KR20110077818A

KR20110077818A - 폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20110077818A
Application number: KR1020090134481A
Authority: KR
Inventors: 김세호; 손지연; 나문호; 최성원; 서민효
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2011-07-07
Also published as: KR101296326B1

Abstract

유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 지질; 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물과 그 제조방법이 개시된다. 상기 음이온성 약물 전달용 조성물은 음이온성 약물의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있으며, 세망내피계 회피가 향상되어 음이온성 약물을 조직으로 효율적으로 전달하여 약효를 발휘하게 할 수 있다는 장점이 있다.

음이온성 약물, 핵산, siRNA, 양이온성 지질, 양친성 블록 고분자, 약물 전달체

Description

폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물 및 그 제조 방법{Composition for Delivery of Anionic Drugs Containing Poly-lactic Acid and Preparation Method thereof}

본 발명은 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 지질; 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.

음이온성 약물, 특히 핵산 물질을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 특히, 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체, 및 양이온성 지질, 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체를 이용한 전달기술들이 개발되어 왔다.

그러나, 바이러스를 이용한 전달체를 이용하는 기술은, 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 양이온성 지질이나 양이온성 고분자를 이용하는 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 이러한 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.

핵산 물질의 전달에 이용되는 비바이러스성 전달체에 대해서 많은 연구가 이루어졌는데, 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 많은 연구가 진행되어 왔다 (De Paula D, Bentley MV, Mahato RI, Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting, RNA 13 (2007) 431-56; Gary DJ, Puri N, Won YY, Polymer-based siRNA delivery: Perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery, J Control release 121 (2007) 64-73).

그러나, 이제까지 연구된 양이온성 지질 또는 폴리양이온성 고분자들은, 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에, 바이러스성 전달체보다는 덜하 지만, 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당한 결과를 나타내었다. 또한, 양이온성 지질과 핵산의 결합을 통해 착화합물을 이루어 세포 내로 핵산을 전달시키는 지질-핵산 복합체의 경우는 세포주 실험에서는 매우 광범위하게 이용되지만, 혈중에서의 안정성을 가질 수 있는 구조를 나타내지 못하기 때문에 생체 내에서 이용하기에는 불가능하다 (US6,458,382 참고).

생체 내에서 핵산을 세포내로 전달하기 위하여 흔히 사용되는 비바이러스성 전달체 중 하나인 핵산-양이온성 리포좀 착물 혹은 핵산을 포함하는 양이온성 리포좀은 양친성 지질, 중성 지질 및 용해성 지질 (fusogenic lipid) 등으로 구성되어 있고 핵산 물질이 리포좀 외부에 정전기적 결합으로 부착되어 있거나 내부에 포획되는데 (US2003-0073640, WO05/007196, US2006-0240093), 이러한 리포좀 전달체는 세망내피계 (RES; reticuloendothelial system)에 쉽게 포획되며 상당한 독성의 부작용을 나타낼 수 있어 전신 적용에 적합하지 않다. 또한, 리포좀 전달체과 더불어 가장 많이 사용되고 있는 비바이러스성 전달체는 양이온성 고분자를 포함하는 전달체로서 고분자 당 다가(multivalent)의 양이온 전하를 포함하는 폴리양이온성 고분자가 주로 사용된다. 특히 흔히 사용되고 있는 고분자는 폴리양이온성 폴리에틸렌이민(PEI, polyethylenimine)으로서, 이러한 폴리양이온성 고분자는 핵산 물질과 정전기적 결합을 통해 결합하여 핵산-고분자 복합체를 이루어 나노 입자를 형성하게 된다. 그러나 이러한 폴리에틸렌이민과 같은 폴리양이온성 고분자들은 세포사멸을 촉진하고, 이러한 세포독성은 고분자의 분자량과 분지도(degree of branching)가 커질수록 증가하는 것으로 알려져 있다. 낮은 분자량의 폴리양이온 성 고분자들은 세포독성은 낮은 것으로 알려져 있으나, 고분자 내의 양이온 밀도가 낮아 핵산과 효과적인 복합체를 형성하지 못하고, 따라서 세포내 전달이 잘 이루어지지 않으며 핵산의 안정성 증가에 크게 기여하지 못하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서, 혈중 및 체액 내에서 안정하고, 세포내 전달이 가능하여 충분한 효과를 얻을 수 있는 음이온성 약물 전달 기술의 개발이 필요하다. 또한, 핵산 물질 자체에 지질 혹은 고분자를 직접 접합시킨 후, 미셀이나 다른 고분자와 복합체를 이루게 하여 나노 입자를 형성시키는 연구도 진행되고 있는데, 핵산 물질에 직접 지질 혹은 고분자를 접합시키는 경우에는 접합 효율이나 품질 관리의 측면에서 어려움을 가지고 있으며 아직까지 명확하게 핵산 전달의 효율에 있어서는 검증이 되어 있지 않다.

한편, 양친성 블록 공중합체를 이용하여 고분자 미셀의 형태로 난용성 약물을 가용화하고 수용액상에서 안정하게 함으로써 약물 전달체로서 이용하려는 노력이 다양하게 진행되었다 (한국 등록특허 제0180334호). 그러나, 이러한 양친성 블록 공중합체는 내부에 소수성을 띄는 고분자 미셀을 형성함으로써 소수성을 띄는 난용성 약물을 가용화할 수는 있지만, 음이온을 띄는 핵산 등의 친수성 약물은 고분자 미셀 내부에 봉입할 수 없으므로, 이들 핵산을 포함하는 음이온성 약물의 전달에는 적당하지 않다.

한편, 많은 질병은 여러 요인으로 인하여 질병 유전자의 발현이 증가하거나 돌연변이에 의해 비정상적인 활성이 나타남으로써 발생하게 된다. siRNA(short interfering RNA)는, 전사 후 공정에서 서열 특이적으로 특정 유전자의 발현을 억제하므로, 유전자 치료제로서 많은 관심이 집중되고 있다. 특히, siRNA의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해, 기존의 안티센스 뉴클레오티드나 리보자임 등의 문제점을 해결할 수 있는 핵산 치료제로 기대되고 있다. siRNA는 15 개 이상 30 개 미만의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기 서열이 상보적인 유전자의 mRNA를 절단함으로써 해당 유전자의 발현을 억제시킨다 (McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737 (2002); Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001).

그러나, 이러한 장점에도 불구하고, siRNA는 혈중에서 핵산 분해 효소에 의해 빠르게 분해되고, 신장을 통하여 빠르게 체외로 배설되는 것으로 알려져 있다. 또한 siRNA는 강한 음전하를 띄어 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 것으로 알려져 있다. 따라서 siRNA를 치료제로 사용하기 위해서는 siRNA를 혈액에서 안정화시키고, 목표로 삼은 조직이나 세포 안으로 효율적으로 전달할 수 있으며, 독성을 나타내지 않는 전달체의 개발이 필요하다.

본 발명의 일례는 폴리락트산을 함유하여 음이온성 약물을 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 미셀 구조체를 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 예는 상기와 같은 음이온성 약물을 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 미셀 구조체를 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물은,

유효성분으로서 음이온성 약물;

양이온성 지질;

양친성 블록 공중합체; 및

폴리락트산

을 포함하는 미셀 구조체를 포함하며,

상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 이와 같이 형성된 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산에 의하여 형성된 미셀 구조 내부에 봉입되는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 물에 용해가 가능하고, 폴리락트산을 포함함으로써, 체내 주입시 세망내피계(RES)를 회피하여 표적 부위, 구체적으로 암조직으로의 전달 효율 이 우수하므로, 세망내피계(RES) 회피 및/또는 표적화 증진 용도로도 유용하다.

상기 조성물은 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.

일례에서, 본 발명에 따른 미셀 구조체를 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법은

(a) 음이온성 약물과 양이온성 지질을 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 용해하여 상분리시키는 공정;

(b) 상기 (a) 공정의 유기용매층을 분리하는 공정;

(c) 상기 (b) 공정의 유기용매층에 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 혼합하고 유기용매를 제거하는 공정; 및

(d) 상기 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명에 따른 조성물의 제조 방법은

(i) 음이온성 약물, 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 용해시키는 공정;

(ii) 상기 (i) 공정의 유기용매를 제거하는 공정; 및

(iii) 상기 (ii) 공정에서 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정

을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

일실시예에서, 상기 음이온성 약물과 양이온성 지질은 정전기적 상호작용에 의해 음이온성 약물과 지질과의 복합체를 이룬 상태에서, 양친성 블록 고분자의 미셀 구조 내부에 봉입된다.

본 발명의 일실시예에 따른 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체가 봉입된 고분자 미셀 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, 음이온성 약물은 양이온성 지질과 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 형성한다. 형성된 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체는, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산에 의해 형성되는 미셀 구조 내에 봉입된다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산에 의해 형성되는 미셀 구조는 수성 환경에서 양친성 블록 공중합체의 친수성 부분이 미셀의 외벽을 형성하고 양친성 블록 공중합체의 소수성 부분과 상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 함유된 폴리락트산이 내벽을 형성하고, 그 내부에 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체가 봉입된 구조이다.

상기 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체는 본 발명 고분자의 미셀 구조 내에 봉입된 상태에서, 혈중 또는 체액 내에서 안정성이 향상된다. 일실시예에서, 상기 미셀의 입자 크기는, 10 내지 200 m이며, 더욱 구체적으로는 10 내지 150nm인 것이 좋다. 상기 입자 크기는, 미셀 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량을 고려한 것이며, 체내에서 음이온성 약물의 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성을 고려하여 최적의 범위를 선정한 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 음이온성 약물은 수용액 중에서 분자 내에 음전 하를 띄는 약리학적 활성을 가진 모든 물질을 포함하는 개념이다. 일실시예에서, 상기 음이온성은, 카르복시기, 포스페이트기 및 설페이트기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기로부터 부여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 또는 헤파린 등의 다중 음이온성 약물 또는 핵산일 수 있다.

또 다른 일실시예에서, 상기 핵산 물질은, 디옥시리보 핵산, 리보 핵산 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산 약물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme) 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다. 구체적으로, 핵산의 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스 염기의 2'-OH 위치에 메틸기, 메톡시에틸기, 불소 등의 다양한 작용기가 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수 식될 수 있다. 예를 들어, siRNA의 경우 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 또는 3' 말단, 또는 양 말단에 수식될 수 있으며, 바람직하게 센스 가닥의 말단에 수식될 수 있다.

상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.

상기 siRNA는, 표적 유전자와 동일한 세포에 존재하는 경우에 siRNA의 서열에 상보적인 mRNA의 분해를 매개함으로써, 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 이중가닥 RNA(duplex RNA), 또는 단일가닥 RNA 내부에서 이중가닥의 형태를 띄는 단일가닥 RNA를 지칭한다. 이중가닥 사이의 결합은, 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지며, 이중가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 서로 결합해야 하는 것은 아니며, 상기 양 가닥은 분리되어 있거나(separate) 분리되어 있지 않을 수 있다. 일실시예에서, 상기 siRNA의 길이는 약 15~60 개의(이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다.) 뉴클레오티드이며, 구체적으로는, 약 15~30 개의 뉴클레오티드이고, 보다 구체적으로는 약 19~25 개의 뉴클레오티드인 siRNA를 포함한다.

일실시예에서, 이중가닥 siRNA는 3' 또는 5' 말단에 1-5 뉴클레오티드의 돌출부(overhang)를 한쪽 말단에, 또는 양쪽 말단에 가질 수 있다. 또 다른 예에서는 양 말단이 돌출부를 갖지 않는 블런트(blunt) 형태일 수 있다. 구체적으로는 US20020086356, US7056704에 개시된 siRNA일 수 있다 (상기 문헌은 본 명세서에 참 조로서 포함된다).

또한, 일실시예에서, siRNA는 두 가닥의 길이가 동일한 대칭적인 구조를 갖거나, 한 가닥이 다른 가닥보다 짧은 비대칭적인 이중가닥 구조일 수 있다. 구체적으로, 19~21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스 (antisense); 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15~19nt의 센스(sense);로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5' 방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3' 말단에 1-5 뉴클레오타이드 돌출부(overhang)를 갖는 비대칭 siRNA일 수 있다. 구체적으로 WO09/078685에 개시된 siRNA일 수 있다.

본 발명의 음이온성 약물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 음이온성 약물의 함량이 0.001 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%을 초과하면, 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.

일실시예에서, 상기 양이온성 지질은, 음이온성 약물과 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입된다. 따라서, 상기 양이온성 지질은 음이온성 약물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 지질 종류일 수 있으며, 예컨대, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로 라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민 (COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 구체적으로, 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 분자당 수용액 상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N- (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

본 발명의 양이온성 지질은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.01 내지 50중량%, 구체적으로는 0.1 내지 10중량% 포함될 수 있다. 상기 양이온성 지질의 함량이 0.01% 미만이면 음이온성 약물과 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50중량%을 초과하면, 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.

상기 양이온성 지질과 음이온성 약물은, 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 형성한다. 일실시예에서, 상기 음이온성 약물(N)과 양이온성 지질(P)의 전하량의 비율(N/P; 음이온성 약물의 음이온 전하에 대한 양이온성 지질의 양이온 전하 비율)은, 0.1 내지 128이며, 구체적으로는 0.5 내지 32이고, 더 구체적으로는 1 내지 16, 보다 더 구체적으로는 6 내지 16인 것이 좋다. 상기 비율(N/P)이 0.1 미만인 경우에는 충분한 양의 음이온성 약물을 포함하는 복합체를 형성하기 어렵기 때문에, 0.1 이상이어야 충분한 양의 음이온 약물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율(N/P)이 128 초과시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 128 이하로 하는 것이 좋다.

일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수용액 상에서, 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 미셀을 형성한다.

일실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로는, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다.

또한, 필요에 따라 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기, 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 고분자 미셀 전달체의 체내 분포를 조절하거나 고분자 미셀 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로 아니사마이드 (anisamide), 비타민 B9 (엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2- 온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다. 또한, 소수성 블록의 소수성을 증가시키켜 미셀의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시킬 수 있다.

상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 40 내지 99.98중량%이며, 구체적으로는 85 내지 99.8중량%, 더 구체적으로는 90 내지 99.8중량%인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 40 중량% 미만이면 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 99.98 중량%를 초과하면 함입할 수 있는 음이온성 약물의 함량이 너무 적어지게 된다.

또 다른 일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 40 내지 70중량%, 구체적으로는 50내지 60중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 40중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 미셀을 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 미셀을 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 40중량% 이상인 것이 좋은 한편, 70중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아서 고분자 미셀의 안정성이 낮아서 음이온성 약물/양이온성 지 질 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 미셀 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 70중량% 이하인 것이 좋다.

일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체는 수용액 상에서 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 미셀 구조 내부에 봉입시키는데, 이 때 양친성 블록 공중합체의 중량(b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율[a/b X 100; (음이온성 약물 중량+양이온성 지질 중량)/양친성 블록 공중합체 중량 X 100]은, 0.001 내지 100중량%, 구체적으로는 0.01 내지 50중량%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10중량%일 수 있다. 상기 중량 비율이, 0.001중량% 미만인 경우에는 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 함량이 지나치게 낮아져서 음이온성 약물에 대한 유효 함량을 충족시키기 어려우며, 반대로 100중량% 초과시에는 양친성 블록 공중합체의 분자량과 음이온성 약물 및 지질 복합체의 양을 고려할 때 적절한 크기의 미셀 구조를 형성하지 못하기 때문이다.

일실시예에서, 본 발명의 조성물은 폴리락트산(PLA)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리락트산은 미셀의 코어(내벽)에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 미셀을 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계(RES)를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산의 카르복실산이 구분자 미셀의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산을 포함하지 않는 고분자 미셀에 비해 표면전위의 양성 전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고, 이로 인하여 목적하는 부위 (예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.

일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 미셀 내벽 성 분으로 포함되는 폴리락트산은 수평균분자량이 500 내지 50,000달톤, 구체적으로 1,000 내지 10,000달톤인 것이 좋다. 분자량이 500달톤 미만이면 수용액에 대한 용해도가 높아 미셀의 코어(내벽)에 존재하기 어렵고, 분자량이 50,000달톤을 초과하면 고분자 미셀의 입자가 커지는 문제가 있다.

상기 폴리락트산은 양친성 블록 고분자에 대한 중량비로 1 내지 200중량%, 구체적으로 10 내지 100중량%로 사용될 수 있다. 폴리락트산의 함량이 양친성 블록 고분자 중량 대비 200중량%를 초과하면 증가하여 미셀의 크기가 커져, 멸균막을 사용한 여과가 어렵고, 1중량% 미만이면 목적하는 효과를 충분히 얻을 수 없다.

한 구체예에서, 상기 폴리락트산의 말단 중 카르복시산의 반대편의 말단은, 히드록시, 아세톡시, 벤조일옥시, 데카노일옥시, 팔미토일옥시 및 탄소수 1 내지 2개의 알콕시로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나로 치환될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 폴리락트산 화학식 1로 나타낼 수 있다.

상기 식에서,

R은 수소, 아세틸기, 벤조일기, 데카노일기, 팔미토일기, 메틸기 또는 에틸기이며,

n는 7-694, 구체적으로 13-138의 정수이다.

일실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 음이온성 약물의 세포 내 전달 효율을 증가시기키 위하여, 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.01 내지 50중량%, 구체적으로는 0.1 내지 10중량%의 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 융합성 지질은 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체에 혼합시, 소수성 상호작용으로 결합하여 음이온성 약물, 양이온성 지질 및 융합성 지질의 복합체를 형성하고, 상기 융합성 지질을 포함하는 복합체는 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된다. 일실시예에서, 상기 융합성 지질은 인지질, 콜레스테롤, 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 구체적으로, 상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 또는 포스파티딘산(phosphatidic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 콜레스테롤 및 토코페롤에는 콜레스테롤 및 토코페롤의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.

구체적으로는 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤, 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디팔미토올레오일포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 음이온성 약물을 함유하는 양친성 블록 공중합체 미셀을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

일실시예에서, 음이온성 약물, 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물을 제조하는 방법은,

(b) 상기 (a) 공정의 유기용매층을 분리하는 공정;

(d) 상기 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정을 포함한다.

상기 (a) 공정에서, 수혼화성 유기용매, 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 음이온성 약물과 양이온성 지질을 혼합하여 복합체를 형성한다. 구체적으로는, 상기 수혼화성 유기용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 상기 혼합 용매의 유기용매는 아세트산 에틸, 아세토니트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 다이옥산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 수용액은 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있다. 상기 혼합 용매 중의 유기용매와 수용액의 혼합비는 특별한 한정은 없으며, 예컨대 부피 기준으로 1:0.1 내지 50, 보다 구체적으로 1:0.5 내지 10 (유기용매 부피:수용액 부피)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용매에 용해시킨 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체의 양은, 사용한 용매량의 0.1-100중량%, 구체적으로는 0.1-10 중량%, 보다 구체적으로는 0.1-1중량%가 되도록 사용할 수 있다. 만약 100 중량% 이상이면 하기 (b) 공정에서 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체를 유기용매로 추출할 때, 수율이 급격히 떨어지는 단점이 있다.

상기 (b) 공정에서 상분리를 통하여 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체를 회수한다. 상기 공정 (a)의 용매에 수용액과 유기 용매를 추가하여 상분리를 유도할 수 있다. 또한, 상분리 시간을 단축시키기 위하여 원심분리 공정을 추가할 수 있다.

상기 (c) 공정에서, 추출된 유기용매에 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 첨가하여 혼합한 후, 유기용매를 증발시킴으로써 제거한다.

상기 (d) 공정은 유기용매가 증발되고 남은 혼합물을 수용액 중에 용해시킴으로써, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입시키게 된다. 상기 수용액은 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있으며 사용량은 양친성 블록 공중합체의 농도가 10 내지 300mg/mL 정도 되게 할 수 있다 상기 고분자의 농도가 10 mg/mL 미만이면 수용액의 부피가 커져서 제조공정상의 취급에 어려움이 있고, 300 mg/mL을 초과하면 수용액의 점도가 높아져서 원활한 미셀 제조가 어렵다. 또 다른 실시예에서, 음이온성 약물, 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물을 제조하는 방법은,

(ii) 상기 (i) 공정의 유기용매층를 제거하는 공정;

(iii) 상기 (ii) 공정의 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정

을 포함할 수 있다.

상기 (i) 공정에서, 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매 에서 음이온성 약물, 양이온성 지질 및 양친성 블록 공중합체를 혼합하여 복합체를 형성한다. 구체적으로는, 상기 수혼화성 유기용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 상기 혼합 용매의 유기용매는 아세트산 에틸, 아세토니트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 다이옥산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 수용액은 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있다. 상기 혼합 용매 중의 유기용매와 수용액의 혼합비는 특별한 한정은 없으며, 예컨대 부피 기준으로 1:0.1 내지 50, 보다 구체적으로 1:0.5 내지 10 (유기용매 부피:수용액 부피)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (ii) 공정에서, 유기용매를 증발시킴으로써 제거한다.

상기 (iii) 공정은 유기용매가 증발되고 남은 혼합물을 수용액 중에 용해시킴으로써, 음이온성 약물과 양이온성 지질와의 복합체를 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입시킨다. 상기 수용액 및 그 사용량은 상기에서 기재한 바와 같다.

또 다른 예에서, 융합성 지질을 포함하는 조성물의 경우, 상기 융합성 지질은 미셀 형성을 위한 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산 첨가시 함께 첨가될 수 있으며, 예컨대 상기 (c) 또는 (i) 공정에서 첨가될 수 있다.

또 다른 일실시예에서, 상기 (d) 또는 (iii) 공정 이후에, (e) 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 공정을 더 포함할 수 있다.

또 다른 일실시예에서, 상기 제조방법은, 상기 (e) 공정의 동결 건조 전에 (d) 또는 (iii) 공정에서 얻은 고분자 미셀 수용액을 멸균 필터로 멸균하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 동결건조 보조제는 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제는, 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하기 위해서 첨가된다. 또한, 상기 동결건조 보조제는, 양친성 블록 공중합체 조성물을 동결건조 후, 재건(reconstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주는 작용을 하게 된다. 또 다른 일실시예에서, 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%, 더 구체적으로는 10 내지 60 중량% 이다.

일실시예에서, 본 발명에 따른 음이온 약물 함유 양친성 블록 공중합체 미셀 조성물은, 수용액, 분말 또는 정제의 형태로 제제화될 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어, 상기 동결 건조 조성물은, 주사용 증류수, 0.9% 생리식염수 및 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건할 수 있다.

본 발명에 따른 제법을 통해 형성된 미셀 입자는, 혈중에서 안정하며, 입자크기는 10 내지 200 nm이며, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm이다.

본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물은, 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고, 용액, 현탁 주사제, 정제 또는 캡슐제 등의 다양한 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물은, 양이온성 지질, 양친성 블록 고분자 및 폴리락트산을 사용하여 음이온성 약물을 외부로부터 격리시킴에 따라 음이온성 약물의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있다. 본 약제학적 조성물은 체내에 투여하였을 경우 음이온성 약물의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있으며, 특히 세망내피계를 회피하여 음이온성 약물이 세포 내로 효율적으로 전달될 수 있다는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

[ 제조예 1] AC -콜레스테롤(3베타[N-( 아미노에탄 ) 카바모일 ]콜레스테롤)의 합성

AC-콜레스테롤의 합성을 위하여 콜레스테릴 클로로포메이트 (cholesteryl chloroformate, Sigma-Aldrich)와 에틸렌디아민 (ethylenediamine, Sigma-Aldrich)을 다음과 같이 반응시켰다.

콜레스테릴 클로로포메이트 1g (2.23mmol)을 20ml의 클로로포름에 녹이고, 별개의 반응용기에 20배 당량의 에틸렌디아민을 30ml의 클로로포름으로 희석하고, 4℃로 유지하였다. 콜레스테릴 클로로포메이트 용액을 에틸렌디아민이 있는 반응용기에 천천히 넣어준 뒤, 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후 증류농축장치(rotary evaporator, Buchi사, R-2055)를 이용하여 용매를 제거하고, 다시 소량의 클로로포름에 녹인 뒤, NaCl 포화용액과 NaCO₃으로 추출하여 클로로포름층을 회수하였다.

이후 증류농축장치(rotary evaporator)로 용매를 제거하고, 클로로포름에 녹인 뒤, 실리카겔 크로마토그래피(silica-gel chromatography)를 실시하여 분리하였다. 클로로포름:메탄올=9:1(v/v)에서 용출된 분획에 염산 용액을 콜레스테릴 클로로포메이트의 50배 당량으로 첨가하고, 단일상이 형성될 때까지 메탄올을 조금씩 첨가하여 AC-콜레스테롤 염산염을 형성하였다.

증류농축장치(rotary evaporator)로 가온, 감압 증류하여 용매를 완전히 제거하였다. AC-콜레스테롤 염산염을 60℃의 메탄올에 녹인 후 4℃로 냉각하여 재결정을 얻었다. 수율은 53%에 달하였다. ¹H-NMR로 AC-콜레스테롤의 합성 여부 및 순도를 확인하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 순도는 99% 이상이었다.

[ 제조예 2] MC -콜레스테롤 (3베타[N-( N' - 모노메틸아미노에탄 ) 카바모일 ]콜레스테롤)의 합성

에틸렌디아민 대신 N-메틸에틸렌디아민(N-metheylethylenediamine, Sigma- Aldrich)을 콜레스테릴 클로로포메이트의 10당량 사용했다는 점을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법을 거쳐, MC-콜레스테롤을 합성 및 정제하였다. 합성 수율은 62%에 해당하였다. ¹H-NMR로 MC-콜레스테롤의 합성 여부 및 순도를 확인하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다. 순도는 99% 이상이었다.

[ 제조예 3] mPEG - PLA ( 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리락타이드 ) 블록 공중합체(A-B)의 중합 (분자량 2,000-1, 750달톤 )

5g의 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(분자량 2,000달톤 이하, NOF corporation)을 100ml 2-구 환저플라스크에 가하고, 3시간 동안 감압(1mmHg) 하에서 100℃로 가열하여 탈수하였다. 반응 플라스크에 건조 질소를 채우고, 반응 촉매인 스태너스 옥토에이트(Sn(Oct)₂, Sigma-Aldrich)를 주사기로 락타이드의 0.1wt%(5mg)로 주입하였다. 반응 혼합물을 30 분간 교반하고, 110℃에서 1시간 동안 1mmHg로 감압하여 촉매를 녹인 용매인 톨루엔을 제거하였다. 정제된 락타이드(5g, Purac)를 가하고, 혼합물을 12시간 동안 130℃로 가열하였다. 형성된 고분자를 에탄올에 녹이고, 디에틸에테르를 가하여 고분자를 석출시켰다. 석출된 고분자를 진공 오븐에서 48시간 동안 건조하였다.

상기 과정을 통해 얻어진 mPEG-PLA의 수평균 분자량은 2,000-1,750달톤이며, 도 4의 ¹H-NMR에 의해 A-B 타입인 것으로 확인되었다.

[ 제조예 4] mPEG - PLA ( 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리락타이드 ) 블록 공중합체(A-B)의 중합 (분자량 5,000-4,000)

모노메톡시폴리에틸렌글리콜(분자량 5,000달톤 이하, NOF corporation)을 사용하여 제조예 3과 동일한 과정을 거쳐 수평균 분자량이 5,000-4,000달톤인 mPEG-PLA 블록 공중합체를 합성하였다. 상기 합성된 블록공중합체의 ¹H-NMR 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 ¹H-NMR에 의해 A-B 타입인 것으로 확인되었다.

[ 제조예 5] mPEG - PLA -토코페롤의 중합

반응용매 아세토니트릴(ACN) 200ml를 사용하고, 반응물로 수평균 분자량이 2,000-1,750달톤인 제조예 3의 mPEG-PLA 26.4 mmol, 토코페롤 석시네이트(tocopherol succinate, Sigma-Aldrich) 31.68mmol, 촉매로 디사이클로헥실카보디이미드(DCC, Sigma-Aldrich) 31.68mmol 및 디메틸아미노피리딘(DMAP, Sigma-Aldrich) 3.168mm을 투입하여 상온에서 24시간 동안 합성하였다. 반응 생성물이 녹아있는 아세토니트릴 용액을 유리 필터로 여과하여, 반응 중 생성된 디사이클로헥실카보우레아(DCU)를 제거하였다.

1차 정제로서, 여과된 아세토니트릴 용액을 차가운 디에틸에테르:헥산=3:7(v/v) 혼합용매에 침전시켜 고분자를 재결정하였다. 얻어진 고분자를 다시 아세토니트릴 용액에 녹이고 디에틸에테르:헥산=3:7 (v/v) 혼합용매에서 침전시켜 2차 정제를 실시하였다. 정제된 고분자는 진공 건조하여, 백색의 가루입자 형태를 얻었다. 얻어진 화합물의 ¹H-NMR 분석 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 ¹H-NMR 분석에서 순도는 97% 이상이었고, 수득률은 92.7%이었다.

[ 제조예 6] mPEG - PLA -토코페롤의 중합 (분자량 5,000-4,000- 530달톤 )

수평균 분자량이 5,000-4,000달톤인 제조예 4의 mPEG-PLA를 사용하여 제조예 5와 동일한 방법으로 mPEG-PLA-토코페롤을 중합하였다. 얻어진 화합물의 ¹H-NMR 분석 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 ¹H-NMR 분석에서 순도는 97% 이상이었고, 수득률은 94.2%이었다.

[ 제조예 7] 아니사마이드 - PEG - PLA ( Anisamide - PEG - PLA )의 중합

아니식산 (anisic acid, 4-메톡시벤조산 (4-methoxybenzoic acid), Sigma-Aldrich) 0.1g (660μmol), 디사이클로헥실카보디이미드 (Sigma-Aldrich) 0.146g (710μmol), N-하이드록시석시니미드(NHS, Sigma-Aldrich) 0.081g (710μmol)을 아세토니트릴:디메틸포름아미드(DMF)=2:1(v/v) 혼합용매에 녹이고 24시간 동안 반응시켜, 아니식산-NHS 에스테르(AA-NHS)를 합성한 후, 반응 부산물인 디사이클로헥실카보우레아를 여과하여 제거하였다. H₂N-PEG-OH(Mn=2,000, NOF corporation) 0.519g(260μmol)을 2ml의 아세토니트릴에 녹이고 1.5배 당량의 AA-NHS를 가한 후, 상온에서 24시간 동안 반응시켜 아니사마이드-PEG(AA-PEG)를 합성하였다. 반응물 을 차가운 디에틸에테르에 침전시켜 AA-PEG를 재결정하는 과정을 2회 반복하여 AA-PEG를 정제하였다. AA-PEG로부터 AA-PEG-PLA-토코페롤를 중합하는 과정은 제조예 3, 4와 동일한 방법으로 수행하였다. ¹H-NMR 분석에서 아니사마이드의 도입률은 90.2%이었으며, 그 결과는 도 8에 나타내었다.

[ 제조예 8] 폴리락트산 ( PLA ) 합성방법

D,L-락트산 (Purac사) 1,000g을 2,000ml의 삼구 둥근바닥 플라스크에 넣고 교반기를 장치하였다. 그런 다음, 80℃로 가열한 기름 중탕에서 가열 및 감압 아스피레이터로 25㎜Hg로 감압하면서 1시간 동안 반응시켜, 과량으로 존재하는 수분을 제거하였다.

반응 온도를 160℃로 상승시키고, 압력을 5~10㎜Hg로 감압한 조건에서, 10시간 반응시킨 후 반응을 종결하였다. 그 결과, 정제되지 않은 상태의 폴리락트산 646g을 얻었다. 제조한 폴리락트산을 정제하기 위하여 폴리락트산 100g에 아세톤 100ml를 가하여 고분자를 용해시켰다. 고분자 용액에 증류수 1000 ml를 서서히 첨가하면서 고분자를 석출시켰다. 석출된 고분자를 여과하고, 증류수 500ml로 2회 세척하였다. 과량의 수분을 제거하기 위하여, 90℃에서 2시간 동안 진공 건조하였다. 그 결과, 정제된 분자량 2,000달톤의 폴리락트산 87g을 얻었다. 정제된 폴리락트산에 대한 NMR 측정결과는 도 9에 나타내었다.

[ 실시예 1] siRNA / 양이온성 지질 복합체 제조

Bligh & Dyer 추출법(Bligh, EG., Dyer, WJ, A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem . Physiol 37 (1959) 911-937)을 이용하여 siRNA/양이온성 지질 복합제를 제조하였다. siRNA는 5μg을 사용하고, 양이온성 지질로 제조예 1 및 2의 AC-콜레스테롤, MC-콜레스테롤 및 TC-콜레스테롤(Sigma Alldrich)을 각각 siRNA 인산기 몰 수의 0, 1, 2, 4, 8 및 16 배 사용하였다 (N/P 비율(siRNA의 인산기에 대한 양이온성 지질의 양이온 비율)=0, 1, 2, 4, 8 및 16).

GFP siRNA 서열 (Dharmacon):

센스 가닥: 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUdTdT-3' (서열번호 1-dTdT)

안티센스 가닥: 5'-AACUUCAGGGUCAGCUUGCdTdT-3' (서열번호 2-dTdT)

상기 N/P 비율이 되도록 siRNA 수용액 100μl, 양이온성 지질 클로로포름 용액 100μl 및 메탄올 210μl를 혼합하여 단일상 (Bligh & Dyer monophase)을 만들고, 증류수 100μl, 클로로포름 100μl를 가하여 상분리 시켰다. 수용액 층과 클로로포름 층의 siRNA 양은 리보그린(Ribogreen, Invitrogen) 시약으로 정량하였다. 정량결과는 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

	상이동 후 투입한 siRNA의 양에 대한 각 상에 존재하는 siRNA의 양의 비율 (%)
N/P 비율	AC-콜레스테롤		MC-콜레스테롤		TC-콜레스테롤
N/P 비율	수상	유기상	수상	유기상	수상	유기상
0	100.8	0	95.4	0	99.1	0
1	37.7	70.9	93.3	0	0	97.7
2	0	100.1	27.5	72.7	0	98.9
4	0	106.1	0	102.2	0	97.9
8	0	105.6	0	102.8	0	96.8
16	0	114.7	0	105.4	0	98.2

표 1을 참조하면, 양이온성 지질들이 siRNA와 복합체를 형성하여 siRNA/양이온성 지질 복합체를 유기용매 층으로 상이동시킴을 확인할 수 있다.

[ 실시예 2] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA / PLA 함유 조성물의 제조

실시예 1의 방법을 따라 siRNA/양이온성 지질 복합제를 제조하였다. siRNA의 인산기에 대한 AC-콜레스테롤의 양이온 비율(N/P 비율)은, 12로 하였다. 상분리 후 클로로포름 층만을 따로 수거하여 mPEG-PLA(분자량 2,000-1,750)에 대한 siRNA/AC-콜레스테롤 복합체의 비율이 0.4wt%가 되도록 제조예 3의 mPEG-PLA 24 mg을 첨가하였다. 또한, 제조예 7의 폴리락트산 (분자량 2,000달톤) 14.4 mg을 첨가한 후, 1-구 둥근 플라스크에 옮겨 담고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 300 μL를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA/PLA 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.

[ 실시예 3] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤/ PLA 함유 고분자 미셀 전달체의 제조

실시예 2과 같은 방법을 사용하되, mPEG-PLA 대신 제조예 5의 mPEG-PLA-토코페롤(분자량 2,000-1,750-530달톤)을 사용하여 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA 고분자 미셀 전달체를 제조하였다. mPEG-PLA-토코페롤에 대한 siRNA/AC-콜레스테롤 복합체의 비율이 0.4wt%가 되도록 하였다.

[ 실시예 4] VEGF siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤/ PLA 함유 고분자 미셀 전달체의 제조

서열번호 3 및 4의 VEGF siRNA을 삼천리 제약에서 구매하여 다음과 같은 VEFG siRNA 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.

VEGF siRNA (Dharmacon):

센스 가닥: 5'-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3'(서열번호 3-dTdT),

안티센스 가닥: 5'-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3'(서열번호 4-dTdT)

1-구 둥근 플라스크에 AC-콜레스테롤 92 μg (N/P 비율 12)과 에탄올을 넣고 실온에서 완전히 녹인 후, 상기 siRNA 5μg을 첨가하여 혼합하였다. 여기에 제조예 6의 mPEG-PLA-토코페롤 (분자량 5,000-4,000-530달톤) 24 mg 및 제조예 7의 PLA (분자량 2,000달톤)을 14.4 mg을 넣고 60 ℃에서 5분간 교반하였다. 이때 mPEG-PLA-토코페롤에 대한 siRNA/AC-콜레스테롤 복합체의 비율이 0.40wt%가 되도록 하였다.

혼합물을 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거 하였다. 플라스크에 증류수 300 μL를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA 함유 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.

[ 실시예 5] VEGF siRNA -콜레스테롤/ AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤/ PLA 함유 고분자 미셀 전달체의 제조

실시예 4에서 사용된 서열번호 3-dTdT 및 4-dTdT의 VEGF siRNA 서열과 동일한 서열을 가지되 센스 가닥의 3' 말단에 콜레스테롤이 공유결합된 VEGF siRNA-콜레스테롤을 삼천리 제약에서 구매하여, 실시예 4와 동일한 조성과 방법으로 VEGF siRNA-콜레스테롤 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.

[ 실시예 6] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤/ PLA / 디올레일포스파티딜 -에 탄올아민 ( DOPE ) 함유 조성물의 제조

실시예 4의 조성비에 추가로 DOPE (Avanti polar lipids) 56μg 을 더하여, 고분자 (블록 공중합체+PLA) 혼합시 DOPE를 첨가하여 DOPE 함유 siRNA 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.

[ 비교예 ] VEGF siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤 함유 고분자 미셀 전달체의 제조

PLA만을 제외하고, 실시예 4와 동일한 조성과 방법으로 VEGF siRNA/AC-콜레 스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.

[ 실험예 1] siRNA / 양이온성 지질/ 양친성 블록 공중합체/ PLA 미셀의 크기 측정 및 siRNA 의 봉입 확인

siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체가 나노입자를 형성하는지 확인하기 위하여 DLS(Dynamic Light Scattering) 방법으로 수용액에서 실시예 4의 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA 고분자 미셀과 실시예 6의 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA 고분자 미셀의 크기를 측정하여 표 2에 나타내었다.

광원으로 출력 10 mV, 파장 638 nm인 헬륨-네온 레이저를 사용하였고, 90℃의 입사광을 사용하였으며, 실험은 25℃에서 수행하였다. 측정과 분석은 Photal Otsuka Electronics사의 ELS-8000 장비를 사용하였다.

[표 2]

	고분자 종류	무게평균 입경
실시예 4	siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA	84.8±30.5nm
실시예 6	siRNA-콜레스테롤/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA/DOPE	78.9±28.4nm
비교예	siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤	72.6±23.6nm

변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 제조된 siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체 미셀에서 siRNA를 정량하였다.

고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl(pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약 (Invitrogen)으로 정량하였다.

측정 결과, 제조시 사용한 siRNA 양의 90% 이상을 추출해 낼 수 있었다.

[ 실험예 2] PLA 포함 고분자 미셀의 조직 분포

siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA 고분자 미셀 또는 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA/DOPE 고분자 미셀을 암 모델 생쥐 (tumor xenografted mouse)에 정맥 주사한 후 조직 분포를 관찰하였다. 실시예 4 및 실시예 6와 같은 조성비와 제조방법으로 각각 고분자 미셀을 제조하되, Cy5.5 형광 염료 (GE healthcare)를 siRNA와 동일 당량으로 넣어 고분자 미셀을 표지하였다. 누드마우스(중앙실험동물) 에 A549 (폐암 세포주, ATCC) 를 피하에 각각 주입하여 암이 유발된 생쥐를 제조하였다. 형광 표지된 고분자 미셀을 암 모델 생쥐에 1 mg/kg의 용량으로 정맥투여한 후 48시간에 각 조직을 적출하여 Cy5.5 형광 (exciatation 파장 675 nm, emission 파장 694 nm)을 CCD 카메라로 측정하여 도 10 및 도 11에 나타내었다. 비교군으로 상기 비교예에서 제조된 전달체를 상기와 같이 형광 표지하여 사용하였다.

도 10 및 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 PLA 또는 DOPE와 PLA를 함유한 siRNA 고분자 미셀 전달체는 암, 간, 이자, 비장, 폐, 신장, 대장의 순으로 많이 존재하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과를 통해 PLA를 함유한 siRNA 고분자 미셀 전달체가 정맥 주사를 통한 전신 전달이 가능함을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 PLA를 함유한 siRNA 고분자 미셀 전달체는 암세포에 존재하는 정도가 비교예의 PLA를 함유하지 않은 경우와 비교하여 현저하게 높은 것으로 나타나, 암세포에 대한 표적화 효율이 우수함을 알 수 있다.

또한, 상기 고분자 미셀 전달체가 주입된 후의 암조직과 간의 평균 강도를 측정하여 아래의 표 3에 나타내었다.

[표 3]

조직	평균 강도(average intensity, A.U.)
조직	비교예	실시예 4	실시예 6
암	1,077	1,729	1,566
간	2,210	675	924
암/간 비율	0.49	2.56	1.69

A.U.: Arbitrary unit

표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 4 및 6의 고분자 미셀 전달체를 주입하는 경우 암조직의 강도가 특이적으로 증가한 반면, 비교예의 경우에는 오히려 간조직의 강도가 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 고분자 미셀 전달체가 암조직에 특이적으로 표적화할 수 있음을 뒷받침하는 것이라 할 수 있다.

[ 실험예 3] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤 고분자/ PLA 미셀의 생체 내 ( in vivo ) 활성 ( mRNA 분석)

siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA 고분자 미셀이 생체 내에서, 사용한 siRNA의 대상 유전자 VEGF (vascular endothelial growth factor)를 억제할 수 있는 지를 mRNA 수준에서 확인하였다.

누드마우스(중앙실험동물 제공) 에 A549 폐암 세포주(ATCC)를 피하에 주입하여 암이 유발된 생쥐를 제조하였다. 실시예 4의 VEGF siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 고분자 미셀을 암 모델 생쥐에 1.5 mg/kg의 용량으로 정맥투여한 후 48시간에 암조직을 적출하였다. 적출된 암조직을 분쇄하여 VEGF mRNA의 양을 bDNA kit(R&D systems)로 분석하였다. bDNA 분석방법은 kit 제조사 (R&D systems)의 지시에 따랐다.

VEGF siRNA의 영향을 받지 않는 유전자인 GAPDH의 mRNA도 동일한 방법으로 분석하여, 측정된 VEGF mRNA의 양을 보정하였다. 얻어진 결과를 표 4에 나타내었다. 대조군으로는 생리식염수를 투여하였다.

[표 4]

군	개체	VEGF/GAPDH	상대량 (%)	평균 (%)
대조군	#1	0.434	89.3	100.0
	#2	0.510	105.0
	#3	0.516	106.2
siRNA 고분자미셀 전달체	#1	0.253	52.2	46.8
	#2	0.226	46.4
	#3	0.203	41.7

표 4은 siRNA 고분자 미셀 전달체를 암 모델 생쥐에 정맥 주사한 후 암 조직에서 타겟 유전자의 mRNA 억제율을 나타낸 것이다. siRNA 고분자 미셀 전달체는 암조직에서 VEGF 단백질의 양을 약 53.2% 억제함을 알 수 있다.

[ 실험예 4] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤 고분자/ PLA 미셀의 생체 내 ( in vivo ) 활성 (단백질)

siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA 고분자 미셀이 생체 내에서, 사용한 siRNA의 대상 유전자 VEGF (vascular endothelial growth factor)를 억제할 수 있는 지를 단백질 수준에서 확인하였다.

누드마우스(중앙실험동물 제공) 에 A549 폐암 세포주(ATCC)를 피하에 주입하여 암이 유발된 생쥐를 제조하였다. 실시예 4의 VEGF siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 고분자 미셀을 암 모델 생쥐에 1.5 mg/kg의 용량으로 정맥투여한 후 48시간에 암조직을 적출하였다. 적출된 암조직을 분쇄하여 VEGF 단백질의 양을 ELISA로 분석하였다. ELISA 분석방법은 kit 제조사 (R&D systems)의 지시에 따랐다. 대조군으로는 생리식염수를 투여하였다. 실험 결과는 표 5에 나타내었다.

[표 5]

군	개체	VEGF 농도 (pg/ml)	상대량 (%)	평균 (%)
대조군	#1	486.4	108.8	100.0
	#2	415.3	92.9
	#3	439.5	98.3
siRNA 고분자미셀 전달체	#1	242.1	54.1	47.9
	#2	186.8	41.8
	#3	213.9	47.9

표 5는 siRNA 고분자 미셀 전달체를 암 모델 생쥐에 정맥 주사한 후 암 조직에서 타겟 유전자의 단백질 억제율을 나타낸 것이다. siRNA 고분자 미셀 전달체는 암조직에서 VEGF 단백질의 양을 약 52.1% 억제함을 알 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 음이온성 약물 전달용 조성물의 모식도이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 AC-토코페롤에 대한 NMR 측정결과이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 MC-토코페롤에 대한 NMR 측정결과이다.

도 4는 본 발명의 제조예 3에 따라 중합된 mPEG-PLA 블록 공중합체에 대한 NMR 측정결과이다.

도 5는 본 발명의 제조예 4에 따른 제조방법에 의해 중합된 mPEG-PLA 블록 공중합체에 대한 NMR 측정결과이다;

도 6은 본 발명의 제조예 5에 따른 제조방법에 의해 중합된 mPEG-PLA-토코페롤에 대한 NMR 측정결과이다;

도 7은 본 발명의 제조예 6에 따른 제조방법에 의해 중합된 mPEG-PLA-토코페롤에 대한 NMR 측정결과이다;

도 8은 본 발명의 제조예 7에 따라 중합된 아니사마이드-PEG-PLA에 대한 NMR 측정결과이다.

도 9은 본 발명의 제조예 8에 따라 중합된 폴리락트산에 대한 NMR 측정결과이다.

도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 /PLA 고분자 미셀 전달체를 전신 전달하였을 때 조직 분포 결과로, 이다 (A: 실험군, B: 비교군).

도 11는 본 발명의 일실시예에 따른 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤/PLA/DOPE 고분자 미셀 전달체를 전신 전달하였을 때 조직 분포 결과이다 (A: 실험군, B: 비교군).

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Composition for Delivery of Anionic Drugs Containing Poly-lactic Acid and <130> DPP-2009-6356-KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of GFP siRNA <400> 1 gcaagcugac ccugaaguu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of GFP siRNA <400> 2 aacuucaggg ucagcuugc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of VEGF siRNA <400> 3 ggaguacccu gaugagauc 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of VEGF siRNA <400> 4 gaucucauca ggguacucc 19

Claims

유효성분으로서 음이온성 약물;

양이온성 지질;

양친성 블록 공중합체; 및

폴리락트산

을 포함하며,

상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는,

음이온성 약물 전달용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 음이온성 약물은 핵산 물질인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제2항에 있어서,

상기 핵산 물질은 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 및 디엔에이자임(DNAzyme)로 구성된 군 으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제3항에 있어서,

상기 핵산 물질은 하나 이상의 말단이 콜레스테롤, 토코페롤, 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민 (COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 음이온성 약물(N)과 양이온성 지질(P)의 전하량의 비율(N/P)은 0.1 내지 128인 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체이며,

상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며,

상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는,

음이온성 약물 전달용 조성물.
제7항에 있어서,

상기 친수성 A 블록의 수평균 분자량은 200 내지 50,000달톤이고, 친수성 B 블록의 수평균 분자량은 50 내지 50,000달톤인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 양친성 블록 공중합체의 중량(b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율(a/b X 100)은, 0.001 내지 100 중량%인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제1항에 있어서,

폴리락트산의 수평균 분자량이 500 내지 50,000달톤인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,

상기 폴리락트산은 양친성 블록 고분자에 대한 중량비로 1 내지 200중량%의 양으로 함유된 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

인지질, 콜레스테롤, 및 토코페롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 융합성 지질을 추가로 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제12항에 있어서,

상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)으로 이 루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 음이온성 약물 전달용 조성물.
제12항에 있어서,

상기 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤, 및 토코페롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 음이온성 약물 전달용 조성물.
(a) 음이온성 약물과 양이온성 지질을 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 용해하고 상분리시키는 공정;

(b) 상기 (a) 공정의 유기용매층을 분리하는 공정;

(c) 상기 (b) 공정의 유기용매층에 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 혼합하고 유기용매를 제거하는 공정; 및

(d) 상기 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정

을 포함하는,

음이온성 약물, 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
(i) 음이온성 약물, 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에 용해시키는 공정;

(ii) 상기 (i) 공정의 유기용매층를 제거하는 공정;

(iii) 상기 (ii) 공정의 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정

을 포함하는,

음이온성 약물, 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 (d) 공정 또는 (iii) 공정 이후에,

(e) 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 공정

을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

상기 (c) 공정 또는 (i) 공정에 융합성 지질을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

상기 음이온성 약물은 핵산 물질인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

상기 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판, 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판, 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민 (COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

상기 음이온성 약물(N)과 양이온성 지질(P)의 전하량의 비율(N/P)은, 0.1 내지 128인 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

상기 양친성 블록 고분자의 중량(b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율(a/b X 100)은, 0.001 내지 100 중량%인 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.