、ＩＦＩ－Ｉ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α）を、診断時、各隔週ＲＮＡ－ＮＰワクチン（×３）の直前、及び毎月の処置後追跡調査の間に、モニタリングする。

以降の研究は、ＯＳＡと診断されたイヌにおける末梢ＤＣ及びＣＡＲ Ｔ細胞活性化表現型を調べる。

免疫療法応答に関する生物学的相関を同定することは、新しい免疫療法の開発を阻んでいる重要な課題であった。免疫応答又は耐性に必要なＤＣ及びＣＡＲ Ｔ細胞表現型は、以下のように調べることができる。簡単に説明すると、診断時及び各ワクチン接種の直前に、１０～５０ｍＬのイヌ末梢血をバキュテナーチューブに採取する。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌを介した密度勾配遠心分離によって分離する。活性化マーカー（すなわち、ＣＤ１１ｃ＋細胞上のＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＭＨＣＩＩ）の決定のために、ＰＢＭＣからのＤＣを毎週評価する。ＣＡＲ導入遺伝子発現を評価する。Ｔ細胞リンパ球を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ２、ＣＤ６９、ＬＦＡ－１、及びＰＤ－１の表面発現について分析し、細胞内染色を、ＦｏｘＰ３及びＩＦＮ－γについて行う。分析は、多色フローサイトメトリーを使用してモニタリングする。有効性を評価するために、腫瘍成長をＣＴ画像化に基づいて決定する（ＲＮＡ－ＮＰ後２週目及び４週目、並びにその後３か月毎）。免疫回避機構を、剖検を介して得られた腫瘍（すなわち、チェックポイントリガンドの発現、ＩＤＯ、ＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーション）において、及びＯＳＡ ＴＭＥ（すなわち、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ、及びＴＡＭ）内で調べた。腫瘍中及びＴＭＥ内の回避機構は、マルチパラメータフローサイトメトリー（ＬＳＲ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって行われる。

本明細書に引用される刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示を記載している文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本発明の態様が特徴を「含むこと」として記載される場合、実施形態も特徴「からなる」又は「から本質的になる」と企図される。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各終点を個々に言及する省略法としての役割を果たすことが単に意図され、各別個の値及び終点は、本明細書において個々に列挙されているのと同程度に本明細書に組み込まれる。動作例を除いて、又は別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数字は、「約」という用語は関連する分野の当業者によって解釈されるため、「約」という用語によって全ての場合に修飾されると理解されるべきである。

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示の理解をより容易にすることを意図しており、別段の主張がない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本開示を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が、本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の明細書を読む際に当業者には明らかになり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変形形態を採用することを予想し、本発明者らは、本開示が本明細書に具体的に記載されているもの以外の変形形態で実施されることを意図している。したがって、本開示は、準拠法によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題の全ての修正形態及び均等物を含む。更に、それらの全ての可能な変形形態における上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、本開示によって包含される。

Claims (48)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のために対象をプレコンディショニングする方法であって、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物を、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を前記対象に施す少なくとも１日前に、前記対象に投与することを含む、方法。
2. 前記組成物が、前記ＣＡＲ Ｔ細胞療法を前記対象に施す２～１４日前に投与される、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が、前記ＣＡＲ Ｔ細胞療法を前記対象に施す約５～約８日前に投与される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記対象が、前記ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す前２１日以内にリンパ球枯渇療法を施されない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記対象が、固形腫瘍に罹患している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記対象が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）耐性悪性腫瘍に罹患している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記対象が、難治性悪性腫瘍に罹患している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記対象が、悪性脳腫瘍に罹患している、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記悪性脳腫瘍が、膠芽腫、髄芽腫、びまん性内在性橋膠腫、又は中枢神経系への転移性浸潤を伴う末梢腫瘍である、請求項８に記載の方法。
10. 前記対象が、再発性又は転移性骨肉腫に罹患している、請求項５に記載の方法。
11. 前記ナノ粒子が、少なくとも３つの核酸層を含み、それらの各々が、カチオン性脂質二重層間に配置される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ナノ粒子の最外層が、カチオン性脂質二重層を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記表面が、前記カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記コアが、カチオン性脂質二重層を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記コアが、約０．５重量％未満の核酸を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ナノ粒子が、約４０ｍＶ～約６０ｍＶのゼータ電位を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ナノ粒子が、約４５ｍＶ～約５５ｍＶのゼータ電位を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰ又はＤＯＴＭＡである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ｍＲＮＡが、腫瘍ｍＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ｍＲＮＡが、インビトロ転写ｍＲＮＡであり、インビトロ転写テンプレートが、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ｍＲＮＡが、前記ＣＡＲ Ｔ細胞によって標的とされる腫瘍抗原をコードしない、請求項１９に記載の方法。
23. 前記ｍＲＮＡが、腫瘍ｍＲＮＡではない、請求項１９に記載の方法。
24. 前記ナノ粒子が、中性脂質を含まない、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置される、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第２の組成物を、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施した後に、投与することを更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記第２の組成物の前記核酸が、腫瘍ｍＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ｍＲＮＡが、インビトロ転写ｍＲＮＡであり、前記インビトロ転写テンプレートが、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである、請求項２６に記載の方法。
28. 対象において固形腫瘍を治療する方法であって、表面抗原陰性固形腫瘍を含む対象に、正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置され、前記核酸が前記表面抗原をコードする、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第１の組成物と、前記表面抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を含む第２の組成物と、を投与することを含む、方法。
29. 前記第１の組成物が、前記第２の組成物の少なくとも１日前に投与される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記第１の組成物が、前記対象に前記第２の組成物を投与する２～１４日前に少なくとも１回投与される、請求項２８に記載の方法。
31. 前記対象が、前記ＣＡＲ Ｔ細胞療法を施す前２１日以内にリンパ球枯渇療法を施されない、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記固形腫瘍が、肺、肝臓、骨、脾臓、又はリンパ節に存在する、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記対象が、再発性又は転移性骨肉腫に罹患している、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ナノ粒子が、少なくとも３つの核酸層を含み、それらの各々が、カチオン性脂質二重層間に配置される、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ナノ粒子の最外層が、カチオン性脂質二重層を含む、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記表面が、前記カチオン性脂質二重層のカチオン性脂質の複数の親水性部分を含む、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記コアが、カチオン性脂質二重層を含む、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記コアが、約０．５重量％未満の核酸を含む、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記ナノ粒子が、約４０ｍＶ～約６０ｍＶのゼータ電位を含む、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記ナノ粒子が、約４５ｍＶ～約５５ｍＶのゼータ電位を含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰ又はＤＯＴＭＡである、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項２８～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記ナノ粒子が、中性脂質を含まない、請求項２８～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記第２の組成物の投与後に前記第１の組成物を投与することを含む、請求項２８～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 正に帯電した表面と、（ｉ）コア、及び（ｉｉ）少なくとも２つの核酸層であって、各核酸層がカチオン性脂質二重層間に配置され、前記核酸が、前記表面抗原をコードしない、少なくとも２つの核酸層を含む、内部とを含む、ナノ粒子を含む第３の組成物を投与することを更に含む、請求項２８～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記第３の組成物の前記核酸が、腫瘍ｍＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
47. 前記第３の組成物の前記核酸が、腫瘍ＲＮＡではない、請求項４５に記載の方法。
48. 前記表面抗原が、ＣＤ７０である、請求項２８～４７のいずれか一項に記載の方法。