CN1964744B - 基于包含两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物药物载体的生物活性剂传递系统 - Google Patents

基于包含两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物药物载体的生物活性剂传递系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供了生物活性剂的传递系统，其基于由如下组合物形成的聚合物药物载体，所述组合物包含由亲水性嵌段和疏水性嵌段组成的两亲性嵌段共聚物及聚乳酸衍生物，所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，在所述聚合物衍生物中，所述聚乳酸的一个末端与至少一个羧基基团共价结合。所述聚乳酸衍生物的羧基基团可以用二价或者三价金属离子固定，这可以通过向聚合物组合物中加入二价或者三价金属离子而获得。

Description

基于包含两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物药物载体的生物活性剂传递系统
相关申请的交叉参考
本申请要求于2004年5月6日向美国专利商标局提交的第60/568,945号美国专利申请的优先权，其全部内容并入此处作为参考。
技术领域
本发明涉及一种传递系统和一种使用聚合物药物载体细胞内传递生物活性剂的方法。更具体而言，本发明涉及一种使用由如下(a)和(b)形成的聚合物药物载体而细胞内传递生物活性剂的方法：(a)包含亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，以及(b)在聚合物末端具有至少一个末端羧基基团的聚乳酸衍生物。
背景技术
为了达到生物活性剂的希望的治疗作用，应使适量的被给予药物进入机体的靶细胞中。为了增加药物的细胞内在化，应使药物以合适浓度在靶组织中保持希望的时间；另外，应使药物进入组织的靶细胞中。组织中的高药物浓度可以通过呈现长血液循环时间的制剂而实现。因此，进行了大量研究以开发利用具有长循环时间的纳米颗粒药物载体的药物传递系统，包括脂质体和聚合物胶束。
已经提示有许多方法可增强生物活性剂的细胞内摄取。也已经描述了用于生物活性剂如寡核苷酸的细胞内传递的传递载体如脂质体(Felgner等的美国专利No.5,264,618(1993)；Eppstein等的美国专利No.4,897,355(1990)；及Wang等，Proc.Nat.Acad.Sci.84：7851-7855(1987)；美国专利No.5,759,519(1998))。然而，因为存在低包封率、药物不稳定性、快速药物渗漏、及贮存稳定性不佳等问题，脂质体作为药物载体的应用受到限制。小的分子表面活性剂胶束(micelle)当被给予机体内后由体液稀释时易于解离，因此难以使其发挥作为药物载体的作用。
近年来，进行了关于聚合物胶束的制备、鉴定和药物应用方面的研究。这些研究见V.Torchilin于Journal of Controlled Release 73(2001)pp.137-172中的综述。聚合物胶束的特征是在水性介质中的核心—壳结构，该结构是由具有疏水性(核心)和亲水性(壳)链段的两亲性嵌段共聚物形成的。水溶性不佳的药物被包封于该胶束的疏水性核心中。已经有许多研究旨在开发具有亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B、A-B-A或者B-A-B嵌段共聚物。对于用作药物载体，优选疏水性B嵌段(胶束内部核心嵌段)包含可生物降解的聚合物如聚-DL-丙交酯、聚-ε-己内酯或者聚(γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯(aspartate))，亲水性A嵌段(胶束外部壳嵌段)是能与血浆蛋白和细胞膜相互作用的聚合物，如聚乙二醇(PEG)。
聚合物胶束之吸引人的特性是，其可以避免药物在体内被网状内皮组织系统(RES)或者单核吞噬系统(MPS)摄取，并因此可以在血液中长时间循环。这个优点来自胶束的结构。两亲性嵌段共聚物的亲水性部分形成外壳并暴露于体液，因此有效地保护胶束免于与细胞膜和血液中血浆蛋白相互作用[V.Torchilin等，Advanced DrugDelivery Reviews 16(1995)pp.141-155]。
R.Savic等示出了实验证据，证明由聚(己内酯)-b-聚(环氧乙烷)嵌段共聚物形成的胶束可以通过利用在聚合物PCL末端共价附着四甲基罗丹明-5-羰基叠氮(TMRCA)的胶束将生物活性剂传递至活细胞中[R.Savic等，Sceince 300(2003)pp.615-618]。然而，荧光胶束仅可以在胞质中检测到，而在细胞核区室中检测不到，因此生物活性剂如DNA结合抗癌药物不适合与胶束一起应用。
综上所述，需要开发可以将生物活性剂传递至靶细胞中的聚合物胶束或者纳米颗粒。因此，本发明提供一种使用聚合物胶束或者纳米颗粒药物载体的靶向细胞内传递生物活性剂的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种使用由包含如下(a)和(b)的组合物形成的聚合物药物载体来细胞内传递生物活性剂的方法：(a)包含亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段的末端羟基基团由生育酚或胆固醇基团取代，以及(b)在聚合物末端具有至少一个末端羧基基团的聚乳酸衍生物。任选地，0.01-10当量的二价或者三价金属离子与1当量的所述聚乳酸衍生物的羧基末端基团结合。
本发明的另一个目的是提供细胞内传递生物活性剂的传递系统，其包含在水溶液中的生物活性剂及所述生物活性剂包封于其中的聚合物药物载体，其中所述聚合物药物载体是由包含如下(a)和(b)的聚合物组合物制备的：(a)包含亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，(b)在聚合物末端具有至少一个羧基的聚乳酸衍生物；其中当所述药物载体与细胞接触时，包封于该聚合物药物载体中的所述生物活性剂可以大量传递至细胞中。本发明的另一个目的是提供一种细胞内传递生物活性剂的组合物，其包含在水溶液中的生物活性剂和所述生物活性剂包封于其中的聚合物药物载体，其中所述聚合物药物载体是由包含如下(a)和(b)的聚合物组合物制备的：(a)包含亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，以及(b)在聚合物末端具有至少一个羧基基团的聚乳酸衍生物；其中当药物载体与细胞接触时，包封于该聚合物药物载体中的所述生物活性剂可以大量传递至所述细胞中。
本发明涉及可以将生物活性剂传递至靶细胞中的聚合物药物载体。
附图说明
图1是在给予本发明的组合物之后，生物活性剂自体液中的细胞内在化示意图。
图2A示出在用药物组合物处理多柔比星(doxorubicin)敏感细胞(MES-SA)之后，药物在其中内在化的细胞数。
图2B示出在用药物组合物处理多柔比星抗性细胞(MES-SA/Dx-5)之后，药物在其中内在化的细胞数。
图3A示出在用药物组合物处理多柔比星敏感细胞(MES-SA)之后，通过FACS检测的荧光强度。
图3B示出在用药物组合物处理多柔比星抗性细胞(MES-SA/Dx-5)之后，通过FACS检测的荧光强度。
图4A示出在用含有多柔比星的组合物(组合物1，右侧)和常规溶液制剂(左侧)处理多柔比星敏感细胞(MES-SA)之后2小时获得的共焦显微镜图象。
图4B示出在用含有多柔比星的组合物(组合物1)和常规溶液制剂处理多柔比星敏感细胞(MES-SA)之后8小时获得的共焦显微镜图象。
图4C示出在用含有多柔比星的组合物(组合物1)和常规溶液制剂处理多柔比星抗性细胞(MES-SA/Dx-5)之后2小时获得的共焦显微镜图象。
图4D示出在用含有多柔比星的组合物(组合物1)和常规溶液制剂处理多柔比星抗性细胞(MES-SA/Dx-5)之后8小时获得的共焦显微镜图象。
图4E示出在用含有表柔比星(epirubicin)的组合物(组合物6)和常规溶液制剂处理表柔比星敏感细胞(MCF-7)之后2小时获得的共焦显微镜图象。
图4F示出在用含有表柔比星的组合物(组合物6)和常规溶液制剂处理表柔比星敏感细胞(MCF-7)之后8小时获得的共焦显微镜图象。
图4G示出在用含有表柔比星的组合物(组合物6)和常规溶液制剂处理表柔比星抗性细胞(MCF-7/ADR)之后2小时获得的共焦显微镜图象。
图4H示出在用含有表柔比星的组合物(组合物6)和常规溶液制剂处理表柔比星抗性细胞(MCF-7/ADR)之后8小时获得的共焦显微镜图象。
图5A示出在用药物组合物(0.1μg/ml)处理多柔比星敏感细胞(MES-SA)之后细胞的生存力。
图5B示出在用药物组合物(1.0μg/ml)处理多柔比星抗性细胞(MES-SA/Dx-5)之后细胞的生存力。
图6示出在大鼠中经静脉内给予药物组合物之后随着时间的流逝血浆中的药物浓度。
具体实施方式
在揭示和描述本发明之前，应理解本发明不限于本文揭示的特定构型、方法步骤和材料，这些构型、方法步骤和材料可以变化。还应理解本文应用的术语只是用于描述特定的实施方案，无限制本发明范围之意，本发明范围仅受所附权利要求书及其等价物(equivalents)的限制。
必须注意在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式除非特别指出则也包括复数指示对象。因此，例如提及含有“末端基团”的聚合物包括两或多个这样的基团。
在对本发明进行的描述和权利要求中，如下术语根据下述解释应用。
如本文所用，术语“生物活性剂”是指一种有机化合物或者药物，其具有希望的生物学活性或功能，即在体内的生物学作用或生理学作用。例如，由治疗剂组成的生物活性剂可以改变细胞功能，如基因功能。或者，由诊断剂如磁共振成像(“MRI”)或者计算机化断层成像(“CT”)剂组成的生物活性剂具有增强组织和/或器官诊断图象的生物学功能。
如本文所用，术语“可生物降解的”或者“生物降解”定义为通过增溶水解或者通过生物学形成的实体的作用，所述材料转变为较不复杂的中间产物或者终产物。所述生物学形成的实体可以是酶或者其它生物体产物。
如本文所用，术语“生物相容的”是指对生物体不引起副作用的材料或所述材料通过增溶水解或者生物学形成的实体的作用形成中间产物或者终产物。所述生物学形成的实体可以是酶或者其它生物体产物。
“聚(丙交酯)”或者“PLA”是指衍生自乳酸缩合或者丙交酯的开环聚合的聚合物。术语“丙交酯”和“乳酸酯”可互换应用。
现在参考示例性实施方案，并且本文使用特定的语言描述这些实施方案。应理解这些解释无任何限制本发明范围之意。相关领域技术人员对本文所述的本发明特征加以变化和进一步修改，及本文所述的本发明的原理的其它应用，均被认为在本发明的范围内。
本发明提供一种使用聚合物药物载体细胞内传递生物活性剂的方法，所述聚合物药物载体是由如下聚合物组合物形成，所述聚合物组合物包含含有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物及聚乳酸衍生物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，而所述聚乳酸衍生物在该聚合物末端具有至少一个末端羧基基团。
本发明还提供了一种使用药物载体细胞内传递生物活性剂的方法，所述药物载体是由如下聚合物组合物形成，所述聚合物组合物包含含有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物及相对于1当量的聚乳酸衍生物羧基末端基团0.01-10当量的二价或者三价金属离子，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚琥珀酸或者胆固醇琥珀酸基团取代的末端羟基基团，所述聚乳酸衍生物在该聚合物末端具有至少一个末端羧基基团。
本发明进一步提供了一种细胞内传递生物活性剂的传递系统，其包含在水溶液中的生物活性剂及所述生物活性剂包封于其中的聚合物药物载体，其中所述聚合物药物载体是由包含如下(a)和(b)的聚合物组合物制备的：(a)包含亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，以及(b)聚乳酸衍生物，在该聚合物末端具有至少一个羧基基团；其中当所述药物载体与细胞接触时，包封于该聚合物药物载体中的所述生物活性剂可以大量传递至所述细胞中。
在本发明的一个实施方案中，所述生物活性剂被大量、优选以比没有所述聚合物药物载体的情况中更有效的方式传递至细胞中。
本发明进一步提供可将生物活性剂传递至靶细胞的聚合物药物载体。
特别地，本发明提供一种细胞内传递生物活性剂的方法，其包括如下步骤：
a)选择至少一种生物活性剂；
b)制备包含含有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物组合物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，而所述聚乳酸衍生物在该聚合物末端具有至少一个羧基基团；
c)将所述聚合物组合物与所述生物活性剂在溶剂中混合及溶解，并蒸发所述溶剂；
d)加入水溶液以在该溶液中形成所述生物活性剂包封于其中的聚合物药物载体；和
e)将所述药物载体与细胞接触以促进所述生物活性剂传递至所述细胞中。
选择至少一种生物活性剂
本发明的生物活性剂可以是发挥希望的生物学活性的任何有机化合物或者任何药物，其包括但不限于蛋白质，激素如睾酮、雌二醇、雌激素、孕酮、醋酸去炎松、地塞米松等等，基因，多肽，寡核苷酸，核苷酸，抗体，药物如抗癌剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗生素、麻醉剂、抗高血压剂、及治疗糖尿病的剂、抗高脂血症剂、抗病毒剂、Parkinson′s疾病治疗剂、抗痴呆剂、止吐剂、免疫抑剂、抗溃疡剂、轻泻药、抗疟剂，及诊断显影剂。抗癌剂例如包括紫杉醇、表柔比星、更生霉素、博来霉素、丝裂霉素、多西他赛、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、dausorubicin、伊达比星、ara-C、环孢霉素A等等，及其衍生物。
上述生物活性剂可以0.1～20∶80.0～99.9的重量比加入所述聚合物组合物中，以适当地包封于由两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物形成的胶束核心中。
制备聚合物组合物
本发明的两亲性嵌段共聚物优选是包含亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型双嵌段共聚物或者B-A-B型三嵌段共聚物。所述两亲性嵌段共聚物当被置于水相中时形成核心-壳型聚合物胶束，其中疏水性B嵌段形成核心，亲水性A嵌段形成壳。优选地，亲水性A嵌段是选自如下组中的成员：聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺及其衍生物。更优选地，亲水性A嵌段是选自如下组中的成员：单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯-共-丙烯二醇(polyethylene-co-propylene glycol)、及聚乙烯基吡咯烷酮。优选地，亲水性A嵌段的数均分子量为500-50,000道尔顿。更优选地，亲水性A嵌段的数均分子量为1,000-20,000道尔顿。
本发明的两亲性嵌段共聚物的疏水性B嵌段是选自以下组中的高度生物相容的和可生物降解的聚合物：聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯和聚膦嗪。更优选地，所述疏水性B嵌段是选自以下组中的一种或多种：聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚二氧六环-2-酮、聚乳酸-共-乙交酯、聚乳酸-共-二氧六环-2-酮、聚乳酸-共-己内酯及聚乙醇酸-共-己内酯。疏水性嵌段的末端基团有羟基基团，且疏水性B嵌段的羟基末端基团由具有极佳疏水性的疏水性生育酚或胆固醇基团取代，目的是增加疏水性B嵌段的疏水性同时保持其分子量。使用连接剂将生育酚或胆固醇基团与疏水性B嵌段的末端羟基基团化学结合，所述连接剂例如是二羧酸，如琥珀酸、丙二酸、戊二酸、己二酸。生育酚和胆固醇是具有环形结构的生物相容的疏水性化合物，其可增加聚合物胶束的内部疏水性，从而增强聚合物胶束的物理稳定性。优选地，两亲性嵌段共聚物的疏水性B嵌段的数均分子量为500-50,000道尔顿。更优选地，两亲性嵌段共聚物的疏水性B嵌段的数均分子量为1,000-20,000道尔顿。
本发明的两亲性嵌段共聚物的亲水性A嵌段与疏水性B嵌段的重量比优选在3∶7至8∶2范围内，更优选在4∶6至7∶3范围内。如果亲水性A嵌段的含量太低，则聚合物在水溶液中不能形成聚合物胶束，如果其含量太高，则形成的聚合物胶束不稳定。
在一个实施方案中，本发明的两亲性嵌段共聚物可以由如下化学式表示：
R1’-O-[R3’]l’-[R4’]m’-[R5’]n’-C(＝O)-(CH2)x’-C(＝O)-O-R2’(I’)
其中R1’是CH3-，H-[R5’]n’-[R4’]m’-，或者
R2’-O-C(＝O)-(CH2)x’-C(＝O)-[R5’]n’-[R4’]m’-；
R2’是生育酚或胆固醇；
R3’是-CH2CH2-O-，-CH(OH)-CH2-，-CH(C(＝O)-NH2)-CH2-，或者
R4’是-C(＝O)-CHZ’-O-，其中Z’是氢原子或者甲基基团；
R5’是-C(＝O)-CHY”-O-，其中Y”是氢原子或者甲基基团，-C(＝O)-CH2CH2CH2CH2CH2-O-，或者-C(＝O)-CH2OCH2CH2-O-；
1’是4-1150的整数；
m’是1-300的整数；
n’是0-300的整数；
X’是0-4的整数。
具有其羟基末端基团由生育酚或胆固醇取代的疏水性嵌段的嵌段共聚物可以根据如下方法制备。在一个实施方案中，将合适的连接剂例如二羧酸如琥珀酸、丙二酸、戊二酸或者己二酸引入生育酚或胆固醇的羟基基团中，并使羧化的生育酚或胆固醇与疏水性B嵌段的羟基末端基团化学结合。
在一个实施方案中，根据美国专利No.6,322,805所述方法，将包含单甲氧基聚乙二醇(mPEG；Mn＝2,000)和聚丙交酯(PLA；Mn＝1,750)的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLA)称重，使用真空泵在120℃脱水，然后溶解于乙腈或者二氯甲烷中。向其中加入生育酚琥珀酸酯或者胆固醇琥珀酸酯，称重二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)并分别作为引发剂和催化剂加入，在室温下进行反应。由于在mPEG-PLA的末端-OH与疏水性化合物的-COOH之间形成二环己基脲(DCU)，反应物变得不透明。24小时后，通过玻璃过滤器除去DCU，用盐酸水溶液萃取并除去DMAP。向该纯化产物溶液中加入MgSO4以除去任何残余的水分，然后在己烷/二乙醚溶剂中形成沉淀以获得结合了生育酚琥珀酰基或者胆固醇琥珀酰基的两亲性嵌段共聚物mPEG-PLA-生育酚或者mPEG-PLA-胆固醇(其中生育酚或胆固醇通过琥珀酸二酯与PLA结合)。过滤沉淀的聚合物，然后真空干燥获得白色颗粒状聚合物。
在另一个实施方案中，不用任何催化剂而将羧化的疏水性化合物用草酰氯活化，并将其与mPEG-PLA的末端结合。即将生育酚(或者胆固醇)琥珀酸酯与草酰氯反应，然后在室温真空下除去过量的草酰氯。称重mPEG-PLA并加入其中，反应在100℃进行12小时以获得mPEG-PLA-生育酚(或者胆固醇)。将合成的聚合物溶解于乙腈或者二氯甲烷中，在己烷/二乙醚中沉淀，过滤。
在上述两种制备方法中，可以使用生育酚(或胆固醇)丙二酸酯、生育酚(或胆固醇)戊二酸酯或者生育酚(或胆固醇)己二酸酯等代替生育酚(或胆固醇)琥珀酸酯。
在另一个实施方案中，使用二氯化物作为连接剂将生育酚或胆固醇与mPEG-PLA末端结合。具体而言，称重生育酚或胆固醇并使用真空泵在50℃脱水。向其中加入过量的连接剂，进行反应12小时。在反应完成后，在100℃在真空下除去过量加入的连接剂。向其中加入称重的mPEG-PLA，在100℃进行反应12小时。将合成的聚合物溶解于二氯甲烷中，在己烷/二乙醚中沉淀以获得其中生育酚或胆固醇通过琥珀酸二酯与PLA结合的两亲性嵌段共聚物，即mPEG-PLA-生育酚或者mPEG-PLA-胆固醇。过滤沉淀的聚合物产物，在真空下干燥以获得白色颗粒状聚合物。该反应中可以使用的连接剂可选自二氯化物如琥珀酰氯、草酰氯、丙二酰氯、戊二酰氯、己二酰氯。
本发明的聚乳酸衍生物的一或多个末端与至少一种羧酸或者羧酸盐共价结合。本发明的聚乳酸衍生物的另一端可以与选自以下组中的官能团共价结合：羟基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、癸酰氧基和棕榈酰氧基。羧酸或者羧酸盐在pH为4或更高的水溶液中作为亲水性基团，使得聚乳酸衍生物在其中形成聚合物胶束。当本发明的聚乳酸衍生物溶解于水溶液中时，聚乳酸衍生物中存在的亲水性和疏水性成分应该是平衡的，以形成聚合物胶束。因此，本发明的聚乳酸衍生物的数均分子量优选在500-2,500道尔顿范围内。聚乳酸衍生物的分子量可以通过在制备期间控制反应温度、时间等加以调节。
所述聚乳酸衍生物优选由如下化学式表示：
RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM                      (I)
其中A是-COO-CHZ-；B是-COO-CHY-、-COO-CH2CH2CH2CH2CH2-或者-COO-CH2CH2OCH2；R是氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或者乙基基团；Z和Y各自是氢原子、甲基或者苯基基团；M是H、Na、K或者Li；n是1-30的整数，m是0-20的整数。
本发明的聚乳酸的一端与羧基基团或者其碱金属盐共价结合，优选与其碱金属盐结合。形成聚乳酸衍生物的碱金属盐中的金属离子是一价离子，例如钠、钾或者锂。金属离子盐形式的聚乳酸衍生物在室温是固体，并且由于其相对中性的pH而非常稳定。
更优选地，所述聚乳酸衍生物由如下化学式表示：
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY’]q-COO-CHZ-COOM (II)
其中X是甲基基团；Y’是氢原子或者苯基基团；p是0-25的整数，q是0-25的整数，条件是p+q是5-25的整数；R、Z和M与化学式(I)中所定义的相同。
另外，以下化学式(III)、(IV)和(V)的聚乳酸衍生物也是合适的：
RO-PAD-COO-W-M’                   (III)
其中W-M’是
Figure A20058001812400221
或者
Figure A20058001812400222
PAD是选自如下组中的成员：D，L-聚乳酸、D-聚乳酸、聚扁桃酸、D，L-乳酸和乙醇酸的共聚物、D，L-乳酸与扁桃酸的共聚物、D，L-乳酸与己内酯的共聚物、以及D，L-乳酸与1，4-二氧六环-2-酮的共聚物；R和M与化学式(I)中所定义的相同。
S-O-PAD-COO-Q                      (IV)
其中S是
Figure A20058001812400223
L是-NR1-或者-O-；R1是氢原子或者C1-10烷基；Q是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH3或者CH2C6H5；a是0-4的整数；b是1-10的整数；R和M与化学式(I)中所定义的相同；PAD与化学式(III)中所定义的相同。
Figure A20058001812400224
或
Figure A20058001812400225
其中R’是-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，M与化学式(I)中所定义的相同；PAD与化学式(III)中所定义的相同；a是1-4的整数(当a＝1时，其是3-arm PLA-COONa；如果a＝2，其是4-armPLA-COONa；当a＝3时，其是5-arm PLA-COONa；如果a＝4，其是6-arm PLA-COONa)。
聚合物(化学式V)的合成引发剂包括甘油、赤藓糖醇、苏糖醇(threltol)、季戊四醇(pentaerytritol)、木糖醇、核糖醇、山梨醇和甘露醇。
基于两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的总重量，本发明的聚合物组合物可以含有0.1-99.9重量％的两亲性嵌段共聚物和0.1-99.9重量％的聚乳酸衍生物。优选地，本发明的聚合物组合物含有20-95重量％的两亲性嵌段共聚物和5-80重量％的聚乳酸衍生物。更优选地，本发明的聚合物组合物含有50-90重量％的两亲性嵌段共聚物和10-50重量％的聚乳酸衍生物。
尽管本发明的聚乳酸衍生物单独即可在pH为4或更高的水溶液中形成胶束，但是包含两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物组合物可以在任何pH值的水溶液中形成胶束，且本发明的聚合物组合物可以在pH1-10的范围内使用，优选在pH4-8的范围内使用。根据聚合物的分子量及聚乳酸衍生物与两亲性嵌段共聚物之比，由本发明的聚合物组合物制备的胶束或者纳米颗粒的粒径可以在1-400nm范围内调节，优选在5-200nm范围内调节。
在本发明的一个实施方案中，聚乳酸衍生物的羧基末端基团与二价或者三价金属离子结合或固定。金属离子固定的聚合物组合物可以通过向两亲性嵌段共聚物与聚乳酸衍生物的聚合物组合物中加入二价或三价金属离子而制备。所述聚合物胶束或者纳米颗粒可以通过改变加入的结合或者固定聚乳酸衍生物的羧基末端基团的二价或者三价金属离子的量而形成。
所述二价或者三价金属离子优选是选自如下组中的成员：Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cr3+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+及Al3+。二价或者三价金属离子可以硫酸盐、氯化物、碳酸盐、磷酸盐或者羟基化物的形式，优选CaCl2、MgCl2、ZnCl2、AlCl3、FeCl3、CaCO3、MgCO3、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、AlPO4、MgSO4、Ca(OH)2、Mg(OH)2、Al(OH)3、或者Zn(OH)2的形式加入两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物的聚合物组合物中。
聚合物胶束或纳米颗粒可以通过改变加入的金属离子的当量数而制备。特别地，如果相对于羧基末端基团加入0.5当量或更少的二价金属离子，则可以与聚乳酸衍生物的羧基末端基团形成键合的金属离子是不足够的，因此形成聚合物胶束。如果加入0.5当量或更多的二价金属离子，则可以与聚乳酸衍生物的羧基末端基团形成键合的金属离子足以稳固地固定胶束，因此形成纳米颗粒。
另外，药物从聚合物胶束或者纳米颗粒中的释放速度可以通过改变加入的金属离子的当量数而改变。如果金属离子相对于聚乳酸衍生物的羧基基团以1当量或更低的量存在，则会降低可与聚乳酸衍生物羧基末端基团结合的数目，由此而增加药物释放速度。如果金属离子以1当量或更高的量存在，则会增加可与聚乳酸衍生物羧基末端基团结合的数目，由此降低药物释放速度。因此，为了增加药物在血液中的释放速度，应使用小当量的金属离子，为了降低药物释放速度，则应使用大当量的金属离子。
金属离子固定的本发明的聚合物组合物可含有5-95重量％的两亲性嵌段共聚物，5-95重量％的聚乳酸衍生物及相对于聚乳酸衍生物的羧基末端基团的当量数0.01-10当量的二价或者三价金属离子。优选地，其含有20-80重量％的两亲性嵌段共聚物，20-80重量％的聚乳酸衍生物及0.1-5当量的二价或者三价金属离子；更优选地，其含有20-60重量％的两亲性嵌段共聚物，40-80重量％的聚乳酸衍生物及0.2-2当量的二价或者三价金属离子。
将所述聚合物组合物和生物活性剂在溶剂中混合及溶解并蒸发所述 溶剂；配制生物活性剂包封于其中的药物载体溶液
本发明的药物载体可以是由聚合物组合物形成的聚合物胶束或者纳米颗粒，所述聚合物组合物包含含有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物和在聚合物末端具有至少一个末端羧基基团的聚乳酸衍生物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基。
本发明的纳米颗粒或者胶束可以由聚合物组合物形成，所述聚合物组合物包含含有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段共聚物和聚乳酸衍生物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的羟基末端基团，所述聚乳酸衍生物在与二价或者三价金属离子结合或固定的末端具有至少一个末端羧基基团。
根据所述生物活性剂，所述生物活性剂可以包封于所述胶束或者纳米颗粒中，或者其可以通过与可生物降解的聚乳酸衍生物的羧基基团形成稳定的离子复合物而掺入本发明的胶束或纳米颗粒中。
可以将所述两亲性嵌段共聚物、聚乳酸衍生物及水溶性较差的药物以一定比例溶解于一或多种混合的有机溶剂中，所述有机溶剂选自以下组中：丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙酸和二氧六环。可以从其中除去所述有机溶剂以制备水溶性较差的药物与聚合物的同质混合物。本发明的水溶性较差的药物与聚合物组合物的同质混合物可以在0-80℃加入pH4-8的水溶液中，形成含有水溶性较差的药物的混合的聚合物胶束水溶液。然后可以将上述含有药物的聚合物胶束水溶液冻干，以制备固体形式的聚合物胶束组合物。
向含有水溶性较差的药物的混合的聚合物胶束水溶液中加入含有0.001-2M二价或三价金属离子的水溶液。将该混合物在室温缓慢搅拌0.1-1小时，然后冻干以制备固体形式的金属离子固定的聚合物胶束或者纳米颗粒。
将药物载体与细胞接触
为了口服或者非胃肠道给予生物活性剂，将所述生物活性剂包封于药物载体中，并因此使其增溶。特别地，金属离子固定的聚合物胶束或者纳米颗粒在血流中长时间保留并在靶损害处积聚。在胶束降解时，所述生物活性剂从胶束的疏水性核心中释放以发挥药理学作用。
对于非胃肠道传递，所述聚合物组合物可以静脉内、肌内、腹膜内、经鼻、直肠内、眼内、或者肺内给予。对于口服给予，将生物活性剂与本发明的药物载体混合，然后以片剂、胶囊或者水溶液形式给予。本发明的聚合物组合物可以根据特定药物需要而以不同剂量范围给予。如医药领域所熟知，任一患者的给药剂量依赖于许多因素，包括患者的体重、体表面积、年龄、给予的特定化合物、性别、给予时间和途径、一般健康状况、及同时给予的其它药物。
生物活性剂的细胞内在化
生物活性剂的细胞内在化可以使用含有药物的组合物通过流式细胞仪和共焦显微镜进行研究。作为本发明的实施例，将人子宫癌细胞系(MES-SA；MES-SA/Dx-5)和人乳腺癌细胞系(MCF-7；MCF-7/ADR)用本发明的药物组合物处理。细胞系MES-SA和MCF-7均是多柔比星敏感的细胞系，细胞系MES-SA/Dx-5、MCF-7/ADR是多柔比星抗性细胞系。
如图2A-3B和表2A和2B所示，与常规溶液制剂(游离-Dox)相比，药物从本发明的药物组合物(组合物1)中更有效地进入细胞中。最显著地，从本发明药物组合物中吸收药物的细胞数目比从常规溶液制剂中吸收药物的细胞数目高5倍。特别地，在药物抗性细胞系中明显见到多柔比星被摄入细胞中。因此，本发明的药物组合物可用于克服化疗中的多重药物抗性。
图4A-4H中共焦图象示出流式细胞仪结果：当用本发明的药物组合物处理时，更多的药物被细胞吸收。在图4A-4H中，左侧图片是在用常规溶液制剂处理后的共焦图象，右侧图片是在用本发明的组合物处理后的共焦图象。如图4B、4D、4F和4H所示，在细胞质和细胞核区室中检测到所述胶束或纳米颗粒。
另外，图5A-5B和表3示出的MTT分析结果支持了流式细胞仪和共焦显微镜研究的结果。对于MTT分析，测试了本发明的含有多柔比星的组合物(组合物1)和常规的多柔比星制剂(游离-Dox)对人子宫癌细胞系MES-SA(多柔比星敏感细胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性细胞系)的作用。如图5A所示，这两种组合物对于多柔比星敏感细胞的细胞毒性活性相似，但是如图5B所示，当用这两种组合物处理多柔比星抗性细胞时，与常规溶液制剂相比本发明的药物组合物在处理3天后示出高6.7倍的活性。这种活性差异是由于药物抗性细胞系的特点所致，其中P-糖蛋白(P-gp)是过表达的并且它们持续地将细胞毒性药物从细胞中挤出。由于游离药物不能在药物抗性细胞中集中，该结果提示本发明的药物载体与掺入该药物载体中的药物一起进入细胞中。
从本发明的药物载体的物理稳定性和细胞内在化研究结果中，可以断定大多数本发明的含有生物活性剂的组合物以胶束或者纳米颗粒形式通过胞吞而不是其结构的毁坏而进入细胞质中。这种细胞内在化过程示于图1中：1代表药物，2代表胶束或者纳米颗粒的内部核心，3代表胶束或者纳米颗粒的外壳，4代表胞外液体，5代表细胞膜，6代表细胞质。
以Sprague-Dawley大鼠(200-250g)，使用含有多柔比星的本发明组合物(组合物1-5)及常规多柔比星制剂(游离-Dox)进行药动学实验。如图6和表4所示，与常规多柔比星制剂相比，本发明的组合物呈现在血液中循环时间延长。本发明的组合物1的由血液浓度-时间曲线下的面积(AUC)计算的生物利用度比常规多柔比星制剂高63倍。
本发明的药物载体可以提供延长的体循环时间，因为其尺寸较小(＜100nm)、其亲水性壳使得被MPS的摄取降至最低、并且其高分子量防止了被肾脏排泄。本发明的药物载体可用作水溶性药物、肽和蛋白质以及水溶性较差的药物的载体。如细胞内在化研究所证实，本发明的含有生物活性剂的组合物在水性介质中形成如此稳定的胶束或纳米颗粒，以至于可以以胶束或者纳米颗粒形式通过胞吞进入细胞质中而不会破坏其结构。另外，通过本发明的组合物可以实现生物活性剂在肿瘤组织中更多地积聚。
最佳实施方式
如下实施例可以使本领域技术人员更清楚地理解怎样实施本发明。应理解尽管结合本发明优选的具体实施方案对本发明进行了描述，但如下实施例只是用于举例说明本发明，而无任何限制本发明范围之意。本发明的其它方面对于本领域技术人员而言将显而易见。
制备例1：PEG和PLA的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLA)
将20g单甲氧基聚乙二醇(分子量为2,000的mPEG)、20g从乙酸乙酯中重结晶的D，L-丙交酯及溶解于5ml甲苯中的0.2g辛酸亚锡的混合物加入配有机械搅拌器和蒸馏设施的反应器中。在120℃蒸发残余的甲苯。反应在真空下(25mmHg)进行。发生聚合6小时后，将所得聚合物溶解于二氯甲烷中并倒入冷却的二乙醚中(4℃)以使聚合物沉淀。将沉淀的聚合物用二乙醚洗涤两次并在真空下(0.1mmHg)干燥24小时。通过核磁共振(NMR)光谱分析确定的嵌段共聚物的分子量为2,000-1,800(对于PEG嵌段为2,000，对于PLA嵌段为1,800)。
制备例2：PEG和PLGA的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLGA)
通过与制备例1中所述的相同程序，使用14g D，L-丙交酯和6g乙交酯代替20g D，L-丙交酯制备双嵌段共聚物(mPEG-PLGA，LA∶GA＝70∶30重量比)。通过NMR确定的嵌段共聚物的分子量为2,000-1,750(对于PEG嵌段为2,000，对于PLGA嵌段为1,750)。
制备例3：PEG和PCL的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PCL)
通过与制备例1中所述的相同程序，使用20gε-己内酯代替D，L-丙交酯制备双嵌段共聚物(mPEG-PCL)。通过NMR确定嵌段共聚物的分子量为2,000-1,800(对于PEG嵌段为2,000，对于PCL嵌段为1,800)。
制备例4：PEO和PLA的两亲性嵌段共聚物(PLA-PEO-PLA)
通过与制备例1中所述的相同程序，使用20g聚乙二醇(分子量为2,000的PEG)代替单甲氧基聚乙二醇(分子量为2,000的mPEG)制备三嵌段共聚物(PLA-PEO-PLA)。通过NMR确定嵌段共聚物的分子量为850-2,000-850(对于PEO嵌段为2,000，每个PLA嵌段均为900)。
制备例5：生育酚琥珀酸酯
将8.6g生育酚、2.4g琥珀酸酐和2.9g 4-(二甲胺)吡啶(DMAP)的混合物在配有机械搅拌器的反应器中溶解于100ml的1，4-二氧六环中。反应在室温进行。在搅拌24小时后，将反应混合物引入HCl溶液中以沉淀生育酚琥珀酸酯(10.2g；产率＝96％)。
制备例6：胆固醇琥珀酸酯
通过与制备例5中所述的相同程序，使用7.7g胆固醇代替生育酚制备胆固醇琥珀酸酯(9.1g；产率＝94％)。
制备例7：在疏水性嵌段末端具有生育酚基团的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Toco)
将10.0g(2.6mmol)在制备例1中制备的mPEG-PLA与1.7g(3.2mmol)在制备例5中制备的生育酚琥珀酸酯的混合物在配有机械搅拌器的反应器中溶解于50 ml乙腈中。0.78g(3.8mmol)的二环己基碳二亚胺(DCC)和0.046g(0.38mmol)的4-(二甲胺)吡啶(DMAP)用作催化剂。在室温搅拌24小时后，使用玻璃过滤器过滤该混合物以除去二环己基脲(dicyclohexylcarbourea)。残余的催化剂用HCl水溶液萃取，向聚合物溶液中加入硫酸镁以除去水。使所得产物(mPEG-PLA-Toco)从n-己烷/二乙醚(6/4，v/v)共溶剂中重结晶。过滤重结晶的产物并在真空下干燥，获得白色粉末状产物(9.9g；产率＝87％)。
制备例8：在疏水性嵌段末端具有生育酚基团的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLGA-Toco)
通过与制备例7中所述的相同程序，使用9.8g(2.6mmol)在制备例2中制备的mPEG-PLGA代替在制备例1中制备的mPEG-PLA制备两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLGA-Toco)(9.5g；产率＝83％)。
制备例9：在疏水性嵌段末端具有生育酚基团的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PCL-Toco)
通过与制备例7中所述的相同程序，使用10.0g(2.6mmol)在制备例3中制备的mPEG-PCL代替在制备例1中制备的mPEG-PLA制备两亲性嵌段共聚物(mPEG-PCL-Toco)(10.1g；产率＝89％)。
制备例10：在疏水性嵌段末端具有生育酚基团的两亲性嵌段共聚物(Toco-PLA-PEO-PLA-Toco)
通过与制备例7中所述的相同程序，使用9.6g(2.6mmol)在制备例4中制备的PLA-PEO-PLA代替在制备例1中制备的mPEG-PLA制备两亲性嵌段共聚物(Toco-PLA-PEO-PLA-Toco)(9.2g；产率＝84％)。
制备例11：在疏水性嵌段末端具有胆固醇基团的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Chol)
通过与制备例7中所述的相同程序，使用1.6g(3.2mmol)在制备例6中制备的胆固醇琥珀酸酯代替在制备例5中制备的生育酚琥珀酸酯制备两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Chol)(9.7g；产率＝86％)。
制备例12：可生物降解的聚酯(PLMA-COONa)
(1)PLMA-COOH的制备
将7.5g D，L-乳酸(0.083mol)和2.5g D，L-扁桃酸(0.016mol)的混合物加入配有机械搅拌器和蒸馏设施的反应器中。在80℃在减压下(25mmHg)用吸气器蒸发水分。反应在真空下(10mmHg)在180℃高温进行5小时。将所得产物加入蒸馏水中，将沉淀的聚合物用蒸馏水进一步洗涤。然后将聚合物产物加入0.1升蒸馏水中，通过向其中逐步加入碳酸氢钠将该水溶液的pH调节为6-8以溶解该聚合物。通过离心或过滤分离和除去不可溶于水的聚合物。向其中滴加1N盐酸溶液，将聚合物在该水溶液中沉淀。将沉淀的聚合物用蒸馏水洗涤两次，分离并在减压下干燥，获得具有羧基末端基团的聚合物(6.7gPLMA-COOH，产率＝67％)。通过NMR确定该聚合物的数量平均分子量为1,100。
(2)PLMA-COONa的制备
将5g PLMA-COOH聚合物溶液在配有机械搅拌器和蒸馏设施的反应器中溶解于丙酮中。将该溶液在室温缓慢搅拌，向其中缓慢加入碳酸氢钠溶液(1N)，以使pH达到7。向其中加入无水硫酸镁以除去任何残余的水分。过滤该混合物，将残余的丙酮用旋转蒸发器蒸发，由此获得白色固体产物。将该固体产物再溶解于无水丙酮中，过滤该溶液以除去不溶的颗粒，蒸发丙酮，获得白色固体状终产物PLMA-COONa(产率：95％)。
制备例13：可生物降解的聚酯(3arm-PLA-COOK)
(1)3arm-PLA-OH的制备
将1.0g(0.011mol)甘油加入配有机械搅拌器和蒸馏设施的反应器中。在80℃使水分蒸发30分钟。向其中加入于甲苯中的0.036g(0.089mmol)辛酸亚锡，将残余的甲苯在120℃蒸发，将从乙酸乙酯中重结晶的36g(0.25mol)D，L-丙交酯引入反应器中。在真空下(20mmHg)在130℃进行反应。聚合6小时后，将所得聚合物溶解于丙酮中，向其中滴加NaHCO3水溶液(0.2N)以使聚合物沉淀。将沉淀的聚合物用蒸馏水洗涤3次，在减压下干燥，获得白色粉末形式的聚合物(3arm-PLA-OH)。通过NMR光谱分析确定该聚合物分子量为3,050。
(2)3arm-PLA-COOH的制备
将10g(3.28mmol)如上述制备的3arm-PLA-OH聚合物加入配有机械搅拌器和蒸馏设施的反应器中。在120℃使水分蒸发1小时。向其中加入1.96g(19.6mmol)琥珀酸酐，在125℃实施反应6小时。将所得聚合物溶解于丙酮中，向其中滴加蒸馏水以使聚合物沉淀。将沉淀的聚合物在60℃溶解于NaHCO3水溶液(0.2N)中，向其中滴加HCl水溶液(1N)以使聚合物沉淀。将沉淀的聚合物用蒸馏水洗涤3次，在真空下干燥，获得白色粉末形式的聚合物(3arm-PLA-COOH)。通过NMR光谱分析确定该聚合物的分子量为3,200。
(3)3arm-PLA-COOK的制备
最后，通过与制备例12中所述的相同程序，使用5g如上述制备的3arm-PLA-COOH聚合物和碳酸氢钾溶液(1N)代替PLMA-COOH聚合物和碳酸氢钠溶液(1N)制备可生物降解的聚酯(3arm-PLA-COOK)(产率＝90％)。
制备例14：可生物降解的聚酯(4arm-PLA-COONa)
(1)4arm-PLA-OH的制备
通过与制备例13中所述的相同程序，使用1.5g(0.011mol)季戊四醇代替甘油制备4arm-PLA-OH聚合物。通过NMR光谱分析确定该聚合物(4arm-PLA-OH)的分子量为3,100。
(2)4arm-PLA-COOH的制备
通过与制备例13中所述的相同程序，使用10g(3.23mmol)如上述制备的4arm-PLA-OH聚合物和2.58g(25.8mmol)琥珀酸酐代替10g(3.28mmol)3arm-PLA-OH聚合物和1.96g(19.6mmol)琥珀酸酐制备4arm-PLA-COOH聚合物。通过NMR光谱分析确定该聚合物(4arm-PLA-COOH)的分子量为3,300。
(3)4arm-PLA-COONa的制备
最后，通过与制备例12中所述的相同程序，使用5g如上述制备的4arm-PLA-COOH聚合物代替PLMA-COOH聚合物制备可生物降解的聚酯(4arm-PLA-COONa)(产率＝92％)。
制备例15：可生物降解的聚酯(PLA-COONa)
(1)PLA-COOH的制备
通过与制备例12中所述的相同程序，使用10g D，L-乳酸(0.11mmol)制备PLA-COOH(产率＝78％)。通过NMR确定该聚合物的数量平均分子量为1,100。
(2)PLA-COONa的制备
通过与制备例12中所述的相同程序，使用5g如上述制备的PLA-COOH聚合物代替PLMA-COOH聚合物制备可生物降解的聚酯(PLA-COONa)(产率＝92％)。
实施例1：含有药物的组合物(组合物1：多柔比星/mPEG-PLA-Toco/PLMA-COONa)
将10mg盐酸多柔比星在圆底烧瓶中溶解于5ml乙醇-水(9∶1v/v)中。向其中加入810mg在制备例7中制备的两亲性嵌段共聚物(mPEG-PLA-Toco)和180mg在制备例12中制备的可生物降解的聚酯(PLMA-COONa)，使其完全溶解形成清澈的溶液。将溶剂在升高的温度(60℃)及真空下使用旋转蒸发器蒸发。加入3ml乳糖水溶液(20重量％)，并将该烧瓶用旋转蒸发器在60℃以100rpm转动，以在水性介质中形成胶束或者纳米颗粒。使用0.22μm PVDF滤膜过滤该溶液。将过滤的溶液冻干并贮存在冰箱中直至使用。过滤的溶液中的胶束或者纳米颗粒的粒径通过动态光散射法(DLS，ZetaPlus，Brookhaven Instruments Ltd.)测定。通过使用道诺霉素作为内标以HPLC分析多柔比星含量而计算载药率(相对于初始使用的药物，掺入胶束或者纳米颗粒中药物的wt.％)。进行HPLC分析的条件如下：
进样体积：75μl
流速：1.0ml/分钟
流动相：在40分钟将溶剂B从15％梯度增加至85％(溶剂A：1％乙酸；溶剂B：乙腈)
温度：室温
柱：C-18(Vydac，多环(multi-ring)，孔大小：5μm)
波长：485nm
根据动态光散射(DLS)方法测定粒径。
结果示于表1。
实施例2：含有药物的组合物(组合物2：多柔比星/mPEG-PLGA-Toco/PLMA-COONa)
通过与实施例1中所述的相同程序，使用在制备例8中制备的mPEG-PLGA-Toco代替mPEG-PLA-Toco制备含有药物的组合物(组合物2)。
结果示于表1。
实施例3：含有药物的组合物(组合物3：多柔比星/mPEG-PCL-Toco3arm-PLA-COOK)
通过与实施例1中所述的相同程序，使用在制备例9中制备的mPEG-PCL-Toco和在制备例13中制备的3arm-PLA-COOK代替mPEG-PLA-Toco和PLMA-COONa制备含有药物的组合物(组合物3)。
结果示于表1。
实施例4：含有药物的组合物(组合物4：多柔比星/Toco-PLA-PEO-PLA-Toco/4arm-PLA-COONa)
通过与实施例1中所述的相同程序，使用在制备例10中制备的Toco-PLA-PEO-PLA-Toco和在制备例1 4中制备的4arm-PLA-COONa代替mPEG-PLA-Toco和PLMA-COONa制备含有药物的组合物(组合物4)。
结果示于表1。
实施例5：含有药物的组合物(组合物5：多柔比星/mPEG-PLA-Chol/PLMA-COONa)
通过与实施例1中所述的相同程序，使用在制备例11中制备的mPEG-PLA-Chol代替mPEG-PLA-Toco制备含有药物的组合物(组合物5)。
实施例6：含有药物的组合物(组合物6：表柔比星/mPEG-PLA-Toco/PLMA-COONa)
通过与实施例1中所述的相同程序，使用表柔比星代替多柔比星制备含有药物的组合物(组合物6)。
结果示于表1。
实施例7：含有药物的组合物(组合物7：Ca2+-固定的紫杉醇/mPEG-PLA-Toco/PLA-COONa)
(1)含有紫杉醇的水溶液的制备
将248.1mg在制备例15中制备的PLA-COONa、7.5mg紫杉醇和744.3mg在制备例7中制备的mPEG-PLA-Toco的混合物完全溶解于5ml乙醇中，获得清澈的溶液。从中除去乙醇以制备含有紫杉醇的聚合物组合物。向其中加入蒸馏水(6.2ml)，将该混合物在60℃搅拌30分钟，以制备含有紫杉醇的水溶液。
(2)用二价金属离子固定
将0.121ml(0.109mmol)的0.9M无水氯化钙水溶液加入如上制备的含有紫杉醇的水溶液中，将混合物在室温搅拌20分钟。使用0.22μm PVDF滤膜过滤该混合物。将过滤的溶液冻干并贮存在冰箱中直至使用。
结果示于表1。
实施例8：含有药物的组合物(组合物8：Mg2+-固定的紫杉醇/mPEG-PLGA-Toco/PLMA-COONa)
通过与实施例7中所述的相同程序制备Mg2+-固定的含有紫杉醇的组合物，不同之处是使用248.1mg在制备例12中制备的PLMA-COONa(Mn：1,096)、7.5mg紫杉醇、744.3mg在制备例8中制备的mPEG-PLGA-Toco及0.230ml(0.113mmol)的0.5M氯化镁6水合物水溶液(Mw：203.31)。
结果示于表1。
实施例9：含有药物的组合物(组合物9：Ca2+-固定的紫杉醇/mPEG-PLA-Toco/PLMA-COONa)
通过与实施例7中所述的相同程序制备Ca2+-固定的含有紫杉醇的组合物，不同之处是使用248.1mg在制备例12中制备的PLMA-COONa、7.5mg紫杉醇、744.4mg在制备例7中制备的mPEG-PLA-Toco及0.230ml(0.113mmol)的0.9M无水氯化钙水溶液。
结果示于表1。
实施例10：含有药物的组合物(组合物10：Ca2+固定的紫杉醇/mPEG-PLA-Chol/PLMA-COONa)
通过与实施例7中所述的相同程序制备Ca2+固定的紫杉醇组合物，不同之处是使用248.1mg在制备例12中制备的PLMA-COONa、7.5mg的紫杉醇、744.4mg在制备例11中制备的mPEG-PLA-Chol及0.230ml(0.113mmol)的0.9M无水氯化钙的水溶液。结果示于表1。
表1
    药物 两亲性嵌段共聚物   可生物降解的聚酯   包封率(％)    粒径(nm)
    初始重量 10mg 810mg 180mg - -
    组合物1     多柔比星     mPEG-PLA-Toco   PLMA-COONa     98     32
    组合物2     多柔比星     mPEG-PLGA-Toco   PLMA-COONa     97     28
    组合物3     多柔比星     mPEG-PCL-Toco   3arm-PLA-COOK     95     41
    组合物4     多柔比星     Toco-PLA-PEO-PLA-Toco   4arm-PLA-COONa     95     57
    组合物5     多柔比星     mPEG-PLA-Chol   PLMA-COONa     96     35
    组合物6     表柔比星     mPEG-PLA-Toco   PLMA-COONa     97     38
    组合物7     紫杉醇     mPEG-PLA-Toco   PLA-COONa     99     29
    组合物8     紫杉醇     mPEG-PLGA-Toco   PLMA-COONa     101     30
    组合物9     紫杉醇     mPEG-PLA-Toco   PLMA-COONa     100     34
    组合物10     紫杉醇     mPEG-PLA-Chol   PLMA-COONa     99     34
实施例11：药物的细胞内摄取的评价：流式细胞仪
为了评价生物活性剂的细胞内摄取，测试了本发明的含有多柔比星的组合物(实施例1中组合物1)和常规的多柔比星制剂(盐酸多柔比星的水溶液，游离-Dox)对人子宫癌细胞系MES-SA(多柔比星敏感细胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性细胞系)的作用。
根据Walker等(Experimental Cell Research 207：142(1993))所述方法，使用FACStarPlus(Becton Dickinson)进行流式细胞计量研究。简而言之，将细胞(1.0×106)在补加了10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的McCoy′s 5A培养基(Invitrogen Corp.)中温育。在温育24小时之后，将细胞用1.0μg/ml剂量的所述药物组合物处理。将于12×75 Falcon管中的细胞置于FACStarPlus上，在488nm(激发)和519nm(发射)的波长下观测荧光。数据通过CellQuest软件分析，结果示于图3A-4B及总结于表2A和2B。
表2A：吸收药物的细胞数目(％)
Figure G05818124120061206D000301
比值*＝组合物1/游离-Dox
表2B：荧光强度的改变(Δ)
Figure G05818124120061206D000302
比值*＝组合物1/游离-Dox
如图2A-3B及表2A和2B所示，与常规溶液制剂(游离-Dox)相比，药物更有效地从本发明的药物组合物(组合物1)中进入细胞中。特别地，多柔比星在药物抗性细胞系中显著地被摄取。
实施例12A：共焦显微镜检：MES-SA细胞中的含有多柔比星的组合物
为了使生物活性剂的细胞内摄取可视化，测试了本发明的含有多柔比星的组合物(实施例1中的组合物1)和常规的多柔比星制剂(盐酸多柔比星的水溶液，游离-Dox)对人子宫癌细胞系MES-SA(多柔比星敏感细胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性细胞系)的作用。
在具有倒置荧光显微镜和图像分析仪的Zeiss(Thornwood，NY)LSM510共焦成像系统上使细胞成像。简而言之，将于补加了10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的3ml McCoy′s 5A培养基(InvitrogenCorp.)中的细胞(3×105)在37℃在玻璃盖玻片上温育过夜。在温育后，将细胞用1.0μg/ml剂量的药物组合物处理，并将盖玻片置于显微镜上。以给定的时间间隔在484nm激发波长下观测荧光，结果示于图4A-4D。
图4A-4D中的共焦图像示出流式细胞计量结果：当用本发明的含有多柔比星的组合物进行处理时，细胞中吸收了更多的多柔比星。在图4A-4D中，左侧图片是在用常规溶液制剂处理后的共焦图像，右侧的图像是在用本发明的组合物处理后的图像。如图4B和4D所示，在细胞质和细胞核区室中检测到胶束或者纳米颗粒。
实施例12B：共焦显微镜检：MCF-7细胞中的含有表柔比星的组合物
为了使药物的细胞内摄取可视化，测试了本发明的含有表柔比星的组合物(实施例6中的组合物6)和常规的表柔比星制剂(盐酸表柔比星的水溶液)对人乳腺癌细胞系MCF-7(表柔比星敏感细胞系)和MCF-7/ADR(表柔比星抗性细胞系)的作用。
通过与实施例12A中所述的相同程序，使用RPMI培养基(Invitrogen Corp.)代替McCoy′s 5A培养基获得共焦图像，结果示于图4E-4H。
图4E-4H的共焦图像示出流式细胞计量结果：当用本发明的含有表柔比星的组合物进行处理时，细胞中吸收了更多的表柔比星。在图4E-4H中，左侧图片是在用常规溶液制剂处理后的共焦图像，右侧图像是用本发明的组合物处理后的图像。如图4F和4H所示，在细胞质和细胞核区室中检测到所述胶束或者纳米颗粒。
实施例13：体外细胞毒性
为了进行本发明的组合物的体外细胞毒性测试，测试了本发明的含有多柔比星的组合物(实施例1中组合物1，Doxo-PNP)和常规多柔比星制剂(盐酸多柔比星水溶液，游离-Dox)对于人子宫癌细胞系MES-SA(多柔比星敏感细胞系)和MES-SA/Dx-5(多柔比星抗性细胞系)的作用。MTT分析是一种经充分确立的细胞毒性测试方法。当将细胞用MTT(甲基噻唑四唑鎓)处理时，通过仅在活细胞中存在的酶的作用由MTT-四唑鎓还原产生MTT-甲(死亡的细胞不能将MTT-四唑鎓还原为MTT-甲
Figure 10003_1
)。MTT-甲
Figure 10003_2
的荧光通过荧光读出器检测，光密度与细胞的数目相关。该程序是自动化的，通过微平板读出器中安装的软件计算细胞生存力和IC50值(50％细胞生长抑制浓度)。
每种组合物的细胞毒性活性以0.01至100μg/ml的5个10倍稀释度在这两种人肿瘤细胞系中评价。在持续暴露3天后，将细胞用MTT(甲基噻唑四唑鎓)处理。通过荧光读出器检测通过活细胞中存在的酶的作用而由MTT-四唑鎓还原产生的MTT-甲。光密度与细胞数目相关。两个独立实验的结果均以各细胞系的IC50值(50％抑制浓度)表示。基本如Carmichael等(Cancer Research 47：936(1987))所述的方法进行MTT分析。简而言之，从补加了10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的McCoy′s 5A培养基(Invitrogen Corp.)中生长的指数生长期培养物中收获细胞，计数并铺板于96孔微滴定平板中(每个细胞系100个细胞悬浮液，5×104细胞/ml)。在恢复24小时后使细胞继续指数生长，向孔中加入培养基(每个平板24个对照孔)或者含有药物的培养基。各药物浓度一式三份铺板。在持续暴露于药物3天后，将细胞用25μl于无菌水中的MTT溶液(2mg/ml)处理。使用自动微平板读出器(SpectraMax 190，Molecular Devices)在549nm波长测定荧光，由光密度计算存活细胞数目。
细胞存活研究结果示于图5A和5B，各细胞系的IC50值(50％抑制浓度)总结于表3。
表3：MTT分析(IC50，μg/ml)
Figure G05818124120061206D000331
比值*＝游离-Dox/组合物1
如图5A所示，这两种组合物对于多柔比星敏感细胞的细胞毒性活性相似，但是当处理多柔比星抗性细胞时，如图5B所示，与常规溶液制剂相比本发明的药物组合物在处理后3天时示出高6.7倍的活性。这种活性差异是由于药物抗性细胞的特点所致，在药物抗性细胞中P-糖蛋白(P-gp)是过表达的，并且其持续地将细胞毒性药物挤出细胞外。由于游离药物不能在药物抗性细胞中积聚，该结果提示本发明的药物载体与掺入该药物载体中的药物一起进入细胞中。
实施例14：在大鼠中的药动学
在7-8周龄的Sprague-Dawley大鼠(200～250g)中，在静脉内给予本发明的含有多柔比星的组合物(实施例1-5中的组合物1-5)和常规多柔比星制剂(盐酸多柔比星水溶液，游离-Dox)之后测定血浆中药物浓度。
向大鼠通过尾静脉静脉内注射5mg/kg的剂量(每种制剂注射5只大鼠)。在注射药物1分钟、5分钟、15分钟、30分钟及1小时、2小时、4小时、8小时和24小时后自尾静脉收集血样。将血样立即离心，分离血浆。将血浆样品贮存在-50℃直至进行分析。通过如实施例1所述的HPLC分析方法分析多柔比星。
血液浓度—时间曲线(C-t曲线)示于图6，使用线性梯形法则计算血液浓度-时间曲线下的面积(AUC)。结果示于表4。
表4：在大鼠中的药动学
Figure G05818124120061206D000341
应理解上文参照的实施方案只是用于举例说明本发明原理的应用。在不偏离本发明精神和范围内可以对本发明进行多种修改和变化。尽管在附图中对本发明进行了图示，并且结合本发明的目前被认为是最为可行以及优选的实施方案进行了具体和详细的描述，本领域技术人员显然知道在不偏离如本文所述的原理和观念的条件下，可以对本发明进行多种修改。

Claims (16)

1.一种用于细胞内传递生物活性剂的组合物，其包含在水溶液中的生物活性剂及所述生物活性剂包封于其中的聚合物药物载体，其中所述聚合物药物载体是由包含如下(a)和(b)的聚合物组合物制备的：(a)由亲水性嵌段和疏水性嵌段组成的两亲性嵌段共聚物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团，和(b)在聚合物末端具有至少一个羧基基团的聚乳酸衍生物；其中当所述药物载体与细胞接触时，包封于该聚合物药物载体中的所述生物活性剂可被大量传递至所述细胞中，
其中
-所述聚乳酸衍生物具有500–2500道尔顿的数均分子量并由如下式(II)和(V)之一表示：
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY’]q-COO-CHZ-COOM      (II)其中X是甲基基团，Y’是氢原子或者苯基基团，p是0－25的整数，q是0－25的整数，条件是p+q是5－25的整数，R是氢原子、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、棕榈酰基、甲基或者乙基基团，Z是氢原子、甲基或者苯基基团，并且M是H、Na、K或Li；以及
Figure FDA0000665821570000011
其中R’是-PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM，而PAD是选自如下组中的成员：D,L-聚乳酸、D-聚乳酸、以及D,L-乳酸与扁桃酸的共聚物，M是H、Na、K或者Li，a是1－4的整数；
-所述亲水性嵌段是数均分子量为1000–20000道尔顿的mPEG或PEG，而所述疏水性嵌段是选自如下组中之一：聚丙交酯、聚己内酯、以及聚乳酸-共-乙交酯，且其数均分子量为1000–20000道尔顿，其中所述羧基末端基团由生育酚琥珀酸或者胆固醇琥珀酸基团取代，而且该亲水性嵌段与疏水性嵌段的重量比为4:6–7:3；
-基于所述两亲性嵌段共聚物与聚乳酸衍生物的总重量，所述聚合物组合物包含50－90重量％的两亲性嵌段共聚物及10－50重量％的聚乳酸衍生物；以及
-所述生物活性剂与聚合物组合物的重量比是0.1～20.0:80.0～99.9。
2.一种制备权利要求1的用于细胞内传递生物活性剂的组合物的方法，其包括如下步骤：
a)选择至少一种生物活性剂；
b)制备包含含有亲水性嵌段和疏水性嵌段的两亲性嵌段和在聚合物末端具有至少一个羧基基团的聚乳酸衍生物的聚合物组合物，其中所述疏水性嵌段具有由生育酚或胆固醇基团取代的末端羟基基团；
c)将所述聚合物组合物和所述生物活性剂在溶剂中混合及溶解，并蒸发所述溶剂；以及
d)加入水溶液以在该溶液中形成所述生物活性剂包封于其中的聚合物药物载体。
3.权利要求1的组合物，其中所述聚乳酸衍生物是钠盐或者钾盐形式，其通过在没有催化剂存在的条件下进行缩合反应并随后用碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾或者碳酸钾中和而获得。
4.权利要求1的组合物，其中所述药物载体的粒径在1－400nm范围内。
5.权利要求1的组合物，其中所述生物活性剂是选自以下组中之一：蛋白质和多肽药物。
6.权利要求1的组合物，其中所述生物活性剂是选自以下组中之一：抗癌剂、抗炎剂、抗高血压剂、止吐剂和抗生素。
7.权利要求1的组合物，其中所述生物活性剂是核酸。
8.权利要求1的组合物，其中所述药物载体是聚合物胶束。
9.权利要求1的组合物，其中所述聚合物药物载体是由进一步包含相对于1当量的所述聚乳酸衍生物的羧基末端基团0.01－10当量的二价或者三价金属离子的聚合物组合物制备的。
10.权利要求9的组合物，其中所述二价或者三价金属离子是选自以下组中之一：Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cr3+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Al3+。
11.权利要求9的组合物，其中所述聚乳酸衍生物是钠盐或者钾盐形式，其通过在没有催化剂存在的条件下进行缩合反应并随后用碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾或者碳酸钾中和而获得。
12.权利要求9的组合物，其中所述药物载体的粒径在1－400nm范围内。
13.权利要求9的组合物，其中所述生物活性剂是选自以下组中之一：蛋白质和多肽药物。
14.权利要求9的组合物，其中所述生物活性剂是选自以下组中之一：抗癌剂、抗炎剂、抗高血压剂、止吐剂和抗生素。
15.权利要求9的组合物，其中所述生物活性剂是核酸。
16.权利要求9的组合物，其中所述药物载体是聚合物胶束或纳米颗粒。
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