CN117241836A - 包含脂质纳米颗粒的用于预防或治疗癌症的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含脂质纳米颗粒的用于预防或治疗癌症的组合物。根据一个实施方式的药物组合物具有优异的生物相容性，能够高效地递送基因治疗剂等，从而具有优异的癌症预防或治疗效果，并且即使与抗癌剂和/或放射治疗组合使用时也具有优异的癌症预防或治疗效果。

Description

包含脂质纳米颗粒的用于预防或治疗癌症的组合物

技术领域

本发明涉及包含脂质纳米颗粒的用于预防或治疗癌症的组合物。

背景技术

在药物制剂行业，药物递送系统(DDS)被设计来通过减少药物的副作用并最大化功效和效果而有效地递送所需量的药物，其是一项高附加值核心技术，能够创造与新药开发相媲美的经济效益，而且具有巨大的成功潜力，并且其目的是通过使药物施用更为有效而提高患者治疗质量。难溶性药物的溶解技术属于药物吸收促进技术，是药物递送系统的核心技术之一，被认为是降低新药物质开发成本同时提高现有上市药物的附加值的最合理方式。特别是，通过开发药物溶解技术的改良型新药的开发是能够以低成本创造巨大附加值的领域。

使用遗传药物递送系统的基因疗法的建立是为了改变遗传结合并治疗多种疾病。在成功和安全地进行这种基因治疗时，有效的基因递送是主要挑战之一，病毒递送系统被证明在基因递送方面是有效的。然而，由于诸如免疫原性、插入的DNA的大小限制和大规模生产的困难等一些缺陷，限制了病毒作为基因递送系统的应用。如阳离子脂质体和聚合物等非病毒基因载体作为病毒系统的替代手段而开始受到关注。

聚合物递送系统的改进的稳定性特征以及制造和操作的便利性引发了对无毒和可生物降解的聚合物载体的设计和合成的研究，以实现有效和安全的基因递送。聚(L-赖氨酸)、聚乙烯亚胺、Starburst、聚酰氨基胺树枝状大分子、阳离子脂质体等能够自组装，并将质粒DNA(pDNA)压缩成足以通过内吞作用进入细胞的小结构，因此被作为非病毒基因递送系统被广泛研究。

诸如反义RNA和siRNA等核酸是能够在体内抑制特定蛋白质表达的物质，并且作为治疗癌症、遗传性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等的重要工具而备受瞩目(Novina和Sharp,Nature,430,161-164,2004)。然而，如siRNA等核酸难以直接递送至细胞内，而且容易被血液中的酶分解，因此有很多研究来克服这些。迄今为止，将核酸递送到细胞中的方法主要是通过与正电荷的脂质或聚合物混合进行携带(分别命名为脂质-DNA缀合物(lipoplex)和聚合物-DNA缀合物(polyplex))的方法(Hirko等，Curr.Med.Chem.,10,1185-93,2003；Merdan等，Adv.Drug.Deliv.Rev.,54,715-58,2002；Spagnou等，Biochemistry,43,13348-13356,2004)。脂质-DNA缀合物与核酸结合而将核酸良好地递送至细胞，因而在细胞水平上被大量使用，但在体内，当局部注射时，在许多情况下具有诱发体内炎症的缺点(Filonand和Phillips,Biochim.Biophys.Acta,1329,345-56,1997)，并在如肺、肝、脾等组织中积累，这些组织大体上是血管内注射时的主要通道器官(Ren等，Gene Therapy,7,764-768,2000)。

此外，这种非病毒递送系统存在转染效率低的问题。许多努力都倾向于提高转染效率，但稳定的系统还很渺茫。此外，非病毒基因递送系统的载体由于生物相容性差和不可生物降解性而表现出非常高的细胞毒性。

在这样的技术背景下，由于纳米颗粒能够有效地将抗癌剂递送至靶器官或细胞，因而需要开发具有优异抗癌效果的纳米颗粒。

发明内容

一个实施方式提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含(1)脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：其中结合有6元杂环胺和烷基环氧化物的可电离脂质、磷脂、胆固醇和脂质-聚乙二醇(PEG)缀合物，和

(2)第一抗癌剂，并且

其中，所述第一抗癌剂是阴离子药物、核酸或其组合。

另一个实施方式提供了用于治疗癌症的药物组合物，其与包括上述药物组合物的放射治疗组合使用。

其它实施方式提供了用于与抗癌剂组合使用的药物组合物，其还包含上述药物组合物和第二抗癌剂。

技术方案

实现上述目的的一个方面提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含：(1)脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：其中结合有6元杂环胺和烷基环氧化物的可电离脂质、磷脂、胆固醇和脂质-聚乙二醇(PEG)缀合物，和

(2)第一抗癌剂，

其中，所述第一抗癌剂是阴离子药物、核酸或其组合。

所述药物组合物中包含的脂质纳米颗粒具有优异的生物相容性，能够高效地递送抗癌剂(例如，基因治疗剂)等，并且能够有用地在诸如脂质纳米颗粒介导的基因治疗和成像诊断技术等相关技术领域中使用。

在此，“可电离脂质(ionizable lipid)”或“类脂质(lipidoid)”是指容易质子化的含胺脂质，例如，可以是电荷状态根据周围的pH而变化的脂质。可电离脂质可以是其中组合有6元杂环胺和烷基环氧化物的脂质。具体地，可电离脂质可以是与通过6元杂环胺和烷基环氧化物反应生成的脂质具有相似特征的化合物，更具体地，可以是通过使6元杂环胺与烷基环氧化物反应的环氧化物开环反应生成的化合物。

在一个实施方式中，可电离脂质可以是其中6元杂环胺和烷基环氧化物通过以1:n(n＝6元杂环胺中包含的伯胺数×2+仲胺数×1)的摩尔比反应而组合的可电离脂质。根据一个具体实施方式，其可以通过将246胺和1,2-环氧十二烷以1:4的摩尔比混合并在700至800rpm和85至95℃的条件下反应2至4天来制备。

可电离脂质可以在低于阳离子脂质的pKa的pH下质子化(带正电)，并且在高于pKa的pH下它可以基本上是中性的。在一个实施方式中，脂质纳米颗粒可包含质子化的可电离脂质和/或显示中性的可电离脂质。

可电离脂质是具有与脂质相似特性的可电离化合物，通过与药物(例如阴离子药物和/或核酸)的静电相互作用，可以起到将药物高效包封在脂质纳米颗粒中的作用。

6元杂环胺可包含哌嗪或哌啶的结构。

6元杂环胺可以是包含叔胺的链式胺或非链式胺，并且根据一个实施方式，其可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：

在一个实施方式中，所述六元杂环胺可以为选自1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪、N-(3-氨基丙基)哌啶、(1-甲基-4-哌啶基)甲胺、2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙胺、1-(2-氨基乙基)哌嗪和1-(3-氨基丙基)哌嗪中的一种或多种。

根据可电离脂质中包含的胺的类型，脂质纳米颗粒的以下方面可能有所不同：(i)药物包封率，(ii)PDI(多分散指数)，和/或(iii)药物组合物向癌组织和/或癌细胞的药物递送效率。

包含含胺的可电离脂质的脂质纳米颗粒可以具有以下一种或多种特征：

(1)将药物高效包封在脂质纳米颗粒中；

(2)制备的脂质纳米颗粒的大小均匀(或PDI值低)；和/或

(3)对癌组织和/或癌细胞的优异药物递送效率；和/或

(4)体内长期循环(long circulation)能力；和/或

(5)优异的癌症预防和/或治疗效果。

根据一个实施方式，包含含有1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪(Cas编号7209-38-3)的可电离脂质的脂质纳米颗粒与包含含有其他类型的胺的可电离脂质的纳米颗粒相比可具有以下一种或多种特征：

(1)将药物高效包封在脂质纳米颗粒中；

(2)制备的脂质纳米颗粒的大小均匀(或PDI值低)；和/或

(3)对癌组织和/或癌细胞的优异药物递送效率；和/或

(4)体内长期循环能力；和/或

(5)优异的癌症预防和/或治疗效果。

烷基环氧化物可具有以下化学式1的结构。

[化学式1]

烷基环氧化物可具有C6至C14、C6至C12、C6至C10、C8至C14、C8至C12、C8至C10、C10至C14、C10至C12或C10的碳长度，例如，它可以是C10的1,2-环氧十二烷。通过将可电离脂质中包含的烷基环氧化物的碳数设定在上述范围内，可以呈现脂质纳米颗粒中包封的药物的高包封率。

在一个实施方式中，可电离脂质可具有以下化学式2的通式。

[化学式2]

化学式2的结构是根据一个实施方式的可电离脂质结构的一个实例，并且可电离脂质的结构可以根据6元杂环胺和烷基环氧化物的类型而不同。

根据一个实施方式，包含具有化学式2结构的可电离脂质的脂质纳米颗粒与包含其他类型的可电离脂质的脂质纳米颗粒相比可具有以下一种或多种特征：

(1)将药物高效包封在脂质纳米颗粒中；

(2)制备的脂质纳米颗粒的大小均匀(或PDI值低)；和/或

(3)对癌组织和/或癌细胞的优异药物递送效率；和/或

(4)体内长期循环能力；和/或

(5)优异的癌症预防和/或治疗效果。

根据一个实施方式，脂质纳米颗粒的pKa可以为5至8、5.5至7.5、6至7或6.5至7。pKa是酸解离常数，并且是指通常用作指示目标物质的酸强度的指标的值。脂质纳米颗粒的pKa值在脂质纳米颗粒的体内稳定性和脂质纳米颗粒的药物释放方面是重要的。在一个实施方式中，pKa值在上述范围内的脂质纳米颗粒可以在体内安全地递送至癌组织和/或癌细胞，并到达所述靶组织和/或靶细胞，并且在胞吞作用后呈现正电荷，通过与内体膜的阴离子蛋白的静电相互作用释放包封的药物(第一抗癌剂)。

根据一个实施方式的脂质纳米颗粒的成分的磷脂起到覆盖和保护脂质纳米颗粒中可电离脂质和药物(第一抗癌剂)相互作用形成的核心的作用，并且可以在药物的细胞内递送过程中通过与靶细胞的磷脂双层结合而促进细胞膜渗透和内体逃逸。

对于磷脂，可以没有限制地使用能够促进根据一个实施方式的脂质纳米颗粒融合的磷脂，例如，其可以是选自以下中的一种或多种：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸]等。在一个实施方式中，包含DOPE的脂质纳米颗粒可有效递送mRNA(优异的mRNA药物递送效率)，而在另一实施方式中，包含DSPE的脂质纳米颗粒可有效递送siRNA(优异的siRNA药物递送效率)。

胆固醇可以为脂质纳米颗粒中的脂质填充提供形态刚性，并分散在纳米颗粒的核心和表面以提高纳米颗粒的稳定性。

在本文中，“脂质-聚乙二醇(PEG)缀合物”、“脂质-PEG”、“PEG-脂质”、“PEG-脂质”或“脂质-PEG”是指脂质和PEG缀合的形式，并且是指其中作为亲水性聚合物的聚乙二醇(PEG)聚合物结合到一个末端的脂质。脂质-PEG缀合物可能有助于脂质纳米颗粒内的纳米颗粒在血清中的颗粒稳定性，并起到防止纳米颗粒之间聚集的作用。此外，脂质-PEG缀合物可以在核酸的体内递送过程中保护核酸免于降解酶作用，并且增强核酸在体内的稳定性和增加包封在纳米颗粒中的药物的半衰期。

在脂质-PEG缀合物中，PEG可直接缀合至脂质或通过接头部分连接至脂质。可以使用适合将PEG结合至脂质的任何接头部分，并且其例如包括无酯接头部分和含酯接头部分。无酯接头部分不仅包括酰氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)、尿素(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、琥珀酰基(-(O)CCH₂CH₂C(O)-)、琥珀酰氨基(-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-)、醚、二硫化物以及它们的组合(例如，包含氨基甲酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)，但不限于此。含酯接头部分包括例如碳酸酯(-OC(O)O-)、琥珀酰氧基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其组合，但不限于此。

在一个实施方式中，脂质-PEG缀合物的平均分子量可以是100至10000道尔顿、200至10000道尔顿、500至10000道尔顿、1000至10000道尔顿、1500至10000道尔顿、2000至10000道尔顿、100至7500道尔顿、200至7500道尔顿、500至7500道尔顿、1000至7500道尔顿、1500至7500道尔顿、2000至7500道尔顿、100至5000道尔顿、200至5000道尔顿、500至5000道尔顿吨，1000至5000道尔顿，1500至5000道尔顿、2000至5000道尔顿、100至3000道尔顿、200至3000道尔顿、500至3000道尔顿、1000至3000道尔顿、1500至3000道尔顿、2000至3000道尔顿、100至2600道尔顿、200至2600道尔顿，500至2600道尔顿、1000至2600道尔顿、1500至2600道尔顿、2000至2600道尔顿、100至2500道尔顿、200至2500道尔顿、500至2500道尔顿、1000至2500道尔顿、1500至2500道尔顿、或2000至2500道尔顿。

对于脂质-PEG缀合物中的脂质，可以没有限制地使用任何能够结合聚乙二醇的脂质，并且也可以使用作为脂质纳米颗粒的其他成分的磷脂和/或胆固醇。具体地，脂质-PEG缀合物中的脂质可以是神经酰胺、二肉豆蔻酰甘油(DMG)、琥珀酰-二酰甘油(s-DAG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或胆固醇。

在一个实施方式中，脂质-PEG缀合物可以是与二烷氧基丙基结合的PEG(PEG-DAA)、与二酰基甘油结合的PEG(PEG-DAG)、与磷脂如磷脂酰乙醇胺结合的PEG(PEG-PE)、缀合至神经酰胺的PEG(PEG-CER、神经酰胺-PEG缀合物、神经酰胺-PEG、PEG-神经酰胺缀合物或PEG-神经酰胺)、缀合至胆固醇或其衍生物的PEG、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE(DSPE-PEG)以及它们的混合物，并且例如可以是C16-PEG2000神经酰胺、DMG-PEG 2000、14:0PEG2000 PE。

根据一个实施方式，与包含含有其他类型的脂质-PEG缀合物的脂质纳米颗粒的情形相比，包含含有神经酰胺-PEG缀合物的脂质纳米颗粒的情形可以具有以下一种或多种特征：

(1)将药物高效包封在脂质纳米颗粒中；

(2)制备的脂质纳米颗粒的大小均匀(或PDI值低)；和/或

(3)对癌组织和/或癌细胞的优异药物递送效率；和/或

(4)体内长期循环能力；和/或

(5)优异的癌症预防和/或治疗效果。

脂质-PEG缀合物中的PEG是一种亲水性聚合物，具有抑制血清蛋白吸附的能力，并增加脂质纳米颗粒在体内的循环时间，并且能够起到预防纳米颗粒间的聚集的作用。另外，脂质-PEG缀合物可以在体内显示出防止纳米颗粒降解的隐身功能。

PEG可以是官能团结合到未结合脂质的一侧的PEG(功能化PEG)。在这种情况下，可以使用的官能团可以是选自由琥珀酰基、羧酸、马来酰亚胺、胺基、生物素、氰基和叶酸等组成的组中的一种或多种。

根据一个实施方式，脂质纳米颗粒中的脂质-PEG缀合物的含量可以为0.1至20mol％、0.25至20mol％、0.5至20mol％、1至20mol％、1.5至20mol％、2至20mol％、2.5至20mol％、3至20mol％、0.1至15mol％、0.25至15mol％、0.5至15mol％、1至15mol％、1.5至15mol％、2至15mol％、2.5至15mol％、3至15mol％、0.1至12.5mol％、0.25至12.5mol％、0.5至12.5mol％、1至12.5mol％、1.5至12.5mol％、2至12.5mol％、2.5至12.5mol％、3至12.5mol％、0.1至10mol％、0.25至10mol％、0.5至10mol％、1至10mol％、1.5至10mol％、2至10mol％、2.5至10mol％、3至10mol％、0.1至7.5mol％、0.25至7.5mol％、0.5至7.5mol％、1至7.5mol％、1.5至7.5mol％、2至7.5mol％、2.5至7.5mol％、3至7.5mol％、0.1至5mol％、0.25至5mol％、0.5至5mol％、1至5mol％、1.5至5mol％、2至5mol％、2.5至5mol％、或3至5mol％。

在一个实施方式中，脂质纳米颗粒向癌组织和/或癌细胞内的药物递送效果可能取决于脂质纳米颗粒中包含的脂质-PEG缀合物的含量。

例如，脂质纳米颗粒中包含的脂质-PEG缀合物的含量为0.1至20mol％、0.25至20mol％、0.5至20mol％、1至20mol％、1.5至20mol％、2至20mol％、2.5至20mol％、3至20mol％、0.1至15mol％、0.25至15mol％、0.5至15mol％、1至15mol％、1.5至15mol％、2至15mol％、2.5至15mol％、3至15mol％、0.1至12.5mol％、0.25至12.5mol％、0.5至12.5mol％、1至12.5mol％、1.5至12.5mol％、2至12.5mol％、2.5至12.5mol％、3至12.5mol％、0.1至10mol％、0.25至10mol％、0.5至10mol％、1至10mol％、1.5至10mol％、2至10mol％、2.5至10mol％、3至10mol％、0.1至7.5mol％、0.25至7.5mol％、0.5至7.5mol％、1至7.5mol％、1.5至7.5mol％、2至7.5mol％、2.5至7.5mol％、3至7.5mol％、0.1至5mol％、0.25至5mol％、0.5至5mol％、1至5mol％、1.5至5mol％、2至5mol％、2.5至5mol％、或3至5mol％，这样的脂质纳米颗粒与包含的脂质-PEG缀合物的含量落在上述范围之外的脂质纳米颗粒相比可以具有以下一种或多种特征：

(1)将药物高效包封在脂质纳米颗粒中；

(2)制备的脂质纳米颗粒的大小均匀(或PDI值低)；和/或

(3)对癌组织和/或癌细胞的优异药物递送效率；和/或

(4)体内长期循环能力；和/或

(5)优异的癌症预防和/或治疗效果。

根据一个实施方式、在脂质纳米颗粒中的胆固醇的含量可以为10至60mol％、20至60mol％、30至60mol％、34.5至60mol％、35至60mol％、39.5至60mol％、40至60mol％、43至60mol％、44至60mol％、10至55mol％、20至55mol％、30至55mol％、34.5至55mol％、35至55mol％、39.5至55mol％、40至55mol％、43至55mol％、44至55mol％、10至52.5mol％、20至52.5mol％、30至52.5mol％、34.5至52.5mol％、35至52.5mol％、39.5至52.5mol％、40至52.5mol％、43至52.5mol％、44至52.5mol％、10至51mol％、20至51mol％、30至51mol％、34.5至51mol％、35至51mol％、39.5至51mol％、40至51mol％、43至51mol％、44至51mol％、10至50mol％、20至50mol％、30至50mol％、34.5至50mol％、35至50mol％、39.5至50mol％、40至50mol％、43至50mol％、44至50mol％、10至45mol％、20至45mol％、30至45mol％、34.5至45mol％、35至45mol％、39.5至45mol％、40至45mol％、43至45mol％、44至45mol％、10至44.25mol％、20至44.25mol％、30至44.25mol％、34.5至44.25mol％、35至44.25mol％、39.5至44.25mol％、40至44.25mol％、43至44.25mol％、44至44.25mol％、10至44mol％、20至44mol％、30至44mol％、34.5至44mol％、35至44mol％、39.5至44mol％、40至44mol％、43至44mol％、44至44mol％、10至43mol％、20至43mol％、30至43mol％、34.5至43mol％、35至43mol％、39.5至43mol％或40至43mol％。

根据一个实施方式、在脂质纳米颗粒中的脂质-PEG缀合物和胆固醇的含量之和可以为40至60mol％、40至55mol％、40至53.5mol％、40至50mol％、40至47.5mol％、40至45mol％、40至44.5mol％、42至60mol％、42至55mol％、42至53.5mol％、42至50mol％、42至47.5mol％、42至45mol％、42至44.5mol％、44至60mol％、44至55mol％、44至53.5mol％、44至50mol％、44至47.5mol％、44至45mol％、44至44.5mol％、44.5至60mol％、44.5至55mol％、44.5至53.5mol％、44.5至50mol％、44.5至47.5mol％、或44.5至45mol％。

根据一个实施方式、在脂质纳米颗粒中的可电离脂质的含量可以为10至60mol％、10至55mol％、10至50mol％、10至45mol％、10至42.5mol％、10至42.5mol％、10至40mol％、10至35mol％、10至30mol％、10至26.5mol％、10至25mol％、10至20mol％、15至60mol％、15至55mol％、15至50mol％、15至45mol％、15至42.5mol％、15至40mol％、15至35mol％、15至30mol％、15至26.5mol％、15至25mol％、15至20mol％、20至60mol％、20至55mol％、20至50mol％、20至45mol％、20至42.5mol％、20至40mol％、20至35mol％、20至30mol％、20至26.5mol％、20至25mol％、25至60mol％、25至55mol％、25至50mol％、25至45mol％、25至42.5mol％、25至40mol％、25至35mol％、25至30mol％、25至26.5mol％、26.5至60mol％、26.5至55mol％、26.5至50mol％、26.5至45mol％、26.5至42.5mol％、26.5至40mol％、26.5至35mol％、26.5至30mol％、30至60mol％、30至55mol％、30至50mol％、30至45mol％、30至42.5mol％、30至40mol％、30至35mol％、35至60mol％、35至55mol％、35至50mol％、35至45mol％、35至42.5mol％、35至40mol％、40至60mol％、40至55mol％、40至50mol％、40至45mol％、40至42.5mol％、42.5至60mol％、42.5至55mol％、42.5至50mol％、或42.5至45mol％。

根据一个实施方式、在脂质纳米颗粒中的磷脂的含量可以为5至30mol％、5至25mol％、5至20mol％、5至15mol％、5至13mol％、5至10mol％、10至30mol％、10至25mol％、10至20mol％、10至15mol％、10至13mol％、15至30mol％、15至25mol％、15至20mol％、20至30mol％、或20至25mol％。

在此，“mol％(mol％，摩尔百分比)”表示为特定组分的摩尔数除以所有组分的摩尔数之和然后乘以100所得的百分比，并以式表示，例如可以为以下等式1。

(等式1)

mol％＝(特定组分的摩尔数)/(所有组分的摩尔数之和)×100

脂质纳米颗粒可包含如下摩尔比的可电离脂质：磷脂：胆固醇：脂质-PEG缀合物：摩尔比为20至50：10至30：10至60：0.25至10，摩尔比为20至50：10至30：20至60：0.25至10，摩尔比为20至50：10至30：30至60：0.5至5，摩尔比为25至45：10至25：40至50：0.5至3，摩尔比25至45：10至20：40至55：0.5至3，摩尔比25至45：10至20：40至55：1.0至1.5，摩尔比为40至45：10至15：40至45：0.5至3.0，摩尔比为40至45：10至15：40至45：0.5至3，摩尔比为40至45：10至15：40至45：1至1.5，摩尔比为25至30：17至22：50至55：0.5至3.0，摩尔比为25至30：17至22：50至55：1.0至2.5，摩尔比为25至30：17至22：50至55：1.5至2.5。在保持脂质-PEG缀合物和胆固醇的摩尔数之和恒定的同时，在脂质纳米颗粒中包含的组分中，胆固醇的摩尔数的减少等于脂质-PEG缀合物的摩尔数的增加，从而可以维持组分的摩尔比。

此处，摩尔比是指摩尔数之比。

脂质纳米颗粒可包含20至50重量份的可电离脂质、10至30重量份的磷脂、30至60重量份的胆固醇以及0.1至10重量份的脂质-PEG缀合物。

此处，“重量份”是指所包含的各成分的重量比。

基于纳米颗粒总重量，脂质纳米颗粒可包含20至50重量份的可电离脂质、10至30重量份的磷脂、40至60重量份的胆固醇和1.5至3重量份的脂质-PEG缀合物。具体地，基于纳米颗粒总重量，脂质纳米颗粒可以包括25至50重量份的可电离脂质、10至20重量份的磷脂、35至55重量份的胆固醇和0.5至5.0重量份的脂质-PEG缀合物。

与包含所包含的可电离脂质、胆固醇、磷脂和/或脂质-PEG缀合物落在上述范围之外的脂质纳米颗粒的情形相比，包含上述范围(摩尔比、重量份数和/或重量％的范围)内的可电离脂质、胆固醇、磷脂和/或脂质-PEG缀合物的脂质纳米颗粒可以在以下方面是优异的：(i)脂质纳米颗粒的稳定性；(ii)抗癌剂的包封率；(iii)向癌组织和/或癌细胞的药物递送效率；(iv)体内长期循环效果；和/或(v)癌症预防和/或治疗效果。

本文中，脂质纳米颗粒向癌组织和/或癌细胞的“靶向(targeting)”和“定位(localization)”可以是在组织或细胞中的内化(internalization)，并且可以指细胞核内的内化，因为脂质纳米颗粒能够穿透核膜。

药物组合物可以是包封有第一抗癌剂(例如阴离子药物和/或诸如核酸等生理活性物质)的药物组合物，并且第一抗癌剂被高效而稳定地包封在脂质纳米颗粒中，从而通过根据一个实施例的药物组合物表现出优异的癌症预防和/或治疗效果。

在一个实施方式中，包含在脂质纳米颗粒中的可电离脂质与第一抗癌剂(例如，阴离子药物、核酸或其组合)的重量比可为1至20:1、1至15:1、1至10:1、5至20:1、5至15:1、5至10:1、7.5至20:1、7.5至15:1或7.5至10:1。

与包含所含的(1)可电离脂质和(2)第一抗癌剂的重量比落在上述范围之外的脂质纳米颗粒的组合物相比，当根据一个实施方式的组合物包含重量比在上述范围内的(1)可电离脂质和(2)第一抗癌剂(例如阴离子药物、核酸或其组合)时，其在下述方面更高(优异)：(i)脂质纳米颗粒内的第一抗癌剂(例如阴离子药物、核酸或其组合)的包封率；(ii)抗癌剂向癌组织和/或癌细胞的递送效率；(iii)体内长期循环效果；和/或(iv)癌症预防和/或治疗效果。

其中包封有第一抗癌剂的脂质纳米颗粒的平均粒径可以为20nm至200nm、20nm至180nm、20nm至170nm、20nm至150nm、20nm至120nm、20nm至100nm、20nm至90nm、30nm至200nm、30nm至180nm、30nm至170nm、30nm至150nm、30nm至120nm、30nm至100nm、30nm至90nm、40nm至200nm、40至180nm、40nm至170nm、40nm至150nm、40nm至120nm、40nm至100nm、40nm至90nm、50nm至200nm、50至180nm、50nm至170nm、50nm至150nm、50nm至120nm、50nm至100nm、50nm至90nm、60nm至200nm、60至180nm、60nm至170nm、60nm至150nm、60nm至120nm、60nm至100nm、60nm至90nm、70nm至200nm、70至180nm、70nm至170nm、70nm至150nm、70nm至120nm、70nm至100nm、70nm至90nm、80nm至200nm、80nm至180nm、80nm至170nm、80nm至150nm、80nm至120nm、80nm至100nm、80nm至90nm、90nm至200nm、90至180nm、90nm至170nm、90nm至150nm、90nm至120nm、或90nm至100nm，以便于容易引入癌组织和/或癌细胞。由于粒径在上述范围内的纳米颗粒可以长时间保留在血液中，因此可以增加到达靶肿瘤组织的机会。具有在上述范围内的粒径的脂质纳米颗粒可表现出增强的渗透性和保留(Enhanced Permeability andRetention,EPR)。EPR效应意味着具有特定大小的分子相比正常组织更倾向于在肿瘤组织中积累。粒径在该范围内的脂质纳米颗粒比粒径在该范围外的脂质纳米颗粒更少地排泄至肾脏，并且不诱导免疫细胞的活性，从而可以有效地实现向癌细胞和/或癌组织的递送。

在一个实施方式中，与包含直径超过上述范围的上限的纳米颗粒的组合物相比，包含具有处于上述范围内的直径的脂质纳米颗粒的组合物在以下方面更优异：(i)抗癌剂向癌组织和/或癌细胞的递送效率；(ii)癌组织和/或癌细胞内的增强渗透性和保留(EPR)效应的增加；和/或(iii)癌症预防和/或治疗效果。根据一个实施方式的脂质纳米颗粒通过呈现出5至8、5.5至7.5、6至7或6.5至7的pKa而在酸性pH条件下表现出正电荷，并且通过与表现出负电荷的治疗剂如第一抗癌剂(例如，核酸和阴离子药物(例如，蛋白质))的静电相互作用而容易地与药物形成复合物，从而高效地包封药物，并且其可以有用地用作包含第一抗癌剂(例如，核酸)的用于预防和/或治疗癌症的组合物。

在此，“包封(encapsulation)”是指在体内有效地包裹并包埋递送物质，而第一抗癌剂(药物)包封比(包封率)是指包封在脂质纳米颗粒中的第一抗癌剂(药物)内容物占制备所用的药物总内容物的比例。

在根据一个实施方式的组合物中，第一抗癌剂的包封率可以是70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、94％以上、大于80％且99％以下、大于80％且97％以下、大于80％且95％以下、85％以上且95％以下、87％以上且95％以下、90％以上且95％以下、91％以上且95％以下、91％以上且94％以下、大于91％且95％以下、92％以上且99％以下、92％以上且97％以下、或92％以上且95％以下。

根据一个实施方式，包封率可以通过常用的方法计算，例如，第一抗癌剂(药物)包封率可以通过以Triton-X处理根据一个实施方式的脂质纳米颗粒并测量经Triton-X处理和未经Triton-X处理的脂质纳米颗粒在特定波长带宽(例如，激发：480至490nm，发射：520至530nm)中的荧光强度，通过以下等式2计算。

(等式2)

药物包封率(％)＝(Triton-X处理的脂质纳米颗粒的荧光强度(荧光)-未经Triton-X处理的脂质纳米颗粒的荧光强度(荧光))/(Triton-X处理的脂质纳米颗粒的荧光强度(荧光))×100

第一抗癌剂可以为显示出癌症治疗和/或预防效果的阴离子药物、核酸或其组合。

核酸可以是选自以下中的一种或多种：小干扰RNA(siRNA)、核糖体核糖核酸(rRNA)、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、互补脱氧核糖核酸(cDNA)、适体、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、反义寡核苷酸、shRNA、miRNA、核酶、PNA、DNA酶和用于基因编辑的sgRNA等；但不限于此。

在此，术语“siRNA”是指可以通过特定mRNA的切割诱导RNAi(RNA干扰)的双链RNA(duplex RNA)，或者在单链RNA内部具有双链形式的单链RNA。它由具有与靶基因mRNA同源的序列的正义RNA链和具有与其互补的序列的反义RNA链组成。由于siRNA可以抑制靶基因的表达，因此提供了一种有效的基因敲除方法或基因治疗方法。双链之间的结合是通过核苷酸间的氢键实现的，而并非双链内的所有核苷酸都必须互补并完全结合。

siRNA的长度可以是约15至60、具体地约15至50、约15至40、约15至30、约15至25、约16至25、约19至25、约20至25或约20到23个核苷酸。siRNA长度是指双链RNA一侧上的核苷酸数，即碱基对数，而在单链RNA的情况下，是指单链RNA内部的双链的长度。此外，siRNA可以由出于增加血液稳定性或减弱免疫响应等目的引入有各种官能团的核苷酸组成。

在此，术语“反义寡核苷酸”可以在一个或多个碱基、糖或主链的位置被修饰以增强功效(De Mesmaeker等，Curr Opin Struct Biol.,5(3):343-55,1995)。寡核苷酸主链可以通过硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、短链烷基、环烷基、短链杂原子、杂环糖间结合等修饰。此外，反义寡核苷酸可包含一个或多个取代的糖部分。反义寡核苷酸可包含修饰的碱基。修饰的碱基包括次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶(特别是5-甲基胞嘧啶)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC、龙胆二糖基HMC、2-氨基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤等。

此处，“单链脱氧核糖核酸(ssDNA)”是指选择性地结合特定靶DNA并诱导反基因(antigene)效应的单链寡核苷酸。

此处，“适体”是指与特定靶标结合的寡核苷酸(一般为20至80nt的DNA或RNA)。优选地，在本文中，“适体”是指寡核苷酸适体(例如，DNA或RNA适体)。

此处，“mRNA”是指能够表达基因的合成mRNA(体外转录的mRNA)。

在此，“shRNA”是指单链的50-70个核苷酸，在体内形成茎环(stemloop)结构。在5至10个核苷酸的环的两侧，19至29个核苷酸的长RNA互补地进行碱基配对而形成双链茎。

此处，“miRNA(microRNA)”是指控制基因表达并由全长21至23个核苷酸组成的单链RNA分子。miRNA是一种不在细胞内表达的寡核苷酸，具有短的茎环结构。miRNA与一个或两个以上的mRNA(信使RNA)具有完全或部分同源性，通过与mRNA互补结合来抑制靶基因的表达。

在此，“核酶(ribozyme)”是RNA的一种，是识别特定RNA的核苷酸序列并具有切割自身的酶的相同功能的RNA。核酶是靶信使RNA链的互补核苷酸序列，并由特异性结合的区域和切割靶RNA的区域组成。

在此，“DNA酶(DNAzyme)”是具有酶活性的单链DNA分子，并且由10至23个核苷酸组成的DNA酶(10-23DNA酶)在生理相似条件下在特定位置切割RNA链。10-23DNA酶在任何在没有碱基配对的情况下在暴露的嘌呤和嘧啶之间切割。10-23DNA酶由一个由15个保守核苷酸序列(例如，5'-GGCTAGCTACAACGA-3')组成的酶的活性位点(催化结构域)和在上述酶的活性结构域左侧和右侧的由识别RNA底物的7到8个DNA核苷酸序列组成的RNA底物结合域组成。

此处，“PNA(肽核酸，peptide nucleic acid)”是指具有核酸和蛋白质的所有性质的分子，是指能够与DNA或RNA互补结合的分子。PNA于1999年首次以其中核碱基通过肽键连接的近似DNA报道(文献[Nielsen PE,Egholm M,Berg RH,Buchardt O,"Sequence-selective recognition of DNAby strand displacement with a thymine-substitutedpolyamide",Science 1991,Vol.254:pp1497-1500])。PNA在自然界中不存在，是通过化学方法人工合成的。PNA引起与核苷酸序列互补的天然核酸的杂交反应而形成双链。同样长度的PNA/DNA双链比DNA/DNA双链更稳定。作为肽骨架，最常用的是通过酰胺键重复连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸，在这种情况下，肽核酸的主链是电中性的，与天然核酸的主链不同。PNA中存在的4种核苷酸具有与天然核酸的情形几乎相同的空间尺寸和核苷酸间距离。PNA不仅在化学上比天然核酸更稳定，而且在生物学上也很稳定，因为它不会被核酸酶或蛋白酶降解。

在此，“sgRNA”是指与特定DNA靶标结合的寡核苷酸(通常为RNA分子)，是指crisprRNA(crRNA)和示踪剂(tracrRNA)的复合单RNA分子。它是一种RNA分子，用于在CRISPR系统中与Cas9核酸酶一起识别特定的DNA序列，并且能够进行选择性的基因切割，其大约包含能够与DNA互补结合的20-nt序列，全长为100nt。

此处，“基因编辑蛋白”是指Cas9、spCas9、cjCas9、casX、CasY和Cpf1等，是指与sgRNA一起识别靶DNA核苷酸序列以引起DNA切割的蛋白质。

根据一个实施方式的药物递送用组合物可以以高包封率包含Cas9 mRNA。先前已知的用于递送Cas9 mRNA的组合物在将其用作递送Cas9 mRNA的组合物方面具有局限性，因为它包含的Cas9 mRNA比例低。另一方面，根据一个实施方式的脂质纳米颗粒可包含具有高包封率的Cas9 mRNA，具体为70％以上的包封率，因此其可有效地用于基因编辑疗法。

阴离子药物可以是阴离子生物聚合物-药物缀合物，例如具有阴离子的各种肽、蛋白质药物、蛋白质-核酸结构体或透明质酸-肽缀合物、透明质酸-蛋白质缀合物等。蛋白质药物的非限制性实例可以是细胞凋亡诱导因子(例如，细胞色素C、半胱天冬酶3/7/8/9等)，也包括基因编辑蛋白如Cas 9、作为基因编辑剪刀的cpf1，以及各种细胞内蛋白质(例如，转录因子)，等等。

根据一个实施方式的用于预防或治疗癌症的药物组合物可以包含其中内部包封有阴离子药物和/或核酸的脂质纳米颗粒。

癌症可以是由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的。例如，由HPV感染引起的癌症不限于但可以选自由宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌、扁桃体癌、咽癌、喉癌、头颈癌和肺腺癌组成的组。

癌症可选自由以下组成的组：宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌、扁桃体癌、咽癌、喉癌、头颈癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、肺癌、胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、慢性或急性白血病、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、直肠癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。

药物组合物可以通过包括肠胃外施用的多种途径施用至包括人在内的哺乳动物，肠胃外施用可以经静脉内、皮下、腹膜内或局部施用，并且剂量根据患者的状况和体重、疾病程度、药物形式、施用途径和时间变化，但可以由本领域技术人员适当选择。

当配制根据一个实施方式的药物组合物时，其通过使用稀释剂或赋形剂如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等来制备。

肠胃外施用的剂型包括灭菌水性溶液、非水性溶剂、悬浮溶剂、乳液、冻干剂、栓剂等。

作为非水性溶剂和悬浮溶剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基底化合物，有Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂脂、甘油、明胶等。

根据一个实施方式的药物组合物以药学有效剂量施用。在此，“药学有效剂量”是指足以在适用于医学治疗的合理收益/风险比下治疗疾病的量，有效剂量水平可根据患者的疾病类型、严重程度、药物活性、药物敏感性、施用时间、施用途径和排泄速率、治疗周期和并用药物等因素以及医学领域公知的其它因素来确定。根据一个实施方式的药物组合物可以作为单独的治疗剂施用，或者可以与其他治疗剂联合施用，并且可以与常规治疗剂依次施用或同时施用，并且可以单次或多次施用。考虑到所有上述因素，重要的是施用能够在没有副作用的情况下以最小的量获得最大的效果的量，并且这可以由本领域技术人员容易地确定。

具体地，取决于患者的年龄、性别和体重，根据本发明的化合物的有效剂量可以有所不同，并且可以每天或隔天施用，或者每天分成1至3次施用。然而，这可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增减，因此，上述剂量不以任何方式对本发明的范围进行限制。

在一个具体实施方式中，基于药物组合物中包含的药物(阴离子药物、核酸或其组合)的浓度，药物组合物可以以0.1至100mg/kg、0.1至50mg/kg、1至10mg/kg或1至5mg/kg的剂量施用。

另一方面可以提供一种包含上述药物组合物的：与放射治疗组合使用的用于预防癌症的药物组合物；增强放射敏感性的药物组合物；或与放射治疗组合使用的用于治疗癌症的药物组合物。所述药物组合物可以在癌症治疗过程中通过提高癌细胞对放射的损伤敏感性来进一步提高治疗癌症的效果，和/或可以用作待治疗的组合物或试剂，从而通过抑制癌细胞对放射的抗性而容易诱导癌细胞因放射而死亡，因此包含所述药物组合物的组合物可以与放射治疗组合使用。

此处，增强放射敏感性是指在使用放射的疾病治疗中增强细胞对放射的敏感性。由此，可以提高放射治疗效率，特别是在癌症治疗中并行治疗时，可以增强癌细胞的放射敏感性，从而能够表现出对癌细胞的杀伤作用和增殖抑制作用。

根据一个实施方式的用于与放射治疗组合使用的用于癌症治疗的药物组合物(或用于增强放射敏感性的组合物、用于与放射治疗组合使用的用于癌症治疗的药物组合物)可以包含作为第一抗癌剂的HPV 16型(HPV16)或HPV 18型(HPV18)病毒的E6和/或E7蛋白的表达或活性抑制剂、磷酸甲羟戊酸激酶(PMVK)蛋白或其组合。PMVK表达抑制剂、E6和/或E7表达抑制剂可选自由与PMVK、E6和/或E7基因的mRNA互补结合的反义核苷酸、小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)组成的组。PMVK活性抑制剂和/或HPV16(或HPV18型)病毒的E6和/或E7活性抑制剂可以选自由与PMVK、HPV16(或HPV18型)病毒的E6和/或E7蛋白特异性结合的肽、肽模拟物和适体组成的组。

在一个实施方式中，药物组合物可以在癌症治疗期间与照射组合施用。“照射”是指一种破坏恶性细胞的DNA的局部治疗方法。正常细胞具有比肿瘤细胞更强的修复这种损伤的能力。照射是指利用这种差异的治疗，并且包括通常意味着使用放射的治疗方法。照射按治疗目的可分为根治性(红)放射治疗、辅助性放射治疗和姑息性放射治疗。根治性(红)放射治疗是指在肿瘤相对局限于局部区域而不存在远端转移时以完全治愈为目的的放射治疗。辅助放射治疗是指为防止外科手术后局部复发而进行的放射治疗。通过结合放射治疗，不仅可以简单地减少复发，而且可以减少手术范围以保持功能。姑息性放射治疗是以减轻癌症引起的症状为目的的放射治疗。

放射是一种使用高能辐射杀死癌细胞的治疗方法，但会影响周围的正常组织以及癌细胞，因此可能会因治疗而产生副作用。其实例包括皮肤变化、脱发、恶心和呕吐、腹泻、粘膜炎/食管炎、口干症、生殖功能变化等。

根据一个实施方式的与放射治疗组合使用的用于治疗癌症的药物组合物、增强放射敏感性的药物组合物或与放射治疗组合使用的用于治疗癌症的药物组合物可以通过减少对放射的需求来减少此类副作用。此外，不仅对放射敏感的癌细胞，而且对放射有抗性的癌细胞，都可以增加放射敏感性。

与放射治疗组合使用的用于治疗癌症的药物组合物(或与放射治疗组合使用的用于治疗癌症的药物组合物)包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含在上文所述的范围(摩尔比、重量份数和/或重量％的范围)的可电离脂质、胆固醇、磷脂和/或脂质-PEG缀合物，与包含的脂质纳米颗粒包含落在上述范围之外的可电离脂质、胆固醇、磷脂和/或脂质-PEG缀合物的情形相比，所述药物组合物可以通过增加癌细胞、肿瘤细胞和癌组织对放射的敏感性而具有优异的杀伤癌细胞和治疗癌症的效果。

在一个实施方式中，根据一个实施方式，与包含的脂质纳米颗粒包含其它类型的脂质-PEG缀合物的情形相比，包含含有1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪和/或神经酰胺-PEG缀合物的脂质纳米颗粒的情形可以通过增加癌细胞、肿瘤细胞和癌组织对放射的敏感性而具有优异的杀伤癌细胞和治疗癌症的效果。

另一方面可以提供与抗癌剂组合使用的药物组合物；或用于增强抗癌治疗的药物组合物，其进一步包含所述药物组合物和第二抗癌剂。所述药物组合物如上文所述。

所述第二抗癌剂可以为选自以下的一种或多种：棉酚、氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、司马沙尼(semaxanib)、博舒替尼、阿西替尼、西地尼布、来他替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生碱(Viscum album)、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥佐米星、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、七铂、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、丙卡巴肼、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多西氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美嘧啶、奥特拉西尔、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、依诺他滨、氟他胺、地西他滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西紫杉醇、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、潜尼泊苷(teniposide)、多柔比星、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、更生霉素、吡柔比星、阿柔比星、普洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、维甲酸、依西美坦、氨鲁米特、阿那格雷、诺维滨、法屈唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏罗唑、比卡鲁胺、洛莫司汀和卡莫司汀。

在一个实施方式中，第二抗癌剂可以不被包封在药物组合物中包含的脂质纳米颗粒内。

另一方面可以提供一种增强癌症对化疗或放疗的敏感性的方法，该方法包括在进行化疗或放疗来治疗癌症(例如，由HPV感染引起的癌症)期间组合施用药物组合物。

在化疗的情况下，“组合施用”可以在进行化疗前数小时(例如前4小时)先施用药物组合物。此外，在放疗的情况下，可以在照射1天后，在2天内多次(例如，2至4次)施用药物组合物。

另一方面提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，该方法包括将所述药物组合物施用于患者。所述癌症如上文所述。

根据一个实施方式的用于预防或治疗癌症的方法还可以包括确认(选择)需要预防和/或治疗癌症的患者。在一个实施方式中，患者可以是已进行放疗和/或化疗的患者；正在进行放疗和/或化疗的患者；和/或计划进行放疗和/或化疗的患者。

应用该治疗方法的目标受试者是指已经发生发展或可能发展出癌症的包括小鼠和家畜等在内的哺乳动物，包括人，但不限于此。通过向目标受试者施用包含脂质纳米颗粒的药物组合物(或与放疗和/或抗癌剂组合使用的药物组合物)可以使受试者得到有效治疗，所述脂质纳米颗粒包含处于上述范围内的可电离脂质、胆固醇、磷脂和/或脂质-PEG缀合物(摩尔比、重量份和/或重量％的范围)。

在此，“施用”是指通过任何合适的方法将药物组合物引入目标受试者，而作为施用途径，可以通过各种口服或肠胃外(例如，静脉内、皮下或局部应用)途径施用，只要它可以到达靶组织。

用于预防或治疗的方法可以包括以药学有效剂量施用药物组合物(或与放疗和/或抗癌剂组合使用的药物组合物)。适当的每日总使用量可以在正确的医学判断范围内通过治疗来确定，可以一次或分若干次施用。然而，对于特定患者可以不同地应用特定的治疗有效剂量，这取决于各种因素，包括要实现的反应的类型和程度、具体组合物(包括在某些情况下是否使用另一种药物)、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、组合物的施用时间、施用途径和分泌速率、治疗周期、与特定组合物一起使用或同时使用的药物，以及医学领域公知的类似因素。

另一方面涉及治疗癌症的方法，包括将所述药物组合物施用于动物(例如，除人以外的动物)，并进行放射照射。

当在施用药物组合物之后进行放射照射时，放射治疗效果以及进一步的癌症治疗效果可根据协同效应而显著增强。

待治疗的动物可以是任何哺乳动物，包括人、家畜和宠物，但不限于此。

对于照射，可以应用常规用于癌症放疗的任何照射方法，或用于后来开发的癌症的放射照射方法。

另一方面可以提供用于杀死癌细胞的组合物，其包含脂质纳米颗粒和第一抗癌剂。另一方面可以提供一种用于杀死癌细胞的方法，其包括将第一抗癌剂包封在脂质纳米颗粒中。可被根据一个实施方式的组合物杀死的癌细胞可涉及上文所述的癌细胞。

有利效果

根据一个实施方式的药物组合物具有优异的生物相容性并且能够高效地递送基因治疗剂，因此具有优异的预防或治疗癌症的效果，并且在与抗癌剂和/或放射治疗组合使用时具有优异的预防或治疗癌症的效果。

附图说明

图1a显示了根据一个实施例的脂质纳米颗粒的示例性结构，图1b显示了通过Cryo-TEM观察根据一个实施例的纳米颗粒的图像。

图2显示了246-C10在CDCl₃中的¹H NMR(室温，400MHz)的结果。

图3a(241-C10 LNP至243-C10 LNP)和图3b(244-C10 LNP至246-C10 LNP)显示了在具有pH 4.1至pH 9.6范围的溶液中的各脂质纳米颗粒显示的荧光强度测量结果。

图4a和图4b是显示各纳米颗粒的细胞内基因递送效率的结果。具体地，图4a显示了通过将包封编码荧光素酶的mRNA(luc mRNA)的LNP转化到HeLa细胞中然后溶解细胞后测得的发光强度，图4b显示了在将包封siRNA的LNP转化到Hela-Luc癌细胞之后的荧光素酶表达的测定结果。

图5a至图5c是显示纳米颗粒在小鼠中的基因递送效率的结果。具体地，图5a显示了用LNP包封荧光附着的siGFP 48小时并将其注射到小鼠模型中后，通过IVIS确认在癌组织、肝脏和肾脏中的生物分布的结果。图5b显示了通过将包含siLuc的脂质纳米颗粒施用于Hela-Luc异种移植小鼠模型，用生物发光设备测量荧光素酶表达增加和减少的结果。

图5c作为生物发光图显示了在将包含siLuc的脂质纳米颗粒施用于Hela-Luc异种移植小鼠模型后根据注射方法的荧光素酶表达的增加和减少。

图6a显示了在头颈鳞状细胞癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的凋亡作用。

图6b显示了在头颈鳞状细胞癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的mRNA基因表达的增加和减少。

图6c显示了在头颈鳞状细胞癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的蛋白质表达的增加和减少。

图7a显示了在胰腺癌细胞系、肺癌细胞系、乳腺癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的凋亡作用。

图7b显示了在胰腺癌细胞系、肺癌细胞系、乳腺癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的mRNA基因表达的增加和减少。

图7c显示了在胰腺癌细胞系、肺癌细胞系、乳腺癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的蛋白质表达的增加和减少。

图7d显示了在胰腺癌细胞系、肺癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的凋亡。

图7e显示了在胰腺癌细胞系、肺癌细胞系和宫颈癌细胞系中由包含siRNA的纳米颗粒造成的蛋白质表达的增加和减少。

图7f显示了在移植有胰腺癌细胞系的小鼠模型中由包含siRNA的纳米颗粒针对放射造成的siRNA递送和mRNA基因表达的增加和减少。

图7g显示了在移植有肺癌细胞系的小鼠模型中的通过包含siRNA的纳米颗粒针对放射造成的siRNA递送和mRNA基因表达的增加和减少。

具体实施方式

将通过以下实施例更详细地描述本发明，但范围不受以下实施例的限制。

实施例1.可电离脂质的制备

实施例1-1.可电离脂质的制备

通过将包含6-元杂环叔胺的下表1的胺基化合物与1,2-环氧十二烷(下文为C10)以1:n(n＝伯胺×2+仲胺×1)的摩尔比反应来合成可电离脂质。

[表1]

具体地，将表1的胺241至246和环氧化物(C10)以1:n(n＝伯胺×2+仲胺×1)的摩尔比各自加入到带有磁棒的5ml小瓶中，并在搅拌器中以750rpm、90℃搅拌3天来进行反应。然后，用WELUX精细硅胶柱(Intertec，韩国)纯化后，计算反应产生的每种可电离脂质的分子量，并使用乙醇以100mg/ml的浓度储存。用胺241和C10制备的可电离脂质命名为“241-C10”，用其他胺类制备的可电离脂质同理命名为“使用的胺名称(241至246)-C10”。

实施例1-2.确认产生的可电离脂质的确认

为了确认实施例1-1中制备的电离性脂质，进行了¹H NMR。具体地，通过在0.5mlCDCl₃(Sigma，美国)中稀释至100毫摩尔浓度来准备5μg的实施例1-1中合成的可电离脂质(246-C10)。然后，各取0.5ml放入400MHz NMR管中并将顶部密封，再用石蜡膜封口密封，从而使用Agilent 400MHZ FT-NMR(Agilent，美国)得到NMR谱，结果示于图2中。如图2所示，可以看出代表246-C10各官能团的信号是饱和的。

另外，为了确认实施例1-1中制备的电离性脂质(241-C10至246-C10)，进行了MS分析。具体地，将可电离脂质以0.5ppm以下的浓度稀释在乙醇中，并进行MS分析。分析所用设备为Agilent Technologies的6230LC/MS(Palo Alto,美国)，分离管使用AgilentTechnologies的Zorbax SB-C18(100mm×2.1mm i.d.，3.5μm)，以两种溶剂(A)含有0.1％甲酸的蒸馏水和(B)乙腈进行梯度洗脱。流动相的溶剂梯度保持4分钟，直到有机溶剂乙腈(B)的比例在2分钟内从初始30％增加到80％，然后有机溶剂的比例再次降低到30％并稳定。流动相的流速为300μL/min，分析仪的进样量为2μL。进行MS分析的结果示于下表2中。如表2所示，可以确认可电离脂质的测定m/z比和计算m/z比几乎相同。

[表2]

从结果可以确认，在实施例1-1中很好地制备了可电离脂质。

实施例2.脂质纳米颗粒的制备

实施例2-1.脂质纳米颗粒的制备

将实施例1-1制备的可电离脂质(241-C10至246-C10)、胆固醇(胆固醇粉末，BioReagent,细菌培养适用，≥99％,Sigma,韩国)、磷脂(DSPC)(Avanti,美国)和脂质-PEG缀合物(神经酰胺-PEG缀合物；C16 PEG2000神经酰胺，Avanti，美国)以42.5:13:43:1.5的摩尔比溶解在乙醇中。

将溶解了可电离脂质、胆固醇、磷脂和脂质-PEG的乙醇和醋酸盐缓冲液用微流体混合装置(Benchtop Nanoassemblr；PNI，加拿大)以12ml/min的流速以体积比1：3混合，由此制备脂质纳米颗粒(LNP)。

实施例2-2.包封有核酸的脂质纳米颗粒的制备

实施例1-1制备的可电离脂质(241-C10至246-C10)、胆固醇(胆固醇粉末，BioReagent,细菌培养适用，≥99％,sigma,韩国)、磷脂(DSPC或DOPE)(18:0PC(DSPC)、18:1(△9-Cis)PE(DOPE)，Avanti,美国)和脂质-PEG缀合物(神经酰胺-PEG缀合物；C16 PEG2000神经酰胺,Avanti,美国)溶解在乙醇中。作为RNA治疗剂，将30μg mRNA(萤光素酶mRNA；SEQID NO：1)在0.75ml柠檬酸钠中稀释，或将30μg siRNA(siLUC，siGFP，Anti-HPV16 E6/E7siRNA，Anti-PMVK siRNA等)用0.75ml乙酸钠(50mM)稀释以制备水相。mRNA和siRNA向Bioneer(韩国)请求合成并使用。

将其中溶解有RNA治疗剂(核酸)的水相(乙酸钠或柠檬酸钠)以及其中溶解有可电离脂质、胆固醇、磷脂和脂质-PEG缀合物(下文称脂质-PEG)的有机相(乙醇)通过微流体混合装置(Benchtop Nanoassemblr；PNI，加拿大)以12mL/min的流速混合，制备其中包封有核酸的脂质纳米颗粒(LNP)。(i)为了制备其中包封有mRNA的脂质纳米颗粒，将可电离脂质：磷脂(DOPE)：胆固醇：脂质-PEG(C16-PEG2000神经酰胺)以26.5：20：52.5至51：1.0至2.5的摩尔比溶解在乙醇中(调节胆固醇和脂质-PEG的含量使得摩尔比的总和为100)，并混合有机相和水相使得mRNA(荧光素酶mRNA；SEQ ID NO:1):可电离脂质的重量比为1:10，由此制备脂质纳米颗粒。(ii)为了制备其中包封有siRNA的脂质纳米颗粒，将可电离脂质：磷脂(DSPC)：胆固醇：脂质-PEG(C16-PEG2000神经酰胺)以42.5：13：44至39.5：0.5至5.0的摩尔比溶解在乙醇中(调节胆固醇和脂质-PEG的含量使得摩尔比的总和为100)，并混合有机相和水相使得siRNA(siFVII，SEQ ID NO：2和3以相同的摩尔比混合；或siFVIII，SEQ ID NO：4至11以相同的摩尔比混合；或siLuc：SEQ ID NO：12和13以相同的比例混合)：可电离脂质的重量比为1:7.5，由此制备脂质纳米颗粒(LNP)。使用的siRNA序列如下表3所述。表3中，以小写字母表示的碱基经2’-O-甲基修饰。

[表3]

使用10,000MWCO透析盒将制备的LNP在PBS中透析16小时，以去除乙醇并调节体内pH值和纳米颗粒的pH值。

包含可电离脂质“241-C10”的脂质纳米颗粒被命名为“241-C10 LNP”，使用包含胺的可电离脂质制备的脂质纳米颗粒(包括其中包封有核酸的脂质纳米颗粒)被命名为“所含胺名称(241至246)-C10 LNP”。

实施例2-3.包封有核酸的脂质纳米颗粒的观察

如实施例2-2通过使用神经酰胺-PEG缀合物(C16-PEG2000神经酰胺)制备其中包封有siLuc(SEQ ID NO：5)的脂质纳米颗粒。将制备的脂质纳米颗粒(包含1.5mol％神经酰胺-PEG缀合物)以基于siRNA浓度的60μg的量加载到200目碳纤维膜Cu-网格上，并浸入用vitrobot液化的乙烷中(约-170度以下)并进行急冻制备，然后用Cryo-TEM(Tecnai F20，FEI)进行观察，结果示于图1b中。如图1b所示，观察到具有实心形状的球形颗粒。

实施例3. 脂质纳米颗粒的pKa

在本实施例中，实施例2-1中配制的各脂质纳米颗粒(LNP)的pKa通过体外TNS测定计算。阴离子TNS通过与带正电的可电离脂质相互作用而变得亲脂，随着pH值接近每个LNP的pKa值，TNS的亲脂性变得更低，更多的水分子淬灭TNS荧光，因此，具有6.0至7.0的pKa的脂质纳米颗粒具有优异的体内递送效率，脂质纳米颗粒在根据pH值表示荧光的图中呈现“s型曲线”，意味着它们容易与内体膜相互作用，容易在酸化过程中脱离内体。

具体地，将包含20mM磷酸钠、25mM柠檬酸盐、20mM乙酸铵和150mM NaCl的溶液的pH用0.1N NaOH和/或0.1N HCl从pH 4.1至pH 9.6以0.5的间隔调节以制备不同pH单位的溶液。将100μL具有各pH值(从pH 4.1至pH 9.6，间隔为0.5)的每种溶液添加到黑色96孔板中，并将每种溶液添加到pH值在该范围内的溶液中，以使用300μM的TNS储备溶液使最终浓度为6μM。将241-C10 LNP至246-C10 LNP添加到混合溶液中使得最终浓度为20μM。荧光强度是通过Tecan设备在325nm激发和435nm发射下测量的，各脂质纳米颗粒的荧光强度如图3a和图3b所示，每个脂质纳米颗粒的pKa计算为达到最大荧光一半时的pH值并显示在下表4中。如图3b所示，可以看出244-C10 LNP至246-C10 LNP通过非线性回归显示出荧光滴定S型曲线。

[表4]

脂质纳米颗粒	pKa
		241-C10 LNP	7.7
242-C10LNP	8.7
		243-C10LNP	8.2
244-C10LNP	6.8
		245-C10LNP	6.9
246-C10LNP	7

如表4中所证实，根据一个实施例的脂质纳米颗粒显示出具有优异的体内安全性和药物释放的6.0至7.0的pKa范围。

根据所含的可电离脂质的种类(可电离脂质中所含的胺的种类)，通过与实施例2-2同样的方法制备的包封有核酸的LNP也显示相同的图案。

实施例4.脂质纳米颗粒特性的确认

实施例4-1.粒径测量

在本实施例中，测定实施例2-2中测定的包封有mRNA的脂质纳米颗粒(LNP；含有1.5mol％的脂质-PEG)的大小。使用PBS将其稀释使得在实施例2-2中制备的各脂质纳米颗粒中包含的RNA(荧光素酶mRNA；SEQ ID NO：1)的浓度为1μg/ml，并且在Malvern ZetasizerNano(Malvern Instruments,英国)中使用动态光散射(DLS)测量LNP的直径和多分散指数(PDI)，结果如下表5所述。

[表5]

脂质纳米颗粒	直径(nm)	PDI
			241-C10 LNP	128	0.259
242-C10LNP	77	0.210
			243-C10LNP	56	0.225
244-C10LNP	66	0.149
			245-C10LNP	70	0.210
246-C10LNP	68	0.143

如表5所证实，根据一个实施例的脂质纳米颗粒显示出易于引入肝细胞并且药物释放优异的粒径，并且可以发现PDI值小且颗粒均匀，顺序为241-C10 LNP>243-C10 LNP>242-C10 LNP＝245-C10 LNP>244-C10 LNP>246-C10 LNP。

实施例4-2.包封效率的测量

通过Ribogreen分析(Quant-iTTMRNA，Invitrogen)测定了其中包封有作为核酸药物的siRNA(siFVII siRNA)的各LNP(含有1.5mol％的脂质-PEG)的包封效率(药物包封效率，％)。将实施例2-2中制备的包封有核酸药物的LNP在96孔板中用50μl的1xTE缓冲液稀释，使siRNA的终浓度为4至7μg/ml。向未经Triton-X处理的组(Triton-x LNP(-))添加50μL 1xTE缓冲液，向经Triton-X处理的组(Triton-x LNP(+))添加50μL 2％Triton-X缓冲液。37℃温育10分钟，通过用Triton-X降解LNP释放出包封的核酸。然后，向各孔添加100μL Ribogreen试剂。在/>200PRO NanoQuant(Tecan)中以波长带宽(激发：485nm，发射：528nm)测定Triton LNP(-)和Triton LNP(+)的荧光强度(FL)，并以下等式3计算药物包封效率(包封效率，％)。各LNP的药物包封效率(％)作为重复测量两次的结果的平均值示于下表6中。

(等式3)

药物包封效率(％)＝(Triton LNP(+)荧光强度-Triton LNP(-)荧光强度)/(Triton LNP(+)荧光强度)×100

[表6]

脂质纳米颗粒	包封效率(％)
		241-C10 LNP	84
242-C10LNP	83
		243-C10LNP	91
244-C10LNP	87
		245-C10LNP	91
246-C10LNP	94

如表6中所证实，根据一个实施例的脂质纳米颗粒可以高效地包封药物。

实施例5.使用脂质纳米颗粒的细胞内核酸递送的确认

实施例5-1.根据LNP中包含的可电离脂质类型的核酸递送效果

在根据一个实施方式将LNP转染到细胞中的前一天，将HeLa细胞(韩国细胞系库)以0.01×10⁶个细胞/孔等分于白板(96孔)中，并在37℃、0.5至3％CO₂条件下在DMEM培养基(SH30022，Hyclone，美国)中培养。将其中包封有编码荧光素酶的mRNA(lucmRNA；SEQ IDNO:1)的LNP(241-C10LNP至246-C10LNP，包含1.5mol％的脂质-PEG)和0.1μg/ml ApoE3通过移液管吸吹搅拌，然后在室温下温育10分钟，之后在HeLa细胞中进行处理(100ng/孔，基于脂质纳米颗粒中包含的mRNA)。ApoE3结合到LNP表面，并起到允许LNP通过细胞表面表达的LDL受体通过内吞作用进入细胞的作用。

24小时后，在分别用100μL/孔的Bright-GloTM荧光素酶测定溶液(Promega，美国)处理，室温放置10分钟，然后使用Infinite M200发光测量装置测量溶解细胞的发光强度(Tecan，美国)，结果示于图4a中。如图4a所示，pKa范围为6.0至7.0的244-C10LNP、245-C10LNP和246-C10LNP显示出较强的发光强度，其中246-C10LNP的发光强度最高，因此可以看出246-C10LNP具有最高的细胞内药物递送效率。

实施例5-2.癌细胞中的核酸递送的确认

通过在脂质纳米颗粒中包含C16 PEG-神经酰胺或PEG-DSPE来将脂质-PEG的含量改变为1.5至10.0mol％，以类似于实施例2-2的方法来制备脂质纳米颗粒，。

脂质纳米颗粒中包含的可电离脂质：siRNA的重量比为7.5：1，LNP中所含的可电离脂质(246-C10)：磷脂(DSPC)：胆固醇：脂质-PEG(C16-PEG2000神经酰胺或PEG-DSPE)的摩尔比为42.5：13：39.5至43：1.5至5.0(调整胆固醇和脂质-PEG的含量以使摩尔比之和为100)。

在将根据一个实施例的LNP转染到细胞中的前一天，将HeLa细胞(韩国细胞系库)以0.01x10⁶个细胞/孔等分于白板(96孔)中，并在37℃、0.5至3％CO₂条件下于DMEM培养基(SH30022，Hyclone，美国)中培养。在以包封有siLuc(SEQ ID NO：2和3)的脂质纳米颗粒以10nM的siRNA浓度处理HeLa-Luc细胞系后24小时，Bright-GloTM萤光素酶测定溶液(Promega，美国)100μL/孔进行处理，室温静置10分钟，然后使用Infinite M200发光测量装置(Tecan，美国)测量溶解的细胞的发光强度，结果示于图4b。所使用的siLuc(靶向荧光素酶基因的siRNA)的序列描述于上表3中。

如图4b所示，根据一个实施例的脂质纳米颗粒对Hela-Luc细胞(其为癌细胞)具有优异的核酸递送效果。

实施例5-3.药代动力学分析

如实施例2的方法，脂质纳米颗粒中包封抗HPV16 E6/E7 siRNA(SEQ ID NO：6和7；表3)，脂质纳米颗粒中包含的脂质-PEG的含量为1.5至5.0mol％。脂质纳米颗粒中包含的可电离脂质：siRNA的重量比为7.5:1，LNP中包含的可电离脂质(246-C10)：磷脂(DSPC)：胆固醇：脂质-PEG(C16-PEG2000神经酰胺)的摩尔比为42.5：13：39.5至43：1.5至5.0。以与实施例4-1相同的方法测量如上制备的脂质纳米颗粒的直径和PDI，示于下表7。

[表7]

脂质-PEG(mol％)	平均直径(nm)	PDI
			5.0	67.4	0.312
1.5	122.9	0.214

Spragu-Dawley大鼠(7-8周龄，雄性)股静脉注射包封有抗HPV16 E6/E7 siRNA的脂质纳米颗粒的药物2mg/kg后，0.5分钟至24小时采血，于4℃和13,000rpm离心5分钟后立即将血浆保护并保存于-70℃深冷库中。使用茎环RT-qPCR检测方法从保护的血浆中确认血浆中的抗HPV16 E6/E7 siRNA。当选择对siRNA具有特异性的茎环RT引物和探针并使用siRNA标准样品应用实时PCR技术时，作为对于siRNA标准样品的Cp值(y)之间的线性分析的结果，利用平均斜率(slope average)和决定系数R²，分析siRNA标准样品和Cp值之间的递归，以进行茎环RT-qPCR检测方法。使用WinNonlin程序分析药代动力学参数的结果如表8所示。

[表8]

如表8所示，包封有siHPV16_E6/E7的LNP与裸siRNA相比，药物施用后的血中最大浓度(Cmax)更高，并且药物消除半衰期(T1/2)保持得更长，而药物的清除率(CL)更低，因此引起其在体内长时间维持，药物清除程度低，因此增加了体内稳定性。

实施例5-4.siRNA-LNP迁移到癌组织中的确认

制备包封有Cy5.5标记的siGFP(SEQ ID No：4和5；表3)的脂质纳米颗粒(246-C10LNP)，脂质纳米颗粒中的脂质-PEG的含量为5.0mol％。脂质纳米颗粒中包含的可电离脂质：siRNA的重量比为7.5:1，LNP中包含的可电离脂质(246-C10)：磷脂(DSPC)：胆固醇：脂质-PEG(C16-PEG2000神经酰胺)的摩尔比为42.5：13：39.5：5.0。以与实施例4-1相同的方法测量如上制备的脂质纳米颗粒的直径和PDI，示于下表9。

[表9]

脂质-PEG(％)	平均直径(nm)	PDI
			5.0	30	0.142

将5×10⁶HeLa细胞皮下接种到C57BL/6雌性7周龄20g小鼠中。每周两次监测小鼠的肿瘤体积和体重。使用数字卡尺测量肿瘤大小。使用V＝0.5×W²×L(V＝肿瘤体积，W＝肿瘤宽度，L＝肿瘤长度)计算肿瘤体积。当肿瘤大小达到100mm³时，将脂质纳米颗粒注射到小鼠体内，注射后48小时，通过IVIS确认生物分布。测量癌组织、肝脏和肾脏中的荧光，结果示于图5a。如图5a所示，可以确认当施用根据一个实施例的脂质纳米颗粒时向癌组织的迁移优异。

实施例5-5.异种移植肿瘤小鼠模型中的体内siRNA递送和基因调控的确认

如上述实施例5-2所证实，246-C10LNP在体外表现出优异的基因表达效果(基因递送效果)，本实施例将要证实其体内药物递送效率和生物分布。

通过实施例5-4的方法，将siLuc(SEQ ID NO：2和3；表3)用246-C10LNP(包含1.5mol％的脂质-PEG)制备，并将各纳米颗粒在PBS中透析16小时以去除乙醇。将5×10⁶HeLa-Luc癌细胞皮下接种到C57BL/6雌性7周龄(OrientBio)20g小鼠中。每周两次监测小鼠的肿瘤体积和体重。使用数字卡尺测量肿瘤大小。使用V＝0.5×W²×L(V＝肿瘤体积，W＝肿瘤宽度，L＝肿瘤长度)计算肿瘤体积。当肿瘤大小达到100mm³时，将siLuc脂质纳米颗粒和阴性对照siRNA注射到小鼠体内，在注射后48小时，使用IVIS(PerkinElmer，美国)设备显示生物发光强度。如图5b所示，与施用阴性对照siRNA脂质纳米颗粒的组相比，确认了在HeLa-Luc异种移植小鼠体内施用互补siLuc脂质纳米颗粒的组中发光强度降低。由此，可以确认根据一个实施例的脂质纳米颗粒的递送和维持能力是优异的。

通过实施例5-4的方法，将siLuc(SEQ ID NO：2和3；表3)用246-C10LNP(包含1.5mol％的脂质-PEG)制备，并将各纳米颗粒在PBS中透析16小时以去除乙醇。通过用与图5b相同的方法制作异种移植小鼠模型来测量根据注射法的生物发光强度。

通过IV(静脉内)注射或IT(肿瘤内)注射的方法将包封有siLuc的脂质纳米颗粒注射3小时后，通过IVIS(PerkinElmer，美国)设备确认生物发光，结果示于图5c。如图5c所示，绘制了根据其中施用包含siLuc的脂质纳米颗粒的注射方法的生物发光，并且可以证实静脉内注射和肿瘤内注射都降低了发光强度。

实施例6.使用抗-HPV16 E6/E7 siRNA的癌症治疗效果的确认

实施例6-1.包封有靶向HPV16 E6/E7基因的siRNA的脂质纳米颗粒制备

以与实施例2-2的方法类似地制备246-C10脂质纳米颗粒(包含1.5mol％的脂质-PEG)，其中封装了靶向HPV16的E6/E7基因的siRNA(SEQ ID NO：6和7；表3)。

实施例6-2.癌细胞杀伤效果测定

为了测量癌细胞的杀伤效果，在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系UM-SCC-47(Meark目录号SCC071)细胞和宫颈癌细胞系Ca Ski(ATCC目录号CRL-1550)细胞系中，转染实施例6-1制备的包封有抗-HPV16 E6/E7 siRNA的LNP。

头颈部鳞状细胞癌细胞系UM-SCC-47在含10％胎牛血清和抗生素的DMEM培养基(Hyclone公司目录号：SH30243.01)中于37℃、5％CO₂和100％湿度条件下培养。宫颈癌细胞系CaSki在含10％胎牛血清和抗生素的RPMI(Hyclone公司目录号：SH30027.01)培养基中于37℃、5％CO₂、100％湿度条件下培养。

转染前24小时将1×10⁵个细胞置于6孔板中培养，然后，在单一施用组和组合施用组中，用包封有抗HPV16 E6/E7 siRNA的246-C10LNP(含1.5mol％脂质PEG)以10nM至30nM的浓度处理UM-SCC-47，并以10nM至40nM的浓度处理CaSki细胞，并且在顺铂(CDDP)的情况下，在施用组和组合施用组中，在UM-SCC-47中以浓度1μM至5μM处理，在CaSki中以浓度5μM至10μM处理，并且与Apoe4 1.5μg/ml在室温结合15分钟，然后在6孔板中处理。转染后48小时，通过使用血细胞计数器的相差显微镜确认细胞中台盼蓝的染色程度来确认细胞活力，结果示于图6a。

如图6a所示，根据一个实施例的包封有siRNA的脂质纳米颗粒的癌细胞杀伤效果非常好，而与抗癌剂(CDDP)组合使用时，杀伤效果进一步增强。

实施例6-3.mRNA表达测量

在本实施例中，为了测定根据一个实施例的脂质纳米颗粒的药物(siRNA)递送效率，测定了HPV16E6/E7的mRNA表达，而为了确认根据一个实施例的脂质纳米颗粒的癌症预防或治疗效果，测量了p21 mRNA表达。

为了测量mRNA表达水平，在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系UM-SCC-47(Meark目录号SCC071)细胞和宫颈癌细胞系Ca Ski(ATCC目录号CRL-1550)细胞系中，转染实施例6-1中制备的包封有抗-HPV16 E6/E7 siRNA的LNP。头颈部鳞状细胞癌细胞系UM-SCC-47和宫颈癌细胞系CaSki如实施例6-2所述培养。

转染前24小时将1×10⁵个细胞置于6孔板中培养，然后，在单一施用组和组合施用组中，用包封有抗HPV16 E6/E7 siRNA的246-C10LNP(含1.5mol％脂质PEG)以10nM至30nM的浓度处理UM-SCC-47，并以10nM至40nM的浓度处理Ca Ski细胞，并且在顺铂(CDDP)的情况下，在施用组和组合施用组中，在UM-SCC-47中以浓度1μM至5μM处理，在Ca Ski中以浓度5μM至10μM处理，并且与Apoe4 1.5μg/ml在室温结合15分钟，然后在6孔板中处理。

转染后48小时，裂解细胞，并根据制造商的说明书使用RiboEX^TM(GeneAll，目录号301-001)提取RNA，并进行能够确认HPV16 E6/E7(正向引物：SEQ ID NO：8/反向引物：SEQID NO：9/探针：UPL#63(Roche))、P21(正向引物：SEQ ID NO：10/反向引物：SEQ ID NO:11/探针：UPL#82(Roche))、HPRT1(正向引物：SEQ ID NO:12/反向引物：SEQ ID NO:13/探针：UPL#73(Roche))的mRNA的表达水平的定量实时-聚合酶链式反应(qRT-PCR)，结果显示在图6b。HPRT1用作管家基因，所用引物序列见下表10所述。

[表10]

如图6b所示，可以证实当包封有抗HPV16 E6/E7 siRNA的脂质纳米颗粒处理时，HPV16 E6/E7的mRNA表达显著降低，而p21 mRNA(肿瘤抑制基因p53的一个亚基因)的表达显著增加，并且当与化学抗癌剂(顺铂，CDDP)组合使用时，HPV16E6/E7的mRNA表达减少和p21mRNA表达增加进一步增加。

实施例6-4.蛋白质表达测量

在本实施例中，为了确认根据一个实施例的脂质纳米颗粒的癌症预防或治疗效果，测定了p21和p53的蛋白质表达。

为了测量蛋白质表达水平，在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系UM-SCC-47(Meark目录号SCC071)细胞和宫颈癌细胞系Ca Ski(ATCC目录号CRL-1550)细胞系中，转染实施例6-1中制备的包封有抗-HPV16 E6/E7 siRNA的LNP。头颈部鳞状细胞癌细胞系UM-SCC-47和宫颈癌细胞系CaSki如实施例6-2所述培养。

转染前24小时将1×10⁵个细胞置于6孔板中培养，然后，在单一施用组和组合施用组中，用包封有抗HPV16 E6/E7 siRNA的246-C10LNP(含1.5mol％脂质-PEG)以10nM至30nM的浓度处理UM-SCC-47，并以10nM至40nM的浓度处理Ca Ski细胞，并且在顺铂(CDDP)的情况下，在施用组和组合施用组中，在UM-SCC-47中以浓度1μM至5μM处理，在Ca Ski中以浓度5μM至10μM处理，并且与Apoe4 1.5μg/ml在室温结合15分钟，然后在6孔板中处理。

转染后48小时，采用Western印迹分析法，检测p21、p53和管家蛋白b-肌动蛋白的表达水平。通过添加RIPA细胞裂解缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM EDTA，0.1％ SDS，0.5％脱氧胆酸盐和1％NP-40)来使其裂解，并用通过能够定量蛋白量的BCA测定以相同的蛋白量进行Western印迹。一抗抗-P21(Santacruz目录号SC-817)按1:2000稀释使用，抗-p53(Santacruz目录号SC-47698)按1:2000稀释使用，抗-B-肌动蛋白(Santacruz目录号SC-47778)按1:3000稀释使用。将作为二抗的IgG-小鼠-HRP-结合抗体按1:5000稀释进行，结果示于图6c。

如图6c所示，当包封有抗HPV16 E6/E7 siRNA的脂质纳米颗粒单独或与抗癌剂(CDDP)组合处理时，p21和p53蛋白表达显著增加。

实施例7.使用PMVK siRNA的癌症治疗效果的确认

实施例7-1.包封有靶向PMVK的siRNA的脂质纳米颗粒的制备

以与实施例2-2的方法类似的方式，制备其中包封有靶向PMVK的siRNA(SEQ IDNO：14和15；表3)的246-C10脂质纳米颗粒(包含1.5mol％的脂质-PEG)。

实施例7-2.癌细胞杀伤效果测定

为了测定癌细胞杀伤效果，在胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC目录号CL-1420)、肺癌细胞系A549(ATCC目录号CCL-185)、乳腺癌细胞系癌细胞系MCF-7(ATCC目录号HTB-22)和宫颈癌细胞系Hela(ATCC目录号CCL-2)细胞系中，转染实施例7-1中制备的包封有抗PMVKsiRNA的LNP。

胰腺癌细胞系Miapaca-2和宫颈癌细胞系Hela在含有10％胎牛血清和抗生素的DMEM培养基(Hyclone公司货号：SH30243.01)中于37℃、5％ CO₂和100％湿度条件下培养。

肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系MCF-7在含10％胎牛血清和抗生素的RPMI培养基(Hyclone公司目录号：SH30027.01)中于37℃、5％CO₂和100％湿度条件下培养。

转染24小时前，将1×10⁵个细胞置于6孔板中培养，然后，在单一施用组和组合施用组中，将包封有抗PMVK siRNA的246-C10LNP(含有1.5mol％的脂质-PEG)以20nM至40nM的浓度处理，而在顺铂((CDDP)Sigma,目录号P4394)的情况下，在施用组和组合施用组中，以浓度1μM至5μM处理，并且与Apoe4 1.5μg/ml在室温结合15分钟，然后在6孔板中处理。转染后48小时，通过使用血细胞计数器的相差显微镜确认细胞中台盼蓝的染色程度来确认细胞活力，结果示于图7a。

如图7a所示，根据一个实施例的药物包封的脂质纳米颗粒通过siRNA的癌细胞杀伤作用增加。

实施例7-3.mRNA表达测量

在本实施例中，为了测量根据一个实施例的脂质纳米颗粒的药物(siRNA)递送效率，测量了肺癌、胰腺癌、乳腺癌和宫颈癌细胞中的PMVK mRNA表达。

为了测量mRNA的表达水平，在胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC目录号CL-1420)、肺癌细胞系A549(ATCC目录号CCL-185)、乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC目录号HTB-22)和宫颈癌细胞系Hela(ATCC目录号CCL-2)细胞系中，用实施例7-1制备的包封有抗-PMVK siRNA的LNP转染。胰腺癌细胞系Miapaca-2、宫颈癌细胞系Hela、肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系MCF-7如实施例7-2培养。

转染24小时前，将0.5×10⁵至1×10⁵个细胞置于6孔板中培养，然后，在单一施用组和组合施用组中，将包封有抗PMVK siRNA的246-C10LNP(含1.5mol％的脂质-PEG)以20nM至40nM的浓度处理，而在顺铂((CDDP)Sigma,目录号P4394)的情况下，在施用组和组合施用组中，以浓度1μM至5μM处理，并且与Apoe4 1.5μg/ml在室温结合15分钟，然后在6孔板中处理。转染后48小时，裂解细胞，并根据制造商的说明书使用RiboEX^TM(GeneAll，目录号301-001)提取RNA，并进行能够确认PMVK(正向:SEQ ID NO:16/反向:SEQ ID NO:17/探针:UPL#49(Roche)),B-肌动蛋白(正向:SEQ ID NO:18/反向:SEQ ID NO:19/探针:UPL#64(Roche))的mRNA的表达水平的定量实时-聚合酶链式反应(qRT-PCR)，结果如图7b所示。使用B-肌动蛋白作为管家基因，使用的引物序列如下表11所示。

[表11]

如图7b所示，包封有PMVK siRNA的脂质纳米颗粒处理癌细胞时，PMVK的mRNA表达显著降低。

实施例7-4.蛋白质表达测定

在本实施例中，为了测量根据一个实施例的脂质纳米颗粒的药物(siRNA)递送效率，测定了肺癌、胰腺癌、乳腺癌和宫颈癌细胞中的PMVK蛋白表达。

为了测量蛋白质的表达水平，在胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC目录号CL-1420)，肺癌细胞系A549(ATCC目录号CCL-185)、乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC目录号HTB-22)和宫颈癌细胞系Hela(ATCC目录号CCL-2)细胞系中，以实施例7-1制备的抗-PMVK siRNA包封的LNP转染。胰腺癌细胞系Miapaca-2、宫颈癌细胞系Hela、肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系MCF-7如实施例7-2培养。

转染24小时前，将0.5×10⁵至1×10⁵个细胞置于6孔板中培养，然后，在单一施用组和组合施用组中，将包封有抗PMVK siRNA的246-C10LNP(含1.5mol％的脂质-PEG)以20nM至40nM的浓度处理，而在顺铂((CDDP)Sigma,目录号P4394)的情况下，在施用组和组合施用组中，以浓度1μM至5μM处理，并且与Apoe4 1.5μg/ml在室温结合15分钟，然后在6孔板中处理。转染后48小时，采用Western印迹分析方法测定PMVK的表达水平。通过加入RIPA细胞裂解缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM EDTA，0.1％ SDS、0.5％脱氧胆酸盐和1％NP-40)，通过能够定量蛋白质量的BCA测定以相同的蛋白量进行Western印迹。一抗抗-PMVK(Atlas抗体目录号HPA029900)按1:2000稀释使用。将作为二抗的IgG-小鼠-HRP-结合抗体按1:5000稀释进行，结果示于图7c。

如图7c所示，包封有抗PMVK siRNA的脂质纳米颗粒处理癌细胞时，PMVK蛋白表达显著降低。

实施例7-5.在癌细胞系中PMVK敲低后通过放射敏感性的活力测量

在本实施例中，为了测量根据一个实施例的脂质纳米颗粒的药物(siRNA)递送效率，测定了PMVK敲低后的细胞活力，其已知是与肺癌、胰腺癌和宫颈癌的放疗抗性相关的因素。

为了测量蛋白质的表达水平，在胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC目录号CL-1420)、肺癌细胞系A549(ATCC目录号CCL-185)、宫颈癌细胞系Hela(ATCC目录号CCL-2)细胞系和CaSki(ATCC目录号CRL-1550)细胞系中，转染其中以类似于实施例2-2的方法包封有靶向PMVK基因的siRNA(SEQ ID NO：14和15；表3)的246-C10脂质纳米颗粒(包含1mol％的脂质-PEG)。胰腺癌细胞系Miapaca-2、宫颈癌细胞系Hela、Ca Ski和肺癌细胞系A549如实施例7-2培养。

转染前24小时，将0.3×10⁴Miapaca-2、A549、HeLa和Ca Ski细胞接种于96孔板中，然后培养24小时。将实施例7-5中制备的包封有抗PMVK siRNA的246-C10脂质纳米颗粒(包含1mol％的脂质-PEG)转染到培养的细胞中。此外，使用6-MV光子束直线加速器，以10Gy放射处理。放射治疗后第二天，通过CCK-8测定法确认细胞活力。结果示于图7d。

如图7d所示，当在癌细胞中进行包封有抗PMVK siRNA的246-C10脂质纳米颗粒和放射处理时，细胞死亡显著增加。

实施例7-6.癌细胞系中PMVK纳米颗粒敲低后通过辐射敏感性的蛋白质表达测量

在本实施例中，为了测量根据一个实施例的脂质纳米颗粒的药物(siRNA)递送效率，测定了PMVK敲低后的蛋白质表达，其已知是与肺癌、胰腺癌和宫颈癌的放疗抗性相关的因素。

为了测量蛋白质表达，在胰腺癌细胞系Miapaca-2(ATCC目录号CL-1420)、肺癌细胞系A549(ATCC目录号CCL-185)、宫颈癌细胞系Hela(ATCC目录号CCL-2)细胞系和Ca Ski(ATCC目录号CRL-1550)细胞系中，转染实施例7-5中制备的包封有抗PMVK siRNA的脂质纳米颗粒。胰腺癌细胞系Miapaca-2、宫颈癌细胞系Hela、Ca Ski和肺癌细胞系A549如实施例7-2培养。

转染前24小时，将1×10⁵个Miapaca-2、A549、HeLa和Ca Ski细胞接种于96孔板中，然后培养24小时。将实施例7-5中制备的包封有抗PMVK siRNA的246-C10脂质纳米颗粒(包含1mol％的脂质-PEG)转染到培养的细胞中。此外，使用6-MV光子束直线加速器，进行10Gy放射处理。在放射治疗后的第二天，提取蛋白质，然后使用PMVK抗体进行Western印迹，从而确认蛋白质的表达。结果示于图7e。

如图7e所示，可以证实，当在癌细胞中进行包封有抗PMVK siRNA的246-C10脂质纳米颗粒和放射处理时，PMVK siRNA的蛋白质表达减少。

实施例7-7.在异种移植肿瘤小鼠模型中通过包含siRNA的纳米颗粒确认的体内siRNA递送和基因调控的确认

在本实施例中，为了测量根据一个实施例的脂质纳米颗粒的药物(siRNA)递送效率，测定了PMVK敲低后的肿瘤大小变化，其已知是与胰腺癌异种移植肿瘤小鼠模型中的放疗抗性相关的因素。

将3×10⁶个Miapaca-2癌细胞(ATCC，目录号CRL-1420)和1×10⁶个A549癌细胞(ATCC，目录号CCL-185)皮下接种到BALB/c雄性5周龄裸鼠(OrientBio)20g小鼠右腿。小鼠肿瘤体积和体重每周监测3次。使用数字卡尺测量肿瘤大小。使用V＝0.5×W²×L(V＝肿瘤体积，W＝肿瘤宽度，L＝肿瘤长度)计算肿瘤体积。以与实施例7-5的方法类似的方式，制备了包封有靶向PMVK基因的siRNA(SEQ ID NO：14和15；表3)的246-C10脂质纳米颗粒(包含1mol％的脂质-PEG)。当肿瘤大小达到100mm³±20时，在第一周和第三周在Miapaca-2异种移植裸鼠中以3mg/kg QD×3IV(静脉内)注射包封有PMVK的246-C10脂质纳米颗粒和载剂LNP，并在注射纳米颗粒后，每周一次使用6-MV光子束直线加速器进行4Gy的照射处理。结果示于图7f。

以与实施例7-5的方法类似的方式，制备了包封有靶向PMVK基因的siRNA(SEQ IDNO：14和15；表3)的246-C10脂质纳米颗粒(包含1mol％的脂质-PEG)。当肿瘤大小达到100mm³±20时，在第一周和第三周在Miapaca-2异种移植裸鼠中以3mg/kg QD×3IV(静脉内)注射包封有PMVK的LNP和载剂LNP，此外，在注射纳米颗粒后，每周一次使用6-MV光子束直线加速器进行2Gy的放射处理。结果示于图7g。如图7f和图7g所示，可以证实当进行放射治疗时，施用了包含抗PMKV siRNA的246-C10脂质纳米颗粒的小鼠模型中的PMVK基因表达进一步降低。

<110> 银汉斯德生物技术公司

<120> 包含脂质纳米颗粒的用于预防或治疗癌症的组合物

<130> OPP20215035KR

<150> KR 10-2020-0183898

<151> 2020-12-24

<150> KR 10-2021-0153381

<151> 2021-11-09

<160> 19

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 荧光素酶mRNA

<400> 1

auggaagacg ccaaaaacau aaagaaaggc ccggcgccau ucuauccgcu ggaagaugga 60

accgcuggag agcaacugca uaaggcuaug aagagauacg cccugguucc uggaacaauu 120

gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg cugaguacuu cgaaaugucc 180

guucgguugg cagaagcuau gaaacgauau gggcugaaua caaaucacag aaucgucgua 240

ugcagugaaa acucucuuca auucuuuaug ccgguguugg gcgcguuauu uaucggaguu 300

gcaguugcgc ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag uaugggcauu 360

ucgcagccua ccgugguguu cguuuccaaa aagggguugc aaaaaauuuu gaacgugcaa 420

aaaaagcucc caaucaucca aaaaauuauu aucauggauu cuaaaacgga uuaccaggga 480

uuucagucga uguacacguu cgucacaucu caucuaccuc ccgguuuuaa ugaauacgau 540

uuugugccag aguccuucga uagggacaag acaauugcac ugaucaugaa cuccucugga 600

ucuacugguc ugccuaaagg ugucgcucug ccucauagaa cugccugcgu gagauucucg 660

caugccagag auccuauuuu uggcaaucaa aucauuccgg auacugcgau uuuaaguguu 720

guuccauucc aucacgguuu uggaauguuu acuacacucg gauauuugau auguggauuu 780

cgagucgucu uaauguauag auuugaagaa gagcuguuuc ugaggagccu ucaggauuac 840

aagauucaaa gugcgcugcu ggugccaacc cuauucuccu ucuucgccaa aagcacucug 900

auugacaaau acgauuuauc uaauuuacac gaaauugcuu cugguggcgc uccccucucu 960

aaggaagucg gggaagcggu ugccaagagg uuccaucugc cagguaucag gcaaggauau 1020

gggcucacug agacuacauc agcuauucug auuacacccg agggggauga uaaaccgggc 1080

gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 1140

acgcugggcg uuaaucaaag aggcgaacug ugugugagag guccuaugau uauguccggu 1200

uauguaaaca auccggaagc gaccaacgcc uugauugaca aggauggaug gcuacauucu 1260

ggagacauag cuuacuggga cgaagacgaa cacuucuuca ucguugaccg ccugaagucu 1320

cugauuaagu acaaaggcua ucagguggcu cccgcugaau uggaauccau cuugcuccaa 1380

caccccaaca ucuucgacgc aggugucgca ggucuucccg acgaugacgc cggugaacuu 1440

cccgccgccg uuguuguuuu ggagcacgga aagacgauga cggaaaaaga gaucguggau 1500

uacgucgcca gucaaguaac aaccgcgaaa aaguugcgcg gaggaguugu guuuguggac 1560

gaaguaccga aaggucuuac cggaaaacuc gacgcaagaa aaaucagaga gauccucaua 1620

aaggccaaga agggcggaaa gaucgccgug uaa 1653

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> siLuc_正义

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> deoxyribonucleotides

<400> 2

aacgcugggc guuaaucaat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> siLuc_反义

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸

<400> 3

uugauuaacg cccagcguut t 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cy5.5 标记的siGFP_正义

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸

<400> 4

acaugaagca gcacgacuut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cy5.5 labeled siGFP_反义

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸

<400> 5

aagucgugcu gcuucaugut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-HPV16 E6/E7_正义

<400> 6

gaccggucga uguaugucuu g 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-HPV16 E6/E7_反义

<400> 7

agacauacau cgaccggucc a 21

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HPV16 E6/E7_正向引物

<400> 8

ccactgatct ctactgttat gagcaa 26

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HPV16 E6/E7_反向引物

<400> 9

ccagctggac catctatttc a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P21_正向引物

<400> 10

cgaagtcagt tccttgtgga g 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P21_反向引物

<400> 11

catgggttct gacggacat 19

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HPRT1_正向引物

<400> 12

tgaccttgat ttattttgca tacc 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-PMVK_正义

<400> 13

cgagcaagac gttcagtcct 20

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-PMVK_正义

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸

<400> 14

uggacgaugc ugagucagat t 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-PMVK_反义

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸

<400> 15

ucugacucag caucguccat t 21

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PMVK_正向引物

<400> 16

atatccccag tgccagtcc 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PMVK_反向引物

<400> 17

aacaaggggc tgagaacatc 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B-肌动蛋白_正向引物

<400> 18

ccaaccgcga gaagatga 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B-肌动蛋白 _反向引物

<400> 19

ccagaggcgt acagggatag 20

Claims (16)

1.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含：

(1)脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含结合有1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪和烷基环氧化物的可电离脂质、磷脂、胆固醇和脂质-聚乙二醇(PEG)缀合物，和

(2)第一抗癌剂，并且

其中，所述第一抗癌剂是阴离子药物、核酸或其组合。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述烷基环氧化物为1,2-环氧十二烷。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述磷脂为选自由以下组成的组中的一种或多种：DOPE、DSPC、POPC、EPC、DOPC、DPPC、DOPG、DPPG、DSPE、磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、POPE、DOPS和1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸]。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述脂质-PEG缀合物为选自由以下组成的组中的一种或多种：神经酰胺、二肉豆蔻酰甘油(DMG)、琥珀酰-二酰基甘油(s-DAG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和胆固醇。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述脂质-PEG缀合物的含量为0.25mol％至10mol％。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为20至50:10至30:10至60:0.25至10的可电离脂质：磷脂：胆固醇：脂质-PEG缀合物。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述脂质纳米颗粒的pKa为6.0至7.0。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述第一抗癌剂被包封在所述脂质纳米颗粒的内部。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述脂质纳米颗粒的平均直径为30nm至150nm。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述阴离子药物为选自由以下组成的组中的一种或多种：肽、蛋白质药物、蛋白质-核酸结构体和阴离子生物聚合物-药物缀合物。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述核酸为选自由以下组成的组中的一种或多种：小干扰核糖核酸(siRNA)、核糖体核糖核酸(rRNA)、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、互补脱氧核糖核酸(cDNA)、适体、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、反义寡核苷酸、shRNA、miRNA、核酶、PNA和DNA酶。

12.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述癌症是由人乳头瘤病毒(HPV)感染导致的癌症。

13.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述癌症选自由以下组成的组：宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌、扁桃体癌、咽癌、喉癌、头颈癌、鳞状细胞头颈癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、肺癌、胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、慢性或急性白血病、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、直肠癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。

14.一种用于与放射疗法组合使用的癌症治疗用药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的药物组合物。

15.一种用于与抗癌剂组合施用的药物组合物，其还包含权利要求1至13中任一项所述的药物组合物和第二抗癌剂。

16.根据权利要求15所述的用于与抗癌剂组合施用的药物组合物，其中，所述第二抗癌剂是选自由顺铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、多柔比星、氟尿嘧啶和卡铂组成的组中的一种或多种。